プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異的アンタゴニスト
ＰＫＣペプチドアゴニストの生物学的活性を変化させるか、そうでなければＰＫＣペプチドアゴニストをペプチドアンタゴニストへ変換する方法が記載される。この方法は、１つ以上のアミノ酸残基を置換する工程を包含し、その結果、ペプチド中の電荷を変化し、および／または、そうでなければそれぞれのＰＫＣ酵素に対するＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位由来の配列に類似の配列を作成する。ＰＫＣ酵素の活性を阻害する方法、およびεＰＫＣの種々のアンタゴニストもまた、開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アゴニストの生物学的作用をアンタゴニストへ変換する方法、特に、プロテインキナーゼＣのアゴニストを、プロテインキナーゼＣのアンタゴニストへ変換する方法に関する。本発明はまた、プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異的調節のためのペプチド組成物、およびプロテインキナーゼＣの特定のアイソザイムの作用に拮抗する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）は、種々の細胞機能（細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性が挙げられる）に関するシグナル伝達において、重要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムとしては、少なくとも１１の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、このプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて、少なくとも３つのサブファミリーに分けられ得る。各々のアイソザイムは、アイソザイム固有（「可変」または「Ｖ」）ドメインが散在する、多くの相同（「保存」または「Ｃ」）ドメインを含む。「古典的」または「ｃＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（αＰＫＣ、βＩＰＫＣ、βＩＩＰＫＣ、およびγＰＫＣ）は、４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を含み、そしてカルシウム、ホスファチジルセリン、およびジアシルグリセロールまたはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。「新規」または「ｎＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（δＰＫＣ、εＰＫＣ、ηＰＫＣ、およびθＰＫＣ）において、Ｃ２様ドメインは、Ｃ１ドメインの上位にある。しかし、Ｃ２ドメインは、カルシウムに結合せず、したがって、ｎＰＫＣサブファミリーは、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、「異型」または「αＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（ζＰＫＣ、およびλ／ιＰＫＣ）は、Ｃ２ドメインおよびＣ１相同ドメインの半分の両方を欠き、そしてジアセチルグリセロール、ホルボールエステルおよびカルシウムに、感受性である。
【０００３】
ＰＫＣアイソザイムの細胞内分布に対する研究は、ＰＫＣの活性化が、その細胞内での再分布（転位とも称される）をもたらし、その結果、活性化ＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格要素、核および他の細胞内区画と結合することを実証する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。異なるＰＫＣアイソザイムの固有の細胞機能は、細胞内の局在により決定され得る。例えば、活性化βＩＰＫＣは、核の内側に見出され、対照的に、活性化βＩＩＰＫＣは、核周囲および心筋細胞の細胞末梢に見出される（非特許文献４）。εＰＫＣ（カルシウムとは無関係であるが、活性化のためにリン脂質を必要とする、新規ＰＫＣファミリーのメンバー）は、脊髄神経節および脊髄の表層の両方において主要な求心性ニューロンに見出される。
【０００４】
種々のＰＫＣアイソザイムの細胞内の異なる領域への局在は、次に、活性化アイソザイムの、特定のアンカー分子（活性化Ｃキナーゼのレセプター（ＲＡＣＫ）とも称される）への結合に起因するようである。ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムとそれぞれの細胞内部位とを選択的に固定することにより、機能すると考えられる。ＲＡＣＫは、完全に活性化したＰＫＣにのみ結合し、そして必ずしも酵素の基質ではない。そしてまた、このキナーゼの触媒ドメインにより媒介されるＲＡＣＫへも結合しない（非特許文献５）。ＰＫＣの転位は、活性化酵素のＲＡＣＫへの結合を反映し、ＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣにその細胞応答を発生するために必要である（非特許文献６）。インビボにおいてＲＡＣＫに対するＰＫＣの阻害は、ＰＫＣ結合の転位およびＰＫＣに媒介される機能を阻害する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００５】
一般に、ＰＫＣの転位は、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能のために必要である。ＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位を模倣するペプチド（非特許文献８；非特許文献７）は、インビボにて酵素の機能を選択的に阻害する、ＰＫＣのアイソザイム特異的転位インヒビターである。このようなＰＫＣのアイソザイム選択的インヒビターは、活性化アイソザイムと、そのそれぞれのアンカータンパク質（ＲＡＣＫ）との相互作用を選択的に阻害する能力に基づいて同定されている（非特許文献１０）。これらの短いペプチドのインヒビター（７〜１２アミノ酸長）は、個別のアイソザイムの機能に選択的に干渉することが示されている（非特許文献５；非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献１２；非特許文献１４）。
【０００６】
βＰＫＣおよびεＰＫＣ、ならびに他のＰＫＣアイソザイムの転位アゴニストペプチドもまた、同定されている（非特許文献８；非特許文献１４）。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位を模倣するペプチド（非特許文献１５；非特許文献６）は、インビボにて酵素の機能を選択的に阻害する、ＰＫＣのアイソザイム特異的転位アクチベーターである（非特許文献８；非特許文献１５）。これらのＰＫＣ由来の６〜８個のアミノ酸ペプチドは、その対応するＲＡＣＫ内の配列に対して相同であり、したがって、これらは、それぞれ偽βＲＡＣＫ（ΨβＲＡＣＫ）および偽εＲＡＣＫ（ΨεＲＡＣＫ）と称される。ΨβＲＡＣＫまたはΨεＲＡＣＫの細胞内への導入は、対応するアイソザイムの選択的転位を引き起こし、インビトロおよびインビボにおける基質のリン酸化により測定される場合の、その触媒活性を増加する（非特許文献８；非特許文献１４）。アイソザイム（そのＲＡＣＫは、まだ同定されていない（例えば、δＰＫＣおよびθＰＫＣ））のΨＲＡＣＫ配列のＣ２ドメインまたはＣ２様ドメインの位置もまた、転位アゴニストペプチドに対応して見出された（非特許文献１６）。たとえば、ΨεＲＡＣＫの細胞内への導入は、δＰＫＣの選択的転位を引き起こし、その触媒活性を増加する（非特許文献１６）。これらのペプチドはまた、細胞内およびインビボにおいて、βＰＫＣ、δＰＫＣおよびεＰＫＣの役割を同定するために使用されている（非特許文献８；非特許文献１６；非特許文献１４）。
【０００７】
治療の観点から、ＰＫＣの個別のアイソザイムは、種々の疾患状態の機構に関連する。この疾患状態としては、以下が挙げられる：癌（αＰＫＣおよびδＰＫＣ）；心肥大および心不全（βＩＰＫＣおよびβＩＩＰＫＣ）；侵害受容（γＰＫＣおよびεＰＫＣ）；虚血（心筋梗塞が挙げられる）（εＰＫＣおよびδＰＫＣ）；免疫応答（特にＴ細胞媒介性）（θＰＫＣ）；ならびに線維芽細胞増殖および記憶（δＰＫＣおよびζＰＫＣ）。種々のＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドおよび可変領域特異的ペプチドが、以前に記載されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。疼痛の知覚におけるεＰＫＣの役割（特許文献１に最初に記載されたεＰＫＣの選択的インヒビターである、εＶ１−２ペプチドの治療的使が挙げられる）は、近年報告された（特許文献２；特許文献３）。
【特許文献１】米国特許第５，７８３，４０５号明細書
【特許文献２】国際公開第００／０１４１５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，３７６，４６７号明細書
【非特許文献１】Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９年、第８６巻：ｐ．３４０９−３４１３
【非特許文献２】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．およびＨａｌｌ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９年、第１０８巻：ｐ．５５３−５６７
【非特許文献３】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（公式にはＣｅｌｌ Ｒｅｇ．）１９９０年、第１巻：ｐ．６９３−７０６
【非特許文献４】Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９４年，第２１０巻：ｐ２８７−２９７
【非特許文献５】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９１年、第８８巻：ｐ３９９７−４０００
【非特許文献６】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５年、第２６８巻：ｐ．２４７−２５１
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年、第２７１巻：ｐ．２４９６２−２４９６６
【非特許文献８】Ｒｏｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５年、第９２巻：ｐ４９２−４９６
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｌ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２年、第１８８巻：ｐ．１２３５−１２４０
【非特許文献１０】Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎ，Ｍ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年、第１６巻：ｐ．９１９−９２４
【非特許文献１１】Ｒｏｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、第２７０巻：ｐ．２４１８０−２４１８７
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９６年、第７０巻（２，第２版）：Ａ３９１
【非特許文献１３】Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、第２７２巻：ｐ．３０９４５−３０９５１
【非特許文献１４】Ｄｏｒｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９年、第９６巻：ｐ．１２７９８−１２８０３
【非特許文献１５】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１年、第２２６巻：ｐ．１４６６−１４６８
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１年、第９８巻：ｐ．１１１４−１１１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＰＫＣアイソザイムは、種々の疾患状態に関連することは明らかであり、そしてヒト疾患を処置するための治療剤を開発するために、特定のＰＫＣアイソザイムの作用を調節する方法についての必要性が存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を別のアミノ酸で置換して、（例えば、置換した位置における電荷を変化させることにより）ペプチドの電子分布を変更すること、そして／または、活性化Ｃキナーゼについてのレセプター（ＲＡＣＫ）タンパク質にのそれぞれの上のプロテインキナーゼＣ結合部位内の配列に、このペプチドがより類似するように変更することは、ＰＫＣ酵素の活性を阻害するために使用され得るＰＫＣアンタゴニストを産生することが発見された。したがって、プロテインキナーゼＣアゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアゴニストペプチド模倣物をプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する。本発明の特定の形態において、このペプチドアンタゴニストは、アンタゴニストが誘導されるアイソザイムの選択的インヒビターである。
