ヒドロキシチロソル含有オリーブ抽出物による栄養製品の栄養強化及びヒドロキシチロソルにより栄養強化された栄養製品
【課題】 従来技術に関連する問題点を解決する。
【解決手段】 本発明は、ヒドロキシチロソル高含有組成物の栄養供給により、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用される、抗酸化剤能力が高められた、栄養製品、特に、食料品（即ち、栄養強化食用油及び栄養強化食用油含有製品）及び栄養補助食品（即ち、栄養強化食用油を含有するソフトジェルカプセル）に関する。
【解決手段】 本発明は、ヒドロキシチロソル高含有組成物の栄養供給により、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用される、抗酸化剤能力が高められた、栄養製品、特に、食料品（即ち、栄養強化食用油及び栄養強化食用油含有製品）及び栄養補助食品（即ち、栄養強化食用油を含有するソフトジェルカプセル）に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシチロソル(hydroxytyrosol)含有オリーブ抽出物による栄養製品の栄養強化に関する。また、本発明は、ヒドロキシチロソルにより栄養強化された栄養製品に関し、更に、医療用の用途、特に、心臓血管系疾患（ＣＶＤ）、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療に用いられるオリーブ抽出物及びオリーブ抽出物により栄養強化された栄養製品に関する。
【０００２】
本発明によれば、オリーブ果実又はオリーブオイル抽出残留物（搾り滓）から得られたオリーブ抽出物を食用油に添加し、この食用油を栄養製品に添加する。これにより、ヒドロキシチロソルのレベルが高められる。
【０００３】
更に詳細には、本発明は、ヒドロキシチロソル高含有及び精製組成物の栄養供給により、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用されるべき食用油含有製品の栄養強化に関する。
【背景技術】
【０００４】
英国心臓財団により２００５年に発行された欧州心臓血管系疾患統計増刊号によれば、ＣＶＤはヨーロッパにおける主要な死亡原因であり、毎年４３５万人以上がＣＶＤで死亡している。冠動脈系心臓疾患（ＣＨＤ）それ自体はヨーロッパにおける単一の最も一般的な死亡原因であり、ヨーロッパでは毎年１９５万人がＣＨＤで死亡している。
【０００５】
この増刊号は、ＣＶＤの経済的コストの推計値に関する新規な段落を含んでいた。ＣＶＤのトータルコストは総計１６９０億ユーロに達し、そのうち、１０５０億ユーロは欧州連合（ＥＵ）におけるＣＶＤ治療費であり、６４０億ユーロは喪失された生産性とインフォーマルケアのコストによるものである。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症とも呼ばれる動脈内へのプラーク堆積は、ＣＶＤの主因であり、また、ＣＨＤの最も常習的原因である。動脈内におけるアテローム性動脈硬化症的プラーク堆積は動脈の一般的な障害である。これは、動脈血管壁に脂肪、コレステロール及びその他の物質が堆積し、そして、プラークと呼ばれる硬質物質を生成することにより
発症する。
【０００７】
最後には、プラーク堆積物は動脈の狭窄と柔軟性低下を引き起こす。これは血液の流れを益々困難にする。冠動脈が狭くなると、心臓への血流が低下又は停止し、胸郭の苦痛（持続性アンギナ）、短呼吸、心臓発作及びその他の症状を引き起こす。
【０００８】
プラーク片はバラバラに破壊され、血流に乗って移動することができる。これは心臓発作の一般的な原因である。血塊はプラーク堆積物の周囲にも生成することができる。血塊は血流をブロックする。血塊が心臓、肺又は脳内を移動すると、これは脳卒中、心臓発作又は肺塞栓症を引き起こす。
【０００９】
動脈性高血圧症、血中のトリグリセリド及び総コレステロールの値が高いことや喫煙は、この疾患の進展の一因となるファクターであることが立証されている。最近、研究者らは、これらリスクファクター（危険因子）の幾つかが或る人々の間で密集していることを発見した。これらのリスクファクターの密集はメタボリック症候群として知られているいる。
【００１０】
メタボリック症候群の人々は下記のような密集的リスクファクターを有する。
・中央肥満。これは、腹部（胃部）における余分体重を意味する。
・ブドウ糖と呼ばれるタイプの糖の消化障害（ブドウ糖不耐症）。メタボリック症 候群の患者は通常、高インスリン血症又は２型糖尿病を有する。
・血流中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）及びトリグリセリドの値が高い。
・血流中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）の値が低い。
・高血圧症
【００１１】
メタボリック症候群については究明すべきことが依然として多々あるが、医師は、メタボリック症候群の人々が高いＣＶＤリスクを有することを知っている。多くの研究が、ＬＤＬの生体内酸化がアテローム性動脈硬化症の進展に中心的な役割を演じていることを証明している(Knight, 1995; Witzum, 1994)。
【００１２】
地中海ダイエットの基本的脂肪成分であるオリーブオイルはＣＨＤ(De Lorgeriら，1999；Hertogら，1993; Mattson及びGrundy, 1985)及び或る種の癌(d'Amicis及びFranci, 1999; Bragaら, 1998; Trichopoulouら, 1995; Matin-morenoら, 1994)の低発生率に関連している。
【００１３】
ＬＤＬ酸化を防止するためのオリーブオイル消費の健康上の利点は、その抗酸化性及びその高一価不飽和脂肪酸含量の両方に関連づけられるであろう(Nicolaiewら, 1998)。バージンオリーブオイルのフェノール系化合物類は、オリーブオイルを酸化から保護する強力な抗酸化特性を有する(Visioliら, 1998; Paradopoulos及びBoskou, 1991)。更に、フェノール系化合物類は、健康上の肯定的な利点も示した(Owenら, 2000; Mannaら, 1999)。バージンオリーブオイル中の最も代表的なフェノール系化合物類の幾つかは、ヒドロキシチロソル、チロソル及びこれらの幾つかの誘導体類であり、これらはオリーブオイル製造の過程でオリーブ果実から抽出される(Brenesら, 1999)。
【００１４】
ヒドロキシチロソルはオリーブオイル中に存在し、下記の化学式で示される。
【００１５】
同時係属特許出願第ＥＰ０７００１７９１号及びＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００１７３号明細書には、オリーブ及び／又はオリーブオイル抽出残留物からのヒドロキシチロソルの製造方法及び製造装置が記載されている。これらの出願の発明は、食品、医薬及び化粧品工業の分野におけるヒドロキシチロソル源として使用されるべきヒドロキシチロソル含有製品又は抽出物の製造を目的としている。これらの出願明細書の内容を参照として本明細書中に組み込む。
【００１６】
幾つかの官能特性が、エキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイル中のオリーブポリフェノール類により顕在化されることは周知である。これらオリーブオイルの官能特性は消費者によるオリーブオイル受容性に大きな影響を及ぼす。幾つかのフェノール類は主に苦味の味覚感覚を顕現させる。しかし、その他のフェノール系分子類は、口蓋内及び味蕾内の三叉神経の遊離端を刺激し、辛味、渋味及び金属風味などの化学的な感覚を生じさせる。オリーブの果実に苦味を与えるフェノール系化合物であるオレウロペイン(oleuropein)は、脂溶性ではなくむしろ水溶性である。従って、果実を圧搾したとき、オレウロペインは、オリーブオイル内には殆ど移行しない。従って、エキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイル中のオレウロペインの平均含有量はそれぞれ１ｐｐｂ及び１１ｐｐｍ程度である。
【００１７】
オレウロペインはオリーブオイル内に存在し、下記の化学式で示される。
【００１８】
それにもかかわらず、多数のオレウロペイン関連化合物類は、オレウロペイン自体よりも一層油溶性であり、オレウロペインアグリコン（例えば、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形、ＡＯＡ）の異性体又は異性体類の形及びヒドキシチロソル又はチロソルに結合したエレノール酸（それぞれ、３，４−ＤＥＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡと命名されている）のジアルデヒドの形でオイル中に高含量で存在する。これらは、Gutierrez-Rosales及び共著者らの, J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6021-6025（非特許文献１）によれば、主に苦味の原因であるオリーブポリフェノール類である。
【００１９】
オレウロペインアグリコン（例えば、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形）はオリーブオイル内に存在し、下記の化学式で示される。
【００２０】
Frank及び共著者らの, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238（非特許文献２）には、オレウロペイン誘導体類の苦味の感覚閾値を示すための、「味希釈分析法」と呼ばれる手法が記載されている。苦味は、サンプルの一連の希釈水溶液を作製し、次いで、トライアングルテストで判定されるように希釈サンプルを水と判別できる濃度を発見するまで、濃度の増大に従ってこれらを味見することによって評価された。少なくともこれらの化合物類については、２２５ｎｍにおける吸光度（Ｋ２２５値）と苦味との直接的な相関関係は存在しないことも示された。Mateoら、J. Am. Oil. Chem. Soc. 2004, 81, 71-75（非特許文献３）は、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形（オレウロペインを、Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グコシダーゼで加水分解することにより得た）と苦味との間の相関関係を立証した。
【００２１】
Andrewesら、J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1415-1420（非特許文献４）は、ポリフェノール類とオリーブオイル辛味との間の関係を立証した。ｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡは、多くのオリーブオイルで味わう焼けるような感覚の根元である。
【００２２】
２００５年に、Beauchamp及び共著者ら、Nature 2005, 437, 45-46（非特許文献５）は、異なるエキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイルから単離されたｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡの辛味強度を測定し、この分子が、咽喉刺激の原因となる基本的成分であることを確認した。
【００２３】
要約すれば、オリーブポリフェノール類によるオリーブオイルの栄養強化に基づく技法を使用して抗酸化能力を増大するための如何なる設定も、オイルの本来の官能特性を変性してはならず、苦味をもたらすオリーブポリフェノール類の量を増大させてもならない。そうしなければ、オイルの官能特性が事後的に変性され、その結果、過剰な苦味、辛味及び／又は渋味による不愉快な風味を生じ、結果的に、多くの消費者から拒絶されてしまう。
【００２４】
ポリフェノール類及びヒドロキシチロソルを食料品に添加することは周知である。米国特許第６９４２８９０号公報（特許文献１）には、オリーブ果実由来の固体を食料品に添加し、抗酸化剤（特に、オリーブポリフェノール類）を増大させる、食料品の栄養強化方法が記載されている。この方法は、脱苦味処理を受けていないオリーブから得られた固体で栄養強化されるべき食料品（例えば、植物油）を或る時間にわたって培養し、次いで、オイルから固形物を濾別しなければならない。この方法に関連する主要な問題点は、植物油の官能特性の変性に関連し、過剰な苦味及び／又は渋味がオイルのポリフェノール類含量の増大に伴って生成されるときに、不愉快な風味を生じることである。米国特許第６９４２８９０号公報に開示された発明によれば、特に、エキストラバージンオリーブオイルのオリーブポリフェノール類含量を１４５ｐｐｍから最大５３０ｐｐｍまで増大させるオリーブ固形物を２．５％だけ添加することにより最終製品を製造することにより、この変性を避けることができる。
【００２５】
米国特許第６１６２４８０号公報（特許文献２）には、抗酸化剤による植物油の栄養強化方法が記載されている。苦味除去されていないオリーブを植物油中に１〜３０日間浸漬し、抗酸化剤、特にオリーブポリフェノール類のレベルを増大させる。実施例１によれば、トスカーナ地方で収穫された苦味除去されていないオリーブを１０％添加し、トスカーナ地方のエキストラバージンオリーブオイルと共に３０日間ゆっくりと撹拌すると、エキストラバージンオリーブオイルのオリーブポリフェノール類含量が４２０ｐｐｍから５９１ｐｐｍに増大した。この最大増加量はこの発明により可能になる。この方法は、撹拌することを除けば、オリーブオイル中にオリーブを保存するために使用される周知の方法と実質的に同一である。
【００２６】
米国特許第６９４２８９０号公報及び米国特許第６１６２４８０号公報に記載された方法に関連する主要な問題点は、脂溶性であるポリフェノール類だけがオリーブ固形物又は油中のオリーブ類から（部分的に）抽出されることである。
【００２７】
米国特許第６７４６７０６号公報（特許文献３）には、食品組成物（スプレッド、ヴィネグレット及びトマトソース）の栄養強化方法が記載されている。これらの組成物は、水相中にチロソル及びヒドロキシチロソルを少なくとも１５ｐｐｍの高含量で含有することを特徴とする水相を２０〜１００ｗｔ％含有する。それにもかかわらず、この方法は殆ど効果がない。製造された食品組成物でチロソル及びヒドロキシチロソルの水相中の濃度が５０ｐｐｍ超に達する実施例が皆無である。
【００２８】
米国特許第６３６１８０３号公報（特許文献４）の実施例１３には、実施例４の方法により製造されたオリーブ抽出物を使用することを特徴とする、油中の抗酸化活性を高めることができる方法が記載されている。それにもかかわらず、対照サンプルの抗酸化活性（１ｇ当たり０．１８ｍＭトロロックス当量）は、この方法により約３倍（１ｇ当たり０．５３ｍＭトロロックス当量）までしか高められなかった。米国特許第６３６１８０３号公報の発明は、許容可能な純度品質を有するヒドロキシチロソルを含有するオリーブ抽出物を製造するために、有機溶媒（特に、極性溶媒）を使用しなければならない。極性水性溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル又はアセトンから選択され、極性油性溶媒は、例えば、エステル類、アミド類、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ＤＭＦ及びこれらの混合物類から選択される。例えば、有毒溶媒であるメタノールなどの有機溶媒の使用は好ましくない。特に、得られた最終製品が栄養分野で使用される場合には、有機溶媒の使用は好ましくない。
【００２９】
有機溶媒（及び或る場合には有毒な有機溶媒）の使用により生じる問題点に加えて、この方法に関連する主な問題点は、実施例１３（抗酸化剤組成物）に開示されたオリーブ抽出物濃厚物の再溶解に水／エタノール／酢酸混合物を必要とすることであり、抽出物を予め溶解させ、そして、栄養強化するべきオイル中に安定なエマルジョンを生成しなければならない。従って、この方法は栄養分野では不便である。
【００３０】
イタリア特許第０１３２６５５３号公報（特許文献５）には、オリーブ葉又は植生水から得られた抽出物をオリーブオイルに添加することにより得られた栄養強化オリーブオイルが記載されている。この抽出物は全てのタイプのポリフェノール類に富んでいる。すなわち、この抽出物は低純度のヒドロキシチロソルを有する。この特許及び前記の特許の問題点は主に、ポリフェノール類の総量に対して遊離ヒドロキシチロソルの量が低すぎることである。その他のポリフェノール類に対するヒドロキシチロソルの量が低ければ低いほど、オイル中の同じ量の遊離ヒドロキシチロソルを含有する栄養強化製品の苦味が強くなる。
【００３１】
米国特許第５９９８６４１号公報（特許文献６）は、苦味を増大させることなく、オリーブオイル中のポリフェノール類の総含量を高める方法に関する。この方法を実施するために、オリーブオイルは、ポリフェノール類と脱苦味酵素（例えば、Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼ（実施例１））を含有する水溶液で乳化される。その後、水中には溶解性であるが、油中には不溶性である、これら生成ポリフェノール類の損耗を避けるために、水は蒸発又は限外濾過により除去する。この方法の問題点は、非常に長時間（実施例によれば少なくとも２４時間かかり、１００時間に達することもある）を要すること、及び、オレウロペインアグリコン及び糖類を含む酵素反応の全ての生成物がオイル中に残留することである。
【００３２】
β−グルコシダーゼ（例えば、Sigma社から購入したアーモンド由来のもの）によるオレウロペインの加水分解は、通常、５０マイクロモルの閾値で苦味が検知されたオレウロペインアグリコンの異性体（又は異性体類）の製造のために幾人かの研究者により使用されていることに注目すべきである（Frank及び共著者, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238）。また、Mateoら, J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81, 71-75は、（Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼによるオレウロペインの加水分解により得られた）オレウロペインアグリコンのアルデヒド形と苦味との間の相関関係を立証した。換言すれば、米国特許第５９９８６４１号公報に記載された発明では、酵素加水分解の結果は、味見したときにオイルに苦味を与えるが、Ｋ２２５テストでは検出できないポリフェノール系化合物類などのような多数の副生物をもたらすことである。
【００３３】
また、蒸発による水分除去は、バージンオリーブオイルの官能特性に悪影響を及ぼすことも考慮すべきである。なぜなら、オリーブオイルの独特な芳香の元となる殆どの揮発性物質類は蒸発処理中に水と共に抽出されてしまうからである。
【００３４】
要約すれば、前記の方法は、長過ぎるか、又は複雑過ぎるか、或いは、栄養分野にとって苛酷過ぎるか、若しくはこれら全てである。更に、強過ぎる苦味、高すぎる刺激味強度又は高すぎる糖及び副生物含量を有さず、しかも、芳香揮発成分を失うことなく、食用油中に取り込むことができるヒドロキシチロソルの量が低すぎるので、酸化変性に対してＬＤＬを殆ど保護することができない。オイル中に取り込まれたポリフェノール類の殆どがヒドロキシチロソルよりも高い油溶性を特徴とするセコイリドイド類（オレウロペイン関連化合物類）であること、その結果として、オレウロペインアグリコン（ＡＯＡ）、３，４−ＤＥＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡとして、ヒドロキシチロソルよりも高い含量でオイルに取り込まれること、及び、これらオリーブポリフェノール類が主に苦味及び刺激味の元となることなどにより、前記の全ての方法は、総オリーブポリフェノール類を高含量で有するが、これら油中に存在する総オリーブポリフェノール類に対してヒドロキシチロソルを低含量でしか有しないオリーブオイルが得られるだけであることも注目しなければならない。オリーブオイルの官能特性を望ましくない形に変化させることができるこれらセコイリドイド類の取り込みは、実際に、前記の全ての方法で使用されるオリーブポリフェノール類源に直接関連しており、実際に、ヒドロキシチロソル中に低含量で及び／又は低純度で存在する。
【００３５】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】米国特許第６９４２８９０号公報
【特許文献２】米国特許第６１６２４８０号公報
【特許文献３】米国特許第６７４６７０６号公報
【特許文献４】米国特許第６３６１８０３号公報
【特許文献５】イタリア特許第０１３２６５５３号公報
【特許文献６】米国特許第５９９８６４１号公報
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Gutierrez-Rosalesら, J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6021-6025
【非特許文献２】Frankら, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238
【非特許文献３】Mateoら、J. Am. Oil. Chem. Soc. 2004, 81, 71-75
【非特許文献４】Andrewesら、J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1415-1420
【非特許文献５】Beauchampら、Nature 2005, 437, 45-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の目的は、前記の従来技術に関連する問題点を解決し、そして、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用ではあるが、栄養強化食品の官能特性の望ましからざる変性を避けるためのヒドロキシチロソル源として使用されるべき栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用されるべきヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とする栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００４０】
本発明の他の目的は、ヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とするにもかかわらず、安定かつ耐久性のあるエマルジョンの形の、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００４１】
本発明の更に別の目的は、極めて純度の高いヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とする栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
これらの目的は、オリーブ抽出物を有する栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供する本発明により達成される。
【００４３】
オリーブ果実及びオリーブオイル抽出副生物から得られる前記のような溶剤不含有天然オリーブ抽出物の製造方法は、栄養強化食品の官能特性を不愉快な形に変性することなく、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品内の抗酸化能力を、未だかつて決して記載されたことのない程度に高めることができる。従って、本発明は抗酸化剤ヒドロキシチロソル高含有オリーブ抽出物の製造方法に関する。
【００４４】
本発明の別の側面は、下記の工程からなる、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品の製造方法に関する。
（ａ）オリーブ果実又はオリーブオイル抽出残留物若しくは搾り滓（すなわち、オリーブオイル抽出からの前記のような残留物）から製造され、かつ、ヒドロキシチロソルに富んだ、液状と粉末状の間の適当なオリーブ抽出物を選択する工程。この選択は、栄養強化すべき栄養製品に応じて変化する。好ましくは、食用油の栄養強化のためには、液状のオリーブ抽出物を選択し、少なくとも水を１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のためには固形のオリーブ抽出物を選択する。
