ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子座の修飾のための方法および組成物
ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードするゲノムＤＮＡの標的切断による、ＧＲ遺伝子の不活性化のための方法および組成物を本明細書で開示する。かかる方法および組成物は、例えば、グルココルチコイド処置中に免疫機能の保持を必要とする治療用途で有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年１１月１３日出願の米国暫定出願第６０／８５９，０２５号、２００６年１１月１５日出願の米国暫定出願第６０／８５９，４１７号、および２００７年９月７日出願の米国暫定出願第６０／９６７，８２０号の利益を請求し、その開示の全ては、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた発明の権利の記載
【０００２】
本開示は、標的突然変異生成、標的ゲノム組み込み、および標的組み換えを含む、免疫学、免疫系変調、およびゲノム修飾の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、身体のほぼ全ての細胞中で発現される。コルチゾール等のグルココルチコイドホルモンの結合時に、受容体は、細胞核に転座され、一式の組織特異的な標的遺伝子を活性化する。組織によってＧＲ標的遺伝子が異なるという事実は、異なる組織におけるＧＲ効果の多面的パターンをもたらす。
【０００４】
グルココルチコイドホルモンの生理的作用の多くが医学的関心であり、臨床的介入の潜在的分野を提示する。例えば、クッシング症候群では、過剰なＧＲ活性が高血圧につながる。脳では、ＧＲ経路の異常は、うつ病および気分障害に結び付けられており、肺では、そのような異常は、喘息および慢性気道疾患と関連している。
【０００５】
グルココルチコイドホルモンの最もよく特徴付けられた臨床活性の１つは、免疫抑制効果による、消炎作用である。グルココルチコイドホルモンへのＴ細胞の暴露は、Ｔ細胞アネルギーにつながり、Ｔ細胞活性化を妨害する。最近の概説については、Ｒｈｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（１６）：１７１１−２３を参照されたい。グルココルチコイドによる長期的治療は、糖尿病および骨粗鬆症のような重篤な副作用につながる。Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２６（３）：４５２−６４の考察を参照されたい。さらに、免疫系全体の抑制は、潜在ウイルスの再活性化につながり得るものであり（Ｒｅｉｎｋｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １（３）：１５７−６４を参照されたい）、免疫療法の方法、例えば、患者への有益な免疫細胞の一部の送達を妨害する。
【０００６】
細胞の一部、例えば、特徴付けられたＴ細胞群における、ＧＲ機能の選択的崩壊を可能にする方法が利用可能であれば、グルココルチコイド処置を伴うＧＲ過剰活性化と関連する問題の多くを解決することができる。１つのそのような方法は、ＧＲをコードする遺伝子の配列を変更することであろう。確かに、ゲノム中の特定の場所でＤＮＡ配列を操作する（すなわち、編集する）能力は、ここしばらくヒトゲノム生物学の主要な目標となっている。種々の技術がこの目的で以前に試験されてきたが、これらの方法でゲノム修飾が達成される頻度は、治療用途にとっては概して低すぎるものとなっている。例えば、Ｙａｎｅｚ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（２）：１４９−１５９を参照されたい。
【０００７】
ゲノム編集の別の重要な用途は、ゲノムへの臨床的有用な導入遺伝子の挿入である。しかしながら、あらゆるゲノム編集方法の決定的要件は、それが規定の場所への標的化挿入を可能にすることである。治療用導入遺伝子の正確に標的化された組み込みの要件の重要性は、Ｘ連鎖ＳＣＩＤの治療に対する臨床試験において、ヒト遺伝子療法に使用される導入遺伝子の無作為な組み込みが、場合によっては、標的細胞の発癌性形質転換につながった挿入突然変異をもたらしたという最近の観察によって、強調されている。Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６４４）：４１５−９．
【０００８】
ゲノムＤＮＡの標的切断のための様々な方法および組成物が説明されている。そのような標的切断事象は、例えば、標的化突然変異生成を誘導する、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導する、および所定の染色体座での標的化組み換えを促進するために使用することができる。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第ＵＳ ２００３／０２３２４１０号（２００３年１２月１８日）、第ＵＳ ２００５／００２６１５７号（２００５年２月３日）、第ＵＳ ２００５／００６４４７４号（２００５年３月２４日）、第ＵＳ ２００５／０２０８４８９号（２００５年９月２２日）、および第ＵＳ ２００６／０１８８９８７号（２００６年８月２４日）を参照されたい。外来性配列の標的化組み込みもまた、達成することができる。その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願整理番号第１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日出願）を参照されたい。また、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号（２００５年９月１５日）も参照されたい。
【０００９】
しかしながら、ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の特異的切断のため、およびＧＲ遺伝子の修飾による免疫機能の変調のための方法および組成物は、これまで記載されていない。
【発明の概要】
【００１０】
グルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードするヒト遺伝子のヌクレオチド配列の変異のための方法および組成物を本明細書で開示する。ある実施形態では、ヒトＧＲ遺伝子の配列の変異は、ＧＲ機能を不活性化する。
【００１１】
前記方法は、ＧＲ遺伝子における配列の２本鎖切断を触媒する、ヒトＧＲ遺伝子を標的とする１対の亜鉛フィンガーヌクレアーゼの細胞中の発現を含む。亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、標的配列および切断半ドメインを結合するように遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを備える、融合タンパク質である。細胞中の亜鉛フィンガーヌクレアーゼの発現は、ヌクレアーゼ自体、ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡの、細胞への導入によって達成することができる。ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、ＧＲ遺伝子中の標的部位へ結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを備える。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの遺伝子操作は、標的ヌクレオチド配列を結合するために必要とされる亜鉛フィンガーのアミノ酸配列の決定（コンピュータまたは経験的手段によって達成され得る）、および所望のアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の構築を含む。
【００１２】
ヒトＧＲ遺伝子を標的とする、例示的な遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを表２に示し、それらの標的配列を表１に示す。したがって、本開示は、ヒトＧＲ遺伝子中の任意の部位を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼと、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを提供する。前述の亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドを備える細胞、例えば、単離細胞、一次細胞または培養液中の細胞のいずれかも、提供される。
【００１３】
ある実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによるヒトＧＲ遺伝子の標的切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因する配列変異を誘導する。付加的な実施形態では、２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼが細胞中で発現され、ドナーポリヌクレオチドが細胞に導入される。ドナーポリヌクレオチドは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによって作成される２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを含有する。ドナーポリヌクレオチドは、任意で、例えば、キメラＴ細胞容体等の導入遺伝子を備え得る、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列を含有する。
【００１４】
本明細書に記載されるような、ＧＲ遺伝子の一次ヌクレオチド配列を変更することによる、ＧＲ機能の不活性化は、種々の用途でＧＲ介在性免疫抑制を防止するために使用することができる。
【００１５】
一態様では、（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）切断半ドメインとを備える、融合タンパク質を、本明細書で提供する。ある実施形態では、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える。本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００１６】
別の態様では、本開示は、細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップを含む方法を提供し、各融合タンパク質は、該融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）切断半ドメインとを備える。ある実施形態では、融合タンパク質の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える。本明細書に記載される方法のいずれかは、ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップをさらに含んでもよく、該ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える。任意で、ポリヌクレオチドは、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列（例えば、修飾受容体等の導入遺伝子）をさらに備え得る。その上、前記方法のうちのいずれかは、グルココルチコイド介在性免疫抑制および／またはＴ細胞アネルギーを防止し得る。
【００１７】
さらに別の態様では、本開示は、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択する方法を提供する。前記方法は、ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を引き起こすように本明細書に記載されるようなＺＦＮを発現するステップと、ドナーポリヌクレオチド（ＧＲ相同性アームと、外来性配列とを備える）を細胞に導入するステップとを含む。次いで、正常量のＧＲを発現する細胞を破壊する、コルチコステロイドの存在位下で細胞を増殖させることによって、ドナーポリヌクレオチドがＧＲ遺伝子に挿入されている細胞が選択される。「コルチコステロイド」という用語は、コルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン、およびアルドステロン等の自然発生ステロイドホルモンを含む。前記用語はまた、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、フルドロコルチゾン（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）（フロリネフ（Ｆｌｏｒｉｎｅｆ）（登録商標））等を含む、コルチコステロイド様効果を有する合成薬剤も含む。ある実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。前記方法のうちのいずれかでは、外来性配列は、導入遺伝子（関心のポリペプチドをコードする配列）を備え得る。あるいは、外来性配列は、非コード配列であり得る。
【００１８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかでは、ＺＦＮは、ウイルス送達ベクター、例えば、複製欠損ウイルスベクター、を使用して発現される。ある実施形態では、ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである。
【００１９】
したがって、本開示は、次の実施形態を含むが、それらに限定されない。
１．細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、
１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップを含み、
各融合タンパク質は、融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、方法。
２．融合タンパク質の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える、１に記載の方法。
３．ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップをさらに含み、ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、１に記載の方法。
４．ポリヌクレオチドは、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列をさらに備える、３に記載の方法。
５．外来性配列は、導入遺伝子を備える、４に記載の方法。
【００２０】
６．導入遺伝子は、修飾受容体をコードする、５に記載の方法。
７．ＧＲ機能の不活性化は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を防止する、１に記載の方法。
８．ＧＲ機能の不活性化は、Ｔ細胞アネルギーを防止する、１に記載の方法。
９．
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、融合タンパク質。
１０．亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える、９に記載の融合タンパク質。
【００２１】
１１．９に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
１２．発現するステップは、細胞をウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、１に記載の方法。
１３．ベクターは、複製欠損である、１２に記載の方法。
１４．ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、１２に記載の方法。
１５．ＧＲ遺伝子中に外来性配列を備える細胞を選択する方法であって、
１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、各融合タンパク質は、融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、ステップと、
ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップであって、ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、ステップと、
ＧＲ遺伝子中に外来性配列を備えない細胞が破壊されるような条件下で、該細胞を天然または合成コルチコステロイドで処置することにより、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択するステップと、
を含む、方法。
【００２２】
１６．コルチコステロイドは、合成である、１５に記載の方法。
１７．コルチコステロイドは、デキサメタゾンである、１６に記載の方法。
１８．外来性配列は、導入遺伝子を備える、１５に記載の方法。
１９．発現するステップは、細胞をウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、１５に記載の方法。
２０．ベクターは、複製欠損である、１９に記載の方法。
２１．ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、例示的プラスミド構築物の概略図である。「ＣＭＶプロモータ」は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータを意味し、「ＺＦＮ」は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする配列（例えば、切断半ドメインに融合される亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン）を意味し、「ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ」は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化信号を意味し、「ＳＶ４０プロモータ」は、シミアンウイルス４０からの主要プロモータを意味し、「ＮｅｏＲ」は、ネオマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレームを意味し、「ＳＶ４０ ｐＡ」は、シミアンウイルス４０の主要転写単位からのポリアデニル化信号を意味し、「ＣｏＩＥｌ」はコリシンＥ１からの複製起点を意味し、「ＡｍｐＲ」は、アンピシリン耐性をコードするβラクタマーゼ遺伝子を意味する。
【図２】２つの異なる亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、例示的プラスミド構築物の概略図である。次の追加を伴って、略称は図１と同じである。「２Ａ」は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）リボソームスタッタリングシグナルを意味し、「ＫａｎＲ」は、カナマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレームを意味し、「ｐＵＣ ｏｒｉ」は、ｐＵＣ １９プラスミドからの複製起点を意味する。
【図３】パネルＡおよびＢは、造血細胞中（Ｋ５６２）のＧＲ遺伝子座中のＺＦＮによる切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。図３Ａは、エクソン３における切断の分析を示し、図３Ｂは、エクソン６における切断の分析を示す。１０％アクリルアミドゲルのエチジウムブロマイド染色を示す。
【図４】パネルＡおよびＢは、ＧＲ遺伝子座へのゼタカイン導入遺伝子のＺＦＮ介在性標的化組み込みを示す図である。 デキサメタゾンの存在下または不在下でＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナーＺＦＮ構築物を形質移入されたＣＥＭ１４細胞のＰＣＲ分析を示す図である。「＋」があるレーンは、デキサメタゾンで処置された細胞を示し、「−」があるレーンは、デキサメタゾンで処置されていない多細胞を示す。「Ｍ」は、マーカレーンを示し、「ｕｎ」は、非形質移入細胞を示し、「ゼタカイン」は、ＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナー構築物を形質移入された細胞を示し、「ｐ．ｃ．」は、陽性対照を示し、「ｎ．ｃ．」は、陰性対照を示す。 図４（Ｂ）において、ＳｅｘＡ１で消化されたＣＥＭ １４ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す図である。「Ｍ」は、マーカレーンを示し、「ｕｎ」は、デキサメタゾンで処置された非形質移入細胞を示し、「ゼタカイン」は、ＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナー構築物を形質移入され、デキサメタゾンで処置された細胞を示す。また、矢印により、１．６ｋｂマーカ帯域、野生型５．２ｋｂ帯域、および組み込まれたゼタカイン導入遺伝子（ＴＩ）を表す２．０ｋｂ帯域も示す。
【図５】ヒトグルココルチコイド受容体に対する抗体で調査された、タンパク質ブロットの化学発光像を示す図である。「ＣＥＭ １４」は、非形質移入細胞を意味し、「ＺＦＮ」は、ＧＲ遺伝子のエクソン３を標的とする２つのＺＦＮをコードする配列、ゼタカインカセットを含有する配列、およびＧＲ遺伝子と相同の配列を含有するプラスミドが形質移入されていたＣＥＭ１４細胞を意味する。全長および短縮ＧＲタンパク質に対応する帯域を写真の左側に示す。
【図６】ＣＤ−８＋Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子座のエクソン３中のＺＦＮによる切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。１０％アクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。略称は次の通りである。「ｕｎ」は、非形質移入細胞を意味し、「ＧＦＰ」は、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを形質移入された細胞を意味する。形質移入細胞中に発現される亜鉛フィンガーヌクレアーゼの亜鉛フィンガー部分の同一性を、２つの最右レーンの上側に示す。詳細については、表１および２を参照されたい。
【図７】パネルＡおよびＢは、デキサメタゾンによる処置の前（図７Ａ）および後（図７Ｂ）の、ＣＤ−８＋Ｔ細胞中のＺＦＮによるＧＲ切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。「ＺＦＮ−１０」は、１０の感染の多重度（ｍｏｉ）でＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＺＦＮ−３０」は、３０のｍｏｉでＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＺＦＮ−１００」は、１００のｍｏｉでＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＧＦＰ」は、１００のｍｏｉで緑色蛍光タンパク質をコードする対照Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスを形質移入された細胞を意味する。修飾頻度（割合）を様々なレーンの下に示す。
【図８】８日間の１０−４Ｍデキサメタゾンによる第２の処置の前および後に細胞の生存を比較することによって決定されるような、実施例７に記載されるＣＤ８＋細胞プールのグルココルチコイド耐性を表すグラフである。
【図９】パネルＡおよびＢは、２つの別個の実験からのＧＲタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。パネルＡは、実施例７に記載されるＣＤ８＋細胞プールから、ウイルス形質導入に使用されたゼタカイン発現ＣＤ８＋細胞プール（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）から、およびＺＦＮ １００プールのサブクローン（「１０Ａ１」）から抽出されたタンパク質の結果を示す。各パネルを調査するために使用された抗体をブロットの左側に列挙する。ＴＦＩＩＢ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を、負荷対照として使用した。ＧＲ抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。パネルＢは、ＧＲ−ＺＦＮ発現Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスで処置されたＣＭＶへの特異性を伴うＣＤ８＋細胞の様々なサブクローンにおけるＧＲタンパク質レベルを示す。クローン名をレーンの上側に示し、「模擬」は、模擬の感染した開始ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋細胞プールを指す。
【図１０】パネルＡからＤは、指示遺伝子の発現に対する、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。パネルＡは、ＩκＢαの発現を示し、パネルＢは、ＧＩＬＺの発現を示し、パネルＣは、ＭＫＰ−１の発現を示し、パネルＥは、ＩＦＮγの発現を示す。試験されたサンプルをバーの下に示し、サンプルは未処置（「ｕｎ」）またはデキサメタゾンで２０時間処置された（「ｄｅｘ」）のいずれかであった。
【図１１】グリオーマ細胞による刺激時のＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γサイトカイン放出を表すグラフである。ＣＤ８＋Ｔ細胞プールをバーの下に示す。「Ｄｅｘ」とは、１０−６Ｍデキサメタゾンで処置された細胞を指す。「Ｕ８７ＭＧ」とは、グリア芽腫刺激細胞の存在下で培養された細胞を指す。
【図１２】パネルＡからＥは、対照およびＧＲ−ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用したクロム放出アッセイの結果を表すグラフである。使用された細胞を各グラフの上側に記述する。サンプルは、様々なエフェクタ：標的比で右側に示される標的細胞株を使用して、得た。クロム放出の割合を、各データ点について、エフェクタ：標的比に対して描画する。
【図１３】パネルＡからＣは、ルシフェラーゼ標的Ｕ８７ＭＧ細胞を使用した、同所性グリア芽腫マウスモデルにおける腫瘍細胞から放出された光子を表すグラフである。パネルＡは、指示動物へのＰＢＳ対照注入からの光子放出を示す。パネルＢは、ＧＦＰ１００対照を注入された動物からの光子放出を示す。パネルＣは、ＺＦＮ１００（ｍｏｉ １００でのＧＲ標的化ＺＦＮ）を注入された動物からの光子放出を示す。
【図１４】パネルＡからＤは、グルココルチコイドホルモンの投与の存在または非存在下で、同所性マウスグリア芽腫モデルにおける腫瘍細胞から放出された光子を表すグラフである。図１４Ａおよび１４Ｂは、デキサメタゾンの非存在（図１４Ａ）および存在（図１４Ｂ）下でのＰＢＳ対照注入からの光子放出を示す。図１４Ｃおよび１４Ｄは、デキサメタゾンの非存在（図１４Ｃ）または存在（図１４Ｄ）下で、腫瘍細胞にＺＦＮ処置クローン１０Ａ１を注入した後のマウスの腫瘍細胞からの光子放出を示す。
【図１５】ＳＥＬＥＸによる個別亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合特異性を決定するための実験的概要を表す、概略図である。ビオチン化抗ＨＡ Ｆａｂ抗体断片の存在下で、赤血球凝集素で標識されたＺＦＮを無作為化ＤＮＡ配列のプールによりインキュベートした。標識されたＺＦＮ−ＤＮＡ複合体をストレプトアビジン被覆電磁ビーズで捕獲し、結合ＤＮＡを解放し、ＰＣＲによって増幅した。開始配列として以前に溶出および増幅したＤＮＡのプールを使用して、このプロセスを３回反復した。４回目の反復後、溶出したＤＮＡ断片を配列決定し、コンセンサス配列を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書では「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」と呼ばれる、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメイン（または切断半ドメイン）とを備える、融合タンパク質を利用して、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードする遺伝子の一次配列を変更するのに有用な組成物および方法を本明細書で開示する。そのような配列変異は、ヒトＧＲ機能の不活性化をもたらすことができる。当該分野で公知のように、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択方法によって、または合理的設計の技術を使用することによって、選択した任意の標的ＤＮＡ配列を結合するように遺伝子操作することができる。転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む、様々な種類の機能ドメインへの、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの融合もまた、記載されている。例えば、その開示が、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号および第６，９３３，１１３号、ならびに米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい。したがって、選択した配列に対する切断特異性を有する、カスタムエンドヌクレアーゼである切断ドメイン（すなわち、２本鎖ＤＮＡを切断する能力があるポリペプチドドメイン）としても知られる、ヌクレアーゼドメインへの、遺伝子操作されている亜鉛フィンガー結合ドメインの融合を構築することができる。ある実施形態では、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、「切断半ドメイン」（すなわち、二量化されると、２本鎖ＤＮＡ切断活性を保有する、ポリペプチドドメイン）に融合され、１対のそのような融合タンパク質は、標的化ＤＮＡ切断に使用される。
【００２５】