【００１０】
本発明のさらに別の局面において、ＰＫＣ酵素の活性を阻害する方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、この酵素をＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、ここで、このペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な、別のアミノ酸で置換される。本発明の特定の形態において、この置換は、置換された残基位置における電荷の変化をもたらす。
【００１１】
処置方法もまた提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはεＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する。この方法は、εＰＫＣ酵素の活性を調節することにより、多種多様の疾患または状態を処置するために使用され得る。
【００１２】
ＰＫＣ拮抗性活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物もまた、提供される。本発明の１つの形態において、このペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。本発明のさらに他の形態において、このペプチドは、本明細書中に示される配列を有する。
【００１３】
ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、プロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
ＰＫＣ酵素の活性を阻害する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
本明細書中に記載されるＰＫＣアンタゴニストを使用する処置方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
εＰＫＣ拮抗性活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
本発明のこれら目的および他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の記述を、添付の図面とともに読むときに、より十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（好ましい実施形態の説明）
本発明の原理の理解を進める目的のために、ここで、好ましい実施形態に対して参照がなされ、特定の用語が、同じものを記載するために使用される。それにもかかわらず、本発明の範囲が限定されないことが意図され、このような本発明の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書中に例示されるこのような本発明の原理のさらなる適用は、本発明に関する当業者に通常想像されるように企図されることが理解される。
【００１９】
本発明は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチドに変換する方法を提供する。ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、このペプチドまたはペプチド模倣物の電子分布が変化され、そして／または、ペプチドまたはペプチド模倣物は、それぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列により近く類似するように別のアミノ酸で置換する工程は、ＰＫＣ酵素の活性を阻害するために使用され得るアンタゴニストを産生することが発見された。１つの形態において、方法は、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物に変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する。本発明のさらに他の形態において、この置換は、異なるアミノ酸を有するペプチドまたはペプチド模倣物を合成するか、あるいは、既存のペプチドまたはペプチド模倣物のアミノ酸を改変し、その結果、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物が、アンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物に変換されることにより、なされ得る。本明細書中のペプチド模倣物は、それぞれのＰＫＣ酵素上の分子間結合部位に選択的に結合する低分子を含む。
【００２０】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣ酵素と、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来のＰＫＣインヒビターペプチドあるいはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物とを接触させる工程を包含し、ここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。
【００２１】
処置方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはこのεＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する。この方法は、εＰＫＣ酵素の活性を調節することにより、多種多様な疾患または状態を処置するために使用され得る。
【００２２】
ＰＫＣ拮抗活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物もまた、提供される。本発明の特定の形態において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、ここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。
【００２３】
本発明の１つの局面において、ＰＫＣ酵素アゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣ酵素アンタゴニストペプチドまたはＰＫＣ酵素アンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換する工程を包含する。「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基の鎖からなる化合物をいう。そうではないと指定されない限り、ペプチドについてのこの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で提供される。
【００２４】
この方法は、多種多様なＰＫＣ酵素に適用可能である。上記のように、ＰＫＣ酵素は、その調節ドメインの相同性に基づいて、３つのファミリーに分類される：従来のＰＫＣ（ｃＰＫＣ；α、βＩ、βＩＩ、およびγが挙げられる）、新規ＰＫＣ（ｎＰＫＣ；ε、δ、η、およびθが挙げられる）、および異型ＰＫＣ（ａＰＫＣ；ζ、ιおよびλが挙げられる）。本明細書中で以前に記載されたように、ＰＫＣ酵素について、その生物学的効果を発揮するためには、これらの酵素は、活性化されて、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質へ結合されなければならない。例として、εＰＫＣ結合部位は、εＲＡＣＫ上に存在する（このアミノ酸配列は、配列番号１にＮＮＶＡＬＧＹＤとして示される）。そのそれぞれのＰＫＣ酵素との結合相互作用のためのＰＫＣ結合部位はまた、他のＲＡＣＫ上にも存在する。例えば、ＲＡＣＫ１上のβＰＫＣ結合部位は、ＳＩＫＩＷＤとして配列番号２に示される。この配列は、βＩとβＩＩとの間で同一である。なぜならば、これらは、最後の５０アミノ酸のみ異なり、そしてαＰＫＣおよびγＰＫＣにおいて同一であるからである。本発明の１つの形態において、特定のアゴニスト由来の特定のアンタゴニストを設計する場合、これらの結合部位の配列は、少なくとも１つのアミノ酸が、ペプチドまたはペプチド模倣物をそれぞれのＰＫＣ酵素上のＰＫＣ結合部位により厳密に類似させるようなアミノ酸で置換されることを確実にするために、あるいは、そうでなければ、ペプチドまたはペプチド模倣物の結合部位に対する結合親和性を、増加させるために、適用され得る。本発明のさらに他の形態において、本明細書中に記載されるペプチドアゴニストまたはペプチドアゴニスト模倣物の少なくとも１つの荷電アミノ酸を、非荷電アミノ酸で置換することは、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換すると予測されている。
【００２５】
多種多様なＰＫＣペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物のアゴニストは、改変されても、あるいは、そうでないならＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換されてもよく、結果的に本発明における用途が見い出される。ＰＫＣアゴニストは、少なくとも約４〜約３０アミノ酸の配列、または少なくとも約５〜約１５アミノ酸の配列を含み得る。ＰＫＣアゴニストは、約３０アミノ酸より長い配列から構成され得ることが、理解される。「ＰＫＣアゴニスト」は、本明細書中で、ＰＫＣを活性化して活性化されたＰＫＣを形成し、ＰＫＣがその生物学的機能を実施することを容易にするか、または可能にし、あるいは、ＰＫＣの活性を模倣して、その模倣物がＰＫＣの１つ以上の生物学的機能を実施することを可能にする、化合物を意味する。アゴニストは、例えば、活性化されたＰＫＣが、細胞の特定の領域に転位されて、その結果、その生物学的効果を発揮させ得る。当該分野で公知のように、ＰＫＣの酵素のファミリーは、セリン／スレオニンキナーゼであり、そして、無数の細胞のプロセス（細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性が挙げられる）に関連する。「ＰＫＣアンタゴニスト」または「ＰＫＣインヒビター」は、本明細書中において、ＰＫＣ酵素を阻害して不活性化ＰＫＣ酵素を形成し、ＰＫＣがその生物学的機能を実施することを予防するか、その予防を容易にし、あるいは、ＰＫＣアンタゴニストの活性を模倣して、その模倣物がＰＫＣの生物学的機能を阻害することを可能にする化合物を意味する。アンタゴニストは、例えば、活性化されたＰＫＣが細胞の特異的な領域に転位されて、その結果、ＰＫＣが、その生物学的機能を発揮することを防ぎ得る。用語「アンタゴニスト」および「インヒビター」は、本明細書中で交換可能に使用されることに注意が必要である。
【００２６】
このようなアゴニストとしては、ｃＰＫＣアゴニスト（例えば、αＰＫＣアゴニスト、βＩＰＫＣアゴニスト、βＩＩＰＫＣアゴニスト、およびγＰＫＣアゴニストが挙げられる）；ｎＰＫＣアゴニスト（εＰＫＣアゴニスト、δＰＫＣアゴニスト、ηＰＫＣアゴニスト、およびθＰＫＣアゴニストが挙げられる）；ならびにａＰＫＣアゴニスト（ξＰＫＣアゴニスト、ιＰＫＣアゴニスト、およびλＰＫＣアゴニストが挙げられる）が挙げられる。それぞれのＰＫＣアゴニストは、各々のＰＫＣ酵素（例えば、ΨαＲＡＣＫ、ΨβＩＲＡＣＫ、ΨεＲＡＣＫ、ΨλＲＡＣＫなど）に存在するΨＲＡＣＫ配列由来であり得る。ペプチドまたはペプチドフラグメントは、そのペプチドが、同一であるアミノ酸配列を有する場合か、あるいはそうでないなら、親ペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列に特定の％の同一性（少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、そして少なくとも約９５％の同一性を含む）を有する場合、親ペプチドまたは親ポリペプチド「由来である」。このような定義は、親ペプチドまたは親ポリペプチドまたは親ペプチド模倣物と比較した場合に、その配列の中に少なくとも１アミノ酸の置換を有する、ペプチドまたはペプチド模倣物を包含する。理論に限定されるべきではないが、これらのΨＲＡＣＫ配列は、本明細書中の実施例においてより完全に考察されるように、ＰＫＣ酵素のそれぞれのＲＡＣＫ結合部位との阻害性の分子内相互作用に少なくとも関連することが見出された。
【００２７】
