ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を含むヘパリン、これらの調製方法およびこれらの使用
本発明はヘパリンを構成する多糖類がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）、−Ｂｉｏｔとの共有結合を有し、一般式（Ｉ）に相当することを特徴とするビオチン化ヘパリンに関し、式中、ｉは０または１であり、Ｒ１は式−ＣＯ−（ＣＨ２）ｊ−ＮＨ−または−ＣＯ−（ＣＨ２）ｊ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｋ−ＮＨの鎖であり、ｊおよびｋは１から１０のいずれかの値を有する整数であり、Ｂｉｏｔはビオチンまたはビオチン誘導体の基であり、ｎは１５０００Ｄａの平均分子量を有するヘパリンについて約２５の平均値を有する整数であり、ＸはＨまたはＳＯ３Ｎａであり、ＹはＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａであり、波線はこれらが結合しているピラノース環の下または上にある結合を表す。本発明は同化合物を調製するための方法およびこれらの治療法における使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を含有するヘパリンに関し、これらの調製方法、これらを含有する薬剤組成物、これらの治療上の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、１５０００ダルトン（Ｄａ）前後の分子量を有する、動物由来の硫酸化されたムコ多糖類の混合物である。以下にヘパリンまたはヘパリン類について言及する：ヘパリンの構造、平均分子量および多糖鎖の多分散性は実際にヘパリンが由来する動物種および器官によって変化し得る（例：ブタ粘膜ヘパリン、ウシ腸ヘパリンなど）。
【０００３】
ヘパリンは、特に抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を介して、血液凝固連鎖に関与する２つの酵素、すなわち第Ｘａ因子および第１１ａ因子（またはトロンビン）の阻害を触媒する。したがってこれは、この抗凝固性および抗血栓性の故に治療に使用される。
【０００４】
しかし、ヘパリンはこの使用条件を制限する欠点を有する。特に、この高い抗凝固活性（特にこの高い抗第ＩＩａ活性）は、出血の原因となることがある（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５巻、補遺３、１９９９年）。ヘパリン誘導体はこれらの望ましくない出血性副作用で知られている。
【０００５】
血栓治療の分野においては、目的は同時に出血の誘発を避けつつ血液の流動性を回復または維持することである。実際には、何らかの突発的理由で、治療中の患者において出血が引き起こされる可能性があることが知られている。抗血栓治療中の患者に対して外科手術を実施する必要もあり得る。さらに、ある種の外科手術の途中で血液の凝固を防ぐために抗凝固剤が高い投与量で使用されることがあり、手術の終わりにはこれらを中和することが望ましい。したがって、いつでも抗凝固剤の活性を止めるために中和可能な抗血栓剤に対する必要性がある。
【０００６】
ビオチン化合成多糖類などの中和可能な抗血栓剤が特許出願ＷＯ０２／２４７５４およびＷＯ０６／０３０１０４に記載されている。これらの合成は、特に上述の多糖類自体にではなくこれらの保護された等価物に対して実行されるビオチンまたはビオチン誘導体のグラフト化を含み、本発明の化合物に対しては適用できない。この理由は、多糖類の混合物であり、したがって、それに対しては上述の特許出願に記載されているビオチンのグラフト化が、グラフト位置の十分な位置選択性を誘導することを可能にせず、またヘパリンのすべての官能化可能な多糖鎖のビオチン化も可能にしない不均質な製品である最終製品に対するビオチン化を実行することが望まれていることである。
【０００７】
Ｏｓｍｏｎｄらのチームは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻（２００２）１９９−２０７頁に、ブタヘパリンをビオチン化するためのいくつかの技法を記載しており、それらの１つは還元的アミノ化に続くビオチンのカップリングを経るヘパリンの還元性末端におけるビオチンのカップリングを含むと記載している。しかし、この文献に記載されている操作条件はビオチン化ヘパリンが十分に再現可能に得られることを可能にせず：彼らはヘパリンの構造的多様性および市販のヘパリン中に存在する多糖鎖の実際の構造を考慮に入れていない。市販のヘパリンは、それらの還元性末端に、Ｏｓｍｏｎｄらによって記載されている手順によってはビオチンで官能化させることができない、分解されたグリコセリンを含有する多糖鎖の大きな比率を含む。したがって、前記刊行物に記載されているブタヘパリンのビオチン化のための操作条件は、効率的な中和を可能にするに足るビオチン化の程度などの期待される特徴を有するビオチン化ヘパリンが十分に再現性を以って得られることを可能にはしない。
【０００８】
Ｔｓｅｎｇらのチームは、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７巻（２００６年）、２６２７−２６３６頁に、ヘパリンのビオチンを用いる官能化に続いてヘパリンをアビジンとの相互作用によってフィルム上に固定化するための技法を記載している。ヘパリンのビオチン化は、ヨウ素を用いる酸化を介して実行され、ラクトンの形成に次いでビオチンの２−（４−アミノフェニル）エチルアミン誘導体を用いるカップリングが続く。しかし、Ｔｓｅｎｇらによって提示された操作条件は、還元性末端においてビオチン化ヘパリンの全体的および再現性のある生成を想定しておらず、酸化段階が還元性末端に選択的であり得ることまたはかかる処置の後でヘパリンの生物学的活性が保存されることを示唆するものは何もない。
【０００９】
Ｋｅｔｔらのチームは、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１６２０巻（２００３年）、２２５−２３４頁に、アビジンと様々なグリコサミノグリカンの間の親和性の研究を記載しており、アビジンがヘパリンに対する強い親和性を示すことを実証している。これらの親和性の研究において、ヘパリンはビオチンを用いて誘導体化され得るが、ヘパリンの多糖鎖中のビオチン化部位の指摘はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／２４７５４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０３０１０４号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５巻、補遺３、１９９９年
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻（２００２）１９９−２０７頁
【非特許文献３】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７巻（２００６年）、２６２７−２６３６頁
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１６２０巻（２００３年）、２２５−２３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本出願人は、アビジンまたはストレプトアビジンを用いて中和され得、天然のヘパリンと同等の生物学的特性を有する新規なヘパリンを提供するという目的を設定した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、構成多糖類がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有すること、および一般式（Ｉ）に相当することを特徴とする、本明細書において以下「ビオチン化ヘパリン」と呼ばれる、新規な修飾されたヘパリン
【００１４】
【化１】
［式中、
−ｉは、０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）の配列を表し、
【００１５】
【化２】
［式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なって、１から１０のいずれかの値を取り得る整数である。］、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ｎは、１５０００Ｄａの平均分子量を有するヘパリンについて約２５の平均値を有する整数を表し、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する。］
およびこれらの薬剤として許容される塩に関する。
【００１６】
意外にも、多糖鎖の還元性末端におけるビオチンまたはビオチン誘導体の導入は、ヘパリンの薬剤学上の活性を変更しない。具体的には、本発明の主題である新規なビオチン化ヘパリンは、天然のヘパリン、すなわちビオチン化前のヘパリンと同等の抗血栓作用を有する。
【００１７】
これらは、天然のヘパリンを超える重要な利点を有する：これらは緊急の事態において特定の解毒剤を用いて急速に中和され得る。この特定の解毒剤は、テトラマーまたはモノマー形態のアビジン、またはストレプトアビジンであり、それぞれ６６０００、１６４００および６００００Ｄａに等しい質量を有する（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２版、１９９６年、Ｍ．Ｎ．９２０、１５１−１５２頁、Ｒｅｖｕｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）。
【００１８】
これらはまた、使用される投与量が高く、同時に出血のリスクを低減するという治療指標において有用であるという利点を有し、したがって動脈治療分野において有用であり得る。
【００１９】
上述のビオチン（Ｂｉｏｔ）基はヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタン酸から誘導される基である。本発明による一般式（Ｉ）中のＢｉｏｔ基は式（ｃ）に相当するのが有利である。
【００２０】
【化３】
【００２１】
ビオチン誘導体は市販されており（「Ｐｉｅｒｃｅ」Ｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅ、２００５年、７−１１頁）または当業の熟練者に知られている標準的な方法を使用して調製され得る。特に特許出願ＷＯ０２／２４７５４で言及されているビオチン誘導体を挙げることができる。
【００２２】
本発明によるビオチン化ヘパリンにおいて、インデックスｉは０に等しくてよく、この場合はビオチンまたはビオチン誘導体との結合は、多糖鎖の還元性末端の糖単位に付いているアミン官能基上に直接作られる。
【００２３】
あるいは、ｉは１に等しくてもよく、ビオチン基またはビオチン誘導体との結合は、例えば、ｊが５に等しい上記の式（ａ）の配列またはｊおよびｋが同一であり５に等しい上記の式（ｂ）の配列から成る。したがって、上記の式（Ｉ）において、Ｒ１は、例えば、式−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨまたは−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表し得る。
【００２４】