ゲノムＤＮＡの切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）として知られる、細胞修復機構の誘導をもたらすことができる。切断されたＤＮＡ末端を再接合するプロセスにおいて、ＮＨＥＪはしばしば、ＤＮＡ切断の部位で、またはその周囲で、突然変異を配列に導入する。修復プロセスのエラーが発生しやすい性質は、エラーが発生しやすい修復が標的配列の変異を引き起こすまで標的配列を引き続き結合および切断する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの能力と一体になって、切断の部位またはその付近で、突然変異の蓄積を高頻度でもたらす。したがって、標的切断の部位またはその付近で、配列変化（すなわち、突然変異）を誘導するために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによる内因性ゲノムＤＮＡ配列の標的切断を使用することができる。ヌクレオチド配列のそのような変化がタンパク質をコードするゲノムの領域で生じた場合、それらは通常、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変異をもたらす。例えば、リーディングフレームの変異は、早期の翻訳終結により、短縮タンパク質の産生をもたらすことができる。あるいは、誤ったアミノ酸がコードされる場合がある。いずれにしても、非機能性ポリペプチドが産生される。ＮＨＥＪ後の配列変異の付加的な結果は、変異配列によってコードされるｍＲＮＡのナンセンス変異による崩壊である。したがって、選択した遺伝子の機能を不活性化するために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用する標的化ＤＮＡ切断を使用することができる。不活性化は、両方の対立遺伝子の突然変異生成、または単一の対立遺伝子の突然変異生成のいずれかによって達成され、ドミナントネガティブ変異タンパク質を生成することができる。
【００２６】
内因性染色体ＤＮＡ中の所定部位での標的切断はまた、相同指向性および相同独立性両方の機構によって、切断の部位またはその付近での外来性配列の組み込みを促進するためにも、使用することができる。相同依存性組み込みに対しては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼに加えて、標的切断部位の両側にゲノム配列と相同な配列を含有する、「ドナー配列」が、細胞に提供される。そのようなドナー配列はまた、標的切断部位の付近にあり、任意で２列の相同配列間に配置される、ゲノム配列と非相同である配列も含有することができる。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号（２００５年３月２４日）、および米国特許出願第１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日）を参照されたい。外来性配列の組み込みが、両方の対立遺伝子において遺伝子の転写領域内で生じた場合、遺伝子の不活性化が起こり得る。最終的に、内因性染色体ＤＮＡ中の２つ以上の部位での標的切断は、切断部位間のゲノム配列の欠失をもたらすことができる。その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００６−０１８８９８７号（２００６年８月２４日）を参照されたい。したがって、遺伝子機能は、先述の機能のいずれかによって不活性化することができ、その全ては、１つ以上の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを伴う内因性染色体ＤＮＡの標的切断に依存する。
【００２７】
本開示は、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子を突然変異させるための方法および組成物を提供する。そのような突然変異は、ＧＲ機能の損失を引き起こし、対象の免疫機能の変調をもたらすことができる。ある実施形態では、ＧＲ遺伝子の突然変異は、ヒトＧＲ遺伝子座への外来性配列の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ介在性組み込みに起因する。付加的な実施形態では、外来性配列は、修飾受容体分子をコードする配列を備える。
【００２８】
本明細書で開示される方法および組成物は、特定細胞群におけるグルココルチコイド受容体機能の永久撤廃を可能にする。このことは、例えば、患者に特定の免疫反応を生じさせることが可能な免疫細胞の一部を保持することを可能にしながら、それらの患者を免疫抑制グルココルチコイドホルモンで処置することを可能にする。
【００２９】
治療的導入遺伝子に対する規定の組み込み部位としてのＧＲ遺伝子座の使用を促進する、方法および組成物も提供する。
【００３０】
概略
この方法の実践、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、染色質構造分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、および当該技術分野内であるような関連分野における、従来技術を採用する。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７および定期的更新、ならびにシリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照されたい。
【００３１】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互交換可能に使用され、線形または円形配座、かつ１本鎖または２本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的として解釈されない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸塩部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定ヌクレオチドの類似体には、同じ塩基対合特異性があり、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する自然発生アミノ酸の化学類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも該当する。
【００３３】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は概して、１０−６ Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強さを指し、増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関性がある。
【００３４】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自身に（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するように）結合することができ、および／または、１つ、または複数の異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有することができる。
【００３５】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーを通した配列特異的な様式でＤＮＡを結合する、タンパク質、またはより大型のタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語はしばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３６】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。亜鉛フィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、設計／組成が主に合理的基準に起因する、自然に発生しないタンパク質である。設計の合理的基準は、置換法則、および既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、および第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５８号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５９号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０６０号、国際公開第特許 ０２／０１６５３６号、および国際特許公開第ＷＯ ０３／０１６４９６号も参照されたい。
【００３７】
「選択した」亜鉛フィンガータンパク質は、産生が主にファージ提示法、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の経験的プロセスに起因する、自然にないタンパク質である。例えば、米国特許第ＵＳ ５，７８９，５３８号、第ＵＳ ５，９２５，５２３号、第ＵＳ ６，００７，９８８号、第ＵＳ ６，０１３，４５３号、第ＵＳ ６，２００，７５９号、国際特許公開第ＷＯ ９５／１９４３１号、国際特許公開第ＷＯ ９６／０６１６６号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５４３１１号、国際特許公開第ＷＯ ００／２７８７８号、国際特許公開第ＷＯ ０１／６０９７０号、国際特許公開第ＷＯ ０１／８８１９７号、および国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００３８】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡとなり得て、線形、円形、または分岐となり得て、１本鎖または２本鎖のいずれかとなり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、長さが約２から１０，０００のヌクレオチドの間（またはその間あるいはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、長さが約１００から１，０００のヌクレオチドの間（またはその間の任意の整数値）、より好ましくは、長さが約２００から５００のヌクレオチドの間となり得る。
【００３９】
「相同、非相同配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は、第２の配列とは同一ではない、第１の配列を指す。例えば、変異遺伝子の野生型配列を備えるポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列と相同であり、非同一である。ある実施形態では、２つの配列間の相同性の程度は、正常な細胞機構を利用して、その間の相同組み換えを可能にするのに十分である。２つの相同な非同一配列は、任意の長さとなり得て、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドほども小さく（例えば、標的化相同組み換えによる、ゲノム点突然変異の補正のため）、または１０キロベース以上ほども大きくなり得る（例えば、染色体中の所定の異所での遺伝子の挿入のため）。相同な非同一配列を備える２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０から１０，０００の間のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【００４０】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で公知である。典型的に、そのような技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定するステップ、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定するステップ、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較するステップを含む。ゲノム配列もまた、このように決定および比較することができる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性率を決定することによって比較することができる。核酸またはアミノ酸配列にかかわらず、２つの配列の同一性率は、２つの整列された配列間の完全適合の数を、より短い配列の長さで除し、１００を乗じたものである。核酸配列の近似整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化された、採点マトリクスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性率を決定する、このアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションでＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法の既定パラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）に記載されている。本開示との関連で同一性率を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ． Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ． Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によって頒布される、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権がある、プログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用するものである。このパッケージ一式からＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用することができ、初期設定パラメータが採点表（例えば、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが１、およびギャップが６）に使用される。生成されるデータから、「適合」値は、配列同一性を反映する。同一性率または配列間の類似性を計算するための他の適切なプログラムが、当該技術分野で概して公知であり、例えば、別の整列プログラムは、初期設定パラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のような既定パラメータを使用して、使用することができる。遺伝子コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予期＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、表記＝５０配列、並び替え＝高スコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見ることができる。本明細書に記載される配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８０％から１００％、およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性率は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００４１】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定した２本鎖を形成した後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定を可能にする条件下で、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して決定されるように、分子の規定の長さに対して少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％配列同一性を呈する時に、相互に実質的に相同である。本明細書で使用されるような、「実質的に相同」もまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列への完全同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定システムに対して定義されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で識別することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義するステップは、当該技術分野の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記参照、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００４２】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションを次のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的同一核酸配列は、標的分子への完全同一配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用して評価することができる。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで様々である条件を使用して、行うことができる。低ストリンジェンシーの条件が採用される場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性の部分的な程度さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して、評価することができるため、非特異的結合事象がない場合、二次調査は標的にハイブリッド形成しない。
【００４３】
ハイブリダイゼーションを用いた検出システムを利用する時、参照核酸配列に補完的な核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列は、選択的に互いにハイブリッド形成または結合して、２本鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的に参照配列をハイブリッド形成することが可能な核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列との少なくとも約７０％配列同一性を有する、長さが少なくとも約１０〜１４のヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下で、ハイブリッド形成する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列との少なくとも約９０〜９５％配列同一性を有する、長さが少なくとも約１０〜１４のヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で公知のように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００４４】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が不適合ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を疎外する程度を指し、より高いストリンジェンシーは、不適合ハイブリッドに対するより低い耐性と相関性がある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、それらに限定されない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増加される。
【００４５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬の有無（例えば、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度、および時間パラメータといった因子を変えることによって、ならびに洗浄条件を変えることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために無数の同等な条件を採用できることが、当該技術分野で周知である。特定の一式のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００４６】
「組み換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的で、「相同組み換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞における２本鎖切断の修復中に行われる、そのような交換の特殊形態を指す。このプロセスは、ドナーから標的への遺伝情報の転送につながるため、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験したもの）のテンプレート修復のために「ドナー」分子を使用し、「非交差遺伝子変換」または「短経路遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、そのような転送は、破壊標的とドナーとの間に形成するヘテロ２本鎖ＤＮＡの不適合補正、および／または、ドナーが標的の一部となる遺伝子情報を再合成するために使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴うことができる。そのような特殊ＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変異をもたらす。
【００４７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素または化学的加水分解を含むがそれに限定されない、種々の方法によって開始することができる。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能であり、２つの異なる１本鎖切断事象の結果として２本鎖切断を生じることができる。ＤＮＡ切断は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの産生をもたらすことができる。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化２本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【００４８】
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断に対する触媒活性を保有する、１つ以上のポリペプチド配列を備える。切断ドメインは、単一ポリペプチド鎖に含有することができ、または切断活性は、２つ（以上）のポリペプチドの関連に起因することができる。「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるか、または異なるかのいずれか）と併せて、切断活性（好ましく２本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。「第１および第２の切断半ドメイン」、「＋および−切断半ドメイン」、および「右および左切断半ドメイン」という用語は、二量化する切断半ドメイン対を指すために、相互交換可能に使用される。
【００４９】
「遺伝子操作されている切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の遺伝子操作切断半ドメイン）との偏性ヘテロ二量体を形成するよう修飾されている、切断半ドメインである。参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許公報第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号、米国暫定出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）も参照されたい。
【００５０】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを備える核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を備える。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のうちの２つずつを備える八量体と関連する、ＤＮＡの約１５０の塩基対を備え、（有機体に応じて様々な長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概してリンカーＤＮＡと関連する。本開示の目的で、「クロマチン」という用語は、原核または真核両方の、あらゆる種類の細胞核タンパク質を含有することを意図する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソーム両方のクロマチンを含む。
【００５１】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を備える、クロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしば、細胞のゲノムを備える全ての染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を備えることができる。
【００５２】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を備える、複製核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例は、プラスミド、および特定のウイルスゲノムを含む。
【００５３】
「到達可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造に梱包されないと考えられている。到達可能領域の異なる構造はしばしば、例えば、ヌクレアーゼといった、化学的および酵素プローブへのその感度によって検出することができる。
【００５４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在する十分な条件が提供されれば、結合分子が結合する、核酸の一部を定義する、核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００５５】
「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝子的，生化学的、または他の方法によって細胞に導入することができる、分子である。「細胞中の通常の存在」は、細胞の特定発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中のみに存在する分子は、成人筋細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンを備えることができる。
【００５６】
外因性分子は、とりわけ、組み合わせ化学プロセスによって生成されるような小分子、タンパク質等の巨大分子、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を備える任意の複合体となり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、１本または２本鎖となり得て、線形、分岐、または円形となり得て、任意の長さとなり得る。核酸は、２本鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、およびヘリカーゼを含むが、それらに限定されない。
【００５７】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸となり得る。例えば、外因性核酸は、細胞、または通常は細胞中に存在しない染色体に導入される、感染ウイルスゲノム、プラスミド、またはエピソームを備えることができる。細胞へ外因性分子を導入する方法は、当業者に公知であり、脂質介在転移（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在転移、およびウイルスベクター介在転移を含むが、それらに限定されない。
【００５８】
対称的に、「内因性」分子は、特定環境条件下で特定発生段階において特定細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体または他の細胞小器官、または自然発生エピソーム核酸を備えることができる。付加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【００５９】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合される、分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子となり得るか、または、異なる化学型の分子となり得る。第１の種類の融合分子の例は、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）を含むが、それらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および副溝結合剤と核酸との間の融合を含むが、それらに限定されない。
【００６０】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因することができ、ポリヌクレオチドは、転写され、転写産物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシングポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達の方法は、本開示の別の場所で提示する。
【００６１】
「遺伝子」は、本開示の目的で、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびに、そのような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモータ配列、終結因子、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサ、サイレンサ、絶縁体、境界要素、複製起点、マトリクス取着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。
【００６２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子産物への、遺伝子に含有される情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質となり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されるＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質を含む。
【００６３】
遺伝子発現の「変調」とは、遺伝子の活動の変化を指す。発現の変調は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、それらに限定されない。
【００６４】
「真核」細胞は、真菌細胞（酵母菌等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含むが、それらに限定されない。
【００６５】