同一性％は、例えば、高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈより利用可能な、２．２．９版が挙げられる）を使用して、配列情報を比較することにより、決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアライメント方法に基づき、そしてＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）で議論されるとおりである。簡単に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を２つの配列のうち短いのものの記号の全数で除算した同一なアライメントされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数と規定する。このプログラムは、比較されるタンパク質の全長にわたって、同一性％を決定するために使用され得る。例えば、そのプログラムの中のｂｌａｓｔｐにおいて、短いクエリー配列に関する探索を最適化するために、デフォルトのパラメータが提供される。このプログラムはまた、ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムにより決定されるように、ＳＥＧフィルタの使用により、クエリー配列の断片の正体を明らかにすることを可能にする。
【００２８】
多種多様なこのようなΨＲＡＣＫ配列は、様々な種（以下のヒト配列が挙げられる）において当該分野で公知である：例えば、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ，配列番号３）；ΨδＲＡＣＫ（ＭＲＡＡＥＥＰＭ，配列番号４）；ΨθＲＡＣＫ（ＫＧＫＮＶＤＬＩ、配列番号５）；ΨηＲＡＣＫ（ＨＥＴＰＬＧＹＤ、配列番号６）；およびΨβＲＡＣＫ（ＳＶＥＩＷＤ、配列番号７）。ＲＡＣＫ配列は、各々のＰＫＣアイソザイムとそのＲＡＣＫとの相同性領域を探索することにより同定された。εＰＫＣにおいて、例えば、ΨεＲＡＣＫ配列ＨＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号３；εＰＫＣ ８５−９２）は、アミノ酸ＮＮＶＡＬＧＹＤ（配列番号１；εＲＡＣＫ ２８５−２９２）を構成するεＲＡＣＫの配列と、約７５％の相同性を有する。ΨＲＡＣＫ配列に対応するペプチド（εＰＫＣが挙げられる）は、εＰＫＣ選択的アゴニストとして機能する。
【００２９】
このアゴニストは、上記の配列（そのフラグメントまたは改変体を含む）の誘導体であり得る。改変体は、本発明におけるアゴニストとして有利に利用され得るペプチドの誘導体を得るために、アミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む。
【００３０】
保存的アミノ酸置換は、選択されたペプチドまたはポリペプチドの活性（例えば、εＰＫＣアゴニスト活性またはΨεＲＡＣＫアゴニスト活性）または三次構造に有意な変化をもたらさない置換である。このような置換は、代表的に、選択されたアミノ酸残基を、類似の構造、大きさまたは他の物理化学的性質を有する異なる残基で置き換える工程を包含する。例えば、ＧｌｕのＡｓｐへの置換は、保存的置換であるみなされる。なぜならば、この両方は、類似の大きさの、負に荷電したアミノ酸であるためである。物理化学性質なアミノ酸の分類は、当業者に公知である。例えば、以下の群の各々の中のアミノ酸は、同じ群の中のほかのアミノ酸と相互交換可能され得る：脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる）；非芳香族であり、ヒドロキシルを含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；アミド側鎖を有するアミノ酸（グルタミン、およびアスパラギンが挙げられる）；塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる）；芳香族環の側鎖を有するアミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる）；および硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸（システインおよびメチオニンが挙げられる）。
【００３１】
したがって、εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ配列由来の適切なεＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＨＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号３）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号８（ＨＥＡＤＩＧＹＤ）；配列番号９（ＨＤＡＰＩＧＹＥ）；配列番号１０（ＨＤＡＰＶＧＹＥ）；配列番号１１（ＨＤＡＰＬＧＹＥ）；配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）；配列番号１３（ＨＤＡＰＩＧＥＹ）；配列番号１４（ＡＤＡＰＩＧＹＤ）；配列番号１５（ＨＤＧＰＩＧＹＤ）；配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）；配列番号１７（ＡＥＡＰＶＧＥＹ）；配列番号１８（ＨＥＡＰＩＧＤＮ）；配列番号１９（ＨＤＧＤＩＧＹＤ）；配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）および配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）。
【００３２】
δＰＫＣのΨδＲＡＣＫ配列由来の適切なδＰＫＣアゴニストとしては、例えば、配列番号４（ＭＲＡＡＥＥＰＶ）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号２２（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）；配列番号２３（ＭＲＶＶＥＥＰＶ）；配列番号２４（ＭＲＡＡＤＥＰＶ）；配列番号２５（ＭＲＡＡＥＥＰ）；配列番号２６（ＭＲＬＬＥＥＰＶ）；配列番号２７（ＭＲＬＡＥＥＰＶ）；および配列番号２８（ＭＲＡＡＥＥ）。
【００３３】
ηＰＫＣ上のΨηＲＡＣＫ配列由来の例示的なηＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＨＥＴＰＬＧＹＤ（配列番号６）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号２９（ＨＤＴＰＬＧＹＤ）；配列番号３０（ＨＤＴＰＬＧ）；配列番号３１（ＨＤＴＰＩＧＹＤ）；配列番号３２（ＨＥＴＰＡＧＹＤ）；配列番号３３（ＨＥＴＰＡＧＹＥ）；配列番号３４（ＫＥＴＰＡＧＹＤ）；配列番号３５（ＫＥＴＰＶＧＹＤ）および配列番号３６（ＫＥＴＰＶＧ）。
【００３４】
θＰＫＣ上のΨθＲＡＣＫ配列由来の例示的なθＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＫＧＫＮＶＤＬＩ（配列番号５）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号３７（ＲＧＫＮＶＥＬＡ）；配列番号３８（ＫＮＶＤＬＩ）；配列番号３９（ＲＧＲＮＶＤＬＩ）；配列番号４０（ＫＧＲＮＡＤＬＩ）；配列番号４１（ＫＧＫＮＶＥＬＩ）；配列番号４２（ＫＧＫＮＶＥＬＡ）；配列番号４３（ＫＧＫＱＶＤＬＩ）および配列番号４４（ＲＧＫＮＬＤＬＩ）。
【００３５】
βＰＫＣ上のΨβＲＡＣＫ配列由来の例示的なβＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＳＶＥＩＷＤ（配列番号７）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下が挙げられる：配列番号４５（ＳＡＥＩＷＤ）；配列番号４６（ＳＶＥＬＷＤ）；配列番号４７（ＴＶＥＩＷＤ）；配列番号４８（ＳＶＥＩＷＥ）および配列番号４９（ＳＶＥＩＷ）。
【００３６】
他の適切なアゴニストとしては、本明細書中に記載されるアゴニストのアミノ酸配列（配列番号３〜４９が挙げられる）に対して、少なくとも約５０％の同一性、さらに少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、さらに少なくとも約８０％の同一性、およびさらに少なくとも約９０％の同一性を有し、そしてそれぞれのＰＫＣ酵素についてのアゴニストとして機能するアゴニストが挙げられることが理解される。
【００３７】
また、本明細書中に記載されるΨＲＡＣＫ配列はまた、本明細書中に示される残基を越える１つ以上のアミノ酸残基を含み得ることが理解される。例えば、８５〜９２位のΨεＲＡＣＫ配列（配列ＨＤＡＰＩＧＹＤ；配列番号３に対応する）に関して、配列番号９３（ＴＤＶＣＮＧＲＫＩＥＬＡＶＦＨＤＡＰＩＧＹＤＤＦＶＡＮＣＴＩ）は、εＰＫＣのアミノ酸７１〜１００の残基の配列を示す。７４〜８１位のΨδＲＡＣＫ配列（配列ＭＲＡＡＥＥＰＶ；配列番号４に対応）に関して、配列番号９４（ＩＱＩＶＬＭＲＡＡＥＥＰＶＳＥＶＴＶ）は、δＰＫＣのアミノ酸６９〜８６の残基の配列を示す。７５〜８２位のΨθＲＡＣＫ配列（配列ＫＧＫＮＶＤＬＩ；配列番号５に対応）に関して、配列番号９５（ＭＱＩＩＶＫＧＫＮＶＤＬＩＳＥＴＴＶ）は、θＰＫＣのアミノ酸７０〜８７の残基の配列を示す。８８〜９５位におけるΨηＲＡＣＫ配列（配列ＨＥＴＰＬＧＹＤ；配列番号６に対応）に関して、配列番号９６（ＥＬＡＶＦＨＥＴＰＬＧＹＤＨＦＶＡＮ）は、ηＰＫＣのアミノ酸８３〜１００の残基の配列を示す。２４１〜２４６位におけるΨβＲＡＣＫ配列（配列ＳＶＥＩＷＤ；配列番号７に対応）に関して、配列番号９７（ＫＤＲＲＬＳＶＥＩＷＤＷＤＷＤＬ）は、βＰＫＣ由来のアミノ酸２３６〜２５１の残基の配列を示す。配列９３〜９６由来であり、εＰＫＣアゴニスト、δＰＫＣアゴニスト、θＰＫＣアゴニストおよびηＰＫＣアゴニストとしての活性を有する配列は、例えば、本明細書中の教示にしたがって、置換位置におけるペプチドの電荷の変化を達成する置換アミノ酸を選択することにより（例えば、置換位置における電荷を減少するか、または増加させることにより）改変されて、その生物学的活性をアンタゴニストの活性へと変換し得る。例えば、負に荷電するか、正に荷電するアミノ酸は、非荷電アミノ酸を置換し得る。本発明の特定の形態において、改変された配列は、そのそれぞれの酵素についての天然のＲＡＣＫの電子分布により厳密に類似する。
【００３８】
ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力があるＰＫＣアゴニストペプチドに存在するアミノ酸は、本発明の１つの形態において、アゴニストペプチドを、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列に、より近接に類似させるアミノ酸である。したがって、この置換は、アゴニストペプチド上の特定の位置に存在し、そして、置換前に２つの配列の間の同一性％を比較する場合に、ＰＫＣアゴニストと、それぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の参照配列との間の同一性％を増加させるアミノ酸配列を用いる。置換されるアミノ酸を置き換えるこのようなアミノ酸は、ペプチド内で非保存的アミノ酸置換を提供するアミノ酸を含み得る。
【００３９】
ペプチド配列が比較されるＲＡＣＫタンパク質上の参照配列は、本明細書中で以前に記載されたＢＬＡＳＴプログラム、または当該分野で公知の他の類似のプログラムを使用して、比較される２つの配列を最適にアライメントすることから導き出される配列であり、そして、例えば、約４〜約３０アミノ酸、または約５〜約１５アミノ酸に相当し得る。それぞれのＲＡＣＫのＰＫＣ結合部位において３０アミノ酸より長い参照配列はまた、参照配列に対して構築されたペプチドアンタゴニストを比較する場合（ペプチドアンタゴニストの長さが、約３０アミノ酸より長いような状況が挙げられる）に、利用され得ることが理解される。参照配列が、本明細書中で議論されるＰＫＣの種々のアイソタイプから選択され得るような配列の例は、本明細書中で以前に列挙されている。置換されるアミノ酸は、本明細書中に記載されるとおりの別の適切なアミノ酸で置換される場合に、ＰＫＣ酵素のＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列に対して、同一性％の増加したペプチド配列をもたらし、そして結果として、ＰＫＣアゴニストペプチドのＰＫＣアンタゴニストペプチドへの変換をもたらすペプチド中の任意のアミノ酸であり得る。この適切なアミノ酸は、ペプチドまたはペプチド模倣物と、ＰＫＣ酵素のＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位との間の結合親和性を増加させるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明の他の形態において、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力があるアミノ酸は、そのペプチドまたはペプチド模倣物が、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位から選択される参照ペプチドの電子分布に、より厳密に近づくことを可能にするか、あるいは、荷電アミノ酸を非荷電アミノ酸で置換する、アミノ酸である。置換されるアミノ酸を置き換えるこのようなアミノ酸は、ペプチド中の非保存的アミノ酸置換を提供するアミノ酸であり得る。例として、８アミノ酸の参照ペプチドが、２位において非荷電アミノ酸を有し、そしてＢＬＡＳＴプログラムを使用して最適にアライメントすると、このアゴニストが、同じ位置に荷電アミノ酸を有する場合に、このアゴニスト中のアミノ酸は、このアゴニストペプチドが、参照ペプチドの特定の位置における電荷をより厳密に近づけ、そしてＰＫＣアゴニストをアンタゴニストへ変換することを可能にするために、非荷電アミノ酸で置換され得る。したがって、ＰＫＣアゴニスト中の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）を、極性の非荷電アミノ酸（例えば、アスパラギンまたはグルタミン）で置換し得、これにより、ペプチド中の置換位置における電荷を減少し得る。いくつかの場合において、所与の配列における極性の非荷電残基は、荷電残基（例えば、正または負に荷電したアミノ酸残基）で置換され得、これにより、ペプチド中の置換位置における電荷を増加して、ペプチド機能における変化を達成することが理解される。
