プロテアーゼ阻害剤
本発明は、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤である。
【背景技術】
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシステインプロテアーゼ（チオールプロテアーゼ）と総称されている。カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫは、カルシウム依存性中性プロテアーゼ（ＣＡＭＰ）、パパイン、フィシン、プロメライン等とともに代表的なシステインプロテアーゼの一つである。そしてこれらシステインプロテアーゼに対して阻害作用を有する物質は、システインプロテアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬等として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテプシンＬ、カテプシンＢと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、それによって、とりわけカテプシンＬ阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある（勝沼信彦著、「ＢＩＯ ｍｅｄｉａ」、第７巻、第６号、第７３〜７７ページ、１９９２年）。骨組織においては、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊（骨吸収）を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に２つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミンＤ誘導体、女性ホルモン（エストロゲン）等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシステインプロテアーゼ群、中でも特にカテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテプシンＬ及びＢは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによって古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテプシンＬ、カテプシンＢ及びカテプシンＫのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、タンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミンＤ、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテプシンＬ阻害、カテプシンＢ阻害、又はカテプシンＫ阻害のいわゆるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている（特開平７−１７９４９６号公報、特表２００２−５０１５０２号公報）が、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。
一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は１０日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシウムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピードが腎臓の処理能力を上回ったとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、このような目的に使用し得るシステインプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下のものが開示されている。
（１）カテプシンＬ特異的阻害ポリペプチド（特開平７−１７９４９６号公報）
（２）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平９−２２１４２５号公報）
（３）バリン誘導体およびその用途（特開２００１−１３９５３４号公報）
（４）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平７−２４２６００号公報）
（５）ＦＡ−７０Ｃ１物質（特開２０００−７２７９７号公報）
（６）ＦＡ−７０Ｄ物質、その製造法及びその用途（国際公開第９７／３１１２２号パンフレット）
しかしながら、さらに、抗原性のない、安全な素材として使えるシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
他方、これまでに、母乳中にプロテアーゼ阻害物質が存在することが知られている。母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチトリプシンが挙げられ、インターα２−トリプシン阻害物質、α２−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含まれている（清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第８０〜８１ページ）。
乳中において、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質については、すでに以下のものが開示されている。
（１）牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約５７ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−２８９６号公報）
（２）牛初乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−１２６２９４号公報）
（３）人乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規タンパク質およびその製造方法（特開平１０−８０２８１号公報）
（４）牛乳から調製された牛乳由来塩基性シスタチン及び／又は牛乳由来塩基性シスタチン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開２０００−２８１５８７号公報）
（５）乳塩基性蛋白質（ＭＢＰ）中に含まれるシスタチンＣ、及びインビトロにおける該シスタチンＣによる骨吸収阻害効果（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー［Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、日本、第６６巻、第１２号、２００２年、ｐ２５３１−２５３６）
ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフェリン及びβ−カゼインなどが挙げられる。ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ：以下Ｌｆと略すことがある）は、主に母乳中に含まれているおよそ分子量８０ｋＤａの鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている（ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）、第９４巻、第１ページ、１９７９年、およびジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６７巻、第６０ページ、１９８４年）。また、様々な作用をもつ乳タンパク質として、疾病の治療剤に幅広く利用されている。ラクトフェリンは乳由来のタンパク質であるから安全性が高く、長期連用することが可能で、それ自体は殆ど無味無臭であり、各種の食品・医薬品・飼料の添加物として、汎用性が高いタンパク質である。
なお、疾病の治療剤にラクトフェリンを応用した例としては、
（１）抗腫瘍剤（特公平５−８６９３２号公報）
（２）抗リウマチ剤（特開平５−１８６３６８号公報）
（３）ＩｇＡ産生促進剤（特開平６−３２７４３号公報）
（４）便秘を改善する育児用調製粉乳（特開平６−２０５６４０号公報）
（５）血管新生病治療剤（特開平９−１９４３８８号公報）
（６）経口がん転移抑制剤（特開平１０−５９８６４号公報）
（７）ＩｇＥ産生抑制剤（特開２００１−１５８７４８号公報）
等が開示されている。
また、Ｌｆの分解物については、
（８）抗菌性およびチロシナーゼ活性阻害（ヨーロッパ特許公報第４３８７５０号）
（９）細胞への病原菌付着防止（特開平３−２２０１３０号公報）
（１０）抗ウィルス作用（特開平１−２３３２２６号公報）
等が開示されている。
また、鉄−ラクトフェリンを有効成分とする骨強化剤が、骨疾患の予防及び治療に有効であることが開示されている（特開２０００−２８１５８６号公報）。この技術は、鉄とラクトフェリンが結合した鉄−ラクトフェリンを有効成分として投与し、骨の基質であるコラーゲンの前駆体であるプロリン及びリジンの水酸化に関与する酵素の補酵素である鉄を供給し、コラーゲン生成を強化するというものである。
上記のように、これまでにシステインプロテアーゼ阻害物質が見いだされており、動物細胞、血液中、尿中及び乳中などにおいてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害物質が見いだされている。システインプロテアーゼ阻害物質のうち蛋白性のものはシスタチンと総称されている。シスタチンファミリーは、共通する活性部位を有することが知られており、その配列が明らかとなっている（早石修著、「プロテアーゼとそのインヒビター」、メジカルビュー社、第１版、第１刷、第１０４〜１１５ページ、１９９３年）。
しかしながら、ラクトフェリン及びその部分ペプチド、並びにトランスフェリンがシステインプロテアーゼ阻害作用を有することは知られておらず、また、ラクトフェリン及びトランスフェリンが、シスタチンファミリーの共通活性部位配列と相同性を有する領域を有することについても知られていなかった。さらに、ラクトフェリン及びその部分ペプチド、並びにトランスフェリンによるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨疾患の予防・治療剤についても知られていなかった。
【発明の開示】
本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
本発明者は、抗原性のない、安全な素材として利用する事が可能なシステインプロテアーゼ阻害物質を鋭意検索した結果、乳由来のタンパク質であるラクトフェリン及びラクトフェリン由来のペプチドフラグメント、並びにトランスフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下の（１）〜（１２）のとおりである。
（１）ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（２）ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である前記（１）に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（３）ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である前記（１）又は（２）に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（４）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（５）システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
（８） ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（９） ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である、前記（８）に記載の使用。
（１０） ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である前記（８）又は（９）に記載の使用。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（１１） システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の使用。
（１２） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である前記（１１）に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ乳タンパク質の逆ザイモグラフィーの検出を示す図（写真）である。
図２は、システインプロテアーゼに対するヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図３は、実施例１で製造したヒトラクトフェリンの部分ペプチド（ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５）、及びウシラクトフェリンの部分ペプチド（ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２）、並びに配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するペプチド（ヒトトランスフェリンペプチドＹ６６６−Ｒ６８２）、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するペプチド（ウシトランスフェリンペプチドＹ６７２−Ｒ６８８）のアミノ酸配列を示す図である。
