プロテアーゼ耐性ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン
【課題】プロテアーゼ存在下でも安定な、酸化低比重リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＬＤＬ」という）結合物質、酸化ＬＤＬの除去剤若しくは除去装置、酸化ＬＤＬの除去若しくは測定する方法、又は、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療薬若しくは予防薬を提供する。
【解決手段】酸化ＬＤＬの除去に、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインを利用し、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインのトロンビン分解部位のアミノ酸を置換することにより、プロテアーゼ耐性能、及び、酸化ＬＤＬ結合能の両方を備えるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を得た。
【効果】本ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、安定な酸化ＬＤＬ等のＬＯＸ−１結合物質との結合剤となる。
【解決手段】酸化ＬＤＬの除去に、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインを利用し、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインのトロンビン分解部位のアミノ酸を置換することにより、プロテアーゼ耐性能、及び、酸化ＬＤＬ結合能の両方を備えるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を得た。
【効果】本ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、安定な酸化ＬＤＬ等のＬＯＸ−１結合物質との結合剤となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ存在下でも安定な、酸化低比重リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＬＤＬ」という）結合物質、酸化ＬＤＬの除去剤若しくは除去装置、酸化ＬＤＬの除去若しくは測定する方法、又は、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療薬若しくは予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ＬＤＬは、スカベンジャー受容体のリガンドとして取り込まれ泡沫細胞を形成し、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞を活性化することから血管内皮障害性疾患の原因と考えられている。よって、血中の酸化ＬＤＬを除去することにより、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療又は予防に利用することができることから、酸化ＬＤＬを標的とした治療法の開発が望まれている。例えば、酸化ＬＤＬを除去する方法として、ＬＤＬ中に含まれるａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ中の陽性荷電アミノ酸との静電的結合を利用してデキストラン硫酸をリガンドとする吸着材が実用化されている。また、同様の作用を利用するジアルキルアミノアルキルデキストランを利用する方法が開示されている（特許文献１）。しかし、これらの静電的作用を利用する場合には、酸化ＬＤＬに対する選択性が低いという問題があった。酸化ＬＤＬに対する抗体として、酸化ホスファチジルコリンに対する抗体を利用する方法が知られている。しかし、ＬＤＬは、アポリポタンパク質、リン脂質、コレステロール等の複合体であることから、ＬＤＬが酸化を受けると様々な成分が過酸化され、タンパク質の架橋や開裂等が連続的に起こる。このため、実際には酸化ＬＤＬは単一の物質ではなく多様な物質であり、前記抗体による酸化ＬＤＬの除去が、酸化ＬＤＬ中の酸化ホスファチジルコリンの含有量に依存してしまうという問題があった。
【０００３】
レクチン様酸化ＬＤＬレセプター−１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、以下、「ＬＯＸ−１」という）は、血管内皮細胞の酸化ＬＤＬレセプターとして同定されたタンパク質である（非特許文献１参照）。酸化ＬＤＬによるアテローム性動脈硬化の形成に、ＬＯＸ−１が介在することが報告されている（非特許文献２参照）。ＬＯＸ−１は、酸化ＬＤＬに特異的に結合することから、ＬＯＸ−１を用いて酸化ＬＤＬを測定した例が報告されている（非特許文献３参照）。しかし、ＬＯＸ−１を利用して酸化ＬＤＬを除去する試みはこれまでのところ行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１０２３４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｗａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７３−７７（１９９７）
【非特許文献２】Ｍｅｈｔａ ＪＬら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ １００：１６３４−４２（２００７）
【非特許文献３】Ｓａｔｏら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００：３０３−３０９（２００８）
【発明の概要】
【０００６】
本願発明等は、酸化ＬＤＬの除去に、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインを利用することを考え、鋭意検討した結果、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインが血中に存在するプロテアーゼにより分解されることを見出し、安定性に問題が生じ得ることを見出した。そこで、本願発明者らは、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインが分解を受けるプロテアーゼについて検討したところ、特にトロンビンによる分解を受けやすいことを見出した。更に、本願発明者らは、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインがトロンビンにより分解を受ける部位について検討したところ、ＬＯＸ−１全長配列における、２０８番目と２０９番目、２０９番目と２１０番目、２２９番目と２３０番目、２３１番目と２３２番目、２４８番目と２４９番目、及び、２７１番目と２７２番目のアミノ酸の間がトロンビンにより分解を受けやすいことを見出した。そこで、本発明者らは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインの前記トロンビン分解部位のアミノ酸を置換することにより、プロテアーゼ耐性能、及び、酸化ＬＤＬ結合能の両方を備えるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を得て本願発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインのうち、トロンビンにより分解され得る、２０８番目と２０９番目のアミノ酸（分解部位１）、２０９番目と２１０番目のアミノ酸（分解部位２）、２２９番目と２３０番目のアミノ酸（分解部位３）、２３１番目と２３２番目（分解部位４）、２４８番目と２４９番目（分解部位５）、及び、２７１番目と２７２番目のアミノ酸（分解部位６）におけるアミノ酸（以下、総称して「トロンビン分解部位アミノ酸」という）を置換することにより、トロンビン耐性のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を提供するものである。本明細書において、アミノ酸の位置を示す番号は、特に定義されない限り、配列番号２に示すヒトＬＯＸ−１全長配列におけるアミノ酸の位置により表現されている。本願発明は、具体的には、次の（１）〜（３７）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が置換されているポリペプチド：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
（２） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（３） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（４） 配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（５） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（６） 配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（７） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（８） 配列番号２における２３２番目に該当するグルタミンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（９） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１０） 配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１１） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１２） 配列番号２における２７２番目に該当するアラニンが、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１３） （２）〜（１２）から選択される２以上の任意の組み合わせからなる、（１）に記載のポリペプチド。
（１４） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１５） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１６） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１７） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１８） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１９） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２７２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（２０）配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換され、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換され、配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換され、配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換され、かつ、配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（２１） 配列番号２における２０８番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアミノ酸が、以下の（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択される１以上の置換により置換されている、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号２における２０８番目に該当するアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換；
（ｉｉ）配列番号２における２２９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｉｉｉ）配列番号２における２３１番目に該当するアミノ酸のグルタミンへの置換；
（ｉｖ）配列番号２における２４８番目に該当するアミノ酸のアスパラギン酸又はグリシンへの置換；
（ｖ）配列番号２における２７１番目に該当するアミノ酸のロイシンへの置換。
（２２） 配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸に置換されている、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２３） 配列番号２における２０９番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、以下の（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択される１以上の置換により置換されている、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号２における２０９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｉｉ）配列番号２における２３０番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｉｉｉ）配列番号２における２３２番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｉｖ）配列番号２における２４９番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｖ）配列番号２における２７２番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換。
（２４） 配列番号２における２０８番目及び／又は２０９番目に該当するアミノ酸、２２９番目及び／又は２３０番目に該当するアミノ酸、２３１番目及び／又は２３２番目に該当するアミノ酸、２４８番目及び／又は２４９番目に該当するアミノ酸、並びに、２７１番目及び／又は２７２番目に該当するアミノ酸が置換されている、（１）〜（２３）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２５） 野生型ＬＯＸ−１と比較して、トロンビンによる分解量が少ないことを特徴とする、（１）〜（２４）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２６） ＬＯＸ−１結合物質への結合活性を有する、（１）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２７） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（２６）に記載のポリペプチド。
（２８） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（２９） （２８）記載の核酸を含有するベクター。
（３０） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤。
（３１） 酸化ＬＤＬ除去剤である、（３０）に記載の除去剤。
（３２） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置。
（３３） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（３２）に記載の除去装置。
（３４） 検体中のＬＯＸ−１結合物質の除去方法であって、
血液又は血液成分と（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
（３５） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（３４）に記載の除去方法。
（３６） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質測定用キット。
（３７） 検体中のＬＯＸ−１結合物質の測定方法であって、
検体を調整する工程；及び、
検体と（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【０００８】
本明細書において、「ＬＯＸ−１」又は「野生型ＬＯＸ−１」とは、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター−１のことである。ＬＯＸ−１は、そのスプライシングアイソフォームが報告されている（国際公開公報ＷＯ２００６／１３７１０１）、従って、本明細書においてＬＯＸ−１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、そのスプライシングアイソフォームを意味する。ＬＯＸ−１のレクチン様ドメインのうち、Ｃ末端に位置する７アミノ酸（ウシＬＯＸ−１の２６１番目から２６７番目、ヒトＬＯＸ−１では２６５番目から２７０番目に相当）がリガンド結合に重要であることが報告されている（Ｃｈｅｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３５５：２８９−２９６（２００１））。本明細書において、「ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン」又は「ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン」とは、ＬＯＸ−１タンパク質又はそのスプライシングアイソフォームのうち、酸化ＬＤＬと結合する領域を備えるペプチドのことであり、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインは、ＬＯＸ−１細胞外ドメイン、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４を含む。ここで、「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、６１番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチドのことである。また、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチドのことである。「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１２９番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドのことである。なお、これらのタンパク質又はポリペプチドと９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるタンパク質又はポリペプチド、これらのタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるタンパク質又はポリペプチド、あるいは、これらのタンパク質又はポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質又はポリペプチドであって、酸化ＬＤＬ結合能を有するポリペプチド又はタンパク質も、ＬＯＸ−１又はＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインに含まれる。
【０００９】
本明細書において、「ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体」又は「ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体」とは、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインである。より具体的には、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合するポリペプチドのことである：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１０】
一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１細胞外ドメイン（以下、「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１細胞外ドメイン変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約２１３アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１１】
別の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４（以下、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約１４５アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１２】
また、別の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ（以下、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約１３１アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１３】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体における６か所のトロンビン分解部位を構成する１１個のアミノ酸のうち置換されるアミノ酸の数は、１〜１１個であってよく、好ましくは、２〜８個である。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインにおける、トロンビン分解部位は、分解部位１（配列番号２における２０８番目と２０９番目のアミノ酸）、分解部位２（配列番号２における２０９番目と２１０番目のアミノ酸）、分解部位３（配列番号２における２２９番目と２３０番目のアミノ酸）、分解部位４（配列番号２における２３１番目と２３２番目のアミノ酸）、分解部位５（配列番号２における２４８番目と２４９番目のアミノ酸）、及び、分解部位６（配列番号２における２７１番目と２７２番目のアミノ酸）である。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、前記分解部位１〜６のうち、少なくとも１か所の分解部位においてアミノ酸が置換されているポリペプチドであり、好ましくは全ての分解部位においてアミノ酸が置換されているポリペプチドである。１か所の分解部位におけるアミノ酸置換は、当該分解部位を構成する２個のアミノ酸の両方が置換されていてもよいし、片方のみが置換されていてもよい。
【００１４】
トロンビンは、一般的に、アルギニンのカルボキシ末端側（以下、「Ｃ末側」という）を切断することが知られている。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアルギニン（Ｒ）を他のアミノ酸に置換することにより行われる。アルギニンを置換するアミノ酸は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質への結合を維持し、かつ、トロンビンによる分解を受けないアミノ酸であれば特に限定されない。例えば、ＬＯＸ−１の結晶構造は報告されており（国際公開公報ＷＯ２００５／０５４４６０）、リガンド結合との結合に重要な部位（ウシでは２６１番目−２６７番目、ヒトでは２６５番目−２７０番目）も知られていることから、リガンド結合機能を維持する立体構造をとるアミノ酸置換をコンピュータによる立体構造予測の手法を用いて選択することができる。配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアルギニンと置換するアミノ酸は、好ましくは、リシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン酸、又は、グリシンである。より好ましくは、配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンは、ロイシン又はメチオニンと置換される。また、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンは、リシンと置換される。配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンは、グルタミンと置換される。配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンは、アスパラギン酸又はグリシンと置換される。配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンはロイシンと置換される。