【００４１】
アゴニスト中の少なくとも１つのアミノ酸が、置換される。本発明の特定の形態において、２、３、または４以上のアミノ酸が、置換され得る。アゴニスト中の置換され得るアミノ酸の数または％はまた、ペプチドまたはペプチド模倣物中のアミノ酸の数に依存し得る。アゴニストの長さがより長いほど、および／またはこのアゴニストペプチドと、それぞれのＲＡＣＫのＰＫＣ結合部位内の配列との間の同一性％もしくは電子分布の差が大きいほど、より多い置換数が可能である。約８アミノ酸のアゴニスト中の適切な置換数は、約４未満を含む。例として、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物のアミノ酸の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、さらに少なくとも約４０％、さらに少なくとも約５０％、および少なくとも約６０％が、置換され得る。
【００４２】
本発明の方法にしたがって、εＰＫＣアゴニストペプチド由来である、εＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号５０〜５７に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）、配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）、配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）および配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）（これらは、米国特許第６，１６５，９７７号に開示される）として同定される、代替のΨεＲＡＣＫ配列に基づき、そして、例えば、εＲＡＣＫ上のεＰＫＣ結合部位内の配列（例えば、ＮＮＶＡＬＧＹＤ（配列番号１）により類似するように、そして／または、選択されたアミノ酸残基において電荷の変化を含むように改変され得る。これらの代替のΨεＲＡＣＫ配列は、本明細書中に開示される方法にしたがって改変され得、ここで、１つ以上のアミノ酸残基は、ペプチド中の電荷の変化を達成するアミノ酸残基で置換され得る。例えば、配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５０（ＨＮＡＰＩＧＤＹ）および配列番号５１（ＨＤＡＰＩＧＮＹ）に到達する。配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５２（ＨＮＡＰＩＧ）に到達する。配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５３（ＨＮＡＰＩＰＹＤ）および配列番号５４（ＨＤＡＰＩＰＹＮ）に到達し得る。さらに、配列番号３（ＨＤＡＰＩＧＹＤ）は、最初のＤのＮへの置換により改変されて、配列番号５５（ＨＮＡＰＩＧＹＤ）に到達し得る。配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）は、第１または第２のＤのいずれかをＮで置換することにより改変されて、それぞれ、配列番号５６（ＨＮＡＡＩＧＹＤ）および配列番号５７（ＨＤＡＡＩＧＹＮ）に到達し得る。
【００４３】
本発明の方法にしたがって、δＰＫＣアゴニストペプチド由来である、δＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号５８〜６５に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記の代替のΨδＲＡＣＫ配列に基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号４（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）は、ＲをＤまたはＥへ交換することにより改変されて、それぞれ、配列番号５８（ＭＤＶＡＥＥＰＶ）および配列番号５９（ＭＥＶＡＥＥＰＶ）に到達し得る。あるいは、配列番号４（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）における第２のＥは、ＮまたはＱで置換されて、配列番号６０（ＭＲＶＡＥＮＰＶ）および配列番号６１（ＭＲＶＡＥＱＰＶ）に到達し得る。類似の改変は、例えば、配番号２７（ＭＲＬＡＥＥＰＶ）に対してなされ、配列番号６２（ＭＤＬＡＥＥＰＶ）に到達し得る（ＲをＤに交換する）；配列番号６３（ＭＥＬＡＥＥＰＶ）（ＲをＥに交換する）；配列番号６４（ＭＲＬＡＥＮＰＶ）（第２のＥをＮで交換する）；および配列番号６５（ＭＲＬＡＥＱＰＶ）（第２のＥをＱで交換する）。
【００４４】
本発明の方法にしたがって、ηＰＫＣアゴニストペプチド由来である、ηＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号６６〜６９に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨηＲＡＣＫ配列および代替のΨηＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号６（ＨＥＴＰＬＧＹＤ）および配列番号３４（ＫＥＴＰＡＧＹＤ）は、ＱのＥとの置換により改変されて、配列番号６６（ＨＱＴＰＬＧＹＤ）；配列番号６７（ＫＮＴＰＡＧＹＤ）；配列番号６８（ＫＱＴＰＡＧＹＤ）；および配列番号６９（ＫＮＴＰＡＧＹＤ）に到達し得る。
【００４５】
本発明の方法にしたがって、θＰＫＣアゴニストペプチド由来である、θＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号７０〜７８に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨθＲＡＣＫ配列および代替のΨθＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号５（ＫＧＫＮＶＤＬＩ）は、第２のＫを、ＤまたはＥのいずれかで置換することにより改変されて、配列番号７０（ＫＧＤＮＶＤＬＩ）および配列番号７１（ＫＧＥＮＶＤＬＩ）に到達し得；ＥをＮで置換して、配列番号７２（ＫＧＫＥＶＤＬＩ）に到達し得；あるいは、ＮをＤで置換して配列番号７３（ＫＧＫＮＶＮＬＩ）に到達し得る；同様に、配列番号３７（ＲＧＫＮＶＥＬＡ）は、ＫをＤまたはＥのいずれかで置換することにより改変されて、それぞれ、配列番号７４（ＲＧＤＮＶＥＬＡ）および配列番号７５（ＲＧＥＮＶＥＬＡ）に到達し得る。さらに、配列番号４３（ＫＧＫＱＶＤＬＩ）は、ＮをＤで置換することにより改変されて、配列番号７６（ＫＧＫＱＶＮＬＩ）に到達し得るか、あるいは、第２のＫをＤまたはＥで置換することにより、改変されて、それぞれ、配列番号７７（ＫＧＤＱＶＮＬＩ）および配列番号７８（ＫＧＥＱＶＮＬＩ）に到達し得る。
【００４６】
本発明の方法にしたがって、βＰＫＣアゴニストペプチド由来である、βＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号７９〜８５に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨβＲＡＣＫ配列および代替のΨβＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号７（ＳＶＥＩＷＤ）、配列番号４５（ＳＡＥＩＷＤ）；配列番号４６（ＳＶＥＬＷＤ）：配列番号４７（ＴＶＥＩＷＥ）；配列番号４８（ＳＶＥＩＷＥ）；および配列番号４９（ＳＶＥＩＷ）は全て、ＥをＫで置換することにより改変されて、配列番号８０（ＳＶＫＩＷＤ）；配列番号８１（ＳＡＫＩＷＤ）；配列番号８２（ＳＶＫＬＷＤ）；配列番号８３（ＴＶＫＩＷＥ）；配列番号８４（ＳＶＫＩＷＥ）；および配列番号８５（ＳＶＫＩＷ）に到達し得る。
【００４７】
これは、本明細書中に記載される種々のアゴニストにより産生され得るアンタゴニストの網羅的な列挙ではないことが、理解される。本明細書中で記載されるそれぞれのＰＫＣアイソザイムについてか、および／または当該分野で公知の、他の特定の他の類似のＰＫＣアゴニスト配列または代替のΨＲＡＣＫ配列は、本明細書中に記載される方法を使用して改変され得、ＰＫＣアンタゴニストを産生する。方法論は、本明細書中に記載される特定の置換を超えて広がることが、本明細書中の記載から理解される。ペプチド中の負に荷電したか、または正に荷電したアミノ酸残基の、極性の非荷電アミノ酸残基との置換は、ペプチドまたはペプチド模倣物の活性における変化を提供するように企図され、極性の非荷電アミノ酸の、正または負に荷電したアミノ酸との置換もまた、同様である。正に荷電したアミノ酸の、負に荷電したアミノ酸との置換、および、負に荷電したアミノ酸の、正に荷電したアミノ酸との置換もまた、想定される。正に荷電したアミノ酸としては、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。選択したアミノ酸について置換可能である、極性の非荷電アミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。これらのアミノ酸は、少なくとも生物学的ｐＨ（例えば、約ｐＨ７）で前述の電荷を有することが期待される。したがって、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され得る。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、リジンまたはアルギニンで置換され得る。セリンおよびスレオニンは、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギンで置換され得る。
【００４８】
本明細書中に記載されるＰＫＣペプチドアゴニストまたはペプチドアンタゴニストは、当業者に公知の方法により得られ得る。例えば、このタンパク質アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、当該分野で公知の種々の固相合成技術ならびに、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐａｕｌ Ｌｌｏｙｄら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９７）に記載されるような技術を使用して化学合成され得る。さらに、ペプチドを、ペプチド模倣物へ変換する方法もまた、当業者に周知である。
【００４９】
あるいは、タンパク質アゴニストまたはタンパク質アンタゴニストは、当業者に周知の組換え技術、ならびに例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｏｂｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ（１９９８）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら．，編．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（これは、規則的に、かつ周期的にアップデートされる）に記載されるとおりの技術により作製され得る。例えば、発現ベクターは、所望されるペプチドアゴニストまたはペプチドアンタゴニストを、適切な宿主細胞中で産生するために使用され得、次いで、この生産物は、公知の方法により単離され得る。この発現ベクターは、例えば、所望されるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで、このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に作動可能に連結される。
【００５０】
本明細書中で定義される場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的関係のある位置に置かれる場合、別のヌクレオチドに「作動可能に連結」される。例えば、コード配列が、プロモーター配列に作動可能に連結される場合、これは、一般に、プロモーターがコード配列の転写を促進し得ることを意味する。作動可能に連結されたとは、連結されたＤＮＡ配列が、代表的に近接し、そして、２つのタンパク質コード領域に結合し、近接し、そして読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、数キロ塩基対までプロモーターから離れ、そしてイントロン配列が、可変長の中に存在し得る場合に、機能し得ることから、数ヌクレオチドの配列は、連結され得るが、近接しない。さらに、本明細書中で定義される場合、ヌクレオチド配列は、天然のまたは合成のヌクレオチドおよび／もしくはヌクレオシドの直線かつ連続したアレイ、ならびにその誘導体を指すことが意図される。用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードすること（ｃｏｄｉｎｇ）」とは、ヌクレオチド配列により、転写および翻訳の機構を介して、その情報を、細胞に提供し、その情報から、一連のアミノ酸が、特定のアミノ酸配列へと組み立てられて、ポリペプチドを産生するプロセスをいう。