図４は、システインプロテアーゼに対するヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図５は、システインプロテアーゼに対するトランスフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明は、ラクトフェリン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２７８８に記載のアミノ酸配列を有するヒト・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ２４６２７に記載のアミノ酸配列を有するウシ・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｑ２９４７７に記載のアミノ酸配列を有するヤギ・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｏ７７８１１に記載のアミノ酸配列を有するウマ・ラクトフェリン）、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２７８７に記載のアミノ酸配列を有するヒト・トランスフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｑ２９４４３に記載のアミノ酸配列を有するウシ・トランスフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ２７４２５に記載のアミノ酸配列を有するウマ・トランスフェリン）からなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤である。
本発明に使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の常法により、前記原料から分離して得られるラクトフェリンを用いることができる。中でも、工業的規模で製造されている市販のラクトフェリン（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の効果において、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本発明では、ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることができる。
本発明に使用するラクトフェリンの部分ペプチドの製造方法としては、前記ラクトフェリンを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解することによって製造する方法、遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、及び化学合成によって合成ペプチドを製造する方法などが例示される。尚、加水分解によって製造する方法を用いた場合、本発明のラクトフェリンの部分ペプチドは加水分解物中に混合物として含まれた形態で用いても良く、また常法に従ってＨＰＬＣ等により精製した形態で用いても良い。
本発明に使用するラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトラクトフェリン、または配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを例示することができる。また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するウシラクトフェリン、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド等を例示することができる。なお、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１９はシグナル配列である。
これらのラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドは、システインプロテアーゼ阻害活性を有するため、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤に使用することが可能である。
また、後述するように完全長ラクトフェリンがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列表の配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、配列表の配列番号２のアミノ酸番号６７６〜６９２を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらタンパク質及びペプチドは、例えば、本発明によりそのシステインプロテアーゼ阻害活性領域が明らかとなったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常の遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるラクトフェリン及びラクトフェリンの部分ペプチドには、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
ここで、本発明に用いることができるラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドが例示される。尚、「１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位」として可能なものは、少なくとも前記アミノ酸番号のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドとシステインプロテアーゼとの間の立体的な相互作用に影響を及ぼさず、システインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に設定できるものである。例えば、複数とは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは２から３個、より好ましくは２個である。
アミノ酸配列における置換は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６８６〜６９０のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６８３〜６８７のアミノ酸においては、アミノ酸の種類を変更しない範囲での置換が望ましい。すなわち、前記配列におけるアミノ酸と、同アミノ酸を置換するアミノ酸は構造上の分類で類似種類のアミノ酸であることが望ましい。具体的には前記配列のアミノ酸が酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸アミドである場合はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンのうちのいずれかとの置換、塩基性アミノ酸である場合はリジン、ヒスチジン、又はアルギニンのうちのいずれかとの置換、芳香族アミノ酸である場合はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのうちのいずれかとの置換、脂肪族アミノ酸又はオキシアミノ酸である場合は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン又はスレオニンのうちのいずれかとの置換、及び前記以外のアミノ酸（システイン、メチオニン、プロリン等）の場合はシステインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に置換することが望ましい。また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、又は、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において、１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合、複数個とはアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは２から５個、より好ましくは２から３個である。
さらに、本発明に用いることができるラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
上記のようなラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列は、従来知られている変異処理によっても取得されうる。
上記のような変異を有する塩基配列を適当な細胞で発現させ、本発明の試験例又は実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、ラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明においては、トランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドを使用することもできる。本発明に使用するトランスフェリンは、一般に市販されているトランスフェリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。）の乳又は血液等を原料とし、例えばカラムクロマトグラフィー法等により分離して得られるトランスフェリンを使用することができる。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したトランスフェリンを使用することも可能である。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の効果において、トランスフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本発明では、トランスフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型トランスフェリン；該アポ型トランスフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和トランスフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和トランスフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることができる。
本発明においてはトランスフェリンの部分ペプチドも使用しうる。前記ラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と推定されるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５、及び、配列番号２のアミノ酸番号６７６〜６９２）と、トランスフェリンのアミノ酸配列を比較したところ、配列番号３に示すヒトトランスフェリンのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２の領域（ヒトトランスフェリンペプチドＹ６６６−Ｒ６８２）、及び配列番号４に示すウシトランスフェリンのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８の領域（ウシトランスフェリンペプチドＹ６７２−Ｒ６８８）に、ラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と高い相同性が認められた（図３参照）。このことと、後記実施例に示すようにトランスフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性が認められたことから、上記のそれぞれの領域を含むヒトトランスフェリン及びウシトランスフェリンの部分ペプチドも、同様にシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが強く示唆される。
本発明に使用するトランスフェリンの部分ペプチドの製造方法としては、前記トランスフェリンを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解することによって製造する方法、遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、及び化学合成によって合成ペプチドを製造する方法などが例示される。尚、加水分解によって製造する方法を用いた場合、本発明のトランスフェリンの部分ペプチドは加水分解物中に混合物として含まれた形態で用いても良く、また常法に従ってＨＰＬＣ等により精製した形態で用いても良い。
本発明に使用するトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒトトランスフェリン、またはヒトトランスフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを挙げることができる。また、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するウシトランスフェリン、または、ウシトランスフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド等を例示することができる。なお、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１９のアミノ酸配列はシグナル配列である。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列からなるペプチドは、本発明によって明らかとなったシステインプロテアーゼ阻害活性領域であるヒトラクトフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列、及びウシラクトフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列との相同性から、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。また、完全長トランスフェリンがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列表の配列番号４のアミノ酸番号６７２〜６８８を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらタンパク質及びペプチドは、例えば、本発明によりそのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と推定される領域が明らかとなったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常の遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるトランスフェリン及びトランスフェリンの部分ペプチドには、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
