ヒストンデアセチラーゼ１／２選択的インヒビターアッセイ
本発明は、（ｉ）ＨＤＡＣ１および／または２酵素を、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質中に見出されまたＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３およびＭＩ−ＥＲ１中にも見出されるＳＡＮＴおよびＥＬＭ２領域を含有するタンパク質と共に、適当なアッセイバッファ中でインキュベートする段階と、（ｉｉ）有望なＨＤＡＣインヒビターおよび適当な基質を添加してインキュベートする段階と、（ｉｉｉ）インキュベーションを中止し、推定ＨＤＡＣインヒビターが酵素活性に与えた効果を標準との比較によって定量する段階と、を含むヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ１および／または２インヒビター特異的アッセイに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＤＡＣサブタイプ選択的インヒビターのスクリーニングに好適な高効率のヒストンデアセチラーゼ１／２（ＨＤＡＣ１／２）特異的アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
可逆性ヒストンアセチル化が真核性遺伝子転写の主要調節因子であることは証明されていた。ヒストンテール中のリシン残基は、転写コアクチベーターとして機能するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）によってアセチル化される。ヒストンがアセチル化されると、普通の転写活性化で見られるよりも制限的でないクロマチン構造が生じる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）はＨＡＴによって触媒される反応を逆行させ、抑制的クロマチン構造に導く。３つの主要クラスに所属する多数のＨＤＡＣが同定されている。クラスＩのＨＤＡＣはＨＤＡＣ１、２、３および８を含み、酵母Ｒｐｄ３デアセチラーゼに相同であるが、ＨＤＡＣ４、５、６、７および９を含むクラスＩＩのデアセチラーゼはむしろ酵母Ｈｄａ１に類似している。ＨＤＡＣＩＩはすべての他のサブタイプに比べて類似および差異の双方の特徴が顕著である。ＨＤＡＣの第三のクラスは、活性化のためにＮＡＤ補因子が必要な酵母Ｓｉｒ２サイレンサータンパク質の同族体である。ＨＤＡＣはインビボでは、遺伝子転写を能動的に抑制するためにＤＮＡ結合性タンパク質のターゲットになる長い多タンパク質複合体として機能することが知見されている。
【０００３】
ＨＤＡＣ３は正常にはコリプレッサーＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴとの緊密な化学量論的複合体として存在する。ＨＤＡＣ３の酵素活性にはＳＭＲＴまたはＮ−ＣｏＲが必要であり、これらは、双方のコリプレッサーに存在する２つのＳＡＮＴモチーフの１つを含むＤＡＤドメイン（デアセチラーゼ活性化ドメイン）を介して相互作用しデアセチラーゼを活性化する。ＤＡＤはＮ−末端ＤＡＤ−特異的モチーフとＣ−末端ＳＡＮＴ−様ドメインとを含む。
【０００４】
転写に関与する多くのタンパク質は保存されたＳＡＮＴモチーフを含有しているが、その機能は十分に解明されていない（Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｔｅｋ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１５８−１６３）。組換えＨＤＡＣ３は不活性であり、活性化は（ＨｅＬａ細胞のような）細胞中のデアセチラーゼと補因子ＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとの同時発現、または、ウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いたＨＤＡＣ３およびＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲのインビトロ転写−翻訳によって生じる。
【０００５】
公表された証拠を確認するために、Ｃ−末端標識ＨＤＡＣ３（ＨＤＡＣ３−ＦＬＡＧ）を、Ｎ−ＣｏＲのＤＡＤ領域を含有する［ＤＡＤをＧＡＬ４のＤＮＡ結合性ドメイン（ＧＡＬ４−ＤＢＤ）に融合した］構築物と共に細胞にコトランスフェクトした。また、ＨＤＡＣ３−ＦＬＡＧおよびＧＡＬ４−ＤＡＤを個別に発現させて混合した。複合体を抗−ＦＬＡＧ（ＨＤＡＣ３用）または抗−ＧＡＬ４（ＤＡＤ用）で免疫沈降させ（図１Ａ）、単一のアセチル化リシンを含有するヒストンＨ４−由来オクタマーペプチド基質と共にインキュベートした。活性をアセチル化基質の変換％として表すと（図１Ｂ）、ＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲ ＤＡＤがＨＤＡＣ３の相互作用および活性化に必須であることが確認された。
【０００６】
ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２は共通に８４％の一致を有しており、異なる機能を有しているか否かは判っていないが、転写抑制において相補的な役割を果たすと考えられる。既知のＨＤＡＣ１／２複合体は、転写コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａ（Ｈａｓｓｉｇ，Ｃ．Ａ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９７）Ｃｅｌｌ，８９：３４１−３４８）、ＣｏＲＥＳＴ（ＲＥＳＴのコリプレッサー；Ｙｏｕ，Ａ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１４５４−１４５８）、ＭＴＡ−２（ＮｕＲＤ複合体中の転移関連タンパク質２；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｎｇ，Ｈ．−Ｈ．，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，Ｈ．，Ｔｅｍｐｓｔ，Ｐ．，Ｂｉｒｄ，Ａ．ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３：１９２４−１９３５）、ＭＩ−ＥＲ１（中胚葉誘導初期応答１；Ｄｉｎｇ，Ｚ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ Ｐａｔｅｒｎｏ，Ｇ．Ｄ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２３：２５０−２５８）を含有している。
【０００７】
ＳＡＮＴモチーフはＣｏＲＥＳＴ、ＭＴＡ−２およびＭＩ−ＥＲ１に存在している（図２）。われわれは、これらのすべてのタンパク質中の相同性がＳＡＮＴに限定されずにＮ−末端に続いており、ＤＡＤ−相同領域をＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとして定義できることを知見した（図２）。ＨＤＡＣ１／２コリプレッサーは、Ｅｇｌ−２７中の存在が最初に記載されたもう１つの共通ドメインＥＬＭ２に、胚発生中のパターン形成に基本的な役割を果たすセノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含有している（Ｓｏｌａｒｉ，Ｆ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ａｎｄ Ａｈｒｉｎｇｅｒ，Ｊ．（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６：２４８３−２４９４）．ＥＬＭ２およびＤＡＤの双方を内包するタンパク質のこの部分を図２のＸ−領域で表す（以後の本文中では“Ｘ−領域”と呼ぶ）。ＭＴＡ−２コリプレッサーはまたＮ−末端ドメインＢＡＨ（ブロモ隣接相同；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｇ．Ｈ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｒ．Ｈ．（２００１）Ｇｅｎｅ，２６８：１−７；図３）を有しており、これは遺伝子の転写および抑制に関与する多数のタンパク質中で同定され、タンパク質−タンパク質相互作用に関与している可能性が高い。アミノ酸配列相同に基づいて、Ｘ−領域を含有しているその他の多くのタンパク質、例えば、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２およびＣｏＲＥＳＴ３を同定できる。