【００１５】
また、トロンビンは、一般的に、アルギニンとそのＣ末側に位置する非酸性アミノ酸との間を切断すると考えられている。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、アルギニンのＣ末側に位置する非酸性アミノ酸を、酸性アミノ酸（グルタミン酸又はアスパラギン酸）に置換することにより行われる。また、本願発明者らは、アルギニンのＣ末側のアミノ酸をシステイン、又は、ヒスチジンに置換した場合にもトロンビン分解に耐性を示すことを見出した。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸を、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換することにより行われる。
【００１６】
配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンは、好ましくは、リシン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、より好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２０８番目のアルギニンが置換されていない場合、２０９番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２０８番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２０９番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１７】
配列番号２における２１０番目に該当するアルギニンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２０９番目のアルギニンが置換されていない場合、２１０番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２０９番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２１０番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１８】
配列番号２における２３０番目に該当するバリンは、好ましくは、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、より好ましくは、スレオニン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、更に好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２２９番目のアルギニンが置換されていない場合、２３０番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２２９番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２３０番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１９】
配列番号２における２３２番目に該当するグリシンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、より好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２３１番目のアルギニンが置換されていない場合、２３２番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２３１番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２３２番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２０】
配列番号２における２４９番目に該当するグリシンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、より好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２４８番目のアルギニンが置換されていない場合、２４９番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２４８番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２４９番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２１】
配列番号２における２７２番目に該当するアラニンは、好ましくは、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、より好ましくは、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、更に好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２７１番目のアルギニンが置換されていない場合、２７２番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２７１番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２７２番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２２】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体としては、例えば、配列番号２において、２０８番目がアルギニン(野生体)、ロイシン、メチオニン、又は、リジン；２０９番目がアルギニン(野生体)又はリジン；２１０番目がアスパラギン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２２９番目はアルギニン(野生体)又はリジン；２３０番目がバリン(野生体)、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、又は、フェニルアラニン；２３１番目がアルギニン(野生体)、グルタミン、又は、リジン；２３２番目がグリシン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２４８番目がアルギニン(野生体)、アスパラギン酸、グリシン、又は、リジン；２４９番目がグリシン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２７１番目がアルギニン(野生体)、ロイシン、リジン、又は、グルタミン；２７２番目がアラニン(野生体)、スレオニン、セリン、イソロイシンであるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン、但し、全てが野生型のアミノ酸であるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインを除く、を挙げることができる。
【００２３】
本願明細書におけるアミノ酸置換は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質への結合を維持し、かつ、トロンビンによる分解を受けない置換であれば特に限定されない。例えば、ＬＯＸ−１の結晶構造は報告されており（国際公開公報ＷＯ２００５／０５４４６０）、リガンド結合との結合に重要な部位（ウシでは２６１番目−２６７番目、ヒトでは２６５番目−２７０番目）も知られていることから、リガンド結合機能を維持する立体構造をとるアミノ酸置換をコンピュータによる立体構造予測の手法を用いて選択することができる。
【００２４】
本明細書において、「ＬＯＸ−１結合物質」とは、ＬＯＸ−１のリガンドのことである。ＬＯＸ−１結合物質は、例えば、酸化ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、又は、血小板であってよく、好ましくは、酸化ＬＤＬである。
【００２５】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１結合活性を維持する限り、トロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変（即ち、置換、欠失、付加、挿入又は修飾）されていてもよい。具体的には、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインと９０％相同性を有するようにトロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変されていてもよい。又は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を有するようにトロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変されていてもよい。あるいは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、トロンビン分解部位以外のアミノ酸が１〜数個改変されていてもよい。トロンビン分解部位以外のアミノ酸が置換される場合、好ましくは保存的置換により置換される。「保存的置換」とは、大きさ、疎水・親水性、酸性・塩基性等の性質に影響せず又は変更させないアミノ酸による置換であって、元のタンパク質又はペプチドの活性を維持する置換を意味する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ １９：１７１−１７５（１９８３））。
【００２６】
本明細書において、「相同性」とは、二つのアミノ酸配列を比較した場合に、同一であるアミノ酸のパーセントのことを意味する。二つのアミノ酸配列において、同一であるアミノ酸のパーセントは、当該二つのアミノ酸を、ギャップを考慮した上で適切なアラインメントを行い、（（同一であるアミノ酸の数）／（全長アミノ酸数）×１００）により求めることができる。相同性の計算は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の既存のプログラムを利用して計算することもできる。
【００２７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、当業者が一般的に使用するハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かは、サザンブロットの様な核酸のハイブリダイゼーションを確認できる手法を用いて確認することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、０．７〜１．０Ｍ ＮａＣｌ存在下、６５℃で行われ、６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液により洗浄後ハイブリダイズを確認することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．等）。
【００２８】
また、上述の通り、ＬＯＸ−１の立体構造及び酸化ＬＤＬ結合に重要なアミノ酸が報告されていることから、改変すべきアミノ酸及びその改変方法は、コンピュータによる立体構造シミュレーションを利用して元のタンパク質又はペプチドの立体構造を維持するアミノ酸として選択してもよい。特に、ウシＬＯＸ−１の２６２番目のリシンと２６３番目のリシン（ヒトＬＯＸ−１では２６６番目のリシンと２６７番目のリシンに相当）の置換が酸化ＬＤＬへの結合活性に影響があることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６６番目のリシンと２６７番目のリシンが改変されていないポリペプチドである。また、ウシＬＯＸ−１の２６１番目〜２６７番目のアミノ酸（ヒトＬＯＸ−１では２６５番目〜２７０番目に相当）が酸化ＬＤＬへの結合に重要であることが報告されていることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６５番目〜２７０番目のアミノ酸が改変されていないポリペプチドである。更に、ウシＬＯＸ−１の２６１番目〜２７０番目のアミノ酸の欠失が、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬへの結合活性を消失させることが報告されていることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６５番目〜２７３番目のアミノ酸が欠失されていないポリペプチドである。
【００２９】
天然のＬＯＸ−１タンパク質は二量体を形成することが報告されている。従って、本明細書における、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、二量体を形成していてもよい。また、ＬＯＸ−１のスプライシングアイソフォームが報告されている（国際公開公報ＷＯ２００６／１３７１０１）。従って、本明細書におけるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、当該スプライシングアイソフォームにおける酸化ＬＤＬ結合ドメインが改変されたものであってもよい。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤に関する。本除去剤を使用することにより、ＬＯＸ−１結合物質を除去することができる。本除去剤は、その除去能を高めるため、例えば、抗酸化ホスファチジルコリン抗体、抗アポＢ抗体、酸化ホスファチジルコリン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、酸化ＬＤＬ受容体（米国特許５，５１０，４６６）等の酸化ＬＤＬとの結合性を備える物質を備えていてもよい。また、本除去剤は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体が適宜固相に結合された状態であってもよい。具体的な態様において、本除去剤は、例えば、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体が結合した中空糸である。本発明の除去剤は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）を吸着除去可能なものであれば、その形状・構造、使用方法等が特に限定されるものではなく、例えば、懸濁液等の液状であってもよいし、カラム、貼布、錠剤等の固体であってもよい。
【００３１】
また、別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置に関する。本装置は、ＬＯＸ−１結合物質を除去する限りその用途が限定されるものではないが、好ましくは血液中の酸化ＬＤＬを除去する目的で使用される。本発明の、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置は、好ましくは、アフェレーシス治療で使用される酸化ＬＤＬ吸着装置である。例えば、本発明のＬＯＸ−１結合物質除去装置は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する吸着器であってもよいし、血液ポンプ、抗凝固剤注入ポンプ、動脈圧モニタ、血漿分離器、濾過圧モニタ、血漿ポンプ、吸着機入口圧モニタ、吸着器、微粒子除去フィルタ、静脈圧モニタ、気泡検出器を備える吸着装置であってもよい。該酸化ＬＤＬ吸着装置は、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療に用いることができる。
【００３２】
また、別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質除去との結合阻害剤に関する。本阻害剤は、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質との結合を阻害する限りその用途が限定されるものではないが、好ましくは血液中の酸化ＬＤＬとマクロファージや血管内皮細胞等の細胞表面上のＬＯＸ−１との結合を阻害する目的で使用される。本発明の、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質除去との結合阻害剤は、好ましくは、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療剤である。
【００３３】
本明細書において、「酸化ＬＤＬに起因する疾患」とは、酸化ＬＤＬにより発症又は増悪する疾患のことであり、例えば、血管内皮障害性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、虚血性疾患、動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症、脳卒中、心不全、心筋梗塞、狭心症、冠動脈狭窄、及び、バージャー病を挙げることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、プロテアーゼによる分解に耐性を示す。従って、本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、安定な酸化ＬＤＬ等のＬＯＸ−１結合物質との結合剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】トロンビン処理したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体及びその変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図中、左から順に、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。また、図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はトロンビン未処理の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、レーン３はトロンビン処理後の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表す。
【図２】トロンビン量を０Ｕから２Ｕまで変化させて、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）量を測定した結果を示す図である。図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。
【図３】ＣＴＬＤ及びトロンビン耐性が向上した変異体の酸化ＬＤＬ結合能を測定した結果を示す。図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｄ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を、ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＱＧ−ＬＴ）、ＱＤ−ＬＴは変異体ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ（ＱＤ−ＬＴ）を示す。
【図４】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【図５】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【図６】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載のＬＯＸ−１をコードする遺伝子配列を基に、所望のアミノ酸配列（例えば、１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列）を与えるＤＮＡをクローニングし、当該ＤＮＡを鋳型として所望のトロンビン結合部位のアミノ酸置換を与えるＤＮＡを設計後、部位特異的変異処理（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｈｕｔｓｃｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５３：（１８）、６５５１−６５６０（１９７８））、又は、ＰＣＲを介した変異処理（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｓｈｉｍａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５７：１５７−６５（１９９６））を用いて作製することができる。例えば、変異導入用のキットとして、ジーンテイラー部位特異的変異導入システム（ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、及び、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）が市販されている。よって、アミノ酸の置換は、これらのキットを用いてキット添付のプロトコルに従うことにより行うことができる。
【００３７】
作製されたＤＮＡは、適宜選択された発現ベクターに組み込んだ後、宿主にトランスフェクトされる。発現ベクターは宿主及び選択マーカー等に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主として大腸菌を使用する場合、ｐＥＴ２２ｂを使用することができ、宿主として動物細胞を使用する場合、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶを使用することができる。宿主へのトランスフェクションは、市販のトランスフェクション試薬を用いて当業者周知の方法により行うことができる。その後、必要に応じて、ＩＰＴＧ等の発現促進試薬及び／又は抗生物質等の選択試薬の存在下で宿主を培養することにより、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を発現させることができる。
【００３８】