ここで、本発明に用いることができるトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドとしては、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドが例示される。尚、「１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位」として可能なものは、少なくとも前記アミノ酸番号のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドとシステインプロテアーゼとの間の立体的な相互作用に影響を及ぼさず、システインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に設定できるものである。例えば、複数とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸、及び配列表の配列番号４に記載のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは２から３個、より好ましくは２個である。
アミノ酸配列における置換は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７３〜６７７のアミノ酸、及び、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６８３のアミノ酸においては、アミノ酸の種類を変更しない範囲での置換が望ましい。すなわち、前記配列におけるアミノ酸と、同アミノ酸を置換するアミノ酸は構造上の分類で類似種類のアミノ酸であることが望ましい。具体的には前記配列のアミノ酸が酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸アミドである場合はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンのうちのいずれかとの置換、塩基性アミノ酸である場合はリジン、ヒスチジン、又はアルギニンのうちのいずれかとの置換、芳香族アミノ酸である場合はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのうちのいずれかとの置換、脂肪族アミノ酸又はオキシアミノ酸である場合は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン又はスレオニンのうちのいずれかとの置換、及び前記以外のアミノ酸（システイン、メチオニン、プロリン等）の場合はシステインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に置換することが望ましい。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、及び配列表の配列番号４に記載のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において、１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合、複数個とはアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは２から５個、より好ましくは２から３個である。
さらに、本発明に用いることができるトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
上記のようなトランスフェリンタンパク質又はトランスフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列は、従来知られている変異処理によっても取得されうる。
上記のような変異を有する塩基配列を適当な細胞で発現させ、本発明の試験例又は実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、トランスフェリンタンパク質又はトランスフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤においては、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンもしくはトランスフェリンの部分ペプチドをそれぞれ単独で使用することも、複数種を併用して使用することも可能である。また、ラクトフェリンの部分ペプチドは、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。さらに、トランスフェリンの部分ペプチドは、１種を単独で使用することも複数種を混合して用いることも可能である。
本発明に用いることができるラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンは、カテプシンＢ、Ｌ、Ｓ及びパパイン等のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する。システインプロテアーゼ阻害活性は、Ｂａｒｒｅｔｔ等の方法に従って測定することができる。本発明の試験例又は実施例において、該測定方法について詳細に記載する。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤はラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを使用し、これらの一又は複数種を公知の製剤学的に許容される製剤担体と組合わせることにより、製造することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
本発明の製剤中に含まれるラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンの量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％とするのがよい。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与することにより、システインプロテアーゼが関与する疾患を治療することができる。ここで、患者とは、ヒトであってもよいが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。
本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンの量は、０．１〜１２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防・治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌（スタフィロコッカス・アウレウスＶ８等）やウイルス（ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、エイズウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤は、本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、本発明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化し使用時に組み合わせても良い。
本発明の飲食品組成物は、食品又は飲料の原料にラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加して製造することができ、経口的に摂取することが可能である。前記原料は、通常の飲料や食品に用いられているものを使用することができる。本発明の飲食品組成物は、システインプロテアーゼ阻害剤を添加する以外は、通常の飲食品組成物と同様にして調製することができる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類：加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。
本発明の飲食品組成物において、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％となるように添加すればよい。
本発明の飼料組成物は、飼料にラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。飼料組成物の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示され、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、酵母類等とともに混合して本発明の飼料組成物を製造することができる。
本発明の飼料組成物において、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％となるように添加すればよい。
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここに、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
次に試験例を示して本発明を具体的に説明する。
［試験例１］
本試験は、乳中のシステインプロテアーゼ阻害物質を検出するために行った。
（１）検出法
本発明者はプロテアーゼ阻害物質の検出法として「逆ザイモグラフィー」という手法を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロテアーゼ阻害物質の検出を行った。逆ザイモグラフィーとは通常のザイモグラフィーの逆の手法によるものであり、基本的原理は次のとおりである。即ち、ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにプロテアーゼ阻害物質を含むサンプルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲル中のタンパク質を分解する。この操作により阻害物質が存在する部分はプロテアーゼの活性を阻害することから、ゼラチンはプロテアーゼによる分解を免れ、これが染色液によって染色されることにより、阻害物質を識別することが可能となる。
（２）試験方法
本発明における逆ザイモグラフィーの方法は以下のとおりである。
牛乳中の全タンパク質及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）をサンプルとし、０．１％ゼラチンを含む１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）を行った。泳動後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に４５分間浸漬して洗浄した後、更に４５分間蒸留水に浸漬する操作を３回繰り返してゲルを洗浄した。このゲルを、１ｍｇパパイン（３１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに浸漬し、３７℃で１０時間保温してゼラチンを消化した。ゲルを蒸留水で洗浄後、染色液（０．０２５％クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）Ｒ−２５０、４０％メタノール、７％酢酸水溶液）で１時間染色し、その後脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸水溶液）で脱色を行った。
これとは別に、対照試験としてゼラチンを含まない１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて前記と同様に逆ザイモグラフィーを行った。さらに、通常の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
（３）試験結果
本試験の結果は図１に示すとおりである。図１は逆ザイモグラフィーのパターンを示す結果である。図１の１レーンは牛乳中の全タンパク質の通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン、２レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザイモグラフィーのパターン、３レーンは牛乳中の全タンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターン、４レーンはウシラクトフェリンの逆ザイモグラフィーのパターン、５レーンはウシラクトフェリンのゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターンを各々示している。尚、図中矢印はウシ由来ラクトフェリン（分子量７８ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動位置を示している。尚、６レーン及び７レーンは本試験例とは直接関係がない。
図１から明らかなとおり、２レーンにおいてウシラクトフェリンの泳動位置（７８ｋＤａ）とほぼ同位置に逆ザイモグラフィーのポジティブなバンドが確認された。このことより、牛乳中にシステインプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存在が確認された。また、４レーンにおいてウシラクトフェリンを泳動したパパインを用いた逆ザイモグラフィーにおいて、ポジティブなバンドが確認された。
以上の結果から、ウシ由来のラクトフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが示唆された。
［試験例２］
本試験は、試験例１においてシステインプロテアーゼ阻害活性が示唆された７８ｋＤａのバンドについてＮ末端アミノ酸配列を決定するために行った。
（１）試験方法
試験例１で使用した牛乳中の全タンパク質サンプルを同様に使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＣＢＢで染色後、７８ｋＤａ付近に泳動された染色バンドを切り出した。このバンドについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
牛乳中の７８ｋＤａ染色バンドのアミノ酸配列を決定した結果、７８ｋＤａ染色バンドのＮ末端アミノ酸配列は配列表の配列番号２に記載されるウシラクトフェリンのそれと完全に一致した。従って、本試験の結果と試験例１の結果の両者から、ウシラクトフェリンはシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例３］
