フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上する方法
【課題】公知のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの欠点を克服し、グルコースに対する反応性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供すること。
【解決手段】フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子レベルで改変することで、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性よりも基質との反応性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【解決手段】フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子レベルで改変することで、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性よりも基質との反応性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）の比活性を向上させる方法に関するものであって、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法及び該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体のグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病の発生率は年々増加傾向にあり、更に糖尿病予備軍といわれる人数を合わせると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になると推測されている。また、生活習慣病への関心が非常に高まっていることもあり、血糖値を自己管理する機会は増加している。こうした時代背景において、血糖自己測定モニターのための技術開発は、糖尿病患者が日常の血糖値を管理するための重要な技術である。血糖測定技術に関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。
【０００３】
血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としてはグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性や熱に対する安定性が高いという利点があった。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）由来ＦＡＤＧＤＨが、特許文献３には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】特開２００７−２８９１４８
【特許文献３】特開２００８−２３７２１０
【特許文献４】ＷＯ２００６／１０１２３９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述のような公知のＦＡＤＧＤＨを改変し、グルコース測定用としてより適した酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特許文献２、あるいは特許文献３に記載する公知のＦＡＤＧＤＨは臨床検査薬用酵素としては比活性が低く、臨床検査では高濃度の酵素を添加しなければならないという欠点があった。そこで、本発明者らはさらにこれらを遺伝子レベルで改変し改変前より比活性を向上する方法を検討した。
その結果、本発明者らはＦＡＤＧＤＨの特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られた改変型ＦＡＤＧＤＨの比活性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
項２．
項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
項３．
項１または２に記載のタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位
のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質。
項４．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項５．
項４に記載の遺伝子を含むベクター。
項６．
項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項７．
項６に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
項８．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
項９．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
項１０．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により臨床検査薬用酵素として有用な、比活性の高い新規ＦＡＤＧＤＨを創出し、工業的に大量に該ＦＡＤＧＤＨを生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において、アミノ酸配列はアルファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｓ４１２Ｌ」は４１２位のＳ（Ｓｅｒ）がＬ（Ｌｅｕ）に置換することを意味する。なお、配列番号１、配列番号２、配列番号２３において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。
【００１４】
本願発明の一実施形態は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【００１５】
配列番号１は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列のうち１６３位のグリシンをアルギニンに、および、５５１位バリンをシステインに、それぞれ置換変異することにより、熱安定性を向上したＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、特許文献２または特許文献３により公知である。
配列番号１と配列番号２のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性以外の酵素特性は変化していないことを確かめている。例えば、比活性については、いずれのＦＡＤＧＤＨも、約６００Ｕ／Ａ２８０であり、ほぼ一致していた。
【００１６】
配列番号２３は、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、特許文献４により公知である。
【００１７】
アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号２３）を、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて比較分析したところ、６３．７％の相同性があり、配列番号１または２の４１２部位のアミノ酸は、配列番号３の４０８部位のアミノ酸に相当する。（図１参照）
【００１８】
また、本願発明の別の一実施形態は、以下の（ｄ）で表されるタンパク質である。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【００１９】
本願明細書において、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
また、本願明細書において、あるアミノ酸配列における配列番号１の４１２位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列を比較したとき、配列番号１の４１２位と対応する位置をもって同等と判断する。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売され
ているＶｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。
【００２０】
上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２１】
さらに、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質、もしくは、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２２】
上記のタンパク質は、アミノ酸配列の相同性比較などを行うＧＥＮＥＴＹＸソフトにおいて、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（３）配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または、
（４）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さ
らにより好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体であって、その比活性が改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して向上したものである。
【００２３】
本願において、比活性とは、一定量のタンパク質当たりの活性を意味する。比活性の向上とは一定量当たりのタンパク質当たりの活性が上昇することを意味する。
【００２４】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは、比活性が改変前と比べて１割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。さらに好ましくは、改変前と比べて２割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。さらに好ましくは、改変前と比べて３割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。
【００２５】
比活性の測定方法は、後述のＦＡＤＧＤＨの活性測定法を用いて求める。
【００２６】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号１で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００２７】
作製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５・、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２８】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
【００２９】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号１または
配列番号２で表されるタンパク質が例示できる。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号２３で表されるタンパク質が例示できる。
【００３０】