「関心の領域」は、例えば、外因性分子を結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内の、あるいはそれに隣接する非コード配列等の、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組み換えの目的となり得る。関心の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノム中に存在することができる。関心の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラ配列、またはイントロン等の転写された非コード領域内、または、コード領域の上流または下流のいずれかにある、非転写領域内となり得る。関心の領域は、単一ヌクレオチド対ほども小さいか、または長さが最大で２，０００ヌクレオチド対、または任意の整数値のヌクレオチド対となり得る。
【００６６】
「操作可能な連結」および「操作可能に連結された」（または「動作可能に連結された」）という用語は、２つ以上の構成要素（例えば、配列要素）の並置に関して相互交換可能に使用され、その場合、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに加えられる機能を媒介することができるという可能性を可能にするように、構成要素が配設される。例証として、プロモータ等の転写調節配列は、１つ以上の転写調節因子の有無に応じて、転写調節配列がコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に操作可能に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスで操作可能に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサは、たとえ連続的でなくても、コード配列に操作可能に連結される転写調節配列である。
【００６７】
融合ポリペプチドに関して、「操作可能に連結された」という用語は、構成要素のそれぞれが、他の構成要素への連結において、そのように連結されなかった場合に果たすのと同じ機能を果たすという事実を指す。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合される、融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能である一方で、切断ドメインは、標的部位の付近でＤＮＡを切断することが可能である場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、操作可能に連結している。
【００６８】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同じ数の残基を保有することができ、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換基を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリッド形成する能力）を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲルの電気泳動によって化学分析することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、２ハイブリッドアッセイ、または遺伝子学および生化学両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ９８／４４３５０を参照されたい。
【００６９】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計
亜鉛フィンガーヌクレアーゼの構築は、例えば、米国特許出願公報第２００３−０２３２４１０号、第２００５−００２６１５７号、第２００５−００６４４７４号、および第２００５−０２０８４８９号に記載されており、その開示は、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。簡潔に言えば、２、３、４、５、６以上の亜鉛フィンガーを備える、非自然発生亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを、所定の標的ヌクレオチド配列に結合するように遺伝子操作する。遺伝子操作されている亜鉛フィンガー結合ドメインを、ヌクレアーゼドメイン、切断ドメイン、または切断半ドメインに融合し、標的ヌクレオチド配列またはその付近でのＤＮＡ切断が可能な、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを形成する。ある実施形態では、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの概念設計後、標準の分子生物学的方法を使用して、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを構築する。
【００７０】
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の突然変異生成を促進するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼを、次のように設計および合成する。ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の関連部分のヌクレオチド配列が得られる。５〜６のヌクレオチド対によって分離される１対の標的配列に対して、個別亜鉛フィンガーおよびそれらの標的部位のリスト、および／または２指分子およびそれらの標的部位のリストを含有する、コンピュータプログラムを任意で使用して、そのようにして得られた配列を走査し、各標的配列は、３、４、５、または６指亜鉛フィンガータンパク質によって結合することができる。例えば、米国特許第６，７８５，６１３号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ０１／５３４８０号、および米国特許出願公報第２００３／００９２０００号を参照されたい。ＺＦＰ設計のための付加的な方法は、例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，７３３，９７０号、第６，７４６，８３８号、第６，７８５，６１３号、第６，８６６，９９７号、第７，０３０，２１５号、国際特許公開第ＷＯ ０１／０８８１９７号、国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号、および米国特許出願公報第２００３／００４４９５７号、第２００３／０１０８８８０号、第２００３／０１３４３１８号、および第２００４／０１２８７１７号に開示されている。
【００７１】
前のステップで識別された各標的配列について、ＦｏｋＩ切断半ドメインと標的配列に結合する亜鉛フィンガータンパク質との間の融合をコードする遺伝子を合成する。例えば、米国特許第５，４３６，１５０号、国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号を参照されたい。各融合タンパク質は、例えば、Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：６３２−６３７によって記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、その標的配列に結合する親和性について検査することができる。所定の閾値を超える標的配列結合親和性を有するタンパク質は、細胞に基づいたレポーターアッセイでのさらなる検査を受けることができる。
【００７２】
任意で、上記のような１つ以上の融合タンパク質の結合特異性を評価し、必要であれば、１つ以上のアミノ酸残基の変更（無作為化を含む）によって改善し、その後、標的配列に対するファージ提示アッセイ（例えば、国際特許公開第ＷＯ ９６／０６１６６号参照）、および／または米国特許第６，７９４，１３６号に記載の反復最適化の方法を行うことができる。
【００７３】
細胞に基づいた検査は、例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−６５１、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号に記載されているように行われる。簡潔に言えば、適切な細胞株において、ドキシサイクリン誘導性プロモータの転写制御下で、上記のように識別される標的配列対を、欠陥染色体緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に挿入する。２つの亜鉛フィンガー／ＦｏｋＩ融合タンパク質（そのそれぞれは標的配列のうちの１つに結合する）をコードする核酸と、欠陥染色体ＧＦＰ遺伝子の相同指向性修復に対するテンプレートの働きをする場合に、機能的ＧＦＰ遺伝子を再構成する配列を含有する核酸とを、細胞に形質移入する。相同指向性修復が生じた細胞は、ドキシサイクリンによる誘導後に、蛍光活性化細胞分類によって、識別および定量することができる。
【００７４】
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子を標的とする亜鉛フィンガー結合ドメイン
本明細書で開示される、ＧＲの不活性化のための方法は、（１）選択した標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（２）切断ドメインまたは切断半ドメインとを備える、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを利用する。ヒトＧＲ遺伝子中に標的部位を有する、任意のそのような亜鉛フィンガーヌクレアーゼを、開示された方法で使用することができる。あるいは、標的配列が適切な数のヌクレオチドによって分離される、それぞれ切断半ドメインを備える、任意の対の亜鉛フィンガーヌクレアーゼもまた、使用することができる。例えば、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９、およびＢｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００Ｉ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７を参照されたい。
【００７５】
ヒトＧＲ遺伝子中に標的部位を有する、例示的な亜鉛フィンガー結合ドメインを表１および２に開示する。表１は、例示的結合ドメインの標的配列、およびＧＲ遺伝子中の標的部位の場所を提供する。表２は、これらの結合ドメインの遺伝子操作されている認識領域（ＤＮＡ結合特異性の原因となっている）のアミノ酸配列を示す。亜鉛フィンガー配列をアミノからカルボキシの順序で示し、Ｆ１は、タンパク質のアミノ末端に最も近い亜鉛フィンガーを意味する。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
切断ドメイン
ＧＲ遺伝子中の標的部位に結合する任意の亜鉛フィンガーをヌクレアーゼと組み合わせて、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを形成することができる。上記のように、任意の切断ドメインまたは切断半ドメインを、本明細書に記載される亜鉛フィンガーヌクレアーゼで使用することができる。米国特許公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい。したがって、本明細書で開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、エンドまたはエクソヌクレアーゼから取得することができる。切断ドメインを抽出することができる例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する付加的な酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、また、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上は、切断ドメインおよび切断半ドメイン源として使用することができる。ある実施形態では、切断ドメインは、分離可能な結合および切断ドメインを有するヌクレアーゼ、例えば、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼから取得することができる。
【００８０】
例示的な切断半ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼから取得することができる。ある実施形態では、切断半ドメインは、分離可能な結合および切断ドメインを有するヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼから取得される。また、ホモ二量体化を最小限化する、または防ぐ、遺伝子操作されている切断半ドメイン（二量化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）が、例えば、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号および第２００６−０１８８９８７号に記載されている。Ｆｏｋ Ｉの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８におけるアミノ酸残基は全て、Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインの二量化に影響を及ぼすための標的である。
【００８１】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの付加的な遺伝子操作されている切断半ドメインを本明細書に記載する。第１の切断半ドメインは、Ｆｏｋ Ｉの位置４９０（下記に下線を引いた、野生型配列でのＥ）および５３８（下記に下線を引いた、野生型配列でのＩ）におけるアミノ酸残基での突然変異を含み、かつ第２の切断半ドメインは、アミノ酸残基４８６（下記に下線を引いた、野生型配列でのＱ）および４９９（下記に下線を引いた、野生型配列でのＩ）での突然変異を含む。
【００８２】
【化１】
【００８３】
上記に示されるように、４９０での突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）と交換し、５３８での突然変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と交換し、４８６での突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）と交換し、位置４９９での突然変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｅｕ（Ｌ）と交換する。具体的には、１つの切断半ドメイン中の位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、上記に示されるような「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定された遺伝子操作されている切断半ドメインを産生することによって、および、別の切断半ドメイン中の位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、上に示されるような「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定された遺伝子操作されている切断半ドメインを産生することによって、本明細書に記載される遺伝子操作されている切断半ドメインを調製した。これらの突然変異は、ホモ二量体を形成する、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ突然変異を含有する２つの切断半ドメインの能力低下をもたらし（野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインと比較して）、同様に、Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ突然変異を含有する２つの切断半ドメインもまた、ホモ二量体を形成することができない。しかしながら、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ突然変異を含有する切断半ドメインは、Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ 突然変異を含有する切断半ドメインを伴うヘテロ二量体を形成して、２本鎖ＤＮＡ切断が可能な機能的切断ドメインを再構成することが可能である。その上、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ含有切断半ドメインとＱ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ含有切断半ドメインとの間のヘテロ二量化は、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメイン間の二量化と同様の効率で生じる。したがって、本明細書に記載される遺伝子操作切断されている半ドメインは、異常切断が最小限化または撤廃される、偏性ヘテロ二量体突然変異体である。
【００８４】
本明細書に記載される遺伝子操作されている切断半ドメインは、任意の適切な方法を使用して、例えば、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号（実施例５）および米国特許出願整理番号第１１／４９３，４２３号（実施例３８）に記載されているような、野生型切断半ドメイン（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）の部位指向性突然変異生成によって、調製することができる。
【００８５】
治療の方法
ある種類の癌免疫療法では、Ｔ細胞は、腫瘍細胞特異的な抗原を認識する細胞表面タンパク質を発現するように遺伝子操作され、これらの遺伝子操作されているＴ細胞は、対象に導入される。例えば、表面上でＩＬ−１３受容体を過剰発現する腫瘍細胞を有する、グリア芽腫患者は、腫瘍の外科的切除後に、細胞表面に係留される「ゼタカイン」を発現する細胞障害性Ｔ細胞で処置することができる。ゼタカインは、細胞外ドメインを、細胞表面、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインに係留することが可能な、支持領域に連結される可溶性受容体リガンドを備える、細胞外ドメインから成るキメラ膜貫通免疫受容体である。Ｔリンパ球の表面上で発現されると、そのようなキメラ受容体は、Ｔ細胞活性を、可溶性受容体リガンドに特異的な受容体を発現する特定の細胞に方向付ける。
【００８６】
グリオーマおよびグリア芽腫の治療のために、ゼタカインは、ＩＬ−１３受容体を発現する細胞を標的とする。したがって、ゼタカインは、ＩｇＧのＦｃ領域に連結されるＩＬ−１３Ｒアルファ２特異性ＩＬ−１３変異ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の細胞外標的ドメインと、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメインと、ヒトＣＤ３ゼータ鎖とを備える、グリオーマ特異的な免疫受容体を構成することができる。そのようなゼタカインを発現するＴ細胞は、外科的腫瘍切除後に残っている、ＩＬ−１３過剰発現グリオーマおよびグリア芽腫腫瘍細胞を検出し、破壊することが可能である。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、Ｋａｈｌｏｎ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：９１６０−９１６６、および米国特許出願公報第２００６−００６７９２０号、第２００５−０１２９６７１号、および第２００３−０１７１５４６号を参照されたい。
【００８７】
しかしながら、この方法の臨床用途は、脳腫瘍患者は、炎症および脳の腫脹を予防するために、腫瘍切除後に、グルココルチコイドホルモンでも処置しなければならないという事実によって妨げられる。このグルココルチコイド治療は、ゼタカイン含有Ｔ細胞の活性化を阻害し、したがって、それらの殺細胞活性を防ぐ。
【００８８】
本明細書で開示される方法および組成物は、ゼタカイン含有Ｔ細胞におけるＧＲ機能を根絶することを可能にすることにより、それらがグルココルチコイドの阻害効果に耐性を示すようにする。したがって、開示された方法および組成物の使用によって、術後のグリア芽腫患者は、残留腫瘍細胞を除去するように、グルココルチコイド（腫脹および炎症を予防するため）およびゼタカイン含有Ｔ細胞の両方で処置することができる。確かに、Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子の不活性化は、ＧＲ遺伝子座へのゼタカインをコードする配列の標的化組み込みによって実現することができ、単一ステップで両方の目的を実現する。
【００８９】
したがって、ある実施形態では、ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼがＴ細胞で発現され、ＧＲ遺伝視座中の部位で切断する。ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含有する細胞は、ゼタカインをコードするドナーＤＮＡ分子と任意で接触されるため、ゼタカイン含有配列は、ＧＲ遺伝子座に組み込まれることにより、それらの細胞におけるＧＲ機能を不活性化する。
【００９０】
付加的な用途
遺伝子操作されているＴ細胞または単離Ｔ細胞による患者の治療は、これらの患者がまた、デカドロン等の免疫抑制剤でも処置される場合に、低下する。しかしながら、本明細書で開示されるように、ＧＲ機能を不活性化するためにＧＲ遺伝子座を標的とするＺＦＮを使用する、そのような治療用免疫細胞の修飾は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を受けない免疫細胞群の生成を可能にする。本明細書に記載される方法の高い効率は、他のいずれの技術でも可能ではない、選択マーカの非存在下でのＧＲ遺伝子の両方の対立遺伝子の同時崩壊を可能にする。Ｔ細胞は、あらゆる一次細胞のように、限定された複製能および有限寿命を有するため、ＧＲ遺伝子の両方の対立遺伝子における突然変異（ホモ接合体欠失を含む）を得ることができる速度もまた、重要な考慮事項である。
【００９１】
ヒト細胞中のＧＲ遺伝子座の配列の修飾のための、本明細書で開示される方法は、ＧＲ機能を欠く相当な数の細胞を含有する、細胞プールの生成を可能にし、また、ＧＲ活性を欠くクローン細胞株の単離も可能にする。そのような細胞は、Ｔ細胞および免疫系の他の細胞（例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、記憶細胞、マクロファージ）を含むが、それらに限定されず、その全ては、通常、グルココルチコイド受容体の作用により、グルココルチコイドホルモンの存在下で適切な活性化を受けることを妨げられる。
【００９２】
上記のように、これらの方法の１つの用途は、グルココルチコイドに反応しない脳腫瘍細胞を標的にするゼタカイン発現Ｔ細胞を提供するための、ＺＦＮの使用である。他の例は、例えば、免疫抑制剤の投与を受けている移植患者または他の免疫不全患者における、日和見感染を治療するために使用される、Ｔ細胞におけるＧＲのＺＦＮ媒介性不活性化を含む。
【００９３】
望ましくないＧＲ活性の付加的な臨床合併症もまた、特定の標的細胞群におけるＧＲ活性の不活性化によって緩和することができる。これに関連して、ＧＲの多面的活性は、部分的には、同じ遺伝子から生成される複数の受容体イソ型の存在に基づくことが注目される。例えば、Ｚｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ７０：４０７−４１７を参照されたい。本明細書に記載される、ＺＦＮ介在性ＧＲ遺伝子修飾の単一ヌクレオチドレベル分解能は、組織特異的なＺＦＮ発現（例えば、両方とも参照することにより組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい）と組み合わせて、共に特定の組織における特定の受容体イソ型の崩壊を可能にし、他のいずれの技術でも可能ではない方法である。また、野生型ＧＲを、選択した特定のリガンドによって独占的に調節されるイソ型と交換するために、ＺＦＮを使用するＧＲ遺伝子の配列の変異を使用することができる。
【００９４】
逆に、ＧＲ遺伝子座における突然変異を伴う患者では、突然変異自体の補正を通して、または機能的ＧＲをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の標的化挿入によってのいずれかで、選択した標的組織におけるＧＲ活性を回復させるために、ＺＦＮ介在性ゲノム編集を使用することができる。
【００９５】
本明細書で開示される方法および組成物はまた、研究用途、薬剤スクリーニング、および標的検証のための細胞株を生成するために使用することができる。例えば、本明細書で開示されるようなＺＦＮを使用して、選択した細胞株におけるＧＲ機能を撤廃することにより、ＧＲ機能の存在または非存在下であることのみ異なる、対応対の同系細胞株の生成を可能にする。別の例として、ＧＲ遺伝子座へのレポータ遺伝子の挿入、またはＧＲタンパク質へのレポータの融合は、グルココルチコイド受容体の性質および調節の高分解能研究を促進する。そのような細胞株は、研究目的で、ならびに標的検証および薬剤スクリーニングなどの産業用途で使用することができる。同様に、ＺＦＮ介在性遺伝子補正は、ＧＲ遺伝子座に特定の変化を導入して、様々な受容体ドメインおよびイソ型を研究するための細胞株を生成するために、使用することができる。
【００９６】
最後に、ＧＲ遺伝子座の不活性化が介入の主要目的ではないが、修飾細胞に悪影響を及ぼさない場合、ＧＲ遺伝子座は、任意の遺伝子療法用途での任意の導入遺伝子に対する「セーフハーバー」組み込み部位として、使用することができる。したがって、本開示はまた、外来性配列がＧＲ遺伝子に組み込まれている細胞の選択のための方法も提供する。方法は、本明細書に記載されるようなＺＦＮで細胞中の内因性ＧＲ遺伝子を切断するステップと、外来性配列がＧＲ遺伝子に組み込まれるような条件下で、典型的に、ＧＲ相同性アームを伴うドナー構築物上にある、外来性配列（例えば、導入遺伝子）を細胞に導入するステップとを伴う。次いで、組み込まれた配列のない細胞（正常なＧＲ発現を伴う細胞）を破壊する、自然発生または合成コルチコステロイド（例えば、コルチゾール、デキサメタゾン等）に細胞を暴露することによって、組み込まれた外来性配列を伴う細胞を選択することができる。実施例４も参照されたい。
【００９７】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡ配列の送達のためのベクター
細胞への、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列の送達、および／またはドナーＤＮＡの送達に、任意のベクターを使用することができる。例示的なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスを含む。ＤＮＡはまた、形質移入、エレクトロポレーション、脂質介在性方法、遺伝子銃、およびリン酸カルシウム介在性導入によって、細胞に送達することもできる。
【００９８】
本明細書で開示される方法および組成物は、永久ゲノム変異（例えば、外来性配列の標的化突然変異または標的化組み込み）を生じるために一時的事象（ＺＦＮ介在性２本鎖切断）を利用するため、細胞中で持続する送達ベクターを使用する必要はない。したがって、非複製ウイルスベクターを送達媒体として使用することができる。したがって、複製欠損アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス（例えば、Ａｄ ５／３５）、および非統合レンチウイルスベクターは全て、送達媒体として適切である。
【００９９】
本用途で使用することができるアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの非限定的な例は、ヒトまたは非ヒト血清型に由来する、組み換え（Ｅ１欠失等）、条件付きで複製可能（腫瘍退縮性等）、および／または複製可能なＡｄベクター（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５、またはブタアデノウイルス−３）、キメラＡｄベクター（Ａｄ５／３５等）、または遺伝子操作されている繊維節タンパク質（節タンパク質のＨＩループ内のペプチド挿入等）を伴う指向性変異Ａｄベクター、および／または「中身がない」Ａｄベクター、例えば、免疫原性を低減し、かつＤＮＡペイロードのサイズを増加させて、ＺＦＮおよびドナー分子の両方の同時送達を可能にし、特に、大型導入遺伝子が標的化組み込みを介して組み込まれることを可能にするように、Ａｄゲノムからの全てのアデノウイルス遺伝子が削除されている、Ａｄベクターを含む。
【０１００】
複製欠損性組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、容易に多数の異なる細胞型に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子に取って代わるように遺伝子操作され、後に、複製欠損ベクターは、トランスにおける欠失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中に繁殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉にあるもの等の、非分裂の分化細胞を含む、生体内の複数種類の細胞を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大量運搬能力を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用の例は、筋肉注射による抗腫瘍予防接種のためのポリヌクレオチド療法を伴った。Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９．
【０１０１】
臨床試験での遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用の付加的な例は、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−２１８；Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：５−１０；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３、およびＴｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３を含む。
【０１０２】
ある実施形態では、Ａｄベクターは、２つ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含有する、キメラアデノウイルスベクターである。例えば、Ａｄベクターは、Ａｄ５／３５ベクターとなり得る。Ａｄ５／３５は、Ａｄ５の繊維タンパク質をＢ群Ａｄ３５からの繊維タンパク質と交換することによって作成される。Ａｄ５／３５ベクターおよびこのベクターの特性は、例えば、Ｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：６６４−６７７；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３７７−３８８；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．６：６３１−６４１；Ｓｃｈｒｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３２：５３６−５４６；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１１：３８４−３９３；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２５６７−２５８３、およびＳｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：４９６−５０９に記載されている。
