プロテアソーム活性化剤
【課題】プロテアソーム活性化剤を提供する。
【解決手段】シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【解決手段】シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特許文献４）が開発されている。
【０００６】
さらに、本発明者は、大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物のプロテアソーム活性促進成分が、生体内の異常タンパク質を除去するのみではなく、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことを見出し、大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物（特許文献５）の開発を行っている。
皮膚老化と関連する因子としてプロテアソーム活性の低下に伴う老化タンパクの蓄積を挙げることが出来る。皮膚由来線維芽細胞に紫外線Ａ波を照射する事でプロテアソーム活性が低下する事、シリビンを紫外線Ａ波照射前後に添加する事でプロテアソーム活性化（トリプシン様活性）が起こり、老化タンパクの指標である酸化カルボニルタンパクが低下した事が知られている（特許文献６：特許第３９１４２４４号公報 異常タンパク質除去用組成物）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７９５９２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９８号公報
【特許文献５】特開２００４−１３１４３１号公報
【特許文献６】特許第３９１４２４４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】蛋白質 核酸 酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、シリビンマルトシド及びシリマリンの組み合わせで良好なプロテアソーム活性を示すことを知見したことに基づき、本発明を提案する。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
（２）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ｂ波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
（３）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
（４）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ波被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、シリビンマルトシドとシリマリンを組み合わせて用いることにより、それぞれを単独で用いる場合と比較して、プロテアソーム活性を格段に増強することができる。そして、本発明のシリビンマルトシドとシリマリンとを組み合わせた剤は、紫外線に暴露されるとプロテアソームを活性化し、また、紫外線暴露により生じた異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚がん、皮膚におけるしわやしみなどの予防又は改善することができる。特に、紫外線Ｂ波被曝によるトリプシン様活性低下を回復させる効果、紫外線Ａ波被曝によるトリプシン様活性低下を回復させる効果、紫外線Ａ波被曝によるキモトリプシン様活性低下による回復効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図２】ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図３】ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図４】ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。
【００１５】
本発明で用いられるシリビンマルトシドは下記式（１）に示されるものであり、文献（Ｋｒｅｎ Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １，２４６７−２４７４（１９９７））に従って、シリビンに、ルイス酸を触媒として、パーアセチルマルトースを反応させてグリコシド結合を生成し、脱アセチル化することにより得られるが、市販のものを用いることも可能である。
【００１６】
【化１】
【００１７】
また、本発明で用いられるシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．６５６６６−０７−１）は、キク科マリアアザミ（別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの総称であり、確認されている主要成分はシリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２２８８８−７０−６）、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などがある（天然薬物事典、奥田拓男編）。シリマリンは古くからヨーロッパで肝臓疾患の予防及び治療を目的として使用されている。また、酸化防止剤として広く知られている。皮膚に対して有用な組成物として、乾癬及びアトピー性皮膚炎治療製剤（特許文献；特開平５−２８６８６４号公報）、フラボノリグナンとリン脂質との錯体を活性成分として含み、紅斑、火傷、皮膚又は粘膜のジストロフィー状態、皮膚炎等の治療、皮膚の老化防止及び放射線、風、太陽などの外部環境からの刺激保護に有用な組成物（特許文献；特許第２９４８８１８号）、表皮透過バリア強化剤（特許文献；特開２０００−１６９３２８）皮脂分泌抑制剤（特許文献；特開２０００−１６９３３２）などが知られている。シリマリンは通常マリアアザミの種実からエタノール抽出し、スプレードライにより乾燥粉末として得られるエキス原料として市販されている。本発明に使用するシリマリンは市販されているシリマリンをそのまま用いることができる。また、マリアアザミからシリビン、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリビンなどのシリマリンの構成成分を単離、精製した化合物を用いることができる。
【実施例】
【００１８】
［評価検体］
（ａ）シリビンマルトシド
（ｂ）シリマリンＥＴ／Ｇ（Ｉｎｄｅｎａ S.P.A）
【００１９】
［シリビン配糖体（シリビンマルトシド）の合成］
βマルトースもしくはβラクトースの配糖体化をＨｅｌｆｅｒｉｃｈの方法に従ってシリビン配糖体を合成した。
シリビン（3.0 ｇ、 6.2 mol、東京化成工業社製）とオクタ-O-アセチル-D-マルトース（6.3 ｇ、 9.2ｍｏｌ、和光純薬社製）とを180 ｍｌのジクロロメタン−アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ、関東化学社製）の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体（1.14ｍｌ、 12.4 ｍｍｏｌ、Merck Chemicals社製）を窒素存在下、室温で １９時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（関東化学社製）を加え、１５０ｍｌジクロロメタン（関東化学社製）で２回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム（関東化学社製）処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水（１：８：１、関東化学社製）を３５℃３０時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンマルトシド（1.0 g, 収率20%）を得た。