【００５１】
アゴニストまたはアンタゴニストは、天然のアミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、または非天然のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を含み得る。ペプチド中のアミノ酸は、ペプチド結合により連結され得るか、または改変されたペプチド（本明細書中に記載されるペプチド模倣物が挙げられる）においては、非ペプチド結合により連結され得る。
【００５２】
アミノ酸を連結するアミド結合に対する多種多様な改変が、なされ得、そしてこれは当該分野において公知である。このような改変は、一般的な論評（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５５３（２００３），およびＲｉｐｋａ，Ａ．Ｓ．，Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１（１９９８））で議論される。これらの改変は、２つの方法の内の一方でペプチドの性質を改善するために設計される：（ａ）立体配座の柔軟性を制限することにより、ペプチドの効力を増加させる；（ｂ）非分解性の部分をペプチドに導入することにより、ペプチドの半減期を増加させる。
【００５３】
ストラテジー（ａ）の例としては、アミド結合の窒素またはα炭素上にさらなるアルキル基を配置すること（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎらのペプトイドストラテジー）、および、例えばＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．らのα改変（Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３（１９９６））が、挙げられる。アミドの窒素およびα炭素は、ともに連結されて、さらなる制限を提供し得る（Ｓｃｏｔｔら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．６：１６２９−１６３２（２００４））。
【００５４】
ストラテジー（ｂ）の例として、アミド結合の、例えば、ウレア残基（Ｐａｔｉｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：７２７４−７２８０（２００３））、またはアザ−ペプチド連結（ＺｅｇａおよびＵｒｌｅｂ，Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓｌｏｖ．４９：６４９−６６２（２００２））による置換が挙げられる。他の例もまた周知である：例えば、銀にさらなる炭素（「ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１：１７３（１９９８））、またはエテン単位（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））を導入すること、またはヒドロキシエチレン部分の使用（Ｐａｔａｎｉ，Ｇ．Ａ．，Ｌａｖｏｉｅ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：３１４７−３１７６（１９９６））。１つ以上のアミノ酸は、等配電子の部分（例えば、ピロリノン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１１０３７（２０００））、またはテトラヒドロフラン（Ｋｕｌｅｓｚａ，Ａ．ら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．５：１１６３（２００３）））により置換され得る。
【００５５】
本発明のさらに別の局面において、インビトロまたはインビボにおいて、ＰＫＣアンタゴニストを投与することにより、ＰＫＣ酵素（例えば、εＰＫＣ）の活性を調節する方法が、提供される。ＰＫＣアンタゴニストは、ぺプチド（すなわち、アミノ酸配列）、またはそのペプチドの作用に刺激するように選択されたペプチド模倣物の有機分子であり得る。例として、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣ酵素をＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、ここでこのペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、そしてここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。使用に適切なこのアゴニストペプチドは、本明細書中で以前に記載されているとおりである。アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換しやすいアミノ酸置換もまた、本明細書中で以前に記載されている。
【００５６】
本発明のさらに別の局面において、ＰＫＣ酵素により調節される状態を処置する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のペプチドまたはペプチド模倣物を、それらを必要とする患者へ投与する工程を包含し、このペプチドまたはペプチド模倣物は、対応するＰＫＣアイソザイムの拮抗性の調節因子として作用する。１つのＰＫＣアンタゴニストまたはＰＫＣアンタゴニストとの組み合わせが、投与され得る。このようなアンタゴニストは、本明細書中で以前に記載されたアンタゴニストである。
【００５７】
ＰＫＣにより調節される多種多様な疾患または状態は、処置され得る。本明細書中で処置される疾患または状態は、代表的に、それぞれのＰＫＣアイソザイムの活性の増加に関連する疾患または状態であり、そしてＰＫＣアンタゴニストの投与から恩恵を被る。１つの例として、種々の炎症性疾患および線維症疾患は、εＰＫＣの活性の増加に関連している（Ａｋｓｏｙ，Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３６：１８３−１８８（２００４）；Ｆａｎｇ，Ｑ．ら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２４：９１８−９２４（２００４））。
【００５８】
したがって、εＰＫＣアンタゴニストを用いた処置に影響を受けやすい状態としては、例えば、線維症疾患（肺線維症または強皮症）、および炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、アレルギー性鼻炎が挙げられる）；肺疾患（慢性閉塞性肺疾患およびぜん息が挙げられる）；自己免疫疾患（多発性硬化症、ギャン−バレー症候群、乾癬、グレーブス病、慢性関節リウマチが挙げられる）、および免疫媒介性の糖尿病（１型真性糖尿病が挙げられる）が挙げられる。
【００５９】
本明細書中に記載されるインヒビターは、融合タンパク質の一部となることにより改変され得る。この融合タンパク質は、ペプチドインヒビターの細胞内摂取を増加させるように機能するタンパク質またはペプチドを含むか、別の所望される生物学的効果（例えば、治療効果）を有するか、あるいはこれらの機能の両方を有し得る。例えば、εＰＫＣまたは他のペプチドアンタゴニストもしくはペプチド模倣物アンタゴニストを、サイトカインまたは所望される生物学的応答を誘発する他のタンパク質に共役するか、あるいはそうでないなら付着することが、所望であり得る。この融合タンパク質は、当業者に公知の方法により産生され得る。このインヒビターペプチドは、当該分野で公知の種々の手段で、別のペプチドへ結合されるか、またはそうでないなら、共役され得る。例えば、インヒビターペプチドまたはインヒビターペプチド模倣物は、架橋を介して、キャリアペプチドまたは本明細書に記載される他のペプチドに結合され得、ここで、融合タンパク質の両方のペプチドは、その活性を保持する。さらなる例として、このペプチドは、一方のぺプチドのＣ末端から他方のペプチドのＮ末端へのアミド結合により、互いに連結され得るか、またはそうでないなら共益され得る。インヒビターぺプチドと、融合タンパク質の他のメンバーとの間の連結は、ペプチド結合により切断不可能であるか、あるいは、例えば、エステルまたは当該分野で公知のほかの切断可能な結合により切断可能であり得る。
【００６０】
さらに、本発明の他の形態において、ペプチドアンタゴニストの細胞内摂取を増加し得るキャリアタンパク質またはペプチドは、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来の配列（配列番号９１（ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）で示される）であり得、そしてＮ末端のＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を介する架橋によるインヒビターへ結合され得る（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８−７１６７（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ ７９：１０８６（１９９６）において議論される）。あるいは、インヒビターは、１型ヒト免疫不全ウイルス由来のトランス活性化調節タンパク質（Ｔａｔ）由来の輸送ポリペプチド（例えば、配列番号９２に示されるＴａｔのアミノ酸４７〜５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ））（Ｖｉｖｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２：１６０１０−１６０１７（１９９７）、米国特許第５，８０４，６０４号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＴ４８０７０に記載される）、あるいは、ポリアルギニン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５６：３１８−３２５（２０００）およびＲｏｌｈｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：１２５３−１２５７（２０００）に記載される）により改変され得る。このインヒビターは、インヒビターの細胞摂取を増加するために、当業者に公知の他の方法により改変され得る。
【００６１】
このインヒビターは、種々の形態で有利に投与され得る。例えば、このインヒビターは、溶液または懸濁液中で舌下投与のために錠剤形態で投与され得る。このインヒビターはまた、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルと混合され得る。このキャリアは、例えば非経口投与に適切な液体（水、生理食塩水、または他の水溶液が挙げられる）であっても、油であってもよい。このキャリアは、静脈内投与または関節内投与のために選択され得、そして、当該分野で公知の防腐剤、静菌剤、緩衝液および抗酸化剤を含有し得る、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液を含み得る。錠剤形態において、固体キャリアとしては、例えば、ラクトース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、カルシウム、ホスフェート、炭酸カルシウム、合成カルシウムまたは天然カルシウムの割り当て、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、乾燥酵母、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。この錠剤は、好ましくは、口内での溶解を補助する１つ以上の薬剤を含む。このインヒビターはまた、当該分野で公知の他の類似の薬物が投与される形態で投与され得る。
【００６２】
このインヒビターは、種々の経路により患者へ投与され得る。例えば、このインヒビターは、非経口（腹腔内、静脈内、関節内、皮下、または筋肉内が挙げられる）で投与され得る。このインヒビターはまた、粘膜表面（直腸内、および膣内が挙げられる）；鼻内（吸入が挙げられる）；舌下；眼内および経皮により投与され得る。これらの投与経路の組み合わせもまた、想定される。
【００６３】
