パッケージ化ウイルス様粒子
本発明は、ワクチン接種学、免疫学および医学の分野に関連する。本発明は、免疫賦活性核酸、好ましくは少なくとも一つの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドおよびｔｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）リガンドをパッケージ化したウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合あるいは融合した抗原に対して免疫学的応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明は、特にアレルギー、腫瘍および慢性ウイルス病並びに他の慢性疾患の治療に有効な強い抗体およびＴ細胞応答を誘発するために用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、ワクチン接種学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、免疫賦活性核酸、好ましくは少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧ配列及びｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンドを含むオリゴヌクレオチドをＶＬＰにパッケージ化したウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合又は融合した抗原に対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明を使用して、アレルギー、腫瘍および慢性ウイルス性疾患、並びに他の慢性疾患を治療するのに特に有用な、強力な抗体とＴ細胞応答を誘導することができる。
【０００２】
関連技術
一般的に、自己抗原に対する抗体応答を誘発することは困難である。ワクチン接種の効率を改善する一つの方法は、用いる抗体の反復程度を増やすことである。単離したタンパク質とは異なって、ウイルスはＴ細胞の援助がある時でもないときでも任意のアジュバントの不在下にて即時的な効率のよい免疫応答が誘導される(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991))。ウイルスの多くはわずかなタンパク質からなるにもかかわらず、それらの単離した成分よりもより強い免疫応答の誘因となりうる。Ｂ細胞応答について、ウイルスの免疫厳正の重要な一因子は表面上エピトープの反復と配列であることが知られている。多くのウイルスはＢ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンと効率よく架橋する一定のエピトープ配列を表示する類似の結晶性表面を提示している(Bachmann及びZinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996))。このＢ細胞上の表面免疫グロブリンの架橋は細胞周期の進行及びＩｇＭ抗体の産生を直接的に誘導する強い活性化シグナルである。さらに、このように引き起こされたＢ細胞はヘルパーＴ細胞を活性化することができ、それによって次に、ワクチン接種の目標である、Ｂ細胞でのＩｇＭからＩｇＧ抗体産生の転換と長く残るＢ細胞メモリーの生成が起こる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。ウイルス構造は、自己免疫疾患の抗-抗体の生成と病原体への自然な応答の一部にも関連している(Fehr, T., ら., J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)を参照)。ゆえに、非常に体系化されたウイルス表面によって提示される抗原は抗原に対する強い抗体応答を誘導することができる。
【０００３】
記載したように、通常免疫系は自己由来の構造に対して抗体を生成することはない。低濃度で存在する可溶性抗原はＴｈ細胞レベルでの耐性によるものである。この条件下で、Ｔヘルプを運搬しうる担体に自己抗原を結合すると寛容性が壊れうる。可溶性タンパク質が高濃度であるか膜タンパク質が低濃度であるためにはＢ及びＴｈ細胞が寛容でありうる。しかしながら、Ｂ細胞の寛容性は可逆的（無反応）であり、外来性の担体に結合した非常に体系化された様式の抗体の投与により破壊されうる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。
【０００４】
最近の所見により、パッケージ化ＣｐＧを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）がＶＬＰにコンジュゲートした抗原に対するＴ細胞応答の誘因となることができることが示されている（ＷＯ０３／０２４４８１）。加えて、パッケージ化ＣｐＧはその安定性が亢進し、マウスの脾腫およびリンパ節腫脹を伴う髄外造血を引き起こすなどの上述した副作用を実質的に取り除いた。
ＡＰＣ上にＴＬＲ９を拘束するＣｐＧと対照的に、他のＴＬＲリガンド単独ではＶＬＰ誘発性Ｔ細胞応答を亢進することはない(Schwarzら., (2003) Eur. J. Immunol., 33, 1465-1470)。具体的に、ペプチドグリカン、ＴＬＲ２のリガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３のリガンド、ＬＰＳ、ＴＬＲ４のリガンド、フラゲリン、ＴＬＲ５およびイミクイモード(imiquimode)のリガンド、ＴＬＲ７のリガンドのすべてはＣｐＧと類似の方法でＶＬＰ誘発性ＣＴＬ応答を亢進することはない。
【０００５】
近年ワクチン接種戦略ではめざましい進歩があったが、現行の戦略に必要な改善点が残されている。特に当分野では、深刻な副作用を伴わずにＴ及びＢ細胞の強い応答を引き起こす、とりわけ強いＣＴＬ免疫応答を促進して、天然の病原体と同じくらい効率よく抗病原性防御を与える新規で改良されたワクチンの開発が必要である。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、免疫賦活性核酸、典型的及び好ましくは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）を刺激するＣｐＧモチーフを含み、ＶＬＰないにパッケージ化されたＤＮＡオリゴヌクレオチドがＶＬＰに結合した抗原又はともに用いた抗原、すなわちパッケージ化ＶＬＰと混合した抗原へのＢ及びＴ細胞応答を亢進する一方で、ペプチドグリカン、ＴＬＲ２のリガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３のリガンド、ＬＰＳ、ＴＬＲ４のリガンド、フラゲリン、ＴＬＲ５およびイミクイモード(imiquimode)のリガンド、ＴＬＲ７のリガンドを含む他のＴＬＲリガンドすべてはＣｐＧと類似の方法でＶＬＰ誘発性ＣＴＬ応答を亢進しないという驚くべき発見に基づく(Schwarzら., (2003) Eur. J. Immunol., 33, 1465-1470)。しかしながら驚くべきことに、ＴＬＲ９以外のＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ４がＶＬＰに結合又は融合した抗原に対してＴ細胞応答を亢進しないにもかかわらず、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの存在下でそれらはＴ細胞応答を効率よく亢進した。ゆえに、ＴＬＲリガンドと免疫賦活性核酸の間に相乗的効果があった。
【０００７】
第一の実施態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。
同様に好ましい実施態様では、本発明は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子と混合している非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはウイルス様粒子と混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。
【０００８】
更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸はＣｐＧモチーフを含んでいないにもかかわらず免疫賦活性を示す。このような核酸はＷＯ０１／２２９７２に記載されている。ここに記載のすべての配列は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはリン酸ジエステル骨格のホスホロチオエート修飾体により安定化されていない。
好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはヒト細胞のＩＦＮαを誘導する。他の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドを誘導するＩＦＮαはグアノシン豊富なリピート配列に隣接し、パリンドローム配列を含む。
【０００９】
更なる好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、組み換えウイルス様粒子である。ウイルス様粒子がリポタンパク質のエンベロープを含まないことも好ましい。組み換えウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウイルス、はしかウイルス、シンビス(Sindbis)・ウイルス、ロタ・ウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォーク・ウイルス、又はヒト・パピローマ・ウイルス、ＲＮＡファージ、Ｑβ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージおよびＴｙの組み換えタンパク質を含むか、あるいは選択的にこれらからなることが好ましい。特定の実施態様では、ウイルス様粒子は、１つ又は複数の異なるＢ型肝炎ウイルスのコア（キャプシド）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含むか、あるいは選択的にこれらからなる。
更なる好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含む。好ましいＲＮＡファージは、Ｑβ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージである。
【００１０】
他の実施態様では、抗原又は抗原混合物は組み換え抗原である。他の実施態様では、抗原又は抗原混合物を天然源、限定するものではないが：花粉、塵、真菌類、昆虫、食物、哺乳類の表皮性物質、毛髪、唾液、血清、ミツバチ、腫瘍、病原体および羽毛から抽出する。
他の実施態様では、抗原はウイルス様粒子と結合している、あるいは遺伝学的にウイルス様粒子と融合している。
【００１１】
また他の実施態様では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；及び（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適したポリペプチドからなる群から選択することができる。
更なる実施態様では、抗原又は抗原混合物を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適した有機分子；および（６）薬剤、ホルモン又は毒性化合物に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子からなる群から選択することができる。
【００１２】
特定の実施態様では、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞又はＴｈ細胞のエピトープを含むか、あるいは選択的にこれからなる。関連実施態様では、抗原はＢ細胞エピトープを含むか、あるいは選択的にこれからなる。関連実施態様では、ウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスのコア・タンパク質を含む。
好ましい実施態様では、ＣｐＧを負荷したウイルス様粒子に添加した付加的なＴＬＲリガンドはＴＬＲ４により認識される。そのようなリガンドはＬＰＳ、あるいは好ましくは解毒したＬＰＳ、例としてＭＰＬ(Nat Biotechnol 17: 1075)や合成ＴＬＲ４リガンドであってもよい。
【００１３】
本発明の他の態様では、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に混合、接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはウイルス様粒子と混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含んでなる組成物を動物に導入することを含む、ヒト又は他の動物種の免疫応答を亢進するための方法を提供する。
本発明の更に他の実施態様では、本組成物は動物に、皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内あるいはリンパ節内に直接導入する。同様に好ましい実施態様では、免疫亢進性組成物は局所的、腫瘍付近あるいはワクチン接種しようとする局所的ウイルス蓄積場に適用する。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、免疫応答はＴ細胞応答であり、抗原に対するＴ細胞応答が亢進される。特定の実施態様では、Ｔ細胞応答は細胞障害性Ｔ細胞応答であり、抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答が亢進される。本発明の他の実施態様では、免疫応答はＢ細胞応答であり、抗原に対するＢ細胞応答が亢進される。
また、本発明は、薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とともに免疫学的に有効な量の本発明の免疫亢進性組成物を含むワクチンに関する。また、本発明は、免疫学的に有効な量の開示されたワクチンを動物に投与することを含む、動物の免疫化及び／又は治療の方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰを、改変したＶＬＰに結合又は混合した抗原に対して動物又はヒトのワクチン接種に用いる。改変型ＶＬＰを使用して、たとえば、腫瘍、ウイルス性疾患、あるいは自己分子に対してワクチン接種することができる。ワクチン接種は、予防又は治療目的、あるいはその両方であってよい。さらに、改変型ＶＬＰを使用して、アレルギーあるいは喘息などのアレルギー関連疾患に対するワクチン接種をして、アレルゲンに対する免疫偏向及び／又は抗体応答を誘導することができる。そして、そのようなワクチン接種と治療それぞれにより、例えば前記のアレルギー性動物及び患者それぞれの脱感作を引き起こすことができる。
多くの場合、所望の免疫応答は、免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰと結合しているか又は混合している抗原に直接対するものであろう。抗原は、ペプチド、タンパク質又はドメイン、並びにそれらの混合であり得る。
【００１６】
注射の経路は、好ましくは皮下又は筋肉内であるが、ＣｐＧ含有ＶＬＰを皮内、鼻腔内、静脈内あるいはリンパ節に直接用いることもできる。同様に好ましい実施態様では、抗原と混合又は結合したＣｐＧ含有ＶＬＰを局所的、腫瘍付近あるいはワクチン接種しようとする局所的ウイルス蓄積場に適用する。
前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載はいずれも例示的及び解説的なものであり、権利を主張する本発明を更に解説することを意図するものである。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等あるいは均等である任意の方法および物質を、本発明を実施又は試験する際に使用することができ、好ましい方法および物質は、本明細書で以下に記載する。
【００１８】
１．定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」、又は本明細書中で単に「リンカー」と呼ばれるものは、抗原又は抗原決定基を第２の付着部位と会合させるか、あるいは、必ずしもではないが典型的には、１つのアミノ酸残基として、より好ましくはシステイン残基として、既に第２の付着部位からなっているか、あるいはそれを含むことがより好ましい。しかしながら、本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを、示すことを目的とするものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明内に含まれる。このような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を好ましくは含み、任意のアミノ酸を欠いているリンカーも、本発明内に含まれるものとする。抗原又は抗原決定基、又は場合によっては第２の付着部位と、アミノ酸リンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００１９】
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫、および蛛形網を含むことを意味する。
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープ又は抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体およびそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬ又はＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類および哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つ又は複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の組成物はアレルギーの治療のためのワクチンの構築に使用しうる。ＩｇＥイソ型の抗体はアレルギー反応の重要な成分である。肥満細胞がその表面上でＩｇＥ抗体と結合し、肥満細胞表面上に結合したＩｇＥ分子への特定の抗原が結合するとヒスタミン及びアレルギー反応の他のメディエータが放出される。ゆえに、ＩｇＥ抗体産生を抑制すると標的がアレルギーに対して防御する。これは所望のＴヘルパー細胞応答を起こすことによって可能となる。Ｔヘルパー細胞応答はタイプ１（ＴＨ１）とタイプ２（ＴＨ２）のＴヘルパー細胞応答に分類することができる(Romagnani, Immunol. Today 18:263-266 (1997))。ＴＨ１細胞はＢ細胞がＩｇＧ抗体を産生する誘因となるインターフェロンγ及び他のサイトカインを分泌する。対照的に、ＴＨ２細胞によって産生される重要なサイトカインはＢ細胞にＩｇＥを産生させるＩＬ−４である。多くの実験系では、ＴＨ１細胞がＴＨ２細胞の誘導を抑制し、逆の場合も同じなので、ＴＨ１及びＴＨ２の応答の発生は相互に限定的なものある。ゆえに、同時に強いＴＨ１応答を引き起こす抗原はＴＨ２応答の発生とその後のＩｇＥ抗体の産生を抑制する。高濃度のＩｇＧ抗体により、ＩｇＥを結合する肥満細胞へのアレルゲンの結合が阻害され、それによってヒスタミンの放出が抑制される。ゆえに、ＩｇＧ抗体がＩｇＥ媒介性アレルギー反応を防御する。アレルギーの原因となる典型的な物質には、限定するものではないが：花粉（例えば草、ブタクサ、カバノキ又は山スギ）；ハウスダストおよび塵ダニ；哺乳類の表皮のアレルゲンおよび動物の垢；糸状菌および真菌類；昆虫体および昆虫毒物；羽毛；食物；及び、薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。Shough, H. ら., REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第19版, (82章), Mack Publishing Company, Mack Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995)を参照し、出典明記によりここにその内容全体が組み込まれる。ゆえに、非メチル化ＣＧモチーフ内にパッケージ化された豊富なＤＮＡを含むウイルス様粒子と混合したアレルゲンを用いて個体を免疫化するとアレルギー発生前だけでなくその後も利点がある。
【００２１】
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、及び／又は、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことが示されることを意味する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【００２２】
本明細書で使用する「微生物抗原」という用語は、微生物の抗原であり、感染ウイルス、感染細菌、寄生虫および感染真菌だけには限られないが、これらを含む。このような抗原には、無傷微生物、および天然単離体およびその断片、さらに、天然微生物抗原と同一であるか類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する、合成又は組み換え化合物がある。化合物は、それが免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘導する場合、天然微生物抗原と類似している。このような抗原は当分野では日常的に使用され、当業者によく知られている。
ここで用いる微生物抗原である感染性ウイルス、細菌及び感染性糸状菌の例はＷＯ０３／０２４４８１（２３頁最後の段落から２５頁３段落目まで）に記載されており、出典明記によりその開示がここに組み込まれる。
【００２３】
本発明の組成物および方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することによって、癌を治療するためにも有用である。本明細書で使用する「腫瘍抗原」は、腫瘍又は癌と関係があり免疫応答を誘発することができる、ペプチドなどの化合物である。特に、ＭＨＣ分子の概念で提示されるとき、化合物は免疫応答を誘発することができる。腫瘍抗原は、たとえばCohen他、Cancer Research、54:1055(1994)中に記載されたのと同様に、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、あるいは知られている抗原の新規合成によって、癌細胞から作製することができる。腫瘍抗原は、腫瘍又は癌ポリペプチド全体であるかあるいはその抗原部分である、抗原を含む。このような抗原は、組み換えによって、あるいは当分野で知られている任意の他の手段によって、単離又は作製することができる。癌又は腫瘍には、胆管癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛上皮腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、（たとえば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌、並びに他の癌腫および肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００２４】
また、アレルゲンは脊椎動物では抗原として作用する。ここで「アレルゲン」なる用語は、「アレルゲン抽出物」及び「アレルゲンのエピトープ」も包含する。アレルゲンの例として、限定するものではないが：花粉（例えば草、ブタクサ、カバノキ又は山スギ）；ハウスダストおよび塵ダニ；哺乳類の表皮のアレルゲンおよび動物の垢；糸状菌および真菌類；昆虫体および昆虫毒物；羽毛；食物；及び、薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。
抗原決定基：ここで用いる「抗原決定基」なる用語は、Ｂ又はＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。抗原決定基に応答したＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は細胞性免疫及び／又は体液性免疫の媒介に重要なエフェクター機能の核酸や構築によって抗原決定基に応答する。
【００２５】
抗原掲示細胞：本明細書で使用するように、「抗原提示細胞」という用語は、免疫賦活能力を有する異種群の白血球、又は骨髄由来細胞を指すことを意味する。たとえば、これらの細胞は、Ｔ細胞によって認識することができるＭＨＣ分子と結合するペプチドを、生成することができる。この用語は、用語「補助細胞」と同義であり、たとえばランゲルハンス細胞、指状突起細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを含む。いくつかの条件下では、上皮細胞、内皮細胞、および他の非骨髄由来細胞も、抗原提示細胞として働くことができる。
会合(association)：ここで用いる第一および第二の付着部位に適用する際の「会合」なる用語は、好ましくは少なくとも一非ペプチド結合によるものである第一付着部位と第二付着部位の結合を指す。会合の性質は共有性、イオン性、疎水性、極性、又はこれらの何れかの組合せであってよく、好ましくは会合の性質は共有性であり、更により好ましくは会合は少なくとも一、好ましくは一つの非ペプチド結合を介する。ここで用いる第一及び第二の付着部位に適用する際の「会合」なる用語は、本発明の組成物を形成する第一付着部位と第二付着部位の直接結合又は会合を包含するだけでなく、場合によって好ましくは、本発明の組成物となる第一付着部位と第二付着部位の直接会合又は結合をも包含するものであり、この結果典型的に及び好ましくは異種二機能性架橋によるものである。
【００２６】
第１の付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、典型的かつ好ましくはウイルス様粒子により含まれる、典型的かつ好ましくは抗原又は抗原決定基により含まれる第二付着部位が会合しうる非天然又は天然起源の要素を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリ核酸、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又はこれらの化学反応基であってよい。第一付着部位は、典型的かつ好ましくは、ウイルス様粒子の表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上に存在する。好ましくは、第一付着部位がアミノ酸又はその化学的反応基である。
【００２７】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、ウイルス様粒子の表面上に位置する第一付着部位が会合することができる、抗原又は抗原決定基と関係がある、典型的かつ好ましくはそれにより含まれる要素を指す。第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又はこれらの化学反応基であってよい。少なくとも１つの第二付着部位が、抗原又は抗原決定基上に存在する。したがって、「少なくとも１つの第二付着部位を有する抗原又は抗原決定基」なる用語は、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基および第二付着部位を含む、抗原又は抗原構築体を指す。しかしながら、特に、非天然起源である、すなわち抗原又は抗原決定基中に本来存在しない第二付着部位に関しては、これらの抗原又は抗原構築体は、「アミノ酸リンカー」を含む。
【００２８】
結合(bound)：本発明で用いる「結合」なる用語は、共有、たとえば本発明の免疫賦活性核酸のウイルス様粒子への化学的結合による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。この用語は、物質の封入、又は部分的封入も含む。「結合」なる用語は、「連結(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、および「付着(attached)」などより広義であり、これらを含む。さらに、ウイルス様粒子を結合した免疫賦活性物質に関して、「結合」なる用語も免疫賦活性物質の封入又は部分的封入を含む。ゆえに、ウイルス様粒子に結合した免疫賦活性核酸に関して、「結合」なる用語は「連結(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、「パッケージ化」および「付着(attached)」などより広義であり、これらを含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性核酸を、単に「パッケージする」ともいわれるオリゴヌクレオチドが保持されるように、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。
【００２９】
連結(coupled)：ここで用いる「連結」なる用語は、共有結合による、あるいは強力な非共有的相互作用による付着、典型的かつ好ましくは共有結合による付着を指す。さらに、抗原のウイルス様粒子への結合に関して「連結」なる用語は、好ましくはそれぞれ少なくとも一つの非ペプチド結合による会合及び付着を意味する。生物学的に活性がある物質を連結させるために、当業者により通常使用されている任意の方法を、本発明において使用することができる。
融合(fusion)：ここで用いる「融合」なる用語は、コード化ヌクレオチド配列をイン・フレームで組み合わせることによる、一つのポリペプチド中の異なる起源のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」なる用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入、さらにその末端の一端への融合を明確に含む。
【００３０】
ＣｐＧ：ここで用いる「ＣｐＧ」なる用語は、少なくとも一の非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（たとえば、シトシンの次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧ-オリゴヌクレオチド」又はＤＮＡ）を含み、脊椎動物骨髄由来細胞によるサイトカイン発現を刺激する／活性化する、たとえばそれに対する促進効果を有する、あるいはそれを誘導するか増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。たとえばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞、たとえば、樹状細胞、単球およびマクロファージなどの活性化において、有用であることができる。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、たとえば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
【００３１】
コート・タンパク質：ここで用いる「コート・タンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、「ＣＰ」なる用語を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱｂの「コート・タンパク質」は、「ＱβＣＰ」並びにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコート・タンパク質は、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
【００３２】
エピトープ：ここで用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒト中で、抗原又は免疫活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的一部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子の関係でそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。ここで用いる「免疫原生エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002(1983)を参照のこと）、動物の抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原性エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞レセプターによって免疫特異的に結合させることができる。
【００３３】
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約５個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約８〜１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。
免疫応答：本明細書で使用するように、「免疫応答」なる用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化又は増殖をもたらす、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つ又は複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される作用剤を指す。「免疫原性ポリペプチド」は、アジュバントの存在下又は不在下で、単独あるいは担体と結び付いて、細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導するポリペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞は活性化されてもよい。
【００３４】
免疫化：本明細書で使用するように、「免疫化する」又は「免疫化」なる用語、又は関連用語は、標的抗原又はエピトープに対する、十分な免疫応答（抗体及び／又は細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む）を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基本レベルより大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞及び／又は体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫化することができると考えられる。
【００３５】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる核酸を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてよい。前述したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」なる用語は、４−ブロモ−シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
【００３６】
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」なる用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる物質を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活物質は、ｔｏｌｌ様レセプター(toll-like receptor)活性化物質およびサイトカイン分泌誘導物質だけには限られないが、これらを含む。Ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質は、免疫賦活性核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、および免疫賦活有機分子、たとえばタクソールなどだけには限られないが、これらを含む。
混合(mixed)：ここで用いる「混合」なる用語は、ともに添加される、互いに化学的に結合しない、さらに分離することができる二以上の物質、成分又はヨウ素の混合を意味する。
【００３７】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」なる用語は、２個以上のヌクレオチド、一般に少なくとも約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」なる用語は、１００以上〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００以上〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００以上〜約５００個のヌクレオチドを含む核酸配列も指す。「オリゴヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドも指し、これは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。該修飾は骨格又はヌクレオチド類似体を含んでもよい。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には、二本鎖又は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を、非制限的に含む。さらに「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡを含む三本鎖領域を指す。さらにオリゴヌクレオチドは、合成、ゲノム又は組み換え、たとえばλ−ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体、および糸状ファージ、たとえばＭ１３などであってよい。
【００３８】
また、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、１つ又は複数の修飾体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、および安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。たとえば、適切なヌクレオチド修飾体／類似体には、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化塩基、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、５−メチルデオキシシトシン、および５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジンがある。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされてきており、したがって、「オリゴヌクレオチド」は、化学的に、酵素によって、あるいは代謝によって修飾された形のポリヌクレオチド、自然界に典型的に見られるもの、およびウイルスおよび細胞に特有の化学形のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。
【００３９】
パッケージ化：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰと関係がある免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸の状態を指す。本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的連結による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を含む。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。「パッケージ化」なる用語は「連結」および「付着」などの用語を含み、また特に好ましくは、「パッケージ化」なる用語は物質の封入、又は部分的封入も含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。ゆえに、「パッケージ化」なる用語を意味する場合、特に、免疫賦活性核酸が免疫賦活物質である場合、「パッケージ化」という用語は、パッケージ化された状態の核酸が、ＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅによる加水分解に曝されないことを示す。好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸は、ＶＬＰキャプシド中に、最も好ましくは非共有方式でパッケージ化されている。
【００４０】
ＰＣＲ産物：ここで用いる「ＰＣＲ産物」なる用語は、ＰＣＲの開始材料である標的ＤＮＡ配列の増幅されたコピーを指す。標的配列は、例えば二本鎖ＤＮＡを含みうる。ＰＣＲのためのＤＮＡは「ｃＤＮＡ」ともいわれる相補的ＤＮＡを起源とするものであり、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡの転換産物であり得る。ＰＣＲのためのＤＮＡ源は細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり得る。ＰＣＲのためにＤＮＡを抽出した細胞源は、限定するものではなく、血液試料；ヒト、動物又は植物組織；糸状菌；及び細菌由来のものを含む。ＰＣＲの開始材料であるＤＮＡは未精製、ある程度精製もしくは高度に精製されうる。ＰＣＲのためのＤＮＡ源は、限定するものではなく、プラスミドベクター及びバクテリオファージベクターを含むベクター内にクローン化された挿入物（インサート）由来でもよい。「ＰＣＲ産物」なる用語は、「ポリメラーゼ連鎖反応産物」と置き換え可能である。
【００４１】
本発明の組成物は、場合によっては薬剤として許容可能な担体と組み合わせることができる。本明細書で使用するように、「薬学的に受容可能な担体」なる用語は、ヒト又は他の動物に投与するのに適した、１つ又は複数の適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又は被包性物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分と組み合わせて施用を容易にする、有機又は無機成分、天然又は合成物を示す。
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドも指すことを目的とする。組み換え体又は誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
【００４２】
免疫応答を「高める」物質は、その物質を加えることによって、その物質を加えずに測定した同じ免疫応答と比較して、より高まった、あるいは増大した、あるいは任意の方向に偏向した免疫応答が観察される物質を指す。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、たとえばこの物質ありおよびなしで５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。これは、この物質なしのＣＴＬ溶菌活性と比較して、ＣＴＬ溶菌活性が高まる物質の量が、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分量であると言える。好ましい実施態様では、免疫応答は、少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上高まる。分泌するサイトカインの量又はそのタイプも、変わる可能性がある。あるいは、誘導された抗体の量又はそれらのサブクラスが変更するかもしれない。
【００４３】
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」なる用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは十分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により常套法にて決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するのに有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露により抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であると思われる。この用語は、「十分量」とも同義である。
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患又は状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／又は疾患又は状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００４４】
Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド：ここで用いる「Ｔｏｌｌ様レセプターリガンド」なる用語は、少なくとも一のＴＬＲを活性化することができる任意のリガンドを指す(例としてBeutler, B. 2002, Curr. Opin. Hematol., 9, 2-10, Schwarzら., 2003, Eur.J.Immunol., 33, 1465-1470を参照)。本発明のＴＬＲリガンドは、限定しないが、少なくとも一のｔｏｌｌ様レセプター１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、又はＴＬＲ１１を活性化する。例えば、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）又はリポテイコ酸（ＬＴＡ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ２を活性化し(Aliprantisら., Science (1999), 285:736-9；Underhill, ら., Nature, (1999), 401:811-5)；ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ３を活性化し(Alexopoulou ら., Nature (2001), 413:732-8)；リポ多糖類（ＬＰＳ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ４を活性化し(Poltorak, ら., Science (1998), 282:2085-8)；フラゲリンは典型的かつ好ましくはＴＬＲ５を活性化し(Hayashiら. Nature (2001), 410:1099-103)；バクテリアＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ及びイミダゾキノリン(imidazoquinoline)などのある種の合成物質は典型的かつ好ましくはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を活性化し(Diebold S.ら. Science 303:1529；Heil, FH.ら. Science 303:1526)；バクテリアＤＮＡ、特にＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ９を活性化する(Schnareら. Curr. Biol. (2000), 10:1139-42；Hemmi H ら. Nature (2000), 408: 740-5)。ここに挙げた論文は出典明記によりここに組み込まれる。ＴＬＲリガンドの概要は、Abreuの論文の表に挙げられており、出典明記によりここに組み込まれ(Abreu M.T.及びArditi M. J., Pediatrics (2004), 421-9)、ＴＬＲ１１とそのリガンドについての参考文献はZhangら., Science, (2004), 303:1522-6に記載されている。当業者の一般的な知識とともにこれら組み込まれる論文を参照すると、ある分子が本発明に基づくＴＬＲリガンドであるかどうか、ＴＬＲリガンドが少なくとも一のＴＬＲを活性化するかどうかを試験することは常套法の範囲内である。そのような試験の典型的かつ好ましい例は以下の通りである：３×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に１μｇのＴＬＲ発現プラスミドと２０ｎｇのＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポータープラスミドを２００ボルトで９６０μＦにて電気穿孔法を行う。適当な空の発現ベクターを添加することによって一度の電気穿孔につき全量のプラスミドＤＮＡを１５μｇに保つ。１ウェルあたり１０５個の細胞をまき、一晩培養した後、試験すべきリガンドにてさらに７〜１０時間刺激する。公知のＴＬＲリガンドの濃度範囲は、典型的な例として２５μｇ／ｍｌ ＲＮＡ４０−４２とＤＯＴＡＰの複合体（ＲＮＡの細胞内への内部移行を促進する）、１μＭ ＣｐＧ−ＯＤＮ２００６、１０μＭ Ｒ−８４８、５０μｇ／ｍｌ ポリ（Ｉ：Ｃ）、又は１μｇ／ｍｌ Ｐａｍ３Ｃｙｓである(Heil, FH.ら. Science 303:1526)。刺激した細胞をレポーター溶解バッファ(Promega, Mannheim, Germany)を用いて溶解し、製造者の指示書にしたがって照度計、典型的かつ好ましくはBerthold照度計(Wildbad, Germany)を用いて溶解物のルシフェラーゼ活性を評価する。これは当業者の知識の範囲内であり、したがって任意のリガンドの試験のための前述の実験を適用する。