本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３１】
改変前のタンパク質をコードする遺伝子として、たとえば、上記の配列番号１で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２４で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号２で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２５で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号２３で表されるタンパク質（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨ）をコードする遺伝子としては、配列番号２６で表される塩基配列が例示できる。
【００３２】
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、例えば、
（１）配列番号１の４１２位、
（２）配列番号２の４１２位、
（３）配列番号２３の４０８位、もしくは、
（４）配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸
をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
【００３３】
本願発明の遺伝子は、たとえばＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００３４】
本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。
【００３５】
例えば、上記のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００３６】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３７】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００３８】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。
【００３９】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリ内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。
【００４０】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。
【００４１】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
【００４２】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００４３】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００４４】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００４５】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００４６】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４７】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００４８】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４９】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００５０】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５１】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００５２】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス
社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５３】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２１．９ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４．５ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００５４】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００５５】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００５８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００５９】
実施例１ 改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝子の作製
ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号２５：配列番号２で表されるタンパク質をコードする。）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調整した。
該プラスミドを鋳型として、１６番目（実施例１〜５においては、配列番号２におけるＮ末端からの位置を示す。「部位」「位」も同義。）のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４８番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４９番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５８番目のフェニルアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９０番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９６番目のメチオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９７番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４１２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するように設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２０番目のプロリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２１番目のフェニルアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２３番目のアルギニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４９９番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５００番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０３番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０６番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０７番目のプロリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０８番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５３７番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５４６番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異操作を行い、改変型ＦＡＤＧＤＨを作成した。
【実施例２】
【００６０】
実施例２ 改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製と培養力価の比較
得られた改変型ＦＡＤＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００６１】
調製した粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりＧＤＨ活性を測定した。表１にスクリーニングの結果を示す。改変部位と培養力価を比較し、４１２部位を置換することで改変前のＦＡＤＧＤＨよりも培養力価が向上する効果が確認されたことから４１２部位を候補とした。
【００６２】
【表１】
【実施例３】
【００６３】
実施例３ ４１２部位のアミノ酸の至適化
実施例２で作製した４１２部位を改変した複数のシングルコロニーをＬＢ液体培地に摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの４１２部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定し、１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを取得した。４１２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ａ、４１２部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｃ、４１２部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｅ、４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｆ、４１２部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｈ、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｉ、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｋ、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｌ、４１２部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｍ、４１２部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｎ、４１２部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｑ、４１２部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｒ、４１２部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｔ、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｖ、４１２部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｙ、４１２部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｄ、４１２部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｐ、４１２部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｗと命名した。