（ｂ）前記工程（ａ）で選択されたオリーブ抽出物をオイル及び／又はオイル含有製品に添合し、かつ、混合する工程。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例３参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣ（「高速液体クロマトグラフィー」の略。以下同じ）により測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図２】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例４参照）の抗酸化能力と、ヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図３】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例５参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図４】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例６参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図５】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例７参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図６】ホモジナイザーを使用して製造されたか、又はホモジナイザーを使用せずに製造された、液状オリーブ抽出物及びエキストラバージンオリーブオイルのエマルジョンの粒度分布曲線からなるグラフ図である。
【図７】ラットのトリグリセリドに対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図８】ラットの動脈硬化指数（総コレステロール値／ＨＤＬコレステロール値）に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図９】ラットの血漿中の総抗酸化能力（ＴＡＣ）に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図１０】ラットの収縮期血圧に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図１１】ラットの動脈硬化指数（総コレステロール値／ＨＤＬコレステロール値）に対する、本発明による高純度ヒドロキシチロソルに富んだオリーブ果実抽出物の効果を示すグラフ図である。図１１は実施例１２に関連する。この実施例では、動物群は表６により組織化された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の栄養製品は、ヒドロキシチロソルを少なくとも３０ｐｐｍ、好ましくは３０ｐｐｍ〜３００００ｐｐｍ含有する。栄養製品が例えば、均質化エマルジョン（好ましくは、マイクロエマルジョン）のような形の栄養強化食用油である場合、及び、栄養製品が前記のような栄養強化食用油を含有する食料品である場合、好ましい範囲は３０〜３００ｐｐｍである。この場合、ヒドロキシチロソル含量は好ましくは４５ｐｐｍ〜７０ｐｐｍの範囲内であり、一層好ましくは、５０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍの範囲内である。栄養製品が例えば、均質化エマルジョン（好ましくは、マイクロエマルジョン）を含有するソフトジェルカプセルのような形の、カプセル化された栄養強化食用油からなる栄養補助食品である場合、ヒドロキシチロソル含量は３００〜３００００ｐｐｍ、好ましくは、５００〜３０００ｐｐｍの範囲内である。
【００４７】
本発明による栄養強化オイルのＫ２２５値（下記の実施例１３及び１４参照）は０．２８以下であり、好ましくは０．２５以下である。更に、前記栄養強化オイルのＡＯＡ含量は、１２０ｐｐｍ未満、好ましくは８５ｐｐｍ未満、一層好ましくは５５ｐｐｍ未満である。
【００４８】
本発明による、かつ、前記のような添加オリーブ抽出物からなる栄養製品は優れた抗酸化能力を示す。
【００４９】
最後に、本発明の第４の側面として、本発明は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療における、栄養製品、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の使用に関する。前記のように、本発明の第１の側面は、高純度の形の抗酸化性ヒドロキシチロソルを大量に含むオリーブ抽出物の製造に関する。従来の問題点は、親水性ヒドロキシチロソルの油中への取り込みを高めることであった。この問題点は、溶媒を使用することなくヒドロキシチロソルを抽出する方法を使用することからなり、かつ、ヒドロキシチロソルを大量に含有し、そして、副生物、糖類および塩類に対して非常に高い純度を特徴とするする最終オリーブ抽出物を提供することができる本発明により解決された。
【００５０】
本発明の或る実施態様では、オリーブオイル抽出の残留物又は搾り滓をヒドロキシチロソル抽出の原料として使用できる。この方法は、本願出願人による同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−０７００１７９１（出願日：２００７年１月２６日）及びＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００１７３（国際出願日：２００８年１月２８日）号明細書に記載されている。別の実施態様では、オリーブ抽出物の製造用の原料として、オリーブ果実を使用する。好ましくは、グリーンオリーブ、一層好ましくは、全形グリーンオリーブを使用する。
【００５１】
前記出願の明細書の教示に従った方法では、抽出残留物又は全形オリーブ果実若しくは圧潰オリーブ果実を、脱イオン水と、均質化／混合する。全形オリーブ果実又は均質化オリーブパルプ素材若しくは残留物素材を水と混合して混合物を生成したら、次の工程において、この混合物の水中で酸性加水分解を行う。この加水分解は、２０℃〜１４０℃、好ましくは７０℃〜１４０℃の範囲内の温度で、更に好ましくは連続的な滅菌システム中で１１０℃〜１４０℃の範囲内の温度で行われる。加水分解を受ける酸性混合物のｐＨ値は１．０〜６．０の範囲内である。加水分解後の混合物は当業者に公知の物理的方法（例えば、濾過及び／又は遠心分離）により清澄化され、加水分解生成物から全形オリーブ果実又は懸濁している固形物を除去し、そして、懸濁液中に固形物を殆ど含まない清澄化された溶液を得る。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記工程に続いて、前記のようにして得られた生成物を少なくとも１回、酸活性化アニオン交換樹脂及び吸着媒非イオン性樹脂から選択される樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、そして、前記クロマトグラフカラムに保持されている生成物を水で溶出する工程を実施する。
【００５３】
本発明の更に別の側面によれば、液状生成物は例えば、逆浸透濃縮法により濃縮される。更に別の工程として、クロマトグラフ精製及び逆浸透濃縮の後、得られた液状生成物を別の実施態様において、マルトデキストリン類のような担体と共に噴霧乾燥することにより固形化する。
【００５４】
前記のようにして得られたオリーブ抽出物はヒドロキシチロソルに非常に富み、出発物質及び副生物を殆ど含有せず、しかも、糖類及び塩類の含量が極めて低い。
【００５５】
前記の方法により得られる抽出物は液状又は固形状の何れの形状であってもよく、そして、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも４０％の純度、好ましくは、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも８０％の純度、更に好ましくは、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％の純度（波長２８０ｎｍで測定されるＨＰＬＣピークエリアにより決定される値）を特徴とする。本発明の好ましい側面によれば、本発明により得られるヒドロキシチロソル含有液状生成物（液状のオリーブ抽出物）は、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）又は一層好ましくは少なくとも４５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも３５％の総フェノール類含量を有する。本発明の更に好ましい側面によれば、本発明により得られるヒドロキシチロソル含有固形生成物（固形のオリーブ抽出物）は、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも２０％の総フェノール類含量を有する。
【００５６】
本発明の好ましい側面によれば、ヒドロキシチロソル含有固形生成物は、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度を有する。
【００５７】
これらの抽出物は有機溶媒を含有せず、また、糖類及び塩類も殆ど含有しない。
【００５８】
本発明のグリーンオリーブ抽出物は、ヒドロキシチロソルの含有量が非常に高く、しかも、ヒドロキシメチルフルフラルの含有量が低いので、オリーブオイル製造の残留物の抽出物として好ましい。これらの抽出物は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療に使用することができる。また、これらの抽出物は栄養補助食品の製造にも使用できる。
【００５９】
本発明の第２の側面は、オリーブ抽出物を有する栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の製造方法、すなわち、いわゆる機能性食品の製造方法に関する。
【００６０】
第１の工程は適当なオリーブ抽出物の選択である。オイルの栄養強化のためには、通常、液状のオリーブ抽出物が選択される。このようなオリーブ抽出物は、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）又は一層好ましくは少なくとも４５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも３５％の総フェノール類含量を有する。このようなオリーブ抽出物の使用はオイルの栄養強化のために好ましい。その理由は、栄養強化オイルの所望の抗酸化能力に達するのに必要なオリーブ抽出物の量が少ないためにオイル中に存在する残留水が殆ど増大すること無く、オリーブ抽出物の安定なエマルジョンを製造できるからである。
【００６１】
実際、高ヒドロキシチロソル含量と、望ましからざる副生物（例えば、ＡＯＡ、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡ）低含量と、糖類及び塩類の実質的無含量の本発明によるオリーブ抽出物は、栄養強化すべきオイル中に添合されたとき、安定なエマルジョンを生成する。実際、例えば、３５％（Ｗ／Ｗ）以上の高ヒドロキシチロソル含量を特徴とするので、高ヒドロキシチロソル含量を特徴とする栄養強化オイルを得るために少量のオリーブ抽出物が好適である。更に、糖類及び塩類を殆ど含まないという、本発明によるオリーブ抽出物の純度のために、オリーブ抽出物を栄養強化すべきオイル中に添合したとき、乳化剤又はその他の添加剤無しであっても、安定なエマルジョンが得られる。その結果、得られた栄養強化オイルは食品、医薬品及び化粧品分野で使用できるという、即時的効果をもたらす。
【００６２】
従って、得られる栄養強化オイルはヒドロキシチロソルを少なくとも３０ｐｐｍ含有し、しかも、悪影響を全く受けていない官能特性を維持する。
【００６３】
水分を少なくとも１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のためには、通常、粉末状のオリーブ抽出物が選択される。このようなオリーブ抽出物のヒドロキシチロソル含量は少なくとも２０％（Ｗ／Ｗ）である。好適な担体は例えば、マルトデキストリン類、乳糖、カゼイネート類等である。このようなオリーブ抽出物の使用は、水分を少なくとも１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のために好ましい。その理由は、このような粉末は取り扱いが簡単であり、しかも、オイル含有製品の所望の抗酸化能力に達するのに使用される範囲内のこのような栄養製品中に完全に溶解するからである。
【００６４】
第２の工程は、選択されたオリーブ抽出物をオイル及び／又はオイル含有製品に添合することからなる。オリーブ抽出物の栄養製品への添合は、各製品の技術的方法に従って混合及び均質化することにより行われる。
【００６５】
オイルの栄養強化は、その技術的製造中にオリーブ抽出物を添合することからなる。一般的に、液状のオリーブ抽出物は所望の重量比でオイルに添加され、制御された温度及び撹拌パラメータの元で完全に混合される。次いで、生成物を静置し、過剰量の水系オリーブ抽出物を除去する必要がある。これを行うために、例えば、常用のデカンテーションなどのような公知の方法を使用することができる。実際、植物油の製造過程で、幾つかの連続的な常用のデカンテーション工程は残留水を除去するために日常的に行われており、また、その製造過程で通常行われる最後のデカンテーション工程の直前に、自然な方法で、オリーブ抗酸化剤をオイルに添合させることができる。水系抽出物中のヒドロキシチロソル含量が高いために、各混合工程で、相当量のヒドロキシチロソルをオイル製品に移行させることができる。油相からデカンテーション除去された水相は通常、少量のヒドロキシチロソルを含有している。従って、更なる使用のために回収される。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様では、液状のオリーブ抽出物はオイルに添加され、制御された温度及び撹拌パラメータに従って、不活性雰囲気（例えば、窒素雰囲気）下で予備混合される。得られた生成物を２段工程均質化手順に従って運転されるホモジナイザー中に供給する。第１工程は、２００〜７００バールの圧力で行われ、第２工程は圧力を３０〜５０バールに維持して行われる。プレエマルジョンの均質化により、安定なエマルジョンを得ることが出来る。本発明の或る実施態様では、純粋なヒドロキシチロソルを水に添加し、得られた溶液をオイルと混合し、そして均質化してヒドロキシチロソルを油相に移行させる。特に、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療に使用する観点から、最終製品内に有機溶媒の痕跡が残らないようにするために、本発明による天然抽出物を使用することが好ましい。
【００６７】
固形のオイル含有製品の栄養強化は、その技術的製造中にオリーブ抽出物を添合し、そして混合することからなる。一般的に、オイル含有製品の製造方法は、（ａ）植物油及び／又は植物脂肪及び場合により、別の脂肪親和性成分類からなる油相の存在、（ｂ）前記（ａ）の油相に、制御された撹拌及び温度範囲の元での乳化剤の添加からなる乳化工程、及び（ｃ）水と、場合により、別の脂肪親和性成分類を含有する水相の存在を含むことを特徴とする。油相対水相の比率は９：１〜１：９の範囲内である。
【００６８】
オリーブ抽出物粉末を所望の比率で工程（ｃ）の水相へ添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で完全に溶解させる。その直後に、安定なｏ／ｗマトリックスを生成するために、乳化剤が予め添合された工程（ａ）の油相を工程（ｃ）の水相へ添加する。
【００６９】
本発明の第３の側面は、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品を製造するために、好ましくは前記のようなオリーブ抽出物の形でヒドロキシチロソルが添合された栄養製品に関する。本明細書で使用される「栄養製品」という用語は、食用油であるか又は少なくとも食用油を含有する、全ての食料品、食用製品、又は栄養補助食品を意味する。本発明の栄養製品は好ましくは、本発明のオリーブ抽出物を０．０１５％〜９３％（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で含有する。一層好ましくは、本発明のオリーブ抽出物を０．０１％〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で含有する。オリーブ抽出物をこの添加量で含有する食用油である栄養製品は例えばつぎのようなものであることができる。
（ａ）少し例を挙げれば、バージンオリーブオイル、エキストラバージンオリーブオイル、オリーブオイル、ランパンテオリーブオイル、精製オリーブオイル、粗製オリーブ搾り滓オイル、精製オリーブ搾り滓オイル、ヒマワリ油、トウモロコシ油、大豆油、亜麻仁油、扁桃油、キャノーラ油、サフラワー油、パーム油、ココヤシ油、菜種油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などのような様々な原料から得られる植物油、及び
（ｂ）少し例を挙げれば、藻類、オキアミ、大型ニシン、アンチョビ、マグロ、ニシン、サーディン、サバ、タラから得られた海産物油又は魚油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などのような様々な原料から得られるである海産物油又は魚油。
【００７０】
本発明のオリーブ抽出物の更に一層好ましい範囲は０．０５％〜３５％（ｗ／ｗ）からなる。少なくとも植物油を含有し、オリーブ抽出物を前記の添加量で含有する栄養製品は例えば、少し例を挙げれば、マーガリン、マヨネーズ、ガーリックマヨネーズ、ガスパーチョスープ、塗り広げ可能なソース、サラダドレッシングなどのようなオイル含有製品、前記オイル含有製品の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などである。
【００７１】
最後に、本発明の第４の側面は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療における、本発明２の栄養製品、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の使用に関する。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様では、オリーブ抽出物（液状）及び食用油のエマルジョンを使用し、ソフトジェルカプセルを製造した。
【００７３】
ソフトジェルカプセルを製造する場合、様々な側面を考慮すべきである。考慮すべき第１の側面はカプセルサイズである。大抵の消費者が許容可能な上限サイズは約１．２ｇである。このサイズはその他のオイル栄養補助食品で通常使用されているサイズを示す。考慮すべき第２の側面は、一日当たりに摂取すべきカプセルの個数である。一般的に、１日当たりの摂取上限は４〜６カプセルである。一層大きなカプセルサイズが考慮される場合、飲み込み易いので、楕円形（１０００ｍｇ以上）が好ましい。本発明はこれらのパラメータにより制限されない。別の考慮事項は、作用効果の点から必要な最小投与量である。心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療のための最小の投与量は食用油で２ｇである。この投与量は、ヒドロキシチロソルを一日当たり３〜５０ｍｇ送達する。例えば、投与量１ｇの栄養強化食用油を１日当たり２回投与することができる。
【実施例１】
【００７４】
オリーブ果実からのオリーブ抽出物の製造
オリーブ果実のサンプル２５Ｋｇを脱イオン水５０Ｌと混合した。得られた混合物を数分間混合した。次いで、濃度９８％の硫酸６３６ｇを添加した。得られた混合物を、１５ｐｓｉ（大気圧以上）のオートクレーブ中に、温度１２１℃で３０分間閉じ込めた。その後、濾過器で濾過することにより、固形残留物から水相を分離させた。濾過器に残された固相を脱イオン水１２．５Ｌで洗浄し、この洗浄工程から得られた水を、予め回収された水相と合わせた。次いで、約５６Ｌの水相を遠心分離して精製し、濾過器を通して固形粒子を除去した。ヒドロキシチロソルを１４１ｇ含有し、５０．５％のＨＰＬＣ純度を有する粗製水性抽出物が５２Ｌ得られた。
【００７５】
次いで、アセテートサイクルにより事前に活性化された、アニオンタイプの酸活性化イオン交換樹脂を含有するクロマトグラフカラムに粗製水性抽出物を装填した。例えば、ＩＲＡ−６７を使用できる。カラム終端部から回収される液相はヒドロキシチロソルを全く含有していない。それよりも、最初に装填したヒドロキシチロソルが少なくとも９０％回収されるまで、脱イオン水で連続的に溶出させた。
【００７６】
最初のカラムから得られた溶出相を、別の吸着媒非イオン交換樹脂含有クロマトグラフカラムに装填することが好ましい。例えば、ＸＡＤ−１１８０樹脂を使用できる。この第２のカラムの終端部から回収された液相はヒドロキシチロソルを全く含有していない。次いで、最初に装填したヒドロキシチロソルが少なくとも９０％回収されるまで、脱イオン水で樹脂からヒドロキシチロソルを溶出させた。
【００７７】
溶出相は、約９６．７％のＨＰＬＣ純度を有するヒドロキシチロソルを約１１４ｇ含有していた。
【００７８】
次いで、容量を濃厚生成物１０Ｌにまで減容させるために、パイロットプラントで得られたヒドロキシチロソルを１１４ｇ含有する精製抽出物の画分４６１Ｌを、２．５ｍ２の高分子膜を備えた逆浸透パイロットプラントを用いて濃縮した。次いで、ヒドロキシチロソルを３．５％含有するヒドロキシチロソル濃縮液を得るために、同じ材質からなる０．３５ｍ２高分子膜を使用した。最後に、逆浸透濃縮液を２４５ミリバールの真空圧下で７８℃のロータリーエバポレーターに装填し、液状のオリーブ果実抽出物の濃度を約１０倍に高め、９３．３％のＨＰＬＣ純度を有するヒドロキシチロソルの最終濃度を３７．２％（ｗ／ｗ）に達しさせた。
【実施例２】
【００７９】
噴霧乾燥によるオリーブ抽出物粉末の製造
実施例１で得られたヒドロキシチロソルを１９．５ｇ含有する液状の精製オリーブ抽出物２６０ｍｌのサンプルを、脱イオン水２６０ｍｌに予め溶解させたマルトデキストリン５８ｇと共にゆっくりと撹拌した。例えば、ジャガイモマルトデキストリンを使用できる。噴霧乾燥機に供給するために蠕動ポンプを使用した。このポンプは入口空気温度を１５０℃に予め平衡化させておいた。出口空気温度を１００℃未満にするために、供給速度を調節した。水分５．４％（カールフィッシャー法）及びヒドロキシチロソル含量２１．９％（ｗ／ｗ）の白色粉末が７６ｇ得られた。
【実施例３】
【００８０】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。６個のエキストラバージンオリーブオイルサンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、エキストラバージンオリーブオイルに添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを得た。
【００８１】
その直後に、６個の栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図１参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力は０．２４ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力は５．０５ｍＭトロロックス当量／ｇであった。すなわち、エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力が２１倍高められたことを意味する。
【実施例４】
【００８２】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化ヒマワリ油の製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、ヒマワリ油の栄養強化のために選択した。６個のヒマワリ油サンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、ヒマワリ油に添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化ヒマワリ油を得た。
【００８３】
その直後に、６個の栄養強化ヒマワリ油のそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図２参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は５．４２ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例５】
【００８４】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化トウモロコシ油の製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、トウモロコシ油の栄養強化のために選択した。６個のトウモロコシ油サンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、トウモロコシ油に添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化トウモロコシ油を得た。
【００８５】
その直後に、６個の栄養強化トウモロコシ油のそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図３参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化トウモロコシ油の抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は５．２３ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例６】
【００８６】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化マーガリンの製造