【００４５】
ついで、誘導されたルシフェラーゼ活性がネガティブ対照（試験すべきリガンドを添加しないで同じ条件で行った同じ実験）の活性より測定される閾値より統計学的に顕著に高い場合、本発明に関するＴＬＲを活性化すると考えられる。ここで閾値は、６つの別々の実験と６つの実験から３度求めたルシフェラーゼ活性の標準偏差により定義される。ついで、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように決定された閾値より高い場合、典型的かつ好ましくは「統計学的に顕著に」ＴＬＲを活性化すると考えられる。好ましくは、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように決定された閾値より少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍高い場合、リガンドは「統計学的に顕著に」ＴＬＲを活性化すると考えられる。
典型的かつ好ましくは、本発明の免疫賦活性核酸がＴＬＲを活性化する場合、本発明のＴＬＲリガンド（ｄ）は免疫賦活性核酸により活性化されるＴＬＲとは異なるＴＬＲを活性化する。例えば、免疫賦活性核酸がＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧであるならば、しかして本発明の組成物のＴＬＲリガンド（ｄ）と第二ＴＬＲリガンドはＴＬＲ９以外の何れかのＴＬＲである第二ＴＬＲ、例えばＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１を活性化する。一方、例えば、免疫賦活性核酸がＴＬＲ３のリガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）であるならば、しかして本発明の組成物のＴＬＲリガンド（ｄ）と第二ＴＬＲリガンドはＴＬＲ３以外の何れかのＴＬＲである第二ＴＬＲ、と例えばＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０又は１１を活性化する。
【００４６】
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）リガンド：ＴＬＲ４リガンドはＴＬＲ４依存性様式で細胞内にシグナル伝達をすることができる。典型的かつ好ましい例として、ＬＰＳ及びその誘導体、ｇｐ９６、熱タンパク質及びデフェンシンである。好ましいＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳ及び例えば脂質Ａテールの側鎖を欠如した解毒化したＬＰＳなどの誘導体(Persingら., (2002), Trends Microbiol., 10 (10 Suppl), 32-37)、例としてMPL、モノリン酸化脂質Ａ及びその誘導体(Johnsonら., (1999), J Med Chem., 42(22), 4640-4649)、又は化学的に変更したＬＰＳ及びＬＰＳの合成類似体(Fernandesら, (1997), 34 (8-9) 569-576；Przetakら, (2003), 21, 961-970)である。ここに挙げたすべての参考文献は出典明記によりここに組み込まれる。本発明の好ましいＬＰＳ誘導体、例としてＬＰＳの解毒化した型、化学的に変更した又は合成したＬＰＳ類似体は、当業者に公知のウサギを用いた発熱試験の対象となる。典型的かつ好ましくは、好適なＬＰＳ誘導体はウサギの発熱試験で有意差を示さない。
【００４７】
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」なる用語は、宿主のゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質と、宿主のゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指し、自己として定義する。好ましくはここで用いる「自己抗原」なる用語は、ヒトのゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質と、ヒトのゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指し、自己として定義する。自己抗原を含む本発明の組成物、薬剤組成物及びワクチンは特に、宿主に適用する場合自己抗原に対する認容性を破壊する。ここで、「自己抗原に対する認容性を破壊する」とは、宿主への自己抗原を含む本発明の組成物、薬剤組成物及びワクチンを適応したときに自己抗原特異的にここで定義するような免疫応答、好ましくはＢ又はＴ細胞応答を亢進することを指す。さらに、２つ又は数個の分子の組合せから生じるタンパク質、又は自己分子の画分であるタンパク質、および前に定義した２つの自己分子と高い相同性（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質も、自己とみなすことができる。本発明の他の好ましい実施態様では、抗原は自己抗原である。本発明に関して有用な、自己抗原の非常に好ましい実施態様は、ＷＯ０２／０５６９０５に記載されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【００４８】
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、又は「治療している」なる用語は、予防及び／又は療法を指す。感染病に関して使用するとき、たとえば、この用語は、病原体による感染に対する被験者の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被験者が病原体によって感染するか、あるいは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、および感染と戦うため、たとえば感染を低下させるか除外するため、あるいは感染が悪化するのを防ぐための、被験者が感染した後の治療を指す。
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁又は溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、これだけに限らないが、抗体及び／又はサイトカインの生成、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞応答を含む免疫応答を誘発することができる。
【００４９】
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に比較して少量又は多量で存在することができる、アジュバントをさらに含む。本明細書で使用するように、「アジュバント」なる用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、又は宿主中でデポー作用を生み出すことができる物質を指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層免疫応答の増強が与えられる。さまざまなアジュバントを使用することができる。その例には、不完全フロイント・アジュバント、水酸化アルミニウム、および改変型ムラミルジペプチドがある。
ウイルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）なる用語は、ウイルスに似ているが、病原性であることは証明されていない構造を指す。典型的には、本発明のウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウイルス様粒子はウイルス・ゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウイルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。一般的に、本発明のウイルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウイルス・ゲノムのすべて又は一部、特にウイルス・ゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、又はＲＮＡファージのウイルス・キャプシドなどの、ウイルス・キャプシドである。本明細書で互換的に使用する、「ウイルス・キャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウイルス・タンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウイルス・キャプシドおよびキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状又は管状である。たとえば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、「キャプシド様構造」なる用語は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが十分な程度の状態および反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
【００５０】
ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージ・コート・タンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰは、たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を邪魔するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じるＱβＣＰサブユニット（配列番号１）（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９〜１５（１９９６）を参照のこと）であり、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニット（配列番号２）をさらに含んでもよい。リードスルーな工程は効率が低く、ＶＬＰ中にほんのわずかな量のＡ１タンパク質しかない。パッケージ化ＩＳＳと連結した抗原の異なる組み合わせを用いて多くの数の実験が行われている。ＱβＣＰサブユニットから限局的に集積したＱβコートタンパク質のＶＬＰ、又はキャプシド内にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰを用いる場合、連結効率とパッケージ化効率に違いは観察されなかった。さらに、ＱβＶＬＰ調整物間に免疫応答の違いも観察されなかった。ゆえに、明確にするために「ＱβＶＬＰ」なる用語はＱβＣＰサブユニットから限局的に集積したＱβコートタンパク質のＶＬＰ又はキャプシド内にＡ１タンパク質をさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰ何れの実施例についての記載全体を通して用いる。
【００５１】
本明細書で使用するように、「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態を指す。いくつかのウイルス型では、ウイルスはタンパク質キャプシドに囲まれたゲノムを含み、他のウイルスは追加的な構造（たとえば、エンベロープ、尾部など）を有する。
非エンベロープ・ウイルス粒子は、ウイルス・ゲノムを囲み保護するタンパク質キャプシドでできている。エンベロープで覆われたウイルスは、ウイルスの遺伝物質を囲むキャプシド構造も有するが、さらに、キャプシドを囲む脂質二重層エンベロープを有する。
本発明の好ましい実施態様では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープ又はリポタンパク質含有エンベロープを含まない。更なる好ましい実施態様では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００５２】
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施態様は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核および真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく発見することができる（たとえば、Sambrook, J.他, eds.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL, 2nd.edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)；Ausubel,F.他, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H.Wiley & Sons,Inc.(1997)）。組織培養細胞系を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法（Cells,J.,ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998)）、および抗体系の技術（Harlow,E.and Lane,D., 「Antibodies:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988)；Deutscher,M.P., 「Guide to Protein Purification」Meth.Enzymol.128, Academic Press San Diego(1990)；Scopes,R.K., 「Protein Purification Principles and Practice」3rd ed., SpringerVerlag, New York(1994)）も文献中に十分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
【００５３】
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示する本発明は、動物の１つ又は複数の抗原に対する、免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）ウイルス様粒子、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含む、あるいは選択的にこれらからなる。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。さらに、本発明によって実践者は、例えば、感染病並びに慢性感染病の予防及び／又は治療、癌の予防及び／又は治療、喘息などのアレルギー又はアレルギー関連疾患の予防及び／又は治療を含む様々な治療及び／又は予防目的の、このような組成物を都合よく構築することができる。
【００５４】
本出願に述べるウイルス様粒子は、ＷＯ０３／０２４４８１の３９〜５９頁に詳述されているＶＬＰを指し、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。ＶＬＰの例には、限定するものではないが、Ｂ型肝炎ウイルス、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、及び特にＱβ−ファージが含まれる。より特定の実施態様では、ＶＬＰは、組み換えポリペプチド、又はその断片を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれらからなる。好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、本質的にこれらからなるか、あるいは選択的にこれらからなる。好ましくは、ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；ｌ）バクテリオファージＰＰ７；及びｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されることが好ましい。本発明の更に好ましい実施態様では、組み換えタンパク質はＲＮＡファージのコートタンパク質を含むか、実質的にそれらからなるか、あるいは選択的にそれらからなる。
【００５５】
本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体的な好ましい例には、ＷＯ０３／０２４４８１（４１頁最終段落〜４９頁第２段落）に詳細に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれ、バクテリオファージＱβ（ＰＩＲデータベース、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、および受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＲ１７（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４はＳＰＣＰを指し、および受託番号ＮＰ６９５０２６はＳＰＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＭＳ２（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号３）、バクテリオファージＡＰ２０５（配列番号３２又は３３）などのＲＮＡバクテリオファージのコート・タンパク質が含まれる。
【００５６】
４個のリシン残基が、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの表面上で露出している。露出したリシン残基がアルギニンによって置換されている、Ｑβ変異体も、本発明用に使用することができる。したがって、以下のＱβコート・タンパク質変異体、および変異体Ｑβ ＶＬＰを、本発明を実施する際に使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号４）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号５）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号６）、「Ｑβ−２５１」（配列番号７）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号８）。したがって、本発明の他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβコート・タンパク質の組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、あるいは選択的にこれらからなり、ウイルス様粒子は、ａ）配列番号４のアミノ酸配列；ｂ）配列番号５のアミノ酸配列；ｃ）配列番号６のアミノ酸配列；ｄ）配列番号７のアミノ酸配列；およびｅ）配列番号８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。前述したＱβコート・タンパク質、変異体Ｑβコート・タンパク質ＶＬＰおよびキャプシドそれぞれの構築、発現および精製は、ＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。
【００５７】
更に、本発明は上記したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいは選択的にこれから実質的になるか、あるいは選択的にこれからなるタンパク質を含む組成物を包含する。免疫応答を誘導する能力を保持するＶＬＰの断片は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個のアミノ酸長のポリペプチドであるが、ＶＬＰを含むサブユニットの配列の長さに明らかに依存するポリペプチドを含むか、あるいは選択的にこれらからなっていてよい。このような断片の例は、免疫応答促進組成物を調製するのに適した、本明細書で論じるタンパク質の断片を含む。
前述したように、本発明は、ウイルス様粒子又はそれに由来する組み換え体を含む。当業者は、このような粒子を生成させ抗原をそれに混合させる知識を有している。他の例を示すことによって、本明細書において本発明は、ウイルス様粒子としてのＢ型肝炎ウイルス様粒子の生成を提供する（実施例１）。
【００５８】
一実施態様では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、又はＨＢｃＡｇの断片から構成されており、これが改変されて、遊離システイン残基の数がなくなっているかあるいは減少している。例えば、配列番号９に示すＨＢｃＡｇ又はその変異体などのＨＢｃＡｇタンパク質であり、本発明の組成物を調整するのに用いることができるＨＢｃＡｇタンパク質の具体的な好ましい例には、ＷＯ０３／０２４４８１（５２頁第４段落〜５８頁最終段落）に詳細に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。本発明に用いることができるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、例えばＷＯ００／３２２２７の特に実施例１７〜１９及び２１〜２４、並びにＷＯ０１／８５２０８の特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１及び４１、及びＷＯ０２／０５６９０５に開示されている。後者の出願は特に実施例２３、２４、３１及び５１を指す。３つすべての明細書は出典明記により明確にここに組み込まれる。
【００５９】
本発明を実施する際に使用するのに適した、いくつかの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が同定されてきている（たとえば、Yuan他(J.Virol.73:10122-10128(1999)）。更に、本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇ変異体は、ＷＯ０３／０２４４８１（５４頁第３段落〜５５頁第１段落）に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明で使用するのに適したＨＢｃＡｇは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入、又は結合、又はさもなくば付着することができ、免疫応答を誘導することができる限りは、任意の生物に由来するものであってよい。
【００６０】
本発明のいくつかの実施態様では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドに導入して、抗原又は抗原決定基とＨＢｃＡｇのＶＬＰの結合を仲介させる。好ましい実施態様では、本発明の組成物を、配列番号１０のアミノ酸１〜１４４、又は１〜１４９、１〜１８５を含むか、あるいは選択的にこれらからなるＨＢｃＡｇを用いて調整するものであり、そのＨＢｃＡｇは改変されて、位置７９および８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号３４）を有するペプチドで置換された結果生じた配列番号９６のアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変異体である。更なる好ましい実施態様では、配列番号１０の位置４８および１０７におけるシステイン残基が、セリンに変異する（配列番号３６）。更に本発明は、上述したアミノ酸変異を有するＷＯ０３／０２４４８１（５４頁第３段落〜５５頁第１段落）に示すアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含む組成物を含む。更には、キャプシド又はＶＬＰを形成するために結合することができ、上記アミノ酸の変異を有する付加的なＨＢｃＡｇも本発明の範囲内である。したがって、本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されており、前に示した変更によって改変されている、これらのタンパク質を形成するアミノ酸配列を含むか、あるいは選択的にこれらからなる、ＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、組成物をさらに含む。
【００６１】
本発明の一態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが結合したウイルス様粒子は、亢進した免疫応答が望まれる抗原／免疫源と連結又は混合している。ある場合では、単一抗原がそのように変更されたウイルス様粒子と連結又は混合するであろう。他の場合では、そのように変更したＶＬＰは他の抗原や更なる複合抗原混合と連結又は混合する。抗原は組み換えして産生するか天然源から抽出することができ、その天然源には限定するものではないが、花粉、塵、真菌類、昆虫、食物、哺乳類の表皮、羽毛、ミツバチ、腫瘍、病原体及び羽毛が含まれる。
本発明の一実施態様では、少なくとも一の免疫賦活性核酸、好ましくは少なくとも一の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと、ＶＬＰに連結又は融合するかＶＬＰと混合した抗原と、少なくとも一のＴＬＲリガンドを含有するＶＬＰを含んでなる組成物を添加した物質は、ＴＬＲの活性、典型的かつ好ましくは本発明の免疫賦活性核酸によって活性化されない第二ＴＬＲの活性を誘発することができる。
【００６２】
一実施態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。好ましくは、免疫賦活性核酸（ｂ）はリガンド（ｄ）により活性化されるＴＬＲと異なるＴＬＲを活性化する。
【００６３】
ＴＬＲは、免疫系による自己／非自己識別のための鍵であるとよく記載されるパターン認識分子である。今日までに１０個のヒトｔｏｌｌ様レセプタが知られている。それらは種々のリガンドによって活性化される。ＴＬＲ２は、ペプチドグリカン、リポタンパク、リポポリサッカリド、リポテイコ酸およびザイモサン、およびマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ-２によって活性化される；ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡによって活性化する；ＴＬＲ４は、リポポリサッカリド、リポテイコ酸およびタキソール、および熱ショックタンパク質ＨＳＰ-６０、Ｇｐ９６およびデフェンシンなどの熱ショックタンパク質によって活性化される；ＴＬＲ５は、細菌鞭毛、特にフラゲリンタンパク質によって活性化される；ＴＬＲ６はペプチドグリカンによって活性化され、ＴＬＲ７はイミキモド(imiquimoid)およびイミダゾキノリン化合物、例えばＲ―848、ロキソリビン(loxoribine)およびブロピリミン(bropirimine)によって活性化され、ＴＬＲ９は細菌ＤＮＡ、特にＣｐＧ-オリゴヌクレオチドによって活性化される。ＴＬＲ１、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１０およびＴＬＲ１１のリガンドは今までに知られていない。しかしながら、最近の報告により、同じレセプタが異なるリガンドと反応することができること、更にレセプタが存在することが示される。リガンドの上記リストは網羅的なものではなく、更にリガンドは当業者の知識の範囲内である。一般に、ＴＬＲの誘因により抗原提示細胞（ＡＰＣ）が活性化される。したがって、ＴＬＲｓの誘因によりＡＰＣの活性化によって、Ｔ細胞応答が亢進されるかもしれない。本発明において、発明者は、異なるＴＬＲの刺激により相乗的応答が引き起こされるという驚くべき発見をした。具体的には、ＶＬＰ内にパッケージ化されたＣｐＧによるＴＬＲ９の刺激は、ＬＰＳ又は他のＴＬＲ４リガンドによるＴＬＲ４の刺激と相乗作用するかもしれない。したがって、好ましい実施態様では、ＣｐＧによりＴＬＲ９に付加的に刺激されたＴＬＲは、ＴＬＲ4であってもよい。ＴＬＲ４について様々なリガンドが知られている。それらはＬＰＳを含み、ＬＰＳはＴＬＲ４の天然リガンドである。加えて、例えばリピドＡ尾部の側鎖を欠いているＬＰＳの解毒された型はまた、ＴＬＲ４の強力な活性化因子である。モノスホリルリピドＡ及びその誘導体は当分野において周知である。好適な誘導体は、３ｄｅ-ｏ-アシル化モノリン酸化リピドＡであって、英国特許番号２２２０２１１から知られている。ＴＬＲ４を刺激する能力にもかかわらず、これらの非天然リガンドは、相対的に非中毒性であるため、ワクチン製剤におけるＴＬＲ４刺激のための好適な物質である(Curr Drug Targets Infect Disord. 2001 Nov;1(3):273-86.)。近年では、ＴＬＲリガンドのファミリは、熱ショックタンパク質(J Biol Chem. 2002 Apr 26;277(17): 15107-12.)及びデフェンシン(Science. 2002 Nov 1;298(5595): 1025-9.)を含むように範囲が広がっている。ゆえに、デフェンシンおよび熱ショックタンパク質もまたこの発明の範囲内である。
【００６４】
一実施態様では、本発明の組成物における免疫賦活性核酸が、（ａ）リボ核酸；（ｂ）デオキシリボ核酸；（ｃ）キメラ核酸；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも何れか一の核酸の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸がポリ-（Ｉ：Ｃ）である。他の実施態様では、免疫賦活性核酸が免疫賦活性核酸が、（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；及び（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは本発明の免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
２クラスの核酸、すなわち１）免疫賦活性配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特定の隣接塩基内の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）、および２）さまざまな型のウイルスによって合成される二本鎖ＲＮＡが、免疫応答を高める細菌成分中の重要な構成要素である。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）などの合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、樹状細胞に前炎症性サイトカインの生成を誘導させ、高レベルの共賦活分子を発現させることができる。
【００６５】
TokunagaおよびYamamotoらによる一連の研究によって、細菌ＤＮＡ又は合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ヒトＰＢＭＣおよびマウス脾臓細胞を誘発して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を生成させることが示されている（Yamamotoら、Springer Semin Immunopathol.22:11-19中に概説されている）。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、本来はＩ型ＩＦＮの強力な誘導物質として合成されたが、ＩＬ−１２などの他のサイトカインも誘導する。
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン−ポリシチジル酸の二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）を含む。リボ核酸およびその修飾体、およびそれらを生成するための方法は、Levy、H.B(Methods Enzymol.1981、78:242-251)、DeClercq,E(Methods Enzymol.1981、78:227-236)、およびTorrence,P.F.(Methods Enzymol 1981;78:326-331)、およびその中の参照によって記載されている。更なる好適なリボ核酸は、二本の鎖が二本鎖ＲＮＡを形成しているポリ（ＩＣ）などイノシン酸およびシチジル酸のポリヌクレオチドを含む。リボ核酸は、生物から単離することができる。リボ核酸は、他の合成リボ核酸、特に合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドも含み、これらはリン酸ジエステル骨格の修飾によって、特にホスホロチオエートの修飾によって、ヌクレアーゼ耐性になっている。他の好ましい実施態様では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格が、デオキシリボースによって置換されている。当業者は、合成オリゴヌクレオチドの合成の仕方の手順を知っている。
【００６６】
一般的に、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む。さらにオリゴヌクレオチドは、約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチドを含むことができる。さらにオリゴヌクレオチドは、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含むことができる。
好ましい実施態様では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格の１つ又は複数のホスホチオエステル修飾体を含む。たとえば、リン酸骨格の１つ又は複数のリン酸の修飾体を有するか、あるいは修飾されたリン酸骨格のすべてを有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および１個、数個、あるいはすべてのヌクレオチドのリン酸骨格の修飾体が、ホスホロチオエート修飾体であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。
【００６７】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組み換え体、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、および一本又は二本鎖であってもよい。本発明において使用するために、当分野でよく知られているいくつかの手順のいずれかを使用して、核酸を新たに合成することができる。たとえば、ｂ−シアノエチル・ホスホアミダイト法（Beaucage,S.L.,and Caruthers,M.H.、Tet.Let.22:1859(1981)；ヌクレオシドＨ−リン酸法(Gareggら、Tet.Let.27:4051-4054(1986)；Froehlerら、Nucl.Acid.Res.14:5399-5407(1986)；Gareggら、Tet.Let.27:4055-4058(1986)、Gaffneyら、Tet.Let.29:2619-2622(1988))。これらの化学的方法は、市場で入手可能なさまざまな自動式オリゴヌクレオチド合成装置によって、実施することができる。あるいは、ＣｐＧをプラスミド中において大規模で生成させることができ(Sambrook,T.ら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor laboratory Press、New York、1989を参照のこと）、これは被験者に投与された後にオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、知られている技法、制限酵素、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して、既存の核酸配列（たとえば、ゲノム又はｃＤＮＡ）から作製することができる。
【００６８】
免疫賦活性核酸、並びに非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、当分野で知られている任意の方法によってＶＬＰに結合することができ、その組成物は動物の免疫応答を高めるものとする。たとえば、オリゴヌクレオチドは、共有的又は非共有的に結合することができる。さらに、ＶＬＰは、完全あるいは部分的に、免疫賦活性核酸並びに非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入することができる。免疫賦活性核酸、および非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合部位（本来存在するもの又は本来存在しないもの）、ＤＮＡ結合部位、又はＲＮＡ結合部位などのＶＬＰ部位に結合することができることが好ましい。他の実施態様では、ＶＬＰ部位はアルギニンリッチリピート又はリジンリッチリピートを含む。本発明の免疫賦活性核酸を本発明のＶＬＰ、例えばＨＢｃＡｇ、ＲＮＡファージＱβ又はＡＰ２０５にパッケージ化する方法は、当分野で公知であり、ＷＯ０３／０２４４８１（特に実施例１１〜１７）に記載されており、その開示はその全体が出典明記によりここに組み込まれる。
【００６９】
本発明の組成物の１つの具体的な使用は、抗原に対する特定の免疫応答を高める目的で、樹状細胞を活性化させることである。樹状細胞は、エキソビボ又はインビボの技法を使用して、亢進することができる。エキソビボの手順を、自己又は異種細胞に使用することができるが、自己細胞に使用することが好ましい。好ましい実施態様では、樹状細胞を末梢血液又は骨髄から単離するが、これは樹状細胞の任意の源から単離することができる。癌の免疫療法の目的での、樹状細胞のエキソビボでの操作は、Engleman,E.G., Cytotechnology 25:1(1997)；Van Schooten,W.ら, Molecular Medicine Today, June, 255(1997)；Steinman,R.M., Experimental Hematology 24:849(1996)；及びGluckman,J.C., Cytokines,Cellular and Molecular Therapy 3:187(1997)を含めた、当分野のいくつかの参照文献に記載されてきている。
樹状細胞を、インビボでの方法を使用して、本発明の組成物と接触させることもできる。これを実施するために、ＣｐＧを、抗原に連結又は抗原と混合したＶＬＰと付加的なＴＬＲリガンドとを組み合わせて、免疫療法を必要とする被験者に直接投与する。いくつかの実施態様では、ＶＬＰ／ＣｐＧを腫瘍の局所領域に投与することが好ましく、当分野で知られている任意の方法、たとえば腫瘍への直接的な注射によって、これを実施することができる。
【００７０】
本発明の更なるとても好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる。後者はインビトロで血液細胞を刺激することができるということがすでに明らかとなった(Kuramoto E.ら., Japanese Journal Cancer Research 83, 1128-1131 (1992)。
本発明の他の好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部である。好ましくは、前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である。他の好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列が、１０以下のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接しており、好ましくは、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である。更なる好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってそのＮ末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってそのＣ末端に隣接する。これら本発明の免疫賦活性核酸はＶＬＰ内にとても効率よくパッケージ化されることが思いがけなく明らかとなった。この結果、パッケージ化する能力は、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）を１０のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接して有する対応する免疫賦活性核酸と比較して亢進された。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）を含むか、あるいは選択的にそれから実質的になるか、あるいは選択的にそれからなるものであり、該パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
本発明の更にとても好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４０）；及び主としてここではＧ３−６と略す、（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４１）；及び主としてここではＧ４−６と略す、（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；及び主としてここではＧ５−６と略す、（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４３）；及び主としてここではＧ６−６と略す、（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４４）；及び主としてここではＧ７−７と略す、（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４５）；及び主としてここではＧ８−８と略す、（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４６）；及び主としてここではＧ９−９と略す、及び（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４７）及び主としてここではＧ６と略す、からなる群から選択される核酸配列を有する。
【００７２】
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が少なくとも４及び多くとも９のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が少なくとも５及び多くとも８のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも８グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
【００７３】
実験的データにより、パリンドローム配列がより少ないグアノシン自体により隣接する場合、好適な本発明の免疫賦活性核酸、すなわちパリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が１０以下のグアノシン自体によってその３’末端及び５’末端に隣接しているグアノシン隣接、パリンドローム配列及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをＶＬＰ内にパッケージ化する場合が増加する。しかしながら、パリンドローム配列を隣接するグアノシン自体の数が少なくなると、インビトロの血液細胞の刺激が減少する。ゆえに、パッケージ化能は示した本発明の免疫賦活性核酸の生物学的活性の減少による。ゆえに好適な実施態様は、パッケージ化能と生物学的活性とが調和されている。
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化が配列番号４５の核酸配列を持つ、すなわち免疫賦活性核酸がＧ８−８である。
【００７４】
本発明の特に好ましい実施態様では、本組成物は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）少なくとも一の免疫賦活性核酸、（ｃ）少なくとも一の抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含み、該免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドであり、該ＴＬＲのリガンドがＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０及び１１からなる群から選択した少なくとも一のＴＬＲを活性化する。
本発明の更なる特に好ましい実施態様では、本組成物は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）少なくとも一の免疫賦活性核酸、（ｃ）少なくとも一の抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含み、該免疫賦活性核酸（ｂ）がポリ（Ｉ：Ｃ）であり、該リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のリガンドであり、該ＴＬＲのリガンドがＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択した少なくとも一のＴＬＲを活性化する。
【００７５】
更に本発明の組成物は、変更したウイルス様粒子と混合した又は連結した抗原ないし抗原決定基を含む。本発明は、所望の治療効果を考慮して選択された抗原ないし抗原決定基によって異なる組成物を提供する。本発明の使用に適する抗原又は抗原決定基はＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８及びＷＯ０２／０５６９０５に開示されており、その開示内容は出典明記によりその全体がここに組み込まれる。
抗原は公知又はまだ知られていない起源の任意の抗原でよい。それは感受性のある患者にアレルギー反応を引き起こすことが知られているバクテリア；ウイルス又は他の病原体；腫瘍；又は、木、草、雑草、植物、真菌類、糸状菌、塵ダニ、食物又は動物から単離することができる。あるいは、抗原は好適なコード化核酸の発現から得られる組み換え抗原であり得る。好ましい実施態様では、抗原は組み換え抗原である。もちろん、抗原の選択は所望する免疫学的応答と宿主に依存する。
【００７６】
本発明は広く多種の抗原に適用できる。好ましい実施態様では、抗原はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。
本発明の抗原は、以下の：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｂ）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｄ）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；および（ｅ）ポリペプチドに天然に存在する糖鎖、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）で述べた何れかのポリペプチドの断片（たとえば、ドメイン）からなる群から選択することができる。
好ましい抗原には、病原体（たとえば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌）由来の抗原、および腫瘍由来の抗原（特に腫瘍関連抗原、すなわち「腫瘍マーカー」）及びアレルゲンがある。他の好ましい抗原は、自己抗原(それぞれautoantigen、self antigen)である。