【実施例４】
【００６４】
実施例４ ４１２部位を置換したＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の比較
実施例３で取得した４１２部位置換した１９種のＦＡＤＧＤＨ改変体を、５０ｍｌ ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．０２％アデカノールＬＧ−１２６、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ；ｐＨ７．３）を用いて、３０℃で４６時間振とう培養した。その後、実施例２と同様の方法で粗酵素液を調製し、培養力価を測定した。表２にＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の結果を示す。４１２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを除く全ての改変体で改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割以上向上した。
表２で示されるように、５０ｍｌ ＬＢ培地／５００ｍｌ坂口フラスコ，３０℃，４６時間培養した時のＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の比較した結果、Ｓ４１２Ａ，Ｓ４１２Ｄ，Ｓ４１２Ｐ，Ｓ４１２Ｗを除く全ての改変体の培養力価は、配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して向上していた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨをアンピシリンを含む５０ｍｌ−１／２ＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。その後、それぞれの培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターに調製した６Ｌ ＬＢ培地に植菌し、３０℃で８４時間、培養し、培養液の一部をサンプリングした。その後、実施例２と同様の方法で粗酵素液を調製し、培養力価を測定した。表３にＦＡＤＧＤＨ改変体を１０Ｌ容ジャーファーメンターで培養した場合の培養力価の結果を示す。その結果、４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が２割向上し、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割向上し、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が３割向上し、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割向上し、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が２割向上した。
表３で示されるように、６Ｌ ＬＢ培地／１０ｍ３−ジャーファーメンター，３０℃，８４時間培養した時のＦＡＤＧＤＨ改変体（Ｓ４１２Ｌ，Ｓ４１２Ｉ，Ｓ４１２Ｌ，Ｓ４１２Ｖ，Ｓ４１２Ｋ）の培養力価の比較した結果、全ての改変体の培養力価は配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して２割以上向上していた。
【００６７】
【表３】
【実施例５】
【００６８】
実施例５ 改変型ＦＡＤＧＤＨの標品の作製と比活性の比較
改変型ＦＡＤＧＤＨを１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＬＢ培地に培養温度３０℃で８４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨの標品とした。
【００６９】
上記の方法で４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの標品を作製し、比活性を測定した。表４に示すように、これらの改変型ＦＡＧＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して、３割比活性が向上した。
表４で示されるように、ＦＡＤＧＤＨ改変体（Ｓ４１２Ｉ，Ｓ４１２Ｖ）から酵素を精製し比活性を比較した結果、ＦＡＤＧＤＨ改変体の比活性は配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して３割程度向上していた。
【００７０】
【表４】
【実施例６】
【００７１】
実施例６ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の作製
アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号２６）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調製した。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を比較分析したところ、６３．７％の相同性があり、配列番号１または２の４１２部位のアミノ酸は、配列番号２３の４０８部位のアミノ酸に相当することが明らかとなった。（図１参照）
そこで、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの４０８位はフェニルアラニンであり、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの４１２位のセリンとは異なるが、この４０８位のフェニルアラニンを部位特異的アミノ酸置換して比活性を比較検討することにした。
該プラスミドを鋳型として、４０８位（実施例６〜８においては、配列番号２３におけるＮ末端からの位置を示す。「部位」「位」も同義。）のフェニルアラニンをセリンに置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、または、イソロイシンに置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、または、バリンに置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異操作を行い、野生型のフェニルアラニンが、セリンあるいはイソロイシンあるいはバリンに置換した３種類の改変型ＦＡＤＧＤＨ発現プラスミドを作製した。
【実施例７】
【００７２】
実施例７ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製と培養力価の比較
得られた３種類の改変型ＦＡＤＧＤＨ発現プラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだＴＢ液体培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、１．２５％リン酸２カリウム、０．２３％リン酸１カリウム）に摂取し、２５℃で２日間振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００７３】
調製した粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりＧＤＨ活性を測定した。野生型ＦＡＤＧＤＨと改変型ＦＡＤＧＤＨの培養力価を比較し、４０８部位を置換することで改変前のＦＡＤＧＤＨよりも培養力価が向上する効果を確認できた。４０８部位のＦをＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が１．７倍向上し、４０８部位のＦをＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が３．４倍向上し、４０８部位のＦをＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が４．１倍向上した。
【００７４】
【表５】
【実施例８】
【００７５】
実施例８ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨの標品の作製と比活性の比較
改変型ＦＡＤＧＤＨを２Ｌ容坂口フラスコを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で５２時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、ＤＥＡＥ−セファロースカラムによるイオン交換クロマト（溶出条件は全て０〜０．４Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施した。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は全て２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨの標品とした。
【００７６】
上記の方法でアスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの標品を作製し、比活性を測定した。表６に示すように、Ｓに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型ＦＡＤＧＤＨと顕著な差異が見られなかったが、ＩまたはＶに置換した改変型ＦＡＧＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して、それぞれ、２割、３割比活性が向上していた。
このように、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と少なくとも６３．７％（ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて計算）以上の相同性を有するＦＡＤＧＤＨにおいては、配列番号１または２の４１２部位に相当するアミノ酸を置換することにより比活性が向上する可能性が高いことが明らかになった。この現象は、相同性を有するＦＡＤＧＤＨ全てに有効な技術であるが、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨにおいては、特に、比活性を向上する有効な部位であり、少なくとも、アスペルギルス属由来のＦＡＤＧＤＨにおいては、比活性を向上する改変型ＦＡＤＧＤＨがほぼ間違いなく作製できるものと考える。
【００７７】
ＦＡＤＧＤＨの比活性を向上することにより、グルコースセンサーで使用する酵素量を減少することが出来る。使用酵素量を減少できれば、少ない検体量でも、十分に酵素を溶解することができ、引いては測定精度の向上や測定時間の短縮に繋げることができる。
