フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）エステラーゼおよびその使用
【課題】 ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素の提供。
【解決手段】フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、上記酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、上記サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。上記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤを含むアミノ酸配列を有する。
【解決手段】フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、上記酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、上記サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。上記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤを含むアミノ酸配列を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（本明細書中で以後、ＭＥＨＰ）エステラーゼに関する。本発明のＭＥＨＰエステラーゼは、フタル酸エステルを分解する微生物に由来し、詳細には、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属細菌に由来し、より詳細には、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．Ｐ８２１９株）に由来する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境ホルモンと総称される物質が、社会的に大きな問題を引き起こしている。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれ、極微量であっても、人間をはじめとする動物の体内で内分泌系を撹乱する作用を有する、人工または植物由来の化学物質である。環境ホルモンは、人間をはじめとする動物に対して明白な毒性効果を有することが指摘されている。環境ホルモンの作用によって、動物では、性転換、精子密度の減少等の生殖器官形成の異常が起きる。これらの異常は種の絶滅に繋がりかねない。それゆえ、自然環境から環境ホルモンを除去することが重要な課題となっている。
【０００３】
環境ホルモンの中でも、フタル酸エステル（例えば、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（本明細書中で以後、ＤＥＨＰ））は、プラスチックを製造する際の可塑剤として用いられ、多量に製造および使用される。ＤＥＨＰは環境中に放出されても生物分解されにくく、動物に対して長期にわたって影響を及ぼし続ける。それゆえ、自然環境からのＤＥＨＰの除去が重要な課題となっている。
【０００４】
本発明者らは、以前に、フタル酸エステルを分解する能力を有するＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を単離し、２０００年１１月８日付けで、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧工業技術院生命工学工業技術研究所）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託した（特許文献１）。
【０００５】
ＤＥＨＰをフタル酸に分解する経路として現在までのところ２種類の経路が提唱されている。まず一つは、ＤＥＨＰから直接フタル酸に加水分解する経路である。微生物ではＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１が産出する菌体外酵素のみが知られている（非特許文献１）。Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の産出する酵素は菌体外酵素で分子質量は１５ｋＤａで、最適ｐＨ ８．６、最適反応温度４２ ℃である。この酵素はＣａ２＋で活性化され、Ｈｇ２＋のようなその他の金属イオンでは阻害をうける。比活性は最終２，９２０ ｕｎｉｔ／Ｏ．Ｄ２８０である。
【０００６】
第２は、ＤＥＨＰをフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）に加水分解し、別の酵素でＭＥＨＰをフタル酸に分解する経路である。フタル酸ジエステルをフタル酸モノエステルに加水分解する酵素がヒトの唾液４）や、豚の肝臓に局在するカルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ ３．１．１．１）（非特許文献２）、および小麦の細胞（非特許文献３）から精製されている。そのＤＥＨＰ分解経路およびＤＥＨＰ分解酵素の性質を、以下の表１および表２に示す。
【０００７】
【表１】
【０００８】
【表２】
【特許文献１】特願平２０００−３４１２１４
【非特許文献１】Ｋｕｒａｎｅ，Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２９，１１８−３４，１９９７
【非特許文献２】Ｔ．Ｎｉｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４９（１）７６−８１，２００３，
【非特許文献３】Ｈａｎｓ−ｗｉｌｌｉ ＫＲＥＬＬら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３，５７−６２，１９８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在まで、ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素は、単離されていない。本願は、ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素の単離およびその特徴付けを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
・（項１） フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、上記酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、上記サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。
・（項２） 項１に記載の酵素であって、上記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、酵素。
・（項３） 項１または２に記載の酵素であって、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株により産生される、酵素。
・（項４） 項１〜３のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の反応最適温度は約４５℃である、酵素。
・（項５） 項１〜４のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の反応最適ｐＨは７．０〜８．０である、酵素。
・（項６） 項１〜５のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有さない、酵素。
・（項７） 項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素は、２０重量％のメタノールの存在下で９０％以上の活性が保持される、酵素。
・（項８） 項１〜７のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の活性化エネルギーは約６３ｋＪ／ｍｏｌである、酵素。
・（項９） 項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
・（項１０） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質を、項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させ、上記酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程
を包含する、方法。
・（項１１） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるためのキットであって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
上記酵素の使用方法を指示する指示書と、
を含む、キット。
・（項１２） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させる組成物であって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
・（項１３） フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素を精製するための方法であって、
産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を、フタル酸ジ−２−エステルの存在下または非存在下で培養する工程、ならびに
上記培養物を、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに順次供する工程、
を包含する、方法。
・（項１４） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質中の初期フタル酸量を測定する工程、
上記物質を、項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させて、上記酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程、および
上記インキュベート後の物資中のフタル酸量を測定する工程、
を包含し、
上記初期フタル酸量と比較した上記インキュベート後の物質中のフタル酸量の減少は、上記物質におけるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を示す、方法。
・（項１５） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するためのキットであって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
上記酵素の使用方法を指示する指示書と、
を包含する、キット。
・（項１６） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための組成物であって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
・（項１７） 項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素に対する抗体。
【発明の効果】
【００１１】
ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素を初めて提供した。このような分解活性を有することは、従来知られておらず、しかも、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（ＤＥＨＰ）加水分解活性を有しないような選択性を有する酵素は、従来になかった。従って、ＤＥＨＰを分解することが好ましくない状況において、有害ホルモン様物質であるＭＥＨＰを分解することが必要な場合に、特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「ＭＥＨＰ」とは、「フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（Ｍｏｎｏ−２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）」の略称であり、本明細書では、両者とも同じ意味で使用される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「ＤＥＨＰ」とは、「フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（Ｄｉ−２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）」の略称であり、本明細書では、両者とも同じ意味で使用される。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）加水分解活性」とは、基質ＭＥＨＰの少なくとも一部をフタル酸へと加水分解する活性を意味する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（ＤＥＨＰ）加水分解活性」とは、基質ＤＥＨＰの少なくとも一部（好ましくは、少なくとも１０％以上）をＭＥＨＰまたはフタル酸へと加水分解する活性を意味する。
【００１７】
（微生物）
本発明で使用される特に好ましいＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであるＰ８２１９株は、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号（現：産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として、２０００年１１月６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現：産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に寄託されており、当業者は、この株を代表例として使用することができることが理解される。
【００１８】
本明細書中では、「フタル酸エステル」とは、以下の式に示す構造を有するフタル酸エステルをいう：
【００１９】
【化１】
上記化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ１およびＲ２は同時に水素ではない。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は同時にアルキルである。ここで、ＭＥＨＰおよびＤＥＨＰがこのフタル酸エステルの範囲内に入ることが理解される。
【００２０】
本明細書中で用いられる「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の、不飽和結合を有さない炭化水素基を表し、特に指定がない場合、任意の鎖長を有する。
【００２１】
アルキルの例として、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチルなどが挙げられる。
【００２２】
例えば、アルキルが「１〜１５個の炭素原子を有するアルキル」として記載されている場合、この基は例えば、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニルまたはイソノニルを意味し得る。
【００２３】
好ましくは、アルキルは、独立して、１〜１５個の炭素原子を有するアルキルである。アルキルは、独立して、好ましくは２〜１５個、より好ましくは３〜１５個、さらにより好ましくは４〜１５個、さらにより好ましくは５〜１４個、さらにより好ましくは６〜１３個、さらにより好ましくは７〜１２個、さらにより好ましくは８〜１１個の炭素原子を有するアルキルであり、最も好ましくは８個の炭素原子を有するアルキルである。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方は、２−エチルヘキシル基であり、さらにより好ましくはＲ１およびＲ２はいずれも２−エチルヘキシル基である。
【００２４】
フタル酸エステルは、好ましくは、環境ホルモンである。本明細書中で用いられる「環境ホルモン」とは、ホルモン様の作用を有する物質であって、ホルモンのかかわる過程を撹乱する物質をいう。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれる。環境ホルモンとして作用するフタル酸エステルの例としては、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジノニル、フタル酸ジイソノニル、フタル酸ジエチルなどが挙げられる。
【００２５】
ここで、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルは、プラスチックの可塑剤として広く用いられており、日本における国内生産量と輸入量の合計は、２５９，９２７ｔ（２００１年度）と非常に多い。しかし、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルは、動物実験において大量投与による肝・腎の変性および繁殖能力の低下が見られ、催奇形性、変異原性も報告されている。毒性は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルよりも、その代謝中間産物であるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの方が強いことが認められている。従って、本発明のようなフタル酸モノ−２−エチルヘキシルに対して選択性のある分解酵素は、他の基質(例えば、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル）との反応による予想外の結果を伴わずにフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを分解可能であるという点で有用である。
【００２６】
本明細書中で用いられる「規定培地」とは、構成成分が全て規定されている培地をいう。規定培地は、一般的な細菌の培地であり得、例えば、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏培地、ＮＢ培地などの培地である。
【００２７】
Ｍ９培地の組成は、以下の実施例２に示すとおりである。普通ブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。ハートインフュジョン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ウシ心臓滲出液５００ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．４に調整された培地である。トリプトソイブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、トリプトン１７ｇ、ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．３に調整された培地である。ツァペックドックス氏培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ショ糖 ３０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＮａＮＯ３ ２ｇ、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇを含み、ｐＨが５．６に調整された培地である。ＮＢ培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス２ｇ、および塩化ナトリウム２ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。
【００２８】
本明細書中で用いられる「消失」とは、何らかの作用により、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルが検出されなくなることをいう。フタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルの消失は、フタル酸エステルの２つのエステル部分のうちのいずれか一方にのみ生じたエステル分解に起因してもよいが、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの場合は、一つしかないので、その一つのエステルが分解されたことをもって消失という。消失をもたらす原因の例としては、エステル分解、アルキル鎖の切断などが挙げられる。好ましくは、消失は、フタル酸エステルのエステル部分のエステル分解によって生じる。
【００２９】
本発明において用いられるＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓおよびフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む生物は、当該分野で公知のスクリーニング方法によって天然のサンプルから単離され得る。このようなスクリーニング方法の例として、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを唯一の炭素源としてサンプルの培養を行い、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる細菌を濃縮し、そして単離する方法が挙げられる。天然のサンプルは、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを排出する工場の汚水、下水処理場の活性汚泥、廃棄物処理場の土壌などであり得る。
【００３０】
あるいは、本発明において使用され得るＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、フタル酸エステル分解能を保持しさえすれば、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託された菌株に変異誘発処理を行うことにより得られるか、または天然に変異を受けた誘導体であってもよい。そのような変異誘発処理は当該分野で周知であり、そのような変異誘発処理を行うための変異原としては、α線、β線、γ線およびＸ線のような物理的変異原、ならびにニトロソグアニジンおよびベンゾピレンのような化学的変異原が挙げられる。
【００３１】
本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルの分解方法では、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌から抽出された酵素を用いることができる。この方法では、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む溶液中で培養する工程を包含する。この方法で用いられる溶液は、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させることを所望するサンプル自体であってもよいし、このサンプルに無機塩（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４ＣｌおよびＮａＣｌ）を添加して、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌の培養に、より適したものとなるように成分を調整したものであってもよい。好ましくは、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切であるように成分の調整を行う。
【００３２】