本試験は、ウシラクトフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のウシラクトフェリン（森永乳業社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対してシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。阻害活性の測定方法はＢａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］を参考にして、次のとおり行った。即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に種々の濃度に溶解したサンプルに、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ，最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験では各サンプルにつき、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳより選ばれる１種：和光純薬工業社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対するウシラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ウシラクトフェリンの濃度が１０−６Ｍに達したときに完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＳのシステインプロテアーゼ活性は、ウシラクトフェリンの濃度が１０−５Ｍに達したときに７０％以上阻害され、１０−４Ｍの濃度で完全に阻害された。従って、ウシラクトフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
【表１】
［試験例４］
本試験は、ヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のヒトラクトフェリン（シグマ社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図２に示すとおりである。図２は、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対するヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ヒトラクトフェリンの濃度が１０−６Ｍに達したときにほぼ完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＳのシステインプロテアーゼ活性は、ヒトラクトフェリンの濃度が１０−５Ｍに達したときに８０％以上阻害され、１０−４Ｍの濃度でほぼ完全に阻害された。従って、ヒトラクトフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
［試験例５］
本試験は、ラクトフェリンの部分ペプチドのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として、後記する実施例１で製造した、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するペプチド〔以下、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５（図３を参照）と記載する。〕を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図４に示すとおりである。図４は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ペプチドの濃度が１０−４Ｍに達したときに５０％以上阻害され、１０−３Ｍの濃度でほぼ完全に阻害された。また、カテプシンＢのシステインプロテアーゼ活性は、ペプチドの濃度が１０−３Ｍに達したときに６０％阻害された。従って、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。また、後記する実施例１で製造した、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するペプチド〔以下、ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２（図３を参照）と記載する。〕について同様の阻害活性測定試験を行ったところ、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５とほぼ同等の活性を示すことが明らかとなった。
［試験例６］
本試験は、トランスフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のウシトランスフェリン（日本製薬社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図５に示すとおりである。図５は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するトランスフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパインのシステインプロテアーゼ活性は、トランスフェリンの濃度が１０−４Ｍに達したときに４０％阻害され、１０−３Ｍの濃度で完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、トランスフェリンの濃度が１０−４Ｍに達したときに３０％以上阻害された。従って、ウシトランスフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するペプチド（図３を参照：ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５）を、以下の方法により製造した。
尚、前記本発明のペプチドは、自動アミノ酸合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａ）を用いて合成を行い製造を行った。
２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン（アプライド・バイオシステムズ社製。以下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する）により、ペプチド合成用固相樹脂であるＨＭＰ樹脂（アプライド・バイオシステムズ社製）のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭＰで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−スレオニン［具体的には、合成するペプチドのＣ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸（アプライド・バイオシステムズ社製）］をＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）リージェントキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。次に、前記Ｆｍｏｃ基の切断、続いて、Ｃ末端から２番目のアミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アラニンの縮合、及び洗浄を行い、さらにＦｍｏｃ−アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、保護ペプチド樹脂を作製し、樹脂より粗製ペプチドを回収した。
前記粗製ペプチドから、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）によりペプチドの精製を行った。カラムは逆相系のＣ１８−ＯＤＳ（メルク社製。Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００）を使用した。得られた精製ペプチドはＨＰＬＣ分析を行い、精製物が単一であることを更に確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列を、気相式自動アミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ）を用いて決定した結果、配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有していた。
尚、同様の方法により配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するペプチド（図３を参照：ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２）も製造した。
【実施例２】
（ラクトフェリンを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
ウシラクトフェリン（森永乳業社製） ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシラクトフェリン、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例３】
（カプセル入りラクトフェリンの調製）
乳糖（和光純薬工業社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）６００ｇを、５０メッシュ篩（ヤマト科学社製）により篩分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Ｃｅｓｅｒｅ Ｐｅｄｉｎｉ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６ Ｂｏｄｙ、空重量は７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、ウシラクトフェリン８２ｍｇ入りのカプセル剤７，０００個を得た。
【実施例４】
（ウシラクトフェリンを添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）１ｇを添加し、ウシラクトフェリン約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例５】
（ウシラクトフェリンを添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシラクトフェリンを含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【産業上の利用の可能性】
以上詳記したとおり、本発明はラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）食品素材として利用することができるタンパク質、又はその部分ペプチドであるので、安全性に優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
（２）幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
（３）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
（４）特定保健用食品、栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用することが可能である。
（５）食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤である。
【背景技術】
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシステインプロテアーゼ（チオールプロテアーゼ）と総称されている。カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫは、カルシウム依存性中性プロテアーゼ（ＣＡＭＰ）、パパイン、フィシン、プロメライン等とともに代表的なシステインプロテアーゼの一つである。そしてこれらシステインプロテアーゼに対して阻害作用を有する物質は、システインプロテアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬等として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテプシンＬ、カテプシンＢと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、それによって、とりわけカテプシンＬ阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある（勝沼信彦著、「ＢＩＯ ｍｅｄｉａ」、第７巻、第６号、第７３〜７７ページ、１９９２年）。骨組織においては、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊（骨吸収）を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に２つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミンＤ誘導体、女性ホルモン（エストロゲン）等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシステインプロテアーゼ群、中でも特にカテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテプシンＬ及びＢは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによって古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテプシンＬ、カテプシンＢ及びカテプシンＫのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、タンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミンＤ、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテプシンＬ阻害、カテプシンＢ阻害、又はカテプシンＫ阻害のいわゆるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている（特開平７−１７９４９６号公報、特表２００２−５０１５０２号公報）が、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。