発現したポリペプチドは、必要に応じてリフォールディングさせることができる。ポリペプチドのリフォールディングは、必要に応じて界面活性剤を含む、変性剤を含有する変性緩衝液にポリペプチドを添加して可溶化した後、透析又は希釈により変性剤を除去することにより行うことができる。可溶化に使用する変性剤としては、例えば、グアニジン塩酸塩又は尿素を使用することができる。変性緩衝液としては、例えば、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）を使用することができる。変性緩衝液に加えるポリペプチドの量は、ポリペプチドの安定性に応じて選択することができ、例えば、２〜７Ｍである。可溶化を行う温度は、例えば、３７〜５０℃とすることができる。ポリペプチドがジスルフィド結合を有する場合、変性剤の他、還元剤を添加することができる。還元剤としては、例えば、β−メルカプトエタノール又はジチオトレイトールを使用することができる。ジスルフィド結合を有するポリペプチドを可溶化させる時間は、存在するジスルフィド結合の数に応じて延ばすことができ、例えば、４本のジスルフィド結合を有する場合には、３７℃で３時間又は室温で１２時間インキュベートすることができる。可溶化したポリペプチドのリフォールディングは、可溶化ポリペプチド溶液を１０〜１００倍に希釈させることにより行うことができる。リフォールディングの温度は、ポリペプチドの性質に応じて適宜選択することができ、例えば、４〜３７℃から選択することができる。また、可溶化において還元剤を使用した場合には、リフォールディングにおいて酸化剤（例えば、酸化型グルタチオン又はシスチン）を加えることができる。可溶化において界面活性剤を使用した場合には、リフォールディングにおいてシクロデキストリン又はシクロアミロースを加えることができる。また、リフォールディングにおいて低分子化合物を添加することもできる（Ｇｏｕｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１５：２７９−９０（２００５））。また、市販のキット、例えば、ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、Ｒｅｆｏｌｄ ＳＫ（Ｎｏｖｅｘｉｎ社）、Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ＣＡ Ｋｉｔ、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ＧｒｏＥ、ｉＦＯＬＤＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ社）を用いてリフォールディングを行うこともできる。また、ＬＯＸ−１のリフォールディングに関する情報がリフォールディング条件のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｆｏｌｄ．ｍｅｄ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ．ａｕ／）上に登録されており、当該情報を参照してリフォールディングの条件を検討することができる。
【００３９】
一の態様において、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去剤に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去剤を医療用吸着剤として使用する場合、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を単独で使用することもできるし、担体に固定化して使用することもできる。また、本発明の吸着剤において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、表面に無機化合物又は有機化合物を結合させて使用することもできる。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体への所望の化合物の結合は、ペプチドへの結合方法として当業者周知の方法を用いることができる。
【００４０】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化して使用する場合、このような、基材又は担体としては、医療用に用いられる基材又は担体であれば特に限定はない。基材又は担体の形状としては、例えば、シート状；ビーズ状；中空糸、糸束等の繊維状；織物状；スポンジ状；又はネット状等を挙げることができる。また、基材又は担体の素材としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、再生セルロース等のセルロース；コラーゲン、キチン、キトサン等の生体由来材料；活性炭及びセラミック等の無機材料；、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル；ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン等のポリビニル；ナイロン（ナイロン６、ナイロン６４、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン４６、ナイロン９、ナイロン１１、又は、ナイロン１２）等のポリアミド；ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のポリアクリル；ポリスルホン；ポリイミド；ポリエーテルスルホン；ポリカーボネート；ポリウレタン；ポリビニルアルコール；ポリテトラフルオロエチレン等のポリハロオレフィン；ポリ尿素；ポリチオ尿素；ポリオキシメチレン；エチレンビニルアルコール共重合、ＡＢＳ樹脂、エチレンビニルアセテート等の共重合体；及び、ポリエステル系ポリマーアロイ等を挙げることができる。
【００４１】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化して使用する場合、固定化の方法はＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材に固定化できる方法であれば特に限定は無く、例えば、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材の表面に被覆してもよく、又は、微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させてもよい。
【００４２】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材表面に被覆する場合、基材表面とスペーサーを介して結合させることにより、又は、基材表面に直接結合することにより製造することができる。更に、本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化する方法として、担体に共有結合による固定化を利用することができる。例えば、固定化担体表面上にアミノ基等の官能基を導入し、グルタルアルデヒド等で当該官能基を活性化して、タンパク質表面のアミノ基等と結合させる方法を用いることができる。タンパク質をその配向性を調節しながら固相への結合する方法が知られていることから、好ましくは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質結合部位が血液と接触する表面上に位置するように固定化する。
【００４３】
微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させる場合、予め作製した微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を添加してもよいし、空隙を作成しながらＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させてもよい。微小空隙を形成する担体物質としては、好ましくは、直径１ｎｍ〜１００ｎｍの繊維状又は概球状の物質であり、より好ましくは、直径数ｎｍ〜１０ｎｍの繊維状又は慨球形の物質である。担体により形成された空隙の大きさは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持できる大きさであれば特に限定されないが、好ましくは、２ｎｍ〜１０００ｎｍであり、より好ましくは、１０ｎｍ〜１００ｎｍである。
【００４４】
一の態様において、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去装置に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去装置を医療用吸着装置として使用する場合、直接血液吸着法（ＤＨＰ）用の装置又は血漿吸着法用の装置であってよいが、好ましくは血漿吸着法用の装置である。本吸着装置は、上述の吸着材を吸着器に充填することにより製造することができる。更に、本吸着装置は、血液ポンプ、抗凝固剤注入ポンプ、動脈圧モニタ、血漿分離器、濾過圧モニタ、血漿ポンプ、吸着機入口圧モニタ、吸着器、微粒子除去フィルタ、静脈圧モニタ、気泡検出器を適切な回路として組み立てることにより製造することができる。
【００４５】
一の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の除去方法に関する。本発明の除去方法を医療用として用いる場合、本発明の除去方法は、血液から血漿を分離するステップ、及び、分離された血漿をＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体と接触させるステップを備える。本発明の方法は、好ましくは、血液に抗凝固剤を添加するステップ、血液から血漿を分離するステップ、分離された血漿をＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体と接触させるステップ、必要に応じて吸着された生体に必要な成分を血漿に添加するステップ、及び、血漿と分離された成分と血漿とを混合するステップを備える。抗凝固剤としては、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム等のヘパリン；ダルテパリンナトリウム、パルパリンナトリウム、レビパリンナトリウム等の低分子ヘパリン；又は、メシル酸ナファモスタットを使用することができる。
【００４６】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）を測定することを備える、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の検査方法又はＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患の診断方法に関する。即ち、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の検査方法であって、検体を調整するステップ；検体とＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体とを接触させるステップ；及び、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体へのＬＯＸ−１結合物質の結合を測定するステップを備える方法に関する。また、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患の診断方法であって、検体を調整するステップ；検体とＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体とを接触させるステップ；ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体へのＬＯＸ−１結合物質の結合を測定するステップ；及び、結合したＬＯＸ−１結合物質の量が健常人と比較して多い場合に、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患である可能性が高いと判定するステップを備える方法に関する。診断は、例えば、その数値等の閾値の設定の仕方により、酸化ＬＤＬに起因する疾患への罹患の有無の診断であってもよいし、将来酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患する可能性を予測するものであってもよい。比較対象となる健常人における酸化ＬＤＬのレベルは、例えば、当業者周知の情報により、又は、酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患したことのない被験者の試料における酸化ＬＤＬのレベルを測定することにより、又は、他の酸化ＬＤＬに起因する疾患の指標による評価と組み合わせることにより知ることができる。本発明の酸化ＬＤＬのレベルを利用して、患者が酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患する可能性を判定することができる。判定は、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４７】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を投与することを備える、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療方法に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を医薬として用いる場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、貼布剤、点滴、軟膏等を挙げることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）と共に投与されてもよい。また、本発明の治療薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００４８】
本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、血中に投与する。具体的には、血管内（例えば、静脈内、冠動脈内）に投与することができる。また、本発明の化合物は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の化合物の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の化合物の投与方法として、好ましくは、１週間に１〜４回投与であり、より好ましくは、１週間に１回投与である。また、本発明の化合物は、２〜３週間に１回投与とすることもできる。
【００４９】
本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、虚血性疾患の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量として、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、５〜５００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、１０〜３０μｇ／ｋｇである。
【００５０】
なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本明細書において、「約」の語は、±１０％以内の数値を意味する。数値が整数値を取る必要がある場合、小数点以下の数値は四捨五入される。以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
実施例１．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのクローニング
ヒト肺ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）より、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＬＯＸ−１ＣＴＬＤをクローニングした。具体的には、Ｓａｗａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６（６６２０）、７３−７７（１９９７）に示される配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５４３）（配列番号１）に基づいて、ＣＴＬＤに適合する２種類の特異的プライマー
センスプライマー：５’−ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡ−３’（配列番号６）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号７）
を用いて増幅した。増幅転写物の塩基配列をＤＮＡ配列分析機３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて確認した。さらに、ＣＴＬＤの配列をもつＰＣＲフラグメントの５’側にＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを、３’側にＨｉｓタグをＰＣＲにより付加し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ切断部位、ＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングして、塩基配列を３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）により確認した（非図示）。
【００５２】
実施例２．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのプロテアーゼ切断部位の検討
（１）ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのプロテアーゼによる切断検討
実施例１において調製したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ２２ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換した。得られた形質転換宿主細胞を、アンピシリン（和光）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように添加したＬＢ培地に播種し、３７℃で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬＯＸ−１ ＣＴＬＤの発現を誘導し、３７℃で２時間培養した後、菌体を集菌し、ＴＢＳにて洗浄した。ほとんどのＣＴＬＤが封入体を形成していたため、不溶性ポリペプチド画分をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて精製した。
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒで精製した封入体を用いて、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ＣＡ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）によりリフォールディングを行い、カートリッジＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ（ＧＥ社）に吸着させた後、イミダゾールによる濃度勾配で溶出し、ＣＴＬＤを部分精製した。部分精製したタンパクは、さらに、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ）に吸着させて、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎによる濃度勾配で精製した。
精製して得られたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、大過剰のトロンビン、エンテロキナーゼ、又は、第Ｘａ因子で処理してプロテアーゼ切断を受けるか調べた。２５μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解した２５μｇのＬＯＸ−１ ＣＴＬＤに、２Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）（１Ｕは、１ｇの対象タンパク質を分解する濃度）、１０Ｕのエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、又は、１０Ｕの第Ｘａ因子（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を加え、２５℃で１８時間反応させた。反応後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加して反応を停止させ、直後に反応産物を定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとして調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。その結果、トロンビンにより処理したサンプルではＣＴＬＤの断片化が確認されたが、エンテロキナーゼ、又は、第Ｘａ因子で処理したサンプルではＣＴＬＤの断片化は確認されなかった（非図示）。このことから、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤは、トロンビンにより切断されることが確認された。
【００５３】
（２）ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのトロンビンによる切断部位検討
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ断片について、常法に従いペプチドマッピングを行ったところ、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤは、Ｒ２０８とＲ２０９の間、Ｒ２０９とＮ２１０の間、Ｒ２２９とＶ２３０の間、Ｒ２３１とＧ２３２の間、Ｒ２４８とＧ２４９の間、及び、Ｒ２７１とＡ２７２の間で切断することが明らかとなった。これらの切断部位のうち、特に、Ｒ２２９、Ｒ２３１及びＲ２４８は、ＬＯＸ−１のリガンド認識に必須なアミノ酸残基として報告されている（Ｏｈｋｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３（６）：９０５−９１７（２００５））。
【００５４】
実施例３．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤへの変異導入
ＣＴＬＤのトロンビン切断部位のアミノ酸置換を行い、トロンビン耐性変異体の作成を行った。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、当該キットに添付のプロトコルに従って、表３０に記載の変異を導入した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
作成した変異体の一覧を表１に示す。一番左のカラムのうち、ＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）は野生型のＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを示し、その他は変異体の名前を示す。一番上のＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）の行は野生型におけるアミノ酸の位置及びアミノ酸の種類を示し、その下に各変異体について変異を導入した場所と置換したアミノ酸をそれぞれ示す。トロンビン耐性は変異を導入した場所の耐性の程度を示す。結合活性は、酸化ＬＤＬとの結合程度を示す。(それぞれ後に記載する方法による)
【００５７】
各変異体作成のために用いたプライマーは、以下のとおりである（図４〜６）。尚、以下のプライマーの説明において、例えば、「Ｇ２３２Ａ」は、２３２番目における野生型のＧ（グリシン）をＡ（アラニン）に変換したことを意味するものとする。
（ａ）２３２位のグリシンの置換
Ｇ２３２Ｃ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号８）
Ｇ２３２Ｄ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号９）
Ｇ２３２Ｅ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１０）
Ｇ２３２Ｆ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１１）
Ｇ２３２Ｈ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１２）
Ｇ２３２Ｉ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１３）
Ｇ２３２Ｋ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１４）
Ｇ２３２Ｌ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１５）
Ｇ２３２Ｍ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｔｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１６）
Ｇ２３２Ｎ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１７）
Ｇ２３２Ｐ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｃｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１８）