本発明の方法では、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルに、無機成分などを添加して、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切な溶液を調製する。次いで、この溶液に、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を添加する。添加する細菌は、予め前培養を行って順調に増殖している状態にあってもよいし、そうでなくともよい。予め前培養を行うことが好ましい。溶液に添加する細菌の量は、適切に選択され得るが、代表的には、溶液１ｍｌあたり約１０３〜１０９個、好ましくは約１０４〜１０８個、より好ましくは約１０６〜１０８個である。この細菌から、本明細書に記載されるような精製方法によって、本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシル分解酵素を単離する。
【００３３】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む溶液に、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する酵素またはそれを含む組成物を添加した後、この溶液は、約１０℃〜約４５℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃、最も好ましくは約３０℃にて培養される。培養を行う際には、溶液を攪拌してもよいし、攪拌しなくともよい。
【００３４】
本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させるための組成物は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌から抽出された酵素を含む。培地の濃縮物は、培養時にフタル酸モノ−２−エチルヘキシル分解活性を有する酵素を含む細菌の増殖に適切であるようなものが使用され得る。培地の濃縮物の例としては、前記濃縮物が、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の濃縮物である。本発明の組成物は、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルと混合して使用するために好適である。
【００３５】
例えば、本発明において使用される細菌は、ガラス、プラスチックなどで作製された管状物中に封入され得る。また、細菌は、ゼラチンなどのコーティング剤で包まれたカプセル剤（好ましくは、ソフトカプセル剤）中に封入され得る。培地の濃縮物は、乾燥粉末状態にあることが好ましい。
【００３６】
（ＤＥＨＰの分解経路と分解酵素）
ＤＥＨＰをフタル酸に分解する経路として現在までのところ２種類の経路が提唱されている。
【００３７】
第一は、ＤＥＨＰから直接フタル酸に加水分解する経路である。微生物ではＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１が産出する菌体外酵素のみが知られている。Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の産出する酵素は菌体外酵素で分子質量は１５ ｋＤａで、最適ｐＨ ８．６、最適反応温度４２℃である。この酵素はＣａ２＋で活性化され、Ｈｇ２＋のようなその他の金属イオンでは阻害をうける。比活性は最終２，９２０ ｕｎｉｔ／Ｏ．Ｄ．２８０である。
【００３８】
第２は、ＤＥＨＰをフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）に加水分解し、別の酵素でＭＥＨＰをフタル酸に分解する経路である。フタル酸ジエステルをフタル酸モノエステルに加水分解する酵素がヒトの唾液、豚の肝臓に局在するカルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ ３．１．１．１）（Ｔａｔｓｕｈｉｒｏ Ｎｉｉｎｏ，Ｔｏｈｒｕ Ｉｓｉｂａｓｈｉ，Ｈａｊｉｍｕ Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｋｅｎ Ｔａｋｅｄａ，Ｓｕｋｅｏ Ｏｎｏｄｅｒａ（２００３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４９（１） ７６−８１）、小麦の細胞（Ｈａｎｓ−ｗｉｌｌｉ ＫＲＥＬＬ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＳＡＮＤＥＲＭＡＮＮ，Ｊｒ（１９８４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３，５７−６２）から精製されている。現在知られているＤＥＨＰをＭＥＨＰに加水分解する酵素の性質は表２に示されている。
【００３９】
Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株が単離された当初、この菌はＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の近縁属であることから、ＤＥＨＰを菌体外でフタル酸に加水分解すると考えられたが、Ｐ８２１９株はフタル酸を資化しないことからＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１とは異なる分解酵素および代謝経路を有することも考えられた。しかし、Ｐ８２１９株の代謝経路およびＤＥＨＰ分解酵素の性質は未解明である。
【００４０】
現在までに知られているＤＥＨＰの分解経路は、表１に示されている。
【００４１】
このように、第二の経路の場合、ＭＥＨＰがいまだに残ることが想定される。このようなＭＥＨＰもまた、有害作用を有することから、そのような有害物質の除去が必要となる。ＤＥＨＰが体内に入ると、ＭＥＨＰに分解され尿中に排出される。しかし、腎臓の機能が低く血液透析や腹膜透析を必要とする場合、体内にＭＥＨＰが大量に蓄積する。ＭＥＨＰが催奇性、発ガン性、肝毒性を示すことが報告されている。従って、ＭＥＨＰを分解する活性は必須であるといえる。
【００４２】
（フタル酸およびフタル酸エステル類の測定法）
（使用試薬）
（１）イソアミルアルコール（和光純薬 試薬特級）
（２）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（使用器具）
（１）分液ロートシェーカー
（２）高速液体クロマトグラフシステム
・クロマトパック Ｃ−Ｒ８Ａ ＶＰ
・ポンプ ＬＣ−１０ＡＤ ＶＰ
・デガッサー ＤＧＵ−１２Ａ ＶＰ
・カラムオーブン ＣＴＯ−１０Ａ ＶＰ
・検出器 ＳＰＤ−１０Ａ ＶＰ
・コントロールパネル ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ
（３）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−Ｄｕｏ ｆｉｌｔｅｒ
（４）試料前処理用シリンジ １．０ ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ
（実験操作）
１．培養した２０ｍｌの培養液に６ＮのＨＣｌを１ｍｌ添加し、イソアミルアルコールを２０ｍｌ加え、５０ｍｌ容分液ロートに移した後、分液ロートシェーカーにて１０分間撹拌する。
２．エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ ｒｐｍにて３分間遠心分離を行う。
３．有機相を回収し、培養０〜３０時間は５倍量、３０時間以降は等量のメタノールに置換する。
４．ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを下記のＨＰＬＣの条件にて測定を行う。
【００４３】
（ＨＰＬＣの例示的条件）
【００４４】
【表３】
以上の操作を 図１にフローチャートで示す。
【００４５】
（アルカリ抽出による培養液からの菌体タンパク質の抽出法および定量法）
（使用試薬）
（１）ＮａＯＨ（和光純薬 試薬特級）
（２）ＨＣｌ（和光純薬 試薬特級）
（３）フォリン・シカトーフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ製）
（４） ローリー試薬（下記表参照）
【００４６】
【表４】
（使用器具）
（１）遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｍｔｉ−２５）
（２）分光光度計（島津製 ＵＶ−１６００）
（実験操作）
（アルカリ抽出法による培養液からの菌体タンパク質の抽出）
（１）各種フタル酸エステル類を単一炭素源とするＭ９液体培地（２０ｍｌ培地／１００ｍｌ容三角フラスコ）に培養した培養液を１０，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃にて集菌した。
（２）遠心後の細胞に２０ｍｌ（０、１２、２３時間培養液は５ｍｌ）の精製水を加えて懸濁し、試験管に４ｍｌずつ分注した。
（３）それぞれに液量と等量の１Ｎ ＮａＯＨを添加し、ボルテックスにて撹拌した。
（４）１００℃にて１０分間インキュベートした。
（５）流水で冷却し、１Ｎ ＨＣｌを１Ｎ ＮａＯＨと等量添加し、ボルテックスにて撹拌した。
（６）１０，０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離した後、浮遊物や沈殿物が混入しないように、上澄み部分をエペンチューブに移した。
【００４７】
以上の操作を図２にフローチャートで示した。
【００４８】
（Ｌｏｗｒｙ法による抽出液中のタンパク質濃度の測定）
（１）ワッセルマン試験管にそれぞれのエッペンチューブより抽出液を５００μｌ入れ、ローリー試薬を２．５ｍｌ添加後、ボルテックスミキサーにて撹拌し、室温で１５分間反応させた。ブランクとしてワッセルマン試験管に精製水を５００μｌ入れ、ローリー試薬を添加し、同様に反応させた。
（２）１５分後、フェノール試薬を５００μｌずつ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌後室温で３０分間反応させ、吸光度計にてＯ．Ｄ７５０を測定した。
【００４９】
（無細胞抽出物の調製法）
（材料）
ＮＢ本培養液２Ｌ
（使用する緩衝液など）
０．１ Ｍ リン酸バッファー，ｐＨ ７．５
（１）Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬 試薬特級）
（２） ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬 試薬特級）
・それぞれ脱イオン水にて０．１ Ｍの溶液を作り、混合してｐＨ ７．５に調整した。
【００５０】
（使用器機）
（１）遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２５）Ｒｏｔｅｒ ＩＤ ＪＡ １４
（２） ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ製 Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ）
（３）超遠心分離器（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製）
（使用試薬）
（１）フェニルメチルスルホニルフルオリド（以下ＰＭＳＦ）、ＳＩＧＭＡ製 分子量１７４．２
（２）ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）、ナカライテスク製
（実験操作）
（１）培養した本培養液２Ｌを遠心分離して細胞と培養液上澄みに分画する。細胞を無菌的に滅菌水に懸濁して遠心分離を行い、上澄みを除去する。この操作を２回繰り返し、細胞の洗浄を行う。
（２）細胞をＭ９合成培地（５００ｍｌ容三角フラスコ２００ｍｌ×１０本）に加え、ＤＥＨＰを１，５００ｐｐｍ添加した。２５℃のロータリーシェーカーで１５時間振盪し、酵素の誘導を行う。
（３）集菌した細胞２Ｌ分を−４０℃に冷却した９９％エタノール２００ｍｌに懸濁する。
（４）直ちに１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離を行い、上澄みのエタノールを除去する。
（５）０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．５で細胞を洗浄する。
（６）０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．５に懸濁し、ガラスビーズ（０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍΦ）を加える。
（７）ＤＭＳＯに溶解した０．２５ＭのＰＭＳＦを０．１％（ｖ／ｖ）添加した後、ダイノミルを用いて細胞を破砕（３０秒間×６回）する。
（８）濾過を行い、ガラスビーズを取り除く。
（９）細胞破砕液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄みを回収し、無細胞抽出物とする。
【００５１】
以上の操作を図３にフローチャートで示す。
【００５２】
（ＤＥＨＰおよびＭＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
（材料）
酵素液（試料）
（使用試薬）
（１）酢酸エチル（和光純薬 試薬特級）
（２）６Ｎ塩酸
（３）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（４）ＤＥＨＰ懸濁液（表５参照）
（５）ＭＥＨＰ溶液（表６参照）
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】
（使用器具および器機）
（１）Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｓｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ製 ＰＥＲＳＯＮＡＬ−１１）
（２）ボルテックスミキサー
（３）高速液体クロマトグラフシステム
（４）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−ＤＵＯ ｆｉｌｔｅｒ
（５）試料前処理用シリンジ １．０ ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ
（実験操作）
（ＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
【００５５】
【表７】
（１）試験管に表１．６の混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。これを０ ｔｉｍｅと反応後の２本調製する。
（２）振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌する。
（３）酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行う。
（４）エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行う。
（５）有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換する。
（６）ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルをＨＰＬＣにて測定する。
【００５６】
（ＭＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
【００５７】
【表８】
表８の反応混液を調製し、酵素反応を１５分間行った。以下の操作はＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法に準じる。
【００５８】
（本発明の酵素）
（１）ＤＥＨＰによる誘導を行った無細胞抽出物からＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム、疎水カラム、ゲル濾過カラムの各種クロマトグラフィーによって酵素の精製を行った。例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の最終の収率は１６．８％、比活性１．８２μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであった。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる酵素の精製純度を検定した結果、分子質量３０ｋＤａ付近に単一のバンドがみられた。ゲル濾過の結果、ＭＥＨＰエステラーゼの分子量が約６２ｋＤａであったことから、本酵素は、分子量約３１ｋＤａのホモ二量体であると考えられる。
（３）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の反応最適温度は、４５℃で、反応最適ｐＨは、７．０〜８．０であった。
（４）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の活性化エネルギーを算出した結果、６３．２ｋＪ／ｍｏｌであるが、この半分〜２倍程度の結果が本発明の好ましい例示的範囲として挙げることができる。
（５）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例は、好ましくは、ＤＥＨＰを基質にしない。
（６）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例はメタノール濃度２０％まではほとんど酵素活性に影響しなかった。
（７）ＭＥＨＰ分解酵素を持つ酵素や、ＭＥＨＰ分解酵素の精製に関する報告がなく、例示的に、Ｐ８２１９株によって産出され得る例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例は新規の酵素であるようである。
【００５９】
（本発明において用いられる生化学技術）
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００６０】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００６２】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に、場合によっては染色体外に（例えば、プラスミド上に）、一定の順序に配列している。ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のようなタンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の遺伝子というときは、通常、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の構造遺伝子およびＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００６３】
本明細書において遺伝子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００６４】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、例えば、本明細書において提供される配列情報に基づいて、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００６５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００６６】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００６７】
本明細書において用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００６８】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００６９】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号 １文字記号 意味
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ａｓｘ アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ 不明または他のアミノ酸。
【００７０】
塩基
記号 意味
ａ アデニン
ｇ グアニン
ｃ シトシン
ｔ チミン
ｕ ウラシル
ｒ グアニンまたはアデニンプリン
ｙ チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ グアニンまたはシトシン
ｗ アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００７１】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特にＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のような酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本明細書において、例えば、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸に対応するアミノ酸または核酸は、それぞれヒトＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸などが例示される。
【００７２】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素遺伝子）の配列の全部または一部をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００７３】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００７５】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００７６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７７】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００７８】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００７９】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ法（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ法（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００８１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００８２】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００８３】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【００８４】
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する核酸分子において行われ得る。
【００８５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００８６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００８７】
親水性指数もまた、ポリペプチドの設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００８８】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８９】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００９０】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ ＺｏｌｌｅｒおよびＭｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【００９１】