【００２０】
［皮膚由来線維芽細胞におけるプロテアソーム活性測定］
（１）細胞培養および紫外線照射
新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＢ、三光純薬）を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でＰＤＬ（集団倍加数）をチェックしながら継代培養した。下記に定めた線維芽細胞のＰＤＬ数に達したところでプロテアソーム活性の試験に供した。
【００２１】
（ａ）紫外線Ｂ波照射にはＰＤＬ２０〜４０の若い細胞を用い、紫外線Ａ波照射にはＰＤＬ４５〜６０の老化した細胞を用いた。
（ｂ）トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、２０００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度によるように調整した。
（ｃ）６ウェル平板プレートに細胞を１０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで２４ｈ培養した。
（ｄ）紫外線照射前に、各サンプルを10μg/ml（5%FBS含有ＤＭＥＭ；ＤＭＳＯ1%含有）の濃度で添加し、24ｈ培養した。2者併用群に関しては5μg/mlずつ添加した。
（ｅ）培養液をHank’s（-）液に置換し、紫外線照射を行った。
（ｆ）照射終了後、直ちにHank’s（-）液を紫外線照射前と同一濃度条件の評価検体含有5％FBS含有DMEM（ＤＭＳＯ1%含有）に置換し、24h培養した。
【００２２】
（２）細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定
培養液を除去しＰＢＳ（−）で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を８００μＬ添加し、３７℃で５分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１．５ｍｌでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を１５ｍｌ容遠沈管に回収した。１，５００ｒｐｍ ５ｍｉｎの条件で遠沈して培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄し再び１，５００ｒｐｍ ５ｍｉｎの条件で遠沈してＤＭＥＭ中の色素（フェノールレッド）を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセリン、ｐＨ＝７．５）３００μＬに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ １、ＤＵＴＹ４０、１５ｓｅｃを２ｓｅｔ」）した。ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容エッペンチューブに全量移し、１５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン ＳＩＧＭＡ社製）換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）を用いた。
平板９６ウェルプレートに
プロテアソーム活性溶液／ＢＳＡ 溶媒：ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １０μｌ
Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）２００μｌ
を加えて１０ｍｉｎ室温にてプレートごと撹拌反応した。吸光度５９０ｎｍをプレートリーダーで計測し、ＢＳＡ溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
【００２３】
（３）プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）で調整し、３０μＬずつを分注して−２０℃冷凍保存した。使用時に解凍し６００μＬの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板９６ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
【００２４】
１．基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） １０．５μＬ （蛍光分析 時の基質ペプチド濃度２３．８μＭ）
２．反応液（１００ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝ ８．０） ２５μＬ
３．１０ｍＭ ＡＴＰ含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １９．５μＬ（蛍光分析時 のＡＴＰ濃度は０．９７５ｍＭ）
４．プロテアソーム活性サンプル（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ） ２０μＬ
上記溶液を３７℃１ｈ撹拌反応し、反応終了後に、
５．１０％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ（反応停止液） ２５μＬ
６．１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ＝９．０） １００μＬ （全量２００μＬ／ ｗｅｌｌ）
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）由来の蛍光強度（励起波長 Ｅｘ３８０ｎｍ、蛍光波長 Ｅｍ４４０ｎｍ）を測定した。
【００２５】
（４）データ処理
（蛍光強度／タンパク濃度）で算出されるプロテアソーム活性について、ＵＶ（−）のコントロール群を基準（１．００）とし、平均値で他の各群と比較した。
有意差検定は紫外線照射のコントロール処理群に対する多重比較をＤｕｎｅｔｔ ｔｅｓｔ（＊＊：ｐ＜０．０１， ＊ ｐ＜０．０５）で行った。
【００２６】
［紫外線Ｂ照射時のプロテアソーム活性］
［実施例１］
ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
（ａ）紫外線Ｂ波 非照射 コントロール
（ｂ）紫外線Ｂ波 照射 コントロール
（ｃ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ｂ波 照射 シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルト シド（５μｇ／ｍｌ）
【００２７】