【０００８】
ＭＴＡ−２のＳＡＮＴドメインはＨＤＡＣ１への結合に寄与すると考えられ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｇ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｒｕｓｓａｎｏｖａ，Ｖ．Ｒ．，Ｈｉｒａｉ，Ｔ．，Ｑｉｎ，Ｊ．Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：６８１７−６８２４）、ＣｏＲＥＳＴ中のＨＤＡＣ１機能的相互作用に必須であると考えられる（Ｙｏｕ，Ａ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１４５４−１４５８）。また、Ｄｉｎｇらは、ＭＩ−ＥＲ１中でＨＤＡＣ１活性を補強し転写抑制を媒介する原因となるドメインをＥＬＭ２含有領域にマッピングした。彼らの分析は、ＭＩ−ＥＲ１のＳＡＮＴドメインがＨＤＡＣ１との増殖性相互作用に必ずしも必要でないことを示す。
【０００９】
いくつかのＭＴＡ−２欠失突然変異体を構築しＧＡＬ４−ＤＢＤのＣ−末端に融合させた（図３および実験）。標識−ＨＤＡＣ１と共に同時発現させ、抗−ＦＬＡＧと共に同時免疫沈降させ、ＭＴＡ２突然変異体とＨＤＡＣ１との会合を測定した（図４）。
【００１０】
図４に示すように、ＤＡＤ−相同領域もＥＬＭ２ドメインもＨＤＡＣ１へのコリプレッサーの結合に十分ではなかった。これらの実験では、双方のドメインを含む完全Ｘ−領域が相互作用に必要十分であったが、ＢＡＨは必ずしも必要でないと考えられた。
【００１１】
同時免疫沈降した同じ複合体をＨ４−由来アセチル化ペプチド基質と共にインキュベートした。全部のサンプルがＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧを最適濃度以下の同じ濃度（０．２５ｎＭ）で含有するように標準化した（図５Ａ）。この濃度のＨＤＡＣ１は組換えコリプレッサーの非存在下で活性でなかった。酵素活性を観察するためには、少なくとも５ｎＭのＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧの使用が必要であった（図示せず）。
【００１２】
このデータは、全長コリプレッサーＭＴＡ−２がＨＤＡＣ１の最大活性化を与えたことを明らかに示す。３つの個別実験を平均するとバックグラウンドレベル（ＤＢＤ）に対して５倍の活性化が測定された（図５Ａ）。構築物の活性化能力を図５Ｂにまとめる。
【００１３】
ＧＡＬ４−ＭＴＡ２発現ベクターをＧＡＬ４−依存性リポーター構築物と共に細胞にコトランスフェクトした転写抑制アッセイで確証的な結果が得られた（図６）。
【００１４】
ＨＤＡＣインヒビターの存在下で転写が回復したので（結果示さず）、抑制はＨＤＡＣ−依存性であった。これらの実験から以下の結論が得られる：
−ＭＴＡ−２主体のキメラからＳＡＮＴドメインを除去すると、結合、活性化能力および転写抑制機能が低下する；
−ＥＬＭ２ドメインは必須であるがＨＤＡＣ１機能に十分ではない；
−ＨＤＡＣ１の最小活性化ドメインは、ＥＬＭ２およびＤＡＤ−相同領域の双方を内包するＸ−領域である；
−ＨＤＡＣ１の最大活性化は全長ＭＴＡ−２コリプレッサーによって得られる。
【００１５】
ＨＤＡＣ２およびもう１つのコリプレッサーＣｏＲＥＳＴを用いた（いくつかの）反復実験でも同様の結果が得られた。
【００１６】
ＭＴＡ−２コリプレッサーまたはＸ−領域を含有しているそのフラグメントがＨＤＡＣ１および／または２の触媒活性を増強する能力をもつことは新規な知見である。特に、ＨＤＡＣ１および２を全ＭＴＡ−２コリプレッサーと同時精製することによってデアセチラーゼの触媒効率を対数オーダで増進することが可能であった（図７および図示せず）。ＨＤＡＣ１／２の酵素活性を観察するためには少なくとも５ｎＭのデアセチラーゼの使用が必要であるが、コリプレッサーの存在下では０．２５ｎＭの濃度で十分である。これまでに報告されたことのないこの知見は、適切な基質変換を得るためにナノモル以下の酵素濃度で十分なので、ＨＤＡＣサブタイプ選択的インヒビターのスクリーニングに適した高効率のヒストンデアセチラーゼ１および２特異的アッセイの設計が可能になる。
【００１７】
ヒストンデアセチラーゼが細胞増殖の調節に基幹的な役割を果たすことは公知であり、従ってＨＤＡＣの阻害は抗癌治療の重要な手掛かりになる。このためには、少量の酵素でサブタイプ選択的酵素アッセイを設計することが極めて重要である。
【００１８】
図９はＧＡＬ ＤＢＤに下線を付けて示し、ＧＳＧＳリンカーを太字で示す。
【００１９】
従って、本発明の第一の目的は、
（ｉ）ＨＤＡＣ１および／または２酵素を、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質中に見出されまたＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３およびＭＩ−ＥＲ１中にも見出されるＳＡＮＴおよびＥＬＭ２領域を含有するタンパク質と共に、適当なアッセイバッファ中でインキュベートする段階と、
（ｉｉ）有望なＨＤＡＣインヒビターおよび適当な基質を添加してインキュベートする段階と、
（ｉｉｉ）インキュベーションを中止し、推定ＨＤＡＣインヒビターが酵素活性に与えた効果を標準との比較によって定量する段階と、を含むヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ１および／または２インヒビター特異的アッセイを提供することである。
【００２０】
段階（ｉ）のタンパク質は、好ましくは哺乳類細胞中で発現される組換えタンパク質が適切である。該タンパク質は好適には、全長ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３、ＭＩ−ＥＲ１を含有しているか、または、これらのタンパク質の１つと実質的な配列一致（適正には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の配列一致）を有しておりかつＸ−領域（本文中に定義）を含んでいるかもしくはこれらのタンパク質の１つのＸ−領域（本文中に定義）含有フラグメントを含んでいるタンパク質を含有している。好ましくはタンパク質が全長ＭＴＡ−２である。
【００２１】
別の実施態様では、段階（ｉ）のタンパク質が、好ましくは哺乳類細胞中で発現される組換えタンパク質である。該タンパク質は好適には、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１もしくはＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質のＸ−領域またはＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３もはくはＭＩ−ＥＲ１のＸ−領域に実質的な配列一致（適正には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の配列一致）を有しているＸ−領域を含有している。
【００２２】
本発明はさらに、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２と、本質的に全長ＭＴＡ−２またはそのＸ領域含有フラグメントから成るタンパク質とを含有する組換え酵素複合体に関する。