Ｇ２３２Ｑ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１９）
Ｇ２３２Ｒ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２０）
Ｇ２３２Ｓ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２１）
Ｇ２３２Ｔ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｃｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２２）
Ｇ２３２Ｖ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２３）
Ｇ２３２Ｗ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２４）
Ｇ２３２Ｙ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２５）
【００５８】
（ｂ）２４９位のグリシンの置換
Ｇ２４９Ｃ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２６）
Ｇ２４９Ｄ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２７）
Ｇ２４９Ｅ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２８）
Ｇ２４９Ｆ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｔｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２９）
Ｇ２４９Ｈ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３０）
Ｇ２４９Ｉ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３１）
Ｇ２４９Ｋ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３２）
Ｇ２４９Ｌ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３３）
Ｇ２４９Ｍ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３４）
Ｇ２４９Ｎ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３５）
Ｇ２４９Ｐ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３６）
Ｇ２４９Ｑ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３７）
Ｇ２４９Ｒ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｇｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３８）
Ｇ２４９Ｓ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３９）
Ｇ２４９Ｔ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４０）
Ｇ２４９Ｖ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４１）
Ｇ２４９Ｗ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４２）
Ｇ２４９Ｙ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４３）
【００５９】
（ｃ）２３１位のアルギニンの置換
Ｒ２３１Ｑ：５’−ｃｔｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃａａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃ−３’ （配列番号４４）
【００６０】
（ｄ）２４８位のアルギニンの置換
Ｒ２４８Ｄ：５’−ｇｔｇｃａｔａｔａｔａｃａａｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇ−３’（配列番号４５）
Ｒ２４８Ｇ：５’−ｇｔｇｃａｔａｔａｔａｃａａｇｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇ−３’（配列番号４６）
【００６１】
（ｅ）２７１位のアルギニン、及び、２７２位のアラニンの置換
Ｒ２７１Ｌ Ａ２７２Ｔ：５’−ａｇａａｇｇｃａａａｃｃｔａｔｔａａｃａｃａｇｃａｔｃａｔｃａｔｃ−３’（配列番号４７）
【００６２】
（ｆ）２０８位のアルギニン、及び、２０９位のアルギニンの置換
Ｒ２０８Ｌ Ｒ２０９Ｋ：５’−ｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇａａｇａａｃｃｃｃａｇｃｔａｃｃｃ−３’（配列番号４８）
Ｒ２０８Ｍ Ｒ２０９Ｋ：５’−ｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｃｔａｔｇａａｇａａｃｃｃｃａｇｃｔａｃｃｃ−３’（配列番号４９）
【００６３】
（ｇ）２２９位のアルギニン、及び、２３０位のバリンの置換(２３１位のアルギニンもグルタミン酸に置換)
Ｒ２２９Ｋ Ｖ２３０Ｔ：５’−ｇｃｃｃｃａｃｔｔａｔｔｔａａａａｃｃｃａａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃ−３’（配列番号５０）
【００６４】
得られた増幅転写物を上記実施例１に記載の方法に準じてプラスミドベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入した。得られたプラスミドを実施例２（１）に記載の方法に準じて大腸菌ＢＬ２1（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換してＣＴＬＤを発現させた。その後、実施例２（１）に記載の方法に準じて培養産物を精製して各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体を得た。
【００６５】
実施例４．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体のトロンビン耐性測定
精製して得られたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体２５μｇを、２５μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解し、２Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を加え、２５℃で１８時間反応させた。反応後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加して反応を停止させ、直後に反応産物を定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとして調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。
【００６６】
結果を図１に示す。図中、左から順に、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。また、図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はトロンビン未処理の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、レーン３はトロンビン処理後の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表す。図に示されるとおり、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体は、２Ｕのトロンビンで１８時間処理しても分解されなかった。よって、トロンビンにより分解を受けない(トロンビン耐性が向上した)ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体が作成されたことが確認された。
【００６７】
また、同様にトロンビン量を０Ｕから２Ｕまで変化させて、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）のトロンビンによる分解の様子を測定した結果を図２に示す。図は、各ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表すバンドを示しており、図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。この結果から、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体が比較的少量のトロンビンで分解されるのに対し、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）及びＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）は、０．５Ｕのトロンビン処理ではほとんど分解されず、２Ｕのトロンビン処理でも分解されずに残存することが示された。
【００６８】
本実験の結果から、トロンビン耐性が向上したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体を表１に示す。表１において、一番左のカラムのうち、ＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）はＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を示し、その他は変異体の名前を示す。一番上のＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）の行は野生型におけるアミノ酸の位置及びアミノ酸の種類を示し、その下に各変異体について変異を導入した場所と置換したアミノ酸をそれぞれ示す。表において、丸印はトロンビン耐性が野生型よりも向上したことを示し、三角印はトロンビン耐性が野生型よりもわずかに向上したことを示し、バツ印はトロンビン耐性が野生型と同程度であったことを示す。
【００６９】
実施例５．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能測定
トロンビン耐性の向上が示されたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体が酸化ＬＤＬ結合能を維持しているか否かを確認するために、各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体と酸化ＬＤＬとの結合能を測定した。
（１）酸化ＬＤＬの調製
酸化ＬＤＬを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。ＬＤＬ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）は、酸化する前に予め透析して、ＥＤＴＡを完全に取り除いた。その後、ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳ（−）という）に溶解し、作製した溶液に、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で２０時間インキュベートし、その後、１ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。反応停止後の溶液を、ＰＢＳ（−）（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析した。得られた酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％ ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。酸化の程度は、ＴＢＡＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、過酸化脂質量（約１０ｎｍｏｌ ｏｆ ＭＤＡ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎを目標）を測定することにより行った。
（２）酸化ＬＤＬへの結合活性測定
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社）に、ＬＤＬおよび（１）において調製した酸化ＬＤＬを、最終濃度が０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳで希釈した後、１００μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを洗浄し、５％ＢＳＡ／ＴＢＳにて１時間ブロッキングし、さらにＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍＬに希釈したＣＴＬＤ又はＣＴＬＤ変異体溶液１００μＬを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ社）の１００，０００×希釈溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を５０μＬ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。
【００７０】
結果を図３に示す。本実験で用いた各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能は、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体と比較して、遜色が無いことが示された。同様に、その他のＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能を測定した結果、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体と同様の結合活性を有することが確認された（表１）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、トロンビンに分解されることなく酸化ＬＤＬへの結合能を維持することから、酸化ＬＤＬ結合剤として利用することができる。具体的には、酸化ＬＤＬの除去及び測定に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ存在下でも安定な、酸化低比重リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＬＤＬ」という）結合物質、酸化ＬＤＬの除去剤若しくは除去装置、酸化ＬＤＬの除去若しくは測定する方法、又は、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療薬若しくは予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ＬＤＬは、スカベンジャー受容体のリガンドとして取り込まれ泡沫細胞を形成し、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞を活性化することから血管内皮障害性疾患の原因と考えられている。よって、血中の酸化ＬＤＬを除去することにより、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療又は予防に利用することができることから、酸化ＬＤＬを標的とした治療法の開発が望まれている。例えば、酸化ＬＤＬを除去する方法として、ＬＤＬ中に含まれるａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ中の陽性荷電アミノ酸との静電的結合を利用してデキストラン硫酸をリガンドとする吸着材が実用化されている。また、同様の作用を利用するジアルキルアミノアルキルデキストランを利用する方法が開示されている（特許文献１）。しかし、これらの静電的作用を利用する場合には、酸化ＬＤＬに対する選択性が低いという問題があった。酸化ＬＤＬに対する抗体として、酸化ホスファチジルコリンに対する抗体を利用する方法が知られている。しかし、ＬＤＬは、アポリポタンパク質、リン脂質、コレステロール等の複合体であることから、ＬＤＬが酸化を受けると様々な成分が過酸化され、タンパク質の架橋や開裂等が連続的に起こる。このため、実際には酸化ＬＤＬは単一の物質ではなく多様な物質であり、前記抗体による酸化ＬＤＬの除去が、酸化ＬＤＬ中の酸化ホスファチジルコリンの含有量に依存してしまうという問題があった。
【０００３】
レクチン様酸化ＬＤＬレセプター−１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、以下、「ＬＯＸ−１」という）は、血管内皮細胞の酸化ＬＤＬレセプターとして同定されたタンパク質である（非特許文献１参照）。酸化ＬＤＬによるアテローム性動脈硬化の形成に、ＬＯＸ−１が介在することが報告されている（非特許文献２参照）。ＬＯＸ−１は、酸化ＬＤＬに特異的に結合することから、ＬＯＸ−１を用いて酸化ＬＤＬを測定した例が報告されている（非特許文献３参照）。しかし、ＬＯＸ−１を利用して酸化ＬＤＬを除去する試みはこれまでのところ行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１０２３４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｗａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７３−７７（１９９７）
【非特許文献２】Ｍｅｈｔａ ＪＬら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ １００：１６３４−４２（２００７）
【非特許文献３】Ｓａｔｏら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００：３０３−３０９（２００８）
【発明の概要】
【０００６】
本願発明等は、酸化ＬＤＬの除去に、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインを利用することを考え、鋭意検討した結果、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインが血中に存在するプロテアーゼにより分解されることを見出し、安定性に問題が生じ得ることを見出した。そこで、本願発明者らは、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインが分解を受けるプロテアーゼについて検討したところ、特にトロンビンによる分解を受けやすいことを見出した。更に、本願発明者らは、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインがトロンビンにより分解を受ける部位について検討したところ、ＬＯＸ−１全長配列における、２０８番目と２０９番目、２０９番目と２１０番目、２２９番目と２３０番目、２３１番目と２３２番目、２４８番目と２４９番目、及び、２７１番目と２７２番目のアミノ酸の間がトロンビンにより分解を受けやすいことを見出した。そこで、本発明者らは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインの前記トロンビン分解部位のアミノ酸を置換することにより、プロテアーゼ耐性能、及び、酸化ＬＤＬ結合能の両方を備えるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を得て本願発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインのうち、トロンビンにより分解され得る、２０８番目と２０９番目のアミノ酸（分解部位１）、２０９番目と２１０番目のアミノ酸（分解部位２）、２２９番目と２３０番目のアミノ酸（分解部位３）、２３１番目と２３２番目（分解部位４）、２４８番目と２４９番目（分解部位５）、及び、２７１番目と２７２番目のアミノ酸（分解部位６）におけるアミノ酸（以下、総称して「トロンビン分解部位アミノ酸」という）を置換することにより、トロンビン耐性のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を提供するものである。本明細書において、アミノ酸の位置を示す番号は、特に定義されない限り、配列番号２に示すヒトＬＯＸ−１全長配列におけるアミノ酸の位置により表現されている。本願発明は、具体的には、次の（１）〜（３７）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が置換されているポリペプチド：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
（２） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（３） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（４） 配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（５） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（６） 配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（７） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（８） 配列番号２における２３２番目に該当するグルタミンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（９） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１０） 配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１１） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１２） 配列番号２における２７２番目に該当するアラニンが、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（１３） （２）〜（１２）から選択される２以上の任意の組み合わせからなる、（１）に記載のポリペプチド。
（１４） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１５） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１６） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１７） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１８） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（１９） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２７２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている（１）に記載のポリペプチド。
