ビニルインダゾリル化合物
本発明は、癌の治療に有用なビニルインダゾリル化合物を提供する。
（Ｉ）
（Ｉ）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（該当なし）
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、発達および血管形成の間の形態形成などの多くの生理学的プロセスの重要なメディエーターとして認識されている。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーは、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、疎水性膜貫通領域およびチロシンキナーゼドメインを含有する細胞質部分からなる糖タンパク質である、４つのメンバー（ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４）からなる。ＦＧＦ結合は、ＦＧＦＲ二量化、その後の受容体自己リン酸化および下流シグナル伝達経路の活性化を導く。受容体活性化は、細胞増殖、細胞代謝および細胞生存などの多様なプロセスの調節に関与する特定の下流シグナル伝達パートナーの動員および活性化には十分である。従って、ＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナル伝達経路は、腫瘍細胞増殖、移動、浸潤、および血管形成に不可欠である多くの生物学的プロセスに対して多面的効果を有する。
【０００３】
ビニルインダールは癌の治療のために当該技術分野において公知である。例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと。ＦＧＦＲ阻害剤もまた、当該技術分野において公知である。例えば、特許文献３を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０２１０１３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３１０１９６８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２０２２５９８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌などの増殖性疾患、ならびに、特に、ＦＧＦおよび／またはＦＧＦＲ異常調節によって媒介される疾患の治療のための臨床用途を有すると考えられる新規のビニルインダゾリル化合物を提供する。
【０００６】
さらに、本発明の特定の化合物は、いくつかの以前に知られているＦＧＦＲ阻害剤と比べて優れたＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３有効性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００８】
本発明はまた、（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
本発明は、哺乳動物における、乳癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の化合物または塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に本発明の化合物または塩を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物はさらに、１つ以上の他の治療剤を含む。
【００１１】
本発明はまた、治療に使用するための本発明の化合物または塩を提供する。さらに、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における本発明の化合物または塩の使用を提供する。特に、それらの癌は、乳癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫ＡＭＬ、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される。より特に、癌は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される。最も特に、癌は非小細胞肺癌である。最も特に、癌は胃癌である。最も特に、癌は多発性骨髄腫である。さらに、本発明は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される癌を治療するための医薬組成物であって、活性成分として本発明の化合物または塩を含む、医薬組成物を提供する。
【００１２】
当業者は、ラセミ化合物の（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールは、（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノールの代わりにラセミ化合物の１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノールから開始する（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールについて記載されているように実質的に製造され得ることを理解するだろう。
【００１３】
さらに、当業者は、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールが１つのキラル中心を含有することを理解するだろう。（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールが単一の鏡像異性体として存在することが好ましい。単一の鏡像異性体は、キラル試薬で開始するか、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術により調製され得る。代替として、単一の鏡像異性体は、標準的なキラルクロマトグラフィーまたは結晶化技術によって混合物から単離され得る。
【００１４】
本発明の全ての化合物は塩を形成できることは当業者により理解されるだろう。本発明の化合物はアミンであり、従って、多くの無機酸および有機酸のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。かかる薬学的に許容される酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照のこと。
【００１５】
本発明の化合物は、以下の調製例および実施例に示すように調製され得る。以下の調製例および実施例の命名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １０．０における構造名の命名機能を用いて行う。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
調製例１
１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール
３つ口の１２Ｌの丸底フラスコに、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，３Ｌ）およびジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ，３１５ｍＬ，２．２４ｍｏｌ）を加え、−７８℃まで冷却する。ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中に１．６Ｍ，１４００ｍＬ，２．２４ｍｏｌ）をゆっくりと加える。添加が完了した後、温度を−７８℃に安定させ、３，５−ジクロロピリジン（２９６．７ｇ，２．００ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えると、赤さび色の懸濁液に変化する黄色溶液をすぐに形成する。添加が完了した後、温度を−７８℃に安定させ、ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のアセトアルデヒド（２３０ｍＬ，４．０５ｍｏｌ）をゆっくりと加える。−７８℃で撹拌し続ける。３時間後、ドライアイス浴を除去し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１Ｌ）を滴下して加えることにより反応をクエンチし始める。反応物を一晩撹拌しながら室温（ＲＴ）まで加温する。混合物を、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ，２Ｌ）、飽和塩化アンモニウム水溶液（１Ｌ）および水（２Ｌ）で希釈する。有機物を分離させ、飽和塩化ナトリウム水溶液（ブライン）で洗浄する。ＭＴＢＥ（１．５Ｌ）で水相を抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー［ヘキサン中の２５％酢酸エチル（ＥＡ）］により残留物を精製して、赤色の油状物として標題の化合物を得る。収量：３５２ｇ（９０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋１］＋。
【００１７】
調製例２
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール
上記の反応において得た立体異性体の混合物を、９０％ヘプタン／１０％エタノールで溶出するＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈカラムで分離する。ピーク２は所望の鏡像異性体である。絶対配置を確立するために、生成物のサンプルをＣＤＣｌ３（最終濃度１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解する。ＢａＦ２ウィンドウおよび１００ｍｍの経路長を備えるＩＲセルを用いてＣｈｉｒａｌＩＲ ＦＴ ＶＣＤ分光計（ＢｉｏＴｏｏｌｓ Ｉｎｃ（登録商標））を用いて４ｃｍ−１の分解能で振動円二色性（ＶＣＤ）および赤外線（ＩＲ）スペクトルを得る。１５０μＬのサンプルを用いて６時間、ＶＣＤおよびＩＲを収集する。平滑化またはさらなるデータ処理をせずにデータを提示する。Ｌｉｎｕｘ（登録商標）クラスターでＢ３ＰＷ９１／６−３１Ｇ＊＊レベルにおけるガウス分布によって、最も低いエネルギーの配座異性体を最適化することにより振動周波数および振動吸収ならびにＶＣＤ強度を得、６ｃｍ−１振動円二色性のローレンツ帯域幅を用いて対応するスペクトルをシミュレートする。上記の分析はＳ異性体である生成物を示す。収量：８４．３７ｇ（２７％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋１］＋。
【００１８】
調製例３
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エチルメタンスルホネート
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール（５．０２ｇ，２６．１４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ，１００ｍＬ）に溶解し、氷浴中でフラスコを冷却する。トリエチルアミン（ＴＥＡ，３．５ｍＬ，２５．１１ｍｍｏｌ）を加え、続いてメタンスルホニルクロリド（２．２ｍＬ，２８．４２ｍｍｏｌ）を滴下して加える。氷浴を除去し、反応物をＲＴまで加温する。４時間後、水（１００ｍＬ）で反応物をクエンチし、層を分離する。ＤＣＭ（５０ｍＬ）、続いて２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／クロロホルム（５０ｍＬ）で水層を抽出する。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。収量：７．１５ｇ，（１００％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ２７０［Ｍ＋１］＋。
【００１９】
調製例４
４−ヨード−１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール
磁気撹拌バー、窒素ブランケットおよび内部温度プローブを備える１Ｌの３つ口フラスコ中で、２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（３４ｇ，１５６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＡＣＮ，４００ｍＬ）に溶解する。４−ヨードピラゾール（２９．３４ｇ，１４９．７４ｍｍｏｌ）、続いて炭酸セシウム（７３．４ｇ，２２３．０２ｍｍｏｌ）を加える。混合物をＲＴで１８時間撹拌する。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で反応混合物を濾過し、濾過ケーキをＡＣＮで洗浄し、濾液を金色の油状物まで濃縮する。さらに精製せずに使用する。収量：４７．８１９ｇ（９９％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ３２３［Ｍ＋１］＋。
【００２０】
調製例５
