パーキンソン病の診断検査
本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）を検出し、予後診断し、経過観察するための分子マーカーに関し、前記分子マーカーは発現パターンの変化した１つ若しくは複数の遺伝子、又はその遺伝子産物（ＲＮＡ又はタンパク質）である。ＰＤ患者においてその発現がアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子は、ＰＤの早期診断のための、疾患の進行をモニターするための手段であり、ＰＤの治療のための新規の物質をスクリーニングするためのターゲットとして働くことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、経過観察するための分子マーカーの使用に関する。
【０００２】
略語：
ＡＣＴＢ：βアクチン；ＡＤ：アルツハイマー病；ＡＬＡＳ１：アミノレブリン酸δ合成酵素１；ＡＬＤＨ１Ａ１：アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１；ＡＬＳ：筋萎縮性側索硬化症；ＡＲＰＰ：２１−サイクリックＡＭＰ制御リン酸化タンパク質；ＤＡ：ドーパミン；ＤＥＰＣ：ジエチルピロカーボネート；ＥＧＬＮ１：ｅｇｌナイン同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）１；ＥＩＦ４Ｇ１：真核生物の翻訳開始因子４γ、１；ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素；ＨＳＰＡ８／ＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４：シャペロン熱ショック７０ｋＤａタンパク質８；Ｌ１３ａ：ＲＰＬ１３Ａ；ＬＧＡＬＳ９：レクチン、ガラクトシド結合性、可溶性、９；ＬＯＣ５６９２０：セマフォリンｓｅｍ２；ＬＲＰ６：低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質６；ＭＡＮ２Ｂ１：マンノシダーゼ、α、クラス２Ｂ、メンバー１；ＭＰＴＰ：Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン；ＯＳ：酸化ストレス、ＰＡＲＶＡ：パルビン（ｐａｒｖｉｎ）、α；ｐｃ：緻密部；ＰＤ：パーキンソン病；ＰＥＮＫ：プロエンケファリン；ＰＥＴ：陽電子放射断層撮影法、ＰＭＤ：死後の遅延；ＲＯＳ：活性酸素種；ＳＥＬＰＬＧ：セレクチンＰリガンド；ＳＫＰ１Ａ：Ｓ相キナーゼ会合タンパク質１Ａ；ＳＮ：黒質；ＳＰＥＣＴ：単一光子放射型断層撮影法；ＳＰＨＫ１：スフィンゴシンキナーゼ１；ＳＲＰＫ２：ＳＦＲＳタンパク質キナーゼ２；ＳＲＲＭ２：セリン／アルギニン反復マトリックス２；ＴＭＥＦＦ１：ＥＧＦ様の及び２つのフォリスタチン様のドメイン１を伴う膜貫通型タンパク質；ＴＲＩＭ３６：三分裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）モチーフ含有３６；ＵＣＨＬ：１−ユビキチンＣ末端加水分解酵素−Ｌ１；ＵＰＳ：ユビキチンプロテアソーム系；ＵＰＤＲＳ：パーキンソン病統一スケール；ＶＭＡＴ：小胞モノアミンメンバー；ＺＳＩＧ１１：推定上の分泌タンパク質ＺＳＩＧ１１。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、６５歳を超える集団で罹患率が１％である、進行性の神経変性障害であり、黒質（ＳＮ）におけるドーパミン神経の変性、及び結果として起こる線条体のドーパミン欠乏をもたらす（Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒら、１９７３年）。ドーパミン作動性神経の変性の原因及びメカニズムは、依然として把握困難である。散発性の（非遺伝性の）パーキンソン病は、この疾患の最も一般的な形態を成す。
【０００４】
ＰＤの遺伝性の形態も、散発性の形態も、主に、タンパク質ハンドリングの機能障害、異化作用、酸化ストレス損傷に集中する。
【０００５】
ＰＤの病因の一因となる潜在的な要因には、ミトコンドリアの機能不全、ドーパミン（ＤＡ）の自動酸化又は酵素（モノアミンオキシダーゼ）的酸化、及びＳＮ緻密部（ｐｃ）における過剰な鉄の蓄積が引き起こす継続する選択的酸化ストレス（ＯＳ）が含まれる（Ｒｉｅｄｅｒｅｒら、１９８９年；Ｙｏｕｄｉｍら、１９９３年；Ｇｏｔｚら、１９９４年；Ｊｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｏｌａｎｏｗ、１９９６年；Ｏｌａｎｏｗ ａｎｄ Ｙｏｕｄｉｍ、１９９６年；Ｙｏｕｄｉｍ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｒｅｒ、１９９７年；Ｊｅｎｎｅｒ，１９９８年）。特に、酸化還元活性のある鉄が、選択的に死滅するメラニン含有ニューロンの中に、及びＰＤの形態学的な特徴であるレヴィ小体の縁に観察されている。
【０００６】
レヴィ小体は、脂質、凝集したαシヌクレイン（その末梢のハロ（ｈａｌｏ）に集中している）、及びユビキチン結合した過剰リン酸化ニューロフィラメントタンパク質から構成される（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年）。数々の研究（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ−Ｇｏｌｔｓら、２０００年；Ｅｂａｄｉら、２００１年；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、２００１年）により、αシヌクレインが鉄の存在下で毒性の凝集物を形成し、これがＯＳによるレヴィ小体の形成の一因であると考えられていることが示されている。最近、ユビキチン結合したタンパク質が凝集したレヴィ小体は、ミスフォールディングされたタンパク質が堆積する単なる一般的な部位ではなく、毒性のミスフォールディングされた損害を受けたタンパク質を除去することをねらった防御措置としてとらえられ始めている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００４年；Ｔａｎａｋａら、２００４年）。
【０００７】
今や、かなりの数の変異した鉄代謝遺伝子が神経変性に直接関与することが示されているので、脳の鉄代謝の誤制御は、神経変性疾患で注目を浴びている（Ｆｅｌｌｅｔｓｃｈｉｎら、２００３年；Ｙｏｕｄｉｍ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｒｅｒ、２００４年）。したがって、鉄の酸化還元状態は中心的要素を成し、加齢し疾患に冒された脳における、タンパク質のミスフォールディング及び凝集の範囲の一因となる。
【０００８】
ユビキチン結合したタンパク質及びプロテアソームのタンパク質のハンドリングにおける欠陥は、ＰＤ、並びに、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びハンチントン病などの他の慢性神経変性疾患における、並びに加齢における共通の特徴である（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｎｄｉｎ、２００３年；Ｄａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ、２００３年）。これは、次には、細胞周期、プロセッシング、及び転写物の制御など、ユビキチン結合に関連するいくつかの細胞のプロセス、細胞内輸送、シグナル伝達経路、並びに正常の及び損傷を受けた細胞内タンパク質の分解における損傷をもたらす（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｎｄｉｎ、２００３年）。
【０００９】
証拠の蓄積により、この疾患の最も一般的な形態を構成する散発性ＰＤにおけるタンパク質のミスフォールディング、及びタンパク質封入体への凝集の決定的な役割に注意が向けられている。例えば、２０Ｓプロテアソームαサブユニットの損失（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００２年；ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）、及び散発性ＰＤのＳＮｐｃにおける２６／２０Ｓプロテアソーム系の活性の減少（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）も、報告されている。
【００１０】
αシヌクレイン、パーキン、及びユビキチンＣ末端加水分解酵素−Ｌ１（ＵＣＨＬ−１）における３つの明らかに独立した遺伝子変異は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）の活性を損なうことがあり、遺伝性ＰＤの稀な形態で記載されている（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、２００３年）。より最近では、ＤＪ−１遺伝子における劣性変異が、酸化ストレスに対する細胞応答で１つの役割を演じていることが提唱された（Ｂｏｎｉｆａｔｉら、２００３年）。しかしながら、これらの遺伝子のどれも、ＰＤの全症例の９５％を超えて構成する散発性ＰＤで変異することは実証されていない。
【００１１】
ＰＤの病因を探索する取組みは、細胞死に対するニューロンの脆弱性を増し、又は細胞の死を引き起こすことさえあり得る、遺伝子発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションにおける変化の研究に基づいている。数々の研究が、ＳＮにおけるカルシウム結合性タンパク質（２８ｋＤａカルビンジン−Ｄ）の減少（Ｉａｃｏｐｉｎｏ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｓ、１９９０年）、及びＰＤ患者からのリンパ球におけるＤ３レセプターｍＲＮＡ（Ｎａｇａｉら、１９９６年）の減少など、様々な遺伝子の発現における変更を報告している。
【００１２】
動物でパーキンソニズムを誘発するのに用いられる神経毒の中でも、Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯動物、霊長動物、及び他の種におけるパーキンソン症候群の神経化学的特性及び解剖学的特性の多くを最もよく再現する（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、２００３年）。このモデルにはある種の限界が内在する、即ち進行性の性質及びレヴィ小体（封入体）が欠如しているが、ドーパミン作動性の神経変性をもたらす分子の事象について多くが知られるようになっている。
【００１３】
ＭＰＴＰ動物モデルを用いて、いくつかの遺伝子の発現における変更が観察された。例えば、パーキンソン症候群のサルの被殻におけるニューロンの亜集団に、グルタミン酸脱炭酸酵素ｍＲＮＡの増加が観察され、これはＭＰＴＰ処置したパーキンソン症候群のサルでは線条体淡蒼球体のＧＡＢＡ作動性ニューロンが機能亢進する更なる証拠を提供するものである（Ｓｏｇｈｏｍｏｎｉａｎ ａｎｄ Ｌａｐｒａｄｅ、１９９７年）。ＳＮにおけるＢａｘ（細胞死エフェクター）ｍＲＮＡ発現が、Ｂａｘの免疫反応性の相伴う増加とともに増加することも、同モデルで検出された（Ｈａｓｓｏｕｎａら、１９９６年）。
【００１４】
より最近では、変性の間に起こる一連の事象のより全体的な像を得るために、ＭＰＴＰモデルを使用して、マウスの中脳における特異な遺伝子発現の変化を評価している（Ｇｒｕｍｂｌａｔｔら、２００１年）。研究で用いた中央の密度のマイクロアレイは、約１２００の遺伝子を含んでいた。このようにして、変更され得る特異な遺伝子発現の限定的な像が観察された。それでも、この研究では、酸化ストレス、炎症、一酸化窒素、グルタミン酸興奮毒性、及び、アップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）又はダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）される神経栄養因子経路に関する遺伝子の変更が実証された。細胞周期及び鉄代謝の制御、アポトーシス、中間代謝、並びにシグナル伝達を含む、以前に記載されていない更なる遺伝子の経路も観察されている。
【００１５】
更に、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの増加、プロデス（ｐｒｏ−ｄｅａｔｈ）遺伝子ＢＡＤ、ＢＡＸ、及びＢＩＤの増加が、メタンフェタミン処置ラットで報告された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１年）。これに伴って、アンチデス（ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ）遺伝子Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬに、大幅な減少があった（Ｃａｄｅｔら、２００１年；Ｊａｙａｎｔｈｉら、２００１年）。
【００１６】
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）によるドーパミンの枯渇により引き起こされるＰＤの、別の動物モデルでは、成年ラット及び新生児ラットの線条体にグルタミン酸脱炭酸酵素ｍＲＮＡ発現の増加が見られた。並行してプレプロエンケファリンの増加及びプレプロダイノルフィンｍＲＮＡレベルの減少が観察された（Ｌａｐｒａｄｅ ａｎｄ Ｓｏｇｈｏｍｏｎｉａｎ、１９９９年）。
【００１７】
パーキンソン病統一スケール（ＵＰＤＲＳ）（Ｆａｈｎ、１９８７年）などの、最近認められたＰＤ診断のための臨床診断基準により、パーキンソニズムを検出するための高い感度がもたらされている（Ｂｒｏｏｋｓ、１９９８年）。しかしながら、散発性ＰＤ、及び殆どの家族性ＰＤの症例のための、臨床の、特に前臨床のＰＤを確実に診断するために用いることができる、感度の良い特異的な生化学的マーカーは存在しない。
【００１８】
ＰＤを診断する１つの取組みは、典型的なＰＤを非定型のＰＤと区別する手段を提供する機能画像法であり、ドーパミン作動性の機能の損失の特徴的なパターンを明らかにするものである。更に、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、及び単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）は、ＰＤにおける線条体の代謝の維持レベル及びドーパミンレセプターの結合性を示すが、非定型の変異型ではレベルは減少する（Ｂｒｏｏｋｓ、１９９８年）。それでも、これらの手段ではＰＤの正確な診断は得られず、しばしば、ＰＤの専門家が、７．６年の経過観察の間に診断を稀に変更した（Ｊａｎｋｏｖｉｃら、２０００年）。
【００１９】
更に、これらの診断方法は全て、症状が現れた時点のみに、ニューロンの７０％近くが変性した後でのみ、ＰＤを有する対象を検出することができる（Ｚｉｇｍｏｎｄら、１９８９年）。このため、勿論、治療及びおそらくはニューロンの救出さえも殆ど不可能になっている。これを考慮すると、疾患を初期の段階で診断することが望ましく、この理由から、初期の診断方法を開発することが重要である。
【００２０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、神経保護作用を示す薬物は既に多く存在する（Ｄｒｕｋａｒｃｈ ａｎｄ ｖａｎ Ｍｕｉｓｗｉｎｋｅｌ、２００１年；Ｇｒｕｎｂｌａｔｔら、２００１年及び２００３年；Ｋｏｌｌｅｒ、２００２年；Ｏｌａｎｏｗら、１９９６年及び１９９８年；Ｒｉｅｄｅｒｅｒら、２０００年及び２００２年；Ｓｏｔｏ−Ｏｔｅｒｏら、２００２年）。更に、神経変性のプロセスを遅らせるのに遺伝子治療が最も奏功することが示された（Ａｚｚｏｕｚら、２００２年；Ｌｅ ａｎｄ Ｆｒｉｍ、２００２年；Ｌｕｏら、２００２年；ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｒｄｏｗｅｒ、２００２年；Ｍｏｎｖｉｌｌｅ、２００２年；Ｏｌａｎｏｗ、２００２年；Ｓｅｎｉｏｒ、２００２年；Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら、２００２年）。問題は、治療の開始が遅すぎ、生存するニューロンの数が少なすぎるため、これらの薬物及び方法はＰＤの患者でいかなる成功も示さなかったことである。したがって、早期に診断すれば、ＰＤに生じる細胞死から保護することができる治療方策に服従するための、且つ疾患の進行を防止するためのより良い時間点を提供することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ゆえに、ニューロンの実質的な損傷が生じ、典型的な症状が現れる前に、ＰＤ患者を治療することが重大である。したがって、初期の段階でＰＤを検出しモニターするための、初期診断方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、一態様では、疾患の進行及び治療の効果をモニターする、診断の目的の、パーキンソン病の分子マーカーの使用に関する。
【００２３】
別の一態様では、本発明は、測定可能な生物学的マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、経過観察する方法に関し、前記マーカーは、変更された発現パターンを示す１つ又は複数の遺伝子であり、又はそれによりコードされる遺伝子産物である。
【００２４】
本発明による分子マーカーとして使用するための遺伝子は、以下に詳しく述べるように、ＰＤ患者で発現がアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、治療を経過観察するための特異的な分子マーカー又は生物学的マーカーの使用に関する。
【００２６】
本発明によると、例えば、遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡｌ、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７など、ＰＤで変更された発現パターンを有する遺伝子が見出された。
【００２７】
したがって、一実施形態では、本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、治療を経過観察するための分子マーカーの使用に関し、この分子マーカーは、１つ又は複数の上記の遺伝子、又はそれらの遺伝子産物である。
【００２８】
本発明者らは、上記に記載した遺伝子のいくつかは健常個体に比べてＰＤ患者で発現の増加を示すが、他の遺伝子は発現の減少を示すことを更に見出した。以下の表３及び表４はそれぞれ、ダウンレギュレート及びアップレギュレートされる遺伝子、並びに各遺伝子に対して、遺伝子銀行番号、全遺伝子名、及びその機能を含めたそれらの特徴づけを示している。
【００２９】
本発明によると、以下の遺伝子はアップレギュレートされる、即ち、ＰＤで発現レベルの増加を示すことが見出され、以下、「アップレギュレートされる遺伝子」と呼ぶ。ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７。
【００３０】
更に、本発明によると、以下の遺伝子はダウンレギュレートされる、即ち、ＰＤで発現レベルの減少を示すことが見出され、以下、「ダウンレギュレートされる遺伝子」と呼ぶ。ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２。
【００３１】
本明細書で用いられる「分子マーカー」及び「生物学的マーカー」は交換可能に用いられて、個体から得たサンプルにおいて、ＰＤの診断のために同定し、測定することができる遺伝子産物を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる「遺伝子産物」は、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することによる、遺伝子の発現産物を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写物、即ちｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、若しくはあらゆる他のタイプのＲＮＡなどのＲＮＡ、又はｍＲＮＡの翻訳により産生されたタンパク質であることができる。
【００３３】
本明細書で用いられる「ＰＤで発現パターンの変化された遺伝子」は、例えば健常個体に比べて、ＰＤ患者でアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を意味する。本明細書で、遺伝子のアップレギュレーションの前後関係で用いる「アップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」は、例えば遺伝子により発現されるＲＮＡ又はタンパク質などの、遺伝子産物の産生の増加をもたらすあらゆるプロセスを意味する。本明細書で、遺伝子のダウンレギュレーションの前後関係で用いる「ダウンレギュレーション（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」は、例えば遺伝子により発現されるＲＮＡ又はタンパク質などの、遺伝子産物の産生の減少をもたらすあらゆるプロセスを意味する。
【００３４】
遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのレベルを含む、遺伝子発現のレベルは、以下に記載する周知の手順により測定することができる。一般的に、遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションは、遺伝子産物の産生におけるあらゆる検出可能な増加又は減少を含む。アップレギュレートされる、及び遺伝子活性化は、観察される活性がベースラインレベルに比べて、統計的に有意差がある（例えば、増加又は減少する）ことも意味することができる。観察された偶然生じた差の確率（ｐ値）が予め決定されたあるレベルより小さい場合に、差は「統計的に有意」であると通常みなされる。本明細書で用いられる「統計的に有意差がある」は、ｐ値が＜０．０５、好ましくはダウンレギュレートされる遺伝子（表３）で＜０．０２、より好ましくはアップレギュレートされる遺伝子（表４）で＜０．００５であることを意味する。本発明によると、アップレギュレートされる遺伝子における発現の増加は、少なくとも１．５倍、好ましくは１〜３倍（表４）であり、ダウンレギュレートされる遺伝子における発現の減少は少なくとも０．６６倍又はそれより少なく、好ましくは０．３〜０．６６である（表３）。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＤの生物学的マーカーは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ，ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物であり、且つ／又は、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物である。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、分子マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、且つ／又は治療の経過観察をする方法に関し、この分子マーカーは、１つ又は複数の本発明のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子である。好ましくは、分子マーカーは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物であり、且つ／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物である。
【００３７】
本発明の方法は、試験すべき個体からサンプルを得、サンプルにおいて、本発明のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子に特異的な１つ又は複数の遺伝子産物のレベルの減少又は増加を検出することを含む。
【００３８】
試験する個体は、ＰＤを有すると疑われる個体、パーキンソン症候群様の症状を示す個体、新たなＰＤ患者、疾患の進行を経過観察するために、且つ／又は治療の有効性をモニターするために、神経保護の又は他の適切なＰＤ薬物で治療中のＰＤ患者であることができる。したがって、本発明は、初期の段階でＰＤを診察する方法、及び、家族性及び散発性両方のＰＤ患者の、ＰＤ患者の治療をモニターする方法を提供する。
【００３９】
検出には、あらゆる適切なサンプルを用いることができるが、試験する個体から得た血液、血清、又は皮膚の生検サンプルを用いることが好ましい。
【００４０】
様々な異なるアッセイを利用して遺伝子パターンの発現の変更を検出することができ、遺伝子転写物のレベル及びタンパク質をコードする遺伝子のレベルを検出する方法が含まれる。より詳しくは、本明細書に開示する診断方法及び予後診断方法には、個体からサンプルを得、サンプルにおける１つ又は複数のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子の発現レベルを決定することが含まれる。通常、この決定された値又は試験値を、対照（健常個体、非ＰＤ患者）又はベースライン値における発現レベルなどのあるタイプの参照と比較する。
【００４１】
本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏで分子マーカーを使用することも企図される。
【００４２】
試験する遺伝子産物がサンプルから抽出されたＲＮＡである場合、遺伝子発現のレベル、即ち遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのレベルを、核酸プローブアレイ、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ドットブロットアッセイ、及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むがそれだけには限定されない周知の手順により測定することができる。
【００４３】
好ましい一実施形態では、核酸プローブアレイを用いて遺伝子転写物を検出し定量する（以下の実施例に記載する通り）。アレイは様々なタイプであることができ、例えば、長さの短い合成プローブ（２０ｍｅｒ又は２５ｍｅｒ）、ｃＤＮＡの全長又は遺伝子のフラグメント、増幅したＤＮＡ、ＤＮＡのフラグメント（例えば制限酵素により生成されたもの）、及び逆転写されたＤＮＡなどの様々なタイプのプローブを含むことができる。アレイはカスタムアレイであることができ、遺伝子のｍＲＮＡ遺伝子配列の特定の予め選択されたサブシーケンス若しくはその増幅産生物をハイブリダイズするプローブ、又は配列に関係なくｍＲＮＡを分析するようにデザインされた一般的なアレイが含まれる。
【００４４】
プローブアレイを用いる方法では、試験サンプルから得た核酸は標識されたｃＤＮＡに通常逆転写されるが、標識したｍＲＮＡを直接使用することができる。標識した核酸を含む試験サンプルを、次いで、アレイのプローブと接触させ、サンプルに存在する試験する遺伝子に関連するあらゆる標識された核酸がプローブとハイブリダイズした後、アレイを通常１回又は複数回の高度に厳密な洗浄に曝して非結合の核酸を除去し、アレイの核酸プローブに対する非特異的結合を最小にする。標識した核酸の結合を、任意の様々な市販のスキャナー、及び付随するソフトウェアプログラムを用いて検出する。例えば、サンプル由来の核酸を蛍光標識で標識する場合、ハイブリダイゼーションの強度は、例えば共焦点スキャン顕微鏡の光子計数法により決定することができる。標識は、酵素法により増幅することができるシグナルを提供することができ、又は、例えば、放射性同位元素、発色団、磁性粒子、及び高電子密度粒子を含む他の標識を用いることができる。
【００４５】
標識した核酸にハイブリダイズされたプローブアレイ上のこれらの位置を、市販のリーダーを用いて検出する。カスタマイズされたアレイに対して、次いでハイブリダイゼーションパターンを分析して、分析しているサンプル中の周知のｍＲＮＡ種の存在、及び／又は相対量若しくは絶対量を決定することができる。