図１に紫外線Ｂ波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性の結果を示す。紫外線Ｂ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、紫外線Ｂ波照射によりトリプシン様プロテアソーム活性（ｂ）は２９％に低下したのに対し、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では７２％、紫外線Ｂ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群では５２％（ｄ）のトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではトリプシン様プロテアソーム活性は９８％を示し、紫外線Ｂ波照射コントロール群に対して有意にトリプシン様プロテアソーム活性を示した。併用群のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいは、シリビンマルトシドを単独で添加した群と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００２８】
［参考例１］
実施例１と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いてキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価を行った。結果を図４に示す。紫外線Ｂ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、紫外線Ｂ波照射によってキモトリプシン様プロテアソーム活性は３７％に低下したのに対し、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では１０９％、紫外線Ｂ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では８５％のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示し、それぞれ有意にプロテアソーム活性化した。一方、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は９１％を示し、紫外線Ｂ波照射コントロール群に対して有意にプロテアソーム活性化した。いずれの群においても有意なキモトリプシン様プロテアソーム活性を発揮したが、シリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドとの併用効果を実証する事が出来なかった。
【００２９】
［紫外線Ａ照射時のプロテアソーム活性］
［実施例２］
ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
（ａ）紫外線Ｂ波 非照射 コントロール
（ｂ）紫外線Ｂ波 照射 コントロール
（ｃ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ｂ波 照射 シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルト シド（５μｇ／ｍｌ）
【００３０】
図２に、紫外線Ａ波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性の結果を示す。紫外線Ａ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、トリプシン様プロテアソーム活性は紫外線Ａ波照射によって２９％に低下したのに対し、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では９６％、紫外線Ａ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では８１％のトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではトリプシン様プロテアソーム活性は１５８％を示し、紫外線Ａ波照射コントロール群（ａ）に対して有意にトリプシン様プロテアソームを活性化した。更に、併用群のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいはシリビンマルトシドを単独で添加した群（ｃ）（ｄ）と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００３１】
［実施例３］
実施例２と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いたキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価の結果を図３に示す。キモトリプシン様プロテアソーム活性は紫外線Ａ波照射によって５０％に低下したのに対し、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では１２８％、紫外線Ａ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では１２８％のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は２１９％を示し、紫外線Ａ波照射コントロール群（ｂ）に対して有意にキモトリプシン様プロテアソームを活性化した。更に、併用群（ｅ）のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいはシリビンマルトシドを単独で添加した群（ｃ）（ｄ）と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００３２】
［考察］
シリマリンＥＴ／Ｇ、シリビンマルトシド単独添加の同一濃度（１０μｇ／ｍｌ）条件でのプロテアソームの活性化を試験条件［紫外線Ａ波／Ｂ波×トリプシン様活性／キモトリプシン様活性］で総括すると、総じてシリマリンＥＴ／Ｇがシリビンマルトシドよりも優れたプロテアソーム活性を示した。これは、シリビンマルトシドが糖修飾されて分子量が大きく嵩高くなることで細胞膜に対する透過性がシリビンマルトシドでは低下した事に起因すると考えられる。
【００３３】
しかしながら、半分の濃度（５μｇ／ｍｌ）同士で２者を併用した時のプロテアソーム活性は、いずれの試験条件においても両成分の単独添加より優れたプロテアソーム活性を示したことから、２者併用による相乗効果があると考えられる。
【００３４】
シリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドの相乗的なプロテアソーム活性化は、真皮線維芽細胞への添加により時間差をもって細胞膜を通過する事に起因すると推測される。このシリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドの相乗的なプロテアソーム活性化作用は、生体、とりわけ皮膚の異常タンパク質や酸化タンパク質の除去や排泄に効果的に作用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特許文献４）が開発されている。
【０００６】
さらに、本発明者は、大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物のプロテアソーム活性促進成分が、生体内の異常タンパク質を除去するのみではなく、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことを見出し、大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物（特許文献５）の開発を行っている。
