ヒトパピローマウイルスの検出
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該ＨＰＶが、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すものである、前記方法に関する。特に、本発明は、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）に関するインビトロスクリーニング方法を提供する。前記方法は、子宮頸癌のスクリーニングにおいて有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ：ヒトパピローマウイルス）が存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該ＨＰＶが、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すものである、前記方法に関する。特に、本発明は、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変に相当する持続性形質転換ＨＰＶ感染、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）の、インビトロスクリーニング方法を提供する。前記方法は、子宮頸癌のスクリーニングにおいて有用である。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は世界中で最も一般的な悪性疾患の１つであり、女性における罹患率及び死亡率の主要原因の１つである(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J(1993) Int J Cancer 54: 594-606; Pisani P, Parkin DM, Ferlay J (1993) Int J Cancer 55: 891-903)。米国では１９９６年に15,700の浸潤子宮頸癌の新規症例が予測され、世界中での年間発生数は、世界保健機関によって450,000例と推定されている（1990年）。年間発生率は世界の種々の地域において異なり、西アジアでの100,000人あたり７．６人から 南アフリカでの100,000人あたり４６．８人にわたる(Parkin et al., 1993 ibid)。
【０００３】
子宮頸癌の現在の概念は、しばしば１０〜２５年の期間にわたって発現する多段階疾患であると考えられている。子宮頸部の浸潤扁平上皮癌は、基底板の貫通及び間質又は上皮固有層の浸潤によって示される。子宮頸癌の臨床経過は大きな変動を示す。予後は、臨床病期、リンパ節の関与、原発腫瘤、組織学的タイプ、浸潤の深さ及びリンパ管内蔓延に関連してきた(Delgado G,et al., (1990) Gynecol Oncol 38: 352-357)。あまり好ましくない腫瘍特徴を有する一部の患者が比較的良好な結果を示すことがあり、また一部には初期の限定疾患が致死的結果を迎える患者もある。これは、リスクに適合した治療を投与するために、新たに診断された子宮頸癌をさらに特性付けるための付加的なマーカーの明らかな必要性を示す (Ikenberg H, et al., Int. J. Cancer 59: 322-6.1994)。
【０００４】
子宮頸癌の疫学は、宗教、婚姻及び性的パターンとの強い結びつきを示した。１００近い症例−対照試験がＨＰＶと頸部新形成の関係を検討しており、ほとんど全部が明確な結びつきを認めた(IARC monographs, 1995)。その結びつきは強力で一貫しており、限られた数のウイルス型に特異的である (Munoz N, Bosch FX (1992) HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies. IARC Sci Publ 251-261)。最も参考となる試験において、ＨＰＶ １６ ＤＮＡとの強い結びつきが浸潤癌及び高悪性度ＣＩＮ病変に関して顕著な一貫性を持って認められ、この結びつきが偶然、バイアス又は交絡によって説明できる可能性を排除した(IARC monographs, 1995)。間接的な証拠は、癌細胞において検出されるＨＰＶ ＤＮＡが、発癌現象におけるより早期のＨＰＶ感染の役割についての良好なマーカーであることを示唆した。ウイルス負荷の上昇と子宮頸癌の危険度の間での用量−反応関係が報告されている (Munoz and Bosch, 1992 ibid)。一部のより大きなシリーズでは、腫瘍の１００％までがＨＰＶに関して陽性であったが、ウイルス陰性子宮頸癌の存在についてはまだ論争の余地がある (Meijer CJ, et al., (1992) Detection of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cancer screening. IARC Sci Publ 271-281; Das BC, et al., (1993) Cancer 72: 147-153)。
【０００５】
扁平上皮子宮頸癌で認められる最も多いＨＰＶ型は、ＨＰＶ１６（４１％〜８６％）及び１８（２％〜２２％）である。加えて、ＨＰＶ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５４、５６、５８、５９、６１、６６及び６８も認められる(IARC monographs, 1995)。バルセロナでのＨＰＶ２０００国際会議において、ＨＰＶ１６、１８、３１及び４５は高危険度と定義され、ＨＰＶ３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９、６８は中間危険度と定義された (Keerti V. Shah. P71)。高危険度プラス中間危険度の１３のＨＰＶは、しばしば合わせて癌関連ＨＰＶ型と称される。
【０００６】
多くの試験により、子宮頸部検診におけるＨＰＶ検査の潜在的役割が調査されている (Cuzick et al. A systematic review of the role of human papillomavirus testing withing a cervical screening programme. Health Technol Assess 3: 14.1999参照)。
【０００７】
Reidらは、初めて、スクリーニングにおけるＨＰＶ検査の役割を明らかにした(Reid R, et al., (1991) Am J Obstet Gynecol 164: 1461-1469)。この試験は、性感染症クリニック及び専門婦人科医からの高危険度女性に関して実施され、ＨＰＶ検出のために高感度（低ストリンジェンシー）サザンブロットハイブリダイゼーションを使用した。合計１０１２名の女性が登録され、頸管造影法も、細胞学検査の可能な補助検査としてみなされた。全部で２３のＣＩＶ ＩＩ／ＩＩＩ病変が発見されたが、１２だけが細胞学検査によって検出された（感受性５２％、特異性９２％）。ＨＰＶ検査は１６の高悪性度病変を検出した。
【０００８】
Bauerらは、ルーチンスミア（routine smears）のために来院した若齢女性（大学生）におけるＭＹ０９／１１プライマー(Manos M, et al., (1990) Lancet 335: 734)を使用した早期ＰＣＲベースの試験を報告している(Bauer HM, et al., (1991) JAMA 265: 472-477)。彼らは、４６７名の女性において４６％の陽性率を認め、これはドットブロットアッセイ（１１％）の場合よりもはるかに高かった。
【０００９】
ＧＰ５／６プライマーによるＰＣＲを用いた試験(Van Den Brule AJ, et al., (1990) J Clin Microbiol 28: 2739-2743) において、van der Brule et al. (Van Den Brule AJ, et al., (1991) Int J Cancer 48: 404-408)は、細胞学検査によって評価したときの子宮頸部新生物とＨＰＶ陽性の非常に強い相関を示した。細胞診陰性のより高齢女性（３５〜５５歳）では、ＨＰＶ陽性率はわずかに３．５％であり、１６、１８、３１及び３３型だけを考慮した場合にはこれは１．５％まで低下し、一方組織学的非浸潤癌を有する女性は全てＨＰＶ陽性であり、９０％は上記の４つの型のうちの１種を有していた。より軽度の細胞学的異常を有する女性は段階的により低いＨＰＶ陽性率を有しており、明らかな傾向を示した。
【００１０】
Roda Housmanらは、異常スミアを有するさらなる１３７３名の女性を検討することによってこれらの観察を拡大させた(Roda Housman AM, et al., (1994) Int J Cancer 56: 802-806)。この試験も、スミア結果の重症度の上昇に伴う陽性率上昇を確認した。彼らはまた、ＨＰＶの不均一性のレベルが、軽度スミアについての２２型から、高悪性度スミアについての１０の「高危険度」型に低下することを認めた。この論文は細胞診陰性の女性を含んでおらず、また細胞学的疾患は組織学的に確認されていない。
【００１１】
Cuzickらは、ＨＰＶ検査が、ランダムスクリーニングの間に検出される細胞学的異常の優先順位決定のために有用な情報を提供することを初めて報告した(Cuzick J, et al., (1992) Lancet 340: 112-113; Cuzick J, et al., (1994) Br J Cancer 69:167-171)。コルポスコピーに差し向けられた１３３名の女性の試験において、彼らは４２％の正の予測価を認め、これは中等度の核異型に関するものと同様であった。結果はＨＰＶ１６に関して最も顕著であり、４２名のＨＰＶ１６陽性女性のうち３９名が、生検で高悪性度ＣＩＮを有することが認められた。この試験はウイルス負荷を評価することの重要性を指摘し、高レベルの高危険度型だけを陽性とみなした。
【００１２】
Coxらは、ボーダーラインスミアを有する女性を優先順位決定するためにHybrid Capture（商標）システム（DIGENE Corporation，Gaithersburg，MD，USA）を使用するＨＰＶ検査の役割を明らかにした(Cox JT, et al., (1995) Am J Obstet Gynecol 172: 946-954)。この検査は、大学紹介サービスからの２１７名のそのような女性に関して実施され、反復細胞診についての７３％と比較して、ＣＩＶ ＩＩ／ＩＩＩに関して９３％の感受性を認めた。高いウイルス負荷は、偽陽性を低下させることによって性能をさらに改善することが認められた。５ＲＬＵをカットオフ値とみなしたとき、約２４％のＰＰＶが感受性を喪失していないことが認められた。
【００１３】
ＷＯ９１／０８３１２号は、試料中のＥ６／Ｅ７ ＨＰＶ遺伝子の全部又は一部の転写産物を検出することによってＨＰＶ活性のレベルを測定すること、及びＨＰＶ活性の測定値を、活性と重篤な子宮頸部形成異常又は癌への進行の危険度との間のこれまでに確立された関係と比較することを含む、ＨＰＶに感染した個人の予後を判定するための方法を述べている。
【００１４】
ＷＯ９９／２９８９０号は、遺伝子発現レベルの測定と分析に基づくＨＰＶ感染の評価のための方法を述べる。特に、ＷＯ９９／２９８９０号は、２又はそれ以上のＨＰＶ遺伝子（例えばＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＥ２）の発現のレベルを測定し、その後、患者におけるＨＰＶに基づく疾患の病期の指標を提供するために、これらの遺伝子の組合せの発現の比率を比較することに基づく方法を述べている。
【００１５】
本発明者は以前に、発現レベルの正確な定量的測定を必要とせずに、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現の簡単な陽性／陰性判定だけに基づいてＨＰＶ関連疾患の臨床的に有用な評価を行うことが可能であると判定した。この方法は技術的に単純であり、好ましい実施形態では、中から高流量方式での自動化に適合させやすい。この方法は、出願人のＷＯ０３／５７９１４号に詳述されている。
【００１６】
ＷＯ０３／５７９１４号に記載の方法は、好ましくは、Norchip ASから市販されているPre-Tect HPV-Proofer（商標）キットを用いて実施される。HPV-Prooferアッセイは、３つのレベルの情報：
（１）５つの異なる特定ＨＰＶ型（１６、１８、３１、３３及び４５型）からのｍＲＮＡの特定；
（２）癌遺伝子ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在の判定；及び
（３）調節不全を指示する完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在の判定
を提供する。
【００１７】
各々の試料は３つの二重NASBA反応を受け、それ故６つの結果が各試料について報告される。汚染を監視するために毎回陰性対照を含める。試薬の性能を監視するために全てのＨＰＶ型に関する陽性対照を含める。内因性細胞制御Ｕ１Ａ ｍＲＮＡ（細胞ハウスキーピング遺伝子）は、偽陰性の可能性を排除するために試験手順全体を監視する。HPV-ProoferアッセイはＨＰＶ ＤＮＡを検出することはできない。自動化常用データ分析、解釈及び報告のためにはPreTech Analysis Software（ＰＡＳ）が使用される。
【００１８】
HPV-Prooferアッセイの有用性は少なくとも１２の臨床試験で評価されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者は、今や、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイが、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５からのＨＰＶ−ｍＲＮＡを検出するが、ＨＰＶ粒子は検出しないことを確認した。むしろ、HPV-Prooferアッセイで測定され得るようなＥ６／Ｅ７転写産物の存在は、転写調節の喪失及び複製する能力の喪失、並びに／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ前駆体の発現の指標である。Pre-Tect HPV-Prooferが感染性ウイルスであるＨＰＶ粒子を検出することは不可能である。転写調節が失われて、ウイルスが組み込まれたとき、このウイルスはウイルス粒子を生産することができないからである。HPV-Prooferを用いてＥ６／Ｅ７発現に関して陽性と検出された細胞の内部のウイルスは、それらの正常な生活環を捨て、全てのＥ６／Ｅ７転写産物からのプロモーターの転写制御の調節を喪失するか、又はスプライシング能力を失って、Ｅ６／Ｅ７転写産物を残すか又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡ前駆体の安定化形態を発現する。
【００２０】
本発明者はまた、ＨＰＶ感染細胞におけるＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現が、巨大化した細胞核の存在、異数性（典型的には細胞あたり５以上又は９個の動原体）及びまた有糸分裂として特徴付けられる細胞変化と相関することを認めた。Ｅ６／Ｅ７発現に関して陽性である細胞（例えばPreTect HPV-Proofer試験を用いて）は、どこか具合の悪いところがあり、細胞異常を示すか又は大きな成熟細胞核を有する。これらの結果も、子宮頸病変の細胞学的及び組織学的特性決定と相関する。巨大細胞核及び９以下の動原体を有する細胞がない、細胞学的及び組織学的に定義された低悪性度病変は、HPV-ProoferでＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現に関して陽性結果を与えない。
【００２１】
それ故、本発明者は、ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７転写産物の発現が、ヒトパピローマウイルスによる持続性感染の存在に関連する細胞異常の存在の分子指標として使用できると判定した。Ｅ６／Ｅ７発現の検出は、それ故、高悪性度と低悪性度の子宮頸病変を識別するために使用し得る。特に、Ｅ６／Ｅ７発現の検出は、異数細胞（aneuploidic cells）を伴わない組織学的に定義されたＣＩＮ ＩＩＩ試料と異数細胞を有する試料を識別することができる；完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関して陽性の試料は異数細胞を有すると評価される。Ｅ６／Ｅ７発現の検出はまた、後退に向かう組織学的に定義されたＣＩＮ ＩＩＩ又はＣＩＮ ＩＩ（ＨＳＩＬ症例）症例と、感染が持続する又は進行する症例とを区別することができる；完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関して陽性の試料は、治療せずに放置した場合進行する可能性が高い感染があると評価される。
【００２２】
本発明者はさらに、以下のように結論した：
（１）Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子からの発現の頻度は病変の重症度と共に上昇する。
（２）場合によりＨＰＶ型別と組み合わせて、Ｅ６／Ｅ７発現の評価によってＨＰＶ腫瘍形成活性を検出することは、高悪性度病変の強力な予測因子である。
（３）子宮頸癌の圧倒的多数（９６％）が、５つの主要発癌性ＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５）の少なくとも１種を含む。
（４）Pre-Tect HPV-Proofer（商標）でＥ６／Ｅ７発現に関して試験陽性であった患者は、HPV-Proofer結果が陽性でない患者よりも持続性感染を維持する可能性が有意に高かった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
従って第一態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスが存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、前記ヒトパピローマウイルスは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するものであり、前記方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、前記細胞又は組織における、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すヒトパピローマウイルスの存在の指標とみなす、前記方法を提供する。
【００２４】
第二態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中に巨大細胞核及び細胞異数性を特徴とする細胞変化があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、検査下にある前記細胞又は組織が前記細胞変化を示すことの指標とみなす、前記方法を提供する。
【００２５】
第三態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が発現している被験者をスクリーニングすることを含み、当該ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現が陽性の被験者を、前記細胞又は組織においてヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があると判定する、前記方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型の１種からの完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物によって特定される、前記ＨＰＶサブタイプの１種による「持続性形質転換感染」は、細胞診又は組織診によって評価したとき、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)と同等であるとみなされる。従って、本発明の第三態様の方法は、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)と同等である、ヒトパピローマウイルスによる持続性形質転換感染についてのスクリーニング法を提供する。
【００２７】