実施例２による方法で得られた濃度２３．３％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する固形の精製オリーブ抽出物のサンプルを、マーガリンの栄養強化のために選択した。６個のマーガリンサンプル（各２００ｇ）を次のようにして製造した。配合量を徐々に高めながら、固形のオリーブ抽出物を所望の重量比で、マーガリンのその他の常用成分類（例えば、ホエイ、ブライン等）と共に、水相に添加した。次いで、水相と、乳化剤（レシチン）が混合された精製オイルを、僅かに混合させながら、５０〜６０℃付近の温度でブレンドさせた。最後に、混合スプレッドを冷却し、固化させた。
【００８７】
その直後に、６個の栄養強化マーガリンのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図４参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化マーガリンの抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化マーガリンの抗酸化能力は１８９．０５ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例７】
【００８８】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化マヨネーズの製造
実施例２による方法で得られた濃度２３．３％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する固形の精製オリーブ抽出物のサンプルを、マヨネーズの栄養強化のために選択した。５個のマヨネーズサンプル（各４００ｇ）を次のようにして製造した。先ず最初に、卵黄をミキシングボウルに添加し、速度３で完全に混和した。別の容器で、オリーブ抽出物（水相に望ましい重量比に応じてオリーブ抽出物の配合量を段階的に増大させながら添加した）、蒸留水、レモンジュース、食酢及び塩を混和した。オリーブ抽出物が溶解されるまで撹拌した。この混合物に卵黄を添加し、速度３で約２〜３分間混和した。最後に、オイルをゆっくりと添加し、速度を６にまで上げてエマルジョンを作製した。
【００８９】
その直後に、５個の栄養強化マヨネーズのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図５参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化マヨネーズの抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化マヨネーズの抗酸化能力は１４８．３３ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例８】
【００９０】
ホモジナイザーを用いてオリーブ果実抽出物を乳化することによる栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの製造
実施例１による方法で得られた濃度３１．１％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。下記の表１に示される試験計画に従って、各１０００ｇの栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのサンプルを３個製造した。
【００９１】
表１
オリーブ抽出物 全圧（バール） 備考
配合量 第１段階／第２段階
μＬオリーブ抽出物／Ｌオイル
２３０ 加圧無し （対照，ホモジナイザー
使用せず）
２３０ ３００／３０
２３０ ５００／３０
【００９２】
容量１Ｌのエキストラバージンオリーブオイル内容物を容器に注ぎ入れ、撹拌した。その後、液状のオリーブ抽出物２３０μＬをエキストラバージンオリーブオイルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分間後、プレエマルジョンが生成された。このプレエマルジョンを、２段階均質化手法に従って運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。プレエマルジョンの均質化により安定なエマルジョンを得ることができる。
【００９３】
その直後に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの３個の各サンプルからのアリコートを使用し、レーザ粒径分析計により均質化効率を測定し、また、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。粒径分布曲線（図６参照）をプロットし、平均粒径を計算した。結果を下記の表２に要約して示す。
【００９４】
表２
サンプル ヒドロキシチロソル(ppm) 平均粒径(μm)
非均質化 ５１ １．９９９
３００／３０ ６０ １．２５９
５００／３０ ５９ ０．８４９
【００９５】
粒径分布曲線（図６参照）、平均粒径及びヒドロキシチロソル含量（表２）を考慮すれば、均質化技術は極めて申し分無く実行され、例えば、５００／３０バールでプレエマルジョンを均質化する場合、液状オリーブ抽出物とエキストラバージンオリーブオイルとの安定なマイクロエマルジョンを製造することができる。
【実施例９】
【００９６】
オリーブ果実抽出物を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのソフトジェルカプセルの製造
実施例１による方法で得られた濃度３５．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。
【００９７】
容量１Ｌのエキストラバージンオリーブオイル内容物を容器に注ぎ入れ、撹拌した。その後、液状のオリーブ抽出物４．６８ｇをエキストラバージンオリーブオイルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分間後、プレエマルジョンが生成された。このプレエマルジョンを、第１均質化段階として５００バールで、また、第２均質化段階として３０バールで、１０Ｌ／ｈで運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。
【００９８】
次いで、グリセリン、水及びマスキング剤及び着色剤として二酸化チタンを含有する食用ゼラチンで、上記で製造されたエマルジョンをカプセル封入した。カプセルを包装前に室温で２日間乾燥させた。
【００９９】
ソフトジェルカプセルの製造及び商業生産は当業者に周知である。従って、本明細書ではこれ以上詳細には説明しない。従って、本発明によるオリーブ果実抽出物を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのソフトジェルカプセルは当業者が容易に製造することができる。
【実施例１０】
【０１００】
心臓血管系疾患の予防又は治療におけるオリーブ果実抽出物含有栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの使用
１０．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット４８匹（平均体重１５０〜１８０ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、各８匹毎の実験群に割り振った。各群の４匹のラットをサブグループとして、照明（１２時間毎の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１０１】
１０．２ 食餌
この実験に使用した食餌は次の通りであった。
・ 対照食餌（Ｃ）：精製ヒマワリ油が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌（Ａ）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ エキストラバージンオリーブオイル(evoo)（Ｏ）：エキストラバージンオリーブオイル(evoo)（ヒドロキシチロソル（HT）の天然含有量の測定値が５．７ｍｇHT／ｋｇ(evoo)のもの）が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ 標準ラット食餌＋栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与（５ｍｇHT／ｋｇ（体重））（Ｇ５）：標準ラット食餌(Panlab社製)に（本発明の実施例３により製造された）栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与を併用。ヒドロキシチロソル(HT)５ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。
・ 標準ラット食餌＋栄養強化エキストラバージンオリーブオイル（Ｇ８）の強制経口投与（８ｍｇHT／ｋｇ（体重））（Ｇ８）：標準ラット食餌(Panlab社製)に（本発明の実施例３により製造された）栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与を併用。ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。
【０１０２】
飲料水と食餌は任意に摂取させた。しかし、全研究を通じて、各ラット毎の平均給餌量は３０ｇ／日（ラット毎の実際の食餌摂取量は不知）であった。更に、各ラット群に、毎日５ｍｇHT／ｋｇ（体重）及び８ｍｇHT／ｋｇ（体重）をそれぞれ給餌するために、Ｇ５及びＧ８食餌を受けているラット群に栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。脂肪の酸化を避けるために、正しい配合量の標準ラット食餌(Panlab社製)及び脂肪／オイルを混合することにより全ての食餌を毎日調製し、かつ、使用直前まで４℃で暗所に保存した。また、摂取されずに残った前日の食餌は廃棄した。
【０１０３】
本研究に使用したＯ、Ｇ５及びＧ８食餌内のヒドロキシチロソル（ＨＴ）濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【０１０４】
１０．３ 実験計画
実験計画を下記の表３に示す。
【０１０５】
表３
群 初日から ３１日目から 備考
３０日目まで ６０日目まで
１ 食餌Ｃ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＣＣ
（対照食餌）
２ 食餌Ａ 食餌Ａ 給餌食餌：ＡＡ
（アテローム性食餌、負対照）
３ 食餌Ａ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＡＣ
（アテローム性食餌後の対照食餌の効果）
４ 食餌Ａ 食餌Ｏ 給餌食餌：ＡＯ
（アテローム性食餌後の天然含有量 5.7mgHT/kg(evoo)のevoo食餌の効果）
５ 食餌Ａ 食餌Ｇ５ 給餌食餌：ＡＧ５
（アテローム性食餌後、日用量が5mgHT/kg
(体重)となる栄養強化evoo食餌の効果）
６ 食餌Ａ 食餌Ｇ８ 給餌食餌：ＡＧ８
（アテローム性食餌後の、日用量が8mgHT/kg
(体重)となる栄養強化evoo食餌の効果）
【０１０６】
ＣＣ，ＡＡ，ＡＣ，ＡＯ，ＡＧ５及びＡＧ８食餌で処理されるラット群は次のようにして給餌した。
ＣＣ又はＡＡ食餌でそれぞれ処理されるラット群には、２ヶ月間食餌C又はＡを給餌した。
ＡＣ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｃ食餌（ヒマワリ油が全く配合されていない標準ラット食餌(Panlab社製）だけからなる食餌）を給餌した。
ＡＯ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｏ食餌（天然含有量5.7mgHT/kg(evoo)のevoo食餌）を給餌した。
Ｇ５食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｇ５食餌（日用量が5mgHT/kg(体重)となる栄養強化evoo）を強制経口投与により給餌した。
Ｇ８食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｇ８食餌（日用量が8mgHT/kg(体重)となる栄養強化evoo）を強制経口投与により給餌した。
【０１０７】
実験終了時点で、絶食ラットに麻酔をかけ、安楽死させた直後に心臓内穿刺を行い血液を試験管に捕集した。分析のために血漿を遠心分離法により分離させた。
【０１０８】
１０．４ 血漿中の脂質及び総抗酸化能力（ＴＡＣ）の測定
総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の血漿濃度を、（スペインのバルセロナに所在する）Biosystems社から購入した市販のキットを使用し、製造者の取り扱い指示書に従って、比色定量分析法により測定した。
【０１０９】
血漿の総抗酸化能力は、標準物質としてトロロックスを使用し、Reら（１９９９）により開示された方法に従って測定した。新鮮な血漿をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、そして２０μＬを、ＡＢＴＳ［２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）］＋ラジカルカチオン９８０μＬと共に、暗所で、室温で１０分間培養した。１０分後、吸光度を７３４ｎｍで測定した。過硫酸カリウム１４ミリモル(mM)水溶液４４０μＬをＡＢＴＳ(Sigma-A1808)７mM水溶液２５ｍＬに添加し、暗所で１２〜１４時間培養することにより、ＡＢＴＳ＋カチオン母液を調製した。使用液は、７３４ｎｍにおける吸光度が０．７±０．０２になるまで、母液をＰＢＳで希釈することにより得た。
【０１１０】
１０．５ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、一方向ANOVA（分散分析）により分析した。グループ間の差分はTukeyテスト（多重比較検定）により評価した。差分はＰ値が＜０．０５である場合に、有意と見做された。データはSigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１１１】
１０．６ 考察
得られた結果を図７〜図９に示す。トリグリセリドレベル、動脈硬化指数及び総抗酸化能力(TAC)は各ラット群と相関されている。
【０１１２】
図７は、トリグリセリドレベルと、異なる食餌スキームに従って分類されたラットとの間の相関関係を示す。図７によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群１は最も低いトリグリセリドレベルを示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最も高いトリグリセリドレベルを示す。ラット群１とラット群２の間のトリグリセリドレベル差は、Ｐ値が＜０．００１なので、統計的に有意である。興味深い結果が、Ｇ５食餌及びＧ８食餌でそれぞれ処理されたラット群５とラット群６について示されている。最初の一ヶ月間アテローム性食餌を給餌されたラットであっても、引き続く処理中に、標準ラット食餌と共に本発明による栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを強制経口投与で給餌されると、ラット群５とラット群１又はラット群６とラット群１との間のトリグリセリドレベルには統計的有意差が認められなかったことを、このトリグリセリド値は示している。換言すれば、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、トリグリセリドの値が、対照食餌により得られるレベルに匹敵する値にまで顕著に低下したことが、ラット群Ｇ５及びＧ８について認められた。アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、更に一ヶ月間、標準ラット食餌と共にエキストラバージンオリーブオイル(evoo)だけをラット（ラット群４）に給餌した場合には、同じ結果が認められなかった。この場合、トリグリセリドレベル（負対照ラット群２のトリグリセリドレベルよりも低いとしても）は、対照食餌（ラット群１）を給餌されたラット群について測定されたトリグリセリドレベルに対する統計的有意差がＰ値＜０．００１であった。更に、Ｐ値＜０．００１なので、ラット群３とラット群１との間のトリグリセリドレベルの統計的有意差が認められた。このことは、非栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの効果は、アテローム性食餌の一ヶ月後の標準ラット食餌（Ｇ３）の効果を殆ど上回らないことを意味する。
【０１１３】
図８は、動脈硬化指数と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図８によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群は最低動脈硬化指数を示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最高動脈硬化指数を示す。Ｐ値＜０．００１なので、ラット群１とラット群２との間には動脈硬化指数の統計的有意差が存在する。興味深い結果が、Ｇ５食餌及びＧ８食餌でそれぞれ処理されたラット群５とラット群６について示されている。ラット群５とラット群１又はラット群６とラット群１との間の動脈硬化指数の統計的有意差は認められなかった。換言すれば、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、動脈硬化指数値が、対照食餌で得られる値に匹敵する値にまで顕著に低下したことが、ラット群Ｇ５及びＧ８について認められた。これに対して、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、更に一ヶ月間、標準ラット食餌と共にエキストラバージンオリーブオイル(evoo)だけをラット（ラット群４）に給餌した場合には、同じ結果が認められなかった。この場合、動脈硬化指数値（負対照ラット群２の動脈硬化指数値と統計的有意差があったとしても）は、Ｐ値＜０．０５なので、対照食餌を給餌されたラット群（ラット群１）について検出された動脈硬化指数値に対して統計的有意差を生じた。
【０１１４】
図９はＴＡＣ血漿値と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図９によれば、ラット群５とラット群６が最高総抗酸化能力を示す。ラット群５とラット群１（Ｐ値＜０．００１）とラット群６とラット群１（Ｐ値＜０．００１）との間の総抗酸化能力値には統計的有意差が存在する。この結果は、本発明による栄養強化オイル／オイル含有製品及び特に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルは幾つかの効果をもたらし、かつ、心血管系の保護に使用できることを再確認する。実際、高コレステロール／トリグリセリドレベル、低ＨＤＬコレステロールレベル及び特に被酸化ＬＤＬは、動脈内のアテローム性プラーク堆積及びメタボリック症候群に付随するリスクファクター（危険因子）の一つである。前記の結果を要約すれば、オリーブ抽出物を含有する栄養強化栄養製品は心血管系発作に関するバイオマーカーを有する効果について実験が行われ、得られた結果は、本発明によるオリーブ抽出物による栄養強化を受けていない類似の栄養製品について得られた結果と比較された。測定された全てのパラメータを考慮すると（図７〜図９参照）、栄養強化栄養製品（オリーブ抽出物含有）の成分類は相乗効果を示すということが結論付けられる。更に、栄養強化栄養製品（本発明によるオリーブ抽出物含有）の規則的投与は心血管系を保護し、心血管系発作の発生を大なり小なり防止し、その結果、当該製品は健康増進栄養製品として申し分の無いものであるということが結論付けられる。
【実施例１１】
【０１１５】
高血圧症治療における栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(本発明によるオリーブ抽出物が添加されたevoo)の使用
１１．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット３６匹（試験開始時点の体重約２００ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、６個の実験群（各群当たりラット６匹）に割り振り、照明（１２時間の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１１６】
１１．２ 食餌
整定期間中及び試験期間中、ラットには固形のラット用標準食餌(Panlab社製)を給餌した。飲料水及び餌は自由に摂取させた。整定期間の７日間が経過した後、本試験による治療を開始した。
【０１１７】
１１．３ 実験計画
栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(本発明によるオリーブ抽出物が添加されたevoo)の効果を測定するため、高血圧症モデルの誘発用としてＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステル(L-NAME)を使用した。
【０１１８】
整定期間経過後、L-NAME誘発高血圧症治療の開始前に、動脈血圧の基礎データ(D0)をLetica5002測定器で測定した。
【０１１９】
ラットを下記の表４に示される実験計画に従って処置した。
【０１２０】
表４
L-NAME
群 含有飲料水 強制経口投与 備考
１ 無し 無し 高血圧症の誘発無し
２ 40mgL-NAME/kg* 無し 高血圧症誘発
（負対照）
３ 40mgL-NAME/kg* エキストラバージン 天然含有量5.7mgHT/kgevoo
オリーブオイル のエキストラバージン
(evoo)0.2mL オリーブオイル(evoo)の投与
と並行して高血圧症誘発
４ 40mgL-NAME/kg* 本発明によるオリーブ HTの一日摂取量が5mg/kg
抽出物が添加された (体重)となる栄養強化evoo
栄養強化evoo0.2mL の投与と並行して高血圧症
従って、一日摂取量 誘発
5mgHT/kg(体重)となる
５ 40mgL-NAME/kg* 本発明によるオリーブ HTの一日摂取量が8mg/kg
抽出物が添加された (体重)となる栄養強化evoo
栄養強化evoo0.2mL の投与と並行して高血圧症
従って、一日摂取量 誘発
8mgHT/kg(体重)となる
6 40mgL-NAME/kg* カプトプリル100mg/kg カプトプリル(降圧剤)100mg
の投与と並行して高血圧症
誘発（正対照）
＊Ｌ−ＮＡＭＥ処理剤は、ラット１匹当たり２００ｇの体重を考慮し、そして、ラットへの平均一日給水量を４０ｍＬ／日に標準化して、自由に摂取できる飲料水摂取を通して全てのラット群に投与した。但し、ラット毎の実際の水摂取量は不知。
【０１２１】
１１．４ 活性のクロノグラム(Cronogramme)
ラットを習慣付けるために、整定期間中、Lectica5002測定器を用いて尻尾動脈の脈動を記録することにより動脈血圧の測定を行った。
【０１２２】
試験測定／処置のクロノグラムを下記の表５に要約して示す。
【０１２３】
表５
日数 動脈血圧の測定 L-NAME補給 強制経口投与
飲料水
０ 有り 有り 無し
１ 無し 有り 有り
２ 有り 有り 有り
３ 無し 有り 有り
４ 有り 有り 有り
５ 無し 有り 有り
６ 無し 有り 有り
７ 有り 有り 有り
【０１２４】
１１．５ 動脈血圧の測定
動脈血圧は前記のクロノグラムに従って、尾カフ(tail-cuff)法により定期的に測定した。尾動脈の脈動を検出可能にするため、測定前にラットを３７℃で１０分間静置した。本研究で使用した測定器のLE5002(スペインのバルセロナに所在するLetica,Hospitalet社製)は正確なマイクロプロセッサプログラムと結合された高感度パルス変換器を有し、その結果、正確な動脈血圧の測定ができる。動脈血圧測定は、概日サイクルの如何なる影響も避けるために、一日の同じ時間に行った。
【０１２５】
１１．６ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、SigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１２６】
１１．７ 考察
図１０は、血圧検出値と、異なる処置スキームに従って分類されたラット群との間の相関関係を示す。図１０によれば、ラット群１は高血圧を示さなかったが、ラット群２はL-NAME処置により誘発された高く、増大化する血圧値を示した。ラット群６（正対照）は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、カプトプリル（公知の高効率降圧剤）で処置したので、血圧値の顕著な低下が示された。ラット群３は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、エキストラバージンオリーブオイル(evoo)で処置し、一方、ラット群４及び５は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(栄養強化evoo)で処置した。ラット群４及び５の血圧値は、ラット群３の血圧値よりも著しく低かった。従って、本発明による栄養強化エキストラバージンオリーブオイルにより発現される高血圧症に対する作用は、非栄養強化evooにより発現される作用に比べて、極めて優れている。
