ビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、その薬学的に許容可能な塩、その製造方法及びそれを有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物
【課題】新規なビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物、その薬学的に許容可能な塩の提供。
【解決手段】下記の化学式１
で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、その薬学的に許容可能な塩、その製造方法及びそれを有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物。化学式１の誘導体化合物は、βアミロイド集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させ、βアミロイド集積関連疾患において現われる学習及び記憶力低下を改善させる効果を示す。
【解決手段】下記の化学式１
で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、その薬学的に許容可能な塩、その製造方法及びそれを有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物。化学式１の誘導体化合物は、βアミロイド集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させ、βアミロイド集積関連疾患において現われる学習及び記憶力低下を改善させる効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、その薬学的に許容可能な塩、その製造方法及びそれを有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に平均寿命が長くなって老齢人口が増加する高齢化化社会になるにつれて、アルツハイマー病に代表される老人性痴ほう症、脳卒中またはパーキンソン病のような退行性脳疾患の発病率が大きく増加している。保健社会研究院調査統計によると我が国の老人人口は、２０００年に７％を越えて高齢社会に突入して以来、２００３年には３９７万人と、老人人口の割合が８．３％に至り、２０１９年には、１４．４％に至って完全高齢社会になると予想されている。我が国の場合、７５〜７９歳の老人人口の１５％が痴ほう症を病んでいて、８０歳以上の老人人口の３９％が痴ほう症患者である。また、女性が男性に比べて２〜３倍高い発病率を有することが知られている。
【０００３】
痴ほう症は、正常に発達した脳が歳を取るにつれて後天的な外傷や疾病などの外部的要因によって基質的に損傷されたり破壊されたりして、言語、学習、知能などに対する全般的な認知機能と高次精神機能が病的に減退する複合的な臨床症侯群を包括したもので、漸進的な記憶力障害が、失語症、失認症、失行症などの行動的な障害とともに現われて、社会的および職業的な機能に障害をもたらす。痴ほう症を大きく原因別でみると、アルツハイマー病による痴ほう症、血管性痴ほう症、特定脳疾患及び全身性疾患による痴ほう症などに分けることができ、この中でアルツハイマー病による痴ほう症が５０％以上を占める。
【０００４】
アルツハイマー病の解剖学的な特徴は、記憶及び認識を担当する神経細胞の減少と死滅である。病理学的な特徴は、神経細胞内部の神経原線維変化（neurofibrillary tangle）と神経細胞外部の老人性斑（senile plaque）の発現である。アルツハイマー疾患は、免疫学的要因、遺伝的要因、ウイルス感染、毒性物質を含んだ多様な環境的要因、頭部に怪我をした場合など多くの要因によって誘発されることが知られていて、今まで、βアミロイドタンパク質が脳に蓄積されて生じる神経斑の神経毒性による神経細胞破壊と、過リン酸化タウタンパク質が脳に蓄積されて神経繊維束が生成され、それによって神経退行を起こすことが、アルツハイマー性痴ほう症の主要原因として報告されている。
【０００５】
上述したβアミロイドは、アルツハイマー病患者で発見されるタンパク質で、４０個のアミノ酸（βアミロイド１−４０）または４２個のアミノ酸（βアミロイド１−４２）で構成されている。βアミロイドタンパク質前駆体は、β−、γ−分解酵素によってβアミロイド４２単量体になった後、集積してオリゴマーを形成し、このオリゴマーの集積でプロトフィブリル（protofibril）、フィブリル（fibril）、プラーク（plaque）の段階を経るようになる。最近の研究で、オリゴマーが、髪の毛構造のフィブリルより高い神経毒性を有すると報告され、オリゴマーの生成を減らすことがアルツハイマー病の治療方法として注目されるようになった。
【０００６】
現在まで開発された治療剤では、アルツハイマー性痴ほう症患者の脳でアセチルコリンという物質が正常人に比べて減少するという点に着眼して、脳内のアセチルコリンの量を増加させたり、コリン性神経細胞の活性を増加させる方向で開発されたコリン系統の薬剤がある。しかし、市販中のアルツハイマー病治療剤である、ドネペジル（Donepezil）、リバスチグミン（Rivastigmin）、ガランタミン（Galantamin）、メマンチン（Memantine）などは、病気を根本的に治療するためではなく、記憶力障害症状を改善するための薬物であり、副作用及び治療に限界があるため改善が必要である。
【０００７】
ここで、本発明者等は、βアミロイドの集積を阻害する治療剤を開発するために研究中、新規なビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物が、βアミロイドの集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させることができ、アルツハイマー病のようなβアミロイド集積関連疾患に有用であることを発見して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／０１８２８４６ Ａ１号公報
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１０７ Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９６５，５６８ Ｂ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規なビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物、その薬学的に許容可能な塩を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記新規な誘導体化合物の製造方法を提供することにある。
【００１１】
さらに、本発明のまた他の目的は、前記新規な誘導体化合物を有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、下記の化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物、その薬学的に許容可能な塩及びその製造方法を提供する。
【００１３】
【化１】
【００１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、本明細書中以下で定義するとおりである。）
【００１５】
また、本発明は、βアミロイド集積を阻害することができ、βアミロイドに由来した毒性を軽減させることができる前記化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の化学式１の誘導体化合物は、βアミロイド集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させて、アルツハイマー病などのようなβアミロイド集積関連疾患において現われる学習及び記憶力低下を改善させる効果を示すので、本発明による化学式１の誘導体化合物は、アルツハイマー病の治療剤及びそれと類似性がある疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による実験例４のマウスの空間的な認知学習能力を測定する水中迷路試験の結果を示したグラフである。
【図２】本発明による実験例４の急性アルツハイマー病（ａｃｕｔｅ ＡＤ）モデルでのβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力に対する効果を測定する、Ｙ−迷路、物体認識、受動回避試験の結果である（（Ａ）Ｙ−迷路：１はＡβ１−４２ １０ｎＭ；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ、（Ｂ）物体認識：１は対照群；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；５はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ、（Ｃ）受動回避：１は対照群；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；５はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ）。
【図３】本発明による実験例５の形質転換マウスに対するβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力に対する効果を測定する、Ｙ−迷路、物体認識、文脈恐怖条件づけの結果である（（Ａ）：Ｙ−迷路、（Ｂ）：物体認識、（Ｃ）：文脈恐怖条件づけであり、１は対照群であり、２は実施例１の化合物である）。
【図４】本発明による実験例５の形質転換マウスでの学習及び記憶力改善効果がβアミロイドの集積阻害とβアミロイド量の減少によって現われた結果なのかどうかを調べるために、形質転換マウスの大脳を免疫組織学的な方法で分析した結果である（（Ａ）：コンゴレッドで染色してアミロイドプラークの量を測定、（Ｂ）：酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４０）の量を測定、（Ｃ）：酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４２）の量を測定、（Ｄ）：神経細胞の量を測定）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、下記の化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１９】
【化２】
【００２０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２１】
本発明による前記化学式１の誘導体化合物において、
前記Ｘは、互いに独立して窒素または炭素であり；
前記Ｒ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のアルキルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
前記Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びジ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノからなる群から選択されるいずれか一つである。
【００２２】
好ましくは、本発明による化学式１の誘導体化合物において、
前記Ｘは、互いに独立して、窒素または炭素であり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立的して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましい。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明による前記化学式１で表わされる誘導体化合物は、
（１）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（２）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（３）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン、
（４）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（５）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（６）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（７）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（８）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（９）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１０）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１１）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１２）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１３）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１４）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１５）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１６）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１７）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１８）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１９）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（２０）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２１）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２２）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２３）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２４）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）フェノール、
（２５）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）フェノール、
（２６）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、及び
（２７）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノールからなる群から選択されるいずれか一つである。
【００２４】
また、本発明は、前記化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩だけではなく、その異性体またはそれから製造され得る溶媒化物または水和物をすべて含む。