完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ＨＰＶ ｍＲＮＡの持続的存在によって定義される持続性形質転換ＨＰＶ感染は、持続性ＣＩＮ ＩＩ＋と直接相関し、それ故子宮頸部検診プログラムにおける予後マーカーとして役立つと考えられる。特に、本発明の方法は、細胞診／組織診に基づき、意味未確定の異型扁平上皮細胞(ASCUS)又は低悪性度扁平上皮内病変(LSIL)を有すると同定された女性のトリアージにおいて使用し得る。低い割合であるが、頸部上皮内癌(CIN)ＩＩＩ及び浸潤子宮頸癌(ICC)へと進行するので、そのような患者の管理は困難である。細胞診／組織診によるフォローアップ試験は、ＣＩＮ ＩＩ＋のより高い危険度を有する全ての女性を特定することはできない。ここで報告する臨床試験において、完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現の検出は高悪性度子宮頸病変に関して著明な特異性を示し、そのような転写産物の存在が、有用な予後マーカーを提供することを示した。
【００２８】
本発明の方法における陽性スクリーニング結果は、完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現の検出によって示される。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現についての陽性結果は、被験者が、Ｅ６／Ｅ７発現の調節の喪失を示す及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するウイルスを保有することを指示し、さらに、被験者が異常細胞変化を有することを指示する。
【００２９】
ここで使用する「Ｅ６／Ｅ７調節の喪失」という用語は、全てのＥ６／Ｅ７転写産物からのプロモーターの転写制御の調節の喪失、又はＥ６／Ｅ７オープンリーディングフレームにおける正常なスプライシング能力の喪失を意味する。
【００３０】
「安定化ｍＲＮＡ前駆体」という用語は、Ｅ６オープンリーディングフレーム内でいかなるスプライシング事象も受けておらず、それ故完全長タンパク質をコードし、同じＨＰＶサブタイプの天然又は野生型ヒトパピローマウイルスによって発現される完全長Ｅ６タンパク質をコードする等価の一次（スプライシングされていない）Ｅ６／Ｅ７転写産物よりも安定である（すなわちより長い半減期を示す）、一次（primary）Ｅ６／Ｅ７転写産物を言う。天然又は野生型ヒトパピローマウイルスは、ヒト宿主の持続性感染に関連するゲノム修飾を有さず、ヒトゲノム内に組み込まれていないウイルスを指す。そのような天然又は野生型ウイルスはまた、完全長ｍＲＮＡ前駆体が有意の程度まで細胞内に蓄積しないように、Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ前駆体又は完全長ｍＲＮＡ転写産物のスプライシングが転写後すぐに起こることを特徴とする。そこで、ｍＲＮＡ前駆体は翻訳が起こり得る以前にスプライシング装置によってプロセシングされるので、ｍＲＮＡ前駆体は一般に、天然又は野生型ウイルスに感染した細胞では完全長Ｅ６タンパク質を与えるように翻訳されない。しかし、持続性形質転換ＨＰＶ感染に関連する異常を有する細胞では、ｍＲＮＡ前駆体が安定化される及び／又はスプライシングされず、それ故正常細胞又は正常増殖細胞、例えば複製ＨＰＶに感染した細胞、では認められないレベルまで細胞内に蓄積することができる。
【００３１】
天然又は野生型ウイルスにおいて発現される一次Ｅ６／Ｅ７（スプライシングされていない）転写産物に関して、安定化ｍＲＮＡ前駆体は、Ｅ６タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの外側の転写産物の領域において、例えばウイルス組込みの結果としてヒトゲノムから転写されたｍＲＮＡ配列の付加によって又はＨＰＶ配列の欠失によって、修飾され得る。それ故安定化ｍＲＮＡ前駆体は、天然又は野生型ウイルスにおいて発現されるＥ６／Ｅ７一次（スプライシングされていない）転写産物とは異なる配列及び構造であり得るが、依然として完全長Ｅ６タンパク質をコードする。
【００３２】
「異常細胞変化」という用語は、多倍体ＤＮＡ特性を有する病変及び高い平均ＤＮＡ指数値、ＤＮＡ異数性の高いパーセンテージ及び2.5c Exceeding Ratesを有するＣＩＮ病変を含む、高悪性度ＣＩＮ（形質転換細胞の腫瘍性増殖と定義される）、ＣＩＮ（頸部上皮内癌）ＩＩＩ、又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)に等しいか又はそれ以上の重症度の疾患の特徴である細胞変化を含む、低悪性度子宮頸病変又は低悪性度扁平上皮内病変よりも重症の疾患の特徴である細胞変化を包含する(Hanselaar et al., 1992, Anal Cell Pathol., 4: 315-324; Rihet et al., 1996, J. Clin Pathol 49: 892-896; and McDermott et al., 1997, Br. J. Obstet Gynaecol. 104: 623-625)。
【００３３】
子宮頸部形成異常とも呼ばれる、頸部上皮内癌（「ＣＩＮ」と略称する）は、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる子宮頸部の状態である。ＣＩＮはその重症度によってＩ、ＩＩ又はＩＩＩと分類される。前癌性異常とみなされるが、実際の癌ではない。最も軽度の形態、ＣＩＮ Ｉは、通常は自然に消失するが、まれに癌へと進行することがある。より重症の形態であるＣＩＮ ＩＩ及びＣＩＮ ＩＩＩは、ほとんどの場合同じ状態にとどまるか又は時間と共に悪化する。それらは癌になり得るが、適切に治療すればほとんどの場合癌になることはない。
【００３４】
ＨＰＶは、子宮頸癌の発症を導き得る、子宮頸部の細胞変化の発現における病原因子として特定された。これらの細胞変化は、ＨＰＶウイルスゲノムからのＥ６／Ｅ７タンパク質の構成的又は持続的発現に関連する。それ故、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現が検出できる被験者、特に経時的に評価したとき持続的Ｅ６／Ｅ７発現を示す被験者は、既に子宮頸部の細胞変化を発現していると結論することができる。これらの変化は、子宮頸部のごくわずかな細胞においてのみ起こり得るものであり、従来の細胞診では検出不能であると考えられる。それにもかかわらず、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出のための高感度で、特異的且つ正確な方法の使用により、従来の細胞学的スクリーニングを用いて可能であるよりもはるかに早期の段階で、既に子宮頸部の細胞変化を示す被験者を特定することが可能である。これは、子宮頸癌の発症を予防することを目指す治療による早期の介入措置を可能にする。
【００３５】
ヒトゲノムへのＨＰＶ組込みの結果として又は改変されたエピソームＨＰＶゲノムにおける「修飾」の結果として、ウイルスのＥ６／Ｅ７癌遺伝子転写の正常な制御が失われる(Durst et al. , 1985, J Gen Virol, 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater and Pater, 1985 Virology 145: 313-318; Schwarz et al., 1985, Nature 314: 111-114; Park et al., 1997, ibid)。これに対し、前悪性病変及びＨＰＶに感染した正常上皮においては、パピローマウイルスは主として「非修飾」エピソーム形態であり、それ故癌遺伝子（Ｅ６／Ｅ７）転写は存在しないか又は効率的に下方調節され得る (Johnson et al., 1990, J Gen Virol, 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli et al., 1993, J Med Virol, 40: 261-265)。ヒトゲノムへのヒトパピローマウイルス１６型ＤＮＡの組込みは、より不安定な細胞活性／ゲノム、及びＥ６及びＥ７ ｍＲＮＡの安定性上昇を導くことが認められる (Jeon and Lambert, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 1654-1658)。そこで、子宮頸癌において典型的に認められるが、ごくまれにＣＩＮ病変でも存在するＨＰＶ組込みは(Carmody et al., 1996, Mol Cell Probes, 10: 107-116)、子宮頸癌発生における重要な事象であると思われる。
【００３６】
臨床状況では、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現のスクリーニングだけに基づく方法の性能は、確信を持ってＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現についての陰性結果を評価する能力に決定的に依存する。これもやはり、最大の感受性を備え、さらに最小の偽陰性結果を生じる検出手法を必要とする。好ましい実施形態では、これは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在又は不在をスクリーニングするための高感度増幅とリアルタイム検出手法を用いることによって達成される。最も好ましい手法は、Leone et al., Nucleic Acids Research., 1998, Vol 26, 2150-2155に記載された、分子指標（molecular beacons）プローブを用いるリアルタイムNASBA増幅である。この手法の感受性の故に、偽陰性結果の発生は最小限に抑えられ、より大きな確信を持って「陰性Ｅ６／Ｅ７発現」の結果を評価することができる。臨床スクリーニングプログラムに関連してアッセイを使用しようとする場合、これは極めて重要である。
【００３７】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型のいずれか１種又はそれ以上（より好ましくは全部）からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現に関してアッセイすることが好ましい。１つの実施形態では、上記アッセイはこれらのＨＰＶ型のみ検出し得る。ノルウェー人の試験母集団において子宮頸癌標本の９６％以上でＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型からのＤＮＡが検出された。他の試験は、Ｅ６及びＥ７の発現は悪性状態への転換及び維持のために必要であると考えられるので、Ｅ６及びＥ７が子宮頸癌においてほとんど不変的に保持されることを示した(Choo et al., 1987, J Med Virol 21: 101-107; Durst et al., 1995, Cancer Genet Cytogenet, 85: 105-112)。非損傷ゲノム又はＬ１遺伝子配列の検出に基づくＨＰＶ検出系と異なり、Ｅ６／Ｅ７領域から発現されるＨＰＶ ｍＲＮＡの検出は、子宮頸癌を発症する危険度に直接関係する患者の９０％以上を検出し得る。
【００３８】
臨床では、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出に基づく方法は、ポストスクリーニング又は優先順位決定において、すなわちＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １又はコンジロームの診断歴を有する個人のさらなる分析において使用し得る。前記方法は、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １又はコンジロームの過去の診断歴を有する個人の群から、子宮頸癌を発症する危険度の高い個人を選択するために使用し得る。ＡＳＣＵＳ、コンジローム及びＣＩＮ Ｉは、異なる細胞学者及び異なる細胞学科の間での非常に低い再現性の故に、大なり小なり同じ診断と定義し得る。Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192.1993)は、ＣＩＮ Ｉ症例の約１％だけが子宮頸癌に進行し得ることを認めた。それ故、子宮頸癌を発症する実質的な危険性がある、ＡＳＣＵＳ、コンジローム又はＣＩＮ Ｉを有する個人のサブセットを特定する効率的な方法が強く求められている。Karlsen et al., 1996 による子宮頸癌症例試験の８７％においてＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型のうちの１種が検出された。ＨＰＶ４５型を含めると、子宮頸癌標本のほぼ９０％がこれら５つのＨＰＶ型に関連することが認められる。それ故、Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192.1993) によって提供されたデータから算定すると、見逃されるＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ Ｉ又はコンジロームを有する症例の９９．９％以上が、本発明者らのHPV-Prooferキットによって検出される。
【００３９】
本発明の方法の高い感受性と特異性は、子宮頸癌を発症する危険度が高い又は非常に高い女性の検出のための一次スクリーニング、反射試験キット又は常用診断において有用であり得ることを意味する。
【００４０】
本発明の方法では、ｍＲＮＡの「陽性発現」は、バックグラウンドを上回る発現を意味すると解釈される。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現のレベルの正確な定量的測定の絶対的必要性は存在しない。
【００４１】
ある実施形態では、本発明の方法は、ｍＲＮＡ発現のレベルの定量的測定を含み得る。好ましい実施形態では、「陽性発現」と「陰性発現」の明らかな識別を与えるために、「陽性発現」の判定は関連ｍＲＮＡの５０コピー以上（試料１ｍＬあたり又は試料の総容量あたり）の存在を必要とし、一方「陰性発現」の判定は関連ｍＲＮＡの１コピー以下（試料１ｍＬあたり、又は試料の総容量あたり）の存在を必要とし得る。
【００４２】
本発明の方法は、好ましくは、癌関連ＨＰＶ型、より好ましくは「高危険度」癌関連ＨＰＶ型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを特異的に検出することができる手法を用いてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡをスクリーニングすることを含む。前記最も好ましい実施形態では、前記方法は、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくは４５型からＥ６ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡをスクリーニングすることを含む。最も好ましくは、この方法は、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３型、及び好ましくは４５型の少なくとも１種、最も好ましくは５種の型全部からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現を特異的に検出する。しかし、１６、１８、３１、３３及び４５以外の他の型から、例えば３５、３９、４５、５２、５６、５８、５９、６６及び６８からのＥ６／Ｅ７の発現に関して陽性の女性は、なお細胞異常を示し得る。そこで、本発明の方法は、最も好ましくはＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関するスクリーニングに加えて、これらのＨＰＶ型の１又はそれ以上からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現に関してスクリーニングすることを含み得る。ある種のＨＰＶ型は、著明な地理的／個体群（population）分布を示す。それ故、例えばＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についてのスクリーニングに加えて、試験下にある個体群／地理的領域において一般的であることが知られるＨＰＶ型に特異的なプライマーを含めることが適切であると考えられる。
【００４３】
本発明の方法は、完全長Ｅ６タンパク質をコードするＨＰＶ型の一部又は全部の完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出に基づくものである。これらの実施形態では、完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在を陽性スクリーニング結果とみなす。
【００４４】
「完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物」という用語は、天然に生じるスプライス変異体を除外するが、機能性完全長Ｅ６及びＥ７タンパク質をコードする２シストロン性転写産物を包含する。これまでに４つのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ種、すなわちスプライシングされていないＥ６転写産物及びＥ６*Ｉ、Ｅ６*ＩＩ及びＥ６*ＩＩＩと表わされる３つのスプライシングされた転写産物が、ＨＰＶ１６に感染した細胞において記述されている(Smotkin D, et al. , J Virol. 1989 Mar 63 (3): 1441-7; Smotkin D, Wettstein FO. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul 83 (13): 4680-4; Doorbar J. et al., Virology. 1990 Sep 178(1) : 254-62; Cornelissen MT, et al. J Gen Virol. 1990 May 71 (Pt 5): 1243-6; Johnson MA, et al., J Gen Virol. 1990 Jul 71 (Pt 7): 1473-9; Schneider-Maunoury S, et al., J Virol. 1987 Oct 61 (10): 3295-8; Sherman L, et al. Int J Cancer. 1992 Feb 50 (3): 356-64)。４つの転写産物全てが、Ｅ６ ＯＲＦの２番目のＡＴＧのすぐ上流に位置する単一プロモーター（ｐ９７）から転写される。ＨＰＶ１６の場合は、「完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物」という用語は、Ｅ６ ＯＲＦ内のヌクレオチド９７−ヌクレオチド８８０まで（ヌクレオチド９７及び８８０を含む）の領域の全部又は実質的に全部を含む転写産物を指す。ヌクレオチド位置は標準ＨＰＶ命名法に従って番号付けている（Human Papillomavirus Compendium OnLine参照、インターネットを通して又はHV Database,Mail Stop K710,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM 87545,USAより書類形態で入手可能）。
【００４５】
ＨＰＶ１６以外のＨＰＶ型に関しては、「完全長」Ｅ６／Ｅ７転写産物は、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７転写産物の上述した領域に相同な配列を含む転写産物を含み、Ｅ６スプライス変異体を除外すると解釈される。ＨＰＶ型の様々な配列アラインメントがHuman Papillomavirus Compendium OnLineによって公的に入手可能である。
【００４６】
完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の特異的検出は、例えば完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物にのみ存在し、スプライス変異体には存在しない領域に特異的なプライマー又はプローブを使用して、達成し得る。
【００４７】
Ｅ６*Ｉ転写産物は、ヌクレオチド２２６と４０９との間にコード配列の喪失を示し（ＨＰＶ１６型において）、Ｅ６*ＩＩ転写産物は、ヌクレオチド２２６と５２６との間にコード配列の喪失を示す（ＨＰＶ１６型において）。それ故、ＨＰＶ１６型のヌクレオチド２２６と４０９との間に位置する領域又はＨＰＶ１８、３１、３３又は４５型の１種からの相同領域から少なくとも１個のプライマー又はプローブを使用することが好ましい。完全長転写産物に対する特異性は、好ましくはこの領域内に位置する配列に特異的なプローブと共に、１個のプライマーがこの領域内に位置する配列に特異的であり、他方のプライマーがこの領域の外側に位置する配列に特異的であるプライマー対、又は両方のプライマーがこの領域内の配列に特異的であるプライマー対を使用することによって達成できる。他の実施形態では、完全長Ｅ６をコードするｍＲＮＡに対する特異性を付与するために、この領域内の配列に特異的なプローブと組み合わせて、両方のプライマーがこの領域の外側の配列に特異的であるプライマー対を使用することも可能であり得る。