【００４６】
別の好ましい一実施形態では、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、サンプルに存在する遺伝子ｍＲＮＡの量を決定することができる（以下の実施例を参照されたい）。これらの方法は、例えば蛍光発生ヌクレアーゼアッセイにより、増幅プロセス中に形成された増幅産物の量を測定して、目的とする遺伝子の特定の転写物を検出し定量することを含む。これらのアッセイは、単にＴａｑＭａｎ（登録商標）法として文献で頻繁に言及される手法で、二重標識した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物の蓄積を連続的に測定する。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲアッセイで用いられるプローブは、通常短い（約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドであり、２種の異なる蛍光色素、即ちプローブの５’末端のレポーター色素、及び３’末端の消光色素で標識されているが、色素はプローブ上の他の位置でも結合することができる。特定の転写物を測定するために、プローブは、特定の転写物上のプローブ結合性部位と相補性に、少なくとも実質的な配列を有するようにデザインされている。特定の転写物の側面に位置する領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも、核酸を増幅するのに使用するために反応混合物に添加する。
【００４８】
プローブが完全である場合、２つの蛍光体間でエネルギーの移動が生じ、クエンチャーがレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長期の間、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂し、その結果、ポリヌクレオチド−クエンチャー複合体からレポーター色素を放出し、レポーター発光強度の増大をもたらし、それを適当な検出システムにより測定することができる。蛍光発生アッセイの間に作り出される蛍光発光を、増幅過程にわたりレポーター及びクエンチャーの蛍光強度を記録することのできるコンピュータソフトウェアを含む市販の検出器により測定する。次いで、これらの記録値を用いて、連続的に、標準化されたレポーターの発光強度の増大を計算し、最終的に増幅されているｍＲＮＡの量を定量することができる。
【００４９】
ドットブロット及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに基づくアッセイでは、ＰＤの検査を行う個体からのサンプルを、フィルターなどの支持体上にスポットし、次いで、本発明の１つ又は複数のアップレギュレートされる遺伝子又はダウンレギュレートされる遺伝子由来の核酸で特異的にハイブリダイズした標識した核酸プローブでプローブする。フィルター上に固定化した核酸でプローブをハイブリダイゼーションした後、非結合の核酸を洗い流し、ハイブリダイゼーション複合物の存在を、フィルターに結合した標識したプローブの量に基づき検出し定量した。
【００５０】
したがって、本発明により、生物学的材料、好ましくは血液又は皮膚の生検サンプルからＲＮＡを抽出することにより、遺伝子の発現パターンが決定される。このＲＮＡを、市販のキットにより迅速に分離する。次いで、ＲＮＡを、選択された遺伝子及び標準化のために働く適切なハウスキーピング遺伝子を含むカスタマイズされたＧｅｎｅＣｈｉｐアレイにハイブリダイゼーションすることにより、又は選択された各遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲにより試験する。遺伝子の発現パターンを、陽性コントロール及び陰性コントロールのＲＮＡ（それぞれ、新しいＰＤ及び健常対象）の発現と比べることにより決定する。対象をＰＤ患者と規定するためには、この技術の１つにより得られた遺伝子発現のパターンは、表３又は４に記載したパターンと同様でなければならない。
【００５１】
別の一実施形態では、アップレギュレートされる遺伝子又はダウンレギュレートされる遺伝子の発現により得られる遺伝子産物はタンパク質であり、そのタンパク質に結合することのできる抗体又はそのフラグメントにより検出することができる。抗体、又はフラグメント誘導体は、あらゆる適当なマーカー、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光標識、常磁性標識、又はフリーラジカルで検出可能に標識することができる。
【００５２】
好ましい一実施形態では、本発明は、パーキンソン症候群様の症状を表す個体におけるパーキンソン病の発生を診断する方法に関し、前記個体から得られたサンプルにおける１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子の、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＡＬＤＨＩＡ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４の発現のレベルの減少、並びに／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子の、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫＩ、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１の発現レベルの増加を検出することを含む。１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子の発現が少なくとも約１．５倍の増加であり、且つ／又は１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子の発現が約０．６６倍又はそれより少ない減少であれば、個体がＰＤに罹患していることを示す。
【００５３】
ＰＤの診断に用いられる現在の方法に比べると、この方法は珍しい遺伝的な変異又は疾患の家族歴を用いないが、散発性のＰＤにも生じる一般的な遺伝子発現の変化を用いるという利点がある。これらの遺伝子発現の変更は、特定の遺伝的背景の結果として引き起こされることがあるだけではなく、環境的背景の結果としても引き起こされることがある。したがって、この方法は、遺伝子変異を有するＰＤ患者も、散発性のＰＤ患者も、広範な細胞死及び非可逆性のニューロンの実質的な損傷が起こる前の、疾患の発生における大変早期に検出する。
【００５４】
ＰＤは、非治療の場合、全ての脳機能の全般的な悪化をしばしば伴う全身の無能力に進行し、早期の死亡をもたらすことがある。治療を行っても、この障害は依然として様々な方法で人を損なう。殆どの者は、薬物にある程度反応する。症状の軽減する程度、及びこの症状のコントロールがどのくらい続くかは、非常に変動する。
【００５５】
したがって、別の一実施形態では、本発明は、ＰＤ患者の治療を予知し、又はモニターする方法を提供し、前記患者から得たサンプルにおける、１つ又は複数の本発明のダウンレギュレートされる遺伝子又はアップレギュレートされる遺伝子の発現のレベルを検出することを含み、この場合、１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４の発現レベルの増加、並びに／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１の発現レベルの減少が治療の有効性を示す。
【００５６】
以下の実施例に示すように、本発明者らは、世界的に主流の、ＰＤで最も冒された脳の領域である黒質緻密部において差次的に発現された遺伝子を同定した（表３及び４を参照されたい）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高密度ＤＮＡマイクロアレイを用いて、年齢をマッチさせた対照と比べて差次的に発現された遺伝子を同定した。ＰＤの小脳は、冒されていない脳の領域であり、組織特異性に対する対照となった。遺伝子発現の確認は、定量的リアルタイムＰＣＲで分析することにより実現した。
【００５７】
ダウンレギュレートされる遺伝子は、シグナル伝達、タンパク質分解（例えば、ユビキチン−プロテアソームサブユニット）、ドーパミン作動性の伝達／代謝、イオン輸送、タンパク質の修飾／リン酸化、及びエネルギー経路／解糖の機能上のクラスに属することが見出された。アップレギュレートされる遺伝子は、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、細胞周期、タンパク質の修飾／リン酸化、タンパク質代謝、転写、及び炎症／ストレス（例えば、鉄及び酸素の主要なセンサーであるＥＧＬＮ１）を含む生物学的プロセスに主に集中した。
【００５８】
１つの主要な発見は、散発性のパーキンソン症候群患者の黒質（ＳＮ）で、特にＳＣＦ（Ｅ３）リガーゼ複合体のメンバーであるＳＫＰ１Ａの発現が特別に減少したことであった。ＳＫＰ１Ａの減少には、エネルギー経路及びシグナル伝達において、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、及び炎症／ストレスに関連する機能上の活性が数々の遺伝子で顕著に増加するのと並行して、２６Ｓプロテアソームの様々なサブユニットの発現の低下が伴った。
【００５９】
ＳＫＰ１は、モジュラー多タンパク質であるＳｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ、及び基質認識性Ｆ−ｂｏｘタンパク質（ＳＣＦ）の中で機能しているＲＩＮＧタンパク質のＲｂｘファミリーの一部である（Ｋａｍｕｒａら、１９９９年）。このユニットは、多数のＥ３複合体の形成を可能にし、これは、次には、広範囲の様々なタンパク質の基質を認識することができる。
【００６０】
ＳＣＦ複合体はモジュラーであり、ＳＫＰ１はいくつかのＦ−ｂｏｘタンパク質と相互作用をすることができ、Ｆ−ｂｏｘタンパク質は特異的な標的の認識を担い、その結果機能上の多様性をもたらし、この複合体が処理するレパートリーのタンパク質を増加させる。ヒトは、機能上のＳＫＰ１アイソフォームを１つだけ発現する（Ｓｅｍｐｌｅ、２００３年）。したがって、観察されるその発現の減少は律速因子を構成することができ、ＰＤ患者の脳における、チロシン水酸化酵素、シンフィリン−１、α−シヌクレイン、リン酸化タウなど、広範囲のユビキチン結合したタンパク質凝集物の蓄積を説明することができる（Ｌｉａｎｉら、２００４年；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、２００４年；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、２００４年）。
【００６１】
定量リアルタイムＰＣＲ分析では、健常の対象でもＰＤの対象でも、ＳＮは特に低レベルのＳＫＰ１ＡのｍＲＮＡを発現していることが示された。例えば、対照サンプルは、大変低い発現値（０．０１３±０．０１１）を示し、Ｒａｂ３Ｂ（１．８０±０．７０）から２オーダーを超える差があるが、この発現はＰＤのＳＮｐｃでは影響を受けなかった。ＰＤのＳＮｐｃでは、ＳＫＰＡ１Ａの発現が減少する明らかな傾向が観察された。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＳＮｒで、又はＰＤの小脳で影響を受けなかった。
【００６２】
ＳＫＰ１Ａにおけるこの選択的減少の他に、ＰＤの脳のＳＮにおいて、２０Ｓプロテアソームサブユニットであるα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）のｍＲＮＡ、並びに２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニットである、非−ＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）及びＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）の相伴う減少が観察され、更に、ＰＤにおけるドーパミン作動性ニューロンの損傷の一因となる可能性がある。
【００６３】
これらの発見は、神経変性のシナリオで新規の役割を演じるものがあることを明らかにし、新規の薬物成分を開発するための潜在的な目標を提供するものである。
【００６４】
したがって、本発明は、パーキンソン病を治療するのに有用な物質をスクリーニングする方法を更に提供し、１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、好ましくはダウンレギュレートされる遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、の発現をアップレギュレートし、且つ／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、好ましくはＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１の発現レベルをダウンレギュレートする物質を同定することを含む。
【００６５】
当技術分野で周知のハイスループットスクリーニング方法を用いて、ＰＤの治療に有用である化合物を同定することができる。
【００６６】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００６７】
材料と方法
（ｉ）ヒト脳組織
ドイツ国立脳ネットセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍａｎ Ｂｒａｉｎ−Ｎｅｔ Ｃｅｎｔｅｒ）（プロジェクト番号ＧＡ１０）、及びオランダ脳バンク（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ−Ｂａｎｋ）（プロジェクト番号３５０）より、死後のヒト脳を得た。ＰＤの組織は、確立されたガイドラインによりＨｏｅｈｎ＆Ｙａｈｒの診断基準に基づいて中程度から重症のパーキンソン症候群の個体から得た（Ｈｏｅｈｎ ａｎｄ Ｙａｈｒ、１９６７年）。対象は全て、Ｂｒａａｋ＆ＢｒａａｋによるＡＤ病理に陰性だった（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ、１９９７年）（詳細は表１を参照されたい）。ＰＤ及び対照の平均年齢は、それぞれ７６．６歳及び７７．８歳であった。ＰＤ及び対照の平均死後遅延（ＰＭＤ、死から−８０℃で脳を凍結するまでの時間間隔）は、それぞれ２６．２時間と１９．８時間であった。生検では、脳を切開し、一方の半分を薄片として液体窒素中瞬間凍結し、他方の半分を組織病理学検査用に中性の緩衝ホルマリン中に貯蔵した。これらの研究に用いるヒト脳組織の症例の選択には、厳重な診断基準を用いた。ヒトＳＮ及び小脳領域は、対照及びＰＤの提供者から得た。手順は全て、ドイツ及びオランダ脳バンクシステム（Ｇｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ−Ｂａｎｋ ｓｙｓｔｅｍｓ）により確立された一致基準に従い、実験室のヒト組織の注意及び使用のためのＮＩＨガイド（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ）に従い、ヴュルツブルグ大学倫理委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｒｚｂｕｒｇ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ドイツ、Ｗｕｒｚｂｕｒｇ）により承認された。
【００６８】
（ｉｉ）全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡを、フェノール−グアニジンイソチオシアネート試薬（ｐｅｑＧＯＬＤ ＴｒｉＦａｓｔ；ドイツ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ＰｅＱＬａｂＧｍｂＨ）で調製した（Ｌｕｋｉｗ ａｎｄ Ｂａｚａｎ、１９９７年）。ＲＮＡ分離試薬を、０．２μＭのろ過したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−処理水（米国メリーランド州Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）で調製し、分離手順を通して使用した。全ＲＮＡサンプルを、分光光度計で２２０から３２０ｎｍでスキャンし、全ＲＮＡのＡ２６０／Ａ２８０は典型的に＞１．９であった。更に、全ＲＮＡの品質管理に、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を行った。抽出した全ＲＮＡの全てで、２８Ｓ／１８Ｓ比は＞１．５であった。重要なこととして、ＰＤと対照の間で、スペクトルの純度、分解速度、分子サイズ、又はＳＮ及び小脳の全ＲＮＡの収量に有意差はみとめられなかった。全ＲＮＡをＤＮａｓｅ−Ｉ消化を受けさせてゲノムのＤＮＡ残渣を除き、引き続き、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）により清浄にした。
【００６９】
（ｉｉｉ）アレイ処理
実験は全て、／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｄａｔａｓｈｅｅｔｓ／ｈｕｍａｎ＿ｄａｔａｓｈｅｅｔ．ｐｄｆ．に記載されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−ＦＯＣＵＳオリゴヌクレオチドアレイを用いて行った。各サンプルからの全ＲＮＡを用いてビオチン化した標的ＲＮＡを調製し、製造元の勧めから若干の修飾を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｍａｎｕａｌ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｍａｎｕａｌ．ａｆｆｘ）。手短に述べると、１０μｇのｍＲＮＡを用いて、Ｔ７−結合したオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いることにより、第１の鎖のｃＤＮＡを生成した。第２の鎖を合成した後、ビオチン化したＵＴＰ及びＣＴＰ（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でｉｎ ｖｉｔｒｏの転写を行い、ＲＮＡの約１００倍の増幅をもたらした。手順を完全に記載したものは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｐｉｃｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｍｂｃｆ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＧｅｎｅＣｈｉｐ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｐｒｅｐ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ＣＲ＿ＵＫ＿ｖ＿２．ｐｄｆで入手できる。各サンプルから生成された標的ｃＤＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｍａｎｕａｌ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｍａｎｕａｌ．ａｆｆｘ）を用いて製造元の勧めにより処理した。手短に述べると、スパイクの対照をフラグメントにしたｃＤＮＡ１５μｇに加えてから、一晩ハイブリダイゼーションした。次いで、アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー上でスキャンした。これらの手順を完全に記載したものは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｐｉｃｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｍｂｃｆ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＧｅｎｅＣｈｉｐ＿Ｈｙｂ＿Ｗａｓｈ＿Ｓｃａｎ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ｖ＿２＿ｗｅｂ．ｐｄｆで入手できる。更に、開始のＲＮＡの品質及び量を、アガロースゲルを用いて確認した。スキャン後、アレイ画像を肉眼で評価して、スキャナー配列及びチップ表面に顕著な泡又はキズの存在しないことを確認した。ＢｉｏＢスパイク対照は、全てのアレイ上に存在することが見出され、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ、及びＣｒｅＸも強度が増加して存在した。全部で１７個の遺伝子チップを使用した（ＳＮｐｃに１２個、ＰＤ患者及び年齢をマッチさせた対照の小脳に５個）。
【００７０】
（ｉｖ）統計学的分析
Ｍａｓ ５アルゴリズムの結果を用いて、遺伝子をフィルターにかけた。死後のサンプルで作業をする際に予想される困難の１つに、ＲＮＡ調製の際の様々な程度の分解がある。したがって、これらのサンプルを起源とするｃＲＮＡは、５’末端よりも３’末端を多く含む。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイプローブセットは、可能なときはいつでも３’末端が選択されるようにデザインされているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／ｈｇｕｌ３３＿ｄｅｓｉｇｎ＿ｔｅｃｈｎｏｔｅ．ｐｄｆ）、比較的３’含量が高いサンプルの分析が可能になっている。ＭＡＳ ５により存在する（Ｐ）として検出されるプローブセットのシグナルのｐ値は、（プローブセットに含まれるプローブから決定して）０．０４より小さい。これにより、本発明者らは存在の信号を、確信を持って使用できるようになった。
【００７１】
部分的に分解されたサンプルは、プローブセットのプローブの部分とハイブリダイズし、高いｐ値をもたらす（且つ、非存在として検出される）ことがある。６サンプルのうち少なくとも４サンプルでプローブセットが存在するとして検出され、信号が全て２０を超える場合は、このプローブセットが存在すると本発明者らは決定した。シグナルが２０を超え対照サンプル全てで存在（Ｐ）として検出される遺伝子、又はＰＤサンプル全てでシグナルが２０を超え６サンプル中４サンプルで存在として検出される遺伝子を表す３５１７プローブセットのリストを、アレイ上に含まれる８７６３プローブセットから作成した（補足ｈｔｔｐ：／／ｅｎｇ．ｓｈｅｂａ．ｃｏ．ｉｌ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。
【００７２】
Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定で決定すると、患者と対照のサンプル間で、２６２のプローブセットで差が認められた（ｐ値＜０．０５）（補足ｈｔｔｐ：／／ｅｎｇ．ｓｈｅｂａ．ｃｏ．ｉｌ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。プローブセットを更にフィルターにかけ、ＰＤサンプルの平均（幾何平均）シグナルと対照サンプルの平均シグナルとの比が１．５を超え、又は０．６６より小さいものを選択した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの相関は、有効なヒットの殆どが失われる結果になるので適用しなかった。しかしながら、統計学的検定とともに前述したカットオフを用いると、高度に厳重な分析がもたらされ、通常の生物学的プロセスに関わる、規定されたサブセットの遺伝子に注目する可能性が与えられる。６９個のプローブセットがアップレギュレートされ、６８個のプローブセットがダウンレギュレートされた。
【００７３】
（ｖ）結果のリアルタイム定量ＰＣＲ確認
マイクロアレイの結果を確認するために、本発明者らは、ＰＤ及び対照からの、ＳＮｐｃ、網様部（ＳＮｒ）、及び小脳におけるｍＲＮＡサンプルに定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。各サンプルからの全ＲＮＡ（１〜０．４ｍｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１７０〜８８９０）を用いて、ランダム６量体、及びｏｌｉｇｏｄＴプライマーで逆転写した。遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子、即ち、βアクチン（ＡＣＴＢ）、リボソームのタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、アミノレブリネートδ合成酵素１（ＡＬＡＳ１）、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に標準化し（クアンチテクト(ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ)（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｓ ＡＣＴＢ Ａｓｓａｙ ２５１０１３及びＨｓＧＡＰＤ Ａｓｓａｙ ２４１０１１）、ｇｅＮｏｒｍプログラムによる分析の後に選択した（ｖｓ．３．３；ダウンロードはｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ３１．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｊｖｄｅｓｏｍｐ／ｇｅｎｏｒｍ／から）（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、２００２年；Ｓｃｈｕｌｚら、２００４年）。ｇｅＮｏｒｍプログラムは、所与のｃＤＮＡサンプルパネルにおける１セットの試験する遺伝子から最も安定なハウスキーピング遺伝子を決定し、使用者が規定した数のハウスキーピング遺伝子の幾何平均をもとに各組織サンプルに対する遺伝子発現の標準化ファクターを計算する。最初は、本発明者らは、リボソームの１８Ｓ及びシクロフィリンＡを含む、全部で６個のハウスキーピング遺伝子を試験したが、最後の２者は適切でないことが見出された。
【００７４】
これらのハウスキーピング遺伝子の安定性を試験し、標準化に対し最も正確であることが見出された。ハウスキーピング遺伝子のリボソームの１８Ｓを増幅することにより、ＤＮＡ汚染がないことが確認され、反応溶液をアガロースゲルに流して産物が非存在であることを確認した。ＲＴがないサンプルを、ＦＡＭを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲにより実験のサンプルと同時に試験すると、上記のプロトコールを用いて、３５サイクルより少ない場合には一貫して増幅を生じなかった。前述したように、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱシステム（米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＢｉｏＲａｄ社）でリアルタイムＰＣＲを行った（Ｓｖａｒｅｎら、２０００年；Ｕｇｏｚｚｏｌｉら、２００２年）。手短に述べると、ｃＤＮＡ３０〜１００ｎｇ、及び遺伝子に特異的なプライマー、及びクアンチテクト（登録商標）カスタムアッセイ（Ｃｕｓｔｏｍｅ Ａｓｓａｙ）（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）により製造されたプローブ（表２）をクアンチテクト Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社、２０４３４３）に加えた。リアルタイムＰＣＲを、ＰＣＲ増幅にかけた（９５℃１５分間で１サイクル、９４℃１５秒間で３０〜４５サイクル、５６℃３０秒間アニーリング及びＦＡＭで検出、及び７６℃で３０秒間伸長）。ＰＣＲ反応は全て、２回ずつ行った。増幅した転写物は比較ＣＴ法を用いて定量し、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱシステムプログラムで分析した。各増幅産物の検量線は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてアガロースゲルから分離したｃＤＮＡ単位複製配列をプールしたものの１０倍希釈物から作成して、プライマーの効率及び量子化を決定した。データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０００で分析して、生の発現値を作成した。様々な脳の領域における遺伝子発現の差を、ＰＣコンピュータ上の、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアプログラム（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ５．０ソフトウェア、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）を用いて比較した。