皮膚老化と関連する因子としてプロテアソーム活性の低下に伴う老化タンパクの蓄積を挙げることが出来る。皮膚由来線維芽細胞に紫外線Ａ波を照射する事でプロテアソーム活性が低下する事、シリビンを紫外線Ａ波照射前後に添加する事でプロテアソーム活性化（トリプシン様活性）が起こり、老化タンパクの指標である酸化カルボニルタンパクが低下した事が知られている（特許文献６：特許第３９１４２４４号公報 異常タンパク質除去用組成物）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７９５９２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９８号公報
【特許文献５】特開２００４−１３１４３１号公報
【特許文献６】特許第３９１４２４４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】蛋白質 核酸 酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、シリビンマルトシド及びシリマリンの組み合わせで良好なプロテアソーム活性を示すことを知見したことに基づき、本発明を提案する。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
（２）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ｂ波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
（３）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ波被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
（４）シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ波被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、シリビンマルトシドとシリマリンを組み合わせて用いることにより、それぞれを単独で用いる場合と比較して、プロテアソーム活性を格段に増強することができる。そして、本発明のシリビンマルトシドとシリマリンとを組み合わせた剤は、紫外線に暴露されるとプロテアソームを活性化し、また、紫外線暴露により生じた異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚がん、皮膚におけるしわやしみなどの予防又は改善することができる。特に、紫外線Ｂ波被曝によるトリプシン様活性低下を回復させる効果、紫外線Ａ波被曝によるトリプシン様活性低下を回復させる効果、紫外線Ａ波被曝によるキモトリプシン様活性低下による回復効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図２】ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図３】ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【図４】ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、シリビンマルトシド、シリマリンのキモトリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプロテアソーム活性化剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。
【００１５】
本発明で用いられるシリビンマルトシドは下記式（１）に示されるものであり、文献（Ｋｒｅｎ Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １，２４６７−２４７４（１９９７））に従って、シリビンに、ルイス酸を触媒として、パーアセチルマルトースを反応させてグリコシド結合を生成し、脱アセチル化することにより得られるが、市販のものを用いることも可能である。
【００１６】
【化１】
【００１７】
また、本発明で用いられるシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．６５６６６−０７−１）は、キク科マリアアザミ（別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの総称であり、確認されている主要成分はシリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２２８８８−７０−６）、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などがある（天然薬物事典、奥田拓男編）。シリマリンは古くからヨーロッパで肝臓疾患の予防及び治療を目的として使用されている。また、酸化防止剤として広く知られている。皮膚に対して有用な組成物として、乾癬及びアトピー性皮膚炎治療製剤（特許文献；特開平５−２８６８６４号公報）、フラボノリグナンとリン脂質との錯体を活性成分として含み、紅斑、火傷、皮膚又は粘膜のジストロフィー状態、皮膚炎等の治療、皮膚の老化防止及び放射線、風、太陽などの外部環境からの刺激保護に有用な組成物（特許文献；特許第２９４８８１８号）、表皮透過バリア強化剤（特許文献；特開２０００−１６９３２８）皮脂分泌抑制剤（特許文献；特開２０００−１６９３３２）などが知られている。シリマリンは通常マリアアザミの種実からエタノール抽出し、スプレードライにより乾燥粉末として得られるエキス原料として市販されている。本発明に使用するシリマリンは市販されているシリマリンをそのまま用いることができる。また、マリアアザミからシリビン、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリビンなどのシリマリンの構成成分を単離、精製した化合物を用いることができる。
【実施例】
【００１８】
［評価検体］
（ａ）シリビンマルトシド
（ｂ）シリマリンＥＴ／Ｇ（Ｉｎｄｅｎａ S.P.A）
【００１９】
［シリビン配糖体（シリビンマルトシド）の合成］
βマルトースもしくはβラクトースの配糖体化をＨｅｌｆｅｒｉｃｈの方法に従ってシリビン配糖体を合成した。
シリビン（3.0 ｇ、 6.2 mol、東京化成工業社製）とオクタ-O-アセチル-D-マルトース（6.3 ｇ、 9.2ｍｏｌ、和光純薬社製）とを180 ｍｌのジクロロメタン−アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ、関東化学社製）の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体（1.14ｍｌ、 12.4 ｍｍｏｌ、Merck Chemicals社製）を窒素存在下、室温で １９時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（関東化学社製）を加え、１５０ｍｌジクロロメタン（関東化学社製）で２回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム（関東化学社製）処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水（１：８：１、関東化学社製）を３５℃３０時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンマルトシド（1.0 g, 収率20%）を得た。
【００２０】
［皮膚由来線維芽細胞におけるプロテアソーム活性測定］
（１）細胞培養および紫外線照射