【００４８】
異なるＨＰＶ型は、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の異なるパターンを示す。完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物の検出のためのプローブ又はプライマーの設計を助けるために使用し得る、ＨＰＶ１６及び３１型を含む、様々なＨＰＶ型についての転写産物地図は、Human Papillomavirus Compendium（上記の通り）によって公的に入手可能である。
【００４９】
アッセイ方法
本発明の方法は、少なくとも１つの細胞又は組織において、より詳細には少なくとも１つの細胞又は組織からのＲＮＡを含む試料において、Ｅ６／Ｅ７転写産物の存在をスクリーニングすることを含む。前記の少なくとも１つの細胞又は組織は、ヒトパピローマウイルスによる感染に対して感受性である型の少なくとも１種の頸部細胞、すなわち頸部上皮細胞を含み得る。
【００５０】
開示されるスクリーニング方法は、試験する被験者から採取した頸部細胞を含む臨床試料又は生検から単離された核酸の標本に関して実施し得る。核酸のソースとして使用し得る適切な試料は、子宮頸部スワブ、子宮頸部生検、子宮頸部切屑、刷毛及び綿球等を使用して採取した試料、皮膚生検／いぼ、またパラフィン包埋組織、及びホルマリン又はメタノール固定細胞を含む（しかし、排他的ではない）。
【００５１】
開示する方法を用いてスクリーニングする核酸の標本はｍＲＮＡを含まねばならないが、精製ポリＡ+ｍＲＮＡの標本である必要はなく、全ＲＮＡの標本又はＲＮＡとゲノムＤＮＡの両方を含む全核酸の粗標本、あるいはさらに粗細胞溶解産物も、NASBA反応のための出発物質として適する。基本的にｍＲＮＡを含む核酸の標本の単離のための当技術分野で公知のいかなる手法も、被験試料から核酸を単離するために使用し得る。好ましい手法は、米国特許出願第５，２３４，８０９号及び欧州特許公開公報第ＥＰ−Ｂ−０３８９,０６３号に述べられている「Ｂｏｏｍ」単離法である。これはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む核酸標本を単離するために使用でき、カオトロピック試薬、グアニジンチオシアネート(GuSCN)の存在下での二酸化ケイ素粒子の核酸結合特性に基づく。
【００５２】
本発明の方法は、ＨＰＶゲノムの活発な転写の評価に基づく。この方法は、ｍＲＮＡ発現を検出するために使用される厳密な手法に関するものにに限定されない。特定ｍＲＮＡ配列の検出のための多くの手法が当技術分野において公知であり、本発明に従って使用し得る。例えば特定ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション、増幅又は配列決定手法によって検出し得る。
【００５３】
増幅手法によって、最も好ましくは等温増幅、例えばNASBA、転写媒介性増幅、ＲＮＡのシグナル媒介性増幅テクノロジー、等温溶液相増幅等によってｍＲＮＡ発現を検出することが最も好ましい。これらの方法は全て当技術分野において周知である。より好ましくは、増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせた等温増幅によってｍＲＮＡ発現を検出する。最も好ましい組合せは、Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155によって述べられているような、分子指標テクノロジーを用いた増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせた、NASBAによる増幅である。
【００５４】
NASBA手法を用いた被験試料中のＨＰＶの検出のための方法は、一般に以下の工程：
（ａ）適切なプライマー対、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を加水分解するリボヌクレアーゼ、前記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、及びリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む反応媒質を作製すること；
（ｂ）反応媒質を、NASBA増幅反応を許容する反応条件下で、ＨＰＶを含むことが予測される被験試料から単離した核酸の標本と共にインキュベートすること；及び
（ｃ）NASBA増幅反応の何らかのＨＰＶ特異的産物を検出すること及び／又は定量的に測定すること
を含む。
【００５５】
NASBA反応の特異的産物（すなわち標的ＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンスコピー）の検出は、多くの異なる方法で実施し得る。１つのアプローチでは、NASBA産物を特異的にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用してNASBA産物を検出し得る。ハイブリダイゼーションプローブは、検出標識、例えば蛍光、発光、放射性又は化学発光化合物又は酵素標識又は当業者に公知の他の何らかの種類の標識に結合し得る。標識の厳密な性質は決定的に重要ではないが、それ自体であるいは１又はそれ以上の付加的な物質（例えば酵素についての基質）と共に、外部からの手段によって検出可能なシグナルを生成し得ることを要する。
【００５６】
好ましい反応方法は、反応の経過と共にNASBA反応の産物の形成を持続的に観測することができる、いわゆる「リアルタイムNASBA」である。好ましい実施形態では、これは、当技術分野で公知であり、ここで説明するように、NASBA産物にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的配列を含む「分子指標」プローブ、ステム−二本鎖形成オリゴヌクレオチド配列及び一対の蛍光／消光成分を用いて達成し得る。増幅の前に分子指標プローブを反応混合物に添加すれば、NASBA産物の形成をリアルタイムで観測することが可能となり得る（Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155）。リアルタイムNASBA検出を実施するための試薬キット及び装置は市販されている（例えばNucliSens（商標） EasyQshisutemu、Organon Teknikaより）。
【００５７】
さらなるアプローチでは、分子指標テクノロジーを、別々のハイブリダイゼーションプローブを必要とせずにNASBA反応のリアルタイム観測を可能にするプライマー２オリゴヌクレオチドに組み込み得る。
【００５８】
さらなるアプローチでは、プライマー２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド配列にハイブリダイズする一般的標識検出プローブを用いてNASBA反応の産物を観測し得る。これはOrganon Teknikaによって供給される「NucliSens（商標）」検出システムに相当する。このシステムでは、固体支持体、例えば磁気マイクロビーズに結合した、ここで述べるようなプローブオリゴヌクレオチドを含むＨＰＶ特異的捕獲プローブを使用することにより、標的ＨＰＶ ｍＲＮＡに由来するNASBA産物に対する特異性を付与し得る。最も好ましくは、一般的標識検出プローブは、Organon Teknikaによって供給されるＥＣＬ（商標）検出プローブである。NASBAアンプリコンをＨＰＶ特異的捕獲プローブ及び一般的ＥＣＬプローブにハイブリダイズさせる（プライマー２上の相補的配列によって）。ハイブリダイゼーション後、ビーズ／アンプリコン／ＥＣＬプローブ複合体を自動ＥＣＬリーダー（例えばOrganon Teknikaによって供給されるNucliSens（商標）リーダー）の磁気電極で捕獲し得る。その後、電圧パルスがＥＣＬ（商標）反応を開始させる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも主要な癌関連ＨＰＶ型である１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの増幅に基づくものである。これを達成することができるいくつかの異なる方法がある。
【００６０】
１つの実施形態では、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型の各々に特異的な別々のプライマー対を、各々のＨＰＶ型からの転写産物を個別に増幅するために使用し得る。あるいは、増幅反応の多重化を可能にするために単一容器内で２又はそれ以上のプライマー対の混合物を使用し得る。
【００６１】
さらなる実施形態では、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型からのＥ６／Ｅ７遺伝子の領域を増幅することができる単一プライマー対を使用してもよく、これは、単一増幅反応において４つ（好ましくは５つ）の型全部の増幅を可能にする。これは、例えば縮重プライマーの対を使用して又はＨＰＶ型全体にわたって高度に保存されているＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの領域を選択することによって達成できる。
【００６２】
Ｅ６／Ｅ７プライマー対はＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡのいずれの領域に対応してもよく、Ｅ６オープンリーディングフレーム及び／又はＥ７オープンリーディングフレームの全部又は一部の増幅を可能にし得る。好ましくは、完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長転写産物の増幅を可能にする。
【００６３】
さらなるアプローチでは、縮重オリゴヌクレオチドプライマー又は、好ましくはＨＰＶ遺伝子型間での配列変異の部位に対応する、小さな配列変異を示すポリヌクレオチドの複合混合物の使用によって、多数のＨＰＶ型についての特異性を実現し得る。そのような縮重プライマー又は混合物の使用の背後にある理論的根拠は、混合物は各々のＨＰＶ型を検出することができる少なくとも１種のプライマー対を含み得るということである。
【００６４】
さらなるアプローチでは、好ましくはＨＰＶ遺伝子型間での配列変異の部位で、１又はそれ以上のイノシンヌクレオチドをプライマーに組み込むことによって多数のＨＰＶ型に対する特異性を達成し得る。
【００６５】
様々なＨＰＶ型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出のために使用し得る適切なプライマー及びプローブのリストは、ＷＯ０３／０５７９１４号及びＷＯ０３／０５７９２７号に見出し得る。ＷＯ０３／０５７９１４号及びＷＯ０３／０５７９２７号の内容全体が参照してここに組み込まれる。
【００６６】
本発明の方法は、好ましくはPre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ及びキットを用いて実施される。しかし、本発明がこの特定アッセイの使用に限定されないことは了解されるべきである。
【００６７】
本発明の方法は、子宮頸、子宮体及び／又は子宮頸管の全体又は部分からの実際に組織診陰性である代表的試料を陰性と評価する。これは、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）をこれまでに開発された最も有望な一次スクリーニング法の１つにする、卓越した特異性を提供する。
【００６８】
子宮頸癌を発症する危険度の高い女性の診断のためにPre-Tect HPV-Proofer（商標）だけを使用することの特異性は、年齢及び仕事とは無関係であり、市販のＤＮＡに基づくアッセイ単独よりも３倍以上高い特異性であることが証明された。
【００６９】
Ｅ６／Ｅ７転写産物の検出は、反復試験を実施する必要なしに高危険度感染が持続し得るかどうかを特定する潜在的可能性を有する。Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子からの発現の頻度は病変の重症度と共に上昇する。
【００７０】
本発明の方法は、何らかの適切な方法によるＨＰＶ遺伝子型決定と組み合わせて実施し得る。「ＨＰＶ遺伝子型決定」という用語は、所与の個体中に存在するＨＰＶサブタイプの特定を可能にする手法である。ＨＰＶタイピングと組み合わせたＥ６／Ｅ７発現の検出によるＨＰＶ腫瘍形成作用の評価は、高悪性度病変の強力な予測因子となる見込みがある。
【００７１】
本発明は、以下の実験実施例を参照してさらに理解される。
【００７２】
Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ
Pre-Tect HPV-Proofer（商標）キット及びアッセイの使用に関係する全ての実験実施例に関し、当該アッセイは、供給される指示書に従って市販のキットを用いて実施した。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡのリアルタイム検出のためのアッセイの操作に関するさらなる情報は、その内容全体が参照してここに組み込まれる、ＷＯ０３／０５７９１４号に認められる。
【００７３】
以下の実験章は、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ及びキットを使用して得られた臨床データを要約するものである。
【実施例１】
【００７４】
外来患者母集団から収集した４１３６の子宮頸部試料における発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からのＥ６及びＥ７ ｍＲＮＡ発現
この試験の目的は、組織診によって確認された細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３試料においてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ及びＤＮＡの存在を特定することであった。
【００７５】
材料及び方法：
試料は、３０歳以上の女性（n=4136）を含む、十分にスクリーニングされた外来患者母集団から収集した。高危険度ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型の各々からのＥ６／Ｅ７転写産物を、リアルタイム多重NASBAに基づき、Pre-Tect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua、Norway）によって検出した。ＨＰＶ ＤＮＡの存在をＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって検討し、その後ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料をＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についての型特異的ＰＣＲに供した。細胞学的ＨＧＳＩＬ診断を有する女性を生検及び組織診に差し向けた。
【００７６】
組織診で確認された症例をノルウェー癌登録（Norwegian Cancer Registry）に登録した。ノルウェーでは、細胞学的ＨＧＳＩＬは、ＨＧＳＩＬ／ＡＧＵＳ、ＨＧＳＩＬ／ＡＳＣ−Ｈ、ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ２及びＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３に分類することができる。
【００７７】
結果：
２５の細胞学的ＨＧＳＩＬ症例のうちで、１４例がＣＩＮ２＋として組織診で確認された。組織学的ＣＩＮ２＋の２症例は、細胞診によってＨＧＳＩＬ／ＡＳＣ−Ｈ及びＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ２と診断された。Pre-Tect HPV-Prooferは、細胞学的ＨＧＳＩＬ症例の５２％（１３／２５）、組織学的ＣＩＮ２＋症例の８６％（１２／１４）、及び組織診によって確認されなかった細胞学的ＨＧＳＩＬ症例の９％（１／１１）を検出した。Ｇｐ５＋／６＋ ＰＣＲに関する数は、それぞれ６４％（１６／２５）、９３％（１３／１４）、及び２７％（３／１１）である。コンセンサスＰＣＲによって陽性であるが、Pre-Tect HPV-Prooferでは陰性の、組織学的ＣＩＮ２＋の１試料は、ＨＰＶ３５と特定された。ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３の有病率は０．２９％（１２／４１３６）であり、組織学的ＣＩＮ２＋の有病率は５６％（１４／２５）であった。Pre-Tect HPV-Proofer及びコンセンサスＰＣＲについての感受性、特異性、及び正及び負の予測価を表１に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
考察及び結論：
細胞学ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３症例と組織学的ＣＩＮ２＋症例の間で良好な一致があったが、細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３の１例だけが組織診によってＣＩＮ２＋と確認されなかった。組織診で確認されたＣＩＮ２＋症例では、ＨＰＶ ＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方に関して検出程度は高く、ほぼ同じであった。組織診によって確認されなかった細胞学的ＨＧＳＩＬ症例では、PreTect HPV-Prooferについての検出程度はコンセンサスＰＣＲに関するよりも低かった。合わせて考慮すると、細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３及びPreTect HPV-Prooferは全ての組織学的ＣＩＮ２＋を検出した。
【００８０】
結論として、５つの最も頻繁に認められる発癌性ＨＰＶ型、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７転写産物は、ほとんど全ての組織学的ＣＩＮ２＋症例において存在すると思われる。PreTect HPV-Prooferについての高い特異性及び正の予測価はＨＰＶ診断における利点であり、それ故ｍＲＮＡ検出は細胞診及び組織診の適切な補助である。
【実施例２】
【００８１】
スウェーデン婦人科学スクリーニングプログラムにおける低悪性度病変のフォローアップとしてのＨＰＶ検出
スウェーデンでは、年間約40,000の細胞診症例がフォローアップを必要とする異常を示す。大部分の症例は自然に後退するが、一部は治療しなければ進行する。また、フォローアップ方法における細胞診の低い感受性という問題も存在する。前癌性病変の検出において、細胞学的ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ Ｉの検出後にＨＰＶ検査を実施したとき、特異性と感受性の両方が劇的に改善することが認められた。
【００８２】
主たる目的は、スウェーデンスクリーニングプログラムでの細胞診及び組織診に関してＨＰＶ ＲＮＡ及びＤＮＡ試験のそれぞれの役割を評価することであった。もう１つの重要な目的は、ＣＩＮ Ｉ又はＡＳＣＵＳを有するが、ＨＰＶ ＲＮＡ又はＤＮＡ試験のいずれかで陰性の女性においてＣＩＮ ＩＩ＋を見落とす危険性を評価することであった。
【００８３】
試験材料は、スウェーデンの中心部における通常のスクリーニングプログラム後の１５０００人の女性からである。細胞診でＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ Ｉに関して陽性の全ての女性をその後の試験のために選択した。細胞診又は組織診材料全てを、経験を積んだ病理学者がブラインド法で再評価した。ＡＳＣＵＳ及びＣＩＮ Ｉに関して陽性の試料（N=240）をPreTect HPV-Prooferで評価し（N=240）、無作為抽出した試料を、４ヵ月後にHybrid Capture II（ＨＣＩＩ）と細胞診（N=127）及び細胞診単独（N=112）によって試験した。それらを、７ヵ月後にＬＥＥＰ生検からの組織診（N=126）と、及び１２ヵ月後にPreTect HPV-Proofer（N=240）、ＨＣＩＩ及び細胞診と比較した（表２）。ＡＳＣＵＳ及びＣＩＮ Ｉを有する全ての試料をｍＲＮＡに関して試験した。コルポスコピーによるＬＥＥＰ生検（N=126）を細胞診断異常及び／又は陽性ＨＰＶ ＤＮＡ試験を有する全ての女性に関してフォローアップの一部として採取した（４ヵ月後）。ＨＰＶ ＤＮＡはＨＣＩＩアッセイ（Digene，Gatesburg，MD，USA）を用いて検出した。ＨＰＶ １６、１８、３１、３３及び４５からのＥ６／Ｅ７転写産物の特定と個別分類は、PreTect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua，Norway）を用いて実施した。