【００７５】
（ｖｉ）免疫組織化学的分析
パーキンソン症候群患者及び年齢をマッチさせた対照からのパラフィン包埋した黒質を、ミクロトームにより冠状連続切片（厚さ６マイクロメートル）にかけた。脱パラフィンした切片を、デジタルデクローキングチャンバー（ｄｅｃｌｏａｃｋｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ）（米国カリフォルニア州Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ、Ｂｉｏｃｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中で、クエン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いてアンマスキングし、１０％正常ヤギ血清で２時間ＲＴでブロックし、抗ＳＫＰ１と４℃で一夜インキュベートした。ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ結合体及び基質としてＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）と、適切なビオチン化した第２抗体によりＨｉｓｔｏｓｔａｉｎ−Ｐｌｕｓキット（米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｚｙｍｅｄ）を用いて、製造元の指示に従いヘマトキシリンで対比染色を行って、検出を得た。
【００７６】
（実施例１）ＰＤ患者で差次的に発現された遺伝子の機能上の分類
パーキンソン症候群患者６名及び年齢をマッチさせた対照６名からの死後ＳＮｐｃに対し、ＤＮＡマイクロアレイ分析を行って、疾患と関連のある遺伝子転写における変更を同定した。
【００７７】
本発明者らは、本発明者らの分析を、差次的な発現が少なくとも１．５倍で有意水準がｐ＜０．０５である遺伝子に限定した。分析した全３５１７個の有効なプローブセットのうち（材料と方法を参照されたい）、１３７個が診断基準を満たした。ＰＤ及び対照サンプルにおけるこれら１３７個の遺伝子の相対発現レベルを表す、ヒートマップを実施し（図１）、そのうち６８個が転写上、ダウンレギュレートされ（表３）、６９個がアップレギュレートされた（表４）。
【００７８】
１２個にわたるサンプルで、遺伝子は、それらの相対発現レベルにより集中した。陰性対照に対し、非関連の脳の領域、ＰＤ（２サンプル）及び対照（３サンプル）の両者の小脳で５つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを行い、遺伝子の変化の組織特異性を評価した。階層的クラスタリングにより、ＰＤの小脳でも正常の小脳でも発現の完全に異なる発現パターンを表すことが示された（データは示さず）。
【００７９】
その後、遺伝子はＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ注釈ツールにしたがって機能上のグループに分類した（Ｄｅｎｎｉｓら、２００３年）（ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓｌ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄａｖｉｄ／ｕｐｌｏａｄ．ａｓｐ）。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより規定されるように、このプログラムにより、生物学的プロセス、分子機能、又は細胞成分にしたがって系統立てられたグループの遺伝子において制御の傾向を見出すことが可能になっている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）。
【００８０】
所与の遺伝子は、１つを超える機能、又は生物学的経路に割り当てられることがあることが理解される。これにより、各機能上のグループの真のサイズの過剰見積りをもたらすことがある。本発明者らは、各遺伝子を単一の機能上のクラスに割り当てることによって、これを克服した。図２Ａに示すように、ＰＤにおけるシグナル伝達、タンパク質分解、ドーパミン作動性の伝達及び代謝、イオン輸送、タンパク質の修飾／リン酸化、並びにエネルギー経路／解糖の機能上のクラスで、主要な遺伝子のダウンレギュレーションが観察された。
【００８１】
ＰＤにおいて差次的にアップレギュレートされる遺伝子に関しては、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、細胞周期、タンパク質の修飾／リン酸化、タンパク質代謝、転写、及び炎症／ストレスを含む生物学的プロセスに主に集中した（図２Ｂ）。
【００８２】
最も過剰発現され又は濃縮した遺伝子を同定するために、ＥＡＳＡプログラムで遺伝子カテゴリーの統計学的分析を行った（Ｈｏｓａｃｋら、２００３年）。機能上のグループ内で変化する遺伝子の割合がチップ全体におけるそのような遺伝子の分画より有意に大きい場合、このような分類は結果における信頼性を上昇させる。
【００８３】
０．０５未満の「イージースコア（Ｅａｓｙ ｓｃｏｒｅ）」の機能上の分類が、過剰発現と記録された。この分析では、差次的にダウンレギュレートされる遺伝子における最も顕著な変化は、タンパク質分解及びペプチド分解（１０％）の生物学的プロセスでｐ＜０．０２のＥＡＳＥスコアで起こり（表３、星印でしるした）、並びにイオン輸送体及び加水分解酵素活性に関する分子の機能で（ｐ＜０．０５、データは示さず）起こったことが明らかになった。このタンパク質分解性のグループの中では、２０Ｓプロテアソームサブユニットα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）、２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニット、非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）、並びにＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）などのＵＰＳの触媒サブユニット及び調節サブユニットの両者の発現が減少することを、本発明者らは観察した。ＰＳＭＤ８は、有意水準の上限をわずかに超えていたが、６名の患者では減少の明らかな傾向が見られた（患者のうち３名＞対照の１．５倍）。ＰＳＭＤ８は、他のＵＰＳ成分とともに集合するので、本発明者らはこれがＰＤで機能的に影響を受けていると考えた。
【００８４】
一方、生物学的プロセス及び分子機能において、ＰＤで遺伝子発現が増加する統計学的に有意な傾向が、細胞接着／細胞マトリックス（約１５％）に対してｐ＜０．００５のＥＡＳＥスコアで（表４、星印でしるした）、構造分子及びタンパク質キナーゼ活性に対して（ｐ＜０．０５、データは示さず）見出された。
【００８５】
並行して、６名のパーキンソン症候群のうち少なくとも５名のＳＮにおいて１．５倍の差次的な発現を表す遺伝子を選択する、例外的に厳格な分析を行った。各患者のサンプルのシグナルを、対照サンプルのシグナルの平均（幾何平均）と比較した。この評価により、年齢、死因、性別、死後間隔、疾患の重症度などの要因の組み合わせに由来することがある各死後組織サンプル内の遺伝子発現における変動を同定できるので、大変重要である。
【００８６】
この取組みは、ＰＤの症例で差次的に発現された全遺伝子を２０個のみに制限し、そのうち、それぞれ対象グループに比べて８個が減少し、１２個が増加した（図３）。
【００８７】
重要なこととして、８個のダウンレギュレートされる遺伝子のうち、３個（３７．５％）がＤＡの神経伝達及び代謝に属する（図３Ａ）。これには、サイクリックＡＭＰ制御リン酸化タンパク質（ＡＲＰＰ−２１）、溶質担体ファミリー（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ）１８（小胞モノアミンメンバー２、ＶＭＡＴ２）、及びアルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）が含まれる。更に２個の遺伝子が、タンパク質のハンドリング及び分解に関連する（Ｓ期キナーゼ会合タンパク質１Ａ（ｐ１９Ａ）、ＳＫＰ１Ａ、及びシャペロン熱ショック７０ｋＤａタンパク質８、ＨＳＰＡ８）。最後の３個の遺伝子は、リン酸化及びタンパク質修飾プロセスにあずかるＳＦＲＳタンパク質キナーゼ２（ＳＲＰＫ２）、三分裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）３連モチーフ含有３６（ＴＲＩＭ３６）、並びに、両者とも機能が知られていないＥＧＦ様及び２個のフォリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通型のタンパク質（ＴＭＥＦＦ１）である。
【００８８】
１２個のアップレギュレートされる遺伝子（図３Ｂ）には、細胞接着の機能上のグループに属するパルビン（ｐａｒｖｉｎ）α（ＰＡＲＶＡ）、レクチン、ガラクトシド結合性、可溶性、９（ガレクチン９）（ＬＧＡＬＳ９）、及びセレクチンＰリガンド（ＳＥＬＰＬＧ）、細胞シグナリングのクラスに関与するプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）及び低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（６ＬＲＰ６）、タンパク質及び脂質の代謝、並びにリン酸化のカテゴリー由来のｅｇｌナイン同族体１（線虫）（ＥＧＬＮ１）、真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質２（ＥＩＦ４ＢＰ２）、マンノシダーゼ、α、クラス２Ｂ、メンバー１（ＭＡＮ２Ｂ１）、及びスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）、細胞の成長に関与するセマフォリンｓｅｍ２（ＬＯＣ５６９２０）、推定上の分泌タンパク質ＺＳＩＧ１１（ＺＳＩＧ１１）、及び両者とも機能が知られていないセリン／アルギニン反復マトリックス２（ＳＲＲＭ２）が含まれる。
【００８９】
（実施例２）定量リアルタイムＰＣＲ
ＵＰＳで重要な役割を果たす、主要な遺伝子の１つであるＳＫＰ１Ａの発現が減少するという本発明者らの発見を確認するために、本発明者らはＳＫＰ１Ａ、並びに２つの更なる遺伝子であるＨＳＣ７０及びＶＭＡＴ２に対してリアルタイム定量ＰＣＲを行ったが、これら遺伝子は全て、＜０．６７のファクターでパーキンソン症候群患者６名中少なくとも５名に影響を及ぼした。
【００９０】
アレイハイブリダイゼーションに用いるＲＮＡがＰＣＲに十分でない場合は、本発明者らは、２つの更なるサンプルを実験グループに加えた（対照７及び患者７）。本発明者らは、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別々の領域を分析した。小脳は、遺伝子変化の特異性を評価するための、ＰＤに関連しない領域として選ばれた。
【００９１】
リアルタイムＰＣＲ分析により、正常の対象でもＰＤの対象でも、ＳＮは特に低いｍＲＮＡレベルのＳＫＰ１Ａを発現することが明らかになった（図４）。統計学的に有意ではなかったが、ＰＤのＳＮｐｃで発現が減少する明らかな傾向が観察された（図４Ａ）。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＰＤのＳＮｒ又は小脳では影響を及ぼさなかった（図４Ｂ、Ｃ）。
【００９２】
本発明者らは、パーキンソン症候群患者のＳＮｐｃ及びＳＮｒの両者でＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４をコードするＨＳＰ８の遺伝子発現が有意に減少することを確認したが（図４Ｄ、Ｅ）、ＰＤ及び対照からの小脳に有意な変更は観察されなかった（図４Ｆ）。ＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４は、２つのアイソフォームで存在し、短小化したものはタンパク質結合性で可変のドメインにおける１５３個のアミノ酸残基を欠く（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘチップのプローブセットはこれらの間を区別することができず、その結果、アレイハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析の両者から得られた結果は両タイプの結合したレベルを表さなければならない。
【００９３】
これらの新規の発見に加えて、本発明者らのアレイ分析は、小胞のＤＡ輸送体（ＶＭＡＴ２）の発現が減少する証拠も確認した。リアルタイムＰＣＲによりＳＮｐｃにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡの特異的な減少が明らかになったが、ＳＮｒの変化は極めてはっきりしなかった（図４Ｇ、Ｈ）。ＰＤと対照の小脳におけるサンプル間で有意な差が見られなかったので、これらの変更はＳＮに特異的であった。
【００９４】
アレイ及びリアルタイムＰＣＲ分析の両者で見出された発現の減少は、ＰＤのＳＮにおけるｍＲＮＡレベルの一般的な減少の結果にすぎないのか、或いはシナプスの損失であるのかを決定するために、本発明者らは３つの遺伝子の発現を調査した。３つの遺伝子は、Ｒａｂ３ｂ ＧＴＰａｓｅ（図４Ｊ、Ｋ、Ｌ）、シンタキシン６、及びコートマー（ｃｏａｔｏｍｅｒ）タンパク質複合体サブユニットζ２（ＣＯＰζ２）（データは示さず）であり、これらは、小胞体からゴルジへの小胞の輸送、小胞体膜ドッキング、並びにホルモン及び神経伝達物質のニューロン開口放出（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）の制御因子である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ、１９９９年；Ｆｕｔａｔｓｕｍｏｒｉら、２０００年；Ｗｅｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ、２００１年）。これらの発現は、様々な脳の領域におけるＰＤ及び対照サンプル間で違いがなかった。
【００９５】
上記の実験において、ＰＤで選択された生物学的に意義のある経路、及び、文献に報告され、リアルタイムＰＣＲ分析により確認された遺伝子変化の実質的な一致に焦点を当てた厳格な分析を行った。
【００９６】
（実施例３）パーキンソン症候群及び健常対照者の脳からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンにおけるＳＫＰ１タンパク質の検出
パーキンソン症候群の脳及び健常対照者からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンのサンプルで、ＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学的分析を行った（材料と方法に記載した通り）。図５に要約した結果は、ＳＫＰ１タンパク質は正常サンプルに存在するが、ＰＤサンプルには殆ど非存在であることを示している。したがって、ｍＲＮＡのＳＫＰ１発現について上記の実施例１及び２で得られた結果は、ＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学的分析によるタンパク質レベルで確認された。
【００９７】
結果の要約
本発明の結果は、初めて、パーキンソン症候群の死後の脳のＳＮｐｃにおける全体的な遺伝子発現の変化を、年齢をマッチさせた対照に比べて示すものである。１つの主要な新規の発見は、タンパク質の異化作用の不可欠な成分であるＳＫＰ１Ａ遺伝子の負の調節である。この遺伝子の減少には、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、及び炎症／ストレスに関する機能上の活性を有する遺伝子の数の顕著な増加と並行して、エネルギー経路及びシグナル伝達における２６Ｓプロテアソームの様々なサブユニットの発現の減少が伴う。
【００９８】
パーキンソン症候群のＳＮｐｃにおける、ＳＣＦユビキチンリガーゼ多タンパク質複合体の成分であるＳＫＰ１Ａの減少
ＳＫＰ１は、モジュラー多タンパク質のＳｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ、及び基質認識性Ｆ−ｂｏｘタンパク質（ＳＣＦ）内で機能する、ＲＩＮＧタンパク質のＲｂｘファミリーの部分である（Ｋａｍｕｒａら、１９９９年）。このユニットにより多数のＥ３複合体の形成が可能になり、次に、Ｅ３複合体は広範囲の様々なタンパク質の基質を認識できる。ＳＣＦ複合体はモジュラーであり、ＳＫＰ１は、特異的な標的の認識を担ういくつかのＦ−ｂｏｘタンパク質と相互作用をすることができ、それにより機能上の多様性をもたらし、この複合体により処理されるタンパク質のレパートリーを増やす。ヒトは、機能上のＳＫＰ１アイソフォームを１つだけ発現する（Ｓｅｍｐｌｅ、２００３年）。したがって、本明細書で観察されるその発現の減少は、律速因子を構成することができ、ＰＤ患者の脳における広範囲のユビキチン結合したタンパク質（例えば、チロシン水酸化酵素、シンフィリン−１、α−シヌクレイン、リン酸化タウ）の凝集体を説明することができる（Ｌｉａｎｉら、２００４年；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、２００４年；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、２００４年）。
【００９９】
定量リアルタイムＰＣＲ分析により、ＳＮは正常対象でもＰＤ対象でも特に低いｍＲＮＡレベルのＳＫＰ１Ａを発現することが明らかになった。例えば、対照サンプルは、その発現がＰＤのＳＮｐｃで影響を受けないＲａｂ３Ｂ（１．８０±０．７０）より、２ケタを超えて異なる大変低い発現値を示す（０．０１３±０．０１１）。ＳＫＰ１ＡのｍＲＮＡは特に不安定であり、死後組織で即座に分解することもあり得る。これは、サンプルの発現レベルにおける大きな変動を説明することができるが、ＰＤのＳＮｐｃにおける発現が減少する明らかな傾向が観察された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのデザインは特別であるので、死後のサンプルなど部分的に分解されているサンプルでさえプローブセットのプローブに部分的にハイブリダイズすることがあり、高いｐ値をもたらし、存在するとみなされる。したがって、厳格な分析（ｐ＜０．０５、少なくとも１．５のファクターで５名の患者で減少）とともにチップの方策をとれば、この結果が確信的になる。ＳＫＰ１Ａ発現レベルが低いということは、少なくとも部分的に、例えば、鉄濃度、酵素的（モノアミンオキシダーゼ）及び非酵素的（自己酸化）ＤＡ代謝、異常タンパク質の蓄積、プロテアソームの阻害、及び神経毒性が誘導するＯＳの増加など、様々なタイプのストレスに対してＳＮｐｃが特に感受性であることを説明することができる。この前後関係では、ＰＡ２８マルチサブユニットプロテアソームアクチベーター（ｍｕｌｔｉｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（２６Ｓプロテアソームの構成要素）タンパク質のレベルは、正常及び特発性両方のＰＤ対象のＳＮｐｃで他の脳の領域に比べて大変低いことが示され（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）、おそらくは、様々なストレス傷害に対し既に損なわれた、障害がおきたＤＡ含有ニューロンを悪化させている。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＰＤのＳＮｒ又は小脳では影響を受けなかった。
【０１００】
最近の研究は、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）も新規のＳＣＦ様複合体内で、基質の認識を担うＦ−ｂｏｘ／ＷＤ反復タンパク質ｈＳｅｌ−１０、及びＳＫＰ１を含まないＣｕｌｌｉｎ１とともに機能することができることを実証している（Ｓｔａｒｏｐｏｌｉら、２００３年）。この発見によると、パーキンは、ｈＳｅｌ−１０以外のアダプタータンパク質と関連する可能性がある。このような複合体は多様な基質特異性を表す可能性があり、パーキンについて報告されていたいくつかの標的を説明することができる（Ｄｅｖら、２００３年）。
【０１０１】
プロテアソームサブユニットにおける機能障害
ＳＫＰ１Ａにおけるこの選択的減少の他に、ＰＤの脳のＳＮで、２０Ｓプロテアソームサブユニットであるα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）ｍＲＮＡ、並びに２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニットである、非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）及びＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）に相伴った減少が観察され、これらは更にＰＤのドーパミン作動性ニューロンの損傷の一因となる可能性がある。１９Ｓ複合体は、プロテアソームの２０Ｓタンパク質分解性のコアの一端又は両端に位置し（Ｃｏｕｘら、１９９６年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年）、少なくとも１８のサブユニットを含む（Ｇｌｉｃｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、２００２年）。これは、「基底部」と「蓋部」の２つのサブ複合体に細分され、これらはそれぞれ、２０Ｓタンパク質分解性のコアの近位及び遠位の部分を形成し、一緒に２６Ｓ複合体を形成する。蓋部はＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２を含む８つの調節粒子の非−ＡＴＰ分解酵素（Ｒｐｎ）サブユニットを構成する。蓋部の重要な機能の１つは、多ユビキチン結合したタンパク質及び他のプロテアソームの潜在的な基質を認識することである（Ｇｌｉｃｋｍａｎら、１９９８年）。基底部は、３つの非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット（Ｒｐｎ１、Ｒｐｎ２、及びＲｐｎ１０、この最後は基底部にも蓋部にも共通である）、並びにＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７を含む６つの推定上のＡＴＰ分解酵素サブユニット（Ｒｐｔ１〜６）を含む。これらは、非ユビキチン結合した標的タンパク質の非天然の立体配座と相互作用をし（Ｇｌｉｃｋｍａｎら、１９９８年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、２０００年）、その１つであるＳ６’／ＴＢＰ１は、凝集した又はモノマーのα−シヌクレインと結合することが見出された（Ｇｈｅｅら、２０００年；Ｓｎｙｄｅｒら、２００３年）。同様の前後関係で、調節のプロテアソームタンパク質Ｓ６とも呼ばれるＰＳＭＣ４は、別の前シナプスタンパク質であり、シナプス小胞と関連のある、野生型及び変異型のシンフィリン−１（Ｄｕｋｅら、２００４年）、と特異的に相互作用することが最近報告されている（Ｒｉｂｅｉｒｏら、２００２年）。シンフィリン−１は、α−シヌクレインと関連があり、同様にレヴィ小体に蓄積することが見出された（Ｗａｋａｂａｙａｓｉら、２０００年）。したがって、本発明に見出されるＰＳＭＣ４のレベルの減少は、緩慢であるが持続的であるα−シヌクレインの凝集によるＵＰＳの進行性の阻害とともに、レヴィ小体でこれらの蓄積を引き起こすことがある（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年；Ｌｉａｎｉら、２００４年）。ＰＤサンプルにおけるグリコサミノクリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｃｌｙｃａｎ）ヘパラン硫酸遺伝子の発現の観察される増加は、示唆されたように、α−シヌクレインの原繊維形成及び凝集の一因にもなり得る（Ｃｏｈｌｂｅｒｇら、２００２年）。６つのＡＴＰ分解酵素はそれぞれ不可欠であり、タンパク質分解へのＡＴＰ要求、並びに２６Ｓ複合体を形成するための２０Ｓ及び１９Ｓ複合体の会合の説明となる（Ｇｈｉｓｌａｉｎら、１９９３年；Ｇｏｒｄｏｎら、１９９３年）。したがって、パーキンソン症候群患者の脳におけるＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７の発現の減少は、２６Ｓプロテアソーム複合体のレベルの減少、ユビキチン結合したタンパク質の異常蓄積、及び、次に細胞の欠陥を引き起こすことがあるサイクリンなどの寿命の短いタンパク質の分解速度の低下の一因となり得る（レビューには、Ｃｏｕｘら、１９９６年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年を参照されたい）。実際、本発明者らは、サイクリンＧ会合キナーゼ遺伝子の減少を観察した。サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼの蓄積は、アポトーシスを経験している有糸分裂後のニューロンで（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、１９９９年；Ｃｏｐａｎｉら、２００１年）、及びＰＤのＭＰＴＰモデルで（Ｇｒｕｎｂｌａｔｔら、２００１年）報告されている。この事象は、細胞周期に再度入る際の試みを表すことができることが示唆されている（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、２００２年）。本発明者らの発見は、２０Ｓプロテアソームのβ−サブユニットではなくα−サブユニットの発現が減少し、いくつかの１９Ｓサブユニットのタンパク質発現レベルが減少し、散発性のＰＤ患者のＳＮｐｃで２６／２０Ｓプロテアソーム活性が機能的に不足するという以前の報告と一致する（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）。しかしながら、ウェスタンブロット分析で使用した抗体は、様々なプロテアソームサブユニットに共通の配列を認識したので、また、分子量の過剰見積りをもたらすタンパク質の二量体化の可能性があったので、この研究では、影響を受ける様々なサブユニットの正確な性質は確立されなかった。このように、本発明は、より広い観点を提供し、特異的なプロテアソーム構成成分の発現における遺伝子の変化を明らかにするものである。
【０１０２】
熱ショックタンパク質シャペロンＨＳＣ−７０