一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は１０日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシウムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピードが腎臓の処理能力を上回ったとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、このような目的に使用し得るシステインプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下のものが開示されている。
（１）カテプシンＬ特異的阻害ポリペプチド（特開平７−１７９４９６号公報）
（２）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平９−２２１４２５号公報）
（３）バリン誘導体およびその用途（特開２００１−１３９５３４号公報）
（４）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平７−２４２６００号公報）
（５）ＦＡ−７０Ｃ１物質（特開２０００−７２７９７号公報）
（６）ＦＡ−７０Ｄ物質、その製造法及びその用途（国際公開第９７／３１１２２号パンフレット）
しかしながら、さらに、抗原性のない、安全な素材として使えるシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
他方、これまでに、母乳中にプロテアーゼ阻害物質が存在することが知られている。母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチトリプシンが挙げられ、インターα２−トリプシン阻害物質、α２−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含まれている（清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第８０〜８１ページ）。
乳中において、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質については、すでに以下のものが開示されている。
（１）牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約５７ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−２８９６号公報）
（２）牛初乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−１２６２９４号公報）
（３）人乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規タンパク質およびその製造方法（特開平１０−８０２８１号公報）
（４）牛乳から調製された牛乳由来塩基性シスタチン及び／又は牛乳由来塩基性シスタチン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開２０００−２８１５８７号公報）
（５）乳塩基性蛋白質（ＭＢＰ）中に含まれるシスタチンＣ、及びインビトロにおける該シスタチンＣによる骨吸収阻害効果（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー［Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、日本、第６６巻、第１２号、２００２年、ｐ２５３１−２５３６）
ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフェリン及びβ−カゼインなどが挙げられる。ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ：以下Ｌｆと略すことがある）は、主に母乳中に含まれているおよそ分子量８０ｋＤａの鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている（ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）、第９４巻、第１ページ、１９７９年、およびジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６７巻、第６０ページ、１９８４年）。また、様々な作用をもつ乳タンパク質として、疾病の治療剤に幅広く利用されている。ラクトフェリンは乳由来のタンパク質であるから安全性が高く、長期連用することが可能で、それ自体は殆ど無味無臭であり、各種の食品・医薬品・飼料の添加物として、汎用性が高いタンパク質である。
なお、疾病の治療剤にラクトフェリンを応用した例としては、
（１）抗腫瘍剤（特公平５−８６９３２号公報）
（２）抗リウマチ剤（特開平５−１８６３６８号公報）
（３）ＩｇＡ産生促進剤（特開平６−３２７４３号公報）
（４）便秘を改善する育児用調製粉乳（特開平６−２０５６４０号公報）
（５）血管新生病治療剤（特開平９−１９４３８８号公報）
（６）経口がん転移抑制剤（特開平１０−５９８６４号公報）
（７）ＩｇＥ産生抑制剤（特開２００１−１５８７４８号公報）
等が開示されている。
また、Ｌｆの分解物については、
（８）抗菌性およびチロシナーゼ活性阻害（ヨーロッパ特許公報第４３８７５０号）
（９）細胞への病原菌付着防止（特開平３−２２０１３０号公報）
（１０）抗ウィルス作用（特開平１−２３３２２６号公報）
等が開示されている。
また、鉄−ラクトフェリンを有効成分とする骨強化剤が、骨疾患の予防及び治療に有効であることが開示されている（特開２０００−２８１５８６号公報）。この技術は、鉄とラクトフェリンが結合した鉄−ラクトフェリンを有効成分として投与し、骨の基質であるコラーゲンの前駆体であるプロリン及びリジンの水酸化に関与する酵素の補酵素である鉄を供給し、コラーゲン生成を強化するというものである。
上記のように、これまでにシステインプロテアーゼ阻害物質が見いだされており、動物細胞、血液中、尿中及び乳中などにおいてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害物質が見いだされている。システインプロテアーゼ阻害物質のうち蛋白性のものはシスタチンと総称されている。シスタチンファミリーは、共通する活性部位を有することが知られており、その配列が明らかとなっている（早石修著、「プロテアーゼとそのインヒビター」、メジカルビュー社、第１版、第１刷、第１０４〜１１５ページ、１９９３年）。
しかしながら、ラクトフェリン及びその部分ペプチド、並びにトランスフェリンがシステインプロテアーゼ阻害作用を有することは知られておらず、また、ラクトフェリン及びトランスフェリンが、シスタチンファミリーの共通活性部位配列と相同性を有する領域を有することについても知られていなかった。さらに、ラクトフェリン及びその部分ペプチド、並びにトランスフェリンによるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨疾患の予防・治療剤についても知られていなかった。
【発明の開示】
本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症等の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
本発明者は、抗原性のない、安全な素材として利用する事が可能なシステインプロテアーゼ阻害物質を鋭意検索した結果、乳由来のタンパク質であるラクトフェリン及びラクトフェリン由来のペプチドフラグメント、並びにトランスフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下の（１）〜（１２）のとおりである。
（１）ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（２）ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である前記（１）に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（３）ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である前記（１）又は（２）に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（４）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（５）システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
（８） ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（９） ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である、前記（８）に記載の使用。
（１０） ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である前記（８）又は（９）に記載の使用。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（１１） システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の使用。
（１２） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である前記（１１）に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ乳タンパク質の逆ザイモグラフィーの検出を示す図（写真）である。
図２は、システインプロテアーゼに対するヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図３は、実施例１で製造したヒトラクトフェリンの部分ペプチド（ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５）、及びウシラクトフェリンの部分ペプチド（ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２）、並びに配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するペプチド（ヒトトランスフェリンペプチドＹ６６６−Ｒ６８２）、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するペプチド（ウシトランスフェリンペプチドＹ６７２−Ｒ６８８）のアミノ酸配列を示す図である。
図４は、システインプロテアーゼに対するヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図５は、システインプロテアーゼに対するトランスフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明は、ラクトフェリン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２７８８に記載のアミノ酸配列を有するヒト・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ２４６２７に記載のアミノ酸配列を有するウシ・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｑ２９４７７に記載のアミノ酸配列を有するヤギ・ラクトフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｏ７７８１１に記載のアミノ酸配列を有するウマ・ラクトフェリン）、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２７８７に記載のアミノ酸配列を有するヒト・トランスフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｑ２９４４３に記載のアミノ酸配列を有するウシ・トランスフェリン、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ２７４２５に記載のアミノ酸配列を有するウマ・トランスフェリン）からなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤である。
本発明に使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の常法により、前記原料から分離して得られるラクトフェリンを用いることができる。中でも、工業的規模で製造されている市販のラクトフェリン（例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の効果において、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本発明では、ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることができる。
本発明に使用するラクトフェリンの部分ペプチドの製造方法としては、前記ラクトフェリンを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解することによって製造する方法、遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、及び化学合成によって合成ペプチドを製造する方法などが例示される。尚、加水分解によって製造する方法を用いた場合、本発明のラクトフェリンの部分ペプチドは加水分解物中に混合物として含まれた形態で用いても良く、また常法に従ってＨＰＬＣ等により精製した形態で用いても良い。
本発明に使用するラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトラクトフェリン、または配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを例示することができる。また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するウシラクトフェリン、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド等を例示することができる。なお、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１９はシグナル配列である。
これらのラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドは、システインプロテアーゼ阻害活性を有するため、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤に使用することが可能である。
また、後述するように完全長ラクトフェリンがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列表の配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、配列表の配列番号２のアミノ酸番号６７６〜６９２を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらタンパク質及びペプチドは、例えば、本発明によりそのシステインプロテアーゼ阻害活性領域が明らかとなったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常の遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるラクトフェリン及びラクトフェリンの部分ペプチドには、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
ここで、本発明に用いることができるラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドが例示される。尚、「１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位」として可能なものは、少なくとも前記アミノ酸番号のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドとシステインプロテアーゼとの間の立体的な相互作用に影響を及ぼさず、システインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に設定できるものである。例えば、複数とは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは２から３個、より好ましくは２個である。
アミノ酸配列における置換は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６８６〜６９０のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６８３〜６８７のアミノ酸においては、アミノ酸の種類を変更しない範囲での置換が望ましい。すなわち、前記配列におけるアミノ酸と、同アミノ酸を置換するアミノ酸は構造上の分類で類似種類のアミノ酸であることが望ましい。具体的には前記配列のアミノ酸が酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸アミドである場合はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンのうちのいずれかとの置換、塩基性アミノ酸である場合はリジン、ヒスチジン、又はアルギニンのうちのいずれかとの置換、芳香族アミノ酸である場合はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのうちのいずれかとの置換、脂肪族アミノ酸又はオキシアミノ酸である場合は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン又はスレオニンのうちのいずれかとの置換、及び前記以外のアミノ酸（システイン、メチオニン、プロリン等）の場合はシステインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に置換することが望ましい。また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、又は、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において、１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合、複数個とはアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは２から５個、より好ましくは２から３個である。
さらに、本発明に用いることができるラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
上記のようなラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列は、従来知られている変異処理によっても取得されうる。
上記のような変異を有する塩基配列を適当な細胞で発現させ、本発明の試験例又は実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、ラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明においては、トランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドを使用することもできる。本発明に使用するトランスフェリンは、一般に市販されているトランスフェリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。）の乳又は血液等を原料とし、例えばカラムクロマトグラフィー法等により分離して得られるトランスフェリンを使用することができる。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したトランスフェリンを使用することも可能である。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の効果において、トランスフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本発明では、トランスフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型トランスフェリン；該アポ型トランスフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和トランスフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和トランスフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は複数種の混合物を用いることができる。
本発明においてはトランスフェリンの部分ペプチドも使用しうる。前記ラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と推定されるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５、及び、配列番号２のアミノ酸番号６７６〜６９２）と、トランスフェリンのアミノ酸配列を比較したところ、配列番号３に示すヒトトランスフェリンのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２の領域（ヒトトランスフェリンペプチドＹ６６６−Ｒ６８２）、及び配列番号４に示すウシトランスフェリンのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８の領域（ウシトランスフェリンペプチドＹ６７２−Ｒ６８８）に、ラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と高い相同性が認められた（図３参照）。このことと、後記実施例に示すようにトランスフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性が認められたことから、上記のそれぞれの領域を含むヒトトランスフェリン及びウシトランスフェリンの部分ペプチドも、同様にシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが強く示唆される。
本発明に使用するトランスフェリンの部分ペプチドの製造方法としては、前記トランスフェリンを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解することによって製造する方法、遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、及び化学合成によって合成ペプチドを製造する方法などが例示される。尚、加水分解によって製造する方法を用いた場合、本発明のトランスフェリンの部分ペプチドは加水分解物中に混合物として含まれた形態で用いても良く、また常法に従ってＨＰＬＣ等により精製した形態で用いても良い。
本発明に使用するトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒトトランスフェリン、またはヒトトランスフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを挙げることができる。また、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するウシトランスフェリン、または、ウシトランスフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド等を例示することができる。なお、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１９のアミノ酸配列はシグナル配列である。
配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列からなるペプチドは、本発明によって明らかとなったシステインプロテアーゼ阻害活性領域であるヒトラクトフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列、及びウシラクトフェリンのアミノ酸配列である配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列との相同性から、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。また、完全長トランスフェリンがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列表の配列番号４のアミノ酸番号６７２〜６８８を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらタンパク質及びペプチドは、例えば、本発明によりそのシステインプロテアーゼ阻害活性領域と推定される領域が明らかとなったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常の遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数の位置での１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるトランスフェリン及びトランスフェリンの部分ペプチドには、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも含有される。
ここで、本発明に用いることができるトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドとしては、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドが例示される。尚、「１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位」として可能なものは、少なくとも前記アミノ酸番号のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドとシステインプロテアーゼとの間の立体的な相互作用に影響を及ぼさず、システインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に設定できるものである。例えば、複数とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸、及び配列表の配列番号４に記載のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは２から３個、より好ましくは２個である。
アミノ酸配列における置換は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７３〜６７７のアミノ酸、及び、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６８３のアミノ酸においては、アミノ酸の種類を変更しない範囲での置換が望ましい。すなわち、前記配列におけるアミノ酸と、同アミノ酸を置換するアミノ酸は構造上の分類で類似種類のアミノ酸であることが望ましい。具体的には前記配列のアミノ酸が酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸アミドである場合はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンのうちのいずれかとの置換、塩基性アミノ酸である場合はリジン、ヒスチジン、又はアルギニンのうちのいずれかとの置換、芳香族アミノ酸である場合はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのうちのいずれかとの置換、脂肪族アミノ酸又はオキシアミノ酸である場合は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン又はスレオニンのうちのいずれかとの置換、及び前記以外のアミノ酸（システイン、メチオニン、プロリン等）の場合はシステインプロテアーゼ阻害活性を損なわない範囲で任意に置換することが望ましい。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、及び配列表の配列番号４に記載のうち、アミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において、１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合、複数個とはアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは２から５個、より好ましくは２から３個である。