治療有効量のεＰＫＣまたは他のインヒビターペプチドが、提供される。本明細書中で使用される場合、インヒビターの治療有効量は、特定の疾患または状態に付随する症状を減少させるか、あるいは排除するために必要とされるインヒビターの量である。このような臨床エンドポインド（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）は、多種多様な疾患または状態について当該分野で周知である。この量は、それぞれのＰＫＣ酵素の活性を調節する（例えば、減少する）のに有効な量を含む。例えば、治療有効量は、ＰＫＣ酵素の細胞内活性（キナーゼ活性、ＰＫＣ酵素転位活性が挙げられる）に影響を及ぼし、そして／または、その他にＰＫＣがその生物学的機能を果たすことを防ぐのに有効な量を含む。この量は、当該分野で公知の投与経路、処置期間、使用される特定のインヒビター、特定の疾患または状態、および患者の健康に依存して変動する。当業者は、最適な投薬量を決定することができる。一般に、代表的に利用されているインヒビターの量は、例えば、体重１ｋｇあたり約０．０００５ｍｇ〜約２０ｍｇであるが、好ましくは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００６４】
処置されるべき患者は、代表的には、このような処置を必要とする患者（ＰＫＣアンタゴニストでの処置に影響を受けやすい特定の疾患または状態により影響を受ける患者が挙げられる）である。患者は、さらに代表的には、脊椎動物、好ましくは哺乳動物（ヒトが挙げられる）である。処置され得る他の動物としては、家畜（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシおよびブタ）が挙げられる。処置され得る他の例示的な動物としては、ネコ、イヌ；げっ歯類（げっ歯目のげっ歯類が挙げられる（例えば、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、およびモルモット））；ウサギ目のメンバー（ウサギおよびノウサギが挙げられる）、およびこのような処置から恩恵を受け得る任意の他の哺乳動物が挙げられる。患者は、好ましくは、インビボで処置される。
【００６５】
したがって、ＰＫＣペプチドアンタゴニスト（本明細書中に記載されるεＰＫＣアンタゴニストが挙げられる）は、εＰＫＣの転位、または他の活性に関する状態の処置のために治療剤としての用途が発見される。ＰＫＣアンタゴニストの投与は、例えば、転位およびその後のシグナル伝達事象のカスケードを阻害する。アンタゴニストはまた、虚血および他の状態におけるＰＫＣアイソザイムの効果に対する研究において、用途が発見され、そしてまた、拮抗活性を有するか、またはペプチドの模倣物として作用する治療剤の設計において、スクリーニングの補助として使用され得る。
【００６６】
ここで、上記の本発明を例示する特定の実施例に対して、参照がなされる。実施例は、好ましい実施形態を例示するために提供され、これにより本発明の範囲に対する限定が意図されないことが理解されるべきである。さらに、本明細書中で引用された全ての文書は、当該分野における技術レベルを表しており、その全体が、本明細書により参考として援用される。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
（心筋細胞に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
（Ａ．ペプチドの調製および細胞への送達）
以下のペプチドを、従来の技術により、合成し、そして精製した（９５％より高く）：
ΨεＲＡＣＫ（配列番号３、ＨＤＡＰＩＧＹＤ、εＰＫＣアミノ酸残基８５−９２）；
Ｎ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号５５、ＨＮＡＰＩＧＹＤ）；
Ａ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号７９、ＨＡＡＰＩＧＹＤ）；
εＶ１−２（配列番号８６、ＥＡＶＳＬＫＰＴ；εＰＫＣアミノ酸残基１４〜２１、そして米国特許第６，１６５，９７７号に記載される）；
ΨβＲＡＣＫ（配列番号７、ＳＶＥＩＷＤ、βＰＫＣアミノ酸２４１−２４６）。
【００６８】
このぺプチドは、未改変であるか、あるいは、Ｎ−末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介してＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来のキャリアペプチド（配列番号６，Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０，（１９９４）；Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８１８８−１８１９３，（１９９６）；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８−７１６７，（１９９５））に架橋したかのどちらかであった。このキャリアペプチド（配列番号６）を、コントロールペプチドとして使用した。
【００６９】
一次心筋細胞培養物（９０〜９５％純度）を、前述のように新生児ラットから調製した（Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０９４５−３０９５１，（１９９７）；Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．−Ｈ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２１０：２８７−２９７，（１９９４））。ペプチド（適用された濃度は１００ｎＭ〜１μＭ）を、コントロールとしての見せ掛けの透過とともに、一過性の透過により細胞内に導入するか（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６−１０９９，（１９９６））、あるいは、コントロールとしてキャリア−キャリアのダイマーとともに、キャリア−ペプチドの結合体として細胞内に導入した（３０ｎＭ〜１μＭ）（Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，前述（１９９４）；Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，前述（１９９６）；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら，前述（１９９５））。
【００７０】
細胞を、ペプチドの非存在下、または存在下で１０〜２０分間処理し、次に、１ｎＭ ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてか、または用いずに１０分間または２０分間さらにインキュベートした。あるいは、細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡ（ポジティブコントロール）を用いて１０分間インキュベートするか、またはＰＭＡの非存在下でインキュベートした。
【００７１】
（Ｂ．心筋細胞の収縮頻度の測定）
心筋細胞の収縮頻度の測定を、実質的に以前に記載されたとおりに実施した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４９６２−２４９６６，（１９９６））。簡単に述べると、３５ｍｍプレート上で培養した心筋細胞を、３７℃において、温度調節装置（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．）に置き、そして倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）のステージ上に配置した。１つの顕微鏡内の視野において、４つの細胞の収縮頻度を、２分間ごとに各々１５秒間定量した。基底収縮頻度（約３００ビート／分）は、長い時間にわたり、安定であった。
【００７２】
（結果）
上記のように、配列番号１〜５により表されるペプチドを、合成し、そして精製した。詳細には、ΨεＲＡＣＫ（配列番号３、ＨＤＡＰＩＧＹＤ）、 Ｎ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号５５、ＨＮＡＰＩＧＹＤ）、Ａ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号７９、ＨＡＡＰＩＧＹＤ）；εＶ１−２（配列番号８６、ＥＡＶＳＬＫＰＴ）；ΨβＲＡＣＫ（配列番号７、ＳＶＥＩＷＤ）を、調製した。これらのペプチドを、改変しないか、あるいは、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメイン由来のキャリアペプチド（配列番号８１、Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）に架橋した。
【００７３】
配列番号３、配列番号５５および配列番号７９のペプチドを、新生児ラットから調製した心筋細胞培養物内に、コントロールとしての見せ掛けの透過とともに、一過性の透過により導入するか、あるいは、コントロールとしてキャリア−キャリアのダイマーとともに、キャリア−ペプチドの結合体として導入した。この細胞を、ペプチドの非存在下、または存在下で１０〜２０分間処理し、次に、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてか、または用いずに１０分間または２０分間さらにインキュベートした。あるいは、細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡを用いて１０分間インキュベートする（ポジティブコントロール）か、またはＰＭＡの非存在下でインキュベートした。ペプチドおよび／またはＰＭＡの効果を、実施例１Ｂに記載されるように、筋細胞の収縮頻度を測定することにより、決定した。
【００７４】
図１Ａは、ΨεＲＡＣＫで処理し（三角形）、およびコントロールペプチドで処理し（正方形）、次に、実験の開始から約３０分後に培地に添加されたＰＭＡでのインキュベーションについての結果を示す（ＰＭＡの添加を、図１Ａのグラフ上の矢印により示す）。細胞に対するΨεＲＡＣＫペプチドの適用から約１０分後、コントロール細胞と比較して心筋細胞の収縮頻度の減少が誘導された。ΨεＲＡＣＫの存在下で観察された減少は、ＰＭＡの添加によりかなり増強された。このことは、心筋細胞の収縮頻度の減少を誘導することが公知である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２４９６２（１９９６））。
【００７５】
図１Ｂは、新生児ラットの心筋細胞の収縮頻度の減少％を示す。この減少％は、細胞の基底収縮頻度に対するものであり、この細胞は、１分間あたり約３００ビートで自然に、かつ安定にうつ。ΨεＲＡＣＫペプチドで処理した細胞は、ペプチド添加の２０分後に、コントロールペプチドで処理した細胞についての２±１％と比較して、収縮頻度において、ΨεＲＡＣＫについての基底頻度から９±２％の減少を有した。ＰＭＡとともにΨεＲＡＣＫで処理した細胞は、基底収縮頻度から４４±６％の減少を経験し、対して、ＰＭＡ単独での処置は、わずか１１±４％の減少を引き起こした。
【００７６】
引き続き図１Ｂを参照して、細胞を、εＰＫＣ特異的インヒビターペプチド（εＶ１−２）で処理して、収縮頻度に対するΨεＲＡＣＫの効果は、その能力に起因してεＰＫＣの転位を誘導し、そこから、誘導する場合に、εＰＫＣ選択的転位インヒビターが、転位を阻害するか否かを、決定した。実際には、図１Ｂに示すように、心筋細胞の収縮に対するΨεＲＡＣＫの効果を、εＰＫＣ特異的インヒビターペプチドεＶ１−２の事前の適用により、無効にした。さらに、ΨεＲＡＣＫ効果が、εＰＫＣの触媒活性の増加に起因する場合、この効果は、触媒活性のインヒビターにより無効にされるはずである。示されるように、非選択的ＰＫＣインヒビターのケレリスリン（ｃｈｅ）が、ΨεＲＡＣＫにより誘導される調律運動の変化（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ）を阻害した。これらのデータは、新生児の心筋細胞における陰性の調律運動の変化を誘導するために、εＰＫＣ活性化が必要とされ、そして誘導するのに十分であることを、実証する。
【００７７】
図１Ａ〜１Ｂにおける結果は、ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞における収縮頻度の抑制を刺激することを確実にする。この方法論は、εＰＫＣの転位に対して、他のペプチドおよびペプチド模倣物の効果を定量するための手段を提供する。このようにして、配列ＨＮＡＰＩＧＹＤ（配列番号５５）を有するペプチドを設計し、Ｎ−ΨεＲＡＣＫとして、本明細書中で参照する。この配列は、アスパラギン酸（Ｄ）（負に荷電したアミノ酸）を、アスパラギン（Ｎ）（極性の非荷電アミノ酸）へ置換することを除いて、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ、配列番号３）と同一である。心筋細胞の収縮頻度に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果を、研究した。その結果を、図２Ａ〜２Ｃに示す。
【００７８】