細胞に対するタンパク質毒性の傷害又はいくつかのストレス条件は、野生型及び変異のタンパク質の正確なフォールディングを助けることにより細胞を保護することを目的とした分子シャペロンのアップレギュレーションを誘導することができる。このようなものの１つに、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）ファミリーのメンバーである、７０ｋＤａ熱ショック同族タンパク質（Ｈｓｃ７０）がある（Ｚｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｂｒｏｎｋ、２００１年）。Ｈｓｃ７０は、通常、タンパク質のフォールディング、再フォールディング、集合、分解、及び生物膜を介したタンパク質の転位置などの細胞プロセスを媒介する。Ｈｓｐ７０が過剰発現されると、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでミスフォールディングされ凝集したα−シヌクレイン種の量を減少させ（Ｋｌｕｃｋｅｎら、２００４年）、野生型α−シヌクレイン、並びに変異の形態のＡ３０Ｐ及びＡ５３Ｔを発現し（Ａｕｌｕｃｋら、２００２年）、ポリグルタミンの病原性に関連する分解を抑制するトランスジェニックハエのＰＤのモデルでドーパミン作動性ニューロンの損失を防止することが示されている（Ｂｏｎｉｎｉ、２００２年）。最近、２７４名のＰＤ患者で、ＰＤへの罹患性を増加させることがあるＨＳＰ７０−１の５’プロモーター領域に機能上の多形性が報告されている（Ｗｕら、２００４年）。本発明者らは、リアルタイム定量ＰＣＲにより確認して、６名中５名のパーキンソン症候群患者のＳＮｐｃ及びＳＮｒの両方でＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４をコードするＨＳＰ８の遺伝子発現が著しく減少するが、ＰＤ患者と対照からの小脳の間に組織特異性を示唆する著しい変更は観察されなかったことを見出している。ＨＳＰＡ８は２つのアイソフォームで存在し、短小化したものは、タンパク質結合領域及び可変領域で１５３個のアミノ酸残基を欠く（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。これは、コシャペロンと競合することにより、Ｈｓｃ７０の内因性の阻害的制御因子として機能すると考えられている（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。現在、このどちらがより強く影響を受けるかを、本発明者らは区別することができない。
【０１０３】
Ｈｓｃ７０は、小胞及び核内輸送に関与する他に、アンフォールドの、又は異常型のタンパク質を認識することによるタンパク質のユビキチン結合、及びコシャペロンであるＥ３リガーゼ酵素ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０と相互作用するタンパク質のカルボキシル末端）への分配で役割を果たすことがある（Ｍｕｒａｔａら、２００３年）。ＣＨＩＰは、Ｈｓｐ９０及び／又はＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０と協力し、それらの結合したミスフォールディングされた基質にユビキチン結合することができる。したがって、このＨｓｃ７０−ＣＨＩＰペアは、シャペロンによりもたらされたアンフォールドのタンパク質を特異的に認識するための、Ｅ３リガーゼを示す。ＵＰＳによる再フォールディング又は分解を逃れたタンパク質は封入体中に蓄積する凝集体を形成するので、この分子シャペロン−ＵＰＳの品質管理システムは神経変性疾患では特に重要である。実際、分子シャペロン、並びにユビキチン及びプロテアソームは封入体及びレヴィ小体に動員され（Ｓｔｅｎｏｉｅｎら、１９９９年；Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、２００１年）、損傷したタンパク質を分解し又はそれらの除去を防止する品質管理システムの試みを指摘している。実際、数々の神経変性疾患は、タンパク質の品質管理システムの失敗によりもたらされる様子である（Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、２００１年）。
【０１０４】
細胞接着分子、鉄、及び酸化ストレス
細胞の遊走及び軸索の伸長、並びに細胞骨格及びＡＤの構成成分など、ニューロンの発達で不可欠な役割を演じている遺伝子間の関連が最近提唱されている（ＤｅＦｅｒｒａｒｉ ａｎｄ Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ、２０００年）。細胞骨格構成成分（例えば、ニューロフィラメント、微小管関連タンパク質）の異常なリン酸化、並びにシナプス及び他のタンパク質のユビキチン結合がレヴィ小体内で遭遇するＰＤに、同様の仮説をあてることができる（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年）。
【０１０５】
膜及び細胞外マトリックス（細胞接着プロセス）に重要な構造上の、及びリン酸化の分子機能を有する遺伝子の異常なアップレギュレーションを示す本発明者らの現在の発見は、この仮定を支持し、未来の治療学に潜在的な新規の遺伝子ターゲットを示す本発明者らの知識を拡張するものである。
【０１０６】
ＰＤ、ＡＤ、及び多発性硬化症で報告されているような脳の炎症の間、重要な細胞接着分子の組織化の崩壊及びそれらのシグナル伝達経路の減少が、グリア細胞及びマクロファージの動員、並びにサイトカイン及びＯＳの増加におそらく関連する、脳の病状を生じることがある。更に、本発明者らは、６名中５名の患者に、最近記載された、鉄−及び２−オキソグルタレート−依存性ジオキシゲナーゼスーパーファミリーに属するプロリンヒドロキシラーゼ酵素であるＥＧＬＮ１（ｅｇｌナイン同族体１）遺伝子の１．５倍を超える著しい誘導を観察した（Ｅｐｓｔｅｉｎら、２００１年）。これらの酵素は、低酸素感受性遺伝子のアレイの協調的な誘導を調和させる主たる制御因子である、転写因子である低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ）の発現をコントロールする、重要な鉄及び酸素のセンサーとして働く。ＨＩＦの標的遺伝子は、脈管形成、細胞の増殖／生存、及びグルコース／鉄の代謝に特に関連している（Ｌｅｅら、２００４年）。酸素レベルが高いとき、又は鉄の過負荷時、ＥＧＬＮ水酸化酵素は、ＨＩＦを標的にしてプロテオソームを分解する。
【０１０７】
興味深いことに、遊離の鉄が誘導しプロテアソームが媒介する、鉄調節タンパク質（ＩＲＰ２）の分解は、２−オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼの活性も伴い、鉄のキレート化剤により阻害される（Ｈａｎｓｏｎら、２００３年；Ｗａｎｇら、２００４年）。したがって、ＩＲＰ２は翻訳後修飾を起こすＥＧＬＮ１の基質であり、タンパク質分解のためにＥＧＬＮ１にシグナルを送る可能性がある。ＳＮｐｃにおけるＥＧＬＮ１の過剰産生は、ＩＲＰ２の低下、並びに引き続きトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）ｍＲＮＡの減少及びフェリチンレベルの増加をもたらすことがあり、両者ともＩＲＰ２によるそれぞれ正及び負の転写調節を受ける（Ｍｅｙｒｏｎ−Ｈｏｌｔｚら、２００４年；Ｐｏｎｋａ、２００４年）。ＩＲＰ２のノックマウスにおける最近の研究により、実質的な運動緩徐及び振戦で線条体に鉄が蓄積することが明らかになっている（ＬａＶａｕｔｅら、２００１年）。
【０１０８】
鉄及びＯＳセンサータンパク質の発現の増加は、両者ともＨＩＦタンパク質により調節される、ホスホフルクトキナーゼ及び脈管形成因子ＶＥＧＦで観察される減少の直接の原因であることがある（Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏら、２００３年）。ホスホフルクトキナーゼは、解糖系によるグルコースの流動をコントロールする、重要な調節酵素である。同様に、ＶＥＧＦは、ＰＩ３Ｋ及びｒａｓ経路の活性化により、グルコースの輸送及び代謝に関与する遺伝子を活性化する。これらの経路における２つの主役である、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＢ及びホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒作用、αポリペプチドの発現も、パーキンソン症候群のＳＮｐｃでダウンレギュレートされる。この発見は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）分析を用い、ＳＮへのグルコースの取りこみの減少を実証して（Ｂｅｒｄｉｎｇら、２００１年）ヒトＰＤ患者における以前の報告を支持し、この疾患により冒された主要な生存経路のより広い視野を提供するものである。これらの観察は、数々のエネルギー経路／解糖に関連する遺伝子が更に減少すること、並びに鉄／ＯＳ及び炎症遺伝子が増加することに加えて、ミトコンドリアの機能不全、並びに活性酸素種及び窒素種がＰＤの病原の一因であるという仮説と一致する。これと一致して、最近の研究は、推定上のフリーラジカルセンサーＤＪ−１遺伝子における劣性の変異を、早期発症型のパーキンソン症候群と関連付けた（Ｂｏｎｉｆａｔｉら、２００３年）。
【０１０９】
驚くべきことに、アポトーシスに関連する遺伝子はＰＤサンプルで最も小さい機能上のクラスを構成し、このことは疾患で生じている神経変性の一連の事象におけるプログラム細胞の死の関連に疑問を投げかけている。ＰＤにおけるアポトーシスの役割は、その証拠があっても病理学的発見及び神経変性の速度と相互に関連しないので、大いに議論の余地がある。本発明者らは、アポトーシスの変化がより早い段階で生じ、疾患の進行とともに減少する可能性を排除することはできない。
【０１１０】
ドーパミンの神経伝達及び代謝
これらのニューロンのプロセスの崩壊は、パーキンソン症候群のＳＮにおける、細胞接着タンパク質複合体と結合することがある細胞シグナリング遺伝子の発現において、並びに小胞の分泌経路、及びドーパミン作動性の神経伝達及び代謝に属する遺伝子において観察される減少によって悪化することがある。ＰＤ患者６名中少なくとも５名における決定的な変更を検出しようと探索する高度に厳密な分析では、対照グループに比べて遺伝子発現の変化は１．５倍であり、小胞のモノアミン輸送体ＶＭＡＴ２（ＳＣＬ１８Ａ２）を含む８遺伝子（そのうち３遺伝子がＤＡ伝達に関連する）の発現が大きく減少することを本発明者らは観察した。リアルタイムＰＣＲの確認分析では、ＳＮｐｃにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡに特異的な減少が現れたが、ＳＮｒにおける変化はそれほど顕著ではなかった。この発見は、ＰＤにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡの著しい減少を示すし、この著しい減少は着色した残りのニューロンにおけ、細胞あたりの輸送体及びＶＭＡＴ２両方のシグナルの顕著な減少と関連していたという対照及びＰＤの死後のＳＮについての以前の報告と一致している（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９６年；Ｂｒｏｏｋｓ、２００３年）。小脳ではＰＤと対照サンプルとの間に有意差がなかったので、これらの変更はＳＮに特異的であった。他の２つの著しい変化は、ＤＡ伝達及び代謝に関連する遺伝子であり、それぞれアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）及びｃＡＭＰ調節リンタンパク質をコードする、ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＲＰＰ−２１の減少と関連していた。ＡＲＰＰ−２１は、大脳基底核のＤＡで神経支配された脳の領域（例えば、尾状核〜被殻）、及び黒質で特に濃縮されていた（Ｏｕｉｍｅｔら、１９８９年；Ｔｓｏｕら、１９９３年）。ＤＡＲＰＰ−３２（ドーパミン及びアデノシン３’：５’−モノリン酸調節リンタンパク質−３２Ｋ）同様、ＡＲＰＰ−２１はＤＡレセプターであるＤ１により活性化され、したがって、Ｄ−１神経伝達の機能上の活性の指標を表すことができる。本発明者らが知る限りでは、これはＰＤのＳＮにおけるＡＲＰＰ−２１ｍＲＮＡレベルの減少についての最初の報告である。ＡＬＤＨ１Ａ１は、ＳＮのＤＡ細胞及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）で高度に且つ特異的に発現され、ＳＮｐｃドーパミン作動性ニューロンで著しく減少するが、ＰＤの脳のＶＴＡでは減少しないことが見出された（Ｇａｌｔｅｒら、２００３年）。これは、６−ヒドロキシドーパミンにおける線条体のＡＬＤＨ活性が、又はラット（Ａｇｉｄら、１９７３年）若しくはネコ（Ｄｕｎｃａｎら、１９７２年）で電気的に誘導された病変が、著しく減少するという所見と一致する。
【０１１１】
ＡＬＤＨは、ＤＡのアルデヒド誘導体（３，４ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及び４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニルアセトアルデヒド）への分解に関与し（Ｍａｒｄｈ ａｎｄ Ｖａｌｌｅｅ、１９８６年）、これらは次いで、ホモバニリン酸及びジヒドロキシフェニル酢酸に代謝され、また高度に反応性で神経毒性であるアルデヒドの解毒に関与する（Ｈｊｅｌｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、１９８３年）。したがって、ＤＡ伝達における変更は、ＡＬＤＨ活性を変更することがあり、且つ／又は、逆に、ＡＬＤＨが媒介する代謝の変化は、大脳基底核及び大脳辺縁系の、神経細胞体及び終末部におけるＤＡレベルに影響を及ぼすことがある。これらのタンパク質は、ＶＭＡＴ２と結びついて、今やＰＤの新規のマーカーとしてみなすことができる。
【０１１２】
本発明に観察されるこれらのＤＡの神経伝達、及び代謝に関連した遺伝子のレベルが全体的に減少することは、神経伝達物質の貯蔵と深刻に折り合い、ＤＡニューロンの機能不全と相互に関連することがある。これは、小胞体からの初期の小胞トラフィッキングタンパク質のＳＥＣ２２ファミリーのメンバーであるＳＥＣ２２Ｌ１ｍＲＮＡのレベルが減少することにより（Ｈａｙら、１９９６年）、且つ膜担体輸送体の多くに観察される減少により、更に悪化することがある。広いレパートリーの細胞内タンパク質及び膜タンパク質を輸送する、細胞輸送及び小胞トラフィッキングの損傷は、これらが凝集し、細胞が細胞質封入体（アグリソーム）内及びレヴィ小体に堆積することを、よく説明することができる。本発明者らの観察を説明する１つの単純な仮説は、ＤＡを含有するニューロン本体及びニューロンのシナプスの損失が、遺伝子産物のレベルの減少を説明することができるということである。この仮定は、広いレパートリーの小胞輸送又はシナプス関連遺伝子における同様の遺伝子発現の変化を予想するものである。しかしながら、本発明者らのマイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲの確認から浮上したように、Ｒａｂ３ｂ、シンタキシン６、及びＣＯＰζ２などのカテゴリーに関係する多くの遺伝子の発現は、ＰＤでは変更されなかった。
【０１１３】
タンパク質の修飾／リン酸化
２つのプレ−ｍＲＮＡスプライシング関連遺伝子の発現は、対照の脳に比べて、ＰＤサンプル６個中５個のそれぞれで、逆比例に且つ高度に影響を受けていた。ＳＦＲタンパク質キナーゼ２をコードするＳＲＰＫ２遺伝子はダウンレギュレートされ、セリン／アルギニン反復マトリックス２をコードするＳＲＲＭ２は著しく増加した。ＳＲＰＫ２は、アルギニン／セリンに富む（ＳＲ）ドメイン含有スプライシングファクターのリン酸化に特異的な予想配列を有する、脳で高度に発現されるキナーゼであり、スプライシングファクターは、次に脳の領域でＲＮＡスプライシングを調節する（Ｗａｎｇら、１９９８年）。興味深いことに、ＳＲＲＭ２（又はＳＲｍ３００）は、主要な複合ＳＲｍ１６０／３００内のコアクチベーターとして機能するＳＲドメイン含有スプライシングファクターであり、サブセットの構成的にスプライスされたプレ−ｍＲＮＡのプロセッシングを担う（Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、２０００年）。
【０１１４】
ＳＲＭＭ２がＳＲＰＫ２の基質であれば、ＰＤのＳＮｐｃにおけるキナーゼＳＲＰＫ２の確固とした減少及びＳＲＭＭ２の高い発現が、異常な低リン酸化ＳＲＭＭ２の蓄積をもたらすことは妥当と思われる。これは、次にＳＲｍ１６０、及び／又はスプライシング活性における広範な損傷に最終的に集中する他の関連のあるＳＲタンパク質の核の分布に影響を及ぼす可能性がある。
【０１１５】
結論
ＰＤの病理学及び病因学に関する情報は幅広いが、ＰＤの発症のきっかけとなる主要な事象が何であるかを断言するのは未だ時期尚早である。本発明が示すのは、細胞外マトリックス／細胞骨格構成成分の進行性の誤制御とともに、ＯＳ及び炎症の状態と同時発生するするＵＰＳの選択的構成成分のレベルの減少である。これらの一連の事象は、疾患の経過の間、独立して又は協力的に働き、結局はドーパミン作動性ニューロンの死をもたらす可能性がある。したがって、様々に影響を受けたタンパク質の動態のわずかな変更でも、数十年の間にＰＤにおけるＤＡ含有ニューロンの緩慢に進行する神経変性の根底にある蓄積効果となるかもしれない。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【０１１９】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ＰＤのサンプルで差次的に発現された１３７遺伝子の相対的な発現レベルを、対照サンプルと比べて示す。対照に比べて１．５のファクターで変更するという診断基準を満たし、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験をｐ＜０．０５の有意水準で通過した遺伝子のみが含まれた。１２サンプルにわたり、遺伝子は相対的発現レベルにより集中した。発現レベルを平均値と比較してカラーコードした。平均より小さい値は緑色、平均を超える値は赤色である。
【図２Ａ】Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙにしたがって類別された生物学的プロセスに関わる遺伝子の機能上のクラスター分析を示す。円グラフは、対照の脳と比べて、ＰＤサンプルでダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子の分布を示している。異なる機能グループで変更された遺伝子の数を示している。各機能グループの真のサイズの過剰見積りを避けるために、各遺伝子を単一のカテゴリーに割り当てた。（Ａ）における遺伝子の総数は６８個であり、（Ｂ）では６９個である。
【図２Ｂ】Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙにしたがって類別された生物学的プロセスに関わる遺伝子の機能上のクラスター分析を示す。円グラフは、対照の脳と比べて、ＰＤサンプルでダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子の分布を示している。異なる機能グループで変更された遺伝子の数を示している。各機能グループの真のサイズの過剰見積りを避けるために、各遺伝子を単一のカテゴリーに割り当てた。（Ａ）における遺伝子の総数は６８個であり、（Ｂ）では６９個である。
【図３】ＰＤサンプル６個中少なくとも５個で、１．５以上のファクターで変化した、差次的に発現された遺伝子のヒートマップを示す。患者のサンプルシグナルを、対照のサンプルシグナルの平均と比較した（幾何平均）。ＰＤサンプルで、ダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子を対照の脳と比べた。発現レベルを平均値と比較してカラーコードした。平均より小さい値は緑色、平均を超える値は赤色である。
【図４−１】ＰＤで差次的に発現された遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の確認を示す。以下のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションでは、ＰＤのＳＮで発現が変更された遺伝子の選択された数を、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別の脳の領域で確認して、組織特異的な遺伝子の変更を検出した。ＳＫＰ１Ａでは、値は１を超えるように調節し、ｌｏｇＹ軸を適用した。材料と方法で記載したように、検量線は４個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均に標準化した相対的な遺伝子発現を表す。ＰＤ及び対照の症例に対応するデータポイントを示してある。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５対対照。
【図４−２】ＰＤで差次的に発現された遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の確認を示す。以下のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションでは、ＰＤのＳＮで発現が変更された遺伝子の選択された数を、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別の脳の領域で確認して、組織特異的な遺伝子の変更を検出した。ＳＫＰ１Ａでは、値は１を超えるように調節し、ｌｏｇＹ軸を適用した。材料と方法で記載したように、検量線は４個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均に標準化した相対的な遺伝子発現を表す。ＰＤ及び対照の症例に対応するデータポイントを示してある。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５対対照。
【図５】パーキンソン症候群の脳からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンで、差次的に発現されたＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学分析の確認を示す。メラニン含有ドーパミン（ＤＡ）ニューロン内のＳＫＰ１免疫反応性は、青色を含むことで示される（緑色矢印を参照されたい）。ＳＫＰ１は、ＰＤでは殆ど非存在である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、経過観察するための分子マーカーの使用に関する。
【０００２】
略語：
ＡＣＴＢ：βアクチン；ＡＤ：アルツハイマー病；ＡＬＡＳ１：アミノレブリン酸δ合成酵素１；ＡＬＤＨ１Ａ１：アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１；ＡＬＳ：筋萎縮性側索硬化症；ＡＲＰＰ：２１−サイクリックＡＭＰ制御リン酸化タンパク質；ＤＡ：ドーパミン；ＤＥＰＣ：ジエチルピロカーボネート；ＥＧＬＮ１：ｅｇｌナイン同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）１；ＥＩＦ４Ｇ１：真核生物の翻訳開始因子４γ、１；ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素；ＨＳＰＡ８／ＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４：シャペロン熱ショック７０ｋＤａタンパク質８；Ｌ１３ａ：ＲＰＬ１３Ａ；ＬＧＡＬＳ９：レクチン、ガラクトシド結合性、可溶性、９；ＬＯＣ５６９２０：セマフォリンｓｅｍ２；ＬＲＰ６：低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質６；ＭＡＮ２Ｂ１：マンノシダーゼ、α、クラス２Ｂ、メンバー１；ＭＰＴＰ：Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン；ＯＳ：酸化ストレス、ＰＡＲＶＡ：パルビン（ｐａｒｖｉｎ）、α；ｐｃ：緻密部；ＰＤ：パーキンソン病；ＰＥＮＫ：プロエンケファリン；ＰＥＴ：陽電子放射断層撮影法、ＰＭＤ：死後の遅延；ＲＯＳ：活性酸素種；ＳＥＬＰＬＧ：セレクチンＰリガンド；ＳＫＰ１Ａ：Ｓ相キナーゼ会合タンパク質１Ａ；ＳＮ：黒質；ＳＰＥＣＴ：単一光子放射型断層撮影法；ＳＰＨＫ１：スフィンゴシンキナーゼ１；ＳＲＰＫ２：ＳＦＲＳタンパク質キナーゼ２；ＳＲＲＭ２：セリン／アルギニン反復マトリックス２；ＴＭＥＦＦ１：ＥＧＦ様の及び２つのフォリスタチン様のドメイン１を伴う膜貫通型タンパク質；ＴＲＩＭ３６：三分裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）モチーフ含有３６；ＵＣＨＬ：１−ユビキチンＣ末端加水分解酵素−Ｌ１；ＵＰＳ：ユビキチンプロテアソーム系；ＵＰＤＲＳ：パーキンソン病統一スケール；ＶＭＡＴ：小胞モノアミンメンバー；ＺＳＩＧ１１：推定上の分泌タンパク質ＺＳＩＧ１１。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、６５歳を超える集団で罹患率が１％である、進行性の神経変性障害であり、黒質（ＳＮ）におけるドーパミン神経の変性、及び結果として起こる線条体のドーパミン欠乏をもたらす（Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒら、１９７３年）。ドーパミン作動性神経の変性の原因及びメカニズムは、依然として把握困難である。散発性の（非遺伝性の）パーキンソン病は、この疾患の最も一般的な形態を成す。
【０００４】
ＰＤの遺伝性の形態も、散発性の形態も、主に、タンパク質ハンドリングの機能障害、異化作用、酸化ストレス損傷に集中する。
【０００５】
ＰＤの病因の一因となる潜在的な要因には、ミトコンドリアの機能不全、ドーパミン（ＤＡ）の自動酸化又は酵素（モノアミンオキシダーゼ）的酸化、及びＳＮ緻密部（ｐｃ）における過剰な鉄の蓄積が引き起こす継続する選択的酸化ストレス（ＯＳ）が含まれる（Ｒｉｅｄｅｒｅｒら、１９８９年；Ｙｏｕｄｉｍら、１９９３年；Ｇｏｔｚら、１９９４年；Ｊｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｏｌａｎｏｗ、１９９６年；Ｏｌａｎｏｗ ａｎｄ Ｙｏｕｄｉｍ、１９９６年；Ｙｏｕｄｉｍ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｒｅｒ、１９９７年；Ｊｅｎｎｅｒ，１９９８年）。特に、酸化還元活性のある鉄が、選択的に死滅するメラニン含有ニューロンの中に、及びＰＤの形態学的な特徴であるレヴィ小体の縁に観察されている。
【０００６】
レヴィ小体は、脂質、凝集したαシヌクレイン（その末梢のハロ（ｈａｌｏ）に集中している）、及びユビキチン結合した過剰リン酸化ニューロフィラメントタンパク質から構成される（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年）。数々の研究（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ−Ｇｏｌｔｓら、２０００年；Ｅｂａｄｉら、２００１年；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、２００１年）により、αシヌクレインが鉄の存在下で毒性の凝集物を形成し、これがＯＳによるレヴィ小体の形成の一因であると考えられていることが示されている。最近、ユビキチン結合したタンパク質が凝集したレヴィ小体は、ミスフォールディングされたタンパク質が堆積する単なる一般的な部位ではなく、毒性のミスフォールディングされた損害を受けたタンパク質を除去することをねらった防御措置としてとらえられ始めている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００４年；Ｔａｎａｋａら、２００４年）。
【０００７】
今や、かなりの数の変異した鉄代謝遺伝子が神経変性に直接関与することが示されているので、脳の鉄代謝の誤制御は、神経変性疾患で注目を浴びている（Ｆｅｌｌｅｔｓｃｈｉｎら、２００３年；Ｙｏｕｄｉｍ ａｎｄ Ｒｉｅｄｅｒｅｒ、２００４年）。したがって、鉄の酸化還元状態は中心的要素を成し、加齢し疾患に冒された脳における、タンパク質のミスフォールディング及び凝集の範囲の一因となる。
【０００８】