さらに、本発明に用いることができるトランスフェリン又はトランスフェリンの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６６６〜６８２のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７２〜６８８のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
上記のようなトランスフェリンタンパク質又はトランスフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列は、従来知られている変異処理によっても取得されうる。
上記のような変異を有する塩基配列を適当な細胞で発現させ、本発明の試験例又は実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、トランスフェリンタンパク質又はトランスフェリンの部分ペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤においては、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンもしくはトランスフェリンの部分ペプチドをそれぞれ単独で使用することも、複数種を併用して使用することも可能である。また、ラクトフェリンの部分ペプチドは、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。さらに、トランスフェリンの部分ペプチドは、１種を単独で使用することも複数種を混合して用いることも可能である。
本発明に用いることができるラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンは、カテプシンＢ、Ｌ、Ｓ及びパパイン等のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する。システインプロテアーゼ阻害活性は、Ｂａｒｒｅｔｔ等の方法に従って測定することができる。本発明の試験例又は実施例において、該測定方法について詳細に記載する。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤はラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを使用し、これらの一又は複数種を公知の製剤学的に許容される製剤担体と組合わせることにより、製造することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
本発明の製剤中に含まれるラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンの量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％とするのがよい。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与することにより、システインプロテアーゼが関与する疾患を治療することができる。ここで、患者とは、ヒトであってもよいが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。
本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンの量は、０．１〜１２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防・治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌（スタフィロコッカス・アウレウスＶ８等）やウイルス（ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、エイズウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤は、本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、本発明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化し使用時に組み合わせても良い。
本発明の飲食品組成物は、食品又は飲料の原料にラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加して製造することができ、経口的に摂取することが可能である。前記原料は、通常の飲料や食品に用いられているものを使用することができる。本発明の飲食品組成物は、システインプロテアーゼ阻害剤を添加する以外は、通常の飲食品組成物と同様にして調製することができる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類：加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。
本発明の飲食品組成物において、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％となるように添加すればよい。
本発明の飼料組成物は、飼料にラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。飼料組成物の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示され、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、酵母類等とともに混合して本発明の飼料組成物を製造することができる。
本発明の飼料組成物において、ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、又はトランスフェリンを添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中０．００５〜６０質量％、好ましくは０．０５〜５０質量％となるように添加すればよい。
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここに、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
次に試験例を示して本発明を具体的に説明する。
［試験例１］
本試験は、乳中のシステインプロテアーゼ阻害物質を検出するために行った。
（１）検出法
本発明者はプロテアーゼ阻害物質の検出法として「逆ザイモグラフィー」という手法を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロテアーゼ阻害物質の検出を行った。逆ザイモグラフィーとは通常のザイモグラフィーの逆の手法によるものであり、基本的原理は次のとおりである。即ち、ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにプロテアーゼ阻害物質を含むサンプルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲル中のタンパク質を分解する。この操作により阻害物質が存在する部分はプロテアーゼの活性を阻害することから、ゼラチンはプロテアーゼによる分解を免れ、これが染色液によって染色されることにより、阻害物質を識別することが可能となる。
（２）試験方法
本発明における逆ザイモグラフィーの方法は以下のとおりである。
牛乳中の全タンパク質及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）をサンプルとし、０．１％ゼラチンを含む１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）を行った。泳動後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に４５分間浸漬して洗浄した後、更に４５分間蒸留水に浸漬する操作を３回繰り返してゲルを洗浄した。このゲルを、１ｍｇパパイン（３１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに浸漬し、３７℃で１０時間保温してゼラチンを消化した。ゲルを蒸留水で洗浄後、染色液（０．０２５％クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）Ｒ−２５０、４０％メタノール、７％酢酸水溶液）で１時間染色し、その後脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸水溶液）で脱色を行った。
これとは別に、対照試験としてゼラチンを含まない１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて前記と同様に逆ザイモグラフィーを行った。さらに、通常の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
（３）試験結果
本試験の結果は図１に示すとおりである。図１は逆ザイモグラフィーのパターンを示す結果である。図１の１レーンは牛乳中の全タンパク質の通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン、２レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザイモグラフィーのパターン、３レーンは牛乳中の全タンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターン、４レーンはウシラクトフェリンの逆ザイモグラフィーのパターン、５レーンはウシラクトフェリンのゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターンを各々示している。尚、図中矢印はウシ由来ラクトフェリン（分子量７８ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動位置を示している。尚、６レーン及び７レーンは本試験例とは直接関係がない。
図１から明らかなとおり、２レーンにおいてウシラクトフェリンの泳動位置（７８ｋＤａ）とほぼ同位置に逆ザイモグラフィーのポジティブなバンドが確認された。このことより、牛乳中にシステインプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存在が確認された。また、４レーンにおいてウシラクトフェリンを泳動したパパインを用いた逆ザイモグラフィーにおいて、ポジティブなバンドが確認された。
以上の結果から、ウシ由来のラクトフェリンにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが示唆された。
［試験例２］
本試験は、試験例１においてシステインプロテアーゼ阻害活性が示唆された７８ｋＤａのバンドについてＮ末端アミノ酸配列を決定するために行った。
（１）試験方法
試験例１で使用した牛乳中の全タンパク質サンプルを同様に使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＣＢＢで染色後、７８ｋＤａ付近に泳動された染色バンドを切り出した。このバンドについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
牛乳中の７８ｋＤａ染色バンドのアミノ酸配列を決定した結果、７８ｋＤａ染色バンドのＮ末端アミノ酸配列は配列表の配列番号２に記載されるウシラクトフェリンのそれと完全に一致した。従って、本試験の結果と試験例１の結果の両者から、ウシラクトフェリンはシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例３］
本試験は、ウシラクトフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のウシラクトフェリン（森永乳業社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対してシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。阻害活性の測定方法はＢａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］を参考にして、次のとおり行った。即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に種々の濃度に溶解したサンプルに、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ，最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験では各サンプルにつき、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳより選ばれる１種：和光純薬工業社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対するウシラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ウシラクトフェリンの濃度が１０−６Ｍに達したときに完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＳのシステインプロテアーゼ活性は、ウシラクトフェリンの濃度が１０−５Ｍに達したときに７０％以上阻害され、１０−４Ｍの濃度で完全に阻害された。従って、ウシラクトフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
【表１】
［試験例４］