（２０）配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換され、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換され、配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換され、配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換され、かつ、配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（２１） 配列番号２における２０８番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアミノ酸が、以下の（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択される１以上の置換により置換されている、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号２における２０８番目に該当するアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換；
（ｉｉ）配列番号２における２２９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｉｉｉ）配列番号２における２３１番目に該当するアミノ酸のグルタミンへの置換；
（ｉｖ）配列番号２における２４８番目に該当するアミノ酸のアスパラギン酸又はグリシンへの置換；
（ｖ）配列番号２における２７１番目に該当するアミノ酸のロイシンへの置換。
（２２） 配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸に置換されている、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２３） 配列番号２における２０９番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、以下の（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択される１以上の置換により置換されている、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ｉ）配列番号２における２０９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｉｉ）配列番号２における２３０番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｉｉｉ）配列番号２における２３２番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｉｖ）配列番号２における２４９番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｖ）配列番号２における２７２番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換。
（２４） 配列番号２における２０８番目及び／又は２０９番目に該当するアミノ酸、２２９番目及び／又は２３０番目に該当するアミノ酸、２３１番目及び／又は２３２番目に該当するアミノ酸、２４８番目及び／又は２４９番目に該当するアミノ酸、並びに、２７１番目及び／又は２７２番目に該当するアミノ酸が置換されている、（１）〜（２３）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２５） 野生型ＬＯＸ−１と比較して、トロンビンによる分解量が少ないことを特徴とする、（１）〜（２４）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２６） ＬＯＸ−１結合物質への結合活性を有する、（１）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（２７） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（２６）に記載のポリペプチド。
（２８） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（２９） （２８）記載の核酸を含有するベクター。
（３０） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤。
（３１） 酸化ＬＤＬ除去剤である、（３０）に記載の除去剤。
（３２） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置。
（３３） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（３２）に記載の除去装置。
（３４） 検体中のＬＯＸ−１結合物質の除去方法であって、
血液又は血液成分と（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
（３５） ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、（３４）に記載の除去方法。
（３６） （１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質測定用キット。
（３７） 検体中のＬＯＸ−１結合物質の測定方法であって、
検体を調整する工程；及び、
検体と（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【０００８】
本明細書において、「ＬＯＸ−１」又は「野生型ＬＯＸ−１」とは、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター−１のことである。ＬＯＸ−１は、そのスプライシングアイソフォームが報告されている（国際公開公報ＷＯ２００６／１３７１０１）、従って、本明細書においてＬＯＸ−１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、そのスプライシングアイソフォームを意味する。ＬＯＸ−１のレクチン様ドメインのうち、Ｃ末端に位置する７アミノ酸（ウシＬＯＸ−１の２６１番目から２６７番目、ヒトＬＯＸ−１では２６５番目から２７０番目に相当）がリガンド結合に重要であることが報告されている（Ｃｈｅｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３５５：２８９−２９６（２００１））。本明細書において、「ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン」又は「ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン」とは、ＬＯＸ−１タンパク質又はそのスプライシングアイソフォームのうち、酸化ＬＤＬと結合する領域を備えるペプチドのことであり、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインは、ＬＯＸ−１細胞外ドメイン、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４を含む。ここで、「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、６１番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチドのことである。また、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチドのことである。「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１２９番目から２７３番目のアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドのことである。なお、これらのタンパク質又はポリペプチドと９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるタンパク質又はポリペプチド、これらのタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるタンパク質又はポリペプチド、あるいは、これらのタンパク質又はポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質又はポリペプチドであって、酸化ＬＤＬ結合能を有するポリペプチド又はタンパク質も、ＬＯＸ−１又はＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインに含まれる。
【０００９】
本明細書において、「ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体」又は「ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体」とは、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインである。より具体的には、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合するポリペプチドのことである：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１０】
一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１細胞外ドメイン（以下、「ＬＯＸ−１細胞外ドメイン変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１細胞外ドメイン変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約２１３アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の６１番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１１】
別の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４（以下、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ１４変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約１４５アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１２９番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１２】
また、別の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ（以下、「ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体」という）である。より具体的には、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、ＬＯＸ−１結合物質と結合する約１３１アミノ酸からなるポリペプチドである：
（ａ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｃ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【００１３】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体における６か所のトロンビン分解部位を構成する１１個のアミノ酸のうち置換されるアミノ酸の数は、１〜１１個であってよく、好ましくは、２〜８個である。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインにおける、トロンビン分解部位は、分解部位１（配列番号２における２０８番目と２０９番目のアミノ酸）、分解部位２（配列番号２における２０９番目と２１０番目のアミノ酸）、分解部位３（配列番号２における２２９番目と２３０番目のアミノ酸）、分解部位４（配列番号２における２３１番目と２３２番目のアミノ酸）、分解部位５（配列番号２における２４８番目と２４９番目のアミノ酸）、及び、分解部位６（配列番号２における２７１番目と２７２番目のアミノ酸）である。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、前記分解部位１〜６のうち、少なくとも１か所の分解部位においてアミノ酸が置換されているポリペプチドであり、好ましくは全ての分解部位においてアミノ酸が置換されているポリペプチドである。１か所の分解部位におけるアミノ酸置換は、当該分解部位を構成する２個のアミノ酸の両方が置換されていてもよいし、片方のみが置換されていてもよい。
【００１４】
トロンビンは、一般的に、アルギニンのカルボキシ末端側（以下、「Ｃ末側」という）を切断することが知られている。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアルギニン（Ｒ）を他のアミノ酸に置換することにより行われる。アルギニンを置換するアミノ酸は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質への結合を維持し、かつ、トロンビンによる分解を受けないアミノ酸であれば特に限定されない。例えば、ＬＯＸ−１の結晶構造は報告されており（国際公開公報ＷＯ２００５／０５４４６０）、リガンド結合との結合に重要な部位（ウシでは２６１番目−２６７番目、ヒトでは２６５番目−２７０番目）も知られていることから、リガンド結合機能を維持する立体構造をとるアミノ酸置換をコンピュータによる立体構造予測の手法を用いて選択することができる。配列番号２における２０８番目、２０９番目、２２９番目、２３１番目、２４８番目、及び／又は、２７１番目に該当するアルギニンと置換するアミノ酸は、好ましくは、リシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン酸、又は、グリシンである。より好ましくは、配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンは、ロイシン又はメチオニンと置換される。また、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンは、リシンと置換される。配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンは、グルタミンと置換される。配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンは、アスパラギン酸又はグリシンと置換される。配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンはロイシンと置換される。
【００１５】
また、トロンビンは、一般的に、アルギニンとそのＣ末側に位置する非酸性アミノ酸との間を切断すると考えられている。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、アルギニンのＣ末側に位置する非酸性アミノ酸を、酸性アミノ酸（グルタミン酸又はアスパラギン酸）に置換することにより行われる。また、本願発明者らは、アルギニンのＣ末側のアミノ酸をシステイン、又は、ヒスチジンに置換した場合にもトロンビン分解に耐性を示すことを見出した。よって、一の態様において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体におけるトロンビン分解部位アミノ酸の置換は、配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸を、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換することにより行われる。
【００１６】
配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンは、好ましくは、リシン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、より好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２０８番目のアルギニンが置換されていない場合、２０９番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２０８番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２０９番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１７】
配列番号２における２１０番目に該当するアルギニンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２０９番目のアルギニンが置換されていない場合、２１０番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２０９番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２１０番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１８】
配列番号２における２３０番目に該当するバリンは、好ましくは、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、より好ましくは、スレオニン、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、更に好ましくは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換される。２２９番目のアルギニンが置換されていない場合、２３０番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２２９番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２３０番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１９】
配列番号２における２３２番目に該当するグリシンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、より好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２３１番目のアルギニンが置換されていない場合、２３２番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２３１番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２３２番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２０】
配列番号２における２４９番目に該当するグリシンは、好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、より好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２４８番目のアルギニンが置換されていない場合、２４９番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２４８番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２４９番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２１】
配列番号２における２７２番目に該当するアラニンは、好ましくは、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、より好ましくは、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、更に好ましくは、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される。２７１番目のアルギニンが置換されていない場合、２７２番目のアルギニンはシステイン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。また、２７１番目のアルギニンが他のアミノ酸と置換されている場合、２７２番目のアルギニンは他のアミノ酸と置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２２】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体としては、例えば、配列番号２において、２０８番目がアルギニン(野生体)、ロイシン、メチオニン、又は、リジン；２０９番目がアルギニン(野生体)又はリジン；２１０番目がアスパラギン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２２９番目はアルギニン(野生体)又はリジン；２３０番目がバリン(野生体)、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、又は、フェニルアラニン；２３１番目がアルギニン(野生体)、グルタミン、又は、リジン；２３２番目がグリシン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２４８番目がアルギニン(野生体)、アスパラギン酸、グリシン、又は、リジン；２４９番目がグリシン(野生体)、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸；２７１番目がアルギニン(野生体)、ロイシン、リジン、又は、グルタミン；２７２番目がアラニン(野生体)、スレオニン、セリン、イソロイシンであるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン、但し、全てが野生型のアミノ酸であるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインを除く、を挙げることができる。
【００２３】
本願明細書におけるアミノ酸置換は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質への結合を維持し、かつ、トロンビンによる分解を受けない置換であれば特に限定されない。例えば、ＬＯＸ−１の結晶構造は報告されており（国際公開公報ＷＯ２００５／０５４４６０）、リガンド結合との結合に重要な部位（ウシでは２６１番目−２６７番目、ヒトでは２６５番目−２７０番目）も知られていることから、リガンド結合機能を維持する立体構造をとるアミノ酸置換をコンピュータによる立体構造予測の手法を用いて選択することができる。
【００２４】
本明細書において、「ＬＯＸ−１結合物質」とは、ＬＯＸ−１のリガンドのことである。ＬＯＸ−１結合物質は、例えば、酸化ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、又は、血小板であってよく、好ましくは、酸化ＬＤＬである。
【００２５】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１結合活性を維持する限り、トロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変（即ち、置換、欠失、付加、挿入又は修飾）されていてもよい。具体的には、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインと９０％相同性を有するようにトロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変されていてもよい。又は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を有するようにトロンビン分解部位以外のアミノ酸が改変されていてもよい。あるいは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、トロンビン分解部位以外のアミノ酸が１〜数個改変されていてもよい。トロンビン分解部位以外のアミノ酸が置換される場合、好ましくは保存的置換により置換される。「保存的置換」とは、大きさ、疎水・親水性、酸性・塩基性等の性質に影響せず又は変更させないアミノ酸による置換であって、元のタンパク質又はペプチドの活性を維持する置換を意味する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ １９：１７１−１７５（１９８３））。
【００２６】