【実施例】
【０１０３】
次の実施例は、限定的ではなく、請求された主題を例証するものとして提示する。
実施例１：ヒトＧＲ遺伝子を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミド送達媒体の構築
各標的配列を３、４、５、または６指亜鉛フィンガータンパク質によって結合することができる、５〜６のヌクレオチド対によって分離される１対の標的配列に対して、個別亜鉛フィンガーおよびそれらの標的部位のリスト、および／または２指分子およびそれらの標的部位のリストを含有する、コンピュータプログラムを任意で使用して、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子の配列を走査することによって、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインに対する標的部位を選択した。例えば、米国特許第６，７８５，６１３号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ０１／５３４８０号、および米国特許出願公報第２００３／００９２０００号を参照されたい。ＺＦＰ設計のための付加的な方法は、例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，７３３，９７０号、第６，７４６，８３８号、第６，７８５，６１３号、第６，８６６，９９７号、第７，０３０，２１５号、国際特許公開第ＷＯ ０１／０８８１９７号、国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号、および米国特許出願公報第２００３／００４４９５７号、第２００３／０１０８８８０号、第２００３／０１３４３１８号、および第２００４／０１２８７１７号に開示されている。
【０１０４】
前のステップで識別された標的配列のいくつかについて、ＦｏｋＩ切断半ドメインと標的配列に結合する亜鉛フィンガータンパク質との間の融合をコードする遺伝子を合成した。例えば、米国特許第５，４３６，１５０号、国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号を参照されたい。
そのような融合遺伝子を構築し、それらをプラスミドに導入するために、標準の分子生物学的方法を使用した。例示的な発現構築物を図１および２に示す。
【０１０５】
実施例２：遺伝子操作されている亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用する、ヒトＧＲ遺伝子の標的切断
ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２４３）を培養した。１×１０６細胞／ｍｌの密度で、２×１０６個の細胞をペレット化し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイス（Ａｍａｘａ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、２つのＺＦＮ発現ベクターのそれぞれ２．５μｇを形質移入した。一式の細胞に、エクソン３標的化９６６６および９６７４結合ドメイン（表１および２参照）を備える亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするプラスミドを形質移入した。第２の一式の細胞に、エクソン６標的化８６５３および９７３７結合ドメイン（表１および２参照）を備える亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするプラスミドを形質移入した。対照は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドが形質移入された細胞、および非形質移入細胞を含んだ。
【０１０６】
形質移入の３日後、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、細胞からＤＮＡを単離した。ＧＲ遺伝子座のエクソン３またはエクソン６のいずれかに特異的なプライマ（表３参照）を使用するＰＣＲ増幅に対するテンプレートとして、このＤＮＡ（１００ｎｇ）を使用した。増幅産物を変性させ、次いで、リアニールし、リアニールした産物を不適合特異的なヌクレアーゼＣｅｌ−Ｉ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）に暴露させた。Ｃｅｌ−Ｉ処置の産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。増幅産物群がヌクレオチド配列に関して同質である場合、Ｃｅｌ−Ｉ切断に耐性を示す完全適合２本鎖が、変性およびリアニーリング後に産生されるべきである。一方で、増幅産物の一部における挿入物、欠失、および／または不適合の存在により、増幅産物が異質である場合、リアニーリングは、Ｃｅｌ−Ｉ切断の影響を受けやすい、配列不適合を含有するいくつかの２本鎖を生成する。結果として、増幅産物よりも小さい産物は、ゲル上で欠失される。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
結果を図３に示す。非形質移入細胞からの、およびＧＦＰをコードするプラスミドが形質移入された細胞からの、エクソン３およびエクソン６特異的なＤＮＡの増幅産物は、同質増幅産物群を示す、変性、リアニーリング、およびＣｅｌ Ｉ処置後に、単一帯域を生じる（各パネルのそれぞれ左および中央レーン）。対称的に、エクソン３における標的部位（９６６６および９６７４）を伴う亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミドが形質移入された細胞からのエクソン３特異的な増幅産物は、変性、リアニーリング、およびＣｅｌ Ｉ処置後に、２つのより小さい産物を生じる（左パネル、最右レーン）。これらのより小さい産物の存在は、リアニールされたＤＮＡ中の一意の場所での配列不適合の存在を示す。同様に、エクソン６における標的部位（８６５３および９７３７）を伴う亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミドが形質移入された細胞からのエクソン６特異的な増幅産物は、エクソン６における標的切断を示す、（同様の分子量の）２つのより小さい産物を生じる。
【０１０９】
実施例３：ヒトＧＲ遺伝子における標的切断によって誘導される突然変異の性質
ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞（Ｍ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡより入手したグルココルチコイド感受性リンパ細胞株）を培養した。１×１０６細胞／ｍｌの密度で、２×１０６個の細胞をペレット化し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイスを使用して、エクソン３標的化８６６７および８６６８ＤＮＡ結合ドメイン（表１および２参照）を伴うＺＦＮをコードするプラスミドを形質移入した。２．５μｇの各プラスミドを使用した。１４日間にわたる１０−５Ｍデキサメタゾンへの暴露によって、ＧＲ機能を欠く細胞を選択し、ＧＲエクソン３特異的なプライマ（表３参照）を使用したＰＣＲによって、デキサメタゾン耐性細胞から単離されたＤＮＡを増幅した。アガロースゲル上で増幅反応混合物を分画し、予測された増幅産物（ＧＲ遺伝子中のプライマ配列の場所に基づく）にサイズが対応する帯域をゲルから切除した。Ｔｏｐｏ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、この帯域中のＤＮＡをクローン化し、個別クローンのヌクレオチド配列を決定した。
【０１１０】
１つのクローンでは、配列分析は、標的切断の部位の付近の２ヌクレオチド欠失の存在を明らかにした。第２のクローンでは、１１ヌクレオチド欠失が欠失していた。第３のクローンは、配列の混合を備え、そのうちの１つは、４つのヌクレオチドの複製であり、他方は、１９ヌクレオチド欠失であった。
【０１１１】
これらの結果は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したＧＲ遺伝子の標的切断が、遺伝子における挿入および欠失両方の突然変異を誘導し、その全てが翻訳リーディングフレームの変化をもたらしたことを示す。
【０１１２】
これらのデキサメタゾン耐性細胞におけるＲＮＡ分析は、異常ＧＲ転写産物のナンセンス変異による崩壊を示す、非形質移入細胞と比較して、より低いレベルのＧＲ ｍＲＮＡを明らかにした。
【０１１３】
実施例４：ヒトＧＲ遺伝子座への導入遺伝子の導入
グルココルチコイドホルモンは、多くの一次細胞および細胞株において、アポトーシスを誘発するか、または細胞増殖を減速する。したがって、ａ）ＧＲ遺伝子座のＺＦＮ介在性２対立遺伝子突然変異を含有する細胞、ｂ）ＧＲ機能の不活性化をもたらす、ＧＲ遺伝子座の両方の対立遺伝子へのドナーＤＮＡ配列のＺＦＮ介在性標的化組み込みを含有する、細胞、またはｃ）ＧＲ遺伝子座の一方の対立遺伝子上のＺＦＮ介在性ＧＲ突然変異、および他方の対立遺伝子上のＺＦＮ介在性標的化組み込みを含有する細胞を、選択または豊富にするために、ＧＲ遺伝子座を標的とするＺＦＮと組み合わせて、グルココルチコイドホルモン処置を使用することができる。
【０１１４】
この様式でＧＲ遺伝子座に組み込むことができる配列は、任意の選択された導入遺伝子を伴う発現カセットを含むが、それらに限定されない。ＧＲ遺伝子座への組み込みを使用することの潜在的な便益は、ａ）ドナー分子上での選択マーカの使用を回避すること、ｂ）高レベル遺伝子発現と適合性があり、サイレンシングを受けない遺伝子座からの導入遺伝子の発現の長期的安定性、ｃ）導入遺伝子の無作為な組み込みを行うと発生し得る、挿入突然変異事象を回避することを含むが、それらに限定されない。ゼタカイン導入遺伝子を使用して、次のような実験を行った。
【０１１５】
別個の実験において、ＧＲ標的化ＺＦＮ ９６６６および９６７４をコードする２５μｇの発現構築物、およびゼタカイン導入遺伝子を用いて、ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞を培養し、形質移入した（前の実施例で記載されるように）。ゼタカインドナーＺＦＮ構築物をＣＥＭ１４細胞に形質移入し、形質移入細胞のアリコートをデキサメタゾン（正常ＧＲ機能を有する細胞を破壊する）で２週間インキュベートする一方で、残りの細胞は未処置のままとした。非形質移入細胞を対照として使用し、同様に処置した。デキサメタゾン処置後、ＰＣＲ（図４Ａ）によって、およびサザンブロット法によって（図４Ｂ）、ＧＲ遺伝子座へのゼタカイン導入遺伝子の標的化組み込みを検出した。免疫染色は、ＧＲ ＺＦＮおよびゼタカインドナー構成物の両方が形質移入された、デキサメタゾン選択ＣＥＭ １４細胞中の高レベルゼタカイン発現を示す（図示せず）。
【０１１６】
これらの結果は、ヒトＧＲ遺伝子中のドナー配列の標的化組み込みが実現されたこと、ドナー配列の組み込みがＧＲ機能を不活性化したこと、およびドナー配列に含有される導入遺伝子の正常機能が得られたことを実証した。
【０１１７】
実施例５：ＧＲ遺伝子中の外来性配列の標的化組み込み後のＧＲポリペプチド産生
ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞を培養し、ゼタカインカセットを含有し、ＧＲ遺伝子への相同性領域が両側に並ぶＧＲエクソン３標的化ＺＦＮペア８６６７および８６６９をコードする、２５μｇの発現ベクターを、上記のように形質移入した。形質移入の２日後、１０−６Ｍデキサメタゾンを増殖培地に添加し、選択の２週間後にグルココルチコイド耐性クローンを得た。
【０１１８】
デキサメタゾン処置を克服した形質移入細胞からのタンパク質抽出物を全細胞溶解によって調製し、ヒトＧＲへの抗体（カタログ番号６１１２２６、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して、ウェスタンブロット分析を行った。結果を図５に示す。野生型受容体に対応する帯域を非形質移入ＣＥＭ １４細胞において検出したが（左レーン）、一方で、ＺＦＮおよびドナー配列で処置したＣＥＭ １４細胞のクローンは、野生型受容体のサイズに対応する免疫反応物質を含有しなかった。その代わり、短縮受容体型にサイズが対応する帯域を検出した（右レーン）。
【０１１９】
実施例６：ＣＤ８＋Ｔ細胞中のヒトＧＲ遺伝子の標的切断
ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から新鮮なヒト末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞を入手した。Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイスおよびプロトコルを使用して、２×１０６個の細胞に、ＺＦＮコード配列が２Ａ配列によって分離された、ヒトＧＲ遺伝子座のエクソン３を標的とする２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、５μｇの発現プラスミドを形質移入した。別個の形質移入において、２つのエクソン３標的化ＺＦＮペア（９６６６−９６７１および９６６６−９６７４）を検査した。対照は、非形質移入細胞、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドが形質移入された細胞であった。
【０１２０】
５％ヒト血清を含有するＸ−ＶＩＶ０１５培地（両方ともＣａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤより購入）で、形質移入ＣＤ８＋細胞を４８時間培養した。その後、ＤＮＡを単離し、それぞれ５μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）をＰＣＲ反応物に添加したことを除いて、エクソン３特異的な増幅プライマを使用して、上記の実施例２に記載されるように、Ｃｅｌ Ｉ分析を行った。
【０１２１】
Ｃｅｌ Ｉ処置後、１０％アクリルアミドゲル上で消化産物を分画した。Ｓｔｏｒｍ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、ゲルのオートラジオグラフ像を現像した。結果を図６に示す。Ｃｅｌ Ｉ切断産物の定量によって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度を決定し、図６の右端の２つのレーンに示す。したがって、ＧＲ標的化ＺＦＮは、効率的にＣＤ８＋Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子座を修飾する。
【０１２２】
実施例７：ＧＲ−ＺＦＮ処置ＣＤ−８＋Ｔ細胞の分析
Ａ．ＺＦＮがＧＲ遺伝子座での突然変異を生成する
第０日に、ゼタカイン導入遺伝子を発現する５千万個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）を刺激し、第７日に、１０（「ＺＦＮ１０−」）、３０（「ＺＦＮ３０−」）、および１００（「ＺＦＮ１００−」）の感染の多重度（ｍｏｉｓ）で、ＺＦＮペア９６６６および９６７４を発現するＡｄ５／Ｆ３５に感染させた。対照として、ＣＤ８＋細胞はまた、同じｍｏｉｓ（「ＧＦＰ１０−」、「ＧＦＰ３０−」、「ＧＦＰ１００−」）で、Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスを発現するＧＦＰにも感染させた。
【０１２３】
細胞を上記のように増殖させ、サイトカインの非存在下にて１０−４Ｍの濃度のグルココルチコイドホルモンデキサメタゾンで、感染後７日の細胞を６日間処置した。得られた細胞プール（それぞれ、「ＺＦＮ１０」、「ＺＦＮ３０」、「ＺＦＮ１００」、および「ＧＦＰ１０」、「ＧＦＰ３０」、「ＧＦＰ１００」）を再刺激し、再刺激の１２日後に細胞を収穫した。ＤＮＡを単離し、ＺＦＮ標的領域のＰＣＲによってＧＲ遺伝子座の修飾について分析し、その後、上記の実施例２に記載されるように、Ｃｅｌ Ｉ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）エンドヌクレアーゼアッセイを行った。図７のパネルＡおよびＢに示されるように、一時的ＺＦＮ発現は、ＧＲ遺伝子座での突然変異を伴うＧＣ耐性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した。
【０１２４】
ＰＣＲ産物はまた、ＰＣＲ４ ＴＯＰＯベクターにもサブクローン化し、Ｔ７プライマを使用して挿入配列を分析した。細胞プールＺＦＮ１００中のＧＲ遺伝子座のエクソン３におけるＺＦＮ標的領域の配列決定は、ＧＲ対立遺伝子の７０％がＺＦＮ結合領域に突然変異を含有したことを実証した。対照的に、細胞がＧＦＰ１００対照ウイルスに感染していた場合には、ＧＲ対立遺伝子に突然変異は見出されなかった。
【０１２５】
ＣＤ８＋細胞プールのグルココルチコイドホルモン耐性はまた、８日間の１０−４Ｍデキサメタゾンによる第２の処置前後の細胞の生存を比較することによっても決定した。Ｇｕａｖａ細胞分析器を使用して、生存能力を測定した。図８に示されるように、ＺＦＮ処置細胞は、グルココルチコイドホルモンに対する増大した耐性を示した。
【０１２６】
Ｂ．ＺＦＮ修飾ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＧＲタンパク質発現
ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、全長ＧＲタンパク質の存在についても検査した。
１つの実験では、ＧＲ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴＦＩＩＢ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）抗体を使用したウェスタンブロット法によって、上記のＣＤ８＋細胞プールからの、およびウイルス形質導入に使用されたゼタカイン発現ＣＤ８＋細胞プール（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）からのタンパク質抽出物を分析した。また、細胞プールと同時に、ＺＦＮ １００プールのサブクローン（「１０Ａ１」）を分析した。図９Ａに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比べてＧＲタンパク質の損失を示した。
【０１２７】
別個の実験では、ＧＲの発現はまた、ＺＦＮ処置ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋サブクローンにおいても評価した。特に、本明細書に記載されるようなＺＦＮを使用して、ＣＭＶを標的とするＧＲ陰性ＣＤ８＋細胞を生成した。これらの細胞の単一細胞由来サブクローンを単離し、上記のようにこれらのクローンからタンパク質抽出物を得た。２６のサブクローンの遺伝子型決定は、２つの野生型クローン、およびＺＦＮ結合領域を備えるＧＲ遺伝子座における突然変異を伴う２４のクローンを識別した。上記のように、ヒトＧＲ抗体（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）によるウェスタンブロット法によって、タンパク質抽出物を分析した。図９Ｂに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋クローンは、ＧＲタンパク質の損失を示した。
【０１２８】
したがって、本明細書に記載されるようなＺＦＮは、一次細胞中のＧＲタンパク質発現を低減または排除することができる。
【０１２９】
Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲ
また、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＲ陰性（ＺＦＮ処置）ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析して、既知のＧＲ標的遺伝子の発現に対するグルココルチコイド添加の効果を決定した。結果を図１０Ａ−１０Ｄに示す。細胞は、示されるように、未処置のままとした（「ｕｎ」）か、または１０−６Ｍデキサメタゾンで２０時間処置した（「ｄｅｘ」）。標準プロトコルを使用してＲＮＡを単離し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって、様々なグルココルチコイド調節遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。同じＲＮＡサンプルから得られたＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の値によって、ＧＲ標的遺伝子のＲＮＡ値を補正した。ＧＲ標的遺伝子に対するＴａｑｍａｎプローブおよびプライマは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。図１０Ａ〜Ｄに示されるように、グルココルチコイドホルモン処置は、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞ほどは標的遺伝子に影響しなかった。
【０１３０】
Ｄ．サイトカイン放出
グリオーマ細胞で刺激されたＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカイン放出も評価した。単独で、またはＵ８７ＭＧグリア芽腫刺激細胞の存在下で、ＧＦＰ１００、ＺＦＮ１００、および未処置ＣＤ８＋Ｔ細胞プールを培養した。その後、１０−６Ｍデキサメタゾンを培養物に添加した。２０時間後、細胞培養上清を収穫し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＦＮ−γレベルを分析した。
【０１３１】
図１１に示されるように、グリオーマ細胞による刺激時のＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン放出が維持され、グルココルチコイドホルモンに対して耐性となっていた。
【０１３２】
Ｅ．細胞溶解活性に対するクロム放出アッセイ
ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を分析するために、エフェクタ（ＺＦＮ処置または対照ＣＤ８＋Ｔ細胞）の標的細胞（ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞株および対照細胞株）に対する様々な比で、クロム放出アッセイを行った。
【０１３３】
図１２のパネルＡからＥに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ１３Ｒα２＋標的細胞を破壊する能力を維持する。
【０１３４】
実施例８：ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体内投与
ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、生体内の殺腫瘍細胞活性についても分析した。第０日に、脳に注入されたルシフェラーゼ標識Ｕ８７ＭＧ細胞を使用して、腫瘍細胞毒性を同所性グリア芽腫マウスモデルにおいて測定した。第５日に、対照またはＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞を脳に注入し、第２４日までルシフェラーゼ活性を測定することによって腫瘍体積を決定した。
【０１３５】
図１３に示されるように、ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＣ）は、対照と比べて、腫瘍体積を低減した。その上、図１４に示される実験は、マウス腫瘍モデルにおけるＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性が、グルココルチコイドホルモンの投与によって悪影響を及ぼされなかったことを実証する。したがって、グルココルチコイドホルモンの投与を受けている患者におけるグリア芽腫の治療のために、ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することができる。
【０１３６】
実施例９：ＧＲ ＺＦＮ特異性の分析
細胞中のＧＲ ＺＦＮ ９６６６および９６７４の特異性を分析するために、我々はまず、親和性に基づく標的部位選択手順（ＳＥＬＥＸ）を使用して、体外での９６６６および９６７４両方のＺＦＮに対するコンセンサスＤＮＡ結合部位を決定した。２００７年５月２３日出願の米国特許整理番号第１１／８０５，７０７号も参照されたい。実験概要を図１５に提供する。簡潔に言えば、ビオチン化抗ＨＡ Ｆａｂ抗体断片の存在下で、赤血球凝集素で標識されたＺＦＮを無作為化ＤＮＡ配列のプールによりインキュベートした。標識されたＺＦＮ−ＤＮＡ複合体をストレプトアビジン被覆電磁ビーズで捕獲し、結合ＤＮＡを解放し、ＰＣＲによって増幅した。開始配列として以前に溶出および増幅したＤＮＡのプールを使用して、このプロセスを３回反復した。４回目の反復後、溶出したＤＮＡ断片を配列決定し、ＺＦＮ ９６６６およびＺＦＮ ９６７４の結合部位における各位置での塩基頻度を決定した。
【０１３７】
ヒトゲノム中の最も類似した推定標的外部位のゲノム規模での生物情報予測を誘導するために、部位選択データに基づくコンセンサスを使用した。次いで、潜在的切断部位の得られたリストを順序付けし、実験的に導出された結合部位選好との最高類似性を伴う部位を優先した。
【０１３８】
ＮＲ３Ｃ１（ＧＲ遺伝子座）は、部位選択実験で決定された結合部位選好との最も良好な適合を含有する。１５の潜在的標的外部位のうち、１０が注釈遺伝子の範囲内であり、２つのみがエクソン配列内で生じる。これらの１０の遺伝子のうちのいずれについても、突然変異または崩壊は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における既知の病変と関連していない。
【０１３９】
クローン１０Ａ１（Ｔ細胞由来クローン）の遺伝子型決定は、コンセンサスとの最高類似性を伴う１５の部位のうちのいずれも、ＧＲ（標的内）遺伝子座の２対立遺伝子修飾をもたらした条件下で修飾されなかったことを確認した。
【０１４０】
本願で言及される全ての特許、特許出願、および公報は、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。
【０１４１】
理解を明確にする目的で、例証および一例として、本開示をある程度詳細に提供したが、本開示の本質または範囲を逸脱しない限り、様々な変更および修正を実践できることが、当業者には明白となるであろう。したがって、先述の説明および実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年１１月１３日出願の米国暫定出願第６０／８５９，０２５号、２００６年１１月１５日出願の米国暫定出願第６０／８５９，４１７号、および２００７年９月７日出願の米国暫定出願第６０／９６７，８２０号の利益を請求し、その開示の全ては、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた発明の権利の記載
【０００２】
本開示は、標的突然変異生成、標的ゲノム組み込み、および標的組み換えを含む、免疫学、免疫系変調、およびゲノム修飾の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、身体のほぼ全ての細胞中で発現される。コルチゾール等のグルココルチコイドホルモンの結合時に、受容体は、細胞核に転座され、一式の組織特異的な標的遺伝子を活性化する。組織によってＧＲ標的遺伝子が異なるという事実は、異なる組織におけるＧＲ効果の多面的パターンをもたらす。
【０００４】
グルココルチコイドホルモンの生理的作用の多くが医学的関心であり、臨床的介入の潜在的分野を提示する。例えば、クッシング症候群では、過剰なＧＲ活性が高血圧につながる。脳では、ＧＲ経路の異常は、うつ病および気分障害に結び付けられており、肺では、そのような異常は、喘息および慢性気道疾患と関連している。
【０００５】
グルココルチコイドホルモンの最もよく特徴付けられた臨床活性の１つは、免疫抑制効果による、消炎作用である。グルココルチコイドホルモンへのＴ細胞の暴露は、Ｔ細胞アネルギーにつながり、Ｔ細胞活性化を妨害する。最近の概説については、Ｒｈｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（１６）：１７１１−２３を参照されたい。グルココルチコイドによる長期的治療は、糖尿病および骨粗鬆症のような重篤な副作用につながる。Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２６（３）：４５２−６４の考察を参照されたい。さらに、免疫系全体の抑制は、潜在ウイルスの再活性化につながり得るものであり（Ｒｅｉｎｋｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １（３）：１５７−６４を参照されたい）、免疫療法の方法、例えば、患者への有益な免疫細胞の一部の送達を妨害する。
【０００６】
細胞の一部、例えば、特徴付けられたＴ細胞群における、ＧＲ機能の選択的崩壊を可能にする方法が利用可能であれば、グルココルチコイド処置を伴うＧＲ過剰活性化と関連する問題の多くを解決することができる。１つのそのような方法は、ＧＲをコードする遺伝子の配列を変更することであろう。確かに、ゲノム中の特定の場所でＤＮＡ配列を操作する（すなわち、編集する）能力は、ここしばらくヒトゲノム生物学の主要な目標となっている。種々の技術がこの目的で以前に試験されてきたが、これらの方法でゲノム修飾が達成される頻度は、治療用途にとっては概して低すぎるものとなっている。例えば、Ｙａｎｅｚ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（２）：１４９−１５９を参照されたい。
【０００７】
ゲノム編集の別の重要な用途は、ゲノムへの臨床的有用な導入遺伝子の挿入である。しかしながら、あらゆるゲノム編集方法の決定的要件は、それが規定の場所への標的化挿入を可能にすることである。治療用導入遺伝子の正確に標的化された組み込みの要件の重要性は、Ｘ連鎖ＳＣＩＤの治療に対する臨床試験において、ヒト遺伝子療法に使用される導入遺伝子の無作為な組み込みが、場合によっては、標的細胞の発癌性形質転換につながった挿入突然変異をもたらしたという最近の観察によって、強調されている。Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６４４）：４１５−９．
【０００８】