【００２５】
さらに、本発明は、前記化学式１で表わされる誘導体の製造方法を提供する。
【００２６】
製造方法１：
本発明による化学式１の誘導体は、下記のスキーム１に示したように、化学式２のピリミジン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物を塩基条件下で縮合反応させる工程（工程１）、及び前記工程１で製造した化学式４の化合物を脱保護反応させる工程（工程２）からなる製造方法によって製造することができる。
【００２７】
【化３】
【００２８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、前記化学式１について本明細書中で定義するとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシの場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルにより保護されており、化学式１ａは化学式１の誘導体である）。
【００２９】
以下、本発明による前記製造方法１を工程別でさらに詳細に説明する。
【００３０】
まず、本発明による前記工程１は、ピリミジン母核を有する化学式２の化合物である４，６−ジメチルピリミジン化合物と化学式３のベンズアルデヒド化合物とを縮合反応させる工程である。前記工程１は、４，６−ジメチルピリミジン化合物とベンズアルデヒド化合物を相間移動触媒（ＰＴＣ，ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃａｔａｌｙｓｔ）の存在下で塩基性溶液で加熱還流させて遂行することができる。ここで、相間移動触媒は、テトラブチルアンモニウムハイドロジェンスルファート（Ｂｕ４ＮＨＳＯ４）、ベンジルトリメチルアンモニウムなどを使用することができ、塩基性溶液は水酸化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。また、前記化学式３のベンズアルデヒド化合物は、ヒドロキシ基が保護基により保護された下記の化合物からなる群から選択されるものを使用することがさらに好ましい。
【００３１】
【化４】
【００３２】
（前記化合物構造において、ＰＭＢは、ｐ−メトキシベンジルであり、ＭＯＭはメトキシメチルである。）
【００３３】
次に、本発明による前記工程２は、工程１で製造した化学式４の化合物に対して保護基を除去する工程である。ここで、保護基は、塩酸／エチルアルコール（３：１）の溶媒で加熱還流させたり、トリフルオロ酢酸を含むメチレンクロライド溶媒で撹拌することにより除去することができる。
【００３４】
製造方法２：
また、本発明による化学式１の誘導体は、下記のスキーム２に示したように化学式５のベンゼン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物をエーテル類の有機溶媒に溶解させた後、０℃で塩基を添加して反応させる工程（工程Ａ）、及び前記工程Ａで製造した化学式６の化合物を脱保護反応させる工程（工程Ｂ）を含んで成る製造方法によって製造することができる。
【００３５】
【化５】
【００３６】
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記化学式１において定義したもののと同様であり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシの場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルにより保護されており、化学式１ｂは化学式１の誘導体である）。
【００３７】
以下、本発明による前記製造方法２を工程別にさらに詳しく説明する。
【００３８】
まず、本発明による前記工程Ａは、化学式５の１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンまたは、３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールと化学式３のベンズアルデヒド化合物をホーナーエモンズ（Horner-Emmons olefination）反応させる工程である。前記工程Ａは、１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンまたは３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールと化学式３のベンズアルデヒドを無水テトラヒドロフラン溶媒に溶解後、０℃で塩基を添加して遂行することができる。ここで、塩基は水素化ナトリウム（ＮａＨ）、水素化リチウム（ＬｉＨ）、水素化カリウム（ＫＨ）などのアルカリ金属水素化合物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムプロポキシド、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、リチウムイソプロポキシドなどの金属アルコキシドなどを使用することが好ましく、カリウム ｔ−ブトキシドを使用することがさらに好ましい。また、前記化学式３のベンズアルデヒド化合物は、製造方法１で使用したヒドロキシ基が保護基に保護された化合物からなる群から選択されたものを使用することが好ましい。
【００３９】
次に、本発明による前記工程Ｂは、工程Ａで製造した化学式６の化合物に対して保護基を除去する工程である。ここで、保護基は、塩酸／エチルアルコール（３：１）の溶媒で加熱還流させたり、トリフロオロ酢酸を含むメチルレンクルロライド溶媒で撹拌したりすることで遂行することができる。
【００４０】
さらに、本発明は、前記化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００４１】
前記βアミロイド集積関連疾患は、痴ほう症、アルツハイマー病、ダウン症候群、脳アミロイド血管症、大脳アミロイド血管症、全身性アミロイド病、オランダ（Dutch）型アミロイド症などを含む。
【００４２】
本発明による前記化学式１の誘導体は、ＴｈＴ蛍光強度を使用したβアミロイド（１−４２）フィブリル形成に対する阻害効果測定実験で、対照群に比べて低い蛍光強度を示すことから、優秀なβアミロイドフィブリル形成阻害効果があることが分かる（実験例１参照）。
【００４３】
また、本発明による化学式１の誘導体は、ＨＴ−２２細胞に対する細胞毒性を測定した実験の結果、大部分の実施例の化合物は、７０％以上の高い細胞生存率を示すことが分かる（実験例２参照）。
【００４４】
さらに、本発明による前記化学式１の誘導体は、βアミロイドによる細胞毒性の軽減程度を測定した実験から、対照群に使用したβアミロイド（Ａβ ２３−３５）に比べて、細胞生存率が増加することが測定され、このことからβアミロイドの毒性を効果的に軽減させることが分かる（実験例３参照）。
【００４５】
また、本発明による前記化学式１の誘導体は、急性アルツハイマー病（Ａｃｕｔｅ ＡＤ）マウスに対するＹ−迷路検査、物体認識試験、受動回避試験、水中迷路試験により学習力及び記憶力を評価する実験の結果、βアミロイド（１−４２）を注入した後、本発明による実施例化合物を投与した場合、統計的に有意な記憶力回復、認知学習能力回復を示すことが分かる（実験例４、表６、図１及び図２参照）。
【００４６】
さらに、本発明による前記化学式１の誘導体は、形質転換マウスに対するＹ−迷路試験、物体認識試験により学習能力及び記憶力を評価した実験結果から、多少の記憶力障害を回復させることが分かる（実験例５、図３の（Ａ）及び（Ｂ）参照）。また、文脈恐怖条件づけ試験（context fear conditioning）による記憶力試験の結果から、本発明による化合物を投与した場合、βアミロイド毒性による海馬損傷が減少することが分かる（実験例５、図３の（Ｃ）参照）。
【００４７】
また、本発明による前記化学式１の誘導体は、大脳皮質と海馬のアミロイドプラーク量とβアミロイド量を測定した結果、対照群に比べてそれらの量を減少させ（実験例６、図４の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）参照）、神経細胞の量をさらに増加させたことが分かる。
【００４８】
したがって、本発明による前記化学式１の誘導体は、βアミロイドの集積を阻害することにより、上述したβアミロイド集積関連疾患を予防または治療するために有効に使用できる。
【００４９】
本発明による前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防剤または治療剤は、下記の多様な経口または非経口投与形態に剤形化することができるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
経口投与用の剤形では、例えば、錠剤、丸薬、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、それら剤形は、前記有効成分以外に慣用的に使用される充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を１種以上使用することができる。崩壊剤としては、寒天、澱粉、アルギン酸またはそのナトリウム塩、無水リン酸１水素カルシウム塩などを使用することができ、滑沢剤としては、シリカ、タルク、ステアリン酸またはそのマグネシウム塩またはカルシウム塩、ポリエチレングリコールなどを使用することができ、結合剤として、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどを使用することができる。その他にも、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどを希釈剤として使用することができ、場合によっては、一般的に知られた混合物、吸収剤、着色剤、香料、甘味料などを一緒に使用することができる。
【００５１】
また、前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む退行性神経疾患の予防剤または治療剤は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤または胸部内に注射剤を注入する方法による。ここで、非経口投与用剤形に製剤化するために、前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を安定剤または緩衝剤とともに水に混合し、溶液または懸濁液を調製して、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型製剤とすることができる。
【００５２】
前記組成物は、滅菌したり、または防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩、緩衝剤などの補助剤及びその他治療的に有用な物質を含むことができ、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
【００５３】
本発明の前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む、退行性神経疾患の予防剤または治療剤を単位用量形態に剤形化する場合、有効成分として化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を、約０．１〜１，５００ｍｇの単位用量で含有することが好ましい。投与量は、患者の体重、年齢及び疾病の特殊な性質と重症度のような要因による医者の処方による。しかし、成人治療に必要な投与量は、投与の頻度と強度によって一日に約１〜５００ｍｇの範囲が普通である。成人の筋肉内または静脈内投与時の一回投与量では、一日に数回に分けて投与することができ、一日に約５〜３００ｍｇの全体投与量であれば十分であるが、一部患者の場合には、さらに高い一日投与量が好ましいことがある。
【００５４】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳細に説明する。
【００５５】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
＜製造例１＞出発物質の製造１
本発明による製造方法１で出発物質に使用する化学式２の４，６−ジメチルピリミジン化合物を、下記のスキーム３に示したような有機化学分野で一般的に知られている方法で製造して使用した。すなわち、化学式７の化合物と２，４−ペンタジオンを炭酸カリウム水溶液で加熱還流させて得た。
【００５７】
【化６】
【００５８】
（式中、Ｒ１は、化学式１において定義したものと同様である。）
【００５９】
＜製造例２＞出発物質の製造２
本発明による製造方法２で出発物質で使用する化学式５の１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンは、下記のスキーム４に示したような有機化学分野で一般的に知られているアルブーゾフ（Arbuzof）反応を使用して製造した。すなわち、α−ジブロモ−ｍ−ザイレンをトリエチルホスフィンとともにトルエンで加熱還流させて得た。
【００６０】
【化７】
【００６１】
＜製造例３＞出発物質の製造３
本発明による製造方法２で出発物質に使用する化学式５の３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールを、下記のスキーム５に示したような有機化学分野で一般的に知られている方法でアルブーゾフ（Ａｒｂｕｚｏｖ）反応を使用して製造した。すなわち、３，５−ジ（ヒドロキシメチル）フェノールを無水１，４−ジオキサンに溶解した後、ＢＦ３?Ｅｔ２Ｏとヨウ化カリウムを添加して、３，５−ビス（アイオドメチル）フェノールを得た後、それをトリエチルホスフィンとともにトルエンで加熱還流させて、３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールを得た。
【００６２】
【化８】
【００６３】
＜実施例１＞（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジンの合成
【００６４】
【化９】
【００６５】
工程１：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジンの合成
１０ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、４，６−ジメチルピリミジン０．２１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、４−メトキシ−３−（４−メトキシベンジルオキシ）ベンズアルデヒド１．１ｇ（４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート０．１ｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を加えて、５時間加熱還流した。固体をろ過して水で洗浄した。得られた固体は、真空乾燥器で乾燥させてエチルアセテートで再結晶して（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジン１．０６ｇを得た。
【００６６】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.81 (s, 6H), 3.91 (s, 6H), 5.12 (s, 4H), 6.87 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.19 (s, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 9.03 (s, 1H)