【０１２７】
動脈性高血圧症は動脈内のアテローム性プラーク堆積及びメタボリック症候群に付随するリスクファクター（危険因子）の一つなので、前記の結果は非常に興味深い。本発明によるオリーブ抽出物により栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルが動脈血圧に及ぼす効果について研究し、そして、オリーブ抽出物による処置を受けなかった対照ラット群と比較した。収縮期血圧測定値（図１０参照）を考慮すれば、オリーブ抽出物及び本発明によるオリーブ抽出物を含有する栄養製品の規則的投与は抗高血圧作用を示し、心血管系発作の発生を大なり小なり防止すると結論付けることができる。本発明によるオリーブ抽出物を含有する栄養製品は、健康を増進する栄養補助食品と見做すことができ、従って、抗高血圧作用を有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルと類似の機能性食品を製造するための有効な手段である。
【実施例１２】
【０１２８】
心臓血管系疾患の予防又は治療における高純度ヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物の使用
１２．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット３２匹（平均体重１５０〜１８０ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、各群８匹の４個の実験群に割り振った。各群の４匹のラットをサブグループとして、照明（１２時間毎の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１２９】
１０．２ 食餌
この実験に使用した食餌は次の通りであった。
・ 対照食餌（Ｃ）：精製ヒマワリ油が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌（Ａ）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソル（８ｍｇHT／ｋｇ（体重））強制経口投与（Ａ−Ｇ８）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)＋ヒドロキシチロソル抽出物（８ｍｇヒドロキシチロソル／ｋｇ（体重））強制経口投与。ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、強制経口投与により摂取させた。
【０１３０】
飲料水と食餌は任意に摂取させた。しかし、全研究を通じて、各ラット毎の平均給餌量は３０ｇ／日（ラット毎の実際の食餌摂取量は不知）であった。脂肪の酸化を避けるために、正しい配合量の標準ラット食餌(Panlab社製)及び脂肪／オイルを混合することにより全ての食餌を毎日調製し、かつ、使用直前まで４℃で暗所に保存した。また、摂取されずに残った前日の食餌は廃棄した。
【０１３１】
本研究に使用したＡ−Ｇ８食餌内のヒドロキシチロソル（ＨＴ）濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【０１３２】
１２．３ 実験計画
実験計画を下記の表６に示す。
【０１３３】
表６
群 初日から ３１日目から 備考
３０日目まで ６０日目まで
１ 食餌Ｃ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＣＣ
（対照食餌）
２ 食餌Ａ 食餌Ａ 給餌食餌：ＡＡ
（アテローム性食餌、負対照）
３ 食餌Ａ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＡＣ
（アテローム性食餌後の対照食餌の効果）
４ 食餌Ａ−Ｇ８ 食餌Ａ−Ｇ８ 給餌食餌：ＡＧ８−ＡＧ８
（アテローム性食餌に対する8mgHT/kg 体重の効果）
【０１３４】
ＣＣ，ＡＡ，ＡＣ及びＡ−Ｇ８食餌で処理されるラット群は次のようにして給餌した。
ＣＣ又はＡＡ食餌でそれぞれ処理されるラット群には、２ヶ月間食餌C又はＡを給餌した。
ＡＣ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｃ食餌（ヒマワリ油が全く配合されていない標準ラット食餌(Panlab社製）だけからなる食餌）を給餌した。
ＡＧ８−ＡＧ８食餌で処理されるラットには、２ヶ月間Ａ−Ｇ８食餌（アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソル８ｍｇ／ｋｇ（体重）強制経口投与）を給餌した。
【０１３５】
実験終了時点で、絶食ラットに麻酔をかけ、安楽死させた直後に心臓内穿刺を行い血液を試験管に捕集した。分析のために血漿を遠心分離法により分離させた。
【０１３６】
１２．４ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、一方向ANOVA（分散分析）により解析した。グループ間の差分はTukeyテスト（多重比較検定）により評価した。差分はＰ値が＜０．０５である場合に、有意と見做された。データはSigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１３７】
１２．５ 考察
得られた結果を図１１に示す。動脈硬化指数は前記のように表６に示される各ラット群と相関されている。
【０１３８】
図１１は、動脈硬化指数と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図８によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群は最低動脈硬化指数を示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最高動脈硬化指数を示す。Ｐ値＜０．００１なので、ラット群１とラット群２との間には動脈硬化指数の統計的有意差が存在する。興味深い結果が、本実験においてＡ−Ｇ８食餌で処理されたラット群４について示されている。ラット群４とラット群１との間の動脈硬化指数の統計的有意差は認められなかった。換言すれば、Ａ−Ｇ８ラット群については、アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物の強制経口投与で２ヶ月間処理した後、対照食餌により得られる動脈硬化指数に匹敵する不変的動脈硬化指数が認められた。これに対して、最初の１ヶ月間はアテローム性食餌で処理し、引き続く１ヶ月間は標準ラット食餌だけが給餌されたラット群３の場合、同じ効果は認められなかった。この場合、（負対照ラット群２の動脈硬化指数値と統計的有意差があったとしても）動脈硬化指数値は、Ｐ値＜０．０５なので、対照食餌を給餌されたラット群（ラット群１）について検出された動脈硬化指数値に対して統計的有意差を生じた。ラット群４からもたらされた動脈硬化指数値は、本発明により得られたヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物による予防効果を示唆する。
【０１３９】
全ての測定パラメータを考慮すれば、本発明によるオリーブ抽出物の規則的投与は心臓血管系を保護し、動脈内におけるアテローム性プラークの堆積及びメタボリック症候群に付随すると考えられる幾つかのリスクの発現を防止するものと結論付けることができる。従って、本発明のオリーブ抽出物は、栄養補助食品の製造に使用すべき、健康促進天然抽出物であると十分に考えられる。
【０１４０】
前記のように、本発明の食用油は本来の官能特性を維持する。すなわち、苦味値を全く増大させず、しかも、オレウロペイン系アグリコン（例えば、アルデヒド形のオレウロペイン系アグリコン）及び糖類（例えば、グルコース、すなわち、オレウロペイン中に存在する糖）などのような複合フェノール類（例えば、オレウロペイン、すなわち、ヒドロキシチロソルのエステル）などの加水分解副生物を全く含有しない。
【０１４１】
下記は、オイル、すなわち、オリーブオイルに対して通常行われる品質試験の説明である。
【０１４２】
１）酸度
酸度は、試験されるオイル中の遊離脂肪酸の含量割合（重量％）を示す。遊離脂肪酸は通常、無傷のオリーブから得られるオイル中にも存在する。トリグリセリドが生成されると、果実中に天然に存在する酵素（リパーゼ）の作用により、酸度が段々と高まる。これは、トリグリセリド分子からの脂肪酸の分離（脂肪分解）を助長する。同じ脂肪分解現象は、オリーブ果実上で生長する微生物により生成される酵素によっても起こり得る。従って、官能特性的に優れ、かつ、一層低い酸度を有する生成物を得るためには、オリーブを良好な状態で貯蔵庫内に保存しなければならない。
【０１４３】
２）過酸化物値
試験されるオイル中の過酸化物の含量は過酸化物値で表される。過酸化物値が高まるほど、オイルの酸化による劣化が大きい。次には、過酸化物は更なる酸化を受け、異なる方法で検出可能なその他の成分類（アルデヒド類、ケトン類等）の生成を起こす。これらの化合物類（二次酸化化合物類と呼ばれる）は、油酸敗を起こす原因である。酸化及び果実の組織内に存在する酵素類（リポキシゲナーゼ類）のために、圧搾前の果実内には或る濃度の過酸化物が既に存在する。特定の自然環境（例えば、凍結点以下の温度、ダシック(dacic)侵入、干魃等）又は不適切に収穫されかつ保存されたオリーブは、過酸化物の更なる生成が助長される。粉砕中であっても、不適切な加工又は不衛生なオリーブ圧搾機及び／又は容器などにより、過酸化物は著しく増大することができる。最後に、オイルを光源又は熱源に長期間曝露すると過酸化物が増大する。過酸化物類は滴定により検出できる。
【０１４４】
３）紫外線による分光光度研究
このテストは、同じ分析手法で決定される３種類のパラメータ（Ｋ２３２，Ｋ２７０，ΔＫ）の測定からなる。Ｋ２３２の値が大きければ大きいほど、共役ジエン類の濃度も一層高いが、Ｋ２７０は共役ジエン類の濃度と釣り合う。しかし、共役ジエン類の酸化化合物類はＫ２３２の一因となるが、二次酸化の化合物類（アルデヒド類、ケトン類等）はＫ２７０の一因となる。
【０１４５】
この理由により、Ｋ２７０の値がオリーブオイルが属すると思われるカテゴリーの限界値を超えている場合、ＥＣ規則は二次的分光光度テストの前にサンプル（アルミナを含む）に対して特別な前処理を行うことを規定している。新たな測定値が限界値を超えている場合、このオリーブオイルは純粋ではないと宣言しなければならない。
【０１４６】
４）苦味テスト
このテストは、Gutierrezら，J.Am.Oil.Chem.Soc. 1992, 69(4), 394-395に記載された方法に従って行われる。この試験は、２２５ｎｍにおける吸光度（Ｋ２２５テスト）とオリーブオイルの苦味との間に線形相関が存在することを見出した。
【０１４７】
経験的に、Ｋ２２５値が０．３００以上の場合、オリーブオイルを直接消費すると問題が起こることが知られている。更に、０．３６０程度又はこれ以上のＫ２２５値は、殆どの消費者により拒絶される極めて苦いオリーブオイルに該当する。
【実施例１３】
【０１４８】
比較例：異なるオリーブポリフェノール源により栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの製造
比較のために、実施例１による方法で得られた精製オリーブ抽出物のサンプルとオリーブ葉から及びオリーブ工場植生水からの抽出物の市販サンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。各抽出物の仕様を下記の表Ｃ１に示す。
【０１４９】
表Ｃ１
抽出物 ＨＴ（％） オレウロペイン ＨＴ純度 残留有機溶
（％） (HPLC280nm) 媒(ppm)
精製オリーブ抽出物 ３４．５ 不検出 ９３．４ 不検出
（実施例１によるもの）
オリーブ葉抽出物 ０．４ ３５．６ ５．２ エタノール
156ppm
オリーブ工場植生水 ２．５ ０．２ ５１．３ アセトン
105ppm
【０１５０】
容量３Ｌボトルのエキストラバージンオリーブオイルをスーパーマーケットで購入し、別のテストで使用した。
【０１５１】
前記エキストラバージンオリーブオイル各５００ｍＬのサンプル４個を、それぞれのガラスビーカに注ぎ入れた。そして、別の抽出物を下記の表Ｃ２に従って添加した。
【０１５２】
表Ｃ２
抽出物 抽出物添加量 オイル中のＨＴの最高理論
（ｇ） 増大量(ppm)
A)精製オリーブ抽出物 ０．１ ６９
（実施例１によるもの）
B)オリーブ葉抽出物 ２０ １６０
C)オリーブ工場植生水 ２０ １０００
D)抽出物不添加（対照） −− −−−
【０１５３】
次いで、各テストＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを下記のようにして行った。
【０１５４】
Ａ）液状の精製オリーブ抽出物（実施例１によるもの）０．１１ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分後、プレエマルジョンが精製された。このプレエマルジョンを２段階均質化方法に従って運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。第１段階は３００バールの圧力、第２段階は３０バールの圧力でそれぞれ操作されるプレエマルジョンの均質化により安定なエマルジョンを得ることができる。
【０１５５】
Ｂ）オリーブ工場植生水抽出物２０ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、６０℃で２時間磁気的に撹拌した（イタリア特許第１３２６５５３号公報の比較例１と比較するため）。加熱処理完了後、サンプルは暗緑色を呈し、依然として多数の固形物を含んでいた。その後、固形物をデカント法により除き、オリーブオイルを室温にまで冷却し、最後に、サンプルを遠心分離し、固形物を除去した。
【０１５６】
C)オリーブ葉抽出物２０ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、６０℃で２時間磁気的に撹拌した（イタリア特許第１３２６５５３号公報の比較例３と比較するため）。加熱処理完了後、サンプルは依然として多数の固形物を含んでいた。その後、固形物をデカント法により除き、オリーブオイルを室温にまで冷却し、最後に、サンプルを遠心分離し、固形物を除去した。
【０１５７】
これらの直後に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの３個のサンプル（サンプルＡ，Ｂ及びＣ）と、エキストラバージンオリーブオイルの１個の対照サンプル（サンプルＤ）からなる４個のサンプルのそれぞれからアリコートを採取し、このアリコートを、Gutierrezら，J.Am.Oil.Chem.Soc. 1992, 69(4), 394-395に記載された方法に従って測定される苦味指数（Ｋ２２５）測定、及びＨＰＬＣによるヒドロキシチロソルとオレウロペイン含量測定に使用した。測定結果を下記の表Ｃ３に要約して示す
【０１５８】
表Ｃ３
抽出物 K225 オイル中の オイル中のオレ オイル中のＨＴ取込
ＨＴ(ppm) ウロペイン み歩留まり（％）
(ppm)
A)精製オリーブ 0.24 71 不検出 92.8
抽出物実施例１
によるもの）
B)オリーブ葉 0.35 28 10 13.1
抽出物
C)オリーブ 0.32 38 1 3.1
工場植生水
D)抽出物不 0.25 7 不検出 ---
添加（対照）
【０１５９】
前記の表に示された予備テストでは、過剰な苦味及び／又は渋味による不快な風味を起こすオリーブオイルの官能特性の変化を避けながら、ヒドロキシチロソルのレベルを高めるためには、オリーブ抽出物の純度及び出所が必須要件であることが示された。
【０１６０】
更に、オリーブ葉抽出物及びオリーブ工場植生水抽出物の使用及びイタリア特許第１３２６５５３号公報に記載された前記の処理方法（６０℃で２時間加熱）の使用は、苛酷過ぎ、技術的に複雑であり、しかも実際的ではない（処理後にオリーブオイル中に大量の固形物が残留する）か、若しくは、栄養分野で商業的に実行できない（オリーブオイル中に取り込まれるヒドロキシチロソルの含量が極めて低い）。更に、植物油中に取り込まれるヒドロキシチロソルの量が少なすぎて、酸化変性に対してＬＤＬを殆ど保護することができない。
【実施例１４】
【０１６１】
比較例：異なる抽出物により栄養強化された植物油の官能特性の測定
前記の実施例１３におけるサンプルＡ〜Ｃ及び対照サンプルＤを下記の品質特性についてテストした。表Ｃ４に要約して示す。
【０１６２】
表Ｃ４
抽出物 遊離脂肪酸 過酸化物指数 Ｋ２７０ Ｋ２３２
オレイン酸含量 meqO2/Kgとして NMT0.22 NMT2.5
(%)として NMT20
NMT0.8%
A)精製オリーブ 0.22 7 0.17 1.76
抽出物実施例１
によるもの）
B)オリーブ葉 0.35 9.5 0.27 2.13
抽出物
C)オリーブ 0.40 7.9 0.18 1.91
工場植生水
D)抽出物不 0.22 7.2 0.15 1.85
添加（対照）
【０１６３】
遊離脂肪酸値、過酸化物指数、Ｋ２７０及びＫ２３２などの品質パラメータの変化が認められた。オリーブ葉抽出物により栄養強化されたオリーブオイルのＫ２７０値は０．２７と極めて高い値であり、２００７年６月２１日制定の執行規則（ＥＣ）Ｎｏ．７０２／２００７による、エキストラバージンオリーブオイルについて許容される最大値を超えている。
【０１６４】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシチロソル(hydroxytyrosol)含有オリーブ抽出物による栄養製品の栄養強化に関する。また、本発明は、ヒドロキシチロソルにより栄養強化された栄養製品に関し、更に、医療用の用途、特に、心臓血管系疾患（ＣＶＤ）、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療に用いられるオリーブ抽出物及びオリーブ抽出物により栄養強化された栄養製品に関する。
【０００２】
本発明によれば、オリーブ果実又はオリーブオイル抽出残留物（搾り滓）から得られたオリーブ抽出物を食用油に添加し、この食用油を栄養製品に添加する。これにより、ヒドロキシチロソルのレベルが高められる。
【０００３】
更に詳細には、本発明は、ヒドロキシチロソル高含有及び精製組成物の栄養供給により、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用されるべき食用油含有製品の栄養強化に関する。
【背景技術】
【０００４】
英国心臓財団により２００５年に発行された欧州心臓血管系疾患統計増刊号によれば、ＣＶＤはヨーロッパにおける主要な死亡原因であり、毎年４３５万人以上がＣＶＤで死亡している。冠動脈系心臓疾患（ＣＨＤ）それ自体はヨーロッパにおける単一の最も一般的な死亡原因であり、ヨーロッパでは毎年１９５万人がＣＨＤで死亡している。
【０００５】
この増刊号は、ＣＶＤの経済的コストの推計値に関する新規な段落を含んでいた。ＣＶＤのトータルコストは総計１６９０億ユーロに達し、そのうち、１０５０億ユーロは欧州連合（ＥＵ）におけるＣＶＤ治療費であり、６４０億ユーロは喪失された生産性とインフォーマルケアのコストによるものである。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症とも呼ばれる動脈内へのプラーク堆積は、ＣＶＤの主因であり、また、ＣＨＤの最も常習的原因である。動脈内におけるアテローム性動脈硬化症的プラーク堆積は動脈の一般的な障害である。これは、動脈血管壁に脂肪、コレステロール及びその他の物質が堆積し、そして、プラークと呼ばれる硬質物質を生成することにより
発症する。
【０００７】
最後には、プラーク堆積物は動脈の狭窄と柔軟性低下を引き起こす。これは血液の流れを益々困難にする。冠動脈が狭くなると、心臓への血流が低下又は停止し、胸郭の苦痛（持続性アンギナ）、短呼吸、心臓発作及びその他の症状を引き起こす。
【０００８】
プラーク片はバラバラに破壊され、血流に乗って移動することができる。これは心臓発作の一般的な原因である。血塊はプラーク堆積物の周囲にも生成することができる。血塊は血流をブロックする。血塊が心臓、肺又は脳内を移動すると、これは脳卒中、心臓発作又は肺塞栓症を引き起こす。
【０００９】
動脈性高血圧症、血中のトリグリセリド及び総コレステロールの値が高いことや喫煙は、この疾患の進展の一因となるファクターであることが立証されている。最近、研究者らは、これらリスクファクター（危険因子）の幾つかが或る人々の間で密集していることを発見した。これらのリスクファクターの密集はメタボリック症候群として知られているいる。
【００１０】
メタボリック症候群の人々は下記のような密集的リスクファクターを有する。
・中央肥満。これは、腹部（胃部）における余分体重を意味する。
・ブドウ糖と呼ばれるタイプの糖の消化障害（ブドウ糖不耐症）。メタボリック症 候群の患者は通常、高インスリン血症又は２型糖尿病を有する。
・血流中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）及びトリグリセリドの値が高い。
・血流中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）の値が低い。
・高血圧症
【００１１】
メタボリック症候群については究明すべきことが依然として多々あるが、医師は、メタボリック症候群の人々が高いＣＶＤリスクを有することを知っている。多くの研究が、ＬＤＬの生体内酸化がアテローム性動脈硬化症の進展に中心的な役割を演じていることを証明している(Knight, 1995; Witzum, 1994)。
【００１２】
地中海ダイエットの基本的脂肪成分であるオリーブオイルはＣＨＤ(De Lorgeriら，1999；Hertogら，1993; Mattson及びGrundy, 1985)及び或る種の癌(d'Amicis及びFranci, 1999; Bragaら, 1998; Trichopoulouら, 1995; Matin-morenoら, 1994)の低発生率に関連している。
【００１３】
ＬＤＬ酸化を防止するためのオリーブオイル消費の健康上の利点は、その抗酸化性及びその高一価不飽和脂肪酸含量の両方に関連づけられるであろう(Nicolaiewら, 1998)。バージンオリーブオイルのフェノール系化合物類は、オリーブオイルを酸化から保護する強力な抗酸化特性を有する(Visioliら, 1998; Paradopoulos及びBoskou, 1991)。更に、フェノール系化合物類は、健康上の肯定的な利点も示した(Owenら, 2000; Mannaら, 1999)。バージンオリーブオイル中の最も代表的なフェノール系化合物類の幾つかは、ヒドロキシチロソル、チロソル及びこれらの幾つかの誘導体類であり、これらはオリーブオイル製造の過程でオリーブ果実から抽出される(Brenesら, 1999)。
【００１４】
ヒドロキシチロソルはオリーブオイル中に存在し、下記の化学式で示される。
【００１５】
同時係属特許出願第ＥＰ０７００１７９１号及びＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００１７３号明細書には、オリーブ及び／又はオリーブオイル抽出残留物からのヒドロキシチロソルの製造方法及び製造装置が記載されている。これらの出願の発明は、食品、医薬及び化粧品工業の分野におけるヒドロキシチロソル源として使用されるべきヒドロキシチロソル含有製品又は抽出物の製造を目的としている。これらの出願明細書の内容を参照として本明細書中に組み込む。
【００１６】
幾つかの官能特性が、エキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイル中のオリーブポリフェノール類により顕在化されることは周知である。これらオリーブオイルの官能特性は消費者によるオリーブオイル受容性に大きな影響を及ぼす。幾つかのフェノール類は主に苦味の味覚感覚を顕現させる。しかし、その他のフェノール系分子類は、口蓋内及び味蕾内の三叉神経の遊離端を刺激し、辛味、渋味及び金属風味などの化学的な感覚を生じさせる。オリーブの果実に苦味を与えるフェノール系化合物であるオレウロペイン(oleuropein)は、脂溶性ではなくむしろ水溶性である。従って、果実を圧搾したとき、オレウロペインは、オリーブオイル内には殆ど移行しない。従って、エキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイル中のオレウロペインの平均含有量はそれぞれ１ｐｐｂ及び１１ｐｐｍ程度である。
【００１７】
オレウロペインはオリーブオイル内に存在し、下記の化学式で示される。
【００１８】
それにもかかわらず、多数のオレウロペイン関連化合物類は、オレウロペイン自体よりも一層油溶性であり、オレウロペインアグリコン（例えば、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形、ＡＯＡ）の異性体又は異性体類の形及びヒドキシチロソル又はチロソルに結合したエレノール酸（それぞれ、３，４−ＤＥＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡと命名されている）のジアルデヒドの形でオイル中に高含量で存在する。これらは、Gutierrez-Rosales及び共著者らの, J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6021-6025（非特許文献１）によれば、主に苦味の原因であるオリーブポリフェノール類である。
【００１９】