いくつかの実施例では、ペプチドｐ３３を含むＶＬＰを用いた。ペプチドｐ３３を含むＶＬＰはその便利さゆえのみにより用いたのであり、野生型のＶＬＰを更に本発明に用いることができることを注記する。ペプチドｐ３３はリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に由来した。ｐ３３ペプチドはもっとも適するＣＴＬエピトープの一つを表出している。ｐ３３特異的Ｔ細胞はトランスジェニックマウスに致死的な糖尿病を引き起こすことが示されている(Speiserら., J. Exp. Med. 186:645 (1997))。ゆえに、この特異的エピトープは特に自己免疫、腫瘍免疫学並びにウイルス性疾患の研究によく適する。
【００７７】
本発明の一特異的実施態様では、抗原又は抗原決定基は感染性疾患の予防に有用なものである。このような処置は、例としてヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種又は非哺乳動物種も同様に広く影響する非常に様々な感染性疾患の治療に有用であろう。感染性疾患は当業者によく知られており、その例には、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、イプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘、パピローマウイルスなどのウイルス病因の感染症；または、肺炎、結核、梅毒などの細菌病因の感染症；又は、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの寄生虫病因の感染症が含まれる。ゆえに、本発明の組成物に選択された抗原又は抗原決定基は医学の分野でよく知られているものであり；抗原又は抗原決定基には、以下の：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０およびｇｐ１６０；インフルエンザ抗原血球凝集素、Ｍ２タンパク質およびノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原又はマラリアのスポロゾイト周囲タンパク質又はそれらの断片を含む。
上記のように、抗原には、天然源由来の又は合成したウイルス、細菌及び真菌などの感染性微生物及びその断片が含まれる。
【００７８】
ウイルスなどの感染性微生物、脊椎動物の抗原であり、本発明の組成物の使用に用いることができるＲＮＡウイルスの例、又は例示的ＤＮＡウイルスは、例としてＷＯ０３／０２４４８１（特に８６〜８９頁）に記載されており、その開示は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の特定の実施態様では、抗原は一以上の細胞障害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、又は細胞障害性Ｔ細胞エピトープとＴｈ細胞エピトープの組み合わせを含む。
ヒトの抗原特異的免疫応答を亢進するために、好ましい実施態様の方法は、他の哺乳動物又は他の動物、例として雌鶏、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラおよびキジなどの鳥の治療に特によく適している。鳥は、多くのタイプの感染症の第一標的である。本発明の組成物に用いることができる抗原の他の例はＷＯ０３／０２４４８１（９０〜９３頁）に記載されている。
【００７９】
本発明の他の態様では、「自己」遺伝子産物（例として、腫瘍壊死因子）が原因となる又は悪化する疾患ないし症状を予防する及び／又は寛解する方法に用いるのに適したワクチン組成物を提供する。ゆえに、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物が原因となる又は悪化する疾患ないし症状を予防及び／又は寛解する抗体の産生を引き起こす組成物を含む。このような疾患ないし症状の例には、移植片対宿主病、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸窮迫症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン性リンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増生病、リンパ節腫脹（ＩＰＬ）、血管免疫増生性リンパ節腫脹（ＡＩＬ）、免疫芽細胞性リンパ節腫脹（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病および骨粗鬆症芽含まれる。
関連する特定の実施態様では、本発明の組成物はアレルギー、癌又は薬剤中毒の治療及び／又は予防のために用いることができる。
【００８０】
組成物の調整及びアレルギー治療の方法に用いるための抗原ないし抗原決定基の選択は、このような疾患を治療する医学分野の技術者に公知であろう。そのような抗原ないし抗原決定基の代表例には以下の：蜂毒ホスホリパーゼＡ２；Ａｍｂ ａ １（ブタクサ花粉アレルゲン）、Ｂｅｔ ｖ I（カバノキ花粉アレルゲン）；５Ｄｏｌ ｍ Ｖ（白色顔クロスズメバチ(white-faced hornet)毒物アレルゲン）；Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２及びＤｅｒ ２（イエダニアレルゲン）；Ｌｅｐ ｄ ２（塵ダニアレルゲン）；Ａｌｔ １、Ａｓｐ ｆ １、及びＡｓｐ ｆ １６（真菌類アレルゲン）；Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２及びＡｒａ ｈ３（ピーナッツアレルゲン）、並びに免疫学応答を誘発するために用いることができるそれぞれの断片が含まれる。さらに、本発明は花粉抽出物又は蜂毒などの有機体又は有機体の一部から単離したアレルゲン混合物の使用に特に有用である。
【００８１】
好ましい実施態様では、花粉抽出物は樹木、草、雑草および栽培植物を含むか、あるいは選択的にこれからなる。樹木花粉抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：アカシア、ハンノキ（灰色）、アーモンド、リンゴ、アプリコット、小脳活樹(arbor vitae)、トネリコ、ポプラ(aspen)、ヤマモモ、ブナノキ、カバノキ（春季）、カバノキ（白）、ボトルブラッシュ、トネリコバカエデ、イナゴマメ木、スギ、限定するものでなく日本スギを含む、サクランボ、クリ、ハコヤナギ、イトスギ、ニワトコの木、ニレ（アメリカ）、ユーカリノキ、モミ、エノキ、ヘイゼルナッツ、ヘムロック(hemlock)、ヒッコリ、アサダ、鉄木、ビャクシン、イナゴ、カエデ、コバノブラッシノキ(melaleuca)、メスキート、バイカウツギ、クワ、オーク（白）、オリーブ、オレンジ、オーセージ・オレンジ(osage orang)、パロ・バーデ(palo verde)、桃、西洋ナシ、ペカン、コショウの木、松、プラム、ポプラ、イボタノキ、アメリカスギ材、ホソバグミ、トウヒ、モミジバフウ、スズカケノキ、アメリカカラマツ、神樹、クルミおよびヤナギを含む。草花粉抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：バヒア(bahia)、オオムギ、浜辺の雑草、カヤツリ草、バミューダ草、ブルーグラス（ケンタッキー）、スズメノチャヒキ、バンチ(brome)、カナリアクサヨシ、チェス(chess)、とうもろこし、ウシノケグサ（草原）、グラーマグラス、ジョンソン(johnson)、ジューン(johnson)草、コエラー(koeler's)、オート麦、カモガヤ、インチキ草(quack)、コヌカグサ、ライ麦草（多年草）、塩(salt)、モロコシ、スーダングラス、甘い芽生えの草(sweet vernal grass)、オオアワガエリ、ベルベットグラス(velvetgrass)、小麦およびホイートグラスを含む。雑草及び栽培植物抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：アルファルファ、アマランス、シナギク、ホウセンカ根、バッシア(bassia)、浜辺イガ、花をつける雑草(broomwood)、バローブッシュ(burrow bush)、ケアレス雑草、トウゴマ、ｃｈａｍｉｓｅ、クローバ、オナモミ、ハルシャギク、コスモス、スイセン、ダリア、デイジー、タンポポ、ギシギシ(dock)、カミルレモドキ、焼け跡に生える雑草、グラジオラス、アキノキリンソウ、グリースウッド、アサ、スイカズラ、ホップ、イオドンブッシュ(iodone bush)、エルサレムオーク、コキア、子羊のクォータース(lamb's quarters)、ユリ、マリゴールド、キンセンカ(marshelder)、メキシコのお茶、ヨモギ、マスタード、イラクサ(nettle)、ピックルウィード(pickleweed)、アカザ、未加工緑のバナナ（イギリス）、ポピー、貧窮状態の雑草(povertyweed)、ウズラ草(quailbush)、ブタクサ（巨大なもの）、ブタクサ（短いもの）、ブタクサ（西洋のもの）、バラ、ラッシャンシスル、よもぎ、ソルトブラッシュ(saltbrush)、鱗屑、エニシダ、マツナ、ヒメスイバ、キンギョソウ、テンサイ、ヒマワリ、西洋の水麻、ウィンターファット(winter fat)、駆虫草、ヨモギを含む。
【００８２】
好ましい実施態様では、花粉抽出物はライ麦を含むか、あるいは選択的にそれからなる。
ブタクサ花粉の季節的な出現（９月〜１０月）は、多くの個体において喘息を誘発する(Marshall, J.ら., J. Allergy Clin. Immunol.108: 191-197 (2001))。喘息は、肺炎症、可逆気流閉塞および気道過敏反応によって特徴づけられる。空気アレルゲンに対する免疫学的応答の複合的カスケードにより気道の白血球が漸増する。具体的には、リンパ球、マクロファージ、好酸球、好中球、プラズマ細胞およびマスト細胞は、気管支の粘膜に浸透する(Redman, T.ら., Exp. Lung Res. 27: 433-451 (2001))。好酸球漸増は、ＴＨ２サイトカインＩＬ―4およびＩＬ―5の産生増加と関連しており、慢性の炎症性過程を起こす喘息病因における重要な要因である(Justice, J.ら., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282: L302-L309 (2002)、その内容全体が出典明記によりここに組み込まれる。短いブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)の免疫主体ブタクサアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １である (Santeliz, J.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 109:455-462 (2002))。本発明の特定の実施態様では、組成物は、ウイルス様粒子と混合した又は連結したＡｍｂ ａ １を含む。
さらに他の好ましい実施態様では、塵抽出物は、ハウスダストおよび塵ダニを含むか、あるいは選択的にそれよりなる。ハウスダストの例には、限定するものではなく：ハウスダスト、マットレス塵およびupholstrey塵を含む。塵ダニの例には、限定するものでなく、コナヒョウヒダニ(D. farniae)、ヤケヒョウヒダニ(D. ptreronysiinus)、ダニ混合物およびサヤアシニクダニ(L. destructor)を含む。塵抽出物もまた、限定するものでなく、スギおよびベイスギ粉塵、綿繰り機塵、オーク粉、穀物（昇降機）の粉末、パドック(paduk)塵および木材の塵を含む。
【００８３】
粉塵ダニは、先進諸国の湿潤な気候の家の長期に存在する屋内のアレルゲンの重要な出所である(Arlian, L., Current Allergy and Asthma Reports I: 581-586 (2001))。全てのアレルギー性気管支喘息患者の約６０〜８５％は、ハウスダストダニであるヤケヒョウヒダニ(Dermatophogoldes pteronyssinus)に対して感受性が高い(Arlian, L., Current Allergy and Asthma Reports I: 581-586 (2001))。免疫主体ヤケヒョウヒダニ(D. pteronyssinus)粉塵ダニアレルゲンにはＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２及びＤｅｒ ２が含まれ（Kircher, M.ら., J. Allergy Clin. Immunol.109: 517-523 (2002)及びClarke, A.ら., Int. Arch. Allergy Immunol. 120:126-134 (1999)、その内容の全体は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明の特定の実施態様では、組成物がウイルス様粒子に連結又は混合したＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ２又はその断片、あるいはその抗原性部位の混合を含む。粉塵に対するアレルギー反応の重要な原因は、特に農業地域において、サヤアシニクダニ(Lepidoglyphus destructor)である(Ericksson, T.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001))。免疫優性サヤアシニクダニ粉塵ダニアレルゲンは、Ｌｅｐ ｄ ２である (Ericksson, T.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001))。本発明の特定の実施態様では、組成物は、ウイルス様粒子に連結した又はウイルス様粒子と混合したＬｅｐ ｄ ２を含む。
【００８４】
好ましい実施態様では、真菌類抽出物は、アルタナリア、コウジカビ、ボトリティス、カンジダ、セファロスポリウム、セファロセシウム(cephalothecium)、ケトミウム、クラドスポリウム、クリトコッカス(crytococcus)、カルバラリア、エピコッカム、エピデルモフィトン、フザリウム、ゲラシノスポラ(gelasinospora)、ゲオトリクム、グリオクラジウム(gliocladium)、ヘルミント スポリウム、ホルモデンドラム(hormodendrum), ミクロスポラム(microsporium)、ムコール、マイコゴン(mycogone)、ニグロスポラ(nigraspora)、パエキロミケス(paecilomyces)、ペニシリウム、フォーマ(phoma)、プルラリア(pullularia)、リゾプス、ロドトルラ、ルスツ(rusts)、サッカロマイセス、スムツ(smuts)、スポンディロクラジウム(spondylocladium)、ステムフィリウム(trichoderma)、トリコフィトン及びバーティシリウムを含むか、あるいは選択的にこれからなる。
アルテルナリア・アルテルナータは、米国で最も重要な真菌原因アレルギー疾患の一つと考えられている。アルテルナリアは米国及びオーストラリアの砂漠地域での主な喘息関連アレルゲンであり、米国ミッドウェスト地域で深刻な呼吸停止と死を引き起こすことが報告されている（Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001)及びShampain, M.ら., Am. Rev. Respir. Dis. 126:493-498 (1982)、その内容の全体が出典明記により本明細書中に組み込まれる）。免疫主体アルテルナリア・アルテルナータ抗原はＡｌｔ ａ １である(Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001))。アルテルナリア感受性個体の８０％以上はＡｌｔ ａ １に対してＩｇＥ抗体を持つ(Vailes, L.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1891-1895 (2001))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合したＡｌｔ ａ １を含む。
【００８５】
他の日和見性真菌類はアスペルギルス・フミガタスであり、その真菌はアレルギー性喘息を含む肺疾患の広域抗菌スペクトルに関与する。免疫主体アスペルギルス・フミガタステストは、Ａｓｐ ｆ １と、Ａｓｐ ｆ １６とを含む(Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合したＡｓｐ ｆ １又はＡｓｐ ｆ １６又はその抗原の混合を含む。
他の好ましい実施態様では、昆虫抽出物には、全身にアレルギー性反応を誘発する刺す虫、毒物タンパク質がアレルギー性反応を誘発する刺す虫、及び吸入してアレルギー性反応を誘発する昆虫を含むか、あるいは選択的にこれからなる。限定するものではないが、全身にアレルギー性反応を誘発する刺す虫の例として、アリ（黒）、アリ（赤）、アリ（カーペンター）、アリ混合（黒／赤）、アリ（ファイア）が含まれる。限定するものではないが、毒物タンパク質がアレルギー性反応を誘発する刺す虫の例には、蜂蜜ミツバチ、黄色のスズメバチ(yellow hornet)、スズメバチ(wasp)、ホホナガスズメバチ(yellow jacket)、クロスズメバチ(white-faced hornet)および混合スズメバチが含まれる。限定するものではないが、吸入してアレルギー性反応を誘発する昆虫の例には、アブラムシ、黒色のハエ、チョウ、トビケラ、セミ／イナゴ、コオロギ、ゴキブリ、ミジンコ、シギアブ、ショウジョウバエ、蜂蜜ミツバチ（全身）、アブ、イエバエ、ヨコバイ、トビケラ、メキシコの豆ゾウムシ、ダニ（粉塵）、蚊、ガ、キノコハエ、ラセンウジバエ、ワラジムシ、クモ、及び、ミジンコ科が含まれる。
【００８６】
他の好ましい実施態様では、食物抽出物は動物製品及び植物製品を含むか、あるいは選択的にこれからなる。
限定するものではないが、動物製品の例には、牛肉、ニワトリ、シカ、カモ、卵（ニワトリ）、魚、ヤギ、ガチョウ、ラム、牛乳（ウシ）、牛乳（ヤギ）、豚肉、ウサギ、甲殻類およびシチメンチョウが含まれる。限定するものではないが、植物製品の例には、リンゴ、アプリコット、クズウコン、アーティチョーク、アスパラガス、アボガド、バナナ、豆、ビート、ベリー類、キャベツ科、ニンジン、セロリ、サクランボ、チョコレート、柑橘類果実、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、ナツメヤシ、ナス、穀物、ブドウ、グリーン、ゴム、ホップ、レタス、麦芽、マンゴー、メロン、キノコ、ナッツ類、オクラ、オリーブ、タマネギ、パパイア、通称サトウニンジン、エンドウ、南京豆、西洋ナシ、ピーマン、パイナップル、プラム、ジャガイモ、プルーン、西洋カボチャ、ラディッシュ、ダイオウ、香辛料／調味料、ホウレンソウ、カボチャ、タピオカ、お茶、トマト、スイカおよび酵母が含まれる。
【００８７】
９５％以上のピーナッツアレルギー患者に感知される２つの主なアレルギーピーナッツタンパク質は、Ａｒａ ｈ １とＡｒａ ｈ ２である(Bannon, G.,ら., Int. Arch. Allergy Immunol. 124:70-72 (2001)及びLi, X.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000)、この内容の全体は出典明記により本明細書中に組み込まれる）。Ａｒａ ｈ ３は約４５％のピーナッツアレルギー患者に感知される(Li, X.,ら., J Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合した抗原Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２又はＡｒａ ｈ ３又はその抗原の混合を含む。
【００８８】
他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、哺乳動物上皮性アレルゲンには、ラクダ、ネコ体毛、ネコの毛皮、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、スナネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ブタ、ウマ、アンゴラ山羊の毛（モヘア）、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）が含まれる。更に他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、羽毛にはカナリア、ニワトリ、カモ、ガチョウ、インコ、ハト、シチメンチョウが含まれる。他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、他の吸入物質には、アカシア、藻類、ヒマの実、木綿リンター、綿実、デリス、シダ胞子、穀物粉塵、アサ繊維、ヘンナ、亜麻仁、ガーゴム、ジュート、インドゴム、カポック、革、リコポジウム、オリス根、ジョチュウギク、絹（生）、サイザル麻、タバコの葉、トラガカントゴムおよび木材の粉塵が含まれる。
他の好ましい実施態様では、一般的に定義された哺乳動物のアレルゲンは、天然源から生成したもの又は組み換え発現させたものの何れかを含む。限定するものではないが、これらには、ネコからのＦｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ３（シスタチン）、及び、ネコ、ラクダ、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、スナネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ブタ、ウマ、アンゴラ山羊の毛、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）からのアルブミンが含まれる。
【００８９】
癌を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われ（参照により組み込まれている、Renkvist他、Cancer.Immunol.Immunother.50:3-15(2001)を参照のこと）、このような抗原又は抗原決定基は本発明の範囲内に含まれる。このような型の抗原又は抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経こう腫）；ＣＥＡ（延髄甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００エピトープ、例としてアミノ酸１５４−１６２（配列：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ、配列番号１４）、２０９−２１７（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ、配列番号１５）、２８０−２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ、配列番号１６）、４５７−４６６（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ、配列番号１７）および４７６−４８５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ、配列番号１８）など；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ、例としてアミノ酸２６−３５（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号３７）、２６−３５ＡＬ（ＥＬＡＧＩＧＩＣＴＶ、配列番号３８）、２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１９）、および３２−４０（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ、配列番号２０）など；チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質（たとえば、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）；チロシナーゼ・エピトープ、例としてアミノ酸１−９（ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ、配列番号２１）および３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、配列番号２２）など；ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質；ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質エピトープ、例としてアミノ酸３８−６４（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ、配列番号２３）など；ＭＡＧＥ−３タンパク質；ＭＡＧＥ−３タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、配列番号２４）など；他のヒト腫瘍抗原、たとえばＣＥＡエピトープ、例としてアミノ酸５７１−５７９（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ、配列番号２５）など；ｐ５３タンパク質；ｐ５３タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸６５−７３（ＲＭＰＥＡＡＰＰＶ、配列番号２６）、１４９−１５７（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ、配列番号２７）および２６４−２７２（ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ、配列番号２８）など；Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープ、例としてアミノ酸３６９−３７７（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ、配列番号２９）および６５４−６６２（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ、配列番号３０）など；ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質；ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸８６−９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ、配列番号３１）など；およびそれぞれの断片又は変異体があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【００９０】
自己抗原と関連がある他の疾患又は状態を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択も、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原又は抗原決定基の代表的な例は、たとえばリンフォトキシン（たとえば、リンフォトキシンα（ＬＴα）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ）、およびリンフォトキシン受容体、核因子ｋａｐｐａＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ）、破骨細胞関連レセプター（ＯＳＣＡＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン１７およびアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｒａｎｋ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、オンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、エンドグリン、エオタキシン、グレーリン、ＢＬＣ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ブラジキニン、レジスチン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、ＧＩＨ、ＣＲＨ、ＴＲＨおよびガストリン、およびそれぞれの断片であり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【００９１】
本発明の特定の実施態様では、抗原又は抗原決定基は（ａ）ＨＩＶの組み換えポリペプチド；（ｂ）インフルエンザ・ウイルスの組み換えポリペプチド（たとえば、インフルエンザ・ウイルスＭ２ポリペプチド又はその断片）；（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組み換えポリペプチド；（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えポリペプチド；（ｅ）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａの組み換えポリペプチド；（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組み換えポリペプチド；（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの組み換えポリペプチド；（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅの組み換えポリペプチド；（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅの組み換えポリペプチド；（ｊ）乳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｋ）腎臓癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｌ）前立腺癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｍ）皮膚癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｎ）脳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｏ）白血病細胞の組み換えポリペプチド；（ｐ）組み換えプロファイル；（ｑ）ハチ刺されアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｒ）ナッツ・アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｓ）花粉の組み換えポリペプチド；（ｔ）室内埃の組み換えポリペプチド；（ｕ）ネコ又はネコの毛アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｖ）食物アレルギーの組み換えタンパク質；（ｗ）喘息の組み換えタンパク質；（ｘ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの組み換えタンパク質；（ｙ）（ａ−ｘ）に挙げた何れかのタンパク質源から抽出した抗原；および（ｚ）（ａ）〜（ｘ）に挙げた何れかのタンパク質の断片からなる群から選択される。
【００９２】
本発明の他の実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージ化したウイルス様粒子と連結あるいは混合した抗原は、細胞障害性又はＴｈ細胞何れかのＴ細胞エピトープである。本発明の他の実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージ化したウイルス様粒子と連結あるいは混合した抗原は、Ｂ細胞エピトープである。更なる好ましい実施態様では、抗原は、少なくとも２つの、好ましくは異なるエピトープの組み合わせであり、その少なくとも２つのエピトープは直接又はリンカー配列によって連結している。このエピトープは好ましくは細胞障害性及びＴｈ細胞エピトープからなる群から選択される。
本発明の抗原、および特に示した１個又は複数個のエピトープは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、合成、あるいは組み換えによって発現、ウイルス様粒子と結合、あるいはウイルス様粒子と融合することができる。抗原とウイルス様粒子の結合を記載する代表的な手順は、ＷＯ００／３２２２７中、ＷＯ０１／８５２０８中、およびＷＯ０２／０５６９０５中に開示されており、それらの開示は参照によりここに組み込まれている。
【００９３】
また本発明は疾患又は症状を予防する及び／又は寛解するために用いることができるワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫亢進組成物と薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とを含むか、あるいは選択的にそれらからなる。
さらに本発明は動物の疾患又は症状を予防する及び／又は寛解するためのワクチン接種方法を提供する。一実施態様では、本発明は広い範囲の動物種、特にヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの哺乳動物種の感染性疾患を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス病因の感染症、例えばＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、イプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘など；または、細菌病因の感染症、例えば肺炎、結核、梅毒など；または、寄生虫病因の感染症、例えばマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの治療をするために設定することができる。
他の実施態様では、本発明は広い範囲の動物種、特にヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの哺乳動物種の癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、限定するものではないが、リンパ腫、上皮癌、肉腫および黒色腫を含むすべてのタイプの癌を治療するために設定することができる。
【００９４】
当業者は理解されていると思われるが、本発明の組成物を動物に投与するとき、それらは、組成物の有効性を向上させるのに望ましい、塩、バッファー、アジュバント又は他の物質を含む、組成物の形であってよい。薬剤組成物の調製において使用するのに適した物質の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol,A,ed.、Mack Publishing Co.、(1990))を含めた多数の源中に与えられる。
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。さらに、本発明の組成物は、「治療上有効量」（すなわち、望ましい生理学的効果を生み出す量）で投与される。
本発明の組成物は、当分野で知られているさまざまな方法によって投与することができる。選択される個々の形式は、選択される個々の組成物、治療される状態の重度、および治療効果のために必要とされる用量に、当然ながら依存するであろう。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に許容される任意の投与形式、すなわち臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生成する、任意の形式を使用して行うことができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、脳槽内(intracistemal)、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口又は鼻部スプレーとしての投与がある。本明細書で使用する、用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む、投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。
【００９５】
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水）又は非水溶液および懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
付随的に、たとえば混合物として、あるいは別々に、組合せを投与することができるが、一斉にすなわち同時に、あるいは順次に投与することもできる。このことは、組合せ物質が治療用混合物と共に投与されること、および組合せ物質が一斉にではなく別々に、たとえば別の静脈内経路によって同じ個体に投与される手順の表示を含む。「組合せ」投与は、所与の成分又は物質の１つを最初に、次に第２のものを別々に投与することをさらに含む。
用量レベルは、投与形式、被験者の性質、および担体／アジュバント製剤の質に依存する。ＶＬＰ、抗原及びアジュバントの典型的な量は、被験者当たり約０．００１μｇ〜約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、被験者当たり少なくとも約１０μｇ〜約５００μｇである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。抗原の典型的な量はＶＬＰを添加しないで投与するときに典型的に用いる範囲に匹敵するか、同様であるか、同じである。
【００９６】
本組成物は、好都合なことに単位用量の形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。それらの方法は、本発明の組成物と１つ又は複数の追加成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に、これらの組成物は、本発明の組成物を均一かつ完全に、液状担体、微細固形担体、又はこの両方と結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として存在することができ、それぞれが所定量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性の液体又は非水性の液体に懸濁させた懸濁液、シロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含んでよい。このような送達系によって、前に記載した本発明の組成物の繰り返しの投与を避けることができ、被験者および医者に対する利便性が高まる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
本発明の他の実施態様は、本発明の組成物を生成するための方法、および前記組成物を使用する癌およびアレルギーの医学的な治療の方法を含む。
【００９７】
ゆえに、特に本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と連結又は混合した抗原及びＴＬＲリガンドとともに、免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化Ｃ及びＧ（ＣｐＧ）内のＤＮＡオリゴヌクレオチドリッチを負荷した又はパッケージ化したＶＬＰがその抗原に対する免疫応答の亢進を誘導するという発見に関する。驚くことに、ＴＬＲリガンドを組成物に添加するとこの免疫原生は劇的に亢進する。加えて、抗原に対するＴ細胞応答は特にＴｈ１型に関する。
【００９８】
以下の実施例は単なる例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態および変形形態を本発明の方法で作製することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の変更形態および変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、含むことが考えられる。
本明細書で言及するすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全容を参照により明確に組み込んである。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ＶＬＰの生成
ＬＣＭＶ由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇのＤＮＡ配列を、配列番号１２に示す。ｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ）を、以下のように生成させた：Ｂ型肝炎ウイルスの完全なウイルス・ゲノムを含むＢ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。発現プラスミドの生成についてはすでに記載されている（ＷＯ０３／０２４４８１を参照）。
よく発現させるために選択した大腸菌Ｋ８０２のクローンにプラスミドを形質移入し、細胞を増殖させ、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中に再懸濁した。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理の後、４μｌのベンゾナーゼおよび１０ｍＭのＭｇＣ１２を加え、懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みを保持した。
【０１００】
次に、２０％（ｗ／ｖ）（０．２ｇ／ｍｌの溶解物）硫酸アンモニウムを、上澄みに加えた。氷上で３０分間のインキュベーション、および４℃、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを捨て、ペレットを２〜３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍｌのＰＢＳ溶液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテクノロジーＡＧ）に負荷し、画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに負荷し、精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰキャプシドを含む画分を集めた。集めた画分は、ヒドロキシアパタイト・カラムに負荷した。流動物（精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰキャプシドを含む）を回収した。電子顕微鏡法は、標準的なプロトコルに従って行った。代表的な例を、Storni T.,ら.,(2002) J Immunol.; 168(6):2880-6の表１に示す。
ペプチドｐ３３を含むＶＬＰは都合よいという理由でのみ用いたのであって、同様に野生型ＶＬＰは本発明に用いることができるということを注記する。本明細書にわたって、ｐ３３-ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ、ＨＢｃＡｇ-ｐ３３ ＶＬＰ、ｐ３３-ＶＬＰ及びＨＢｃ３３は交換可能に用いた。
【０１０１】
実施例２
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＨＢｃＡｇ ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
実施例１に記載した組み換えＶＬＰに、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）を行い、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質を検出するために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した（図１）。細菌生成ＶＬＰは高レベルの一本鎖ＲＮＡを含み、これはおそらく、ＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端の近くに現れ、Ｘ線結晶解析によって示されるように、形状的にはＶＬＰの内側に位置している、アルギニン反復配列と結合している。混入したＲＮＡは容易に消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅＡをインキュベートすることによって排除することができる。非常に活性があるＲＮａｓｅ Ａ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有しており、おそらく十分小さいので、ＶＬＰに入り望ましくないリボ核酸を排除する。
組み換えＶＬＰに、ＲＮａｓｅ Ａによる消化前に、ＣｐＧ豊富なオリゴヌクレオチド（配列番号１１を参照）を補った。図２に示すように、未処理ｐ３３−ＶＬＰと比較して同じ移動を示すので、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドはキャプシド構造を有している。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド含有ＶＬＰを、透析（３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜を使用して、２４時間、ＰＢＳにて４５００倍希釈）によって、非結合オリゴヌクレオチドから精製した（図３を参照）。
【０１０２】
実施例３
ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅによりＲＮＡを除去し、その後オリゴヌクレオチドをＶＬＰ中にパッケージ化することによって、ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ＶＬＰ（細菌一本鎖ＲＮＡを含み、実施例１に示すように生成した）を、第一には、ＲＮａｓｅ Ａと共にインキュベートしてＲＮＡを除去し、第二のステップでは、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（通常のリン酸ジエステル分子を含むだけでなく、リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体も含む）を、サンプルに補った（図４）。この実験によって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解反応中に必ずしも同時に必要とされるわけではなく、後で加えることができることが明らかに示される。
【０１０３】
実施例４
ＲＮＡｓｅ消化によるＲＮＡバクテリオファージＱｂ内へのＣｐＧオリゴヌクレオチドのパッケージ化
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰをこの実験に用いた。未処理のままかリン骨格のホスホロチオエート修飾体を有するＣｐＧ-２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とパッケージ化した後に用いた。ＣｐＧ-２００６のパッケージ化は、０．２ｍｌの１００ｍＭ ＺｎＳＯ４溶液の存在下にて８ｍｌのＱｂＶＬＰ溶液（２．２ｍｇ／ｍｌ）を６０℃で一晩インキュベーションすることによって行った。この処理によって、ＱｂＶＬＰ内に含まれるＲＮＡの加水分解が行われる。透析チューブ（カットオフＭＷＣＯ３０００００）を用いて２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．５にて透析した後、１ｍｌ ＶＬＰ溶液当たり１３０ｎｍｏｌのＣｐＧ-２００６を添加し、６５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３時間インキュベートした。続いて、１ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にて５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ(Merck)にて３７℃で３時間処理して、上記のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．５にて透析することによって、パッケージ化されなかったＣｐＧ-２００６を除去した。パッケージ化されたＣｐＧ-２００６をアガロースゲル電気泳動を行ってエチジウムブロマイドにて核酸を可視化し、続いてクーマシーブルーにてタンパク質を可視化して、確認した。加えて、パッケージ化ＶＬＰをＴＢＥ尿素ゲルにて分析し、パッケージ化されたＣｐＧ-オリゴヌクレオチドの量を推定した。約６．７ｎｍｏｌのＣｐＧ-２００６が１００μｇのＱｂＶＬＰ内にパッケージ化された。