本試験は、ヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のヒトラクトフェリン（シグマ社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図２に示すとおりである。図２は、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対するヒトラクトフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ヒトラクトフェリンの濃度が１０−６Ｍに達したときにほぼ完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＳのシステインプロテアーゼ活性は、ヒトラクトフェリンの濃度が１０−５Ｍに達したときに８０％以上阻害され、１０−４Ｍの濃度でほぼ完全に阻害された。従って、ヒトラクトフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、カテプシンＬ、及びカテプシンＳに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
［試験例５］
本試験は、ラクトフェリンの部分ペプチドのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として、後記する実施例１で製造した、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するペプチド〔以下、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５（図３を参照）と記載する。〕を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図４に示すとおりである。図４は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパイン及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、ペプチドの濃度が１０−４Ｍに達したときに５０％以上阻害され、１０−３Ｍの濃度でほぼ完全に阻害された。また、カテプシンＢのシステインプロテアーゼ活性は、ペプチドの濃度が１０−３Ｍに達したときに６０％阻害された。従って、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。また、後記する実施例１で製造した、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するペプチド〔以下、ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２（図３を参照）と記載する。〕について同様の阻害活性測定試験を行ったところ、ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５とほぼ同等の活性を示すことが明らかとなった。
［試験例６］
本試験は、トランスフェリンのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として市販のウシトランスフェリン（日本製薬社製）を使用し、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬ（以上いずれも市販品：和光純薬工業社製）に対して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法によりシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図５に示すとおりである。図５は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するトランスフェリンのシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、パパインのシステインプロテアーゼ活性は、トランスフェリンの濃度が１０−４Ｍに達したときに４０％阻害され、１０−３Ｍの濃度で完全に阻害された。また、カテプシンＢ及びカテプシンＬのシステインプロテアーゼ活性は、トランスフェリンの濃度が１０−４Ｍに達したときに３０％以上阻害された。従って、ウシトランスフェリンは、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対してシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが判明した。
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するペプチド（図３を参照：ヒトラクトフェリンペプチドＹ６７９−Ｋ６９５）を、以下の方法により製造した。
尚、前記本発明のペプチドは、自動アミノ酸合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａ）を用いて合成を行い製造を行った。
２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン（アプライド・バイオシステムズ社製。以下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する）により、ペプチド合成用固相樹脂であるＨＭＰ樹脂（アプライド・バイオシステムズ社製）のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭＰで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−スレオニン［具体的には、合成するペプチドのＣ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸（アプライド・バイオシステムズ社製）］をＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）リージェントキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。次に、前記Ｆｍｏｃ基の切断、続いて、Ｃ末端から２番目のアミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アラニンの縮合、及び洗浄を行い、さらにＦｍｏｃ−アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、保護ペプチド樹脂を作製し、樹脂より粗製ペプチドを回収した。
前記粗製ペプチドから、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）によりペプチドの精製を行った。カラムは逆相系のＣ１８−ＯＤＳ（メルク社製。Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００）を使用した。得られた精製ペプチドはＨＰＬＣ分析を行い、精製物が単一であることを更に確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列を、気相式自動アミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ）を用いて決定した結果、配列番号１のアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有していた。
尚、同様の方法により配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するペプチド（図３を参照：ウシラクトフェリンペプチドＹ６７６−Ｋ６９２）も製造した。
【実施例２】
（ラクトフェリンを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
ウシラクトフェリン（森永乳業社製） ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシラクトフェリン、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例３】
（カプセル入りラクトフェリンの調製）
乳糖（和光純薬工業社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）６００ｇを、５０メッシュ篩（ヤマト科学社製）により篩分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Ｃｅｓｅｒｅ Ｐｅｄｉｎｉ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６ Ｂｏｄｙ、空重量は７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、ウシラクトフェリン８２ｍｇ入りのカプセル剤７，０００個を得た。
【実施例４】
（ウシラクトフェリンを添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）１ｇを添加し、ウシラクトフェリン約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例５】
（ウシラクトフェリンを添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及びウシラクトフェリン（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシラクトフェリンを含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【産業上の利用の可能性】
以上詳記したとおり、本発明はラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）食品素材として利用することができるタンパク質、又はその部分ペプチドであるので、安全性に優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
（２）幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
（３）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
（４）特定保健用食品、栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用することが可能である。
（５）食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である請求項１に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である請求項１又は２に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項４】
システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項５】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
【請求項８】
ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項９】
ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である請求項８又は９に記載の使用。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項１１】
システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である請求項１に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である請求項１又は２に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項４】
システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項５】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
【請求項８】
ラクトフェリン、ラクトフェリンの部分ペプチド、及びトランスフェリンからなる群より選択される１種又は複数種の混合物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項９】
ラクトフェリン及び／又はトランスフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は複数種の混合物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリンの部分ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すタンパク質又はペプチドの１種又は複数種の混合物である請求項８又は９に記載の使用。
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７９〜６９５のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号６７６〜６９２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項１１】
システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、又は悪性腫瘍性高カルシウム血症である請求項１１に記載の使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０１１６
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５６８３９（Ｐ２００４−５５６８３９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５００７
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【特許番号】特許第３７２６０９５号（Ｐ３７２６０９５）
【特許公報発行日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５００７
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【特許番号】特許第３７２６０９５号（Ｐ３７２６０９５）
【特許公報発行日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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