本明細書において、「相同性」とは、二つのアミノ酸配列を比較した場合に、同一であるアミノ酸のパーセントのことを意味する。二つのアミノ酸配列において、同一であるアミノ酸のパーセントは、当該二つのアミノ酸を、ギャップを考慮した上で適切なアラインメントを行い、（（同一であるアミノ酸の数）／（全長アミノ酸数）×１００）により求めることができる。相同性の計算は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の既存のプログラムを利用して計算することもできる。
【００２７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、当業者が一般的に使用するハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かは、サザンブロットの様な核酸のハイブリダイゼーションを確認できる手法を用いて確認することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、０．７〜１．０Ｍ ＮａＣｌ存在下、６５℃で行われ、６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液により洗浄後ハイブリダイズを確認することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．等）。
【００２８】
また、上述の通り、ＬＯＸ−１の立体構造及び酸化ＬＤＬ結合に重要なアミノ酸が報告されていることから、改変すべきアミノ酸及びその改変方法は、コンピュータによる立体構造シミュレーションを利用して元のタンパク質又はペプチドの立体構造を維持するアミノ酸として選択してもよい。特に、ウシＬＯＸ−１の２６２番目のリシンと２６３番目のリシン（ヒトＬＯＸ−１では２６６番目のリシンと２６７番目のリシンに相当）の置換が酸化ＬＤＬへの結合活性に影響があることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６６番目のリシンと２６７番目のリシンが改変されていないポリペプチドである。また、ウシＬＯＸ−１の２６１番目〜２６７番目のアミノ酸（ヒトＬＯＸ−１では２６５番目〜２７０番目に相当）が酸化ＬＤＬへの結合に重要であることが報告されていることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６５番目〜２７０番目のアミノ酸が改変されていないポリペプチドである。更に、ウシＬＯＸ−１の２６１番目〜２７０番目のアミノ酸の欠失が、ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬへの結合活性を消失させることが報告されていることから、好ましくは、ヒトＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、２６５番目〜２７３番目のアミノ酸が欠失されていないポリペプチドである。
【００２９】
天然のＬＯＸ−１タンパク質は二量体を形成することが報告されている。従って、本明細書における、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、二量体を形成していてもよい。また、ＬＯＸ−１のスプライシングアイソフォームが報告されている（国際公開公報ＷＯ２００６／１３７１０１）。従って、本明細書におけるＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、当該スプライシングアイソフォームにおける酸化ＬＤＬ結合ドメインが改変されたものであってもよい。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤に関する。本除去剤を使用することにより、ＬＯＸ−１結合物質を除去することができる。本除去剤は、その除去能を高めるため、例えば、抗酸化ホスファチジルコリン抗体、抗アポＢ抗体、酸化ホスファチジルコリン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、酸化ＬＤＬ受容体（米国特許５，５１０，４６６）等の酸化ＬＤＬとの結合性を備える物質を備えていてもよい。また、本除去剤は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体が適宜固相に結合された状態であってもよい。具体的な態様において、本除去剤は、例えば、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体が結合した中空糸である。本発明の除去剤は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）を吸着除去可能なものであれば、その形状・構造、使用方法等が特に限定されるものではなく、例えば、懸濁液等の液状であってもよいし、カラム、貼布、錠剤等の固体であってもよい。
【００３１】
また、別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置に関する。本装置は、ＬＯＸ−１結合物質を除去する限りその用途が限定されるものではないが、好ましくは血液中の酸化ＬＤＬを除去する目的で使用される。本発明の、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去装置は、好ましくは、アフェレーシス治療で使用される酸化ＬＤＬ吸着装置である。例えば、本発明のＬＯＸ−１結合物質除去装置は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する吸着器であってもよいし、血液ポンプ、抗凝固剤注入ポンプ、動脈圧モニタ、血漿分離器、濾過圧モニタ、血漿ポンプ、吸着機入口圧モニタ、吸着器、微粒子除去フィルタ、静脈圧モニタ、気泡検出器を備える吸着装置であってもよい。該酸化ＬＤＬ吸着装置は、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療に用いることができる。
【００３２】
また、別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質除去との結合阻害剤に関する。本阻害剤は、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質との結合を阻害する限りその用途が限定されるものではないが、好ましくは血液中の酸化ＬＤＬとマクロファージや血管内皮細胞等の細胞表面上のＬＯＸ−１との結合を阻害する目的で使用される。本発明の、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有する、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１結合物質除去との結合阻害剤は、好ましくは、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療剤である。
【００３３】
本明細書において、「酸化ＬＤＬに起因する疾患」とは、酸化ＬＤＬにより発症又は増悪する疾患のことであり、例えば、血管内皮障害性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、虚血性疾患、動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症、脳卒中、心不全、心筋梗塞、狭心症、冠動脈狭窄、及び、バージャー病を挙げることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、プロテアーゼによる分解に耐性を示す。従って、本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、安定な酸化ＬＤＬ等のＬＯＸ−１結合物質との結合剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】トロンビン処理したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体及びその変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図中、左から順に、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。また、図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はトロンビン未処理の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、レーン３はトロンビン処理後の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表す。
【図２】トロンビン量を０Ｕから２Ｕまで変化させて、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）量を測定した結果を示す図である。図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。
【図３】ＣＴＬＤ及びトロンビン耐性が向上した変異体の酸化ＬＤＬ結合能を測定した結果を示す。図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｄ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を、ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＱＧ−ＬＴ）、ＱＤ−ＬＴは変異体ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ（ＱＤ−ＬＴ）を示す。
【図４】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【図５】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【図６】ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体作成のために用いたプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載のＬＯＸ−１をコードする遺伝子配列を基に、所望のアミノ酸配列（例えば、１４３番目から２７３番目のアミノ酸配列）を与えるＤＮＡをクローニングし、当該ＤＮＡを鋳型として所望のトロンビン結合部位のアミノ酸置換を与えるＤＮＡを設計後、部位特異的変異処理（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｈｕｔｓｃｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５３：（１８）、６５５１−６５６０（１９７８））、又は、ＰＣＲを介した変異処理（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｓｈｉｍａｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５７：１５７−６５（１９９６））を用いて作製することができる。例えば、変異導入用のキットとして、ジーンテイラー部位特異的変異導入システム（ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、及び、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）が市販されている。よって、アミノ酸の置換は、これらのキットを用いてキット添付のプロトコルに従うことにより行うことができる。
【００３７】
作製されたＤＮＡは、適宜選択された発現ベクターに組み込んだ後、宿主にトランスフェクトされる。発現ベクターは宿主及び選択マーカー等に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主として大腸菌を使用する場合、ｐＥＴ２２ｂを使用することができ、宿主として動物細胞を使用する場合、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶを使用することができる。宿主へのトランスフェクションは、市販のトランスフェクション試薬を用いて当業者周知の方法により行うことができる。その後、必要に応じて、ＩＰＴＧ等の発現促進試薬及び／又は抗生物質等の選択試薬の存在下で宿主を培養することにより、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を発現させることができる。
【００３８】
発現したポリペプチドは、必要に応じてリフォールディングさせることができる。ポリペプチドのリフォールディングは、必要に応じて界面活性剤を含む、変性剤を含有する変性緩衝液にポリペプチドを添加して可溶化した後、透析又は希釈により変性剤を除去することにより行うことができる。可溶化に使用する変性剤としては、例えば、グアニジン塩酸塩又は尿素を使用することができる。変性緩衝液としては、例えば、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）を使用することができる。変性緩衝液に加えるポリペプチドの量は、ポリペプチドの安定性に応じて選択することができ、例えば、２〜７Ｍである。可溶化を行う温度は、例えば、３７〜５０℃とすることができる。ポリペプチドがジスルフィド結合を有する場合、変性剤の他、還元剤を添加することができる。還元剤としては、例えば、β−メルカプトエタノール又はジチオトレイトールを使用することができる。ジスルフィド結合を有するポリペプチドを可溶化させる時間は、存在するジスルフィド結合の数に応じて延ばすことができ、例えば、４本のジスルフィド結合を有する場合には、３７℃で３時間又は室温で１２時間インキュベートすることができる。可溶化したポリペプチドのリフォールディングは、可溶化ポリペプチド溶液を１０〜１００倍に希釈させることにより行うことができる。リフォールディングの温度は、ポリペプチドの性質に応じて適宜選択することができ、例えば、４〜３７℃から選択することができる。また、可溶化において還元剤を使用した場合には、リフォールディングにおいて酸化剤（例えば、酸化型グルタチオン又はシスチン）を加えることができる。可溶化において界面活性剤を使用した場合には、リフォールディングにおいてシクロデキストリン又はシクロアミロースを加えることができる。また、リフォールディングにおいて低分子化合物を添加することもできる（Ｇｏｕｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１５：２７９−９０（２００５））。また、市販のキット、例えば、ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、Ｒｅｆｏｌｄ ＳＫ（Ｎｏｖｅｘｉｎ社）、Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ＣＡ Ｋｉｔ、Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ＧｒｏＥ、ｉＦＯＬＤＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ社）を用いてリフォールディングを行うこともできる。また、ＬＯＸ−１のリフォールディングに関する情報がリフォールディング条件のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｆｏｌｄ．ｍｅｄ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ．ａｕ／）上に登録されており、当該情報を参照してリフォールディングの条件を検討することができる。
【００３９】
一の態様において、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去剤に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去剤を医療用吸着剤として使用する場合、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を単独で使用することもできるし、担体に固定化して使用することもできる。また、本発明の吸着剤において、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、表面に無機化合物又は有機化合物を結合させて使用することもできる。ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体への所望の化合物の結合は、ペプチドへの結合方法として当業者周知の方法を用いることができる。
【００４０】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化して使用する場合、このような、基材又は担体としては、医療用に用いられる基材又は担体であれば特に限定はない。基材又は担体の形状としては、例えば、シート状；ビーズ状；中空糸、糸束等の繊維状；織物状；スポンジ状；又はネット状等を挙げることができる。また、基材又は担体の素材としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、再生セルロース等のセルロース；コラーゲン、キチン、キトサン等の生体由来材料；活性炭及びセラミック等の無機材料；、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル；ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン等のポリビニル；ナイロン（ナイロン６、ナイロン６４、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン４６、ナイロン９、ナイロン１１、又は、ナイロン１２）等のポリアミド；ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のポリアクリル；ポリスルホン；ポリイミド；ポリエーテルスルホン；ポリカーボネート；ポリウレタン；ポリビニルアルコール；ポリテトラフルオロエチレン等のポリハロオレフィン；ポリ尿素；ポリチオ尿素；ポリオキシメチレン；エチレンビニルアルコール共重合、ＡＢＳ樹脂、エチレンビニルアセテート等の共重合体；及び、ポリエステル系ポリマーアロイ等を挙げることができる。
【００４１】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化して使用する場合、固定化の方法はＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材に固定化できる方法であれば特に限定は無く、例えば、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材の表面に被覆してもよく、又は、微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させてもよい。
【００４２】
ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材表面に被覆する場合、基材表面とスペーサーを介して結合させることにより、又は、基材表面に直接結合することにより製造することができる。更に、本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を基材又は担体に固定化する方法として、担体に共有結合による固定化を利用することができる。例えば、固定化担体表面上にアミノ基等の官能基を導入し、グルタルアルデヒド等で当該官能基を活性化して、タンパク質表面のアミノ基等と結合させる方法を用いることができる。タンパク質をその配向性を調節しながら固相への結合する方法が知られていることから、好ましくは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体のＬＯＸ−１結合物質結合部位が血液と接触する表面上に位置するように固定化する。
【００４３】
微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させる場合、予め作製した微小空隙内にＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を添加してもよいし、空隙を作成しながらＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持させてもよい。微小空隙を形成する担体物質としては、好ましくは、直径１ｎｍ〜１００ｎｍの繊維状又は概球状の物質であり、より好ましくは、直径数ｎｍ〜１０ｎｍの繊維状又は慨球形の物質である。担体により形成された空隙の大きさは、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を保持できる大きさであれば特に限定されないが、好ましくは、２ｎｍ〜１０００ｎｍであり、より好ましくは、１０ｎｍ〜１００ｎｍである。
【００４４】
一の態様において、本願発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去装置に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を含有するＬＯＸ−１結合物質除去装置を医療用吸着装置として使用する場合、直接血液吸着法（ＤＨＰ）用の装置又は血漿吸着法用の装置であってよいが、好ましくは血漿吸着法用の装置である。本吸着装置は、上述の吸着材を吸着器に充填することにより製造することができる。更に、本吸着装置は、血液ポンプ、抗凝固剤注入ポンプ、動脈圧モニタ、血漿分離器、濾過圧モニタ、血漿ポンプ、吸着機入口圧モニタ、吸着器、微粒子除去フィルタ、静脈圧モニタ、気泡検出器を適切な回路として組み立てることにより製造することができる。
【００４５】
一の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の除去方法に関する。本発明の除去方法を医療用として用いる場合、本発明の除去方法は、血液から血漿を分離するステップ、及び、分離された血漿をＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体と接触させるステップを備える。本発明の方法は、好ましくは、血液に抗凝固剤を添加するステップ、血液から血漿を分離するステップ、分離された血漿をＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体と接触させるステップ、必要に応じて吸着された生体に必要な成分を血漿に添加するステップ、及び、血漿と分離された成分と血漿とを混合するステップを備える。抗凝固剤としては、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム等のヘパリン；ダルテパリンナトリウム、パルパリンナトリウム、レビパリンナトリウム等の低分子ヘパリン；又は、メシル酸ナファモスタットを使用することができる。
【００４６】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）を測定することを備える、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の検査方法又はＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患の診断方法に関する。即ち、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）の検査方法であって、検体を調整するステップ；検体とＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体とを接触させるステップ；及び、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体へのＬＯＸ−１結合物質の結合を測定するステップを備える方法に関する。また、本発明は、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患の診断方法であって、検体を調整するステップ；検体とＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体とを接触させるステップ；ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体へのＬＯＸ−１結合物質の結合を測定するステップ；及び、結合したＬＯＸ−１結合物質の量が健常人と比較して多い場合に、ＬＯＸ−１結合物質（好ましくは、酸化ＬＤＬ）に起因する疾患である可能性が高いと判定するステップを備える方法に関する。診断は、例えば、その数値等の閾値の設定の仕方により、酸化ＬＤＬに起因する疾患への罹患の有無の診断であってもよいし、将来酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患する可能性を予測するものであってもよい。比較対象となる健常人における酸化ＬＤＬのレベルは、例えば、当業者周知の情報により、又は、酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患したことのない被験者の試料における酸化ＬＤＬのレベルを測定することにより、又は、他の酸化ＬＤＬに起因する疾患の指標による評価と組み合わせることにより知ることができる。本発明の酸化ＬＤＬのレベルを利用して、患者が酸化ＬＤＬに起因する疾患に罹患する可能性を判定することができる。判定は、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４７】