【０１０４】
実施例５
ＶＬＰ内への免疫賦活性核酸のパッケージ化
ＶＬＰの核酸内容物の分解に関与するＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４
低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＱβ ＶＬＰをＲＮａｓｅＡ処理した。あるいは、実施例１１と同様に低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＡＰ２０５ ＶＬＰをＺｎＳＯ４処理した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,１ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ７．４の何れかにあるＡＰ２０５ ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を５５０ｒｐｍのＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて２．５ｍＭ ＺｎＳＯ４にて５０℃で４８時間処理し、ＡＰ２０５ ＶＬＰ試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を１０．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１２８１１８）を用いてはじめに21２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後一晩透析した。透析後、実施例４に記載のように試料を確認し、上清中のタンパク質濃度をBradford分析によって測定した。
【０１０５】
ＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４処理したＶＬＰ内へのＩＳＳのパッケージ化
ＲＮＡ加水分解及び透析の後、Ｑβ及びＡＰ２０５ ＶＬＰｓ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）をＶＬＰ １ｍｌ当たり１３０μｌのＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＮＫＣｐＧ−表１を参照；Ｇ３−６、Ｇ８−８−表２を参照；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８に含まれる１ｍＭ オリゴヌクレオチド)と混合した。試料を６５０ｒｐｍのサーモシェイカーを用いて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、試料を２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ １ｍｌ当たり125 Uのベンゾナーゼ(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)にて処理し、透析前に３７℃で３時間インキュベートした。試料を３００．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１３１４４７）を用いて２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後同じバッファーにて一晩透析した。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド及びクーマシーブルーにて染色してＶＬＰ内にパッケージ化されたオリゴヌクレオチドを確認した。
【０１０６】
実施例６
ＶＬＰ内にパッケージ化されるリボ核酸
ＶＬＰの核酸内容物のＺｎＳＯ４依存性分解
実施例１１の記載と同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＱβ ＶＬＰをＲＮａｓｅＡ処理した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,１ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ７．４の何れかにあるＡＰ２０５ ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を５５０ｒｐｍのＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて２．５ｍＭ ＺｎＳＯ４にて５０℃で４８時間処理した。Ｑβ及びＡＰ２０５ ＶＬＰ試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、実施例８のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて透析した。
ＺｎＳＯ４処理したＶＬＰ内へのポリ（Ｉ：Ｃ）のパッケージ化
免疫賦活性核酸ポリ（Ｉ：Ｃ）(カタログ番号２７−４７３２−０１、poly(I)・poly(C), Pharmacia Biotech)をＰＢＳ（Invitrogen カタログ番号１４０４０）又は水にて４ｍｇ／ｍｌ（９μＭ）の濃度に溶解した。ポリ（Ｉ：Ｃ）を６０℃で１０分間インキュベートして、３７℃に冷ました。インキュベートしたポリ（Ｉ：Ｃ）をＺｎＳＯ４処理したＱβ又はＡＰ２０５ ＶＬＰ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）何れかに１０倍モル過剰量で添加し、この混合物を６５０ｒｐｍのサーモミキサーにて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、３００ｒｐｍのサーモミキサーを用いて２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ １ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼにて３７℃で３時間インキュベーションすることによって過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を酵素学的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解の後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を３００．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１３１４４７）を用いて21２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後同じバッファーにて一晩透析した。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
パッケージ化は１％アガロースゲル、及びプロテイナーゼＫ消化の後にＴＢＥ／尿素ゲルにて確認した。
【０１０７】
実施例７
ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ内にパッケージ化されるリボ核酸
実施例１１の記載と同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＨＢｃＡｇ ＶＬＰをＺｎＳＯ４処理し、実施例２２のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて透析する。ポリ（Ｉ：Ｃ）を１０倍モル過剰量でＨＢｃＡｇ ＶＬＰ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、実施例２４に記載のように６５０ｒｐｍのサーモミキサーにて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、３００ｒｐｍのサーモミキサーを用いて２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ混合物 １ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼにて３７℃で３時間インキュベーションすることによって過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を酵素学的に加水分解した。実施例４の記載と同様にベンゾナーゼ加水分解の後、試料を確認し、実施例９のように透析する。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０１０８】
実施例８
ＣｐＧのみがｐ３３融合ＨＢｃＡｇ（ｐ３３-ＶＬＰ）に対してＣＴＬ応答を亢進することができる。
ｐ３３-ＶＬＰを以下のように生成した：Ｂ型肝炎ウイルスの完全なウイルス・ゲノムを含むＢ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子を発現ベクターｐＫＫ２２３．３(Amersham Pharmacia Biotech Inc., NJ)のｔａｃプロモータ制御下にあるＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に導入した。標準的ＰＣＲ法によって３つのロイシンリンカーを介してＬＣＭＶ由来のｐ３３ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）（配列番号６０）をＨＢｃＡｇ（ａａ１−１８３）のＣ末端に融合した。大腸菌Ｋ８０２ｄにプラスミドを形質移入し、２リッター培養液にて好適な集密度１（６００ｎｍ波長）になるまで成長させた。最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＣ(Sigma, Division of Fluka AG, Switzerland)を４時間添加することによって細胞を誘導した。ついで、遠心分離によって細菌を回収し、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ７．０）に再懸濁した。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理後、４μｌのベンゾナーゼ(Merck, Darmstadt, Germany)及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を細胞溶解物に添加した。ついで、懸濁液を室温にて３０分インキュベートし、２７０００×ｇにて１５分間遠心分離した。取り出した上清に２０％（ｗ／ｖ）アンモニウム硫酸塩を添加した。氷上にて３０分間インキュベートして４８０００×ｇにて１５分間遠心分離した後の上清を捨て、ペレットを２−３ｍｌのリン酸生理的緩衝液に再懸濁した。この調整物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ゲル濾過カラム(Amersham Pharmacia Biotech Inc., NJ)に負荷して精製した。分画をタンパク質内容物についてＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにて分析し、純粋なＨＢｃキャプシドを含む試料を貯蔵した。常套的なプロトコールに従って電子顕微鏡検査を行った。マウスを種種のＴＬＲリガンド（各１００μｇ）を有するｐ３３ ＶＬＰ（１００μｇ）にて免疫化した（図５参照）：
【０１０９】
ＬＰＳ（大腸菌Ｋ-２３５）をシグマ(Buchs, Switzerland)より、ポリ（Ｉ：Ｃ）をアマシャムバイオサイエンス(Dubendorf, Switzerland)より、ペプチドグリカン（黄色ブドウ球菌(S. aureus)）をＦｌｕｋａ(Buchs, Switzerland)より、, イミクイモダム(Imiquimodum)（AldaraＴＭクリームとして３Ｍ(Ruschlikon, Switzerland)より購入した。リポテイコ酸（黄色ブドウ球菌及び連鎖球菌）はＬＵＮＡＭｅＤ ＡＧ(Zurich, Schwitzerland)より快く提供していただいた。ホスホロチオエート修飾体ＣｐＧ-ＯＤＮはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ(Balgach, Switzerland)により合成した。１２日後、血中のｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって評価した。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Lympholyte-M 溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにて細胞を分析した。
図５は、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧを除いて、多種のＴＬＲリガンドがＢ型肝炎コア抗原に融合したペプチドｐ３３（ｐ３３−ＶＬＰｓ）に対してＴ細胞応答を亢進しないことを示す。ＰＢＳ又はＴＬＲの示した刺激の存在下でｐ３３−ＶＬＰｓにてマウスを免疫化した。１００μｇのＨＢｃ３３と１００μｇのアジュバントを用いた。ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって８日後に評価した。それぞれのバーは個々のマウスを示す。（ＬＴＡ＝リポテイコ酸、ＰＧＮ＝ペプチドグリカン、大腸菌Ｋ−２３５由来のＬＰＳ、Sigma）。
【０１１０】
実施例９
Ａｌｕｍ及びＩＦＡなどの古典的アジュバンドはｐ３３特異的ＣＴＬ応答を亢進しない
常套的プロトコールに従ってＣｙＣｐＧｐｔ（２０ｎｍｏｌ）、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にて１００μｇのｐ３３融合ＨＢｃＡｇ（ｐ３３-ＶＬＰ）でマウスを免疫化して、１２日後、肝臓ＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ）にて負荷試験して、抗ウイルス保護を評価した。５日後、脾臓中のウイルス力価を測定した。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した２％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて脾臓をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＭＣ５７細胞にて力価測定した。１時間のインキュベーション後、５％胎仔ウシ血清、１％メチルセルロース及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を含むＤＭＥＭにて細胞の表面を覆った。３７℃で２時間のインキュベーションの後、細胞内染色手順（ウイルスの各タンパク質を染色する）によって細胞のＬＣＭＶ感染について評価した：細胞を４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した後、１％トリトンＸ-１００にて２０分間溶解を行った。１０％胎仔ウシ血清にて１時間インキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。ラット抗ＬＣＭＶ抗体（ＶＬ-４）にて細胞を１時間染色した。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc)を二次抗体として用いて、標準的な手順に従ってＯＤＰ基質の色素反応を行った（図６）。
図６は、代表的なアジュバントであるＡｌｕｍ及びＩＦＡがＶＬＰ誘導性免疫を亢進しないことを示す。ＰＢＳ、ＣｐＧ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３−ＶＬＰｓでマウスをワクチン処理して、８日後、肝臓ＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ）にて負荷試験した。脾臓中のウイルス力価を５日後に測定した。
【０１１１】
実施例１０
ＴＬＲ４リガンドはＣｐＧを負荷したＶＬＰによって誘導されたＴ細胞応答を亢進する
ペプチドｐ３３をＱｂに連結して、実施例７のようにＣｐＧを負荷した。この実験に用いたＣｐＧはＮＫ ＣｐＧ（ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ）（配列番号５２）である。続いて、ＰＢＳ、ＭＰＬ（Sigma、製造者の指示に従って１：１に混合して用いる）又はＬＰＳ（２０μｇ、大腸菌Ｋ-２３５、Sigma）の存在下にてｐ３３-Ｑｂ／ＣｐＧ（１８０μｇ）にてマウスを免疫化した。１０日後、四量体染色によってｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を測定した（図７Ａ）。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。CellQuestソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてFACSCaliburにて細胞を分析した。
【０１１２】
同日、ＬＣＭＶ-ＧＰ（ペプチドｐ３３由来）を発現する組み換えワクチンウイルスを腹腔内投与することによってマウスを負荷試験し、５日後に卵巣内のウイルス力価を測定した（図７Ｂ）。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した５％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて卵巣をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＢＳＣ４０細胞にて力価測定した。３７℃で一晩インキュベートした後、付着細胞層を、５０％エタノール、２％クリスタル・バイオレット及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液にて染色して、ウイルスプラークを可視化した。
図７は、ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３連結ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３連結Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。８日後、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色（Ａ）によって評価した。同日に、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクチンウイルスにてマウスを負荷試験し、卵巣中のウイルス力価を５日後に測定した（Ｂ）。
【０１１３】
実施例１１
従来のアジュバンドはＣｐＧを負荷したＶＬＰによって誘導されるＴ細胞応答を亢進する
ペプチドｐ３３をＱｂに連結して、実施例２１のようにＣｐＧを負荷した。この実験に用いたＣｐＧはＮＫ ＣｐＧ（ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ）（配列番号５２）、又はＧ１０−ＰＯ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ）（配列番号５４）である。続いて、標準的なプロトコールに従って、ＰＢＳ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３-Ｑｂ／ＣｐＧ（１８０μｇ）にてマウスを免疫化した。１０日後、四量体染色によってｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を測定した。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにて細胞を分析した。
【０１１４】
同日、ＬＣＭＶ-ＧＰ（ペプチドｐ３３由来）を発現する組み換えワクチンウイルスを腹腔内投与することによってマウスを負荷試験し、５日後に卵巣内のウイルス力価を測定した。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した５％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて卵巣をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＢＳＣ４０細胞にて力価測定した。３７℃で一晩インキュベートした後、付着細胞層を、５０％エタノール、２％クリスタル・バイオレット及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液にて染色して、ウイルスプラークを可視化した。
【０１１５】
表１：本明細書にわたって使用したいくつかの免疫賦活性核酸の用語と配列
小文字はホスホロチオエート結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示し、一方で大文字はホスホジエステル結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＲＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えによって生成させたＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２）において、３７℃で２時間インキュベートした。その後これらのサンプルに、６倍濃縮したＤＮＡローディング・バッファー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を添加し、１％の純粋なアガロース・ゲル中に１００ボルトで３０分間展開した。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰに含有されるＲＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。独立した３実験において、同一の結果を得た。
【図２】ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、バッファーのみ又はＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下での、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の前にサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ｐ３３−ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰとＲＮａｓｅ Ａの同時インキュベーション用に使用すると、同一の結果を得た。
【図３】ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でのＲＮａｓｅ Ａによる消化とその後の透析（ＶＬＰ非結合ＣｐＧオリゴヌクレオチドを排除するため）の前後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２から５）において、３７℃で２時間インキュベートした。５０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート結合を含む：レーン２および３、リン酸骨格の正常なリン修飾体を含む：レーン４および５）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の前にＶＬＰに加えた。処理した試料を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜(Spectrum Medical Industries Inc.、Houston、USA)を用いてＰＢＳ（４５００倍希釈）で２４時間かけて十分に透析して、過剰なＤＮＡを排除した（レーン３および５）。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。
【図４】ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ消化が終了した後にのみＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加えた、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の後にのみサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰの再構築に使用すると、同一の結果を得た。
【図５】ＴＬＲ９リガンドＣｐＧを除いて、多種のＴＬＲリガンドがＢ型肝炎コア抗原に融合したペプチドｐ３３（ｐ３３−ＶＬＰｓ）に対するＴ細胞応答を亢進しないことを示す。ＰＢＳ又はＴＬＲの示した刺激の存在下でｐ３３−ＶＬＰｓにてマウスを免疫化した。１００μｇのＨＢｃ３３と１００μｇのアジュバントを用いた。ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって８日後に評価した。それぞれのバーは個々のマウスを示す。（ＬＴＡ＝リポテイコ酸、ＰＧＮ＝ペプチドグリカン、大腸菌Ｋ−２３５由来のＬＰＳ、Sigma）。
【図６】代表的なアジュバントであるＡｌｕｍ及びＩＦＡがＶＬＰ誘導性免疫を亢進しないことを示す。ＰＢＳ、ＣｐＧ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３−ＶＬＰｓでマウスをワクチン処理して、８日後、肝臓ＬＣＭＶにて負荷試験した（２００ｐｆｕ、静脈内）。脾臓中のウイルス力価を５日後に測定した。
【図７Ａ】ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３結合ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３結合Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。８日後、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって評価した。
【図７Ｂ】ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３結合ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３結合Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。（Ａ）と同日に（８日後に）、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクチンウイルスにてマウスを負荷試験し、卵巣中のウイルス力価を５日後に測定した。
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、ワクチン接種学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、免疫賦活性核酸、好ましくは少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧ配列及びｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンドを含むオリゴヌクレオチドをＶＬＰにパッケージ化したウイルス様粒子（ＶＬＰ）に結合又は融合した抗原に対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明を使用して、アレルギー、腫瘍および慢性ウイルス性疾患、並びに他の慢性疾患を治療するのに特に有用な、強力な抗体とＴ細胞応答を誘導することができる。
【０００２】
関連技術
一般的に、自己抗原に対する抗体応答を誘発することは困難である。ワクチン接種の効率を改善する一つの方法は、用いる抗体の反復程度を増やすことである。単離したタンパク質とは異なって、ウイルスはＴ細胞の援助がある時でもないときでも任意のアジュバントの不在下にて即時的な効率のよい免疫応答が誘導される(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991))。ウイルスの多くはわずかなタンパク質からなるにもかかわらず、それらの単離した成分よりもより強い免疫応答の誘因となりうる。Ｂ細胞応答について、ウイルスの免疫厳正の重要な一因子は表面上エピトープの反復と配列であることが知られている。多くのウイルスはＢ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンと効率よく架橋する一定のエピトープ配列を表示する類似の結晶性表面を提示している(Bachmann及びZinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996))。このＢ細胞上の表面免疫グロブリンの架橋は細胞周期の進行及びＩｇＭ抗体の産生を直接的に誘導する強い活性化シグナルである。さらに、このように引き起こされたＢ細胞はヘルパーＴ細胞を活性化することができ、それによって次に、ワクチン接種の目標である、Ｂ細胞でのＩｇＭからＩｇＧ抗体産生の転換と長く残るＢ細胞メモリーの生成が起こる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。ウイルス構造は、自己免疫疾患の抗-抗体の生成と病原体への自然な応答の一部にも関連している(Fehr, T., ら., J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)を参照)。ゆえに、非常に体系化されたウイルス表面によって提示される抗原は抗原に対する強い抗体応答を誘導することができる。
【０００３】
記載したように、通常免疫系は自己由来の構造に対して抗体を生成することはない。低濃度で存在する可溶性抗原はＴｈ細胞レベルでの耐性によるものである。この条件下で、Ｔヘルプを運搬しうる担体に自己抗原を結合すると寛容性が壊れうる。可溶性タンパク質が高濃度であるか膜タンパク質が低濃度であるためにはＢ及びＴｈ細胞が寛容でありうる。しかしながら、Ｂ細胞の寛容性は可逆的（無反応）であり、外来性の担体に結合した非常に体系化された様式の抗体の投与により破壊されうる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。
【０００４】
最近の所見により、パッケージ化ＣｐＧを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）がＶＬＰにコンジュゲートした抗原に対するＴ細胞応答の誘因となることができることが示されている（ＷＯ０３／０２４４８１）。加えて、パッケージ化ＣｐＧはその安定性が亢進し、マウスの脾腫およびリンパ節腫脹を伴う髄外造血を引き起こすなどの上述した副作用を実質的に取り除いた。
ＡＰＣ上にＴＬＲ９を拘束するＣｐＧと対照的に、他のＴＬＲリガンド単独ではＶＬＰ誘発性Ｔ細胞応答を亢進することはない(Schwarzら., (2003) Eur. J. Immunol., 33, 1465-1470)。具体的に、ペプチドグリカン、ＴＬＲ２のリガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３のリガンド、ＬＰＳ、ＴＬＲ４のリガンド、フラゲリン、ＴＬＲ５およびイミクイモード(imiquimode)のリガンド、ＴＬＲ７のリガンドのすべてはＣｐＧと類似の方法でＶＬＰ誘発性ＣＴＬ応答を亢進することはない。
【０００５】
近年ワクチン接種戦略ではめざましい進歩があったが、現行の戦略に必要な改善点が残されている。特に当分野では、深刻な副作用を伴わずにＴ及びＢ細胞の強い応答を引き起こす、とりわけ強いＣＴＬ免疫応答を促進して、天然の病原体と同じくらい効率よく抗病原性防御を与える新規で改良されたワクチンの開発が必要である。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、免疫賦活性核酸、典型的及び好ましくは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）を刺激するＣｐＧモチーフを含み、ＶＬＰないにパッケージ化されたＤＮＡオリゴヌクレオチドがＶＬＰに結合した抗原又はともに用いた抗原、すなわちパッケージ化ＶＬＰと混合した抗原へのＢ及びＴ細胞応答を亢進する一方で、ペプチドグリカン、ＴＬＲ２のリガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３のリガンド、ＬＰＳ、ＴＬＲ４のリガンド、フラゲリン、ＴＬＲ５およびイミクイモード(imiquimode)のリガンド、ＴＬＲ７のリガンドを含む他のＴＬＲリガンドすべてはＣｐＧと類似の方法でＶＬＰ誘発性ＣＴＬ応答を亢進しないという驚くべき発見に基づく(Schwarzら., (2003) Eur. J. Immunol., 33, 1465-1470)。しかしながら驚くべきことに、ＴＬＲ９以外のＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ４がＶＬＰに結合又は融合した抗原に対してＴ細胞応答を亢進しないにもかかわらず、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの存在下でそれらはＴ細胞応答を効率よく亢進した。ゆえに、ＴＬＲリガンドと免疫賦活性核酸の間に相乗的効果があった。
【０００７】
第一の実施態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。
同様に好ましい実施態様では、本発明は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子と混合している非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはウイルス様粒子と混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。
【０００８】
更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸はＣｐＧモチーフを含んでいないにもかかわらず免疫賦活性を示す。このような核酸はＷＯ０１／２２９７２に記載されている。ここに記載のすべての配列は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはリン酸ジエステル骨格のホスホロチオエート修飾体により安定化されていない。
好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはヒト細胞のＩＦＮαを誘導する。他の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドを誘導するＩＦＮαはグアノシン豊富なリピート配列に隣接し、パリンドローム配列を含む。
【０００９】
更なる好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、組み換えウイルス様粒子である。ウイルス様粒子がリポタンパク質のエンベロープを含まないことも好ましい。組み換えウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウイルス、はしかウイルス、シンビス(Sindbis)・ウイルス、ロタ・ウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォーク・ウイルス、又はヒト・パピローマ・ウイルス、ＲＮＡファージ、Ｑβ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージおよびＴｙの組み換えタンパク質を含むか、あるいは選択的にこれらからなることが好ましい。特定の実施態様では、ウイルス様粒子は、１つ又は複数の異なるＢ型肝炎ウイルスのコア（キャプシド）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含むか、あるいは選択的にこれらからなる。
更なる好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含む。好ましいＲＮＡファージは、Ｑβ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージである。
【００１０】
他の実施態様では、抗原又は抗原混合物は組み換え抗原である。他の実施態様では、抗原又は抗原混合物を天然源、限定するものではないが：花粉、塵、真菌類、昆虫、食物、哺乳類の表皮性物質、毛髪、唾液、血清、ミツバチ、腫瘍、病原体および羽毛から抽出する。
他の実施態様では、抗原はウイルス様粒子と結合している、あるいは遺伝学的にウイルス様粒子と融合している。
【００１１】
また他の実施態様では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；及び（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適したポリペプチドからなる群から選択することができる。
更なる実施態様では、抗原又は抗原混合物を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子；（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適した有機分子；および（６）薬剤、ホルモン又は毒性化合物に対する免疫応答を誘導するのに適した有機分子からなる群から選択することができる。
【００１２】
特定の実施態様では、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞又はＴｈ細胞のエピトープを含むか、あるいは選択的にこれからなる。関連実施態様では、抗原はＢ細胞エピトープを含むか、あるいは選択的にこれからなる。関連実施態様では、ウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスのコア・タンパク質を含む。
好ましい実施態様では、ＣｐＧを負荷したウイルス様粒子に添加した付加的なＴＬＲリガンドはＴＬＲ４により認識される。そのようなリガンドはＬＰＳ、あるいは好ましくは解毒したＬＰＳ、例としてＭＰＬ(Nat Biotechnol 17: 1075)や合成ＴＬＲ４リガンドであってもよい。
【００１３】
本発明の他の態様では、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に混合、接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはウイルス様粒子と混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含んでなる組成物を動物に導入することを含む、ヒト又は他の動物種の免疫応答を亢進するための方法を提供する。
本発明の更に他の実施態様では、本組成物は動物に、皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内あるいはリンパ節内に直接導入する。同様に好ましい実施態様では、免疫亢進性組成物は局所的、腫瘍付近あるいはワクチン接種しようとする局所的ウイルス蓄積場に適用する。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、免疫応答はＴ細胞応答であり、抗原に対するＴ細胞応答が亢進される。特定の実施態様では、Ｔ細胞応答は細胞障害性Ｔ細胞応答であり、抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答が亢進される。本発明の他の実施態様では、免疫応答はＢ細胞応答であり、抗原に対するＢ細胞応答が亢進される。
また、本発明は、薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とともに免疫学的に有効な量の本発明の免疫亢進性組成物を含むワクチンに関する。また、本発明は、免疫学的に有効な量の開示されたワクチンを動物に投与することを含む、動物の免疫化及び／又は治療の方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰを、改変したＶＬＰに結合又は混合した抗原に対して動物又はヒトのワクチン接種に用いる。改変型ＶＬＰを使用して、たとえば、腫瘍、ウイルス性疾患、あるいは自己分子に対してワクチン接種することができる。ワクチン接種は、予防又は治療目的、あるいはその両方であってよい。さらに、改変型ＶＬＰを使用して、アレルギーあるいは喘息などのアレルギー関連疾患に対するワクチン接種をして、アレルゲンに対する免疫偏向及び／又は抗体応答を誘導することができる。そして、そのようなワクチン接種と治療それぞれにより、例えば前記のアレルギー性動物及び患者それぞれの脱感作を引き起こすことができる。
多くの場合、所望の免疫応答は、免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰと結合しているか又は混合している抗原に直接対するものであろう。抗原は、ペプチド、タンパク質又はドメイン、並びにそれらの混合であり得る。
【００１６】
注射の経路は、好ましくは皮下又は筋肉内であるが、ＣｐＧ含有ＶＬＰを皮内、鼻腔内、静脈内あるいはリンパ節に直接用いることもできる。同様に好ましい実施態様では、抗原と混合又は結合したＣｐＧ含有ＶＬＰを局所的、腫瘍付近あるいはワクチン接種しようとする局所的ウイルス蓄積場に適用する。
前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載はいずれも例示的及び解説的なものであり、権利を主張する本発明を更に解説することを意図するものである。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等あるいは均等である任意の方法および物質を、本発明を実施又は試験する際に使用することができ、好ましい方法および物質は、本明細書で以下に記載する。
【００１８】
１．定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」、又は本明細書中で単に「リンカー」と呼ばれるものは、抗原又は抗原決定基を第２の付着部位と会合させるか、あるいは、必ずしもではないが典型的には、１つのアミノ酸残基として、より好ましくはシステイン残基として、既に第２の付着部位からなっているか、あるいはそれを含むことがより好ましい。しかしながら、本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを、示すことを目的とするものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明内に含まれる。このような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を好ましくは含み、任意のアミノ酸を欠いているリンカーも、本発明内に含まれるものとする。抗原又は抗原決定基、又は場合によっては第２の付着部位と、アミノ酸リンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００１９】
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫、および蛛形網を含むことを意味する。
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープ又は抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体およびそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬ又はＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類および哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つ又は複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の組成物はアレルギーの治療のためのワクチンの構築に使用しうる。ＩｇＥイソ型の抗体はアレルギー反応の重要な成分である。肥満細胞がその表面上でＩｇＥ抗体と結合し、肥満細胞表面上に結合したＩｇＥ分子への特定の抗原が結合するとヒスタミン及びアレルギー反応の他のメディエータが放出される。ゆえに、ＩｇＥ抗体産生を抑制すると標的がアレルギーに対して防御する。これは所望のＴヘルパー細胞応答を起こすことによって可能となる。Ｔヘルパー細胞応答はタイプ１（ＴＨ１）とタイプ２（ＴＨ２）のＴヘルパー細胞応答に分類することができる(Romagnani, Immunol. Today 18:263-266 (1997))。ＴＨ１細胞はＢ細胞がＩｇＧ抗体を産生する誘因となるインターフェロンγ及び他のサイトカインを分泌する。対照的に、ＴＨ２細胞によって産生される重要なサイトカインはＢ細胞にＩｇＥを産生させるＩＬ−４である。多くの実験系では、ＴＨ１細胞がＴＨ２細胞の誘導を抑制し、逆の場合も同じなので、ＴＨ１及びＴＨ２の応答の発生は相互に限定的なものある。ゆえに、同時に強いＴＨ１応答を引き起こす抗原はＴＨ２応答の発生とその後のＩｇＥ抗体の産生を抑制する。高濃度のＩｇＧ抗体により、ＩｇＥを結合する肥満細胞へのアレルゲンの結合が阻害され、それによってヒスタミンの放出が抑制される。ゆえに、ＩｇＧ抗体がＩｇＥ媒介性アレルギー反応を防御する。アレルギーの原因となる典型的な物質には、限定するものではないが：花粉（例えば草、ブタクサ、カバノキ又は山スギ）；ハウスダストおよび塵ダニ；哺乳類の表皮のアレルゲンおよび動物の垢；糸状菌および真菌類；昆虫体および昆虫毒物；羽毛；食物；及び、薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。Shough, H. ら., REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第19版, (82章), Mack Publishing Company, Mack Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995)を参照し、出典明記によりここにその内容全体が組み込まれる。ゆえに、非メチル化ＣＧモチーフ内にパッケージ化された豊富なＤＮＡを含むウイルス様粒子と混合したアレルゲンを用いて個体を免疫化するとアレルギー発生前だけでなくその後も利点がある。
【００２１】
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、及び／又は、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことが示されることを意味する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【００２２】
本明細書で使用する「微生物抗原」という用語は、微生物の抗原であり、感染ウイルス、感染細菌、寄生虫および感染真菌だけには限られないが、これらを含む。このような抗原には、無傷微生物、および天然単離体およびその断片、さらに、天然微生物抗原と同一であるか類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する、合成又は組み換え化合物がある。化合物は、それが免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘導する場合、天然微生物抗原と類似している。このような抗原は当分野では日常的に使用され、当業者によく知られている。
ここで用いる微生物抗原である感染性ウイルス、細菌及び感染性糸状菌の例はＷＯ０３／０２４４８１（２３頁最後の段落から２５頁３段落目まで）に記載されており、出典明記によりその開示がここに組み込まれる。
【００２３】
本発明の組成物および方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することによって、癌を治療するためにも有用である。本明細書で使用する「腫瘍抗原」は、腫瘍又は癌と関係があり免疫応答を誘発することができる、ペプチドなどの化合物である。特に、ＭＨＣ分子の概念で提示されるとき、化合物は免疫応答を誘発することができる。腫瘍抗原は、たとえばCohen他、Cancer Research、54:1055(1994)中に記載されたのと同様に、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、あるいは知られている抗原の新規合成によって、癌細胞から作製することができる。腫瘍抗原は、腫瘍又は癌ポリペプチド全体であるかあるいはその抗原部分である、抗原を含む。このような抗原は、組み換えによって、あるいは当分野で知られている任意の他の手段によって、単離又は作製することができる。癌又は腫瘍には、胆管癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛上皮腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、（たとえば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌、並びに他の癌腫および肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００２４】