オレウロペインアグリコン（例えば、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形）はオリーブオイル内に存在し、下記の化学式で示される。
【００２０】
Frank及び共著者らの, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238（非特許文献２）には、オレウロペイン誘導体類の苦味の感覚閾値を示すための、「味希釈分析法」と呼ばれる手法が記載されている。苦味は、サンプルの一連の希釈水溶液を作製し、次いで、トライアングルテストで判定されるように希釈サンプルを水と判別できる濃度を発見するまで、濃度の増大に従ってこれらを味見することによって評価された。少なくともこれらの化合物類については、２２５ｎｍにおける吸光度（Ｋ２２５値）と苦味との直接的な相関関係は存在しないことも示された。Mateoら、J. Am. Oil. Chem. Soc. 2004, 81, 71-75（非特許文献３）は、オレウロペインアグリコンのアルデヒド形（オレウロペインを、Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グコシダーゼで加水分解することにより得た）と苦味との間の相関関係を立証した。
【００２１】
Andrewesら、J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1415-1420（非特許文献４）は、ポリフェノール類とオリーブオイル辛味との間の関係を立証した。ｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡは、多くのオリーブオイルで味わう焼けるような感覚の根元である。
【００２２】
２００５年に、Beauchamp及び共著者ら、Nature 2005, 437, 45-46（非特許文献５）は、異なるエキストラバージンオリーブオイル及びバージンオリーブオイルから単離されたｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡの辛味強度を測定し、この分子が、咽喉刺激の原因となる基本的成分であることを確認した。
【００２３】
要約すれば、オリーブポリフェノール類によるオリーブオイルの栄養強化に基づく技法を使用して抗酸化能力を増大するための如何なる設定も、オイルの本来の官能特性を変性してはならず、苦味をもたらすオリーブポリフェノール類の量を増大させてもならない。そうしなければ、オイルの官能特性が事後的に変性され、その結果、過剰な苦味、辛味及び／又は渋味による不愉快な風味を生じ、結果的に、多くの消費者から拒絶されてしまう。
【００２４】
ポリフェノール類及びヒドロキシチロソルを食料品に添加することは周知である。米国特許第６９４２８９０号公報（特許文献１）には、オリーブ果実由来の固体を食料品に添加し、抗酸化剤（特に、オリーブポリフェノール類）を増大させる、食料品の栄養強化方法が記載されている。この方法は、脱苦味処理を受けていないオリーブから得られた固体で栄養強化されるべき食料品（例えば、植物油）を或る時間にわたって培養し、次いで、オイルから固形物を濾別しなければならない。この方法に関連する主要な問題点は、植物油の官能特性の変性に関連し、過剰な苦味及び／又は渋味がオイルのポリフェノール類含量の増大に伴って生成されるときに、不愉快な風味を生じることである。米国特許第６９４２８９０号公報に開示された発明によれば、特に、エキストラバージンオリーブオイルのオリーブポリフェノール類含量を１４５ｐｐｍから最大５３０ｐｐｍまで増大させるオリーブ固形物を２．５％だけ添加することにより最終製品を製造することにより、この変性を避けることができる。
【００２５】
米国特許第６１６２４８０号公報（特許文献２）には、抗酸化剤による植物油の栄養強化方法が記載されている。苦味除去されていないオリーブを植物油中に１〜３０日間浸漬し、抗酸化剤、特にオリーブポリフェノール類のレベルを増大させる。実施例１によれば、トスカーナ地方で収穫された苦味除去されていないオリーブを１０％添加し、トスカーナ地方のエキストラバージンオリーブオイルと共に３０日間ゆっくりと撹拌すると、エキストラバージンオリーブオイルのオリーブポリフェノール類含量が４２０ｐｐｍから５９１ｐｐｍに増大した。この最大増加量はこの発明により可能になる。この方法は、撹拌することを除けば、オリーブオイル中にオリーブを保存するために使用される周知の方法と実質的に同一である。
【００２６】
米国特許第６９４２８９０号公報及び米国特許第６１６２４８０号公報に記載された方法に関連する主要な問題点は、脂溶性であるポリフェノール類だけがオリーブ固形物又は油中のオリーブ類から（部分的に）抽出されることである。
【００２７】
米国特許第６７４６７０６号公報（特許文献３）には、食品組成物（スプレッド、ヴィネグレット及びトマトソース）の栄養強化方法が記載されている。これらの組成物は、水相中にチロソル及びヒドロキシチロソルを少なくとも１５ｐｐｍの高含量で含有することを特徴とする水相を２０〜１００ｗｔ％含有する。それにもかかわらず、この方法は殆ど効果がない。製造された食品組成物でチロソル及びヒドロキシチロソルの水相中の濃度が５０ｐｐｍ超に達する実施例が皆無である。
【００２８】
米国特許第６３６１８０３号公報（特許文献４）の実施例１３には、実施例４の方法により製造されたオリーブ抽出物を使用することを特徴とする、油中の抗酸化活性を高めることができる方法が記載されている。それにもかかわらず、対照サンプルの抗酸化活性（１ｇ当たり０．１８ｍＭトロロックス当量）は、この方法により約３倍（１ｇ当たり０．５３ｍＭトロロックス当量）までしか高められなかった。米国特許第６３６１８０３号公報の発明は、許容可能な純度品質を有するヒドロキシチロソルを含有するオリーブ抽出物を製造するために、有機溶媒（特に、極性溶媒）を使用しなければならない。極性水性溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル又はアセトンから選択され、極性油性溶媒は、例えば、エステル類、アミド類、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ＤＭＦ及びこれらの混合物類から選択される。例えば、有毒溶媒であるメタノールなどの有機溶媒の使用は好ましくない。特に、得られた最終製品が栄養分野で使用される場合には、有機溶媒の使用は好ましくない。
【００２９】
有機溶媒（及び或る場合には有毒な有機溶媒）の使用により生じる問題点に加えて、この方法に関連する主な問題点は、実施例１３（抗酸化剤組成物）に開示されたオリーブ抽出物濃厚物の再溶解に水／エタノール／酢酸混合物を必要とすることであり、抽出物を予め溶解させ、そして、栄養強化するべきオイル中に安定なエマルジョンを生成しなければならない。従って、この方法は栄養分野では不便である。
【００３０】
イタリア特許第０１３２６５５３号公報（特許文献５）には、オリーブ葉又は植生水から得られた抽出物をオリーブオイルに添加することにより得られた栄養強化オリーブオイルが記載されている。この抽出物は全てのタイプのポリフェノール類に富んでいる。すなわち、この抽出物は低純度のヒドロキシチロソルを有する。この特許及び前記の特許の問題点は主に、ポリフェノール類の総量に対して遊離ヒドロキシチロソルの量が低すぎることである。その他のポリフェノール類に対するヒドロキシチロソルの量が低ければ低いほど、オイル中の同じ量の遊離ヒドロキシチロソルを含有する栄養強化製品の苦味が強くなる。
【００３１】
米国特許第５９９８６４１号公報（特許文献６）は、苦味を増大させることなく、オリーブオイル中のポリフェノール類の総含量を高める方法に関する。この方法を実施するために、オリーブオイルは、ポリフェノール類と脱苦味酵素（例えば、Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼ（実施例１））を含有する水溶液で乳化される。その後、水中には溶解性であるが、油中には不溶性である、これら生成ポリフェノール類の損耗を避けるために、水は蒸発又は限外濾過により除去する。この方法の問題点は、非常に長時間（実施例によれば少なくとも２４時間かかり、１００時間に達することもある）を要すること、及び、オレウロペインアグリコン及び糖類を含む酵素反応の全ての生成物がオイル中に残留することである。
【００３２】
β−グルコシダーゼ（例えば、Sigma社から購入したアーモンド由来のもの）によるオレウロペインの加水分解は、通常、５０マイクロモルの閾値で苦味が検知されたオレウロペインアグリコンの異性体（又は異性体類）の製造のために幾人かの研究者により使用されていることに注目すべきである（Frank及び共著者, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238）。また、Mateoら, J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81, 71-75は、（Sigma社から購入したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼによるオレウロペインの加水分解により得られた）オレウロペインアグリコンのアルデヒド形と苦味との間の相関関係を立証した。換言すれば、米国特許第５９９８６４１号公報に記載された発明では、酵素加水分解の結果は、味見したときにオイルに苦味を与えるが、Ｋ２２５テストでは検出できないポリフェノール系化合物類などのような多数の副生物をもたらすことである。
【００３３】
また、蒸発による水分除去は、バージンオリーブオイルの官能特性に悪影響を及ぼすことも考慮すべきである。なぜなら、オリーブオイルの独特な芳香の元となる殆どの揮発性物質類は蒸発処理中に水と共に抽出されてしまうからである。
【００３４】
要約すれば、前記の方法は、長過ぎるか、又は複雑過ぎるか、或いは、栄養分野にとって苛酷過ぎるか、若しくはこれら全てである。更に、強過ぎる苦味、高すぎる刺激味強度又は高すぎる糖及び副生物含量を有さず、しかも、芳香揮発成分を失うことなく、食用油中に取り込むことができるヒドロキシチロソルの量が低すぎるので、酸化変性に対してＬＤＬを殆ど保護することができない。オイル中に取り込まれたポリフェノール類の殆どがヒドロキシチロソルよりも高い油溶性を特徴とするセコイリドイド類（オレウロペイン関連化合物類）であること、その結果として、オレウロペインアグリコン（ＡＯＡ）、３，４−ＤＥＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡとして、ヒドロキシチロソルよりも高い含量でオイルに取り込まれること、及び、これらオリーブポリフェノール類が主に苦味及び刺激味の元となることなどにより、前記の全ての方法は、総オリーブポリフェノール類を高含量で有するが、これら油中に存在する総オリーブポリフェノール類に対してヒドロキシチロソルを低含量でしか有しないオリーブオイルが得られるだけであることも注目しなければならない。オリーブオイルの官能特性を望ましくない形に変化させることができるこれらセコイリドイド類の取り込みは、実際に、前記の全ての方法で使用されるオリーブポリフェノール類源に直接関連しており、実際に、ヒドロキシチロソル中に低含量で及び／又は低純度で存在する。
【００３５】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】米国特許第６９４２８９０号公報
【特許文献２】米国特許第６１６２４８０号公報
【特許文献３】米国特許第６７４６７０６号公報
【特許文献４】米国特許第６３６１８０３号公報
【特許文献５】イタリア特許第０１３２６５５３号公報
【特許文献６】米国特許第５９９８６４１号公報
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Gutierrez-Rosalesら, J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6021-6025
【非特許文献２】Frankら, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 231-238
【非特許文献３】Mateoら、J. Am. Oil. Chem. Soc. 2004, 81, 71-75
【非特許文献４】Andrewesら、J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1415-1420
【非特許文献５】Beauchampら、Nature 2005, 437, 45-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の目的は、前記の従来技術に関連する問題点を解決し、そして、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用ではあるが、栄養強化食品の官能特性の望ましからざる変性を避けるためのヒドロキシチロソル源として使用されるべき栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療用のヒドロキシチロソル源として使用されるべきヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とする栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００４０】
本発明の他の目的は、ヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とするにもかかわらず、安定かつ耐久性のあるエマルジョンの形の、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【００４１】
本発明の更に別の目的は、極めて純度の高いヒドロキシチロソルを高い含量で有することを特徴とする栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
これらの目的は、オリーブ抽出物を有する栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品を提供する本発明により達成される。
【００４３】
オリーブ果実及びオリーブオイル抽出副生物から得られる前記のような溶剤不含有天然オリーブ抽出物の製造方法は、栄養強化食品の官能特性を不愉快な形に変性することなく、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品内の抗酸化能力を、未だかつて決して記載されたことのない程度に高めることができる。従って、本発明は抗酸化剤ヒドロキシチロソル高含有オリーブ抽出物の製造方法に関する。
【００４４】
本発明の別の側面は、下記の工程からなる、栄養強化食用油及び／又はオイル含有食料品の製造方法に関する。
（ａ）オリーブ果実又はオリーブオイル抽出残留物若しくは搾り滓（すなわち、オリーブオイル抽出からの前記のような残留物）から製造され、かつ、ヒドロキシチロソルに富んだ、液状と粉末状の間の適当なオリーブ抽出物を選択する工程。この選択は、栄養強化すべき栄養製品に応じて変化する。好ましくは、食用油の栄養強化のためには、液状のオリーブ抽出物を選択し、少なくとも水を１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のためには固形のオリーブ抽出物を選択する。
（ｂ）前記工程（ａ）で選択されたオリーブ抽出物をオイル及び／又はオイル含有製品に添合し、かつ、混合する工程。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例３参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣ（「高速液体クロマトグラフィー」の略。以下同じ）により測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図２】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例４参照）の抗酸化能力と、ヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図３】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例５参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図４】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例６参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図５】本発明により得られたオリーブ抽出物の配合量を高めることによる栄養強化の結果として、本発明により得られた栄養製品（実施例７参照）の抗酸化能力と、ＨＰＬＣにより測定されたヒドロキシチロソル中の抗酸化剤含量との間の線形相関を示すグラフ図である。
【図６】ホモジナイザーを使用して製造されたか、又はホモジナイザーを使用せずに製造された、液状オリーブ抽出物及びエキストラバージンオリーブオイルのエマルジョンの粒度分布曲線からなるグラフ図である。
【図７】ラットのトリグリセリドに対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図８】ラットの動脈硬化指数（総コレステロール値／ＨＤＬコレステロール値）に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図９】ラットの血漿中の総抗酸化能力（ＴＡＣ）に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図１０】ラットの収縮期血圧に対する、本発明によるオリーブ抽出物で栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの効果を示すグラフ図である。
【図１１】ラットの動脈硬化指数（総コレステロール値／ＨＤＬコレステロール値）に対する、本発明による高純度ヒドロキシチロソルに富んだオリーブ果実抽出物の効果を示すグラフ図である。図１１は実施例１２に関連する。この実施例では、動物群は表６により組織化された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の栄養製品は、ヒドロキシチロソルを少なくとも３０ｐｐｍ、好ましくは３０ｐｐｍ〜３００００ｐｐｍ含有する。栄養製品が例えば、均質化エマルジョン（好ましくは、マイクロエマルジョン）のような形の栄養強化食用油である場合、及び、栄養製品が前記のような栄養強化食用油を含有する食料品である場合、好ましい範囲は３０〜３００ｐｐｍである。この場合、ヒドロキシチロソル含量は好ましくは４５ｐｐｍ〜７０ｐｐｍの範囲内であり、一層好ましくは、５０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍの範囲内である。栄養製品が例えば、均質化エマルジョン（好ましくは、マイクロエマルジョン）を含有するソフトジェルカプセルのような形の、カプセル化された栄養強化食用油からなる栄養補助食品である場合、ヒドロキシチロソル含量は３００〜３００００ｐｐｍ、好ましくは、５００〜３０００ｐｐｍの範囲内である。
【００４７】
本発明による栄養強化オイルのＫ２２５値（下記の実施例１３及び１４参照）は０．２８以下であり、好ましくは０．２５以下である。更に、前記栄養強化オイルのＡＯＡ含量は、１２０ｐｐｍ未満、好ましくは８５ｐｐｍ未満、一層好ましくは５５ｐｐｍ未満である。
【００４８】
本発明による、かつ、前記のような添加オリーブ抽出物からなる栄養製品は優れた抗酸化能力を示す。
【００４９】
最後に、本発明の第４の側面として、本発明は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防及び治療における、栄養製品、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の使用に関する。前記のように、本発明の第１の側面は、高純度の形の抗酸化性ヒドロキシチロソルを大量に含むオリーブ抽出物の製造に関する。従来の問題点は、親水性ヒドロキシチロソルの油中への取り込みを高めることであった。この問題点は、溶媒を使用することなくヒドロキシチロソルを抽出する方法を使用することからなり、かつ、ヒドロキシチロソルを大量に含有し、そして、副生物、糖類および塩類に対して非常に高い純度を特徴とするする最終オリーブ抽出物を提供することができる本発明により解決された。
【００５０】
本発明の或る実施態様では、オリーブオイル抽出の残留物又は搾り滓をヒドロキシチロソル抽出の原料として使用できる。この方法は、本願出願人による同時係属特許出願ＥＰ−Ａ−０７００１７９１（出願日：２００７年１月２６日）及びＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００１７３（国際出願日：２００８年１月２８日）号明細書に記載されている。別の実施態様では、オリーブ抽出物の製造用の原料として、オリーブ果実を使用する。好ましくは、グリーンオリーブ、一層好ましくは、全形グリーンオリーブを使用する。
【００５１】
前記出願の明細書の教示に従った方法では、抽出残留物又は全形オリーブ果実若しくは圧潰オリーブ果実を、脱イオン水と、均質化／混合する。全形オリーブ果実又は均質化オリーブパルプ素材若しくは残留物素材を水と混合して混合物を生成したら、次の工程において、この混合物の水中で酸性加水分解を行う。この加水分解は、２０℃〜１４０℃、好ましくは７０℃〜１４０℃の範囲内の温度で、更に好ましくは連続的な滅菌システム中で１１０℃〜１４０℃の範囲内の温度で行われる。加水分解を受ける酸性混合物のｐＨ値は１．０〜６．０の範囲内である。加水分解後の混合物は当業者に公知の物理的方法（例えば、濾過及び／又は遠心分離）により清澄化され、加水分解生成物から全形オリーブ果実又は懸濁している固形物を除去し、そして、懸濁液中に固形物を殆ど含まない清澄化された溶液を得る。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記工程に続いて、前記のようにして得られた生成物を少なくとも１回、酸活性化アニオン交換樹脂及び吸着媒非イオン性樹脂から選択される樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、そして、前記クロマトグラフカラムに保持されている生成物を水で溶出する工程を実施する。
【００５３】
本発明の更に別の側面によれば、液状生成物は例えば、逆浸透濃縮法により濃縮される。更に別の工程として、クロマトグラフ精製及び逆浸透濃縮の後、得られた液状生成物を別の実施態様において、マルトデキストリン類のような担体と共に噴霧乾燥することにより固形化する。
【００５４】
前記のようにして得られたオリーブ抽出物はヒドロキシチロソルに非常に富み、出発物質及び副生物を殆ど含有せず、しかも、糖類及び塩類の含量が極めて低い。
【００５５】
前記の方法により得られる抽出物は液状又は固形状の何れの形状であってもよく、そして、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも４０％の純度、好ましくは、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも８０％の純度、更に好ましくは、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％の純度（波長２８０ｎｍで測定されるＨＰＬＣピークエリアにより決定される値）を特徴とする。本発明の好ましい側面によれば、本発明により得られるヒドロキシチロソル含有液状生成物（液状のオリーブ抽出物）は、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）又は一層好ましくは少なくとも４５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも３５％の総フェノール類含量を有する。本発明の更に好ましい側面によれば、本発明により得られるヒドロキシチロソル含有固形生成物（固形のオリーブ抽出物）は、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも２０％の総フェノール類含量を有する。
【００５６】
本発明の好ましい側面によれば、ヒドロキシチロソル含有固形生成物は、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度を有する。
【００５７】
これらの抽出物は有機溶媒を含有せず、また、糖類及び塩類も殆ど含有しない。
【００５８】
本発明のグリーンオリーブ抽出物は、ヒドロキシチロソルの含有量が非常に高く、しかも、ヒドロキシメチルフルフラルの含有量が低いので、オリーブオイル製造の残留物の抽出物として好ましい。これらの抽出物は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療に使用することができる。また、これらの抽出物は栄養補助食品の製造にも使用できる。
【００５９】
本発明の第２の側面は、オリーブ抽出物を有する栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の製造方法、すなわち、いわゆる機能性食品の製造方法に関する。
【００６０】