本発明との関連において、「還元性末端」という用語は、末端グルコサミンまたはマンノサミン（グルコサミンの塩基性媒体中でのエピマー化からもたらされるマンノサミン）が下記の式（ＩＩ）に相当する環状ヘミアセタール官能基を有する多糖鎖の末端を意味する。
【００２５】
【化４】
式中、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する（下：グルコサミン、上：マンノサミン）。
【００２６】
「ヘパリンの構成多糖類」という用語は、ウロン酸残基を含有する二糖単位（Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）およびＮ−硫酸化またはＮ−アセチル化されていてもよいＤ−グルコサミン残基の反復によって特徴付けられる多糖類を意味する。二糖単位はＤ−グルコサミンのＣ６および／またはＣ３位置においてならびにウロン酸のＣ２位置においてＯ−硫酸化されていてもよい（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈ．Ｅｄｗａｒｄ Ｃｏｎｒａｄ、１９９８年、１頁）。
【００２７】
先に示した通り、ヘパリンは動物由来の硫酸化されたムコ多糖類の混合物である。天然のヘパリン類、すなわちビオチン化の前の出発ヘパリン類は「ヘパリン類」と呼ばれる。
【００２８】
本発明において使用されるヘパリン類は、特にウシ、ヒツジまたはブタ由来のものであればよく、より具体的にはウシの肺、ウシの腸粘膜、ブタの腸粘膜またはヒツジの腸粘膜に由来することができる。有利には、本発明において使用されるヘパリンはブタ由来のものであり、例えばブタの腸粘膜に由来する。
【００２９】
本発明によるビオチン化ヘパリンは、前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも６０％、有利には少なくとも６４％が、これらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有し、ヘパリンの元の構造とは無関係に上記で定義された式（Ｉ）に相当するものであり；有利には少なくとも前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有する。
【００３０】
本発明は薬剤として許容される塩のいずれの形態にあるビオチン化ヘパリンをも対象とする。
【００３１】
本発明の１つの主題は、以下のステップを含むことを特徴とする、上述のビオチン化ヘパリンを調製する方法でもある。
【００３２】
ａ）ヘパリンはヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップと、
ｂ）次いで上記で得られた生成物に対してアミン塩および還元剤の存在下で２０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップと、
ｃ）最後にＲ１、ｉおよびＢｉｏｔが上記式（Ｉ）に関して定義された通りである活性化された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて、水性媒体または有機媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ。
【００３３】
ヘパリンに基づく混合物の構成成分のヘパリナーゼ１、２および３の混合物の存在下での解重合の後の上記の調製方法の全ステップは、分析ＨＰＬＣモニタリング、特にＳＡＸタイプ、より詳しくはＣＴＡＳＡＸタイプによって制御され得る。かかる分析モニタリングは、例えば特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用して実行され得る。
【００３４】
還元的アミノ化ステップｂ）の後に、前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％がこれらの還元性末端に−ＮＨ２官能基（還元的アミノ化された多糖類）を有していることが特に確認される。
【００３５】
アシル化ステップｃ）の後では、前記還元アミノ化された多糖の少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％がビオチン化されていることが特に確認される。
【００３６】
したがって、本発明によるビオチン化ヘパリンを調製する方法の全収率は少なくとも６０％であり、有利には少なくとも６４％である。有利には、この収率は少なくとも８０％である。
【００３７】
以下の用語は次の通りに定義される。
【００３８】
−ヘパリナーゼ１：フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）由来の酵素ヘパリンリアーゼＩ（ＥＣ４．２．２．７）、
−ヘパリナーゼ２：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の酵素ヘパリンリアーゼＩＩ、
−ヘパリナーセ３：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の酵素ヘパリンリアーゼＩＩＩ（ＥＣ４．２．２．８）。
【００３９】
ヘパリナーゼ３は、ヘパリンの多糖鎖のタンパク質への結合のための領域（グリコセリン）の除去を可能にし、鎖の還元性末端がグリコセリン残基を含まない鎖の生成を可能にする。ヘパリナーゼ１および２は、多糖鎖の低分子量の断片への開裂を可能にする（ヘパリン解重合反応）。
【００４０】
本発明による化合物を調製する方法は、出発ヘパリン（「天然」ヘパリン）として以前に文献において報告されている通りに調製されたヘパリンを使用する。特に刊行物「Ｌ’ｈｅｐａｒｉｎｅ，ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｏｐｒｉｅｔｅｓ，ａｎａｌｙｓｅｓ」、Ｊ．Ｐ Ｄｕｃｌｏｓ、Ｍａｓｓｏｎ刊、１９８４年が参照される。ヘパリンは特に特許出願ＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１に記載されている方法によって調製され得る。
【００４１】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、アミン塩は第四級アミン塩でよく；有利には式ＮＨ４Ｚに相当するハロゲン化アンモニウム塩であり、式中、Ｚはハロゲン原子、例えば塩素、フッ素、臭素またはヨウ素の原子を表す。
【００４２】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、還元剤はボロハイドライド塩、例えばシアノボロハイドライド塩でよい。
【００４３】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、温度は有利には５０から８０℃の間である。
【００４４】
上記調製方法のアシル化ステップｃ）において、塩基は炭酸塩または炭酸水素塩、特にナトリウムまたはカリウム塩形態であればよく、あるいは水溶性または有機溶解性の当業の熟練者に知られている有機塩基であってもよい。
【００４５】
上記調製方法のアシル化ステップｃ）において、「有機媒体」という用語は、例えば、ジクロロメタンまたはジメチルホルムアミドを意味する。
【００４６】
本発明によるビオチン化ヘパリンを調製する方法は、有利には以下のステップを含む：
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップと、
ｂ）上記で得られた生成物に対してハロゲン化アンモニウム塩およびボロハイドライド塩の存在下で５０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップと、
ｃ）最後に、活性化されたエステル形態の上記で定義された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて、水性媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ。
【００４７】
上記で定義されたビオチン化された誘導体−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔは、あらかじめ形成されたまたは当業の熟練者に知られている標準的なカップリング条件を使用してその場で発生された活性化されたエステルの形態で直接アシル化反応において使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体または３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の形態の活性化されたエステルが特に使用され得る。
【００４８】
本発明による調製方法はスキーム１に例示されている。
【００４９】
【化５】
【００５０】
スキーム１によれば、ヘパリンは残っているタンパク質結合（すなわち天然または分解されたグリコセリン）を除去するためにヘパリン３を用いて処理され、グリコセリン残基を含まない還元性末端を含む化合物１を得る。このヘパリン（化合物１）は、次いでアミン塩およびボロハイドライド塩などの還元剤の存在下で還元的アミノ化を施されて遊離のアミン官能基を還元性末端に含有する化合物２を生成する。
【００５１】
この化合物は、次いで上記で定義された活性化されたビオチン誘導体−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔとの反応を経て、塩基の存在下でアシル化されてビオチン化された化合物３をもたらす。この反応は、例えば、Ｒ１が配列−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表す場合はエステル３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩と、Ｒ１が配列−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表す場合はエステル３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩と、あるいはＲ１が存在しない場合は（ｉ＝０）ビオチノイル−３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩と実行され得る。
【００５２】
スキーム１において、実際には多糖鎖の混合物のヘパリン誘導体としてあるものなので化合物１、２および３は仮想上の表現であることは理解される。
【００５３】
本文書の以下に、本発明によるビオチン化ヘパリンおよびこれらを得るために有用な様々な中間体の合成の実施例が例示のために詳述される。
【００５４】
以下の略称が使用される。
【００５５】
ＥＰＢヘパリン：Ｂｉｏｉｂｅｒｉｃａ社によって販売されているヘパリン；
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー；
ＳＡＸ：強アニオン交換クロマトグラフィー；
ＣＴＡ：セチルトリメチルアンモニウム；
ｑｓ：−に足る量
ＬＣ：長鎖、６−アミノヘキサノイル配列に対応して；
スルホ−ＮＨＳ：３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩；
ヘパリナーゼ１：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩ酵素（ＥＣ４．２．２．７）；
ヘパリナーゼ２：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩＩ酵素；
ヘパリナーゼ３：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩＩＩ（ＥＣ４．２．２．８）。