【００２３】
本発明はまた、ＨＤＡＣ１および／またはＨＤＡＣ２および少なくともＸ領域のアミノ酸を発現するように異種ＤＮＡで形質転換させた組換え細胞を提供する。
【００２４】
方法の特定実施態様では、酵素、特に組換え酵素のアリコートがＳＡＮＴおよびＥＬＭ２モチーフを含有するタンパク質と共に提供される。各アリコートがマイクロプレートのウェルに収容されている。ＨＤＡＣインヒビター活性試験の対象となる被験分析液の系列希釈液を細胞収容マイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。方法は場合によっては、既知のＨＤＡＣインヒビターの系列希釈液を陽性対照として含む。ＨＤＡＣインヒビター活性試験の対象となる複数の被験分析液のおのおのを、ＳＡＮＴおよびＥＬＭ２モチーフ含有タンパク質と共に酵素含有マイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。別の実施態様では、複数の分析液の系列希釈液を調製し、細胞収容マイクロタイタープレートの個々のウェルに各希釈液を加える。
【００２５】
以下の実施例は本発明およびその実施方法を説明する。
【実施例】
【００２６】
ＨｅＬａ細胞中の標識−ＨＤＡＣ１／２とＧＡＬ４−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴとの同時発現：一過性トランスフェクション、可溶性抽出物の調製およびアフィニティ精製
ＨｅＬａ細胞への一過性コトランスフェクションには哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ ＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧまたはｐＣＭＶ ＨＤＡＣ２−ＦＬＡＧを、ｐＣＤＮＡ ＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴまたは対応する欠失突然変異体と共に使用した。
【００２７】
リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示通りに使用し、７．５マイクログラムのｐＣＤＮＡ−ＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧまたはｐＣＭＶ−ＨＤＡＣ２−ＦＬＡＧを、７．５マイクログラムのｐＣＤＮＡ−ＧＡＬ４ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴプラスミドＤＮＡと共に、１０７のＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
【００２８】
トランスフェクションの２４時間後、細胞を１×ＰＢＳに収集し、４℃、１５００×ｇで５分間遠心し、１×ＰＢＳで２回洗浄した。遠心後、細胞ペレットを−８０℃で保存した。細胞ペレットを１ｍｌの低張溶解バッファ（２０ｍＭのヘペスｐＨ７．９、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、完全ＥＤＴＡ−非含有プロテアーゼインヒビターカクテル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）に再懸濁させることによって細胞溶解液を調製し、次いで氷上で１５分間インキュベートし、２ｍｌのＤｏｕｎｃｅｒ（Ｂ、２５ストローク）で細胞を破壊し、１５０ｍＭのＫＣｌと０．５％のＮＰ４０とのホモジェネート（等張溶解バッファ：ＩＬＢ）に加えた。サンプルを３０秒間ずつ２回音波処理（出力５／６、デューティサイクル９０、タイマー一定）し、次いで回転ホイール上で４℃で１時間インキュベートすることによって可溶性の全細胞抽出物が得られた。ＳＳ３４ロータに入れ、４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心し、透明上清（可溶性タンパク質抽出物）を収集し、ＢｉｏＲａｄ試薬を使用して全タンパク質濃度を測定した。抽出物中の標識ＨＤＡＣ濃度は、４、８および１６マイクログラムの全タンパク質を４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに８−１６ｎｇの基準タンパク質と共に泳動させ、次いで抗−ＦＬＡＧアルカリホスファターゼ共役モノクローナル抗体（Ｍ２−ＡＰ、Ａ９４６９、ＳＩＧＭＡ）と共にウェスタンブロット分析することによって測定した。同じ抽出物中のＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴキメラタンパク質の発現レベルは、抗−ＧＡＬ４ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−５７７）で顕在化させた同じ免疫ブロットで評価した。
【００２９】
標識ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２を含有する可溶性タンパク質抽出物をＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２またはＣｏＲＥＳＴ変異体のおのおのに組合せて、製造業者の指示通りに調製した抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（Ａ２２２０、ＳＩＧＭＡ）に塗布し、ＩＬＢ中で平衡させた。ゲルマトリックスと可溶性タンパク質抽出物とを混合し（２マイクログラムの標識ＨＤＡＣあたり１０マイクロリットルのゲルマトリックス）、回転ホイール上で４℃で一夜インキュベートした。ゲルマトリックスを遠心によって回収し、ＩＬＢで１回、０．１％ＮＰ−４０含有ＩＬＢで２回、溶出バッファ［５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ−１００、１００ｍＭのＫＣｌ］中でさらに２回洗浄した。１００マイクログラム／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド（Ｆ４７９９、ＳＩＧＭＡ）を含有している１０倍容量の溶出バッファをゲルマトリックスに添加し、次いで室温の回転ホイール上で１時間インキュベートすることによってＨＤＡＣ複合体を溶出させた。遠心によって溶出タンパク質を上清中に収集し、１０、２０および３０ｎｇの定量用基準タンパク質を使用する抗−ＦＬＡＧウェスタンブロット分析によって標識ＨＤＡＣ１／２濃度を測定した。ＨＤＡＣ−結合ＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴ変異体のおのおのの存在は抗−ＧＡＬ４抗体で顕在化させた同じ免疫ブロット上で評価した。
【００３０】
転写−翻訳およびアフィニティ精製の組合せによる標識−ＨＤＡＣ１／２およびＧＡＬ４−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴのインビトロ発現
ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示通りに使用した。混合実験には、１２０マイクロリットルの反応容量に各４マイクログラムの各発現プラスミドＤＮＡを使用して対応タンパク質（標識−ＨＤＡＣまたはＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴ）のインビトロ合成を駆動した。同時発現実験には、２００マイクロリットル容量の同じ反応液に０．８マイクログラムの標識−ＨＤＡＣ１／２発現プラスミドＤＮＡおよび各６マイクログラムの補因子発現プラスミドＤＮＡを加えた。タンパク質合成段階の完了後、混合実験には２５マイクロリットルのＨＤＡＣ１／２ ＴＮＴ反応液を１００マイクロリットルの補因子ＴＮＴ反応液と混合し、７５マイクロリットルのｍｏｃｋＴＮＴ反応液を加えて最終容量２００マイクロリットルとした。次にサンプルを室温で１０から１５分間インキュベートした。２００マイクロリットルのＨＤＡＣ１／２＋補因子混合物を、製造業者の指示通りに調製した３０マイクロリットルの抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲルに塗布し、Ｍ２−ＩＰバッファ（２０ｍＭのヘペスｐＨ７．９、３００ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１％のトゥイーン２０、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＥＤＴＡ−非含有インヒビターカクテル）中で平衡させた。４℃の回転ホイール上で一夜インキュベーション後、遠心によってゲルマトリックスを回収し、Ｍ２−ＩＰバッファで１回、１５０ｍＭのＫＣｌを含有するＭ２−ＩＰバッファで２回、ＨＤＡＣ ＨＰＬＣ活性化バッファ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中でさらに２回洗浄した。１／５量のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。残りのゲルマトリックスを遠心によって回収し、ＨＰＬＣデアセチラーゼアッセイに使用するために最終容量１００マイクロリットルのＨＤＡＣ活性化バッファ中でインキュベートした。
【００３１】
ＨＤＡＣ ＨＰＬＣ活性アッセイ
１００％ＤＭＳＯ中の２マイクロリットルの被験化合物溶液（５０×）を一定濃度の組換え酵素を含有している１００マイクロリットルのアッセイバッファ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に加えた。室温で１５分間プレインキュベーション後、２００ｕＭの蛍光ヒストンＨ４（ＡｃＫ１６）ペプチド基質のＤＭＳＯプレ希釈溶液（最終濃度：４ｕＭ）を２マイクロリットルの量で添加した［ペプチド基質：Ｍｃａ−ＧＡＫ（ε−Ａｃ）ＲＨＲＫＶ−ＮＨ２ λｅｘ ３２５ｎＭ；λｅｍ ３９３ｎＭ］。デアセチラーゼ反応を室温で４時間行わせ、２０ｕｌの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液の添加によって停止させた。対応する脱アセチル産物に変換されたペプチド基質のパーセンテージは、ＨＰＬＣを使用し、１ｍｌ／分のＨ２Ｏ／５％−４０％アセトニトリルの２４ｍｌ直線勾配、次いで９５％アセトニトリルまでの急勾配（１ｍｌ）、さらに９５％アセトニトリルの３ｍｌ段階で溶出させたＢｅｃｋｍａｎ（４．６ｍｍ×５ｃｍ）Ｃ１８カラム上のＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉクロマトグラフで分析した。
【００３２】
外的に発現された大抵の組換えＨＤＡＣは不活性またはほぼ不活性であることが知見された。逆に、哺乳類細胞中で発現された組換え酵素は、それらの内因性等価物と同様に、それらの活性に影響を与える特異的調節ポリペプチドと相互作用する傾向を有していた。しかしながら大規模ＨＤＡＣ生産に哺乳類細胞を使用する場合の主要な障碍は、タンパク質収率が比較的低いことである。ＨＤＡＣ１／２の酵素活性を観察するためには少なくとも５ｎＭのデアセチラーゼを使用する必要がある。われわれは、ＨＤＡＣ１／２活性がコリプレッサーＭＴＡ−２の存在下に対数オーダで増進されることを知見した。すなわち、ナノモル以下の酵素濃度（０．２５ｎＭ）で適正な基質変換を十分に得ることができるのでアッセイ処理量を大規模化できる。
【００３３】
Ｘ−領域含有タンパク質のアミノ酸配列位置合せ
ＭＴＡ−２、ＣｏＲＥＳＴまたはＭＩ−ＥＲ１由来のＸ−領域のアミノ酸配列を照会コードとして使用しタンパク質配列データベースを探索することによってＸ−領域を含有する他のタンパク質を同定した。結果を図８に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】複合体を抗−ＦＬＡＧ（ＨＤＡＣ３用）または抗−ＧＡＬ４（ＤＡＤ用）で免疫沈降させた。
【図１Ｂ】単一のアセチル化リシンを含有するヒストンＨ４−由来オクタマーペプチド基質と共にインキュベートし、活性をアセチル化基質の変換％として表す。
【図２】ＳＡＮＴモチーフはＣｏＲＥＳＴ、ＭＴＡ−２およびＭＩ−ＥＲ１に存在している。これらのすべてのタンパク質中の相同性がＳＡＮＴに限定されずにＮ−末端に続いており、ＤＡＤ−相同領域をＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとして定義できることを知見した。
【図３】いくつかのＭＴＡ−２欠失突然変異体を構築しＧＡＬ４−ＤＢＤのＣ−末端に融合させた。
【図４】標識−ＨＤＡＣ１と共に同時発現させ、抗−ＦＬＡＧと共に同時免疫沈降させ、ＭＴＡ２突然変異体とＨＤＡＣ１との会合を測定した。
【図５Ａ】同時免疫沈降した同じ複合体をＨ４−由来アセチル化ペプチド基質と共にインキュベートした。全部のサンプルがＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧを最適濃度以下の同じ濃度（０．２５ｎＭ）で含有するように標準化した。
【図５Ｂ】構築物の活性化能力。
【図６】ＧＡＬ４−ＭＴＡ２発現ベクターをＧＡＬ４−依存性リポーター構築物と共に細胞にコトランスフェクトした転写抑制アッセイで確証的な結果が得られた。
【図７】ＨＤＡＣ１および２を全ＭＴＡ−２コリプレッサーと同時精製することによってデアセチラーゼの触媒効率を対数オーダで増進することが可能であった。
【図８】ＭＴＡ−２、ＣｏＲＥＳＴまたはＭＩ−ＥＲ１由来のＸ−領域のアミノ酸配列を照会コードとして使用しタンパク質配列データベースを探索することによってＸ−領域を含有する他のタンパク質を同定した。
【図９】ＧＡＬ ＤＢＤに下線を付けて示し、ＧＳＧＳリンカーを太字で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＤＡＣサブタイプ選択的インヒビターのスクリーニングに好適な高効率のヒストンデアセチラーゼ１／２（ＨＤＡＣ１／２）特異的アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
可逆性ヒストンアセチル化が真核性遺伝子転写の主要調節因子であることは証明されていた。ヒストンテール中のリシン残基は、転写コアクチベーターとして機能するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）によってアセチル化される。ヒストンがアセチル化されると、普通の転写活性化で見られるよりも制限的でないクロマチン構造が生じる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）はＨＡＴによって触媒される反応を逆行させ、抑制的クロマチン構造に導く。３つの主要クラスに所属する多数のＨＤＡＣが同定されている。クラスＩのＨＤＡＣはＨＤＡＣ１、２、３および８を含み、酵母Ｒｐｄ３デアセチラーゼに相同であるが、ＨＤＡＣ４、５、６、７および９を含むクラスＩＩのデアセチラーゼはむしろ酵母Ｈｄａ１に類似している。ＨＤＡＣＩＩはすべての他のサブタイプに比べて類似および差異の双方の特徴が顕著である。ＨＤＡＣの第三のクラスは、活性化のためにＮＡＤ補因子が必要な酵母Ｓｉｒ２サイレンサータンパク質の同族体である。ＨＤＡＣはインビボでは、遺伝子転写を能動的に抑制するためにＤＮＡ結合性タンパク質のターゲットになる長い多タンパク質複合体として機能することが知見されている。
【０００３】
ＨＤＡＣ３は正常にはコリプレッサーＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴとの緊密な化学量論的複合体として存在する。ＨＤＡＣ３の酵素活性にはＳＭＲＴまたはＮ−ＣｏＲが必要であり、これらは、双方のコリプレッサーに存在する２つのＳＡＮＴモチーフの１つを含むＤＡＤドメイン（デアセチラーゼ活性化ドメイン）を介して相互作用しデアセチラーゼを活性化する。ＤＡＤはＮ−末端ＤＡＤ−特異的モチーフとＣ−末端ＳＡＮＴ−様ドメインとを含む。