ゲノムＤＮＡの標的切断のための様々な方法および組成物が説明されている。そのような標的切断事象は、例えば、標的化突然変異生成を誘導する、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導する、および所定の染色体座での標的化組み換えを促進するために使用することができる。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第ＵＳ ２００３／０２３２４１０号（２００３年１２月１８日）、第ＵＳ ２００５／００２６１５７号（２００５年２月３日）、第ＵＳ ２００５／００６４４７４号（２００５年３月２４日）、第ＵＳ ２００５／０２０８４８９号（２００５年９月２２日）、および第ＵＳ ２００６／０１８８９８７号（２００６年８月２４日）を参照されたい。外来性配列の標的化組み込みもまた、達成することができる。その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願整理番号第１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日出願）を参照されたい。また、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号（２００５年９月１５日）も参照されたい。
【０００９】
しかしながら、ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の特異的切断のため、およびＧＲ遺伝子の修飾による免疫機能の変調のための方法および組成物は、これまで記載されていない。
【発明の概要】
【００１０】
グルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードするヒト遺伝子のヌクレオチド配列の変異のための方法および組成物を本明細書で開示する。ある実施形態では、ヒトＧＲ遺伝子の配列の変異は、ＧＲ機能を不活性化する。
【００１１】
前記方法は、ＧＲ遺伝子における配列の２本鎖切断を触媒する、ヒトＧＲ遺伝子を標的とする１対の亜鉛フィンガーヌクレアーゼの細胞中の発現を含む。亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、標的配列および切断半ドメインを結合するように遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを備える、融合タンパク質である。細胞中の亜鉛フィンガーヌクレアーゼの発現は、ヌクレアーゼ自体、ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡの、細胞への導入によって達成することができる。ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、ＧＲ遺伝子中の標的部位へ結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを備える。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの遺伝子操作は、標的ヌクレオチド配列を結合するために必要とされる亜鉛フィンガーのアミノ酸配列の決定（コンピュータまたは経験的手段によって達成され得る）、および所望のアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の構築を含む。
【００１２】
ヒトＧＲ遺伝子を標的とする、例示的な遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを表２に示し、それらの標的配列を表１に示す。したがって、本開示は、ヒトＧＲ遺伝子中の任意の部位を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼと、前記亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを提供する。前述の亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドを備える細胞、例えば、単離細胞、一次細胞または培養液中の細胞のいずれかも、提供される。
【００１３】
ある実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによるヒトＧＲ遺伝子の標的切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因する配列変異を誘導する。付加的な実施形態では、２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼが細胞中で発現され、ドナーポリヌクレオチドが細胞に導入される。ドナーポリヌクレオチドは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによって作成される２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを含有する。ドナーポリヌクレオチドは、任意で、例えば、キメラＴ細胞容体等の導入遺伝子を備え得る、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列を含有する。
【００１４】
本明細書に記載されるような、ＧＲ遺伝子の一次ヌクレオチド配列を変更することによる、ＧＲ機能の不活性化は、種々の用途でＧＲ介在性免疫抑制を防止するために使用することができる。
【００１５】
一態様では、（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）切断半ドメインとを備える、融合タンパク質を、本明細書で提供する。ある実施形態では、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える。本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００１６】
別の態様では、本開示は、細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップを含む方法を提供し、各融合タンパク質は、該融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）切断半ドメインとを備える。ある実施形態では、融合タンパク質の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える。本明細書に記載される方法のいずれかは、ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップをさらに含んでもよく、該ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える。任意で、ポリヌクレオチドは、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列（例えば、修飾受容体等の導入遺伝子）をさらに備え得る。その上、前記方法のうちのいずれかは、グルココルチコイド介在性免疫抑制および／またはＴ細胞アネルギーを防止し得る。
【００１７】
さらに別の態様では、本開示は、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択する方法を提供する。前記方法は、ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を引き起こすように本明細書に記載されるようなＺＦＮを発現するステップと、ドナーポリヌクレオチド（ＧＲ相同性アームと、外来性配列とを備える）を細胞に導入するステップとを含む。次いで、正常量のＧＲを発現する細胞を破壊する、コルチコステロイドの存在位下で細胞を増殖させることによって、ドナーポリヌクレオチドがＧＲ遺伝子に挿入されている細胞が選択される。「コルチコステロイド」という用語は、コルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン、およびアルドステロン等の自然発生ステロイドホルモンを含む。前記用語はまた、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、フルドロコルチゾン（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）（フロリネフ（Ｆｌｏｒｉｎｅｆ）（登録商標））等を含む、コルチコステロイド様効果を有する合成薬剤も含む。ある実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。前記方法のうちのいずれかでは、外来性配列は、導入遺伝子（関心のポリペプチドをコードする配列）を備え得る。あるいは、外来性配列は、非コード配列であり得る。
【００１８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかでは、ＺＦＮは、ウイルス送達ベクター、例えば、複製欠損ウイルスベクター、を使用して発現される。ある実施形態では、ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである。
【００１９】
したがって、本開示は、次の実施形態を含むが、それらに限定されない。
１．細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、
１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップを含み、
各融合タンパク質は、融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、方法。
２．融合タンパク質の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える、１に記載の方法。
３．ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップをさらに含み、ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、１に記載の方法。
４．ポリヌクレオチドは、ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列をさらに備える、３に記載の方法。
５．外来性配列は、導入遺伝子を備える、４に記載の方法。
【００２０】
６．導入遺伝子は、修飾受容体をコードする、５に記載の方法。
７．ＧＲ機能の不活性化は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を防止する、１に記載の方法。
８．ＧＲ機能の不活性化は、Ｔ細胞アネルギーを防止する、１に記載の方法。
９．
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、融合タンパク質。
１０．亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表２の行に示される順序で、一式のアミノ酸配列を備える、９に記載の融合タンパク質。
【００２１】
１１．９に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
１２．発現するステップは、細胞をウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、１に記載の方法。
１３．ベクターは、複製欠損である、１２に記載の方法。
１４．ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、１２に記載の方法。
１５．ＧＲ遺伝子中に外来性配列を備える細胞を選択する方法であって、
１対の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、各融合タンパク質は、融合タンパク質がＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断半ドメインと、
を備える、ステップと、
ポリヌクレオチドを細胞に導入するステップであって、ポリヌクレオチドは、２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、ステップと、
ＧＲ遺伝子中に外来性配列を備えない細胞が破壊されるような条件下で、該細胞を天然または合成コルチコステロイドで処置することにより、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択するステップと、
を含む、方法。
【００２２】
１６．コルチコステロイドは、合成である、１５に記載の方法。
１７．コルチコステロイドは、デキサメタゾンである、１６に記載の方法。
１８．外来性配列は、導入遺伝子を備える、１５に記載の方法。
１９．発現するステップは、細胞をウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、１５に記載の方法。
２０．ベクターは、複製欠損である、１９に記載の方法。
２１．ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、例示的プラスミド構築物の概略図である。「ＣＭＶプロモータ」は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータを意味し、「ＺＦＮ」は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする配列（例えば、切断半ドメインに融合される亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン）を意味し、「ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ」は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化信号を意味し、「ＳＶ４０プロモータ」は、シミアンウイルス４０からの主要プロモータを意味し、「ＮｅｏＲ」は、ネオマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレームを意味し、「ＳＶ４０ ｐＡ」は、シミアンウイルス４０の主要転写単位からのポリアデニル化信号を意味し、「ＣｏＩＥｌ」はコリシンＥ１からの複製起点を意味し、「ＡｍｐＲ」は、アンピシリン耐性をコードするβラクタマーゼ遺伝子を意味する。
【図２】２つの異なる亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、例示的プラスミド構築物の概略図である。次の追加を伴って、略称は図１と同じである。「２Ａ」は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）リボソームスタッタリングシグナルを意味し、「ＫａｎＲ」は、カナマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレームを意味し、「ｐＵＣ ｏｒｉ」は、ｐＵＣ １９プラスミドからの複製起点を意味する。
【図３】パネルＡおよびＢは、造血細胞中（Ｋ５６２）のＧＲ遺伝子座中のＺＦＮによる切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。図３Ａは、エクソン３における切断の分析を示し、図３Ｂは、エクソン６における切断の分析を示す。１０％アクリルアミドゲルのエチジウムブロマイド染色を示す。
【図４】パネルＡおよびＢは、ＧＲ遺伝子座へのゼタカイン導入遺伝子のＺＦＮ介在性標的化組み込みを示す図である。 デキサメタゾンの存在下または不在下でＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナーＺＦＮ構築物を形質移入されたＣＥＭ１４細胞のＰＣＲ分析を示す図である。「＋」があるレーンは、デキサメタゾンで処置された細胞を示し、「−」があるレーンは、デキサメタゾンで処置されていない多細胞を示す。「Ｍ」は、マーカレーンを示し、「ｕｎ」は、非形質移入細胞を示し、「ゼタカイン」は、ＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナー構築物を形質移入された細胞を示し、「ｐ．ｃ．」は、陽性対照を示し、「ｎ．ｃ．」は、陰性対照を示す。 図４（Ｂ）において、ＳｅｘＡ１で消化されたＣＥＭ １４ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す図である。「Ｍ」は、マーカレーンを示し、「ｕｎ」は、デキサメタゾンで処置された非形質移入細胞を示し、「ゼタカイン」は、ＧＲ−ＺＦＮおよびゼタカインドナー構築物を形質移入され、デキサメタゾンで処置された細胞を示す。また、矢印により、１．６ｋｂマーカ帯域、野生型５．２ｋｂ帯域、および組み込まれたゼタカイン導入遺伝子（ＴＩ）を表す２．０ｋｂ帯域も示す。
【図５】ヒトグルココルチコイド受容体に対する抗体で調査された、タンパク質ブロットの化学発光像を示す図である。「ＣＥＭ １４」は、非形質移入細胞を意味し、「ＺＦＮ」は、ＧＲ遺伝子のエクソン３を標的とする２つのＺＦＮをコードする配列、ゼタカインカセットを含有する配列、およびＧＲ遺伝子と相同の配列を含有するプラスミドが形質移入されていたＣＥＭ１４細胞を意味する。全長および短縮ＧＲタンパク質に対応する帯域を写真の左側に示す。
【図６】ＣＤ−８＋Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子座のエクソン３中のＺＦＮによる切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。１０％アクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。略称は次の通りである。「ｕｎ」は、非形質移入細胞を意味し、「ＧＦＰ」は、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを形質移入された細胞を意味する。形質移入細胞中に発現される亜鉛フィンガーヌクレアーゼの亜鉛フィンガー部分の同一性を、２つの最右レーンの上側に示す。詳細については、表１および２を参照されたい。
【図７】パネルＡおよびＢは、デキサメタゾンによる処置の前（図７Ａ）および後（図７Ｂ）の、ＣＤ−８＋Ｔ細胞中のＺＦＮによるＧＲ切断を明示する、Ｃｅｌ Ｉアッセイの結果を示す図である。「ＺＦＮ−１０」は、１０の感染の多重度（ｍｏｉ）でＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＺＦＮ−３０」は、３０のｍｏｉでＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＺＦＮ−１００」は、１００のｍｏｉでＺＦＮペア９６６６および９６７４を持つＡｄ５／Ｆ３５ベクターに感染した細胞を意味し、「ＧＦＰ」は、１００のｍｏｉで緑色蛍光タンパク質をコードする対照Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスを形質移入された細胞を意味する。修飾頻度（割合）を様々なレーンの下に示す。
【図８】８日間の１０−４Ｍデキサメタゾンによる第２の処置の前および後に細胞の生存を比較することによって決定されるような、実施例７に記載されるＣＤ８＋細胞プールのグルココルチコイド耐性を表すグラフである。
【図９】パネルＡおよびＢは、２つの別個の実験からのＧＲタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。パネルＡは、実施例７に記載されるＣＤ８＋細胞プールから、ウイルス形質導入に使用されたゼタカイン発現ＣＤ８＋細胞プール（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）から、およびＺＦＮ １００プールのサブクローン（「１０Ａ１」）から抽出されたタンパク質の結果を示す。各パネルを調査するために使用された抗体をブロットの左側に列挙する。ＴＦＩＩＢ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を、負荷対照として使用した。ＧＲ抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。パネルＢは、ＧＲ−ＺＦＮ発現Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスで処置されたＣＭＶへの特異性を伴うＣＤ８＋細胞の様々なサブクローンにおけるＧＲタンパク質レベルを示す。クローン名をレーンの上側に示し、「模擬」は、模擬の感染した開始ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋細胞プールを指す。
【図１０】パネルＡからＤは、指示遺伝子の発現に対する、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。パネルＡは、ＩκＢαの発現を示し、パネルＢは、ＧＩＬＺの発現を示し、パネルＣは、ＭＫＰ−１の発現を示し、パネルＥは、ＩＦＮγの発現を示す。試験されたサンプルをバーの下に示し、サンプルは未処置（「ｕｎ」）またはデキサメタゾンで２０時間処置された（「ｄｅｘ」）のいずれかであった。
【図１１】グリオーマ細胞による刺激時のＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γサイトカイン放出を表すグラフである。ＣＤ８＋Ｔ細胞プールをバーの下に示す。「Ｄｅｘ」とは、１０−６Ｍデキサメタゾンで処置された細胞を指す。「Ｕ８７ＭＧ」とは、グリア芽腫刺激細胞の存在下で培養された細胞を指す。
【図１２】パネルＡからＥは、対照およびＧＲ−ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用したクロム放出アッセイの結果を表すグラフである。使用された細胞を各グラフの上側に記述する。サンプルは、様々なエフェクタ：標的比で右側に示される標的細胞株を使用して、得た。クロム放出の割合を、各データ点について、エフェクタ：標的比に対して描画する。
【図１３】パネルＡからＣは、ルシフェラーゼ標的Ｕ８７ＭＧ細胞を使用した、同所性グリア芽腫マウスモデルにおける腫瘍細胞から放出された光子を表すグラフである。パネルＡは、指示動物へのＰＢＳ対照注入からの光子放出を示す。パネルＢは、ＧＦＰ１００対照を注入された動物からの光子放出を示す。パネルＣは、ＺＦＮ１００（ｍｏｉ １００でのＧＲ標的化ＺＦＮ）を注入された動物からの光子放出を示す。
【図１４】パネルＡからＤは、グルココルチコイドホルモンの投与の存在または非存在下で、同所性マウスグリア芽腫モデルにおける腫瘍細胞から放出された光子を表すグラフである。図１４Ａおよび１４Ｂは、デキサメタゾンの非存在（図１４Ａ）および存在（図１４Ｂ）下でのＰＢＳ対照注入からの光子放出を示す。図１４Ｃおよび１４Ｄは、デキサメタゾンの非存在（図１４Ｃ）または存在（図１４Ｄ）下で、腫瘍細胞にＺＦＮ処置クローン１０Ａ１を注入した後のマウスの腫瘍細胞からの光子放出を示す。
【図１５】ＳＥＬＥＸによる個別亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合特異性を決定するための実験的概要を表す、概略図である。ビオチン化抗ＨＡ Ｆａｂ抗体断片の存在下で、赤血球凝集素で標識されたＺＦＮを無作為化ＤＮＡ配列のプールによりインキュベートした。標識されたＺＦＮ−ＤＮＡ複合体をストレプトアビジン被覆電磁ビーズで捕獲し、結合ＤＮＡを解放し、ＰＣＲによって増幅した。開始配列として以前に溶出および増幅したＤＮＡのプールを使用して、このプロセスを３回反復した。４回目の反復後、溶出したＤＮＡ断片を配列決定し、コンセンサス配列を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書では「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」と呼ばれる、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメイン（または切断半ドメイン）とを備える、融合タンパク質を利用して、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードする遺伝子の一次配列を変更するのに有用な組成物および方法を本明細書で開示する。そのような配列変異は、ヒトＧＲ機能の不活性化をもたらすことができる。当該分野で公知のように、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択方法によって、または合理的設計の技術を使用することによって、選択した任意の標的ＤＮＡ配列を結合するように遺伝子操作することができる。転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む、様々な種類の機能ドメインへの、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの融合もまた、記載されている。例えば、その開示が、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号および第６，９３３，１１３号、ならびに米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい。したがって、選択した配列に対する切断特異性を有する、カスタムエンドヌクレアーゼである切断ドメイン（すなわち、２本鎖ＤＮＡを切断する能力があるポリペプチドドメイン）としても知られる、ヌクレアーゼドメインへの、遺伝子操作されている亜鉛フィンガー結合ドメインの融合を構築することができる。ある実施形態では、遺伝子操作されている亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、「切断半ドメイン」（すなわち、二量化されると、２本鎖ＤＮＡ切断活性を保有する、ポリペプチドドメイン）に融合され、１対のそのような融合タンパク質は、標的化ＤＮＡ切断に使用される。
【００２５】
ゲノムＤＮＡの切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）として知られる、細胞修復機構の誘導をもたらすことができる。切断されたＤＮＡ末端を再接合するプロセスにおいて、ＮＨＥＪはしばしば、ＤＮＡ切断の部位で、またはその周囲で、突然変異を配列に導入する。修復プロセスのエラーが発生しやすい性質は、エラーが発生しやすい修復が標的配列の変異を引き起こすまで標的配列を引き続き結合および切断する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの能力と一体になって、切断の部位またはその付近で、突然変異の蓄積を高頻度でもたらす。したがって、標的切断の部位またはその付近で、配列変化（すなわち、突然変異）を誘導するために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによる内因性ゲノムＤＮＡ配列の標的切断を使用することができる。ヌクレオチド配列のそのような変化がタンパク質をコードするゲノムの領域で生じた場合、それらは通常、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変異をもたらす。例えば、リーディングフレームの変異は、早期の翻訳終結により、短縮タンパク質の産生をもたらすことができる。あるいは、誤ったアミノ酸がコードされる場合がある。いずれにしても、非機能性ポリペプチドが産生される。ＮＨＥＪ後の配列変異の付加的な結果は、変異配列によってコードされるｍＲＮＡのナンセンス変異による崩壊である。したがって、選択した遺伝子の機能を不活性化するために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用する標的化ＤＮＡ切断を使用することができる。不活性化は、両方の対立遺伝子の突然変異生成、または単一の対立遺伝子の突然変異生成のいずれかによって達成され、ドミナントネガティブ変異タンパク質を生成することができる。
【００２６】
内因性染色体ＤＮＡ中の所定部位での標的切断はまた、相同指向性および相同独立性両方の機構によって、切断の部位またはその付近での外来性配列の組み込みを促進するためにも、使用することができる。相同依存性組み込みに対しては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼに加えて、標的切断部位の両側にゲノム配列と相同な配列を含有する、「ドナー配列」が、細胞に提供される。そのようなドナー配列はまた、標的切断部位の付近にあり、任意で２列の相同配列間に配置される、ゲノム配列と非相同である配列も含有することができる。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号（２００５年３月２４日）、および米国特許出願第１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日）を参照されたい。外来性配列の組み込みが、両方の対立遺伝子において遺伝子の転写領域内で生じた場合、遺伝子の不活性化が起こり得る。最終的に、内因性染色体ＤＮＡ中の２つ以上の部位での標的切断は、切断部位間のゲノム配列の欠失をもたらすことができる。その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００６−０１８８９８７号（２００６年８月２４日）を参照されたい。したがって、遺伝子機能は、先述の機能のいずれかによって不活性化することができ、その全ては、１つ以上の亜鉛フィンガーヌクレアーゼを伴う内因性染色体ＤＮＡの標的切断に依存する。
【００２７】
本開示は、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子を突然変異させるための方法および組成物を提供する。そのような突然変異は、ＧＲ機能の損失を引き起こし、対象の免疫機能の変調をもたらすことができる。ある実施形態では、ＧＲ遺伝子の突然変異は、ヒトＧＲ遺伝子座への外来性配列の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ介在性組み込みに起因する。付加的な実施形態では、外来性配列は、修飾受容体分子をコードする配列を備える。
【００２８】
本明細書で開示される方法および組成物は、特定細胞群におけるグルココルチコイド受容体機能の永久撤廃を可能にする。このことは、例えば、患者に特定の免疫反応を生じさせることが可能な免疫細胞の一部を保持することを可能にしながら、それらの患者を免疫抑制グルココルチコイドホルモンで処置することを可能にする。
【００２９】
治療的導入遺伝子に対する規定の組み込み部位としてのＧＲ遺伝子座の使用を促進する、方法および組成物も提供する。
【００３０】
概略
この方法の実践、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、染色質構造分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、および当該技術分野内であるような関連分野における、従来技術を採用する。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７および定期的更新、ならびにシリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照されたい。