また、アレルゲンは脊椎動物では抗原として作用する。ここで「アレルゲン」なる用語は、「アレルゲン抽出物」及び「アレルゲンのエピトープ」も包含する。アレルゲンの例として、限定するものではないが：花粉（例えば草、ブタクサ、カバノキ又は山スギ）；ハウスダストおよび塵ダニ；哺乳類の表皮のアレルゲンおよび動物の垢；糸状菌および真菌類；昆虫体および昆虫毒物；羽毛；食物；及び、薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。
抗原決定基：ここで用いる「抗原決定基」なる用語は、Ｂ又はＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。抗原決定基に応答したＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は細胞性免疫及び／又は体液性免疫の媒介に重要なエフェクター機能の核酸や構築によって抗原決定基に応答する。
【００２５】
抗原掲示細胞：本明細書で使用するように、「抗原提示細胞」という用語は、免疫賦活能力を有する異種群の白血球、又は骨髄由来細胞を指すことを意味する。たとえば、これらの細胞は、Ｔ細胞によって認識することができるＭＨＣ分子と結合するペプチドを、生成することができる。この用語は、用語「補助細胞」と同義であり、たとえばランゲルハンス細胞、指状突起細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを含む。いくつかの条件下では、上皮細胞、内皮細胞、および他の非骨髄由来細胞も、抗原提示細胞として働くことができる。
会合(association)：ここで用いる第一および第二の付着部位に適用する際の「会合」なる用語は、好ましくは少なくとも一非ペプチド結合によるものである第一付着部位と第二付着部位の結合を指す。会合の性質は共有性、イオン性、疎水性、極性、又はこれらの何れかの組合せであってよく、好ましくは会合の性質は共有性であり、更により好ましくは会合は少なくとも一、好ましくは一つの非ペプチド結合を介する。ここで用いる第一及び第二の付着部位に適用する際の「会合」なる用語は、本発明の組成物を形成する第一付着部位と第二付着部位の直接結合又は会合を包含するだけでなく、場合によって好ましくは、本発明の組成物となる第一付着部位と第二付着部位の直接会合又は結合をも包含するものであり、この結果典型的に及び好ましくは異種二機能性架橋によるものである。
【００２６】
第１の付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、典型的かつ好ましくはウイルス様粒子により含まれる、典型的かつ好ましくは抗原又は抗原決定基により含まれる第二付着部位が会合しうる非天然又は天然起源の要素を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリ核酸、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又はこれらの化学反応基であってよい。第一付着部位は、典型的かつ好ましくは、ウイルス様粒子の表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上に存在する。好ましくは、第一付着部位がアミノ酸又はその化学的反応基である。
【００２７】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、ウイルス様粒子の表面上に位置する第一付着部位が会合することができる、抗原又は抗原決定基と関係がある、典型的かつ好ましくはそれにより含まれる要素を指す。第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又はこれらの化学反応基であってよい。少なくとも１つの第二付着部位が、抗原又は抗原決定基上に存在する。したがって、「少なくとも１つの第二付着部位を有する抗原又は抗原決定基」なる用語は、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基および第二付着部位を含む、抗原又は抗原構築体を指す。しかしながら、特に、非天然起源である、すなわち抗原又は抗原決定基中に本来存在しない第二付着部位に関しては、これらの抗原又は抗原構築体は、「アミノ酸リンカー」を含む。
【００２８】
結合(bound)：本発明で用いる「結合」なる用語は、共有、たとえば本発明の免疫賦活性核酸のウイルス様粒子への化学的結合による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。この用語は、物質の封入、又は部分的封入も含む。「結合」なる用語は、「連結(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、および「付着(attached)」などより広義であり、これらを含む。さらに、ウイルス様粒子を結合した免疫賦活性物質に関して、「結合」なる用語も免疫賦活性物質の封入又は部分的封入を含む。ゆえに、ウイルス様粒子に結合した免疫賦活性核酸に関して、「結合」なる用語は「連結(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、「パッケージ化」および「付着(attached)」などより広義であり、これらを含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性核酸を、単に「パッケージする」ともいわれるオリゴヌクレオチドが保持されるように、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。
【００２９】
連結(coupled)：ここで用いる「連結」なる用語は、共有結合による、あるいは強力な非共有的相互作用による付着、典型的かつ好ましくは共有結合による付着を指す。さらに、抗原のウイルス様粒子への結合に関して「連結」なる用語は、好ましくはそれぞれ少なくとも一つの非ペプチド結合による会合及び付着を意味する。生物学的に活性がある物質を連結させるために、当業者により通常使用されている任意の方法を、本発明において使用することができる。
融合(fusion)：ここで用いる「融合」なる用語は、コード化ヌクレオチド配列をイン・フレームで組み合わせることによる、一つのポリペプチド中の異なる起源のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」なる用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入、さらにその末端の一端への融合を明確に含む。
【００３０】
ＣｐＧ：ここで用いる「ＣｐＧ」なる用語は、少なくとも一の非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（たとえば、シトシンの次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧ-オリゴヌクレオチド」又はＤＮＡ）を含み、脊椎動物骨髄由来細胞によるサイトカイン発現を刺激する／活性化する、たとえばそれに対する促進効果を有する、あるいはそれを誘導するか増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。たとえばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞、たとえば、樹状細胞、単球およびマクロファージなどの活性化において、有用であることができる。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、たとえば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
【００３１】
コート・タンパク質：ここで用いる「コート・タンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、「ＣＰ」なる用語を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱｂの「コート・タンパク質」は、「ＱβＣＰ」並びにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコート・タンパク質は、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
【００３２】
エピトープ：ここで用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒト中で、抗原又は免疫活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的一部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子の関係でそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。ここで用いる「免疫原生エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002(1983)を参照のこと）、動物の抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原性エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞レセプターによって免疫特異的に結合させることができる。
【００３３】
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約５個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約８〜１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。
免疫応答：本明細書で使用するように、「免疫応答」なる用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化又は増殖をもたらす、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つ又は複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される作用剤を指す。「免疫原性ポリペプチド」は、アジュバントの存在下又は不在下で、単独あるいは担体と結び付いて、細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導するポリペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞は活性化されてもよい。
【００３４】
免疫化：本明細書で使用するように、「免疫化する」又は「免疫化」なる用語、又は関連用語は、標的抗原又はエピトープに対する、十分な免疫応答（抗体及び／又は細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む）を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基本レベルより大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞及び／又は体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫化することができると考えられる。
【００３５】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる核酸を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてよい。前述したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」なる用語は、４−ブロモ−シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
【００３６】
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」なる用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる物質を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活物質は、ｔｏｌｌ様レセプター(toll-like receptor)活性化物質およびサイトカイン分泌誘導物質だけには限られないが、これらを含む。Ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質は、免疫賦活性核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、および免疫賦活有機分子、たとえばタクソールなどだけには限られないが、これらを含む。
混合(mixed)：ここで用いる「混合」なる用語は、ともに添加される、互いに化学的に結合しない、さらに分離することができる二以上の物質、成分又はヨウ素の混合を意味する。
【００３７】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」なる用語は、２個以上のヌクレオチド、一般に少なくとも約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」なる用語は、１００以上〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００以上〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００以上〜約５００個のヌクレオチドを含む核酸配列も指す。「オリゴヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドも指し、これは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。該修飾は骨格又はヌクレオチド類似体を含んでもよい。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には、二本鎖又は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を、非制限的に含む。さらに「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡを含む三本鎖領域を指す。さらにオリゴヌクレオチドは、合成、ゲノム又は組み換え、たとえばλ−ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体、および糸状ファージ、たとえばＭ１３などであってよい。
【００３８】
また、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、１つ又は複数の修飾体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、および安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。たとえば、適切なヌクレオチド修飾体／類似体には、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化塩基、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、５−メチルデオキシシトシン、および５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジンがある。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされてきており、したがって、「オリゴヌクレオチド」は、化学的に、酵素によって、あるいは代謝によって修飾された形のポリヌクレオチド、自然界に典型的に見られるもの、およびウイルスおよび細胞に特有の化学形のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。
【００３９】
パッケージ化：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰと関係がある免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸の状態を指す。本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的連結による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を含む。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。「パッケージ化」なる用語は「連結」および「付着」などの用語を含み、また特に好ましくは、「パッケージ化」なる用語は物質の封入、又は部分的封入も含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。ゆえに、「パッケージ化」なる用語を意味する場合、特に、免疫賦活性核酸が免疫賦活物質である場合、「パッケージ化」という用語は、パッケージ化された状態の核酸が、ＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅによる加水分解に曝されないことを示す。好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸は、ＶＬＰキャプシド中に、最も好ましくは非共有方式でパッケージ化されている。
【００４０】
ＰＣＲ産物：ここで用いる「ＰＣＲ産物」なる用語は、ＰＣＲの開始材料である標的ＤＮＡ配列の増幅されたコピーを指す。標的配列は、例えば二本鎖ＤＮＡを含みうる。ＰＣＲのためのＤＮＡは「ｃＤＮＡ」ともいわれる相補的ＤＮＡを起源とするものであり、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡの転換産物であり得る。ＰＣＲのためのＤＮＡ源は細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり得る。ＰＣＲのためにＤＮＡを抽出した細胞源は、限定するものではなく、血液試料；ヒト、動物又は植物組織；糸状菌；及び細菌由来のものを含む。ＰＣＲの開始材料であるＤＮＡは未精製、ある程度精製もしくは高度に精製されうる。ＰＣＲのためのＤＮＡ源は、限定するものではなく、プラスミドベクター及びバクテリオファージベクターを含むベクター内にクローン化された挿入物（インサート）由来でもよい。「ＰＣＲ産物」なる用語は、「ポリメラーゼ連鎖反応産物」と置き換え可能である。
【００４１】
本発明の組成物は、場合によっては薬剤として許容可能な担体と組み合わせることができる。本明細書で使用するように、「薬学的に受容可能な担体」なる用語は、ヒト又は他の動物に投与するのに適した、１つ又は複数の適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又は被包性物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分と組み合わせて施用を容易にする、有機又は無機成分、天然又は合成物を示す。
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドも指すことを目的とする。組み換え体又は誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
【００４２】
免疫応答を「高める」物質は、その物質を加えることによって、その物質を加えずに測定した同じ免疫応答と比較して、より高まった、あるいは増大した、あるいは任意の方向に偏向した免疫応答が観察される物質を指す。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、たとえばこの物質ありおよびなしで５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。これは、この物質なしのＣＴＬ溶菌活性と比較して、ＣＴＬ溶菌活性が高まる物質の量が、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分量であると言える。好ましい実施態様では、免疫応答は、少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上高まる。分泌するサイトカインの量又はそのタイプも、変わる可能性がある。あるいは、誘導された抗体の量又はそれらのサブクラスが変更するかもしれない。
【００４３】
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」なる用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは十分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により常套法にて決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するのに有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露により抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であると思われる。この用語は、「十分量」とも同義である。
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患又は状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／又は疾患又は状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００４４】
Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド：ここで用いる「Ｔｏｌｌ様レセプターリガンド」なる用語は、少なくとも一のＴＬＲを活性化することができる任意のリガンドを指す(例としてBeutler, B. 2002, Curr. Opin. Hematol., 9, 2-10, Schwarzら., 2003, Eur.J.Immunol., 33, 1465-1470を参照)。本発明のＴＬＲリガンドは、限定しないが、少なくとも一のｔｏｌｌ様レセプター１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、又はＴＬＲ１１を活性化する。例えば、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）又はリポテイコ酸（ＬＴＡ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ２を活性化し(Aliprantisら., Science (1999), 285:736-9；Underhill, ら., Nature, (1999), 401:811-5)；ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ３を活性化し(Alexopoulou ら., Nature (2001), 413:732-8)；リポ多糖類（ＬＰＳ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ４を活性化し(Poltorak, ら., Science (1998), 282:2085-8)；フラゲリンは典型的かつ好ましくはＴＬＲ５を活性化し(Hayashiら. Nature (2001), 410:1099-103)；バクテリアＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ及びイミダゾキノリン(imidazoquinoline)などのある種の合成物質は典型的かつ好ましくはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を活性化し(Diebold S.ら. Science 303:1529；Heil, FH.ら. Science 303:1526)；バクテリアＤＮＡ、特にＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ９を活性化する(Schnareら. Curr. Biol. (2000), 10:1139-42；Hemmi H ら. Nature (2000), 408: 740-5)。ここに挙げた論文は出典明記によりここに組み込まれる。ＴＬＲリガンドの概要は、Abreuの論文の表に挙げられており、出典明記によりここに組み込まれ(Abreu M.T.及びArditi M. J., Pediatrics (2004), 421-9)、ＴＬＲ１１とそのリガンドについての参考文献はZhangら., Science, (2004), 303:1522-6に記載されている。当業者の一般的な知識とともにこれら組み込まれる論文を参照すると、ある分子が本発明に基づくＴＬＲリガンドであるかどうか、ＴＬＲリガンドが少なくとも一のＴＬＲを活性化するかどうかを試験することは常套法の範囲内である。そのような試験の典型的かつ好ましい例は以下の通りである：３×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に１μｇのＴＬＲ発現プラスミドと２０ｎｇのＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポータープラスミドを２００ボルトで９６０μＦにて電気穿孔法を行う。適当な空の発現ベクターを添加することによって一度の電気穿孔につき全量のプラスミドＤＮＡを１５μｇに保つ。１ウェルあたり１０５個の細胞をまき、一晩培養した後、試験すべきリガンドにてさらに７〜１０時間刺激する。公知のＴＬＲリガンドの濃度範囲は、典型的な例として２５μｇ／ｍｌ ＲＮＡ４０−４２とＤＯＴＡＰの複合体（ＲＮＡの細胞内への内部移行を促進する）、１μＭ ＣｐＧ−ＯＤＮ２００６、１０μＭ Ｒ−８４８、５０μｇ／ｍｌ ポリ（Ｉ：Ｃ）、又は１μｇ／ｍｌ Ｐａｍ３Ｃｙｓである(Heil, FH.ら. Science 303:1526)。刺激した細胞をレポーター溶解バッファ(Promega, Mannheim, Germany)を用いて溶解し、製造者の指示書にしたがって照度計、典型的かつ好ましくはBerthold照度計(Wildbad, Germany)を用いて溶解物のルシフェラーゼ活性を評価する。これは当業者の知識の範囲内であり、したがって任意のリガンドの試験のための前述の実験を適用する。
【００４５】
ついで、誘導されたルシフェラーゼ活性がネガティブ対照（試験すべきリガンドを添加しないで同じ条件で行った同じ実験）の活性より測定される閾値より統計学的に顕著に高い場合、本発明に関するＴＬＲを活性化すると考えられる。ここで閾値は、６つの別々の実験と６つの実験から３度求めたルシフェラーゼ活性の標準偏差により定義される。ついで、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように決定された閾値より高い場合、典型的かつ好ましくは「統計学的に顕著に」ＴＬＲを活性化すると考えられる。好ましくは、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように決定された閾値より少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍高い場合、リガンドは「統計学的に顕著に」ＴＬＲを活性化すると考えられる。
典型的かつ好ましくは、本発明の免疫賦活性核酸がＴＬＲを活性化する場合、本発明のＴＬＲリガンド（ｄ）は免疫賦活性核酸により活性化されるＴＬＲとは異なるＴＬＲを活性化する。例えば、免疫賦活性核酸がＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧであるならば、しかして本発明の組成物のＴＬＲリガンド（ｄ）と第二ＴＬＲリガンドはＴＬＲ９以外の何れかのＴＬＲである第二ＴＬＲ、例えばＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１を活性化する。一方、例えば、免疫賦活性核酸がＴＬＲ３のリガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）であるならば、しかして本発明の組成物のＴＬＲリガンド（ｄ）と第二ＴＬＲリガンドはＴＬＲ３以外の何れかのＴＬＲである第二ＴＬＲ、と例えばＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０又は１１を活性化する。
【００４６】
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）リガンド：ＴＬＲ４リガンドはＴＬＲ４依存性様式で細胞内にシグナル伝達をすることができる。典型的かつ好ましい例として、ＬＰＳ及びその誘導体、ｇｐ９６、熱タンパク質及びデフェンシンである。好ましいＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳ及び例えば脂質Ａテールの側鎖を欠如した解毒化したＬＰＳなどの誘導体(Persingら., (2002), Trends Microbiol., 10 (10 Suppl), 32-37)、例としてMPL、モノリン酸化脂質Ａ及びその誘導体(Johnsonら., (1999), J Med Chem., 42(22), 4640-4649)、又は化学的に変更したＬＰＳ及びＬＰＳの合成類似体(Fernandesら, (1997), 34 (8-9) 569-576；Przetakら, (2003), 21, 961-970)である。ここに挙げたすべての参考文献は出典明記によりここに組み込まれる。本発明の好ましいＬＰＳ誘導体、例としてＬＰＳの解毒化した型、化学的に変更した又は合成したＬＰＳ類似体は、当業者に公知のウサギを用いた発熱試験の対象となる。典型的かつ好ましくは、好適なＬＰＳ誘導体はウサギの発熱試験で有意差を示さない。
【００４７】
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」なる用語は、宿主のゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質と、宿主のゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指し、自己として定義する。好ましくはここで用いる「自己抗原」なる用語は、ヒトのゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質と、ヒトのゲノム又はＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指し、自己として定義する。自己抗原を含む本発明の組成物、薬剤組成物及びワクチンは特に、宿主に適用する場合自己抗原に対する認容性を破壊する。ここで、「自己抗原に対する認容性を破壊する」とは、宿主への自己抗原を含む本発明の組成物、薬剤組成物及びワクチンを適応したときに自己抗原特異的にここで定義するような免疫応答、好ましくはＢ又はＴ細胞応答を亢進することを指す。さらに、２つ又は数個の分子の組合せから生じるタンパク質、又は自己分子の画分であるタンパク質、および前に定義した２つの自己分子と高い相同性（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質も、自己とみなすことができる。本発明の他の好ましい実施態様では、抗原は自己抗原である。本発明に関して有用な、自己抗原の非常に好ましい実施態様は、ＷＯ０２／０５６９０５に記載されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【００４８】
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、又は「治療している」なる用語は、予防及び／又は療法を指す。感染病に関して使用するとき、たとえば、この用語は、病原体による感染に対する被験者の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被験者が病原体によって感染するか、あるいは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、および感染と戦うため、たとえば感染を低下させるか除外するため、あるいは感染が悪化するのを防ぐための、被験者が感染した後の治療を指す。
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁又は溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、これだけに限らないが、抗体及び／又はサイトカインの生成、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞応答を含む免疫応答を誘発することができる。
【００４９】
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に比較して少量又は多量で存在することができる、アジュバントをさらに含む。本明細書で使用するように、「アジュバント」なる用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、又は宿主中でデポー作用を生み出すことができる物質を指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層免疫応答の増強が与えられる。さまざまなアジュバントを使用することができる。その例には、不完全フロイント・アジュバント、水酸化アルミニウム、および改変型ムラミルジペプチドがある。
ウイルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）なる用語は、ウイルスに似ているが、病原性であることは証明されていない構造を指す。典型的には、本発明のウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウイルス様粒子はウイルス・ゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウイルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。一般的に、本発明のウイルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウイルス・ゲノムのすべて又は一部、特にウイルス・ゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、又はＲＮＡファージのウイルス・キャプシドなどの、ウイルス・キャプシドである。本明細書で互換的に使用する、「ウイルス・キャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウイルス・タンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウイルス・キャプシドおよびキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状又は管状である。たとえば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、「キャプシド様構造」なる用語は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが十分な程度の状態および反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
【００５０】
ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージ・コート・タンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰは、たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を邪魔するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じるＱβＣＰサブユニット（配列番号１）（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９〜１５（１９９６）を参照のこと）であり、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニット（配列番号２）をさらに含んでもよい。リードスルーな工程は効率が低く、ＶＬＰ中にほんのわずかな量のＡ１タンパク質しかない。パッケージ化ＩＳＳと連結した抗原の異なる組み合わせを用いて多くの数の実験が行われている。ＱβＣＰサブユニットから限局的に集積したＱβコートタンパク質のＶＬＰ、又はキャプシド内にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰを用いる場合、連結効率とパッケージ化効率に違いは観察されなかった。さらに、ＱβＶＬＰ調整物間に免疫応答の違いも観察されなかった。ゆえに、明確にするために「ＱβＶＬＰ」なる用語はＱβＣＰサブユニットから限局的に集積したＱβコートタンパク質のＶＬＰ又はキャプシド内にＡ１タンパク質をさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰ何れの実施例についての記載全体を通して用いる。
【００５１】
本明細書で使用するように、「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態を指す。いくつかのウイルス型では、ウイルスはタンパク質キャプシドに囲まれたゲノムを含み、他のウイルスは追加的な構造（たとえば、エンベロープ、尾部など）を有する。
非エンベロープ・ウイルス粒子は、ウイルス・ゲノムを囲み保護するタンパク質キャプシドでできている。エンベロープで覆われたウイルスは、ウイルスの遺伝物質を囲むキャプシド構造も有するが、さらに、キャプシドを囲む脂質二重層エンベロープを有する。
本発明の好ましい実施態様では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープ又はリポタンパク質含有エンベロープを含まない。更なる好ましい実施態様では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００５２】
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施態様は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核および真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく発見することができる（たとえば、Sambrook, J.他, eds.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL, 2nd.edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)；Ausubel,F.他, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H.Wiley & Sons,Inc.(1997)）。組織培養細胞系を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法（Cells,J.,ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998)）、および抗体系の技術（Harlow,E.and Lane,D., 「Antibodies:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988)；Deutscher,M.P., 「Guide to Protein Purification」Meth.Enzymol.128, Academic Press San Diego(1990)；Scopes,R.K., 「Protein Purification Principles and Practice」3rd ed., SpringerVerlag, New York(1994)）も文献中に十分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
【００５３】
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示する本発明は、動物の１つ又は複数の抗原に対する、免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）ウイルス様粒子、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含む、あるいは選択的にこれらからなる。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。さらに、本発明によって実践者は、例えば、感染病並びに慢性感染病の予防及び／又は治療、癌の予防及び／又は治療、喘息などのアレルギー又はアレルギー関連疾患の予防及び／又は治療を含む様々な治療及び／又は予防目的の、このような組成物を都合よく構築することができる。
【００５４】
本出願に述べるウイルス様粒子は、ＷＯ０３／０２４４８１の３９〜５９頁に詳述されているＶＬＰを指し、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。ＶＬＰの例には、限定するものではないが、Ｂ型肝炎ウイルス、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、及び特にＱβ−ファージが含まれる。より特定の実施態様では、ＶＬＰは、組み換えポリペプチド、又はその断片を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれらからなる。好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、本質的にこれらからなるか、あるいは選択的にこれらからなる。好ましくは、ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；ｌ）バクテリオファージＰＰ７；及びｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されることが好ましい。本発明の更に好ましい実施態様では、組み換えタンパク質はＲＮＡファージのコートタンパク質を含むか、実質的にそれらからなるか、あるいは選択的にそれらからなる。
【００５５】
本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体的な好ましい例には、ＷＯ０３／０２４４８１（４１頁最終段落〜４９頁第２段落）に詳細に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれ、バクテリオファージＱβ（ＰＩＲデータベース、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、および受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＲ１７（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４はＳＰＣＰを指し、および受託番号ＮＰ６９５０２６はＳＰＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＭＳ２（ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号３）、バクテリオファージＡＰ２０５（配列番号３２又は３３）などのＲＮＡバクテリオファージのコート・タンパク質が含まれる。
【００５６】
４個のリシン残基が、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの表面上で露出している。露出したリシン残基がアルギニンによって置換されている、Ｑβ変異体も、本発明用に使用することができる。したがって、以下のＱβコート・タンパク質変異体、および変異体Ｑβ ＶＬＰを、本発明を実施する際に使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号４）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号５）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号６）、「Ｑβ−２５１」（配列番号７）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号８）。したがって、本発明の他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβコート・タンパク質の組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれらから本質的になるか、あるいは選択的にこれらからなり、ウイルス様粒子は、ａ）配列番号４のアミノ酸配列；ｂ）配列番号５のアミノ酸配列；ｃ）配列番号６のアミノ酸配列；ｄ）配列番号７のアミノ酸配列；およびｅ）配列番号８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。前述したＱβコート・タンパク質、変異体Ｑβコート・タンパク質ＶＬＰおよびキャプシドそれぞれの構築、発現および精製は、ＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。
【００５７】
更に、本発明は上記したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいは選択的にこれから実質的になるか、あるいは選択的にこれからなるタンパク質を含む組成物を包含する。免疫応答を誘導する能力を保持するＶＬＰの断片は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個のアミノ酸長のポリペプチドであるが、ＶＬＰを含むサブユニットの配列の長さに明らかに依存するポリペプチドを含むか、あるいは選択的にこれらからなっていてよい。このような断片の例は、免疫応答促進組成物を調製するのに適した、本明細書で論じるタンパク質の断片を含む。
前述したように、本発明は、ウイルス様粒子又はそれに由来する組み換え体を含む。当業者は、このような粒子を生成させ抗原をそれに混合させる知識を有している。他の例を示すことによって、本明細書において本発明は、ウイルス様粒子としてのＢ型肝炎ウイルス様粒子の生成を提供する（実施例１）。
【００５８】
一実施態様では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、又はＨＢｃＡｇの断片から構成されており、これが改変されて、遊離システイン残基の数がなくなっているかあるいは減少している。例えば、配列番号９に示すＨＢｃＡｇ又はその変異体などのＨＢｃＡｇタンパク質であり、本発明の組成物を調整するのに用いることができるＨＢｃＡｇタンパク質の具体的な好ましい例には、ＷＯ０３／０２４４８１（５２頁第４段落〜５８頁最終段落）に詳細に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。本発明に用いることができるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、例えばＷＯ００／３２２２７の特に実施例１７〜１９及び２１〜２４、並びにＷＯ０１／８５２０８の特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１及び４１、及びＷＯ０２／０５６９０５に開示されている。後者の出願は特に実施例２３、２４、３１及び５１を指す。３つすべての明細書は出典明記により明確にここに組み込まれる。