【０００４】
転写に関与する多くのタンパク質は保存されたＳＡＮＴモチーフを含有しているが、その機能は十分に解明されていない（Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｔｅｋ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１５８−１６３）。組換えＨＤＡＣ３は不活性であり、活性化は（ＨｅＬａ細胞のような）細胞中のデアセチラーゼと補因子ＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとの同時発現、または、ウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いたＨＤＡＣ３およびＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲのインビトロ転写−翻訳によって生じる。
【０００５】
公表された証拠を確認するために、Ｃ−末端標識ＨＤＡＣ３（ＨＤＡＣ３−ＦＬＡＧ）を、Ｎ−ＣｏＲのＤＡＤ領域を含有する［ＤＡＤをＧＡＬ４のＤＮＡ結合性ドメイン（ＧＡＬ４−ＤＢＤ）に融合した］構築物と共に細胞にコトランスフェクトした。また、ＨＤＡＣ３−ＦＬＡＧおよびＧＡＬ４−ＤＡＤを個別に発現させて混合した。複合体を抗−ＦＬＡＧ（ＨＤＡＣ３用）または抗−ＧＡＬ４（ＤＡＤ用）で免疫沈降させ（図１Ａ）、単一のアセチル化リシンを含有するヒストンＨ４−由来オクタマーペプチド基質と共にインキュベートした。活性をアセチル化基質の変換％として表すと（図１Ｂ）、ＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲ ＤＡＤがＨＤＡＣ３の相互作用および活性化に必須であることが確認された。
【０００６】
ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２は共通に８４％の一致を有しており、異なる機能を有しているか否かは判っていないが、転写抑制において相補的な役割を果たすと考えられる。既知のＨＤＡＣ１／２複合体は、転写コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａ（Ｈａｓｓｉｇ，Ｃ．Ａ．，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９７）Ｃｅｌｌ，８９：３４１−３４８）、ＣｏＲＥＳＴ（ＲＥＳＴのコリプレッサー；Ｙｏｕ，Ａ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１４５４−１４５８）、ＭＴＡ−２（ＮｕＲＤ複合体中の転移関連タンパク質２；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｎｇ，Ｈ．−Ｈ．，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，Ｈ．，Ｔｅｍｐｓｔ，Ｐ．，Ｂｉｒｄ，Ａ．ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３：１９２４−１９３５）、ＭＩ−ＥＲ１（中胚葉誘導初期応答１；Ｄｉｎｇ，Ｚ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ Ｐａｔｅｒｎｏ，Ｇ．Ｄ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２３：２５０−２５８）を含有している。
【０００７】
ＳＡＮＴモチーフはＣｏＲＥＳＴ、ＭＴＡ−２およびＭＩ−ＥＲ１に存在している（図２）。われわれは、これらのすべてのタンパク質中の相同性がＳＡＮＴに限定されずにＮ−末端に続いており、ＤＡＤ−相同領域をＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとして定義できることを知見した（図２）。ＨＤＡＣ１／２コリプレッサーは、Ｅｇｌ−２７中の存在が最初に記載されたもう１つの共通ドメインＥＬＭ２に、胚発生中のパターン形成に基本的な役割を果たすセノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含有している（Ｓｏｌａｒｉ，Ｆ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．ａｎｄ Ａｈｒｉｎｇｅｒ，Ｊ．（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６：２４８３−２４９４）．ＥＬＭ２およびＤＡＤの双方を内包するタンパク質のこの部分を図２のＸ−領域で表す（以後の本文中では“Ｘ−領域”と呼ぶ）。ＭＴＡ−２コリプレッサーはまたＮ−末端ドメインＢＡＨ（ブロモ隣接相同；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｇ．Ｈ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｒ．Ｈ．（２００１）Ｇｅｎｅ，２６８：１−７；図３）を有しており、これは遺伝子の転写および抑制に関与する多数のタンパク質中で同定され、タンパク質−タンパク質相互作用に関与している可能性が高い。アミノ酸配列相同に基づいて、Ｘ−領域を含有しているその他の多くのタンパク質、例えば、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２およびＣｏＲＥＳＴ３を同定できる。
【０００８】
ＭＴＡ−２のＳＡＮＴドメインはＨＤＡＣ１への結合に寄与すると考えられ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｇ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｒｕｓｓａｎｏｖａ，Ｖ．Ｒ．，Ｈｉｒａｉ，Ｔ．，Ｑｉｎ，Ｊ．Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：６８１７−６８２４）、ＣｏＲＥＳＴ中のＨＤＡＣ１機能的相互作用に必須であると考えられる（Ｙｏｕ，Ａ．，Ｔｏｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１４５４−１４５８）。また、Ｄｉｎｇらは、ＭＩ−ＥＲ１中でＨＤＡＣ１活性を補強し転写抑制を媒介する原因となるドメインをＥＬＭ２含有領域にマッピングした。彼らの分析は、ＭＩ−ＥＲ１のＳＡＮＴドメインがＨＤＡＣ１との増殖性相互作用に必ずしも必要でないことを示す。
【０００９】
いくつかのＭＴＡ−２欠失突然変異体を構築しＧＡＬ４−ＤＢＤのＣ−末端に融合させた（図３および実験）。標識−ＨＤＡＣ１と共に同時発現させ、抗−ＦＬＡＧと共に同時免疫沈降させ、ＭＴＡ２突然変異体とＨＤＡＣ１との会合を測定した（図４）。
【００１０】
図４に示すように、ＤＡＤ−相同領域もＥＬＭ２ドメインもＨＤＡＣ１へのコリプレッサーの結合に十分ではなかった。これらの実験では、双方のドメインを含む完全Ｘ−領域が相互作用に必要十分であったが、ＢＡＨは必ずしも必要でないと考えられた。
【００１１】
同時免疫沈降した同じ複合体をＨ４−由来アセチル化ペプチド基質と共にインキュベートした。全部のサンプルがＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧを最適濃度以下の同じ濃度（０．２５ｎＭ）で含有するように標準化した（図５Ａ）。この濃度のＨＤＡＣ１は組換えコリプレッサーの非存在下で活性でなかった。酵素活性を観察するためには、少なくとも５ｎＭのＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧの使用が必要であった（図示せず）。
【００１２】