【００３１】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互交換可能に使用され、線形または円形配座、かつ１本鎖または２本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的として解釈されない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸塩部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定ヌクレオチドの類似体には、同じ塩基対合特異性があり、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する自然発生アミノ酸の化学類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも該当する。
【００３３】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は概して、１０−６ Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強さを指し、増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関性がある。
【００３４】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自身に（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するように）結合することができ、および／または、１つ、または複数の異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有することができる。
【００３５】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーを通した配列特異的な様式でＤＮＡを結合する、タンパク質、またはより大型のタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語はしばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３６】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。亜鉛フィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、設計／組成が主に合理的基準に起因する、自然に発生しないタンパク質である。設計の合理的基準は、置換法則、および既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、および第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５８号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５９号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０６０号、国際公開第特許 ０２／０１６５３６号、および国際特許公開第ＷＯ ０３／０１６４９６号も参照されたい。
【００３７】
「選択した」亜鉛フィンガータンパク質は、産生が主にファージ提示法、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の経験的プロセスに起因する、自然にないタンパク質である。例えば、米国特許第ＵＳ ５，７８９，５３８号、第ＵＳ ５，９２５，５２３号、第ＵＳ ６，００７，９８８号、第ＵＳ ６，０１３，４５３号、第ＵＳ ６，２００，７５９号、国際特許公開第ＷＯ ９５／１９４３１号、国際特許公開第ＷＯ ９６／０６１６６号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５４３１１号、国際特許公開第ＷＯ ００／２７８７８号、国際特許公開第ＷＯ ０１／６０９７０号、国際特許公開第ＷＯ ０１／８８１９７号、および国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００３８】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡとなり得て、線形、円形、または分岐となり得て、１本鎖または２本鎖のいずれかとなり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、長さが約２から１０，０００のヌクレオチドの間（またはその間あるいはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、長さが約１００から１，０００のヌクレオチドの間（またはその間の任意の整数値）、より好ましくは、長さが約２００から５００のヌクレオチドの間となり得る。
【００３９】
「相同、非相同配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は、第２の配列とは同一ではない、第１の配列を指す。例えば、変異遺伝子の野生型配列を備えるポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列と相同であり、非同一である。ある実施形態では、２つの配列間の相同性の程度は、正常な細胞機構を利用して、その間の相同組み換えを可能にするのに十分である。２つの相同な非同一配列は、任意の長さとなり得て、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドほども小さく（例えば、標的化相同組み換えによる、ゲノム点突然変異の補正のため）、または１０キロベース以上ほども大きくなり得る（例えば、染色体中の所定の異所での遺伝子の挿入のため）。相同な非同一配列を備える２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０から１０，０００の間のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【００４０】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で公知である。典型的に、そのような技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定するステップ、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定するステップ、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較するステップを含む。ゲノム配列もまた、このように決定および比較することができる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性率を決定することによって比較することができる。核酸またはアミノ酸配列にかかわらず、２つの配列の同一性率は、２つの整列された配列間の完全適合の数を、より短い配列の長さで除し、１００を乗じたものである。核酸配列の近似整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化された、採点マトリクスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性率を決定する、このアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションでＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法の既定パラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）に記載されている。本開示との関連で同一性率を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ． Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ． Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によって頒布される、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権がある、プログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用するものである。このパッケージ一式からＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用することができ、初期設定パラメータが採点表（例えば、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが１、およびギャップが６）に使用される。生成されるデータから、「適合」値は、配列同一性を反映する。同一性率または配列間の類似性を計算するための他の適切なプログラムが、当該技術分野で概して公知であり、例えば、別の整列プログラムは、初期設定パラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のような既定パラメータを使用して、使用することができる。遺伝子コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予期＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、表記＝５０配列、並び替え＝高スコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見ることができる。本明細書に記載される配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８０％から１００％、およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性率は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００４１】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定した２本鎖を形成した後に、１本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定を可能にする条件下で、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を使用して決定されるように、分子の規定の長さに対して少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％配列同一性を呈する時に、相互に実質的に相同である。本明細書で使用されるような、「実質的に相同」もまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列への完全同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定システムに対して定義されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で識別することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義するステップは、当該技術分野の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記参照、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００４２】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションを次のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的同一核酸配列は、標的分子への完全同一配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用して評価することができる。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで様々である条件を使用して、行うことができる。低ストリンジェンシーの条件が採用される場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性の部分的な程度さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して、評価することができるため、非特異的結合事象がない場合、二次調査は標的にハイブリッド形成しない。
【００４３】
ハイブリダイゼーションを用いた検出システムを利用する時、参照核酸配列に補完的な核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブおよび参照配列は、選択的に互いにハイブリッド形成または結合して、２本鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的に参照配列をハイブリッド形成することが可能な核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列との少なくとも約７０％配列同一性を有する、長さが少なくとも約１０〜１４のヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下で、ハイブリッド形成する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列との少なくとも約９０〜９５％配列同一性を有する、長さが少なくとも約１０〜１４のヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で公知のように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００４４】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が不適合ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を疎外する程度を指し、より高いストリンジェンシーは、不適合ハイブリッドに対するより低い耐性と相関性がある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、それらに限定されない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増加される。
【００４５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬の有無（例えば、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度、および時間パラメータといった因子を変えることによって、ならびに洗浄条件を変えることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために無数の同等な条件を採用できることが、当該技術分野で周知である。特定の一式のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００４６】
「組み換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的で、「相同組み換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞における２本鎖切断の修復中に行われる、そのような交換の特殊形態を指す。このプロセスは、ドナーから標的への遺伝情報の転送につながるため、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験したもの）のテンプレート修復のために「ドナー」分子を使用し、「非交差遺伝子変換」または「短経路遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、そのような転送は、破壊標的とドナーとの間に形成するヘテロ２本鎖ＤＮＡの不適合補正、および／または、ドナーが標的の一部となる遺伝子情報を再合成するために使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴うことができる。そのような特殊ＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変異をもたらす。
【００４７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素または化学的加水分解を含むがそれに限定されない、種々の方法によって開始することができる。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能であり、２つの異なる１本鎖切断事象の結果として２本鎖切断を生じることができる。ＤＮＡ切断は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの産生をもたらすことができる。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化２本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【００４８】
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断に対する触媒活性を保有する、１つ以上のポリペプチド配列を備える。切断ドメインは、単一ポリペプチド鎖に含有することができ、または切断活性は、２つ（以上）のポリペプチドの関連に起因することができる。「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるか、または異なるかのいずれか）と併せて、切断活性（好ましく２本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。「第１および第２の切断半ドメイン」、「＋および−切断半ドメイン」、および「右および左切断半ドメイン」という用語は、二量化する切断半ドメイン対を指すために、相互交換可能に使用される。
【００４９】
「遺伝子操作されている切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の遺伝子操作切断半ドメイン）との偏性ヘテロ二量体を形成するよう修飾されている、切断半ドメインである。参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許公報第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号、米国暫定出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）も参照されたい。
【００５０】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを備える核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を備える。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のうちの２つずつを備える八量体と関連する、ＤＮＡの約１５０の塩基対を備え、（有機体に応じて様々な長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概してリンカーＤＮＡと関連する。本開示の目的で、「クロマチン」という用語は、原核または真核両方の、あらゆる種類の細胞核タンパク質を含有することを意図する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソーム両方のクロマチンを含む。
【００５１】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を備える、クロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしば、細胞のゲノムを備える全ての染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を備えることができる。
【００５２】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を備える、複製核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例は、プラスミド、および特定のウイルスゲノムを含む。
【００５３】
「到達可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造に梱包されないと考えられている。到達可能領域の異なる構造はしばしば、例えば、ヌクレアーゼといった、化学的および酵素プローブへのその感度によって検出することができる。
【００５４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在する十分な条件が提供されれば、結合分子が結合する、核酸の一部を定義する、核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００５５】
「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝子的，生化学的、または他の方法によって細胞に導入することができる、分子である。「細胞中の通常の存在」は、細胞の特定発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中のみに存在する分子は、成人筋細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンを備えることができる。
【００５６】
外因性分子は、とりわけ、組み合わせ化学プロセスによって生成されるような小分子、タンパク質等の巨大分子、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を備える任意の複合体となり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、１本または２本鎖となり得て、線形、分岐、または円形となり得て、任意の長さとなり得る。核酸は、２本鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、およびヘリカーゼを含むが、それらに限定されない。
【００５７】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸となり得る。例えば、外因性核酸は、細胞、または通常は細胞中に存在しない染色体に導入される、感染ウイルスゲノム、プラスミド、またはエピソームを備えることができる。細胞へ外因性分子を導入する方法は、当業者に公知であり、脂質介在転移（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在転移、およびウイルスベクター介在転移を含むが、それらに限定されない。
【００５８】
対称的に、「内因性」分子は、特定環境条件下で特定発生段階において特定細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体または他の細胞小器官、または自然発生エピソーム核酸を備えることができる。付加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【００５９】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合される、分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子となり得るか、または、異なる化学型の分子となり得る。第１の種類の融合分子の例は、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）を含むが、それらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および副溝結合剤と核酸との間の融合を含むが、それらに限定されない。
【００６０】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因することができ、ポリヌクレオチドは、転写され、転写産物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシングポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達の方法は、本開示の別の場所で提示する。
【００６１】
「遺伝子」は、本開示の目的で、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびに、そのような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモータ配列、終結因子、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサ、サイレンサ、絶縁体、境界要素、複製起点、マトリクス取着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。
【００６２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子産物への、遺伝子に含有される情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質となり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されるＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質を含む。
【００６３】
遺伝子発現の「変調」とは、遺伝子の活動の変化を指す。発現の変調は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、それらに限定されない。
【００６４】
「真核」細胞は、真菌細胞（酵母菌等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含むが、それらに限定されない。
【００６５】
「関心の領域」は、例えば、外因性分子を結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内の、あるいはそれに隣接する非コード配列等の、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組み換えの目的となり得る。関心の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノム中に存在することができる。関心の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラ配列、またはイントロン等の転写された非コード領域内、または、コード領域の上流または下流のいずれかにある、非転写領域内となり得る。関心の領域は、単一ヌクレオチド対ほども小さいか、または長さが最大で２，０００ヌクレオチド対、または任意の整数値のヌクレオチド対となり得る。
【００６６】
「操作可能な連結」および「操作可能に連結された」（または「動作可能に連結された」）という用語は、２つ以上の構成要素（例えば、配列要素）の並置に関して相互交換可能に使用され、その場合、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに加えられる機能を媒介することができるという可能性を可能にするように、構成要素が配設される。例証として、プロモータ等の転写調節配列は、１つ以上の転写調節因子の有無に応じて、転写調節配列がコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に操作可能に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスで操作可能に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサは、たとえ連続的でなくても、コード配列に操作可能に連結される転写調節配列である。
【００６７】
融合ポリペプチドに関して、「操作可能に連結された」という用語は、構成要素のそれぞれが、他の構成要素への連結において、そのように連結されなかった場合に果たすのと同じ機能を果たすという事実を指す。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合される、融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能である一方で、切断ドメインは、標的部位の付近でＤＮＡを切断することが可能である場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、操作可能に連結している。
【００６８】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同じ数の残基を保有することができ、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換基を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリッド形成する能力）を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲルの電気泳動によって化学分析することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、２ハイブリッドアッセイ、または遺伝子学および生化学両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ９８／４４３５０を参照されたい。
【００６９】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計
亜鉛フィンガーヌクレアーゼの構築は、例えば、米国特許出願公報第２００３−０２３２４１０号、第２００５−００２６１５７号、第２００５−００６４４７４号、および第２００５−０２０８４８９号に記載されており、その開示は、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。簡潔に言えば、２、３、４、５、６以上の亜鉛フィンガーを備える、非自然発生亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを、所定の標的ヌクレオチド配列に結合するように遺伝子操作する。遺伝子操作されている亜鉛フィンガー結合ドメインを、ヌクレアーゼドメイン、切断ドメイン、または切断半ドメインに融合し、標的ヌクレオチド配列またはその付近でのＤＮＡ切断が可能な、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを形成する。ある実施形態では、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの概念設計後、標準の分子生物学的方法を使用して、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを構築する。
【００７０】