【００５９】
本発明を実施する際に使用するのに適した、いくつかの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が同定されてきている（たとえば、Yuan他(J.Virol.73:10122-10128(1999)）。更に、本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇ変異体は、ＷＯ０３／０２４４８１（５４頁第３段落〜５５頁第１段落）に記載されており、その開示内容は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明で使用するのに適したＨＢｃＡｇは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入、又は結合、又はさもなくば付着することができ、免疫応答を誘導することができる限りは、任意の生物に由来するものであってよい。
【００６０】
本発明のいくつかの実施態様では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドに導入して、抗原又は抗原決定基とＨＢｃＡｇのＶＬＰの結合を仲介させる。好ましい実施態様では、本発明の組成物を、配列番号１０のアミノ酸１〜１４４、又は１〜１４９、１〜１８５を含むか、あるいは選択的にこれらからなるＨＢｃＡｇを用いて調整するものであり、そのＨＢｃＡｇは改変されて、位置７９および８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号３４）を有するペプチドで置換された結果生じた配列番号９６のアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変異体である。更なる好ましい実施態様では、配列番号１０の位置４８および１０７におけるシステイン残基が、セリンに変異する（配列番号３６）。更に本発明は、上述したアミノ酸変異を有するＷＯ０３／０２４４８１（５４頁第３段落〜５５頁第１段落）に示すアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含む組成物を含む。更には、キャプシド又はＶＬＰを形成するために結合することができ、上記アミノ酸の変異を有する付加的なＨＢｃＡｇも本発明の範囲内である。したがって、本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されており、前に示した変更によって改変されている、これらのタンパク質を形成するアミノ酸配列を含むか、あるいは選択的にこれらからなる、ＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、組成物をさらに含む。
【００６１】
本発明の一態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが結合したウイルス様粒子は、亢進した免疫応答が望まれる抗原／免疫源と連結又は混合している。ある場合では、単一抗原がそのように変更されたウイルス様粒子と連結又は混合するであろう。他の場合では、そのように変更したＶＬＰは他の抗原や更なる複合抗原混合と連結又は混合する。抗原は組み換えして産生するか天然源から抽出することができ、その天然源には限定するものではないが、花粉、塵、真菌類、昆虫、食物、哺乳類の表皮、羽毛、ミツバチ、腫瘍、病原体及び羽毛が含まれる。
本発明の一実施態様では、少なくとも一の免疫賦活性核酸、好ましくは少なくとも一の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと、ＶＬＰに連結又は融合するかＶＬＰと混合した抗原と、少なくとも一のＴＬＲリガンドを含有するＶＬＰを含んでなる組成物を添加した物質は、ＴＬＲの活性、典型的かつ好ましくは本発明の免疫賦活性核酸によって活性化されない第二ＴＬＲの活性を誘発することができる。
【００６２】
一実施態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｂ）免疫賦活性核酸、好ましくは核酸又はオリゴヌクレオチドがウイルス様粒子に接合、融合、さもなければ接着あるいは封入されている、すなわち結合及び好ましくはパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）ＶＬＰに結合又は融合した少なくとも一抗原、あるいはＶＬＰと混合された抗原、及び（ｄ）少なくとも一ＴＬＲリガンドを含む、動物の免疫応答を亢進するための組成物を提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンド（ｄ）は本発明のＶＬＰ（ａ）と混合している。好ましくは、免疫賦活性核酸（ｂ）はリガンド（ｄ）により活性化されるＴＬＲと異なるＴＬＲを活性化する。
【００６３】
ＴＬＲは、免疫系による自己／非自己識別のための鍵であるとよく記載されるパターン認識分子である。今日までに１０個のヒトｔｏｌｌ様レセプタが知られている。それらは種々のリガンドによって活性化される。ＴＬＲ２は、ペプチドグリカン、リポタンパク、リポポリサッカリド、リポテイコ酸およびザイモサン、およびマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ-２によって活性化される；ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡによって活性化する；ＴＬＲ４は、リポポリサッカリド、リポテイコ酸およびタキソール、および熱ショックタンパク質ＨＳＰ-６０、Ｇｐ９６およびデフェンシンなどの熱ショックタンパク質によって活性化される；ＴＬＲ５は、細菌鞭毛、特にフラゲリンタンパク質によって活性化される；ＴＬＲ６はペプチドグリカンによって活性化され、ＴＬＲ７はイミキモド(imiquimoid)およびイミダゾキノリン化合物、例えばＲ―848、ロキソリビン(loxoribine)およびブロピリミン(bropirimine)によって活性化され、ＴＬＲ９は細菌ＤＮＡ、特にＣｐＧ-オリゴヌクレオチドによって活性化される。ＴＬＲ１、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１０およびＴＬＲ１１のリガンドは今までに知られていない。しかしながら、最近の報告により、同じレセプタが異なるリガンドと反応することができること、更にレセプタが存在することが示される。リガンドの上記リストは網羅的なものではなく、更にリガンドは当業者の知識の範囲内である。一般に、ＴＬＲの誘因により抗原提示細胞（ＡＰＣ）が活性化される。したがって、ＴＬＲｓの誘因によりＡＰＣの活性化によって、Ｔ細胞応答が亢進されるかもしれない。本発明において、発明者は、異なるＴＬＲの刺激により相乗的応答が引き起こされるという驚くべき発見をした。具体的には、ＶＬＰ内にパッケージ化されたＣｐＧによるＴＬＲ９の刺激は、ＬＰＳ又は他のＴＬＲ４リガンドによるＴＬＲ４の刺激と相乗作用するかもしれない。したがって、好ましい実施態様では、ＣｐＧによりＴＬＲ９に付加的に刺激されたＴＬＲは、ＴＬＲ4であってもよい。ＴＬＲ４について様々なリガンドが知られている。それらはＬＰＳを含み、ＬＰＳはＴＬＲ４の天然リガンドである。加えて、例えばリピドＡ尾部の側鎖を欠いているＬＰＳの解毒された型はまた、ＴＬＲ４の強力な活性化因子である。モノスホリルリピドＡ及びその誘導体は当分野において周知である。好適な誘導体は、３ｄｅ-ｏ-アシル化モノリン酸化リピドＡであって、英国特許番号２２２０２１１から知られている。ＴＬＲ４を刺激する能力にもかかわらず、これらの非天然リガンドは、相対的に非中毒性であるため、ワクチン製剤におけるＴＬＲ４刺激のための好適な物質である(Curr Drug Targets Infect Disord. 2001 Nov;1(3):273-86.)。近年では、ＴＬＲリガンドのファミリは、熱ショックタンパク質(J Biol Chem. 2002 Apr 26;277(17): 15107-12.)及びデフェンシン(Science. 2002 Nov 1;298(5595): 1025-9.)を含むように範囲が広がっている。ゆえに、デフェンシンおよび熱ショックタンパク質もまたこの発明の範囲内である。
【００６４】
一実施態様では、本発明の組成物における免疫賦活性核酸が、（ａ）リボ核酸；（ｂ）デオキシリボ核酸；（ｃ）キメラ核酸；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも何れか一の核酸の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸がポリ-（Ｉ：Ｃ）である。他の実施態様では、免疫賦活性核酸が免疫賦活性核酸が、（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；及び（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは本発明の免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
２クラスの核酸、すなわち１）免疫賦活性配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特定の隣接塩基内の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）、および２）さまざまな型のウイルスによって合成される二本鎖ＲＮＡが、免疫応答を高める細菌成分中の重要な構成要素である。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）などの合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、樹状細胞に前炎症性サイトカインの生成を誘導させ、高レベルの共賦活分子を発現させることができる。
【００６５】
TokunagaおよびYamamotoらによる一連の研究によって、細菌ＤＮＡ又は合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ヒトＰＢＭＣおよびマウス脾臓細胞を誘発して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を生成させることが示されている（Yamamotoら、Springer Semin Immunopathol.22:11-19中に概説されている）。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、本来はＩ型ＩＦＮの強力な誘導物質として合成されたが、ＩＬ−１２などの他のサイトカインも誘導する。
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン−ポリシチジル酸の二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）を含む。リボ核酸およびその修飾体、およびそれらを生成するための方法は、Levy、H.B(Methods Enzymol.1981、78:242-251)、DeClercq,E(Methods Enzymol.1981、78:227-236)、およびTorrence,P.F.(Methods Enzymol 1981;78:326-331)、およびその中の参照によって記載されている。更なる好適なリボ核酸は、二本の鎖が二本鎖ＲＮＡを形成しているポリ（ＩＣ）などイノシン酸およびシチジル酸のポリヌクレオチドを含む。リボ核酸は、生物から単離することができる。リボ核酸は、他の合成リボ核酸、特に合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドも含み、これらはリン酸ジエステル骨格の修飾によって、特にホスホロチオエートの修飾によって、ヌクレアーゼ耐性になっている。他の好ましい実施態様では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格が、デオキシリボースによって置換されている。当業者は、合成オリゴヌクレオチドの合成の仕方の手順を知っている。
【００６６】
一般的に、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む。さらにオリゴヌクレオチドは、約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチドを含むことができる。さらにオリゴヌクレオチドは、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含むことができる。
好ましい実施態様では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格の１つ又は複数のホスホチオエステル修飾体を含む。たとえば、リン酸骨格の１つ又は複数のリン酸の修飾体を有するか、あるいは修飾されたリン酸骨格のすべてを有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および１個、数個、あるいはすべてのヌクレオチドのリン酸骨格の修飾体が、ホスホロチオエート修飾体であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。
【００６７】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組み換え体、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、および一本又は二本鎖であってもよい。本発明において使用するために、当分野でよく知られているいくつかの手順のいずれかを使用して、核酸を新たに合成することができる。たとえば、ｂ−シアノエチル・ホスホアミダイト法（Beaucage,S.L.,and Caruthers,M.H.、Tet.Let.22:1859(1981)；ヌクレオシドＨ−リン酸法(Gareggら、Tet.Let.27:4051-4054(1986)；Froehlerら、Nucl.Acid.Res.14:5399-5407(1986)；Gareggら、Tet.Let.27:4055-4058(1986)、Gaffneyら、Tet.Let.29:2619-2622(1988))。これらの化学的方法は、市場で入手可能なさまざまな自動式オリゴヌクレオチド合成装置によって、実施することができる。あるいは、ＣｐＧをプラスミド中において大規模で生成させることができ(Sambrook,T.ら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor laboratory Press、New York、1989を参照のこと）、これは被験者に投与された後にオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、知られている技法、制限酵素、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して、既存の核酸配列（たとえば、ゲノム又はｃＤＮＡ）から作製することができる。
【００６８】
免疫賦活性核酸、並びに非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、当分野で知られている任意の方法によってＶＬＰに結合することができ、その組成物は動物の免疫応答を高めるものとする。たとえば、オリゴヌクレオチドは、共有的又は非共有的に結合することができる。さらに、ＶＬＰは、完全あるいは部分的に、免疫賦活性核酸並びに非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入することができる。免疫賦活性核酸、および非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合部位（本来存在するもの又は本来存在しないもの）、ＤＮＡ結合部位、又はＲＮＡ結合部位などのＶＬＰ部位に結合することができることが好ましい。他の実施態様では、ＶＬＰ部位はアルギニンリッチリピート又はリジンリッチリピートを含む。本発明の免疫賦活性核酸を本発明のＶＬＰ、例えばＨＢｃＡｇ、ＲＮＡファージＱβ又はＡＰ２０５にパッケージ化する方法は、当分野で公知であり、ＷＯ０３／０２４４８１（特に実施例１１〜１７）に記載されており、その開示はその全体が出典明記によりここに組み込まれる。
【００６９】
本発明の組成物の１つの具体的な使用は、抗原に対する特定の免疫応答を高める目的で、樹状細胞を活性化させることである。樹状細胞は、エキソビボ又はインビボの技法を使用して、亢進することができる。エキソビボの手順を、自己又は異種細胞に使用することができるが、自己細胞に使用することが好ましい。好ましい実施態様では、樹状細胞を末梢血液又は骨髄から単離するが、これは樹状細胞の任意の源から単離することができる。癌の免疫療法の目的での、樹状細胞のエキソビボでの操作は、Engleman,E.G., Cytotechnology 25:1(1997)；Van Schooten,W.ら, Molecular Medicine Today, June, 255(1997)；Steinman,R.M., Experimental Hematology 24:849(1996)；及びGluckman,J.C., Cytokines,Cellular and Molecular Therapy 3:187(1997)を含めた、当分野のいくつかの参照文献に記載されてきている。
樹状細胞を、インビボでの方法を使用して、本発明の組成物と接触させることもできる。これを実施するために、ＣｐＧを、抗原に連結又は抗原と混合したＶＬＰと付加的なＴＬＲリガンドとを組み合わせて、免疫療法を必要とする被験者に直接投与する。いくつかの実施態様では、ＶＬＰ／ＣｐＧを腫瘍の局所領域に投与することが好ましく、当分野で知られている任意の方法、たとえば腫瘍への直接的な注射によって、これを実施することができる。
【００７０】
本発明の更なるとても好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる。後者はインビトロで血液細胞を刺激することができるということがすでに明らかとなった(Kuramoto E.ら., Japanese Journal Cancer Research 83, 1128-1131 (1992)。
本発明の他の好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部である。好ましくは、前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である。他の好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列が、１０以下のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接しており、好ましくは、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である。更なる好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってそのＮ末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってそのＣ末端に隣接する。これら本発明の免疫賦活性核酸はＶＬＰ内にとても効率よくパッケージ化されることが思いがけなく明らかとなった。この結果、パッケージ化する能力は、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）を１０のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接して有する対応する免疫賦活性核酸と比較して亢進された。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様では、前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）を含むか、あるいは選択的にそれから実質的になるか、あるいは選択的にそれからなるものであり、該パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
本発明の更にとても好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４０）；及び主としてここではＧ３−６と略す、（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４１）；及び主としてここではＧ４−６と略す、（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；及び主としてここではＧ５−６と略す、（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４３）；及び主としてここではＧ６−６と略す、（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４４）；及び主としてここではＧ７−７と略す、（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４５）；及び主としてここではＧ８−８と略す、（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４６）；及び主としてここではＧ９−９と略す、及び（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４７）及び主としてここではＧ６と略す、からなる群から選択される核酸配列を有する。
【００７２】
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が少なくとも４及び多くとも９のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が少なくとも５及び多くとも８のグアノシン自体によってその５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも８グアノシン自体によってその３’末端に隣接する。
【００７３】
実験的データにより、パリンドローム配列がより少ないグアノシン自体により隣接する場合、好適な本発明の免疫賦活性核酸、すなわちパリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）であり、該パリンドローム配列が１０以下のグアノシン自体によってその３’末端及び５’末端に隣接しているグアノシン隣接、パリンドローム配列及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをＶＬＰ内にパッケージ化する場合が増加する。しかしながら、パリンドローム配列を隣接するグアノシン自体の数が少なくなると、インビトロの血液細胞の刺激が減少する。ゆえに、パッケージ化能は示した本発明の免疫賦活性核酸の生物学的活性の減少による。ゆえに好適な実施態様は、パッケージ化能と生物学的活性とが調和されている。
本発明の更なる好ましい実施態様では、免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化が配列番号４５の核酸配列を持つ、すなわち免疫賦活性核酸がＧ８−８である。
【００７４】
本発明の特に好ましい実施態様では、本組成物は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）少なくとも一の免疫賦活性核酸、（ｃ）少なくとも一の抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含み、該免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドであり、該ＴＬＲのリガンドがＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０及び１１からなる群から選択した少なくとも一のＴＬＲを活性化する。
本発明の更なる特に好ましい実施態様では、本組成物は、（ａ）ＶＬＰ、（ｂ）少なくとも一の免疫賦活性核酸、（ｃ）少なくとも一の抗原、及び（ｄ）少なくとも一のＴＬＲリガンドを含み、該免疫賦活性核酸（ｂ）がポリ（Ｉ：Ｃ）であり、該リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のリガンドであり、該ＴＬＲのリガンドがＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択した少なくとも一のＴＬＲを活性化する。
【００７５】
更に本発明の組成物は、変更したウイルス様粒子と混合した又は連結した抗原ないし抗原決定基を含む。本発明は、所望の治療効果を考慮して選択された抗原ないし抗原決定基によって異なる組成物を提供する。本発明の使用に適する抗原又は抗原決定基はＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８及びＷＯ０２／０５６９０５に開示されており、その開示内容は出典明記によりその全体がここに組み込まれる。
抗原は公知又はまだ知られていない起源の任意の抗原でよい。それは感受性のある患者にアレルギー反応を引き起こすことが知られているバクテリア；ウイルス又は他の病原体；腫瘍；又は、木、草、雑草、植物、真菌類、糸状菌、塵ダニ、食物又は動物から単離することができる。あるいは、抗原は好適なコード化核酸の発現から得られる組み換え抗原であり得る。好ましい実施態様では、抗原は組み換え抗原である。もちろん、抗原の選択は所望する免疫学的応答と宿主に依存する。
【００７６】
本発明は広く多種の抗原に適用できる。好ましい実施態様では、抗原はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。
本発明の抗原は、以下の：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｂ）感染病に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；（ｄ）家畜又はペットの免疫応答を誘導するのに適したポリペプチド；および（ｅ）ポリペプチドに天然に存在する糖鎖、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）で述べた何れかのポリペプチドの断片（たとえば、ドメイン）からなる群から選択することができる。
好ましい抗原には、病原体（たとえば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌）由来の抗原、および腫瘍由来の抗原（特に腫瘍関連抗原、すなわち「腫瘍マーカー」）及びアレルゲンがある。他の好ましい抗原は、自己抗原(それぞれautoantigen、self antigen)である。
いくつかの実施例では、ペプチドｐ３３を含むＶＬＰを用いた。ペプチドｐ３３を含むＶＬＰはその便利さゆえのみにより用いたのであり、野生型のＶＬＰを更に本発明に用いることができることを注記する。ペプチドｐ３３はリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に由来した。ｐ３３ペプチドはもっとも適するＣＴＬエピトープの一つを表出している。ｐ３３特異的Ｔ細胞はトランスジェニックマウスに致死的な糖尿病を引き起こすことが示されている(Speiserら., J. Exp. Med. 186:645 (1997))。ゆえに、この特異的エピトープは特に自己免疫、腫瘍免疫学並びにウイルス性疾患の研究によく適する。
【００７７】
本発明の一特異的実施態様では、抗原又は抗原決定基は感染性疾患の予防に有用なものである。このような処置は、例としてヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種又は非哺乳動物種も同様に広く影響する非常に様々な感染性疾患の治療に有用であろう。感染性疾患は当業者によく知られており、その例には、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、イプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘、パピローマウイルスなどのウイルス病因の感染症；または、肺炎、結核、梅毒などの細菌病因の感染症；又は、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの寄生虫病因の感染症が含まれる。ゆえに、本発明の組成物に選択された抗原又は抗原決定基は医学の分野でよく知られているものであり；抗原又は抗原決定基には、以下の：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０およびｇｐ１６０；インフルエンザ抗原血球凝集素、Ｍ２タンパク質およびノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原又はマラリアのスポロゾイト周囲タンパク質又はそれらの断片を含む。
上記のように、抗原には、天然源由来の又は合成したウイルス、細菌及び真菌などの感染性微生物及びその断片が含まれる。
【００７８】
ウイルスなどの感染性微生物、脊椎動物の抗原であり、本発明の組成物の使用に用いることができるＲＮＡウイルスの例、又は例示的ＤＮＡウイルスは、例としてＷＯ０３／０２４４８１（特に８６〜８９頁）に記載されており、その開示は出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の特定の実施態様では、抗原は一以上の細胞障害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、又は細胞障害性Ｔ細胞エピトープとＴｈ細胞エピトープの組み合わせを含む。
ヒトの抗原特異的免疫応答を亢進するために、好ましい実施態様の方法は、他の哺乳動物又は他の動物、例として雌鶏、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラおよびキジなどの鳥の治療に特によく適している。鳥は、多くのタイプの感染症の第一標的である。本発明の組成物に用いることができる抗原の他の例はＷＯ０３／０２４４８１（９０〜９３頁）に記載されている。
【００７９】
本発明の他の態様では、「自己」遺伝子産物（例として、腫瘍壊死因子）が原因となる又は悪化する疾患ないし症状を予防する及び／又は寛解する方法に用いるのに適したワクチン組成物を提供する。ゆえに、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物が原因となる又は悪化する疾患ないし症状を予防及び／又は寛解する抗体の産生を引き起こす組成物を含む。このような疾患ないし症状の例には、移植片対宿主病、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸窮迫症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン性リンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増生病、リンパ節腫脹（ＩＰＬ）、血管免疫増生性リンパ節腫脹（ＡＩＬ）、免疫芽細胞性リンパ節腫脹（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病および骨粗鬆症芽含まれる。
関連する特定の実施態様では、本発明の組成物はアレルギー、癌又は薬剤中毒の治療及び／又は予防のために用いることができる。
【００８０】
組成物の調整及びアレルギー治療の方法に用いるための抗原ないし抗原決定基の選択は、このような疾患を治療する医学分野の技術者に公知であろう。そのような抗原ないし抗原決定基の代表例には以下の：蜂毒ホスホリパーゼＡ２；Ａｍｂ ａ １（ブタクサ花粉アレルゲン）、Ｂｅｔ ｖ I（カバノキ花粉アレルゲン）；５Ｄｏｌ ｍ Ｖ（白色顔クロスズメバチ(white-faced hornet)毒物アレルゲン）；Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２及びＤｅｒ ２（イエダニアレルゲン）；Ｌｅｐ ｄ ２（塵ダニアレルゲン）；Ａｌｔ １、Ａｓｐ ｆ １、及びＡｓｐ ｆ １６（真菌類アレルゲン）；Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２及びＡｒａ ｈ３（ピーナッツアレルゲン）、並びに免疫学応答を誘発するために用いることができるそれぞれの断片が含まれる。さらに、本発明は花粉抽出物又は蜂毒などの有機体又は有機体の一部から単離したアレルゲン混合物の使用に特に有用である。
【００８１】
好ましい実施態様では、花粉抽出物は樹木、草、雑草および栽培植物を含むか、あるいは選択的にこれからなる。樹木花粉抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：アカシア、ハンノキ（灰色）、アーモンド、リンゴ、アプリコット、小脳活樹(arbor vitae)、トネリコ、ポプラ(aspen)、ヤマモモ、ブナノキ、カバノキ（春季）、カバノキ（白）、ボトルブラッシュ、トネリコバカエデ、イナゴマメ木、スギ、限定するものでなく日本スギを含む、サクランボ、クリ、ハコヤナギ、イトスギ、ニワトコの木、ニレ（アメリカ）、ユーカリノキ、モミ、エノキ、ヘイゼルナッツ、ヘムロック(hemlock)、ヒッコリ、アサダ、鉄木、ビャクシン、イナゴ、カエデ、コバノブラッシノキ(melaleuca)、メスキート、バイカウツギ、クワ、オーク（白）、オリーブ、オレンジ、オーセージ・オレンジ(osage orang)、パロ・バーデ(palo verde)、桃、西洋ナシ、ペカン、コショウの木、松、プラム、ポプラ、イボタノキ、アメリカスギ材、ホソバグミ、トウヒ、モミジバフウ、スズカケノキ、アメリカカラマツ、神樹、クルミおよびヤナギを含む。草花粉抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：バヒア(bahia)、オオムギ、浜辺の雑草、カヤツリ草、バミューダ草、ブルーグラス（ケンタッキー）、スズメノチャヒキ、バンチ(brome)、カナリアクサヨシ、チェス(chess)、とうもろこし、ウシノケグサ（草原）、グラーマグラス、ジョンソン(johnson)、ジューン(johnson)草、コエラー(koeler's)、オート麦、カモガヤ、インチキ草(quack)、コヌカグサ、ライ麦草（多年草）、塩(salt)、モロコシ、スーダングラス、甘い芽生えの草(sweet vernal grass)、オオアワガエリ、ベルベットグラス(velvetgrass)、小麦およびホイートグラスを含む。雑草及び栽培植物抽出物の例には、限定するものではないが、以下の：アルファルファ、アマランス、シナギク、ホウセンカ根、バッシア(bassia)、浜辺イガ、花をつける雑草(broomwood)、バローブッシュ(burrow bush)、ケアレス雑草、トウゴマ、ｃｈａｍｉｓｅ、クローバ、オナモミ、ハルシャギク、コスモス、スイセン、ダリア、デイジー、タンポポ、ギシギシ(dock)、カミルレモドキ、焼け跡に生える雑草、グラジオラス、アキノキリンソウ、グリースウッド、アサ、スイカズラ、ホップ、イオドンブッシュ(iodone bush)、エルサレムオーク、コキア、子羊のクォータース(lamb's quarters)、ユリ、マリゴールド、キンセンカ(marshelder)、メキシコのお茶、ヨモギ、マスタード、イラクサ(nettle)、ピックルウィード(pickleweed)、アカザ、未加工緑のバナナ（イギリス）、ポピー、貧窮状態の雑草(povertyweed)、ウズラ草(quailbush)、ブタクサ（巨大なもの）、ブタクサ（短いもの）、ブタクサ（西洋のもの）、バラ、ラッシャンシスル、よもぎ、ソルトブラッシュ(saltbrush)、鱗屑、エニシダ、マツナ、ヒメスイバ、キンギョソウ、テンサイ、ヒマワリ、西洋の水麻、ウィンターファット(winter fat)、駆虫草、ヨモギを含む。
【００８２】
好ましい実施態様では、花粉抽出物はライ麦を含むか、あるいは選択的にそれからなる。
ブタクサ花粉の季節的な出現（９月〜１０月）は、多くの個体において喘息を誘発する(Marshall, J.ら., J. Allergy Clin. Immunol.108: 191-197 (2001))。喘息は、肺炎症、可逆気流閉塞および気道過敏反応によって特徴づけられる。空気アレルゲンに対する免疫学的応答の複合的カスケードにより気道の白血球が漸増する。具体的には、リンパ球、マクロファージ、好酸球、好中球、プラズマ細胞およびマスト細胞は、気管支の粘膜に浸透する(Redman, T.ら., Exp. Lung Res. 27: 433-451 (2001))。好酸球漸増は、ＴＨ２サイトカインＩＬ―4およびＩＬ―5の産生増加と関連しており、慢性の炎症性過程を起こす喘息病因における重要な要因である(Justice, J.ら., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282: L302-L309 (2002)、その内容全体が出典明記によりここに組み込まれる。短いブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)の免疫主体ブタクサアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １である (Santeliz, J.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 109:455-462 (2002))。本発明の特定の実施態様では、組成物は、ウイルス様粒子と混合した又は連結したＡｍｂ ａ １を含む。
さらに他の好ましい実施態様では、塵抽出物は、ハウスダストおよび塵ダニを含むか、あるいは選択的にそれよりなる。ハウスダストの例には、限定するものではなく：ハウスダスト、マットレス塵およびupholstrey塵を含む。塵ダニの例には、限定するものでなく、コナヒョウヒダニ(D. farniae)、ヤケヒョウヒダニ(D. ptreronysiinus)、ダニ混合物およびサヤアシニクダニ(L. destructor)を含む。塵抽出物もまた、限定するものでなく、スギおよびベイスギ粉塵、綿繰り機塵、オーク粉、穀物（昇降機）の粉末、パドック(paduk)塵および木材の塵を含む。
【００８３】
粉塵ダニは、先進諸国の湿潤な気候の家の長期に存在する屋内のアレルゲンの重要な出所である(Arlian, L., Current Allergy and Asthma Reports I: 581-586 (2001))。全てのアレルギー性気管支喘息患者の約６０〜８５％は、ハウスダストダニであるヤケヒョウヒダニ(Dermatophogoldes pteronyssinus)に対して感受性が高い(Arlian, L., Current Allergy and Asthma Reports I: 581-586 (2001))。免疫主体ヤケヒョウヒダニ(D. pteronyssinus)粉塵ダニアレルゲンにはＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２及びＤｅｒ ２が含まれ（Kircher, M.ら., J. Allergy Clin. Immunol.109: 517-523 (2002)及びClarke, A.ら., Int. Arch. Allergy Immunol. 120:126-134 (1999)、その内容の全体は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明の特定の実施態様では、組成物がウイルス様粒子に連結又は混合したＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ２又はその断片、あるいはその抗原性部位の混合を含む。粉塵に対するアレルギー反応の重要な原因は、特に農業地域において、サヤアシニクダニ(Lepidoglyphus destructor)である(Ericksson, T.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001))。免疫優性サヤアシニクダニ粉塵ダニアレルゲンは、Ｌｅｐ ｄ ２である (Ericksson, T.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001))。本発明の特定の実施態様では、組成物は、ウイルス様粒子に連結した又はウイルス様粒子と混合したＬｅｐ ｄ ２を含む。
【００８４】
好ましい実施態様では、真菌類抽出物は、アルタナリア、コウジカビ、ボトリティス、カンジダ、セファロスポリウム、セファロセシウム(cephalothecium)、ケトミウム、クラドスポリウム、クリトコッカス(crytococcus)、カルバラリア、エピコッカム、エピデルモフィトン、フザリウム、ゲラシノスポラ(gelasinospora)、ゲオトリクム、グリオクラジウム(gliocladium)、ヘルミント スポリウム、ホルモデンドラム(hormodendrum), ミクロスポラム(microsporium)、ムコール、マイコゴン(mycogone)、ニグロスポラ(nigraspora)、パエキロミケス(paecilomyces)、ペニシリウム、フォーマ(phoma)、プルラリア(pullularia)、リゾプス、ロドトルラ、ルスツ(rusts)、サッカロマイセス、スムツ(smuts)、スポンディロクラジウム(spondylocladium)、ステムフィリウム(trichoderma)、トリコフィトン及びバーティシリウムを含むか、あるいは選択的にこれからなる。
アルテルナリア・アルテルナータは、米国で最も重要な真菌原因アレルギー疾患の一つと考えられている。アルテルナリアは米国及びオーストラリアの砂漠地域での主な喘息関連アレルゲンであり、米国ミッドウェスト地域で深刻な呼吸停止と死を引き起こすことが報告されている（Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001)及びShampain, M.ら., Am. Rev. Respir. Dis. 126:493-498 (1982)、その内容の全体が出典明記により本明細書中に組み込まれる）。免疫主体アルテルナリア・アルテルナータ抗原はＡｌｔ ａ １である(Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001))。アルテルナリア感受性個体の８０％以上はＡｌｔ ａ １に対してＩｇＥ抗体を持つ(Vailes, L.ら., Clinical and Exp. Allergy 31:1891-1895 (2001))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合したＡｌｔ ａ １を含む。
【００８５】
他の日和見性真菌類はアスペルギルス・フミガタスであり、その真菌はアレルギー性喘息を含む肺疾患の広域抗菌スペクトルに関与する。免疫主体アスペルギルス・フミガタステストは、Ａｓｐ ｆ １と、Ａｓｐ ｆ １６とを含む(Vailes, L.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合したＡｓｐ ｆ １又はＡｓｐ ｆ １６又はその抗原の混合を含む。
他の好ましい実施態様では、昆虫抽出物には、全身にアレルギー性反応を誘発する刺す虫、毒物タンパク質がアレルギー性反応を誘発する刺す虫、及び吸入してアレルギー性反応を誘発する昆虫を含むか、あるいは選択的にこれからなる。限定するものではないが、全身にアレルギー性反応を誘発する刺す虫の例として、アリ（黒）、アリ（赤）、アリ（カーペンター）、アリ混合（黒／赤）、アリ（ファイア）が含まれる。限定するものではないが、毒物タンパク質がアレルギー性反応を誘発する刺す虫の例には、蜂蜜ミツバチ、黄色のスズメバチ(yellow hornet)、スズメバチ(wasp)、ホホナガスズメバチ(yellow jacket)、クロスズメバチ(white-faced hornet)および混合スズメバチが含まれる。限定するものではないが、吸入してアレルギー性反応を誘発する昆虫の例には、アブラムシ、黒色のハエ、チョウ、トビケラ、セミ／イナゴ、コオロギ、ゴキブリ、ミジンコ、シギアブ、ショウジョウバエ、蜂蜜ミツバチ（全身）、アブ、イエバエ、ヨコバイ、トビケラ、メキシコの豆ゾウムシ、ダニ（粉塵）、蚊、ガ、キノコハエ、ラセンウジバエ、ワラジムシ、クモ、及び、ミジンコ科が含まれる。
【００８６】
他の好ましい実施態様では、食物抽出物は動物製品及び植物製品を含むか、あるいは選択的にこれからなる。
限定するものではないが、動物製品の例には、牛肉、ニワトリ、シカ、カモ、卵（ニワトリ）、魚、ヤギ、ガチョウ、ラム、牛乳（ウシ）、牛乳（ヤギ）、豚肉、ウサギ、甲殻類およびシチメンチョウが含まれる。限定するものではないが、植物製品の例には、リンゴ、アプリコット、クズウコン、アーティチョーク、アスパラガス、アボガド、バナナ、豆、ビート、ベリー類、キャベツ科、ニンジン、セロリ、サクランボ、チョコレート、柑橘類果実、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、ナツメヤシ、ナス、穀物、ブドウ、グリーン、ゴム、ホップ、レタス、麦芽、マンゴー、メロン、キノコ、ナッツ類、オクラ、オリーブ、タマネギ、パパイア、通称サトウニンジン、エンドウ、南京豆、西洋ナシ、ピーマン、パイナップル、プラム、ジャガイモ、プルーン、西洋カボチャ、ラディッシュ、ダイオウ、香辛料／調味料、ホウレンソウ、カボチャ、タピオカ、お茶、トマト、スイカおよび酵母が含まれる。
【００８７】
９５％以上のピーナッツアレルギー患者に感知される２つの主なアレルギーピーナッツタンパク質は、Ａｒａ ｈ １とＡｒａ ｈ ２である(Bannon, G.,ら., Int. Arch. Allergy Immunol. 124:70-72 (2001)及びLi, X.ら., J. Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000)、この内容の全体は出典明記により本明細書中に組み込まれる）。Ａｒａ ｈ ３は約４５％のピーナッツアレルギー患者に感知される(Li, X.,ら., J Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000))。本発明の特定の実施態様では、本組成物はウイルス様粒子と連結した又はウイルス様粒子と混合した抗原Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２又はＡｒａ ｈ ３又はその抗原の混合を含む。
【００８８】
他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、哺乳動物上皮性アレルゲンには、ラクダ、ネコ体毛、ネコの毛皮、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、スナネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ブタ、ウマ、アンゴラ山羊の毛（モヘア）、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）が含まれる。更に他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、羽毛にはカナリア、ニワトリ、カモ、ガチョウ、インコ、ハト、シチメンチョウが含まれる。他の好ましい実施態様では、限定するものではないが、他の吸入物質には、アカシア、藻類、ヒマの実、木綿リンター、綿実、デリス、シダ胞子、穀物粉塵、アサ繊維、ヘンナ、亜麻仁、ガーゴム、ジュート、インドゴム、カポック、革、リコポジウム、オリス根、ジョチュウギク、絹（生）、サイザル麻、タバコの葉、トラガカントゴムおよび木材の粉塵が含まれる。
他の好ましい実施態様では、一般的に定義された哺乳動物のアレルゲンは、天然源から生成したもの又は組み換え発現させたものの何れかを含む。限定するものではないが、これらには、ネコからのＦｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ３（シスタチン）、及び、ネコ、ラクダ、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、スナネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ブタ、ウマ、アンゴラ山羊の毛、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）からのアルブミンが含まれる。
【００８９】