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１Ｈ−インダゾール
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，２．５０Ｌ）、５−ヒドロキシインダゾール（１５０．２０ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）および１Ｈ−イミダゾール（１１４．３５ｇ，１．６８ｍｏｌ）を１０Ｌの反応槽に入れる。混合物を０℃まで冷却し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（２５３．１６ｇ，１．６８ｍｏｌ）を０．５時間にわたって加える。混合物を１８℃で３時間撹拌する。約２０℃での内部温度を維持するために５℃で氷浴を用いて水（２．５Ｌ）を反応物にゆっくりと加える。混合物を分液漏斗に移し、ＥＡ（２×２．５Ｌ）で抽出する。抽出物を合わせ、水（３×２．５Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、赤色の油状物まで蒸発させる。油状物をシリカゲルパッドに通し、溶出液（ヘキサン中に０％〜３０％のＥＡ）で溶出して、結晶化する橙色の油状物として標題の化合物を得る。収量：３００ｇ（１００％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ２４９［Ｍ＋１］＋。
【００２１】
調製例６
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１Ｈ−インダゾール
１０Ｌのジャケット型反応槽中で、ＤＣＭ（４．００Ｌ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１Ｈ−インダゾール（３００．００ｇ，１．２１ｍｏｌ）の溶液を１０℃まで冷却する。得られた溶液に、Ｎ−ヨードスクシンイミド（２９８．８９ｇ，１．３３ｍｏｌ）を０．５時間にわたって一部分ずつ加える。混合物をＲＴで３時間撹拌して、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって示されるように完全な変換を得る。混合物を１０℃まで冷却し、水（２．５Ｌ）でクエンチする。混合物を分液漏斗に移し、ＤＣＭ（２．５）中で水層を抽出する。合わせた有機抽出物を１０％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（５Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、橙色の固体として標題の化合物を得る。収量：３８８ｇ（９０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ３７５［Ｍ＋１］＋。
【００２２】
調製例７
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール
１０Ｌのジャケット型反応槽中で、ＤＣＭ（２．５０Ｌ）およびＴＨＦ（１．００Ｌ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１Ｈ−インダゾール（３８７．００ｇ，１．０８ｍｏｌ）の溶液を１０℃まで冷却する。得られた混合物に、メタンスルホン酸（１４．０ｍＬ，２１６．０２ｍｏｌ）、続いて３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２９６ｍＬ，３．２４ｍｏｌ）を、０．５時間にわたって加え、わずかな発熱を観測する。混合物をＲＴで３時間撹拌する。反応物を１０℃まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２Ｌ）でクエンチする。混合物を水（２Ｌ）で希釈し、水層をＤＣＭ（２Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出物を水（２Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。溶出液（０〜１０％のＥＡ／ヘキサン）を用いてシリカゲルパッドを通して残留物を溶出して、標題の化合物を得る。収量：１５０ｇ（３１％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４５９［Ｍ＋１］＋。
【００２３】
調製例８
（Ｅ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール−５−オール
磁気撹拌棒、温度プローブ、およびセプタムを有する冷却器を備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコ中で、ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（１４ｇ，３０．５４ｍｍｏｌ）の混合物を、１０分間窒素でスパージする。得られた溶液に、トリブチルアミン（ＴＢＡ，６．７ｇ，３６．１ｍｍｏｌ）および４，４，５，５−テトラメチル−２−ビニル−１，３，２−ジオキサボロラン（７．０ｇ，４３．１８ｍｍｏｌ）を加え、１０分間スパージを継続する。得られた混合物に、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（０．４５ｇ，０．６３ｍｍｏｌ）を加え、さらに０．５時間スパージを継続する。混合物を９５〜１００℃にて１８時間加熱する。反応混合物を４０℃以下に冷却し、４−ヨード−１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール（９．８ｇ，３０．４２ｍｍｏｌ）を入れる。得られた混合物に、水酸化バリウム八水和物（１９．３ｇ，６０．３ｍｍｏｌ）および水（１３ｍＬ）を加え、１０分間スパージを継続する。１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンパラジウム（ＩＩ）クロリドＤＣＭ錯体（１．３ｇ，１．５６ｍｍｏｌ）を反応物に加え、０．５時間スパージを継続する。混合物を９５℃にて窒素下で３時間加熱する。混合物をＥＡで希釈し、セライト（登録商標）パッドで濾過する。ブライン（４００ｍＬ）でパッドを洗浄し、濾液層を分離する。有機層をブラインで洗浄し、合わせた水層をＥＡで抽出する。有機溶液を合わせ、茶色の油状物まで濃縮する。油状物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルパッドに加える。溶出液（ヘキサン中に５０％のＥＡ、続いてヘキサン中に７０％のＥＡ）でパッドを溶出して、淡い茶色の油状物を得る。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で粉砕して、固体として標題の化合物を得る。収量：５ｇ（３７％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４３９［Ｍ＋１］＋。
【００２４】
調製例９
５−（（Ｒ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（（Ｅ）−２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール
内部温度プローブ、還流冷却器、窒素ブランケットおよび磁気撹拌バーを備えた３つ口の２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、ＡＣＮ（９２ｍＬ）中で（Ｅ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール−５−オール（１０．０ｇ，２２．８３ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（７．８８ｇ，２３．９４ｍｍｏｌ）をスラリーにし、６０℃まで加温する。懸濁液に、（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エチルメタンスルホネート（７．０３ｇ，２６．０２ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌する。反応混合物をＲＴまで冷却し、濾過し、ＡＣＮで固体を洗浄する。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（２〜４％（メタノール中に２Ｍのアンモニア）／ＤＣＭ）により残留物を精製する。生成物の画分を合わせ、白色の泡状物まで真空下で濃縮する。収量：１２．５ｇ（８６％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ６１２［Ｍ＋１］＋。
【実施例】
【００２５】
実施例１
（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノール
【化１】
添加漏斗、窒素入口、内部温度プローブおよび磁気撹拌棒を備えた３つ口の２５０ｍＬ丸底フラスコにメタノール（５７ｍＬ）を入れ、氷浴中で冷却する。得られた溶液に、塩化アセチル（２０ｍＬ，２８１．０３ｍｍｏｌ）を添加漏斗を通してゆっくりと加える。その溶液に、メタノール（４０ｍＬ）に溶解した５−（（Ｒ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（（Ｅ）−２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール（７．１ｇ，１１．５９ｍｍｏｌ）を添加漏斗を介して加える。添加が完了した後、氷浴を除去し、ＲＴまで加温し、混合物を４時間撹拌する。反応混合物を真空下で黄色の泡状物まで濃縮する。黄色の泡状物をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０ｍＬ）にゆっくりと加える。ＲＴにて３０分間、混合物を撹拌する。混合物を濾過し、水（１００ｍＬ）で固体を洗浄し、真空下で乾燥させる。高温のＥＡ／メタノール／ヘキサンから固体を再結晶化して、白色の固体として標題の化合物を得る。収量：２．１ｇ（４１％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４４４［Ｍ＋１］＋。
【００２６】
ＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路の異常調節は、ヒト悪性腫瘍の多くの形態に関係している。ＦＧＦＲおよびＦＧＦは、しばしば、多数の癌において過剰発現し、それらの発現は、しばしば、不十分な予後に関連する。ＦＧＦＲキナーゼドメインにおける活性化突然変異は、乳癌、ＮＳＣＬＣ、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌および多発性骨髄腫を含む、いくつかの種類の腫瘍で見出されている。ＦＧＦＲ遺伝子座のゲノム増幅もまた、多くの乳癌、胃癌、および多発性骨髄腫の癌患者で検出された。ＦＧＦＲおよびＦＧＦの過剰発現もまた、膀胱癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、および肺癌などの多くの異なる種類の腫瘍で見出されている。ＦＧＦＲファミリー経路阻害剤治療が有効であり得る他の癌としては、ＡＭＬ、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌が挙げられる。腫瘍形成および進行におけるそれらの役割に加えて、ＦＧＦおよびＦＧＦＲはまた、特に腫瘍増殖の間の血管形成の重要な調節因子である。ＦＧＦ／ＦＧＦＲ軸もまた、癌関連線維芽細胞などの他の腫瘍間質細胞を増大させるのに重要な役割を果たす。ＦＧＦの上方制御もまた、抗血管形成および他の化学療法に対する耐性を生じる。最終的に、ＦＧＦＲの低分子阻害剤は、いくつかの臨床前腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性が実証されており、診療所で診断されている。まとめると、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路は、癌細胞におけるいくつかの重要な細胞プロセスに不可欠である。これらの理由のために、ＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦシグナル伝達を標的とする治療は、直接腫瘍細胞に、および腫瘍の血管新生の両方に影響を及ぼし得る。
【００２７】
全ての例示した化合物を、以下のアッセイ：ＦＧＦＲ１酵素アッセイ（フィルター結合）、ＦＧＦＲ３酵素アッセイ（フィルター結合）、ＲＴ−１１２細胞ベースのアッセイにおけるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫ（ＢＳＡの存在下において）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞ベースアッセイにおけるＥＲＫリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＦＧＦＲのインビボ標的阻害アッセイ、およびＲＴ１１２ヒト膀胱および他の癌異種移植片モデルのうちの少なくとも１つにおいて以下に記載するように実質的に試験する。これらのアッセイは、試験される化合物がＦＧＦＲファミリー経路の阻害剤であり、抗癌活性を有することを実証する。