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の突然変異生成を促進するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼを、次のように設計および合成する。ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子の関連部分のヌクレオチド配列が得られる。５〜６のヌクレオチド対によって分離される１対の標的配列に対して、個別亜鉛フィンガーおよびそれらの標的部位のリスト、および／または２指分子およびそれらの標的部位のリストを含有する、コンピュータプログラムを任意で使用して、そのようにして得られた配列を走査し、各標的配列は、３、４、５、または６指亜鉛フィンガータンパク質によって結合することができる。例えば、米国特許第６，７８５，６１３号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ０１／５３４８０号、および米国特許出願公報第２００３／００９２０００号を参照されたい。ＺＦＰ設計のための付加的な方法は、例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，７３３，９７０号、第６，７４６，８３８号、第６，７８５，６１３号、第６，８６６，９９７号、第７，０３０，２１５号、国際特許公開第ＷＯ ０１／０８８１９７号、国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号、および米国特許出願公報第２００３／００４４９５７号、第２００３／０１０８８８０号、第２００３／０１３４３１８号、および第２００４／０１２８７１７号に開示されている。
【００７１】
前のステップで識別された各標的配列について、ＦｏｋＩ切断半ドメインと標的配列に結合する亜鉛フィンガータンパク質との間の融合をコードする遺伝子を合成する。例えば、米国特許第５，４３６，１５０号、国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号を参照されたい。各融合タンパク質は、例えば、Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：６３２−６３７によって記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、その標的配列に結合する親和性について検査することができる。所定の閾値を超える標的配列結合親和性を有するタンパク質は、細胞に基づいたレポーターアッセイでのさらなる検査を受けることができる。
【００７２】
任意で、上記のような１つ以上の融合タンパク質の結合特異性を評価し、必要であれば、１つ以上のアミノ酸残基の変更（無作為化を含む）によって改善し、その後、標的配列に対するファージ提示アッセイ（例えば、国際特許公開第ＷＯ ９６／０６１６６号参照）、および／または米国特許第６，７９４，１３６号に記載の反復最適化の方法を行うことができる。
【００７３】
細胞に基づいた検査は、例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−６５１、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号に記載されているように行われる。簡潔に言えば、適切な細胞株において、ドキシサイクリン誘導性プロモータの転写制御下で、上記のように識別される標的配列対を、欠陥染色体緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に挿入する。２つの亜鉛フィンガー／ＦｏｋＩ融合タンパク質（そのそれぞれは標的配列のうちの１つに結合する）をコードする核酸と、欠陥染色体ＧＦＰ遺伝子の相同指向性修復に対するテンプレートの働きをする場合に、機能的ＧＦＰ遺伝子を再構成する配列を含有する核酸とを、細胞に形質移入する。相同指向性修復が生じた細胞は、ドキシサイクリンによる誘導後に、蛍光活性化細胞分類によって、識別および定量することができる。
【００７４】
ヒトグルココルチコイド受容体遺伝子を標的とする亜鉛フィンガー結合ドメイン
本明細書で開示される、ＧＲの不活性化のための方法は、（１）選択した標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（２）切断ドメインまたは切断半ドメインとを備える、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを利用する。ヒトＧＲ遺伝子中に標的部位を有する、任意のそのような亜鉛フィンガーヌクレアーゼを、開示された方法で使用することができる。あるいは、標的配列が適切な数のヌクレオチドによって分離される、それぞれ切断半ドメインを備える、任意の対の亜鉛フィンガーヌクレアーゼもまた、使用することができる。例えば、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９、およびＢｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００Ｉ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７を参照されたい。
【００７５】
ヒトＧＲ遺伝子中に標的部位を有する、例示的な亜鉛フィンガー結合ドメインを表１および２に開示する。表１は、例示的結合ドメインの標的配列、およびＧＲ遺伝子中の標的部位の場所を提供する。表２は、これらの結合ドメインの遺伝子操作されている認識領域（ＤＮＡ結合特異性の原因となっている）のアミノ酸配列を示す。亜鉛フィンガー配列をアミノからカルボキシの順序で示し、Ｆ１は、タンパク質のアミノ末端に最も近い亜鉛フィンガーを意味する。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
切断ドメイン
ＧＲ遺伝子中の標的部位に結合する任意の亜鉛フィンガーをヌクレアーゼと組み合わせて、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを形成することができる。上記のように、任意の切断ドメインまたは切断半ドメインを、本明細書に記載される亜鉛フィンガーヌクレアーゼで使用することができる。米国特許公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい。したがって、本明細書で開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、エンドまたはエクソヌクレアーゼから取得することができる。切断ドメインを抽出することができる例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、それらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する付加的な酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、また、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上は、切断ドメインおよび切断半ドメイン源として使用することができる。ある実施形態では、切断ドメインは、分離可能な結合および切断ドメインを有するヌクレアーゼ、例えば、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼから取得することができる。
【００８０】
例示的な切断半ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼから取得することができる。ある実施形態では、切断半ドメインは、分離可能な結合および切断ドメインを有するヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼから取得される。また、ホモ二量体化を最小限化する、または防ぐ、遺伝子操作されている切断半ドメイン（二量化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）が、例えば、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号および第２００６−０１８８９８７号に記載されている。Ｆｏｋ Ｉの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８におけるアミノ酸残基は全て、Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインの二量化に影響を及ぼすための標的である。
【００８１】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの付加的な遺伝子操作されている切断半ドメインを本明細書に記載する。第１の切断半ドメインは、Ｆｏｋ Ｉの位置４９０（下記に下線を引いた、野生型配列でのＥ）および５３８（下記に下線を引いた、野生型配列でのＩ）におけるアミノ酸残基での突然変異を含み、かつ第２の切断半ドメインは、アミノ酸残基４８６（下記に下線を引いた、野生型配列でのＱ）および４９９（下記に下線を引いた、野生型配列でのＩ）での突然変異を含む。
【００８２】
【化１】
【００８３】
上記に示されるように、４９０での突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）と交換し、５３８での突然変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と交換し、４８６での突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）と交換し、位置４９９での突然変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｅｕ（Ｌ）と交換する。具体的には、１つの切断半ドメイン中の位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、上記に示されるような「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定された遺伝子操作されている切断半ドメインを産生することによって、および、別の切断半ドメイン中の位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、上に示されるような「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定された遺伝子操作されている切断半ドメインを産生することによって、本明細書に記載される遺伝子操作されている切断半ドメインを調製した。これらの突然変異は、ホモ二量体を形成する、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ突然変異を含有する２つの切断半ドメインの能力低下をもたらし（野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインと比較して）、同様に、Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ突然変異を含有する２つの切断半ドメインもまた、ホモ二量体を形成することができない。しかしながら、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ突然変異を含有する切断半ドメインは、Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ 突然変異を含有する切断半ドメインを伴うヘテロ二量体を形成して、２本鎖ＤＮＡ切断が可能な機能的切断ドメインを再構成することが可能である。その上、Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ含有切断半ドメインとＱ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ含有切断半ドメインとの間のヘテロ二量化は、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメイン間の二量化と同様の効率で生じる。したがって、本明細書に記載される遺伝子操作切断されている半ドメインは、異常切断が最小限化または撤廃される、偏性ヘテロ二量体突然変異体である。
【００８４】
本明細書に記載される遺伝子操作されている切断半ドメインは、任意の適切な方法を使用して、例えば、参照することによりその全体において本願に組み込まれる、米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号（実施例５）および米国特許出願整理番号第１１／４９３，４２３号（実施例３８）に記載されているような、野生型切断半ドメイン（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）の部位指向性突然変異生成によって、調製することができる。
【００８５】
治療の方法
ある種類の癌免疫療法では、Ｔ細胞は、腫瘍細胞特異的な抗原を認識する細胞表面タンパク質を発現するように遺伝子操作され、これらの遺伝子操作されているＴ細胞は、対象に導入される。例えば、表面上でＩＬ−１３受容体を過剰発現する腫瘍細胞を有する、グリア芽腫患者は、腫瘍の外科的切除後に、細胞表面に係留される「ゼタカイン」を発現する細胞障害性Ｔ細胞で処置することができる。ゼタカインは、細胞外ドメインを、細胞表面、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインに係留することが可能な、支持領域に連結される可溶性受容体リガンドを備える、細胞外ドメインから成るキメラ膜貫通免疫受容体である。Ｔリンパ球の表面上で発現されると、そのようなキメラ受容体は、Ｔ細胞活性を、可溶性受容体リガンドに特異的な受容体を発現する特定の細胞に方向付ける。
【００８６】
グリオーマおよびグリア芽腫の治療のために、ゼタカインは、ＩＬ−１３受容体を発現する細胞を標的とする。したがって、ゼタカインは、ＩｇＧのＦｃ領域に連結されるＩＬ−１３Ｒアルファ２特異性ＩＬ−１３変異ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の細胞外標的ドメインと、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメインと、ヒトＣＤ３ゼータ鎖とを備える、グリオーマ特異的な免疫受容体を構成することができる。そのようなゼタカインを発現するＴ細胞は、外科的腫瘍切除後に残っている、ＩＬ−１３過剰発現グリオーマおよびグリア芽腫腫瘍細胞を検出し、破壊することが可能である。例えば、その開示が、あらゆる目的で参照することにより、その全体において本願に組み込まれる、Ｋａｈｌｏｎ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：９１６０−９１６６、および米国特許出願公報第２００６−００６７９２０号、第２００５−０１２９６７１号、および第２００３−０１７１５４６号を参照されたい。
【００８７】
しかしながら、この方法の臨床用途は、脳腫瘍患者は、炎症および脳の腫脹を予防するために、腫瘍切除後に、グルココルチコイドホルモンでも処置しなければならないという事実によって妨げられる。このグルココルチコイド治療は、ゼタカイン含有Ｔ細胞の活性化を阻害し、したがって、それらの殺細胞活性を防ぐ。
【００８８】
本明細書で開示される方法および組成物は、ゼタカイン含有Ｔ細胞におけるＧＲ機能を根絶することを可能にすることにより、それらがグルココルチコイドの阻害効果に耐性を示すようにする。したがって、開示された方法および組成物の使用によって、術後のグリア芽腫患者は、残留腫瘍細胞を除去するように、グルココルチコイド（腫脹および炎症を予防するため）およびゼタカイン含有Ｔ細胞の両方で処置することができる。確かに、Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子の不活性化は、ＧＲ遺伝子座へのゼタカインをコードする配列の標的化組み込みによって実現することができ、単一ステップで両方の目的を実現する。
【００８９】
したがって、ある実施形態では、ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼがＴ細胞で発現され、ＧＲ遺伝視座中の部位で切断する。ＧＲ標的化亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含有する細胞は、ゼタカインをコードするドナーＤＮＡ分子と任意で接触されるため、ゼタカイン含有配列は、ＧＲ遺伝子座に組み込まれることにより、それらの細胞におけるＧＲ機能を不活性化する。
【００９０】
付加的な用途
遺伝子操作されているＴ細胞または単離Ｔ細胞による患者の治療は、これらの患者がまた、デカドロン等の免疫抑制剤でも処置される場合に、低下する。しかしながら、本明細書で開示されるように、ＧＲ機能を不活性化するためにＧＲ遺伝子座を標的とするＺＦＮを使用する、そのような治療用免疫細胞の修飾は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を受けない免疫細胞群の生成を可能にする。本明細書に記載される方法の高い効率は、他のいずれの技術でも可能ではない、選択マーカの非存在下でのＧＲ遺伝子の両方の対立遺伝子の同時崩壊を可能にする。Ｔ細胞は、あらゆる一次細胞のように、限定された複製能および有限寿命を有するため、ＧＲ遺伝子の両方の対立遺伝子における突然変異（ホモ接合体欠失を含む）を得ることができる速度もまた、重要な考慮事項である。
【００９１】
ヒト細胞中のＧＲ遺伝子座の配列の修飾のための、本明細書で開示される方法は、ＧＲ機能を欠く相当な数の細胞を含有する、細胞プールの生成を可能にし、また、ＧＲ活性を欠くクローン細胞株の単離も可能にする。そのような細胞は、Ｔ細胞および免疫系の他の細胞（例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、記憶細胞、マクロファージ）を含むが、それらに限定されず、その全ては、通常、グルココルチコイド受容体の作用により、グルココルチコイドホルモンの存在下で適切な活性化を受けることを妨げられる。
【００９２】
上記のように、これらの方法の１つの用途は、グルココルチコイドに反応しない脳腫瘍細胞を標的にするゼタカイン発現Ｔ細胞を提供するための、ＺＦＮの使用である。他の例は、例えば、免疫抑制剤の投与を受けている移植患者または他の免疫不全患者における、日和見感染を治療するために使用される、Ｔ細胞におけるＧＲのＺＦＮ媒介性不活性化を含む。
【００９３】
望ましくないＧＲ活性の付加的な臨床合併症もまた、特定の標的細胞群におけるＧＲ活性の不活性化によって緩和することができる。これに関連して、ＧＲの多面的活性は、部分的には、同じ遺伝子から生成される複数の受容体イソ型の存在に基づくことが注目される。例えば、Ｚｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ７０：４０７−４１７を参照されたい。本明細書に記載される、ＺＦＮ介在性ＧＲ遺伝子修飾の単一ヌクレオチドレベル分解能は、組織特異的なＺＦＮ発現（例えば、両方とも参照することにより組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公報第２００５−００６４４７４号を参照されたい）と組み合わせて、共に特定の組織における特定の受容体イソ型の崩壊を可能にし、他のいずれの技術でも可能ではない方法である。また、野生型ＧＲを、選択した特定のリガンドによって独占的に調節されるイソ型と交換するために、ＺＦＮを使用するＧＲ遺伝子の配列の変異を使用することができる。
【００９４】
逆に、ＧＲ遺伝子座における突然変異を伴う患者では、突然変異自体の補正を通して、または機能的ＧＲをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の標的化挿入によってのいずれかで、選択した標的組織におけるＧＲ活性を回復させるために、ＺＦＮ介在性ゲノム編集を使用することができる。
【００９５】
本明細書で開示される方法および組成物はまた、研究用途、薬剤スクリーニング、および標的検証のための細胞株を生成するために使用することができる。例えば、本明細書で開示されるようなＺＦＮを使用して、選択した細胞株におけるＧＲ機能を撤廃することにより、ＧＲ機能の存在または非存在下であることのみ異なる、対応対の同系細胞株の生成を可能にする。別の例として、ＧＲ遺伝子座へのレポータ遺伝子の挿入、またはＧＲタンパク質へのレポータの融合は、グルココルチコイド受容体の性質および調節の高分解能研究を促進する。そのような細胞株は、研究目的で、ならびに標的検証および薬剤スクリーニングなどの産業用途で使用することができる。同様に、ＺＦＮ介在性遺伝子補正は、ＧＲ遺伝子座に特定の変化を導入して、様々な受容体ドメインおよびイソ型を研究するための細胞株を生成するために、使用することができる。
【００９６】
最後に、ＧＲ遺伝子座の不活性化が介入の主要目的ではないが、修飾細胞に悪影響を及ぼさない場合、ＧＲ遺伝子座は、任意の遺伝子療法用途での任意の導入遺伝子に対する「セーフハーバー」組み込み部位として、使用することができる。したがって、本開示はまた、外来性配列がＧＲ遺伝子に組み込まれている細胞の選択のための方法も提供する。方法は、本明細書に記載されるようなＺＦＮで細胞中の内因性ＧＲ遺伝子を切断するステップと、外来性配列がＧＲ遺伝子に組み込まれるような条件下で、典型的に、ＧＲ相同性アームを伴うドナー構築物上にある、外来性配列（例えば、導入遺伝子）を細胞に導入するステップとを伴う。次いで、組み込まれた配列のない細胞（正常なＧＲ発現を伴う細胞）を破壊する、自然発生または合成コルチコステロイド（例えば、コルチゾール、デキサメタゾン等）に細胞を暴露することによって、組み込まれた外来性配列を伴う細胞を選択することができる。実施例４も参照されたい。
【００９７】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡ配列の送達のためのベクター
細胞への、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列の送達、および／またはドナーＤＮＡの送達に、任意のベクターを使用することができる。例示的なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスを含む。ＤＮＡはまた、形質移入、エレクトロポレーション、脂質介在性方法、遺伝子銃、およびリン酸カルシウム介在性導入によって、細胞に送達することもできる。
【００９８】
本明細書で開示される方法および組成物は、永久ゲノム変異（例えば、外来性配列の標的化突然変異または標的化組み込み）を生じるために一時的事象（ＺＦＮ介在性２本鎖切断）を利用するため、細胞中で持続する送達ベクターを使用する必要はない。したがって、非複製ウイルスベクターを送達媒体として使用することができる。したがって、複製欠損アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス（例えば、Ａｄ ５／３５）、および非統合レンチウイルスベクターは全て、送達媒体として適切である。
【００９９】
本用途で使用することができるアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの非限定的な例は、ヒトまたは非ヒト血清型に由来する、組み換え（Ｅ１欠失等）、条件付きで複製可能（腫瘍退縮性等）、および／または複製可能なＡｄベクター（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５、またはブタアデノウイルス−３）、キメラＡｄベクター（Ａｄ５／３５等）、または遺伝子操作されている繊維節タンパク質（節タンパク質のＨＩループ内のペプチド挿入等）を伴う指向性変異Ａｄベクター、および／または「中身がない」Ａｄベクター、例えば、免疫原性を低減し、かつＤＮＡペイロードのサイズを増加させて、ＺＦＮおよびドナー分子の両方の同時送達を可能にし、特に、大型導入遺伝子が標的化組み込みを介して組み込まれることを可能にするように、Ａｄゲノムからの全てのアデノウイルス遺伝子が削除されている、Ａｄベクターを含む。
【０１００】
複製欠損性組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、容易に多数の異なる細胞型に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子に取って代わるように遺伝子操作され、後に、複製欠損ベクターは、トランスにおける欠失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中に繁殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉にあるもの等の、非分裂の分化細胞を含む、生体内の複数種類の細胞を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大量運搬能力を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用の例は、筋肉注射による抗腫瘍予防接種のためのポリヌクレオチド療法を伴った。Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９．
【０１０１】
臨床試験での遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用の付加的な例は、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−２１８；Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：５−１０；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３、およびＴｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３を含む。
【０１０２】
ある実施形態では、Ａｄベクターは、２つ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含有する、キメラアデノウイルスベクターである。例えば、Ａｄベクターは、Ａｄ５／３５ベクターとなり得る。Ａｄ５／３５は、Ａｄ５の繊維タンパク質をＢ群Ａｄ３５からの繊維タンパク質と交換することによって作成される。Ａｄ５／３５ベクターおよびこのベクターの特性は、例えば、Ｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：６６４−６７７；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３７７−３８８；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．６：６３１−６４１；Ｓｃｈｒｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３２：５３６−５４６；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１１：３８４−３９３；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２５６７−２５８３、およびＳｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：４９６−５０９に記載されている。
【実施例】
【０１０３】
次の実施例は、限定的ではなく、請求された主題を例証するものとして提示する。
実施例１：ヒトＧＲ遺伝子を標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミド送達媒体の構築
各標的配列を３、４、５、または６指亜鉛フィンガータンパク質によって結合することができる、５〜６のヌクレオチド対によって分離される１対の標的配列に対して、個別亜鉛フィンガーおよびそれらの標的部位のリスト、および／または２指分子およびそれらの標的部位のリストを含有する、コンピュータプログラムを任意で使用して、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子の配列を走査することによって、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインに対する標的部位を選択した。例えば、米国特許第６，７８５，６１３号、国際特許公開第ＷＯ ９８／５３０５７号、国際特許公開第ＷＯ ０１／５３４８０号、および米国特許出願公報第２００３／００９２０００号を参照されたい。ＺＦＰ設計のための付加的な方法は、例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，７３３，９７０号、第６，７４６，８３８号、第６，７８５，６１３号、第６，８６６，９９７号、第７，０３０，２１５号、国際特許公開第ＷＯ ０１／０８８１９７号、国際特許公開第ＷＯ ０２／０９９０８４号、および米国特許出願公報第２００３／００４４９５７号、第２００３／０１０８８８０号、第２００３／０１３４３１８号、および第２００４／０１２８７１７号に開示されている。
【０１０４】
前のステップで識別された標的配列のいくつかについて、ＦｏｋＩ切断半ドメインと標的配列に結合する亜鉛フィンガータンパク質との間の融合をコードする遺伝子を合成した。例えば、米国特許第５，４３６，１５０号、国際特許公開第ＷＯ ２００５／０８４１９０号、および米国特許出願公報第２００５／００６４４７４号を参照されたい。
そのような融合遺伝子を構築し、それらをプラスミドに導入するために、標準の分子生物学的方法を使用した。例示的な発現構築物を図１および２に示す。
【０１０５】
実施例２：遺伝子操作されている亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用する、ヒトＧＲ遺伝子の標的切断
ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２４３）を培養した。１×１０６細胞／ｍｌの密度で、２×１０６個の細胞をペレット化し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイス（Ａｍａｘａ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、２つのＺＦＮ発現ベクターのそれぞれ２．５μｇを形質移入した。一式の細胞に、エクソン３標的化９６６６および９６７４結合ドメイン（表１および２参照）を備える亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするプラスミドを形質移入した。第２の一式の細胞に、エクソン６標的化８６５３および９７３７結合ドメイン（表１および２参照）を備える亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードするプラスミドを形質移入した。対照は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドが形質移入された細胞、および非形質移入細胞を含んだ。
【０１０６】