図２Ａは、コントロールペプチド（正方形）、またはＮ−ΨεＲＡＣＫ（菱形）での処理後の時間の関数として、新生児ラットの心筋細胞の収縮頻度を示す。上および実施例１において議論するように、収縮頻度を、基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現する。ΨεＲＡＣＫと対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した細胞の収縮頻度は、図２Ａ〜２Ｂに提示されるデータの最初の２０分間の間（ＰＭＡ処理の前）、コントロールペプチドで処理した細胞とほとんど等しかったという事実に見られるように、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞の収縮頻度に対する拮抗効果を有さなかった。この細胞を、ペプチド処理から約２０分後に、ＰＭＡで処理し、図２Ａ〜２Ｂに見られるように、約２０分間より長い時間において、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、εＰＫＣのアンタゴニストとして作用した。すなわち、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ＰＭＡにより誘導される収縮頻度の減少を軽減することができた。図２Ｂに見られるように、ΨεＲＡＣＫは、５ｎＭ ＰＭＡにより誘導される収縮頻度の減少を軽減した。本明細書中には示さない研究において、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、１０ｎＭ ＰＭＡにより誘導される収縮頻度における減少を、ＰＭＡ添加後４０分間で、４７±３％〜２４±５％軽減した（ｎ＝４；Ｐ＜０．０５）。
【００７９】
図２Ｃは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した心筋細胞（菱形）についての収縮速度の減少％を示す。Ｎ−ΨεＲＡＣＫでの処理から約１５分後、この細胞を、１５分の時点の矢印で示されるように、さらにΨεＲＡＣＫで処理した。１５分の時点でΨεＲＡＣＫで処理したコントロール細胞（三角形）は、収縮頻度において直接的な減少を示した；しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫと、ΨεＲＡＣＫとの両方で処理した細胞は、収縮頻度においてほとんど変化を示さなかった。３０分の時点における細胞のＰＭＡでの処理により、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理しないコントロール細胞において、収縮頻度のさらなる減少を誘導した。しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した細胞は、収縮頻度における１０％未満の減少を有し、このことは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、収縮頻度の減少において、ΨεＲＡＣＫとＰＭＡとの合わせた効果を、ほとんど完全に無効にし得ることを示す。したがって、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞において、εＰＫＣ機能のアゴニストとして作用する。
【００８０】
理論に限定されるわけではないが、ΨεＲＡＣＫおよびＮ−ΨεＲＡＣＫの両方は、εｐＫＣのＲＡＣＫ結合部位に結合することが企図される。ΨεＲＡＣＫは、ＲＡＣＫ結合部位とΨεＲＡＣＫ配列との間の分子内相互作用に逆に干渉することにより、作用し、対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ＲＡＣＫ結合部位とεＲＡＣＫとの間の分子間相互作用に干渉することにより、作用する。ペプチドは、酵素のその基質への接触に影響を及ぼすか、またはεＰＫＣの翻訳後改変（例えばリン酸化；リン酸化は、従来ＰＫＣアイソザイムの活性化および転位を調節する）に影響を及ぼす可能性もある。本明細書中で記載される実施例において、荷電アミノ酸を、非荷電アミノ酸で置換して、内因性アンカータンパク質により厳密に類似するペプチドに到達した。任意の配列についての同属のレセプターの配列は、置換の確認における指針を提供する。
【００８１】
（実施例２）
（εＰＫＣの転位に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
新生児ラットおよび成体ラットの心筋細胞における特異的ＰＫＣアイソザイムの転位を、以前に記載されたように（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：６５４−６６３，（１９９５））、処理した細胞の細胞質ゾル画分および粒子画分のウェスタンブロット分析（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）においてＰＫＣアイソザイム特異的抗体を使用することにより、ペプチド処理後に、評価した。簡単に述べると、ペプチド処理後の細胞を、ホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εＰＫＣでプローブし（図３Ａ）、次にはがし、そして抗αＰＫＣについて再度プローブした（図３Ｂ）。転位％（細胞内のＰＫＣの全量にわたる、粒子画分中のＰＫＣの量）を、図３Ａ〜３Ｂのヒストグラムに示す。
【００８２】
（結果）
ウェスタンブロット解析を使用して、εＰＫＣの、細胞質ゾルから細胞下の粒子画分への転位（ＰＫＣ活性化の特徴）を評価した。Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドまたはΨεＲＡＣＫペプチドを、ＰＭＡの用量（１ｎＭ）の存在下にて、一過性の透過により細胞内へ導入した。実施例２に記載されるように、次いで、この細胞をホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εＰＫＣでプローブした（図３Ａ）。次いで、このブロットをはがし、図３Ｂに示されるように、抗αＰＫＣで再度プローブした。転位％を、細胞のＰＫＣの全量にわたる粒子画分のＰＫＣの量として図３Ａ〜３Ｂにヒストグラムで示す。ウェスタンブロットは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫが、ＰＭＡにより誘導される転位を阻害し、したがって、ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫにより誘導されるεＰＫＣ転位のアンタゴニスト、そしてεＰＫＣ機能のアンタゴニストであることを示す（図２）。
【００８３】
（実施例３）
（虚血からのΨεＲＡＣＫに誘導される保護に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
心筋細胞を、以前に記載された（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７８４（１９９９））とおりに、成体雄ラットから単離した。インキュベーション緩衝液中の筋細胞を、実施例１に記載されたように調製した、ペプチドまたはペプチドの組み合わせで、１５分間処理した。次いで、筋細胞を、窒素で飽和した脱気したインキュベーション緩衝液中で、１分間１０００ｒｐｍにてペレット化し、３７℃にて３時間インキュベーションして虚血を刺激した。細胞の損傷を、トリパンブルーの除去により、３時間後に評価し、損傷を有する細胞％を、以前に記載された（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７８４（１９９９））ように、決定した。
【００８４】
（結果）
ΨεＲＡＣＫ（配列番号１）は、細胞に投与される場合、虚血に対する保護を与える（Ｄｏｒｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７９８（１９９９））。この実施例において、虚血エピソードに曝露された細胞に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果を、評価した。さらに、配列ＨＡＡＰＩＧＹＤ（配列番号３）を有するペプチドを（Ａ−ΨεＲＡＣＫと称される）を調製して、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ；配列番号３）におけるアスパラギン酸残基（Ｄ）の変化の効果を決定し、そこから、この残基が、アゴニストとしてのペプチドの作用に重要である場合、そのアラニン（Ａ）（非荷電の、非極性アミノ酸）への置換により、ペプチドを不活性にさせるはずである。心臓の保護に対するこのペプチドの効果もまた、評価した。この実施例において記載されるように、心筋細胞を、虚血を刺激する前に、ΨεＲＡＣＫペプチド、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド、Ａ−ΨεＲＡＣＫペプチド、εＶ１−２ペプチド、およびこれらのペプチドの種々の組み合わせで処理した。虚血エピソードの刺激の後に、細胞損傷を、トリパンブルー色素排除により、評価した。結果を、図４に示す。
【００８５】
図４は、虚血エピソードから得られた、ラット心筋細胞に対する細胞損傷の％を示す棒グラフである。虚血に供されない筋細胞を、各々の棒の透明な領域で表し、虚血損傷の％を、黒く塗った領域により表す。ＰＫＣ活性に対するコントロールとして、筋細胞を、ケレリスリン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）（ｃｈｅ）およびΨεＲＡＣＫペプチドの組み合わせで処理した。ΨεＲＡＣＫペプチドによる処理は、虚血により誘導される細胞損傷を、６０％まで減少した。しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫおよびＡ−ΨεＲＡＣＫは、虚血に対する応答の効果を有さず、このことは、アスパラギン酸の、アスパラギンまたはアラニンへの変化は、ΨεＲＡＣＫのアゴニスト活性の喪失をもたらすことを示す。さらに、Ｎ−ΨεＲＡＣＫとΨεＲＡＣＫとの組み合わせは、虚血性の損傷からの保護を無効にした。選択的インヒビター（εＶ１−２）またはＰＫＣ触媒活性のインヒビター（Ｃｈｅ）を用いた、εＰＫＣの阻害は、ΨεＲＡＣＫにより誘導される保護効果を取り消した。Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ΨεＲＡＣＫにより誘導される保護を無効にし、これに対して、不活性なペプチド（Ａ−ΨεＲＡＣＫ）は無効にせず、このことは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、εＰＫＣインヒビターであることを示す。
【００８６】
これらの知見は、１個のアミノ酸置換（εＲＡＣＫ配列に対するΨεＲＡＣＫの類似性を増加する）は、アゴニスト活性の喪失、およびアンタゴニスト活性の取得をもたらすことを示す。ΨεＲＡＣＫペプチドアゴニストは、ＰＫＣの、そのＲＡＣＫまたは脂質との分子間相互作用を変更することなく、ＰＫＣの分子内相互作用に干渉する。さらに、このペプチドを、εＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位の少なくとも一部に曝露し、次いで、εＲＡＣＫにより置換されて、十分な活性を得る。対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドは、ＲＡＣＫ結合部位とΨεＲＡＣＫとの間の分子間相互作用だけではなく、εＰＫＣとεＲＡＣＫとの間の分子内相互作用にも干渉する。εＰＫＣとεＲＡＣＫとの間の相互作用が阻害されることから、転位およびεＰＫＣの機能もまた、結果として阻害される。
【００８７】
（実施例４）
（異なるΨεＲＡＣＫのεＰＫＣ変異体のプロテアーゼ分解に対する感受性）
ΨεＲＡＣＫのＤ８６部位が、ＲＡＣＫ結合部位との分子内相互作用において、係合される場合、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じた状態（ｃｌｏｓｅｄ ｓｔａｔｅ）で存在し得、したがって、タンパク質分解により耐性である。対照的に、Ｄ（８６）Ａ変異体は、開いた立体配座を支持するはずであり得、したがって、タンパク質分解により感受性であるはずである。この仮説を試験するために、昆虫細胞内で発現されたεＰＫＣ Ｗｔおよび変異体を、εＰＫＣについて以前に示したように（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））、エンドペプチダーゼ（Ａｒｇ Ｃ）によりタンパク質分解に供した。Ａｒｇ Ｃによる分解を、全長εＰＫＣの減少によりモニタリングした。
【００８８】
（材料）
制限酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより得た。抗εＰＫＣ Ｖ５抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより得た。
【００８９】
（細胞培養）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞（ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ， Ｓｏｅｂｏｒｇ， Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された）を、ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）、１０％ウシ胎仔血清（米国で認可された、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）、および抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）を補充した、Ｆ−１２（ＨＡＭ）培養混合物の培地に維持した。ＭＣＦ７細胞（Ｊａｍｅｓ Ｆｏｒｄ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの贈与物）を、５％ ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）中に維持した。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養した。昆虫細胞を、２６℃で増殖し、Ｓｆ９細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）および抗生物質を補充したＳＦ９００ＩＩ ＳＦＭ培地、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）で培養した。Ｈｉ５昆虫細胞を、抗生物質を含有するＩｎｓｅｃｔ Ｘｐｒｅｓｓ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養した。