第１の工程は適当なオリーブ抽出物の選択である。オイルの栄養強化のためには、通常、液状のオリーブ抽出物が選択される。このようなオリーブ抽出物は、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）又は一層好ましくは少なくとも４５％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソル含量と、少なくとも９０％（２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣ測定値）の純度と、少なくとも３５％の総フェノール類含量を有する。このようなオリーブ抽出物の使用はオイルの栄養強化のために好ましい。その理由は、栄養強化オイルの所望の抗酸化能力に達するのに必要なオリーブ抽出物の量が少ないためにオイル中に存在する残留水が殆ど増大すること無く、オリーブ抽出物の安定なエマルジョンを製造できるからである。
【００６１】
実際、高ヒドロキシチロソル含量と、望ましからざる副生物（例えば、ＡＯＡ、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ及びｐ−ＨＰＥＡ−ＥＤＡ）低含量と、糖類及び塩類の実質的無含量の本発明によるオリーブ抽出物は、栄養強化すべきオイル中に添合されたとき、安定なエマルジョンを生成する。実際、例えば、３５％（Ｗ／Ｗ）以上の高ヒドロキシチロソル含量を特徴とするので、高ヒドロキシチロソル含量を特徴とする栄養強化オイルを得るために少量のオリーブ抽出物が好適である。更に、糖類及び塩類を殆ど含まないという、本発明によるオリーブ抽出物の純度のために、オリーブ抽出物を栄養強化すべきオイル中に添合したとき、乳化剤又はその他の添加剤無しであっても、安定なエマルジョンが得られる。その結果、得られた栄養強化オイルは食品、医薬品及び化粧品分野で使用できるという、即時的効果をもたらす。
【００６２】
従って、得られる栄養強化オイルはヒドロキシチロソルを少なくとも３０ｐｐｍ含有し、しかも、悪影響を全く受けていない官能特性を維持する。
【００６３】
水分を少なくとも１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のためには、通常、粉末状のオリーブ抽出物が選択される。このようなオリーブ抽出物のヒドロキシチロソル含量は少なくとも２０％（Ｗ／Ｗ）である。好適な担体は例えば、マルトデキストリン類、乳糖、カゼイネート類等である。このようなオリーブ抽出物の使用は、水分を少なくとも１０％含有するオイル含有製品の栄養強化のために好ましい。その理由は、このような粉末は取り扱いが簡単であり、しかも、オイル含有製品の所望の抗酸化能力に達するのに使用される範囲内のこのような栄養製品中に完全に溶解するからである。
【００６４】
第２の工程は、選択されたオリーブ抽出物をオイル及び／又はオイル含有製品に添合することからなる。オリーブ抽出物の栄養製品への添合は、各製品の技術的方法に従って混合及び均質化することにより行われる。
【００６５】
オイルの栄養強化は、その技術的製造中にオリーブ抽出物を添合することからなる。一般的に、液状のオリーブ抽出物は所望の重量比でオイルに添加され、制御された温度及び撹拌パラメータの元で完全に混合される。次いで、生成物を静置し、過剰量の水系オリーブ抽出物を除去する必要がある。これを行うために、例えば、常用のデカンテーションなどのような公知の方法を使用することができる。実際、植物油の製造過程で、幾つかの連続的な常用のデカンテーション工程は残留水を除去するために日常的に行われており、また、その製造過程で通常行われる最後のデカンテーション工程の直前に、自然な方法で、オリーブ抗酸化剤をオイルに添合させることができる。水系抽出物中のヒドロキシチロソル含量が高いために、各混合工程で、相当量のヒドロキシチロソルをオイル製品に移行させることができる。油相からデカンテーション除去された水相は通常、少量のヒドロキシチロソルを含有している。従って、更なる使用のために回収される。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様では、液状のオリーブ抽出物はオイルに添加され、制御された温度及び撹拌パラメータに従って、不活性雰囲気（例えば、窒素雰囲気）下で予備混合される。得られた生成物を２段工程均質化手順に従って運転されるホモジナイザー中に供給する。第１工程は、２００〜７００バールの圧力で行われ、第２工程は圧力を３０〜５０バールに維持して行われる。プレエマルジョンの均質化により、安定なエマルジョンを得ることが出来る。本発明の或る実施態様では、純粋なヒドロキシチロソルを水に添加し、得られた溶液をオイルと混合し、そして均質化してヒドロキシチロソルを油相に移行させる。特に、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療に使用する観点から、最終製品内に有機溶媒の痕跡が残らないようにするために、本発明による天然抽出物を使用することが好ましい。
【００６７】
固形のオイル含有製品の栄養強化は、その技術的製造中にオリーブ抽出物を添合し、そして混合することからなる。一般的に、オイル含有製品の製造方法は、（ａ）植物油及び／又は植物脂肪及び場合により、別の脂肪親和性成分類からなる油相の存在、（ｂ）前記（ａ）の油相に、制御された撹拌及び温度範囲の元での乳化剤の添加からなる乳化工程、及び（ｃ）水と、場合により、別の脂肪親和性成分類を含有する水相の存在を含むことを特徴とする。油相対水相の比率は９：１〜１：９の範囲内である。
【００６８】
オリーブ抽出物粉末を所望の比率で工程（ｃ）の水相へ添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で完全に溶解させる。その直後に、安定なｏ／ｗマトリックスを生成するために、乳化剤が予め添合された工程（ａ）の油相を工程（ｃ）の水相へ添加する。
【００６９】
本発明の第３の側面は、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品を製造するために、好ましくは前記のようなオリーブ抽出物の形でヒドロキシチロソルが添合された栄養製品に関する。本明細書で使用される「栄養製品」という用語は、食用油であるか又は少なくとも食用油を含有する、全ての食料品、食用製品、又は栄養補助食品を意味する。本発明の栄養製品は好ましくは、本発明のオリーブ抽出物を０．０１５％〜９３％（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で含有する。一層好ましくは、本発明のオリーブ抽出物を０．０１％〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲内の濃度で含有する。オリーブ抽出物をこの添加量で含有する食用油である栄養製品は例えばつぎのようなものであることができる。
（ａ）少し例を挙げれば、バージンオリーブオイル、エキストラバージンオリーブオイル、オリーブオイル、ランパンテオリーブオイル、精製オリーブオイル、粗製オリーブ搾り滓オイル、精製オリーブ搾り滓オイル、ヒマワリ油、トウモロコシ油、大豆油、亜麻仁油、扁桃油、キャノーラ油、サフラワー油、パーム油、ココヤシ油、菜種油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などのような様々な原料から得られる植物油、及び
（ｂ）少し例を挙げれば、藻類、オキアミ、大型ニシン、アンチョビ、マグロ、ニシン、サーディン、サバ、タラから得られた海産物油又は魚油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などのような様々な原料から得られるである海産物油又は魚油。
【００７０】
本発明のオリーブ抽出物の更に一層好ましい範囲は０．０５％〜３５％（ｗ／ｗ）からなる。少なくとも植物油を含有し、オリーブ抽出物を前記の添加量で含有する栄養製品は例えば、少し例を挙げれば、マーガリン、マヨネーズ、ガーリックマヨネーズ、ガスパーチョスープ、塗り広げ可能なソース、サラダドレッシングなどのようなオイル含有製品、前記オイル含有製品の技術的に変性された誘導体類又はその栄養強化に使用できる前記のものの２種類以上の混合物などである。
【００７１】
最後に、本発明の第４の側面は、心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療における、本発明２の栄養製品、栄養強化オイル及び／又はオイル含有製品の使用に関する。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様では、オリーブ抽出物（液状）及び食用油のエマルジョンを使用し、ソフトジェルカプセルを製造した。
【００７３】
ソフトジェルカプセルを製造する場合、様々な側面を考慮すべきである。考慮すべき第１の側面はカプセルサイズである。大抵の消費者が許容可能な上限サイズは約１．２ｇである。このサイズはその他のオイル栄養補助食品で通常使用されているサイズを示す。考慮すべき第２の側面は、一日当たりに摂取すべきカプセルの個数である。一般的に、１日当たりの摂取上限は４〜６カプセルである。一層大きなカプセルサイズが考慮される場合、飲み込み易いので、楕円形（１０００ｍｇ以上）が好ましい。本発明はこれらのパラメータにより制限されない。別の考慮事項は、作用効果の点から必要な最小投与量である。心臓血管系疾患、動脈内へのプラーク堆積、動脈性高血圧症及びメタボリック症候群の予防又は治療のための最小の投与量は食用油で２ｇである。この投与量は、ヒドロキシチロソルを一日当たり３〜５０ｍｇ送達する。例えば、投与量１ｇの栄養強化食用油を１日当たり２回投与することができる。
【実施例１】
【００７４】
オリーブ果実からのオリーブ抽出物の製造
オリーブ果実のサンプル２５Ｋｇを脱イオン水５０Ｌと混合した。得られた混合物を数分間混合した。次いで、濃度９８％の硫酸６３６ｇを添加した。得られた混合物を、１５ｐｓｉ（大気圧以上）のオートクレーブ中に、温度１２１℃で３０分間閉じ込めた。その後、濾過器で濾過することにより、固形残留物から水相を分離させた。濾過器に残された固相を脱イオン水１２．５Ｌで洗浄し、この洗浄工程から得られた水を、予め回収された水相と合わせた。次いで、約５６Ｌの水相を遠心分離して精製し、濾過器を通して固形粒子を除去した。ヒドロキシチロソルを１４１ｇ含有し、５０．５％のＨＰＬＣ純度を有する粗製水性抽出物が５２Ｌ得られた。
【００７５】
次いで、アセテートサイクルにより事前に活性化された、アニオンタイプの酸活性化イオン交換樹脂を含有するクロマトグラフカラムに粗製水性抽出物を装填した。例えば、ＩＲＡ−６７を使用できる。カラム終端部から回収される液相はヒドロキシチロソルを全く含有していない。それよりも、最初に装填したヒドロキシチロソルが少なくとも９０％回収されるまで、脱イオン水で連続的に溶出させた。
【００７６】
最初のカラムから得られた溶出相を、別の吸着媒非イオン交換樹脂含有クロマトグラフカラムに装填することが好ましい。例えば、ＸＡＤ−１１８０樹脂を使用できる。この第２のカラムの終端部から回収された液相はヒドロキシチロソルを全く含有していない。次いで、最初に装填したヒドロキシチロソルが少なくとも９０％回収されるまで、脱イオン水で樹脂からヒドロキシチロソルを溶出させた。
【００７７】
溶出相は、約９６．７％のＨＰＬＣ純度を有するヒドロキシチロソルを約１１４ｇ含有していた。
【００７８】
次いで、容量を濃厚生成物１０Ｌにまで減容させるために、パイロットプラントで得られたヒドロキシチロソルを１１４ｇ含有する精製抽出物の画分４６１Ｌを、２．５ｍ２の高分子膜を備えた逆浸透パイロットプラントを用いて濃縮した。次いで、ヒドロキシチロソルを３．５％含有するヒドロキシチロソル濃縮液を得るために、同じ材質からなる０．３５ｍ２高分子膜を使用した。最後に、逆浸透濃縮液を２４５ミリバールの真空圧下で７８℃のロータリーエバポレーターに装填し、液状のオリーブ果実抽出物の濃度を約１０倍に高め、９３．３％のＨＰＬＣ純度を有するヒドロキシチロソルの最終濃度を３７．２％（ｗ／ｗ）に達しさせた。
【実施例２】
【００７９】
噴霧乾燥によるオリーブ抽出物粉末の製造
実施例１で得られたヒドロキシチロソルを１９．５ｇ含有する液状の精製オリーブ抽出物２６０ｍｌのサンプルを、脱イオン水２６０ｍｌに予め溶解させたマルトデキストリン５８ｇと共にゆっくりと撹拌した。例えば、ジャガイモマルトデキストリンを使用できる。噴霧乾燥機に供給するために蠕動ポンプを使用した。このポンプは入口空気温度を１５０℃に予め平衡化させておいた。出口空気温度を１００℃未満にするために、供給速度を調節した。水分５．４％（カールフィッシャー法）及びヒドロキシチロソル含量２１．９％（ｗ／ｗ）の白色粉末が７６ｇ得られた。
【実施例３】
【００８０】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。６個のエキストラバージンオリーブオイルサンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、エキストラバージンオリーブオイルに添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを得た。
【００８１】
その直後に、６個の栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図１参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力は０．２４ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力は５．０５ｍＭトロロックス当量／ｇであった。すなわち、エキストラバージンオリーブオイルの抗酸化能力が２１倍高められたことを意味する。
【実施例４】
【００８２】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化ヒマワリ油の製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、ヒマワリ油の栄養強化のために選択した。６個のヒマワリ油サンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、ヒマワリ油に添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化ヒマワリ油を得た。
【００８３】
その直後に、６個の栄養強化ヒマワリ油のそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図２参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は５．４２ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例５】
【００８４】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化トウモロコシ油の製造
実施例１による方法で得られた濃度４０．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、トウモロコシ油の栄養強化のために選択した。６個のトウモロコシ油サンプル（各４００ｇ）を製造した。配合量を徐々に高めながら、液状のオリーブ抽出物を所望の重量比で、トウモロコシ油に添加し、厳格に制御された温度及び撹拌パラメータの元で、１時間にわたって完全に混合した。その後、撹拌を止め、そして、混合物をデカンテーション漏斗に充填し、７２時間静置した。その結果、過剰量のオリーブ抽出物が下層に生成された。この下層を上層のオイル相から分離させ、栄養強化トウモロコシ油を得た。
【００８５】
その直後に、６個の栄養強化トウモロコシ油のそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図３参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化トウモロコシ油の抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化ヒマワリ油の抗酸化能力は５．２３ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例６】
【００８６】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化マーガリンの製造
実施例２による方法で得られた濃度２３．３％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する固形の精製オリーブ抽出物のサンプルを、マーガリンの栄養強化のために選択した。６個のマーガリンサンプル（各２００ｇ）を次のようにして製造した。配合量を徐々に高めながら、固形のオリーブ抽出物を所望の重量比で、マーガリンのその他の常用成分類（例えば、ホエイ、ブライン等）と共に、水相に添加した。次いで、水相と、乳化剤（レシチン）が混合された精製オイルを、僅かに混合させながら、５０〜６０℃付近の温度でブレンドさせた。最後に、混合スプレッドを冷却し、固化させた。
【００８７】
その直後に、６個の栄養強化マーガリンのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図４参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化マーガリンの抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化マーガリンの抗酸化能力は１８９．０５ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例７】
【００８８】
オリーブ果実抽出物を有する栄養強化マヨネーズの製造
実施例２による方法で得られた濃度２３．３％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する固形の精製オリーブ抽出物のサンプルを、マヨネーズの栄養強化のために選択した。５個のマヨネーズサンプル（各４００ｇ）を次のようにして製造した。先ず最初に、卵黄をミキシングボウルに添加し、速度３で完全に混和した。別の容器で、オリーブ抽出物（水相に望ましい重量比に応じてオリーブ抽出物の配合量を段階的に増大させながら添加した）、蒸留水、レモンジュース、食酢及び塩を混和した。オリーブ抽出物が溶解されるまで撹拌した。この混合物に卵黄を添加し、速度３で約２〜３分間混和した。最後に、オイルをゆっくりと添加し、速度を６にまで上げてエマルジョンを作製した。
【００８９】
その直後に、５個の栄養強化マヨネーズのそれぞれからのアリコートを使用し、抗酸化能力（標準物質としてトロロックスを使用し、７３４ｎｍで測定されたラジカルＡＢＴＳ吸収能力）を測定し、かつ、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。測定結果を抗酸化能力対ヒドロキシチロソル含量としてプロットした場合（図５参照）、線形相関が得られた。具体的に、非栄養強化マヨネーズの抗酸化能力は０ｍＭトロロックス当量／ｇであったが、本実施例で使用された最高重量比における栄養強化マヨネーズの抗酸化能力は１４８．３３ｍＭトロロックス当量／ｇであった。
【実施例８】
【００９０】
ホモジナイザーを用いてオリーブ果実抽出物を乳化することによる栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの製造
実施例１による方法で得られた濃度３１．１％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。下記の表１に示される試験計画に従って、各１０００ｇの栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのサンプルを３個製造した。
【００９１】
表１
オリーブ抽出物 全圧（バール） 備考
配合量 第１段階／第２段階
μＬオリーブ抽出物／Ｌオイル
２３０ 加圧無し （対照，ホモジナイザー
使用せず）
２３０ ３００／３０
２３０ ５００／３０
【００９２】
容量１Ｌのエキストラバージンオリーブオイル内容物を容器に注ぎ入れ、撹拌した。その後、液状のオリーブ抽出物２３０μＬをエキストラバージンオリーブオイルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分間後、プレエマルジョンが生成された。このプレエマルジョンを、２段階均質化手法に従って運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。プレエマルジョンの均質化により安定なエマルジョンを得ることができる。
【００９３】
その直後に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの３個の各サンプルからのアリコートを使用し、レーザ粒径分析計により均質化効率を測定し、また、ＨＰＬＣによりヒドロキシチロソル含量を測定した。粒径分布曲線（図６参照）をプロットし、平均粒径を計算した。結果を下記の表２に要約して示す。
【００９４】
表２
サンプル ヒドロキシチロソル(ppm) 平均粒径(μm)
非均質化 ５１ １．９９９
３００／３０ ６０ １．２５９
５００／３０ ５９ ０．８４９
【００９５】
粒径分布曲線（図６参照）、平均粒径及びヒドロキシチロソル含量（表２）を考慮すれば、均質化技術は極めて申し分無く実行され、例えば、５００／３０バールでプレエマルジョンを均質化する場合、液状オリーブ抽出物とエキストラバージンオリーブオイルとの安定なマイクロエマルジョンを製造することができる。
【実施例９】
【００９６】
オリーブ果実抽出物を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのソフトジェルカプセルの製造
実施例１による方法で得られた濃度３５．６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシチロソルを含有する液状の精製オリーブ抽出物のサンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。
【００９７】
容量１Ｌのエキストラバージンオリーブオイル内容物を容器に注ぎ入れ、撹拌した。その後、液状のオリーブ抽出物４．６８ｇをエキストラバージンオリーブオイルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分間後、プレエマルジョンが生成された。このプレエマルジョンを、第１均質化段階として５００バールで、また、第２均質化段階として３０バールで、１０Ｌ／ｈで運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。
【００９８】
次いで、グリセリン、水及びマスキング剤及び着色剤として二酸化チタンを含有する食用ゼラチンで、上記で製造されたエマルジョンをカプセル封入した。カプセルを包装前に室温で２日間乾燥させた。
【００９９】
ソフトジェルカプセルの製造及び商業生産は当業者に周知である。従って、本明細書ではこれ以上詳細には説明しない。従って、本発明によるオリーブ果実抽出物を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルのソフトジェルカプセルは当業者が容易に製造することができる。
【実施例１０】
【０１００】
心臓血管系疾患の予防又は治療におけるオリーブ果実抽出物含有栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの使用
１０．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット４８匹（平均体重１５０〜１８０ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、各８匹毎の実験群に割り振った。各群の４匹のラットをサブグループとして、照明（１２時間毎の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１０１】
１０．２ 食餌
この実験に使用した食餌は次の通りであった。
・ 対照食餌（Ｃ）：精製ヒマワリ油が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌（Ａ）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ エキストラバージンオリーブオイル(evoo)（Ｏ）：エキストラバージンオリーブオイル(evoo)（ヒドロキシチロソル（HT）の天然含有量の測定値が５．７ｍｇHT／ｋｇ(evoo)のもの）が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ 標準ラット食餌＋栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与（５ｍｇHT／ｋｇ（体重））（Ｇ５）：標準ラット食餌(Panlab社製)に（本発明の実施例３により製造された）栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与を併用。ヒドロキシチロソル(HT)５ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。