癌を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われ（参照により組み込まれている、Renkvist他、Cancer.Immunol.Immunother.50:3-15(2001)を参照のこと）、このような抗原又は抗原決定基は本発明の範囲内に含まれる。このような型の抗原又は抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経こう腫）；ＣＥＡ（延髄甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００エピトープ、例としてアミノ酸１５４−１６２（配列：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ、配列番号１４）、２０９−２１７（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ、配列番号１５）、２８０−２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ、配列番号１６）、４５７−４６６（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ、配列番号１７）および４７６−４８５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ、配列番号１８）など；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ、例としてアミノ酸２６−３５（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号３７）、２６−３５ＡＬ（ＥＬＡＧＩＧＩＣＴＶ、配列番号３８）、２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１９）、および３２−４０（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ、配列番号２０）など；チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質（たとえば、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）；チロシナーゼ・エピトープ、例としてアミノ酸１−９（ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ、配列番号２１）および３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、配列番号２２）など；ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質；ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質エピトープ、例としてアミノ酸３８−６４（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ、配列番号２３）など；ＭＡＧＥ−３タンパク質；ＭＡＧＥ−３タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、配列番号２４）など；他のヒト腫瘍抗原、たとえばＣＥＡエピトープ、例としてアミノ酸５７１−５７９（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ、配列番号２５）など；ｐ５３タンパク質；ｐ５３タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸６５−７３（ＲＭＰＥＡＡＰＰＶ、配列番号２６）、１４９−１５７（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ、配列番号２７）および２６４−２７２（ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ、配列番号２８）など；Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープ、例としてアミノ酸３６９−３７７（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ、配列番号２９）および６５４−６６２（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ、配列番号３０）など；ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質；ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質エピトープ、例としてアミノ酸８６−９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ、配列番号３１）など；およびそれぞれの断片又は変異体があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【００９０】
自己抗原と関連がある他の疾患又は状態を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択も、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原又は抗原決定基の代表的な例は、たとえばリンフォトキシン（たとえば、リンフォトキシンα（ＬＴα）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ）、およびリンフォトキシン受容体、核因子ｋａｐｐａＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ）、破骨細胞関連レセプター（ＯＳＣＡＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン１７およびアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｒａｎｋ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、オンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、エンドグリン、エオタキシン、グレーリン、ＢＬＣ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ブラジキニン、レジスチン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、ＧＩＨ、ＣＲＨ、ＴＲＨおよびガストリン、およびそれぞれの断片であり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【００９１】
本発明の特定の実施態様では、抗原又は抗原決定基は（ａ）ＨＩＶの組み換えポリペプチド；（ｂ）インフルエンザ・ウイルスの組み換えポリペプチド（たとえば、インフルエンザ・ウイルスＭ２ポリペプチド又はその断片）；（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組み換えポリペプチド；（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えポリペプチド；（ｅ）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａの組み換えポリペプチド；（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組み換えポリペプチド；（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの組み換えポリペプチド；（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅの組み換えポリペプチド；（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅの組み換えポリペプチド；（ｊ）乳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｋ）腎臓癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｌ）前立腺癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｍ）皮膚癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｎ）脳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｏ）白血病細胞の組み換えポリペプチド；（ｐ）組み換えプロファイル；（ｑ）ハチ刺されアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｒ）ナッツ・アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｓ）花粉の組み換えポリペプチド；（ｔ）室内埃の組み換えポリペプチド；（ｕ）ネコ又はネコの毛アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｖ）食物アレルギーの組み換えタンパク質；（ｗ）喘息の組み換えタンパク質；（ｘ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの組み換えタンパク質；（ｙ）（ａ−ｘ）に挙げた何れかのタンパク質源から抽出した抗原；および（ｚ）（ａ）〜（ｘ）に挙げた何れかのタンパク質の断片からなる群から選択される。
【００９２】
本発明の他の実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージ化したウイルス様粒子と連結あるいは混合した抗原は、細胞障害性又はＴｈ細胞何れかのＴ細胞エピトープである。本発明の他の実施態様では、本発明の免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージ化したウイルス様粒子と連結あるいは混合した抗原は、Ｂ細胞エピトープである。更なる好ましい実施態様では、抗原は、少なくとも２つの、好ましくは異なるエピトープの組み合わせであり、その少なくとも２つのエピトープは直接又はリンカー配列によって連結している。このエピトープは好ましくは細胞障害性及びＴｈ細胞エピトープからなる群から選択される。
本発明の抗原、および特に示した１個又は複数個のエピトープは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、合成、あるいは組み換えによって発現、ウイルス様粒子と結合、あるいはウイルス様粒子と融合することができる。抗原とウイルス様粒子の結合を記載する代表的な手順は、ＷＯ００／３２２２７中、ＷＯ０１／８５２０８中、およびＷＯ０２／０５６９０５中に開示されており、それらの開示は参照によりここに組み込まれている。
【００９３】
また本発明は疾患又は症状を予防する及び／又は寛解するために用いることができるワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫亢進組成物と薬学的に受容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とを含むか、あるいは選択的にそれらからなる。
さらに本発明は動物の疾患又は症状を予防する及び／又は寛解するためのワクチン接種方法を提供する。一実施態様では、本発明は広い範囲の動物種、特にヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの哺乳動物種の感染性疾患を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス病因の感染症、例えばＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、イプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘など；または、細菌病因の感染症、例えば肺炎、結核、梅毒など；または、寄生虫病因の感染症、例えばマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの治療をするために設定することができる。
他の実施態様では、本発明は広い範囲の動物種、特にヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの哺乳動物種の癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、限定するものではないが、リンパ腫、上皮癌、肉腫および黒色腫を含むすべてのタイプの癌を治療するために設定することができる。
【００９４】
当業者は理解されていると思われるが、本発明の組成物を動物に投与するとき、それらは、組成物の有効性を向上させるのに望ましい、塩、バッファー、アジュバント又は他の物質を含む、組成物の形であってよい。薬剤組成物の調製において使用するのに適した物質の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol,A,ed.、Mack Publishing Co.、(1990))を含めた多数の源中に与えられる。
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。さらに、本発明の組成物は、「治療上有効量」（すなわち、望ましい生理学的効果を生み出す量）で投与される。
本発明の組成物は、当分野で知られているさまざまな方法によって投与することができる。選択される個々の形式は、選択される個々の組成物、治療される状態の重度、および治療効果のために必要とされる用量に、当然ながら依存するであろう。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に許容される任意の投与形式、すなわち臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生成する、任意の形式を使用して行うことができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、脳槽内(intracistemal)、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口又は鼻部スプレーとしての投与がある。本明細書で使用する、用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む、投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。
【００９５】
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水）又は非水溶液および懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
付随的に、たとえば混合物として、あるいは別々に、組合せを投与することができるが、一斉にすなわち同時に、あるいは順次に投与することもできる。このことは、組合せ物質が治療用混合物と共に投与されること、および組合せ物質が一斉にではなく別々に、たとえば別の静脈内経路によって同じ個体に投与される手順の表示を含む。「組合せ」投与は、所与の成分又は物質の１つを最初に、次に第２のものを別々に投与することをさらに含む。
用量レベルは、投与形式、被験者の性質、および担体／アジュバント製剤の質に依存する。ＶＬＰ、抗原及びアジュバントの典型的な量は、被験者当たり約０．００１μｇ〜約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、被験者当たり少なくとも約１０μｇ〜約５００μｇである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。抗原の典型的な量はＶＬＰを添加しないで投与するときに典型的に用いる範囲に匹敵するか、同様であるか、同じである。
【００９６】
本組成物は、好都合なことに単位用量の形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。それらの方法は、本発明の組成物と１つ又は複数の追加成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に、これらの組成物は、本発明の組成物を均一かつ完全に、液状担体、微細固形担体、又はこの両方と結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として存在することができ、それぞれが所定量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性の液体又は非水性の液体に懸濁させた懸濁液、シロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含んでよい。このような送達系によって、前に記載した本発明の組成物の繰り返しの投与を避けることができ、被験者および医者に対する利便性が高まる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
本発明の他の実施態様は、本発明の組成物を生成するための方法、および前記組成物を使用する癌およびアレルギーの医学的な治療の方法を含む。
【００９７】
ゆえに、特に本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と連結又は混合した抗原及びＴＬＲリガンドとともに、免疫賦活性核酸、好ましくは非メチル化Ｃ及びＧ（ＣｐＧ）内のＤＮＡオリゴヌクレオチドリッチを負荷した又はパッケージ化したＶＬＰがその抗原に対する免疫応答の亢進を誘導するという発見に関する。驚くことに、ＴＬＲリガンドを組成物に添加するとこの免疫原生は劇的に亢進する。加えて、抗原に対するＴ細胞応答は特にＴｈ１型に関する。
【００９８】
以下の実施例は単なる例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態および変形形態を本発明の方法で作製することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の変更形態および変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、含むことが考えられる。
本明細書で言及するすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全容を参照により明確に組み込んである。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ＶＬＰの生成
ＬＣＭＶ由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇのＤＮＡ配列を、配列番号１２に示す。ｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ）を、以下のように生成させた：Ｂ型肝炎ウイルスの完全なウイルス・ゲノムを含むＢ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。発現プラスミドの生成についてはすでに記載されている（ＷＯ０３／０２４４８１を参照）。
よく発現させるために選択した大腸菌Ｋ８０２のクローンにプラスミドを形質移入し、細胞を増殖させ、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中に再懸濁した。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理の後、４μｌのベンゾナーゼおよび１０ｍＭのＭｇＣ１２を加え、懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みを保持した。
【０１００】
次に、２０％（ｗ／ｖ）（０．２ｇ／ｍｌの溶解物）硫酸アンモニウムを、上澄みに加えた。氷上で３０分間のインキュベーション、および４℃、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを捨て、ペレットを２〜３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍｌのＰＢＳ溶液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテクノロジーＡＧ）に負荷し、画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに負荷し、精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰキャプシドを含む画分を集めた。集めた画分は、ヒドロキシアパタイト・カラムに負荷した。流動物（精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ ＶＬＰキャプシドを含む）を回収した。電子顕微鏡法は、標準的なプロトコルに従って行った。代表的な例を、Storni T.,ら.,(2002) J Immunol.; 168(6):2880-6の表１に示す。
ペプチドｐ３３を含むＶＬＰは都合よいという理由でのみ用いたのであって、同様に野生型ＶＬＰは本発明に用いることができるということを注記する。本明細書にわたって、ｐ３３-ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ、ＨＢｃＡｇ-ｐ３３ ＶＬＰ、ｐ３３-ＶＬＰ及びＨＢｃ３３は交換可能に用いた。
【０１０１】
実施例２
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＨＢｃＡｇ ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
実施例１に記載した組み換えＶＬＰに、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）を行い、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質を検出するために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した（図１）。細菌生成ＶＬＰは高レベルの一本鎖ＲＮＡを含み、これはおそらく、ＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端の近くに現れ、Ｘ線結晶解析によって示されるように、形状的にはＶＬＰの内側に位置している、アルギニン反復配列と結合している。混入したＲＮＡは容易に消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅＡをインキュベートすることによって排除することができる。非常に活性があるＲＮａｓｅ Ａ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有しており、おそらく十分小さいので、ＶＬＰに入り望ましくないリボ核酸を排除する。
組み換えＶＬＰに、ＲＮａｓｅ Ａによる消化前に、ＣｐＧ豊富なオリゴヌクレオチド（配列番号１１を参照）を補った。図２に示すように、未処理ｐ３３−ＶＬＰと比較して同じ移動を示すので、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドはキャプシド構造を有している。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド含有ＶＬＰを、透析（３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜を使用して、２４時間、ＰＢＳにて４５００倍希釈）によって、非結合オリゴヌクレオチドから精製した（図３を参照）。
【０１０２】
実施例３
ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅによりＲＮＡを除去し、その後オリゴヌクレオチドをＶＬＰ中にパッケージ化することによって、ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ＶＬＰ（細菌一本鎖ＲＮＡを含み、実施例１に示すように生成した）を、第一には、ＲＮａｓｅ Ａと共にインキュベートしてＲＮＡを除去し、第二のステップでは、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（通常のリン酸ジエステル分子を含むだけでなく、リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体も含む）を、サンプルに補った（図４）。この実験によって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解反応中に必ずしも同時に必要とされるわけではなく、後で加えることができることが明らかに示される。
【０１０３】
実施例４
ＲＮＡｓｅ消化によるＲＮＡバクテリオファージＱｂ内へのＣｐＧオリゴヌクレオチドのパッケージ化
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰをこの実験に用いた。未処理のままかリン骨格のホスホロチオエート修飾体を有するＣｐＧ-２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とパッケージ化した後に用いた。ＣｐＧ-２００６のパッケージ化は、０．２ｍｌの１００ｍＭ ＺｎＳＯ４溶液の存在下にて８ｍｌのＱｂＶＬＰ溶液（２．２ｍｇ／ｍｌ）を６０℃で一晩インキュベーションすることによって行った。この処理によって、ＱｂＶＬＰ内に含まれるＲＮＡの加水分解が行われる。透析チューブ（カットオフＭＷＣＯ３０００００）を用いて２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．５にて透析した後、１ｍｌ ＶＬＰ溶液当たり１３０ｎｍｏｌのＣｐＧ-２００６を添加し、６５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３時間インキュベートした。続いて、１ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にて５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ(Merck)にて３７℃で３時間処理して、上記のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．５にて透析することによって、パッケージ化されなかったＣｐＧ-２００６を除去した。パッケージ化されたＣｐＧ-２００６をアガロースゲル電気泳動を行ってエチジウムブロマイドにて核酸を可視化し、続いてクーマシーブルーにてタンパク質を可視化して、確認した。加えて、パッケージ化ＶＬＰをＴＢＥ尿素ゲルにて分析し、パッケージ化されたＣｐＧ-オリゴヌクレオチドの量を推定した。約６．７ｎｍｏｌのＣｐＧ-２００６が１００μｇのＱｂＶＬＰ内にパッケージ化された。
【０１０４】
実施例５
ＶＬＰ内への免疫賦活性核酸のパッケージ化
ＶＬＰの核酸内容物の分解に関与するＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４
低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＱβ ＶＬＰをＲＮａｓｅＡ処理した。あるいは、実施例１１と同様に低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＡＰ２０５ ＶＬＰをＺｎＳＯ４処理した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,１ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ７．４の何れかにあるＡＰ２０５ ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を５５０ｒｐｍのＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて２．５ｍＭ ＺｎＳＯ４にて５０℃で４８時間処理し、ＡＰ２０５ ＶＬＰ試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を１０．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１２８１１８）を用いてはじめに21２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後一晩透析した。透析後、実施例４に記載のように試料を確認し、上清中のタンパク質濃度をBradford分析によって測定した。
【０１０５】
ＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４処理したＶＬＰ内へのＩＳＳのパッケージ化
ＲＮＡ加水分解及び透析の後、Ｑβ及びＡＰ２０５ ＶＬＰｓ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）をＶＬＰ １ｍｌ当たり１３０μｌのＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＮＫＣｐＧ−表１を参照；Ｇ３−６、Ｇ８−８−表２を参照；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８に含まれる１ｍＭ オリゴヌクレオチド)と混合した。試料を６５０ｒｐｍのサーモシェイカーを用いて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、試料を２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ １ｍｌ当たり125 Uのベンゾナーゼ(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)にて処理し、透析前に３７℃で３時間インキュベートした。試料を３００．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１３１４４７）を用いて２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後同じバッファーにて一晩透析した。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド及びクーマシーブルーにて染色してＶＬＰ内にパッケージ化されたオリゴヌクレオチドを確認した。
【０１０６】
実施例６
ＶＬＰ内にパッケージ化されるリボ核酸
ＶＬＰの核酸内容物のＺｎＳＯ４依存性分解
実施例１１の記載と同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＱβ ＶＬＰをＲＮａｓｅＡ処理した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,１ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ７．４の何れかにあるＡＰ２０５ ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を５５０ｒｐｍのＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて２．５ｍＭ ＺｎＳＯ４にて５０℃で４８時間処理した。Ｑβ及びＡＰ２０５ ＶＬＰ試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、実施例８のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて透析した。
ＺｎＳＯ４処理したＶＬＰ内へのポリ（Ｉ：Ｃ）のパッケージ化
免疫賦活性核酸ポリ（Ｉ：Ｃ）(カタログ番号２７−４７３２−０１、poly(I)・poly(C), Pharmacia Biotech)をＰＢＳ（Invitrogen カタログ番号１４０４０）又は水にて４ｍｇ／ｍｌ（９μＭ）の濃度に溶解した。ポリ（Ｉ：Ｃ）を６０℃で１０分間インキュベートして、３７℃に冷ました。インキュベートしたポリ（Ｉ：Ｃ）をＺｎＳＯ４処理したＱβ又はＡＰ２０５ ＶＬＰ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）何れかに１０倍モル過剰量で添加し、この混合物を６５０ｒｐｍのサーモミキサーにて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、３００ｒｐｍのサーモミキサーを用いて２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ １ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼにて３７℃で３時間インキュベーションすることによって過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を酵素学的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解の後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を３００．０００ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，カタログ番号１３１４４７）を用いて21２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて４℃で２時間、バッファー交換の後同じバッファーにて一晩透析した。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
パッケージ化は１％アガロースゲル、及びプロテイナーゼＫ消化の後にＴＢＥ／尿素ゲルにて確認した。
【０１０７】
実施例７
ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ内にパッケージ化されるリボ核酸
実施例１１の記載と同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４又は４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．４）下にてＨＢｃＡｇ ＶＬＰをＺｎＳＯ４処理し、実施例２２のように２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,ｐＨ７．４にて透析する。ポリ（Ｉ：Ｃ）を１０倍モル過剰量でＨＢｃＡｇ ＶＬＰ（１−１．５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、実施例２４に記載のように６５０ｒｐｍのサーモミキサーにて３７℃で３時間インキュベートした。続いて、３００ｒｐｍのサーモミキサーを用いて２ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下にてＶＬＰ混合物 １ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼにて３７℃で３時間インキュベーションすることによって過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を酵素学的に加水分解した。実施例４の記載と同様にベンゾナーゼ加水分解の後、試料を確認し、実施例９のように透析する。透析後、試料を１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０１０８】
実施例８
ＣｐＧのみがｐ３３融合ＨＢｃＡｇ（ｐ３３-ＶＬＰ）に対してＣＴＬ応答を亢進することができる。
ｐ３３-ＶＬＰを以下のように生成した：Ｂ型肝炎ウイルスの完全なウイルス・ゲノムを含むＢ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子を発現ベクターｐＫＫ２２３．３(Amersham Pharmacia Biotech Inc., NJ)のｔａｃプロモータ制御下にあるＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に導入した。標準的ＰＣＲ法によって３つのロイシンリンカーを介してＬＣＭＶ由来のｐ３３ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）（配列番号６０）をＨＢｃＡｇ（ａａ１−１８３）のＣ末端に融合した。大腸菌Ｋ８０２ｄにプラスミドを形質移入し、２リッター培養液にて好適な集密度１（６００ｎｍ波長）になるまで成長させた。最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＣ(Sigma, Division of Fluka AG, Switzerland)を４時間添加することによって細胞を誘導した。ついで、遠心分離によって細菌を回収し、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ７．０）に再懸濁した。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理後、４μｌのベンゾナーゼ(Merck, Darmstadt, Germany)及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を細胞溶解物に添加した。ついで、懸濁液を室温にて３０分インキュベートし、２７０００×ｇにて１５分間遠心分離した。取り出した上清に２０％（ｗ／ｖ）アンモニウム硫酸塩を添加した。氷上にて３０分間インキュベートして４８０００×ｇにて１５分間遠心分離した後の上清を捨て、ペレットを２−３ｍｌのリン酸生理的緩衝液に再懸濁した。この調整物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ゲル濾過カラム(Amersham Pharmacia Biotech Inc., NJ)に負荷して精製した。分画をタンパク質内容物についてＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにて分析し、純粋なＨＢｃキャプシドを含む試料を貯蔵した。常套的なプロトコールに従って電子顕微鏡検査を行った。マウスを種種のＴＬＲリガンド（各１００μｇ）を有するｐ３３ ＶＬＰ（１００μｇ）にて免疫化した（図５参照）：
【０１０９】
ＬＰＳ（大腸菌Ｋ-２３５）をシグマ(Buchs, Switzerland)より、ポリ（Ｉ：Ｃ）をアマシャムバイオサイエンス(Dubendorf, Switzerland)より、ペプチドグリカン（黄色ブドウ球菌(S. aureus)）をＦｌｕｋａ(Buchs, Switzerland)より、, イミクイモダム(Imiquimodum)（AldaraＴＭクリームとして３Ｍ(Ruschlikon, Switzerland)より購入した。リポテイコ酸（黄色ブドウ球菌及び連鎖球菌）はＬＵＮＡＭｅＤ ＡＧ(Zurich, Schwitzerland)より快く提供していただいた。ホスホロチオエート修飾体ＣｐＧ-ＯＤＮはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ(Balgach, Switzerland)により合成した。１２日後、血中のｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって評価した。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Lympholyte-M 溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにて細胞を分析した。
図５は、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧを除いて、多種のＴＬＲリガンドがＢ型肝炎コア抗原に融合したペプチドｐ３３（ｐ３３−ＶＬＰｓ）に対してＴ細胞応答を亢進しないことを示す。ＰＢＳ又はＴＬＲの示した刺激の存在下でｐ３３−ＶＬＰｓにてマウスを免疫化した。１００μｇのＨＢｃ３３と１００μｇのアジュバントを用いた。ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって８日後に評価した。それぞれのバーは個々のマウスを示す。（ＬＴＡ＝リポテイコ酸、ＰＧＮ＝ペプチドグリカン、大腸菌Ｋ−２３５由来のＬＰＳ、Sigma）。
【０１１０】
実施例９
Ａｌｕｍ及びＩＦＡなどの古典的アジュバンドはｐ３３特異的ＣＴＬ応答を亢進しない
常套的プロトコールに従ってＣｙＣｐＧｐｔ（２０ｎｍｏｌ）、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にて１００μｇのｐ３３融合ＨＢｃＡｇ（ｐ３３-ＶＬＰ）でマウスを免疫化して、１２日後、肝臓ＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ）にて負荷試験して、抗ウイルス保護を評価した。５日後、脾臓中のウイルス力価を測定した。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した２％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて脾臓をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＭＣ５７細胞にて力価測定した。１時間のインキュベーション後、５％胎仔ウシ血清、１％メチルセルロース及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を含むＤＭＥＭにて細胞の表面を覆った。３７℃で２時間のインキュベーションの後、細胞内染色手順（ウイルスの各タンパク質を染色する）によって細胞のＬＣＭＶ感染について評価した：細胞を４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した後、１％トリトンＸ-１００にて２０分間溶解を行った。１０％胎仔ウシ血清にて１時間インキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。ラット抗ＬＣＭＶ抗体（ＶＬ-４）にて細胞を１時間染色した。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc)を二次抗体として用いて、標準的な手順に従ってＯＤＰ基質の色素反応を行った（図６）。
図６は、代表的なアジュバントであるＡｌｕｍ及びＩＦＡがＶＬＰ誘導性免疫を亢進しないことを示す。ＰＢＳ、ＣｐＧ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３−ＶＬＰｓでマウスをワクチン処理して、８日後、肝臓ＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ）にて負荷試験した。脾臓中のウイルス力価を５日後に測定した。
【０１１１】
実施例１０
ＴＬＲ４リガンドはＣｐＧを負荷したＶＬＰによって誘導されたＴ細胞応答を亢進する
ペプチドｐ３３をＱｂに連結して、実施例７のようにＣｐＧを負荷した。この実験に用いたＣｐＧはＮＫ ＣｐＧ（ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ）（配列番号５２）である。続いて、ＰＢＳ、ＭＰＬ（Sigma、製造者の指示に従って１：１に混合して用いる）又はＬＰＳ（２０μｇ、大腸菌Ｋ-２３５、Sigma）の存在下にてｐ３３-Ｑｂ／ＣｐＧ（１８０μｇ）にてマウスを免疫化した。１０日後、四量体染色によってｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を測定した（図７Ａ）。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。CellQuestソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてFACSCaliburにて細胞を分析した。
【０１１２】
同日、ＬＣＭＶ-ＧＰ（ペプチドｐ３３由来）を発現する組み換えワクチンウイルスを腹腔内投与することによってマウスを負荷試験し、５日後に卵巣内のウイルス力価を測定した（図７Ｂ）。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した５％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて卵巣をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＢＳＣ４０細胞にて力価測定した。３７℃で一晩インキュベートした後、付着細胞層を、５０％エタノール、２％クリスタル・バイオレット及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液にて染色して、ウイルスプラークを可視化した。
図７は、ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３連結ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３連結Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。８日後、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色（Ａ）によって評価した。同日に、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクチンウイルスにてマウスを負荷試験し、卵巣中のウイルス力価を５日後に測定した（Ｂ）。
【０１１３】
実施例１１
従来のアジュバンドはＣｐＧを負荷したＶＬＰによって誘導されるＴ細胞応答を亢進する
ペプチドｐ３３をＱｂに連結して、実施例２１のようにＣｐＧを負荷した。この実験に用いたＣｐＧはＮＫ ＣｐＧ（ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ）（配列番号５２）、又はＧ１０−ＰＯ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ）（配列番号５４）である。続いて、標準的なプロトコールに従って、ＰＢＳ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３-Ｑｂ／ＣｐＧ（１８０μｇ）にてマウスを免疫化した。１０日後、四量体染色によってｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を測定した。血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に回収し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ溶液(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Canada)にて１２００ｇ、２２℃で２０分間の密度勾配遠心分離を行うことによってリンパ球を単離した。洗浄の後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＰＥ-標識ｐ３３-Ｈ-２ｂ四量体複合体にて４℃で１０分間染色した後、抗マウスＣＤ８α-ＦＩＴＣ抗体(Pharmingen, クローン53-6.7)にて３７℃で３０分間処理した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences, Mountain View, CA)を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにて細胞を分析した。
【０１１４】
同日、ＬＣＭＶ-ＧＰ（ペプチドｐ３３由来）を発現する組み換えワクチンウイルスを腹腔内投与することによってマウスを負荷試験し、５日後に卵巣内のウイルス力価を測定した。グルタミン、アール塩類及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を添加した５％胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(Gibco)中でホモジナイザーを用いて卵巣をすりつぶした。懸濁液を１０倍希釈工程でＢＳＣ４０細胞にて力価測定した。３７℃で一晩インキュベートした後、付着細胞層を、５０％エタノール、２％クリスタル・バイオレット及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液にて染色して、ウイルスプラークを可視化した。
【０１１５】
表１：本明細書にわたって使用したいくつかの免疫賦活性核酸の用語と配列