このデータは、全長コリプレッサーＭＴＡ−２がＨＤＡＣ１の最大活性化を与えたことを明らかに示す。３つの個別実験を平均するとバックグラウンドレベル（ＤＢＤ）に対して５倍の活性化が測定された（図５Ａ）。構築物の活性化能力を図５Ｂにまとめる。
【００１３】
ＧＡＬ４−ＭＴＡ２発現ベクターをＧＡＬ４−依存性リポーター構築物と共に細胞にコトランスフェクトした転写抑制アッセイで確証的な結果が得られた（図６）。
【００１４】
ＨＤＡＣインヒビターの存在下で転写が回復したので（結果示さず）、抑制はＨＤＡＣ−依存性であった。これらの実験から以下の結論が得られる：
−ＭＴＡ−２主体のキメラからＳＡＮＴドメインを除去すると、結合、活性化能力および転写抑制機能が低下する；
−ＥＬＭ２ドメインは必須であるがＨＤＡＣ１機能に十分ではない；
−ＨＤＡＣ１の最小活性化ドメインは、ＥＬＭ２およびＤＡＤ−相同領域の双方を内包するＸ−領域である；
−ＨＤＡＣ１の最大活性化は全長ＭＴＡ−２コリプレッサーによって得られる。
【００１５】
ＨＤＡＣ２およびもう１つのコリプレッサーＣｏＲＥＳＴを用いた（いくつかの）反復実験でも同様の結果が得られた。
【００１６】
ＭＴＡ−２コリプレッサーまたはＸ−領域を含有しているそのフラグメントがＨＤＡＣ１および／または２の触媒活性を増強する能力をもつことは新規な知見である。特に、ＨＤＡＣ１および２を全ＭＴＡ−２コリプレッサーと同時精製することによってデアセチラーゼの触媒効率を対数オーダで増進することが可能であった（図７および図示せず）。ＨＤＡＣ１／２の酵素活性を観察するためには少なくとも５ｎＭのデアセチラーゼの使用が必要であるが、コリプレッサーの存在下では０．２５ｎＭの濃度で十分である。これまでに報告されたことのないこの知見は、適切な基質変換を得るためにナノモル以下の酵素濃度で十分なので、ＨＤＡＣサブタイプ選択的インヒビターのスクリーニングに適した高効率のヒストンデアセチラーゼ１および２特異的アッセイの設計が可能になる。
【００１７】
ヒストンデアセチラーゼが細胞増殖の調節に基幹的な役割を果たすことは公知であり、従ってＨＤＡＣの阻害は抗癌治療の重要な手掛かりになる。このためには、少量の酵素でサブタイプ選択的酵素アッセイを設計することが極めて重要である。
【００１８】
図９はＧＡＬ ＤＢＤに下線を付けて示し、ＧＳＧＳリンカーを太字で示す。
【００１９】
従って、本発明の第一の目的は、
（ｉ）ＨＤＡＣ１および／または２酵素を、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質中に見出されまたＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３およびＭＩ−ＥＲ１中にも見出されるＳＡＮＴおよびＥＬＭ２領域を含有するタンパク質と共に、適当なアッセイバッファ中でインキュベートする段階と、
（ｉｉ）有望なＨＤＡＣインヒビターおよび適当な基質を添加してインキュベートする段階と、
（ｉｉｉ）インキュベーションを中止し、推定ＨＤＡＣインヒビターが酵素活性に与えた効果を標準との比較によって定量する段階と、を含むヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ１および／または２インヒビター特異的アッセイを提供することである。
【００２０】
段階（ｉ）のタンパク質は、好ましくは哺乳類細胞中で発現される組換えタンパク質が適切である。該タンパク質は好適には、全長ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３、ＭＩ−ＥＲ１を含有しているか、または、これらのタンパク質の１つと実質的な配列一致（適正には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の配列一致）を有しておりかつＸ−領域（本文中に定義）を含んでいるかもしくはこれらのタンパク質の１つのＸ−領域（本文中に定義）含有フラグメントを含んでいるタンパク質を含有している。好ましくはタンパク質が全長ＭＴＡ−２である。
【００２１】
別の実施態様では、段階（ｉ）のタンパク質が、好ましくは哺乳類細胞中で発現される組換えタンパク質である。該タンパク質は好適には、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１もしくはＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質のＸ−領域またはＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３もはくはＭＩ−ＥＲ１のＸ−領域に実質的な配列一致（適正には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の配列一致）を有しているＸ−領域を含有している。
【００２２】
本発明はさらに、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２と、本質的に全長ＭＴＡ−２またはそのＸ領域含有フラグメントから成るタンパク質とを含有する組換え酵素複合体に関する。
【００２３】
本発明はまた、ＨＤＡＣ１および／またはＨＤＡＣ２および少なくともＸ領域のアミノ酸を発現するように異種ＤＮＡで形質転換させた組換え細胞を提供する。
【００２４】
方法の特定実施態様では、酵素、特に組換え酵素のアリコートがＳＡＮＴおよびＥＬＭ２モチーフを含有するタンパク質と共に提供される。各アリコートがマイクロプレートのウェルに収容されている。ＨＤＡＣインヒビター活性試験の対象となる被験分析液の系列希釈液を細胞収容マイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。方法は場合によっては、既知のＨＤＡＣインヒビターの系列希釈液を陽性対照として含む。ＨＤＡＣインヒビター活性試験の対象となる複数の被験分析液のおのおのを、ＳＡＮＴおよびＥＬＭ２モチーフ含有タンパク質と共に酵素含有マイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。別の実施態様では、複数の分析液の系列希釈液を調製し、細胞収容マイクロタイタープレートの個々のウェルに各希釈液を加える。
【００２５】
以下の実施例は本発明およびその実施方法を説明する。
【実施例】
【００２６】
ＨｅＬａ細胞中の標識−ＨＤＡＣ１／２とＧＡＬ４−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴとの同時発現：一過性トランスフェクション、可溶性抽出物の調製およびアフィニティ精製
ＨｅＬａ細胞への一過性コトランスフェクションには哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ ＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧまたはｐＣＭＶ ＨＤＡＣ２−ＦＬＡＧを、ｐＣＤＮＡ ＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴまたは対応する欠失突然変異体と共に使用した。
【００２７】
リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示通りに使用し、７．５マイクログラムのｐＣＤＮＡ−ＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧまたはｐＣＭＶ−ＨＤＡＣ２−ＦＬＡＧを、７．５マイクログラムのｐＣＤＮＡ−ＧＡＬ４ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴプラスミドＤＮＡと共に、１０７のＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
【００２８】