ユビキチン結合したタンパク質及びプロテアソームのタンパク質のハンドリングにおける欠陥は、ＰＤ、並びに、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びハンチントン病などの他の慢性神経変性疾患における、並びに加齢における共通の特徴である（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｎｄｉｎ、２００３年；Ｄａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ、２００３年）。これは、次には、細胞周期、プロセッシング、及び転写物の制御など、ユビキチン結合に関連するいくつかの細胞のプロセス、細胞内輸送、シグナル伝達経路、並びに正常の及び損傷を受けた細胞内タンパク質の分解における損傷をもたらす（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｎｄｉｎ、２００３年）。
【０００９】
証拠の蓄積により、この疾患の最も一般的な形態を構成する散発性ＰＤにおけるタンパク質のミスフォールディング、及びタンパク質封入体への凝集の決定的な役割に注意が向けられている。例えば、２０Ｓプロテアソームαサブユニットの損失（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００２年；ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）、及び散発性ＰＤのＳＮｐｃにおける２６／２０Ｓプロテアソーム系の活性の減少（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）も、報告されている。
【００１０】
αシヌクレイン、パーキン、及びユビキチンＣ末端加水分解酵素−Ｌ１（ＵＣＨＬ−１）における３つの明らかに独立した遺伝子変異は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）の活性を損なうことがあり、遺伝性ＰＤの稀な形態で記載されている（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、２００３年）。より最近では、ＤＪ−１遺伝子における劣性変異が、酸化ストレスに対する細胞応答で１つの役割を演じていることが提唱された（Ｂｏｎｉｆａｔｉら、２００３年）。しかしながら、これらの遺伝子のどれも、ＰＤの全症例の９５％を超えて構成する散発性ＰＤで変異することは実証されていない。
【００１１】
ＰＤの病因を探索する取組みは、細胞死に対するニューロンの脆弱性を増し、又は細胞の死を引き起こすことさえあり得る、遺伝子発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションにおける変化の研究に基づいている。数々の研究が、ＳＮにおけるカルシウム結合性タンパク質（２８ｋＤａカルビンジン−Ｄ）の減少（Ｉａｃｏｐｉｎｏ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｓ、１９９０年）、及びＰＤ患者からのリンパ球におけるＤ３レセプターｍＲＮＡ（Ｎａｇａｉら、１９９６年）の減少など、様々な遺伝子の発現における変更を報告している。
【００１２】
動物でパーキンソニズムを誘発するのに用いられる神経毒の中でも、Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯動物、霊長動物、及び他の種におけるパーキンソン症候群の神経化学的特性及び解剖学的特性の多くを最もよく再現する（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、２００３年）。このモデルにはある種の限界が内在する、即ち進行性の性質及びレヴィ小体（封入体）が欠如しているが、ドーパミン作動性の神経変性をもたらす分子の事象について多くが知られるようになっている。
【００１３】
ＭＰＴＰ動物モデルを用いて、いくつかの遺伝子の発現における変更が観察された。例えば、パーキンソン症候群のサルの被殻におけるニューロンの亜集団に、グルタミン酸脱炭酸酵素ｍＲＮＡの増加が観察され、これはＭＰＴＰ処置したパーキンソン症候群のサルでは線条体淡蒼球体のＧＡＢＡ作動性ニューロンが機能亢進する更なる証拠を提供するものである（Ｓｏｇｈｏｍｏｎｉａｎ ａｎｄ Ｌａｐｒａｄｅ、１９９７年）。ＳＮにおけるＢａｘ（細胞死エフェクター）ｍＲＮＡ発現が、Ｂａｘの免疫反応性の相伴う増加とともに増加することも、同モデルで検出された（Ｈａｓｓｏｕｎａら、１９９６年）。
【００１４】
より最近では、変性の間に起こる一連の事象のより全体的な像を得るために、ＭＰＴＰモデルを使用して、マウスの中脳における特異な遺伝子発現の変化を評価している（Ｇｒｕｍｂｌａｔｔら、２００１年）。研究で用いた中央の密度のマイクロアレイは、約１２００の遺伝子を含んでいた。このようにして、変更され得る特異な遺伝子発現の限定的な像が観察された。それでも、この研究では、酸化ストレス、炎症、一酸化窒素、グルタミン酸興奮毒性、及び、アップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）又はダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）される神経栄養因子経路に関する遺伝子の変更が実証された。細胞周期及び鉄代謝の制御、アポトーシス、中間代謝、並びにシグナル伝達を含む、以前に記載されていない更なる遺伝子の経路も観察されている。
【００１５】
更に、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの増加、プロデス（ｐｒｏ−ｄｅａｔｈ）遺伝子ＢＡＤ、ＢＡＸ、及びＢＩＤの増加が、メタンフェタミン処置ラットで報告された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１年）。これに伴って、アンチデス（ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ）遺伝子Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬに、大幅な減少があった（Ｃａｄｅｔら、２００１年；Ｊａｙａｎｔｈｉら、２００１年）。
【００１６】
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）によるドーパミンの枯渇により引き起こされるＰＤの、別の動物モデルでは、成年ラット及び新生児ラットの線条体にグルタミン酸脱炭酸酵素ｍＲＮＡ発現の増加が見られた。並行してプレプロエンケファリンの増加及びプレプロダイノルフィンｍＲＮＡレベルの減少が観察された（Ｌａｐｒａｄｅ ａｎｄ Ｓｏｇｈｏｍｏｎｉａｎ、１９９９年）。
【００１７】
パーキンソン病統一スケール（ＵＰＤＲＳ）（Ｆａｈｎ、１９８７年）などの、最近認められたＰＤ診断のための臨床診断基準により、パーキンソニズムを検出するための高い感度がもたらされている（Ｂｒｏｏｋｓ、１９９８年）。しかしながら、散発性ＰＤ、及び殆どの家族性ＰＤの症例のための、臨床の、特に前臨床のＰＤを確実に診断するために用いることができる、感度の良い特異的な生化学的マーカーは存在しない。
【００１８】
ＰＤを診断する１つの取組みは、典型的なＰＤを非定型のＰＤと区別する手段を提供する機能画像法であり、ドーパミン作動性の機能の損失の特徴的なパターンを明らかにするものである。更に、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、及び単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）は、ＰＤにおける線条体の代謝の維持レベル及びドーパミンレセプターの結合性を示すが、非定型の変異型ではレベルは減少する（Ｂｒｏｏｋｓ、１９９８年）。それでも、これらの手段ではＰＤの正確な診断は得られず、しばしば、ＰＤの専門家が、７．６年の経過観察の間に診断を稀に変更した（Ｊａｎｋｏｖｉｃら、２０００年）。
【００１９】
更に、これらの診断方法は全て、症状が現れた時点のみに、ニューロンの７０％近くが変性した後でのみ、ＰＤを有する対象を検出することができる（Ｚｉｇｍｏｎｄら、１９８９年）。このため、勿論、治療及びおそらくはニューロンの救出さえも殆ど不可能になっている。これを考慮すると、疾患を初期の段階で診断することが望ましく、この理由から、初期の診断方法を開発することが重要である。
【００２０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、神経保護作用を示す薬物は既に多く存在する（Ｄｒｕｋａｒｃｈ ａｎｄ ｖａｎ Ｍｕｉｓｗｉｎｋｅｌ、２００１年；Ｇｒｕｎｂｌａｔｔら、２００１年及び２００３年；Ｋｏｌｌｅｒ、２００２年；Ｏｌａｎｏｗら、１９９６年及び１９９８年；Ｒｉｅｄｅｒｅｒら、２０００年及び２００２年；Ｓｏｔｏ−Ｏｔｅｒｏら、２００２年）。更に、神経変性のプロセスを遅らせるのに遺伝子治療が最も奏功することが示された（Ａｚｚｏｕｚら、２００２年；Ｌｅ ａｎｄ Ｆｒｉｍ、２００２年；Ｌｕｏら、２００２年；ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｒｄｏｗｅｒ、２００２年；Ｍｏｎｖｉｌｌｅ、２００２年；Ｏｌａｎｏｗ、２００２年；Ｓｅｎｉｏｒ、２００２年；Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら、２００２年）。問題は、治療の開始が遅すぎ、生存するニューロンの数が少なすぎるため、これらの薬物及び方法はＰＤの患者でいかなる成功も示さなかったことである。したがって、早期に診断すれば、ＰＤに生じる細胞死から保護することができる治療方策に服従するための、且つ疾患の進行を防止するためのより良い時間点を提供することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ゆえに、ニューロンの実質的な損傷が生じ、典型的な症状が現れる前に、ＰＤ患者を治療することが重大である。したがって、初期の段階でＰＤを検出しモニターするための、初期診断方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、一態様では、疾患の進行及び治療の効果をモニターする、診断の目的の、パーキンソン病の分子マーカーの使用に関する。
【００２３】
別の一態様では、本発明は、測定可能な生物学的マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、経過観察する方法に関し、前記マーカーは、変更された発現パターンを示す１つ又は複数の遺伝子であり、又はそれによりコードされる遺伝子産物である。
【００２４】
本発明による分子マーカーとして使用するための遺伝子は、以下に詳しく述べるように、ＰＤ患者で発現がアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、治療を経過観察するための特異的な分子マーカー又は生物学的マーカーの使用に関する。
【００２６】
本発明によると、例えば、遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡｌ、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７など、ＰＤで変更された発現パターンを有する遺伝子が見出された。
【００２７】
したがって、一実施形態では、本発明は、パーキンソン病を検出し、予後診断し、治療を経過観察するための分子マーカーの使用に関し、この分子マーカーは、１つ又は複数の上記の遺伝子、又はそれらの遺伝子産物である。
【００２８】
本発明者らは、上記に記載した遺伝子のいくつかは健常個体に比べてＰＤ患者で発現の増加を示すが、他の遺伝子は発現の減少を示すことを更に見出した。以下の表３及び表４はそれぞれ、ダウンレギュレート及びアップレギュレートされる遺伝子、並びに各遺伝子に対して、遺伝子銀行番号、全遺伝子名、及びその機能を含めたそれらの特徴づけを示している。
【００２９】
本発明によると、以下の遺伝子はアップレギュレートされる、即ち、ＰＤで発現レベルの増加を示すことが見出され、以下、「アップレギュレートされる遺伝子」と呼ぶ。ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７。
【００３０】
更に、本発明によると、以下の遺伝子はダウンレギュレートされる、即ち、ＰＤで発現レベルの減少を示すことが見出され、以下、「ダウンレギュレートされる遺伝子」と呼ぶ。ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２。
【００３１】
本明細書で用いられる「分子マーカー」及び「生物学的マーカー」は交換可能に用いられて、個体から得たサンプルにおいて、ＰＤの診断のために同定し、測定することができる遺伝子産物を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる「遺伝子産物」は、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することによる、遺伝子の発現産物を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写物、即ちｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、若しくはあらゆる他のタイプのＲＮＡなどのＲＮＡ、又はｍＲＮＡの翻訳により産生されたタンパク質であることができる。
【００３３】
本明細書で用いられる「ＰＤで発現パターンの変化された遺伝子」は、例えば健常個体に比べて、ＰＤ患者でアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を意味する。本明細書で、遺伝子のアップレギュレーションの前後関係で用いる「アップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」は、例えば遺伝子により発現されるＲＮＡ又はタンパク質などの、遺伝子産物の産生の増加をもたらすあらゆるプロセスを意味する。本明細書で、遺伝子のダウンレギュレーションの前後関係で用いる「ダウンレギュレーション（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」は、例えば遺伝子により発現されるＲＮＡ又はタンパク質などの、遺伝子産物の産生の減少をもたらすあらゆるプロセスを意味する。
【００３４】
遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのレベルを含む、遺伝子発現のレベルは、以下に記載する周知の手順により測定することができる。一般的に、遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションは、遺伝子産物の産生におけるあらゆる検出可能な増加又は減少を含む。アップレギュレートされる、及び遺伝子活性化は、観察される活性がベースラインレベルに比べて、統計的に有意差がある（例えば、増加又は減少する）ことも意味することができる。観察された偶然生じた差の確率（ｐ値）が予め決定されたあるレベルより小さい場合に、差は「統計的に有意」であると通常みなされる。本明細書で用いられる「統計的に有意差がある」は、ｐ値が＜０．０５、好ましくはダウンレギュレートされる遺伝子（表３）で＜０．０２、より好ましくはアップレギュレートされる遺伝子（表４）で＜０．００５であることを意味する。本発明によると、アップレギュレートされる遺伝子における発現の増加は、少なくとも１．５倍、好ましくは１〜３倍（表４）であり、ダウンレギュレートされる遺伝子における発現の減少は少なくとも０．６６倍又はそれより少なく、好ましくは０．３〜０．６６である（表３）。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＤの生物学的マーカーは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ，ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物であり、且つ／又は、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物である。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、分子マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、且つ／又は治療の経過観察をする方法に関し、この分子マーカーは、１つ又は複数の本発明のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子である。好ましくは、分子マーカーは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物であり、且つ／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、及びそれらの遺伝子産物である。
【００３７】
本発明の方法は、試験すべき個体からサンプルを得、サンプルにおいて、本発明のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子に特異的な１つ又は複数の遺伝子産物のレベルの減少又は増加を検出することを含む。
【００３８】
試験する個体は、ＰＤを有すると疑われる個体、パーキンソン症候群様の症状を示す個体、新たなＰＤ患者、疾患の進行を経過観察するために、且つ／又は治療の有効性をモニターするために、神経保護の又は他の適切なＰＤ薬物で治療中のＰＤ患者であることができる。したがって、本発明は、初期の段階でＰＤを診察する方法、及び、家族性及び散発性両方のＰＤ患者の、ＰＤ患者の治療をモニターする方法を提供する。
【００３９】
検出には、あらゆる適切なサンプルを用いることができるが、試験する個体から得た血液、血清、又は皮膚の生検サンプルを用いることが好ましい。
【００４０】
様々な異なるアッセイを利用して遺伝子パターンの発現の変更を検出することができ、遺伝子転写物のレベル及びタンパク質をコードする遺伝子のレベルを検出する方法が含まれる。より詳しくは、本明細書に開示する診断方法及び予後診断方法には、個体からサンプルを得、サンプルにおける１つ又は複数のアップレギュレートされる遺伝子及び／又はダウンレギュレートされる遺伝子の発現レベルを決定することが含まれる。通常、この決定された値又は試験値を、対照（健常個体、非ＰＤ患者）又はベースライン値における発現レベルなどのあるタイプの参照と比較する。
【００４１】
本発明によると、ｉｎ ｖｉｖｏで分子マーカーを使用することも企図される。
【００４２】
試験する遺伝子産物がサンプルから抽出されたＲＮＡである場合、遺伝子発現のレベル、即ち遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのレベルを、核酸プローブアレイ、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ドットブロットアッセイ、及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むがそれだけには限定されない周知の手順により測定することができる。
【００４３】
好ましい一実施形態では、核酸プローブアレイを用いて遺伝子転写物を検出し定量する（以下の実施例に記載する通り）。アレイは様々なタイプであることができ、例えば、長さの短い合成プローブ（２０ｍｅｒ又は２５ｍｅｒ）、ｃＤＮＡの全長又は遺伝子のフラグメント、増幅したＤＮＡ、ＤＮＡのフラグメント（例えば制限酵素により生成されたもの）、及び逆転写されたＤＮＡなどの様々なタイプのプローブを含むことができる。アレイはカスタムアレイであることができ、遺伝子のｍＲＮＡ遺伝子配列の特定の予め選択されたサブシーケンス若しくはその増幅産生物をハイブリダイズするプローブ、又は配列に関係なくｍＲＮＡを分析するようにデザインされた一般的なアレイが含まれる。
【００４４】
プローブアレイを用いる方法では、試験サンプルから得た核酸は標識されたｃＤＮＡに通常逆転写されるが、標識したｍＲＮＡを直接使用することができる。標識した核酸を含む試験サンプルを、次いで、アレイのプローブと接触させ、サンプルに存在する試験する遺伝子に関連するあらゆる標識された核酸がプローブとハイブリダイズした後、アレイを通常１回又は複数回の高度に厳密な洗浄に曝して非結合の核酸を除去し、アレイの核酸プローブに対する非特異的結合を最小にする。標識した核酸の結合を、任意の様々な市販のスキャナー、及び付随するソフトウェアプログラムを用いて検出する。例えば、サンプル由来の核酸を蛍光標識で標識する場合、ハイブリダイゼーションの強度は、例えば共焦点スキャン顕微鏡の光子計数法により決定することができる。標識は、酵素法により増幅することができるシグナルを提供することができ、又は、例えば、放射性同位元素、発色団、磁性粒子、及び高電子密度粒子を含む他の標識を用いることができる。
【００４５】
標識した核酸にハイブリダイズされたプローブアレイ上のこれらの位置を、市販のリーダーを用いて検出する。カスタマイズされたアレイに対して、次いでハイブリダイゼーションパターンを分析して、分析しているサンプル中の周知のｍＲＮＡ種の存在、及び／又は相対量若しくは絶対量を決定することができる。
【００４６】
別の好ましい一実施形態では、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、サンプルに存在する遺伝子ｍＲＮＡの量を決定することができる（以下の実施例を参照されたい）。これらの方法は、例えば蛍光発生ヌクレアーゼアッセイにより、増幅プロセス中に形成された増幅産物の量を測定して、目的とする遺伝子の特定の転写物を検出し定量することを含む。これらのアッセイは、単にＴａｑＭａｎ（登録商標）法として文献で頻繁に言及される手法で、二重標識した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物の蓄積を連続的に測定する。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲアッセイで用いられるプローブは、通常短い（約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドであり、２種の異なる蛍光色素、即ちプローブの５’末端のレポーター色素、及び３’末端の消光色素で標識されているが、色素はプローブ上の他の位置でも結合することができる。特定の転写物を測定するために、プローブは、特定の転写物上のプローブ結合性部位と相補性に、少なくとも実質的な配列を有するようにデザインされている。特定の転写物の側面に位置する領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも、核酸を増幅するのに使用するために反応混合物に添加する。
【００４８】
プローブが完全である場合、２つの蛍光体間でエネルギーの移動が生じ、クエンチャーがレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長期の間、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂し、その結果、ポリヌクレオチド−クエンチャー複合体からレポーター色素を放出し、レポーター発光強度の増大をもたらし、それを適当な検出システムにより測定することができる。蛍光発生アッセイの間に作り出される蛍光発光を、増幅過程にわたりレポーター及びクエンチャーの蛍光強度を記録することのできるコンピュータソフトウェアを含む市販の検出器により測定する。次いで、これらの記録値を用いて、連続的に、標準化されたレポーターの発光強度の増大を計算し、最終的に増幅されているｍＲＮＡの量を定量することができる。
【００４９】
ドットブロット及びｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに基づくアッセイでは、ＰＤの検査を行う個体からのサンプルを、フィルターなどの支持体上にスポットし、次いで、本発明の１つ又は複数のアップレギュレートされる遺伝子又はダウンレギュレートされる遺伝子由来の核酸で特異的にハイブリダイズした標識した核酸プローブでプローブする。フィルター上に固定化した核酸でプローブをハイブリダイゼーションした後、非結合の核酸を洗い流し、ハイブリダイゼーション複合物の存在を、フィルターに結合した標識したプローブの量に基づき検出し定量した。
【００５０】
したがって、本発明により、生物学的材料、好ましくは血液又は皮膚の生検サンプルからＲＮＡを抽出することにより、遺伝子の発現パターンが決定される。このＲＮＡを、市販のキットにより迅速に分離する。次いで、ＲＮＡを、選択された遺伝子及び標準化のために働く適切なハウスキーピング遺伝子を含むカスタマイズされたＧｅｎｅＣｈｉｐアレイにハイブリダイゼーションすることにより、又は選択された各遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲにより試験する。遺伝子の発現パターンを、陽性コントロール及び陰性コントロールのＲＮＡ（それぞれ、新しいＰＤ及び健常対象）の発現と比べることにより決定する。対象をＰＤ患者と規定するためには、この技術の１つにより得られた遺伝子発現のパターンは、表３又は４に記載したパターンと同様でなければならない。
【００５１】
別の一実施形態では、アップレギュレートされる遺伝子又はダウンレギュレートされる遺伝子の発現により得られる遺伝子産物はタンパク質であり、そのタンパク質に結合することのできる抗体又はそのフラグメントにより検出することができる。抗体、又はフラグメント誘導体は、あらゆる適当なマーカー、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光標識、常磁性標識、又はフリーラジカルで検出可能に標識することができる。
【００５２】
好ましい一実施形態では、本発明は、パーキンソン症候群様の症状を表す個体におけるパーキンソン病の発生を診断する方法に関し、前記個体から得られたサンプルにおける１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子の、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＡＬＤＨＩＡ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４の発現のレベルの減少、並びに／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子の、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫＩ、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１の発現レベルの増加を検出することを含む。１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子の発現が少なくとも約１．５倍の増加であり、且つ／又は１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子の発現が約０．６６倍又はそれより少ない減少であれば、個体がＰＤに罹患していることを示す。
【００５３】
ＰＤの診断に用いられる現在の方法に比べると、この方法は珍しい遺伝的な変異又は疾患の家族歴を用いないが、散発性のＰＤにも生じる一般的な遺伝子発現の変化を用いるという利点がある。これらの遺伝子発現の変更は、特定の遺伝的背景の結果として引き起こされることがあるだけではなく、環境的背景の結果としても引き起こされることがある。したがって、この方法は、遺伝子変異を有するＰＤ患者も、散発性のＰＤ患者も、広範な細胞死及び非可逆性のニューロンの実質的な損傷が起こる前の、疾患の発生における大変早期に検出する。
【００５４】
ＰＤは、非治療の場合、全ての脳機能の全般的な悪化をしばしば伴う全身の無能力に進行し、早期の死亡をもたらすことがある。治療を行っても、この障害は依然として様々な方法で人を損なう。殆どの者は、薬物にある程度反応する。症状の軽減する程度、及びこの症状のコントロールがどのくらい続くかは、非常に変動する。