【００８４】
結果
ＨＰＶ検査の結果を、４ヶ月及び１２ヵ月後の細胞診、及び細胞診陽性診断から７ヵ月後の組織学的診断と比較した。ＨＰＶ型の頻度と分布を表３に示す。細胞診と組織診の一致は症例の１９％で認められた。細胞診及びＤＮＡ試験は、ＲＮＡ試験よりもかなり頻繁に、組織診による良性及び低悪性度病変において陽性であった。組織診を「判断基準（golden standard）」として、ＲＮＡ試験は、ＤＮＡ試験（それぞれ３１％と５１％）よりも高い正の予測価と高い特異性（それぞれ４６％と８５．３％）を明らかにした。しかし、ＤＮＡ試験は、ＲＮＡに基づく試験（８１％）よりも高い感受性（９１％）を示した。ＬＥＥＰ円錐切除術で治療された症例の１９％は、治療の５ヵ月後に細胞学的異常を示し、０．５％はＣＩＮ ＩＩ＋であることが認められた。ＨＰＶ ＤＮＡはこれらの症例の２４％において検出され、ＨＰＶ ＲＮＡは６％で検出された（表２）。
【００８５】
【表２】
【００８６】
【表３】
【００８７】
考察及び結論
ＤＮＡに基づく方法と比較してＲＮＡに基づく方法のより高い正の予測価及びより高い特異性は、Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子の発現が悪性表現型の発現と維持のために必要であるという事実によって説明され得る。ＣＩＮ Ｉ又はＡＳＣＵＳを有するが、ＨＰＶ ＲＮＡ又はＤＮＡ試験で陰性である女性において、ＣＩＮ ＩＩ＋を見落とす危険性は極めて低く（０．２％）、細胞学的ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ ＩにおけるＨＰＶ検査の付加価値を確認する。
【実施例３】
【００８８】
３０歳以下の女性における癌遺伝子発現を伴わない高危険度ＨＰＶ感染
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、女性、特に若年齢群における一般的なウイルス感染であるが、ほとんどの感染は一過性で、無症候性である。スカンジナビア諸国では、３０歳以上の女性母集団におけるＨＰＶ罹患率は５から１５％の範囲であるが、より若年の女性でのＨＰＶ罹患率は３０〜４０％という高率であり得る。また、性交経験のある女性の７０〜８０％が、生涯のある時点で、ＨＰＶ感染を獲得する。しかし、感染の大部分は自然に消失し、小さな割合だけが持続して、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）を生じさせる。
【００８９】
この試験の目的は、３０歳以下の女性においてＥ６／Ｅ７転写産物の検出とＨＰＶ ＤＮＡの検出を比較することであった。
【００９０】
材料及び方法：
３０歳以下の女性（平均年齢２６．９歳）から合計２８２の子宮頸部試料を試験した。NucliSens Extractorを用いてＲＮＡ及びＤＮＡを抽出し、発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現をPreTect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua，Norway）によって検出した。ＨＰＶ ＤＮＡの存在をＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって検討し、その後ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料を同じ５つのＨＰＶ型に関する型特異的ＰＣＲに供した。
【００９１】
結果：
合計３２．６％（n=92）の試料がＧｐ５＋／６＋ ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡに関して陽性であり、２４．８％（n=70）が１６、１８、３１、３３及び４５型であることが認められた。同じ５つのＨＰＶ型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡは、症例の１５．２％（n=43）においてのみ認められた。
【００９２】
５つの発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型は、ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料の７６％（７０／９２）を占め、一方、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現はこれらの症例の６１％（４３／７０）で検出された。
【００９３】
細胞診陽性結果は８／２８２症例（２．８％）で得られ、そのうちＡＳＣＵＳは５／８例で、ＨＰＶコンジロームは３／８例で認められた。ＡＳＣＵＳ症例に関しては、４／５例においてＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲ及び型特異的ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡが検出されたのに対し、１つの試料だけがＨＰＶ ｍＲＮＡを含むことが認められた。しかしながら、ＨＰＶコンジローム症例に関しては、全ての試料（n=3）においてＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって、及び２／３例において型特異的ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡが検出され、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現は、１例においてのみPreTect HPV Prooferによって検出された。
【００９４】
考察：
３０歳以下の女性におけるＨＰＶの存在は、より高齢女性に関するよりも高い。これは、他の型と比較して５つの発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型の発生率にも当てはまる。Ｅ６／Ｅ７転写産物の欠如は、ウイルスのエピソーム状態、それ故転写工程の制御された調節を反映すると考えられる。これらの感染は消失する可能性がより高いと考えられる。しかしながら、ウイルスの組込みは、Ｅ２遺伝子を破壊し、それによってＥ６／Ｅ７転写の調節因子としてのその機能も破壊し得る。
【００９５】
結論：
この若年外来患者母集団において、癌遺伝子発現を伴うＨＰＶ感染は、コンセンサスＰＣＲ陽性試料の５０％以下で検出される。そこで、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についてＥ６／Ｅ７遺伝子発現を観測することは、細胞診に加えて有用な診断試験であると考えられる。ｍＲＮＡ検出は、若年女性における進行性疾患に関してより識別力があると考えられる。
【実施例４】
【００９６】
ＨＰＶ検査のためのＤＮＡとＲＮＡに基づく方法
この試験の目的は、細胞診陰性及び陽性の女性における高危険度ＨＰＶ感染の発生率を検討するためにＨＰＶ検査のための２種の市販のアッセイの有効性を確認すること、及び細胞診及び組織診と比較してＤＮＡに基づく試験及びＲＮＡに基づく試験の結果を評価することであった。
【００９７】
材料及び方法
試験母集団は、私立診療所の外来科及び婦人科から選択した。平均年齢４０歳（範囲１９〜８５歳）の６２８名の女性がこの試験に含まれた。従来のパパニコラウスミアを最初に採取し、残りの材料をPreservCyt（商標）バイアル（Cytyc Corporation）に移した。高危険度ＨＰＶ ＤＮＡ（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型）に関する試験をHybrid Capture IIアッセイ（Digene Corporation）で実施し、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の個別特定を、リアルタイムNASBA手法、Pre Tect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS）で実施した。
【００９８】
ＨＰＶ検査が陽性であるか又は細胞診がＨＳＩＬを明らかにしたとき、生検を採取した。組織診を「判断基準（gold standard）」とみなした。
【００９９】
結果
細胞診と組織診の一致は症例の５３％で認められた。高悪性度組織診（ＣＩＮ２＋）は、良性又は低悪性度細胞診結果を有する女性の６１％で検出された。κ値は０．３１であった。２種の試験は、症例の１７％（109/628）において異なる結果となった（表４）。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
両方のＨＰＶ検査が、病変の悪性度と有意の結びつきを示した（p＜0.001）。ＤＮＡ試験は、良性及び低悪性度病変においてより頻繁に陽性であった。ＤＮＡ試験は、ＲＮＡ試験と比較してより高い感受性を明らかにしたが、特異性はより低かった（表５）。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
結論
ＲＮＡ試験は、ＤＮＡ試験よりも高い予後価値及びより高い特異性を明らかにした。
【実施例５】
【０１０４】
ＨＰＶ型特異的ＤＮＡ及びＲＮＡの持続性
ＨＰＶ感染の経過と持続性を、ＨＰＶ遺伝子型決定を線形アレイアッセイと共に使用して、ＨＰＶ陽性で、細胞学的疾患を有していない５４名の女性において分析した。
【０１０５】
子宮頸部の細胞学的異常（核異型）の発現へのＨＰＶ感染の影響を、反復ＨＰＶ遺伝子型決定及び２年後の細胞学的評価によって観測した。HPV-Prooferアッセイを用いた、公知のＨＰＶ癌遺伝子Ｅ６及びＥ７のＨＰＶ転写産物の検出も、両方の時点で実施した。
【０１０６】
材料及び方法：
ＨＰＶ持続性を評価するために設計された進行中の試験の一部として３，０００名以上の女性から２，０００名において液状細胞診（ＬＢＣ）試料を得た（ベースライン）。ＬＢＣは、従来のパパニコラウスミアにおいて実施されるように頸部標本を直接スライドガラス上に置くのではなく、細胞防腐剤溶液を含むバイアル中に頸部標本を流し入れることを含む。一時医療従事者が標本収集を実施し、ThinPrep（登録商標）手順によって扁平層スライドガラスを作製して、英国臨床細胞学会ガイドラインに従って細胞悪性度分類を実施した。ベースライン時に細胞学的に正常な結果を有するが、同時に、ヨーロッパで最も一般的に認められる高危険度型とみなされ、癌の＞９０％に関係する、以下の「高危険度」ＨＰＶ型：１６、１８、３１、３３及び４５型の少なくとも１種に関してＨＰＶ ＤＮＡ陽性であることに基づいて、５４名の女性の集団を選択した。ベースラインの２年後にフォローアップＬＢＣスミアのために女性を再来訪させ、そのときに細胞学的評価とＨＰＶ ＤＮＡ及びＲＮＡ試験を実施した。
【０１０７】
細胞検査後、ＬＢＣ試料中の残留細胞を3,500rpmで１０分間遠心分離し、核酸抽出及びＨＰＶ検出まで−７０℃で分割細胞ペレットとして保存した。QIAamp（登録商標）96 DNA Swab BioRobot（商標）キットと共に供給される試薬を使用し、BioRobot 9604（登録商標）（QIAGEN Ltd．，Crawley，UK）を用いて自動ＤＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡ抽出は、動物細胞からの単離のためのプロトコールに則り、製造者の指示に従って、RNeasyカラム（QIAGEN Ltd.）の適用によって実施した。核酸をＨＰＶ検出までに−７０℃で保存した。
【０１０８】
ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型決定は、固定化プローブを含むナイロンストリップに配置したＰＧＭＹプライマーによって生成される４５０ヌクレオチドのＰＣＲアンプリコンのハイブリダイゼーションを含む、線形アレイハイブリダイゼーションアッセイ（ＬＡ）によって実施した[Gravitt et al., 2000; Coutlee et al., 2002]。ストリップは、２種のレベルのβ-グロビン制御プローブ、１８個の高危険度ＨＰＶ（ＨＲ−ＨＰＶ）プローブ：１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５５、５６、５８、５９、６８、７３、８２、８３及び９個の低危険度ＨＰＶ（ＬＲ−ＨＰＶ）プローブ：６、１１、４０、４２、５３、５４、５７、６６、８４を含んだ。ＰＣＲ試薬、プローブストリップ及び展開試薬は、Roche Molecular Systems,Inc.（Alameda）によって供給された。
【０１０９】
β-グロビン陰性と判定された試料は分析から除外する。等温NASBA増幅によってＲＮＡ増幅を実施し、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、４５型についての完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに対する分子指標（ＭＢ）プローブを使用して型特異的検出を実施した。NASBA増幅及びＨＰＶ検出のために必要な試薬は全て、PreTect（登録商標） HPV-Prooferキット（NorChip，Klokkarstua，Norway）の一部として供給された。蓄積したｍＲＮＡ産物の蛍光検出を、NucliSens EasyQ Analyzerを用いてリアルタイムで実施し、PreTect analysisソフトウエア（PAS，NorChip）を用いて蛍光特性を分析した。
【０１１０】
結果：
ＤＮＡ遺伝子型決定によって観測したとき、２年後に合計１１／５４（２０％）の女性が核異型を発現し、３１／５４及び２３／５４の女性がそれぞれ一過性及び持続性感染を示した。型特異的持続性ＨＰＶ感染を維持していた女性は、一過性感染を示した女性に比べて核異型を発現する可能性が有意に高かった（P＜0.001）。ＨＰＶ ｍＲＮＡ Ｅ６-Ｅ７転写産物の存在は感受性がより低かったが、フォローアップ時の疾患の検出のためにより特異的であった。さらに、ベースライン時にＤＮＡ陽性であり、同時にｍＲＮＡ転写産物に関しても陽性であった女性は、ベースライン時にＤＮＡだけが検出された女性と比較して持続性感染を保有する可能性が有意に高かった（P＞0.013）。この試験は、頸部異常を発現する危険度がより高い女性を特定するために持続型特定ＨＰＶ感染を検出することの重要性を強調する。完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７転写産物の検出は、反復試験を行わずに検出を１時点だけで実施したときでも、いずれの高危険度ＨＰＶ感染が持続し得るかを特定する潜在的可能性を有する。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出は、いずれの感染が持続する可能性がより高いかを特定した。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【実施例６】
【０１１３】
以下の表は、アフリカ人の外来患者個体群からの試料における、PreTect HPV-Prooferによる完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出対コンセンサス及び型特異的ＰＣＲによるＨＰＶ ＤＮＡの検出の概要を示す。組織診（＋）と判定された試料を、組織学に基づくＣＩＮ ＩＩ＋と評価した。
【０１１４】
【表Ａ】
【０１１５】
この試験の結果は、組織診に基づきＣＩＮ ＩＩ＋と判定された細胞異常を示す試料に関して、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型（例えば、PRETECT HPV-proofer）のいずれかからの完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７転写産物の検出に基づくアッセイの特異性を例証する。ＲＮＡアッセイは、組織診と同様の特異性であるが、より高い感受性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ：ヒトパピローマウイルス）が存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該ＨＰＶが、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すものである、前記方法に関する。特に、本発明は、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変に相当する持続性形質転換ＨＰＶ感染、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）の、インビトロスクリーニング方法を提供する。前記方法は、子宮頸癌のスクリーニングにおいて有用である。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は世界中で最も一般的な悪性疾患の１つであり、女性における罹患率及び死亡率の主要原因の１つである(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J(1993) Int J Cancer 54: 594-606; Pisani P, Parkin DM, Ferlay J (1993) Int J Cancer 55: 891-903)。米国では１９９６年に15,700の浸潤子宮頸癌の新規症例が予測され、世界中での年間発生数は、世界保健機関によって450,000例と推定されている（1990年）。年間発生率は世界の種々の地域において異なり、西アジアでの100,000人あたり７．６人から 南アフリカでの100,000人あたり４６．８人にわたる(Parkin et al., 1993 ibid)。
【０００３】
子宮頸癌の現在の概念は、しばしば１０〜２５年の期間にわたって発現する多段階疾患であると考えられている。子宮頸部の浸潤扁平上皮癌は、基底板の貫通及び間質又は上皮固有層の浸潤によって示される。子宮頸癌の臨床経過は大きな変動を示す。予後は、臨床病期、リンパ節の関与、原発腫瘤、組織学的タイプ、浸潤の深さ及びリンパ管内蔓延に関連してきた(Delgado G,et al., (1990) Gynecol Oncol 38: 352-357)。あまり好ましくない腫瘍特徴を有する一部の患者が比較的良好な結果を示すことがあり、また一部には初期の限定疾患が致死的結果を迎える患者もある。これは、リスクに適合した治療を投与するために、新たに診断された子宮頸癌をさらに特性付けるための付加的なマーカーの明らかな必要性を示す (Ikenberg H, et al., Int. J. Cancer 59: 322-6.1994)。
【０００４】
子宮頸癌の疫学は、宗教、婚姻及び性的パターンとの強い結びつきを示した。１００近い症例−対照試験がＨＰＶと頸部新形成の関係を検討しており、ほとんど全部が明確な結びつきを認めた(IARC monographs, 1995)。その結びつきは強力で一貫しており、限られた数のウイルス型に特異的である (Munoz N, Bosch FX (1992) HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies. IARC Sci Publ 251-261)。最も参考となる試験において、ＨＰＶ １６ ＤＮＡとの強い結びつきが浸潤癌及び高悪性度ＣＩＮ病変に関して顕著な一貫性を持って認められ、この結びつきが偶然、バイアス又は交絡によって説明できる可能性を排除した(IARC monographs, 1995)。間接的な証拠は、癌細胞において検出されるＨＰＶ ＤＮＡが、発癌現象におけるより早期のＨＰＶ感染の役割についての良好なマーカーであることを示唆した。ウイルス負荷の上昇と子宮頸癌の危険度の間での用量−反応関係が報告されている (Munoz and Bosch, 1992 ibid)。一部のより大きなシリーズでは、腫瘍の１００％までがＨＰＶに関して陽性であったが、ウイルス陰性子宮頸癌の存在についてはまだ論争の余地がある (Meijer CJ, et al., (1992) Detection of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cancer screening. IARC Sci Publ 271-281; Das BC, et al., (1993) Cancer 72: 147-153)。
【０００５】
扁平上皮子宮頸癌で認められる最も多いＨＰＶ型は、ＨＰＶ１６（４１％〜８６％）及び１８（２％〜２２％）である。加えて、ＨＰＶ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５４、５６、５８、５９、６１、６６及び６８も認められる(IARC monographs, 1995)。バルセロナでのＨＰＶ２０００国際会議において、ＨＰＶ１６、１８、３１及び４５は高危険度と定義され、ＨＰＶ３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９、６８は中間危険度と定義された (Keerti V. Shah. P71)。高危険度プラス中間危険度の１３のＨＰＶは、しばしば合わせて癌関連ＨＰＶ型と称される。
【０００６】
多くの試験により、子宮頸部検診におけるＨＰＶ検査の潜在的役割が調査されている (Cuzick et al. A systematic review of the role of human papillomavirus testing withing a cervical screening programme. Health Technol Assess 3: 14.1999参照)。
【０００７】
Reidらは、初めて、スクリーニングにおけるＨＰＶ検査の役割を明らかにした(Reid R, et al., (1991) Am J Obstet Gynecol 164: 1461-1469)。この試験は、性感染症クリニック及び専門婦人科医からの高危険度女性に関して実施され、ＨＰＶ検出のために高感度（低ストリンジェンシー）サザンブロットハイブリダイゼーションを使用した。合計１０１２名の女性が登録され、頸管造影法も、細胞学検査の可能な補助検査としてみなされた。全部で２３のＣＩＶ ＩＩ／ＩＩＩ病変が発見されたが、１２だけが細胞学検査によって検出された（感受性５２％、特異性９２％）。ＨＰＶ検査は１６の高悪性度病変を検出した。
【０００８】
Bauerらは、ルーチンスミア（routine smears）のために来院した若齢女性（大学生）におけるＭＹ０９／１１プライマー(Manos M, et al., (1990) Lancet 335: 734)を使用した早期ＰＣＲベースの試験を報告している(Bauer HM, et al., (1991) JAMA 265: 472-477)。彼らは、４６７名の女性において４６％の陽性率を認め、これはドットブロットアッセイ（１１％）の場合よりもはるかに高かった。
【０００９】
ＧＰ５／６プライマーによるＰＣＲを用いた試験(Van Den Brule AJ, et al., (1990) J Clin Microbiol 28: 2739-2743) において、van der Brule et al. (Van Den Brule AJ, et al., (1991) Int J Cancer 48: 404-408)は、細胞学検査によって評価したときの子宮頸部新生物とＨＰＶ陽性の非常に強い相関を示した。細胞診陰性のより高齢女性（３５〜５５歳）では、ＨＰＶ陽性率はわずかに３．５％であり、１６、１８、３１及び３３型だけを考慮した場合にはこれは１．５％まで低下し、一方組織学的非浸潤癌を有する女性は全てＨＰＶ陽性であり、９０％は上記の４つの型のうちの１種を有していた。より軽度の細胞学的異常を有する女性は段階的により低いＨＰＶ陽性率を有しており、明らかな傾向を示した。
【００１０】
Roda Housmanらは、異常スミアを有するさらなる１３７３名の女性を検討することによってこれらの観察を拡大させた(Roda Housman AM, et al., (1994) Int J Cancer 56: 802-806)。この試験も、スミア結果の重症度の上昇に伴う陽性率上昇を確認した。彼らはまた、ＨＰＶの不均一性のレベルが、軽度スミアについての２２型から、高悪性度スミアについての１０の「高危険度」型に低下することを認めた。この論文は細胞診陰性の女性を含んでおらず、また細胞学的疾患は組織学的に確認されていない。
【００１１】
Cuzickらは、ＨＰＶ検査が、ランダムスクリーニングの間に検出される細胞学的異常の優先順位決定のために有用な情報を提供することを初めて報告した(Cuzick J, et al., (1992) Lancet 340: 112-113; Cuzick J, et al., (1994) Br J Cancer 69:167-171)。コルポスコピーに差し向けられた１３３名の女性の試験において、彼らは４２％の正の予測価を認め、これは中等度の核異型に関するものと同様であった。結果はＨＰＶ１６に関して最も顕著であり、４２名のＨＰＶ１６陽性女性のうち３９名が、生検で高悪性度ＣＩＮを有することが認められた。この試験はウイルス負荷を評価することの重要性を指摘し、高レベルの高危険度型だけを陽性とみなした。
【００１２】
Coxらは、ボーダーラインスミアを有する女性を優先順位決定するためにHybrid Capture（商標）システム（DIGENE Corporation，Gaithersburg，MD，USA）を使用するＨＰＶ検査の役割を明らかにした(Cox JT, et al., (1995) Am J Obstet Gynecol 172: 946-954)。この検査は、大学紹介サービスからの２１７名のそのような女性に関して実施され、反復細胞診についての７３％と比較して、ＣＩＶ ＩＩ／ＩＩＩに関して９３％の感受性を認めた。高いウイルス負荷は、偽陽性を低下させることによって性能をさらに改善することが認められた。５ＲＬＵをカットオフ値とみなしたとき、約２４％のＰＰＶが感受性を喪失していないことが認められた。
【００１３】
ＷＯ９１／０８３１２号は、試料中のＥ６／Ｅ７ ＨＰＶ遺伝子の全部又は一部の転写産物を検出することによってＨＰＶ活性のレベルを測定すること、及びＨＰＶ活性の測定値を、活性と重篤な子宮頸部形成異常又は癌への進行の危険度との間のこれまでに確立された関係と比較することを含む、ＨＰＶに感染した個人の予後を判定するための方法を述べている。
【００１４】
ＷＯ９９／２９８９０号は、遺伝子発現レベルの測定と分析に基づくＨＰＶ感染の評価のための方法を述べる。特に、ＷＯ９９／２９８９０号は、２又はそれ以上のＨＰＶ遺伝子（例えばＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＥ２）の発現のレベルを測定し、その後、患者におけるＨＰＶに基づく疾患の病期の指標を提供するために、これらの遺伝子の組合せの発現の比率を比較することに基づく方法を述べている。
【００１５】
本発明者は以前に、発現レベルの正確な定量的測定を必要とせずに、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現の簡単な陽性／陰性判定だけに基づいてＨＰＶ関連疾患の臨床的に有用な評価を行うことが可能であると判定した。この方法は技術的に単純であり、好ましい実施形態では、中から高流量方式での自動化に適合させやすい。この方法は、出願人のＷＯ０３／５７９１４号に詳述されている。
【００１６】
ＷＯ０３／５７９１４号に記載の方法は、好ましくは、Norchip ASから市販されているPre-Tect HPV-Proofer（商標）キットを用いて実施される。HPV-Prooferアッセイは、３つのレベルの情報：
（１）５つの異なる特定ＨＰＶ型（１６、１８、３１、３３及び４５型）からのｍＲＮＡの特定；
（２）癌遺伝子ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在の判定；及び
（３）調節不全を指示する完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在の判定
を提供する。
【００１７】
各々の試料は３つの二重NASBA反応を受け、それ故６つの結果が各試料について報告される。汚染を監視するために毎回陰性対照を含める。試薬の性能を監視するために全てのＨＰＶ型に関する陽性対照を含める。内因性細胞制御Ｕ１Ａ ｍＲＮＡ（細胞ハウスキーピング遺伝子）は、偽陰性の可能性を排除するために試験手順全体を監視する。HPV-ProoferアッセイはＨＰＶ ＤＮＡを検出することはできない。自動化常用データ分析、解釈及び報告のためにはPreTech Analysis Software（ＰＡＳ）が使用される。
【００１８】
HPV-Prooferアッセイの有用性は少なくとも１２の臨床試験で評価されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者は、今や、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイが、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５からのＨＰＶ−ｍＲＮＡを検出するが、ＨＰＶ粒子は検出しないことを確認した。むしろ、HPV-Prooferアッセイで測定され得るようなＥ６／Ｅ７転写産物の存在は、転写調節の喪失及び複製する能力の喪失、並びに／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ前駆体の発現の指標である。Pre-Tect HPV-Prooferが感染性ウイルスであるＨＰＶ粒子を検出することは不可能である。転写調節が失われて、ウイルスが組み込まれたとき、このウイルスはウイルス粒子を生産することができないからである。HPV-Prooferを用いてＥ６／Ｅ７発現に関して陽性と検出された細胞の内部のウイルスは、それらの正常な生活環を捨て、全てのＥ６／Ｅ７転写産物からのプロモーターの転写制御の調節を喪失するか、又はスプライシング能力を失って、Ｅ６／Ｅ７転写産物を残すか又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡ前駆体の安定化形態を発現する。
【００２０】
本発明者はまた、ＨＰＶ感染細胞におけるＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現が、巨大化した細胞核の存在、異数性（典型的には細胞あたり５以上又は９個の動原体）及びまた有糸分裂として特徴付けられる細胞変化と相関することを認めた。Ｅ６／Ｅ７発現に関して陽性である細胞（例えばPreTect HPV-Proofer試験を用いて）は、どこか具合の悪いところがあり、細胞異常を示すか又は大きな成熟細胞核を有する。これらの結果も、子宮頸病変の細胞学的及び組織学的特性決定と相関する。巨大細胞核及び９以下の動原体を有する細胞がない、細胞学的及び組織学的に定義された低悪性度病変は、HPV-ProoferでＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現に関して陽性結果を与えない。
【００２１】
それ故、本発明者は、ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７転写産物の発現が、ヒトパピローマウイルスによる持続性感染の存在に関連する細胞異常の存在の分子指標として使用できると判定した。Ｅ６／Ｅ７発現の検出は、それ故、高悪性度と低悪性度の子宮頸病変を識別するために使用し得る。特に、Ｅ６／Ｅ７発現の検出は、異数細胞（aneuploidic cells）を伴わない組織学的に定義されたＣＩＮ ＩＩＩ試料と異数細胞を有する試料を識別することができる；完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関して陽性の試料は異数細胞を有すると評価される。Ｅ６／Ｅ７発現の検出はまた、後退に向かう組織学的に定義されたＣＩＮ ＩＩＩ又はＣＩＮ ＩＩ（ＨＳＩＬ症例）症例と、感染が持続する又は進行する症例とを区別することができる；完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関して陽性の試料は、治療せずに放置した場合進行する可能性が高い感染があると評価される。
【００２２】
本発明者はさらに、以下のように結論した：
（１）Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子からの発現の頻度は病変の重症度と共に上昇する。
（２）場合によりＨＰＶ型別と組み合わせて、Ｅ６／Ｅ７発現の評価によってＨＰＶ腫瘍形成活性を検出することは、高悪性度病変の強力な予測因子である。
（３）子宮頸癌の圧倒的多数（９６％）が、５つの主要発癌性ＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５）の少なくとも１種を含む。
（４）Pre-Tect HPV-Proofer（商標）でＥ６／Ｅ７発現に関して試験陽性であった患者は、HPV-Proofer結果が陽性でない患者よりも持続性感染を維持する可能性が有意に高かった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
従って第一態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスが存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、前記ヒトパピローマウイルスは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するものであり、前記方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、前記細胞又は組織における、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すヒトパピローマウイルスの存在の指標とみなす、前記方法を提供する。
【００２４】
第二態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中に巨大細胞核及び細胞異数性を特徴とする細胞変化があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、検査下にある前記細胞又は組織が前記細胞変化を示すことの指標とみなす、前記方法を提供する。
【００２５】
第三態様では、本発明は、少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が発現している被験者をスクリーニングすることを含み、当該ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現が陽性の被験者を、前記細胞又は組織においてヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があると判定する、前記方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型の１種からの完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物によって特定される、前記ＨＰＶサブタイプの１種による「持続性形質転換感染」は、細胞診又は組織診によって評価したとき、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)と同等であるとみなされる。従って、本発明の第三態様の方法は、持続性細胞異常又は持続性ＣＩＮ ＩＩＩ病変、上皮内癌又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)と同等である、ヒトパピローマウイルスによる持続性形質転換感染についてのスクリーニング法を提供する。
【００２７】
完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ＨＰＶ ｍＲＮＡの持続的存在によって定義される持続性形質転換ＨＰＶ感染は、持続性ＣＩＮ ＩＩ＋と直接相関し、それ故子宮頸部検診プログラムにおける予後マーカーとして役立つと考えられる。特に、本発明の方法は、細胞診／組織診に基づき、意味未確定の異型扁平上皮細胞(ASCUS)又は低悪性度扁平上皮内病変(LSIL)を有すると同定された女性のトリアージにおいて使用し得る。低い割合であるが、頸部上皮内癌(CIN)ＩＩＩ及び浸潤子宮頸癌(ICC)へと進行するので、そのような患者の管理は困難である。細胞診／組織診によるフォローアップ試験は、ＣＩＮ ＩＩ＋のより高い危険度を有する全ての女性を特定することはできない。ここで報告する臨床試験において、完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現の検出は高悪性度子宮頸病変に関して著明な特異性を示し、そのような転写産物の存在が、有用な予後マーカーを提供することを示した。
【００２８】
本発明の方法における陽性スクリーニング結果は、完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現の検出によって示される。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現についての陽性結果は、被験者が、Ｅ６／Ｅ７発現の調節の喪失を示す及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するウイルスを保有することを指示し、さらに、被験者が異常細胞変化を有することを指示する。
【００２９】
ここで使用する「Ｅ６／Ｅ７調節の喪失」という用語は、全てのＥ６／Ｅ７転写産物からのプロモーターの転写制御の調節の喪失、又はＥ６／Ｅ７オープンリーディングフレームにおける正常なスプライシング能力の喪失を意味する。
【００３０】
「安定化ｍＲＮＡ前駆体」という用語は、Ｅ６オープンリーディングフレーム内でいかなるスプライシング事象も受けておらず、それ故完全長タンパク質をコードし、同じＨＰＶサブタイプの天然又は野生型ヒトパピローマウイルスによって発現される完全長Ｅ６タンパク質をコードする等価の一次（スプライシングされていない）Ｅ６／Ｅ７転写産物よりも安定である（すなわちより長い半減期を示す）、一次（primary）Ｅ６／Ｅ７転写産物を言う。天然又は野生型ヒトパピローマウイルスは、ヒト宿主の持続性感染に関連するゲノム修飾を有さず、ヒトゲノム内に組み込まれていないウイルスを指す。そのような天然又は野生型ウイルスはまた、完全長ｍＲＮＡ前駆体が有意の程度まで細胞内に蓄積しないように、Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ前駆体又は完全長ｍＲＮＡ転写産物のスプライシングが転写後すぐに起こることを特徴とする。そこで、ｍＲＮＡ前駆体は翻訳が起こり得る以前にスプライシング装置によってプロセシングされるので、ｍＲＮＡ前駆体は一般に、天然又は野生型ウイルスに感染した細胞では完全長Ｅ６タンパク質を与えるように翻訳されない。しかし、持続性形質転換ＨＰＶ感染に関連する異常を有する細胞では、ｍＲＮＡ前駆体が安定化される及び／又はスプライシングされず、それ故正常細胞又は正常増殖細胞、例えば複製ＨＰＶに感染した細胞、では認められないレベルまで細胞内に蓄積することができる。
【００３１】
天然又は野生型ウイルスにおいて発現される一次Ｅ６／Ｅ７（スプライシングされていない）転写産物に関して、安定化ｍＲＮＡ前駆体は、Ｅ６タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの外側の転写産物の領域において、例えばウイルス組込みの結果としてヒトゲノムから転写されたｍＲＮＡ配列の付加によって又はＨＰＶ配列の欠失によって、修飾され得る。それ故安定化ｍＲＮＡ前駆体は、天然又は野生型ウイルスにおいて発現されるＥ６／Ｅ７一次（スプライシングされていない）転写産物とは異なる配列及び構造であり得るが、依然として完全長Ｅ６タンパク質をコードする。
【００３２】
「異常細胞変化」という用語は、多倍体ＤＮＡ特性を有する病変及び高い平均ＤＮＡ指数値、ＤＮＡ異数性の高いパーセンテージ及び2.5c Exceeding Ratesを有するＣＩＮ病変を含む、高悪性度ＣＩＮ（形質転換細胞の腫瘍性増殖と定義される）、ＣＩＮ（頸部上皮内癌）ＩＩＩ、又は高悪性度扁平上皮内病変(HSIL)に等しいか又はそれ以上の重症度の疾患の特徴である細胞変化を含む、低悪性度子宮頸病変又は低悪性度扁平上皮内病変よりも重症の疾患の特徴である細胞変化を包含する(Hanselaar et al., 1992, Anal Cell Pathol., 4: 315-324; Rihet et al., 1996, J. Clin Pathol 49: 892-896; and McDermott et al., 1997, Br. J. Obstet Gynaecol. 104: 623-625)。
【００３３】
子宮頸部形成異常とも呼ばれる、頸部上皮内癌（「ＣＩＮ」と略称する）は、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる子宮頸部の状態である。ＣＩＮはその重症度によってＩ、ＩＩ又はＩＩＩと分類される。前癌性異常とみなされるが、実際の癌ではない。最も軽度の形態、ＣＩＮ Ｉは、通常は自然に消失するが、まれに癌へと進行することがある。より重症の形態であるＣＩＮ ＩＩ及びＣＩＮ ＩＩＩは、ほとんどの場合同じ状態にとどまるか又は時間と共に悪化する。それらは癌になり得るが、適切に治療すればほとんどの場合癌になることはない。
【００３４】
ＨＰＶは、子宮頸癌の発症を導き得る、子宮頸部の細胞変化の発現における病原因子として特定された。これらの細胞変化は、ＨＰＶウイルスゲノムからのＥ６／Ｅ７タンパク質の構成的又は持続的発現に関連する。それ故、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現が検出できる被験者、特に経時的に評価したとき持続的Ｅ６／Ｅ７発現を示す被験者は、既に子宮頸部の細胞変化を発現していると結論することができる。これらの変化は、子宮頸部のごくわずかな細胞においてのみ起こり得るものであり、従来の細胞診では検出不能であると考えられる。それにもかかわらず、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出のための高感度で、特異的且つ正確な方法の使用により、従来の細胞学的スクリーニングを用いて可能であるよりもはるかに早期の段階で、既に子宮頸部の細胞変化を示す被験者を特定することが可能である。これは、子宮頸癌の発症を予防することを目指す治療による早期の介入措置を可能にする。
【００３５】
ヒトゲノムへのＨＰＶ組込みの結果として又は改変されたエピソームＨＰＶゲノムにおける「修飾」の結果として、ウイルスのＥ６／Ｅ７癌遺伝子転写の正常な制御が失われる(Durst et al. , 1985, J Gen Virol, 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater and Pater, 1985 Virology 145: 313-318; Schwarz et al., 1985, Nature 314: 111-114; Park et al., 1997, ibid)。これに対し、前悪性病変及びＨＰＶに感染した正常上皮においては、パピローマウイルスは主として「非修飾」エピソーム形態であり、それ故癌遺伝子（Ｅ６／Ｅ７）転写は存在しないか又は効率的に下方調節され得る (Johnson et al., 1990, J Gen Virol, 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli et al., 1993, J Med Virol, 40: 261-265)。ヒトゲノムへのヒトパピローマウイルス１６型ＤＮＡの組込みは、より不安定な細胞活性／ゲノム、及びＥ６及びＥ７ ｍＲＮＡの安定性上昇を導くことが認められる (Jeon and Lambert, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 1654-1658)。そこで、子宮頸癌において典型的に認められるが、ごくまれにＣＩＮ病変でも存在するＨＰＶ組込みは(Carmody et al., 1996, Mol Cell Probes, 10: 107-116)、子宮頸癌発生における重要な事象であると思われる。
【００３６】
臨床状況では、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現のスクリーニングだけに基づく方法の性能は、確信を持ってＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現についての陰性結果を評価する能力に決定的に依存する。これもやはり、最大の感受性を備え、さらに最小の偽陰性結果を生じる検出手法を必要とする。好ましい実施形態では、これは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在又は不在をスクリーニングするための高感度増幅とリアルタイム検出手法を用いることによって達成される。最も好ましい手法は、Leone et al., Nucleic Acids Research., 1998, Vol 26, 2150-2155に記載された、分子指標（molecular beacons）プローブを用いるリアルタイムNASBA増幅である。この手法の感受性の故に、偽陰性結果の発生は最小限に抑えられ、より大きな確信を持って「陰性Ｅ６／Ｅ７発現」の結果を評価することができる。臨床スクリーニングプログラムに関連してアッセイを使用しようとする場合、これは極めて重要である。
【００３７】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型のいずれか１種又はそれ以上（より好ましくは全部）からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の発現に関してアッセイすることが好ましい。１つの実施形態では、上記アッセイはこれらのＨＰＶ型のみ検出し得る。ノルウェー人の試験母集団において子宮頸癌標本の９６％以上でＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型からのＤＮＡが検出された。他の試験は、Ｅ６及びＥ７の発現は悪性状態への転換及び維持のために必要であると考えられるので、Ｅ６及びＥ７が子宮頸癌においてほとんど不変的に保持されることを示した(Choo et al., 1987, J Med Virol 21: 101-107; Durst et al., 1995, Cancer Genet Cytogenet, 85: 105-112)。非損傷ゲノム又はＬ１遺伝子配列の検出に基づくＨＰＶ検出系と異なり、Ｅ６／Ｅ７領域から発現されるＨＰＶ ｍＲＮＡの検出は、子宮頸癌を発症する危険度に直接関係する患者の９０％以上を検出し得る。
【００３８】
臨床では、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出に基づく方法は、ポストスクリーニング又は優先順位決定において、すなわちＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １又はコンジロームの診断歴を有する個人のさらなる分析において使用し得る。前記方法は、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １又はコンジロームの過去の診断歴を有する個人の群から、子宮頸癌を発症する危険度の高い個人を選択するために使用し得る。ＡＳＣＵＳ、コンジローム及びＣＩＮ Ｉは、異なる細胞学者及び異なる細胞学科の間での非常に低い再現性の故に、大なり小なり同じ診断と定義し得る。Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192.1993)は、ＣＩＮ Ｉ症例の約１％だけが子宮頸癌に進行し得ることを認めた。それ故、子宮頸癌を発症する実質的な危険性がある、ＡＳＣＵＳ、コンジローム又はＣＩＮ Ｉを有する個人のサブセットを特定する効率的な方法が強く求められている。Karlsen et al., 1996 による子宮頸癌症例試験の８７％においてＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型のうちの１種が検出された。ＨＰＶ４５型を含めると、子宮頸癌標本のほぼ９０％がこれら５つのＨＰＶ型に関連することが認められる。それ故、Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192.1993) によって提供されたデータから算定すると、見逃されるＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ Ｉ又はコンジロームを有する症例の９９．９％以上が、本発明者らのHPV-Prooferキットによって検出される。
【００３９】
本発明の方法の高い感受性と特異性は、子宮頸癌を発症する危険度が高い又は非常に高い女性の検出のための一次スクリーニング、反射試験キット又は常用診断において有用であり得ることを意味する。
【００４０】
本発明の方法では、ｍＲＮＡの「陽性発現」は、バックグラウンドを上回る発現を意味すると解釈される。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現のレベルの正確な定量的測定の絶対的必要性は存在しない。
【００４１】
ある実施形態では、本発明の方法は、ｍＲＮＡ発現のレベルの定量的測定を含み得る。好ましい実施形態では、「陽性発現」と「陰性発現」の明らかな識別を与えるために、「陽性発現」の判定は関連ｍＲＮＡの５０コピー以上（試料１ｍＬあたり又は試料の総容量あたり）の存在を必要とし、一方「陰性発現」の判定は関連ｍＲＮＡの１コピー以下（試料１ｍＬあたり、又は試料の総容量あたり）の存在を必要とし得る。
【００４２】
本発明の方法は、好ましくは、癌関連ＨＰＶ型、より好ましくは「高危険度」癌関連ＨＰＶ型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを特異的に検出することができる手法を用いてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡをスクリーニングすることを含む。前記最も好ましい実施形態では、前記方法は、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくは４５型からＥ６ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡをスクリーニングすることを含む。最も好ましくは、この方法は、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３型、及び好ましくは４５型の少なくとも１種、最も好ましくは５種の型全部からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現を特異的に検出する。しかし、１６、１８、３１、３３及び４５以外の他の型から、例えば３５、３９、４５、５２、５６、５８、５９、６６及び６８からのＥ６／Ｅ７の発現に関して陽性の女性は、なお細胞異常を示し得る。そこで、本発明の方法は、最も好ましくはＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関するスクリーニングに加えて、これらのＨＰＶ型の１又はそれ以上からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの発現に関してスクリーニングすることを含み得る。ある種のＨＰＶ型は、著明な地理的／個体群（population）分布を示す。それ故、例えばＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についてのスクリーニングに加えて、試験下にある個体群／地理的領域において一般的であることが知られるＨＰＶ型に特異的なプライマーを含めることが適切であると考えられる。
【００４３】
本発明の方法は、完全長Ｅ６タンパク質をコードするＨＰＶ型の一部又は全部の完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出に基づくものである。これらの実施形態では、完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの存在を陽性スクリーニング結果とみなす。
【００４４】
「完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物」という用語は、天然に生じるスプライス変異体を除外するが、機能性完全長Ｅ６及びＥ７タンパク質をコードする２シストロン性転写産物を包含する。これまでに４つのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ種、すなわちスプライシングされていないＥ６転写産物及びＥ６*Ｉ、Ｅ６*ＩＩ及びＥ６*ＩＩＩと表わされる３つのスプライシングされた転写産物が、ＨＰＶ１６に感染した細胞において記述されている(Smotkin D, et al. , J Virol. 1989 Mar 63 (3): 1441-7; Smotkin D, Wettstein FO. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul 83 (13): 4680-4; Doorbar J. et al., Virology. 1990 Sep 178(1) : 254-62; Cornelissen MT, et al. J Gen Virol. 1990 May 71 (Pt 5): 1243-6; Johnson MA, et al., J Gen Virol. 1990 Jul 71 (Pt 7): 1473-9; Schneider-Maunoury S, et al., J Virol. 1987 Oct 61 (10): 3295-8; Sherman L, et al. Int J Cancer. 1992 Feb 50 (3): 356-64)。４つの転写産物全てが、Ｅ６ ＯＲＦの２番目のＡＴＧのすぐ上流に位置する単一プロモーター（ｐ９７）から転写される。ＨＰＶ１６の場合は、「完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物」という用語は、Ｅ６ ＯＲＦ内のヌクレオチド９７−ヌクレオチド８８０まで（ヌクレオチド９７及び８８０を含む）の領域の全部又は実質的に全部を含む転写産物を指す。ヌクレオチド位置は標準ＨＰＶ命名法に従って番号付けている（Human Papillomavirus Compendium OnLine参照、インターネットを通して又はHV Database,Mail Stop K710,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM 87545,USAより書類形態で入手可能）。
【００４５】
ＨＰＶ１６以外のＨＰＶ型に関しては、「完全長」Ｅ６／Ｅ７転写産物は、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７転写産物の上述した領域に相同な配列を含む転写産物を含み、Ｅ６スプライス変異体を除外すると解釈される。ＨＰＶ型の様々な配列アラインメントがHuman Papillomavirus Compendium OnLineによって公的に入手可能である。
【００４６】
完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の特異的検出は、例えば完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物にのみ存在し、スプライス変異体には存在しない領域に特異的なプライマー又はプローブを使用して、達成し得る。
【００４７】
Ｅ６*Ｉ転写産物は、ヌクレオチド２２６と４０９との間にコード配列の喪失を示し（ＨＰＶ１６型において）、Ｅ６*ＩＩ転写産物は、ヌクレオチド２２６と５２６との間にコード配列の喪失を示す（ＨＰＶ１６型において）。それ故、ＨＰＶ１６型のヌクレオチド２２６と４０９との間に位置する領域又はＨＰＶ１８、３１、３３又は４５型の１種からの相同領域から少なくとも１個のプライマー又はプローブを使用することが好ましい。完全長転写産物に対する特異性は、好ましくはこの領域内に位置する配列に特異的なプローブと共に、１個のプライマーがこの領域内に位置する配列に特異的であり、他方のプライマーがこの領域の外側に位置する配列に特異的であるプライマー対、又は両方のプライマーがこの領域内の配列に特異的であるプライマー対を使用することによって達成できる。他の実施形態では、完全長Ｅ６をコードするｍＲＮＡに対する特異性を付与するために、この領域内の配列に特異的なプローブと組み合わせて、両方のプライマーがこの領域の外側の配列に特異的であるプライマー対を使用することも可能であり得る。
【００４８】
異なるＨＰＶ型は、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の異なるパターンを示す。完全長Ｅ６／Ｅ７転写産物の検出のためのプローブ又はプライマーの設計を助けるために使用し得る、ＨＰＶ１６及び３１型を含む、様々なＨＰＶ型についての転写産物地図は、Human Papillomavirus Compendium（上記の通り）によって公的に入手可能である。
【００４９】
アッセイ方法
本発明の方法は、少なくとも１つの細胞又は組織において、より詳細には少なくとも１つの細胞又は組織からのＲＮＡを含む試料において、Ｅ６／Ｅ７転写産物の存在をスクリーニングすることを含む。前記の少なくとも１つの細胞又は組織は、ヒトパピローマウイルスによる感染に対して感受性である型の少なくとも１種の頸部細胞、すなわち頸部上皮細胞を含み得る。
【００５０】
開示されるスクリーニング方法は、試験する被験者から採取した頸部細胞を含む臨床試料又は生検から単離された核酸の標本に関して実施し得る。核酸のソースとして使用し得る適切な試料は、子宮頸部スワブ、子宮頸部生検、子宮頸部切屑、刷毛及び綿球等を使用して採取した試料、皮膚生検／いぼ、またパラフィン包埋組織、及びホルマリン又はメタノール固定細胞を含む（しかし、排他的ではない）。
【００５１】
開示する方法を用いてスクリーニングする核酸の標本はｍＲＮＡを含まねばならないが、精製ポリＡ+ｍＲＮＡの標本である必要はなく、全ＲＮＡの標本又はＲＮＡとゲノムＤＮＡの両方を含む全核酸の粗標本、あるいはさらに粗細胞溶解産物も、NASBA反応のための出発物質として適する。基本的にｍＲＮＡを含む核酸の標本の単離のための当技術分野で公知のいかなる手法も、被験試料から核酸を単離するために使用し得る。好ましい手法は、米国特許出願第５，２３４，８０９号及び欧州特許公開公報第ＥＰ−Ｂ−０３８９,０６３号に述べられている「Ｂｏｏｍ」単離法である。これはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む核酸標本を単離するために使用でき、カオトロピック試薬、グアニジンチオシアネート(GuSCN)の存在下での二酸化ケイ素粒子の核酸結合特性に基づく。
【００５２】
本発明の方法は、ＨＰＶゲノムの活発な転写の評価に基づく。この方法は、ｍＲＮＡ発現を検出するために使用される厳密な手法に関するものにに限定されない。特定ｍＲＮＡ配列の検出のための多くの手法が当技術分野において公知であり、本発明に従って使用し得る。例えば特定ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション、増幅又は配列決定手法によって検出し得る。
【００５３】
増幅手法によって、最も好ましくは等温増幅、例えばNASBA、転写媒介性増幅、ＲＮＡのシグナル媒介性増幅テクノロジー、等温溶液相増幅等によってｍＲＮＡ発現を検出することが最も好ましい。これらの方法は全て当技術分野において周知である。より好ましくは、増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせた等温増幅によってｍＲＮＡ発現を検出する。最も好ましい組合せは、Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155によって述べられているような、分子指標テクノロジーを用いた増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせた、NASBAによる増幅である。
【００５４】
NASBA手法を用いた被験試料中のＨＰＶの検出のための方法は、一般に以下の工程：
（ａ）適切なプライマー対、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を加水分解するリボヌクレアーゼ、前記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、及びリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む反応媒質を作製すること；
（ｂ）反応媒質を、NASBA増幅反応を許容する反応条件下で、ＨＰＶを含むことが予測される被験試料から単離した核酸の標本と共にインキュベートすること；及び
（ｃ）NASBA増幅反応の何らかのＨＰＶ特異的産物を検出すること及び／又は定量的に測定すること
を含む。
【００５５】
NASBA反応の特異的産物（すなわち標的ＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンスコピー）の検出は、多くの異なる方法で実施し得る。１つのアプローチでは、NASBA産物を特異的にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用してNASBA産物を検出し得る。ハイブリダイゼーションプローブは、検出標識、例えば蛍光、発光、放射性又は化学発光化合物又は酵素標識又は当業者に公知の他の何らかの種類の標識に結合し得る。標識の厳密な性質は決定的に重要ではないが、それ自体であるいは１又はそれ以上の付加的な物質（例えば酵素についての基質）と共に、外部からの手段によって検出可能なシグナルを生成し得ることを要する。
【００５６】
好ましい反応方法は、反応の経過と共にNASBA反応の産物の形成を持続的に観測することができる、いわゆる「リアルタイムNASBA」である。好ましい実施形態では、これは、当技術分野で公知であり、ここで説明するように、NASBA産物にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的配列を含む「分子指標」プローブ、ステム−二本鎖形成オリゴヌクレオチド配列及び一対の蛍光／消光成分を用いて達成し得る。増幅の前に分子指標プローブを反応混合物に添加すれば、NASBA産物の形成をリアルタイムで観測することが可能となり得る（Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155）。リアルタイムNASBA検出を実施するための試薬キット及び装置は市販されている（例えばNucliSens（商標） EasyQshisutemu、Organon Teknikaより）。
【００５７】
さらなるアプローチでは、分子指標テクノロジーを、別々のハイブリダイゼーションプローブを必要とせずにNASBA反応のリアルタイム観測を可能にするプライマー２オリゴヌクレオチドに組み込み得る。
【００５８】
さらなるアプローチでは、プライマー２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド配列にハイブリダイズする一般的標識検出プローブを用いてNASBA反応の産物を観測し得る。これはOrganon Teknikaによって供給される「NucliSens（商標）」検出システムに相当する。このシステムでは、固体支持体、例えば磁気マイクロビーズに結合した、ここで述べるようなプローブオリゴヌクレオチドを含むＨＰＶ特異的捕獲プローブを使用することにより、標的ＨＰＶ ｍＲＮＡに由来するNASBA産物に対する特異性を付与し得る。最も好ましくは、一般的標識検出プローブは、Organon Teknikaによって供給されるＥＣＬ（商標）検出プローブである。NASBAアンプリコンをＨＰＶ特異的捕獲プローブ及び一般的ＥＣＬプローブにハイブリダイズさせる（プライマー２上の相補的配列によって）。ハイブリダイゼーション後、ビーズ／アンプリコン／ＥＣＬプローブ複合体を自動ＥＣＬリーダー（例えばOrganon Teknikaによって供給されるNucliSens（商標）リーダー）の磁気電極で捕獲し得る。その後、電圧パルスがＥＣＬ（商標）反応を開始させる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも主要な癌関連ＨＰＶ型である１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの増幅に基づくものである。これを達成することができるいくつかの異なる方法がある。
【００６０】
１つの実施形態では、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型の各々に特異的な別々のプライマー対を、各々のＨＰＶ型からの転写産物を個別に増幅するために使用し得る。あるいは、増幅反応の多重化を可能にするために単一容器内で２又はそれ以上のプライマー対の混合物を使用し得る。
【００６１】
さらなる実施形態では、ＨＰＶ１６、１８、３１及び３３型、及び好ましくはＨＰＶ４５型からのＥ６／Ｅ７遺伝子の領域を増幅することができる単一プライマー対を使用してもよく、これは、単一増幅反応において４つ（好ましくは５つ）の型全部の増幅を可能にする。これは、例えば縮重プライマーの対を使用して又はＨＰＶ型全体にわたって高度に保存されているＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの領域を選択することによって達成できる。
【００６２】
Ｅ６／Ｅ７プライマー対はＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡのいずれの領域に対応してもよく、Ｅ６オープンリーディングフレーム及び／又はＥ７オープンリーディングフレームの全部又は一部の増幅を可能にし得る。好ましくは、完全長Ｅ６タンパク質をコードする完全長転写産物の増幅を可能にする。
【００６３】
さらなるアプローチでは、縮重オリゴヌクレオチドプライマー又は、好ましくはＨＰＶ遺伝子型間での配列変異の部位に対応する、小さな配列変異を示すポリヌクレオチドの複合混合物の使用によって、多数のＨＰＶ型についての特異性を実現し得る。そのような縮重プライマー又は混合物の使用の背後にある理論的根拠は、混合物は各々のＨＰＶ型を検出することができる少なくとも１種のプライマー対を含み得るということである。
【００６４】
さらなるアプローチでは、好ましくはＨＰＶ遺伝子型間での配列変異の部位で、１又はそれ以上のイノシンヌクレオチドをプライマーに組み込むことによって多数のＨＰＶ型に対する特異性を達成し得る。
【００６５】
様々なＨＰＶ型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出のために使用し得る適切なプライマー及びプローブのリストは、ＷＯ０３／０５７９１４号及びＷＯ０３／０５７９２７号に見出し得る。ＷＯ０３／０５７９１４号及びＷＯ０３／０５７９２７号の内容全体が参照してここに組み込まれる。
【００６６】
本発明の方法は、好ましくはPre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ及びキットを用いて実施される。しかし、本発明がこの特定アッセイの使用に限定されないことは了解されるべきである。
【００６７】
本発明の方法は、子宮頸、子宮体及び／又は子宮頸管の全体又は部分からの実際に組織診陰性である代表的試料を陰性と評価する。これは、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）をこれまでに開発された最も有望な一次スクリーニング法の１つにする、卓越した特異性を提供する。
【００６８】
子宮頸癌を発症する危険度の高い女性の診断のためにPre-Tect HPV-Proofer（商標）だけを使用することの特異性は、年齢及び仕事とは無関係であり、市販のＤＮＡに基づくアッセイ単独よりも３倍以上高い特異性であることが証明された。
【００６９】
Ｅ６／Ｅ７転写産物の検出は、反復試験を実施する必要なしに高危険度感染が持続し得るかどうかを特定する潜在的可能性を有する。Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子からの発現の頻度は病変の重症度と共に上昇する。
【００７０】
本発明の方法は、何らかの適切な方法によるＨＰＶ遺伝子型決定と組み合わせて実施し得る。「ＨＰＶ遺伝子型決定」という用語は、所与の個体中に存在するＨＰＶサブタイプの特定を可能にする手法である。ＨＰＶタイピングと組み合わせたＥ６／Ｅ７発現の検出によるＨＰＶ腫瘍形成作用の評価は、高悪性度病変の強力な予測因子となる見込みがある。
【００７１】
本発明は、以下の実験実施例を参照してさらに理解される。
【００７２】
Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ
Pre-Tect HPV-Proofer（商標）キット及びアッセイの使用に関係する全ての実験実施例に関し、当該アッセイは、供給される指示書に従って市販のキットを用いて実施した。ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡのリアルタイム検出のためのアッセイの操作に関するさらなる情報は、その内容全体が参照してここに組み込まれる、ＷＯ０３／０５７９１４号に認められる。
【００７３】
以下の実験章は、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイ及びキットを使用して得られた臨床データを要約するものである。
【実施例１】
【００７４】
外来患者母集団から収集した４１３６の子宮頸部試料における発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からのＥ６及びＥ７ ｍＲＮＡ発現
この試験の目的は、組織診によって確認された細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３試料においてＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ及びＤＮＡの存在を特定することであった。
【００７５】
材料及び方法：
試料は、３０歳以上の女性（n=4136）を含む、十分にスクリーニングされた外来患者母集団から収集した。高危険度ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型の各々からのＥ６／Ｅ７転写産物を、リアルタイム多重NASBAに基づき、Pre-Tect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua、Norway）によって検出した。ＨＰＶ ＤＮＡの存在をＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって検討し、その後ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料をＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についての型特異的ＰＣＲに供した。細胞学的ＨＧＳＩＬ診断を有する女性を生検及び組織診に差し向けた。
【００７６】
組織診で確認された症例をノルウェー癌登録（Norwegian Cancer Registry）に登録した。ノルウェーでは、細胞学的ＨＧＳＩＬは、ＨＧＳＩＬ／ＡＧＵＳ、ＨＧＳＩＬ／ＡＳＣ−Ｈ、ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ２及びＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３に分類することができる。
【００７７】
結果：
２５の細胞学的ＨＧＳＩＬ症例のうちで、１４例がＣＩＮ２＋として組織診で確認された。組織学的ＣＩＮ２＋の２症例は、細胞診によってＨＧＳＩＬ／ＡＳＣ−Ｈ及びＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ２と診断された。Pre-Tect HPV-Prooferは、細胞学的ＨＧＳＩＬ症例の５２％（１３／２５）、組織学的ＣＩＮ２＋症例の８６％（１２／１４）、及び組織診によって確認されなかった細胞学的ＨＧＳＩＬ症例の９％（１／１１）を検出した。Ｇｐ５＋／６＋ ＰＣＲに関する数は、それぞれ６４％（１６／２５）、９３％（１３／１４）、及び２７％（３／１１）である。コンセンサスＰＣＲによって陽性であるが、Pre-Tect HPV-Prooferでは陰性の、組織学的ＣＩＮ２＋の１試料は、ＨＰＶ３５と特定された。ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３の有病率は０．２９％（１２／４１３６）であり、組織学的ＣＩＮ２＋の有病率は５６％（１４／２５）であった。Pre-Tect HPV-Proofer及びコンセンサスＰＣＲについての感受性、特異性、及び正及び負の予測価を表１に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
考察及び結論：
細胞学ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３症例と組織学的ＣＩＮ２＋症例の間で良好な一致があったが、細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３の１例だけが組織診によってＣＩＮ２＋と確認されなかった。組織診で確認されたＣＩＮ２＋症例では、ＨＰＶ ＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方に関して検出程度は高く、ほぼ同じであった。組織診によって確認されなかった細胞学的ＨＧＳＩＬ症例では、PreTect HPV-Prooferについての検出程度はコンセンサスＰＣＲに関するよりも低かった。合わせて考慮すると、細胞学的ＨＧＳＩＬ／ＣＩＮ３及びPreTect HPV-Prooferは全ての組織学的ＣＩＮ２＋を検出した。
【００８０】
結論として、５つの最も頻繁に認められる発癌性ＨＰＶ型、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７転写産物は、ほとんど全ての組織学的ＣＩＮ２＋症例において存在すると思われる。PreTect HPV-Prooferについての高い特異性及び正の予測価はＨＰＶ診断における利点であり、それ故ｍＲＮＡ検出は細胞診及び組織診の適切な補助である。
【実施例２】
【００８１】
スウェーデン婦人科学スクリーニングプログラムにおける低悪性度病変のフォローアップとしてのＨＰＶ検出
スウェーデンでは、年間約40,000の細胞診症例がフォローアップを必要とする異常を示す。大部分の症例は自然に後退するが、一部は治療しなければ進行する。また、フォローアップ方法における細胞診の低い感受性という問題も存在する。前癌性病変の検出において、細胞学的ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ Ｉの検出後にＨＰＶ検査を実施したとき、特異性と感受性の両方が劇的に改善することが認められた。
【００８２】
主たる目的は、スウェーデンスクリーニングプログラムでの細胞診及び組織診に関してＨＰＶ ＲＮＡ及びＤＮＡ試験のそれぞれの役割を評価することであった。もう１つの重要な目的は、ＣＩＮ Ｉ又はＡＳＣＵＳを有するが、ＨＰＶ ＲＮＡ又はＤＮＡ試験のいずれかで陰性の女性においてＣＩＮ ＩＩ＋を見落とす危険性を評価することであった。
【００８３】
試験材料は、スウェーデンの中心部における通常のスクリーニングプログラム後の１５０００人の女性からである。細胞診でＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ Ｉに関して陽性の全ての女性をその後の試験のために選択した。細胞診又は組織診材料全てを、経験を積んだ病理学者がブラインド法で再評価した。ＡＳＣＵＳ及びＣＩＮ Ｉに関して陽性の試料（N=240）をPreTect HPV-Prooferで評価し（N=240）、無作為抽出した試料を、４ヵ月後にHybrid Capture II（ＨＣＩＩ）と細胞診（N=127）及び細胞診単独（N=112）によって試験した。それらを、７ヵ月後にＬＥＥＰ生検からの組織診（N=126）と、及び１２ヵ月後にPreTect HPV-Proofer（N=240）、ＨＣＩＩ及び細胞診と比較した（表２）。ＡＳＣＵＳ及びＣＩＮ Ｉを有する全ての試料をｍＲＮＡに関して試験した。コルポスコピーによるＬＥＥＰ生検（N=126）を細胞診断異常及び／又は陽性ＨＰＶ ＤＮＡ試験を有する全ての女性に関してフォローアップの一部として採取した（４ヵ月後）。ＨＰＶ ＤＮＡはＨＣＩＩアッセイ（Digene，Gatesburg，MD，USA）を用いて検出した。ＨＰＶ １６、１８、３１、３３及び４５からのＥ６／Ｅ７転写産物の特定と個別分類は、PreTect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua，Norway）を用いて実施した。
【００８４】
結果
ＨＰＶ検査の結果を、４ヶ月及び１２ヵ月後の細胞診、及び細胞診陽性診断から７ヵ月後の組織学的診断と比較した。ＨＰＶ型の頻度と分布を表３に示す。細胞診と組織診の一致は症例の１９％で認められた。細胞診及びＤＮＡ試験は、ＲＮＡ試験よりもかなり頻繁に、組織診による良性及び低悪性度病変において陽性であった。組織診を「判断基準（golden standard）」として、ＲＮＡ試験は、ＤＮＡ試験（それぞれ３１％と５１％）よりも高い正の予測価と高い特異性（それぞれ４６％と８５．３％）を明らかにした。しかし、ＤＮＡ試験は、ＲＮＡに基づく試験（８１％）よりも高い感受性（９１％）を示した。ＬＥＥＰ円錐切除術で治療された症例の１９％は、治療の５ヵ月後に細胞学的異常を示し、０．５％はＣＩＮ ＩＩ＋であることが認められた。ＨＰＶ ＤＮＡはこれらの症例の２４％において検出され、ＨＰＶ ＲＮＡは６％で検出された（表２）。
【００８５】
【表２】
【００８６】
【表３】
【００８７】
考察及び結論
ＤＮＡに基づく方法と比較してＲＮＡに基づく方法のより高い正の予測価及びより高い特異性は、Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子の発現が悪性表現型の発現と維持のために必要であるという事実によって説明され得る。ＣＩＮ Ｉ又はＡＳＣＵＳを有するが、ＨＰＶ ＲＮＡ又はＤＮＡ試験で陰性である女性において、ＣＩＮ ＩＩ＋を見落とす危険性は極めて低く（０．２％）、細胞学的ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ ＩにおけるＨＰＶ検査の付加価値を確認する。
【実施例３】
【００８８】
３０歳以下の女性における癌遺伝子発現を伴わない高危険度ＨＰＶ感染
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、女性、特に若年齢群における一般的なウイルス感染であるが、ほとんどの感染は一過性で、無症候性である。スカンジナビア諸国では、３０歳以上の女性母集団におけるＨＰＶ罹患率は５から１５％の範囲であるが、より若年の女性でのＨＰＶ罹患率は３０〜４０％という高率であり得る。また、性交経験のある女性の７０〜８０％が、生涯のある時点で、ＨＰＶ感染を獲得する。しかし、感染の大部分は自然に消失し、小さな割合だけが持続して、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）を生じさせる。
【００８９】
この試験の目的は、３０歳以下の女性においてＥ６／Ｅ７転写産物の検出とＨＰＶ ＤＮＡの検出を比較することであった。
【００９０】
材料及び方法：
３０歳以下の女性（平均年齢２６．９歳）から合計２８２の子宮頸部試料を試験した。NucliSens Extractorを用いてＲＮＡ及びＤＮＡを抽出し、発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現をPreTect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS，Klokkarstua，Norway）によって検出した。ＨＰＶ ＤＮＡの存在をＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって検討し、その後ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料を同じ５つのＨＰＶ型に関する型特異的ＰＣＲに供した。
【００９１】
結果：
合計３２．６％（n=92）の試料がＧｐ５＋／６＋ ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡに関して陽性であり、２４．８％（n=70）が１６、１８、３１、３３及び４５型であることが認められた。同じ５つのＨＰＶ型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡは、症例の１５．２％（n=43）においてのみ認められた。
【００９２】
５つの発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型は、ＨＰＶ ＤＮＡ陽性試料の７６％（７０／９２）を占め、一方、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現はこれらの症例の６１％（４３／７０）で検出された。
【００９３】
細胞診陽性結果は８／２８２症例（２．８％）で得られ、そのうちＡＳＣＵＳは５／８例で、ＨＰＶコンジロームは３／８例で認められた。ＡＳＣＵＳ症例に関しては、４／５例においてＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲ及び型特異的ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡが検出されたのに対し、１つの試料だけがＨＰＶ ｍＲＮＡを含むことが認められた。しかしながら、ＨＰＶコンジローム症例に関しては、全ての試料（n=3）においてＧｐ５＋／６＋コンセンサスＰＣＲによって、及び２／３例において型特異的ＰＣＲによってＨＰＶ ＤＮＡが検出され、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現は、１例においてのみPreTect HPV Prooferによって検出された。
【００９４】
考察：
３０歳以下の女性におけるＨＰＶの存在は、より高齢女性に関するよりも高い。これは、他の型と比較して５つの発癌性ＨＰＶ型である１６、１８、３１、３３及び４５型の発生率にも当てはまる。Ｅ６／Ｅ７転写産物の欠如は、ウイルスのエピソーム状態、それ故転写工程の制御された調節を反映すると考えられる。これらの感染は消失する可能性がより高いと考えられる。しかしながら、ウイルスの組込みは、Ｅ２遺伝子を破壊し、それによってＥ６／Ｅ７転写の調節因子としてのその機能も破壊し得る。
【００９５】
結論：
この若年外来患者母集団において、癌遺伝子発現を伴うＨＰＶ感染は、コンセンサスＰＣＲ陽性試料の５０％以下で検出される。そこで、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型についてＥ６／Ｅ７遺伝子発現を観測することは、細胞診に加えて有用な診断試験であると考えられる。ｍＲＮＡ検出は、若年女性における進行性疾患に関してより識別力があると考えられる。
【実施例４】
【００９６】
ＨＰＶ検査のためのＤＮＡとＲＮＡに基づく方法
この試験の目的は、細胞診陰性及び陽性の女性における高危険度ＨＰＶ感染の発生率を検討するためにＨＰＶ検査のための２種の市販のアッセイの有効性を確認すること、及び細胞診及び組織診と比較してＤＮＡに基づく試験及びＲＮＡに基づく試験の結果を評価することであった。
【００９７】
材料及び方法
試験母集団は、私立診療所の外来科及び婦人科から選択した。平均年齢４０歳（範囲１９〜８５歳）の６２８名の女性がこの試験に含まれた。従来のパパニコラウスミアを最初に採取し、残りの材料をPreservCyt（商標）バイアル（Cytyc Corporation）に移した。高危険度ＨＰＶ ＤＮＡ（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型）に関する試験をHybrid Capture IIアッセイ（Digene Corporation）で実施し、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５型からのＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の個別特定を、リアルタイムNASBA手法、Pre Tect HPV-Prooferアッセイ（NorChip AS）で実施した。
【００９８】
ＨＰＶ検査が陽性であるか又は細胞診がＨＳＩＬを明らかにしたとき、生検を採取した。組織診を「判断基準（gold standard）」とみなした。
【００９９】
結果
細胞診と組織診の一致は症例の５３％で認められた。高悪性度組織診（ＣＩＮ２＋）は、良性又は低悪性度細胞診結果を有する女性の６１％で検出された。κ値は０．３１であった。２種の試験は、症例の１７％（109/628）において異なる結果となった（表４）。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
両方のＨＰＶ検査が、病変の悪性度と有意の結びつきを示した（p＜0.001）。ＤＮＡ試験は、良性及び低悪性度病変においてより頻繁に陽性であった。ＤＮＡ試験は、ＲＮＡ試験と比較してより高い感受性を明らかにしたが、特異性はより低かった（表５）。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
結論
ＲＮＡ試験は、ＤＮＡ試験よりも高い予後価値及びより高い特異性を明らかにした。
【実施例５】
【０１０４】
ＨＰＶ型特異的ＤＮＡ及びＲＮＡの持続性
ＨＰＶ感染の経過と持続性を、ＨＰＶ遺伝子型決定を線形アレイアッセイと共に使用して、ＨＰＶ陽性で、細胞学的疾患を有していない５４名の女性において分析した。
【０１０５】
子宮頸部の細胞学的異常（核異型）の発現へのＨＰＶ感染の影響を、反復ＨＰＶ遺伝子型決定及び２年後の細胞学的評価によって観測した。HPV-Prooferアッセイを用いた、公知のＨＰＶ癌遺伝子Ｅ６及びＥ７のＨＰＶ転写産物の検出も、両方の時点で実施した。
【０１０６】
材料及び方法：
ＨＰＶ持続性を評価するために設計された進行中の試験の一部として３，０００名以上の女性から２，０００名において液状細胞診（ＬＢＣ）試料を得た（ベースライン）。ＬＢＣは、従来のパパニコラウスミアにおいて実施されるように頸部標本を直接スライドガラス上に置くのではなく、細胞防腐剤溶液を含むバイアル中に頸部標本を流し入れることを含む。一時医療従事者が標本収集を実施し、ThinPrep（登録商標）手順によって扁平層スライドガラスを作製して、英国臨床細胞学会ガイドラインに従って細胞悪性度分類を実施した。ベースライン時に細胞学的に正常な結果を有するが、同時に、ヨーロッパで最も一般的に認められる高危険度型とみなされ、癌の＞９０％に関係する、以下の「高危険度」ＨＰＶ型：１６、１８、３１、３３及び４５型の少なくとも１種に関してＨＰＶ ＤＮＡ陽性であることに基づいて、５４名の女性の集団を選択した。ベースラインの２年後にフォローアップＬＢＣスミアのために女性を再来訪させ、そのときに細胞学的評価とＨＰＶ ＤＮＡ及びＲＮＡ試験を実施した。
【０１０７】
細胞検査後、ＬＢＣ試料中の残留細胞を3,500rpmで１０分間遠心分離し、核酸抽出及びＨＰＶ検出まで−７０℃で分割細胞ペレットとして保存した。QIAamp（登録商標）96 DNA Swab BioRobot（商標）キットと共に供給される試薬を使用し、BioRobot 9604（登録商標）（QIAGEN Ltd．，Crawley，UK）を用いて自動ＤＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡ抽出は、動物細胞からの単離のためのプロトコールに則り、製造者の指示に従って、RNeasyカラム（QIAGEN Ltd.）の適用によって実施した。核酸をＨＰＶ検出までに−７０℃で保存した。
【０１０８】
ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型決定は、固定化プローブを含むナイロンストリップに配置したＰＧＭＹプライマーによって生成される４５０ヌクレオチドのＰＣＲアンプリコンのハイブリダイゼーションを含む、線形アレイハイブリダイゼーションアッセイ（ＬＡ）によって実施した[Gravitt et al., 2000; Coutlee et al., 2002]。ストリップは、２種のレベルのβ-グロビン制御プローブ、１８個の高危険度ＨＰＶ（ＨＲ−ＨＰＶ）プローブ：１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５５、５６、５８、５９、６８、７３、８２、８３及び９個の低危険度ＨＰＶ（ＬＲ−ＨＰＶ）プローブ：６、１１、４０、４２、５３、５４、５７、６６、８４を含んだ。ＰＣＲ試薬、プローブストリップ及び展開試薬は、Roche Molecular Systems,Inc.（Alameda）によって供給された。
【０１０９】
β-グロビン陰性と判定された試料は分析から除外する。等温NASBA増幅によってＲＮＡ増幅を実施し、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、４５型についての完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに対する分子指標（ＭＢ）プローブを使用して型特異的検出を実施した。NASBA増幅及びＨＰＶ検出のために必要な試薬は全て、PreTect（登録商標） HPV-Prooferキット（NorChip，Klokkarstua，Norway）の一部として供給された。蓄積したｍＲＮＡ産物の蛍光検出を、NucliSens EasyQ Analyzerを用いてリアルタイムで実施し、PreTect analysisソフトウエア（PAS，NorChip）を用いて蛍光特性を分析した。
【０１１０】
結果：
ＤＮＡ遺伝子型決定によって観測したとき、２年後に合計１１／５４（２０％）の女性が核異型を発現し、３１／５４及び２３／５４の女性がそれぞれ一過性及び持続性感染を示した。型特異的持続性ＨＰＶ感染を維持していた女性は、一過性感染を示した女性に比べて核異型を発現する可能性が有意に高かった（P＜0.001）。ＨＰＶ ｍＲＮＡ Ｅ６-Ｅ７転写産物の存在は感受性がより低かったが、フォローアップ時の疾患の検出のためにより特異的であった。さらに、ベースライン時にＤＮＡ陽性であり、同時にｍＲＮＡ転写産物に関しても陽性であった女性は、ベースライン時にＤＮＡだけが検出された女性と比較して持続性感染を保有する可能性が有意に高かった（P＞0.013）。この試験は、頸部異常を発現する危険度がより高い女性を特定するために持続型特定ＨＰＶ感染を検出することの重要性を強調する。完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７転写産物の検出は、反復試験を行わずに検出を１時点だけで実施したときでも、いずれの高危険度ＨＰＶ感染が持続し得るかを特定する潜在的可能性を有する。Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出は、いずれの感染が持続する可能性がより高いかを特定した。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【実施例６】
【０１１３】
以下の表は、アフリカ人の外来患者個体群からの試料における、PreTect HPV-Prooferによる完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の検出対コンセンサス及び型特異的ＰＣＲによるＨＰＶ ＤＮＡの検出の概要を示す。組織診（＋）と判定された試料を、組織学に基づくＣＩＮ ＩＩ＋と評価した。
【０１１４】
【表Ａ】
【０１１５】
この試験の結果は、組織診に基づきＣＩＮ ＩＩ＋と判定された細胞異常を示す試料に関して、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型（例えば、PRETECT HPV-proofer）のいずれかからの完全長Ｅ６タンパク質をコードするＥ６／Ｅ７転写産物の検出に基づくアッセイの特異性を例証する。ＲＮＡアッセイは、組織診と同様の特異性であるが、より高い感受性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスが存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、前記ヒトパピローマウイルスは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するものであり、前記方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、前記細胞又は組織における、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すヒトパピローマウイルスの存在の指標とみなす、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１つの細胞又は組織中に巨大細胞核及び細胞異数性を特徴とする細胞変化があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、検査下にある前記細胞又は組織に前記細胞変化があることの指標とみなす、前記方法。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が発現している被験者をスクリーニングすることを含み、当該ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現が陽性の被験者を、前記細胞又は組織においてヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があると判定する、前記方法。
【請求項４】
少なくとも１種の癌関連ＨＰＶ型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いて前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３型、及び好ましくは４５型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いて前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型の、いずれか１種、又は２種若しくはそれ以上のいずれかの組合せから、Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現を検出することを含み、前記試料中の検査したＨＰＶ型のいずれか１種からの前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を陽性結果とみなす、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、前記ｍＲＮＡの領域を増幅するための増幅反応を用いて、前記増幅反応産物のリアルタイム検出とともに実施する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、リアルタイムNASBAを用いて実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイキットを用いて実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト被験者は、好ましくは検査下の前記細胞又は組織において、ヒトパピローマウイルスＤＮＡの感染が既知の被験者である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト被験者が、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １病変又はコンジロームの診断歴を有する被験者である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞学検査による頸部異常の診断歴を有さない個人の一次スクリーニングのために使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスが存在するヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、前記ヒトパピローマウイルスは、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体を発現するものであり、前記方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、前記細胞又は組織における、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ発現の調節の喪失と複製の喪失とを示す、及び／又は完全長Ｅ６タンパク質をコードする安定化ｍＲＮＡ前駆体の発現を示すヒトパピローマウイルスの存在の指標とみなす、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１つの細胞又は組織中に巨大細胞核及び細胞異数性を特徴とする細胞変化があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において、完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含み、前記試料中の当該Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡ転写産物の存在を、検査下にある前記細胞又は組織に前記細胞変化があることの指標とみなす、前記方法。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞又は組織中にヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があるヒト被験者のインビトロスクリーニング方法であって、当該方法は、前記細胞又は組織由来のｍＲＮＡを含む被験試料において完全長Ｅ６タンパク質をコードするヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が発現している被験者をスクリーニングすることを含み、当該ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現が陽性の被験者を、前記細胞又は組織においてヒトパピローマウイルスの持続性形質転換感染があると判定する、前記方法。
【請求項４】
少なくとも１種の癌関連ＨＰＶ型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いて前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３型、及び好ましくは４５型からＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを検出することができる手法を用いて前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３又は４５型の、いずれか１種、又は２種若しくはそれ以上のいずれかの組合せから、Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現を検出することを含み、前記試料中の検査したＨＰＶ型のいずれか１種からの前記ヒトパピローマウイルスのＥ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の存在を陽性結果とみなす、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、前記ｍＲＮＡの領域を増幅するための増幅反応を用いて、前記増幅反応産物のリアルタイム検出とともに実施する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、リアルタイムNASBAを用いて実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現の検出は、Pre-Tect HPV-Proofer（商標）アッセイキットを用いて実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト被験者は、好ましくは検査下の前記細胞又は組織において、ヒトパピローマウイルスＤＮＡの感染が既知の被験者である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト被験者が、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １病変又はコンジロームの診断歴を有する被験者である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞学検査による頸部異常の診断歴を有さない個人の一次スクリーニングのために使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２４４２１（Ｐ２００７−５２４４２１Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００３０２（Ｐ２００７−５００３０２）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００７７４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１２９
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０３２０４５６５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００７７４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１２９
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０３２０４５６５）
【Ｆターム（参考）】
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