新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＢ、三光純薬）を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でＰＤＬ（集団倍加数）をチェックしながら継代培養した。下記に定めた線維芽細胞のＰＤＬ数に達したところでプロテアソーム活性の試験に供した。
【００２１】
（ａ）紫外線Ｂ波照射にはＰＤＬ２０〜４０の若い細胞を用い、紫外線Ａ波照射にはＰＤＬ４５〜６０の老化した細胞を用いた。
（ｂ）トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、２０００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度によるように調整した。
（ｃ）６ウェル平板プレートに細胞を１０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで２４ｈ培養した。
（ｄ）紫外線照射前に、各サンプルを10μg/ml（5%FBS含有ＤＭＥＭ；ＤＭＳＯ1%含有）の濃度で添加し、24ｈ培養した。2者併用群に関しては5μg/mlずつ添加した。
（ｅ）培養液をHank’s（-）液に置換し、紫外線照射を行った。
（ｆ）照射終了後、直ちにHank’s（-）液を紫外線照射前と同一濃度条件の評価検体含有5％FBS含有DMEM（ＤＭＳＯ1%含有）に置換し、24h培養した。
【００２２】
（２）細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定
培養液を除去しＰＢＳ（−）で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を８００μＬ添加し、３７℃で５分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１．５ｍｌでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を１５ｍｌ容遠沈管に回収した。１，５００ｒｐｍ ５ｍｉｎの条件で遠沈して培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄し再び１，５００ｒｐｍ ５ｍｉｎの条件で遠沈してＤＭＥＭ中の色素（フェノールレッド）を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセリン、ｐＨ＝７．５）３００μＬに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ ＰＵＴ １、ＤＵＴＹ４０、１５ｓｅｃを２ｓｅｔ」）した。ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容エッペンチューブに全量移し、１５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン ＳＩＧＭＡ社製）換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）を用いた。
平板９６ウェルプレートに
プロテアソーム活性溶液／ＢＳＡ 溶媒：ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １０μｌ
Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）２００μｌ
を加えて１０ｍｉｎ室温にてプレートごと撹拌反応した。吸光度５９０ｎｍをプレートリーダーで計測し、ＢＳＡ溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
【００２３】
（３）プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）で調整し、３０μＬずつを分注して−２０℃冷凍保存した。使用時に解凍し６００μＬの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板９６ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
【００２４】
１．基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様） １０．５μＬ （蛍光分析 時の基質ペプチド濃度２３．８μＭ）
２．反応液（１００ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝ ８．０） ２５μＬ
３．１０ｍＭ ＡＴＰ含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ １９．５μＬ（蛍光分析時 のＡＴＰ濃度は０．９７５ｍＭ）
４．プロテアソーム活性サンプル（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ） ２０μＬ
上記溶液を３７℃１ｈ撹拌反応し、反応終了後に、
５．１０％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ（反応停止液） ２５μＬ
６．１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ＝９．０） １００μＬ （全量２００μＬ／ ｗｅｌｌ）
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）由来の蛍光強度（励起波長 Ｅｘ３８０ｎｍ、蛍光波長 Ｅｍ４４０ｎｍ）を測定した。
【００２５】
（４）データ処理
（蛍光強度／タンパク濃度）で算出されるプロテアソーム活性について、ＵＶ（−）のコントロール群を基準（１．００）とし、平均値で他の各群と比較した。
有意差検定は紫外線照射のコントロール処理群に対する多重比較をＤｕｎｅｔｔ ｔｅｓｔ（＊＊：ｐ＜０．０１， ＊ ｐ＜０．０５）で行った。
【００２６】
［紫外線Ｂ照射時のプロテアソーム活性］
［実施例１］
ＰＤＬ３８の若い線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
（ａ）紫外線Ｂ波 非照射 コントロール
（ｂ）紫外線Ｂ波 照射 コントロール
（ｃ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ｂ波 照射 シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルト シド（５μｇ／ｍｌ）
【００２７】
図１に紫外線Ｂ波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性の結果を示す。紫外線Ｂ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、紫外線Ｂ波照射によりトリプシン様プロテアソーム活性（ｂ）は２９％に低下したのに対し、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では７２％、紫外線Ｂ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群では５２％（ｄ）のトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではトリプシン様プロテアソーム活性は９８％を示し、紫外線Ｂ波照射コントロール群に対して有意にトリプシン様プロテアソーム活性を示した。併用群のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいは、シリビンマルトシドを単独で添加した群と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００２８】