・ 標準ラット食餌＋栄養強化エキストラバージンオリーブオイル（Ｇ８）の強制経口投与（８ｍｇHT／ｋｇ（体重））（Ｇ８）：標準ラット食餌(Panlab社製)に（本発明の実施例３により製造された）栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの強制経口投与を併用。ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を含有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。
【０１０２】
飲料水と食餌は任意に摂取させた。しかし、全研究を通じて、各ラット毎の平均給餌量は３０ｇ／日（ラット毎の実際の食餌摂取量は不知）であった。更に、各ラット群に、毎日５ｍｇHT／ｋｇ（体重）及び８ｍｇHT／ｋｇ（体重）をそれぞれ給餌するために、Ｇ５及びＧ８食餌を受けているラット群に栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを正確な投与量で強制経口投与により摂取させた。脂肪の酸化を避けるために、正しい配合量の標準ラット食餌(Panlab社製)及び脂肪／オイルを混合することにより全ての食餌を毎日調製し、かつ、使用直前まで４℃で暗所に保存した。また、摂取されずに残った前日の食餌は廃棄した。
【０１０３】
本研究に使用したＯ、Ｇ５及びＧ８食餌内のヒドロキシチロソル（ＨＴ）濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【０１０４】
１０．３ 実験計画
実験計画を下記の表３に示す。
【０１０５】
表３
群 初日から ３１日目から 備考
３０日目まで ６０日目まで
１ 食餌Ｃ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＣＣ
（対照食餌）
２ 食餌Ａ 食餌Ａ 給餌食餌：ＡＡ
（アテローム性食餌、負対照）
３ 食餌Ａ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＡＣ
（アテローム性食餌後の対照食餌の効果）
４ 食餌Ａ 食餌Ｏ 給餌食餌：ＡＯ
（アテローム性食餌後の天然含有量 5.7mgHT/kg(evoo)のevoo食餌の効果）
５ 食餌Ａ 食餌Ｇ５ 給餌食餌：ＡＧ５
（アテローム性食餌後、日用量が5mgHT/kg
(体重)となる栄養強化evoo食餌の効果）
６ 食餌Ａ 食餌Ｇ８ 給餌食餌：ＡＧ８
（アテローム性食餌後の、日用量が8mgHT/kg
(体重)となる栄養強化evoo食餌の効果）
【０１０６】
ＣＣ，ＡＡ，ＡＣ，ＡＯ，ＡＧ５及びＡＧ８食餌で処理されるラット群は次のようにして給餌した。
ＣＣ又はＡＡ食餌でそれぞれ処理されるラット群には、２ヶ月間食餌C又はＡを給餌した。
ＡＣ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｃ食餌（ヒマワリ油が全く配合されていない標準ラット食餌(Panlab社製）だけからなる食餌）を給餌した。
ＡＯ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｏ食餌（天然含有量5.7mgHT/kg(evoo)のevoo食餌）を給餌した。
Ｇ５食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｇ５食餌（日用量が5mgHT/kg(体重)となる栄養強化evoo）を強制経口投与により給餌した。
Ｇ８食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｇ８食餌（日用量が8mgHT/kg(体重)となる栄養強化evoo）を強制経口投与により給餌した。
【０１０７】
実験終了時点で、絶食ラットに麻酔をかけ、安楽死させた直後に心臓内穿刺を行い血液を試験管に捕集した。分析のために血漿を遠心分離法により分離させた。
【０１０８】
１０．４ 血漿中の脂質及び総抗酸化能力（ＴＡＣ）の測定
総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の血漿濃度を、（スペインのバルセロナに所在する）Biosystems社から購入した市販のキットを使用し、製造者の取り扱い指示書に従って、比色定量分析法により測定した。
【０１０９】
血漿の総抗酸化能力は、標準物質としてトロロックスを使用し、Reら（１９９９）により開示された方法に従って測定した。新鮮な血漿をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、そして２０μＬを、ＡＢＴＳ［２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）］＋ラジカルカチオン９８０μＬと共に、暗所で、室温で１０分間培養した。１０分後、吸光度を７３４ｎｍで測定した。過硫酸カリウム１４ミリモル(mM)水溶液４４０μＬをＡＢＴＳ(Sigma-A1808)７mM水溶液２５ｍＬに添加し、暗所で１２〜１４時間培養することにより、ＡＢＴＳ＋カチオン母液を調製した。使用液は、７３４ｎｍにおける吸光度が０．７±０．０２になるまで、母液をＰＢＳで希釈することにより得た。
【０１１０】
１０．５ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、一方向ANOVA（分散分析）により分析した。グループ間の差分はTukeyテスト（多重比較検定）により評価した。差分はＰ値が＜０．０５である場合に、有意と見做された。データはSigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１１１】
１０．６ 考察
得られた結果を図７〜図９に示す。トリグリセリドレベル、動脈硬化指数及び総抗酸化能力(TAC)は各ラット群と相関されている。
【０１１２】
図７は、トリグリセリドレベルと、異なる食餌スキームに従って分類されたラットとの間の相関関係を示す。図７によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群１は最も低いトリグリセリドレベルを示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最も高いトリグリセリドレベルを示す。ラット群１とラット群２の間のトリグリセリドレベル差は、Ｐ値が＜０．００１なので、統計的に有意である。興味深い結果が、Ｇ５食餌及びＧ８食餌でそれぞれ処理されたラット群５とラット群６について示されている。最初の一ヶ月間アテローム性食餌を給餌されたラットであっても、引き続く処理中に、標準ラット食餌と共に本発明による栄養強化エキストラバージンオリーブオイルを強制経口投与で給餌されると、ラット群５とラット群１又はラット群６とラット群１との間のトリグリセリドレベルには統計的有意差が認められなかったことを、このトリグリセリド値は示している。換言すれば、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、トリグリセリドの値が、対照食餌により得られるレベルに匹敵する値にまで顕著に低下したことが、ラット群Ｇ５及びＧ８について認められた。アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、更に一ヶ月間、標準ラット食餌と共にエキストラバージンオリーブオイル(evoo)だけをラット（ラット群４）に給餌した場合には、同じ結果が認められなかった。この場合、トリグリセリドレベル（負対照ラット群２のトリグリセリドレベルよりも低いとしても）は、対照食餌（ラット群１）を給餌されたラット群について測定されたトリグリセリドレベルに対する統計的有意差がＰ値＜０．００１であった。更に、Ｐ値＜０．００１なので、ラット群３とラット群１との間のトリグリセリドレベルの統計的有意差が認められた。このことは、非栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの効果は、アテローム性食餌の一ヶ月後の標準ラット食餌（Ｇ３）の効果を殆ど上回らないことを意味する。
【０１１３】
図８は、動脈硬化指数と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図８によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群は最低動脈硬化指数を示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最高動脈硬化指数を示す。Ｐ値＜０．００１なので、ラット群１とラット群２との間には動脈硬化指数の統計的有意差が存在する。興味深い結果が、Ｇ５食餌及びＧ８食餌でそれぞれ処理されたラット群５とラット群６について示されている。ラット群５とラット群１又はラット群６とラット群１との間の動脈硬化指数の統計的有意差は認められなかった。換言すれば、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、動脈硬化指数値が、対照食餌で得られる値に匹敵する値にまで顕著に低下したことが、ラット群Ｇ５及びＧ８について認められた。これに対して、アテローム性食餌で一ヶ月間処理した後、更に一ヶ月間、標準ラット食餌と共にエキストラバージンオリーブオイル(evoo)だけをラット（ラット群４）に給餌した場合には、同じ結果が認められなかった。この場合、動脈硬化指数値（負対照ラット群２の動脈硬化指数値と統計的有意差があったとしても）は、Ｐ値＜０．０５なので、対照食餌を給餌されたラット群（ラット群１）について検出された動脈硬化指数値に対して統計的有意差を生じた。
【０１１４】
図９はＴＡＣ血漿値と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図９によれば、ラット群５とラット群６が最高総抗酸化能力を示す。ラット群５とラット群１（Ｐ値＜０．００１）とラット群６とラット群１（Ｐ値＜０．００１）との間の総抗酸化能力値には統計的有意差が存在する。この結果は、本発明による栄養強化オイル／オイル含有製品及び特に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルは幾つかの効果をもたらし、かつ、心血管系の保護に使用できることを再確認する。実際、高コレステロール／トリグリセリドレベル、低ＨＤＬコレステロールレベル及び特に被酸化ＬＤＬは、動脈内のアテローム性プラーク堆積及びメタボリック症候群に付随するリスクファクター（危険因子）の一つである。前記の結果を要約すれば、オリーブ抽出物を含有する栄養強化栄養製品は心血管系発作に関するバイオマーカーを有する効果について実験が行われ、得られた結果は、本発明によるオリーブ抽出物による栄養強化を受けていない類似の栄養製品について得られた結果と比較された。測定された全てのパラメータを考慮すると（図７〜図９参照）、栄養強化栄養製品（オリーブ抽出物含有）の成分類は相乗効果を示すということが結論付けられる。更に、栄養強化栄養製品（本発明によるオリーブ抽出物含有）の規則的投与は心血管系を保護し、心血管系発作の発生を大なり小なり防止し、その結果、当該製品は健康増進栄養製品として申し分の無いものであるということが結論付けられる。
【実施例１１】
【０１１５】
高血圧症治療における栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(本発明によるオリーブ抽出物が添加されたevoo)の使用
１１．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット３６匹（試験開始時点の体重約２００ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、６個の実験群（各群当たりラット６匹）に割り振り、照明（１２時間の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１１６】
１１．２ 食餌
整定期間中及び試験期間中、ラットには固形のラット用標準食餌(Panlab社製)を給餌した。飲料水及び餌は自由に摂取させた。整定期間の７日間が経過した後、本試験による治療を開始した。
【０１１７】
１１．３ 実験計画
栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(本発明によるオリーブ抽出物が添加されたevoo)の効果を測定するため、高血圧症モデルの誘発用としてＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステル(L-NAME)を使用した。
【０１１８】
整定期間経過後、L-NAME誘発高血圧症治療の開始前に、動脈血圧の基礎データ(D0)をLetica5002測定器で測定した。
【０１１９】
ラットを下記の表４に示される実験計画に従って処置した。
【０１２０】
表４
L-NAME
群 含有飲料水 強制経口投与 備考
１ 無し 無し 高血圧症の誘発無し
２ 40mgL-NAME/kg* 無し 高血圧症誘発
（負対照）
３ 40mgL-NAME/kg* エキストラバージン 天然含有量5.7mgHT/kgevoo
オリーブオイル のエキストラバージン
(evoo)0.2mL オリーブオイル(evoo)の投与
と並行して高血圧症誘発
４ 40mgL-NAME/kg* 本発明によるオリーブ HTの一日摂取量が5mg/kg
抽出物が添加された (体重)となる栄養強化evoo
栄養強化evoo0.2mL の投与と並行して高血圧症
従って、一日摂取量 誘発
5mgHT/kg(体重)となる
５ 40mgL-NAME/kg* 本発明によるオリーブ HTの一日摂取量が8mg/kg
抽出物が添加された (体重)となる栄養強化evoo
栄養強化evoo0.2mL の投与と並行して高血圧症
従って、一日摂取量 誘発
8mgHT/kg(体重)となる
6 40mgL-NAME/kg* カプトプリル100mg/kg カプトプリル(降圧剤)100mg
の投与と並行して高血圧症
誘発（正対照）
＊Ｌ−ＮＡＭＥ処理剤は、ラット１匹当たり２００ｇの体重を考慮し、そして、ラットへの平均一日給水量を４０ｍＬ／日に標準化して、自由に摂取できる飲料水摂取を通して全てのラット群に投与した。但し、ラット毎の実際の水摂取量は不知。
【０１２１】
１１．４ 活性のクロノグラム(Cronogramme)
ラットを習慣付けるために、整定期間中、Lectica5002測定器を用いて尻尾動脈の脈動を記録することにより動脈血圧の測定を行った。
【０１２２】
試験測定／処置のクロノグラムを下記の表５に要約して示す。
【０１２３】
表５
日数 動脈血圧の測定 L-NAME補給 強制経口投与
飲料水
０ 有り 有り 無し
１ 無し 有り 有り
２ 有り 有り 有り
３ 無し 有り 有り
４ 有り 有り 有り
５ 無し 有り 有り
６ 無し 有り 有り
７ 有り 有り 有り
【０１２４】
１１．５ 動脈血圧の測定
動脈血圧は前記のクロノグラムに従って、尾カフ(tail-cuff)法により定期的に測定した。尾動脈の脈動を検出可能にするため、測定前にラットを３７℃で１０分間静置した。本研究で使用した測定器のLE5002(スペインのバルセロナに所在するLetica,Hospitalet社製)は正確なマイクロプロセッサプログラムと結合された高感度パルス変換器を有し、その結果、正確な動脈血圧の測定ができる。動脈血圧測定は、概日サイクルの如何なる影響も避けるために、一日の同じ時間に行った。
【０１２５】
１１．６ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、SigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１２６】
１１．７ 考察
図１０は、血圧検出値と、異なる処置スキームに従って分類されたラット群との間の相関関係を示す。図１０によれば、ラット群１は高血圧を示さなかったが、ラット群２はL-NAME処置により誘発された高く、増大化する血圧値を示した。ラット群６（正対照）は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、カプトプリル（公知の高効率降圧剤）で処置したので、血圧値の顕著な低下が示された。ラット群３は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、エキストラバージンオリーブオイル(evoo)で処置し、一方、ラット群４及び５は、L-NAME高血圧症誘発と同時に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイル(栄養強化evoo)で処置した。ラット群４及び５の血圧値は、ラット群３の血圧値よりも著しく低かった。従って、本発明による栄養強化エキストラバージンオリーブオイルにより発現される高血圧症に対する作用は、非栄養強化evooにより発現される作用に比べて、極めて優れている。
【０１２７】
動脈性高血圧症は動脈内のアテローム性プラーク堆積及びメタボリック症候群に付随するリスクファクター（危険因子）の一つなので、前記の結果は非常に興味深い。本発明によるオリーブ抽出物により栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルが動脈血圧に及ぼす効果について研究し、そして、オリーブ抽出物による処置を受けなかった対照ラット群と比較した。収縮期血圧測定値（図１０参照）を考慮すれば、オリーブ抽出物及び本発明によるオリーブ抽出物を含有する栄養製品の規則的投与は抗高血圧作用を示し、心血管系発作の発生を大なり小なり防止すると結論付けることができる。本発明によるオリーブ抽出物を含有する栄養製品は、健康を増進する栄養補助食品と見做すことができ、従って、抗高血圧作用を有する栄養強化エキストラバージンオリーブオイルと類似の機能性食品を製造するための有効な手段である。
【実施例１２】
【０１２８】
心臓血管系疾患の予防又は治療における高純度ヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物の使用
１２．１ 動物
オスのスプラーグ・ドーリーラット３２匹（平均体重１５０〜１８０ｇ）をHarlan Interfauna Iberica SA社（スペインのバルセロナに所在）から購入し、全ての実験中、Murcia大学の動物実験施設内で飼育した。ラットを無作為に、各群８匹の４個の実験群に割り振った。各群の４匹のラットをサブグループとして、照明（１２時間毎の日中／夜間サイクル）、温度（２２±２℃）及び湿度（６０％）の標準的条件下で飼育ケージに収容した。
【０１２９】
１０．２ 食餌
この実験に使用した食餌は次の通りであった。
・ 対照食餌（Ｃ）：精製ヒマワリ油が３％添加された９７％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌（Ａ）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)
・ アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソル（８ｍｇHT／ｋｇ（体重））強制経口投与（Ａ−Ｇ８）：アテローム性動脈硬化症を誘発させるためにコレステロール(Aldrich社製)が１．５％及びラードが３％添加された９５．５％標準ラット食餌(Panlab社製)＋ヒドロキシチロソル抽出物（８ｍｇヒドロキシチロソル／ｋｇ（体重））強制経口投与。ヒドロキシチロソル(HT)８ｍｇ／ｋｇ（体重）を全てのラットに給餌するために、毎日、強制経口投与により摂取させた。
【０１３０】
飲料水と食餌は任意に摂取させた。しかし、全研究を通じて、各ラット毎の平均給餌量は３０ｇ／日（ラット毎の実際の食餌摂取量は不知）であった。脂肪の酸化を避けるために、正しい配合量の標準ラット食餌(Panlab社製)及び脂肪／オイルを混合することにより全ての食餌を毎日調製し、かつ、使用直前まで４℃で暗所に保存した。また、摂取されずに残った前日の食餌は廃棄した。
【０１３１】
本研究に使用したＡ−Ｇ８食餌内のヒドロキシチロソル（ＨＴ）濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【０１３２】
１２．３ 実験計画
実験計画を下記の表６に示す。
【０１３３】
表６
群 初日から ３１日目から 備考
３０日目まで ６０日目まで
１ 食餌Ｃ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＣＣ
（対照食餌）
２ 食餌Ａ 食餌Ａ 給餌食餌：ＡＡ
（アテローム性食餌、負対照）
３ 食餌Ａ 食餌Ｃ 給餌食餌：ＡＣ
（アテローム性食餌後の対照食餌の効果）
４ 食餌Ａ−Ｇ８ 食餌Ａ−Ｇ８ 給餌食餌：ＡＧ８−ＡＧ８
（アテローム性食餌に対する8mgHT/kg 体重の効果）
【０１３４】
ＣＣ，ＡＡ，ＡＣ及びＡ−Ｇ８食餌で処理されるラット群は次のようにして給餌した。
ＣＣ又はＡＡ食餌でそれぞれ処理されるラット群には、２ヶ月間食餌C又はＡを給餌した。
ＡＣ食餌で処理されるラットには、１ヶ月間Ａ食餌（アテローム性食餌、負対照）を給餌し、続いて、更に１ヶ月間Ｃ食餌（ヒマワリ油が全く配合されていない標準ラット食餌(Panlab社製）だけからなる食餌）を給餌した。
ＡＧ８−ＡＧ８食餌で処理されるラットには、２ヶ月間Ａ−Ｇ８食餌（アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソル８ｍｇ／ｋｇ（体重）強制経口投与）を給餌した。
【０１３５】
実験終了時点で、絶食ラットに麻酔をかけ、安楽死させた直後に心臓内穿刺を行い血液を試験管に捕集した。分析のために血漿を遠心分離法により分離させた。
【０１３６】
１２．４ 統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表示され、かつ、一方向ANOVA（分散分析）により解析した。グループ間の差分はTukeyテスト（多重比較検定）により評価した。差分はＰ値が＜０．０５である場合に、有意と見做された。データはSigmaStatソフトウェア（バージョン２．０３）を用いて解析した。
【０１３７】
１２．５ 考察
得られた結果を図１１に示す。動脈硬化指数は前記のように表６に示される各ラット群と相関されている。
【０１３８】
図１１は、動脈硬化指数と、異なる食餌スキームにより分類されたラットとの間の相関関係を示す。図８によれば、ＣＣ食餌（対照食餌）で処理されたラット群は最低動脈硬化指数を示すが、ＡＡ食餌（アテローム性食餌，負対照）で処理されたラット群２は最高動脈硬化指数を示す。Ｐ値＜０．００１なので、ラット群１とラット群２との間には動脈硬化指数の統計的有意差が存在する。興味深い結果が、本実験においてＡ−Ｇ８食餌で処理されたラット群４について示されている。ラット群４とラット群１との間の動脈硬化指数の統計的有意差は認められなかった。換言すれば、Ａ−Ｇ８ラット群については、アテローム性食餌＋ヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物の強制経口投与で２ヶ月間処理した後、対照食餌により得られる動脈硬化指数に匹敵する不変的動脈硬化指数が認められた。これに対して、最初の１ヶ月間はアテローム性食餌で処理し、引き続く１ヶ月間は標準ラット食餌だけが給餌されたラット群３の場合、同じ効果は認められなかった。この場合、（負対照ラット群２の動脈硬化指数値と統計的有意差があったとしても）動脈硬化指数値は、Ｐ値＜０．０５なので、対照食餌を給餌されたラット群（ラット群１）について検出された動脈硬化指数値に対して統計的有意差を生じた。ラット群４からもたらされた動脈硬化指数値は、本発明により得られたヒドロキシチロソルに富むオリーブ果実抽出物による予防効果を示唆する。
【０１３９】
全ての測定パラメータを考慮すれば、本発明によるオリーブ抽出物の規則的投与は心臓血管系を保護し、動脈内におけるアテローム性プラークの堆積及びメタボリック症候群に付随すると考えられる幾つかのリスクの発現を防止するものと結論付けることができる。従って、本発明のオリーブ抽出物は、栄養補助食品の製造に使用すべき、健康促進天然抽出物であると十分に考えられる。
【０１４０】
前記のように、本発明の食用油は本来の官能特性を維持する。すなわち、苦味値を全く増大させず、しかも、オレウロペイン系アグリコン（例えば、アルデヒド形のオレウロペイン系アグリコン）及び糖類（例えば、グルコース、すなわち、オレウロペイン中に存在する糖）などのような複合フェノール類（例えば、オレウロペイン、すなわち、ヒドロキシチロソルのエステル）などの加水分解副生物を全く含有しない。
【０１４１】
下記は、オイル、すなわち、オリーブオイルに対して通常行われる品質試験の説明である。
【０１４２】
１）酸度
酸度は、試験されるオイル中の遊離脂肪酸の含量割合（重量％）を示す。遊離脂肪酸は通常、無傷のオリーブから得られるオイル中にも存在する。トリグリセリドが生成されると、果実中に天然に存在する酵素（リパーゼ）の作用により、酸度が段々と高まる。これは、トリグリセリド分子からの脂肪酸の分離（脂肪分解）を助長する。同じ脂肪分解現象は、オリーブ果実上で生長する微生物により生成される酵素によっても起こり得る。従って、官能特性的に優れ、かつ、一層低い酸度を有する生成物を得るためには、オリーブを良好な状態で貯蔵庫内に保存しなければならない。
【０１４３】
２）過酸化物値
試験されるオイル中の過酸化物の含量は過酸化物値で表される。過酸化物値が高まるほど、オイルの酸化による劣化が大きい。次には、過酸化物は更なる酸化を受け、異なる方法で検出可能なその他の成分類（アルデヒド類、ケトン類等）の生成を起こす。これらの化合物類（二次酸化化合物類と呼ばれる）は、油酸敗を起こす原因である。酸化及び果実の組織内に存在する酵素類（リポキシゲナーゼ類）のために、圧搾前の果実内には或る濃度の過酸化物が既に存在する。特定の自然環境（例えば、凍結点以下の温度、ダシック(dacic)侵入、干魃等）又は不適切に収穫されかつ保存されたオリーブは、過酸化物の更なる生成が助長される。粉砕中であっても、不適切な加工又は不衛生なオリーブ圧搾機及び／又は容器などにより、過酸化物は著しく増大することができる。最後に、オイルを光源又は熱源に長期間曝露すると過酸化物が増大する。過酸化物類は滴定により検出できる。