【００５５】
したがって、別の一実施形態では、本発明は、ＰＤ患者の治療を予知し、又はモニターする方法を提供し、前記患者から得たサンプルにおける、１つ又は複数の本発明のダウンレギュレートされる遺伝子又はアップレギュレートされる遺伝子の発現のレベルを検出することを含み、この場合、１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４の発現レベルの増加、並びに／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、より好ましくは１つ若しくは複数の遺伝子ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１の発現レベルの減少が治療の有効性を示す。
【００５６】
以下の実施例に示すように、本発明者らは、世界的に主流の、ＰＤで最も冒された脳の領域である黒質緻密部において差次的に発現された遺伝子を同定した（表３及び４を参照されたい）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高密度ＤＮＡマイクロアレイを用いて、年齢をマッチさせた対照と比べて差次的に発現された遺伝子を同定した。ＰＤの小脳は、冒されていない脳の領域であり、組織特異性に対する対照となった。遺伝子発現の確認は、定量的リアルタイムＰＣＲで分析することにより実現した。
【００５７】
ダウンレギュレートされる遺伝子は、シグナル伝達、タンパク質分解（例えば、ユビキチン−プロテアソームサブユニット）、ドーパミン作動性の伝達／代謝、イオン輸送、タンパク質の修飾／リン酸化、及びエネルギー経路／解糖の機能上のクラスに属することが見出された。アップレギュレートされる遺伝子は、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、細胞周期、タンパク質の修飾／リン酸化、タンパク質代謝、転写、及び炎症／ストレス（例えば、鉄及び酸素の主要なセンサーであるＥＧＬＮ１）を含む生物学的プロセスに主に集中した。
【００５８】
１つの主要な発見は、散発性のパーキンソン症候群患者の黒質（ＳＮ）で、特にＳＣＦ（Ｅ３）リガーゼ複合体のメンバーであるＳＫＰ１Ａの発現が特別に減少したことであった。ＳＫＰ１Ａの減少には、エネルギー経路及びシグナル伝達において、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、及び炎症／ストレスに関連する機能上の活性が数々の遺伝子で顕著に増加するのと並行して、２６Ｓプロテアソームの様々なサブユニットの発現の低下が伴った。
【００５９】
ＳＫＰ１は、モジュラー多タンパク質であるＳｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ、及び基質認識性Ｆ−ｂｏｘタンパク質（ＳＣＦ）の中で機能しているＲＩＮＧタンパク質のＲｂｘファミリーの一部である（Ｋａｍｕｒａら、１９９９年）。このユニットは、多数のＥ３複合体の形成を可能にし、これは、次には、広範囲の様々なタンパク質の基質を認識することができる。
【００６０】
ＳＣＦ複合体はモジュラーであり、ＳＫＰ１はいくつかのＦ−ｂｏｘタンパク質と相互作用をすることができ、Ｆ−ｂｏｘタンパク質は特異的な標的の認識を担い、その結果機能上の多様性をもたらし、この複合体が処理するレパートリーのタンパク質を増加させる。ヒトは、機能上のＳＫＰ１アイソフォームを１つだけ発現する（Ｓｅｍｐｌｅ、２００３年）。したがって、観察されるその発現の減少は律速因子を構成することができ、ＰＤ患者の脳における、チロシン水酸化酵素、シンフィリン−１、α−シヌクレイン、リン酸化タウなど、広範囲のユビキチン結合したタンパク質凝集物の蓄積を説明することができる（Ｌｉａｎｉら、２００４年；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、２００４年；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、２００４年）。
【００６１】
定量リアルタイムＰＣＲ分析では、健常の対象でもＰＤの対象でも、ＳＮは特に低レベルのＳＫＰ１ＡのｍＲＮＡを発現していることが示された。例えば、対照サンプルは、大変低い発現値（０．０１３±０．０１１）を示し、Ｒａｂ３Ｂ（１．８０±０．７０）から２オーダーを超える差があるが、この発現はＰＤのＳＮｐｃでは影響を受けなかった。ＰＤのＳＮｐｃでは、ＳＫＰＡ１Ａの発現が減少する明らかな傾向が観察された。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＳＮｒで、又はＰＤの小脳で影響を受けなかった。
【００６２】
ＳＫＰ１Ａにおけるこの選択的減少の他に、ＰＤの脳のＳＮにおいて、２０Ｓプロテアソームサブユニットであるα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）のｍＲＮＡ、並びに２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニットである、非−ＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）及びＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）の相伴う減少が観察され、更に、ＰＤにおけるドーパミン作動性ニューロンの損傷の一因となる可能性がある。
【００６３】
これらの発見は、神経変性のシナリオで新規の役割を演じるものがあることを明らかにし、新規の薬物成分を開発するための潜在的な目標を提供するものである。
【００６４】
したがって、本発明は、パーキンソン病を治療するのに有用な物質をスクリーニングする方法を更に提供し、１つ若しくは複数のダウンレギュレートされる遺伝子、好ましくはダウンレギュレートされる遺伝子ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、の発現をアップレギュレートし、且つ／又は１つ若しくは複数のアップレギュレートされる遺伝子、好ましくはＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１の発現レベルをダウンレギュレートする物質を同定することを含む。
【００６５】
当技術分野で周知のハイスループットスクリーニング方法を用いて、ＰＤの治療に有用である化合物を同定することができる。
【００６６】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００６７】
材料と方法
（ｉ）ヒト脳組織
ドイツ国立脳ネットセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｒｍａｎ Ｂｒａｉｎ−Ｎｅｔ Ｃｅｎｔｅｒ）（プロジェクト番号ＧＡ１０）、及びオランダ脳バンク（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ−Ｂａｎｋ）（プロジェクト番号３５０）より、死後のヒト脳を得た。ＰＤの組織は、確立されたガイドラインによりＨｏｅｈｎ＆Ｙａｈｒの診断基準に基づいて中程度から重症のパーキンソン症候群の個体から得た（Ｈｏｅｈｎ ａｎｄ Ｙａｈｒ、１９６７年）。対象は全て、Ｂｒａａｋ＆ＢｒａａｋによるＡＤ病理に陰性だった（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ、１９９７年）（詳細は表１を参照されたい）。ＰＤ及び対照の平均年齢は、それぞれ７６．６歳及び７７．８歳であった。ＰＤ及び対照の平均死後遅延（ＰＭＤ、死から−８０℃で脳を凍結するまでの時間間隔）は、それぞれ２６．２時間と１９．８時間であった。生検では、脳を切開し、一方の半分を薄片として液体窒素中瞬間凍結し、他方の半分を組織病理学検査用に中性の緩衝ホルマリン中に貯蔵した。これらの研究に用いるヒト脳組織の症例の選択には、厳重な診断基準を用いた。ヒトＳＮ及び小脳領域は、対照及びＰＤの提供者から得た。手順は全て、ドイツ及びオランダ脳バンクシステム（Ｇｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ−Ｂａｎｋ ｓｙｓｔｅｍｓ）により確立された一致基準に従い、実験室のヒト組織の注意及び使用のためのＮＩＨガイド（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ）に従い、ヴュルツブルグ大学倫理委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｒｚｂｕｒｇ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ドイツ、Ｗｕｒｚｂｕｒｇ）により承認された。
【００６８】
（ｉｉ）全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡを、フェノール−グアニジンイソチオシアネート試薬（ｐｅｑＧＯＬＤ ＴｒｉＦａｓｔ；ドイツ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ＰｅＱＬａｂＧｍｂＨ）で調製した（Ｌｕｋｉｗ ａｎｄ Ｂａｚａｎ、１９９７年）。ＲＮＡ分離試薬を、０．２μＭのろ過したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−処理水（米国メリーランド州Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）で調製し、分離手順を通して使用した。全ＲＮＡサンプルを、分光光度計で２２０から３２０ｎｍでスキャンし、全ＲＮＡのＡ２６０／Ａ２８０は典型的に＞１．９であった。更に、全ＲＮＡの品質管理に、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を行った。抽出した全ＲＮＡの全てで、２８Ｓ／１８Ｓ比は＞１．５であった。重要なこととして、ＰＤと対照の間で、スペクトルの純度、分解速度、分子サイズ、又はＳＮ及び小脳の全ＲＮＡの収量に有意差はみとめられなかった。全ＲＮＡをＤＮａｓｅ−Ｉ消化を受けさせてゲノムのＤＮＡ残渣を除き、引き続き、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）により清浄にした。
【００６９】
（ｉｉｉ）アレイ処理
実験は全て、／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｄａｔａｓｈｅｅｔｓ／ｈｕｍａｎ＿ｄａｔａｓｈｅｅｔ．ｐｄｆ．に記載されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−ＦＯＣＵＳオリゴヌクレオチドアレイを用いて行った。各サンプルからの全ＲＮＡを用いてビオチン化した標的ＲＮＡを調製し、製造元の勧めから若干の修飾を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｍａｎｕａｌ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｍａｎｕａｌ．ａｆｆｘ）。手短に述べると、１０μｇのｍＲＮＡを用いて、Ｔ７−結合したオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いることにより、第１の鎖のｃＤＮＡを生成した。第２の鎖を合成した後、ビオチン化したＵＴＰ及びＣＴＰ（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でｉｎ ｖｉｔｒｏの転写を行い、ＲＮＡの約１００倍の増幅をもたらした。手順を完全に記載したものは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｐｉｃｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｍｂｃｆ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＧｅｎｅＣｈｉｐ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｐｒｅｐ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ＣＲ＿ＵＫ＿ｖ＿２．ｐｄｆで入手できる。各サンプルから生成された標的ｃＤＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｍａｎｕａｌ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｍａｎｕａｌ．ａｆｆｘ）を用いて製造元の勧めにより処理した。手短に述べると、スパイクの対照をフラグメントにしたｃＤＮＡ１５μｇに加えてから、一晩ハイブリダイゼーションした。次いで、アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー上でスキャンした。これらの手順を完全に記載したものは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｐｉｃｒ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｍｂｃｆ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＧｅｎｅＣｈｉｐ＿Ｈｙｂ＿Ｗａｓｈ＿Ｓｃａｎ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ｖ＿２＿ｗｅｂ．ｐｄｆで入手できる。更に、開始のＲＮＡの品質及び量を、アガロースゲルを用いて確認した。スキャン後、アレイ画像を肉眼で評価して、スキャナー配列及びチップ表面に顕著な泡又はキズの存在しないことを確認した。ＢｉｏＢスパイク対照は、全てのアレイ上に存在することが見出され、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ、及びＣｒｅＸも強度が増加して存在した。全部で１７個の遺伝子チップを使用した（ＳＮｐｃに１２個、ＰＤ患者及び年齢をマッチさせた対照の小脳に５個）。
【００７０】
（ｉｖ）統計学的分析
Ｍａｓ ５アルゴリズムの結果を用いて、遺伝子をフィルターにかけた。死後のサンプルで作業をする際に予想される困難の１つに、ＲＮＡ調製の際の様々な程度の分解がある。したがって、これらのサンプルを起源とするｃＲＮＡは、５’末端よりも３’末端を多く含む。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイプローブセットは、可能なときはいつでも３’末端が選択されるようにデザインされているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／ｈｇｕｌ３３＿ｄｅｓｉｇｎ＿ｔｅｃｈｎｏｔｅ．ｐｄｆ）、比較的３’含量が高いサンプルの分析が可能になっている。ＭＡＳ ５により存在する（Ｐ）として検出されるプローブセットのシグナルのｐ値は、（プローブセットに含まれるプローブから決定して）０．０４より小さい。これにより、本発明者らは存在の信号を、確信を持って使用できるようになった。
【００７１】
部分的に分解されたサンプルは、プローブセットのプローブの部分とハイブリダイズし、高いｐ値をもたらす（且つ、非存在として検出される）ことがある。６サンプルのうち少なくとも４サンプルでプローブセットが存在するとして検出され、信号が全て２０を超える場合は、このプローブセットが存在すると本発明者らは決定した。シグナルが２０を超え対照サンプル全てで存在（Ｐ）として検出される遺伝子、又はＰＤサンプル全てでシグナルが２０を超え６サンプル中４サンプルで存在として検出される遺伝子を表す３５１７プローブセットのリストを、アレイ上に含まれる８７６３プローブセットから作成した（補足ｈｔｔｐ：／／ｅｎｇ．ｓｈｅｂａ．ｃｏ．ｉｌ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。
【００７２】
Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定で決定すると、患者と対照のサンプル間で、２６２のプローブセットで差が認められた（ｐ値＜０．０５）（補足ｈｔｔｐ：／／ｅｎｇ．ｓｈｅｂａ．ｃｏ．ｉｌ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。プローブセットを更にフィルターにかけ、ＰＤサンプルの平均（幾何平均）シグナルと対照サンプルの平均シグナルとの比が１．５を超え、又は０．６６より小さいものを選択した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの相関は、有効なヒットの殆どが失われる結果になるので適用しなかった。しかしながら、統計学的検定とともに前述したカットオフを用いると、高度に厳重な分析がもたらされ、通常の生物学的プロセスに関わる、規定されたサブセットの遺伝子に注目する可能性が与えられる。６９個のプローブセットがアップレギュレートされ、６８個のプローブセットがダウンレギュレートされた。
【００７３】
（ｖ）結果のリアルタイム定量ＰＣＲ確認
マイクロアレイの結果を確認するために、本発明者らは、ＰＤ及び対照からの、ＳＮｐｃ、網様部（ＳＮｒ）、及び小脳におけるｍＲＮＡサンプルに定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。各サンプルからの全ＲＮＡ（１〜０．４ｍｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１７０〜８８９０）を用いて、ランダム６量体、及びｏｌｉｇｏｄＴプライマーで逆転写した。遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子、即ち、βアクチン（ＡＣＴＢ）、リボソームのタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、アミノレブリネートδ合成酵素１（ＡＬＡＳ１）、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に標準化し（クアンチテクト(ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ)（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｓ ＡＣＴＢ Ａｓｓａｙ ２５１０１３及びＨｓＧＡＰＤ Ａｓｓａｙ ２４１０１１）、ｇｅＮｏｒｍプログラムによる分析の後に選択した（ｖｓ．３．３；ダウンロードはｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ３１．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｊｖｄｅｓｏｍｐ／ｇｅｎｏｒｍ／から）（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、２００２年；Ｓｃｈｕｌｚら、２００４年）。ｇｅＮｏｒｍプログラムは、所与のｃＤＮＡサンプルパネルにおける１セットの試験する遺伝子から最も安定なハウスキーピング遺伝子を決定し、使用者が規定した数のハウスキーピング遺伝子の幾何平均をもとに各組織サンプルに対する遺伝子発現の標準化ファクターを計算する。最初は、本発明者らは、リボソームの１８Ｓ及びシクロフィリンＡを含む、全部で６個のハウスキーピング遺伝子を試験したが、最後の２者は適切でないことが見出された。
【００７４】
これらのハウスキーピング遺伝子の安定性を試験し、標準化に対し最も正確であることが見出された。ハウスキーピング遺伝子のリボソームの１８Ｓを増幅することにより、ＤＮＡ汚染がないことが確認され、反応溶液をアガロースゲルに流して産物が非存在であることを確認した。ＲＴがないサンプルを、ＦＡＭを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲにより実験のサンプルと同時に試験すると、上記のプロトコールを用いて、３５サイクルより少ない場合には一貫して増幅を生じなかった。前述したように、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱシステム（米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＢｉｏＲａｄ社）でリアルタイムＰＣＲを行った（Ｓｖａｒｅｎら、２０００年；Ｕｇｏｚｚｏｌｉら、２００２年）。手短に述べると、ｃＤＮＡ３０〜１００ｎｇ、及び遺伝子に特異的なプライマー、及びクアンチテクト（登録商標）カスタムアッセイ（Ｃｕｓｔｏｍｅ Ａｓｓａｙ）（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）により製造されたプローブ（表２）をクアンチテクト Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社、２０４３４３）に加えた。リアルタイムＰＣＲを、ＰＣＲ増幅にかけた（９５℃１５分間で１サイクル、９４℃１５秒間で３０〜４５サイクル、５６℃３０秒間アニーリング及びＦＡＭで検出、及び７６℃で３０秒間伸長）。ＰＣＲ反応は全て、２回ずつ行った。増幅した転写物は比較ＣＴ法を用いて定量し、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱシステムプログラムで分析した。各増幅産物の検量線は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてアガロースゲルから分離したｃＤＮＡ単位複製配列をプールしたものの１０倍希釈物から作成して、プライマーの効率及び量子化を決定した。データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０００で分析して、生の発現値を作成した。様々な脳の領域における遺伝子発現の差を、ＰＣコンピュータ上の、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアプログラム（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ ５．０ソフトウェア、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）を用いて比較した。
【００７５】
（ｖｉ）免疫組織化学的分析
パーキンソン症候群患者及び年齢をマッチさせた対照からのパラフィン包埋した黒質を、ミクロトームにより冠状連続切片（厚さ６マイクロメートル）にかけた。脱パラフィンした切片を、デジタルデクローキングチャンバー（ｄｅｃｌｏａｃｋｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ）（米国カリフォルニア州Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ、Ｂｉｏｃｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中で、クエン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いてアンマスキングし、１０％正常ヤギ血清で２時間ＲＴでブロックし、抗ＳＫＰ１と４℃で一夜インキュベートした。ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ結合体及び基質としてＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）と、適切なビオチン化した第２抗体によりＨｉｓｔｏｓｔａｉｎ−Ｐｌｕｓキット（米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｚｙｍｅｄ）を用いて、製造元の指示に従いヘマトキシリンで対比染色を行って、検出を得た。
【００７６】
（実施例１）ＰＤ患者で差次的に発現された遺伝子の機能上の分類
パーキンソン症候群患者６名及び年齢をマッチさせた対照６名からの死後ＳＮｐｃに対し、ＤＮＡマイクロアレイ分析を行って、疾患と関連のある遺伝子転写における変更を同定した。
【００７７】
本発明者らは、本発明者らの分析を、差次的な発現が少なくとも１．５倍で有意水準がｐ＜０．０５である遺伝子に限定した。分析した全３５１７個の有効なプローブセットのうち（材料と方法を参照されたい）、１３７個が診断基準を満たした。ＰＤ及び対照サンプルにおけるこれら１３７個の遺伝子の相対発現レベルを表す、ヒートマップを実施し（図１）、そのうち６８個が転写上、ダウンレギュレートされ（表３）、６９個がアップレギュレートされた（表４）。
【００７８】
１２個にわたるサンプルで、遺伝子は、それらの相対発現レベルにより集中した。陰性対照に対し、非関連の脳の領域、ＰＤ（２サンプル）及び対照（３サンプル）の両者の小脳で５つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを行い、遺伝子の変化の組織特異性を評価した。階層的クラスタリングにより、ＰＤの小脳でも正常の小脳でも発現の完全に異なる発現パターンを表すことが示された（データは示さず）。
【００７９】
その後、遺伝子はＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ注釈ツールにしたがって機能上のグループに分類した（Ｄｅｎｎｉｓら、２００３年）（ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓｌ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄａｖｉｄ／ｕｐｌｏａｄ．ａｓｐ）。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより規定されるように、このプログラムにより、生物学的プロセス、分子機能、又は細胞成分にしたがって系統立てられたグループの遺伝子において制御の傾向を見出すことが可能になっている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）。
【００８０】
所与の遺伝子は、１つを超える機能、又は生物学的経路に割り当てられることがあることが理解される。これにより、各機能上のグループの真のサイズの過剰見積りをもたらすことがある。本発明者らは、各遺伝子を単一の機能上のクラスに割り当てることによって、これを克服した。図２Ａに示すように、ＰＤにおけるシグナル伝達、タンパク質分解、ドーパミン作動性の伝達及び代謝、イオン輸送、タンパク質の修飾／リン酸化、並びにエネルギー経路／解糖の機能上のクラスで、主要な遺伝子のダウンレギュレーションが観察された。
【００８１】
ＰＤにおいて差次的にアップレギュレートされる遺伝子に関しては、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、細胞周期、タンパク質の修飾／リン酸化、タンパク質代謝、転写、及び炎症／ストレスを含む生物学的プロセスに主に集中した（図２Ｂ）。
【００８２】
最も過剰発現され又は濃縮した遺伝子を同定するために、ＥＡＳＡプログラムで遺伝子カテゴリーの統計学的分析を行った（Ｈｏｓａｃｋら、２００３年）。機能上のグループ内で変化する遺伝子の割合がチップ全体におけるそのような遺伝子の分画より有意に大きい場合、このような分類は結果における信頼性を上昇させる。
【００８３】
０．０５未満の「イージースコア（Ｅａｓｙ ｓｃｏｒｅ）」の機能上の分類が、過剰発現と記録された。この分析では、差次的にダウンレギュレートされる遺伝子における最も顕著な変化は、タンパク質分解及びペプチド分解（１０％）の生物学的プロセスでｐ＜０．０２のＥＡＳＥスコアで起こり（表３、星印でしるした）、並びにイオン輸送体及び加水分解酵素活性に関する分子の機能で（ｐ＜０．０５、データは示さず）起こったことが明らかになった。このタンパク質分解性のグループの中では、２０Ｓプロテアソームサブユニットα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）、２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニット、非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）、並びにＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）などのＵＰＳの触媒サブユニット及び調節サブユニットの両者の発現が減少することを、本発明者らは観察した。ＰＳＭＤ８は、有意水準の上限をわずかに超えていたが、６名の患者では減少の明らかな傾向が見られた（患者のうち３名＞対照の１．５倍）。ＰＳＭＤ８は、他のＵＰＳ成分とともに集合するので、本発明者らはこれがＰＤで機能的に影響を受けていると考えた。