小文字はホスホロチオエート結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示し、一方で大文字はホスホジエステル結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＲＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えによって生成させたＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２）において、３７℃で２時間インキュベートした。その後これらのサンプルに、６倍濃縮したＤＮＡローディング・バッファー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を添加し、１％の純粋なアガロース・ゲル中に１００ボルトで３０分間展開した。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰに含有されるＲＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。独立した３実験において、同一の結果を得た。
【図２】ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、バッファーのみ又はＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下での、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の前にサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ｐ３３−ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰとＲＮａｓｅ Ａの同時インキュベーション用に使用すると、同一の結果を得た。
【図３】ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でのＲＮａｓｅ Ａによる消化とその後の透析（ＶＬＰ非結合ＣｐＧオリゴヌクレオチドを排除するため）の前後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２から５）において、３７℃で２時間インキュベートした。５０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート結合を含む：レーン２および３、リン酸骨格の正常なリン修飾体を含む：レーン４および５）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の前にＶＬＰに加えた。処理した試料を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜(Spectrum Medical Industries Inc.、Houston、USA)を用いてＰＢＳ（４５００倍希釈）で２４時間かけて十分に透析して、過剰なＤＮＡを排除した（レーン３および５）。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。
【図４】ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価するために、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ消化が終了した後にのみＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加えた、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲル電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファーにて０．５μｇ／μｌタンパク質最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）(Sigma、Division of Fluka AG、Switzerland)の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ Ａによる消化の後にのみサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ Ｒｕｌｅｒマーカー(MBS Fermentas GmbH、Heidelberg、Germany)を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。列は、ＶＬＰ内に含有されるＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）又はＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰの再構築に使用すると、同一の結果を得た。
【図５】ＴＬＲ９リガンドＣｐＧを除いて、多種のＴＬＲリガンドがＢ型肝炎コア抗原に融合したペプチドｐ３３（ｐ３３−ＶＬＰｓ）に対するＴ細胞応答を亢進しないことを示す。ＰＢＳ又はＴＬＲの示した刺激の存在下でｐ３３−ＶＬＰｓにてマウスを免疫化した。１００μｇのＨＢｃ３３と１００μｇのアジュバントを用いた。ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって８日後に評価した。それぞれのバーは個々のマウスを示す。（ＬＴＡ＝リポテイコ酸、ＰＧＮ＝ペプチドグリカン、大腸菌Ｋ−２３５由来のＬＰＳ、Sigma）。
【図６】代表的なアジュバントであるＡｌｕｍ及びＩＦＡがＶＬＰ誘導性免疫を亢進しないことを示す。ＰＢＳ、ＣｐＧ、Ａｌｕｍ又はＩＦＡの存在下にてｐ３３−ＶＬＰｓでマウスをワクチン処理して、８日後、肝臓ＬＣＭＶにて負荷試験した（２００ｐｆｕ、静脈内）。脾臓中のウイルス力価を５日後に測定した。
【図７Ａ】ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３結合ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３結合Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。８日後、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色によって評価した。
【図７Ｂ】ＴＬＲ４リガンドがＣｐＧを負荷したｐ３３結合ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を亢進することを示す。ＰＢＳ、ＬＰＳ又はＭＰＬ（１：１混合）の存在下にてＮＫ−ＰＯ ＣｐＧを負荷したｐ３３結合Ｑｂにてマウスをワクチン処理した。（Ａ）と同日に（８日後に）、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクチンウイルスにてマウスを負荷試験し、卵巣中のウイルス力価を５日後に測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ウイルス様粒子；
（ｂ）免疫賦活性核酸；
該免疫賦活性核酸（ｂ）が該ウイルス様粒子（ａ）と結合しており、
（ｃ）該ウイルス様粒子と混合している又は結合している、少なくとも一抗原；と
（ｄ）少なくとも一ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド
を含んでなる、動物の免疫応答を高めるための組成物。
【請求項２】
前記ＴＬＲリガンド（ｄ）が前記ＶＬＰと混合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、およびＴＬＲ１１からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が、リガンド（ｄ）によって活性化されるＴＬＲと異なるＴＬＲを活性化する、請求項１ないし３の何れか一に記載の組成物。
【請求項５】
前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ４のリガンドである、請求項１ないし４の何れか一に記載の組成物。
【請求項６】
前記リガンド（ｄ）が、
（ａ）ＬＰＳ及びその誘導体；
（ｂ）モノスフォリル脂質Ａ及びその誘導体；
（ｃ）ＬＰＳの合成類似体；
（ｄ）ｇｐ９６及びその誘導体；
（ｅ）熱ショックタンパク質；及び
（ｆ）デフェンシン
からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸；
（ｂ）デオキシリボ核酸；
（ｃ）キメラ核酸；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも何れか一の核酸の混合物、
からなる群から選択される、請求項１ないし６の何れか一に記載の組成物。
【請求項８】
前記リボ核酸がポリ-（Ｉ：Ｃ）又はその誘導体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１ないし７及び９の何れか一に記載の組成物。
【請求項１１】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ（配列番号４９）；
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号５１）；
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号５２）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）；及び
（ｅ）「ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３」（配列番号５９）
からなる群から選択される配列を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１０ないし１６の何れか一に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子と非共有結合をしている、請求項１ないし１７の何れか一に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子内にパッケージ化される、請求項１ないし１８の何れか一に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子（ａ）に封入される、請求項１ないし１９の何れか一に記載の組成物。
【請求項２１】
前記パリンドローム配列が、１０以下のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってそのＮ末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってそのＣ末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４０）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４１）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４３）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４４）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４５）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４６）；及び
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４７）
から選択される核酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記パリンドローム配列が少なくとも４及び多くとも９のグアノシン自体の５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体の３’末端に隣接し、好ましくは該パリンドローム配列が少なくとも５及び多くとも８のグアノシン自体の５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも８グアノシン自体の３’末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが配列番号４５の核酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約３００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約６〜約４０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２５の何れか一に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約３００個のヌクレオチド、好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約２０〜約４０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２６の何れか一に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約１０〜約３０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２７の何れか一に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）組み換えオリゴヌクレオチド；
（ｂ）ゲノムオリゴヌクレオチド；
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド；
（ｄ）プラスミド由来オリゴヌクレオチド；
（ｅ）ＰＣＲ産物；
（ｆ）一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
（ｇ）二本鎖オリゴヌクレオチド
から選択される、請求項１ないし２８の何れか一に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）が、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、及びＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウイルス様粒子部位に結合する、請求項１ないし２９の何れか一に記載の組成物。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチド結合部位が非天然に生じるオリゴヌクレオチド結合部位である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ウイルス様粒子部位がアルギニン豊富なリピート配列を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドである、請求項１ないし３２の何れか一に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ４のリガンド、好ましくはＬＰＳ又はその誘導体である、請求項１ないし３３の何れか一に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）がポリ（Ｉ：Ｃ）であり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドである、請求項１ないし３２の何れか一に記載の組成物。
【請求項３６】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）、及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１ないし３５の何れか一に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ウイルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項１ないし３６の何れか一に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ウイルス様粒子（ａ）が組み換えウイルス様粒子であり、好ましくは該ウイルス様粒子が、
（ａ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質；
（ｂ）はしかウイルスの組み換えタンパク質；
（ｃ）シンビス・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｄ）ロタ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｅ）口蹄疫ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｆ）レトロ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｇ）ノーウォーク・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｈ）アルファウイルスの組み換えタンパク質；
（ｉ）ヒト・パピローマ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｊ）ポリオーマウイルスの組み換えタンパク質；
（ｋ）バクテリオファージの組み換えタンパク質；
（ｌ）Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｍ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｎ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｏ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｐ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質；
（ｑ）Ｔｙの組み換えタンパク質；及び
（ｒ）（ａ）〜（ｑ）の組み換えタンパク質の何れかの断片
からなる群から選択される、請求項１ないし３７の何れか一に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組み換えウイルス様粒子が、Ｂ型肝炎ウイルスのコア・タンパク質又はＢＫウイルスＶＰ１タンパク質である、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいは選択的にそれから実質的になるか、あるいは選択的にそれからなり、該ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ；
（ｂ）バクテリオファージＲ１７；
（ｃ）バクテリオファージｆｒ；
（ｄ）バクテリオファージＧＡ；
（ｅ）バクテリオファージＳＰ；
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；
（ｇ）バクテリオファージＭ１１；
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；
（ｋ）バクテリオファージｆ２；
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７；及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含み、該ＲＮＡファージがバクテリオファージＱＢ又はバクテリオファージＡＰ２０５である、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ウイルス様粒子が少なくとも一の第一付着部位を含み、さらに前記抗原（ｃ）が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在しない付着部位；及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在する付着部位；
からなる群から選択される少なくとも一の第二の付着部位を含み、該第二付着部位が該第一付着部位に結合することができる、請求項１ないし４１の何れか一に記載の組成物。
【請求項４３】
アミノ酸リンカーをさらに含み、該アミノ酸リンカーが前記第二付着部位を含むか、あるいは選択的にこれからなる、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）ポリペプチド；
（ｂ）リポタンパク質；及び
（ｃ）糖タンパク質
からなる群から選択される、請求項１ないし４３の何れか一に記載の組成物。
【請求項４５】
前記抗原（ｃ）が組み換え抗原である、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗原（ｃ）が天然源から単離される、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４７】
前記天然源が、
（ａ）花粉エキス；
（ｂ）塵抽出物；
（ｃ）塵ダニ抽出物；
（ｄ）菌類の抽出物；
（ｅ）哺乳類の表皮の抽出物；
（ｆ）羽毛抽出物；
（ｇ）昆虫抽出物；
（ｈ）食物抽出物；
（ｉ）毛髪抽出物；
（ｊ）唾液抽出物、及び、
（ｋ）血清抽出物
からなる群から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）ウイルス；
（ｂ）細菌；
（ｃ）寄生虫；
（ｄ）プリオン；
（ｅ）腫瘍；
（ｆ）自己分子；
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子；
（ｈ）アレルゲン；および
（ｉ）ホルモン
からなる群に由来する、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４９】
前記抗原（ｃ）が腫瘍抗原である、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５０】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２；
（ｂ）ＧＤ２；
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ；
（ｄ）ＣＥＡ；
（ｅ）ＣＤ５２；
（ｆ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；
（ｈ）チロシナーゼ；
（ｉ）ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質；
（ｊ）ＭＡＧＥ−３タンパク質；
（ｋ）ｐ５３タンパク質；
（ｌ）ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）の何れかの抗原の類似体；及び
（ｎ）（ａ）〜（ｍ）の何れかの腫瘍抗原の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗原（ｃ）がアレルゲンである、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５２】
前記アレルゲンが、
（ａ）花粉エキス；
（ｂ）塵抽出物；
（ｃ）塵ダニ抽出物；
（ｄ）菌類の抽出物；
（ｅ）哺乳類の表皮の抽出物；
（ｆ）羽毛抽出物；
（ｇ）昆虫抽出物；
（ｈ）食物抽出物；
（ｉ）毛髪抽出物；
（ｊ）唾液抽出物、及び、
（ｋ）血清抽出物
からなる群由来である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記アレルゲンが、
（ａ）木；
（ｂ）草；
（ｃ）ハウスダスト；
（ｄ）イエダニ；
（ｅ）コウジカビ；
（ｆ）動物の毛髪；
（ｇ）動物の羽毛；
（ｈ）蜂毒；
（ｉ）動物性製品；及び、
（ｊ）植物性製品
からなる群から選択される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）蜂毒ホスホリパーゼＡ２；
（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １；
（ｃ）カバノキ花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；
（ｄ）白色顔スズメバチ(white faced hornet)毒物５Ｄｏｌ ｍ Ｖ；
（ｅ）イエダニＤｅｒ ｐ １；
（ｆ）イエダニＤｅｒ ｆ ２；
（ｇ）イエダニＤｅｒ ２；
（ｈ）塵ダニＬｅｐ ｄ；
（ｉ）真菌類アレルゲンＡｌｔ ａ １；
（ｊ）真菌類アレルゲンＡｓｐ ｆ １；
（ｋ）真菌類アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；及び、
（ｌ）ピーナッツアレルゲン
からなる群から選択される、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５５】
前記抗原（ｃ）が細胞障害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ又は該エピトープの少なくとも２つの組み合わせであり、当該少なくとも２つのエピトープが直接又は連結配列により結合している、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５６】
前記細胞障害性Ｔ細胞エピトープが、
（ａ）ウイルス性エピトープ；
（ｂ）腫瘍性エピトープ；及び
（ｃ）アレルゲン性エピトープ
からなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５７】
前記動物に請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物を含んでなる組成物を導入することを含む、動物の免疫応答を亢進する方法。
【請求項５８】
前記動物が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が前記動物に、皮下、筋内、静脈内、鼻腔内、あるいはリンパ節内に直接導入する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
薬学的に受容可能な希釈剤、担体あるいは賦形剤とともに、免疫学的に有効な量の請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物を含んでなるワクチン。
【請求項６１】
前記動物に免疫学的に有効な量の請求項６０に記載のワクチンを投与することを含む、動物を免疫化又は治療する方法。
【請求項６２】
前記動物が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
アレルギー、腫瘍、慢性疾患及び慢性ウイルス性疾患を含む疾病又は疾患、及び好ましくはそれらからなる群から選択される疾病又は疾患の治療のための薬剤の製造における請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物の使用、あるいは請求項６０に記載のワクチンの使用。
【請求項１】
（ａ）ウイルス様粒子；
（ｂ）免疫賦活性核酸；
該免疫賦活性核酸（ｂ）が該ウイルス様粒子（ａ）と結合しており、
（ｃ）該ウイルス様粒子と混合している又は結合している、少なくとも一抗原；と
（ｄ）少なくとも一ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド
を含んでなる、動物の免疫応答を高めるための組成物。
【請求項２】
前記ＴＬＲリガンド（ｄ）が前記ＶＬＰと混合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、およびＴＬＲ１１からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が、リガンド（ｄ）によって活性化されるＴＬＲと異なるＴＬＲを活性化する、請求項１ないし３の何れか一に記載の組成物。
【請求項５】
前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ４のリガンドである、請求項１ないし４の何れか一に記載の組成物。
【請求項６】
前記リガンド（ｄ）が、
（ａ）ＬＰＳ及びその誘導体；
（ｂ）モノスフォリル脂質Ａ及びその誘導体；
（ｃ）ＬＰＳの合成類似体；
（ｄ）ｇｐ９６及びその誘導体；
（ｅ）熱ショックタンパク質；及び
（ｆ）デフェンシン
からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸；
（ｂ）デオキシリボ核酸；
（ｃ）キメラ核酸；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも何れか一の核酸の混合物、
からなる群から選択される、請求項１ないし６の何れか一に記載の組成物。
【請求項８】
前記リボ核酸がポリ-（Ｉ：Ｃ）又はその誘導体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫賦活性核酸が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１ないし７及び９の何れか一に記載の組成物。
【請求項１１】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ（配列番号４９）；
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号５１）；
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号５２）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）；及び
（ｅ）「ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３」（配列番号５９）
からなる群から選択される配列を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３９）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号５４）を含むか、あるいは選択的にこれから本質的になるか、あるいは選択的にこれからなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１０ないし１６の何れか一に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子と非共有結合をしている、請求項１ないし１７の何れか一に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子内にパッケージ化される、請求項１ないし１８の何れか一に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫賦活性核酸及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、前記ウイルス様粒子（ａ）に封入される、請求項１ないし１９の何れか一に記載の組成物。
【請求項２１】
前記パリンドローム配列が、１０以下のグアノシン自体によりその３’末端及びその５’末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記パリンドローム配列が少なくとも３及び多くとも９のグアノシン自体によってそのＮ末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体によってそのＣ末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４０）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４１）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４３）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４４）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４５）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４６）；及び
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４７）
から選択される核酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記パリンドローム配列が少なくとも４及び多くとも９のグアノシン自体の５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも９グアノシン自体の３’末端に隣接し、好ましくは該パリンドローム配列が少なくとも５及び多くとも８のグアノシン自体の５’末端に隣接し、該パリンドローム配列が少なくとも６及び多くとも８グアノシン自体の３’末端に隣接する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが配列番号４５の核酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約３００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約６〜約４０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２５の何れか一に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約３００個のヌクレオチド、好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約２０〜約４０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２６の何れか一に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約１０〜約３０個のヌクレオチドを含む、請求項１ないし２７の何れか一に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）組み換えオリゴヌクレオチド；
（ｂ）ゲノムオリゴヌクレオチド；
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド；
（ｄ）プラスミド由来オリゴヌクレオチド；
（ｅ）ＰＣＲ産物；
（ｆ）一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
（ｇ）二本鎖オリゴヌクレオチド
から選択される、請求項１ないし２８の何れか一に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）が、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、及びＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウイルス様粒子部位に結合する、請求項１ないし２９の何れか一に記載の組成物。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチド結合部位が非天然に生じるオリゴヌクレオチド結合部位である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ウイルス様粒子部位がアルギニン豊富なリピート配列を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドである、請求項１ないし３２の何れか一に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ４のリガンド、好ましくはＬＰＳ又はその誘導体である、請求項１ないし３３の何れか一に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）がポリ（Ｉ：Ｃ）であり、前記リガンド（ｄ）がＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、１０又は１１のリガンドである、請求項１ないし３２の何れか一に記載の組成物。
【請求項３６】
前記免疫賦活性核酸（ｂ）、及び好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１ないし３５の何れか一に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ウイルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項１ないし３６の何れか一に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ウイルス様粒子（ａ）が組み換えウイルス様粒子であり、好ましくは該ウイルス様粒子が、
（ａ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質；
（ｂ）はしかウイルスの組み換えタンパク質；
（ｃ）シンビス・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｄ）ロタ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｅ）口蹄疫ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｆ）レトロ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｇ）ノーウォーク・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｈ）アルファウイルスの組み換えタンパク質；
（ｉ）ヒト・パピローマ・ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｊ）ポリオーマウイルスの組み換えタンパク質；
（ｋ）バクテリオファージの組み換えタンパク質；
（ｌ）Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えタンパク質；
（ｍ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｎ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｏ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質；
（ｐ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質；
（ｑ）Ｔｙの組み換えタンパク質；及び
（ｒ）（ａ）〜（ｑ）の組み換えタンパク質の何れかの断片
からなる群から選択される、請求項１ないし３７の何れか一に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組み換えウイルス様粒子が、Ｂ型肝炎ウイルスのコア・タンパク質又はＢＫウイルスＶＰ１タンパク質である、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいは選択的にそれから実質的になるか、あるいは選択的にそれからなり、該ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ；
（ｂ）バクテリオファージＲ１７；
（ｃ）バクテリオファージｆｒ；
（ｄ）バクテリオファージＧＡ；
（ｅ）バクテリオファージＳＰ；
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；
（ｇ）バクテリオファージＭ１１；
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；
（ｋ）バクテリオファージｆ２；
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７；及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含み、該ＲＮＡファージがバクテリオファージＱＢ又はバクテリオファージＡＰ２０５である、請求項１ないし３８の何れか一に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ウイルス様粒子が少なくとも一の第一付着部位を含み、さらに前記抗原（ｃ）が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在しない付着部位；及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在する付着部位；
からなる群から選択される少なくとも一の第二の付着部位を含み、該第二付着部位が該第一付着部位に結合することができる、請求項１ないし４１の何れか一に記載の組成物。
【請求項４３】
アミノ酸リンカーをさらに含み、該アミノ酸リンカーが前記第二付着部位を含むか、あるいは選択的にこれからなる、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）ポリペプチド；
（ｂ）リポタンパク質；及び
（ｃ）糖タンパク質
からなる群から選択される、請求項１ないし４３の何れか一に記載の組成物。
【請求項４５】
前記抗原（ｃ）が組み換え抗原である、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗原（ｃ）が天然源から単離される、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４７】
前記天然源が、
（ａ）花粉エキス；
（ｂ）塵抽出物；
（ｃ）塵ダニ抽出物；
（ｄ）菌類の抽出物；
（ｅ）哺乳類の表皮の抽出物；
（ｆ）羽毛抽出物；
（ｇ）昆虫抽出物；
（ｈ）食物抽出物；
（ｉ）毛髪抽出物；
（ｊ）唾液抽出物、及び、
（ｋ）血清抽出物
からなる群から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）ウイルス；
（ｂ）細菌；
（ｃ）寄生虫；
（ｄ）プリオン；
（ｅ）腫瘍；
（ｆ）自己分子；
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子；
（ｈ）アレルゲン；および
（ｉ）ホルモン
からなる群に由来する、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項４９】
前記抗原（ｃ）が腫瘍抗原である、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５０】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２；
（ｂ）ＧＤ２；
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ；
（ｄ）ＣＥＡ；
（ｅ）ＣＤ５２；
（ｆ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；
（ｈ）チロシナーゼ；
（ｉ）ＮＡ１７−Ａ ｎｔタンパク質；
（ｊ）ＭＡＧＥ−３タンパク質；
（ｋ）ｐ５３タンパク質；
（ｌ）ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）の何れかの抗原の類似体；及び
（ｎ）（ａ）〜（ｍ）の何れかの腫瘍抗原の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗原（ｃ）がアレルゲンである、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５２】
前記アレルゲンが、
（ａ）花粉エキス；
（ｂ）塵抽出物；
（ｃ）塵ダニ抽出物；
（ｄ）菌類の抽出物；
（ｅ）哺乳類の表皮の抽出物；
（ｆ）羽毛抽出物；
（ｇ）昆虫抽出物；
（ｈ）食物抽出物；
（ｉ）毛髪抽出物；
（ｊ）唾液抽出物、及び、
（ｋ）血清抽出物
からなる群由来である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記アレルゲンが、
（ａ）木；
（ｂ）草；
（ｃ）ハウスダスト；
（ｄ）イエダニ；
（ｅ）コウジカビ；
（ｆ）動物の毛髪；
（ｇ）動物の羽毛；
（ｈ）蜂毒；
（ｉ）動物性製品；及び、
（ｊ）植物性製品
からなる群から選択される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記抗原（ｃ）が、
（ａ）蜂毒ホスホリパーゼＡ２；
（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １；
（ｃ）カバノキ花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；
（ｄ）白色顔スズメバチ(white faced hornet)毒物５Ｄｏｌ ｍ Ｖ；
（ｅ）イエダニＤｅｒ ｐ １；
（ｆ）イエダニＤｅｒ ｆ ２；
（ｇ）イエダニＤｅｒ ２；
（ｈ）塵ダニＬｅｐ ｄ；
（ｉ）真菌類アレルゲンＡｌｔ ａ １；
（ｊ）真菌類アレルゲンＡｓｐ ｆ １；
（ｋ）真菌類アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；及び、
（ｌ）ピーナッツアレルゲン
からなる群から選択される、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５５】
前記抗原（ｃ）が細胞障害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ又は該エピトープの少なくとも２つの組み合わせであり、当該少なくとも２つのエピトープが直接又は連結配列により結合している、請求項１ないし４４の何れか一に記載の組成物。
【請求項５６】
前記細胞障害性Ｔ細胞エピトープが、
（ａ）ウイルス性エピトープ；
（ｂ）腫瘍性エピトープ；及び
（ｃ）アレルゲン性エピトープ
からなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５７】
前記動物に請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物を含んでなる組成物を導入することを含む、動物の免疫応答を亢進する方法。
【請求項５８】
前記動物が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が前記動物に、皮下、筋内、静脈内、鼻腔内、あるいはリンパ節内に直接導入する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
薬学的に受容可能な希釈剤、担体あるいは賦形剤とともに、免疫学的に有効な量の請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物を含んでなるワクチン。
【請求項６１】
前記動物に免疫学的に有効な量の請求項６０に記載のワクチンを投与することを含む、動物を免疫化又は治療する方法。
【請求項６２】
前記動物が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
アレルギー、腫瘍、慢性疾患及び慢性ウイルス性疾患を含む疾病又は疾患、及び好ましくはそれらからなる群から選択される疾病又は疾患の治療のための薬剤の製造における請求項１ないし５６の何れか一に記載の組成物の使用、あるいは請求項６０に記載のワクチンの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５１３５３２（Ｐ２００９−５１３５３２Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８１７４（Ｐ２００６−５１８１７４）
【出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７６７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００４９０７
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１２日（２００４．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７６７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００４９０７
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
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