トランスフェクションの２４時間後、細胞を１×ＰＢＳに収集し、４℃、１５００×ｇで５分間遠心し、１×ＰＢＳで２回洗浄した。遠心後、細胞ペレットを−８０℃で保存した。細胞ペレットを１ｍｌの低張溶解バッファ（２０ｍＭのヘペスｐＨ７．９、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、完全ＥＤＴＡ−非含有プロテアーゼインヒビターカクテル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）に再懸濁させることによって細胞溶解液を調製し、次いで氷上で１５分間インキュベートし、２ｍｌのＤｏｕｎｃｅｒ（Ｂ、２５ストローク）で細胞を破壊し、１５０ｍＭのＫＣｌと０．５％のＮＰ４０とのホモジェネート（等張溶解バッファ：ＩＬＢ）に加えた。サンプルを３０秒間ずつ２回音波処理（出力５／６、デューティサイクル９０、タイマー一定）し、次いで回転ホイール上で４℃で１時間インキュベートすることによって可溶性の全細胞抽出物が得られた。ＳＳ３４ロータに入れ、４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心し、透明上清（可溶性タンパク質抽出物）を収集し、ＢｉｏＲａｄ試薬を使用して全タンパク質濃度を測定した。抽出物中の標識ＨＤＡＣ濃度は、４、８および１６マイクログラムの全タンパク質を４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに８−１６ｎｇの基準タンパク質と共に泳動させ、次いで抗−ＦＬＡＧアルカリホスファターゼ共役モノクローナル抗体（Ｍ２−ＡＰ、Ａ９４６９、ＳＩＧＭＡ）と共にウェスタンブロット分析することによって測定した。同じ抽出物中のＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴキメラタンパク質の発現レベルは、抗−ＧＡＬ４ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−５７７）で顕在化させた同じ免疫ブロットで評価した。
【００２９】
標識ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２を含有する可溶性タンパク質抽出物をＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２またはＣｏＲＥＳＴ変異体のおのおのに組合せて、製造業者の指示通りに調製した抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（Ａ２２２０、ＳＩＧＭＡ）に塗布し、ＩＬＢ中で平衡させた。ゲルマトリックスと可溶性タンパク質抽出物とを混合し（２マイクログラムの標識ＨＤＡＣあたり１０マイクロリットルのゲルマトリックス）、回転ホイール上で４℃で一夜インキュベートした。ゲルマトリックスを遠心によって回収し、ＩＬＢで１回、０．１％ＮＰ−４０含有ＩＬＢで２回、溶出バッファ［５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ−１００、１００ｍＭのＫＣｌ］中でさらに２回洗浄した。１００マイクログラム／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド（Ｆ４７９９、ＳＩＧＭＡ）を含有している１０倍容量の溶出バッファをゲルマトリックスに添加し、次いで室温の回転ホイール上で１時間インキュベートすることによってＨＤＡＣ複合体を溶出させた。遠心によって溶出タンパク質を上清中に収集し、１０、２０および３０ｎｇの定量用基準タンパク質を使用する抗−ＦＬＡＧウェスタンブロット分析によって標識ＨＤＡＣ１／２濃度を測定した。ＨＤＡＣ−結合ＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴ変異体のおのおのの存在は抗−ＧＡＬ４抗体で顕在化させた同じ免疫ブロット上で評価した。
【００３０】
転写−翻訳およびアフィニティ精製の組合せによる標識−ＨＤＡＣ１／２およびＧＡＬ４−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴのインビトロ発現
ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示通りに使用した。混合実験には、１２０マイクロリットルの反応容量に各４マイクログラムの各発現プラスミドＤＮＡを使用して対応タンパク質（標識−ＨＤＡＣまたはＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＭＴＡ２／ＣｏＲＥＳＴ）のインビトロ合成を駆動した。同時発現実験には、２００マイクロリットル容量の同じ反応液に０．８マイクログラムの標識−ＨＤＡＣ１／２発現プラスミドＤＮＡおよび各６マイクログラムの補因子発現プラスミドＤＮＡを加えた。タンパク質合成段階の完了後、混合実験には２５マイクロリットルのＨＤＡＣ１／２ ＴＮＴ反応液を１００マイクロリットルの補因子ＴＮＴ反応液と混合し、７５マイクロリットルのｍｏｃｋＴＮＴ反応液を加えて最終容量２００マイクロリットルとした。次にサンプルを室温で１０から１５分間インキュベートした。２００マイクロリットルのＨＤＡＣ１／２＋補因子混合物を、製造業者の指示通りに調製した３０マイクロリットルの抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲルに塗布し、Ｍ２−ＩＰバッファ（２０ｍＭのヘペスｐＨ７．９、３００ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１％のトゥイーン２０、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＥＤＴＡ−非含有インヒビターカクテル）中で平衡させた。４℃の回転ホイール上で一夜インキュベーション後、遠心によってゲルマトリックスを回収し、Ｍ２−ＩＰバッファで１回、１５０ｍＭのＫＣｌを含有するＭ２−ＩＰバッファで２回、ＨＤＡＣ ＨＰＬＣ活性化バッファ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中でさらに２回洗浄した。１／５量のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。残りのゲルマトリックスを遠心によって回収し、ＨＰＬＣデアセチラーゼアッセイに使用するために最終容量１００マイクロリットルのＨＤＡＣ活性化バッファ中でインキュベートした。
【００３１】
ＨＤＡＣ ＨＰＬＣ活性アッセイ
１００％ＤＭＳＯ中の２マイクロリットルの被験化合物溶液（５０×）を一定濃度の組換え酵素を含有している１００マイクロリットルのアッセイバッファ（５０ｍＭのヘペスｐＨ７．４、５％グリセロール、０．０１％トリトンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に加えた。室温で１５分間プレインキュベーション後、２００ｕＭの蛍光ヒストンＨ４（ＡｃＫ１６）ペプチド基質のＤＭＳＯプレ希釈溶液（最終濃度：４ｕＭ）を２マイクロリットルの量で添加した［ペプチド基質：Ｍｃａ−ＧＡＫ（ε−Ａｃ）ＲＨＲＫＶ−ＮＨ２ λｅｘ ３２５ｎＭ；λｅｍ ３９３ｎＭ］。デアセチラーゼ反応を室温で４時間行わせ、２０ｕｌの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液の添加によって停止させた。対応する脱アセチル産物に変換されたペプチド基質のパーセンテージは、ＨＰＬＣを使用し、１ｍｌ／分のＨ２Ｏ／５％−４０％アセトニトリルの２４ｍｌ直線勾配、次いで９５％アセトニトリルまでの急勾配（１ｍｌ）、さらに９５％アセトニトリルの３ｍｌ段階で溶出させたＢｅｃｋｍａｎ（４．６ｍｍ×５ｃｍ）Ｃ１８カラム上のＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉクロマトグラフで分析した。
【００３２】