【実施例１】
【００５６】
１．１ ヘパリナーゼ３を用いる解重合によって精製されたＥＰＢヘパリン：
２０℃前後の温度において、粗製のＥＰＢヘパリン１ｇをｐＨ７．０±０．１、２０ｍＭ塩化ナトリウムおよびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌに調節された５ｍＭのリン酸ナトリウム水溶液１５ｍｌ中に溶解させる。ヘパリナーゼ３の０．５ＩＵをヘパリン溶液に加える。得られる反応混合物を５日間攪拌する。塩化ナトリウム１ｇおよびメタノール４５ｍｌを反応混合物に加える。得られる懸濁液を０．４５μｍの膜を通してろ過する。ケーキをメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥する。白色固体０．９８ｇが得られる。観察される収率は９８％である。
【００５７】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。結果は出発ヘパリン中に存在するグリコセリン種の少なくとも８０％の消失を示している。
【００５８】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００５９】
１．２ 還元アミノ化されたヘパリナーゼ３を用いるヘパリン解重合：
ヘパリナーゼ３を用いて精製されたヘパリン０．５ｇを５Ｍ塩化アンモニウム水溶液中に溶解させる。ナトリウムシアノボロハイドライド０．５ｇをヘパリン溶液に加える。混合物を７０℃に２４時間維持する。溶液を２０℃前後の温度まで冷却し、水（５０ｍｌになる量）で希釈し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラムで脱塩する。得られる画分をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水で希釈し、次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで希釈する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物４４４ｍｇが得られる。観察される収率は８９％である。この生成物は、これ以上の精製をすることなく、次のアシル化ステップにおいて使用する。
【００６０】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６１】
１．３ ビオチン化され還元的アミノ化された、ヘパリナーゼ３を用いて解重合されたヘパリン：
解重合され還元的アミノ化されたヘパリン２００ｍｇを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液２ｍｌ中に２０℃前後の温度で溶解させる。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを得られた溶液に加える。得られた溶液を２０℃前後の温度で１時間攪拌する。この溶液を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液４ｍｌで希釈する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加えて、得られた混合物を２時間攪拌する。さらにスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加えて、反応混合物を１６時間攪拌する。得られた反応媒体を水（２００ｍｌになる量）で希釈し、０．４５μｍの膜でろ過してＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水で、次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで溶離する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物１８８ｍｇが得られる。観察される収率は９４％である。
【００６２】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。
【００６３】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：１．３−１．８（ＣＨ２ビオチン，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（ＣＨ２ＣＯビオチン，ｔ，７Ｈｚ）、２．７９（１Ｈ，ｄ，１２Ｈｚ）、３．００（１Ｈ，ｄｄ，１２−５Ｈｚ）、３．２０（ＮＣＨ２ビオチン，ｍ）、３．３０（ＣＨ，ｍ）、３．６８（ＣＨ，ｍ）、３．８０（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｍ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４５（ＣＨ，ｍ）、４．６３（ＮＣＨビオチン，ｍ）、４．８５（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【実施例２】
【００６４】
２．１ ＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によって得られるヘパリン、ヘパリナーゼ３を用いる解重合：
２０℃前後の温度でＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン１ｇを、ｐＨ７．０±０．１、２０ｍＭ塩化ナトリウムおよびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌに調節された５ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１５ｍｌ中に溶解させる。ヘパリナーゼ３の０．５ＩＵをヘパリン溶液に加える。得られる反応混合物を７日間攪拌する。塩化ナトリウム１ｇおよびメタノール４５ｍｌを反応混合物に加える。得られる懸濁液を０．４５μｍの膜を通してろ過する。ケーキをメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥する。白色固体０．９６ｇが得られる。観察される収率は９６％である。
【００６５】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。結果は出発ヘパリン中に存在するグリコセリン種の少なくとも８０％の消失を示している。
【００６６】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６７】
２．２ ヘパリナーゼ３を用いて解重合され還元的アミノ化された、米国特許出願公開第２００５／０２１５５１９号によるヘパリン：
ヘパリナーゼ３で処理されたＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン０．５ｇを５Ｍ塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌ中に溶解させる。ナトリウムシアノボロハイドライド０．５ｇをヘパリン溶液に加える。混合物を７０℃に２４時間維持する。溶液を２０℃前後まで冷却し、水（５０ｍｌになる量）で希釈し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩する。画分を集めて凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物４４６ｍｇが得られる。観察される収率は８９％である。この生成物は、これ以上の精製をすることなく、次のアシル化ステップにおいて使用する。
【００６８】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６９】
２．３ ビオチン化され還元的アミノ化された、ヘパリナーゼ３を用いて解重合されたＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン：
還元的アミノ化された解重合されたヘパリン２００ｍｇを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液２ｍｌ中に２０℃前後の温度で溶解させる。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを得られた溶液に加える。溶液を２０℃前後の温度で１時間攪拌する。得られた懸濁液を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液４ｍｌで希釈する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加え、混合物を２時間攪拌する。さらにスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加え、反応混合物を１６時間攪拌する。得られた反応媒体を水（２００ｍｌにする量）で希釈し、０．４５μｍの膜を通してろ過してＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで溶離する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物１８８ｍｇが得られる。観察される収率は９４％である。
【００７０】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。
【００７１】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：１．３−１．８（ＣＨ２ビオチン，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（ＣＨ２ＣＯビオチン，ｔ，７Ｈｚ）、２．７９（１Ｈ，ｄ，１２Ｈｚ）、３．００（１Ｈ，ｄｄ，１２−５Ｈｚ）、３．２０（ＮＣＨ２ビオチン，ｍ）、３．３０（ＣＨ，ｍ）、３．６８（ＣＨ，ｍ）、３．８０（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｍ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４５（ＣＨ，ｍ）、４．６３（ＮＣＨビオチン，ｍ）、４．８５（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００７２】
本発明による化合物を、生化学的研究および薬剤学的研究の対象とした。
【００７３】
抗第ＩＩａ因子活性および抗第Ｘａ因子活性の測定
ヒト血漿中または緩衝系中の抗第ＩＩａ因子（抗ＦＩＩａ）活性および抗第Ｘａ因子（抗ＦＸａ活性）を発色法によって解析する：抗第ＩＩａ因子活性は、発色基材Ｓ−２２３８、α−トロンビンおよびヒトＡＴＩＩＩ（アンチトロンビンＩＩＩ）を含有するＡｃｔｉｃｈｒｏｍｅヘパリン抗第ＩＩａ因子キット（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）によって試験する。抗ＦＸａ活性は自動化された凝固測定器ＡＣＬ ７０００（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、ＡＴＩＩＩ、第Ｘａ因子および発色基材Ｓ−２７６５を含有するＨｅｐａｒｉｎ ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して測定する。２つの分析は製造者の取扱説明書に従って実施する。
【００７４】
ビオチン化ヘパリン画分のヒト血漿および緩衝系中におけるインビトロ活性を測定するための標準較正曲線を確定するために以下の標準を使用する：
