ビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、パラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法、及びパラゴムノキの形質転換体
【課題】ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを効率よく評価する方法、並びに、パラゴムノキにおけるビタミンＥ生合成を促進し、ビタミンＥ含有量の高いパラゴムノキを作製する方法の提供。
【解決手段】ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価するビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、及び前記記載の方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入するパラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法。
【解決手段】ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価するビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、及び前記記載の方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入するパラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを効率よく評価する方法、並びに、該方法によりビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を用いてパラゴムノキのビタミンＥ生合成を促進する方法、及び当該遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、ゴム製品の主原料として様々な用途において幅広く、かつ大量に用いられている。天然ゴムは、ゴムノキ等のラテックス産生植物が分泌するラテックス（Ｌａｔｅｘ、乳液）を採取し、これに所望の加工をすることにより製造される。このため、主にタイ・マレーシア・インドネシア等の熱帯諸国において、ラテックスを回収するためのゴムノキ、特にパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が、商業的に植樹されている。
【０００３】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に、好ましい外来遺伝子を導入することによって、形質を改変することができるようになった。天然ゴムの製造分野においても、ラテックス産生植物を遺伝学的に改良し、より高品質のラテックスを産生し得る植物体や、より大量のラテックスを産生し得る植物体等の所望の形質を有する植物体を作成する方法が研究されている。なかでも、好ましい手法として、遺伝子組み換えによる分子育種があるが、遺伝子組み換えの植物体を得るためには、遺伝子導入と再分化のプロセスを経る必要がある。
【０００４】
植物の遺伝子導入法としては、植物病原菌の１種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入する方法（アグロバクテリウム法）、遺伝子を担持させた金粒子をパーティクルガンにより植物細胞内に撃ち込む方法（パーティクルガン法）、が主として用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
アグロバクテリウム法により、パラゴムノキの形質転換体作成に成功している事例が幾つかある。例えば、パラゴムノキの葯由来カルスに、アグロバクテリウム属細菌のベクター系を用いて所望の遺伝子を導入し、この植物組織から植物を再生することにより、形質転換されたパラゴムノキを作成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。また、パラゴムノキの珠皮由来カルスからアグロバクテリウム法により形質転換体が得られたという報告もある（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００６】
一方で、ビタミンＥは抗酸化作用を有する天然化合物であり、パラゴムノキから回収されるラテックス中にも含まれていることが確認されている。天然ゴムに十分量のビタミンＥを含有させることは、天然ゴムの酸化抑制に有効である。そこで、パラゴムノキに、ビタミンＥ生合成活性を有する遺伝子を導入してビタミンＥ生合成を促進することにより、ビタミンＥ含有量の高いラテックスを採取することができるパラゴムノキの形質転換体を得ることができると期待される。
【０００７】
植物におけるビタミンＥとして、主にトコトリエノールとトコフェノールとが挙げられる。これまでに判っている植物のビタミンＥの生合成経路を図１に示す。この生合成経路は、例えば、Collakovaらの文献（非特許文献２参照。）や、Bowierらの総説（例えば、非特許文献３参照。）に記載されている。
【０００８】
プレフェン酸を基質として、プレフェン酸デヒドラターゼの作用により４−ヒドロキシフェニルピルビン酸が生成する。そして、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの作用により、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸が生成する。また、非メバロン酸経路も作用しており、ゲラニルゲラニル二リン酸から、ゲラニルゲラニルレダクターゼによりフィチル二リン酸が生成する。
【０００９】
これらの生成物から、ビタミンＥの前駆体であるベンゾキノン誘導体やプラストキノン誘導体が生成する。すなわち、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの作用により、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンが生成する。また、フィチル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの作用により、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンが生成する。更に、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル−Ｌ−メチオニンから、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル１，４−ベンゾキノンが生成する。また、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、２，３−ジメチル−５−フィチル１，４−ベンゾキノンが生成する。
【００１０】
それらを原料としてトコトリエノール類が生成する。すなわち、２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル１，４−ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用により、γ−トコトリエノールが生成し、更にγ−トコトリエノールとＳ−アデノシル-L-メチオニンから、γ−トコトリエノールメチルトランスフェラーゼの作用により、α−トコトリエノールが生成する。また、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用により、δ-トコトリエノールが生成し、更にδ−トコトリエノールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコトリエノールメチルトランスフェラーゼの作用により、β−トコトリエノールが生成する。
【００１１】
更にトコフェノール類も生成する。すなわち、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ−トコフェロールが生成し、更にδ−トコフェロールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりβ−トコフェロールが生成する。また、２，３−ジメチル−５−フィチル−１，４−ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ−トコフェロールが生成し、更にδ−トコフェロールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりα−トコフェロールが生成する。
【００１２】
また、パラゴムノキのビタミンＥについては、パラゴムノキから、ビタミンＥの成分の一種であるトコトリエノールを単離、同定されたことが報告されている（例えば、非特許文献４又は５参照。）。
【００１３】
ビタミンＥの生合成に関連する植物由来の酵素の遺伝子については、これまでシロイヌナズナ由来のゲラニルゲラニルリダクターゼを単離した例（例えば、非特許文献６参照。）、トコフェロールサイクラーゼ遺伝子の変異により前駆体の２，３−ジメチル−５−フィチル−１，４−ベンゾキノンが葉や種子中に蓄積された例（例えば、非特許文献７又は８参照。）、オオムギ由来のホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ遺伝子をシロイヌナズナやトウモロコシに導入しビタミンＥ含有量及び組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献９参照。）、シロイヌナズナ由来のガンマ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子をシロイヌナズナに導入してビタミンＥ組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献１０参照。）、シロイヌナズナ由来のガンマ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子と２−メチル−６−フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼ遺伝子をダイズに導入してビタミンＥ含有量及び組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献１１参照。）などが報告されている。またα−トコフェロ−ルの含有量が高められた形質転換ダイズも開示されている（例えば、特許文献３参照。）。
【００１４】
パラゴムノキにおいても、他の植物と同様に、図１に示すような経路によりビタミンＥが生合成されていると考えられるが、シロイヌナズナ等とは異なり、パラゴムノキの遺伝子は未だ十分に解析されてはいない。このため、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成を制御する遺伝子の情報がなく、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成を制御する手段はこれまでなかった。
【００１５】
最近、本発明者らによって、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のパラゴムノキのホモログ遺伝子が報告された（例えば特許文献４参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００５−１３０８１５号公報
【特許文献２】特許第３２８９０２１号公報
【特許文献３】特開２００６−０７５１０６号公報
【特許文献４】国際公開第０８／１１７７３１号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ブラン（Blanc）、外４名、プラント・セル・レポート（Plant cell Report）、２００６年、第２４巻、第７２４〜７３３ページ。
【非特許文献２】コラコバ(Collakova) 、外１名、プラント・フィジオロジー(Plant Physiology)、２００３年、第１３３巻、第９３０〜９４０ページ。
【非特許文献３】ボウィエ(Bouvier)、外２名、プログレス・イン・リピッド・リサーチ（Progress in Lipid Research）、２００５年、第４４巻、第３５７〜４２９ページ。
【非特許文献４】ウィッテル（Whittle）、外２名、バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）、１９６６年、第１００巻、第１３８〜１４５ページ。
【非特許文献５】ダンフィ（Dunphy）、外３名、ネイチャー（Nature）、１９６５年、第２０７巻、第５２１〜５２２ページ。
【非特許文献６】ケラー（Keller）、外３名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）、１９９８年、第２５１巻、第４１３〜４１７ページ。
【非特許文献７】サトラー（Sattler）、外３名、プラント・フィジオロジー(Plant Physiology)、２００３年、第１３２巻、第２１８４〜２１９５ページ。
【非特許文献８】シュレッズ（Schledz）、外３名、フェブス・レター（FEBS letters）、２００１年、第４９９巻、第１５〜２０ページ。
【非特許文献９】カホーン（Cahoon）、外５名、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００３年、第２１巻、第１０８２〜１０８７ページ。
【非特許文献１０】シンタニ（Shintani）、外１名、サイエンス（Science）、１９９８年、第２８２巻、第２０９８〜２１００ページ。