【００６７】
工程２：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジン１．０６ｇを、９０ｍｌのエチルアルコールと３０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、２０時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、沈殿物をろ過して水と核酸で洗浄して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン０．６ｇ（７９％）を得た。
【００６８】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.80 (s, 6H), 6.97 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.11 (dd, J = 1.9, 8.3 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.95 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 9.17 (s, 2H)
【００６９】
＜実施例２＞（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
【００７０】
【化１０】
【００７１】
工程１：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
１０ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、４，６−ジメチルピリミジン０．２１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド０．８３ｇ（４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート０．１ｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を加えて、５時間加熱還流した。反応液をエチルアセテートで抽出して、有機層を減圧蒸留して得られた化合物をカラムクロマトグラフィーで精製して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．５１ｇを得た。
【００７２】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 2.77 (s, 12H), 3.42 (s, 6H), 5.24 (s, 4H), 7.05 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 1.9, 8.9 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.97 (d, J = 1.0 Hz, 1H)
【００７３】
工程２：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．５１ｇを、４５ｍｌのエチルアルコールと１５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、１０時間熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、炭酸水素ナトリウム１．２６ｇを加え、水４００ｍｌを加えて結晶をろ過して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．３１ｇ（３８％）を得た。
【００７４】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 2.73 (s, 12H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.16 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 7.59 (s, 1H), 7.81 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.93 (s, 1H), 9.62 (bs, 2H)
【００７５】
＜実施例３＞（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼンの合成
【００７６】
【化１１】
【００７７】
工程Ａ：（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼンの合成。
１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼン０．７５ｇと４−メトキシ−３−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド０．７８ｇを、ＴＨＦ溶液に溶解した後、反応液を０℃に冷却してカリウム ｔ−ブトキシド０．８８ｇを加えた。反応液は、室温で２時間反応させた。反応液に２００ｍｌの水を加えて沈殿物をろ過して、白色固体である（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼン０．６９ｇを得た。
【００７８】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.41 (s, 6H), 3.78 (s, 6H), 5.20 (s, 4H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 1.9, 8.5 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 7.32-7.34 (m, 5H), 7.79 (s, 1H)
【００７９】
工程Ｂ：（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼン０．６９ｇを、６０ｍｌのエチルアルコールと２０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、１時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、水１００ｍｌを加えて沈殿物をろ過して、（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン０．５２ｇ（７７％）を得た。
【００８０】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.77 (s, 6H), 6.91 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 16.3 Hz, 2H), 6.98 (dd, J = 1.9, 8.3 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 16.3 Hz, 2H), 7.29-7.41 (m, 3H), 7.74 (s, 1H), 9.03 (s, 2H)
【００８１】
前記実施例１及び実施例２のような方法で、多様なビス（スチリル）ピリミジン誘導体を合成し、その構造及び１Ｈ ＮＭＲデータを下記の表１に示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
前記実施例３のような方法で多様なビス（スチリル）ベンゼン誘導体を合成し、その構造及び１Ｈ ＮＭＲデータを下記の表２に示した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
＜実験例１＞βアミロイドフィブリル形成阻害実験
本発明による実施例化合物のβアミロイドフィブリル阻害程度を測定するために、ＴｈＴ蛍光強度を使用して下記の実験を遂行した。
【００８９】
βアミロイド（１−４２）と本発明の実施例１〜２７の化合物をＤＭＳＯ溶液に溶解して、それをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）溶液に希釈した。βアミロイド（１−４２）（対照群）と実施例化合物１〜２７の最終濃度は、各々２５μＭ、１０μＭにした。室温で１時間培養した後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液に溶解しているチオフラビンＴ（ＴｈＴ，５μＭ，ｐＨ８．５）を加えた。多重表示蛍光計数器（multi label fluorescence counter）を使用して、９６マイクロプレートで蛍光強度を測定した。その結果を下記の表３に示した。蛍光測定時の励起（excitation）と発光（emission）の波長は、４５０ｎｍ（スリット１０ｎｍ）と４８５ｎｍ（スリット１０ｎｍ）が好ましい。
【００９０】
【表６】
【００９１】
前記表３を参照すると、ＴｈＴ蛍光強度を使用したβアミロイド（１−４２）フィブリル形成を阻害する程度を測定した結果、βアミロイド（１−４２）を実施例化合物とともに培養した群は、何も処理しない対照群に比べて低い蛍光強度を示した。低い蛍光強度は、βアミロイドフィブリルの量が少ないことを意味するので、本発明の実施例化合物は、βアミロイドフィブリル形成を阻害することが分かる。特に、実施例７及び実施例１３は、フィブリル形成を著しく阻害することが示された。
【００９２】
＜実験例２＞ＨＴ−２２細胞を使用した化合物の細胞毒性検査
本発明による実施例化合物の細胞に対する毒性の程度を測定するために、ＨＴ−２２細胞を使用して下記の実験を遂行した。
【００９３】
マウスの神経細胞株であるＨＴ−２２をＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で培養した。実験前、ＨＴ−２２細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルの密度で平板培養して血清が除去されたＤＭＥＭ培地で１時間培養した。ＨＴ−２２細胞を培養した後、実施例１〜２７の化合物を２５μＭの濃度で添加して、１８時間培養した。５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）溶液をウェル当り１５μｌずつ入れて、４時間培養後、溶解化緩衝液（１０％ ＳＤＳ， ５０％ ジメチルホルムアミド，ｐＨ４．７）を１００μｌずつ添加して反応させた。１８時間後、マイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記の表４に示した。
【００９４】
【表７】
【００９５】
前記表４を参照すると、本発明による実施例化合物により処理されたＨＴ−２２細胞は、大部分が７０％以上の細胞生存率を示すことが分かる。このことから、本発明による化合物は、細胞に対する毒性を誘発しないことが分った。
【００９６】
＜実験例３＞βアミロイド（１−４２）毒性に対する化合物の毒性軽減効果検査
本発明による実施例化合物のβアミロイドによる毒性の軽減程度を測定するために、下記の実験を遂行した。前記実験例２のような方法で、ＨＴ−２２細胞を培養した後、実施例１〜２７の化合物を添加して１時間培養した。凝集したβアミロイド（Ａβ２５−３５）を２５μＭの濃度で処理した後、１８時間培養してβアミロイド毒性による細胞壊死を誘導した。５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液をウェル当り１５μｌずつ入れて、４時間培養後、溶解化緩衝液を１００μｌずつ添加して反応させた。１８時間後、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍ／６３０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を下記の表５に示した。
【００９７】
【表８】
【００９８】
前記表５を参照すると、本発明による実施例化合物を投与した場合、βアミロイド（Ａβ２５−３５）で処理された細胞のβアミロイド毒性を顕著に減少させることにより、細胞の生存率を増加させることが分かる。
【００９９】
＜実験例４＞急性アルツハイマー病（Acute AD）マウスに対するβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力回復効果測定
本発明による実施例化合物がアルツハイマー病を誘発するβアミロイドが投与されたマウスの学習能力及び記憶力を回復させる程度を調べるために下記の実験を遂行した。
【０１００】
工程１：マウスに対するβアミロイド（１−４２）と化合物の投与
実験には、４〜５週齢、２０〜２５ｇ重量のマウスを使用し、各群別に６匹ずつ使用した。脳室内の注射は、文献に記載された方法によって脳室内に注射した（Ｌａｕｒｓｅｎ＆Ｂｅｌｋｎａｐ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８６年，第１６巻，３５５頁）。５０μｌハミルトン注射器に２６ゲージ注射針の先２．４ｍｍを十字縫合（bregma）に挿入して投与した。すべてのサンプルは、経口投与あるいはフードペレット（food pellet）を通じて各々１０匹ずつのマウスに投与した。脳室内注射後、化合物を２日間投与して、２日にＹ−迷路検査、２〜３日に物体認識検査、３〜４日に受動回避検査、３〜７日に水中迷路検査を実施した。すべての資料は、６匹の平均値を求めた。
【０１０１】
工程２：急性アルツハイマー病（Acute AD）モデル動物実験−Ｙ−迷路、物体認識、受動回避、水中迷路
Ｙ−迷路を通じて短期記憶力を評価し、空間的な記憶力を自発的交差行動（spontaneous alternation behavior）で測定した。Ｙ字形模様の通路に一端にマウスの頭部分が向かうように置いて、８分間自由に三つの通路で往来させた。交差回数は、マウスが連続的に三つの通路を通過した時に一回交差したと定めた。自発的な交差通行量は、交差回数通路を通過した全体回数（number of arm entries）の百分比で計算した。
【０１０２】
物体認識試験は、同一な物体を二つの角から５ｃｍ離れた所に各々位置させた後、提示した物体と新しい物体を探索する時間を測定した。探索は、物体に向かって半径２ｃｍの中に頭を置いて、においを嗅いだり物体を触ることで定義した。
【０１０３】
受動回避試験は、文献に記載された方法によって実施した（Ｓｏｎｇ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９８年，第７１巻，８７５頁）。明るく照明された部屋と暗い部屋からなり、床には電気衝撃を与えることができるように装置された受動回避箱を使用した。マウスを明るい部屋においてマウスが暗い部屋に入って行き次第、０．２５ｍＡで１秒間電気衝撃を与えた。訓練２４時間後、マウスを明るい部屋において暗い部屋に入って行くまでの時間を測定して受動回避反応時間と定めた。
【０１０４】
水中迷路試験は、マウスをプールの四分割面の中の一方でマウスの頭が向くようにおいて、各施行時ごとに任意の四分割面から出発するようにした。マウスが逃避台を捜して上がるまでの遅延時間（latency）を測定して、万一、６０秒内に逃避台の位置を捜し出すことができない場合、実験者が逃避台に導いた。
【０１０５】
得られた結果を下記の表６、図１及び図２に示した。
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
前記表６を参照すると、βアミロイド（１−４２）注入後、実施例１、２、６及び７の化合物を投与したマウスにおいて化合物を投与しないマウスより統計的に有意に記憶力回復効果が現われた。βアミロイド（１−４２）を注入したマウスは、新しい物体に対する関心程度が対照群に比べて約１６％減少し、そこに実施例化合物を投与したマウスは、最高１１％（実施例６）まで記憶力を回復することが示された。また、受動回避試験で、βアミロイド（１−４２）を注入したマウスは認知能力が対照群に比べて約５０％減少し、そこに実施例化合物を処理することで認知能力が約１６％〜３０％程度改善したことが測定された。その中で実施例１の化合物が、最も優れた効果を示した。
【０１０８】
図１を参照すると、マウスの空間的な認知学習能力を測定する水中迷路試験の結果、βアミロイド（１−４２）を投与した群は、認知学習能力欠乏症状を示し、実施例１及び６（図１の（Ａ）参照）と実施例２及び７（図１の（Ｂ）参照）の化合物を服用した群は、βアミロイド（１−４２）のみを投与した群に比べてセッションが増加するほど遅延時間が短縮されることから、時間が経過するほど認知学習能力が回復することが示された。
【０１０９】
また、図２を参照すると、本発明による実施例１の化合物は、濃度依存的に学習及び記憶力回復効果を示した。
【０１１０】
それから、本発明による４種の化合物は、記憶力及び認知学習能力を改善させることにより、βアミロイド形成によって誘発される疾患の予防または治療に有効に使用できることが分かった。
【０１１１】
＜実験例５＞形質転換マウスに対する化合物の学習及び記憶力効果
本発明による実施例化合物が形質転換マウスの学習及び記憶力を回復させる程度を調べるために下記の実験を遂行した。
【０１１２】
形質転換マウスは、ＡＰＰとプレセニリン１（presenilin 1）遺伝子を操作した二重形質転換マウスを使用した。実験には、２６〜３９ｇ重量の８ヶ月齢形質転換マウスを使用し、各群別に１０匹ずつ使用した。２〜３ヶ月の間フードペレット（３ｍｇ／ペレット）を通じて実施例１の化合物を投与して行動実験を行なった。
【０１１３】
実施例１の化合物投与２ヶ月後（１０ヶ月齢）学習及び記憶力回復を確認するためにＹ−迷路検査、物体認識検査を行なった。得られた結果を下記の図３の（Ａ）、（Ｂ）に示した。
【０１１４】
図３の（Ａ）、（Ｂ）を参照すると、全般的に急性アルツハイマー病（acute AD）モデルと比較すると学習及び記憶力効果が小さく現われたが、形質転換マウスで現われる記憶力障害が、実施例１の化合物の投与によって多少と回復することが示された。
【０１１５】
文脈恐怖条件づけ（context fear conditioning）試験を用いて、他の方法で記憶力検査を遂行した。条件刺戟−非条件刺激（ＣＳ−ＵＳ，conditioned stimulus-unconditioned stimulus）に対してマウスに音ショックペアリング（tone-shock pairing）刺激を５回実施した。翌日刺激を提示しない状態で、マウスを刺激を与えた訓練ボックス（context）に残してフリージング（freezing）を観察した。得られた結果を下記の図３の（Ｃ）に示した。図３の（Ｃ）を参照すると、実施例１の化合物を処理したマウスは対照群に比べてフリージングが長く、βアミロイド毒性による海馬損傷が実施例１の化合物によって減少したものと判断される。前記の実験の間、二つのグループの平均体重に差異はなかった。
【０１１６】
前記の形質転換マウスで行動実験結果、実施例１の化合物は、形質転換マウスで学習及び記憶力改善効果を示した。この効果が、βアミロイドの集積阻害とβアミロイド量の減少によって現われた結果なのかどうか調べるために、形質転換マウスの大脳を免疫組織化学的な方法で分析した。行動実験が終わった１１ヶ月齢形質転換マウスの右側大脳半球を切断して染色や酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ，Enzyme-linked immunosorbent assay）を使用して、大脳皮質と海馬のアミロイドプラーク量とβアミロイド量を測定した。得られた結果を下記の図４に示した。
【０１１７】
コンゴレッド（Congo red）でアミロイドプラークを染色してその数を数えた。図４の（Ａ）を参照すると、実施例１の化合物を処理した群は、対照群よりアミロイドプラークが減少する傾向を示した。図４の（Ｂ）、（Ｃ）を参照すると、酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４０）とβアミロイド（１−４２）の量を測定した結果、アミロイドプラークと同じくその量が減少する傾向を示した。図４の（Ｄ）を参照すると、神経細胞の量においては、実施例１の化合物を処理した群でさらに多く示された。
【０１１８】
このことから、本発明による化学式１の誘導体化合物は、βアミロイドの集積を阻害してβアミロイドによる毒性を減少させて神経細胞を保護することで、アルツハイマー病のようなβアミロイド集積関連疾患を予防または治療するのに有用に使用することができる。
【０１１９】
下記に本発明のβアミロイド集積関連疾患の予防剤または治療剤のための製剤例を例示する。
【０１２０】
製剤例１：医薬製剤の製造
１−１．散剤の製造
【表１０】
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【０１２１】
１−２．錠剤の製造
【表１１】
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【０１２２】
１−３．カプセル剤の製造
【表１２】
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１２３】
１−４．注射剤の製造
【表１３】
定法の注射剤の製造方法によって、前記成分を提示した含量で含有させて注射剤を製造した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、その薬学的に許容可能な塩、その製造方法及びそれを有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に平均寿命が長くなって老齢人口が増加する高齢化化社会になるにつれて、アルツハイマー病に代表される老人性痴ほう症、脳卒中またはパーキンソン病のような退行性脳疾患の発病率が大きく増加している。保健社会研究院調査統計によると我が国の老人人口は、２０００年に７％を越えて高齢社会に突入して以来、２００３年には３９７万人と、老人人口の割合が８．３％に至り、２０１９年には、１４．４％に至って完全高齢社会になると予想されている。我が国の場合、７５〜７９歳の老人人口の１５％が痴ほう症を病んでいて、８０歳以上の老人人口の３９％が痴ほう症患者である。また、女性が男性に比べて２〜３倍高い発病率を有することが知られている。
【０００３】
痴ほう症は、正常に発達した脳が歳を取るにつれて後天的な外傷や疾病などの外部的要因によって基質的に損傷されたり破壊されたりして、言語、学習、知能などに対する全般的な認知機能と高次精神機能が病的に減退する複合的な臨床症侯群を包括したもので、漸進的な記憶力障害が、失語症、失認症、失行症などの行動的な障害とともに現われて、社会的および職業的な機能に障害をもたらす。痴ほう症を大きく原因別でみると、アルツハイマー病による痴ほう症、血管性痴ほう症、特定脳疾患及び全身性疾患による痴ほう症などに分けることができ、この中でアルツハイマー病による痴ほう症が５０％以上を占める。
【０００４】
アルツハイマー病の解剖学的な特徴は、記憶及び認識を担当する神経細胞の減少と死滅である。病理学的な特徴は、神経細胞内部の神経原線維変化（neurofibrillary tangle）と神経細胞外部の老人性斑（senile plaque）の発現である。アルツハイマー疾患は、免疫学的要因、遺伝的要因、ウイルス感染、毒性物質を含んだ多様な環境的要因、頭部に怪我をした場合など多くの要因によって誘発されることが知られていて、今まで、βアミロイドタンパク質が脳に蓄積されて生じる神経斑の神経毒性による神経細胞破壊と、過リン酸化タウタンパク質が脳に蓄積されて神経繊維束が生成され、それによって神経退行を起こすことが、アルツハイマー性痴ほう症の主要原因として報告されている。
【０００５】
上述したβアミロイドは、アルツハイマー病患者で発見されるタンパク質で、４０個のアミノ酸（βアミロイド１−４０）または４２個のアミノ酸（βアミロイド１−４２）で構成されている。βアミロイドタンパク質前駆体は、β−、γ−分解酵素によってβアミロイド４２単量体になった後、集積してオリゴマーを形成し、このオリゴマーの集積でプロトフィブリル（protofibril）、フィブリル（fibril）、プラーク（plaque）の段階を経るようになる。最近の研究で、オリゴマーが、髪の毛構造のフィブリルより高い神経毒性を有すると報告され、オリゴマーの生成を減らすことがアルツハイマー病の治療方法として注目されるようになった。
【０００６】
現在まで開発された治療剤では、アルツハイマー性痴ほう症患者の脳でアセチルコリンという物質が正常人に比べて減少するという点に着眼して、脳内のアセチルコリンの量を増加させたり、コリン性神経細胞の活性を増加させる方向で開発されたコリン系統の薬剤がある。しかし、市販中のアルツハイマー病治療剤である、ドネペジル（Donepezil）、リバスチグミン（Rivastigmin）、ガランタミン（Galantamin）、メマンチン（Memantine）などは、病気を根本的に治療するためではなく、記憶力障害症状を改善するための薬物であり、副作用及び治療に限界があるため改善が必要である。
【０００７】
ここで、本発明者等は、βアミロイドの集積を阻害する治療剤を開発するために研究中、新規なビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物が、βアミロイドの集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させることができ、アルツハイマー病のようなβアミロイド集積関連疾患に有用であることを発見して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／０１８２８４６ Ａ１号公報
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１０７ Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９６５，５６８ Ｂ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規なビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物、その薬学的に許容可能な塩を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記新規な誘導体化合物の製造方法を提供することにある。
【００１１】
さらに、本発明のまた他の目的は、前記新規な誘導体化合物を有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、下記の化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体化合物、その薬学的に許容可能な塩及びその製造方法を提供する。
【００１３】
【化１】
【００１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、本明細書中以下で定義するとおりである。）
【００１５】
また、本発明は、βアミロイド集積を阻害することができ、βアミロイドに由来した毒性を軽減させることができる前記化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の化学式１の誘導体化合物は、βアミロイド集積を阻害してβアミロイドの毒性を減少させて、アルツハイマー病などのようなβアミロイド集積関連疾患において現われる学習及び記憶力低下を改善させる効果を示すので、本発明による化学式１の誘導体化合物は、アルツハイマー病の治療剤及びそれと類似性がある疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による実験例４のマウスの空間的な認知学習能力を測定する水中迷路試験の結果を示したグラフである。
【図２】本発明による実験例４の急性アルツハイマー病（ａｃｕｔｅ ＡＤ）モデルでのβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力に対する効果を測定する、Ｙ−迷路、物体認識、受動回避試験の結果である（（Ａ）Ｙ−迷路：１はＡβ１−４２ １０ｎＭ；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ、（Ｂ）物体認識：１は対照群；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；５はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ、（Ｃ）受動回避：１は対照群；２はＡβ１−４２ １０ｎＭ；３はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ５０ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；４はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ １００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ；５はＡβ１−４２ １０ｎＭ＋実施例１ ２００ｍｇ／ｋｇ．ｐ．ｏ）。
【図３】本発明による実験例５の形質転換マウスに対するβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力に対する効果を測定する、Ｙ−迷路、物体認識、文脈恐怖条件づけの結果である（（Ａ）：Ｙ−迷路、（Ｂ）：物体認識、（Ｃ）：文脈恐怖条件づけであり、１は対照群であり、２は実施例１の化合物である）。
【図４】本発明による実験例５の形質転換マウスでの学習及び記憶力改善効果がβアミロイドの集積阻害とβアミロイド量の減少によって現われた結果なのかどうかを調べるために、形質転換マウスの大脳を免疫組織学的な方法で分析した結果である（（Ａ）：コンゴレッドで染色してアミロイドプラークの量を測定、（Ｂ）：酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４０）の量を測定、（Ｃ）：酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４２）の量を測定、（Ｄ）：神経細胞の量を測定）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、下記の化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１９】
【化２】
【００２０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２１】
本発明による前記化学式１の誘導体化合物において、
前記Ｘは、互いに独立して窒素または炭素であり；
前記Ｒ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のアルキルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
前記Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びジ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノからなる群から選択されるいずれか一つである。
【００２２】
好ましくは、本発明による化学式１の誘導体化合物において、
前記Ｘは、互いに独立して、窒素または炭素であり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立的して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましい。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明による前記化学式１で表わされる誘導体化合物は、
（１）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（２）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（３）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン、
（４）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（５）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（６）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（７）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（８）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（９）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１０）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１１）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１２）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１３）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１４）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１５）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１６）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１７）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１８）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１９）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（２０）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２１）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２２）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２３）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２４）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）フェノール、
（２５）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）フェノール、
（２６）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、及び
（２７）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノールからなる群から選択されるいずれか一つである。
【００２４】
また、本発明は、前記化学式１で表わされるビス（スチリル）ピリミジン及びビス（スチリル）ベンゼン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩だけではなく、その異性体またはそれから製造され得る溶媒化物または水和物をすべて含む。
【００２５】
さらに、本発明は、前記化学式１で表わされる誘導体の製造方法を提供する。
【００２６】
製造方法１：
本発明による化学式１の誘導体は、下記のスキーム１に示したように、化学式２のピリミジン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物を塩基条件下で縮合反応させる工程（工程１）、及び前記工程１で製造した化学式４の化合物を脱保護反応させる工程（工程２）からなる製造方法によって製造することができる。
【００２７】
【化３】
【００２８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、前記化学式１について本明細書中で定義するとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシの場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルにより保護されており、化学式１ａは化学式１の誘導体である）。
【００２９】
以下、本発明による前記製造方法１を工程別でさらに詳細に説明する。
【００３０】
まず、本発明による前記工程１は、ピリミジン母核を有する化学式２の化合物である４，６−ジメチルピリミジン化合物と化学式３のベンズアルデヒド化合物とを縮合反応させる工程である。前記工程１は、４，６−ジメチルピリミジン化合物とベンズアルデヒド化合物を相間移動触媒（ＰＴＣ，ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃａｔａｌｙｓｔ）の存在下で塩基性溶液で加熱還流させて遂行することができる。ここで、相間移動触媒は、テトラブチルアンモニウムハイドロジェンスルファート（Ｂｕ４ＮＨＳＯ４）、ベンジルトリメチルアンモニウムなどを使用することができ、塩基性溶液は水酸化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。また、前記化学式３のベンズアルデヒド化合物は、ヒドロキシ基が保護基により保護された下記の化合物からなる群から選択されるものを使用することがさらに好ましい。
【００３１】
【化４】
【００３２】
（前記化合物構造において、ＰＭＢは、ｐ−メトキシベンジルであり、ＭＯＭはメトキシメチルである。）
【００３３】
次に、本発明による前記工程２は、工程１で製造した化学式４の化合物に対して保護基を除去する工程である。ここで、保護基は、塩酸／エチルアルコール（３：１）の溶媒で加熱還流させたり、トリフルオロ酢酸を含むメチレンクロライド溶媒で撹拌することにより除去することができる。
【００３４】
製造方法２：
また、本発明による化学式１の誘導体は、下記のスキーム２に示したように化学式５のベンゼン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物をエーテル類の有機溶媒に溶解させた後、０℃で塩基を添加して反応させる工程（工程Ａ）、及び前記工程Ａで製造した化学式６の化合物を脱保護反応させる工程（工程Ｂ）を含んで成る製造方法によって製造することができる。
【００３５】
【化５】
【００３６】
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記化学式１において定義したもののと同様であり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシの場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルにより保護されており、化学式１ｂは化学式１の誘導体である）。
【００３７】
以下、本発明による前記製造方法２を工程別にさらに詳しく説明する。
【００３８】
まず、本発明による前記工程Ａは、化学式５の１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンまたは、３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールと化学式３のベンズアルデヒド化合物をホーナーエモンズ（Horner-Emmons olefination）反応させる工程である。前記工程Ａは、１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンまたは３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールと化学式３のベンズアルデヒドを無水テトラヒドロフラン溶媒に溶解後、０℃で塩基を添加して遂行することができる。ここで、塩基は水素化ナトリウム（ＮａＨ）、水素化リチウム（ＬｉＨ）、水素化カリウム（ＫＨ）などのアルカリ金属水素化合物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムプロポキシド、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、リチウムイソプロポキシドなどの金属アルコキシドなどを使用することが好ましく、カリウム ｔ−ブトキシドを使用することがさらに好ましい。また、前記化学式３のベンズアルデヒド化合物は、製造方法１で使用したヒドロキシ基が保護基に保護された化合物からなる群から選択されたものを使用することが好ましい。
【００３９】
次に、本発明による前記工程Ｂは、工程Ａで製造した化学式６の化合物に対して保護基を除去する工程である。ここで、保護基は、塩酸／エチルアルコール（３：１）の溶媒で加熱還流させたり、トリフロオロ酢酸を含むメチルレンクルロライド溶媒で撹拌したりすることで遂行することができる。
【００４０】
さらに、本発明は、前記化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００４１】
前記βアミロイド集積関連疾患は、痴ほう症、アルツハイマー病、ダウン症候群、脳アミロイド血管症、大脳アミロイド血管症、全身性アミロイド病、オランダ（Dutch）型アミロイド症などを含む。
【００４２】
本発明による前記化学式１の誘導体は、ＴｈＴ蛍光強度を使用したβアミロイド（１−４２）フィブリル形成に対する阻害効果測定実験で、対照群に比べて低い蛍光強度を示すことから、優秀なβアミロイドフィブリル形成阻害効果があることが分かる（実験例１参照）。
【００４３】
また、本発明による化学式１の誘導体は、ＨＴ−２２細胞に対する細胞毒性を測定した実験の結果、大部分の実施例の化合物は、７０％以上の高い細胞生存率を示すことが分かる（実験例２参照）。
【００４４】
さらに、本発明による前記化学式１の誘導体は、βアミロイドによる細胞毒性の軽減程度を測定した実験から、対照群に使用したβアミロイド（Ａβ ２３−３５）に比べて、細胞生存率が増加することが測定され、このことからβアミロイドの毒性を効果的に軽減させることが分かる（実験例３参照）。
【００４５】
また、本発明による前記化学式１の誘導体は、急性アルツハイマー病（Ａｃｕｔｅ ＡＤ）マウスに対するＹ−迷路検査、物体認識試験、受動回避試験、水中迷路試験により学習力及び記憶力を評価する実験の結果、βアミロイド（１−４２）を注入した後、本発明による実施例化合物を投与した場合、統計的に有意な記憶力回復、認知学習能力回復を示すことが分かる（実験例４、表６、図１及び図２参照）。
【００４６】
さらに、本発明による前記化学式１の誘導体は、形質転換マウスに対するＹ−迷路試験、物体認識試験により学習能力及び記憶力を評価した実験結果から、多少の記憶力障害を回復させることが分かる（実験例５、図３の（Ａ）及び（Ｂ）参照）。また、文脈恐怖条件づけ試験（context fear conditioning）による記憶力試験の結果から、本発明による化合物を投与した場合、βアミロイド毒性による海馬損傷が減少することが分かる（実験例５、図３の（Ｃ）参照）。
【００４７】
また、本発明による前記化学式１の誘導体は、大脳皮質と海馬のアミロイドプラーク量とβアミロイド量を測定した結果、対照群に比べてそれらの量を減少させ（実験例６、図４の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）参照）、神経細胞の量をさらに増加させたことが分かる。
【００４８】
したがって、本発明による前記化学式１の誘導体は、βアミロイドの集積を阻害することにより、上述したβアミロイド集積関連疾患を予防または治療するために有効に使用できる。
【００４９】
本発明による前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むβアミロイド集積関連疾患の予防剤または治療剤は、下記の多様な経口または非経口投与形態に剤形化することができるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
経口投与用の剤形では、例えば、錠剤、丸薬、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、それら剤形は、前記有効成分以外に慣用的に使用される充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を１種以上使用することができる。崩壊剤としては、寒天、澱粉、アルギン酸またはそのナトリウム塩、無水リン酸１水素カルシウム塩などを使用することができ、滑沢剤としては、シリカ、タルク、ステアリン酸またはそのマグネシウム塩またはカルシウム塩、ポリエチレングリコールなどを使用することができ、結合剤として、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどを使用することができる。その他にも、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどを希釈剤として使用することができ、場合によっては、一般的に知られた混合物、吸収剤、着色剤、香料、甘味料などを一緒に使用することができる。
【００５１】
また、前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む退行性神経疾患の予防剤または治療剤は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤または胸部内に注射剤を注入する方法による。ここで、非経口投与用剤形に製剤化するために、前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を安定剤または緩衝剤とともに水に混合し、溶液または懸濁液を調製して、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型製剤とすることができる。
【００５２】
前記組成物は、滅菌したり、または防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩、緩衝剤などの補助剤及びその他治療的に有用な物質を含むことができ、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
【００５３】
本発明の前記化学式１の誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む、退行性神経疾患の予防剤または治療剤を単位用量形態に剤形化する場合、有効成分として化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を、約０．１〜１，５００ｍｇの単位用量で含有することが好ましい。投与量は、患者の体重、年齢及び疾病の特殊な性質と重症度のような要因による医者の処方による。しかし、成人治療に必要な投与量は、投与の頻度と強度によって一日に約１〜５００ｍｇの範囲が普通である。成人の筋肉内または静脈内投与時の一回投与量では、一日に数回に分けて投与することができ、一日に約５〜３００ｍｇの全体投与量であれば十分であるが、一部患者の場合には、さらに高い一日投与量が好ましいことがある。
【００５４】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳細に説明する。
【００５５】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
＜製造例１＞出発物質の製造１
本発明による製造方法１で出発物質に使用する化学式２の４，６−ジメチルピリミジン化合物を、下記のスキーム３に示したような有機化学分野で一般的に知られている方法で製造して使用した。すなわち、化学式７の化合物と２，４−ペンタジオンを炭酸カリウム水溶液で加熱還流させて得た。
【００５７】
【化６】
【００５８】
（式中、Ｒ１は、化学式１において定義したものと同様である。）
【００５９】
＜製造例２＞出発物質の製造２
本発明による製造方法２で出発物質で使用する化学式５の１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼンは、下記のスキーム４に示したような有機化学分野で一般的に知られているアルブーゾフ（Arbuzof）反応を使用して製造した。すなわち、α−ジブロモ−ｍ−ザイレンをトリエチルホスフィンとともにトルエンで加熱還流させて得た。
【００６０】
【化７】
【００６１】
＜製造例３＞出発物質の製造３
本発明による製造方法２で出発物質に使用する化学式５の３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールを、下記のスキーム５に示したような有機化学分野で一般的に知られている方法でアルブーゾフ（Ａｒｂｕｚｏｖ）反応を使用して製造した。すなわち、３，５−ジ（ヒドロキシメチル）フェノールを無水１，４−ジオキサンに溶解した後、ＢＦ３?Ｅｔ２Ｏとヨウ化カリウムを添加して、３，５−ビス（アイオドメチル）フェノールを得た後、それをトリエチルホスフィンとともにトルエンで加熱還流させて、３，５−ビス（ジエチルホスホノメチル）フェノールを得た。
【００６２】
【化８】
【００６３】
＜実施例１＞（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジンの合成
【００６４】
【化９】
【００６５】
工程１：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジンの合成
１０ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、４，６−ジメチルピリミジン０．２１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、４−メトキシ−３−（４−メトキシベンジルオキシ）ベンズアルデヒド１．１ｇ（４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート０．１ｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を加えて、５時間加熱還流した。固体をろ過して水で洗浄した。得られた固体は、真空乾燥器で乾燥させてエチルアセテートで再結晶して（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジン１．０６ｇを得た。
【００６６】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.81 (s, 6H), 3.91 (s, 6H), 5.12 (s, 4H), 6.87 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.19 (s, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 9.03 (s, 1H)
【００６７】
工程２：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−メトキシ−３’−（４”−メトキシベンジルオキシ）スチリル］ピリミジン１．０６ｇを、９０ｍｌのエチルアルコールと３０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、２０時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、沈殿物をろ過して水と核酸で洗浄して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン０．６ｇ（７９％）を得た。
【００６８】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.80 (s, 6H), 6.97 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.11 (dd, J = 1.9, 8.3 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.95 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 9.17 (s, 2H)
【００６９】
＜実施例２＞（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
【００７０】
【化１０】
【００７１】
工程１：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
１０ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に、４，６−ジメチルピリミジン０．２１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−４−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド０．８３ｇ（４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート０．１ｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を加えて、５時間加熱還流した。反応液をエチルアセテートで抽出して、有機層を減圧蒸留して得られた化合物をカラムクロマトグラフィーで精製して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．５１ｇを得た。
【００７２】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 2.77 (s, 12H), 3.42 (s, 6H), 5.24 (s, 4H), 7.05 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 1.9, 8.9 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.97 (d, J = 1.0 Hz, 1H)
【００７３】
工程２：（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−（メトキシメトキシ）−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．５１ｇを、４５ｍｌのエチルアルコールと１５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、１０時間熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、炭酸水素ナトリウム１．２６ｇを加え、水４００ｍｌを加えて結晶をろ過して、（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン０．３１ｇ（３８％）を得た。
【００７４】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 2.73 (s, 12H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.16 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 7.59 (s, 1H), 7.81 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 8.93 (s, 1H), 9.62 (bs, 2H)
【００７５】
＜実施例３＞（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼンの合成
【００７６】
【化１１】
【００７７】
工程Ａ：（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼンの合成。
１，３−ビス（ジエチルホスホノメチル）ベンゼン０．７５ｇと４−メトキシ−３−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド０．７８ｇを、ＴＨＦ溶液に溶解した後、反応液を０℃に冷却してカリウム ｔ−ブトキシド０．８８ｇを加えた。反応液は、室温で２時間反応させた。反応液に２００ｍｌの水を加えて沈殿物をろ過して、白色固体である（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼン０．６９ｇを得た。
【００７８】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.41 (s, 6H), 3.78 (s, 6H), 5.20 (s, 4H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 1.9, 8.5 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 7.32-7.34 (m, 5H), 7.79 (s, 1H)
【００７９】
工程Ｂ：（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼンの合成
前記工程１で得た（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−メトキシ−３’−（メトキシメトキシ）スチリル］ベンゼン０．６９ｇを、６０ｍｌのエチルアルコールと２０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ混合溶液に溶解した後、１時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、水１００ｍｌを加えて沈殿物をろ過して、（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン０．５２ｇ（７７％）を得た。
【００８０】
1H NMR (DMSOd6, 400 MHz) δ 3.77 (s, 6H), 6.91 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 16.3 Hz, 2H), 6.98 (dd, J = 1.9, 8.3 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 16.3 Hz, 2H), 7.29-7.41 (m, 3H), 7.74 (s, 1H), 9.03 (s, 2H)
【００８１】
前記実施例１及び実施例２のような方法で、多様なビス（スチリル）ピリミジン誘導体を合成し、その構造及び１Ｈ ＮＭＲデータを下記の表１に示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
前記実施例３のような方法で多様なビス（スチリル）ベンゼン誘導体を合成し、その構造及び１Ｈ ＮＭＲデータを下記の表２に示した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
＜実験例１＞βアミロイドフィブリル形成阻害実験
本発明による実施例化合物のβアミロイドフィブリル阻害程度を測定するために、ＴｈＴ蛍光強度を使用して下記の実験を遂行した。
【００８９】
βアミロイド（１−４２）と本発明の実施例１〜２７の化合物をＤＭＳＯ溶液に溶解して、それをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）溶液に希釈した。βアミロイド（１−４２）（対照群）と実施例化合物１〜２７の最終濃度は、各々２５μＭ、１０μＭにした。室温で１時間培養した後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液に溶解しているチオフラビンＴ（ＴｈＴ，５μＭ，ｐＨ８．５）を加えた。多重表示蛍光計数器（multi label fluorescence counter）を使用して、９６マイクロプレートで蛍光強度を測定した。その結果を下記の表３に示した。蛍光測定時の励起（excitation）と発光（emission）の波長は、４５０ｎｍ（スリット１０ｎｍ）と４８５ｎｍ（スリット１０ｎｍ）が好ましい。
【００９０】
【表６】
【００９１】
前記表３を参照すると、ＴｈＴ蛍光強度を使用したβアミロイド（１−４２）フィブリル形成を阻害する程度を測定した結果、βアミロイド（１−４２）を実施例化合物とともに培養した群は、何も処理しない対照群に比べて低い蛍光強度を示した。低い蛍光強度は、βアミロイドフィブリルの量が少ないことを意味するので、本発明の実施例化合物は、βアミロイドフィブリル形成を阻害することが分かる。特に、実施例７及び実施例１３は、フィブリル形成を著しく阻害することが示された。
【００９２】
＜実験例２＞ＨＴ−２２細胞を使用した化合物の細胞毒性検査
本発明による実施例化合物の細胞に対する毒性の程度を測定するために、ＨＴ−２２細胞を使用して下記の実験を遂行した。
【００９３】
マウスの神経細胞株であるＨＴ−２２をＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で培養した。実験前、ＨＴ−２２細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルの密度で平板培養して血清が除去されたＤＭＥＭ培地で１時間培養した。ＨＴ−２２細胞を培養した後、実施例１〜２７の化合物を２５μＭの濃度で添加して、１８時間培養した。５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）溶液をウェル当り１５μｌずつ入れて、４時間培養後、溶解化緩衝液（１０％ ＳＤＳ， ５０％ ジメチルホルムアミド，ｐＨ４．７）を１００μｌずつ添加して反応させた。１８時間後、マイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記の表４に示した。
【００９４】
【表７】
【００９５】
前記表４を参照すると、本発明による実施例化合物により処理されたＨＴ−２２細胞は、大部分が７０％以上の細胞生存率を示すことが分かる。このことから、本発明による化合物は、細胞に対する毒性を誘発しないことが分った。
【００９６】
＜実験例３＞βアミロイド（１−４２）毒性に対する化合物の毒性軽減効果検査
本発明による実施例化合物のβアミロイドによる毒性の軽減程度を測定するために、下記の実験を遂行した。前記実験例２のような方法で、ＨＴ−２２細胞を培養した後、実施例１〜２７の化合物を添加して１時間培養した。凝集したβアミロイド（Ａβ２５−３５）を２５μＭの濃度で処理した後、１８時間培養してβアミロイド毒性による細胞壊死を誘導した。５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液をウェル当り１５μｌずつ入れて、４時間培養後、溶解化緩衝液を１００μｌずつ添加して反応させた。１８時間後、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍ／６３０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を下記の表５に示した。
【００９７】
【表８】
【００９８】
前記表５を参照すると、本発明による実施例化合物を投与した場合、βアミロイド（Ａβ２５−３５）で処理された細胞のβアミロイド毒性を顕著に減少させることにより、細胞の生存率を増加させることが分かる。
【００９９】
＜実験例４＞急性アルツハイマー病（Acute AD）マウスに対するβアミロイドの投与と化合物の学習及び記憶力回復効果測定
本発明による実施例化合物がアルツハイマー病を誘発するβアミロイドが投与されたマウスの学習能力及び記憶力を回復させる程度を調べるために下記の実験を遂行した。
【０１００】
工程１：マウスに対するβアミロイド（１−４２）と化合物の投与
実験には、４〜５週齢、２０〜２５ｇ重量のマウスを使用し、各群別に６匹ずつ使用した。脳室内の注射は、文献に記載された方法によって脳室内に注射した（Ｌａｕｒｓｅｎ＆Ｂｅｌｋｎａｐ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８６年，第１６巻，３５５頁）。５０μｌハミルトン注射器に２６ゲージ注射針の先２．４ｍｍを十字縫合（bregma）に挿入して投与した。すべてのサンプルは、経口投与あるいはフードペレット（food pellet）を通じて各々１０匹ずつのマウスに投与した。脳室内注射後、化合物を２日間投与して、２日にＹ−迷路検査、２〜３日に物体認識検査、３〜４日に受動回避検査、３〜７日に水中迷路検査を実施した。すべての資料は、６匹の平均値を求めた。
【０１０１】
工程２：急性アルツハイマー病（Acute AD）モデル動物実験−Ｙ−迷路、物体認識、受動回避、水中迷路
Ｙ−迷路を通じて短期記憶力を評価し、空間的な記憶力を自発的交差行動（spontaneous alternation behavior）で測定した。Ｙ字形模様の通路に一端にマウスの頭部分が向かうように置いて、８分間自由に三つの通路で往来させた。交差回数は、マウスが連続的に三つの通路を通過した時に一回交差したと定めた。自発的な交差通行量は、交差回数通路を通過した全体回数（number of arm entries）の百分比で計算した。
【０１０２】
物体認識試験は、同一な物体を二つの角から５ｃｍ離れた所に各々位置させた後、提示した物体と新しい物体を探索する時間を測定した。探索は、物体に向かって半径２ｃｍの中に頭を置いて、においを嗅いだり物体を触ることで定義した。
【０１０３】
受動回避試験は、文献に記載された方法によって実施した（Ｓｏｎｇ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９８年，第７１巻，８７５頁）。明るく照明された部屋と暗い部屋からなり、床には電気衝撃を与えることができるように装置された受動回避箱を使用した。マウスを明るい部屋においてマウスが暗い部屋に入って行き次第、０．２５ｍＡで１秒間電気衝撃を与えた。訓練２４時間後、マウスを明るい部屋において暗い部屋に入って行くまでの時間を測定して受動回避反応時間と定めた。
【０１０４】
水中迷路試験は、マウスをプールの四分割面の中の一方でマウスの頭が向くようにおいて、各施行時ごとに任意の四分割面から出発するようにした。マウスが逃避台を捜して上がるまでの遅延時間（latency）を測定して、万一、６０秒内に逃避台の位置を捜し出すことができない場合、実験者が逃避台に導いた。
【０１０５】
得られた結果を下記の表６、図１及び図２に示した。
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
前記表６を参照すると、βアミロイド（１−４２）注入後、実施例１、２、６及び７の化合物を投与したマウスにおいて化合物を投与しないマウスより統計的に有意に記憶力回復効果が現われた。βアミロイド（１−４２）を注入したマウスは、新しい物体に対する関心程度が対照群に比べて約１６％減少し、そこに実施例化合物を投与したマウスは、最高１１％（実施例６）まで記憶力を回復することが示された。また、受動回避試験で、βアミロイド（１−４２）を注入したマウスは認知能力が対照群に比べて約５０％減少し、そこに実施例化合物を処理することで認知能力が約１６％〜３０％程度改善したことが測定された。その中で実施例１の化合物が、最も優れた効果を示した。
【０１０８】
図１を参照すると、マウスの空間的な認知学習能力を測定する水中迷路試験の結果、βアミロイド（１−４２）を投与した群は、認知学習能力欠乏症状を示し、実施例１及び６（図１の（Ａ）参照）と実施例２及び７（図１の（Ｂ）参照）の化合物を服用した群は、βアミロイド（１−４２）のみを投与した群に比べてセッションが増加するほど遅延時間が短縮されることから、時間が経過するほど認知学習能力が回復することが示された。
【０１０９】
また、図２を参照すると、本発明による実施例１の化合物は、濃度依存的に学習及び記憶力回復効果を示した。
【０１１０】
それから、本発明による４種の化合物は、記憶力及び認知学習能力を改善させることにより、βアミロイド形成によって誘発される疾患の予防または治療に有効に使用できることが分かった。
【０１１１】
＜実験例５＞形質転換マウスに対する化合物の学習及び記憶力効果
本発明による実施例化合物が形質転換マウスの学習及び記憶力を回復させる程度を調べるために下記の実験を遂行した。
【０１１２】
形質転換マウスは、ＡＰＰとプレセニリン１（presenilin 1）遺伝子を操作した二重形質転換マウスを使用した。実験には、２６〜３９ｇ重量の８ヶ月齢形質転換マウスを使用し、各群別に１０匹ずつ使用した。２〜３ヶ月の間フードペレット（３ｍｇ／ペレット）を通じて実施例１の化合物を投与して行動実験を行なった。
【０１１３】
実施例１の化合物投与２ヶ月後（１０ヶ月齢）学習及び記憶力回復を確認するためにＹ−迷路検査、物体認識検査を行なった。得られた結果を下記の図３の（Ａ）、（Ｂ）に示した。
【０１１４】
図３の（Ａ）、（Ｂ）を参照すると、全般的に急性アルツハイマー病（acute AD）モデルと比較すると学習及び記憶力効果が小さく現われたが、形質転換マウスで現われる記憶力障害が、実施例１の化合物の投与によって多少と回復することが示された。
【０１１５】
文脈恐怖条件づけ（context fear conditioning）試験を用いて、他の方法で記憶力検査を遂行した。条件刺戟−非条件刺激（ＣＳ−ＵＳ，conditioned stimulus-unconditioned stimulus）に対してマウスに音ショックペアリング（tone-shock pairing）刺激を５回実施した。翌日刺激を提示しない状態で、マウスを刺激を与えた訓練ボックス（context）に残してフリージング（freezing）を観察した。得られた結果を下記の図３の（Ｃ）に示した。図３の（Ｃ）を参照すると、実施例１の化合物を処理したマウスは対照群に比べてフリージングが長く、βアミロイド毒性による海馬損傷が実施例１の化合物によって減少したものと判断される。前記の実験の間、二つのグループの平均体重に差異はなかった。
【０１１６】
前記の形質転換マウスで行動実験結果、実施例１の化合物は、形質転換マウスで学習及び記憶力改善効果を示した。この効果が、βアミロイドの集積阻害とβアミロイド量の減少によって現われた結果なのかどうか調べるために、形質転換マウスの大脳を免疫組織化学的な方法で分析した。行動実験が終わった１１ヶ月齢形質転換マウスの右側大脳半球を切断して染色や酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ，Enzyme-linked immunosorbent assay）を使用して、大脳皮質と海馬のアミロイドプラーク量とβアミロイド量を測定した。得られた結果を下記の図４に示した。
【０１１７】
コンゴレッド（Congo red）でアミロイドプラークを染色してその数を数えた。図４の（Ａ）を参照すると、実施例１の化合物を処理した群は、対照群よりアミロイドプラークが減少する傾向を示した。図４の（Ｂ）、（Ｃ）を参照すると、酵素免疫法を使用してβアミロイド（１−４０）とβアミロイド（１−４２）の量を測定した結果、アミロイドプラークと同じくその量が減少する傾向を示した。図４の（Ｄ）を参照すると、神経細胞の量においては、実施例１の化合物を処理した群でさらに多く示された。
【０１１８】
このことから、本発明による化学式１の誘導体化合物は、βアミロイドの集積を阻害してβアミロイドによる毒性を減少させて神経細胞を保護することで、アルツハイマー病のようなβアミロイド集積関連疾患を予防または治療するのに有用に使用することができる。
【０１１９】
下記に本発明のβアミロイド集積関連疾患の予防剤または治療剤のための製剤例を例示する。
【０１２０】
製剤例１：医薬製剤の製造
１−１．散剤の製造
【表１０】
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【０１２１】
１−２．錠剤の製造
【表１１】
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【０１２２】
１−３．カプセル剤の製造
【表１２】
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１２３】
１−４．注射剤の製造
【表１３】
定法の注射剤の製造方法によって、前記成分を提示した含量で含有させて注射剤を製造した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１
【化１】
式中、
Ｘは、互いに独立して窒素または炭素であり、
Ｒ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のアルキルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり、
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びジ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノからなる群から選択されるいずれか一つである
で表わされるビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
前記Ｘは、互いに独立して、窒素または炭素であり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立的して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記化学式１の誘導体が、
（１）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（２）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（３）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン、
（４）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（５）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（６）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（７）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（８）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（９）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１０）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１１）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１２）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１３）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１４）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１５）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１６）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１７）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１８）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１９）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（２０）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２１）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２２）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２３）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２４）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）フェノール、
（２５）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）フェノール、
（２６）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、及び
（２７）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
下記のスキーム１
【化２】
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、請求項１において定義したとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシである場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルで保護されており、化学式１ａは化学式１の誘導体である
により示される、
化学式２のピリミジン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物とを塩基条件下で縮合反応させる工程（工程１）、及び
前記工程１で製造した化学式４の化合物を脱保護反応させる工程（工程２）
からなる請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記工程１の縮合反応が、相間移動触媒の存在下において水酸化ナトリウム水溶液で加熱還流させて遂行されることを特徴とする、請求項４に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記相間移動触媒が、テトラブチルアンモニウム水素スルファートまたはベンジルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする、請求項５に記載の請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記工程２の脱保護反応が、塩酸／エチルアルコール（３：１）溶媒で加熱還流させるか、またはトリフルオル酢酸を含むメチレンクロライド溶媒により遂行されることを特徴とする、請求項４に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項８】
下記のスキーム２
【化３】
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、請求項１において定義したとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシである場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルで保護されており、化学式１ｂは化学式１の誘導体である
により示される、
化学式５のベンゼン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物をエーテル類の有機溶媒に溶解させた後、０℃で塩基を添加して反応させる工程（工程Ａ）；及び
前記工程Ａで製造した化学式６の化合物を脱保護反応させる工程（工程Ｂ）
からなる請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記工程Ａの塩基が、金属水素化合物、金属アルコキシド、アルキルアルカリ金属化合物及びアミド型アルカリ金属化合物からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項８に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記塩基が、水素化ナトリウム（ＮａＨ）、水素化リチウム（ＬｉＨ）、水素化カリウム（ＫＨ）からなる群から選択されるアルカリ金属水素化合物；または、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムプロポキシド、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、及びリチウムイソプロポキシドからなる群から選択される金属アルコキシドであることを特徴とする、請求項９に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記工程Ａの反応溶媒が無水テトラヒドロフランであり、塩基がカリウム ｔ−ブトキシドであることを特徴とする、請求項８に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１２】
第１項の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項１３】
βアミロイド集積関連疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする、第１項の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、請求項１２に記載のβアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項１４】
化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩がβアミロイドの集積を阻害することを特徴とする、請求項１の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、請求項１２に記載のβアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項１】
下記の化学式１
【化１】
式中、
Ｘは、互いに独立して窒素または炭素であり、
Ｒ１は水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びＣ１〜Ｃ４のアルキルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり、
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ及びジ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノからなる群から選択されるいずれか一つである
で表わされるビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
前記Ｘは、互いに独立して、窒素または炭素であり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオからなる群から選択されるいずれか一つであり；
Ｒ２及びＲ３は、互いに独立的して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記化学式１の誘導体が、
（１）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（２）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（３）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ベンゼン、
（４）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（５）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（６）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（７）（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（８）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（９）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１０）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１１）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１２）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１３）２−メトキシ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１４）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１５）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）ピリミジン、
（１６）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１７）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）ピリミジン、
（１８）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（１９）２−メチルチオ−（Ｅ，Ｅ）−４，６−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ピリミジン、
（２０）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２１）（Ｅ，Ｅ）−１，３−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］ベンゼン、
（２２）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２３）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシスチリル）フェノール、
（２４）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシスチリル）フェノール、
（２５）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシスチリル）フェノール、
（２６）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［４’−ヒドロキシ−３’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、及び
（２７）（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス［３’−ヒドロキシ−４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スチリル］フェノール、からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のビス（スチリル）ピリミジンまたはビス（スチリル）ベンゼン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
下記のスキーム１
【化２】
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、請求項１において定義したとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシである場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルで保護されており、化学式１ａは化学式１の誘導体である
により示される、
化学式２のピリミジン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物とを塩基条件下で縮合反応させる工程（工程１）、及び
前記工程１で製造した化学式４の化合物を脱保護反応させる工程（工程２）
からなる請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記工程１の縮合反応が、相間移動触媒の存在下において水酸化ナトリウム水溶液で加熱還流させて遂行されることを特徴とする、請求項４に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記相間移動触媒が、テトラブチルアンモニウム水素スルファートまたはベンジルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする、請求項５に記載の請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記工程２の脱保護反応が、塩酸／エチルアルコール（３：１）溶媒で加熱還流させるか、またはトリフルオル酢酸を含むメチレンクロライド溶媒により遂行されることを特徴とする、請求項４に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項８】
下記のスキーム２
【化３】
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、請求項１において定義したとおりであり、Ｒ４及びＲ５は、前記Ｒ２及びＲ３と同一であるが、ヒドロキシである場合にはそれを保護するｐ−メトキシベンジルまたはメトキシメチルで保護されており、化学式１ｂは化学式１の誘導体である
により示される、
化学式５のベンゼン誘導体化合物と化学式３のベンズアルデヒド誘導体化合物をエーテル類の有機溶媒に溶解させた後、０℃で塩基を添加して反応させる工程（工程Ａ）；及び
前記工程Ａで製造した化学式６の化合物を脱保護反応させる工程（工程Ｂ）
からなる請求項１の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記工程Ａの塩基が、金属水素化合物、金属アルコキシド、アルキルアルカリ金属化合物及びアミド型アルカリ金属化合物からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項８に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記塩基が、水素化ナトリウム（ＮａＨ）、水素化リチウム（ＬｉＨ）、水素化カリウム（ＫＨ）からなる群から選択されるアルカリ金属水素化合物；または、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムプロポキシド、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、カリウムイソプロポキシド、及びリチウムイソプロポキシドからなる群から選択される金属アルコキシドであることを特徴とする、請求項９に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記工程Ａの反応溶媒が無水テトラヒドロフランであり、塩基がカリウム ｔ−ブトキシドであることを特徴とする、請求項８に記載の第１項の化学式１の誘導体の製造方法。
【請求項１２】
第１項の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、βアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項１３】
βアミロイド集積関連疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする、第１項の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、請求項１２に記載のβアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項１４】
化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩がβアミロイドの集積を阻害することを特徴とする、請求項１の化学式１の誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、請求項１２に記載のβアミロイド集積関連疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１６８３４４（Ｐ２０１０−１６８３４４Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２６６３７（Ｐ２００９−１２６６３７）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【出願人】（３０４０３９５４８）コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【出願人】（３０４０３９５４８）コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (36)
【Ｆターム（参考）】
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