【００２８】
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素アッセイ（フィルター結合）
ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ３キナーゼ（０．１５ｎｇ／μＬのヒトＦＧＦＲ１または０．３２ｎｇ／μＬのヒトＦＧＦＲ３）を、１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５、８ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５、５．０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０．０μＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．５μＣｉ３３Ｐ−ＡＴＰ、および０．０５μｇ／μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）を含有する５０μＬのバッファー中でインキュベートする。反応を、ＲＴにて３０分間、５０μｌの容積で実施し、次いで１３０μＬの１０％Ｈ３ＰＯ４を加えることによってクエンチする。反応物（１２０μＬ）を、９６ウェルの１．０μｍのガラス繊維フィルタープレートに移し、ＲＴにて２０〜３０分インキュベートし、次いで０．５％Ｈ３ＰＯ４を含むＴＩＴＥＲＴＥＫ（登録商標）Ｚｏｏｍで３回洗浄する。ウェルを空気乾燥させ、その後４０μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）２０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、次いでＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｏｂｅｔａカウンタでカウントする。化合物阻害のために、化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭのストックとして提供する。化合物を、２０％ＤＭＳＯ中で１：３で連続希釈して、１０点濃度反応曲線を作成し、反応混合物をフィルタープレートに加える前に反応プレート中に１：５（４％最終ＤＭＳＯ濃度中に２０μＭ〜０．００１μＭ最終）で希釈して、化合物活性を決定する。コントロールウェルは４％ＤＭＳＯのみを含み、一方、ベースラインを、０．１Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するコントロールウェルによって確立する。１０の濃度の各々についての阻害パーセント値を、各プレートでコントロールウェルから算出し、１０点濃度反応データを、４パラメーターロジスティック式および得られた曲線フィットから推定される絶対ＩＣ５０値を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ）を用いて後で分析する。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素アッセイは、それぞれ、１．３８および１．４７の推定ＩＣ５０に関して最少有意差（ＭＳＲ）を有する。これらのアッセイにおけるＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３についての実施例１のＩＣ５０結果は、それぞれ、０．００７７および０．００６４μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が有効なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素阻害剤であることを実証する。
【００２９】
ＢＳＡを用いるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫ
ヒトＲＴ１１２膀胱癌細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ １００８２−１４７）およびＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３４０）中の１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ １５１４０−１２２）を補足した１００μＬのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ １１８７５−０８５）中の５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、増殖培地を除去し、２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足した１００μＬのＲＰＭＩ １６４０と取り換える。３７℃でのインキュベーションの３時間後、６％ＤＭＳＯ中の２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＲＰＭＩ １６４０中の２０μＬの３倍希釈した化合物を各ウェルに加える。これにより、１％ＤＭＳＯ中の１０〜０．００５μＭの範囲の１０点用量反応曲線を得た。インキュベーションを３７℃にて１時間継続する。細胞を、無血清ＲＰＭＩ中の５０μＬの５０μｇ／ｍＬのＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２７３−Ｆ９）溶液で刺激して、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９の最終濃度を得る。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（３．７％のホルムアルデヒド、最終濃度）中の３０μＬの２５％のホルムアルデヒド溶液を加えることにより細胞を固定し、ＲＴにて３０分インキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、続いて１００μＬの冷メタノールを加え、−２０℃にて３０分間インキュベートする。メタノールを除去し、細胞を、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＲＴにて１５分インキュベートする。次いで、細胞を、２％ＢＳＡ、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ Ｐ２８５０）、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６）、および０．０１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８３４０）を補足したＰＢＳ中の５０μＬの１：４００希釈のｐ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１０１Ｓ）中で穏やかに撹拌しながら４℃にて一晩インキュベートする。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回、およびＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％ＢＳＡおよび０．１％のホスファターゼ阻害剤カクテル１、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２、および０．０１％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳ中の８０μＬの１：１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）中で暗所で１時間ＲＴにてインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、続いてＰＢＳ中の１００μＬの１：２００希釈のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｐ−３５６６）を加え、次いで１時間暗所でインキュベートする。ウェル当たりのｐ−ＥＲＫ陽性細胞および全細胞を、Ａｌｅｘａ ４８８およびＰＩに関して、それぞれ光学フィルター５００〜５３０ｎＭおよび５７５〜６４０ｎＭを用いてＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｌｔｄ）で同定する。Ａｌｅｘａ ４８８値を用いるｐＥＲＫ／ウェルについての全平均強度を、続いて同じプレートで実施したＭＩＮ（ＤＭＳＯ中の１０μＭの陽性対照化合物）およびＭＡＸ（ＤＭＳＯのみ）対照から得た値を用いて阻害パーセントに変換する。阻害パーセント値および１０点濃度反応データを、続いて４パラメーターＳ字状用量反応式を用いて分析し、相対的ＩＣ５０値を得られた曲線から推定する。ＢＳＡアッセイを用いるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫは、２．７の推定ＩＣ５０について最少有意差（ＭＳＲ）を有する。このアッセイにおいて実施例１についてのＩＣ５０は０．０００４μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が、ヒト癌細胞におけるＦＧＦ９誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３０】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥＲＫリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＳｕｒｅＦｉｒｅ検出
ＦＧＦ受容体１の阻害に対する化合物の効果を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）刺激に応答するＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のリン酸化をモニターすることによって測定する。形成されたｐＥＲＫのレベルを、ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）システム（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＴＧＲＥＳ５０Ｋ）を用いて測定する。これは、リン酸化検体のイムノ−サンドイッチ捕捉、続いて増幅シグナルを生成するために抗体がコーティングされたＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いる検出を利用する均質アッセイフォーマットである。
【００３１】
ＨＵＶＥＣ細胞を回収し、１０％ＦＢＳ、０．４％ウシ脳抽出物、０．１％ヒドロコルチゾン、０．１％硫酸ゲンタマイシンアムホテリシン−Ｂ、および０．１％上皮増殖因子、７代継代までのヒト組換え体を補足した内皮細胞基礎培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＣ−３１３２）からなる増殖培地中に維持する。このアッセイについて、細胞を標準的な手段によって収集し、次いでカウントする。細胞（２０，０００／ウェル）を、９６ウェルＰｏｌｙ−Ｄ−リジンコーティングプレート（ＢＤ，３５４６４０）中の１００μＬの増殖培地に播種する。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。
【００３２】
そのアッセイの日に、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて３時間、１．５％ＦＢＳおよび２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１００μＬのＥＢＭ（内皮細胞基礎）培地中で血清飢餓し、次いで３７℃にて１時間、飢餓培地中で２０μＭの３倍希釈した化合物で処理する。これにより１％ＤＭＳＯ中の１０〜０．００５μＭの範囲の１０点濃度反応曲線を得た。化合物の処理の１時間後、細胞を、３７℃にて１５分間、５０μＬのｂ−ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ０２９１、最終ｂ−ＦＧＦ濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激する。細胞および５０μＬの刺激因子ｂ−ＦＧＦを含有するウェルにおいて、ＭＡＸシグナルを得、１０μＭの陽性対照化合物および５０μｌの刺激因子ｂ−ＦＧＦを有する細胞をＭＩＮとする。次いで、培地を除去し、５０μＬの１×ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）溶解バッファー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）キットコンポーネント）をウェルに加え、穏やかに撹拌しながらＲＴにて１０分間インキュベーションを継続する。ｐＥＲＫ検出のために、６μＬの溶解物および１０μＬの反応混合物（６０部の反応バッファー／１０部の活性化バッファー／０．６部のドナーおよびアクセプタービーズの各々、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６７６０６１７Ｒ）を、３８４ウェルプロキシプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６００６２８０）に移す。プレートを密封し、穏やかに撹拌しながらＲＴにて２時間インキュベートし、次いで標準的なＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）設定（Ｅｘ６８０ｎｍおよびＥｍ５２０−６２０ｎｍ）を用いてＴｕｒｂｏＭｏｄｕｌｅを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取る。放出データを、各プレート上のＭＡＸ（ＤＭＳＯのみ）およびＭＩＮ（ＤＭＳＯ中の１０μＭの陽性対照化合物）対照から決定される阻害パーセントに変換し、次いで１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（登録商標）４．０を用いて４パラメーターロジスティック式にフィットし、ＩＣ５０を推定する。ＥＲＫリン酸化（（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイのＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）検出は、２．１のＩＣ５０について最小有意差（ＭＳＲ）を有する。このアッセイにおける実施例１のＩＣ５０は、０．０００６μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が、ヒト臍帯内皮細胞におけるｂＦＧＦ誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３３】
ＦＧＦＲインビボ標的阻害アッセイ
雌のヌードマウス（ＣＤ１／ｎｕ／ｎｕ）を処置前の１週間馴化させる。動物を、陽性対照、陰性対照および化合物処置群に分類する。化合物（１０％アカシア中で製剤化した）、陽性対照（１０％アカシア）、および陰性対照（１０％アカシア）を強制経口投与する。化合物用量は０．１５〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。２時間後、化合物処置群および陽性対照群を、静脈内投与した生理食塩水中の新しく調製したマウスｂＦＧＦ（６μｇ／動物、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＰＭＧ００３３）で処置する。陰性対照群を、静脈内投与した生理食塩水で処置する。マウスを静脈内投与の１０分後に屠殺する。動物の心臓を収集し、１：１００希釈の阻害剤（ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ Ｓｉｇｍａ Ｐ２８５０；ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＳｉｇｍａ Ｐ８３４０）を含有する３００μＬの氷冷溶解バッファー（ＲＩＰＡ；Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ ＢＰ−１１５）中で１０秒間ホモジナイズする。ホモジネートを１５分間１４，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに移す。タンパク質レベルを、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ ＰＬＵＳ（商標）タンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ＃ １８５６２１０）により決定する。アッセイ手順は、製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと）。
【００３４】
心臓組織ホモジネートを、ＭＳＤ（登録商標）ホスホ−Ｅｒｋ ＥＬＩＳＡ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｎ４１ＣＢ−１）を用いて分析して、組織ホスホ−Ｅｒｋレベルを決定する。ＥＬＩＳＡ手順は、製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと；０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを溶解バッファーに加えることのみ変更）。陽性対照を最小ホスホ−Ｅｒｋ阻害（０％）として使用し、陰性対照を最大ホスホ−Ｅｒｋ阻害（１００％）として使用する。化合物で処置した群の阻害パーセントを、最大および最小阻害群に対して算出する。ＴＥＣ９０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での９０％阻害を達成するのに必要な濃度である。例えば、実施例１の化合物は２８ｎＭの推定ＴＥＣ９０を有する。このデータは、本発明の特定の化合物がインビボにおけるｂＦＧＦ誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３５】
Ｋｄｒに対するこの化合物の活性を評価するために、雌のヌードマウス（ＣＤ１／ｎｕ／ｎｕ）を馴化させ、ＶＥＧＦを、Ｋｄｒ自己リン酸化｛ＶＥＧＦ（６μｇ／動物、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ４９３−ＭＶ／ＣＦ）を誘導するために使用することを除いて上記のように処置する。心臓組織を収集し、上記のようにホモジナイズする。得られたホモジネートを、ＭＳＤ（登録商標）ホスホ−Ｋｄｒ ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｎ４１ＺＡ−１）を用いて分析して、組織ホスホ−Ｋｄｒレベルを決定する。ＥＬＩＳＡ手順は製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと；０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを溶解バッファーに加えることのみ変更）。陽性対照群を、（０％の最小ｐ−ＫＤＲ阻害として）静脈内に投与した生理食塩水中のＶＥＧＦ９６（μｇ／動物）で処置する。陰性対照群を、（１００％の最大ｐ−ＫＤＲ阻害として）静脈内に投与した生理食塩水で処置する。化合物で処置した群の阻害パーセントを、最大および最小阻害群に対して算出する。ＴＥＤ５０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での５０％阻害を達成するのに必要な用量である。例えば、実施例１の化合物は、１．３４ｍｇ／ｋｇの推定ＴＥＤ５０を有する。ＴＥＣ９０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での９０％阻害を達成するのに必要な濃度である。例えば、実施例１の化合物は、２５２ｎＭの推定ＴＥＣ９０を有する。このデータは、本発明の特定の化合物が、以前に知られている特定のＦＧＦＲ阻害剤に比べて、インビボにおけるＶＥＧＦ誘導性Ｋｄｒリン酸化の少しの有効な阻害剤であることを実証する。
【００３６】
異種移植片腫瘍モデル
ヒト膀胱癌細胞ＲＴ１１２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ヒト多発性骨髄腫細胞ＯＰＭ−２（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはヒト胃癌細胞ＳＮＵ−１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のうちの１つを、ＫＯＲＥＡＮ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥ ＢＡＮＫ（ＫＣＬＢ）の推奨に従って培養物中で増殖させ、収集し、ヌードマウスのひ腹に皮下注射する。腫瘍を形成（注入後７〜２１日）させて、動物を無作為化し、対照および試験群に分類する。試験化合物を、適切な媒体中（すなわち１０％アカシア中で製剤化した）で調製し、試験化合物および媒体対照を強制経口投与する。腫瘍反応を、処置課程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定により決定し、腫瘍体積対媒体対照群の阻害パーセントとして報告する。実施例１の化合物は、いくつかの異種移植片腫瘍モデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を実証する。例えば、膀胱腫瘍モデル（ＲＴ−１１２）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、４１．３％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８５．９％の阻害が達成された。胃腫瘍モデル（ＳＮＵ−１６）において、３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＱＤ）で投与した場合、６２％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８３％の阻害が達成された。多発性骨髄腫瘍モデル（ＯＰＭ−２）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、６８％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８４％の阻害が達成された。ＮＳＣＬＣ腫瘍モデル（ＮＣＩ−Ｈ４６０）において、３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＱＤ）で投与した場合、４６％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＢＩＤ）で投与した場合、６９％の阻害が達成された。膵臓腫瘍モデル（ＢｘＰＣ−３）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、１％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、５５％の阻害が達成された。このデータは、本発明の特定の化合物がいくつかの動物モデルにおける異種移植片ヒト腫瘍増殖の阻害剤であることを実証する。
【００３７】
本発明の化合物は、好ましくは、種々の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、かかる組成物は、経口または静脈内投与用である。かかる医薬組成物およびそれを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ｄ．Ｔｒｏｙら，ｅｄｓ．，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照のこと。
【００３８】
本発明の化合物は、通常、広範囲の用量で効果的である。例えば、通常、１日当たりの用量は、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。一部の例において、上述の範囲の下限値より低い用量レベルが十分以上であってもよく、他の場合において、さらに高い用量が、いかなる有害な副作用も引き起こさずに利用されてもよく、従って、上記の用量範囲は本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物（複数も含む）、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況を考慮して医師によって決定されることは理解されるだろう。
【技術分野】
【０００１】
（該当なし）
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、発達および血管形成の間の形態形成などの多くの生理学的プロセスの重要なメディエーターとして認識されている。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーは、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、疎水性膜貫通領域およびチロシンキナーゼドメインを含有する細胞質部分からなる糖タンパク質である、４つのメンバー（ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４）からなる。ＦＧＦ結合は、ＦＧＦＲ二量化、その後の受容体自己リン酸化および下流シグナル伝達経路の活性化を導く。受容体活性化は、細胞増殖、細胞代謝および細胞生存などの多様なプロセスの調節に関与する特定の下流シグナル伝達パートナーの動員および活性化には十分である。従って、ＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナル伝達経路は、腫瘍細胞増殖、移動、浸潤、および血管形成に不可欠である多くの生物学的プロセスに対して多面的効果を有する。
【０００３】
ビニルインダールは癌の治療のために当該技術分野において公知である。例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと。ＦＧＦＲ阻害剤もまた、当該技術分野において公知である。例えば、特許文献３を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０２１０１３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３１０１９６８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２０２２５９８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌などの増殖性疾患、ならびに、特に、ＦＧＦおよび／またはＦＧＦＲ異常調節によって媒介される疾患の治療のための臨床用途を有すると考えられる新規のビニルインダゾリル化合物を提供する。
【０００６】
さらに、本発明の特定の化合物は、いくつかの以前に知られているＦＧＦＲ阻害剤と比べて優れたＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３有効性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００８】
本発明はまた、（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
本発明は、哺乳動物における、乳癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の化合物または塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に本発明の化合物または塩を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物はさらに、１つ以上の他の治療剤を含む。
【００１１】
本発明はまた、治療に使用するための本発明の化合物または塩を提供する。さらに、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における本発明の化合物または塩の使用を提供する。特に、それらの癌は、乳癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫ＡＭＬ、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される。より特に、癌は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される。最も特に、癌は非小細胞肺癌である。最も特に、癌は胃癌である。最も特に、癌は多発性骨髄腫である。さらに、本発明は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌からなる群から選択される癌を治療するための医薬組成物であって、活性成分として本発明の化合物または塩を含む、医薬組成物を提供する。
【００１２】
当業者は、ラセミ化合物の（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールは、（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノールの代わりにラセミ化合物の１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノールから開始する（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールについて記載されているように実質的に製造され得ることを理解するだろう。
【００１３】
さらに、当業者は、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールが１つのキラル中心を含有することを理解するだろう。（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールが単一の鏡像異性体として存在することが好ましい。単一の鏡像異性体は、キラル試薬で開始するか、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術により調製され得る。代替として、単一の鏡像異性体は、標準的なキラルクロマトグラフィーまたは結晶化技術によって混合物から単離され得る。
【００１４】
本発明の全ての化合物は塩を形成できることは当業者により理解されるだろう。本発明の化合物はアミンであり、従って、多くの無機酸および有機酸のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。かかる薬学的に許容される酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照のこと。
【００１５】
本発明の化合物は、以下の調製例および実施例に示すように調製され得る。以下の調製例および実施例の命名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １０．０における構造名の命名機能を用いて行う。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
調製例１
１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール
３つ口の１２Ｌの丸底フラスコに、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，３Ｌ）およびジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ，３１５ｍＬ，２．２４ｍｏｌ）を加え、−７８℃まで冷却する。ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中に１．６Ｍ，１４００ｍＬ，２．２４ｍｏｌ）をゆっくりと加える。添加が完了した後、温度を−７８℃に安定させ、３，５−ジクロロピリジン（２９６．７ｇ，２．００ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えると、赤さび色の懸濁液に変化する黄色溶液をすぐに形成する。添加が完了した後、温度を−７８℃に安定させ、ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のアセトアルデヒド（２３０ｍＬ，４．０５ｍｏｌ）をゆっくりと加える。−７８℃で撹拌し続ける。３時間後、ドライアイス浴を除去し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１Ｌ）を滴下して加えることにより反応をクエンチし始める。反応物を一晩撹拌しながら室温（ＲＴ）まで加温する。混合物を、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ，２Ｌ）、飽和塩化アンモニウム水溶液（１Ｌ）および水（２Ｌ）で希釈する。有機物を分離させ、飽和塩化ナトリウム水溶液（ブライン）で洗浄する。ＭＴＢＥ（１．５Ｌ）で水相を抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー［ヘキサン中の２５％酢酸エチル（ＥＡ）］により残留物を精製して、赤色の油状物として標題の化合物を得る。収量：３５２ｇ（９０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋１］＋。
【００１７】
調製例２
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール
上記の反応において得た立体異性体の混合物を、９０％ヘプタン／１０％エタノールで溶出するＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈカラムで分離する。ピーク２は所望の鏡像異性体である。絶対配置を確立するために、生成物のサンプルをＣＤＣｌ３（最終濃度１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解する。ＢａＦ２ウィンドウおよび１００ｍｍの経路長を備えるＩＲセルを用いてＣｈｉｒａｌＩＲ ＦＴ ＶＣＤ分光計（ＢｉｏＴｏｏｌｓ Ｉｎｃ（登録商標））を用いて４ｃｍ−１の分解能で振動円二色性（ＶＣＤ）および赤外線（ＩＲ）スペクトルを得る。１５０μＬのサンプルを用いて６時間、ＶＣＤおよびＩＲを収集する。平滑化またはさらなるデータ処理をせずにデータを提示する。Ｌｉｎｕｘ（登録商標）クラスターでＢ３ＰＷ９１／６−３１Ｇ＊＊レベルにおけるガウス分布によって、最も低いエネルギーの配座異性体を最適化することにより振動周波数および振動吸収ならびにＶＣＤ強度を得、６ｃｍ−１振動円二色性のローレンツ帯域幅を用いて対応するスペクトルをシミュレートする。上記の分析はＳ異性体である生成物を示す。収量：８４．３７ｇ（２７％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋１］＋。
【００１８】
調製例３
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エチルメタンスルホネート
（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エタノール（５．０２ｇ，２６．１４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ，１００ｍＬ）に溶解し、氷浴中でフラスコを冷却する。トリエチルアミン（ＴＥＡ，３．５ｍＬ，２５．１１ｍｍｏｌ）を加え、続いてメタンスルホニルクロリド（２．２ｍＬ，２８．４２ｍｍｏｌ）を滴下して加える。氷浴を除去し、反応物をＲＴまで加温する。４時間後、水（１００ｍＬ）で反応物をクエンチし、層を分離する。ＤＣＭ（５０ｍＬ）、続いて２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／クロロホルム（５０ｍＬ）で水層を抽出する。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。収量：７．１５ｇ，（１００％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ２７０［Ｍ＋１］＋。
【００１９】
調製例４
４−ヨード−１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール
磁気撹拌バー、窒素ブランケットおよび内部温度プローブを備える１Ｌの３つ口フラスコ中で、２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（３４ｇ，１５６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＡＣＮ，４００ｍＬ）に溶解する。４−ヨードピラゾール（２９．３４ｇ，１４９．７４ｍｍｏｌ）、続いて炭酸セシウム（７３．４ｇ，２２３．０２ｍｍｏｌ）を加える。混合物をＲＴで１８時間撹拌する。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で反応混合物を濾過し、濾過ケーキをＡＣＮで洗浄し、濾液を金色の油状物まで濃縮する。さらに精製せずに使用する。収量：４７．８１９ｇ（９９％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ３２３［Ｍ＋１］＋。
【００２０】
調製例５
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１Ｈ−インダゾール
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，２．５０Ｌ）、５−ヒドロキシインダゾール（１５０．２０ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）および１Ｈ−イミダゾール（１１４．３５ｇ，１．６８ｍｏｌ）を１０Ｌの反応槽に入れる。混合物を０℃まで冷却し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（２５３．１６ｇ，１．６８ｍｏｌ）を０．５時間にわたって加える。混合物を１８℃で３時間撹拌する。約２０℃での内部温度を維持するために５℃で氷浴を用いて水（２．５Ｌ）を反応物にゆっくりと加える。混合物を分液漏斗に移し、ＥＡ（２×２．５Ｌ）で抽出する。抽出物を合わせ、水（３×２．５Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、赤色の油状物まで蒸発させる。油状物をシリカゲルパッドに通し、溶出液（ヘキサン中に０％〜３０％のＥＡ）で溶出して、結晶化する橙色の油状物として標題の化合物を得る。収量：３００ｇ（１００％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ２４９［Ｍ＋１］＋。
【００２１】
調製例６
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１Ｈ−インダゾール
１０Ｌのジャケット型反応槽中で、ＤＣＭ（４．００Ｌ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１Ｈ−インダゾール（３００．００ｇ，１．２１ｍｏｌ）の溶液を１０℃まで冷却する。得られた溶液に、Ｎ−ヨードスクシンイミド（２９８．８９ｇ，１．３３ｍｏｌ）を０．５時間にわたって一部分ずつ加える。混合物をＲＴで３時間撹拌して、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって示されるように完全な変換を得る。混合物を１０℃まで冷却し、水（２．５Ｌ）でクエンチする。混合物を分液漏斗に移し、ＤＣＭ（２．５）中で水層を抽出する。合わせた有機抽出物を１０％のチオ硫酸ナトリウム水溶液（５Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、橙色の固体として標題の化合物を得る。収量：３８８ｇ（９０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ３７５［Ｍ＋１］＋。
【００２２】
調製例７
５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール
１０Ｌのジャケット型反応槽中で、ＤＣＭ（２．５０Ｌ）およびＴＨＦ（１．００Ｌ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１Ｈ−インダゾール（３８７．００ｇ，１．０８ｍｏｌ）の溶液を１０℃まで冷却する。得られた混合物に、メタンスルホン酸（１４．０ｍＬ，２１６．０２ｍｏｌ）、続いて３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２９６ｍＬ，３．２４ｍｏｌ）を、０．５時間にわたって加え、わずかな発熱を観測する。混合物をＲＴで３時間撹拌する。反応物を１０℃まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２Ｌ）でクエンチする。混合物を水（２Ｌ）で希釈し、水層をＤＣＭ（２Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出物を水（２Ｌ）およびブラインで洗浄する。有機混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮する。溶出液（０〜１０％のＥＡ／ヘキサン）を用いてシリカゲルパッドを通して残留物を溶出して、標題の化合物を得る。収量：１５０ｇ（３１％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４５９［Ｍ＋１］＋。
【００２３】
調製例８
（Ｅ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール−５−オール
磁気撹拌棒、温度プローブ、およびセプタムを有する冷却器を備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコ中で、ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ヨード−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（１４ｇ，３０．５４ｍｍｏｌ）の混合物を、１０分間窒素でスパージする。得られた溶液に、トリブチルアミン（ＴＢＡ，６．７ｇ，３６．１ｍｍｏｌ）および４，４，５，５−テトラメチル−２−ビニル−１，３，２−ジオキサボロラン（７．０ｇ，４３．１８ｍｍｏｌ）を加え、１０分間スパージを継続する。得られた混合物に、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（０．４５ｇ，０．６３ｍｍｏｌ）を加え、さらに０．５時間スパージを継続する。混合物を９５〜１００℃にて１８時間加熱する。反応混合物を４０℃以下に冷却し、４−ヨード−１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール（９．８ｇ，３０．４２ｍｍｏｌ）を入れる。得られた混合物に、水酸化バリウム八水和物（１９．３ｇ，６０．３ｍｍｏｌ）および水（１３ｍＬ）を加え、１０分間スパージを継続する。１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンパラジウム（ＩＩ）クロリドＤＣＭ錯体（１．３ｇ，１．５６ｍｍｏｌ）を反応物に加え、０．５時間スパージを継続する。混合物を９５℃にて窒素下で３時間加熱する。混合物をＥＡで希釈し、セライト（登録商標）パッドで濾過する。ブライン（４００ｍＬ）でパッドを洗浄し、濾液層を分離する。有機層をブラインで洗浄し、合わせた水層をＥＡで抽出する。有機溶液を合わせ、茶色の油状物まで濃縮する。油状物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルパッドに加える。溶出液（ヘキサン中に５０％のＥＡ、続いてヘキサン中に７０％のＥＡ）でパッドを溶出して、淡い茶色の油状物を得る。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で粉砕して、固体として標題の化合物を得る。収量：５ｇ（３７％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４３９［Ｍ＋１］＋。
【００２４】
調製例９
５−（（Ｒ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（（Ｅ）−２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール
内部温度プローブ、還流冷却器、窒素ブランケットおよび磁気撹拌バーを備えた３つ口の２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、ＡＣＮ（９２ｍＬ）中で（Ｅ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール−５−オール（１０．０ｇ，２２．８３ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（７．８８ｇ，２３．９４ｍｍｏｌ）をスラリーにし、６０℃まで加温する。懸濁液に、（Ｓ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エチルメタンスルホネート（７．０３ｇ，２６．０２ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌する。反応混合物をＲＴまで冷却し、濾過し、ＡＣＮで固体を洗浄する。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（２〜４％（メタノール中に２Ｍのアンモニア）／ＤＣＭ）により残留物を精製する。生成物の画分を合わせ、白色の泡状物まで真空下で濃縮する。収量：１２．５ｇ（８６％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ６１２［Ｍ＋１］＋。
【実施例】
【００２５】
実施例１
（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノール
【化１】
添加漏斗、窒素入口、内部温度プローブおよび磁気撹拌棒を備えた３つ口の２５０ｍＬ丸底フラスコにメタノール（５７ｍＬ）を入れ、氷浴中で冷却する。得られた溶液に、塩化アセチル（２０ｍＬ，２８１．０３ｍｍｏｌ）を添加漏斗を通してゆっくりと加える。その溶液に、メタノール（４０ｍＬ）に溶解した５−（（Ｒ）−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３−（（Ｅ）−２−（１−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）エチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ビニル）−１Ｈ−インダゾール（７．１ｇ，１１．５９ｍｍｏｌ）を添加漏斗を介して加える。添加が完了した後、氷浴を除去し、ＲＴまで加温し、混合物を４時間撹拌する。反応混合物を真空下で黄色の泡状物まで濃縮する。黄色の泡状物をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０ｍＬ）にゆっくりと加える。ＲＴにて３０分間、混合物を撹拌する。混合物を濾過し、水（１００ｍＬ）で固体を洗浄し、真空下で乾燥させる。高温のＥＡ／メタノール／ヘキサンから固体を再結晶化して、白色の固体として標題の化合物を得る。収量：２．１ｇ（４１％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ ４４４［Ｍ＋１］＋。
【００２６】
ＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路の異常調節は、ヒト悪性腫瘍の多くの形態に関係している。ＦＧＦＲおよびＦＧＦは、しばしば、多数の癌において過剰発現し、それらの発現は、しばしば、不十分な予後に関連する。ＦＧＦＲキナーゼドメインにおける活性化突然変異は、乳癌、ＮＳＣＬＣ、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌および多発性骨髄腫を含む、いくつかの種類の腫瘍で見出されている。ＦＧＦＲ遺伝子座のゲノム増幅もまた、多くの乳癌、胃癌、および多発性骨髄腫の癌患者で検出された。ＦＧＦＲおよびＦＧＦの過剰発現もまた、膀胱癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、および肺癌などの多くの異なる種類の腫瘍で見出されている。ＦＧＦＲファミリー経路阻害剤治療が有効であり得る他の癌としては、ＡＭＬ、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および精巣癌が挙げられる。腫瘍形成および進行におけるそれらの役割に加えて、ＦＧＦおよびＦＧＦＲはまた、特に腫瘍増殖の間の血管形成の重要な調節因子である。ＦＧＦ／ＦＧＦＲ軸もまた、癌関連線維芽細胞などの他の腫瘍間質細胞を増大させるのに重要な役割を果たす。ＦＧＦの上方制御もまた、抗血管形成および他の化学療法に対する耐性を生じる。最終的に、ＦＧＦＲの低分子阻害剤は、いくつかの臨床前腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性が実証されており、診療所で診断されている。まとめると、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ経路は、癌細胞におけるいくつかの重要な細胞プロセスに不可欠である。これらの理由のために、ＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦシグナル伝達を標的とする治療は、直接腫瘍細胞に、および腫瘍の血管新生の両方に影響を及ぼし得る。
【００２７】
全ての例示した化合物を、以下のアッセイ：ＦＧＦＲ１酵素アッセイ（フィルター結合）、ＦＧＦＲ３酵素アッセイ（フィルター結合）、ＲＴ−１１２細胞ベースのアッセイにおけるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫ（ＢＳＡの存在下において）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞ベースアッセイにおけるＥＲＫリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＦＧＦＲのインビボ標的阻害アッセイ、およびＲＴ１１２ヒト膀胱および他の癌異種移植片モデルのうちの少なくとも１つにおいて以下に記載するように実質的に試験する。これらのアッセイは、試験される化合物がＦＧＦＲファミリー経路の阻害剤であり、抗癌活性を有することを実証する。
【００２８】
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素アッセイ（フィルター結合）
ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ３キナーゼ（０．１５ｎｇ／μＬのヒトＦＧＦＲ１または０．３２ｎｇ／μＬのヒトＦＧＦＲ３）を、１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５、８ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５、５．０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０．０μＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．５μＣｉ３３Ｐ−ＡＴＰ、および０．０５μｇ／μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）を含有する５０μＬのバッファー中でインキュベートする。反応を、ＲＴにて３０分間、５０μｌの容積で実施し、次いで１３０μＬの１０％Ｈ３ＰＯ４を加えることによってクエンチする。反応物（１２０μＬ）を、９６ウェルの１．０μｍのガラス繊維フィルタープレートに移し、ＲＴにて２０〜３０分インキュベートし、次いで０．５％Ｈ３ＰＯ４を含むＴＩＴＥＲＴＥＫ（登録商標）Ｚｏｏｍで３回洗浄する。ウェルを空気乾燥させ、その後４０μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）２０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、次いでＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｏｂｅｔａカウンタでカウントする。化合物阻害のために、化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭのストックとして提供する。化合物を、２０％ＤＭＳＯ中で１：３で連続希釈して、１０点濃度反応曲線を作成し、反応混合物をフィルタープレートに加える前に反応プレート中に１：５（４％最終ＤＭＳＯ濃度中に２０μＭ〜０．００１μＭ最終）で希釈して、化合物活性を決定する。コントロールウェルは４％ＤＭＳＯのみを含み、一方、ベースラインを、０．１Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するコントロールウェルによって確立する。１０の濃度の各々についての阻害パーセント値を、各プレートでコントロールウェルから算出し、１０点濃度反応データを、４パラメーターロジスティック式および得られた曲線フィットから推定される絶対ＩＣ５０値を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ）を用いて後で分析する。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素アッセイは、それぞれ、１．３８および１．４７の推定ＩＣ５０に関して最少有意差（ＭＳＲ）を有する。これらのアッセイにおけるＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３についての実施例１のＩＣ５０結果は、それぞれ、０．００７７および０．００６４μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が有効なＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３酵素阻害剤であることを実証する。
【００２９】
ＢＳＡを用いるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫ
ヒトＲＴ１１２膀胱癌細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ １００８２−１４７）およびＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３４０）中の１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ １５１４０−１２２）を補足した１００μＬのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ １１８７５−０８５）中の５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、増殖培地を除去し、２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足した１００μＬのＲＰＭＩ １６４０と取り換える。３７℃でのインキュベーションの３時間後、６％ＤＭＳＯ中の２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＲＰＭＩ １６４０中の２０μＬの３倍希釈した化合物を各ウェルに加える。これにより、１％ＤＭＳＯ中の１０〜０．００５μＭの範囲の１０点用量反応曲線を得た。インキュベーションを３７℃にて１時間継続する。細胞を、無血清ＲＰＭＩ中の５０μＬの５０μｇ／ｍＬのＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２７３−Ｆ９）溶液で刺激して、５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９の最終濃度を得る。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（３．７％のホルムアルデヒド、最終濃度）中の３０μＬの２５％のホルムアルデヒド溶液を加えることにより細胞を固定し、ＲＴにて３０分インキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、続いて１００μＬの冷メタノールを加え、−２０℃にて３０分間インキュベートする。メタノールを除去し、細胞を、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＲＴにて１５分インキュベートする。次いで、細胞を、２％ＢＳＡ、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ Ｐ２８５０）、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６）、および０．０１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８３４０）を補足したＰＢＳ中の５０μＬの１：４００希釈のｐ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１０１Ｓ）中で穏やかに撹拌しながら４℃にて一晩インキュベートする。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回、およびＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％ＢＳＡおよび０．１％のホスファターゼ阻害剤カクテル１、０．０１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２、および０．０１％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳ中の８０μＬの１：１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３４）中で暗所で１時間ＲＴにてインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、続いてＰＢＳ中の１００μＬの１：２００希釈のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｐ−３５６６）を加え、次いで１時間暗所でインキュベートする。ウェル当たりのｐ−ＥＲＫ陽性細胞および全細胞を、Ａｌｅｘａ ４８８およびＰＩに関して、それぞれ光学フィルター５００〜５３０ｎＭおよび５７５〜６４０ｎＭを用いてＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｌｔｄ）で同定する。Ａｌｅｘａ ４８８値を用いるｐＥＲＫ／ウェルについての全平均強度を、続いて同じプレートで実施したＭＩＮ（ＤＭＳＯ中の１０μＭの陽性対照化合物）およびＭＡＸ（ＤＭＳＯのみ）対照から得た値を用いて阻害パーセントに変換する。阻害パーセント値および１０点濃度反応データを、続いて４パラメーターＳ字状用量反応式を用いて分析し、相対的ＩＣ５０値を得られた曲線から推定する。ＢＳＡアッセイを用いるＦＧＦ９誘導性ｐ−ＥＲＫは、２．７の推定ＩＣ５０について最少有意差（ＭＳＲ）を有する。このアッセイにおいて実施例１についてのＩＣ５０は０．０００４μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が、ヒト癌細胞におけるＦＧＦ９誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３０】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥＲＫリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＳｕｒｅＦｉｒｅ検出
ＦＧＦ受容体１の阻害に対する化合物の効果を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）刺激に応答するＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のリン酸化をモニターすることによって測定する。形成されたｐＥＲＫのレベルを、ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）システム（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＴＧＲＥＳ５０Ｋ）を用いて測定する。これは、リン酸化検体のイムノ−サンドイッチ捕捉、続いて増幅シグナルを生成するために抗体がコーティングされたＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いる検出を利用する均質アッセイフォーマットである。
【００３１】
ＨＵＶＥＣ細胞を回収し、１０％ＦＢＳ、０．４％ウシ脳抽出物、０．１％ヒドロコルチゾン、０．１％硫酸ゲンタマイシンアムホテリシン−Ｂ、および０．１％上皮増殖因子、７代継代までのヒト組換え体を補足した内皮細胞基礎培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＣ−３１３２）からなる増殖培地中に維持する。このアッセイについて、細胞を標準的な手段によって収集し、次いでカウントする。細胞（２０，０００／ウェル）を、９６ウェルＰｏｌｙ−Ｄ−リジンコーティングプレート（ＢＤ，３５４６４０）中の１００μＬの増殖培地に播種する。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。
【００３２】
そのアッセイの日に、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて３時間、１．５％ＦＢＳおよび２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１００μＬのＥＢＭ（内皮細胞基礎）培地中で血清飢餓し、次いで３７℃にて１時間、飢餓培地中で２０μＭの３倍希釈した化合物で処理する。これにより１％ＤＭＳＯ中の１０〜０．００５μＭの範囲の１０点濃度反応曲線を得た。化合物の処理の１時間後、細胞を、３７℃にて１５分間、５０μＬのｂ−ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ０２９１、最終ｂ−ＦＧＦ濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激する。細胞および５０μＬの刺激因子ｂ−ＦＧＦを含有するウェルにおいて、ＭＡＸシグナルを得、１０μＭの陽性対照化合物および５０μｌの刺激因子ｂ−ＦＧＦを有する細胞をＭＩＮとする。次いで、培地を除去し、５０μＬの１×ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）溶解バッファー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）キットコンポーネント）をウェルに加え、穏やかに撹拌しながらＲＴにて１０分間インキュベーションを継続する。ｐＥＲＫ検出のために、６μＬの溶解物および１０μＬの反応混合物（６０部の反応バッファー／１０部の活性化バッファー／０．６部のドナーおよびアクセプタービーズの各々、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６７６０６１７Ｒ）を、３８４ウェルプロキシプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６００６２８０）に移す。プレートを密封し、穏やかに撹拌しながらＲＴにて２時間インキュベートし、次いで標準的なＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）設定（Ｅｘ６８０ｎｍおよびＥｍ５２０−６２０ｎｍ）を用いてＴｕｒｂｏＭｏｄｕｌｅを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取る。放出データを、各プレート上のＭＡＸ（ＤＭＳＯのみ）およびＭＩＮ（ＤＭＳＯ中の１０μＭの陽性対照化合物）対照から決定される阻害パーセントに変換し、次いで１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（登録商標）４．０を用いて４パラメーターロジスティック式にフィットし、ＩＣ５０を推定する。ＥＲＫリン酸化（（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイのＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＳＵＲＥＦＩＲＥ（登録商標）検出は、２．１のＩＣ５０について最小有意差（ＭＳＲ）を有する。このアッセイにおける実施例１のＩＣ５０は、０．０００６μＭであると推定する。このデータは、本発明の特定の化合物が、ヒト臍帯内皮細胞におけるｂＦＧＦ誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３３】
ＦＧＦＲインビボ標的阻害アッセイ
雌のヌードマウス（ＣＤ１／ｎｕ／ｎｕ）を処置前の１週間馴化させる。動物を、陽性対照、陰性対照および化合物処置群に分類する。化合物（１０％アカシア中で製剤化した）、陽性対照（１０％アカシア）、および陰性対照（１０％アカシア）を強制経口投与する。化合物用量は０．１５〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。２時間後、化合物処置群および陽性対照群を、静脈内投与した生理食塩水中の新しく調製したマウスｂＦＧＦ（６μｇ／動物、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＰＭＧ００３３）で処置する。陰性対照群を、静脈内投与した生理食塩水で処置する。マウスを静脈内投与の１０分後に屠殺する。動物の心臓を収集し、１：１００希釈の阻害剤（ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ Ｓｉｇｍａ Ｐ２８５０；ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＳｉｇｍａ Ｐ８３４０）を含有する３００μＬの氷冷溶解バッファー（ＲＩＰＡ；Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ ＢＰ−１１５）中で１０秒間ホモジナイズする。ホモジネートを１５分間１４，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに移す。タンパク質レベルを、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ ＰＬＵＳ（商標）タンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ＃ １８５６２１０）により決定する。アッセイ手順は、製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと）。
【００３４】
心臓組織ホモジネートを、ＭＳＤ（登録商標）ホスホ−Ｅｒｋ ＥＬＩＳＡ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｎ４１ＣＢ−１）を用いて分析して、組織ホスホ−Ｅｒｋレベルを決定する。ＥＬＩＳＡ手順は、製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと；０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを溶解バッファーに加えることのみ変更）。陽性対照を最小ホスホ−Ｅｒｋ阻害（０％）として使用し、陰性対照を最大ホスホ−Ｅｒｋ阻害（１００％）として使用する。化合物で処置した群の阻害パーセントを、最大および最小阻害群に対して算出する。ＴＥＣ９０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での９０％阻害を達成するのに必要な濃度である。例えば、実施例１の化合物は２８ｎＭの推定ＴＥＣ９０を有する。このデータは、本発明の特定の化合物がインビボにおけるｂＦＧＦ誘導性ＥＲＫリン酸化の有効な阻害剤であることを実証する。
【００３５】
Ｋｄｒに対するこの化合物の活性を評価するために、雌のヌードマウス（ＣＤ１／ｎｕ／ｎｕ）を馴化させ、ＶＥＧＦを、Ｋｄｒ自己リン酸化｛ＶＥＧＦ（６μｇ／動物、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ４９３−ＭＶ／ＣＦ）を誘導するために使用することを除いて上記のように処置する。心臓組織を収集し、上記のようにホモジナイズする。得られたホモジネートを、ＭＳＤ（登録商標）ホスホ−Ｋｄｒ ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｎ４１ＺＡ−１）を用いて分析して、組織ホスホ−Ｋｄｒレベルを決定する。ＥＬＩＳＡ手順は製造業者の推奨によって同じである（アッセイキットに含まれる取扱説明書を参照のこと；０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを溶解バッファーに加えることのみ変更）。陽性対照群を、（０％の最小ｐ−ＫＤＲ阻害として）静脈内に投与した生理食塩水中のＶＥＧＦ９６（μｇ／動物）で処置する。陰性対照群を、（１００％の最大ｐ−ＫＤＲ阻害として）静脈内に投与した生理食塩水で処置する。化合物で処置した群の阻害パーセントを、最大および最小阻害群に対して算出する。ＴＥＤ５０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での５０％阻害を達成するのに必要な用量である。例えば、実施例１の化合物は、１．３４ｍｇ／ｋｇの推定ＴＥＤ５０を有する。ＴＥＣ９０は用量反応研究から算出し、それはこの時点での９０％阻害を達成するのに必要な濃度である。例えば、実施例１の化合物は、２５２ｎＭの推定ＴＥＣ９０を有する。このデータは、本発明の特定の化合物が、以前に知られている特定のＦＧＦＲ阻害剤に比べて、インビボにおけるＶＥＧＦ誘導性Ｋｄｒリン酸化の少しの有効な阻害剤であることを実証する。
【００３６】
異種移植片腫瘍モデル
ヒト膀胱癌細胞ＲＴ１１２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ヒト多発性骨髄腫細胞ＯＰＭ−２（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはヒト胃癌細胞ＳＮＵ−１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のうちの１つを、ＫＯＲＥＡＮ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥ ＢＡＮＫ（ＫＣＬＢ）の推奨に従って培養物中で増殖させ、収集し、ヌードマウスのひ腹に皮下注射する。腫瘍を形成（注入後７〜２１日）させて、動物を無作為化し、対照および試験群に分類する。試験化合物を、適切な媒体中（すなわち１０％アカシア中で製剤化した）で調製し、試験化合物および媒体対照を強制経口投与する。腫瘍反応を、処置課程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定により決定し、腫瘍体積対媒体対照群の阻害パーセントとして報告する。実施例１の化合物は、いくつかの異種移植片腫瘍モデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を実証する。例えば、膀胱腫瘍モデル（ＲＴ−１１２）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、４１．３％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８５．９％の阻害が達成された。胃腫瘍モデル（ＳＮＵ−１６）において、３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＱＤ）で投与した場合、６２％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８３％の阻害が達成された。多発性骨髄腫瘍モデル（ＯＰＭ−２）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、６８％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、８４％の阻害が達成された。ＮＳＣＬＣ腫瘍モデル（ＮＣＩ−Ｈ４６０）において、３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＱＤ）で投与した場合、４６％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（１７日間、ＢＩＤ）で投与した場合、６９％の阻害が達成された。膵臓腫瘍モデル（ＢｘＰＣ−３）において、３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＱＤ）で投与した場合、１％の阻害が達成され；３ｍｇ／ｋｇ（２１日間、ＢＩＤ）で投与した場合、５５％の阻害が達成された。このデータは、本発明の特定の化合物がいくつかの動物モデルにおける異種移植片ヒト腫瘍増殖の阻害剤であることを実証する。
【００３７】
本発明の化合物は、好ましくは、種々の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、かかる組成物は、経口または静脈内投与用である。かかる医薬組成物およびそれを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ｄ．Ｔｒｏｙら，ｅｄｓ．，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照のこと。
【００３８】
本発明の化合物は、通常、広範囲の用量で効果的である。例えば、通常、１日当たりの用量は、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。一部の例において、上述の範囲の下限値より低い用量レベルが十分以上であってもよく、他の場合において、さらに高い用量が、いかなる有害な副作用も引き起こさずに利用されてもよく、従って、上記の用量範囲は本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物（複数も含む）、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況を考慮して医師によって決定されることは理解されるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１または２に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項４】
治療に使用するための請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項５】
癌の治療のための請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項６】
前記癌は非小細胞肺癌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記癌は胃癌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記癌は多発性骨髄腫である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１】
（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールである請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１または２に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
【請求項４】
治療に使用するための請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項５】
癌の治療のための請求項１または２に記載の化合物または塩。
【請求項６】
前記癌は非小細胞肺癌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記癌は胃癌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記癌は多発性骨髄腫である、請求項５に記載の化合物。
【公表番号】特表２０１２−５２６１２６（Ｐ２０１２−５２６１２６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０９８８９（Ｐ２０１２−５０９８８９）
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３４８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２９５０９
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３４８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２９５０９
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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