【００７８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）の比活性を向上させる方法に関するものであって、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法及び該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体のグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病の発生率は年々増加傾向にあり、更に糖尿病予備軍といわれる人数を合わせると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になると推測されている。また、生活習慣病への関心が非常に高まっていることもあり、血糖値を自己管理する機会は増加している。こうした時代背景において、血糖自己測定モニターのための技術開発は、糖尿病患者が日常の血糖値を管理するための重要な技術である。血糖測定技術に関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。
【０００３】
血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としてはグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性や熱に対する安定性が高いという利点があった。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）由来ＦＡＤＧＤＨが、特許文献３には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】特開２００７−２８９１４８
【特許文献３】特開２００８−２３７２１０
【特許文献４】ＷＯ２００６／１０１２３９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述のような公知のＦＡＤＧＤＨを改変し、グルコース測定用としてより適した酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特許文献２、あるいは特許文献３に記載する公知のＦＡＤＧＤＨは臨床検査薬用酵素としては比活性が低く、臨床検査では高濃度の酵素を添加しなければならないという欠点があった。そこで、本発明者らはさらにこれらを遺伝子レベルで改変し改変前より比活性を向上する方法を検討した。
その結果、本発明者らはＦＡＤＧＤＨの特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られた改変型ＦＡＤＧＤＨの比活性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
項２．
項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
項３．
項１または２に記載のタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位
のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質。
項４．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項５．
項４に記載の遺伝子を含むベクター。
項６．
項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項７．
項６に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
項８．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
項９．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
項１０．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により臨床検査薬用酵素として有用な、比活性の高い新規ＦＡＤＧＤＨを創出し、工業的に大量に該ＦＡＤＧＤＨを生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において、アミノ酸配列はアルファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｓ４１２Ｌ」は４１２位のＳ（Ｓｅｒ）がＬ（Ｌｅｕ）に置換することを意味する。なお、配列番号１、配列番号２、配列番号２３において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。
【００１４】
本願発明の一実施形態は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【００１５】
配列番号１は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列のうち１６３位のグリシンをアルギニンに、および、５５１位バリンをシステインに、それぞれ置換変異することにより、熱安定性を向上したＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、特許文献２または特許文献３により公知である。
配列番号１と配列番号２のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性以外の酵素特性は変化していないことを確かめている。例えば、比活性については、いずれのＦＡＤＧＤＨも、約６００Ｕ／Ａ２８０であり、ほぼ一致していた。
【００１６】
配列番号２３は、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、特許文献４により公知である。
【００１７】
アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号２３）を、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて比較分析したところ、６３．７％の相同性があり、配列番号１または２の４１２部位のアミノ酸は、配列番号３の４０８部位のアミノ酸に相当する。（図１参照）
【００１８】
また、本願発明の別の一実施形態は、以下の（ｄ）で表されるタンパク質である。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【００１９】
本願明細書において、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
また、本願明細書において、あるアミノ酸配列における配列番号１の４１２位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列を比較したとき、配列番号１の４１２位と対応する位置をもって同等と判断する。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売され
ているＶｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。
【００２０】
上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２１】
さらに、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質、もしくは、上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
【００２２】
上記のタンパク質は、アミノ酸配列の相同性比較などを行うＧＥＮＥＴＹＸソフトにおいて、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（３）配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または、
（４）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さ
らにより好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体であって、その比活性が改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して向上したものである。
【００２３】
本願において、比活性とは、一定量のタンパク質当たりの活性を意味する。比活性の向上とは一定量当たりのタンパク質当たりの活性が上昇することを意味する。
【００２４】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは、比活性が改変前と比べて１割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。さらに好ましくは、改変前と比べて２割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。さらに好ましくは、改変前と比べて３割以上向上しているＦＡＤＧＤＨ改変体である。
【００２５】
比活性の測定方法は、後述のＦＡＤＧＤＨの活性測定法を用いて求める。
【００２６】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号１で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００２７】
作製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５・、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２８】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
【００２９】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号１または
配列番号２で表されるタンパク質が例示できる。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号２３で表されるタンパク質が例示できる。
【００３０】
本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３１】
改変前のタンパク質をコードする遺伝子として、たとえば、上記の配列番号１で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２４で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号２で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２５で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号２３で表されるタンパク質（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨ）をコードする遺伝子としては、配列番号２６で表される塩基配列が例示できる。
【００３２】
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、例えば、
（１）配列番号１の４１２位、
（２）配列番号２の４１２位、
（３）配列番号２３の４０８位、もしくは、
（４）配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸
をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
【００３３】