本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素は、代表的には、そのサブユニットが、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を含むことによって特徴付けられる。当業者は、このような配列情報から、全長アミノ酸配列を容易に決定することができることが理解される。また、当業者は、このような配列情報から、核酸配列情報をも決定することができることが理解される。このようなアミノ酸配列の情報は、例えば、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株から、本明細書に記載された精製方法に従って、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素を精製し、配列決定することによって、全長配列を決定してもよい。好ましい実施形態では、本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素は、ＤＥＨＰを加水分解する活性を有しない。
【００９２】
本発明において用いられるＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）加水分解活性を有する酵素を提供する。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、グラム陽性高ＧＣ含量細菌である。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、ミコール酸含有放線菌群に分類され、ノカルジア科に属する。本発明においてＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓを用いる場合、フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）を含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合、このＭＥＨＰの８０％以上が消失し、好ましくは９０％以上が消失し、より好ましくは９５％以上が消失し、そして最も好ましくは１００％消失する。本発明では、好ましくは、このＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓから分離された本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素を使用することができるが、それに限定されず、他の生物に由来する酵素も使用することができることが理解される。そのような他の生物としては、例えば、ノカルジア科に属する細菌を挙げることができる。当業者は、本明細書の記載に基づき、本発明の上記酵素を精製および単離することができることが理解される。
【００９３】
本明細書中において、機能的に等価な（すなわち、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する）ポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００９４】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００９５】
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
【００９６】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，第３版（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙおよびその最新版；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００９７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ら（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９８】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該分野において多数存在し、販売元により、微妙な違い（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を変えて販売されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版）」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＪおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ３（Ｖｏｌｕｍｅ ３），Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａ３．２（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＵＳＡ，２００１）に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【００９９】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１００】
本明細書において使用される組み換えベクターとしては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダＦＩＸベクター（ファージベクター）を、ｃＤＮＡのスクリーニングではラムダＺＡＰベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノムＤＮＡのクローニングにはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／−，ｐＧＥＭ，ｐＣＲ２．１ ベクター（プラスミドベクター）を主に使用することができる。発現ベクターとしてｐＳＶ２ｎｅｏベクター（プラスミドベクター）を利用することができる。このようなベクターは、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ３．２を参考にして適宜実施することができる。
【０１０１】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１０２】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１０３】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１０４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１０５】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版および第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１０６】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１０７】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１０８】
（形質転換体からの単離・精製）
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
【０１０９】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチド変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１１０】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１１１】
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
【０１１２】
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる。
【０１１３】
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
【０１１４】
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【０１１５】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１１６】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明の抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１１７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、崇城大学において規定される基準を遵守した。
【０１２０】
まず、以下の実施例で使用される主な方法および材料を説明する。
【０１２１】
（実施例１．Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株の培養）
Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株（産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号）を、保存菌（ＮＢ斜面培地）より白金耳にて菌を取り、ＮＢ前培養液体培地に植菌し、設定温度２５℃のロータリーシェーカー（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製ｉｎｎｏｖａ ４３３０ １ ｉｎｃｈストローク）にて培養した。ＮＢ液体培地で３日間培養した前培養液をＭ９液体培地（２０ｍｌ／１００ｍｌ容三角フラスコ）に２％（ｖ／ｖ）植菌し、各種フタル酸エステルを１．０ｍｌ／ｌになるように添加し、設定温度２５℃のロータリーシェーカーにて培養した。
【０１２２】
（実施例２．無細胞抽出物の作製）
実施例１において培養した本培養液２Ｌを遠心分離して、細胞と培養液上澄みに分画した。細胞を無菌的に滅菌水に懸濁して遠心分離を行い、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、細胞の洗浄を行った。細胞を、Ｍ９合成培地（５００ｍｌ容三角フラスコ２００ｍｌ×１０本）に加え、ＤＥＨＰを１，５００ｐｐｍ添加した。２５℃のロータリーシェーカーで１５時間振盪し、酵素の誘導を行った。集菌した細胞２Ｌ分を、−４０℃に冷却した９９％エタノール２００ｍｌに懸濁した。遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２５）において、直ちに１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離を行い、上澄みのエタノールを除去した。０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ ７．５で細胞を洗浄した。０．１ Ｍリン酸バッファー，ｐＨ ７．５に懸濁し、ガラスビーズ（０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍΦ）を加えた。ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）（ナカライテスク製）に溶解した０．２５Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド（以下ＰＭＳＦ）（ＳＩＧＭＡ製，分子量１７４．２）を０．１％（ｖ／ｖ）添加した後、ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ製 Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ）を用いて細胞を破砕（３０秒×６回）した。濾過を行い、ガラスビーズを取り除いた。細胞破砕液を１０，０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄みを回収し、無細胞抽出物とした。
【０１２３】
（実施例３．ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例２で調製した無細胞抽出物を、超遠心分離器（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製）において超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ，１時間，４℃）した後に得られた上澄みを精製水にて２倍希釈して脱気した後、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：ＤＥ−５２担体（Ｗｈａｔｍａｎ）
担体の体積：φ１．８×２６ｃｍ
流速：２０ｍｌ／時間
１フラクション：９．８ｍｌ
チャージ：２００ｍｌ
使用バッファー：Ａバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５），Ｂバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５＋０．５Ｍ ＫＣｌ）。
ただし、グラジエント溶出は、Ａバッファー１５０ｍｌとＢバッファー１５０ｍｌで行った。その結果は、図４に示す。
【０１２４】
図４においてプールと示されている部分をプールして以下の実験に用いた。
【０１２５】
（実施例４．ＴＬＣによるＭＥＨＰ分解酵素活性の確認）
実施例３で得た溶出液のうち、ＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認し（図５）、プールし、これをＤＥＡＥ溶出液とした。
【０１２６】
詳細には、試験管に、ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１００μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）８９０μｌであった。５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液の組成は、ＭＥＨＰ溶液２ｍｌ当たり、ＭＥＨＰ ２７ｍｇ、メタノール９７３μｌ、２０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １０００μｌであった。これを０分時と反応後の２本調製した。振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを、ＴＬＣに供した。
【０１２７】
まず、ＴＬＣのプレートの下端から１ｃｍのところに鉛筆で開始線を線引きし、開始線上に開始点をうった。開始点に１／１０量のメタノールに置換した反応産物抽出液を４μｌ（２μｌ×２回）スポットした。シリカゲルプレートの下部を展開溶媒に浸し、サンプルの展開を行った。展開後、シリカゲルプレートを取り出し、展開溶媒を乾かした。波長２５４ｎｍのＵＶランプを照射し、酵素の局在するフラクションを検定した。ＴＬＣの条件は、以下の通りであった：
標準物質：フタル酸、ＤＥＨＰ、ＭＥＨＰ ２５ｍＭ溶液
使用プレート：シリカゲル７０Ｆ２５４プレート５×１０ｃｍ
展開溶媒：ベンゼン：メタノール：酢酸＝８５：１３：２。
【０１２８】
（実施例５．ＨＰＬＣによるＭＥＨＰ分解酵素活性の確認）
実施例４で得た溶出液フラクションのＭＥＨＰ分解酵素活性を、ＨＰＬＣによっても測定した。試験管にＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液（実施例４と同様）１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）９８０μｌであった。これを０分時と反応後の２本調製した。振盪速度 １２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを、下記のＨＰＬＣの条件にて測定を行った：
検出波長 ２５４ｎｍ
サンプルループ ２０μｌ
流速 １ｍｌ／分
溶離液（Ａ：メタノール：１０ｍＭリン酸＝１：４）
溶離液（Ｂ：メタノール）
カラムオーブン温度：４０℃
カラム：Ｗａｋｏｐａｋ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
カラム充填剤：Ｈａｎｄｙ−ＯＤＳ
時間プログラム（分）：
０〜５ Ａ→Ｂ
５〜１５ Ｂ
１５〜２０ Ｂ→Ａ
２５ 停止。
【０１２９】
（実施例６．疎水カラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例４においてＭＥＨＰ分解酵素活性の確認したＤＥＡＥ溶出液を氷水中で冷却しながら硫酸アンモニウムを加え、２０％飽和硫酸アンモニウム塩析を行った。１２時間平衡化し、１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離後、上澄みを疎水カラムにチャージし、疎水カラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＢＵＴＹＬ ６５０Ｍ（東ソー）
担体の体積：φ１．８×１２．７ｃｍ
流速：２０ｍｌ／時間
１フラクション：チャージ〜洗浄９．６ｍｌ
グラジエント４．８ｍｌ
サンプルチャージ：８７ｍｌ
使用バッファー：Ｃバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５＋２０％飽和硫酸アンモニウム），Ａバッファー。
【０１３０】
ただし、グラジエント溶出はＣバッファー１００ｍｌとＡバッファー１００ｍｌで行い、各フラクションのＡ２８０を測定した。実施例４と同様の手順に従い、ＴＬＣにてＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを確認し、プールした。Ｃバッファーを流速２０ｍｌ／ｈｒで流した。フラクション１本あたりチャージ〜洗浄が９．８ｍｌ、グラジエント溶出は４．８ｍｌ分取した。菱型はタンパク質濃度（Ａ２８０）、直線は硫安濃度を表している。フラクションＮｏ．１〜２はチャージ、フラクションＮｏ．３〜１１は洗浄、フラクションＮｏ．１２〜４７はグラジエント溶出をおこなった。なお、グラジエント溶出はＣバッファー、Ａバッファーともに１００ｍｌにて行った。ＴＬＣにて各フラクションの酵素反応産物の有無を調べた。これを疎水カラム溶出液とした。その結果は、図６に示す。図７には、図６の各フラクションのＴＬＣ分析の結果を示す。
【０１３１】
（実施例７．ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例６で得た疎水カラム溶出液を限外濾過器８０５０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）（メンブレンとしてＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＹＭ １０を使用した）を用いて濃縮し、Ｄバッファー（１０ ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５）に置き換えた。ゲル濾過カラムにチャージし、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
担体の体積：φ２．０×４６ｃｍ
流速：３０ｍｌ／時間
１フラクション：２．０ｍｌ
サンプルチャージ：２ｍｌ
使用バッファー：Ｄバッファー。
【０１３２】
各フラクションのＡ２８０を測定した。実施例４と同様の手順に従って、ＴＬＣにてＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを確認し、それぞれの酵素活性をＨＰＬＣで測定した。これをゲル濾過溶出液とした。Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を同様の操作により流し、酵素の分子量を決定した。ゲルろ過スタンダードの溶出パターンから分子量検量線を作成し、分子質量の決定を行った。その結果、分子量は、約６２ｋＤａであった。その結果は、図８に示す。図９には、ゲル濾過カラムの分子量検量線を示す。
【０１３３】
（実施例８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度の確認）
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを作製した。実施例７で得たゲル濾過溶出液に、×３サンプルバッファー（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー，ｐＨ６．８を２ｍｌ、ＳＤＳを０．６ｇ、グリセリンを５ｇ、ＢＰＢを２ｍｇ混合して、ミリＱで１０ｍｌにメスアップした）をサンプル容積の１／３を加え、９５℃にて５分間熱処理後、泳動を行った。サンプルを各レーンにチャージした。濃縮ゲルを、先端マーカーが移動中は２０ｍＡで、分離ゲルを、先端マーカーが移動中は４０ｍＡで、電気泳動した。分離ゲルの８０％程度まで先端マーカーが流れたら電気を止め、ゲルを取り出した。染色液とゲルの入った容器を３０分間振盪して染色を行った。染色後、脱色液に浸け、緩やかに振盪して、脱色した。ゲルを取り出し、タンパク質バンドを確認した。その結果は、図１０に示す。その分子量検量線を図１１に示す。
【０１３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約３１ｋＤａのバンド一つを確認した。実施例６におけるゲル濾過の結果、ＭＥＨＰエステラーゼの分子量が約６２ｋＤａであったことから、本酵素は、分子量約３１ｋＤａのホモ二量体であると考えられる。
【０１３５】
以上をまとめた精製テーブルを示す。
【０１３６】
【表９】
無細胞抽出物を超遠心分離すると酵素活性は上澄み部分から検出され、比活性は０．１０８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなり、収率は８８．４％となった。ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで精製した段階では、比活性は０．３１８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなり、収率は６６．５％となった。２０％飽和硫安塩析した後は、比活性が０．４３６μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなった。さらに疎水カラムによる精製を行った。その結果、比活性が１．２４μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌと大幅に上昇した。また、限外濾過によっても比活性は１．８８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌに上昇した。これは限外濾過によって低分子のタンパク質が除去できたためと考えられる。次にゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行ったが、比活性はほとんど変化せずタンパク質のピークも単一であった。このことから酵素はほぼ精製が完了した状態であると考え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってその純度を検定した。最終比活性から計算すると、ＭＥＨＰ分解酵素は、全タンパク質量の５％程度あったことになり、かなり多いタンパク質であることが分かった。
【０１３７】
（実施例９．ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度を調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。酵素反応混液の組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ懸濁液１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）９８０μｌであった。１５分間反応を行った。
【０１３８】
反応温度の変化によるＭＥＨＰ分解酵素活性の増減を図１２に示す。
【０１３９】
精製の時に行う活性測定では３０℃で反応を行っていた。しかし、活性は４５℃で３０℃のときの２倍となり最大となった。よって、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度は４５℃であった。
【０１４０】
反応温度１０℃〜４５℃の時のＭＥＨＰ分解酵素活性をＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットした。図１３に示す。図１３のＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットを元に、ＭＥＨＰ分解酵素が酵素反応を行う際に必要なエネルギー（活性化エネルギー）を以下の式より求めた。
【０１４１】
【数１】
【０１４２】
【数２】
計算の結果、ＭＥＨＰ分解酵素の活性化エネルギーは６３．２ｋＪ／ｍｏｌとなった。
【０１４３】
下記の表において、このＭＥＨＰエステラーゼの活性化エネルギーを、他の加水分解酵素の活性化エネルギーと比較した。
【０１４４】
【表１０】
他の加水分解酵素と比べ多少大きな活性化エネルギーを持っていたが、ほぼ同じレベルの値となった。
【０１４５】
（実施例１０．ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨ）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨを調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。但し、バッファーは０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー，ｐＨ８．０〜８．５と０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．５〜８．０を使用した。実施例８の酵素反応混液と同じ組成で、４５℃にて１５分間反応を行った。
【０１４６】
結果を図１４に示す。図１４に示されるように、反応ｐＨが７．０〜８．０では、ほとんど酵素活性に変化はみられなかった。
【０１４７】
（実施例１１．ＭＥＨＰ分解酵素の基質特異性）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＤＥＨＰを反応基質として基質特異性を調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。但し、ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液の代わりに、ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液を用いた。ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＤＥＨＰ懸濁液１００μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）８９０μｌであった。５０ｍＭ ＤＥＨＰ懸濁液は、０．５％デオキシコール酸溶液 ４４０３μｌ、ＤＥＨＰ ９７μｌ、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５００μｌを、超音波破砕機にて懸濁した作製した。
【０１４８】
その結果、反応産物であるＭＥＨＰおよびフタル酸は検出されなかった。よって、ＭＥＨＰ分解酵素はＤＥＨＰを分解できないことが分かった。
【０１４９】
（実施例１２： ＭＥＨＰ分解酵素のメタノールに対する耐性）
脂質加水分解酵素であるリパーゼは、有機溶媒中で合成反応を起こすことが知られており、工業的にも広く利用されている。
【０１５０】
ＭＥＨＰ分解酵素も同様に脂質加水分解酵素であるため有機溶媒に耐性を持つのではないかと考えた。そこで、反応液中に１０〜６０％のメタノールを添加し、ＭＥＨＰ分解酵素活性の変化を調べた。（反応液中に最終０．５％のメタノールが既に含まれている。）
酵素液としてゲル濾過溶出液を５μｌ使用し下記の反応混液を調製し、３０℃にて１５分間反応を行った。
【０１５１】
（使用試薬）
（１）酢酸エチル（和光純薬 試薬特級）
（２）６Ｎ塩酸
（３）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（４）ＭＥＨＰ溶液
【０１５２】
【表１１】
（使用器具および器機）
（１）Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｓｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ製 ＰＥＲＳＯＮＡＬ−１１）
（２）ボルテックスミキサー
（３）高速液体クロマトグラフシステム
（４）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−ＤＵＯ ｆｉｌｔｅｒ
（５）試料前処理用シリンジ １．０ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ。
【０１５３】
（測定方法）
【０１５４】
【表１２】
（１）試験管に表１．６の混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。これを０ ｔｉｍｅと反応後の２本調製した。
（２）振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。
（３）酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。
（４）エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。
（５）有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。
（６）ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを実施例５と同様にしてＨＰＬＣにて測定した。
【０１５５】
結果を図１５に示す。示されるように、メタノール濃度２０％まではＭＥＨＰ分解酵素活性はほぼ一定であった。メタノール濃度２０％を超えると活性が大幅に減少し、メタノール濃度４０％ではｃｏｎｔｒｏｌの１／１０にまで減少した。このことからＭＥＨＰ分解酵素はメタノール濃度２０％まで失活しない酵素であることが分かった。
【０１５６】
（実施例１３：Ｎ末端アミノ酸配列決定）
本実施例のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用するために、以下の試薬を調製した：
分離用アクリルアミド溶液（Ａ液）：アクリルアミド ２９．２ｇ／１００ｍｌ、ビス（ＢＩＳ）０．８ｇ／１００ｍｌ
分離用ゲル緩衝溶液（Ｃ液）：Ｔｒｉｓ １８．２ｇ／１００ｍｌ、ＳＤＳ ０．３７５ｇ／１００ｍｌ、ＨＣｌを用いてｐＨを８．９に調整
濃縮用ゲル緩衝溶液（Ｄ液）：Ｔｒｉｓ ６．１ｇ／１００ｍｌ、ＳＤＳ ０．８ｇ／１００ｍｌ、ＨＣｌを用いてｐＨを６．８に調整
×１０電極液：Ｔｒｉｓ １５ｇ／５００ｍｌ、グリシン：７２ｇ／５００ｍｌ、ＳＤＳ：５ｇ／５００ｍｌ、これらを混合して精製水にてメスアップ
１５％過硫酸アンモニウム（重合開始剤）（Ｅ液）：
色素マーカー入りＳＤＳサンプルバッファー：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８） ４０ｍｌ／１００ｍｌ、グリセロール５０ｍｌ／１００ｍｌ、メルカプトエタノール５ｍｌ／１００ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウム５ｇ／１００ｍｌ；および
ブロモフェノールブルー０．０１ｍｇ／１００ｍｌ。
【０１５７】
ゲル版を９９％エタノールにて洗浄し組み立て、外殻にセットした。１２．５％分離ゲルの調製（Ａ液 １５ｍｌ・Ｃ液 ９ｍｌ・ミリＱ １２ｍｌ）を行った。撹拌した後に５分間脱気を行った。ＴＥＭＥＤ ４０μｌ・Ｅ液１００μｌを添加・撹拌し、ゲル版に流し込んだ後、ミリＱを上から１ｍｌ添加した。濃縮ゲルの調製（Ａ液 ２．７ｍｌ・Ｄ液 ４．５ｍｌ・ミリＱ １１ｍｌ）を行った。撹拌した後に、５分間脱気を行った。ＴＥＭＥＤ ４０μｌ・Ｅ液４５μｌを添加・撹拌し、ゲル版に流し込んだ後にコーム型をセットした。濃縮ゲルが固まった後、外殻を外し泳動槽へセットした。電極液を流し込みコーム型を外してコームの洗浄を行った。マーカーおよびサンプルの準備（マーカー１μｌ・サンプル４μｇを×３ ＳＤＳバッファーに添加し、９５℃にて５分間インキュベート）を行った。マーカーおよびサンプルのチャージの後、泳動を開始した（濃縮ゲル ２０ｍＡ・分離ゲル ４０ｍＡ）。泳動終了後、ゲルを適当な大きさにカットした。
【０１５８】
この後のエレクトロブロッティング及びアミノ酸シーケンスにおいて使用するために、以下の試薬を調製した：
ブロッティング溶液１：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１８．１５ ｇ（終濃度０．３Ｍ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０％ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ブロッティング溶液２：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１．５ｇ（終濃度２５ｍＭ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０％ ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ブロッティング溶液３：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１．５ｇ（終濃度２５ｍＭ）、６−アミノ−ｎ−カプロン酸（一級、Ｗａｋｏ）２．６ｇ（終濃度４０ｍＭ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０ ％ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ＣＢＢ染色液：Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌａｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０ ２．５ｇ、エタノール ２５０ｍｌ、酢酸 １００ｍｌを、１０００ｍｌにメスアップ
脱色液：脱イオン水６５０ｍｌ、エタノール２５０ｍｌ、酢酸１００ｍｌを、１０００ｍｌにメスアップ。
【０１５９】
ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｏｉｌｏｎ Ｐｓａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））（２枚）およびＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ 濾紙（ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＰＡＰＥＲ）（６枚）をゲルよりやや大きめに切った。ＰＶＤＦ膜２枚をメタノールにかるく浸した後、ブロッティング溶液３に浸し、５分間緩やかに振盪した。また、濾紙をブロッティング溶液１、２、３にそれぞれ２枚ずつ浸し、５分間緩やかに振盪した。セミドライブロッティング装置（ＡＴＴＯ）上に、ブロッティング溶液１に浸した濾紙をおき、その上に、ブロッティング溶液２に浸した濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲル（上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを終了し、適当にカットしたものを使用）、ブロッティング溶液３に浸した濾紙を順においた。この際、空気が入らないように重ねた。また、ゲル以外は２枚ずつ、重ねて使用した。ブロッティング装置をセットし、１ｍＡ／ｃｍ２で９０分間転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜を超純水に浸し、５分間振盪した。ＣＢＢ染色液に浸し、１０分間程染色した。脱色液に浸し、バンドが鮮明になる程度脱色した。超純水で５分間程濯ぎ、ドライヤーで膜を乾かした。目的のバンドをＰＶＤＦ膜より切り出し、アミノ酸シークエンサー（ｍｏｄｅｌ １６１０Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）にてＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。以下に決定したアミノ酸配列に示す：Ｎ末端アミノ酸配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）。当業者は、このＮ末端アミノ酸配列から、全長配列を容易に決定することができることが理解される。
【０１６０】
（実施例１４：ＤＥＨＰおよびＭＥＨＰ分解酵素の誘導の有無）
次に、本発明の酵素が、ＤＥＨＰで誘導されるかどうかを検証した。
【０１６１】
ＮＢ培地で培養した細胞は、ＤＥＨＰ分解酵素は菌体内に存在するがＭＥＨＰ分解酵素活性はほとんどなかった。また、ＤＥＨＰ分解酵素の活性自身も低かった。しかし、これはＮＢ培地で培養しているためかもしれない。培地中にＤＥＨＰを入れるといずれの酵素も誘導を受け活性が上昇することが考えられた。そこで、ＤＥＨＰを培地に添加し、上記実施例または特開２００２−１４２７５４号公報に従ってＰ８２１９株を培養し、上記実施例に従って無細胞抽出物を調製した。
【０１６２】
ＮＢ培地で培養した菌から調製した無細胞抽出物を非誘導無細胞抽出物と呼び、ＤＥＨＰを単一炭素源として培養した菌から調製した無細胞抽出物を誘導無細胞抽出物と呼び、それぞれのＤＥＨＰ分解酵素活性を、ＤＥＨＰを基質として上記「ＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法」の節の方法に従い活性測定を行った。なお、反応液中に酵素液として、無細胞抽出物を２５０ μｌ入れた。ＭＥＨＰ分解酵素活性はＭＥＨＰを基質にして上記実施例の方法に従い活性測定を行った。
【０１６３】
その結果を図１６〜図１９に示す。図１６は、無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。図１７は、誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。図１８は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応前を示す。図１９は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【０１６４】
反応前と反応後のＭＥＨＰとフタル酸の増加量をＨＰＬＣによって定量した。ＤＥＨＰ分解酵素活性は生成物のＭＥＨＰ生成速度とフタル酸生成速度を合計し、ＭＥＨＰ分解酵素活性はフタル酸の生成速度から求めた。
【０１６５】
【表１３】
非誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素比活性は１．６０×１０−２（μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）で、ＭＥＨＰ分解比活性は０．２２５×１０−２（μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）となり、ＤＥＨＰ分解活性がＭＥＨＰ分解活性より８倍高い値となった。ＤＥＨＰ分解酵素は、細胞培養時にＤＨＥＰの添加・無添加に関わりなく低い値だった。対照的にＭＥＨＰ分解酵素はＤＥＨＰの誘導によって２５倍活性が上昇し、ＤＥＨＰによる誘導を受けることが分かった。
【０１６６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
従来の因子では不可能であった、ＭＥＨＰ特異的なフタル酸エステル分解が達成された。したがって、本発明は、環境ホルモンとして有害作用を示すといわれるＭＥＨＰを分解することができ、有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の活性測定の際に使用されるＨＰＬＣのフローチャートである。
【図２】本発明のアルカリ抽出による培養液からの菌体タンパク質の抽出法および定量法のフローチャートである。
【図３】本発明の無細胞抽出物の調製法のフローチャートである。
【図４】実施例３におけるＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅのクロマトグラムである。
【図５】実施例３のＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による確認写真である。
【図６】実施例６の疎水カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図７】実施例６のＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による確認写真である。
【図８】実施例７のゲル濾過カラムのクロマトグラムである。
【図９】実施例７のゲル濾過カラムの分子量検量線を示す。
【図１０】実施例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１１】実施例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量検量線を示す。
【図１２】実施例９の反応温度の変化によるＭＥＨＰ分解酵素活性の増減を示す。
【図１３】実施例９の反応温度１０℃〜４５℃の時のＭＥＨＰ分解酵素活性をＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットした図である。
【図１４】実施例１０のＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨを示す図である。
【図１５】実施例１２のＭＥＨＰ分解酵素のメタノールに対する耐性を示す図である。
【図１６】図１６は、無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【図１７】図１７は、誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【図１８】図１８は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応前を示す。
【図１９】図１９は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号１は、本発明のＭＥＨＰ分解酵素のＮ末端の１３アミノ酸残基である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（本明細書中で以後、ＭＥＨＰ）エステラーゼに関する。本発明のＭＥＨＰエステラーゼは、フタル酸エステルを分解する微生物に由来し、詳細には、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属細菌に由来し、より詳細には、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．Ｐ８２１９株）に由来する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境ホルモンと総称される物質が、社会的に大きな問題を引き起こしている。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれ、極微量であっても、人間をはじめとする動物の体内で内分泌系を撹乱する作用を有する、人工または植物由来の化学物質である。環境ホルモンは、人間をはじめとする動物に対して明白な毒性効果を有することが指摘されている。環境ホルモンの作用によって、動物では、性転換、精子密度の減少等の生殖器官形成の異常が起きる。これらの異常は種の絶滅に繋がりかねない。それゆえ、自然環境から環境ホルモンを除去することが重要な課題となっている。
【０００３】
環境ホルモンの中でも、フタル酸エステル（例えば、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（本明細書中で以後、ＤＥＨＰ））は、プラスチックを製造する際の可塑剤として用いられ、多量に製造および使用される。ＤＥＨＰは環境中に放出されても生物分解されにくく、動物に対して長期にわたって影響を及ぼし続ける。それゆえ、自然環境からのＤＥＨＰの除去が重要な課題となっている。
【０００４】
本発明者らは、以前に、フタル酸エステルを分解する能力を有するＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を単離し、２０００年１１月８日付けで、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧工業技術院生命工学工業技術研究所）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託した（特許文献１）。
【０００５】
ＤＥＨＰをフタル酸に分解する経路として現在までのところ２種類の経路が提唱されている。まず一つは、ＤＥＨＰから直接フタル酸に加水分解する経路である。微生物ではＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１が産出する菌体外酵素のみが知られている（非特許文献１）。Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の産出する酵素は菌体外酵素で分子質量は１５ｋＤａで、最適ｐＨ ８．６、最適反応温度４２ ℃である。この酵素はＣａ２＋で活性化され、Ｈｇ２＋のようなその他の金属イオンでは阻害をうける。比活性は最終２，９２０ ｕｎｉｔ／Ｏ．Ｄ２８０である。
【０００６】
第２は、ＤＥＨＰをフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）に加水分解し、別の酵素でＭＥＨＰをフタル酸に分解する経路である。フタル酸ジエステルをフタル酸モノエステルに加水分解する酵素がヒトの唾液４）や、豚の肝臓に局在するカルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ ３．１．１．１）（非特許文献２）、および小麦の細胞（非特許文献３）から精製されている。そのＤＥＨＰ分解経路およびＤＥＨＰ分解酵素の性質を、以下の表１および表２に示す。
【０００７】
【表１】
【０００８】
【表２】
【特許文献１】特願平２０００−３４１２１４
【非特許文献１】Ｋｕｒａｎｅ，Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２９，１１８−３４，１９９７
【非特許文献２】Ｔ．Ｎｉｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４９（１）７６−８１，２００３，
【非特許文献３】Ｈａｎｓ−ｗｉｌｌｉ ＫＲＥＬＬら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３，５７−６２，１９８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在まで、ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素は、単離されていない。本願は、ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素の単離およびその特徴付けを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
・（項１） フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、上記酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、上記サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。
・（項２） 項１に記載の酵素であって、上記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、酵素。
・（項３） 項１または２に記載の酵素であって、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株により産生される、酵素。
・（項４） 項１〜３のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の反応最適温度は約４５℃である、酵素。
・（項５） 項１〜４のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の反応最適ｐＨは７．０〜８．０である、酵素。
・（項６） 項１〜５のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有さない、酵素。
・（項７） 項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素は、２０重量％のメタノールの存在下で９０％以上の活性が保持される、酵素。
・（項８） 項１〜７のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、上記酵素の活性化エネルギーは約６３ｋＪ／ｍｏｌである、酵素。
・（項９） 項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
・（項１０） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質を、項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させ、上記酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程
を包含する、方法。
・（項１１） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるためのキットであって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
上記酵素の使用方法を指示する指示書と、
を含む、キット。
・（項１２） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させる組成物であって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
・（項１３） フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素を精製するための方法であって、
産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を、フタル酸ジ−２−エステルの存在下または非存在下で培養する工程、ならびに
上記培養物を、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに順次供する工程、
を包含する、方法。
・（項１４） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質中の初期フタル酸量を測定する工程、
上記物質を、項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させて、上記酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程、および
上記インキュベート後の物資中のフタル酸量を測定する工程、
を包含し、
上記初期フタル酸量と比較した上記インキュベート後の物質中のフタル酸量の減少は、上記物質におけるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を示す、方法。
・（項１５） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するためのキットであって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
上記酵素の使用方法を指示する指示書と、
を包含する、キット。
・（項１６） フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための組成物であって、
項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
・（項１７） 項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素に対する抗体。
【発明の効果】
【００１１】
ＭＥＨＰ分解活性を有する酵素を初めて提供した。このような分解活性を有することは、従来知られておらず、しかも、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（ＤＥＨＰ）加水分解活性を有しないような選択性を有する酵素は、従来になかった。従って、ＤＥＨＰを分解することが好ましくない状況において、有害ホルモン様物質であるＭＥＨＰを分解することが必要な場合に、特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「ＭＥＨＰ」とは、「フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（Ｍｏｎｏ−２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）」の略称であり、本明細書では、両者とも同じ意味で使用される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「ＤＥＨＰ」とは、「フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（Ｄｉ−２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）」の略称であり、本明細書では、両者とも同じ意味で使用される。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）加水分解活性」とは、基質ＭＥＨＰの少なくとも一部をフタル酸へと加水分解する活性を意味する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「フタル酸ジ−２−エチルヘキシル（ＤＥＨＰ）加水分解活性」とは、基質ＤＥＨＰの少なくとも一部（好ましくは、少なくとも１０％以上）をＭＥＨＰまたはフタル酸へと加水分解する活性を意味する。
【００１７】
（微生物）
本発明で使用される特に好ましいＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓであるＰ８２１９株は、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号（現：産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号）ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として、２０００年１１月６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現：産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に寄託されており、当業者は、この株を代表例として使用することができることが理解される。
【００１８】
本明細書中では、「フタル酸エステル」とは、以下の式に示す構造を有するフタル酸エステルをいう：
【００１９】
【化１】
上記化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素およびアルキルからなる群から選択されるがＲ１およびＲ２は同時に水素ではない。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は同時にアルキルである。ここで、ＭＥＨＰおよびＤＥＨＰがこのフタル酸エステルの範囲内に入ることが理解される。
【００２０】
本明細書中で用いられる「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の、不飽和結合を有さない炭化水素基を表し、特に指定がない場合、任意の鎖長を有する。
【００２１】
アルキルの例として、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチルなどが挙げられる。
【００２２】
例えば、アルキルが「１〜１５個の炭素原子を有するアルキル」として記載されている場合、この基は例えば、ｎ−メチル、ｎ−エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デセニル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−イコサニル、ｎ−ヘニコサニル、ｎ−ドコサニル、ｎ−トリアコンチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニルまたはイソノニルを意味し得る。
【００２３】
好ましくは、アルキルは、独立して、１〜１５個の炭素原子を有するアルキルである。アルキルは、独立して、好ましくは２〜１５個、より好ましくは３〜１５個、さらにより好ましくは４〜１５個、さらにより好ましくは５〜１４個、さらにより好ましくは６〜１３個、さらにより好ましくは７〜１２個、さらにより好ましくは８〜１１個の炭素原子を有するアルキルであり、最も好ましくは８個の炭素原子を有するアルキルである。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方は、２−エチルヘキシル基であり、さらにより好ましくはＲ１およびＲ２はいずれも２−エチルヘキシル基である。
【００２４】
フタル酸エステルは、好ましくは、環境ホルモンである。本明細書中で用いられる「環境ホルモン」とは、ホルモン様の作用を有する物質であって、ホルモンのかかわる過程を撹乱する物質をいう。環境ホルモンは、内分泌撹乱物質とも呼ばれる。環境ホルモンとして作用するフタル酸エステルの例としては、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジノニル、フタル酸ジイソノニル、フタル酸ジエチルなどが挙げられる。
【００２５】
ここで、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルは、プラスチックの可塑剤として広く用いられており、日本における国内生産量と輸入量の合計は、２５９，９２７ｔ（２００１年度）と非常に多い。しかし、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルは、動物実験において大量投与による肝・腎の変性および繁殖能力の低下が見られ、催奇形性、変異原性も報告されている。毒性は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルよりも、その代謝中間産物であるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの方が強いことが認められている。従って、本発明のようなフタル酸モノ−２−エチルヘキシルに対して選択性のある分解酵素は、他の基質(例えば、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル）との反応による予想外の結果を伴わずにフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを分解可能であるという点で有用である。
【００２６】
本明細書中で用いられる「規定培地」とは、構成成分が全て規定されている培地をいう。規定培地は、一般的な細菌の培地であり得、例えば、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏培地、ＮＢ培地などの培地である。
【００２７】
Ｍ９培地の組成は、以下の実施例２に示すとおりである。普通ブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。ハートインフュジョン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ウシ心臓滲出液５００ｇ、ペプトン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．４に調整された培地である。トリプトソイブイヨン培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、トリプトン１７ｇ、ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを含み、ｐＨが７．３に調整された培地である。ツァペックドックス氏培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、ショ糖 ３０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＮａＮＯ３ ２ｇ、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇを含み、ｐＨが５．６に調整された培地である。ＮＢ培地は、水を溶媒として、培地１リットルあたり、肉エキス３ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス２ｇ、および塩化ナトリウム２ｇを含み、ｐＨが７．０に調整された培地である。
【００２８】
本明細書中で用いられる「消失」とは、何らかの作用により、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルが検出されなくなることをいう。フタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルの消失は、フタル酸エステルの２つのエステル部分のうちのいずれか一方にのみ生じたエステル分解に起因してもよいが、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの場合は、一つしかないので、その一つのエステルが分解されたことをもって消失という。消失をもたらす原因の例としては、エステル分解、アルキル鎖の切断などが挙げられる。好ましくは、消失は、フタル酸エステルのエステル部分のエステル分解によって生じる。
【００２９】
本発明において用いられるＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓおよびフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む生物は、当該分野で公知のスクリーニング方法によって天然のサンプルから単離され得る。このようなスクリーニング方法の例として、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを唯一の炭素源としてサンプルの培養を行い、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる細菌を濃縮し、そして単離する方法が挙げられる。天然のサンプルは、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを排出する工場の汚水、下水処理場の活性汚泥、廃棄物処理場の土壌などであり得る。
【００３０】
あるいは、本発明において使用され得るＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、フタル酸エステル分解能を保持しさえすれば、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託された菌株に変異誘発処理を行うことにより得られるか、または天然に変異を受けた誘導体であってもよい。そのような変異誘発処理は当該分野で周知であり、そのような変異誘発処理を行うための変異原としては、α線、β線、γ線およびＸ線のような物理的変異原、ならびにニトロソグアニジンおよびベンゾピレンのような化学的変異原が挙げられる。
【００３１】
本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシルのようなフタル酸エステルの分解方法では、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌から抽出された酵素を用いることができる。この方法では、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む溶液中で培養する工程を包含する。この方法で用いられる溶液は、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させることを所望するサンプル自体であってもよいし、このサンプルに無機塩（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４ＣｌおよびＮａＣｌ）を添加して、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌の培養に、より適したものとなるように成分を調整したものであってもよい。好ましくは、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切であるように成分の調整を行う。
【００３２】
本発明の方法では、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルに、無機成分などを添加して、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌の培養に適切な溶液を調製する。次いで、この溶液に、フタル酸エステルを消失させる能力を有する細菌を添加する。添加する細菌は、予め前培養を行って順調に増殖している状態にあってもよいし、そうでなくともよい。予め前培養を行うことが好ましい。溶液に添加する細菌の量は、適切に選択され得るが、代表的には、溶液１ｍｌあたり約１０３〜１０９個、好ましくは約１０４〜１０８個、より好ましくは約１０６〜１０８個である。この細菌から、本明細書に記載されるような精製方法によって、本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシル分解酵素を単離する。
【００３３】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含む溶液に、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する酵素またはそれを含む組成物を添加した後、この溶液は、約１０℃〜約４５℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃、最も好ましくは約３０℃にて培養される。培養を行う際には、溶液を攪拌してもよいし、攪拌しなくともよい。
【００３４】
本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させるための組成物は、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属に属する、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを消失させる能力を有する細菌から抽出された酵素を含む。培地の濃縮物は、培養時にフタル酸モノ−２−エチルヘキシル分解活性を有する酵素を含む細菌の増殖に適切であるようなものが使用され得る。培地の濃縮物の例としては、前記濃縮物が、Ｍ９培地、普通ブイヨン培地、ハートインフュジョン培地、トリプトソイブイヨン培地、ツァペックドックス氏液、およびＮＢ培地からなる群より選択される培地の濃縮物である。本発明の組成物は、例えば、フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを少なくとも部分的に消失させることが所望されるサンプルと混合して使用するために好適である。
【００３５】
例えば、本発明において使用される細菌は、ガラス、プラスチックなどで作製された管状物中に封入され得る。また、細菌は、ゼラチンなどのコーティング剤で包まれたカプセル剤（好ましくは、ソフトカプセル剤）中に封入され得る。培地の濃縮物は、乾燥粉末状態にあることが好ましい。
【００３６】
（ＤＥＨＰの分解経路と分解酵素）
ＤＥＨＰをフタル酸に分解する経路として現在までのところ２種類の経路が提唱されている。
【００３７】
第一は、ＤＥＨＰから直接フタル酸に加水分解する経路である。微生物ではＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１が産出する菌体外酵素のみが知られている。Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の産出する酵素は菌体外酵素で分子質量は１５ ｋＤａで、最適ｐＨ ８．６、最適反応温度４２℃である。この酵素はＣａ２＋で活性化され、Ｈｇ２＋のようなその他の金属イオンでは阻害をうける。比活性は最終２，９２０ ｕｎｉｔ／Ｏ．Ｄ．２８０である。
【００３８】
第２は、ＤＥＨＰをフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）に加水分解し、別の酵素でＭＥＨＰをフタル酸に分解する経路である。フタル酸ジエステルをフタル酸モノエステルに加水分解する酵素がヒトの唾液、豚の肝臓に局在するカルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ ３．１．１．１）（Ｔａｔｓｕｈｉｒｏ Ｎｉｉｎｏ，Ｔｏｈｒｕ Ｉｓｉｂａｓｈｉ，Ｈａｊｉｍｕ Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｋｅｎ Ｔａｋｅｄａ，Ｓｕｋｅｏ Ｏｎｏｄｅｒａ（２００３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４９（１） ７６−８１）、小麦の細胞（Ｈａｎｓ−ｗｉｌｌｉ ＫＲＥＬＬ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＳＡＮＤＥＲＭＡＮＮ，Ｊｒ（１９８４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３，５７−６２）から精製されている。現在知られているＤＥＨＰをＭＥＨＰに加水分解する酵素の性質は表２に示されている。
【００３９】
Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株が単離された当初、この菌はＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１の近縁属であることから、ＤＥＨＰを菌体外でフタル酸に加水分解すると考えられたが、Ｐ８２１９株はフタル酸を資化しないことからＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ Ｓ−１とは異なる分解酵素および代謝経路を有することも考えられた。しかし、Ｐ８２１９株の代謝経路およびＤＥＨＰ分解酵素の性質は未解明である。
【００４０】
現在までに知られているＤＥＨＰの分解経路は、表１に示されている。
【００４１】
このように、第二の経路の場合、ＭＥＨＰがいまだに残ることが想定される。このようなＭＥＨＰもまた、有害作用を有することから、そのような有害物質の除去が必要となる。ＤＥＨＰが体内に入ると、ＭＥＨＰに分解され尿中に排出される。しかし、腎臓の機能が低く血液透析や腹膜透析を必要とする場合、体内にＭＥＨＰが大量に蓄積する。ＭＥＨＰが催奇性、発ガン性、肝毒性を示すことが報告されている。従って、ＭＥＨＰを分解する活性は必須であるといえる。
【００４２】
（フタル酸およびフタル酸エステル類の測定法）
（使用試薬）
（１）イソアミルアルコール（和光純薬 試薬特級）
（２）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（使用器具）
（１）分液ロートシェーカー
（２）高速液体クロマトグラフシステム
・クロマトパック Ｃ−Ｒ８Ａ ＶＰ
・ポンプ ＬＣ−１０ＡＤ ＶＰ
・デガッサー ＤＧＵ−１２Ａ ＶＰ
・カラムオーブン ＣＴＯ−１０Ａ ＶＰ
・検出器 ＳＰＤ−１０Ａ ＶＰ
・コントロールパネル ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ
（３）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−Ｄｕｏ ｆｉｌｔｅｒ
（４）試料前処理用シリンジ １．０ ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ
（実験操作）
１．培養した２０ｍｌの培養液に６ＮのＨＣｌを１ｍｌ添加し、イソアミルアルコールを２０ｍｌ加え、５０ｍｌ容分液ロートに移した後、分液ロートシェーカーにて１０分間撹拌する。
２．エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ ｒｐｍにて３分間遠心分離を行う。
３．有機相を回収し、培養０〜３０時間は５倍量、３０時間以降は等量のメタノールに置換する。
４．ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを下記のＨＰＬＣの条件にて測定を行う。
【００４３】
（ＨＰＬＣの例示的条件）
【００４４】
【表３】
以上の操作を 図１にフローチャートで示す。
【００４５】
（アルカリ抽出による培養液からの菌体タンパク質の抽出法および定量法）
（使用試薬）
（１）ＮａＯＨ（和光純薬 試薬特級）
（２）ＨＣｌ（和光純薬 試薬特級）
（３）フォリン・シカトーフェノール試薬（Ｓｉｇｍａ製）
（４） ローリー試薬（下記表参照）
【００４６】
【表４】
（使用器具）
（１）遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｍｔｉ−２５）
（２）分光光度計（島津製 ＵＶ−１６００）
（実験操作）
（アルカリ抽出法による培養液からの菌体タンパク質の抽出）
（１）各種フタル酸エステル類を単一炭素源とするＭ９液体培地（２０ｍｌ培地／１００ｍｌ容三角フラスコ）に培養した培養液を１０，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃にて集菌した。
（２）遠心後の細胞に２０ｍｌ（０、１２、２３時間培養液は５ｍｌ）の精製水を加えて懸濁し、試験管に４ｍｌずつ分注した。
（３）それぞれに液量と等量の１Ｎ ＮａＯＨを添加し、ボルテックスにて撹拌した。
（４）１００℃にて１０分間インキュベートした。
（５）流水で冷却し、１Ｎ ＨＣｌを１Ｎ ＮａＯＨと等量添加し、ボルテックスにて撹拌した。
（６）１０，０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離した後、浮遊物や沈殿物が混入しないように、上澄み部分をエペンチューブに移した。
【００４７】
以上の操作を図２にフローチャートで示した。
【００４８】
（Ｌｏｗｒｙ法による抽出液中のタンパク質濃度の測定）
（１）ワッセルマン試験管にそれぞれのエッペンチューブより抽出液を５００μｌ入れ、ローリー試薬を２．５ｍｌ添加後、ボルテックスミキサーにて撹拌し、室温で１５分間反応させた。ブランクとしてワッセルマン試験管に精製水を５００μｌ入れ、ローリー試薬を添加し、同様に反応させた。
（２）１５分後、フェノール試薬を５００μｌずつ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌後室温で３０分間反応させ、吸光度計にてＯ．Ｄ７５０を測定した。
【００４９】
（無細胞抽出物の調製法）
（材料）
ＮＢ本培養液２Ｌ
（使用する緩衝液など）
０．１ Ｍ リン酸バッファー，ｐＨ ７．５
（１）Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬 試薬特級）
（２） ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬 試薬特級）
・それぞれ脱イオン水にて０．１ Ｍの溶液を作り、混合してｐＨ ７．５に調整した。
【００５０】
（使用器機）
（１）遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２５）Ｒｏｔｅｒ ＩＤ ＪＡ １４
（２） ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ製 Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ）
（３）超遠心分離器（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製）
（使用試薬）
（１）フェニルメチルスルホニルフルオリド（以下ＰＭＳＦ）、ＳＩＧＭＡ製 分子量１７４．２
（２）ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）、ナカライテスク製
（実験操作）
（１）培養した本培養液２Ｌを遠心分離して細胞と培養液上澄みに分画する。細胞を無菌的に滅菌水に懸濁して遠心分離を行い、上澄みを除去する。この操作を２回繰り返し、細胞の洗浄を行う。
（２）細胞をＭ９合成培地（５００ｍｌ容三角フラスコ２００ｍｌ×１０本）に加え、ＤＥＨＰを１，５００ｐｐｍ添加した。２５℃のロータリーシェーカーで１５時間振盪し、酵素の誘導を行う。
（３）集菌した細胞２Ｌ分を−４０℃に冷却した９９％エタノール２００ｍｌに懸濁する。
（４）直ちに１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離を行い、上澄みのエタノールを除去する。
（５）０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．５で細胞を洗浄する。
（６）０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．５に懸濁し、ガラスビーズ（０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍΦ）を加える。
（７）ＤＭＳＯに溶解した０．２５ＭのＰＭＳＦを０．１％（ｖ／ｖ）添加した後、ダイノミルを用いて細胞を破砕（３０秒間×６回）する。
（８）濾過を行い、ガラスビーズを取り除く。
（９）細胞破砕液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄みを回収し、無細胞抽出物とする。
【００５１】
以上の操作を図３にフローチャートで示す。
【００５２】
（ＤＥＨＰおよびＭＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
（材料）
酵素液（試料）
（使用試薬）
（１）酢酸エチル（和光純薬 試薬特級）
（２）６Ｎ塩酸
（３）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（４）ＤＥＨＰ懸濁液（表５参照）
（５）ＭＥＨＰ溶液（表６参照）
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】
（使用器具および器機）
（１）Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｓｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ製 ＰＥＲＳＯＮＡＬ−１１）
（２）ボルテックスミキサー
（３）高速液体クロマトグラフシステム
（４）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−ＤＵＯ ｆｉｌｔｅｒ
（５）試料前処理用シリンジ １．０ ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ
（実験操作）
（ＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
【００５５】
【表７】
（１）試験管に表１．６の混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。これを０ ｔｉｍｅと反応後の２本調製する。
（２）振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌する。
（３）酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行う。
（４）エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行う。
（５）有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換する。
（６）ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルをＨＰＬＣにて測定する。
【００５６】
（ＭＥＨＰ分解酵素活性の測定法）
【００５７】
【表８】
表８の反応混液を調製し、酵素反応を１５分間行った。以下の操作はＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法に準じる。
【００５８】
（本発明の酵素）
（１）ＤＥＨＰによる誘導を行った無細胞抽出物からＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム、疎水カラム、ゲル濾過カラムの各種クロマトグラフィーによって酵素の精製を行った。例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の最終の収率は１６．８％、比活性１．８２μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであった。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる酵素の精製純度を検定した結果、分子質量３０ｋＤａ付近に単一のバンドがみられた。ゲル濾過の結果、ＭＥＨＰエステラーゼの分子量が約６２ｋＤａであったことから、本酵素は、分子量約３１ｋＤａのホモ二量体であると考えられる。
（３）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の反応最適温度は、４５℃で、反応最適ｐＨは、７．０〜８．０であった。
（４）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例の活性化エネルギーを算出した結果、６３．２ｋＪ／ｍｏｌであるが、この半分〜２倍程度の結果が本発明の好ましい例示的範囲として挙げることができる。
（５）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例は、好ましくは、ＤＥＨＰを基質にしない。
（６）例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例はメタノール濃度２０％まではほとんど酵素活性に影響しなかった。
（７）ＭＥＨＰ分解酵素を持つ酵素や、ＭＥＨＰ分解酵素の精製に関する報告がなく、例示的に、Ｐ８２１９株によって産出され得る例示的な本発明のＭＥＨＰ分解酵素の代表例は新規の酵素であるようである。
【００５９】
（本発明において用いられる生化学技術）
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００６０】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００６２】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に、場合によっては染色体外に（例えば、プラスミド上に）、一定の順序に配列している。ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のようなタンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の遺伝子というときは、通常、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の構造遺伝子およびＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００６３】
本明細書において遺伝子（例えば、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００６４】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、例えば、本明細書において提供される配列情報に基づいて、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００６５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００６６】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００６７】
本明細書において用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００６８】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００６９】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号 １文字記号 意味
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ａｓｘ アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ 不明または他のアミノ酸。
【００７０】
塩基
記号 意味
ａ アデニン
ｇ グアニン
ｃ シトシン
ｔ チミン
ｕ ウラシル
ｒ グアニンまたはアデニンプリン
ｙ チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ グアニンまたはシトシン
ｗ アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００７１】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特にＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のような酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本明細書において、例えば、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸に対応するアミノ酸または核酸は、それぞれヒトＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子におけるアミノ酸または核酸などが例示される。
【００７２】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素の遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素遺伝子）の配列の全部または一部をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００７３】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００７５】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００７６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７７】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００７８】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００７９】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ法（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ法（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００８１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００８２】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００８３】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【００８４】
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する核酸分子において行われ得る。
【００８５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００８６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００８７】
親水性指数もまた、ポリペプチドの設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００８８】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８９】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００９０】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ ＺｏｌｌｅｒおよびＭｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【００９１】
本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素は、代表的には、そのサブユニットが、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を含むことによって特徴付けられる。当業者は、このような配列情報から、全長アミノ酸配列を容易に決定することができることが理解される。また、当業者は、このような配列情報から、核酸配列情報をも決定することができることが理解される。このようなアミノ酸配列の情報は、例えば、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株から、本明細書に記載された精製方法に従って、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素を精製し、配列決定することによって、全長配列を決定してもよい。好ましい実施形態では、本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素は、ＤＥＨＰを加水分解する活性を有しない。
【００９２】
本発明において用いられるＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、本発明のフタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）加水分解活性を有する酵素を提供する。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、グラム陽性高ＧＣ含量細菌である。Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓは、ミコール酸含有放線菌群に分類され、ノカルジア科に属する。本発明においてＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓを用いる場合、フタル酸モノ−２−エチルヘキシル（ＭＥＨＰ）を含む規定培地中で３０℃にて３０時間培養した場合、このＭＥＨＰの８０％以上が消失し、好ましくは９０％以上が消失し、より好ましくは９５％以上が消失し、そして最も好ましくは１００％消失する。本発明では、好ましくは、このＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓから分離された本発明のＭＥＨＰ加水分解活性を有する酵素を使用することができるが、それに限定されず、他の生物に由来する酵素も使用することができることが理解される。そのような他の生物としては、例えば、ノカルジア科に属する細菌を挙げることができる。当業者は、本明細書の記載に基づき、本発明の上記酵素を精製および単離することができることが理解される。
【００９３】
本明細書中において、機能的に等価な（すなわち、ＭＥＨＰ加水分解活性を有する）ポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００９４】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００９５】
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
【００９６】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，第３版（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙおよびその最新版；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００９７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ら（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９８】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該分野において多数存在し、販売元により、微妙な違い（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を変えて販売されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版）」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＪおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ３（Ｖｏｌｕｍｅ ３），Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａ３．２（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＵＳＡ，２００１）に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【００９９】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１００】
本明細書において使用される組み換えベクターとしては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダＦＩＸベクター（ファージベクター）を、ｃＤＮＡのスクリーニングではラムダＺＡＰベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノムＤＮＡのクローニングにはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／−，ｐＧＥＭ，ｐＣＲ２．１ ベクター（プラスミドベクター）を主に使用することができる。発現ベクターとしてｐＳＶ２ｎｅｏベクター（プラスミドベクター）を利用することができる。このようなベクターは、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ３．２を参考にして適宜実施することができる。
【０１０１】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１０２】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１０３】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１０４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１０５】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版および第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１０６】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１０７】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１０８】
（形質転換体からの単離・精製）
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
【０１０９】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチド変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１１０】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１１１】
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
【０１１２】
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる。
【０１１３】
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
【０１１４】
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【０１１５】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１１６】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明の抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１１７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、崇城大学において規定される基準を遵守した。
【０１２０】
まず、以下の実施例で使用される主な方法および材料を説明する。
【０１２１】
（実施例１．Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株の培養）
Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株（産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号）を、保存菌（ＮＢ斜面培地）より白金耳にて菌を取り、ＮＢ前培養液体培地に植菌し、設定温度２５℃のロータリーシェーカー（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製ｉｎｎｏｖａ ４３３０ １ ｉｎｃｈストローク）にて培養した。ＮＢ液体培地で３日間培養した前培養液をＭ９液体培地（２０ｍｌ／１００ｍｌ容三角フラスコ）に２％（ｖ／ｖ）植菌し、各種フタル酸エステルを１．０ｍｌ／ｌになるように添加し、設定温度２５℃のロータリーシェーカーにて培養した。
【０１２２】
（実施例２．無細胞抽出物の作製）
実施例１において培養した本培養液２Ｌを遠心分離して、細胞と培養液上澄みに分画した。細胞を無菌的に滅菌水に懸濁して遠心分離を行い、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、細胞の洗浄を行った。細胞を、Ｍ９合成培地（５００ｍｌ容三角フラスコ２００ｍｌ×１０本）に加え、ＤＥＨＰを１，５００ｐｐｍ添加した。２５℃のロータリーシェーカーで１５時間振盪し、酵素の誘導を行った。集菌した細胞２Ｌ分を、−４０℃に冷却した９９％エタノール２００ｍｌに懸濁した。遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製 Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２５）において、直ちに１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離を行い、上澄みのエタノールを除去した。０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ ７．５で細胞を洗浄した。０．１ Ｍリン酸バッファー，ｐＨ ７．５に懸濁し、ガラスビーズ（０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍΦ）を加えた。ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）（ナカライテスク製）に溶解した０．２５Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド（以下ＰＭＳＦ）（ＳＩＧＭＡ製，分子量１７４．２）を０．１％（ｖ／ｖ）添加した後、ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ製 Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ）を用いて細胞を破砕（３０秒×６回）した。濾過を行い、ガラスビーズを取り除いた。細胞破砕液を１０，０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄みを回収し、無細胞抽出物とした。
【０１２３】
（実施例３．ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例２で調製した無細胞抽出物を、超遠心分離器（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ製）において超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ，１時間，４℃）した後に得られた上澄みを精製水にて２倍希釈して脱気した後、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：ＤＥ−５２担体（Ｗｈａｔｍａｎ）
担体の体積：φ１．８×２６ｃｍ
流速：２０ｍｌ／時間
１フラクション：９．８ｍｌ
チャージ：２００ｍｌ
使用バッファー：Ａバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５），Ｂバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５＋０．５Ｍ ＫＣｌ）。
ただし、グラジエント溶出は、Ａバッファー１５０ｍｌとＢバッファー１５０ｍｌで行った。その結果は、図４に示す。
【０１２４】
図４においてプールと示されている部分をプールして以下の実験に用いた。
【０１２５】
（実施例４．ＴＬＣによるＭＥＨＰ分解酵素活性の確認）
実施例３で得た溶出液のうち、ＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認し（図５）、プールし、これをＤＥＡＥ溶出液とした。
【０１２６】
詳細には、試験管に、ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１００μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）８９０μｌであった。５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液の組成は、ＭＥＨＰ溶液２ｍｌ当たり、ＭＥＨＰ ２７ｍｇ、メタノール９７３μｌ、２０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １０００μｌであった。これを０分時と反応後の２本調製した。振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを、ＴＬＣに供した。
【０１２７】
まず、ＴＬＣのプレートの下端から１ｃｍのところに鉛筆で開始線を線引きし、開始線上に開始点をうった。開始点に１／１０量のメタノールに置換した反応産物抽出液を４μｌ（２μｌ×２回）スポットした。シリカゲルプレートの下部を展開溶媒に浸し、サンプルの展開を行った。展開後、シリカゲルプレートを取り出し、展開溶媒を乾かした。波長２５４ｎｍのＵＶランプを照射し、酵素の局在するフラクションを検定した。ＴＬＣの条件は、以下の通りであった：
標準物質：フタル酸、ＤＥＨＰ、ＭＥＨＰ ２５ｍＭ溶液
使用プレート：シリカゲル７０Ｆ２５４プレート５×１０ｃｍ
展開溶媒：ベンゼン：メタノール：酢酸＝８５：１３：２。
【０１２８】
（実施例５．ＨＰＬＣによるＭＥＨＰ分解酵素活性の確認）
実施例４で得た溶出液フラクションのＭＥＨＰ分解酵素活性を、ＨＰＬＣによっても測定した。試験管にＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。ＭＥＨＰ分解酵素活性測定用反応混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ溶液（実施例４と同様）１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）９８０μｌであった。これを０分時と反応後の２本調製した。振盪速度 １２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを、下記のＨＰＬＣの条件にて測定を行った：
検出波長 ２５４ｎｍ
サンプルループ ２０μｌ
流速 １ｍｌ／分
溶離液（Ａ：メタノール：１０ｍＭリン酸＝１：４）
溶離液（Ｂ：メタノール）
カラムオーブン温度：４０℃
カラム：Ｗａｋｏｐａｋ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
カラム充填剤：Ｈａｎｄｙ−ＯＤＳ
時間プログラム（分）：
０〜５ Ａ→Ｂ
５〜１５ Ｂ
１５〜２０ Ｂ→Ａ
２５ 停止。
【０１２９】
（実施例６．疎水カラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例４においてＭＥＨＰ分解酵素活性の確認したＤＥＡＥ溶出液を氷水中で冷却しながら硫酸アンモニウムを加え、２０％飽和硫酸アンモニウム塩析を行った。１２時間平衡化し、１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離後、上澄みを疎水カラムにチャージし、疎水カラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＢＵＴＹＬ ６５０Ｍ（東ソー）
担体の体積：φ１．８×１２．７ｃｍ
流速：２０ｍｌ／時間
１フラクション：チャージ〜洗浄９．６ｍｌ
グラジエント４．８ｍｌ
サンプルチャージ：８７ｍｌ
使用バッファー：Ｃバッファー（５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５＋２０％飽和硫酸アンモニウム），Ａバッファー。
【０１３０】
ただし、グラジエント溶出はＣバッファー１００ｍｌとＡバッファー１００ｍｌで行い、各フラクションのＡ２８０を測定した。実施例４と同様の手順に従い、ＴＬＣにてＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを確認し、プールした。Ｃバッファーを流速２０ｍｌ／ｈｒで流した。フラクション１本あたりチャージ〜洗浄が９．８ｍｌ、グラジエント溶出は４．８ｍｌ分取した。菱型はタンパク質濃度（Ａ２８０）、直線は硫安濃度を表している。フラクションＮｏ．１〜２はチャージ、フラクションＮｏ．３〜１１は洗浄、フラクションＮｏ．１２〜４７はグラジエント溶出をおこなった。なお、グラジエント溶出はＣバッファー、Ａバッファーともに１００ｍｌにて行った。ＴＬＣにて各フラクションの酵素反応産物の有無を調べた。これを疎水カラム溶出液とした。その結果は、図６に示す。図７には、図６の各フラクションのＴＬＣ分析の結果を示す。
【０１３１】
（実施例７．ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる酵素の精製）
実施例６で得た疎水カラム溶出液を限外濾過器８０５０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）（メンブレンとしてＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＹＭ １０を使用した）を用いて濃縮し、Ｄバッファー（１０ ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ ７．５）に置き換えた。ゲル濾過カラムにチャージし、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行った。その条件は、以下の通りであった：
使用担体：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
担体の体積：φ２．０×４６ｃｍ
流速：３０ｍｌ／時間
１フラクション：２．０ｍｌ
サンプルチャージ：２ｍｌ
使用バッファー：Ｄバッファー。
【０１３２】
各フラクションのＡ２８０を測定した。実施例４と同様の手順に従って、ＴＬＣにてＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを確認し、それぞれの酵素活性をＨＰＬＣで測定した。これをゲル濾過溶出液とした。Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を同様の操作により流し、酵素の分子量を決定した。ゲルろ過スタンダードの溶出パターンから分子量検量線を作成し、分子質量の決定を行った。その結果、分子量は、約６２ｋＤａであった。その結果は、図８に示す。図９には、ゲル濾過カラムの分子量検量線を示す。
【０１３３】
（実施例８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度の確認）
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを作製した。実施例７で得たゲル濾過溶出液に、×３サンプルバッファー（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー，ｐＨ６．８を２ｍｌ、ＳＤＳを０．６ｇ、グリセリンを５ｇ、ＢＰＢを２ｍｇ混合して、ミリＱで１０ｍｌにメスアップした）をサンプル容積の１／３を加え、９５℃にて５分間熱処理後、泳動を行った。サンプルを各レーンにチャージした。濃縮ゲルを、先端マーカーが移動中は２０ｍＡで、分離ゲルを、先端マーカーが移動中は４０ｍＡで、電気泳動した。分離ゲルの８０％程度まで先端マーカーが流れたら電気を止め、ゲルを取り出した。染色液とゲルの入った容器を３０分間振盪して染色を行った。染色後、脱色液に浸け、緩やかに振盪して、脱色した。ゲルを取り出し、タンパク質バンドを確認した。その結果は、図１０に示す。その分子量検量線を図１１に示す。
【０１３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約３１ｋＤａのバンド一つを確認した。実施例６におけるゲル濾過の結果、ＭＥＨＰエステラーゼの分子量が約６２ｋＤａであったことから、本酵素は、分子量約３１ｋＤａのホモ二量体であると考えられる。
【０１３５】
以上をまとめた精製テーブルを示す。
【０１３６】
【表９】
無細胞抽出物を超遠心分離すると酵素活性は上澄み部分から検出され、比活性は０．１０８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなり、収率は８８．４％となった。ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムで精製した段階では、比活性は０．３１８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなり、収率は６６．５％となった。２０％飽和硫安塩析した後は、比活性が０．４３６μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌとなった。さらに疎水カラムによる精製を行った。その結果、比活性が１．２４μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌと大幅に上昇した。また、限外濾過によっても比活性は１．８８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｌに上昇した。これは限外濾過によって低分子のタンパク質が除去できたためと考えられる。次にゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行ったが、比活性はほとんど変化せずタンパク質のピークも単一であった。このことから酵素はほぼ精製が完了した状態であると考え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってその純度を検定した。最終比活性から計算すると、ＭＥＨＰ分解酵素は、全タンパク質量の５％程度あったことになり、かなり多いタンパク質であることが分かった。
【０１３７】
（実施例９．ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度を調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。酵素反応混液の組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＭＥＨＰ懸濁液１０μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）９８０μｌであった。１５分間反応を行った。
【０１３８】
反応温度の変化によるＭＥＨＰ分解酵素活性の増減を図１２に示す。
【０１３９】
精製の時に行う活性測定では３０℃で反応を行っていた。しかし、活性は４５℃で３０℃のときの２倍となり最大となった。よって、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適温度は４５℃であった。
【０１４０】
反応温度１０℃〜４５℃の時のＭＥＨＰ分解酵素活性をＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットした。図１３に示す。図１３のＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットを元に、ＭＥＨＰ分解酵素が酵素反応を行う際に必要なエネルギー（活性化エネルギー）を以下の式より求めた。
【０１４１】
【数１】
【０１４２】
【数２】
計算の結果、ＭＥＨＰ分解酵素の活性化エネルギーは６３．２ｋＪ／ｍｏｌとなった。
【０１４３】
下記の表において、このＭＥＨＰエステラーゼの活性化エネルギーを、他の加水分解酵素の活性化エネルギーと比較した。
【０１４４】
【表１０】
他の加水分解酵素と比べ多少大きな活性化エネルギーを持っていたが、ほぼ同じレベルの値となった。
【０１４５】
（実施例１０．ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨ）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨを調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。但し、バッファーは０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー，ｐＨ８．０〜８．５と０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６．５〜８．０を使用した。実施例８の酵素反応混液と同じ組成で、４５℃にて１５分間反応を行った。
【０１４６】
結果を図１４に示す。図１４に示されるように、反応ｐＨが７．０〜８．０では、ほとんど酵素活性に変化はみられなかった。
【０１４７】
（実施例１１．ＭＥＨＰ分解酵素の基質特異性）
実施例８で精製したＭＥＨＰ分解酵素を酵素液として、ＤＥＨＰを反応基質として基質特異性を調べた。酵素反応および測定は、実施例５と同様に行った。但し、ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液の代わりに、ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液を用いた。ＤＥＨＰ分解酵素活性測定用混液１．０ｍｌの組成は、酵素液１０μｌ、５０ｍＭ ＤＥＨＰ懸濁液１００μｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）８９０μｌであった。５０ｍＭ ＤＥＨＰ懸濁液は、０．５％デオキシコール酸溶液 ４４０３μｌ、ＤＥＨＰ ９７μｌ、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５００μｌを、超音波破砕機にて懸濁した作製した。
【０１４８】
その結果、反応産物であるＭＥＨＰおよびフタル酸は検出されなかった。よって、ＭＥＨＰ分解酵素はＤＥＨＰを分解できないことが分かった。
【０１４９】
（実施例１２： ＭＥＨＰ分解酵素のメタノールに対する耐性）
脂質加水分解酵素であるリパーゼは、有機溶媒中で合成反応を起こすことが知られており、工業的にも広く利用されている。
【０１５０】
ＭＥＨＰ分解酵素も同様に脂質加水分解酵素であるため有機溶媒に耐性を持つのではないかと考えた。そこで、反応液中に１０〜６０％のメタノールを添加し、ＭＥＨＰ分解酵素活性の変化を調べた。（反応液中に最終０．５％のメタノールが既に含まれている。）
酵素液としてゲル濾過溶出液を５μｌ使用し下記の反応混液を調製し、３０℃にて１５分間反応を行った。
【０１５１】
（使用試薬）
（１）酢酸エチル（和光純薬 試薬特級）
（２）６Ｎ塩酸
（３）メタノール（和光純薬 精密分析用）
（４）ＭＥＨＰ溶液
【０１５２】
【表１１】
（使用器具および器機）
（１）Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｓｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ製 ＰＥＲＳＯＮＡＬ−１１）
（２）ボルテックスミキサー
（３）高速液体クロマトグラフシステム
（４）試料前処理用フィルター ＹＭＣ−ＤＵＯ ｆｉｌｔｅｒ
（５）試料前処理用シリンジ １．０ｍｌ容テルモツベルクリン用シリンジ。
【０１５３】
（測定方法）
【０１５４】
【表１２】
（１）試験管に表１．６の混液を入れ、パラフィルムにて密栓した。これを０ ｔｉｍｅと反応後の２本調製した。
（２）振盪速度１２３ｍｉｎ−１、３０℃の往復振盪機にて３０分間酵素反応を行った。反応後、６Ｎ ＨＣｌを１ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌した。
（３）酢酸エチルを２ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、反応産物の抽出を行った。
（４）エッペンチューブに上記懸濁液を分注し、１４，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離を行った。
（５）有機相を回収し、１／４量のメタノールに置換した。
（６）ＹＭＣ Ｄｕｏ−ｆｉｌｔｅｒにてフィルター濾過したサンプルを実施例５と同様にしてＨＰＬＣにて測定した。
【０１５５】
結果を図１５に示す。示されるように、メタノール濃度２０％まではＭＥＨＰ分解酵素活性はほぼ一定であった。メタノール濃度２０％を超えると活性が大幅に減少し、メタノール濃度４０％ではｃｏｎｔｒｏｌの１／１０にまで減少した。このことからＭＥＨＰ分解酵素はメタノール濃度２０％まで失活しない酵素であることが分かった。
【０１５６】
（実施例１３：Ｎ末端アミノ酸配列決定）
本実施例のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用するために、以下の試薬を調製した：
分離用アクリルアミド溶液（Ａ液）：アクリルアミド ２９．２ｇ／１００ｍｌ、ビス（ＢＩＳ）０．８ｇ／１００ｍｌ
分離用ゲル緩衝溶液（Ｃ液）：Ｔｒｉｓ １８．２ｇ／１００ｍｌ、ＳＤＳ ０．３７５ｇ／１００ｍｌ、ＨＣｌを用いてｐＨを８．９に調整
濃縮用ゲル緩衝溶液（Ｄ液）：Ｔｒｉｓ ６．１ｇ／１００ｍｌ、ＳＤＳ ０．８ｇ／１００ｍｌ、ＨＣｌを用いてｐＨを６．８に調整
×１０電極液：Ｔｒｉｓ １５ｇ／５００ｍｌ、グリシン：７２ｇ／５００ｍｌ、ＳＤＳ：５ｇ／５００ｍｌ、これらを混合して精製水にてメスアップ
１５％過硫酸アンモニウム（重合開始剤）（Ｅ液）：
色素マーカー入りＳＤＳサンプルバッファー：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８） ４０ｍｌ／１００ｍｌ、グリセロール５０ｍｌ／１００ｍｌ、メルカプトエタノール５ｍｌ／１００ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウム５ｇ／１００ｍｌ；および
ブロモフェノールブルー０．０１ｍｇ／１００ｍｌ。
【０１５７】
ゲル版を９９％エタノールにて洗浄し組み立て、外殻にセットした。１２．５％分離ゲルの調製（Ａ液 １５ｍｌ・Ｃ液 ９ｍｌ・ミリＱ １２ｍｌ）を行った。撹拌した後に５分間脱気を行った。ＴＥＭＥＤ ４０μｌ・Ｅ液１００μｌを添加・撹拌し、ゲル版に流し込んだ後、ミリＱを上から１ｍｌ添加した。濃縮ゲルの調製（Ａ液 ２．７ｍｌ・Ｄ液 ４．５ｍｌ・ミリＱ １１ｍｌ）を行った。撹拌した後に、５分間脱気を行った。ＴＥＭＥＤ ４０μｌ・Ｅ液４５μｌを添加・撹拌し、ゲル版に流し込んだ後にコーム型をセットした。濃縮ゲルが固まった後、外殻を外し泳動槽へセットした。電極液を流し込みコーム型を外してコームの洗浄を行った。マーカーおよびサンプルの準備（マーカー１μｌ・サンプル４μｇを×３ ＳＤＳバッファーに添加し、９５℃にて５分間インキュベート）を行った。マーカーおよびサンプルのチャージの後、泳動を開始した（濃縮ゲル ２０ｍＡ・分離ゲル ４０ｍＡ）。泳動終了後、ゲルを適当な大きさにカットした。
【０１５８】
この後のエレクトロブロッティング及びアミノ酸シーケンスにおいて使用するために、以下の試薬を調製した：
ブロッティング溶液１：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１８．１５ ｇ（終濃度０．３Ｍ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０％ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ブロッティング溶液２：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１．５ｇ（終濃度２５ｍＭ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０％ ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ブロッティング溶液３：トリス（ＢＩＯＲＡＤ）１．５ｇ（終濃度２５ｍＭ）、６−アミノ−ｎ−カプロン酸（一級、Ｗａｋｏ）２．６ｇ（終濃度４０ｍＭ）、メタノール（特級，Ｗａｋｏ）１００ｍｌ（終濃度２０％）、１０ ％ＳＤＳ ２．５ｍｌ（終濃度０．０５％）、ミリＱにて、５００ｍｌにメスアップ（低温保存）
ＣＢＢ染色液：Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌａｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０ ２．５ｇ、エタノール ２５０ｍｌ、酢酸 １００ｍｌを、１０００ｍｌにメスアップ
脱色液：脱イオン水６５０ｍｌ、エタノール２５０ｍｌ、酢酸１００ｍｌを、１０００ｍｌにメスアップ。
【０１５９】
ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｏｉｌｏｎ Ｐｓａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））（２枚）およびＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ 濾紙（ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＰＡＰＥＲ）（６枚）をゲルよりやや大きめに切った。ＰＶＤＦ膜２枚をメタノールにかるく浸した後、ブロッティング溶液３に浸し、５分間緩やかに振盪した。また、濾紙をブロッティング溶液１、２、３にそれぞれ２枚ずつ浸し、５分間緩やかに振盪した。セミドライブロッティング装置（ＡＴＴＯ）上に、ブロッティング溶液１に浸した濾紙をおき、その上に、ブロッティング溶液２に浸した濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲル（上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを終了し、適当にカットしたものを使用）、ブロッティング溶液３に浸した濾紙を順においた。この際、空気が入らないように重ねた。また、ゲル以外は２枚ずつ、重ねて使用した。ブロッティング装置をセットし、１ｍＡ／ｃｍ２で９０分間転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜を超純水に浸し、５分間振盪した。ＣＢＢ染色液に浸し、１０分間程染色した。脱色液に浸し、バンドが鮮明になる程度脱色した。超純水で５分間程濯ぎ、ドライヤーで膜を乾かした。目的のバンドをＰＶＤＦ膜より切り出し、アミノ酸シークエンサー（ｍｏｄｅｌ １６１０Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）にてＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。以下に決定したアミノ酸配列に示す：Ｎ末端アミノ酸配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）。当業者は、このＮ末端アミノ酸配列から、全長配列を容易に決定することができることが理解される。
【０１６０】
（実施例１４：ＤＥＨＰおよびＭＥＨＰ分解酵素の誘導の有無）
次に、本発明の酵素が、ＤＥＨＰで誘導されるかどうかを検証した。
【０１６１】
ＮＢ培地で培養した細胞は、ＤＥＨＰ分解酵素は菌体内に存在するがＭＥＨＰ分解酵素活性はほとんどなかった。また、ＤＥＨＰ分解酵素の活性自身も低かった。しかし、これはＮＢ培地で培養しているためかもしれない。培地中にＤＥＨＰを入れるといずれの酵素も誘導を受け活性が上昇することが考えられた。そこで、ＤＥＨＰを培地に添加し、上記実施例または特開２００２−１４２７５４号公報に従ってＰ８２１９株を培養し、上記実施例に従って無細胞抽出物を調製した。
【０１６２】
ＮＢ培地で培養した菌から調製した無細胞抽出物を非誘導無細胞抽出物と呼び、ＤＥＨＰを単一炭素源として培養した菌から調製した無細胞抽出物を誘導無細胞抽出物と呼び、それぞれのＤＥＨＰ分解酵素活性を、ＤＥＨＰを基質として上記「ＤＥＨＰ分解酵素活性の測定法」の節の方法に従い活性測定を行った。なお、反応液中に酵素液として、無細胞抽出物を２５０ μｌ入れた。ＭＥＨＰ分解酵素活性はＭＥＨＰを基質にして上記実施例の方法に従い活性測定を行った。
【０１６３】
その結果を図１６〜図１９に示す。図１６は、無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。図１７は、誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。図１８は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応前を示す。図１９は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【０１６４】
反応前と反応後のＭＥＨＰとフタル酸の増加量をＨＰＬＣによって定量した。ＤＥＨＰ分解酵素活性は生成物のＭＥＨＰ生成速度とフタル酸生成速度を合計し、ＭＥＨＰ分解酵素活性はフタル酸の生成速度から求めた。
【０１６５】
【表１３】
非誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素比活性は１．６０×１０−２（μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）で、ＭＥＨＰ分解比活性は０．２２５×１０−２（μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）となり、ＤＥＨＰ分解活性がＭＥＨＰ分解活性より８倍高い値となった。ＤＥＨＰ分解酵素は、細胞培養時にＤＨＥＰの添加・無添加に関わりなく低い値だった。対照的にＭＥＨＰ分解酵素はＤＥＨＰの誘導によって２５倍活性が上昇し、ＤＥＨＰによる誘導を受けることが分かった。
【０１６６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
従来の因子では不可能であった、ＭＥＨＰ特異的なフタル酸エステル分解が達成された。したがって、本発明は、環境ホルモンとして有害作用を示すといわれるＭＥＨＰを分解することができ、有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の活性測定の際に使用されるＨＰＬＣのフローチャートである。
【図２】本発明のアルカリ抽出による培養液からの菌体タンパク質の抽出法および定量法のフローチャートである。
【図３】本発明の無細胞抽出物の調製法のフローチャートである。
【図４】実施例３におけるＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅのクロマトグラムである。
【図５】実施例３のＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による確認写真である。
【図６】実施例６の疎水カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図７】実施例６のＭＥＨＰ分解酵素活性のあるフラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による確認写真である。
【図８】実施例７のゲル濾過カラムのクロマトグラムである。
【図９】実施例７のゲル濾過カラムの分子量検量線を示す。
【図１０】実施例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１１】実施例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量検量線を示す。
【図１２】実施例９の反応温度の変化によるＭＥＨＰ分解酵素活性の増減を示す。
【図１３】実施例９の反応温度１０℃〜４５℃の時のＭＥＨＰ分解酵素活性をＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットした図である。
【図１４】実施例１０のＭＥＨＰ分解酵素の反応最適ｐＨを示す図である。
【図１５】実施例１２のＭＥＨＰ分解酵素のメタノールに対する耐性を示す図である。
【図１６】図１６は、無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【図１７】図１７は、誘導無細胞抽出物のＤＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【図１８】図１８は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応前を示す。
【図１９】図１９は、誘導無細胞抽出物のＭＥＨＰ分解酵素活性測定反応後を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号１は、本発明のＭＥＨＰ分解酵素のＮ末端の１３アミノ酸残基である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、該酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、該サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素であって、前記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酵素であって、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株により産生される、酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の反応最適温度は約４５℃である、酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の反応最適ｐＨは７．０〜８．０である、酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有さない、酵素。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素は、２０重量％のメタノールの存在下で９０％以上の活性が保持される、酵素。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の活性化エネルギーは約６３ｋＪ／ｍｏｌである、酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
【請求項１０】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質を、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させ、該酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるためのキットであって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
該酵素の使用方法を指示する指示書と、
を含む、キット。
【請求項１２】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させる組成物であって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
【請求項１３】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素を精製するための方法であって、
産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を、フタル酸ジ−２−エステルの存在下または非存在下で培養する工程、ならびに
該培養物を、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに順次供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質中の初期フタル酸量を測定する工程、
該物質を、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させて、該酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程、および
該インキュベート後の物資中のフタル酸量を測定する工程、
を包含し、
該初期フタル酸量と比較した該インキュベート後の物質中のフタル酸量の減少は、該物質におけるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を示す、方法。
【請求項１５】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するためのキットであって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
該酵素の使用方法を指示する指示書と、
を包含する、キット。
【請求項１６】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための組成物であって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素に対する抗体。
【請求項１】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素であって、該酵素は、同一のサブユニット２つからなるホモ二量体構造を有し、該サブユニット各々の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合に約３２ｋＤａである、酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素であって、前記サブユニットは、Ｎ末端配列ＰＳＳＳＩＴＱＫＦＨＴＶＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酵素であって、産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株により産生される、酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の反応最適温度は約４５℃である、酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の反応最適ｐＨは７．０〜８．０である、酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素は、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有さない、酵素。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素は、２０重量％のメタノールの存在下で９０％以上の活性が保持される、酵素。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の酵素であって、該酵素の活性化エネルギーは約６３ｋＪ／ｍｏｌである、酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
【請求項１０】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質を、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させ、該酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させるためのキットであって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
該酵素の使用方法を指示する指示書と、
を含む、キット。
【請求項１２】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを除去するかまたは減少させる組成物であって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
【請求項１３】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシル加水分解活性を有する酵素を精製するための方法であって、
産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１０２号として寄託されたＧｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ Ｐ８２１９株を、フタル酸ジ−２−エステルの存在下または非存在下で培養する工程、ならびに
該培養物を、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに順次供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための方法であって、
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルを含むことが疑われる物質中の初期フタル酸量を測定する工程、
該物質を、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と接触させて、該酵素がフタル酸モノ−２−エチルヘキシルを加水分解するに十分な条件下で十分な時間、インキュベートする工程、および
該インキュベート後の物資中のフタル酸量を測定する工程、
を包含し、
該初期フタル酸量と比較した該インキュベート後の物質中のフタル酸量の減少は、該物質におけるフタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を示す、方法。
【請求項１５】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するためのキットであって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素と、
該酵素の使用方法を指示する指示書と、
を包含する、キット。
【請求項１６】
フタル酸モノ−２−エチルヘキシルの存在を検出するための組成物であって、
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素
を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の酵素に対する抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図５】
【図７】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図５】
【図７】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−５５０１４（Ｐ２００６−５５０１４Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３７８０８（Ｐ２００４−２３７８０８）
【出願日】平成１６年８月１７日（２００４．８．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年２月２１日 崇城大学、応用微生物工学専攻共催の「平成１５年度 崇城大学大学院工学研究科応用微生物工学専攻 修士論文発表会」において文書をもって発表
【出願人】（５９７０１９６６５）アイ・エム・ビー株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１７日（２００４．８．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年２月２１日 崇城大学、応用微生物工学専攻共催の「平成１５年度 崇城大学大学院工学研究科応用微生物工学専攻 修士論文発表会」において文書をもって発表
【出願人】（５９７０１９６６５）アイ・エム・ビー株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]