【００８４】
一方、生物学的プロセス及び分子機能において、ＰＤで遺伝子発現が増加する統計学的に有意な傾向が、細胞接着／細胞マトリックス（約１５％）に対してｐ＜０．００５のＥＡＳＥスコアで（表４、星印でしるした）、構造分子及びタンパク質キナーゼ活性に対して（ｐ＜０．０５、データは示さず）見出された。
【００８５】
並行して、６名のパーキンソン症候群のうち少なくとも５名のＳＮにおいて１．５倍の差次的な発現を表す遺伝子を選択する、例外的に厳格な分析を行った。各患者のサンプルのシグナルを、対照サンプルのシグナルの平均（幾何平均）と比較した。この評価により、年齢、死因、性別、死後間隔、疾患の重症度などの要因の組み合わせに由来することがある各死後組織サンプル内の遺伝子発現における変動を同定できるので、大変重要である。
【００８６】
この取組みは、ＰＤの症例で差次的に発現された全遺伝子を２０個のみに制限し、そのうち、それぞれ対象グループに比べて８個が減少し、１２個が増加した（図３）。
【００８７】
重要なこととして、８個のダウンレギュレートされる遺伝子のうち、３個（３７．５％）がＤＡの神経伝達及び代謝に属する（図３Ａ）。これには、サイクリックＡＭＰ制御リン酸化タンパク質（ＡＲＰＰ−２１）、溶質担体ファミリー（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ）１８（小胞モノアミンメンバー２、ＶＭＡＴ２）、及びアルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）が含まれる。更に２個の遺伝子が、タンパク質のハンドリング及び分解に関連する（Ｓ期キナーゼ会合タンパク質１Ａ（ｐ１９Ａ）、ＳＫＰ１Ａ、及びシャペロン熱ショック７０ｋＤａタンパク質８、ＨＳＰＡ８）。最後の３個の遺伝子は、リン酸化及びタンパク質修飾プロセスにあずかるＳＦＲＳタンパク質キナーゼ２（ＳＲＰＫ２）、三分裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）３連モチーフ含有３６（ＴＲＩＭ３６）、並びに、両者とも機能が知られていないＥＧＦ様及び２個のフォリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通型のタンパク質（ＴＭＥＦＦ１）である。
【００８８】
１２個のアップレギュレートされる遺伝子（図３Ｂ）には、細胞接着の機能上のグループに属するパルビン（ｐａｒｖｉｎ）α（ＰＡＲＶＡ）、レクチン、ガラクトシド結合性、可溶性、９（ガレクチン９）（ＬＧＡＬＳ９）、及びセレクチンＰリガンド（ＳＥＬＰＬＧ）、細胞シグナリングのクラスに関与するプロエンケファリン（ＰＥＮＫ）及び低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（６ＬＲＰ６）、タンパク質及び脂質の代謝、並びにリン酸化のカテゴリー由来のｅｇｌナイン同族体１（線虫）（ＥＧＬＮ１）、真核細胞の翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質２（ＥＩＦ４ＢＰ２）、マンノシダーゼ、α、クラス２Ｂ、メンバー１（ＭＡＮ２Ｂ１）、及びスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）、細胞の成長に関与するセマフォリンｓｅｍ２（ＬＯＣ５６９２０）、推定上の分泌タンパク質ＺＳＩＧ１１（ＺＳＩＧ１１）、及び両者とも機能が知られていないセリン／アルギニン反復マトリックス２（ＳＲＲＭ２）が含まれる。
【００８９】
（実施例２）定量リアルタイムＰＣＲ
ＵＰＳで重要な役割を果たす、主要な遺伝子の１つであるＳＫＰ１Ａの発現が減少するという本発明者らの発見を確認するために、本発明者らはＳＫＰ１Ａ、並びに２つの更なる遺伝子であるＨＳＣ７０及びＶＭＡＴ２に対してリアルタイム定量ＰＣＲを行ったが、これら遺伝子は全て、＜０．６７のファクターでパーキンソン症候群患者６名中少なくとも５名に影響を及ぼした。
【００９０】
アレイハイブリダイゼーションに用いるＲＮＡがＰＣＲに十分でない場合は、本発明者らは、２つの更なるサンプルを実験グループに加えた（対照７及び患者７）。本発明者らは、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別々の領域を分析した。小脳は、遺伝子変化の特異性を評価するための、ＰＤに関連しない領域として選ばれた。
【００９１】
リアルタイムＰＣＲ分析により、正常の対象でもＰＤの対象でも、ＳＮは特に低いｍＲＮＡレベルのＳＫＰ１Ａを発現することが明らかになった（図４）。統計学的に有意ではなかったが、ＰＤのＳＮｐｃで発現が減少する明らかな傾向が観察された（図４Ａ）。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＰＤのＳＮｒ又は小脳では影響を及ぼさなかった（図４Ｂ、Ｃ）。
【００９２】
本発明者らは、パーキンソン症候群患者のＳＮｐｃ及びＳＮｒの両者でＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４をコードするＨＳＰ８の遺伝子発現が有意に減少することを確認したが（図４Ｄ、Ｅ）、ＰＤ及び対照からの小脳に有意な変更は観察されなかった（図４Ｆ）。ＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４は、２つのアイソフォームで存在し、短小化したものはタンパク質結合性で可変のドメインにおける１５３個のアミノ酸残基を欠く（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘチップのプローブセットはこれらの間を区別することができず、その結果、アレイハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析の両者から得られた結果は両タイプの結合したレベルを表さなければならない。
【００９３】
これらの新規の発見に加えて、本発明者らのアレイ分析は、小胞のＤＡ輸送体（ＶＭＡＴ２）の発現が減少する証拠も確認した。リアルタイムＰＣＲによりＳＮｐｃにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡの特異的な減少が明らかになったが、ＳＮｒの変化は極めてはっきりしなかった（図４Ｇ、Ｈ）。ＰＤと対照の小脳におけるサンプル間で有意な差が見られなかったので、これらの変更はＳＮに特異的であった。
【００９４】
アレイ及びリアルタイムＰＣＲ分析の両者で見出された発現の減少は、ＰＤのＳＮにおけるｍＲＮＡレベルの一般的な減少の結果にすぎないのか、或いはシナプスの損失であるのかを決定するために、本発明者らは３つの遺伝子の発現を調査した。３つの遺伝子は、Ｒａｂ３ｂ ＧＴＰａｓｅ（図４Ｊ、Ｋ、Ｌ）、シンタキシン６、及びコートマー（ｃｏａｔｏｍｅｒ）タンパク質複合体サブユニットζ２（ＣＯＰζ２）（データは示さず）であり、これらは、小胞体からゴルジへの小胞の輸送、小胞体膜ドッキング、並びにホルモン及び神経伝達物質のニューロン開口放出（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）の制御因子である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ、１９９９年；Ｆｕｔａｔｓｕｍｏｒｉら、２０００年；Ｗｅｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ、２００１年）。これらの発現は、様々な脳の領域におけるＰＤ及び対照サンプル間で違いがなかった。
【００９５】
上記の実験において、ＰＤで選択された生物学的に意義のある経路、及び、文献に報告され、リアルタイムＰＣＲ分析により確認された遺伝子変化の実質的な一致に焦点を当てた厳格な分析を行った。
【００９６】
（実施例３）パーキンソン症候群及び健常対照者の脳からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンにおけるＳＫＰ１タンパク質の検出
パーキンソン症候群の脳及び健常対照者からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンのサンプルで、ＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学的分析を行った（材料と方法に記載した通り）。図５に要約した結果は、ＳＫＰ１タンパク質は正常サンプルに存在するが、ＰＤサンプルには殆ど非存在であることを示している。したがって、ｍＲＮＡのＳＫＰ１発現について上記の実施例１及び２で得られた結果は、ＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学的分析によるタンパク質レベルで確認された。
【００９７】
結果の要約
本発明の結果は、初めて、パーキンソン症候群の死後の脳のＳＮｐｃにおける全体的な遺伝子発現の変化を、年齢をマッチさせた対照に比べて示すものである。１つの主要な新規の発見は、タンパク質の異化作用の不可欠な成分であるＳＫＰ１Ａ遺伝子の負の調節である。この遺伝子の減少には、細胞接着／細胞骨格、細胞外マトリックス成分、及び炎症／ストレスに関する機能上の活性を有する遺伝子の数の顕著な増加と並行して、エネルギー経路及びシグナル伝達における２６Ｓプロテアソームの様々なサブユニットの発現の減少が伴う。
【００９８】
パーキンソン症候群のＳＮｐｃにおける、ＳＣＦユビキチンリガーゼ多タンパク質複合体の成分であるＳＫＰ１Ａの減少
ＳＫＰ１は、モジュラー多タンパク質のＳｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ、及び基質認識性Ｆ−ｂｏｘタンパク質（ＳＣＦ）内で機能する、ＲＩＮＧタンパク質のＲｂｘファミリーの部分である（Ｋａｍｕｒａら、１９９９年）。このユニットにより多数のＥ３複合体の形成が可能になり、次に、Ｅ３複合体は広範囲の様々なタンパク質の基質を認識できる。ＳＣＦ複合体はモジュラーであり、ＳＫＰ１は、特異的な標的の認識を担ういくつかのＦ−ｂｏｘタンパク質と相互作用をすることができ、それにより機能上の多様性をもたらし、この複合体により処理されるタンパク質のレパートリーを増やす。ヒトは、機能上のＳＫＰ１アイソフォームを１つだけ発現する（Ｓｅｍｐｌｅ、２００３年）。したがって、本明細書で観察されるその発現の減少は、律速因子を構成することができ、ＰＤ患者の脳における広範囲のユビキチン結合したタンパク質（例えば、チロシン水酸化酵素、シンフィリン−１、α−シヌクレイン、リン酸化タウ）の凝集体を説明することができる（Ｌｉａｎｉら、２００４年；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、２００４年；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、２００４年）。
【００９９】
定量リアルタイムＰＣＲ分析により、ＳＮは正常対象でもＰＤ対象でも特に低いｍＲＮＡレベルのＳＫＰ１Ａを発現することが明らかになった。例えば、対照サンプルは、その発現がＰＤのＳＮｐｃで影響を受けないＲａｂ３Ｂ（１．８０±０．７０）より、２ケタを超えて異なる大変低い発現値を示す（０．０１３±０．０１１）。ＳＫＰ１ＡのｍＲＮＡは特に不安定であり、死後組織で即座に分解することもあり得る。これは、サンプルの発現レベルにおける大きな変動を説明することができるが、ＰＤのＳＮｐｃにおける発現が減少する明らかな傾向が観察された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのデザインは特別であるので、死後のサンプルなど部分的に分解されているサンプルでさえプローブセットのプローブに部分的にハイブリダイズすることがあり、高いｐ値をもたらし、存在するとみなされる。したがって、厳格な分析（ｐ＜０．０５、少なくとも１．５のファクターで５名の患者で減少）とともにチップの方策をとれば、この結果が確信的になる。ＳＫＰ１Ａ発現レベルが低いということは、少なくとも部分的に、例えば、鉄濃度、酵素的（モノアミンオキシダーゼ）及び非酵素的（自己酸化）ＤＡ代謝、異常タンパク質の蓄積、プロテアソームの阻害、及び神経毒性が誘導するＯＳの増加など、様々なタイプのストレスに対してＳＮｐｃが特に感受性であることを説明することができる。この前後関係では、ＰＡ２８マルチサブユニットプロテアソームアクチベーター（ｍｕｌｔｉｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（２６Ｓプロテアソームの構成要素）タンパク質のレベルは、正常及び特発性両方のＰＤ対象のＳＮｐｃで他の脳の領域に比べて大変低いことが示され（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）、おそらくは、様々なストレス傷害に対し既に損なわれた、障害がおきたＤＡ含有ニューロンを悪化させている。ＳＫＰ１Ａの発現は、ＰＤのＳＮｒ又は小脳では影響を受けなかった。
【０１００】
最近の研究は、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）も新規のＳＣＦ様複合体内で、基質の認識を担うＦ−ｂｏｘ／ＷＤ反復タンパク質ｈＳｅｌ−１０、及びＳＫＰ１を含まないＣｕｌｌｉｎ１とともに機能することができることを実証している（Ｓｔａｒｏｐｏｌｉら、２００３年）。この発見によると、パーキンは、ｈＳｅｌ−１０以外のアダプタータンパク質と関連する可能性がある。このような複合体は多様な基質特異性を表す可能性があり、パーキンについて報告されていたいくつかの標的を説明することができる（Ｄｅｖら、２００３年）。
【０１０１】
プロテアソームサブユニットにおける機能障害
ＳＫＰ１Ａにおけるこの選択的減少の他に、ＰＤの脳のＳＮで、２０Ｓプロテアソームサブユニットであるα−５（ＰＳＭＡ５）、α−３（ＰＳＭＡ３）、及びα−２（ＰＳＭＡ２）ｍＲＮＡ、並びに２６Ｓプロテアソームの１９Ｓ調節複合体の２つのサブユニットである、非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット８（ＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２）及びＡＴＰ分解酵素サブユニット４（ＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７／Ｒｐｔ３）に相伴った減少が観察され、これらは更にＰＤのドーパミン作動性ニューロンの損傷の一因となる可能性がある。１９Ｓ複合体は、プロテアソームの２０Ｓタンパク質分解性のコアの一端又は両端に位置し（Ｃｏｕｘら、１９９６年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年）、少なくとも１８のサブユニットを含む（Ｇｌｉｃｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、２００２年）。これは、「基底部」と「蓋部」の２つのサブ複合体に細分され、これらはそれぞれ、２０Ｓタンパク質分解性のコアの近位及び遠位の部分を形成し、一緒に２６Ｓ複合体を形成する。蓋部はＰＳＭＤ８／Ｒｐｎ１２を含む８つの調節粒子の非−ＡＴＰ分解酵素（Ｒｐｎ）サブユニットを構成する。蓋部の重要な機能の１つは、多ユビキチン結合したタンパク質及び他のプロテアソームの潜在的な基質を認識することである（Ｇｌｉｃｋｍａｎら、１９９８年）。基底部は、３つの非−ＡＴＰ分解酵素サブユニット（Ｒｐｎ１、Ｒｐｎ２、及びＲｐｎ１０、この最後は基底部にも蓋部にも共通である）、並びにＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７を含む６つの推定上のＡＴＰ分解酵素サブユニット（Ｒｐｔ１〜６）を含む。これらは、非ユビキチン結合した標的タンパク質の非天然の立体配座と相互作用をし（Ｇｌｉｃｋｍａｎら、１９９８年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、２０００年）、その１つであるＳ６’／ＴＢＰ１は、凝集した又はモノマーのα−シヌクレインと結合することが見出された（Ｇｈｅｅら、２０００年；Ｓｎｙｄｅｒら、２００３年）。同様の前後関係で、調節のプロテアソームタンパク質Ｓ６とも呼ばれるＰＳＭＣ４は、別の前シナプスタンパク質であり、シナプス小胞と関連のある、野生型及び変異型のシンフィリン−１（Ｄｕｋｅら、２００４年）、と特異的に相互作用することが最近報告されている（Ｒｉｂｅｉｒｏら、２００２年）。シンフィリン−１は、α−シヌクレインと関連があり、同様にレヴィ小体に蓄積することが見出された（Ｗａｋａｂａｙａｓｉら、２０００年）。したがって、本発明に見出されるＰＳＭＣ４のレベルの減少は、緩慢であるが持続的であるα−シヌクレインの凝集によるＵＰＳの進行性の阻害とともに、レヴィ小体でこれらの蓄積を引き起こすことがある（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年；Ｌｉａｎｉら、２００４年）。ＰＤサンプルにおけるグリコサミノクリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｃｌｙｃａｎ）ヘパラン硫酸遺伝子の発現の観察される増加は、示唆されたように、α−シヌクレインの原繊維形成及び凝集の一因にもなり得る（Ｃｏｈｌｂｅｒｇら、２００２年）。６つのＡＴＰ分解酵素はそれぞれ不可欠であり、タンパク質分解へのＡＴＰ要求、並びに２６Ｓ複合体を形成するための２０Ｓ及び１９Ｓ複合体の会合の説明となる（Ｇｈｉｓｌａｉｎら、１９９３年；Ｇｏｒｄｏｎら、１９９３年）。したがって、パーキンソン症候群患者の脳におけるＰＳＭＣ４／ＴＢＰ７の発現の減少は、２６Ｓプロテアソーム複合体のレベルの減少、ユビキチン結合したタンパク質の異常蓄積、及び、次に細胞の欠陥を引き起こすことがあるサイクリンなどの寿命の短いタンパク質の分解速度の低下の一因となり得る（レビューには、Ｃｏｕｘら、１９９６年；Ｖｏｇｅｓら、１９９９年を参照されたい）。実際、本発明者らは、サイクリンＧ会合キナーゼ遺伝子の減少を観察した。サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼの蓄積は、アポトーシスを経験している有糸分裂後のニューロンで（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、１９９９年；Ｃｏｐａｎｉら、２００１年）、及びＰＤのＭＰＴＰモデルで（Ｇｒｕｎｂｌａｔｔら、２００１年）報告されている。この事象は、細胞周期に再度入る際の試みを表すことができることが示唆されている（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、２００２年）。本発明者らの発見は、２０Ｓプロテアソームのβ−サブユニットではなくα−サブユニットの発現が減少し、いくつかの１９Ｓサブユニットのタンパク質発現レベルが減少し、散発性のＰＤ患者のＳＮｐｃで２６／２０Ｓプロテアソーム活性が機能的に不足するという以前の報告と一致する（ＭｃＮａｕｇｈｔら、２００３年）。しかしながら、ウェスタンブロット分析で使用した抗体は、様々なプロテアソームサブユニットに共通の配列を認識したので、また、分子量の過剰見積りをもたらすタンパク質の二量体化の可能性があったので、この研究では、影響を受ける様々なサブユニットの正確な性質は確立されなかった。このように、本発明は、より広い観点を提供し、特異的なプロテアソーム構成成分の発現における遺伝子の変化を明らかにするものである。
【０１０２】
熱ショックタンパク質シャペロンＨＳＣ−７０
細胞に対するタンパク質毒性の傷害又はいくつかのストレス条件は、野生型及び変異のタンパク質の正確なフォールディングを助けることにより細胞を保護することを目的とした分子シャペロンのアップレギュレーションを誘導することができる。このようなものの１つに、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）ファミリーのメンバーである、７０ｋＤａ熱ショック同族タンパク質（Ｈｓｃ７０）がある（Ｚｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｂｒｏｎｋ、２００１年）。Ｈｓｃ７０は、通常、タンパク質のフォールディング、再フォールディング、集合、分解、及び生物膜を介したタンパク質の転位置などの細胞プロセスを媒介する。Ｈｓｐ７０が過剰発現されると、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでミスフォールディングされ凝集したα−シヌクレイン種の量を減少させ（Ｋｌｕｃｋｅｎら、２００４年）、野生型α−シヌクレイン、並びに変異の形態のＡ３０Ｐ及びＡ５３Ｔを発現し（Ａｕｌｕｃｋら、２００２年）、ポリグルタミンの病原性に関連する分解を抑制するトランスジェニックハエのＰＤのモデルでドーパミン作動性ニューロンの損失を防止することが示されている（Ｂｏｎｉｎｉ、２００２年）。最近、２７４名のＰＤ患者で、ＰＤへの罹患性を増加させることがあるＨＳＰ７０−１の５’プロモーター領域に機能上の多形性が報告されている（Ｗｕら、２００４年）。本発明者らは、リアルタイム定量ＰＣＲにより確認して、６名中５名のパーキンソン症候群患者のＳＮｐｃ及びＳＮｒの両方でＨＳＣ７０／ＨＳＣ５４をコードするＨＳＰ８の遺伝子発現が著しく減少するが、ＰＤ患者と対照からの小脳の間に組織特異性を示唆する著しい変更は観察されなかったことを見出している。ＨＳＰＡ８は２つのアイソフォームで存在し、短小化したものは、タンパク質結合領域及び可変領域で１５３個のアミノ酸残基を欠く（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。これは、コシャペロンと競合することにより、Ｈｓｃ７０の内因性の阻害的制御因子として機能すると考えられている（Ｔｓｕｋａｈａｒａら、２０００年）。現在、このどちらがより強く影響を受けるかを、本発明者らは区別することができない。
【０１０３】
Ｈｓｃ７０は、小胞及び核内輸送に関与する他に、アンフォールドの、又は異常型のタンパク質を認識することによるタンパク質のユビキチン結合、及びコシャペロンであるＥ３リガーゼ酵素ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０と相互作用するタンパク質のカルボキシル末端）への分配で役割を果たすことがある（Ｍｕｒａｔａら、２００３年）。ＣＨＩＰは、Ｈｓｐ９０及び／又はＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０と協力し、それらの結合したミスフォールディングされた基質にユビキチン結合することができる。したがって、このＨｓｃ７０−ＣＨＩＰペアは、シャペロンによりもたらされたアンフォールドのタンパク質を特異的に認識するための、Ｅ３リガーゼを示す。ＵＰＳによる再フォールディング又は分解を逃れたタンパク質は封入体中に蓄積する凝集体を形成するので、この分子シャペロン−ＵＰＳの品質管理システムは神経変性疾患では特に重要である。実際、分子シャペロン、並びにユビキチン及びプロテアソームは封入体及びレヴィ小体に動員され（Ｓｔｅｎｏｉｅｎら、１９９９年；Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、２００１年）、損傷したタンパク質を分解し又はそれらの除去を防止する品質管理システムの試みを指摘している。実際、数々の神経変性疾患は、タンパク質の品質管理システムの失敗によりもたらされる様子である（Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、２００１年）。
【０１０４】
細胞接着分子、鉄、及び酸化ストレス
細胞の遊走及び軸索の伸長、並びに細胞骨格及びＡＤの構成成分など、ニューロンの発達で不可欠な役割を演じている遺伝子間の関連が最近提唱されている（ＤｅＦｅｒｒａｒｉ ａｎｄ Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ、２０００年）。細胞骨格構成成分（例えば、ニューロフィラメント、微小管関連タンパク質）の異常なリン酸化、並びにシナプス及び他のタンパク質のユビキチン結合がレヴィ小体内で遭遇するＰＤに、同様の仮説をあてることができる（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００３年）。
【０１０５】
膜及び細胞外マトリックス（細胞接着プロセス）に重要な構造上の、及びリン酸化の分子機能を有する遺伝子の異常なアップレギュレーションを示す本発明者らの現在の発見は、この仮定を支持し、未来の治療学に潜在的な新規の遺伝子ターゲットを示す本発明者らの知識を拡張するものである。
【０１０６】
ＰＤ、ＡＤ、及び多発性硬化症で報告されているような脳の炎症の間、重要な細胞接着分子の組織化の崩壊及びそれらのシグナル伝達経路の減少が、グリア細胞及びマクロファージの動員、並びにサイトカイン及びＯＳの増加におそらく関連する、脳の病状を生じることがある。更に、本発明者らは、６名中５名の患者に、最近記載された、鉄−及び２−オキソグルタレート−依存性ジオキシゲナーゼスーパーファミリーに属するプロリンヒドロキシラーゼ酵素であるＥＧＬＮ１（ｅｇｌナイン同族体１）遺伝子の１．５倍を超える著しい誘導を観察した（Ｅｐｓｔｅｉｎら、２００１年）。これらの酵素は、低酸素感受性遺伝子のアレイの協調的な誘導を調和させる主たる制御因子である、転写因子である低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ）の発現をコントロールする、重要な鉄及び酸素のセンサーとして働く。ＨＩＦの標的遺伝子は、脈管形成、細胞の増殖／生存、及びグルコース／鉄の代謝に特に関連している（Ｌｅｅら、２００４年）。酸素レベルが高いとき、又は鉄の過負荷時、ＥＧＬＮ水酸化酵素は、ＨＩＦを標的にしてプロテオソームを分解する。
【０１０７】
興味深いことに、遊離の鉄が誘導しプロテアソームが媒介する、鉄調節タンパク質（ＩＲＰ２）の分解は、２−オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼの活性も伴い、鉄のキレート化剤により阻害される（Ｈａｎｓｏｎら、２００３年；Ｗａｎｇら、２００４年）。したがって、ＩＲＰ２は翻訳後修飾を起こすＥＧＬＮ１の基質であり、タンパク質分解のためにＥＧＬＮ１にシグナルを送る可能性がある。ＳＮｐｃにおけるＥＧＬＮ１の過剰産生は、ＩＲＰ２の低下、並びに引き続きトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）ｍＲＮＡの減少及びフェリチンレベルの増加をもたらすことがあり、両者ともＩＲＰ２によるそれぞれ正及び負の転写調節を受ける（Ｍｅｙｒｏｎ−Ｈｏｌｔｚら、２００４年；Ｐｏｎｋａ、２００４年）。ＩＲＰ２のノックマウスにおける最近の研究により、実質的な運動緩徐及び振戦で線条体に鉄が蓄積することが明らかになっている（ＬａＶａｕｔｅら、２００１年）。
【０１０８】