【００９０】
（構築物）
これらの研究において使用したＥＧＦＰ−εＰＫＣ構築物は、ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ，Ｓｏｅｂｏｒｇ，Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された。この構築物は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６５２９３で受託されたヒトεＰＫＣ配列と比較して、２つのアミノ酸置換（Ｑ（３４）ＡおよびＳ（３３６）Ｇ）を含んだ。このクローンの部位特異的変異誘発を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ特定部位変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の指示書に従って使用して実施した。この部位特異的変異誘発について使用したプライマーは：Ｄ（８６）Ｎについて、順方向プライマー（５’−ＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号８７）、および逆方向プライマー（５’−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣ−３’）（配列番号８８）であった。Ｄ（８６）Ａについて、順方向プライマー（５’−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣ−３’）（配列番号８９）、および逆方向プライマー（５’−ＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号９０）であった。εＰＫＣ変異体を完全に配列決定し、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）部位に切断して、ｐＥＹＦＰＣ１およびｐＥＣＦＰ Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に再度ライゲーションすることにより、サブクローン化した。バキュロウイルス発現系における発現について、ＧＦＰ−εＰＫＣを、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩで切断して、インサートを放出し、Ｋｌｅｎｏｗ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で満たし、そしてＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化したｐｖＬ １３９２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化した。これらの研究において使用した、ＰＺｅｏＳＶへクローン化したヒトεＲＡＣＫ構築物は、ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ， Ｓｏｅｂｏｒｇ， Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された。εＲＡＣＫインサートを、Ｓｃａ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＸｈｏ１で切断することにより放出し、Ｋｌｅｎｏｗで端部を平滑にし、そしてＰａｃＧ３Ｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＳｍａ１部位へ再度ライゲーションした。εＲＡＣＫを、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。
【００９１】
（一過性のトランスフェクション）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＨｉ５細胞のトランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造者の指示書に従って、実施した。
【００９２】
（昆虫細胞タンパク質の発現）
バキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞で産生し、全てのタンパク質を、Ｈｉ５細胞で発現した。全ての構築物の発現は、トランスフェクション後７２時間で最適であった。感染されたＨｉ５細胞を、ホモジナイズ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２５Ｍスクロース、１２ｍＭ βＭＥ、およびプロテアーゼインヒビター：ロイペプチン（２５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５μｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ（１７μｇ／ｍｌ）、ＳＢＴＩ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｅ６４（２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ））で溶解した。４９０００ｇにて３０分間スピン後に、可溶性画分を単離し、その上清を、さらに使用するまで、−２０℃にて５０％グリセロール中で保存した。
【００９３】
（Ａｒｇ Ｃタンパク質分解アッセイ）
Ａｒｇ Ｃ消化を、記載されるとおりに実施した（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））。約７０ｎｇのＰＫＣを含有する粗昆虫細胞溶解物（標準（ＰＫＣ（ＰａｎＶｅｒａ））とのウェスタンブロット比較により決定した）を、室温にて、２０μｌのエンドプロテイナーゼＡｒｇ Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ２５ユニット／ｍｌ）を含む５２０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で消化した。アリコートを、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で指定された時点において取り出し、次に抗εＰＫＣ抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
【００９４】
（統計分析）
定量分析について、オートラジオグラフを走査し、そしてＮＩＨ画像化ソフトウェアを使用して定量した。吸光度データの分析を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。統計的有意差を決定するために、ａ１テイル２型のＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ）を使用した。時間の経過による曲線の有意差を、２つの様式のＡＮＯＶＡ試験（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ（登録商標））を使用して決定した。
【００９５】
（結果）
これらの実験条件下で、Ｄ（８６）Ａ変異体は、野生型（Ｗｔ）酵素を比較した場合に、Ａｒｇ Ｃによる分解に対する酵素の感受性を変化しなかったが、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔのいずれよりも、タンパク質分解に対してより有意に耐性であった（図５Ａ、Ｂ）。
【００９６】
（実施例５）
（εＰＫＣ変異体のεＲＡＣＫへの結合）
ＲＡＣＫは、活性なＰＫＣに結合する（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．＆ Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ．Ｓ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：３５−４２（１９９８）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．（公式にはＣｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）１：６９３−７０６（１９９０）。ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が、不活性な閉じた形態（ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｍ）を安定化する場合、この分子内相互作用の親和性の増加または減少は、酵素のそのＲＡＣＫに対する結合能力において、対応する減少または増加を引き起こすはずである。不活性な閉じた形態を安定化する、本明細書中で提案されるΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の親和性の増加または減少が、酵素のそのＲＡＣＫに対する結合能力において、減少または増加を引き起こすかどうかを試験するために、リン脂質（ＰＬ）アクチベーターの存在下および非存在下にて、昆虫細胞で発現するεＰＫＣ（ＷｔおよびΨεＲＡＣＫ変異体）の免疫化されたＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合を、定量した。
【００９７】
（εＲＡＣＫ結合アッセイ）
εＰＫＣまたはＧＳＴ−εＲＡＣＫのどちらかを発現する昆虫細胞を、実施例４に記載されるとおりに溶解した。ＧＳＴ−εＲＡＣＫ １０ｎｇを、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ｂｅａｄ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定し、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ βＭＥ、および０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、全体を洗浄した。次いで、固定したＧＳＴ−εＲＡＣＫを、リン脂質アクチベーター（ＰＬ）（１回の反応あたり１２μｇのホスファチジルセリン、１回の反応あたり４００ｎｇのＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）の存在下または非存在下にて、１００ｎｇのＷｔ、Ｄ（８６）Ａ、またはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣタンパク質を含有する昆虫細胞溶解物の可溶性画分とともに４℃にて１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で全体を洗浄する際に、結合されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶出させ、タンパク質を、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。εＲＡＣＫと相互作用するεＰＫＣの量を、抗εＰＫＣ−Ｖ５抗体を用いて、εＰＫＣについてのウェスタンブロットプローブにより定量した。次いで、ブロットを、抗ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で再度プローブ化し、等量のＧＳＴ−εＲＡＣＫが、各々の結合アッセイにおいて存在することを検証した。この実施例についての全ての他の方法を、例えば、実施例４に記載されるとおりに実施した。
【００９８】
（結果）
ＰＬアクチベーターの非存在下において、Ｄ（８６）ＡεＰＫＣ変異体のεＲＡＣＫへの結合は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ酵素のいずれかの結合よりも、少なくとも２倍大きかった（図５Ｃ、Ｄ）。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ酵素のεＲＡＣＫへの結合は、ＰＬの存在下にて、有意に増加し、これに対して、Ｄ（８６）Ａ変異体のεＲＡＣＫへの結合は、増加しなかった（図５Ｃ、Ｄ）。等しい濃度のＰＬの存在下にて、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔεＰＫＣのいずれかよりも、Ｄ（８６）ＮεＰＫＣのεＲＡＣＫ結合は少なかった。これらの結果は、Ｄ（８６）Ａ変異体のεＲＡＣＫ結合部位は、εＲＡＣＫへの結合についてすでに利用可能であるが、これに対して、この部位は、ＷｔまたはＤ（８６）ＮεