ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体、その調製方法および使用
本発明は、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体およびその調製方法を提供する。ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体は、原型であるマウス由来抗体の親和性および特異性を保持している。抗体は、ナノ磁気物質とコンジュゲートして、骨髄造血幹細胞を選別するための免疫磁気ビーズを調製することができる。この抗体を用いると、ＨＡＭＡの出現率が効果的に減少し、造血幹細胞の臨床的移植の安全性が改善される可能性があり、この抗体は一部の悪性血液病および固体腫瘍の治療に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー、特に、抗体、その調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞／造血前駆細胞（ＨＳＣ）の移植は、現在、特定の悪性血液病および固形腫瘍に対する唯一の効果的治療方法であるとよく理解されている。しかし、グラフトに多数のＴリンパ球が含有されるので、グラフティングした後に急性の重篤な移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が起こり、これは、グラフティングされる異種遺伝子の造血幹細胞が長く生存できるか否かに影響する主要な原因の１つである。造血幹細胞／造血前駆細胞の移植に関する主な問題は、グラフト中の不純物細胞による干渉を除くための多量の精製造血幹細胞をいかに得るかである。それゆえ、グラフト中の特定の細胞を一掃または濃縮することは、現在のグラフティング分野に関係する問題である。ＨＳＣには明確な形態学的特徴がないが、主にリンパ球様の単核芽細胞として機能するので、ＨＳＣは細胞表面上のいくつかのタンパク質によってのみ同定することができる。１１０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３４は、今までのところヒトＨＳＣで発現されることが認識されている抗原の最も広く古いものであり、ＨＳＣの質および量を評価するための良いマーカーである。ＣＤ３４抗体に基づく正の選択技術の開発により、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、実験動物および人間において造血機能の再構成を示し［Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ，Ｂｒｙａｎｔ ＥＭ，Ｂａｒｔｅｌｍｅｚ ＳＨ，Ｍｕｉｒｈｅａｄ ＤＴ，Ｋｎｉｔｔｅｒ ＧＨ，Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ Ｗ，Ｓｔｒｏｎｇ ＤＭ，Ｂｅｒｎｓｔｉｅｎ ＩＤ（１９９２）ＣＤ３４＋ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ，ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｓｔａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｂａｂｏｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ ８０：１６９３］［Ｓｈｐａｌｌ ＥＪ，Ｊｏｎｅｓ ＲＢ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｗ，Ｂｅａｒｍａｎ Ｓ，Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｓ，Ｈａｍｉ Ｌ，Ｐｅｔｓｃｈｅ Ｄ，Ｔａｆｆｓ Ｓ，Ｍｙｅｒｓ Ｓ，Ｐｕｒｄｙ Ｍ，Ｈｅｉｍｆｅｌｄ Ｓ，Ｈａｌｌｉｇａｎ Ｊ，Ｂｅｒｅｎｓｏｎ ＲＪ（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：２８］、それゆえ、ＣＤ３４＋はその独特の生物学的特性および機能のために、造血幹細胞グラフティングの最適な標的細胞になっている。
【０００３】
現在、細胞を分離および精製するために最も用いられている方法としては、接着法、分画遠心法、不連続密度勾配法などが挙げられる。これらの技術は多くの実際的な問題を解決しているにもかかわらず、分離および精製に関して、操作時間が長いこと、細胞の回収率が低いこと、およびコストが高いことから、細胞生物学の進展ならびに細胞バイオテクノロジー製品の開発および適用を妨げている。免疫磁気による細胞選択技術は、近年開発された新規細胞分離技術であり、操作が単純かつ容易であること、分離純度が高いこと、および細胞活性が維持されることなどの利点を有し、種々の骨髄細胞および血球、腫瘍細胞、細菌および他の微生物などの分離および検査に使用することができる。したがって、免疫磁気による細胞選択技術は、生物医学分野の研究者に支持されている。近年、免疫磁気ビーズは、徐々にサブミクロンサイズに開発されており、それによって、磁気ビーズによる細胞分離を低い磁場勾配で容易かつ迅速に行うことができ、続いて分析および適用を、細胞表面から磁気ビーズを解離させずに直接行うことができ、またビーズは分離後に細胞活性に影響を与えない。分離の原理は、磁気ナノ粒子を、その表面に抗体をコンジュゲートするためのベクターとして用い、抗体の特異的な親和性によって、磁気ナノ粒子上の抗体が細胞上の特異的な表面抗原に結合して細胞−抗体−磁気ナノ粒子複合体が形成され、印加磁場の指向制御下で、標的細胞を元の細胞混合物から直接、親和性吸着、洗浄および脱離などの操作による１ステップで単離することができるというものである。ナノ磁気細胞親和性分離は、容易かつ便利な磁気分離および高選択性親和性分離の二重の利点を有する。
【０００４】
免疫磁気ビーズが世に出ると、骨髄造血幹細胞を選別するために、ＣＤ３４モノクローナル抗体を磁気ナノ微粒子にコンジュゲートすることによって調製した免疫磁気ビーズの使用が、臨床的な造血幹細胞移植に適用されてきた。磁気分離が、細胞を選別する際に、操作が容易かつ便利である、分離が迅速かつ完璧である、細胞純度が高いなどの利点を有するという事実のおかげで、特定の悪性血液病、重篤な免疫不全ならびに腫瘍の放射線療法および化学療法に起因する造血機能の低下に対して、ＨＳＣ移植が第１の選択になっている。造血幹細胞移植の過程中に、磁気ビーズに結合したこれらの抗体は、造血幹細胞と一緒にヒトの体内に必然的に侵入する。ハイブリドーマ技術によって産生されるマウス由来モノクローナル抗体は、ヒトの体内に侵入後、ヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を引き起こす可能性がある［Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ，Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１９９３ Ｊｕｎ；１４（６）：２４３−６］。それゆえ、当業者にとって、遺伝子工学技術により、マウスの成分を減少させ、ＨＡＭＡの発生率を効果的に減少させることができる免疫原性の低い抗体を構築することが差し迫った問題である。
【０００５】
ヒト化抗体は、マウス由来モノクローナル抗体の欠陥を克服するために開発された遺伝子工学による新規の抗体である。ヒト化抗体の最初の世代は、マウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域から構成されるキメラ抗体である。抗体と抗原の間の親和性は抗体の可変領域で決定されるので、キメラ抗体は良好な親和性を保ち、それと同時に、免疫原性がある程度まで減少する。抗体の可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ）とフレーム領域（ＦＲ）から構成され、ＣＤＲは、抗体の抗原への結合を直接媒介する高度可変領域であり、ＦＲ領域は、比較的保存的であり、免疫原性を産生する可変領域内の主要領域であるＣＤＲ領域の空間的な位置を維持するための支持体として使用される。キメラ抗体はマウス由来抗体の可変領域を保持しているので、臨床的な適用において、なお強力なＨＡＭＡ反応を引き起こす可能性がある。したがって、キメラ抗体の免疫原性を最大限減少させるために、マウスＣＤＲ領域をヒト由来抗体のＦＲ領域に直接グラフティングし、ＣＤＲグラフト抗体、すなわちヒト化抗体を得ることが考えられる。しかし、特定のフレームワーク残基がＣＤＲコンホメーションの保存に重要である、または抗原結合に直接関連するため、マウスＣＤＲを単独で移動させると、通常、抗原結合が著しく低下する。ほとんどの場合、ヒト化抗体を首尾よく設計するには、これらのキーマウス残基をヒトフレームワークに再導入して親和性を回復させることが必要である。それゆえ、抗体をヒト化するためには、ＦＲの抗体活性に影響する重要な残基をいかに決定するかが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、マウスＣＤＲ領域をヒト化抗体のフレームワーク領域内にグラフティングすることによって得られた良好な親和性を保ち、同時にヒト化抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列を再形成している抗体である、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、少なくとも１つの抗原結合部位を含むヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体であって、前記抗原結合部位が、
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する第１の可変領域を含む第１ドメインと、
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する第２の可変領域を含む第２ドメインと
を少なくとも含む、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を提供する。
【０００８】
上記の第１の可変領域および第２の可変領域は、それぞれ、免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対応し、第１の可変領域の超可変領域（ＣＤＲ）は順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ、ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ、ＣＤＲ２：ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧおよびＣＤＲ３：ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹである。上記のＣＤＲ領域に加え、第１の可変領域はヒト免疫グロブリン重鎖可変領域由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。抗体の親和性を改善するために、本発明においてフレームワーク領域のアミノ酸を部分的に再形成させ、それによって、アミノ酸配列が配列番号６であり、配列番号５がそれをコードする対応ヌクレオチド配列である、第１の可変領域が得られる。同様に、第２の可変領域の超可変領域（ＣＤＲ）は順次ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ、ＣＤＲ１’：ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、ＣＤＲ２’：ＱＶＳＮＲＦＳおよびＣＤＲ３’：ＦＱＧＳＨＶＰＲＴである。上記のＣＤＲ領域に加え、第２の可変領域はヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。抗体の親和性を改善するために、本発明においてフレームワーク領域のアミノ酸を部分的に再形成させ、それによって、アミノ酸配列が配列番号８であり、配列番号７がそれをコードする対応ヌクレオチド配列である、第２の可変領域が得られる。
【０００９】
さらに、本発明のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体において、前記抗原結合部位は、
１）前記第１の可変領域およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン重鎖またはその断片と
２）前記第２の可変領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン軽鎖またはその断片と
を含む。
【００１０】
ヒト免疫グロブリン定常領域は、各種免疫グロブリンから選択することができ、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するγ型（ＩｇＧ１）であり、ヒト軽鎖定常領域またはその断片が、κ型またはλ型であることが好ましく、軽鎖定常領域の好ましいアミノ酸配列は配列番号４に示す。
【００１１】
本発明の他の目的は、上記のヒト化ヒトＣＤ３４抗体をコードするヌクレオチド分子を提供することであり、そのヌクレオチド分子によって形質転換される宿主も本発明に含まれる。
【００１２】
本発明は、さらに、上記のヒト化抗ＣＤ３４抗体の調製方法であって、コンピュータを使った分子モデリングに基づいてヒト化抗体ｈ４Ｃ８のアミノ酸配列を設計すること、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子の全遺伝子合成を行い、その遺伝子をヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域で繋げること、それぞれ遺伝子組換えであるが、真核細胞発現ベクターにクローニングしてヒト化抗体の重鎖および軽鎖に対する発現ベクターを構築すること、次いで軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをリポソーム法によりＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトすること、ならびに次いでスクリーニング、培養および精製して産物を得ることを含む方法も提供する。
【００１３】
本発明において、得られた抗体を用いて連続した実験を行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗原結合活性アッセイの結果から、ｈ４Ｃ８が、抗原ＣＤ３４を高度に発現しているヒト骨髄性白血病細胞ＫＧ−１ａに特異的に結合できることが示されている。競合阻害試験の結果から、ｈ４Ｃ８が、原型であるマウス由来抗体の親和性および特異性を保持していることが示されている。この抗体は、骨髄造血幹細胞を選別するためにナノ磁気物質にコンジュゲートして免疫磁気ビーズを調製することができる。この抗体を用いると、ＨＡＭＡの出現率が効果的に減少し、造血幹細胞の臨床的移植の安全性が改善される可能性があり、この抗体は一部の悪性血液病および固体腫瘍の治療に使用することができる。
【００１４】
カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）法を用いて、磁気ビーズ表面のカルボキシル基を活性化させ、次いで活性化したカルボキシル基を抗体のアミノ基と反応させ、ＣＤ３４抗体をコンジュゲートし、細胞を効果的に単離することができるＣＤ３４＋免疫磁気ビーズを調製する。選別モデルを、ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞およびＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞を用いて調製し、ＣＤ３４モノクローナル免疫磁気ビーズを用いてＣＤ３４＋細胞を選別する。同じく、ＣＤ３４＋免疫磁気ナノ粒子を用いて臍帯血幹細胞を選別し、選別によって得られた細胞の純度および収率を分析する。
【００１５】
磁気ナノ粒子に結合する抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を抗体ベクターとして用いてＣＤ３４＋造血幹細胞／造血前駆細胞に結合させ、そのようにして免疫複合体を形成する。印加磁場の影響下で、この複合体を動的に移動させ、磁気ナノ粒子上の抗体に特異的に結合する造血幹細胞／造血前駆細胞を他の細胞（ＣＤ３４抗原を発現しない腫瘍細胞）から単離する。精製した造血幹細胞を元の患者に移入して造血系および免疫系を再構築させ、腫瘍の再発を効果的に減少させる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４Ｃ８モノクローナル抗体を分子シミュレーションした構造の概略図である。ＦＲ領域残基を薄い灰色のリボンで表し、ＣＤＲ領域残基を濃い灰色のリボンで表し、ＣＤＲ領域の周囲５オングストローム（Å）以内の９個のＦＲ領域残基を薄い灰色の球棒で表している。
【図２】ヒト化抗体ｈ４Ｃ８の重鎖（図２−１）および軽鎖（図２−２）のアミノ酸配列と関連配列の並列図である。４Ｃ８ＶＨおよび４Ｃ８ＶＬはそれぞれ、マウス由来モノクローナル抗体４Ｃ８の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を表し、ヒト抗体ＡＡＣ１８２０６の重鎖可変領域およびヒト抗体ＢＡＣ０１７３４の軽鎖可変領域は、それぞれ、ヒト化抗体ｈｕ４Ｃ８の重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域として選択され、ｈｕ４Ｃ８ＶＨａおよびｈｕ４Ｃ８ＶＨｂは、それぞれ異なるヒト化抗体の重鎖可変領域を表し、ｈ４Ｃ８ＶＬａおよびｈ４Ｃ８ＶＬｂは、それぞれ異なるヒト化抗体の軽鎖可変領域を表し、ダッシュは、ヒト抗体ＡＡＣ１８２０６またはＢＡＣ０１７３４の対応残基と同一であるアミノ酸を表し、ＣＤＲ領域は角括弧で表し、カバットの番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｍａｎｎｅｒ）に従ってアミノ酸に番号を付けている［Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ，Ｔ．Ｔ．Ｗｕ，Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｃ．Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１．］。
【図３】ヒト化４Ｃ８抗体の抗原結合活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】競合阻害試験の結果を示すグラフである。
【図５】ＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いたＣＤ３４＋細胞系の選別試験の結果を示すグラフである。前側は、選別前の混在した状態の細胞であり、左側のピークはＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞であり、右側のピークはＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞である。後ろ側は、選別後の正の細胞集団であり、ＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞が取り除かれてＣＤ３４＋細胞が効果的に濃縮されている。
【図６】ＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いた、ヒト臍帯血幹細胞選別試験の結果を示すグラフである。前側は、選別前の臍帯血幹細胞であり、左側のピークはＣＤ３４−細胞集団であり、右側のピークはＣＤ３４＋細胞集団である。後ろ側は、選別後の正の細胞集団であり、ＣＤ３４−細胞が取り除かれてＣＤ３４＋幹細胞が効果的に濃縮されている。
【図７】ヒト化抗ＣＤ３４抗体とマウス由来抗体Ｍｙ１０の競合阻害試験の結果を示すグラフである。
【図８】ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０をビーズにコンジュゲートした後の臍帯血幹細胞選別の競合試験結果を示すグラフである（左側のピークは選別前の試験結果であり、右側のピークは選別後の試験結果である）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の実施例は、単に本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものであると理解されるべきではない。
【００１８】
ＫＧ−１ａ（ヒト白血病細胞、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４６．１）
【００１９】
Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８６）
【００２０】
本発明において、４Ｃ８は、本出願人により２００７年１２月１３日に出願された出願に基づく、２００８年８月２０日に公開されたタイトルが抗ヒトＣＤ３４抗体、その調製方法および使用である中国特許出願第２００７１００９４４５６．９号の発明に開示されている方法によって得られたものを意味し、その方法は下記に詳細を述べる。
【００２１】
ヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域をコードする遺伝子のクローニング
健康なヒトリンパ腫細胞をリンパ腫細胞分離溶液（Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＣＨＩＮＡ）から単離し、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードする遺伝子を、それぞれ参照文献（Ｃｅｌｌ，１９８０，２２：１９７−２０７）および参照文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， １０： ４０７１−４０７９）で報告されている配列に従って設計したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、配列決定による検証によって正しいクローンを得た。配列番号１および２は、それぞれ、重鎖定常領域（ＣＨ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。配列番号３および４は、それぞれ、軽鎖定常領域（ＣＬ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨおよびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＬとマークした。
【実施例１】
【００２２】
抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８の調製−−−細胞融合ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＮＴＥＲから入手）を、ＣＤ３４を高度に発現しているＫＧ−１ａ細胞（ＫＧ−１ａ細胞 ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４６．１）で免疫し、脾臓内のＢリンパ球に抗ヒトＣＤ３４抗体を産生させ、免疫したマウス由来の脾細胞をＮＳ−１（ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞）と融合し、ＨＡＴにより選択的に培養し、培養後、抗ヒトＣＤ３４の陽性クローンを選択し、クローニングした後、サブクローンを選択して単一のクローン細胞により抗体が産生されることを確実にし、次いで各クローン細胞の培養物の上澄みを採取し、次いで、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによる精製によって抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８を得た。
【実施例２】
【００２３】
キメラ抗体ｃ４Ｃ８の構築
抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８の可変領域をコードする遺伝子のクローニング
全ＲＮＡを、抗ヒトＣＤ３４を分泌するハイブリドーマ細胞４Ｃ８ ２×１０６個から、「Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ」試薬キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳＡ）をその取扱説明書に従って用いて抽出した。３種の遺伝子特異的プライマー、ＧＳＰ１、ＧＳＰ２、ＧＳＰ３を、それぞれ、抗体（ＩｇＧ１、κ）の重鎖定常領域および軽鎖定常領域の相応な位置を選択することにより設計した。ここで、ＧＳＰ１は、可変領域遺伝子から最も遠く離れており、逆転写反応に使用し、ＧＳＰ２は、ＰＣＲ増幅の最初の実行に使用し、ＧＳＰ３は、ネステッド増幅に使用する。プライマーは、ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ＆ＳＥＲＶＩＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤにより合成され、その配列は下記であった：ＧＳＰ１−Ｈ，５’−ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’；ＧＳＰ２−Ｈ，５’−ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ−３’；ＧＳＰ３−Ｈ，５’−ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ−３’．ＧＳＰ１−Ｌ，５’−ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴ−３’；ＧＳＰ２−Ｌ，５’−ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＴＣ ＴＴ−３’；ＧＳＰ３−Ｌ，５’−ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＣＧ ＡＣＴ ＧＡ−３’
【００２４】
ＧＳＰ１をプライマーとして用い、５’ＲＡＣＥ試薬キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳ）の取扱説明書に従って、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでポリ（Ｃ）テールを第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加し、テーリング後、ＧＳＰ２およびＡＡＰをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を１００倍希釈し、ＡＵＡＰおよびＧＳＰ３をプライマーとして用いてネステッドＰＣＲ増幅を行った。どちらのＰＣＲ反応もホットスタートＰＣＲで行い、反応条件は、９４℃で５分；９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で７０秒を３０サイクル；７２℃で７分であった。ネステッドＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、次いで対象の断片を回収および精製し、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローニングし、陽性クローンを選択して配列決定し、配列決定の結果について分析を行った。次いで、配列決定により確認された正しいｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨを鋳型として利用し、ＨセンスプライマーＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＴＧおよびＨアンチセンスプライマーＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧを設計し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いてＶＨ鎖可変領域遺伝子を増幅し、その５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にＮｈｅＩ制限酵素部位が含まれるようにした。反応条件は、５０℃で３０分；９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定により検証し、その結果から、配列が５’ＲＡＣＥの配列と完全に一致することが実証された。配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、４Ｃ８重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本実施例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨと命名した。
【００２５】
配列決定により検証された正しいｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬを鋳型として利用して、ＨセンスプライマーＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＧＧ ＣＴＧおよびＬアンチセンスプライマーＧＡＣ ＡＧＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ Ｇを設計し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを用いてＶＬ遺伝子を増幅し、その５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にヒト抗体軽鎖定常領域の５’末端に相補的な配列が含まれるようにした。反応条件は、９４℃で５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で１０分であった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定により検証し、その結果から、配列が５’ＲＡＣＥの配列と完全に一致することが実証された。配列番号１１および配列番号１２は、それぞれ、４Ｃ８軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本実施例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬと命名した。
【００２６】
キメラ抗体ｃ４Ｃ８の構築
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ後、配列決定により正しいとされた上記のプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収した後に得られた４３０ｂｐの消化断片を、同じくＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩによって消化したプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨとライゲーションし、正しいクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した後、対象の断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）とライゲーションし、真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）を構築した。
【００２７】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ後、配列決定により正しいとされた上記プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬを、反応条件が、５０℃で３０分；９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であるオーバーラッピングＰＣＲを用いて、正しいクローンｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬの軽鎖定常領域に直接融合し、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位が含まれるＰＣＲ産物ＶＬＣＬを得た。アガロースゲル電気泳動により精製した後、ＰＣＲ産物を回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定した。配列決定により正しいとされたＶＬＣＬ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによってｐＧＥＭ−Ｔベクターから切断し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）にクローニングして真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）を構築した。
【００２８】
３×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３．５ｃｍの組織培養皿に播種し、細胞が９０〜９５％融合するまで培養した時にトランスフェクトした：プラスミド１０μｇ（プラスミドｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）４μｇ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）６μｇ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを、それぞれ、血清を含まないＤＭＥＭ培地５００μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中、培地皿中の血清含有培地を、血清を含まないＤＭＥＭ培地３ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をプレートに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地２ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２５０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含有する選択培地に移して耐性クローンを選択した。細胞培養物の上澄みを利用し、ＥＬＩＳＡによって、高度に発現しているクローンを選択した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の耐性クローン培養物の上澄みまたは標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間加温インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ）を加え、３７℃で１時間加温インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、Ａ４５０値を測定した。選択によって得られた、高度に発現しているクローンを、血清を含まない培地で拡大培養し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラム（ＧＥ ｃｏｍｐａｎｙ）によって、キメラ抗体ｃ４Ｃ８を単離し精製した。精製された抗体を、ＰＢＳを用いて透析し、紫外線吸収法を定量化に用いた。
【実施例３】
【００２９】
ヒト化抗体４Ｃ８の構築
マウス由来４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域（Ｆｖ）の三次元構造の相同性モデリング
マウス由来４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ｃｏｍｐａｎｙのＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩソフトウェアパッケージにより作製した。まず、４Ｃ８の重鎖可変領域タンパク質および軽鎖可変領域タンパク質の鋳型タンパク質を、それぞれ、ＢＬＡＳＴプログラムによってＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）で検索した。最も高い相同性を有する抗体１Ａ４Ｊを、図１に示したような、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩプログラムを用いた４Ｃ８の三次元構造モデリングのための、４Ｃ８のモデリング鋳型として選択した。
【００３０】
ヒト化４Ｃ８抗体の設計および構築
ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、４Ｃ８の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に最も類似したヒト由来の鋳型を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで検索した。４Ｃ８の重鎖可変領域と最も高い相同性を有するヒト由来抗体は、６８％の類似性を持つヒト抗体ＡＡＣ１８２０６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＣ１８２０６）であり、４Ｃ８の軽鎖可変領域と最も高い相同性を有するヒト由来抗体は、８０％の類似性を持つＢＡＣ０１７３４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＣ０１７３４）である。従って、ＡＡＣ１８２０６およびＢＡＣ０１７３４を、それぞれ、４Ｃ８の重鎖および軽鎖のヒト化鋳型として使用した。まず、４Ｃ８の重鎖ＣＤＲ領域および軽鎖ＣＤＲ領域を、それぞれ、ヒト化鋳型ＡＡＣ１８２０６およびＢＡＣ０１７３４にグラフティングしてＣＤＲがグラフティングされた抗体、それぞれ重鎖および軽鎖に対して、ｈ４Ｃ８Ｈａおよびｈ４Ｃ８Ｌａを形成した。ｈ４Ｃ８Ｈａの可変領域およびｈ４Ｃ８Ｌａの可変領域のアミノ酸配列を図２に示す。ヒト化抗体の重鎖可変遺伝子および軽鎖可変遺伝子（ｈ４Ｃ８ＶＨａおよびｈ４Ｃ８ＶＬａ）を全遺伝子合成により合成し、次いでｈ４Ｃ８ＶＨａ遺伝子およびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨベクターを鋳型として用いて、オーバーラッピングＰＣＲによってヒト化抗体の重鎖遺伝子を合成した。反応条件は、９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。加えて、このヒト化重鎖遺伝子は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位およびシグナルペプチド遺伝子配列、３’末端に翻訳停止コードＴＡＡおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するようにした。シグナルペプチドの配列は配列番号：（ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡ）に示す。最後に、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、対象のバンドを回収し、ｐＧＥＭＴベクターにクローニングして陽性クローンを選択し配列決定した。正しい配列を持つクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ヒト化抗体の重鎖断片Ｈ４Ｃ８ＶＨａＣＨを回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とライゲーションして、ヒト化重鎖真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＨａＣＨ）を構築した。
【００３１】
ｈ４Ｃ８ＶＬａ遺伝子およびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＬベクターを鋳型として用いて、オーバーラッピングＰＣＲによって、ヒト化抗体の軽鎖遺伝子を合成した。反応条件は、９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。このようにして得られたＰＣＲ産物はｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬであり、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位およびシグナルペプチド遺伝子配列、３’末端に翻訳停止コードＴＡＡおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。シグナルペプチドの配列は配列番号：（ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡ）に示す。正しい配列を持つクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ヒト化抗体の軽鎖断片Ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬを回収し、同じくＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とライゲーションして、ヒト化重鎖真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬ）を構築した。
【００３２】
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を、０．８×１０５／ウェルで２４ウェルの組織培養プレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０／ＤＭＥＭ混合培地（１６／ＤＭ培地）を用いて９０〜９５％融合するまで培養してトランスフェクションを行った：プラスミド１μｇ（軽鎖発現ベクター０．６μｇ、重鎖発現ベクター０．４μｇ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌを、それぞれ、血清を含まない１６／ＤＭ培地５０μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中に、２４ウェル培養プレート中の血清含有培地を、血清を含まない１６／ＤＭ培地０．５ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をウェルに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで２０％ＦＣＳ含有１６／ＤＭ培地０．５ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。７２時間後、培養物の上澄みを分析のために利用し、培養物の上澄み中の抗体含有量をＥＬＩＳＡにより決定した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の培養物の上澄みおよび標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトκを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、ＯＤ４５０値を測定した。
【００３３】
ヒトＫＧ−１ａ細胞を、細胞１×１０６個／ｍｌになるように２％ＦＣＳ−ＰＢＳに再懸濁させ、ヒト化抗体をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞培養物の上澄みを、異なる希釈度で、それぞれ加え、それらを４℃で６０分間インキュベートし、次いで細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を細胞に加え、４℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって分析し、蛍光強度を計算した。その結果から、ｃ４Ｃ８キメラ抗体と比べて、ｈ４Ｃ８Ｈａおよびｈ４Ｃ８Ｌａから構成されるヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）は、その活性がほとんど完全に失われることが示されている（図３）。それゆえ、高い親和性を持つヒト化抗体を得るために、さらに、４Ｃ８抗体の結合活性にもしかしたら影響しうるＦＲ領域のマウス由来残基について分析および復帰突然変異を行う必要がある。
【００３４】
モデリングした４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造を分析することにより、ＣＤＲ領域の周囲５Å内の９つのフレームワーク残基、Ｌ３Ｌｅｕ、Ｌ４Ｌｅｕ、Ｌ４６Ｌｅｕ、Ｈ２Ｉｌｅ、Ｈ４６Ｌｙｓ、Ｈ６８Ａｌａ、Ｈ６９Ｌｅｕ、Ｈ８２ａＡｓｎ、およびＨ９１Ｐｈｅが、ヒト化鋳型の対応する位置と異なると同時に、原型である抗体のＣＤＲコンホメーションに影響する可能性があることが発見された。構築されたＣＤＲグラフティング抗体内にこれらのマウス由来アミノ酸残基を残したままヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈｂ／ｈ４Ｃ８Ｌｂ）を得ることができる。ｈ４Ｃ８Ｈｂおよびｈ４Ｃ８Ｌｂの可変領域に対するアミノ酸配列を図２に示す。配列番号５および６は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｈｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。配列番号７および８は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｌｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ｈ４Ｃ８Ｈｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ）、ＨＣＤＲ２（ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧ）、ＨＣＤＲ３（ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹ）である（図２−１のＨ４Ｃ８ＶＨｂ参照）。ｈ４Ｃ８Ｌｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＬＣＤＲ１（ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ）、ＬＣＤＲ２（ＱＶＳＮＲＦＳ）、ＬＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ）である（図２−２のＨ４Ｃ８ＶＬｂ参照）。ヒト化抗体の重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子（ｈ４Ｃ８ＶＨｂ／ｈ４Ｃ８ＶＬｂ）を、それぞれ、オーバーラッピングＰＣＲを用いて合成し、ヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）についてと同じ方法を用いて軽鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬｂＣＬ）および重鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＨｂＣＨ）を構築した。次いで、軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に共トランスフェクトした。フローサイトメトリーアッセイを行って抗体の抗原結合活性を決定し、その結果、ＫＧ−１ａに対するこの抗体の結合能は４Ｃ８キメラ抗体の結合能と同様であることが示され、よってこのヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）をｈ４Ｃ８として設計した。
【実施例４】
【００３５】
ヒト化抗体の安定発現および精製
３×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６１８）を、３．５ｃｍの組織培養皿に播種し、細胞が９０〜９５％融合するまで培養した時にトランスフェクトした：プラスミド１０μｇ（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｖｈ４Ｃ８ＨｂＣＨ）４μｇ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＲＯ（＋）（Ｖｈ４Ｃ８ＬｂＣＬ）６μｇおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを、それぞれ、血清を含まないＤＭＥＭ培地５００μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中、培地皿中の血清含有培地を、血清を含まないＤＭＥＭ培地３ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をプレートに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地２ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２５０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含有する選択培地に移して耐性クローンを選択した。細胞培養物の上澄みを利用し、高度に発現しているクローンを選択した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の耐性クローン培養物の上澄みまたは標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間加温インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ）を加え、３７℃で１時間加温インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、Ａ４５０値を測定した。選択によって得られた、高度に発現しているクローンを、血清を含まない培地で拡大培養し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラム（ＧＥ ｃｏｍｐａｎｙ）によって、ヒト化抗体ｈ４Ｃ８を単離し、精製した。精製された抗体を、ＰＢＳを用いて透析し、紫外線吸収法を定量化に用いた。
【実施例５】
【００３６】
競合阻害試験
固定したほぼ飽和濃度の蛍光標識精製抗体ＦＩＴＣ−４Ｃ８と、非標識抗体の段階希釈液を、それぞれ混合し、次いで、標的のＫＧ−１ａ細胞に加え（１×１０６個／ｍｌ）、４℃で６０分間インキュベートし、細胞を１％のＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、分析のためにＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いたＦＣＭによって試験した。ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｈｕ１２Ｆ６を対照として用いた（調製については、Ｌｉ ＢＨ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｄａｉ ＪＸ， Ｊｉ ＪＪ，Ｑｉａｎ ＷＺ，Ｚｈａｎｇ ＤＰ，Ｈｏｕ Ｓ，Ｇｕｏ ＹＪ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １２Ｆ６ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５，１１６（４）：４８７−９８を参照されたい）。競合抗体の各濃度について、管を３連で用意した。競合抗体が存在しない場合に得られた蛍光強度の平均を示す最大蛍光強度を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００３７】
試験結果を図４に示す。抗体ｈ４Ｃ８は、蛍光標識抗体ＦＩＴＣ−４Ｃ８のＫＧ−１ａへの結合を完全に遮断し、ｈ４Ｃ８とＦＩＴＣ−４Ｃ８のＩＣ５０値はほぼ同じであり、このことは、このヒト化抗体が、原型であるマウス由来抗体の特異性および親和性と同様の特異性および親和性を有することを示唆している。
【００３８】
【表１】
【実施例６】
【００３９】
免疫磁気ビーズの調製
活性化：ｐＨ６．０、０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｔｗｅｅｎ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を活性化緩衝溶液として利用し、カルボキシルビーズ（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢｉｏＭａｇ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＢＭ５７０），ＵＳＡ）２ｍｇを２ｍｌの遠心分離管に入れ、活性化緩衝溶液５００μｌを加えてボルテックスミキサーで均一に混合し、次いで遠心分離管をＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｒａｃｋ上に置き、磁気ビーズが完全に吸着した後、上澄みを小型の真空ポンプによって抽出した。活性化緩衝溶液５００μｌを加えて磁気ビーズを２回、洗浄し直し、次いで、活性化緩衝溶液４８５μｌを磁気ビーズに加え、カルボジイミド（ＥＤＣ、最初の濃度０．５ｇ／ｍｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、最初の濃度０．２５ｇ／ｍｌ）をそれぞれ２．５ｍｇ加え、ボルテックスミキサーで均一に混合して、磁気ビーズの表面のカルボキシル基２ｍｇを室温で３０分間、活性化させた。
【００４０】
コンジュゲート：ｐＨ７．４、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸Ｔｗｅｅｎ溶液（ＰＢＳＴ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）５００μｌをコンジュゲート緩衝液として用い、活性化緩衝溶液５００μｌを加えて活性化した磁気ビーズを３回洗浄し直し、次いでコンジュゲート緩衝液５００μｌを加えて磁気ビーズを２回洗浄した。コンジュゲート緩衝液４７５μｌを加えて洗浄した磁気ビーズを再懸濁させ、６ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ３４抗体２５μｌを加え、磁気ビーズ上の活性化したカルボキシル基を、室温で３時間、抗ＣＤ３４抗体のアミノ基と反応させ、次いで抗体を磁気ビーズの表面にコンジュゲートして、免疫磁気ビーズを得た。
【００４１】
ブロッキング：コンジュゲートした磁気ビーズをコンジュゲート緩衝液５００μｌで２回洗浄し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有コンジュゲート緩衝液５００μｌを加えて３０分間磁気ビーズをブロッキングした。
【００４２】
貯蔵：コンジュゲートした磁気ビーズをコンジュゲート緩衝液５００μｌで２回洗浄し、磁気ビーズを、０．０２％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡを含有するｐＨ７．４、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸Ｔｗｅｅｎ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）５００μｌ中に再懸濁させ、次いで使用するために冷蔵庫内で４℃で貯蔵した。
【実施例７】
【００４３】
ＣＤ３４免疫磁気ビーズによるＣＤ３４＋細胞系の選別
ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ（ヒト白血病細胞）とＣＤ３４−Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ腫細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏで１：１０の比率で混合し、ヒト臍帯血単核細胞（または動員された末梢血単核細胞）を模倣する。
【００４４】
０．１ＭのＰＢＳ溶液の調製：ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ３．４８８ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１０００ｍｌにし、ｐＨ７．４に調整し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、４℃で貯蔵する。
【００４５】
免疫磁気ビーズ選別緩衝液の調製：２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ溶液。
【００４６】
選別緩衝液を細胞１０７個当たり９０μｌの比率で加えて上記の混合細胞を再懸濁させ、
上記の細胞懸濁液に、ＣＤ３４免疫磁気ビーズを細胞１０７個当たり１０μｌの比率で加え、混合して４〜８℃で１５分間インキュベートし、
選別緩衝液を細胞１０７個当たり１０００μｌの比率（１０７個未満の細胞に対しても１０００μｌを適用できる）で加えて細胞を再懸濁させ、遠心分離管を磁場に置き、上澄みを取り除き、
上記のステップを２回繰り返し、
細胞沈殿物を、選別緩衝液５００μｌを用いて再懸濁させ、ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞を得る。
【００４７】
細胞を、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３４０６６８、選別抗体に対する競合作用を有さない）で染色し、選別によって得られた細胞の純度は９５％を超えることが同定され、選別細胞を計測したところ、ＣＤ３４＋細胞の選別収率は９０％を超えた。結果を図５に示す。
【実施例８】
【００４８】
ＣＤ３４免疫磁気ビーズによるヒト臍帯血幹細胞の選別
ヒト臍帯血からＣＤ３４＋血液幹細胞を選別した。
【００４９】
０．１ＭのＰＢＳ溶液の調製：ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ３．４８８ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１０００ｍｌにし、ｐＨ７．４に調整し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、４℃で貯蔵する。
【００５０】
免疫磁気ビーズ選別緩衝液の調製：２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ溶液。
【００５１】
健康な母性臍帯血からＦｉｃｏｌｌを用いて単核細胞を単離する。
【００５２】
選別緩衝液を細胞１０７個当たり９０μｌの比率で加えて単核細胞を再懸濁させ、
上記の細胞懸濁液に、ＣＤ３４免疫磁気ビーズを細胞１０７個当たり１０μｌの比率で加え、混合して４〜８℃で１５分間インキュベートし、
選別緩衝液を細胞１０７個当たり１０００μｌの比率（１０７個未満の細胞に対しても１０００μｌを適用できる）で加えて細胞を再懸濁させ、遠心分離管を磁場に置き、上澄みを取り除き、
上記のステップを２回繰り返し、
細胞沈殿物を、選別緩衝液５００μｌを用いて再懸濁させ、ＣＤ３４＋血液幹細胞を得る。
【００５３】
細胞を、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３４０６６８、選別抗体に対する競合作用を有さない）で染色し、選別によって得られた細胞の純度は９５％を超えることが同定され、選別細胞を計測したところ、ＣＤ３４＋細胞の選別収率は９０％を超えた。結果を図６に示す。
【００５４】
この結果は、我々が調製したＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いた臍帯血幹細胞の選別によって得られた純度および収率が、臨床に適用するための必要性に見合い、骨髄血幹細胞の臨床的移植において使用できることが見込まれることを示している。
【実施例９】
【００５５】
ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０の競合阻害試験
ほぼ飽和濃度のＦＩＴＣ−ＣＤ３４（Ｍｙ１０）（ＢＤ、３４８０５３）ならびに非標識の精製抗体ｈ４Ｃ８および非標識のＭｙ１０（マウス抗ヒトＣＤ３４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ８４８３、抗Ｍｙ１０クローン）の段階希釈液を、血清を含まないハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、１２０４５）で培養した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）により精製した後、培養物の上澄みをそれぞれ混合し、次いで標的細胞ＫＧ−１ａ（１×１０６／ｍｌ）に加え、４℃で６０分間インキュベートし、細胞を１％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、分析のためにＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いたＦＣＭにより試験した。ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｈｕ１２Ｆ６を対照として用いた（調製については、Ｌｉ ＢＨ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｄａｉ ＪＸ， Ｊｉ ＪＪ，Ｑｉａｎ ＷＺ，Ｚｈａｎｇ ＤＰ，Ｈｏｕ Ｓ，Ｇｕｏ ＹＪ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １２Ｆ６ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５，１１６（４）：４８７−９８を参照されたい）。競合抗体の各濃度について、管を３連で用意した。競合抗体が存在しない場合に得られた蛍光強度の平均を示す最大蛍光強度を用いてＩＣ５０値を計算した。この試験を３回繰り返し、統計的な結果を得る。表２を参照されたい。
【００５６】
試験結果を図７に示す。抗体ｈ４Ｃ８によって遮断される蛍光標識抗体ＦＩＴＣ−Ｍｙ１０のＫＧ−１ａ細胞への結合についてのＩＣ５０値は、マウス由来モノクローナル抗体Ｍｙ１０によるものよりも小さく（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）、それゆえ、ｈ４Ｃ８の親和性はマウス由来モノクローナル抗体Ｍｙ１０よりもすぐれている。
【００５７】
【表２】
【実施例１０】
【００５８】
ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０の磁気ビーズへのコンジュゲート後の臍帯血幹細胞選別に対する比較試験
マウス抗ヒトＣＤ３４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ８４８３、抗Ｍｙ１０クローン）を、血清を含まないハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、１２０４５）を用いて培養した。培養物の上澄みをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）により精製し、磁気ビーズ調製条件の必要性に見合った抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Ｍｙ１０）を得た。
【００５９】
Ｍｙ１０およびｈ４Ｃ８を、実施例６の方法に従って磁気ビーズにコンジュゲートして、ＣＤ３４ナノ免疫磁気ビーズを調製した。
【００６０】
ヒト臍帯血幹細胞を、実施例８の方法に従って、Ｍｙ１０およびｈ４Ｃ８ナノ免疫磁気ビーズにより選別した。選別によって得られた陽性細胞を、血球計測プレートにより計測し、２種の磁気ビーズによる選別によって得られた細胞の収率を計算し、選別によって得られた陽性細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ３４（ＢＤ、３４８０５３、８Ｇ１２）によって染色し、２種の磁気ビーズによる選択によって得られた細胞の純度を同定した。染色の結果を図８に示す（左側のピークは選別前の試験結果であり、右側のピークは選別後の試験結果である）。
【００６１】
比較試験の結果を表３に示した。
【００６２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のヒト化抗ＣＤ３４抗体は、原型であるマウス由来抗体の親和性および特異性を保持している。この抗体は、ナノ磁気物質とコンジュゲートして、骨髄造血幹細胞を選別するための免疫磁気ビーズを調製することができる。この抗体を用いると、ＨＡＭＡの出現率が効果的に減少し、造血幹細胞の臨床的移植の安全性が改善される可能性があり、この抗体は、特定の悪性血液病および固形腫瘍の治療に使用することができる。本発明のヒト化抗ＣＤ３４抗体は、遺伝子組換え技術によって得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー、特に、抗体、その調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞／造血前駆細胞（ＨＳＣ）の移植は、現在、特定の悪性血液病および固形腫瘍に対する唯一の効果的治療方法であるとよく理解されている。しかし、グラフトに多数のＴリンパ球が含有されるので、グラフティングした後に急性の重篤な移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が起こり、これは、グラフティングされる異種遺伝子の造血幹細胞が長く生存できるか否かに影響する主要な原因の１つである。造血幹細胞／造血前駆細胞の移植に関する主な問題は、グラフト中の不純物細胞による干渉を除くための多量の精製造血幹細胞をいかに得るかである。それゆえ、グラフト中の特定の細胞を一掃または濃縮することは、現在のグラフティング分野に関係する問題である。ＨＳＣには明確な形態学的特徴がないが、主にリンパ球様の単核芽細胞として機能するので、ＨＳＣは細胞表面上のいくつかのタンパク質によってのみ同定することができる。１１０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３４は、今までのところヒトＨＳＣで発現されることが認識されている抗原の最も広く古いものであり、ＨＳＣの質および量を評価するための良いマーカーである。ＣＤ３４抗体に基づく正の選択技術の開発により、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、実験動物および人間において造血機能の再構成を示し［Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ，Ｂｒｙａｎｔ ＥＭ，Ｂａｒｔｅｌｍｅｚ ＳＨ，Ｍｕｉｒｈｅａｄ ＤＴ，Ｋｎｉｔｔｅｒ ＧＨ，Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ Ｗ，Ｓｔｒｏｎｇ ＤＭ，Ｂｅｒｎｓｔｉｅｎ ＩＤ（１９９２）ＣＤ３４＋ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ，ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｓｔａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｂａｂｏｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ ８０：１６９３］［Ｓｈｐａｌｌ ＥＪ，Ｊｏｎｅｓ ＲＢ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｗ，Ｂｅａｒｍａｎ Ｓ，Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｓ，Ｈａｍｉ Ｌ，Ｐｅｔｓｃｈｅ Ｄ，Ｔａｆｆｓ Ｓ，Ｍｙｅｒｓ Ｓ，Ｐｕｒｄｙ Ｍ，Ｈｅｉｍｆｅｌｄ Ｓ，Ｈａｌｌｉｇａｎ Ｊ，Ｂｅｒｅｎｓｏｎ ＲＪ（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：２８］、それゆえ、ＣＤ３４＋はその独特の生物学的特性および機能のために、造血幹細胞グラフティングの最適な標的細胞になっている。
【０００３】
現在、細胞を分離および精製するために最も用いられている方法としては、接着法、分画遠心法、不連続密度勾配法などが挙げられる。これらの技術は多くの実際的な問題を解決しているにもかかわらず、分離および精製に関して、操作時間が長いこと、細胞の回収率が低いこと、およびコストが高いことから、細胞生物学の進展ならびに細胞バイオテクノロジー製品の開発および適用を妨げている。免疫磁気による細胞選択技術は、近年開発された新規細胞分離技術であり、操作が単純かつ容易であること、分離純度が高いこと、および細胞活性が維持されることなどの利点を有し、種々の骨髄細胞および血球、腫瘍細胞、細菌および他の微生物などの分離および検査に使用することができる。したがって、免疫磁気による細胞選択技術は、生物医学分野の研究者に支持されている。近年、免疫磁気ビーズは、徐々にサブミクロンサイズに開発されており、それによって、磁気ビーズによる細胞分離を低い磁場勾配で容易かつ迅速に行うことができ、続いて分析および適用を、細胞表面から磁気ビーズを解離させずに直接行うことができ、またビーズは分離後に細胞活性に影響を与えない。分離の原理は、磁気ナノ粒子を、その表面に抗体をコンジュゲートするためのベクターとして用い、抗体の特異的な親和性によって、磁気ナノ粒子上の抗体が細胞上の特異的な表面抗原に結合して細胞−抗体−磁気ナノ粒子複合体が形成され、印加磁場の指向制御下で、標的細胞を元の細胞混合物から直接、親和性吸着、洗浄および脱離などの操作による１ステップで単離することができるというものである。ナノ磁気細胞親和性分離は、容易かつ便利な磁気分離および高選択性親和性分離の二重の利点を有する。
【０００４】
免疫磁気ビーズが世に出ると、骨髄造血幹細胞を選別するために、ＣＤ３４モノクローナル抗体を磁気ナノ微粒子にコンジュゲートすることによって調製した免疫磁気ビーズの使用が、臨床的な造血幹細胞移植に適用されてきた。磁気分離が、細胞を選別する際に、操作が容易かつ便利である、分離が迅速かつ完璧である、細胞純度が高いなどの利点を有するという事実のおかげで、特定の悪性血液病、重篤な免疫不全ならびに腫瘍の放射線療法および化学療法に起因する造血機能の低下に対して、ＨＳＣ移植が第１の選択になっている。造血幹細胞移植の過程中に、磁気ビーズに結合したこれらの抗体は、造血幹細胞と一緒にヒトの体内に必然的に侵入する。ハイブリドーマ技術によって産生されるマウス由来モノクローナル抗体は、ヒトの体内に侵入後、ヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を引き起こす可能性がある［Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ，Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１９９３ Ｊｕｎ；１４（６）：２４３−６］。それゆえ、当業者にとって、遺伝子工学技術により、マウスの成分を減少させ、ＨＡＭＡの発生率を効果的に減少させることができる免疫原性の低い抗体を構築することが差し迫った問題である。
【０００５】
ヒト化抗体は、マウス由来モノクローナル抗体の欠陥を克服するために開発された遺伝子工学による新規の抗体である。ヒト化抗体の最初の世代は、マウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域から構成されるキメラ抗体である。抗体と抗原の間の親和性は抗体の可変領域で決定されるので、キメラ抗体は良好な親和性を保ち、それと同時に、免疫原性がある程度まで減少する。抗体の可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ）とフレーム領域（ＦＲ）から構成され、ＣＤＲは、抗体の抗原への結合を直接媒介する高度可変領域であり、ＦＲ領域は、比較的保存的であり、免疫原性を産生する可変領域内の主要領域であるＣＤＲ領域の空間的な位置を維持するための支持体として使用される。キメラ抗体はマウス由来抗体の可変領域を保持しているので、臨床的な適用において、なお強力なＨＡＭＡ反応を引き起こす可能性がある。したがって、キメラ抗体の免疫原性を最大限減少させるために、マウスＣＤＲ領域をヒト由来抗体のＦＲ領域に直接グラフティングし、ＣＤＲグラフト抗体、すなわちヒト化抗体を得ることが考えられる。しかし、特定のフレームワーク残基がＣＤＲコンホメーションの保存に重要である、または抗原結合に直接関連するため、マウスＣＤＲを単独で移動させると、通常、抗原結合が著しく低下する。ほとんどの場合、ヒト化抗体を首尾よく設計するには、これらのキーマウス残基をヒトフレームワークに再導入して親和性を回復させることが必要である。それゆえ、抗体をヒト化するためには、ＦＲの抗体活性に影響する重要な残基をいかに決定するかが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、マウスＣＤＲ領域をヒト化抗体のフレームワーク領域内にグラフティングすることによって得られた良好な親和性を保ち、同時にヒト化抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列を再形成している抗体である、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、少なくとも１つの抗原結合部位を含むヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体であって、前記抗原結合部位が、
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する第１の可変領域を含む第１ドメインと、
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する第２の可変領域を含む第２ドメインと
を少なくとも含む、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を提供する。
【０００８】
上記の第１の可変領域および第２の可変領域は、それぞれ、免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対応し、第１の可変領域の超可変領域（ＣＤＲ）は順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ、ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ、ＣＤＲ２：ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧおよびＣＤＲ３：ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹである。上記のＣＤＲ領域に加え、第１の可変領域はヒト免疫グロブリン重鎖可変領域由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。抗体の親和性を改善するために、本発明においてフレームワーク領域のアミノ酸を部分的に再形成させ、それによって、アミノ酸配列が配列番号６であり、配列番号５がそれをコードする対応ヌクレオチド配列である、第１の可変領域が得られる。同様に、第２の可変領域の超可変領域（ＣＤＲ）は順次ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ、ＣＤＲ１’：ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、ＣＤＲ２’：ＱＶＳＮＲＦＳおよびＣＤＲ３’：ＦＱＧＳＨＶＰＲＴである。上記のＣＤＲ領域に加え、第２の可変領域はヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。抗体の親和性を改善するために、本発明においてフレームワーク領域のアミノ酸を部分的に再形成させ、それによって、アミノ酸配列が配列番号８であり、配列番号７がそれをコードする対応ヌクレオチド配列である、第２の可変領域が得られる。
【０００９】
さらに、本発明のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体において、前記抗原結合部位は、
１）前記第１の可変領域およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン重鎖またはその断片と
２）前記第２の可変領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン軽鎖またはその断片と
を含む。
【００１０】
ヒト免疫グロブリン定常領域は、各種免疫グロブリンから選択することができ、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するγ型（ＩｇＧ１）であり、ヒト軽鎖定常領域またはその断片が、κ型またはλ型であることが好ましく、軽鎖定常領域の好ましいアミノ酸配列は配列番号４に示す。
【００１１】
本発明の他の目的は、上記のヒト化ヒトＣＤ３４抗体をコードするヌクレオチド分子を提供することであり、そのヌクレオチド分子によって形質転換される宿主も本発明に含まれる。
【００１２】
本発明は、さらに、上記のヒト化抗ＣＤ３４抗体の調製方法であって、コンピュータを使った分子モデリングに基づいてヒト化抗体ｈ４Ｃ８のアミノ酸配列を設計すること、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子の全遺伝子合成を行い、その遺伝子をヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域で繋げること、それぞれ遺伝子組換えであるが、真核細胞発現ベクターにクローニングしてヒト化抗体の重鎖および軽鎖に対する発現ベクターを構築すること、次いで軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをリポソーム法によりＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトすること、ならびに次いでスクリーニング、培養および精製して産物を得ることを含む方法も提供する。
【００１３】
本発明において、得られた抗体を用いて連続した実験を行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗原結合活性アッセイの結果から、ｈ４Ｃ８が、抗原ＣＤ３４を高度に発現しているヒト骨髄性白血病細胞ＫＧ−１ａに特異的に結合できることが示されている。競合阻害試験の結果から、ｈ４Ｃ８が、原型であるマウス由来抗体の親和性および特異性を保持していることが示されている。この抗体は、骨髄造血幹細胞を選別するためにナノ磁気物質にコンジュゲートして免疫磁気ビーズを調製することができる。この抗体を用いると、ＨＡＭＡの出現率が効果的に減少し、造血幹細胞の臨床的移植の安全性が改善される可能性があり、この抗体は一部の悪性血液病および固体腫瘍の治療に使用することができる。
【００１４】
カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）法を用いて、磁気ビーズ表面のカルボキシル基を活性化させ、次いで活性化したカルボキシル基を抗体のアミノ基と反応させ、ＣＤ３４抗体をコンジュゲートし、細胞を効果的に単離することができるＣＤ３４＋免疫磁気ビーズを調製する。選別モデルを、ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞およびＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞を用いて調製し、ＣＤ３４モノクローナル免疫磁気ビーズを用いてＣＤ３４＋細胞を選別する。同じく、ＣＤ３４＋免疫磁気ナノ粒子を用いて臍帯血幹細胞を選別し、選別によって得られた細胞の純度および収率を分析する。
【００１５】
磁気ナノ粒子に結合する抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を抗体ベクターとして用いてＣＤ３４＋造血幹細胞／造血前駆細胞に結合させ、そのようにして免疫複合体を形成する。印加磁場の影響下で、この複合体を動的に移動させ、磁気ナノ粒子上の抗体に特異的に結合する造血幹細胞／造血前駆細胞を他の細胞（ＣＤ３４抗原を発現しない腫瘍細胞）から単離する。精製した造血幹細胞を元の患者に移入して造血系および免疫系を再構築させ、腫瘍の再発を効果的に減少させる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４Ｃ８モノクローナル抗体を分子シミュレーションした構造の概略図である。ＦＲ領域残基を薄い灰色のリボンで表し、ＣＤＲ領域残基を濃い灰色のリボンで表し、ＣＤＲ領域の周囲５オングストローム（Å）以内の９個のＦＲ領域残基を薄い灰色の球棒で表している。
【図２】ヒト化抗体ｈ４Ｃ８の重鎖（図２−１）および軽鎖（図２−２）のアミノ酸配列と関連配列の並列図である。４Ｃ８ＶＨおよび４Ｃ８ＶＬはそれぞれ、マウス由来モノクローナル抗体４Ｃ８の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を表し、ヒト抗体ＡＡＣ１８２０６の重鎖可変領域およびヒト抗体ＢＡＣ０１７３４の軽鎖可変領域は、それぞれ、ヒト化抗体ｈｕ４Ｃ８の重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域として選択され、ｈｕ４Ｃ８ＶＨａおよびｈｕ４Ｃ８ＶＨｂは、それぞれ異なるヒト化抗体の重鎖可変領域を表し、ｈ４Ｃ８ＶＬａおよびｈ４Ｃ８ＶＬｂは、それぞれ異なるヒト化抗体の軽鎖可変領域を表し、ダッシュは、ヒト抗体ＡＡＣ１８２０６またはＢＡＣ０１７３４の対応残基と同一であるアミノ酸を表し、ＣＤＲ領域は角括弧で表し、カバットの番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｍａｎｎｅｒ）に従ってアミノ酸に番号を付けている［Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ，Ｔ．Ｔ．Ｗｕ，Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｃ．Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１．］。
【図３】ヒト化４Ｃ８抗体の抗原結合活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】競合阻害試験の結果を示すグラフである。
【図５】ＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いたＣＤ３４＋細胞系の選別試験の結果を示すグラフである。前側は、選別前の混在した状態の細胞であり、左側のピークはＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞であり、右側のピークはＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞である。後ろ側は、選別後の正の細胞集団であり、ＣＤ３４−Ｒａｊｉ細胞が取り除かれてＣＤ３４＋細胞が効果的に濃縮されている。
【図６】ＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いた、ヒト臍帯血幹細胞選別試験の結果を示すグラフである。前側は、選別前の臍帯血幹細胞であり、左側のピークはＣＤ３４−細胞集団であり、右側のピークはＣＤ３４＋細胞集団である。後ろ側は、選別後の正の細胞集団であり、ＣＤ３４−細胞が取り除かれてＣＤ３４＋幹細胞が効果的に濃縮されている。
【図７】ヒト化抗ＣＤ３４抗体とマウス由来抗体Ｍｙ１０の競合阻害試験の結果を示すグラフである。
【図８】ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０をビーズにコンジュゲートした後の臍帯血幹細胞選別の競合試験結果を示すグラフである（左側のピークは選別前の試験結果であり、右側のピークは選別後の試験結果である）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の実施例は、単に本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものであると理解されるべきではない。
【００１８】
ＫＧ−１ａ（ヒト白血病細胞、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４６．１）
【００１９】
Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８６）
【００２０】
本発明において、４Ｃ８は、本出願人により２００７年１２月１３日に出願された出願に基づく、２００８年８月２０日に公開されたタイトルが抗ヒトＣＤ３４抗体、その調製方法および使用である中国特許出願第２００７１００９４４５６．９号の発明に開示されている方法によって得られたものを意味し、その方法は下記に詳細を述べる。
【００２１】
ヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域をコードする遺伝子のクローニング
健康なヒトリンパ腫細胞をリンパ腫細胞分離溶液（Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＣＨＩＮＡ）から単離し、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードする遺伝子を、それぞれ参照文献（Ｃｅｌｌ，１９８０，２２：１９７−２０７）および参照文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， １０： ４０７１−４０７９）で報告されている配列に従って設計したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、配列決定による検証によって正しいクローンを得た。配列番号１および２は、それぞれ、重鎖定常領域（ＣＨ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。配列番号３および４は、それぞれ、軽鎖定常領域（ＣＬ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨおよびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＬとマークした。
【実施例１】
【００２２】
抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８の調製−−−細胞融合ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＮＴＥＲから入手）を、ＣＤ３４を高度に発現しているＫＧ−１ａ細胞（ＫＧ−１ａ細胞 ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４６．１）で免疫し、脾臓内のＢリンパ球に抗ヒトＣＤ３４抗体を産生させ、免疫したマウス由来の脾細胞をＮＳ−１（ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞）と融合し、ＨＡＴにより選択的に培養し、培養後、抗ヒトＣＤ３４の陽性クローンを選択し、クローニングした後、サブクローンを選択して単一のクローン細胞により抗体が産生されることを確実にし、次いで各クローン細胞の培養物の上澄みを採取し、次いで、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによる精製によって抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８を得た。
【実施例２】
【００２３】
キメラ抗体ｃ４Ｃ８の構築
抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体４Ｃ８の可変領域をコードする遺伝子のクローニング
全ＲＮＡを、抗ヒトＣＤ３４を分泌するハイブリドーマ細胞４Ｃ８ ２×１０６個から、「Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ」試薬キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳＡ）をその取扱説明書に従って用いて抽出した。３種の遺伝子特異的プライマー、ＧＳＰ１、ＧＳＰ２、ＧＳＰ３を、それぞれ、抗体（ＩｇＧ１、κ）の重鎖定常領域および軽鎖定常領域の相応な位置を選択することにより設計した。ここで、ＧＳＰ１は、可変領域遺伝子から最も遠く離れており、逆転写反応に使用し、ＧＳＰ２は、ＰＣＲ増幅の最初の実行に使用し、ＧＳＰ３は、ネステッド増幅に使用する。プライマーは、ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ＆ＳＥＲＶＩＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤにより合成され、その配列は下記であった：ＧＳＰ１−Ｈ，５’−ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’；ＧＳＰ２−Ｈ，５’−ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ−３’；ＧＳＰ３−Ｈ，５’−ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ−３’．ＧＳＰ１−Ｌ，５’−ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴ−３’；ＧＳＰ２−Ｌ，５’−ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＴＣ ＴＴ−３’；ＧＳＰ３−Ｌ，５’−ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＣＧ ＡＣＴ ＧＡ−３’
【００２４】
ＧＳＰ１をプライマーとして用い、５’ＲＡＣＥ試薬キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳ）の取扱説明書に従って、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでポリ（Ｃ）テールを第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加し、テーリング後、ＧＳＰ２およびＡＡＰをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を１００倍希釈し、ＡＵＡＰおよびＧＳＰ３をプライマーとして用いてネステッドＰＣＲ増幅を行った。どちらのＰＣＲ反応もホットスタートＰＣＲで行い、反応条件は、９４℃で５分；９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で７０秒を３０サイクル；７２℃で７分であった。ネステッドＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、次いで対象の断片を回収および精製し、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローニングし、陽性クローンを選択して配列決定し、配列決定の結果について分析を行った。次いで、配列決定により確認された正しいｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨを鋳型として利用し、ＨセンスプライマーＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＴＧおよびＨアンチセンスプライマーＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧを設計し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いてＶＨ鎖可変領域遺伝子を増幅し、その５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にＮｈｅＩ制限酵素部位が含まれるようにした。反応条件は、５０℃で３０分；９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定により検証し、その結果から、配列が５’ＲＡＣＥの配列と完全に一致することが実証された。配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、４Ｃ８重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本実施例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨと命名した。
【００２５】
配列決定により検証された正しいｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬを鋳型として利用して、ＨセンスプライマーＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＧＧ ＣＴＧおよびＬアンチセンスプライマーＧＡＣ ＡＧＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ Ｇを設計し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを用いてＶＬ遺伝子を増幅し、その５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にヒト抗体軽鎖定常領域の５’末端に相補的な配列が含まれるようにした。反応条件は、９４℃で５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で１０分であった。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収してｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定により検証し、その結果から、配列が５’ＲＡＣＥの配列と完全に一致することが実証された。配列番号１１および配列番号１２は、それぞれ、４Ｃ８軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本実施例において、正しいクローンをｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬと命名した。
【００２６】
キメラ抗体ｃ４Ｃ８の構築
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ後、配列決定により正しいとされた上記のプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＨを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、回収した後に得られた４３０ｂｐの消化断片を、同じくＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩによって消化したプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨとライゲーションし、正しいクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した後、対象の断片を回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）とライゲーションし、真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）を構築した。
【００２７】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ後、配列決定により正しいとされた上記プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬを、反応条件が、５０℃で３０分；９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であるオーバーラッピングＰＣＲを用いて、正しいクローンｐＧＥＭ−Ｔ／ＶＬの軽鎖定常領域に直接融合し、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が含まれ、３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位が含まれるＰＣＲ産物ＶＬＣＬを得た。アガロースゲル電気泳動により精製した後、ＰＣＲ産物を回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、陽性クローンを選択し、配列決定した。配列決定により正しいとされたＶＬＣＬ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによってｐＧＥＭ−Ｔベクターから切断し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）にクローニングして真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）を構築した。
【００２８】
３×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３．５ｃｍの組織培養皿に播種し、細胞が９０〜９５％融合するまで培養した時にトランスフェクトした：プラスミド１０μｇ（プラスミドｃＤＮＡ３．１（＋）（ＶＨＣＨ）４μｇ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ＶＬＣＬ）６μｇ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを、それぞれ、血清を含まないＤＭＥＭ培地５００μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中、培地皿中の血清含有培地を、血清を含まないＤＭＥＭ培地３ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をプレートに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地２ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２５０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含有する選択培地に移して耐性クローンを選択した。細胞培養物の上澄みを利用し、ＥＬＩＳＡによって、高度に発現しているクローンを選択した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の耐性クローン培養物の上澄みまたは標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間加温インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ）を加え、３７℃で１時間加温インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、Ａ４５０値を測定した。選択によって得られた、高度に発現しているクローンを、血清を含まない培地で拡大培養し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラム（ＧＥ ｃｏｍｐａｎｙ）によって、キメラ抗体ｃ４Ｃ８を単離し精製した。精製された抗体を、ＰＢＳを用いて透析し、紫外線吸収法を定量化に用いた。
【実施例３】
【００２９】
ヒト化抗体４Ｃ８の構築
マウス由来４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域（Ｆｖ）の三次元構造の相同性モデリング
マウス由来４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ｃｏｍｐａｎｙのＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩソフトウェアパッケージにより作製した。まず、４Ｃ８の重鎖可変領域タンパク質および軽鎖可変領域タンパク質の鋳型タンパク質を、それぞれ、ＢＬＡＳＴプログラムによってＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）で検索した。最も高い相同性を有する抗体１Ａ４Ｊを、図１に示したような、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩプログラムを用いた４Ｃ８の三次元構造モデリングのための、４Ｃ８のモデリング鋳型として選択した。
【００３０】
ヒト化４Ｃ８抗体の設計および構築
ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、４Ｃ８の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に最も類似したヒト由来の鋳型を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで検索した。４Ｃ８の重鎖可変領域と最も高い相同性を有するヒト由来抗体は、６８％の類似性を持つヒト抗体ＡＡＣ１８２０６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＣ１８２０６）であり、４Ｃ８の軽鎖可変領域と最も高い相同性を有するヒト由来抗体は、８０％の類似性を持つＢＡＣ０１７３４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＣ０１７３４）である。従って、ＡＡＣ１８２０６およびＢＡＣ０１７３４を、それぞれ、４Ｃ８の重鎖および軽鎖のヒト化鋳型として使用した。まず、４Ｃ８の重鎖ＣＤＲ領域および軽鎖ＣＤＲ領域を、それぞれ、ヒト化鋳型ＡＡＣ１８２０６およびＢＡＣ０１７３４にグラフティングしてＣＤＲがグラフティングされた抗体、それぞれ重鎖および軽鎖に対して、ｈ４Ｃ８Ｈａおよびｈ４Ｃ８Ｌａを形成した。ｈ４Ｃ８Ｈａの可変領域およびｈ４Ｃ８Ｌａの可変領域のアミノ酸配列を図２に示す。ヒト化抗体の重鎖可変遺伝子および軽鎖可変遺伝子（ｈ４Ｃ８ＶＨａおよびｈ４Ｃ８ＶＬａ）を全遺伝子合成により合成し、次いでｈ４Ｃ８ＶＨａ遺伝子およびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＨベクターを鋳型として用いて、オーバーラッピングＰＣＲによってヒト化抗体の重鎖遺伝子を合成した。反応条件は、９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。加えて、このヒト化重鎖遺伝子は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位およびシグナルペプチド遺伝子配列、３’末端に翻訳停止コードＴＡＡおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するようにした。シグナルペプチドの配列は配列番号：（ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡ）に示す。最後に、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、対象のバンドを回収し、ｐＧＥＭＴベクターにクローニングして陽性クローンを選択し配列決定した。正しい配列を持つクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ヒト化抗体の重鎖断片Ｈ４Ｃ８ＶＨａＣＨを回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とライゲーションして、ヒト化重鎖真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＨａＣＨ）を構築した。
【００３１】
ｈ４Ｃ８ＶＬａ遺伝子およびｐＧＥＭ−Ｔ／ＣＬベクターを鋳型として用いて、オーバーラッピングＰＣＲによって、ヒト化抗体の軽鎖遺伝子を合成した。反応条件は、９５℃で１５分；９４℃で５０秒、５８℃で５０秒、７２℃で５０秒を３０サイクル；７２℃で１０分であった。このようにして得られたＰＣＲ産物はｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬであり、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位およびシグナルペプチド遺伝子配列、３’末端に翻訳停止コードＴＡＡおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。シグナルペプチドの配列は配列番号：（ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡ）に示す。正しい配列を持つクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ヒト化抗体の軽鎖断片Ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬを回収し、同じくＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とライゲーションして、ヒト化重鎖真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬａＣＬ）を構築した。
【００３２】
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を、０．８×１０５／ウェルで２４ウェルの組織培養プレートに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０／ＤＭＥＭ混合培地（１６／ＤＭ培地）を用いて９０〜９５％融合するまで培養してトランスフェクションを行った：プラスミド１μｇ（軽鎖発現ベクター０．６μｇ、重鎖発現ベクター０．４μｇ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌを、それぞれ、血清を含まない１６／ＤＭ培地５０μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中に、２４ウェル培養プレート中の血清含有培地を、血清を含まない１６／ＤＭ培地０．５ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をウェルに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで２０％ＦＣＳ含有１６／ＤＭ培地０．５ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。７２時間後、培養物の上澄みを分析のために利用し、培養物の上澄み中の抗体含有量をＥＬＩＳＡにより決定した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の培養物の上澄みおよび標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトκを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、ＯＤ４５０値を測定した。
【００３３】
ヒトＫＧ−１ａ細胞を、細胞１×１０６個／ｍｌになるように２％ＦＣＳ−ＰＢＳに再懸濁させ、ヒト化抗体をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞培養物の上澄みを、異なる希釈度で、それぞれ加え、それらを４℃で６０分間インキュベートし、次いで細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、次いでＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を細胞に加え、４℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって分析し、蛍光強度を計算した。その結果から、ｃ４Ｃ８キメラ抗体と比べて、ｈ４Ｃ８Ｈａおよびｈ４Ｃ８Ｌａから構成されるヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）は、その活性がほとんど完全に失われることが示されている（図３）。それゆえ、高い親和性を持つヒト化抗体を得るために、さらに、４Ｃ８抗体の結合活性にもしかしたら影響しうるＦＲ領域のマウス由来残基について分析および復帰突然変異を行う必要がある。
【００３４】
モデリングした４Ｃ８モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造を分析することにより、ＣＤＲ領域の周囲５Å内の９つのフレームワーク残基、Ｌ３Ｌｅｕ、Ｌ４Ｌｅｕ、Ｌ４６Ｌｅｕ、Ｈ２Ｉｌｅ、Ｈ４６Ｌｙｓ、Ｈ６８Ａｌａ、Ｈ６９Ｌｅｕ、Ｈ８２ａＡｓｎ、およびＨ９１Ｐｈｅが、ヒト化鋳型の対応する位置と異なると同時に、原型である抗体のＣＤＲコンホメーションに影響する可能性があることが発見された。構築されたＣＤＲグラフティング抗体内にこれらのマウス由来アミノ酸残基を残したままヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈｂ／ｈ４Ｃ８Ｌｂ）を得ることができる。ｈ４Ｃ８Ｈｂおよびｈ４Ｃ８Ｌｂの可変領域に対するアミノ酸配列を図２に示す。配列番号５および６は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｈｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。配列番号７および８は、それぞれ、ｈ４Ｃ８Ｌｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ｈ４Ｃ８Ｈｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ）、ＨＣＤＲ２（ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧ）、ＨＣＤＲ３（ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹ）である（図２−１のＨ４Ｃ８ＶＨｂ参照）。ｈ４Ｃ８Ｌｂの３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれ、ＬＣＤＲ１（ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ）、ＬＣＤＲ２（ＱＶＳＮＲＦＳ）、ＬＣＤＲ３（ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ）である（図２−２のＨ４Ｃ８ＶＬｂ参照）。ヒト化抗体の重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子（ｈ４Ｃ８ＶＨｂ／ｈ４Ｃ８ＶＬｂ）を、それぞれ、オーバーラッピングＰＣＲを用いて合成し、ヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）についてと同じ方法を用いて軽鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＬｂＣＬ）および重鎖発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｈ４Ｃ８ＶＨｂＣＨ）を構築した。次いで、軽鎖発現ベクターおよび重鎖発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に共トランスフェクトした。フローサイトメトリーアッセイを行って抗体の抗原結合活性を決定し、その結果、ＫＧ−１ａに対するこの抗体の結合能は４Ｃ８キメラ抗体の結合能と同様であることが示され、よってこのヒト化抗体（ｈ４Ｃ８Ｈａ／ｈ４Ｃ８Ｌａ）をｈ４Ｃ８として設計した。
【実施例４】
【００３５】
ヒト化抗体の安定発現および精製
３×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６１８）を、３．５ｃｍの組織培養皿に播種し、細胞が９０〜９５％融合するまで培養した時にトランスフェクトした：プラスミド１０μｇ（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｖｈ４Ｃ８ＨｂＣＨ）４μｇ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＲＯ（＋）（Ｖｈ４Ｃ８ＬｂＣＬ）６μｇおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌを、それぞれ、血清を含まないＤＭＥＭ培地５００μｌに溶解させ、室温で５分間静置し、上記２種の液体を混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−リポソーム複合体を形成した。この期間中、培地皿中の血清含有培地を、血清を含まないＤＭＥＭ培地３ｍｌと入れ替え、次いで形成されたＤＮＡ−リポソーム複合体をプレートに加え、ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養し、次いで１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地２ｍｌを補充し、ＣＯ２インキュベーター内で持続的に培養した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２５０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含有する選択培地に移して耐性クローンを選択した。細胞培養物の上澄みを利用し、高度に発現しているクローンを選択した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃で一晩置き、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間、ブロッキングし、試験対象の耐性クローン培養物の上澄みまたは標準試料（ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、κ）を加え、３７℃で２時間加温インキュベートし、化合反応のためにＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ）を加え、３７℃で１時間加温インキュベートし、ＴＭＢを加えて３７℃で５分間作用させ、最後にＨ２ＳＯ４を用いて反応を止め、Ａ４５０値を測定した。選択によって得られた、高度に発現しているクローンを、血清を含まない培地で拡大培養し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラム（ＧＥ ｃｏｍｐａｎｙ）によって、ヒト化抗体ｈ４Ｃ８を単離し、精製した。精製された抗体を、ＰＢＳを用いて透析し、紫外線吸収法を定量化に用いた。
【実施例５】
【００３６】
競合阻害試験
固定したほぼ飽和濃度の蛍光標識精製抗体ＦＩＴＣ−４Ｃ８と、非標識抗体の段階希釈液を、それぞれ混合し、次いで、標的のＫＧ−１ａ細胞に加え（１×１０６個／ｍｌ）、４℃で６０分間インキュベートし、細胞を１％のＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、分析のためにＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いたＦＣＭによって試験した。ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｈｕ１２Ｆ６を対照として用いた（調製については、Ｌｉ ＢＨ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｄａｉ ＪＸ， Ｊｉ ＪＪ，Ｑｉａｎ ＷＺ，Ｚｈａｎｇ ＤＰ，Ｈｏｕ Ｓ，Ｇｕｏ ＹＪ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １２Ｆ６ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５，１１６（４）：４８７−９８を参照されたい）。競合抗体の各濃度について、管を３連で用意した。競合抗体が存在しない場合に得られた蛍光強度の平均を示す最大蛍光強度を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００３７】
試験結果を図４に示す。抗体ｈ４Ｃ８は、蛍光標識抗体ＦＩＴＣ−４Ｃ８のＫＧ−１ａへの結合を完全に遮断し、ｈ４Ｃ８とＦＩＴＣ−４Ｃ８のＩＣ５０値はほぼ同じであり、このことは、このヒト化抗体が、原型であるマウス由来抗体の特異性および親和性と同様の特異性および親和性を有することを示唆している。
【００３８】
【表１】
【実施例６】
【００３９】
免疫磁気ビーズの調製
活性化：ｐＨ６．０、０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４Ｔｗｅｅｎ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を活性化緩衝溶液として利用し、カルボキシルビーズ（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢｉｏＭａｇ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＢＭ５７０），ＵＳＡ）２ｍｇを２ｍｌの遠心分離管に入れ、活性化緩衝溶液５００μｌを加えてボルテックスミキサーで均一に混合し、次いで遠心分離管をＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｒａｃｋ上に置き、磁気ビーズが完全に吸着した後、上澄みを小型の真空ポンプによって抽出した。活性化緩衝溶液５００μｌを加えて磁気ビーズを２回、洗浄し直し、次いで、活性化緩衝溶液４８５μｌを磁気ビーズに加え、カルボジイミド（ＥＤＣ、最初の濃度０．５ｇ／ｍｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、最初の濃度０．２５ｇ／ｍｌ）をそれぞれ２．５ｍｇ加え、ボルテックスミキサーで均一に混合して、磁気ビーズの表面のカルボキシル基２ｍｇを室温で３０分間、活性化させた。
【００４０】
コンジュゲート：ｐＨ７．４、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸Ｔｗｅｅｎ溶液（ＰＢＳＴ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）５００μｌをコンジュゲート緩衝液として用い、活性化緩衝溶液５００μｌを加えて活性化した磁気ビーズを３回洗浄し直し、次いでコンジュゲート緩衝液５００μｌを加えて磁気ビーズを２回洗浄した。コンジュゲート緩衝液４７５μｌを加えて洗浄した磁気ビーズを再懸濁させ、６ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ３４抗体２５μｌを加え、磁気ビーズ上の活性化したカルボキシル基を、室温で３時間、抗ＣＤ３４抗体のアミノ基と反応させ、次いで抗体を磁気ビーズの表面にコンジュゲートして、免疫磁気ビーズを得た。
【００４１】
ブロッキング：コンジュゲートした磁気ビーズをコンジュゲート緩衝液５００μｌで２回洗浄し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有コンジュゲート緩衝液５００μｌを加えて３０分間磁気ビーズをブロッキングした。
【００４２】
貯蔵：コンジュゲートした磁気ビーズをコンジュゲート緩衝液５００μｌで２回洗浄し、磁気ビーズを、０．０２％ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡを含有するｐＨ７．４、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸Ｔｗｅｅｎ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）５００μｌ中に再懸濁させ、次いで使用するために冷蔵庫内で４℃で貯蔵した。
【実施例７】
【００４３】
ＣＤ３４免疫磁気ビーズによるＣＤ３４＋細胞系の選別
ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ（ヒト白血病細胞）とＣＤ３４−Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ腫細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏで１：１０の比率で混合し、ヒト臍帯血単核細胞（または動員された末梢血単核細胞）を模倣する。
【００４４】
０．１ＭのＰＢＳ溶液の調製：ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ３．４８８ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１０００ｍｌにし、ｐＨ７．４に調整し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、４℃で貯蔵する。
【００４５】
免疫磁気ビーズ選別緩衝液の調製：２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ溶液。
【００４６】
選別緩衝液を細胞１０７個当たり９０μｌの比率で加えて上記の混合細胞を再懸濁させ、
上記の細胞懸濁液に、ＣＤ３４免疫磁気ビーズを細胞１０７個当たり１０μｌの比率で加え、混合して４〜８℃で１５分間インキュベートし、
選別緩衝液を細胞１０７個当たり１０００μｌの比率（１０７個未満の細胞に対しても１０００μｌを適用できる）で加えて細胞を再懸濁させ、遠心分離管を磁場に置き、上澄みを取り除き、
上記のステップを２回繰り返し、
細胞沈殿物を、選別緩衝液５００μｌを用いて再懸濁させ、ＣＤ３４＋ＫＧ−１ａ細胞を得る。
【００４７】
細胞を、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３４０６６８、選別抗体に対する競合作用を有さない）で染色し、選別によって得られた細胞の純度は９５％を超えることが同定され、選別細胞を計測したところ、ＣＤ３４＋細胞の選別収率は９０％を超えた。結果を図５に示す。
【実施例８】
【００４８】
ＣＤ３４免疫磁気ビーズによるヒト臍帯血幹細胞の選別
ヒト臍帯血からＣＤ３４＋血液幹細胞を選別した。
【００４９】
０．１ＭのＰＢＳ溶液の調製：ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ ３．４８８ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１０００ｍｌにし、ｐＨ７．４に調整し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、４℃で貯蔵する。
【００５０】
免疫磁気ビーズ選別緩衝液の調製：２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ溶液。
【００５１】
健康な母性臍帯血からＦｉｃｏｌｌを用いて単核細胞を単離する。
【００５２】
選別緩衝液を細胞１０７個当たり９０μｌの比率で加えて単核細胞を再懸濁させ、
上記の細胞懸濁液に、ＣＤ３４免疫磁気ビーズを細胞１０７個当たり１０μｌの比率で加え、混合して４〜８℃で１５分間インキュベートし、
選別緩衝液を細胞１０７個当たり１０００μｌの比率（１０７個未満の細胞に対しても１０００μｌを適用できる）で加えて細胞を再懸濁させ、遠心分離管を磁場に置き、上澄みを取り除き、
上記のステップを２回繰り返し、
細胞沈殿物を、選別緩衝液５００μｌを用いて再懸濁させ、ＣＤ３４＋血液幹細胞を得る。
【００５３】
細胞を、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３４０６６８、選別抗体に対する競合作用を有さない）で染色し、選別によって得られた細胞の純度は９５％を超えることが同定され、選別細胞を計測したところ、ＣＤ３４＋細胞の選別収率は９０％を超えた。結果を図６に示す。
【００５４】
この結果は、我々が調製したＣＤ３４免疫磁気ビーズを用いた臍帯血幹細胞の選別によって得られた純度および収率が、臨床に適用するための必要性に見合い、骨髄血幹細胞の臨床的移植において使用できることが見込まれることを示している。
【実施例９】
【００５５】
ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０の競合阻害試験
ほぼ飽和濃度のＦＩＴＣ−ＣＤ３４（Ｍｙ１０）（ＢＤ、３４８０５３）ならびに非標識の精製抗体ｈ４Ｃ８および非標識のＭｙ１０（マウス抗ヒトＣＤ３４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ８４８３、抗Ｍｙ１０クローン）の段階希釈液を、血清を含まないハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、１２０４５）で培養した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）により精製した後、培養物の上澄みをそれぞれ混合し、次いで標的細胞ＫＧ−１ａ（１×１０６／ｍｌ）に加え、４℃で６０分間インキュベートし、細胞を１％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、分析のためにＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いたＦＣＭにより試験した。ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｈｕ１２Ｆ６を対照として用いた（調製については、Ｌｉ ＢＨ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｄａｉ ＪＸ， Ｊｉ ＪＪ，Ｑｉａｎ ＷＺ，Ｚｈａｎｇ ＤＰ，Ｈｏｕ Ｓ，Ｇｕｏ ＹＪ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １２Ｆ６ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５，１１６（４）：４８７−９８を参照されたい）。競合抗体の各濃度について、管を３連で用意した。競合抗体が存在しない場合に得られた蛍光強度の平均を示す最大蛍光強度を用いてＩＣ５０値を計算した。この試験を３回繰り返し、統計的な結果を得る。表２を参照されたい。
【００５６】
試験結果を図７に示す。抗体ｈ４Ｃ８によって遮断される蛍光標識抗体ＦＩＴＣ−Ｍｙ１０のＫＧ−１ａ細胞への結合についてのＩＣ５０値は、マウス由来モノクローナル抗体Ｍｙ１０によるものよりも小さく（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）、それゆえ、ｈ４Ｃ８の親和性はマウス由来モノクローナル抗体Ｍｙ１０よりもすぐれている。
【００５７】
【表２】
【実施例１０】
【００５８】
ヒト化抗ＣＤ３４抗体およびマウス由来抗体Ｍｙ１０の磁気ビーズへのコンジュゲート後の臍帯血幹細胞選別に対する比較試験
マウス抗ヒトＣＤ３４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ８４８３、抗Ｍｙ１０クローン）を、血清を含まないハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、１２０４５）を用いて培養した。培養物の上澄みをｒＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）により精製し、磁気ビーズ調製条件の必要性に見合った抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Ｍｙ１０）を得た。
【００５９】
Ｍｙ１０およびｈ４Ｃ８を、実施例６の方法に従って磁気ビーズにコンジュゲートして、ＣＤ３４ナノ免疫磁気ビーズを調製した。
【００６０】
ヒト臍帯血幹細胞を、実施例８の方法に従って、Ｍｙ１０およびｈ４Ｃ８ナノ免疫磁気ビーズにより選別した。選別によって得られた陽性細胞を、血球計測プレートにより計測し、２種の磁気ビーズによる選別によって得られた細胞の収率を計算し、選別によって得られた陽性細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ３４（ＢＤ、３４８０５３、８Ｇ１２）によって染色し、２種の磁気ビーズによる選択によって得られた細胞の純度を同定した。染色の結果を図８に示す（左側のピークは選別前の試験結果であり、右側のピークは選別後の試験結果である）。
【００６１】
比較試験の結果を表３に示した。
【００６２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のヒト化抗ＣＤ３４抗体は、原型であるマウス由来抗体の親和性および特異性を保持している。この抗体は、ナノ磁気物質とコンジュゲートして、骨髄造血幹細胞を選別するための免疫磁気ビーズを調製することができる。この抗体を用いると、ＨＡＭＡの出現率が効果的に減少し、造血幹細胞の臨床的移植の安全性が改善される可能性があり、この抗体は、特定の悪性血液病および固形腫瘍の治療に使用することができる。本発明のヒト化抗ＣＤ３４抗体は、遺伝子組換え技術によって得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原結合部位を含むヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体であって、前記抗原結合部位が、
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する第１の可変領域を含む第１ドメインと、
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する第２の可変領域を含む第２ドメインと
を少なくとも含む、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項２】
前記抗原結合部位が、
１）前記第１の可変領域およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン重鎖またはその断片と、
２）前記第２の可変領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン軽鎖またはその断片と
を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項３】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片がγ型であり、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片がκ型またはλ型である、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項４】
配列番号５に示す、第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列と、配列番号７に示す、第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列とを少なくとも含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体をコードするヌクレオチド分子。
【請求項５】
下記の配列、
ａ）前記第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン重鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）前記第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン軽鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と
を含む、請求項４に記載のヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記重鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号１に示され、前記軽鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号３に示される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項７】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を含有する免疫コンジュゲート。
【請求項８】
免疫磁気ビーズである、請求項７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９】
骨髄造血幹細胞／骨髄造血前駆細胞の選別における、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の調製方法であって、
１）請求項４から６のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子を使用して発現ベクターを形質転換し、得られた発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換するステップと、
２）前記宿主細胞を培養するステップと、
３）前記宿主細胞によって発現されたヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を採取、分離および精製するステップと
を含む、方法。
【請求項１】
少なくとも１つの抗原結合部位を含むヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体であって、前記抗原結合部位が、
配列番号６に示すアミノ酸配列を有する第１の可変領域を含む第１ドメインと、
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する第２の可変領域を含む第２ドメインと
を少なくとも含む、ヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項２】
前記抗原結合部位が、
１）前記第１の可変領域およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン重鎖またはその断片と、
２）前記第２の可変領域およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片を含む免疫グロブリン軽鎖またはその断片と
を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項３】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片がγ型であり、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片がκ型またはλ型である、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体。
【請求項４】
配列番号５に示す、第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列と、配列番号７に示す、第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列とを少なくとも含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体をコードするヌクレオチド分子。
【請求項５】
下記の配列、
ａ）前記第１の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン重鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）前記第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列およびヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、免疫グロブリン軽鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列と
を含む、請求項４に記載のヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記重鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号１に示され、前記軽鎖定常領域のヌクレオチド配列が配列番号３に示される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項７】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を含有する免疫コンジュゲート。
【請求項８】
免疫磁気ビーズである、請求項７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９】
骨髄造血幹細胞／骨髄造血前駆細胞の選別における、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体の調製方法であって、
１）請求項４から６のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子を使用して発現ベクターを形質転換し、得られた発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換するステップと、
２）前記宿主細胞を培養するステップと、
３）前記宿主細胞によって発現されたヒト化抗ヒトＣＤ３４抗体を採取、分離および精製するステップと
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５０５８１０（Ｐ２０１１−５０５８１０Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７２３５（Ｐ２０１０−５３７２３５）
【出願日】平成２０年１２月３日（２００８．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１９６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９９２２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１６４０２７）シャンハイ グオジアン バイオ−テック インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月３日（２００８．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００１９６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９９２２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１６４０２７）シャンハイ グオジアン バイオ−テック インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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