本願発明の遺伝子は、たとえばＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００３４】
本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。
【００３５】
例えば、上記のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００３６】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３７】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００３８】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。
【００３９】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリ内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。
【００４０】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。
【００４１】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
【００４２】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００４３】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００４４】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００４５】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００４６】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４７】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００４８】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４９】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００５０】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５１】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００５２】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス
社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５３】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２１．９ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４．５ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００５４】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００５５】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００５８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００５９】
実施例１ 改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝子の作製
ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号２５：配列番号２で表されるタンパク質をコードする。）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調整した。
該プラスミドを鋳型として、１６番目（実施例１〜５においては、配列番号２におけるＮ末端からの位置を示す。「部位」「位」も同義。）のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４８番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４９番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５８番目のフェニルアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９０番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９６番目のメチオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、９７番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４１２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するように設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２０番目のプロリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２１番目のフェニルアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４２３番目のアルギニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、４９９番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５００番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０３番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０６番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０７番目のプロリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０８番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５３７番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５４６番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異操作を行い、改変型ＦＡＤＧＤＨを作成した。
【実施例２】
【００６０】
実施例２ 改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製と培養力価の比較
得られた改変型ＦＡＤＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００６１】
調製した粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりＧＤＨ活性を測定した。表１にスクリーニングの結果を示す。改変部位と培養力価を比較し、４１２部位を置換することで改変前のＦＡＤＧＤＨよりも培養力価が向上する効果が確認されたことから４１２部位を候補とした。
【００６２】
【表１】
【実施例３】
【００６３】
実施例３ ４１２部位のアミノ酸の至適化
実施例２で作製した４１２部位を改変した複数のシングルコロニーをＬＢ液体培地に摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの４１２部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定し、１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを取得した。４１２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ａ、４１２部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｃ、４１２部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｅ、４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｆ、４１２部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｈ、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｉ、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｋ、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｌ、４１２部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｍ、４１２部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｎ、４１２部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｑ、４１２部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｒ、４１２部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｔ、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｖ、４１２部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｙ、４１２部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｄ、４１２部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｐ、４１２部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｓ４１２Ｗと命名した。
【実施例４】
【００６４】
実施例４ ４１２部位を置換したＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の比較
実施例３で取得した４１２部位置換した１９種のＦＡＤＧＤＨ改変体を、５０ｍｌ ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．０２％アデカノールＬＧ−１２６、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ；ｐＨ７．３）を用いて、３０℃で４６時間振とう培養した。その後、実施例２と同様の方法で粗酵素液を調製し、培養力価を測定した。表２にＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の結果を示す。４１２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを除く全ての改変体で改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割以上向上した。