【０１４４】
３）紫外線による分光光度研究
このテストは、同じ分析手法で決定される３種類のパラメータ（Ｋ２３２，Ｋ２７０，ΔＫ）の測定からなる。Ｋ２３２の値が大きければ大きいほど、共役ジエン類の濃度も一層高いが、Ｋ２７０は共役ジエン類の濃度と釣り合う。しかし、共役ジエン類の酸化化合物類はＫ２３２の一因となるが、二次酸化の化合物類（アルデヒド類、ケトン類等）はＫ２７０の一因となる。
【０１４５】
この理由により、Ｋ２７０の値がオリーブオイルが属すると思われるカテゴリーの限界値を超えている場合、ＥＣ規則は二次的分光光度テストの前にサンプル（アルミナを含む）に対して特別な前処理を行うことを規定している。新たな測定値が限界値を超えている場合、このオリーブオイルは純粋ではないと宣言しなければならない。
【０１４６】
４）苦味テスト
このテストは、Gutierrezら，J.Am.Oil.Chem.Soc. 1992, 69(4), 394-395に記載された方法に従って行われる。この試験は、２２５ｎｍにおける吸光度（Ｋ２２５テスト）とオリーブオイルの苦味との間に線形相関が存在することを見出した。
【０１４７】
経験的に、Ｋ２２５値が０．３００以上の場合、オリーブオイルを直接消費すると問題が起こることが知られている。更に、０．３６０程度又はこれ以上のＫ２２５値は、殆どの消費者により拒絶される極めて苦いオリーブオイルに該当する。
【実施例１３】
【０１４８】
比較例：異なるオリーブポリフェノール源により栄養強化されたエキストラバージンオリーブオイルの製造
比較のために、実施例１による方法で得られた精製オリーブ抽出物のサンプルとオリーブ葉から及びオリーブ工場植生水からの抽出物の市販サンプルを、エキストラバージンオリーブオイルの栄養強化のために選択した。各抽出物の仕様を下記の表Ｃ１に示す。
【０１４９】
表Ｃ１
抽出物 ＨＴ（％） オレウロペイン ＨＴ純度 残留有機溶
（％） (HPLC280nm) 媒(ppm)
精製オリーブ抽出物 ３４．５ 不検出 ９３．４ 不検出
（実施例１によるもの）
オリーブ葉抽出物 ０．４ ３５．６ ５．２ エタノール
156ppm
オリーブ工場植生水 ２．５ ０．２ ５１．３ アセトン
105ppm
【０１５０】
容量３Ｌボトルのエキストラバージンオリーブオイルをスーパーマーケットで購入し、別のテストで使用した。
【０１５１】
前記エキストラバージンオリーブオイル各５００ｍＬのサンプル４個を、それぞれのガラスビーカに注ぎ入れた。そして、別の抽出物を下記の表Ｃ２に従って添加した。
【０１５２】
表Ｃ２
抽出物 抽出物添加量 オイル中のＨＴの最高理論
（ｇ） 増大量(ppm)
A)精製オリーブ抽出物 ０．１ ６９
（実施例１によるもの）
B)オリーブ葉抽出物 ２０ １６０
C)オリーブ工場植生水 ２０ １０００
D)抽出物不添加（対照） −− −−−
【０１５３】
次いで、各テストＡ，Ｂ，Ｃ及びＤを下記のようにして行った。
【０１５４】
Ａ）液状の精製オリーブ抽出物（実施例１によるもの）０．１１ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、１００ｒｐｍで穏やかに撹拌することにより混合した。３０分後、プレエマルジョンが精製された。このプレエマルジョンを２段階均質化方法に従って運転されるホモジナイザーの供給ホッパーに給送した。第１段階は３００バールの圧力、第２段階は３０バールの圧力でそれぞれ操作されるプレエマルジョンの均質化により安定なエマルジョンを得ることができる。
【０１５５】
Ｂ）オリーブ工場植生水抽出物２０ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、６０℃で２時間磁気的に撹拌した（イタリア特許第１３２６５５３号公報の比較例１と比較するため）。加熱処理完了後、サンプルは暗緑色を呈し、依然として多数の固形物を含んでいた。その後、固形物をデカント法により除き、オリーブオイルを室温にまで冷却し、最後に、サンプルを遠心分離し、固形物を除去した。
【０１５６】
C)オリーブ葉抽出物２０ｇを５００ｍＬのエキストラバージンオリーブオイルサンプルに添加し、６０℃で２時間磁気的に撹拌した（イタリア特許第１３２６５５３号公報の比較例３と比較するため）。加熱処理完了後、サンプルは依然として多数の固形物を含んでいた。その後、固形物をデカント法により除き、オリーブオイルを室温にまで冷却し、最後に、サンプルを遠心分離し、固形物を除去した。
【０１５７】
これらの直後に、栄養強化エキストラバージンオリーブオイルの３個のサンプル（サンプルＡ，Ｂ及びＣ）と、エキストラバージンオリーブオイルの１個の対照サンプル（サンプルＤ）からなる４個のサンプルのそれぞれからアリコートを採取し、このアリコートを、Gutierrezら，J.Am.Oil.Chem.Soc. 1992, 69(4), 394-395に記載された方法に従って測定される苦味指数（Ｋ２２５）測定、及びＨＰＬＣによるヒドロキシチロソルとオレウロペイン含量測定に使用した。測定結果を下記の表Ｃ３に要約して示す
【０１５８】
表Ｃ３
抽出物 K225 オイル中の オイル中のオレ オイル中のＨＴ取込
ＨＴ(ppm) ウロペイン み歩留まり（％）
(ppm)
A)精製オリーブ 0.24 71 不検出 92.8
抽出物実施例１
によるもの）
B)オリーブ葉 0.35 28 10 13.1
抽出物
C)オリーブ 0.32 38 1 3.1
工場植生水
D)抽出物不 0.25 7 不検出 ---
添加（対照）
【０１５９】
前記の表に示された予備テストでは、過剰な苦味及び／又は渋味による不快な風味を起こすオリーブオイルの官能特性の変化を避けながら、ヒドロキシチロソルのレベルを高めるためには、オリーブ抽出物の純度及び出所が必須要件であることが示された。
【０１６０】
更に、オリーブ葉抽出物及びオリーブ工場植生水抽出物の使用及びイタリア特許第１３２６５５３号公報に記載された前記の処理方法（６０℃で２時間加熱）の使用は、苛酷過ぎ、技術的に複雑であり、しかも実際的ではない（処理後にオリーブオイル中に大量の固形物が残留する）か、若しくは、栄養分野で商業的に実行できない（オリーブオイル中に取り込まれるヒドロキシチロソルの含量が極めて低い）。更に、植物油中に取り込まれるヒドロキシチロソルの量が少なすぎて、酸化変性に対してＬＤＬを殆ど保護することができない。
【実施例１４】
【０１６１】
比較例：異なる抽出物により栄養強化された植物油の官能特性の測定
前記の実施例１３におけるサンプルＡ〜Ｃ及び対照サンプルＤを下記の品質特性についてテストした。表Ｃ４に要約して示す。
【０１６２】
表Ｃ４
抽出物 遊離脂肪酸 過酸化物指数 Ｋ２７０ Ｋ２３２
オレイン酸含量 meqO2/Kgとして NMT0.22 NMT2.5
(%)として NMT20
NMT0.8%
A)精製オリーブ 0.22 7 0.17 1.76
抽出物実施例１
によるもの）
B)オリーブ葉 0.35 9.5 0.27 2.13
抽出物
C)オリーブ 0.40 7.9 0.18 1.91
工場植生水
D)抽出物不 0.22 7.2 0.15 1.85
添加（対照）
【０１６３】
遊離脂肪酸値、過酸化物指数、Ｋ２７０及びＫ２３２などの品質パラメータの変化が認められた。オリーブ葉抽出物により栄養強化されたオリーブオイルのＫ２７０値は０．２７と極めて高い値であり、２００７年６月２１日制定の執行規則（ＥＣ）Ｎｏ．７０２／２００７による、エキストラバージンオリーブオイルについて許容される最大値を超えている。
【０１６４】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシチロソルの含量が少なくとも３０ｐｐｍであり、アルデヒド形のオレウロペインアグリコンの含量が１２０ｐｐｍ未満であることを特徴とする、Ｋ２２５値が０．２８以下の食用油である栄養製品。
【請求項２】
ヒドロキシチロソルを３０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ、好ましくは５０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍ含有する請求項１記載の栄養製品。
【請求項３】
ヒドロキシチロソルを３００ｐｐｍ〜３００００ｐｐｍ含有する請求項１記載の栄養製品。
【請求項４】
前記食用油は植物油であり、好ましくは、バージンオリーブオイル、エキストラバージンオリーブオイル、オリーブオイル、ランパンテオリーブオイル、精製オリーブオイル、粗製オリーブ搾り滓オイル、精製オリーブ搾り滓オイル、ヒマワリ油、トウモロコシ油、大豆油、亜麻仁油、扁桃油、キャノーラ油、サフラワー油、パーム油、ココヤシ油、菜種油、前記油類の技術的に変性された誘導体類及び前記のものの２種類以上の混合物から選択される請求項１〜３の何れかに記載の栄養製品。
【請求項５】
前記食用油は海産物油又は魚油であり、好ましくは、藻類、オキアミ、大型ニシン、アンチョビ、マグロ、ニシン、サーディン、サバ、タラから得られた海産物油又は魚油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又は前記のものの２種類以上の混合物である請求項１〜３の何れかに記載の栄養製品。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の食用油を含有する食料品であり、ヒドロキシチロソルを３０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ含有する栄養製品。
【請求項７】
好ましくはマーガリン、マヨネーズ、ガーリックマヨネーズ、ガスパーチョスープ、塗り広げ可能なソース、サラダドレッシングから選択される請求項６記載の栄養製品。
【請求項８】
請求項３による食用油を封入したソフトジェルカプセルの形をした栄養補助食品である栄養製品。
【請求項９】
心臓血管系疾患の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１０】
動脈内へのプラーク堆積の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１１】
メタボリック症候群の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１２】
動脈性高血圧症の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１３】
ヒドロキシチロソル含有水溶液を前記オイルと混合し、そして水相をデカントして除くことからなり、場合により乳化剤の存在下で、かつ、場合により均質化処理を行う、請求項１〜１２の何れかに記載の栄養製品の製造方法。
【請求項１４】
前記均質化処理は第１ステージ及び第２ステージで行い、前記第１ステージは２００〜７００バールの圧力で行われ、前記第２ステージは３０〜５０バールの圧力で行われ、好ましくは、前記第１ステージは３００〜５００バールの圧力で行われ、前記第２ステージは３０〜３５バールの圧力で行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）オリーブ果実及び／又はオリーブの残留物及び／又は圧潰オリーブを、２０℃〜１４０℃の範囲内の温度と、大気圧〜大気圧よりも高い２０ｐｓｉの範囲内の圧力と、１．０〜６．０の範囲内のｐＨで酸性加水分解する工程からなる、オリーブ果実及び／又はオリーブの残留物及び／又は圧潰オリーブからの抽出物を含有するヒドロキシチロソルの製造方法。
【請求項１６】
オリーブ果実で行われる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記加水分解は連続的な滅菌システム内で行われ、前記加水分解温度は１１０℃〜１３０℃の範囲内である請求項１５又は16記載の方法。
【請求項１８】
前記加水分解工程の時間は１５分間〜４５分間の範囲内である請求項１５〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）前記工程（ａ）の加水分解生成物を引き続き処理して透明な水溶液を得る工程を更に有する請求項１５〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた生成物を、酸活性化アニオン交換樹脂類及び吸着媒非イオン性樹脂類から選択される樹脂の少なくとも一つのクロマトグラフカラムに装填する工程、及び（ｄ）前記クロマトグラフカラムに保持された生成物を水で溶出する工程を更に有する請求項１５〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）で得られた生成物を酸活性化アニオン交換樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、保持された生成物を水で溶出し、溶出生成物を吸着媒非イオン性樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、保持された生成物を水で前記カラムから溶出する工程からなる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
逆浸透濃縮の工程を更に有する請求項１５〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
生成物が固形になるまで水を蒸発させる工程を更に有する請求項１５〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１５〜２３の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも４０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する抽出物。
【請求項２５】
請求項１５〜２３の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも８０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する抽出物。
【請求項２６】
請求項１５〜２２の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも３５％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する液状抽出物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも２０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する固形抽出物。
【請求項２８】
請求項２３に記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも４０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する固形抽出物。
【請求項２９】
オリーブ抽出物であることを特徴とする請求項２４〜２８の何れかに記載の抽出物。
【請求項３０】
活性成分を単独で又は活性成分類の混合物を部分的に含む、好ましくは錠剤又はカプセルの形の栄養補助食品としての請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物の使用。
【請求項３１】
心臓血管系疾患の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３２】
動脈内へのプラーク堆積の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３３】
メタボリック症候群の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３４】
動脈性高血圧症の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項１】
ヒドロキシチロソルの含量が少なくとも３０ｐｐｍであり、アルデヒド形のオレウロペインアグリコンの含量が１２０ｐｐｍ未満であることを特徴とする、Ｋ２２５値が０．２８以下の食用油である栄養製品。
【請求項２】
ヒドロキシチロソルを３０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ、好ましくは５０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍ含有する請求項１記載の栄養製品。
【請求項３】
ヒドロキシチロソルを３００ｐｐｍ〜３００００ｐｐｍ含有する請求項１記載の栄養製品。
【請求項４】
前記食用油は植物油であり、好ましくは、バージンオリーブオイル、エキストラバージンオリーブオイル、オリーブオイル、ランパンテオリーブオイル、精製オリーブオイル、粗製オリーブ搾り滓オイル、精製オリーブ搾り滓オイル、ヒマワリ油、トウモロコシ油、大豆油、亜麻仁油、扁桃油、キャノーラ油、サフラワー油、パーム油、ココヤシ油、菜種油、前記油類の技術的に変性された誘導体類及び前記のものの２種類以上の混合物から選択される請求項１〜３の何れかに記載の栄養製品。
【請求項５】
前記食用油は海産物油又は魚油であり、好ましくは、藻類、オキアミ、大型ニシン、アンチョビ、マグロ、ニシン、サーディン、サバ、タラから得られた海産物油又は魚油、前記油類の技術的に変性された誘導体類又は前記のものの２種類以上の混合物である請求項１〜３の何れかに記載の栄養製品。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の食用油を含有する食料品であり、ヒドロキシチロソルを３０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍ含有する栄養製品。
【請求項７】
好ましくはマーガリン、マヨネーズ、ガーリックマヨネーズ、ガスパーチョスープ、塗り広げ可能なソース、サラダドレッシングから選択される請求項６記載の栄養製品。
【請求項８】
請求項３による食用油を封入したソフトジェルカプセルの形をした栄養補助食品である栄養製品。
【請求項９】
心臓血管系疾患の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１０】
動脈内へのプラーク堆積の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１１】
メタボリック症候群の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１２】
動脈性高血圧症の予防又は治療用である請求項１〜８の何れかに記載の栄養製品。
【請求項１３】
ヒドロキシチロソル含有水溶液を前記オイルと混合し、そして水相をデカントして除くことからなり、場合により乳化剤の存在下で、かつ、場合により均質化処理を行う、請求項１〜１２の何れかに記載の栄養製品の製造方法。
【請求項１４】
前記均質化処理は第１ステージ及び第２ステージで行い、前記第１ステージは２００〜７００バールの圧力で行われ、前記第２ステージは３０〜５０バールの圧力で行われ、好ましくは、前記第１ステージは３００〜５００バールの圧力で行われ、前記第２ステージは３０〜３５バールの圧力で行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）オリーブ果実及び／又はオリーブの残留物及び／又は圧潰オリーブを、２０℃〜１４０℃の範囲内の温度と、大気圧〜大気圧よりも高い２０ｐｓｉの範囲内の圧力と、１．０〜６．０の範囲内のｐＨで酸性加水分解する工程からなる、オリーブ果実及び／又はオリーブの残留物及び／又は圧潰オリーブからの抽出物を含有するヒドロキシチロソルの製造方法。
【請求項１６】
オリーブ果実で行われる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記加水分解は連続的な滅菌システム内で行われ、前記加水分解温度は１１０℃〜１３０℃の範囲内である請求項１５又は16記載の方法。
【請求項１８】
前記加水分解工程の時間は１５分間〜４５分間の範囲内である請求項１５〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）前記工程（ａ）の加水分解生成物を引き続き処理して透明な水溶液を得る工程を更に有する請求項１５〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた生成物を、酸活性化アニオン交換樹脂類及び吸着媒非イオン性樹脂類から選択される樹脂の少なくとも一つのクロマトグラフカラムに装填する工程、及び（ｄ）前記クロマトグラフカラムに保持された生成物を水で溶出する工程を更に有する請求項１５〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）で得られた生成物を酸活性化アニオン交換樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、保持された生成物を水で溶出し、溶出生成物を吸着媒非イオン性樹脂のクロマトグラフカラムに装填し、保持された生成物を水で前記カラムから溶出する工程からなる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
逆浸透濃縮の工程を更に有する請求項１５〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
生成物が固形になるまで水を蒸発させる工程を更に有する請求項１５〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１５〜２３の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも４０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する抽出物。
【請求項２５】
請求項１５〜２３の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも８０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する抽出物。
【請求項２６】
請求項１５〜２２の何れかに記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも３５％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する液状抽出物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも２０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する固形抽出物。
【請求項２８】
請求項２３に記載の方法により得られ、ヒドロキシチロソル含量が少なくとも４０％（ｗ／ｗ）であり、かつ、純度が少なくとも９０％（２８０ｎｍのＨＰＬＣによる）であるヒドロキシチロソルを有する固形抽出物。
【請求項２９】
オリーブ抽出物であることを特徴とする請求項２４〜２８の何れかに記載の抽出物。
【請求項３０】
活性成分を単独で又は活性成分類の混合物を部分的に含む、好ましくは錠剤又はカプセルの形の栄養補助食品としての請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物の使用。
【請求項３１】
心臓血管系疾患の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３２】
動脈内へのプラーク堆積の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３３】
メタボリック症候群の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【請求項３４】
動脈性高血圧症の予防又は治療用である請求項２４〜２９の何れかに記載の抽出物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３４２３５（Ｐ２０１０−５３４２３５Ａ）
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７５００（Ｐ２０１０−５１７５００）
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１９０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１３５９６
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０９２１１０２２）プロベルテ ファーマ，エス．エー． (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１９０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１３５９６
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０９２１１０２２）プロベルテ ファーマ，エス．エー． (5)
【Ｆターム（参考）】
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