−第１ 低分子量ヘパリンのための国際標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年制定、コード番号８５／６００）、
−第２ 低分子量ヘパリンのための国際標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年制定、コード番号０１／６０８、２００６年６月から使用）
−エノキサパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標）、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）が内部標準として使用された。
【００７５】
抗ＦＩＩａ活性の測定のために、サンプルまたは国際低分子量ヘパリン標準１０μｌをヒト血漿中のアンチトロンビンまたは０．０５ＭのトリスＨＣｌ、０．１５４ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の緩衝系中に希釈する。この溶液１０μｌを９６ウェルのマイクロ滴定プレートに加える。測定は三重に繰り返す（３つのウェル上で）。マイクロ滴定プレートは、３００ｒｐｍで揺動させながら３７℃に維持する。それぞれのウェルにトロンビン４０μｌを加えて、正確に２分間インキュベートする。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ４０μｌを加える。９０秒後に酢酸４０μｌを加えることによって反応を停止させる。吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４０５ｎｍにおいて測定する。
【００７６】
抗ＦＸａ活性測定のために、サンプルまたは国際低分子量ヘパリン標準をヒト血漿中または０．０５ＭのトリスＨＣｌ、０．１５４ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の緩衝系を用いて希釈する。血漿または緩衝液中のヘパリノイドを含有するサンプルを、ＡＴＩＩＩを含有するワーキング緩衝液を用いて再度１：２０に希釈し、プローブローター中に二重に入れる。第Ｘａ因子試薬および発色基材を自動凝固測定器ＡＣＬ ７０００の指示された容器に注ぎ入れる。
【００７７】
抗ＦＸａ活性の測定は、ＡＣＬ ７０００ソフトウェア中に統合されている「ヘパリン」手順を用いて実施する。分析中は、（ワーキング緩衝液で希釈された）サンプル５０μｌを第Ｘａ因子試薬５０μｌと混合する。３７℃で６０秒間のインキュベーション時間後、濃度１．１ｍＭの発色基材５０μｌを加えて吸収の変化を時間の関数として波長４０５ｎｍにおいて測定する。
【００７８】
得られた結果を、下表に特に記載する。
【００７９】
【表１】
【００８０】
したがって、本発明によるビオチン化ヘパリンの抗ＦＸａ活性が保存されることが、出発天然ヘパリンとの比較によって分かる。
【００８１】
本発明によるビオチン化ヘパリンは、薬剤の調製のために使用され得る。これらは特に抗血栓薬剤として使用され得る。したがって、もう１つの態様によれば、本発明の１つの主題は上記で定義されたビオチン化ヘパリンを含む薬剤である。これらの薬剤は、治療法において、特に静脈血栓、動脈血栓発作における治療および予防において、特に心筋梗塞または不安定狭心症、末梢動脈血栓症、例えば下肢動脈症、脳動脈血栓症および脳卒中などの事例において用途がある。これらは平滑筋細胞の増殖、血管形成の予防および治療において、またアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症のための神経保護薬としても有用である。
【００８２】
もう１つの態様によれば、本発明は上述の病変を治療するための方法にも関し、この方法は本発明による化合物またはこれらの薬剤として許容される塩の有効な投与量の患者への投与を含む。上記において定義されたビオチン化ヘパリンの上述の病変を治療および予防するための使用は、前記ビオチン化ヘパリンのこれらの病変を治療または予防するための薬剤の製造のための使用と同様に、本発明の部分を形成する。
【００８３】
もう１つの態様によれば、本発明の１つの主題は、有効主剤として、本発明によるビオチン化ヘパリンまたはこの薬剤として許容される塩および少なくとも１つの薬剤として許容される不活性な賦形剤を含む薬剤組成物である。前記賦形剤は所望の薬剤形態および投与の態様、例えば経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、経粘膜、局所または直腸内などの経路、によって選択される。
【００８４】
それぞれの投与単位中に、有効主剤は、所望の予防的または治療上の効果を得るための、想定される１日投与量に適した量で存在する。それぞれの投与単位は有効剤を２５から１５０ｍｇ、好都合には３０から１００ｍｇ含有し得る。これらの抗凝固化合物はアビジンまたはストレプトアビジンを用いて中和され得る。
【００８５】
より高いまたはより低い投与量が適切である特殊な事例があり得る；かかる投与量は本発明に関する状況を外れるものではない。通常の慣行によれば、それぞれの患者にとって適当な投与量は投与の態様および前記患者の体重や反応に照らして医師によって決定される。
【００８６】
本発明による化合物は、所望の治療のために有用な１つまたは複数の他の有効剤、例えば抗血栓剤、抗凝固剤または抗血小板凝集剤などとの組合せにおいても使用され得る。
【００８７】
本発明の１つの主題は、本発明によるビオチン化ヘパリンを中和することを可能にすることを特徴とするアビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法でもある。したがって、アビジンまたはストレプトアビジンは、本発明によるビオチン化ヘパリンを中和するための薬剤の調製のために使用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を含有するヘパリンに関し、これらの調製方法、これらを含有する薬剤組成物、これらの治療上の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、１５０００ダルトン（Ｄａ）前後の分子量を有する、動物由来の硫酸化されたムコ多糖類の混合物である。以下にヘパリンまたはヘパリン類について言及する：ヘパリンの構造、平均分子量および多糖鎖の多分散性は実際にヘパリンが由来する動物種および器官によって変化し得る（例：ブタ粘膜ヘパリン、ウシ腸ヘパリンなど）。
【０００３】
ヘパリンは、特に抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を介して、血液凝固連鎖に関与する２つの酵素、すなわち第Ｘａ因子および第１１ａ因子（またはトロンビン）の阻害を触媒する。したがってこれは、この抗凝固性および抗血栓性の故に治療に使用される。
【０００４】
しかし、ヘパリンはこの使用条件を制限する欠点を有する。特に、この高い抗凝固活性（特にこの高い抗第ＩＩａ活性）は、出血の原因となることがある（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５巻、補遺３、１９９９年）。ヘパリン誘導体はこれらの望ましくない出血性副作用で知られている。
【０００５】
血栓治療の分野においては、目的は同時に出血の誘発を避けつつ血液の流動性を回復または維持することである。実際には、何らかの突発的理由で、治療中の患者において出血が引き起こされる可能性があることが知られている。抗血栓治療中の患者に対して外科手術を実施する必要もあり得る。さらに、ある種の外科手術の途中で血液の凝固を防ぐために抗凝固剤が高い投与量で使用されることがあり、手術の終わりにはこれらを中和することが望ましい。したがって、いつでも抗凝固剤の活性を止めるために中和可能な抗血栓剤に対する必要性がある。
【０００６】
ビオチン化合成多糖類などの中和可能な抗血栓剤が特許出願ＷＯ０２／２４７５４およびＷＯ０６／０３０１０４に記載されている。これらの合成は、特に上述の多糖類自体にではなくこれらの保護された等価物に対して実行されるビオチンまたはビオチン誘導体のグラフト化を含み、本発明の化合物に対しては適用できない。この理由は、多糖類の混合物であり、したがって、それに対しては上述の特許出願に記載されているビオチンのグラフト化が、グラフト位置の十分な位置選択性を誘導することを可能にせず、またヘパリンのすべての官能化可能な多糖鎖のビオチン化も可能にしない不均質な製品である最終製品に対するビオチン化を実行することが望まれていることである。
【０００７】
Ｏｓｍｏｎｄらのチームは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻（２００２）１９９−２０７頁に、ブタヘパリンをビオチン化するためのいくつかの技法を記載しており、それらの１つは還元的アミノ化に続くビオチンのカップリングを経るヘパリンの還元性末端におけるビオチンのカップリングを含むと記載している。しかし、この文献に記載されている操作条件はビオチン化ヘパリンが十分に再現可能に得られることを可能にせず：彼らはヘパリンの構造的多様性および市販のヘパリン中に存在する多糖鎖の実際の構造を考慮に入れていない。市販のヘパリンは、それらの還元性末端に、Ｏｓｍｏｎｄらによって記載されている手順によってはビオチンで官能化させることができない、分解されたグリコセリンを含有する多糖鎖の大きな比率を含む。したがって、前記刊行物に記載されているブタヘパリンのビオチン化のための操作条件は、効率的な中和を可能にするに足るビオチン化の程度などの期待される特徴を有するビオチン化ヘパリンが十分に再現性を以って得られることを可能にはしない。
【０００８】
Ｔｓｅｎｇらのチームは、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７巻（２００６年）、２６２７−２６３６頁に、ヘパリンのビオチンを用いる官能化に続いてヘパリンをアビジンとの相互作用によってフィルム上に固定化するための技法を記載している。ヘパリンのビオチン化は、ヨウ素を用いる酸化を介して実行され、ラクトンの形成に次いでビオチンの２−（４−アミノフェニル）エチルアミン誘導体を用いるカップリングが続く。しかし、Ｔｓｅｎｇらによって提示された操作条件は、還元性末端においてビオチン化ヘパリンの全体的および再現性のある生成を想定しておらず、酸化段階が還元性末端に選択的であり得ることまたはかかる処置の後でヘパリンの生物学的活性が保存されることを示唆するものは何もない。
【０００９】
Ｋｅｔｔらのチームは、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１６２０巻（２００３年）、２２５−２３４頁に、アビジンと様々なグリコサミノグリカンの間の親和性の研究を記載しており、アビジンがヘパリンに対する強い親和性を示すことを実証している。これらの親和性の研究において、ヘパリンはビオチンを用いて誘導体化され得るが、ヘパリンの多糖鎖中のビオチン化部位の指摘はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／２４７５４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０３０１０４号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５巻、補遺３、１９９９年
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻（２００２）１９９−２０７頁