表２で示されるように、５０ｍｌ ＬＢ培地／５００ｍｌ坂口フラスコ，３０℃，４６時間培養した時のＦＡＤＧＤＨ改変体の培養力価の比較した結果、Ｓ４１２Ａ，Ｓ４１２Ｄ，Ｓ４１２Ｐ，Ｓ４１２Ｗを除く全ての改変体の培養力価は、配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して向上していた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨをアンピシリンを含む５０ｍｌ−１／２ＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。その後、それぞれの培養液を１０Ｌ容ジャーファーメンターに調製した６Ｌ ＬＢ培地に植菌し、３０℃で８４時間、培養し、培養液の一部をサンプリングした。その後、実施例２と同様の方法で粗酵素液を調製し、培養力価を測定した。表３にＦＡＤＧＤＨ改変体を１０Ｌ容ジャーファーメンターで培養した場合の培養力価の結果を示す。その結果、４１２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が２割向上し、４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割向上し、４１２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が３割向上し、４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が５割向上し、４１２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が２割向上した。
表３で示されるように、６Ｌ ＬＢ培地／１０ｍ３−ジャーファーメンター，３０℃，８４時間培養した時のＦＡＤＧＤＨ改変体（Ｓ４１２Ｌ，Ｓ４１２Ｉ，Ｓ４１２Ｌ，Ｓ４１２Ｖ，Ｓ４１２Ｋ）の培養力価の比較した結果、全ての改変体の培養力価は配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して２割以上向上していた。
【００６７】
【表３】
【実施例５】
【００６８】
実施例５ 改変型ＦＡＤＧＤＨの標品の作製と比活性の比較
改変型ＦＡＤＧＤＨを１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＬＢ培地に培養温度３０℃で８４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨの標品とした。
【００６９】
上記の方法で４１２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと４１２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの標品を作製し、比活性を測定した。表４に示すように、これらの改変型ＦＡＧＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して、３割比活性が向上した。
表４で示されるように、ＦＡＤＧＤＨ改変体（Ｓ４１２Ｉ，Ｓ４１２Ｖ）から酵素を精製し比活性を比較した結果、ＦＡＤＧＤＨ改変体の比活性は配列番号２の２重変異体（表２では「ＦＡＤＧＤＨ改変体１」と記載）と比較して３割程度向上していた。
【００７０】
【表４】
【実施例６】
【００７１】
実施例６ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の作製
アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号２６）を含む組み換えプラスミドｐＡＴＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調製した。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を比較分析したところ、６３．７％の相同性があり、配列番号１または２の４１２部位のアミノ酸は、配列番号２３の４０８部位のアミノ酸に相当することが明らかとなった。（図１参照）
そこで、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの４０８位はフェニルアラニンであり、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの４１２位のセリンとは異なるが、この４０８位のフェニルアラニンを部位特異的アミノ酸置換して比活性を比較検討することにした。
該プラスミドを鋳型として、４０８位（実施例６〜８においては、配列番号２３におけるＮ末端からの位置を示す。「部位」「位」も同義。）のフェニルアラニンをセリンに置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、または、イソロイシンに置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、または、バリンに置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異操作を行い、野生型のフェニルアラニンが、セリンあるいはイソロイシンあるいはバリンに置換した３種類の改変型ＦＡＤＧＤＨ発現プラスミドを作製した。
【実施例７】
【００７２】
実施例７ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製と培養力価の比較
得られた３種類の改変型ＦＡＤＧＤＨ発現プラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだＴＢ液体培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、１．２５％リン酸２カリウム、０．２３％リン酸１カリウム）に摂取し、２５℃で２日間振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００７３】
調製した粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりＧＤＨ活性を測定した。野生型ＦＡＤＧＤＨと改変型ＦＡＤＧＤＨの培養力価を比較し、４０８部位を置換することで改変前のＦＡＤＧＤＨよりも培養力価が向上する効果を確認できた。４０８部位のＦをＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が１．７倍向上し、４０８部位のＦをＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が３．４倍向上し、４０８部位のＦをＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨより培養力価が４．１倍向上した。
【００７４】
【表５】
【実施例８】
【００７５】
実施例８ アスペルギルス・テレウス由来の改変型ＦＡＤＧＤＨの標品の作製と比活性の比較
改変型ＦＡＤＧＤＨを２Ｌ容坂口フラスコを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で５２時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、ＤＥＡＥ−セファロースカラムによるイオン交換クロマト（溶出条件は全て０〜０．４Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施した。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は全て２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨの標品とした。
【００７６】
上記の方法でアスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨと、４０８部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの標品を作製し、比活性を測定した。表６に示すように、Ｓに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型ＦＡＤＧＤＨと顕著な差異が見られなかったが、ＩまたはＶに置換した改変型ＦＡＧＧＤＨは改変前のＦＡＤＧＤＨと比較して、それぞれ、２割、３割比活性が向上していた。
このように、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と少なくとも６３．７％（ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて計算）以上の相同性を有するＦＡＤＧＤＨにおいては、配列番号１または２の４１２部位に相当するアミノ酸を置換することにより比活性が向上する可能性が高いことが明らかになった。この現象は、相同性を有するＦＡＤＧＤＨ全てに有効な技術であるが、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨにおいては、特に、比活性を向上する有効な部位であり、少なくとも、アスペルギルス属由来のＦＡＤＧＤＨにおいては、比活性を向上する改変型ＦＡＤＧＤＨがほぼ間違いなく作製できるものと考える。
【００７７】
ＦＡＤＧＤＨの比活性を向上することにより、グルコースセンサーで使用する酵素量を減少することが出来る。使用酵素量を減少できれば、少ない検体量でも、十分に酵素を溶解することができ、引いては測定精度の向上や測定時間の短縮に繋げることができる。
【００７８】
【表６】
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかで表されるタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、４１２位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、４０８位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｄ）配列番号１または配列番号２または配列番号２３の少なくとも１以上と６３．７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同等の部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質において、配列番号１の４１２位、配列番号２の４１２位、および、配列番号２３の４０８位からなる群のうちいずれかと同一または同等の部位のアミノ酸が、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選ばれるいずれかに置換されているタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１４７４３７（Ｐ２０１１−１４７４３７Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０１７９０（Ｐ２０１０−２０１７９０）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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