鉄及びＯＳセンサータンパク質の発現の増加は、両者ともＨＩＦタンパク質により調節される、ホスホフルクトキナーゼ及び脈管形成因子ＶＥＧＦで観察される減少の直接の原因であることがある（Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏら、２００３年）。ホスホフルクトキナーゼは、解糖系によるグルコースの流動をコントロールする、重要な調節酵素である。同様に、ＶＥＧＦは、ＰＩ３Ｋ及びｒａｓ経路の活性化により、グルコースの輸送及び代謝に関与する遺伝子を活性化する。これらの経路における２つの主役である、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＢ及びホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒作用、αポリペプチドの発現も、パーキンソン症候群のＳＮｐｃでダウンレギュレートされる。この発見は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）分析を用い、ＳＮへのグルコースの取りこみの減少を実証して（Ｂｅｒｄｉｎｇら、２００１年）ヒトＰＤ患者における以前の報告を支持し、この疾患により冒された主要な生存経路のより広い視野を提供するものである。これらの観察は、数々のエネルギー経路／解糖に関連する遺伝子が更に減少すること、並びに鉄／ＯＳ及び炎症遺伝子が増加することに加えて、ミトコンドリアの機能不全、並びに活性酸素種及び窒素種がＰＤの病原の一因であるという仮説と一致する。これと一致して、最近の研究は、推定上のフリーラジカルセンサーＤＪ−１遺伝子における劣性の変異を、早期発症型のパーキンソン症候群と関連付けた（Ｂｏｎｉｆａｔｉら、２００３年）。
【０１０９】
驚くべきことに、アポトーシスに関連する遺伝子はＰＤサンプルで最も小さい機能上のクラスを構成し、このことは疾患で生じている神経変性の一連の事象におけるプログラム細胞の死の関連に疑問を投げかけている。ＰＤにおけるアポトーシスの役割は、その証拠があっても病理学的発見及び神経変性の速度と相互に関連しないので、大いに議論の余地がある。本発明者らは、アポトーシスの変化がより早い段階で生じ、疾患の進行とともに減少する可能性を排除することはできない。
【０１１０】
ドーパミンの神経伝達及び代謝
これらのニューロンのプロセスの崩壊は、パーキンソン症候群のＳＮにおける、細胞接着タンパク質複合体と結合することがある細胞シグナリング遺伝子の発現において、並びに小胞の分泌経路、及びドーパミン作動性の神経伝達及び代謝に属する遺伝子において観察される減少によって悪化することがある。ＰＤ患者６名中少なくとも５名における決定的な変更を検出しようと探索する高度に厳密な分析では、対照グループに比べて遺伝子発現の変化は１．５倍であり、小胞のモノアミン輸送体ＶＭＡＴ２（ＳＣＬ１８Ａ２）を含む８遺伝子（そのうち３遺伝子がＤＡ伝達に関連する）の発現が大きく減少することを本発明者らは観察した。リアルタイムＰＣＲの確認分析では、ＳＮｐｃにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡに特異的な減少が現れたが、ＳＮｒにおける変化はそれほど顕著ではなかった。この発見は、ＰＤにおけるＶＭＡＴ２ｍＲＮＡの著しい減少を示すし、この著しい減少は着色した残りのニューロンにおけ、細胞あたりの輸送体及びＶＭＡＴ２両方のシグナルの顕著な減少と関連していたという対照及びＰＤの死後のＳＮについての以前の報告と一致している（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９６年；Ｂｒｏｏｋｓ、２００３年）。小脳ではＰＤと対照サンプルとの間に有意差がなかったので、これらの変更はＳＮに特異的であった。他の２つの著しい変化は、ＤＡ伝達及び代謝に関連する遺伝子であり、それぞれアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）及びｃＡＭＰ調節リンタンパク質をコードする、ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＲＰＰ−２１の減少と関連していた。ＡＲＰＰ−２１は、大脳基底核のＤＡで神経支配された脳の領域（例えば、尾状核〜被殻）、及び黒質で特に濃縮されていた（Ｏｕｉｍｅｔら、１９８９年；Ｔｓｏｕら、１９９３年）。ＤＡＲＰＰ−３２（ドーパミン及びアデノシン３’：５’−モノリン酸調節リンタンパク質−３２Ｋ）同様、ＡＲＰＰ−２１はＤＡレセプターであるＤ１により活性化され、したがって、Ｄ−１神経伝達の機能上の活性の指標を表すことができる。本発明者らが知る限りでは、これはＰＤのＳＮにおけるＡＲＰＰ−２１ｍＲＮＡレベルの減少についての最初の報告である。ＡＬＤＨ１Ａ１は、ＳＮのＤＡ細胞及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）で高度に且つ特異的に発現され、ＳＮｐｃドーパミン作動性ニューロンで著しく減少するが、ＰＤの脳のＶＴＡでは減少しないことが見出された（Ｇａｌｔｅｒら、２００３年）。これは、６−ヒドロキシドーパミンにおける線条体のＡＬＤＨ活性が、又はラット（Ａｇｉｄら、１９７３年）若しくはネコ（Ｄｕｎｃａｎら、１９７２年）で電気的に誘導された病変が、著しく減少するという所見と一致する。
【０１１１】
ＡＬＤＨは、ＤＡのアルデヒド誘導体（３，４ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及び４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニルアセトアルデヒド）への分解に関与し（Ｍａｒｄｈ ａｎｄ Ｖａｌｌｅｅ、１９８６年）、これらは次いで、ホモバニリン酸及びジヒドロキシフェニル酢酸に代謝され、また高度に反応性で神経毒性であるアルデヒドの解毒に関与する（Ｈｊｅｌｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、１９８３年）。したがって、ＤＡ伝達における変更は、ＡＬＤＨ活性を変更することがあり、且つ／又は、逆に、ＡＬＤＨが媒介する代謝の変化は、大脳基底核及び大脳辺縁系の、神経細胞体及び終末部におけるＤＡレベルに影響を及ぼすことがある。これらのタンパク質は、ＶＭＡＴ２と結びついて、今やＰＤの新規のマーカーとしてみなすことができる。
【０１１２】
本発明に観察されるこれらのＤＡの神経伝達、及び代謝に関連した遺伝子のレベルが全体的に減少することは、神経伝達物質の貯蔵と深刻に折り合い、ＤＡニューロンの機能不全と相互に関連することがある。これは、小胞体からの初期の小胞トラフィッキングタンパク質のＳＥＣ２２ファミリーのメンバーであるＳＥＣ２２Ｌ１ｍＲＮＡのレベルが減少することにより（Ｈａｙら、１９９６年）、且つ膜担体輸送体の多くに観察される減少により、更に悪化することがある。広いレパートリーの細胞内タンパク質及び膜タンパク質を輸送する、細胞輸送及び小胞トラフィッキングの損傷は、これらが凝集し、細胞が細胞質封入体（アグリソーム）内及びレヴィ小体に堆積することを、よく説明することができる。本発明者らの観察を説明する１つの単純な仮説は、ＤＡを含有するニューロン本体及びニューロンのシナプスの損失が、遺伝子産物のレベルの減少を説明することができるということである。この仮定は、広いレパートリーの小胞輸送又はシナプス関連遺伝子における同様の遺伝子発現の変化を予想するものである。しかしながら、本発明者らのマイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲの確認から浮上したように、Ｒａｂ３ｂ、シンタキシン６、及びＣＯＰζ２などのカテゴリーに関係する多くの遺伝子の発現は、ＰＤでは変更されなかった。
【０１１３】
タンパク質の修飾／リン酸化
２つのプレ−ｍＲＮＡスプライシング関連遺伝子の発現は、対照の脳に比べて、ＰＤサンプル６個中５個のそれぞれで、逆比例に且つ高度に影響を受けていた。ＳＦＲタンパク質キナーゼ２をコードするＳＲＰＫ２遺伝子はダウンレギュレートされ、セリン／アルギニン反復マトリックス２をコードするＳＲＲＭ２は著しく増加した。ＳＲＰＫ２は、アルギニン／セリンに富む（ＳＲ）ドメイン含有スプライシングファクターのリン酸化に特異的な予想配列を有する、脳で高度に発現されるキナーゼであり、スプライシングファクターは、次に脳の領域でＲＮＡスプライシングを調節する（Ｗａｎｇら、１９９８年）。興味深いことに、ＳＲＲＭ２（又はＳＲｍ３００）は、主要な複合ＳＲｍ１６０／３００内のコアクチベーターとして機能するＳＲドメイン含有スプライシングファクターであり、サブセットの構成的にスプライスされたプレ−ｍＲＮＡのプロセッシングを担う（Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、２０００年）。
【０１１４】
ＳＲＭＭ２がＳＲＰＫ２の基質であれば、ＰＤのＳＮｐｃにおけるキナーゼＳＲＰＫ２の確固とした減少及びＳＲＭＭ２の高い発現が、異常な低リン酸化ＳＲＭＭ２の蓄積をもたらすことは妥当と思われる。これは、次にＳＲｍ１６０、及び／又はスプライシング活性における広範な損傷に最終的に集中する他の関連のあるＳＲタンパク質の核の分布に影響を及ぼす可能性がある。
【０１１５】
結論
ＰＤの病理学及び病因学に関する情報は幅広いが、ＰＤの発症のきっかけとなる主要な事象が何であるかを断言するのは未だ時期尚早である。本発明が示すのは、細胞外マトリックス／細胞骨格構成成分の進行性の誤制御とともに、ＯＳ及び炎症の状態と同時発生するするＵＰＳの選択的構成成分のレベルの減少である。これらの一連の事象は、疾患の経過の間、独立して又は協力的に働き、結局はドーパミン作動性ニューロンの死をもたらす可能性がある。したがって、様々に影響を受けたタンパク質の動態のわずかな変更でも、数十年の間にＰＤにおけるＤＡ含有ニューロンの緩慢に進行する神経変性の根底にある蓄積効果となるかもしれない。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【０１１９】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ＰＤのサンプルで差次的に発現された１３７遺伝子の相対的な発現レベルを、対照サンプルと比べて示す。対照に比べて１．５のファクターで変更するという診断基準を満たし、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験をｐ＜０．０５の有意水準で通過した遺伝子のみが含まれた。１２サンプルにわたり、遺伝子は相対的発現レベルにより集中した。発現レベルを平均値と比較してカラーコードした。平均より小さい値は緑色、平均を超える値は赤色である。
【図２Ａ】Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙにしたがって類別された生物学的プロセスに関わる遺伝子の機能上のクラスター分析を示す。円グラフは、対照の脳と比べて、ＰＤサンプルでダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子の分布を示している。異なる機能グループで変更された遺伝子の数を示している。各機能グループの真のサイズの過剰見積りを避けるために、各遺伝子を単一のカテゴリーに割り当てた。（Ａ）における遺伝子の総数は６８個であり、（Ｂ）では６９個である。
【図２Ｂ】Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙにしたがって類別された生物学的プロセスに関わる遺伝子の機能上のクラスター分析を示す。円グラフは、対照の脳と比べて、ＰＤサンプルでダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子の分布を示している。異なる機能グループで変更された遺伝子の数を示している。各機能グループの真のサイズの過剰見積りを避けるために、各遺伝子を単一のカテゴリーに割り当てた。（Ａ）における遺伝子の総数は６８個であり、（Ｂ）では６９個である。
【図３】ＰＤサンプル６個中少なくとも５個で、１．５以上のファクターで変化した、差次的に発現された遺伝子のヒートマップを示す。患者のサンプルシグナルを、対照のサンプルシグナルの平均と比較した（幾何平均）。ＰＤサンプルで、ダウンレギュレートされる（Ａ）遺伝子及びアップレギュレートされる（Ｂ）遺伝子を対照の脳と比べた。発現レベルを平均値と比較してカラーコードした。平均より小さい値は緑色、平均を超える値は赤色である。
【図４−１】ＰＤで差次的に発現された遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の確認を示す。以下のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションでは、ＰＤのＳＮで発現が変更された遺伝子の選択された数を、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別の脳の領域で確認して、組織特異的な遺伝子の変更を検出した。ＳＫＰ１Ａでは、値は１を超えるように調節し、ｌｏｇＹ軸を適用した。材料と方法で記載したように、検量線は４個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均に標準化した相対的な遺伝子発現を表す。ＰＤ及び対照の症例に対応するデータポイントを示してある。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５対対照。
【図４−２】ＰＤで差次的に発現された遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の確認を示す。以下のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションでは、ＰＤのＳＮで発現が変更された遺伝子の選択された数を、ＳＮｐｃ、ＳＮｒ、及び小脳の３つの別の脳の領域で確認して、組織特異的な遺伝子の変更を検出した。ＳＫＰ１Ａでは、値は１を超えるように調節し、ｌｏｇＹ軸を適用した。材料と方法で記載したように、検量線は４個のハウスキーピング遺伝子の幾何平均に標準化した相対的な遺伝子発現を表す。ＰＤ及び対照の症例に対応するデータポイントを示してある。ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５対対照。
【図５】パーキンソン症候群の脳からのＳＮｐｃのメラニン化したドーパミン作動性ニューロンで、差次的に発現されたＳＫＰ１タンパク質の免疫組織学分析の確認を示す。メラニン含有ドーパミン（ＤＡ）ニューロン内のＳＫＰ１免疫反応性は、青色を含むことで示される（緑色矢印を参照されたい）。ＳＫＰ１は、ＰＤでは殆ど非存在である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病を検出し、予後診断し、経過観察するための分子マーカーの使用であって、前記分子マーカーが、発現パターンの変化した１つ又は複数の遺伝子、又はその遺伝子産物であり、前記遺伝子が、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される、使用。
【請求項２】
前記１つ又は複数の遺伝子が、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
分子マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、且つ／又は経過観察する方法であって、前記分子マーカーが、発現パターンの変化した１つ又は複数の遺伝子、又はその遺伝子産物であり、前記遺伝子がＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される、方法。
【請求項４】
前記分子マーカーが、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
パーキンソン様症状を示す個体においてパーキンソン病の発生を診断する方法であって、前記個体から得たサンプルにおける、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、及びＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含み、前記遺伝子の発現レベルの前記減少及び／又は増加がパーキンソン病の診断となる、方法。
【請求項８】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、試験する個体からの、血液、血清、又は皮膚の生検である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子によって発現された遺伝子産物を検出することを含み、前記遺伝子産物が、遺伝子によって発現されたタンパク質、又は遺伝子から転写されたＲＮＡ、又はその両方である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出が、サンプルをタンパク質に結合する抗体又はそのフラグメントと接触させることにより、遺伝子によって発現されたタンパク質の存在をアッセイすることを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルにおいてＲＮＡ転写物のレベルの減少又は増加を検出することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ転写物の検出が、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、核酸プローブアレイ、リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ドットブロットアッセイ、及びイン・サイツ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法により行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
パーキンソン病を治療するのに有用な物質をスクリーニングする方法であって、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、及びＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートし、又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、１ＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をダウンレギュレートする物質を同定することを含む、方法。
【請求項１５】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦＩ、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートし、又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をダウンレギュレートする物質を同定することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１】
パーキンソン病を検出し、予後診断し、経過観察するための分子マーカーの使用であって、前記分子マーカーが、発現パターンの変化した１つ又は複数の遺伝子、又はその遺伝子産物であり、前記遺伝子が、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される、使用。
【請求項２】
前記１つ又は複数の遺伝子が、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
分子マーカーの使用を含む、パーキンソン病を診断し、予後診断し、且つ／又は経過観察する方法であって、前記分子マーカーが、発現パターンの変化した１つ又は複数の遺伝子、又はその遺伝子産物であり、前記遺伝子がＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される、方法。
【請求項４】
前記分子マーカーが、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、ＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
パーキンソン様症状を示す個体においてパーキンソン病の発生を診断する方法であって、前記個体から得たサンプルにおける、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、及びＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、ＩＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含み、前記遺伝子の発現レベルの前記減少及び／又は増加がパーキンソン病の診断となる、方法。
【請求項８】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、及びＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの減少、及び／又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、及びＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの増加を検出することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、試験する個体からの、血液、血清、又は皮膚の生検である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子によって発現された遺伝子産物を検出することを含み、前記遺伝子産物が、遺伝子によって発現されたタンパク質、又は遺伝子から転写されたＲＮＡ、又はその両方である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出が、サンプルをタンパク質に結合する抗体又はそのフラグメントと接触させることにより、遺伝子によって発現されたタンパク質の存在をアッセイすることを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルにおいてＲＮＡ転写物のレベルの減少又は増加を検出することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ転写物の検出が、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、核酸プローブアレイ、リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ドットブロットアッセイ、及びイン・サイツ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法により行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
パーキンソン病を治療するのに有用な物質をスクリーニングする方法であって、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦ１、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４、ＨＩＰ２、ＰＡＣＥ４、ＣＯＸ６Ａ１、ＰＦＫＰ、ＯＸＣＴ、ＧＢＥ１、ＵＱＣＲＣ２、ＬＡＮＣＬ１、ＴＲＩＰ１５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＣＬ１、ＧＮＧ５、ＧＮＡＩ１、ＶＥＧＦ、ＲＨＯＢ、ＮＲ４Ａ２、ＳＣＬ３１Ａ２、ＳＣＰ２、ＰＩＧＨ、ＡＲＩＨ２、ＧＭＰＲ２、ＰＰ、ＩＫＢＫＡＰ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＲＮ２、ＢＣＡＳ２、ＩＡＲＳ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＳＥＰ１５、ＴＡＦ９、ＺＦＰ１０３、ＷＲＢ、ＴＭＥＭ４、ＳＭＡＲＣＡ３、ＦＭＲ１、ＰＤＥ６Ｄ、ＳＧＣＥ、ＡＵＨ、ＳＬＣ１６Ａ７、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＵＧＴＲＥＬ１、ＳＥＣ２２Ｌ１、ＣＤ９、ＣＤＨ１９、ＤＵＳＰ１、ＨＳＡ６５９１、ＡＣＴＲ３、ＫＩＦ２、ＴＵＢＢ２、ＡＳＰＡ、ＨＥＬＯ１、Ｃ３ｏｒｆ４、ＣＢＲ１、ＸＰＯＴ、ＬＯＣ５１１４２、ＮＹ−ＲＥＮ−４５、及びＳＥＴ０−２からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートし、又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＡＭ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＭ４ＳＦ９、ＬＡＭＢ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＴＳＴＡ３、ＣＯＬ５Ａ３、ＰＡＬＭ、ＭＹＯＭ１、ＦＬＮＢ、ＨＭＢＳ、ＫＲＴ２Ａ、ＣＳＫ、ＮＵＤＣ、ＨＹＰＥ、ＧＡＫ、ＳＩＡＴ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＣＳＢＰ１、ＣＤ２２、ＥＲＣＣ１、ＤＮＡＪＢ５、ＴＲＡＦ３、ＭＭＰ９、ＥＩＦ４Ｇ１、ＲＰＬ３６、ＳＲＰＫ１、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＪＩＫ、ＬＮＫ、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＴＣＯＦ１、ＮＡＰＧ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＩＴＳＮ１、ＬＯＣ５１０３５、ＰＭＶＫ、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＥＦＥＭＰ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＡＰＲＴ、ＳＰＵＦ、ＧＬＴＳＣＲ２、ＡＤＩＲ、ＰＳＣＤ４、ＣＢＦＡ２Ｔ１、ＣＵＧＢＰ１、１ＮＧ４、ＳＴＡＴ６、ＺＮＦ２３９、ＴＡＬ１、ＴＡＦ１１、ＭＸＤ４、ＲＤＨＬ、ＬＯＣ５１１５７、ＬＲＰ６、ＭＢＤ３、及びＣ９ｏｒｆ７からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をダウンレギュレートする物質を同定することを含む、方法。
【請求項１５】
ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＲＰＰ−２１、ＨＳＰＡ８、ＳＫＰ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＲＰＫ２、ＴＭＥＦＦＩ、ＴＲＩＭ３６、ＡＤＨ５、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＡ２、ＰＳＭＡ５、ＰＳＭＣ４からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をアップレギュレートし、又はＥＧＬＮ１、ＥＩＦ４ＥＢＰ２、ＬＧＡＬＳ９、ＬＯＣ５６９２０、ＬＲＰ６、ＭＡＮ２Ｂ１、ＰＡＲＶＡ、ＰＥＮＫ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＨＫ１、ＳＲＲＭ２、ＺＳＩＧ１１からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現をダウンレギュレートする物質を同定することを含む、請求項１４記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２５２１１（Ｐ２００７−５２５２１１Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４８５８５（Ｐ２００６−５４８５８５）
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００００６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６７３９１
【国際公開日】平成１７年７月２８日（２００５．７．２８）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００００６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６７３９１
【国際公開日】平成１７年７月２８日（２００５．７．２８）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]