【非特許文献３】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７巻（２００６年）、２６２７−２６３６頁
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１６２０巻（２００３年）、２２５−２３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本出願人は、アビジンまたはストレプトアビジンを用いて中和され得、天然のヘパリンと同等の生物学的特性を有する新規なヘパリンを提供するという目的を設定した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、構成多糖類がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有すること、および一般式（Ｉ）に相当することを特徴とする、本明細書において以下「ビオチン化ヘパリン」と呼ばれる、新規な修飾されたヘパリン
【００１４】
【化１】
［式中、
−ｉは、０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）の配列を表し、
【００１５】
【化２】
［式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なって、１から１０のいずれかの値を取り得る整数である。］、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ｎは、１５０００Ｄａの平均分子量を有するヘパリンについて約２５の平均値を有する整数を表し、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する。］
およびこれらの薬剤として許容される塩に関する。
【００１６】
意外にも、多糖鎖の還元性末端におけるビオチンまたはビオチン誘導体の導入は、ヘパリンの薬剤学上の活性を変更しない。具体的には、本発明の主題である新規なビオチン化ヘパリンは、天然のヘパリン、すなわちビオチン化前のヘパリンと同等の抗血栓作用を有する。
【００１７】
これらは、天然のヘパリンを超える重要な利点を有する：これらは緊急の事態において特定の解毒剤を用いて急速に中和され得る。この特定の解毒剤は、テトラマーまたはモノマー形態のアビジン、またはストレプトアビジンであり、それぞれ６６０００、１６４００および６００００Ｄａに等しい質量を有する（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２版、１９９６年、Ｍ．Ｎ．９２０、１５１−１５２頁、Ｒｅｖｕｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）。
【００１８】
これらはまた、使用される投与量が高く、同時に出血のリスクを低減するという治療指標において有用であるという利点を有し、したがって動脈治療分野において有用であり得る。
【００１９】
上述のビオチン（Ｂｉｏｔ）基はヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタン酸から誘導される基である。本発明による一般式（Ｉ）中のＢｉｏｔ基は式（ｃ）に相当するのが有利である。
【００２０】
【化３】
【００２１】
ビオチン誘導体は市販されており（「Ｐｉｅｒｃｅ」Ｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅ、２００５年、７−１１頁）または当業の熟練者に知られている標準的な方法を使用して調製され得る。特に特許出願ＷＯ０２／２４７５４で言及されているビオチン誘導体を挙げることができる。
【００２２】
本発明によるビオチン化ヘパリンにおいて、インデックスｉは０に等しくてよく、この場合はビオチンまたはビオチン誘導体との結合は、多糖鎖の還元性末端の糖単位に付いているアミン官能基上に直接作られる。
【００２３】
あるいは、ｉは１に等しくてもよく、ビオチン基またはビオチン誘導体との結合は、例えば、ｊが５に等しい上記の式（ａ）の配列またはｊおよびｋが同一であり５に等しい上記の式（ｂ）の配列から成る。したがって、上記の式（Ｉ）において、Ｒ１は、例えば、式−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨまたは−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表し得る。
【００２４】
本発明との関連において、「還元性末端」という用語は、末端グルコサミンまたはマンノサミン（グルコサミンの塩基性媒体中でのエピマー化からもたらされるマンノサミン）が下記の式（ＩＩ）に相当する環状ヘミアセタール官能基を有する多糖鎖の末端を意味する。
【００２５】
【化４】
式中、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する（下：グルコサミン、上：マンノサミン）。
【００２６】
「ヘパリンの構成多糖類」という用語は、ウロン酸残基を含有する二糖単位（Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）およびＮ−硫酸化またはＮ−アセチル化されていてもよいＤ−グルコサミン残基の反復によって特徴付けられる多糖類を意味する。二糖単位はＤ−グルコサミンのＣ６および／またはＣ３位置においてならびにウロン酸のＣ２位置においてＯ−硫酸化されていてもよい（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈ．Ｅｄｗａｒｄ Ｃｏｎｒａｄ、１９９８年、１頁）。
【００２７】
先に示した通り、ヘパリンは動物由来の硫酸化されたムコ多糖類の混合物である。天然のヘパリン類、すなわちビオチン化の前の出発ヘパリン類は「ヘパリン類」と呼ばれる。
【００２８】
本発明において使用されるヘパリン類は、特にウシ、ヒツジまたはブタ由来のものであればよく、より具体的にはウシの肺、ウシの腸粘膜、ブタの腸粘膜またはヒツジの腸粘膜に由来することができる。有利には、本発明において使用されるヘパリンはブタ由来のものであり、例えばブタの腸粘膜に由来する。
【００２９】
本発明によるビオチン化ヘパリンは、前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも６０％、有利には少なくとも６４％が、これらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有し、ヘパリンの元の構造とは無関係に上記で定義された式（Ｉ）に相当するものであり；有利には少なくとも前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有する。
【００３０】
本発明は薬剤として許容される塩のいずれの形態にあるビオチン化ヘパリンをも対象とする。
【００３１】
本発明の１つの主題は、以下のステップを含むことを特徴とする、上述のビオチン化ヘパリンを調製する方法でもある。
【００３２】
ａ）ヘパリンはヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップと、
ｂ）次いで上記で得られた生成物に対してアミン塩および還元剤の存在下で２０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップと、
ｃ）最後にＲ１、ｉおよびＢｉｏｔが上記式（Ｉ）に関して定義された通りである活性化された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて、水性媒体または有機媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ。
【００３３】
ヘパリンに基づく混合物の構成成分のヘパリナーゼ１、２および３の混合物の存在下での解重合の後の上記の調製方法の全ステップは、分析ＨＰＬＣモニタリング、特にＳＡＸタイプ、より詳しくはＣＴＡＳＡＸタイプによって制御され得る。かかる分析モニタリングは、例えば特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用して実行され得る。
【００３４】
還元的アミノ化ステップｂ）の後に、前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％がこれらの還元性末端に−ＮＨ２官能基（還元的アミノ化された多糖類）を有していることが特に確認される。
【００３５】
アシル化ステップｃ）の後では、前記還元アミノ化された多糖の少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％がビオチン化されていることが特に確認される。
【００３６】
したがって、本発明によるビオチン化ヘパリンを調製する方法の全収率は少なくとも６０％であり、有利には少なくとも６４％である。有利には、この収率は少なくとも８０％である。
【００３７】
以下の用語は次の通りに定義される。
【００３８】
−ヘパリナーゼ１：フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）由来の酵素ヘパリンリアーゼＩ（ＥＣ４．２．２．７）、
−ヘパリナーゼ２：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の酵素ヘパリンリアーゼＩＩ、
−ヘパリナーセ３：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の酵素ヘパリンリアーゼＩＩＩ（ＥＣ４．２．２．８）。
【００３９】
ヘパリナーゼ３は、ヘパリンの多糖鎖のタンパク質への結合のための領域（グリコセリン）の除去を可能にし、鎖の還元性末端がグリコセリン残基を含まない鎖の生成を可能にする。ヘパリナーゼ１および２は、多糖鎖の低分子量の断片への開裂を可能にする（ヘパリン解重合反応）。
【００４０】
本発明による化合物を調製する方法は、出発ヘパリン（「天然」ヘパリン）として以前に文献において報告されている通りに調製されたヘパリンを使用する。特に刊行物「Ｌ’ｈｅｐａｒｉｎｅ，ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｏｐｒｉｅｔｅｓ，ａｎａｌｙｓｅｓ」、Ｊ．Ｐ Ｄｕｃｌｏｓ、Ｍａｓｓｏｎ刊、１９８４年が参照される。ヘパリンは特に特許出願ＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１に記載されている方法によって調製され得る。
【００４１】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、アミン塩は第四級アミン塩でよく；有利には式ＮＨ４Ｚに相当するハロゲン化アンモニウム塩であり、式中、Ｚはハロゲン原子、例えば塩素、フッ素、臭素またはヨウ素の原子を表す。
【００４２】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、還元剤はボロハイドライド塩、例えばシアノボロハイドライド塩でよい。
【００４３】
上記調製方法の還元的アミノ化ステップｂ）において、温度は有利には５０から８０℃の間である。
【００４４】
上記調製方法のアシル化ステップｃ）において、塩基は炭酸塩または炭酸水素塩、特にナトリウムまたはカリウム塩形態であればよく、あるいは水溶性または有機溶解性の当業の熟練者に知られている有機塩基であってもよい。
【００４５】
上記調製方法のアシル化ステップｃ）において、「有機媒体」という用語は、例えば、ジクロロメタンまたはジメチルホルムアミドを意味する。