別の態様において、本発明は、ＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を投与することを備える、酸化ＬＤＬに起因する疾患の治療方法に関する。本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体を医薬として用いる場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、貼布剤、点滴、軟膏等を挙げることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）と共に投与されてもよい。また、本発明の治療薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００４８】
本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、血中に投与する。具体的には、血管内（例えば、静脈内、冠動脈内）に投与することができる。また、本発明の化合物は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の化合物の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の化合物の投与方法として、好ましくは、１週間に１〜４回投与であり、より好ましくは、１週間に１回投与である。また、本発明の化合物は、２〜３週間に１回投与とすることもできる。
【００４９】
本発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、虚血性疾患の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量として、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、５〜５００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、１０〜３０μｇ／ｋｇである。
【００５０】
なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本明細書において、「約」の語は、±１０％以内の数値を意味する。数値が整数値を取る必要がある場合、小数点以下の数値は四捨五入される。以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
実施例１．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのクローニング
ヒト肺ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）より、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＬＯＸ−１ＣＴＬＤをクローニングした。具体的には、Ｓａｗａｍｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６（６６２０）、７３−７７（１９９７）に示される配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５４３）（配列番号１）に基づいて、ＣＴＬＤに適合する２種類の特異的プライマー
センスプライマー：５’−ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡ−３’（配列番号６）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号７）
を用いて増幅した。増幅転写物の塩基配列をＤＮＡ配列分析機３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて確認した。さらに、ＣＴＬＤの配列をもつＰＣＲフラグメントの５’側にＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを、３’側にＨｉｓタグをＰＣＲにより付加し、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ切断部位、ＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングして、塩基配列を３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）により確認した（非図示）。
【００５２】
実施例２．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのプロテアーゼ切断部位の検討
（１）ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのプロテアーゼによる切断検討
実施例１において調製したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ２２ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換した。得られた形質転換宿主細胞を、アンピシリン（和光）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように添加したＬＢ培地に播種し、３７℃で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬＯＸ−１ ＣＴＬＤの発現を誘導し、３７℃で２時間培養した後、菌体を集菌し、ＴＢＳにて洗浄した。ほとんどのＣＴＬＤが封入体を形成していたため、不溶性ポリペプチド画分をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて精製した。
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒで精製した封入体を用いて、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ＣＡ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）によりリフォールディングを行い、カートリッジＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ｃｒｕｄｅ（ＧＥ社）に吸着させた後、イミダゾールによる濃度勾配で溶出し、ＣＴＬＤを部分精製した。部分精製したタンパクは、さらに、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ）に吸着させて、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎによる濃度勾配で精製した。
精製して得られたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、大過剰のトロンビン、エンテロキナーゼ、又は、第Ｘａ因子で処理してプロテアーゼ切断を受けるか調べた。２５μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解した２５μｇのＬＯＸ−１ ＣＴＬＤに、２Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）（１Ｕは、１ｇの対象タンパク質を分解する濃度）、１０Ｕのエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、又は、１０Ｕの第Ｘａ因子（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を加え、２５℃で１８時間反応させた。反応後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加して反応を停止させ、直後に反応産物を定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとして調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。その結果、トロンビンにより処理したサンプルではＣＴＬＤの断片化が確認されたが、エンテロキナーゼ、又は、第Ｘａ因子で処理したサンプルではＣＴＬＤの断片化は確認されなかった（非図示）。このことから、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤは、トロンビンにより切断されることが確認された。
【００５３】
（２）ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤのトロンビンによる切断部位検討
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ断片について、常法に従いペプチドマッピングを行ったところ、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤは、Ｒ２０８とＲ２０９の間、Ｒ２０９とＮ２１０の間、Ｒ２２９とＶ２３０の間、Ｒ２３１とＧ２３２の間、Ｒ２４８とＧ２４９の間、及び、Ｒ２７１とＡ２７２の間で切断することが明らかとなった。これらの切断部位のうち、特に、Ｒ２２９、Ｒ２３１及びＲ２４８は、ＬＯＸ−１のリガンド認識に必須なアミノ酸残基として報告されている（Ｏｈｋｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３（６）：９０５−９１７（２００５））。
【００５４】
実施例３．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤへの変異導入
ＣＴＬＤのトロンビン切断部位のアミノ酸置換を行い、トロンビン耐性変異体の作成を行った。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、当該キットに添付のプロトコルに従って、表３０に記載の変異を導入した。
【００５５】
【表１】
【００５６】
作成した変異体の一覧を表１に示す。一番左のカラムのうち、ＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）は野生型のＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを示し、その他は変異体の名前を示す。一番上のＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）の行は野生型におけるアミノ酸の位置及びアミノ酸の種類を示し、その下に各変異体について変異を導入した場所と置換したアミノ酸をそれぞれ示す。トロンビン耐性は変異を導入した場所の耐性の程度を示す。結合活性は、酸化ＬＤＬとの結合程度を示す。(それぞれ後に記載する方法による)
【００５７】
各変異体作成のために用いたプライマーは、以下のとおりである（図４〜６）。尚、以下のプライマーの説明において、例えば、「Ｇ２３２Ａ」は、２３２番目における野生型のＧ（グリシン）をＡ（アラニン）に変換したことを意味するものとする。
（ａ）２３２位のグリシンの置換
Ｇ２３２Ｃ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号８）
Ｇ２３２Ｄ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号９）
Ｇ２３２Ｅ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１０）
Ｇ２３２Ｆ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１１）
Ｇ２３２Ｈ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１２）
Ｇ２３２Ｉ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１３）
Ｇ２３２Ｋ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１４）
Ｇ２３２Ｌ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１５）
Ｇ２３２Ｍ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｔｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１６）
Ｇ２３２Ｎ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１７）
Ｇ２３２Ｐ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｃｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１８）
Ｇ２３２Ｑ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃａｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号１９）
Ｇ２３２Ｒ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２０）
Ｇ２３２Ｓ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２１）
Ｇ２３２Ｔ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａａｃｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２２）
Ｇ２３２Ｖ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｇｔｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２３）
Ｇ２３２Ｗ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２４）
Ｇ２３２Ｙ：５’−ｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃｇａｔａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃａｇａｃ−３’（配列番号２５）
【００５８】
（ｂ）２４９位のグリシンの置換
Ｇ２４９Ｃ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２６）
Ｇ２４９Ｄ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２７）
Ｇ２４９Ｅ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２８）
Ｇ２４９Ｆ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｔｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号２９）
Ｇ２４９Ｈ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３０）
Ｇ２４９Ｉ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３１）
Ｇ２４９Ｋ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３２）
Ｇ２４９Ｌ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３３）
Ｇ２４９Ｍ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３４）
Ｇ２４９Ｎ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３５）
Ｇ２４９Ｐ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３６）
Ｇ２４９Ｑ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃａａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３７）
Ｇ２４９Ｒ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｃｇｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３８）
Ｇ２４９Ｓ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３９）
Ｇ２４９Ｔ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａａｃａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４０）
Ｇ２４９Ｖ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｇｔａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４１）
Ｇ２４９Ｗ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４２）
Ｇ２４９Ｙ：５’−ｃａｔａｔａｔａｃａａｃｇａｔａｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇｇ−３’（配列番号４３）
【００５９】
（ｃ）２３１位のアルギニンの置換
Ｒ２３１Ｑ：５’−ｃｔｔａｔｔｔａｇａｇｔｃｃａａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃｃｃ−３’ （配列番号４４）
【００６０】
（ｄ）２４８位のアルギニンの置換
Ｒ２４８Ｄ：５’−ｇｔｇｃａｔａｔａｔａｃａａｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇ−３’（配列番号４５）
Ｒ２４８Ｇ：５’−ｇｔｇｃａｔａｔａｔａｃａａｇｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｔｔａｔｇｃｇ−３’（配列番号４６）
【００６１】
（ｅ）２７１位のアルギニン、及び、２７２位のアラニンの置換
Ｒ２７１Ｌ Ａ２７２Ｔ：５’−ａｇａａｇｇｃａａａｃｃｔａｔｔａａｃａｃａｇｃａｔｃａｔｃａｔｃ−３’（配列番号４７）
【００６２】
（ｆ）２０８位のアルギニン、及び、２０９位のアルギニンの置換
Ｒ２０８Ｌ Ｒ２０９Ｋ：５’−ｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇａａｇａａｃｃｃｃａｇｃｔａｃｃｃ−３’（配列番号４８）
Ｒ２０８Ｍ Ｒ２０９Ｋ：５’−ｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｃｔａｔｇａａｇａａｃｃｃｃａｇｃｔａｃｃｃ−３’（配列番号４９）
【００６３】
（ｇ）２２９位のアルギニン、及び、２３０位のバリンの置換(２３１位のアルギニンもグルタミン酸に置換)
Ｒ２２９Ｋ Ｖ２３０Ｔ：５’−ｇｃｃｃｃａｃｔｔａｔｔｔａａａａｃｃｃａａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｃ−３’（配列番号５０）
【００６４】
得られた増幅転写物を上記実施例１に記載の方法に準じてプラスミドベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入した。得られたプラスミドを実施例２（１）に記載の方法に準じて大腸菌ＢＬ２1（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換してＣＴＬＤを発現させた。その後、実施例２（１）に記載の方法に準じて培養産物を精製して各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体を得た。
【００６５】
実施例４．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体のトロンビン耐性測定
精製して得られたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体２５μｇを、２５μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解し、２Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を加え、２５℃で１８時間反応させた。反応後、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加して反応を停止させ、直後に反応産物を定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとして調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った。
【００６６】
結果を図１に示す。図中、左から順に、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＭＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｄ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。また、図中、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はトロンビン未処理の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを、レーン３はトロンビン処理後の各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表す。図に示されるとおり、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体は、２Ｕのトロンビンで１８時間処理しても分解されなかった。よって、トロンビンにより分解を受けない(トロンビン耐性が向上した)ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体が作成されたことが確認された。
【００６７】
また、同様にトロンビン量を０Ｕから２Ｕまで変化させて、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）のトロンビンによる分解の様子を測定した結果を図２に示す。図は、各ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤを表すバンドを示しており、図中、ＷＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を、ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）を、Ｅ−ＬＴはＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）を示す。この結果から、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体が比較的少量のトロンビンで分解されるのに対し、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（ＬＫ−ＫＴ−ＱＧ−ＬＴ）及びＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体（Ｅ−ＬＴ）は、０．５Ｕのトロンビン処理ではほとんど分解されず、２Ｕのトロンビン処理でも分解されずに残存することが示された。