形質移入の３日後、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、細胞からＤＮＡを単離した。ＧＲ遺伝子座のエクソン３またはエクソン６のいずれかに特異的なプライマ（表３参照）を使用するＰＣＲ増幅に対するテンプレートとして、このＤＮＡ（１００ｎｇ）を使用した。増幅産物を変性させ、次いで、リアニールし、リアニールした産物を不適合特異的なヌクレアーゼＣｅｌ−Ｉ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）に暴露させた。Ｃｅｌ−Ｉ処置の産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。増幅産物群がヌクレオチド配列に関して同質である場合、Ｃｅｌ−Ｉ切断に耐性を示す完全適合２本鎖が、変性およびリアニーリング後に産生されるべきである。一方で、増幅産物の一部における挿入物、欠失、および／または不適合の存在により、増幅産物が異質である場合、リアニーリングは、Ｃｅｌ−Ｉ切断の影響を受けやすい、配列不適合を含有するいくつかの２本鎖を生成する。結果として、増幅産物よりも小さい産物は、ゲル上で欠失される。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
結果を図３に示す。非形質移入細胞からの、およびＧＦＰをコードするプラスミドが形質移入された細胞からの、エクソン３およびエクソン６特異的なＤＮＡの増幅産物は、同質増幅産物群を示す、変性、リアニーリング、およびＣｅｌ Ｉ処置後に、単一帯域を生じる（各パネルのそれぞれ左および中央レーン）。対称的に、エクソン３における標的部位（９６６６および９６７４）を伴う亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミドが形質移入された細胞からのエクソン３特異的な増幅産物は、変性、リアニーリング、およびＣｅｌ Ｉ処置後に、２つのより小さい産物を生じる（左パネル、最右レーン）。これらのより小さい産物の存在は、リアニールされたＤＮＡ中の一意の場所での配列不適合の存在を示す。同様に、エクソン６における標的部位（８６５３および９７３７）を伴う亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、プラスミドが形質移入された細胞からのエクソン６特異的な増幅産物は、エクソン６における標的切断を示す、（同様の分子量の）２つのより小さい産物を生じる。
【０１０９】
実施例３：ヒトＧＲ遺伝子における標的切断によって誘導される突然変異の性質
ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞（Ｍ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡより入手したグルココルチコイド感受性リンパ細胞株）を培養した。１×１０６細胞／ｍｌの密度で、２×１０６個の細胞をペレット化し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイスを使用して、エクソン３標的化８６６７および８６６８ＤＮＡ結合ドメイン（表１および２参照）を伴うＺＦＮをコードするプラスミドを形質移入した。２．５μｇの各プラスミドを使用した。１４日間にわたる１０−５Ｍデキサメタゾンへの暴露によって、ＧＲ機能を欠く細胞を選択し、ＧＲエクソン３特異的なプライマ（表３参照）を使用したＰＣＲによって、デキサメタゾン耐性細胞から単離されたＤＮＡを増幅した。アガロースゲル上で増幅反応混合物を分画し、予測された増幅産物（ＧＲ遺伝子中のプライマ配列の場所に基づく）にサイズが対応する帯域をゲルから切除した。Ｔｏｐｏ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、この帯域中のＤＮＡをクローン化し、個別クローンのヌクレオチド配列を決定した。
【０１１０】
１つのクローンでは、配列分析は、標的切断の部位の付近の２ヌクレオチド欠失の存在を明らかにした。第２のクローンでは、１１ヌクレオチド欠失が欠失していた。第３のクローンは、配列の混合を備え、そのうちの１つは、４つのヌクレオチドの複製であり、他方は、１９ヌクレオチド欠失であった。
【０１１１】
これらの結果は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したＧＲ遺伝子の標的切断が、遺伝子における挿入および欠失両方の突然変異を誘導し、その全てが翻訳リーディングフレームの変化をもたらしたことを示す。
【０１１２】
これらのデキサメタゾン耐性細胞におけるＲＮＡ分析は、異常ＧＲ転写産物のナンセンス変異による崩壊を示す、非形質移入細胞と比較して、より低いレベルのＧＲ ｍＲＮＡを明らかにした。
【０１１３】
実施例４：ヒトＧＲ遺伝子座への導入遺伝子の導入
グルココルチコイドホルモンは、多くの一次細胞および細胞株において、アポトーシスを誘発するか、または細胞増殖を減速する。したがって、ａ）ＧＲ遺伝子座のＺＦＮ介在性２対立遺伝子突然変異を含有する細胞、ｂ）ＧＲ機能の不活性化をもたらす、ＧＲ遺伝子座の両方の対立遺伝子へのドナーＤＮＡ配列のＺＦＮ介在性標的化組み込みを含有する、細胞、またはｃ）ＧＲ遺伝子座の一方の対立遺伝子上のＺＦＮ介在性ＧＲ突然変異、および他方の対立遺伝子上のＺＦＮ介在性標的化組み込みを含有する細胞を、選択または豊富にするために、ＧＲ遺伝子座を標的とするＺＦＮと組み合わせて、グルココルチコイドホルモン処置を使用することができる。
【０１１４】
この様式でＧＲ遺伝子座に組み込むことができる配列は、任意の選択された導入遺伝子を伴う発現カセットを含むが、それらに限定されない。ＧＲ遺伝子座への組み込みを使用することの潜在的な便益は、ａ）ドナー分子上での選択マーカの使用を回避すること、ｂ）高レベル遺伝子発現と適合性があり、サイレンシングを受けない遺伝子座からの導入遺伝子の発現の長期的安定性、ｃ）導入遺伝子の無作為な組み込みを行うと発生し得る、挿入突然変異事象を回避することを含むが、それらに限定されない。ゼタカイン導入遺伝子を使用して、次のような実験を行った。
【０１１５】
別個の実験において、ＧＲ標的化ＺＦＮ ９６６６および９６７４をコードする２５μｇの発現構築物、およびゼタカイン導入遺伝子を用いて、ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞を培養し、形質移入した（前の実施例で記載されるように）。ゼタカインドナーＺＦＮ構築物をＣＥＭ１４細胞に形質移入し、形質移入細胞のアリコートをデキサメタゾン（正常ＧＲ機能を有する細胞を破壊する）で２週間インキュベートする一方で、残りの細胞は未処置のままとした。非形質移入細胞を対照として使用し、同様に処置した。デキサメタゾン処置後、ＰＣＲ（図４Ａ）によって、およびサザンブロット法によって（図４Ｂ）、ＧＲ遺伝子座へのゼタカイン導入遺伝子の標的化組み込みを検出した。免疫染色は、ＧＲ ＺＦＮおよびゼタカインドナー構成物の両方が形質移入された、デキサメタゾン選択ＣＥＭ １４細胞中の高レベルゼタカイン発現を示す（図示せず）。
【０１１６】
これらの結果は、ヒトＧＲ遺伝子中のドナー配列の標的化組み込みが実現されたこと、ドナー配列の組み込みがＧＲ機能を不活性化したこと、およびドナー配列に含有される導入遺伝子の正常機能が得られたことを実証した。
【０１１７】
実施例５：ＧＲ遺伝子中の外来性配列の標的化組み込み後のＧＲポリペプチド産生
ＲＰＭＩ培地でＣＥＭ １４細胞を培養し、ゼタカインカセットを含有し、ＧＲ遺伝子への相同性領域が両側に並ぶＧＲエクソン３標的化ＺＦＮペア８６６７および８６６９をコードする、２５μｇの発現ベクターを、上記のように形質移入した。形質移入の２日後、１０−６Ｍデキサメタゾンを増殖培地に添加し、選択の２週間後にグルココルチコイド耐性クローンを得た。
【０１１８】
デキサメタゾン処置を克服した形質移入細胞からのタンパク質抽出物を全細胞溶解によって調製し、ヒトＧＲへの抗体（カタログ番号６１１２２６、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して、ウェスタンブロット分析を行った。結果を図５に示す。野生型受容体に対応する帯域を非形質移入ＣＥＭ １４細胞において検出したが（左レーン）、一方で、ＺＦＮおよびドナー配列で処置したＣＥＭ １４細胞のクローンは、野生型受容体のサイズに対応する免疫反応物質を含有しなかった。その代わり、短縮受容体型にサイズが対応する帯域を検出した（右レーン）。
【０１１９】
実施例６：ＣＤ８＋Ｔ細胞中のヒトＧＲ遺伝子の標的切断
ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から新鮮なヒト末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞を入手した。Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎデバイスおよびプロトコルを使用して、２×１０６個の細胞に、ＺＦＮコード配列が２Ａ配列によって分離された、ヒトＧＲ遺伝子座のエクソン３を標的とする２つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼをコードする、５μｇの発現プラスミドを形質移入した。別個の形質移入において、２つのエクソン３標的化ＺＦＮペア（９６６６−９６７１および９６６６−９６７４）を検査した。対照は、非形質移入細胞、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドが形質移入された細胞であった。
【０１２０】
５％ヒト血清を含有するＸ−ＶＩＶ０１５培地（両方ともＣａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤより購入）で、形質移入ＣＤ８＋細胞を４８時間培養した。その後、ＤＮＡを単離し、それぞれ５μＣｉのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）をＰＣＲ反応物に添加したことを除いて、エクソン３特異的な増幅プライマを使用して、上記の実施例２に記載されるように、Ｃｅｌ Ｉ分析を行った。
【０１２１】
Ｃｅｌ Ｉ処置後、１０％アクリルアミドゲル上で消化産物を分画した。Ｓｔｏｒｍ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、ゲルのオートラジオグラフ像を現像した。結果を図６に示す。Ｃｅｌ Ｉ切断産物の定量によって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度を決定し、図６の右端の２つのレーンに示す。したがって、ＧＲ標的化ＺＦＮは、効率的にＣＤ８＋Ｔ細胞中のＧＲ遺伝子座を修飾する。
【０１２２】
実施例７：ＧＲ−ＺＦＮ処置ＣＤ−８＋Ｔ細胞の分析
Ａ．ＺＦＮがＧＲ遺伝子座での突然変異を生成する
第０日に、ゼタカイン導入遺伝子を発現する５千万個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）を刺激し、第７日に、１０（「ＺＦＮ１０−」）、３０（「ＺＦＮ３０−」）、および１００（「ＺＦＮ１００−」）の感染の多重度（ｍｏｉｓ）で、ＺＦＮペア９６６６および９６７４を発現するＡｄ５／Ｆ３５に感染させた。対照として、ＣＤ８＋細胞はまた、同じｍｏｉｓ（「ＧＦＰ１０−」、「ＧＦＰ３０−」、「ＧＦＰ１００−」）で、Ａｄ５／Ｆ３５ウイルスを発現するＧＦＰにも感染させた。
【０１２３】
細胞を上記のように増殖させ、サイトカインの非存在下にて１０−４Ｍの濃度のグルココルチコイドホルモンデキサメタゾンで、感染後７日の細胞を６日間処置した。得られた細胞プール（それぞれ、「ＺＦＮ１０」、「ＺＦＮ３０」、「ＺＦＮ１００」、および「ＧＦＰ１０」、「ＧＦＰ３０」、「ＧＦＰ１００」）を再刺激し、再刺激の１２日後に細胞を収穫した。ＤＮＡを単離し、ＺＦＮ標的領域のＰＣＲによってＧＲ遺伝子座の修飾について分析し、その後、上記の実施例２に記載されるように、Ｃｅｌ Ｉ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）エンドヌクレアーゼアッセイを行った。図７のパネルＡおよびＢに示されるように、一時的ＺＦＮ発現は、ＧＲ遺伝子座での突然変異を伴うＧＣ耐性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した。
【０１２４】
ＰＣＲ産物はまた、ＰＣＲ４ ＴＯＰＯベクターにもサブクローン化し、Ｔ７プライマを使用して挿入配列を分析した。細胞プールＺＦＮ１００中のＧＲ遺伝子座のエクソン３におけるＺＦＮ標的領域の配列決定は、ＧＲ対立遺伝子の７０％がＺＦＮ結合領域に突然変異を含有したことを実証した。対照的に、細胞がＧＦＰ１００対照ウイルスに感染していた場合には、ＧＲ対立遺伝子に突然変異は見出されなかった。
【０１２５】
ＣＤ８＋細胞プールのグルココルチコイドホルモン耐性はまた、８日間の１０−４Ｍデキサメタゾンによる第２の処置前後の細胞の生存を比較することによっても決定した。Ｇｕａｖａ細胞分析器を使用して、生存能力を測定した。図８に示されるように、ＺＦＮ処置細胞は、グルココルチコイドホルモンに対する増大した耐性を示した。
【０１２６】
Ｂ．ＺＦＮ修飾ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＧＲタンパク質発現
ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、全長ＧＲタンパク質の存在についても検査した。
１つの実験では、ＧＲ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴＦＩＩＢ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）抗体を使用したウェスタンブロット法によって、上記のＣＤ８＋細胞プールからの、およびウイルス形質導入に使用されたゼタカイン発現ＣＤ８＋細胞プール（「ＩＬ−１３ ＺＫプール」）からのタンパク質抽出物を分析した。また、細胞プールと同時に、ＺＦＮ １００プールのサブクローン（「１０Ａ１」）を分析した。図９Ａに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比べてＧＲタンパク質の損失を示した。
【０１２７】
別個の実験では、ＧＲの発現はまた、ＺＦＮ処置ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋サブクローンにおいても評価した。特に、本明細書に記載されるようなＺＦＮを使用して、ＣＭＶを標的とするＧＲ陰性ＣＤ８＋細胞を生成した。これらの細胞の単一細胞由来サブクローンを単離し、上記のようにこれらのクローンからタンパク質抽出物を得た。２６のサブクローンの遺伝子型決定は、２つの野生型クローン、およびＺＦＮ結合領域を備えるＧＲ遺伝子座における突然変異を伴う２４のクローンを識別した。上記のように、ヒトＧＲ抗体（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）によるウェスタンブロット法によって、タンパク質抽出物を分析した。図９Ｂに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＭＶ標的化ＣＤ８＋クローンは、ＧＲタンパク質の損失を示した。
【０１２８】
したがって、本明細書に記載されるようなＺＦＮは、一次細胞中のＧＲタンパク質発現を低減または排除することができる。
【０１２９】
Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲ
また、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＲ陰性（ＺＦＮ処置）ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析して、既知のＧＲ標的遺伝子の発現に対するグルココルチコイド添加の効果を決定した。結果を図１０Ａ−１０Ｄに示す。細胞は、示されるように、未処置のままとした（「ｕｎ」）か、または１０−６Ｍデキサメタゾンで２０時間処置した（「ｄｅｘ」）。標準プロトコルを使用してＲＮＡを単離し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって、様々なグルココルチコイド調節遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。同じＲＮＡサンプルから得られたＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の値によって、ＧＲ標的遺伝子のＲＮＡ値を補正した。ＧＲ標的遺伝子に対するＴａｑｍａｎプローブおよびプライマは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。図１０Ａ〜Ｄに示されるように、グルココルチコイドホルモン処置は、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞ほどは標的遺伝子に影響しなかった。
【０１３０】
Ｄ．サイトカイン放出
グリオーマ細胞で刺激されたＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカイン放出も評価した。単独で、またはＵ８７ＭＧグリア芽腫刺激細胞の存在下で、ＧＦＰ１００、ＺＦＮ１００、および未処置ＣＤ８＋Ｔ細胞プールを培養した。その後、１０−６Ｍデキサメタゾンを培養物に添加した。２０時間後、細胞培養上清を収穫し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＦＮ−γレベルを分析した。
【０１３１】
図１１に示されるように、グリオーマ細胞による刺激時のＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン放出が維持され、グルココルチコイドホルモンに対して耐性となっていた。
【０１３２】
Ｅ．細胞溶解活性に対するクロム放出アッセイ
ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を分析するために、エフェクタ（ＺＦＮ処置または対照ＣＤ８＋Ｔ細胞）の標的細胞（ＩＬ１３Ｒα２陽性細胞株および対照細胞株）に対する様々な比で、クロム放出アッセイを行った。
【０１３３】
図１２のパネルＡからＥに示されるように、ＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ１３Ｒα２＋標的細胞を破壊する能力を維持する。
【０１３４】
実施例８：ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体内投与
ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、生体内の殺腫瘍細胞活性についても分析した。第０日に、脳に注入されたルシフェラーゼ標識Ｕ８７ＭＧ細胞を使用して、腫瘍細胞毒性を同所性グリア芽腫マウスモデルにおいて測定した。第５日に、対照またはＺＦＮ処置ＣＤ８＋Ｔ細胞を脳に注入し、第２４日までルシフェラーゼ活性を測定することによって腫瘍体積を決定した。
【０１３５】
図１３に示されるように、ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＣ）は、対照と比べて、腫瘍体積を低減した。その上、図１４に示される実験は、マウス腫瘍モデルにおけるＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性が、グルココルチコイドホルモンの投与によって悪影響を及ぼされなかったことを実証する。したがって、グルココルチコイドホルモンの投与を受けている患者におけるグリア芽腫の治療のために、ＺＦＮ処置ＧＲ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することができる。
【０１３６】
実施例９：ＧＲ ＺＦＮ特異性の分析
細胞中のＧＲ ＺＦＮ ９６６６および９６７４の特異性を分析するために、我々はまず、親和性に基づく標的部位選択手順（ＳＥＬＥＸ）を使用して、体外での９６６６および９６７４両方のＺＦＮに対するコンセンサスＤＮＡ結合部位を決定した。２００７年５月２３日出願の米国特許整理番号第１１／８０５，７０７号も参照されたい。実験概要を図１５に提供する。簡潔に言えば、ビオチン化抗ＨＡ Ｆａｂ抗体断片の存在下で、赤血球凝集素で標識されたＺＦＮを無作為化ＤＮＡ配列のプールによりインキュベートした。標識されたＺＦＮ−ＤＮＡ複合体をストレプトアビジン被覆電磁ビーズで捕獲し、結合ＤＮＡを解放し、ＰＣＲによって増幅した。開始配列として以前に溶出および増幅したＤＮＡのプールを使用して、このプロセスを３回反復した。４回目の反復後、溶出したＤＮＡ断片を配列決定し、ＺＦＮ ９６６６およびＺＦＮ ９６７４の結合部位における各位置での塩基頻度を決定した。
【０１３７】
ヒトゲノム中の最も類似した推定標的外部位のゲノム規模での生物情報予測を誘導するために、部位選択データに基づくコンセンサスを使用した。次いで、潜在的切断部位の得られたリストを順序付けし、実験的に導出された結合部位選好との最高類似性を伴う部位を優先した。
【０１３８】
ＮＲ３Ｃ１（ＧＲ遺伝子座）は、部位選択実験で決定された結合部位選好との最も良好な適合を含有する。１５の潜在的標的外部位のうち、１０が注釈遺伝子の範囲内であり、２つのみがエクソン配列内で生じる。これらの１０の遺伝子のうちのいずれについても、突然変異または崩壊は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における既知の病変と関連していない。
【０１３９】
クローン１０Ａ１（Ｔ細胞由来クローン）の遺伝子型決定は、コンセンサスとの最高類似性を伴う１５の部位のうちのいずれも、ＧＲ（標的内）遺伝子座の２対立遺伝子修飾をもたらした条件下で修飾されなかったことを確認した。
【０１４０】
本願で言及される全ての特許、特許出願、および公報は、参照することによりその全体において本願に組み込まれる。
【０１４１】
理解を明確にする目的で、例証および一例として、本開示をある程度詳細に提供したが、本開示の本質または範囲を逸脱しない限り、様々な変更および修正を実践できることが、当業者には明白となるであろう。したがって、先述の説明および実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断ドメインまたは切断半ドメインと、
を備える、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、請求項１に記載の１対の融合タンパク質を、前記融合タンパク質が前記ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、前記細胞中で発現するステップを含む、方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップをさらに含み、前記ポリヌクレオチドは、前記２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、前記２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、前記ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列をさらに備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記外来性配列は、導入遺伝子を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導入遺伝子は、修飾受容体をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＧＲ機能の不活性化は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を防止する、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＧＲ機能の不活性化は、Ｔ細胞アネルギーを防止する、請求項３から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＲ遺伝子に組み込まれた外来性配列を備える細胞を選択する方法であって、
請求項１に記載の１対の融合タンパク質を、前記融合タンパク質が前記ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、前記細胞中で発現するステップと、
ポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドは、前記２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、前記２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域と、前記外来性配列とを備える、ステップと、
前記組み込まれた外来性配列を備えない細胞が破壊されないような条件下で、前記細胞を天然または合成コルチコステロイドで処置することにより、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記コルチコステロイドは、合成である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コルチコステロイドは、デキサメタゾンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外来性配列は、導入遺伝子を備える、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現するステップは、前記細胞を、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを備えるウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、請求項３から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターは、複製欠損である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）ＧＲ遺伝子中の標的配列を結合するように遺伝子操作されている、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）切断ドメインまたは切断半ドメインと、
を備える、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
細胞中のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）機能を不活性化するための方法であって、請求項１に記載の１対の融合タンパク質を、前記融合タンパク質が前記ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、前記細胞中で発現するステップを含む、方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップをさらに含み、前記ポリヌクレオチドは、前記２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、前記２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域とを備える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、前記ＧＲ遺伝子と非相同である外来性配列をさらに備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記外来性配列は、導入遺伝子を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導入遺伝子は、修飾受容体をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＧＲ機能の不活性化は、グルココルチコイド介在性免疫抑制を防止する、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＧＲ機能の不活性化は、Ｔ細胞アネルギーを防止する、請求項３から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＲ遺伝子に組み込まれた外来性配列を備える細胞を選択する方法であって、
請求項１に記載の１対の融合タンパク質を、前記融合タンパク質が前記ＧＲ遺伝子における２本鎖切断を触媒するように、前記細胞中で発現するステップと、
ポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドは、前記２本鎖切断の上流にある配列への第１の相同性領域と、前記２本鎖切断の下流にある配列への第２の相同性領域と、前記外来性配列とを備える、ステップと、
前記組み込まれた外来性配列を備えない細胞が破壊されないような条件下で、前記細胞を天然または合成コルチコステロイドで処置することにより、外来性配列がＧＲ遺伝子に導入されている細胞を選択するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記コルチコステロイドは、合成である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コルチコステロイドは、デキサメタゾンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外来性配列は、導入遺伝子を備える、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現するステップは、前記細胞を、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを備えるウイルス送達ベクターと接触させるステップを含む、請求項３から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターは、複製欠損である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス送達ベクターは、アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、または非統合レンチウイルスである、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１０−５０８８５０（Ｐ２０１０−５０８８５０Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３６３３０（Ｐ２００９−５３６３３０）
【出願日】平成１９年１１月１３日（２００７．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０５１０
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（３０２０４３８３７）サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１３日（２００７．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２３７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０５１０
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（３０２０４３８３７）サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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