【非特許文献１１】エネナーム（Eenennaam）、外１３名、ザ・プラント・セル（The Plant Cell）、２００３年、第１５巻、第３００７〜３０１９ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ある遺伝子がビタミンＥの生合成に関与しているかどうかは、実際にその遺伝子を対象植物に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体中のビタミンＥ含有量を測定することにより、はじめて確認することができる。しかしながら、パラゴムノキでは、他の種類の植物と比較して、再分化や形質転換の効率が非常に低く、形質転換体の作製が困難であるという問題がある。
【００１９】
また、特許文献４には、ビタミンＥ生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であることが他の植物において判明している遺伝子の、パラゴムノキのホモログ遺伝子の配列情報が記載されているが、これらの遺伝子をパラゴムノキに導入した場合に、実際に植物体のビタミンＥ含有量が増大するかどうかを確認してはいない。
【００２０】
本発明は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを効率よく評価する方法、並びに、パラゴムノキにおけるビタミンＥ生合成を促進し、ビタミンＥ含有量の高いパラゴムノキを作製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、パラゴムノキの代わりに、形質転換体の作製効率の高いペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）をモデル植物とし、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、この形質転換体中のビタミンＥ含有量を、遺伝子導入前の植物体と比較することによって、当該遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は、
（１） ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする、ビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（２） 前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする前記（１）記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（３） 評価対象である遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、前記形質転換体を作製することを特徴とする前記（１）又は（２）記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（４） 前記（１）〜（３）のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする、パラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法、
（５） 前記（１）〜（３）のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体、
（６） ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体、
を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法を用いることにより、評価対象である遺伝子を、パラゴムノキに直接導入した形質転換体を作製して評価する方法よりも、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子を、効率よく評価することができる。
このため、本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を効率よく作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、植物のビタミンＥ生合成の経路を示した図である。
【図２】図２は、プレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図３】図３は、プレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図５】図５は、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの塩基配列を示す図である。
【図７】図７は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】図８は、ゲラニルゲラニルレダクターゼの塩基配列を示す図である。
【図９】図９は、ゲラニルゲラニルレダクターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】図１０は、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１は、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】図１２は、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】図１４は、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１５】図１５は、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１６】図１６は、ＨＧＧＴ遺伝子のＧｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物を、電気泳動後核酸染色することにより得られた染色像である。
【図１７】図１７は、各個体のα−トコフェロール（ＴＰ−α）、γ−トコフェロール（ＴＰ−γ）、α−トコトリエノール（ＴＴ−α）、及びγ−トコトリエノール（ＴＴ−γ）の含有量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明及び本願明細書において、「ビタミンＥ生合成遺伝子」とは、ビタミンＥの生合成経路において機能するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。なお、ビタミンＥには、複数の成分が存在しており、パラゴムノキを初めとする植物には、主にトコフェノールとトコトリエノールがある。すなわち、本発明におけるビタミンＥ生合成遺伝子は、植物体内、特にパラゴムノキ内に導入された遺伝子が発現することにより、遺伝子導入前の同種の植物体に比べて、トコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が変化する遺伝子を意味する。
【００２６】
なお、本発明においては、ビタミンＥ生合成遺伝子とは、ビタミンＥの生合成経路において機能するタンパク質をコードするものであればよく、生物由来の天然の遺伝子に限られるものではなく、天然の遺伝子を改変した改変遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。改変遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数のヌクレオチドが欠損、置換又は付加された変異遺伝子、遺伝子を構成するＤＮＡの一部分のみからなるＤＮＡや、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数の領域が欠損、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、複数の遺伝子を組み合わせたキメラ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法（以下、本発明の評価方法、ということがある。）は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする。本発明においては、パラゴムノキのモデル植物として、形質転換体の作製が簡便なペリプロカを用いることにより、評価対象である遺伝子を直接パラゴムノキに導入した形質転換体を用いるよりも、簡便かつ短期間で当該遺伝子の機能を評価することができる。
【００２８】
ペリプロカとは、アフリカ、欧州、北米、アジアなどに自生するガガイモ科ペリプロカ属に属する蔓性の低木（半木本植物）である。乳管を有し、天然ゴムの原料となる乳液を生産する植物であり、植物体を傷つけることで乳液を出すものである。具体的には、ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ グラエカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｇｒａｅｃａ）、ペリプロカ ラエヴィガタ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｌａｅｖｉｇａｔａ）等が例示できる。
【００２９】
トウダイグサ科の木本植物であるパラゴムノキと、ペリプロカとは、分類学上は全く異なる。しかしながら、ペリプロカは、ゴムノキと同様のラテックスを生産する乳管構造を有している。さらに、本願発明者らが、ペリプロカから採取したラテックス中の成分を分析したところ、分子量が１０００００オーダーという、天然ゴムに匹敵する大きさのシス型ポリイソプレンを含有することが判明した。つまり、ペリプロカは、パラゴムノキと同様の乳管構造を有し、かつパラゴムノキと同様の成分を有するラテックスを産生する植物であり、ラテックス産生という点においては、パラゴムノキのモデル植物として有用である
【００３０】
このように、乳管等の器官構造とラテックスの成分とがともに近似していることから明らかであるように、少なくとも乳管におけるビタミンＥ生合成経路は、ペリプロカとパラゴムノキとでは非常に近似している。すなわち、ペリプロカに導入することにより、ペリプロカのトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量を増量させる、つまり、ペリプロカ中でビタミンＥ生合成を促進させることが評価された遺伝子であれば、パラゴムノキにおいてもビタミンＥ生合成促進に高い確率で寄与すると推定される。すなわち、当該遺伝子をパラゴムノキに導入して得られた形質転換体中においても、ペリプロカと同様に、当該遺伝子によってビタミンＥ生合成が促進される可能性が高い。
【００３１】
本発明において評価対象となる遺伝子は、生物由来の天然の遺伝子であってもよく、天然の遺伝子を改変した遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。また、パラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、ペリプロカ由来の遺伝子であってもよく、その他のラテックス産生植物由来の遺伝子であってもよく、動物や微生物由来の遺伝子であってもよく、これらの遺伝子の改変遺伝子であってもよい。
【００３２】
なお、その他のラテックス産生植物としては、例えば、トウダイグサ科のセアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ラゴスゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｕｔｅａ Ｖａｈｌ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）、ガガイモ科のオオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｔｅｇｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、トチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
【００３３】
評価対象とする遺伝子は、パラゴムノキを含むラテックス産生植物由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることが好ましく、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ由来の遺伝子であって、ビタミンＥ生合成経路に関与している可能性の高い遺伝子又はその変異遺伝子であることがより好ましい。このような遺伝子として、例えば、図１に記載する遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
図１に記載されている遺伝子の中には、パラゴムノキにおいて同定されていない遺伝子も多く存在する。このような場合には、パラゴムノキのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）解析により得た遺伝子断片情報と既知遺伝子データベースとの統合解析により、ビタミンＥの生合成に関与する酵素の遺伝子群と思われる配列を特定し、全長ｃＤＮＡクローニングにより、当該遺伝子ホモログを取得することができる（例えば、特許文献４参照。）。
【００３５】
本発明においては、パラゴムノキ由来のホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、又は２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることが好ましく、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、又はホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることがより好ましく、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることがさらに好ましい。
【００３６】