【００４６】
本発明によるビオチン化ヘパリンを調製する方法は、有利には以下のステップを含む：
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップと、
ｂ）上記で得られた生成物に対してハロゲン化アンモニウム塩およびボロハイドライド塩の存在下で５０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップと、
ｃ）最後に、活性化されたエステル形態の上記で定義された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて、水性媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ。
【００４７】
上記で定義されたビオチン化された誘導体−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔは、あらかじめ形成されたまたは当業の熟練者に知られている標準的なカップリング条件を使用してその場で発生された活性化されたエステルの形態で直接アシル化反応において使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体または３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の形態の活性化されたエステルが特に使用され得る。
【００４８】
本発明による調製方法はスキーム１に例示されている。
【００４９】
【化５】
【００５０】
スキーム１によれば、ヘパリンは残っているタンパク質結合（すなわち天然または分解されたグリコセリン）を除去するためにヘパリン３を用いて処理され、グリコセリン残基を含まない還元性末端を含む化合物１を得る。このヘパリン（化合物１）は、次いでアミン塩およびボロハイドライド塩などの還元剤の存在下で還元的アミノ化を施されて遊離のアミン官能基を還元性末端に含有する化合物２を生成する。
【００５１】
この化合物は、次いで上記で定義された活性化されたビオチン誘導体−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔとの反応を経て、塩基の存在下でアシル化されてビオチン化された化合物３をもたらす。この反応は、例えば、Ｒ１が配列−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表す場合はエステル３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩と、Ｒ１が配列−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−を表す場合はエステル３−スルホスクシンイミジル６−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩と、あるいはＲ１が存在しない場合は（ｉ＝０）ビオチノイル−３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩と実行され得る。
【００５２】
スキーム１において、実際には多糖鎖の混合物のヘパリン誘導体としてあるものなので化合物１、２および３は仮想上の表現であることは理解される。
【００５３】
本文書の以下に、本発明によるビオチン化ヘパリンおよびこれらを得るために有用な様々な中間体の合成の実施例が例示のために詳述される。
【００５４】
以下の略称が使用される。
【００５５】
ＥＰＢヘパリン：Ｂｉｏｉｂｅｒｉｃａ社によって販売されているヘパリン；
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー；
ＳＡＸ：強アニオン交換クロマトグラフィー；
ＣＴＡ：セチルトリメチルアンモニウム；
ｑｓ：−に足る量
ＬＣ：長鎖、６−アミノヘキサノイル配列に対応して；
スルホ−ＮＨＳ：３−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩；
ヘパリナーゼ１：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩ酵素（ＥＣ４．２．２．７）；
ヘパリナーゼ２：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩＩ酵素；
ヘパリナーゼ３：フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリンリアーゼＩＩＩ（ＥＣ４．２．２．８）。
【実施例１】
【００５６】
１．１ ヘパリナーゼ３を用いる解重合によって精製されたＥＰＢヘパリン：
２０℃前後の温度において、粗製のＥＰＢヘパリン１ｇをｐＨ７．０±０．１、２０ｍＭ塩化ナトリウムおよびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌに調節された５ｍＭのリン酸ナトリウム水溶液１５ｍｌ中に溶解させる。ヘパリナーゼ３の０．５ＩＵをヘパリン溶液に加える。得られる反応混合物を５日間攪拌する。塩化ナトリウム１ｇおよびメタノール４５ｍｌを反応混合物に加える。得られる懸濁液を０．４５μｍの膜を通してろ過する。ケーキをメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥する。白色固体０．９８ｇが得られる。観察される収率は９８％である。
【００５７】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。結果は出発ヘパリン中に存在するグリコセリン種の少なくとも８０％の消失を示している。
【００５８】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００５９】
１．２ 還元アミノ化されたヘパリナーゼ３を用いるヘパリン解重合：
ヘパリナーゼ３を用いて精製されたヘパリン０．５ｇを５Ｍ塩化アンモニウム水溶液中に溶解させる。ナトリウムシアノボロハイドライド０．５ｇをヘパリン溶液に加える。混合物を７０℃に２４時間維持する。溶液を２０℃前後の温度まで冷却し、水（５０ｍｌになる量）で希釈し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラムで脱塩する。得られる画分をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水で希釈し、次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで希釈する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物４４４ｍｇが得られる。観察される収率は８９％である。この生成物は、これ以上の精製をすることなく、次のアシル化ステップにおいて使用する。
【００６０】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６１】
１．３ ビオチン化され還元的アミノ化された、ヘパリナーゼ３を用いて解重合されたヘパリン：
解重合され還元的アミノ化されたヘパリン２００ｍｇを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液２ｍｌ中に２０℃前後の温度で溶解させる。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを得られた溶液に加える。得られた溶液を２０℃前後の温度で１時間攪拌する。この溶液を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液４ｍｌで希釈する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加えて、得られた混合物を２時間攪拌する。さらにスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加えて、反応混合物を１６時間攪拌する。得られた反応媒体を水（２００ｍｌになる量）で希釈し、０．４５μｍの膜でろ過してＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入する。生成物を水で、次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで溶離する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物１８８ｍｇが得られる。観察される収率は９４％である。
【００６２】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。
【００６３】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：１．３−１．８（ＣＨ２ビオチン，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（ＣＨ２ＣＯビオチン，ｔ，７Ｈｚ）、２．７９（１Ｈ，ｄ，１２Ｈｚ）、３．００（１Ｈ，ｄｄ，１２−５Ｈｚ）、３．２０（ＮＣＨ２ビオチン，ｍ）、３．３０（ＣＨ，ｍ）、３．６８（ＣＨ，ｍ）、３．８０（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｍ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４５（ＣＨ，ｍ）、４．６３（ＮＣＨビオチン，ｍ）、４．８５（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【実施例２】
【００６４】
２．１ ＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によって得られるヘパリン、ヘパリナーゼ３を用いる解重合：
２０℃前後の温度でＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン１ｇを、ｐＨ７．０±０．１、２０ｍＭ塩化ナトリウムおよびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌに調節された５ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１５ｍｌ中に溶解させる。ヘパリナーゼ３の０．５ＩＵをヘパリン溶液に加える。得られる反応混合物を７日間攪拌する。塩化ナトリウム１ｇおよびメタノール４５ｍｌを反応混合物に加える。得られる懸濁液を０．４５μｍの膜を通してろ過する。ケーキをメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥する。白色固体０．９６ｇが得られる。観察される収率は９６％である。
【００６５】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。結果は出発ヘパリン中に存在するグリコセリン種の少なくとも８０％の消失を示している。
【００６６】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６７】
２．２ ヘパリナーゼ３を用いて解重合され還元的アミノ化された、米国特許出願公開第２００５／０２１５５１９号によるヘパリン：
ヘパリナーゼ３で処理されたＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン０．５ｇを５Ｍ塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌ中に溶解させる。ナトリウムシアノボロハイドライド０．５ｇをヘパリン溶液に加える。混合物を７０℃に２４時間維持する。溶液を２０℃前後まで冷却し、水（５０ｍｌになる量）で希釈し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩する。画分を集めて凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物４４６ｍｇが得られる。観察される収率は８９％である。この生成物は、これ以上の精製をすることなく、次のアシル化ステップにおいて使用する。
【００６８】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、３．２８（ＣＨ，ｍ）、３．６５（ＣＨ，ｍ）、３．７７（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｄ，１２Ｈｚ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４２（ＣＨ，ｍ）、４．８８（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００６９】
２．３ ビオチン化され還元的アミノ化された、ヘパリナーゼ３を用いて解重合されたＵＳ２００５／０２１５５１９Ａ１によるヘパリン：
還元的アミノ化された解重合されたヘパリン２００ｍｇを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液２ｍｌ中に２０℃前後の温度で溶解させる。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを得られた溶液に加える。溶液を２０℃前後の温度で１時間攪拌する。得られた懸濁液を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液４ｍｌで希釈する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加え、混合物を２時間攪拌する。さらにスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン３７ｍｇを加え、反応混合物を１６時間攪拌する。得られた反応媒体を水（２００ｍｌにする量）で希釈し、０．４５μｍの膜を通してろ過してＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムのグラジエントで溶離する。得られた生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０のカラムで脱塩し、次いで凍結乾燥する。白色の凍結乾燥物１８８ｍｇが得られる。観察される収率は９４％である。
【００７０】
生成物は、ヘパリナーゼ１，２および３の混合物を用いる解重合によって制御することができ、特許出願ＵＳ２００５／０１８６６７９Ａ１に記載されている方法を使用してＨＰＬＣ−ＳＡＸによって分析することができる。
【００７１】
Ｄ２Ｏ（２５℃、δ（ｐｐｍ））中での多糖類混合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトル：主要シグナル：１．３−１．８（ＣＨ２ビオチン，ｍ）、２．０５（ＣＨ３ＣＯ，ｓ）、２．２５（ＣＨ２ＣＯビオチン，ｔ，７Ｈｚ）、２．７９（１Ｈ，ｄ，１２Ｈｚ）、３．００（１Ｈ，ｄｄ，１２−５Ｈｚ）、３．２０（ＮＣＨ２ビオチン，ｍ）、３．３０（ＣＨ，ｍ）、３．６８（ＣＨ，ｍ）、３．８０（ＣＨ，ｍ）、４．０５（ＣＨ，ｍ）、４．１０（ＣＨ，ｓ）、４．２０（ＣＨ，ｓ）、４．２５（ＣＨ，ｍ）、４．３５（ＣＨ，ｓ）、４．４５（ＣＨ，ｍ）、４．６３（ＮＣＨビオチン，ｍ）、４．８５（ＣＨ，ｓ）、５．２２（ＣＨ，ｓ）、５．４２（ＣＨ，ｓ）。
【００７２】
本発明による化合物を、生化学的研究および薬剤学的研究の対象とした。
【００７３】
抗第ＩＩａ因子活性および抗第Ｘａ因子活性の測定
ヒト血漿中または緩衝系中の抗第ＩＩａ因子（抗ＦＩＩａ）活性および抗第Ｘａ因子（抗ＦＸａ活性）を発色法によって解析する：抗第ＩＩａ因子活性は、発色基材Ｓ−２２３８、α−トロンビンおよびヒトＡＴＩＩＩ（アンチトロンビンＩＩＩ）を含有するＡｃｔｉｃｈｒｏｍｅヘパリン抗第ＩＩａ因子キット（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）によって試験する。抗ＦＸａ活性は自動化された凝固測定器ＡＣＬ ７０００（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、ＡＴＩＩＩ、第Ｘａ因子および発色基材Ｓ−２７６５を含有するＨｅｐａｒｉｎ ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して測定する。２つの分析は製造者の取扱説明書に従って実施する。
【００７４】
ビオチン化ヘパリン画分のヒト血漿および緩衝系中におけるインビトロ活性を測定するための標準較正曲線を確定するために以下の標準を使用する：
−第１ 低分子量ヘパリンのための国際標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年制定、コード番号８５／６００）、
−第２ 低分子量ヘパリンのための国際標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、１９８７年制定、コード番号０１／６０８、２００６年６月から使用）
−エノキサパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標）、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）が内部標準として使用された。
【００７５】
抗ＦＩＩａ活性の測定のために、サンプルまたは国際低分子量ヘパリン標準１０μｌをヒト血漿中のアンチトロンビンまたは０．０５ＭのトリスＨＣｌ、０．１５４ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の緩衝系中に希釈する。この溶液１０μｌを９６ウェルのマイクロ滴定プレートに加える。測定は三重に繰り返す（３つのウェル上で）。マイクロ滴定プレートは、３００ｒｐｍで揺動させながら３７℃に維持する。それぞれのウェルにトロンビン４０μｌを加えて、正確に２分間インキュベートする。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ４０μｌを加える。９０秒後に酢酸４０μｌを加えることによって反応を停止させる。吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４０５ｎｍにおいて測定する。
【００７６】
抗ＦＸａ活性測定のために、サンプルまたは国際低分子量ヘパリン標準をヒト血漿中または０．０５ＭのトリスＨＣｌ、０．１５４ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の緩衝系を用いて希釈する。血漿または緩衝液中のヘパリノイドを含有するサンプルを、ＡＴＩＩＩを含有するワーキング緩衝液を用いて再度１：２０に希釈し、プローブローター中に二重に入れる。第Ｘａ因子試薬および発色基材を自動凝固測定器ＡＣＬ ７０００の指示された容器に注ぎ入れる。
【００７７】
抗ＦＸａ活性の測定は、ＡＣＬ ７０００ソフトウェア中に統合されている「ヘパリン」手順を用いて実施する。分析中は、（ワーキング緩衝液で希釈された）サンプル５０μｌを第Ｘａ因子試薬５０μｌと混合する。３７℃で６０秒間のインキュベーション時間後、濃度１．１ｍＭの発色基材５０μｌを加えて吸収の変化を時間の関数として波長４０５ｎｍにおいて測定する。
【００７８】
得られた結果を、下表に特に記載する。
【００７９】
【表１】
【００８０】
したがって、本発明によるビオチン化ヘパリンの抗ＦＸａ活性が保存されることが、出発天然ヘパリンとの比較によって分かる。
【００８１】
本発明によるビオチン化ヘパリンは、薬剤の調製のために使用され得る。これらは特に抗血栓薬剤として使用され得る。したがって、もう１つの態様によれば、本発明の１つの主題は上記で定義されたビオチン化ヘパリンを含む薬剤である。これらの薬剤は、治療法において、特に静脈血栓、動脈血栓発作における治療および予防において、特に心筋梗塞または不安定狭心症、末梢動脈血栓症、例えば下肢動脈症、脳動脈血栓症および脳卒中などの事例において用途がある。これらは平滑筋細胞の増殖、血管形成の予防および治療において、またアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症のための神経保護薬としても有用である。
【００８２】
もう１つの態様によれば、本発明は上述の病変を治療するための方法にも関し、この方法は本発明による化合物またはこれらの薬剤として許容される塩の有効な投与量の患者への投与を含む。上記において定義されたビオチン化ヘパリンの上述の病変を治療および予防するための使用は、前記ビオチン化ヘパリンのこれらの病変を治療または予防するための薬剤の製造のための使用と同様に、本発明の部分を形成する。
【００８３】
もう１つの態様によれば、本発明の１つの主題は、有効主剤として、本発明によるビオチン化ヘパリンまたはこの薬剤として許容される塩および少なくとも１つの薬剤として許容される不活性な賦形剤を含む薬剤組成物である。前記賦形剤は所望の薬剤形態および投与の態様、例えば経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、経粘膜、局所または直腸内などの経路、によって選択される。
【００８４】
それぞれの投与単位中に、有効主剤は、所望の予防的または治療上の効果を得るための、想定される１日投与量に適した量で存在する。それぞれの投与単位は有効剤を２５から１５０ｍｇ、好都合には３０から１００ｍｇ含有し得る。これらの抗凝固化合物はアビジンまたはストレプトアビジンを用いて中和され得る。
【００８５】
より高いまたはより低い投与量が適切である特殊な事例があり得る；かかる投与量は本発明に関する状況を外れるものではない。通常の慣行によれば、それぞれの患者にとって適当な投与量は投与の態様および前記患者の体重や反応に照らして医師によって決定される。
【００８６】
本発明による化合物は、所望の治療のために有用な１つまたは複数の他の有効剤、例えば抗血栓剤、抗凝固剤または抗血小板凝集剤などとの組合せにおいても使用され得る。
【００８７】
本発明の１つの主題は、本発明によるビオチン化ヘパリンを中和することを可能にすることを特徴とするアビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法でもある。したがって、アビジンまたはストレプトアビジンは、本発明によるビオチン化ヘパリンを中和するための薬剤の調製のために使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化ヘパリンであって、前記ヘパリンの構成多糖類がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有すること、および一般式（Ｉ）
【化６】
［式中、
−ｉは、０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）の配列を表し、
【化７】
［式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なって、１から１０のいずれかの値を取り得る整数である。］、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ｎは、１５０００Ｄａの平均分子量を有するヘパリンについて約２５の平均値を有する整数を表し、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する。］
に相当することを特徴とする、ビオチン化ヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項２】
ｉが０に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項３】
ｉが１に等しいこと、およびＲ１が式（ａ）の配列を表し、式中、ｊは５に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項４】
ｉが１に等しいこと、およびＲ１が式（ｂ）の配列を表し、式中、ｊとｋが同一であり５に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項５】
Ｂｉｏｔが式（ｃ）
【化８】
のビオチン基を表すことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項６】
前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも６４％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項７】
前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有することを特徴とする、請求項６に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項８】
前記ヘパリンがブタ由来のものであることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のヘパリン。
【請求項９】
前記ヘパリンがブタ腸粘膜に由来することを特徴とする、請求項８に記載のヘパリン。
【請求項１０】
請求項１から９の一項に記載のビオチン化ヘパリンを調製する方法であって、下記の
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップ、
ｂ）上記で得られた生成物に対してアミン塩および還元剤の存在下で２０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップ、
ｃ）最後にＲ１、ｉおよびＢｉｏｔが請求項１から５のいずれか一項において定義されたとおりである活性化された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて水性媒体または有機媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
下記の
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップ、
ｂ）上記で得られた生成物に対してハロゲン化アンモニウム塩およびボロハイドライド塩の存在下で５０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップ、
ｃ）最後に活性化されたエステル形態の−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて水性媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンまたは前記ビオチン化ヘパリンの薬剤として許容される塩を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１３】
有効主剤として請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンまたは前記ビオチン化ヘパリンの薬剤として許容される塩および少なくとも１つの薬剤として許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンの抗血栓薬剤としての使用。
【請求項１５】
静脈血栓、動脈血栓発作、特に心筋梗塞または不安定狭心症、末梢動脈血栓症、例えば下肢動脈症、脳動脈血栓症または脳卒中などを治療および予防するための、平滑筋細胞の増殖、血管形成を治療および予防するための、およびアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症のための神経保護薬としての、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
アビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンを中和することを可能にすることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンを中和するための薬剤の調製のための、アビジンまたはストレプトアビジンの使用。
【請求項１】
ビオチン化ヘパリンであって、前記ヘパリンの構成多糖類がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有すること、および一般式（Ｉ）
【化６】
［式中、
−ｉは、０または１に等しく、
−Ｒ１は、式（ａ）または（ｂ）の配列を表し、
【化７】
［式中、ｊおよびｋは、同一でありまたは異なって、１から１０のいずれかの値を取り得る整数である。］、
−Ｂｉｏｔは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−ｎは、１５０００Ｄａの平均分子量を有するヘパリンについて約２５の平均値を有する整数を表し、
−Ｘは、ＨまたはＳＯ３Ｎａを表し、
−Ｙは、ＣＯＣＨ３またはＳＯ３Ｎａを表し、
−波線は、これらが結合しているピラノース環の面の下または上のいずれかに位置する結合を意味する。］
に相当することを特徴とする、ビオチン化ヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項２】
ｉが０に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項３】
ｉが１に等しいこと、およびＲ１が式（ａ）の配列を表し、式中、ｊは５に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項４】
ｉが１に等しいこと、およびＲ１が式（ｂ）の配列を表し、式中、ｊとｋが同一であり５に等しいことを特徴とする、請求項１に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項５】
Ｂｉｏｔが式（ｃ）
【化８】
のビオチン基を表すことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項６】
前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも６４％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項７】
前記ヘパリンの構成多糖類の少なくとも８０％がこれらの還元性末端に−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基への共有結合を有することを特徴とする、請求項６に記載のヘパリンおよびこれらの薬剤として許容される塩。
【請求項８】
前記ヘパリンがブタ由来のものであることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のヘパリン。
【請求項９】
前記ヘパリンがブタ腸粘膜に由来することを特徴とする、請求項８に記載のヘパリン。
【請求項１０】
請求項１から９の一項に記載のビオチン化ヘパリンを調製する方法であって、下記の
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップ、
ｂ）上記で得られた生成物に対してアミン塩および還元剤の存在下で２０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップ、
ｃ）最後にＲ１、ｉおよびＢｉｏｔが請求項１から５のいずれか一項において定義されたとおりである活性化された−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて水性媒体または有機媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
下記の
ａ）ヘパリンがヘパリナーゼ３を用いて処理されるステップ、
ｂ）上記で得られた生成物に対してハロゲン化アンモニウム塩およびボロハイドライド塩の存在下で５０から８０℃の間の温度において還元的アミノ化が実行されるステップ、
ｃ）最後に活性化されたエステル形態の−（Ｒ１）ｉ−Ｂｉｏｔ基を用いて水性媒体中の塩基の存在下でアシル化が実行されるステップ
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンまたは前記ビオチン化ヘパリンの薬剤として許容される塩を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１３】
有効主剤として請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンまたは前記ビオチン化ヘパリンの薬剤として許容される塩および少なくとも１つの薬剤として許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンの抗血栓薬剤としての使用。
【請求項１５】
静脈血栓、動脈血栓発作、特に心筋梗塞または不安定狭心症、末梢動脈血栓症、例えば下肢動脈症、脳動脈血栓症または脳卒中などを治療および予防するための、平滑筋細胞の増殖、血管形成を治療および予防するための、およびアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症のための神経保護薬としての、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
アビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンを中和することを可能にすることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか一項に記載のビオチン化ヘパリンを中和するための薬剤の調製のための、アビジンまたはストレプトアビジンの使用。
【公表番号】特表２０１０−５１８２５１（Ｐ２０１０−５１８２５１Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９８４０（Ｐ２００９−５４９８４０）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０００１７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１３９１８
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０００１７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１３９１８
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
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