外的に発現された大抵の組換えＨＤＡＣは不活性またはほぼ不活性であることが知見された。逆に、哺乳類細胞中で発現された組換え酵素は、それらの内因性等価物と同様に、それらの活性に影響を与える特異的調節ポリペプチドと相互作用する傾向を有していた。しかしながら大規模ＨＤＡＣ生産に哺乳類細胞を使用する場合の主要な障碍は、タンパク質収率が比較的低いことである。ＨＤＡＣ１／２の酵素活性を観察するためには少なくとも５ｎＭのデアセチラーゼを使用する必要がある。われわれは、ＨＤＡＣ１／２活性がコリプレッサーＭＴＡ−２の存在下に対数オーダで増進されることを知見した。すなわち、ナノモル以下の酵素濃度（０．２５ｎＭ）で適正な基質変換を十分に得ることができるのでアッセイ処理量を大規模化できる。
【００３３】
Ｘ−領域含有タンパク質のアミノ酸配列位置合せ
ＭＴＡ−２、ＣｏＲＥＳＴまたはＭＩ−ＥＲ１由来のＸ−領域のアミノ酸配列を照会コードとして使用しタンパク質配列データベースを探索することによってＸ−領域を含有する他のタンパク質を同定した。結果を図８に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】複合体を抗−ＦＬＡＧ（ＨＤＡＣ３用）または抗−ＧＡＬ４（ＤＡＤ用）で免疫沈降させた。
【図１Ｂ】単一のアセチル化リシンを含有するヒストンＨ４−由来オクタマーペプチド基質と共にインキュベートし、活性をアセチル化基質の変換％として表す。
【図２】ＳＡＮＴモチーフはＣｏＲＥＳＴ、ＭＴＡ−２およびＭＩ−ＥＲ１に存在している。これらのすべてのタンパク質中の相同性がＳＡＮＴに限定されずにＮ−末端に続いており、ＤＡＤ−相同領域をＳＭＲＴ／Ｎ−ＣｏＲとして定義できることを知見した。
【図３】いくつかのＭＴＡ−２欠失突然変異体を構築しＧＡＬ４−ＤＢＤのＣ−末端に融合させた。
【図４】標識−ＨＤＡＣ１と共に同時発現させ、抗−ＦＬＡＧと共に同時免疫沈降させ、ＭＴＡ２突然変異体とＨＤＡＣ１との会合を測定した。
【図５Ａ】同時免疫沈降した同じ複合体をＨ４−由来アセチル化ペプチド基質と共にインキュベートした。全部のサンプルがＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧを最適濃度以下の同じ濃度（０．２５ｎＭ）で含有するように標準化した。
【図５Ｂ】構築物の活性化能力。
【図６】ＧＡＬ４−ＭＴＡ２発現ベクターをＧＡＬ４−依存性リポーター構築物と共に細胞にコトランスフェクトした転写抑制アッセイで確証的な結果が得られた。
【図７】ＨＤＡＣ１および２を全ＭＴＡ−２コリプレッサーと同時精製することによってデアセチラーゼの触媒効率を対数オーダで増進することが可能であった。
【図８】ＭＴＡ−２、ＣｏＲＥＳＴまたはＭＩ−ＥＲ１由来のＸ−領域のアミノ酸配列を照会コードとして使用しタンパク質配列データベースを探索することによってＸ−領域を含有する他のタンパク質を同定した。
【図９】ＧＡＬ ＤＢＤに下線を付けて示し、ＧＳＧＳリンカーを太字で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＨＤＡＣ１および／または２酵素を、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質中に見出されまたＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３およびＭＩ−ＥＲ１中にも見出されるＳＡＮＴおよびＥＬＭ２領域を含有するタンパク質と共に、適当なアッセイバッファ中でインキュベートする段階と、
（ｉｉ）有望なＨＤＡＣインヒビターおよび適当な基質を添加してインキュベートする段階と、
（ｉｉｉ）インキュベーションを中止し、推定ＨＤＡＣインヒビターが酵素活性に与えた効果を標準との比較によって定量する段階と、を含むヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ１および／または２インヒビター特異的アッセイ。
【請求項２】
段階（ｉ）のタンパク質が、全長ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３、ＭＩ−ＥＲ１を含有するか、または、これらのタンパク質の１つに少なくとも８０％の配列一致を有しておりかつＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含むタンパク質を含有している請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
段階（ｉ）のタンパク質が全長ＭＴＡ−２である請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２と全長ＭＴＡ−２またはＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含有するそのフラグメントとを含む再構築酵素複合体。
【請求項５】
ＨＤＡＣ１および／またはＨＤＡＣ２とＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含むタンパク質とをコードする異種ＤＮＡで形質転換された組換え細胞。
【請求項１】
（ｉ）ＨＤＡＣ１および／または２酵素を、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−３のようなＭＴＡタンパク質中に見出されまたＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３およびＭＩ−ＥＲ１中にも見出されるＳＡＮＴおよびＥＬＭ２領域を含有するタンパク質と共に、適当なアッセイバッファ中でインキュベートする段階と、
（ｉｉ）有望なＨＤＡＣインヒビターおよび適当な基質を添加してインキュベートする段階と、
（ｉｉｉ）インキュベーションを中止し、推定ＨＤＡＣインヒビターが酵素活性に与えた効果を標準との比較によって定量する段階と、を含むヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ１および／または２インヒビター特異的アッセイ。
【請求項２】
段階（ｉ）のタンパク質が、全長ＭＴＡ−１、ＭＴＡ−２、ＭＴＡ−３、ＣｏＲＥＳＴ、ＣｏＲＥＳＴ２、ＣｏＲＥＳＴ３、ＭＩ−ＥＲ１を含有するか、または、これらのタンパク質の１つに少なくとも８０％の配列一致を有しておりかつＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含むタンパク質を含有している請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
段階（ｉ）のタンパク質が全長ＭＴＡ−２である請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２と全長ＭＴＡ−２またはＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含有するそのフラグメントとを含む再構築酵素複合体。
【請求項５】
ＨＤＡＣ１および／またはＨＤＡＣ２とＥＬＭ２およびＤＡＤ領域を含むタンパク質とをコードする異種ＤＮＡで形質転換された組換え細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５１３１２２（Ｐ２００９−５１３１２２Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３７１０４（Ｐ２００８−５３７１０４）
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７８３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８８３０
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７８３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８８３０
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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