【００６８】
本実験の結果から、トロンビン耐性が向上したＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体を表１に示す。表１において、一番左のカラムのうち、ＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）はＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体を示し、その他は変異体の名前を示す。一番上のＣＴＬＤ（Ｗｉｌｄ）の行は野生型におけるアミノ酸の位置及びアミノ酸の種類を示し、その下に各変異体について変異を導入した場所と置換したアミノ酸をそれぞれ示す。表において、丸印はトロンビン耐性が野生型よりも向上したことを示し、三角印はトロンビン耐性が野生型よりもわずかに向上したことを示し、バツ印はトロンビン耐性が野生型と同程度であったことを示す。
【００６９】
実施例５．ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能測定
トロンビン耐性の向上が示されたＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体が酸化ＬＤＬ結合能を維持しているか否かを確認するために、各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体と酸化ＬＤＬとの結合能を測定した。
（１）酸化ＬＤＬの調製
酸化ＬＤＬを、以下のように調製した。調製に際して、可能なものはすべて滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。ＬＤＬ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）は、酸化する前に予め透析して、ＥＤＴＡを完全に取り除いた。その後、ＥＤＴＡ非含有ＬＤＬを、濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡ非含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳ（−）という）に溶解し、作製した溶液に、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いで、この溶液を、３７℃で２０時間インキュベートし、その後、１ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して、酸化を停止した。反応停止後の溶液を、ＰＢＳ（−）（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析した。得られた酸化ＬＤＬ含有溶液を濾過滅菌し、その濾液に０．０２％ ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、使用時まで４℃で保存した。酸化の程度は、ＴＢＡＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、過酸化脂質量（約１０ｎｍｏｌ ｏｆ ＭＤＡ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎを目標）を測定することにより行った。
（２）酸化ＬＤＬへの結合活性測定
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社）に、ＬＤＬおよび（１）において調製した酸化ＬＤＬを、最終濃度が０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳで希釈した後、１００μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを洗浄し、５％ＢＳＡ／ＴＢＳにて１時間ブロッキングし、さらにＴＢＳで洗浄した後、５μｇ／ｍＬに希釈したＣＴＬＤ又はＣＴＬＤ変異体溶液１００μＬを添加し、２時間室温で放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ社）の１００，０００×希釈溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、さらに室温で１時間放置した。ＴＢＳにて十分に洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を５０μＬ／ウェルで添加し、発色を確認後に反応停止液として２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで加え、Ａ４５０における吸光度を測定した。
【００７０】
結果を図３に示す。本実験で用いた各種ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能は、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体と比較して、遜色が無いことが示された。同様に、その他のＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ変異体の酸化ＬＤＬ結合能を測定した結果、ＬＯＸ−１ ＣＴＬＤ野生体と同様の結合活性を有することが確認された（表１）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本願発明のＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン変異体は、トロンビンに分解されることなく酸化ＬＤＬへの結合能を維持することから、酸化ＬＤＬ結合剤として利用することができる。具体的には、酸化ＬＤＬの除去及び測定に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が置換されているポリペプチド：
（ｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【請求項２】
以下の、（ａ）〜（ｋ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンの、ロイシン、リシン又はメチオニンへの置換；
（ｂ） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンの、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｃ） 配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｄ） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンの、リシンへの置換；
（ｅ） 配列番号２における２３０番目に該当するバリンの、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｆ） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンの、グルタミン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（ｇ） 配列番号２における２３２番目に該当するグルタミンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｈ） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンの、アスパラギン酸、グリシン又はリシンへの置換；
（ｉ） 配列番号２における２４９番目に該当するグリシンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｊ） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンの、ロイシン、リシン又はグルタミンへの置換；及び、
（ｋ） 配列番号２における２７２番目に該当するアラニンの、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換
を備える、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の、（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｂ） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｃ） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｄ） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｅ） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；並びに、
（ｆ） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２７２番目に該当するアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている、
を備える、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換され、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換され、配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換され、配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換され、かつ、配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の、（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０８番目に該当するアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換；
（ｂ）配列番号２における２２９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｃ）配列番号２における２３１番目に該当するアミノ酸のグルタミンへの置換；
（ｄ）配列番号２における２４８番目に該当するアミノ酸のアスパラギン酸又はグリシンへの置換；並びに、
（ｅ）配列番号２における２７１番目に該当するアミノ酸のロイシンへの置換
を備える、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸に置換されている、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
以下の、（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｂ）配列番号２における２３０番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｃ）配列番号２における２３２番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｄ）配列番号２における２４９番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；並びに、
（ｅ）配列番号２における２７２番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換
を備える、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２における２０８番目及び／又は２０９番目に該当するアミノ酸、２２９番目及び／又は２３０番目に該当するアミノ酸、２３１番目及び／又は２３２番目に該当するアミノ酸、２４８番目及び／又は２４９番目に該当するアミノ酸、並びに、２７１番目及び／又は２７２番目に該当するアミノ酸が置換されている、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
野生型ＬＯＸ−１と比較して、トロンビンによる分解量が少ないことを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＬＯＸ−１結合物質への結合活性を有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤。
【請求項１４】
酸化ＬＤＬ除去剤である、請求項１３に記載の除去剤。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物除去装置。
【請求項１６】
ＬＯＸ−１結合物が酸化ＬＤＬである、請求項１５に記載の除去装置。
【請求項１７】
検体中のＬＯＸ−１結合物質の除去方法であって、
血液又は血液成分と請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【請求項１８】
ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、請求項１７に記載の除去方法。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質測定用キット。
【請求項２０】
検体中のＬＯＸ−１結合物質の測定方法であって、
検体を調整する工程；及び、
検体と請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドであって、かつ、配列番号２における２０８番目、２０９番目、２１０番目、２２９番目、２３０番目、２３１番目、２３２番目、２４８番目、２４９番目、２７１番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が置換されているポリペプチド：
（ｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を備えるポリペプチド；あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２の１４３番目から２７３番目からなるアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたポリペプチド。
【請求項２】
以下の、（ａ）〜（ｋ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンの、ロイシン、リシン又はメチオニンへの置換；
（ｂ） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンの、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｃ） 配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｄ） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンの、リシンへの置換；
（ｅ） 配列番号２における２３０番目に該当するバリンの、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｆ） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンの、グルタミン又はリシンに置換されている、（１）に記載のポリペプチド。
（ｇ） 配列番号２における２３２番目に該当するグルタミンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｈ） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンの、アスパラギン酸、グリシン又はリシンへの置換；
（ｉ） 配列番号２における２４９番目に該当するグリシンの、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換；
（ｊ） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンの、ロイシン、リシン又はグルタミンへの置換；及び、
（ｋ） 配列番号２における２７２番目に該当するアラニンの、スレオニン、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンへの置換
を備える、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の、（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ） 配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｂ） 配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２１０番目に該当するアスパラギンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｃ） 配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３０番目に該当するバリンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｄ） 配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２３２番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；
（ｅ） 配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２４９番目に該当するグリシンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている；並びに、
（ｆ） 配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが置換されておらず、かつ、配列番号２における２７２番目に該当するアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンに置換されている、
を備える、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２における２０８番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はメチオニンに置換され、配列番号２における２０９番目に該当するアルギニンが、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン又はヒスチジンに置換され、配列番号２における２２９番目に該当するアルギニンが、リシンに置換され、配列番号２における２３１番目に該当するアルギニンが、グルタミン又はリシンに置換され、配列番号２における２４８番目に該当するアルギニンが、アスパラギン酸、グリシン又はリシンに置換され、かつ、配列番号２における２７１番目に該当するアルギニンが、ロイシン、リシン又はグルタミンに置換されている、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の、（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０８番目に該当するアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換；
（ｂ）配列番号２における２２９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｃ）配列番号２における２３１番目に該当するアミノ酸のグルタミンへの置換；
（ｄ）配列番号２における２４８番目に該当するアミノ酸のアスパラギン酸又はグリシンへの置換；並びに、
（ｅ）配列番号２における２７１番目に該当するアミノ酸のロイシンへの置換
を備える、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２における２０９番目、２１０番目、２３０番目、２３２番目、２４９番目、及び／又は、２７２番目に該当するアミノ酸が、リシン、スレオニン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸に置換されている、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
以下の、（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸置換：
（ａ）配列番号２における２０９番目に該当するアミノ酸のリシンへの置換；
（ｂ）配列番号２における２３０番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換；
（ｃ）配列番号２における２３２番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；
（ｄ）配列番号２における２４９番目に該当するアミノ酸のシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸への置換；並びに、
（ｅ）配列番号２における２７２番目に該当するアミノ酸のスレオニンへの置換
を備える、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２における２０８番目及び／又は２０９番目に該当するアミノ酸、２２９番目及び／又は２３０番目に該当するアミノ酸、２３１番目及び／又は２３２番目に該当するアミノ酸、２４８番目及び／又は２４９番目に該当するアミノ酸、並びに、２７１番目及び／又は２７２番目に該当するアミノ酸が置換されている、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
野生型ＬＯＸ−１と比較して、トロンビンによる分解量が少ないことを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＬＯＸ−１結合物質への結合活性を有する、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質除去剤。
【請求項１４】
酸化ＬＤＬ除去剤である、請求項１３に記載の除去剤。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物除去装置。
【請求項１６】
ＬＯＸ−１結合物が酸化ＬＤＬである、請求項１５に記載の除去装置。
【請求項１７】
検体中のＬＯＸ−１結合物質の除去方法であって、
血液又は血液成分と請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【請求項１８】
ＬＯＸ−１結合物質が酸化ＬＤＬである、請求項１７に記載の除去方法。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、ＬＯＸ−１結合物質測定用キット。
【請求項２０】
検体中のＬＯＸ−１結合物質の測定方法であって、
検体を調整する工程；及び、
検体と請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させるステップを備える方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２２７０５７（Ｐ２０１０−２２７０５７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８０６１３（Ｐ２００９−８０６１３）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（５０８３１１３９６）株式会社ファルミット (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（５０８３１１３９６）株式会社ファルミット (5)
【Ｆターム（参考）】
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