［参考例１］
実施例１と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いてキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価を行った。結果を図４に示す。紫外線Ｂ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、紫外線Ｂ波照射によってキモトリプシン様プロテアソーム活性は３７％に低下したのに対し、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では１０９％、紫外線Ｂ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では８５％のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示し、それぞれ有意にプロテアソーム活性化した。一方、紫外線Ｂ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は９１％を示し、紫外線Ｂ波照射コントロール群に対して有意にプロテアソーム活性化した。いずれの群においても有意なキモトリプシン様プロテアソーム活性を発揮したが、シリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドとの併用効果を実証する事が出来なかった。
【００２９】
［紫外線Ａ照射時のプロテアソーム活性］
［実施例２］
ＰＤＬ５８の老化した線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、プロテアソーム活性化評価を行った。
（ａ）紫外線Ｂ波 非照射 コントロール
（ｂ）紫外線Ｂ波 照射 コントロール
（ｃ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ｂ波 照射 シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ｂ波 照射 シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルト シド（５μｇ／ｍｌ）
【００３０】
図２に、紫外線Ａ波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性の結果を示す。紫外線Ａ波非照射のコントロール（ａ）と比較して、トリプシン様プロテアソーム活性は紫外線Ａ波照射によって２９％に低下したのに対し、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では９６％、紫外線Ａ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では８１％のトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではトリプシン様プロテアソーム活性は１５８％を示し、紫外線Ａ波照射コントロール群（ａ）に対して有意にトリプシン様プロテアソームを活性化した。更に、併用群のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいはシリビンマルトシドを単独で添加した群（ｃ）（ｄ）と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００３１】
［実施例３］
実施例２と同様の線維芽細胞、評価サンプルを用いたキモトリプシン様プロテアソーム活性化評価の結果を図３に示す。キモトリプシン様プロテアソーム活性は紫外線Ａ波照射によって５０％に低下したのに対し、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｃ）では１２８％、紫外線Ａ波照射シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）添加群（ｄ）では１２８％のキモトリプシン様プロテアソーム活性を示したが、有意な差ではなかった。一方、紫外線Ａ波照射シリマリンＥＴ／Ｇ（５μｇ／ｍｌ）＋シリビンマルトシド（５μｇ／ｍｌ）併用群（ｅ）ではキモトリプシン様プロテアソーム活性は２１９％を示し、紫外線Ａ波照射コントロール群（ｂ）に対して有意にキモトリプシン様プロテアソームを活性化した。更に、併用群（ｅ）のトリプシン様プロテアソーム活性は、シリマリンＥＴ／Ｇ、あるいはシリビンマルトシドを単独で添加した群（ｃ）（ｄ）と比較して、明らかに相乗効果が認められた。
【００３２】
［考察］
シリマリンＥＴ／Ｇ、シリビンマルトシド単独添加の同一濃度（１０μｇ／ｍｌ）条件でのプロテアソームの活性化を試験条件［紫外線Ａ波／Ｂ波×トリプシン様活性／キモトリプシン様活性］で総括すると、総じてシリマリンＥＴ／Ｇがシリビンマルトシドよりも優れたプロテアソーム活性を示した。これは、シリビンマルトシドが糖修飾されて分子量が大きく嵩高くなることで細胞膜に対する透過性がシリビンマルトシドでは低下した事に起因すると考えられる。
【００３３】
しかしながら、半分の濃度（５μｇ／ｍｌ）同士で２者を併用した時のプロテアソーム活性は、いずれの試験条件においても両成分の単独添加より優れたプロテアソーム活性を示したことから、２者併用による相乗効果があると考えられる。
【００３４】
シリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドの相乗的なプロテアソーム活性化は、真皮線維芽細胞への添加により時間差をもって細胞膜を通過する事に起因すると推測される。このシリマリンＥＴ／Ｇとシリビンマルトシドの相乗的なプロテアソーム活性化作用は、生体、とりわけ皮膚の異常タンパク質や酸化タンパク質の除去や排泄に効果的に作用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ｂ被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【請求項３】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【請求項４】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【請求項１】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ｂ被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【請求項３】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ被曝によるトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【請求項４】
シリビンマルトシド及びシリマリンを有効成分とする紫外線Ａ被曝によるキモトリプシン様プロテアソーム活性低下に対する回復剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−８２１４９（Ｐ２０１２−８２１４９Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２７７６５（Ｐ２０１０−２２７７６５）
【出願日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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