これらの酵素をコードするパラゴムノキ由来の遺伝子の、具体的な配列情報を以下に示す。なお、これらの遺伝子は、本発明者らによって、上述の方法で構築されたパラゴムノキＥＳＴデータベースにおいて、それぞれの酵素をコードすると推定されるＥＳＴ配列を見出し、これらの配列について３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）により３’末端側の配列を決定し、完全長のｃＤＮＡを取得したものである（例えば、特許文献４参照。）。
【００３７】
プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図２および配列表の配列番号１の塩基番号１から１６７７に示す。配列表の配列番号１の塩基配列において塩基番号１６０から１３２９に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図３および配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から３９０に示す。なお、プレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質として４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００３８】
他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図４および配列表の配列番号３の塩基番号１から１７６０に示す。配列表の配列番号３の塩基配列において塩基番号１９９から１４８５に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図５および配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４２９に示す。なお、上記で述べたように、プレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質として４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００３９】
４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図６および配列表の配列番号５の塩基番号１から１６３１および図６に示す。配列表の配列番号５の塩基配列において塩基番号４７から１３８１に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの推定アミノ酸配列を、図７および配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から４４５に示す。なお、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼは、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４０】
ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図８および配列表の配列番号７の塩基番号１から１７９３に示す。配列表の配列番号７の塩基配列において塩基番号１２から１４２４に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たゲラニルゲラニルレダクターゼの推定アミノ酸配列を、図９および配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から４７１に示す。なお、ゲラニルゲラニルレダクターゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４１】
ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１０および配列表の配列番号９の塩基番号１から１５６３に示す。配列表の配列番号９の塩基配列において塩基番号９３から１３３４に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１１および配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１から４１４に示す。なお、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼは、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として２−メチル−６−フィチルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４２】
２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１２および配列表の配列番号１１の塩基番号１から１４１０に示す。配列表の配列番号１１の塩基配列において塩基番号１６５から１１８７に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得た２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１３および配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１から３４１に示す。なお、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼは、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを基質として２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル−１，４−ベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４３】
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１４および配列表の配列番号１３の塩基番号１から１８３７に示す。配列表の配列番号１３の塩基配列において塩基番号８２から１３１７に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１５および配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から４１１に示す。なお、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４４】
また、これらの酵素をコードする遺伝子としては、図２、４、６、８、１０、１２、及び１４に示した塩基配列を有するものに加えて、これらの塩基配列の一部が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する変異遺伝子であってもよい。ここで、塩基配列の一部が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する変異遺伝子とは、各塩基配列中の２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子であって、元の遺伝子がコードする酵素の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このような変異遺伝子の塩基配列は、元の遺伝子の塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。
【００４５】
例えば、配列表の配列番号１３に示す遺伝子（図１４に示す塩基配列を有する遺伝子）の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１３に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１３に示す塩基配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成する反応を触媒するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り、本発明において、「ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の変異遺伝子」に含まれる。
【００４６】
プレフェン酸デヒドラターゼ等の上述した他の酵素をコードする遺伝子においても、同様である。
【００４７】
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、植物の形質転換体を作製する場合に用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、評価対象である遺伝子を構成するＤＮＡを組み込んだベクターを、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いてプロペリカへ導入することによって、当該遺伝子が導入された形質転換体を作製することができる。
【００４８】
本発明においては、アグロバクテリウム法を用いて形質転換体を作製することが好ましい。プロペリカは、アグロバクテリウム菌による感染効率が高く、かつ、再分化効率が良好であり、アグロバクテリウム法による形質転換体の作製に好適であるためである。
【００４９】
アグロバクテリウム法は、植物体に導入する遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを、アグロバクテリウム属菌に導入し、この遺伝子導入されたアグロバクテリウム属菌を、常法により培養し増殖させた後、カルス又は幼植物体に感染させることによって、植物体に遺伝子を導入する方法である。評価対象たる遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、評価対象たる遺伝子等を組み込んだ遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに、評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えバイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。なお、感染に用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００５０】
評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えベクターは、当該分野において公知のいずれの手法を用いて作製してもよい。一般的に、評価対象とする遺伝子を構成するＤＮＡの前後にプロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む状態で、ベクターに組み込まれているが、これらの制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入される植物中で機能し得るものであればよく、ペリプロカ由来の遺伝子やパラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。その他、乳管特異的プロモーターを用いることも好ましい。
【００５１】
評価対象とする遺伝子は、好適には、マーカー遺伝子とともにベクターに組み込まれることが好ましい。
選抜用マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ヒエグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。また、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、選抜用マーカーとして用いることも好ましい。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＤｓＲｅｄ等の、通常タンパク質発現ベクター等に組み込んで用いられる蛍光タンパク質の中から、適宜選択して用いることができる。
【００５２】
ペリプロカの形質転換体は、例えば、前記ベクターを含む感染液に、ペリプロカの根、茎、葉又は花等の組織、あるいはカルス等の細胞を接触させた後、組織培養することにより得られる。なお、選抜用マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、さらに抗生物質を含有する選択培地で培養することにより、形質転換体を効率よく選抜することができる。
【００５３】
組織や細胞は、殺菌又は滅菌してから組織培養に供する。殺菌又は滅菌は、公知の殺菌剤・滅菌剤を使用して行えば良く、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を使用するのが好ましい。
【００５４】
組織培養は、遮光条件下、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、好ましくは２〜４日程度、同じ組成の培地上で行えば良い。
選択培地での培養は、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２０日間で行う。培養温度は、上記組織培養の場合と同様で良い。
【００５５】
作製した形質転換体は、再分化培地上で培養を継続することにより、シュートを伸長させることができる。伸長したシュートを発根させることにより、幼植物体を取得することができる。その後、この幼植物体を馴化用土に移植し、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、育成することにより、成体の形質転換体を得ることができる。
【００５６】
このようにして得られた形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量を測定し、当該遺伝子導入前のペリプロカ、例えば、当該遺伝子が導入されていないペリプロカと比較することにより、導入された遺伝子が、ビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価することができる。すなわち、トコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量の少なくともいずれか一方が増量していた場合には、導入された遺伝子は、ペリプロカにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であり、よって、パラゴムノキでも同様にビタミンＥの生合成に関与すると評価することができる。
【００５７】
なお、導入する遺伝子の種類によって、形質転換体のトコトリエノール含有量とトコフェノール含有量の両方が増量する場合もあるが、いずれか一方が増量し、他方が減量する場合もある。例えば、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した場合には、形質転換体中のトコトリエノール含有量は増大するものの、トコフェロール含有量は低下する場合がある。
【００５８】
形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量の測定は、常法により行うことができる。例えば、ソクスレー抽出によりペリプロカのツルから得られた抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）等の分析機器を用いて、トコトリエノールやトコフェノールを分析することができる。また、トコトリエノールやトコフェノールの標準品を用いて検量線を作成することにより、トコトリエノール含有量やトコフェノール含有量を定量することができる。
【００５９】
本発明のパラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法（以下、本発明のビタミンＥ生合成促進方法、ということがある。）は、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする。
【００６０】
従来は、パラゴムノキにおいてある特定の機能を有する遺伝子であるか否かを調べるためには、当該遺伝子をパラゴムノキに直接導入し、形質転換体を得た後、この形質転換体を解析することにより、行われていた。つまり、ある遺伝子がパラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを調べるためには、当該遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体を取得し、この形質転換体のビタミンＥ含有量を測定しなければならなかった。
しかしながら、パラゴムノキは形質転換効率が非常に低く、このため、形質転換体自体を取得することが困難であるため、多数の候補遺伝子について解析を行うことは非常に困難である。
【００６１】
これに対して、本発明においては、多数の候補遺伝子を、まず、形質転換体を取得し易いペリプロカに導入し、少なくともペリプロカのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であることが確認された遺伝子をパラゴムノキに導入するため、非常に高い確率で、パラゴムノキのビタミンＥ生合成を促進することができる。
【００６２】
言い換えれば、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することにより、非常に高い確率で、ビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を得ることができる。このようにして得られたパラゴムノキの形質転換体は、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されているために、ビタミンＥ含有量が高いラテックスを産生する。よって、本発明のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体から、ビタミンＥの抗酸化作用により、ゴムの老化防止効果が高められた高機能のラテックスを採取し得ることが期待できる。
【００６３】
パラゴムノキの形質転換体の作製は、前述のペリプロカと同様に、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。例えば、ゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をすることにより、本発明の評価方法によってパラゴムノキのビタミンＥ生合成遺伝子であると評価された遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体を作製することができる。
【００６４】
ビタミンＥ含有量の高いラテックスを産出する形質転換体を得るために、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥ生合成遺伝子であると評価された遺伝子を、乳管特異的プロモーターの下流に組み込んだ組み換えベクターを、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いてパラゴムノキへ導入することも好ましい。
【００６５】
本発明においては、ビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体として、特に、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入された形質転換体であることが好ましい。これらの遺伝子は、パラゴムノキ以外の生物種由来の遺伝子であってもよいが、パラゴムノキ由来の遺伝子であることが好ましく、図２、４、６、１０、及び１４に示した塩基配列を有する遺伝子又はその改変遺伝子であることより好ましく、図２、４、６、１０、及び１４に示した塩基配列を有する遺伝子又はその変異遺伝子であることがさらに好ましい。
【００６６】
例えば、図１４に示した塩基配列を有するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより得られるパラゴムノキの形質転換体は、ビタミンＥ生合成のうち、特にトコトリエノール生合成が促進される。よって、当該遺伝子が導入された形質転換体から採取されるラテックスは、当該遺伝子が導入されていないパラゴムノキに比べて、トコトリエノール含有量が高いことが期待できる。
【実施例】
【００６７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実施例１］
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｏｍｏｇｅｎｔｉｓａｔｅ ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＨＧＧＴ）をコードするパラゴムノキ由来の遺伝子であって、図１４に示す塩基配列（配列番号１３）を有するＨＧＧＴ遺伝子が、ビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを、本発明の評価方法により評価した。
なお、ペリプロカは、国立大学法人九州大学玉泉研究室においてクローン増殖したペリプロカの野生株を用いた。
【００６９】
＜ペリプロカの形質転換体の作製＞
まず、ＧＦＰをコードするＧＦＰ遺伝子のＣ末端にＨＧＧＴをコードするＨＧＧＴ遺伝子を結合させたＧＦＰ−ＨＧＧＴキメラ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子であるｎｐｔII遺伝子とを組み込んだＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子含有バイナリーベクターを作製し、これを、アグロバクテリウムにおいて汎用されているアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入し、ＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを作製した。
次いで、ペリプロカの無菌苗の胚軸部分を５ｍｍ程度に切断し、これをＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを含む感染液に接触させて感染させた後、これを培地で遮光条件下、２５℃で３日間培養した。
感染により遺伝子を導入したペリプロカは、カナマイシン耐性選択培地で、さらに２５℃、明期１６時間の条件下で培養した。これらのペリプロカの胚軸の切り口部分に発生するカルスのうち、ＧＦＰ蛍光を発するカルスを選抜し、培養を継続してシュートを伸長させた。
伸長したシュートを試験管内で発根させ、形質転換体の幼植物体を取得した。これらの幼植物体は、１０ｃｍ程度に生長した時点で、馴化用土に移植し、隔離温室で馴化栽培を実施した。なお、隔離温室栽培は、日本植生株式会社（岡山県津山市）に依頼し、室温２５℃、照度制御した隔離温室下で育成した。
【００７０】
得られた形質転換体に、実際にＨＧＧＴ遺伝子が導入されているかどうかを、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ分析により確認した。具体的には、ＧＦＰ蛍光を発する再分化した幼植物体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により検出することによって、ＨＧＧＴ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の有無を確認した。
この結果、ＧＦＰ蛍光を発する幼植物体の全てにおいてＧＦＰ遺伝子が導入されていることが確認された。一方で、ＨＧＧＴ遺伝子は、ＧＦＰ蛍光を発する幼植物体の８３％において導入が確認された。
図１６は、ＨＧＧＴ遺伝子のＧｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物を、電気泳動後核酸染色することにより得られた染色像である。ＰＣＲ産物が、染色されたバンドとして検出されている。この結果、ＧＦＰ蛍光を発する２３個の形質転換体のうち、１９個の形質転換体において、バンドが検出され、ＨＧＧＴ遺伝子の導入が確認された。
【００７１】
さらに、ＨＧＧＴ遺伝子が導入された個体のビタミンＥ含有量を測定した。具体的には、馴化後２ヶ月経過した時点で、伸長したツルを摘み取り、褐変した葉や損傷葉を除去したものを、分析用試料とした。これらの試料の湿重量を秤量した後、ソクスレー抽出した。ＨＰＬＣにより、この抽出物中のトコフェロール及びトコトリエノールを分析した。α、β、γ、δ体それぞれのトコフェロール及びトコトリエノールの標準品を用いて検量線を作成し、各成分の定量を行った。また、対照として、ペリプロカの野生株から採取した葉に対しても、同様にビタミンＥの各種成分の定量分析を行った。
図１７は、各個体のα−トコフェロール（ＴＰ−α）、γ−トコフェロール（ＴＰ−γ）、α−トコトリエノール（ＴＴ−α）、及びγ−トコトリエノール（ＴＴ−γ）の含有量を示した図である。この結果、野生株においては、α−トコフェロールのみが存在していた。一方、個体Ｎｏ．２１、２５、２６、８３、及び８５は、ＨＧＧＴ遺伝子導入が確認されなかった個体であり、それ以外のＨＧＧＴ遺伝子が導入された形質転換体においては、９０％の確率でα−トコトリエノールの存在が確認できた。また、一部の個体においては、微量のγ−トコトリエノールが存在することも明確となった。
【００７２】
これらの結果から、ＨＧＧＴ遺伝子の導入により、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸から、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを経由してα−及びγ−トコトリエノールを合成する反応が促進されたことが明らかであり、ＨＧＧＴ遺伝子が、ラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された。
よって、ＨＧＧＴ遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、トコトリエノール生合成を促進することができ、このＨＧＧＴ遺伝子が導入されたパラゴムノキの形質転換体からは、トコトリエノール含有量の高いラテックスが採取できることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を効率よく作製することができるため、特に天然ゴムの産生の分野で有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを効率よく評価する方法、並びに、該方法によりビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を用いてパラゴムノキのビタミンＥ生合成を促進する方法、及び当該遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、ゴム製品の主原料として様々な用途において幅広く、かつ大量に用いられている。天然ゴムは、ゴムノキ等のラテックス産生植物が分泌するラテックス（Ｌａｔｅｘ、乳液）を採取し、これに所望の加工をすることにより製造される。このため、主にタイ・マレーシア・インドネシア等の熱帯諸国において、ラテックスを回収するためのゴムノキ、特にパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が、商業的に植樹されている。
【０００３】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に、好ましい外来遺伝子を導入することによって、形質を改変することができるようになった。天然ゴムの製造分野においても、ラテックス産生植物を遺伝学的に改良し、より高品質のラテックスを産生し得る植物体や、より大量のラテックスを産生し得る植物体等の所望の形質を有する植物体を作成する方法が研究されている。なかでも、好ましい手法として、遺伝子組み換えによる分子育種があるが、遺伝子組み換えの植物体を得るためには、遺伝子導入と再分化のプロセスを経る必要がある。
【０００４】
植物の遺伝子導入法としては、植物病原菌の１種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入する方法（アグロバクテリウム法）、遺伝子を担持させた金粒子をパーティクルガンにより植物細胞内に撃ち込む方法（パーティクルガン法）、が主として用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
アグロバクテリウム法により、パラゴムノキの形質転換体作成に成功している事例が幾つかある。例えば、パラゴムノキの葯由来カルスに、アグロバクテリウム属細菌のベクター系を用いて所望の遺伝子を導入し、この植物組織から植物を再生することにより、形質転換されたパラゴムノキを作成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。また、パラゴムノキの珠皮由来カルスからアグロバクテリウム法により形質転換体が得られたという報告もある（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００６】
一方で、ビタミンＥは抗酸化作用を有する天然化合物であり、パラゴムノキから回収されるラテックス中にも含まれていることが確認されている。天然ゴムに十分量のビタミンＥを含有させることは、天然ゴムの酸化抑制に有効である。そこで、パラゴムノキに、ビタミンＥ生合成活性を有する遺伝子を導入してビタミンＥ生合成を促進することにより、ビタミンＥ含有量の高いラテックスを採取することができるパラゴムノキの形質転換体を得ることができると期待される。
【０００７】
植物におけるビタミンＥとして、主にトコトリエノールとトコフェノールとが挙げられる。これまでに判っている植物のビタミンＥの生合成経路を図１に示す。この生合成経路は、例えば、Collakovaらの文献（非特許文献２参照。）や、Bowierらの総説（例えば、非特許文献３参照。）に記載されている。
【０００８】
プレフェン酸を基質として、プレフェン酸デヒドラターゼの作用により４−ヒドロキシフェニルピルビン酸が生成する。そして、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの作用により、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸が生成する。また、非メバロン酸経路も作用しており、ゲラニルゲラニル二リン酸から、ゲラニルゲラニルレダクターゼによりフィチル二リン酸が生成する。
【０００９】
これらの生成物から、ビタミンＥの前駆体であるベンゾキノン誘導体やプラストキノン誘導体が生成する。すなわち、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの作用により、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンが生成する。また、フィチル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの作用により、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンが生成する。更に、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル−Ｌ−メチオニンから、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル１，４−ベンゾキノンが生成する。また、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、２，３−ジメチル−５−フィチル１，４−ベンゾキノンが生成する。
【００１０】
それらを原料としてトコトリエノール類が生成する。すなわち、２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル１，４−ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用により、γ−トコトリエノールが生成し、更にγ−トコトリエノールとＳ−アデノシル-L-メチオニンから、γ−トコトリエノールメチルトランスフェラーゼの作用により、α−トコトリエノールが生成する。また、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用により、δ-トコトリエノールが生成し、更にδ−トコトリエノールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコトリエノールメチルトランスフェラーゼの作用により、β−トコトリエノールが生成する。
【００１１】
更にトコフェノール類も生成する。すなわち、２−メチル−６−フィチルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ−トコフェロールが生成し、更にδ−トコフェロールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりβ−トコフェロールが生成する。また、２，３−ジメチル−５−フィチル−１，４−ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ−トコフェロールが生成し、更にδ−トコフェロールとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから、γ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりα−トコフェロールが生成する。
【００１２】
また、パラゴムノキのビタミンＥについては、パラゴムノキから、ビタミンＥの成分の一種であるトコトリエノールを単離、同定されたことが報告されている（例えば、非特許文献４又は５参照。）。
【００１３】
ビタミンＥの生合成に関連する植物由来の酵素の遺伝子については、これまでシロイヌナズナ由来のゲラニルゲラニルリダクターゼを単離した例（例えば、非特許文献６参照。）、トコフェロールサイクラーゼ遺伝子の変異により前駆体の２，３−ジメチル−５−フィチル−１，４−ベンゾキノンが葉や種子中に蓄積された例（例えば、非特許文献７又は８参照。）、オオムギ由来のホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ遺伝子をシロイヌナズナやトウモロコシに導入しビタミンＥ含有量及び組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献９参照。）、シロイヌナズナ由来のガンマ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子をシロイヌナズナに導入してビタミンＥ組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献１０参照。）、シロイヌナズナ由来のガンマ−トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子と２−メチル−６−フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼ遺伝子をダイズに導入してビタミンＥ含有量及び組成を制御することに成功した例（例えば、非特許文献１１参照。）などが報告されている。またα−トコフェロ−ルの含有量が高められた形質転換ダイズも開示されている（例えば、特許文献３参照。）。
【００１４】
パラゴムノキにおいても、他の植物と同様に、図１に示すような経路によりビタミンＥが生合成されていると考えられるが、シロイヌナズナ等とは異なり、パラゴムノキの遺伝子は未だ十分に解析されてはいない。このため、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成を制御する遺伝子の情報がなく、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成を制御する手段はこれまでなかった。
【００１５】
最近、本発明者らによって、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のパラゴムノキのホモログ遺伝子が報告された（例えば特許文献４参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００５−１３０８１５号公報
【特許文献２】特許第３２８９０２１号公報
【特許文献３】特開２００６−０７５１０６号公報
【特許文献４】国際公開第０８／１１７７３１号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ブラン（Blanc）、外４名、プラント・セル・レポート（Plant cell Report）、２００６年、第２４巻、第７２４〜７３３ページ。
【非特許文献２】コラコバ(Collakova) 、外１名、プラント・フィジオロジー(Plant Physiology)、２００３年、第１３３巻、第９３０〜９４０ページ。
【非特許文献３】ボウィエ(Bouvier)、外２名、プログレス・イン・リピッド・リサーチ（Progress in Lipid Research）、２００５年、第４４巻、第３５７〜４２９ページ。
【非特許文献４】ウィッテル（Whittle）、外２名、バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）、１９６６年、第１００巻、第１３８〜１４５ページ。
【非特許文献５】ダンフィ（Dunphy）、外３名、ネイチャー（Nature）、１９６５年、第２０７巻、第５２１〜５２２ページ。
【非特許文献６】ケラー（Keller）、外３名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）、１９９８年、第２５１巻、第４１３〜４１７ページ。
【非特許文献７】サトラー（Sattler）、外３名、プラント・フィジオロジー(Plant Physiology)、２００３年、第１３２巻、第２１８４〜２１９５ページ。
【非特許文献８】シュレッズ（Schledz）、外３名、フェブス・レター（FEBS letters）、２００１年、第４９９巻、第１５〜２０ページ。
【非特許文献９】カホーン（Cahoon）、外５名、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００３年、第２１巻、第１０８２〜１０８７ページ。
【非特許文献１０】シンタニ（Shintani）、外１名、サイエンス（Science）、１９９８年、第２８２巻、第２０９８〜２１００ページ。
【非特許文献１１】エネナーム（Eenennaam）、外１３名、ザ・プラント・セル（The Plant Cell）、２００３年、第１５巻、第３００７〜３０１９ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ある遺伝子がビタミンＥの生合成に関与しているかどうかは、実際にその遺伝子を対象植物に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体中のビタミンＥ含有量を測定することにより、はじめて確認することができる。しかしながら、パラゴムノキでは、他の種類の植物と比較して、再分化や形質転換の効率が非常に低く、形質転換体の作製が困難であるという問題がある。
【００１９】
また、特許文献４には、ビタミンＥ生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であることが他の植物において判明している遺伝子の、パラゴムノキのホモログ遺伝子の配列情報が記載されているが、これらの遺伝子をパラゴムノキに導入した場合に、実際に植物体のビタミンＥ含有量が増大するかどうかを確認してはいない。
【００２０】
本発明は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを効率よく評価する方法、並びに、パラゴムノキにおけるビタミンＥ生合成を促進し、ビタミンＥ含有量の高いパラゴムノキを作製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、パラゴムノキの代わりに、形質転換体の作製効率の高いペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）をモデル植物とし、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、この形質転換体中のビタミンＥ含有量を、遺伝子導入前の植物体と比較することによって、当該遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は、
（１） ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする、ビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（２） 前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする前記（１）記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（３） 評価対象である遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、前記形質転換体を作製することを特徴とする前記（１）又は（２）記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法、
（４） 前記（１）〜（３）のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする、パラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法、
（５） 前記（１）〜（３）のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体、
（６） ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体、
を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法を用いることにより、評価対象である遺伝子を、パラゴムノキに直接導入した形質転換体を作製して評価する方法よりも、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子を、効率よく評価することができる。
このため、本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を効率よく作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、植物のビタミンＥ生合成の経路を示した図である。
【図２】図２は、プレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図３】図３は、プレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図５】図５は、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの塩基配列を示す図である。
【図７】図７は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】図８は、ゲラニルゲラニルレダクターゼの塩基配列を示す図である。
【図９】図９は、ゲラニルゲラニルレダクターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】図１０は、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１は、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】図１２は、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】図１４は、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１５】図１５は、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１６】図１６は、ＨＧＧＴ遺伝子のＧｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物を、電気泳動後核酸染色することにより得られた染色像である。
【図１７】図１７は、各個体のα−トコフェロール（ＴＰ−α）、γ−トコフェロール（ＴＰ−γ）、α−トコトリエノール（ＴＴ−α）、及びγ−トコトリエノール（ＴＴ−γ）の含有量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明及び本願明細書において、「ビタミンＥ生合成遺伝子」とは、ビタミンＥの生合成経路において機能するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。なお、ビタミンＥには、複数の成分が存在しており、パラゴムノキを初めとする植物には、主にトコフェノールとトコトリエノールがある。すなわち、本発明におけるビタミンＥ生合成遺伝子は、植物体内、特にパラゴムノキ内に導入された遺伝子が発現することにより、遺伝子導入前の同種の植物体に比べて、トコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が変化する遺伝子を意味する。
【００２６】
なお、本発明においては、ビタミンＥ生合成遺伝子とは、ビタミンＥの生合成経路において機能するタンパク質をコードするものであればよく、生物由来の天然の遺伝子に限られるものではなく、天然の遺伝子を改変した改変遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。改変遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数のヌクレオチドが欠損、置換又は付加された変異遺伝子、遺伝子を構成するＤＮＡの一部分のみからなるＤＮＡや、遺伝子を構成するＤＮＡの一又は複数の領域が欠損、置換又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、複数の遺伝子を組み合わせたキメラ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法（以下、本発明の評価方法、ということがある。）は、ある遺伝子が、パラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする。本発明においては、パラゴムノキのモデル植物として、形質転換体の作製が簡便なペリプロカを用いることにより、評価対象である遺伝子を直接パラゴムノキに導入した形質転換体を用いるよりも、簡便かつ短期間で当該遺伝子の機能を評価することができる。
【００２８】
ペリプロカとは、アフリカ、欧州、北米、アジアなどに自生するガガイモ科ペリプロカ属に属する蔓性の低木（半木本植物）である。乳管を有し、天然ゴムの原料となる乳液を生産する植物であり、植物体を傷つけることで乳液を出すものである。具体的には、ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ グラエカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｇｒａｅｃａ）、ペリプロカ ラエヴィガタ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｌａｅｖｉｇａｔａ）等が例示できる。
【００２９】
トウダイグサ科の木本植物であるパラゴムノキと、ペリプロカとは、分類学上は全く異なる。しかしながら、ペリプロカは、ゴムノキと同様のラテックスを生産する乳管構造を有している。さらに、本願発明者らが、ペリプロカから採取したラテックス中の成分を分析したところ、分子量が１０００００オーダーという、天然ゴムに匹敵する大きさのシス型ポリイソプレンを含有することが判明した。つまり、ペリプロカは、パラゴムノキと同様の乳管構造を有し、かつパラゴムノキと同様の成分を有するラテックスを産生する植物であり、ラテックス産生という点においては、パラゴムノキのモデル植物として有用である
【００３０】
このように、乳管等の器官構造とラテックスの成分とがともに近似していることから明らかであるように、少なくとも乳管におけるビタミンＥ生合成経路は、ペリプロカとパラゴムノキとでは非常に近似している。すなわち、ペリプロカに導入することにより、ペリプロカのトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量を増量させる、つまり、ペリプロカ中でビタミンＥ生合成を促進させることが評価された遺伝子であれば、パラゴムノキにおいてもビタミンＥ生合成促進に高い確率で寄与すると推定される。すなわち、当該遺伝子をパラゴムノキに導入して得られた形質転換体中においても、ペリプロカと同様に、当該遺伝子によってビタミンＥ生合成が促進される可能性が高い。
【００３１】
本発明において評価対象となる遺伝子は、生物由来の天然の遺伝子であってもよく、天然の遺伝子を改変した遺伝子や人工的に合成した遺伝子であってもよい。また、パラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、ペリプロカ由来の遺伝子であってもよく、その他のラテックス産生植物由来の遺伝子であってもよく、動物や微生物由来の遺伝子であってもよく、これらの遺伝子の改変遺伝子であってもよい。
【００３２】
なお、その他のラテックス産生植物としては、例えば、トウダイグサ科のセアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ラゴスゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｌｕｔｅａ Ｖａｈｌ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ ｚａｐｏｔａ）、ガガイモ科のオオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｔｅｇｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、トチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
【００３３】
評価対象とする遺伝子は、パラゴムノキを含むラテックス産生植物由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることが好ましく、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその改変遺伝子であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ由来の遺伝子であって、ビタミンＥ生合成経路に関与している可能性の高い遺伝子又はその変異遺伝子であることがより好ましい。このような遺伝子として、例えば、図１に記載する遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
図１に記載されている遺伝子の中には、パラゴムノキにおいて同定されていない遺伝子も多く存在する。このような場合には、パラゴムノキのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）解析により得た遺伝子断片情報と既知遺伝子データベースとの統合解析により、ビタミンＥの生合成に関与する酵素の遺伝子群と思われる配列を特定し、全長ｃＤＮＡクローニングにより、当該遺伝子ホモログを取得することができる（例えば、特許文献４参照。）。
【００３５】
本発明においては、パラゴムノキ由来のホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、又は２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることが好ましく、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、又はホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることがより好ましく、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又はその変異遺伝子であることがさらに好ましい。
【００３６】
これらの酵素をコードするパラゴムノキ由来の遺伝子の、具体的な配列情報を以下に示す。なお、これらの遺伝子は、本発明者らによって、上述の方法で構築されたパラゴムノキＥＳＴデータベースにおいて、それぞれの酵素をコードすると推定されるＥＳＴ配列を見出し、これらの配列について３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）により３’末端側の配列を決定し、完全長のｃＤＮＡを取得したものである（例えば、特許文献４参照。）。
【００３７】
プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図２および配列表の配列番号１の塩基番号１から１６７７に示す。配列表の配列番号１の塩基配列において塩基番号１６０から１３２９に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図３および配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から３９０に示す。なお、プレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質として４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００３８】
他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図４および配列表の配列番号３の塩基番号１から１７６０に示す。配列表の配列番号３の塩基配列において塩基番号１９９から１４８５に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図５および配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４２９に示す。なお、上記で述べたように、プレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質として４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００３９】
４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図６および配列表の配列番号５の塩基番号１から１６３１および図６に示す。配列表の配列番号５の塩基配列において塩基番号４７から１３８１に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの推定アミノ酸配列を、図７および配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から４４５に示す。なお、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼは、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４０】
ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図８および配列表の配列番号７の塩基番号１から１７９３に示す。配列表の配列番号７の塩基配列において塩基番号１２から１４２４に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たゲラニルゲラニルレダクターゼの推定アミノ酸配列を、図９および配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から４７１に示す。なお、ゲラニルゲラニルレダクターゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４１】
ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１０および配列表の配列番号９の塩基番号１から１５６３に示す。配列表の配列番号９の塩基配列において塩基番号９３から１３３４に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１１および配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１から４１４に示す。なお、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼは、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として２−メチル−６−フィチルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４２】
２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１２および配列表の配列番号１１の塩基番号１から１４１０に示す。配列表の配列番号１１の塩基配列において塩基番号１６５から１１８７に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得た２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１３および配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１から３４１に示す。なお、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼは、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを基質として２，３−ジメチル−５−ゲラニルゲラニル−１，４−ベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４３】
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１４および配列表の配列番号１３の塩基番号１から１８３７に示す。配列表の配列番号１３の塩基配列において塩基番号８２から１３１７に対応する部分がコーディング領域である。そしてそのコーディング領域の塩基配列から得たホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１５および配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から４１１に示す。なお、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。
【００４４】
また、これらの酵素をコードする遺伝子としては、図２、４、６、８、１０、１２、及び１４に示した塩基配列を有するものに加えて、これらの塩基配列の一部が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する変異遺伝子であってもよい。ここで、塩基配列の一部が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する変異遺伝子とは、各塩基配列中の２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子であって、元の遺伝子がコードする酵素の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このような変異遺伝子の塩基配列は、元の遺伝子の塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。
【００４５】
例えば、配列表の配列番号１３に示す遺伝子（図１４に示す塩基配列を有する遺伝子）の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１３に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１３に示す塩基配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成する反応を触媒するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り、本発明において、「ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の変異遺伝子」に含まれる。
【００４６】
プレフェン酸デヒドラターゼ等の上述した他の酵素をコードする遺伝子においても、同様である。
【００４７】
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカの形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、植物の形質転換体を作製する場合に用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、評価対象である遺伝子を構成するＤＮＡを組み込んだベクターを、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いてプロペリカへ導入することによって、当該遺伝子が導入された形質転換体を作製することができる。
【００４８】
本発明においては、アグロバクテリウム法を用いて形質転換体を作製することが好ましい。プロペリカは、アグロバクテリウム菌による感染効率が高く、かつ、再分化効率が良好であり、アグロバクテリウム法による形質転換体の作製に好適であるためである。
【００４９】
アグロバクテリウム法は、植物体に導入する遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを、アグロバクテリウム属菌に導入し、この遺伝子導入されたアグロバクテリウム属菌を、常法により培養し増殖させた後、カルス又は幼植物体に感染させることによって、植物体に遺伝子を導入する方法である。評価対象たる遺伝子を含むベクターを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、評価対象たる遺伝子等を組み込んだ遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに、評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えバイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。なお、感染に用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００５０】
評価対象とする遺伝子を組み込んだ組み換えベクターは、当該分野において公知のいずれの手法を用いて作製してもよい。一般的に、評価対象とする遺伝子を構成するＤＮＡの前後にプロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む状態で、ベクターに組み込まれているが、これらの制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入される植物中で機能し得るものであればよく、ペリプロカ由来の遺伝子やパラゴムノキ由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。その他、乳管特異的プロモーターを用いることも好ましい。
【００５１】
評価対象とする遺伝子は、好適には、マーカー遺伝子とともにベクターに組み込まれることが好ましい。
選抜用マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ヒエグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。また、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、選抜用マーカーとして用いることも好ましい。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＤｓＲｅｄ等の、通常タンパク質発現ベクター等に組み込んで用いられる蛍光タンパク質の中から、適宜選択して用いることができる。
【００５２】
ペリプロカの形質転換体は、例えば、前記ベクターを含む感染液に、ペリプロカの根、茎、葉又は花等の組織、あるいはカルス等の細胞を接触させた後、組織培養することにより得られる。なお、選抜用マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、さらに抗生物質を含有する選択培地で培養することにより、形質転換体を効率よく選抜することができる。
【００５３】
組織や細胞は、殺菌又は滅菌してから組織培養に供する。殺菌又は滅菌は、公知の殺菌剤・滅菌剤を使用して行えば良く、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を使用するのが好ましい。
【００５４】
組織培養は、遮光条件下、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、好ましくは２〜４日程度、同じ組成の培地上で行えば良い。
選択培地での培養は、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２０日間で行う。培養温度は、上記組織培養の場合と同様で良い。
【００５５】
作製した形質転換体は、再分化培地上で培養を継続することにより、シュートを伸長させることができる。伸長したシュートを発根させることにより、幼植物体を取得することができる。その後、この幼植物体を馴化用土に移植し、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２３〜２８℃で、育成することにより、成体の形質転換体を得ることができる。
【００５６】
このようにして得られた形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量を測定し、当該遺伝子導入前のペリプロカ、例えば、当該遺伝子が導入されていないペリプロカと比較することにより、導入された遺伝子が、ビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価することができる。すなわち、トコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量の少なくともいずれか一方が増量していた場合には、導入された遺伝子は、ペリプロカにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であり、よって、パラゴムノキでも同様にビタミンＥの生合成に関与すると評価することができる。
【００５７】
なお、導入する遺伝子の種類によって、形質転換体のトコトリエノール含有量とトコフェノール含有量の両方が増量する場合もあるが、いずれか一方が増量し、他方が減量する場合もある。例えば、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した場合には、形質転換体中のトコトリエノール含有量は増大するものの、トコフェロール含有量は低下する場合がある。
【００５８】
形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量の測定は、常法により行うことができる。例えば、ソクスレー抽出によりペリプロカのツルから得られた抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）等の分析機器を用いて、トコトリエノールやトコフェノールを分析することができる。また、トコトリエノールやトコフェノールの標準品を用いて検量線を作成することにより、トコトリエノール含有量やトコフェノール含有量を定量することができる。
【００５９】
本発明のパラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法（以下、本発明のビタミンＥ生合成促進方法、ということがある。）は、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする。
【００６０】
従来は、パラゴムノキにおいてある特定の機能を有する遺伝子であるか否かを調べるためには、当該遺伝子をパラゴムノキに直接導入し、形質転換体を得た後、この形質転換体を解析することにより、行われていた。つまり、ある遺伝子がパラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを調べるためには、当該遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体を取得し、この形質転換体のビタミンＥ含有量を測定しなければならなかった。
しかしながら、パラゴムノキは形質転換効率が非常に低く、このため、形質転換体自体を取得することが困難であるため、多数の候補遺伝子について解析を行うことは非常に困難である。
【００６１】
これに対して、本発明においては、多数の候補遺伝子を、まず、形質転換体を取得し易いペリプロカに導入し、少なくともペリプロカのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であることが確認された遺伝子をパラゴムノキに導入するため、非常に高い確率で、パラゴムノキのビタミンＥ生合成を促進することができる。
【００６２】
言い換えれば、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することにより、非常に高い確率で、ビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を得ることができる。このようにして得られたパラゴムノキの形質転換体は、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されているために、ビタミンＥ含有量が高いラテックスを産生する。よって、本発明のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体から、ビタミンＥの抗酸化作用により、ゴムの老化防止効果が高められた高機能のラテックスを採取し得ることが期待できる。
【００６３】
パラゴムノキの形質転換体の作製は、前述のペリプロカと同様に、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。例えば、ゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をすることにより、本発明の評価方法によってパラゴムノキのビタミンＥ生合成遺伝子であると評価された遺伝子を導入したパラゴムノキの形質転換体を作製することができる。
【００６４】
ビタミンＥ含有量の高いラテックスを産出する形質転換体を得るために、本発明の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥ生合成遺伝子であると評価された遺伝子を、乳管特異的プロモーターの下流に組み込んだ組み換えベクターを、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いてパラゴムノキへ導入することも好ましい。
【００６５】
本発明においては、ビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体として、特に、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入された形質転換体であることが好ましい。これらの遺伝子は、パラゴムノキ以外の生物種由来の遺伝子であってもよいが、パラゴムノキ由来の遺伝子であることが好ましく、図２、４、６、１０、及び１４に示した塩基配列を有する遺伝子又はその改変遺伝子であることより好ましく、図２、４、６、１０、及び１４に示した塩基配列を有する遺伝子又はその変異遺伝子であることがさらに好ましい。
【００６６】
例えば、図１４に示した塩基配列を有するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより得られるパラゴムノキの形質転換体は、ビタミンＥ生合成のうち、特にトコトリエノール生合成が促進される。よって、当該遺伝子が導入された形質転換体から採取されるラテックスは、当該遺伝子が導入されていないパラゴムノキに比べて、トコトリエノール含有量が高いことが期待できる。
【実施例】
【００６７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実施例１］
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｏｍｏｇｅｎｔｉｓａｔｅ ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＨＧＧＴ）をコードするパラゴムノキ由来の遺伝子であって、図１４に示す塩基配列（配列番号１３）を有するＨＧＧＴ遺伝子が、ビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを、本発明の評価方法により評価した。
なお、ペリプロカは、国立大学法人九州大学玉泉研究室においてクローン増殖したペリプロカの野生株を用いた。
【００６９】
＜ペリプロカの形質転換体の作製＞
まず、ＧＦＰをコードするＧＦＰ遺伝子のＣ末端にＨＧＧＴをコードするＨＧＧＴ遺伝子を結合させたＧＦＰ−ＨＧＧＴキメラ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子であるｎｐｔII遺伝子とを組み込んだＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子含有バイナリーベクターを作製し、これを、アグロバクテリウムにおいて汎用されているアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株に導入し、ＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを作製した。
次いで、ペリプロカの無菌苗の胚軸部分を５ｍｍ程度に切断し、これをＧＦＰ−ＨＧＧＴ遺伝子導入アグロバクテリウムを含む感染液に接触させて感染させた後、これを培地で遮光条件下、２５℃で３日間培養した。
感染により遺伝子を導入したペリプロカは、カナマイシン耐性選択培地で、さらに２５℃、明期１６時間の条件下で培養した。これらのペリプロカの胚軸の切り口部分に発生するカルスのうち、ＧＦＰ蛍光を発するカルスを選抜し、培養を継続してシュートを伸長させた。
伸長したシュートを試験管内で発根させ、形質転換体の幼植物体を取得した。これらの幼植物体は、１０ｃｍ程度に生長した時点で、馴化用土に移植し、隔離温室で馴化栽培を実施した。なお、隔離温室栽培は、日本植生株式会社（岡山県津山市）に依頼し、室温２５℃、照度制御した隔離温室下で育成した。
【００７０】
得られた形質転換体に、実際にＨＧＧＴ遺伝子が導入されているかどうかを、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ分析により確認した。具体的には、ＧＦＰ蛍光を発する再分化した幼植物体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により検出することによって、ＨＧＧＴ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の有無を確認した。
この結果、ＧＦＰ蛍光を発する幼植物体の全てにおいてＧＦＰ遺伝子が導入されていることが確認された。一方で、ＨＧＧＴ遺伝子は、ＧＦＰ蛍光を発する幼植物体の８３％において導入が確認された。
図１６は、ＨＧＧＴ遺伝子のＧｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物を、電気泳動後核酸染色することにより得られた染色像である。ＰＣＲ産物が、染色されたバンドとして検出されている。この結果、ＧＦＰ蛍光を発する２３個の形質転換体のうち、１９個の形質転換体において、バンドが検出され、ＨＧＧＴ遺伝子の導入が確認された。
【００７１】
さらに、ＨＧＧＴ遺伝子が導入された個体のビタミンＥ含有量を測定した。具体的には、馴化後２ヶ月経過した時点で、伸長したツルを摘み取り、褐変した葉や損傷葉を除去したものを、分析用試料とした。これらの試料の湿重量を秤量した後、ソクスレー抽出した。ＨＰＬＣにより、この抽出物中のトコフェロール及びトコトリエノールを分析した。α、β、γ、δ体それぞれのトコフェロール及びトコトリエノールの標準品を用いて検量線を作成し、各成分の定量を行った。また、対照として、ペリプロカの野生株から採取した葉に対しても、同様にビタミンＥの各種成分の定量分析を行った。
図１７は、各個体のα−トコフェロール（ＴＰ−α）、γ−トコフェロール（ＴＰ−γ）、α−トコトリエノール（ＴＴ−α）、及びγ−トコトリエノール（ＴＴ−γ）の含有量を示した図である。この結果、野生株においては、α−トコフェロールのみが存在していた。一方、個体Ｎｏ．２１、２５、２６、８３、及び８５は、ＨＧＧＴ遺伝子導入が確認されなかった個体であり、それ以外のＨＧＧＴ遺伝子が導入された形質転換体においては、９０％の確率でα−トコトリエノールの存在が確認できた。また、一部の個体においては、微量のγ−トコトリエノールが存在することも明確となった。
【００７２】
これらの結果から、ＨＧＧＴ遺伝子の導入により、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸から、２−メチル−６−ゲラニルゲラニルベンゾキノンを経由してα−及びγ−トコトリエノールを合成する反応が促進されたことが明らかであり、ＨＧＧＴ遺伝子が、ラゴムノキにおいてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された。
よって、ＨＧＧＴ遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、トコトリエノール生合成を促進することができ、このＨＧＧＴ遺伝子が導入されたパラゴムノキの形質転換体からは、トコトリエノール含有量の高いラテックスが採取できることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、植物体中のビタミンＥ生合成が促進されたパラゴムノキの形質転換体を効率よく作製することができるため、特に天然ゴムの産生の分野で有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする、ビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項３】
評価対象である遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、前記形質転換体を作製することを特徴とする請求項１又は２記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする、パラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体。
【請求項６】
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体。
【請求項１】
ある遺伝子が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）においてビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であるか否かを評価する方法であって、
評価対象である遺伝子を導入したペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ）の形質転換体を作製し、当該形質転換体のトコトリエノール含有量又はトコフェノール含有量が、遺伝子導入前のペリプロカに比べて増量している場合に、当該遺伝子がパラゴムノキのビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価することを特徴とする、ビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、パラゴムノキ由来の遺伝子又はその変異遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項３】
評価対象である遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを使用して、前記形質転換体を作製することを特徴とする請求項１又は２記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子を、パラゴムノキに導入することを特徴とする、パラゴムノキのビタミンＥ生合成促進方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載のビタミンＥ生合成遺伝子の評価方法により、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のビタミンＥの生合成に関与する遺伝子であると評価された遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体。
【請求項６】
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、及びホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子又はその変異遺伝子が導入されたことを特徴とするパラゴムノキの形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−１８７５８９（Ｐ２０１０−１８７５８９Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３４６２７（Ｐ２００９−３４６２７）
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム・省エネルギー技術開発プログラム／植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発／パラゴムノキのゴム生産制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム・省エネルギー技術開発プログラム／植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発／パラゴムノキのゴム生産制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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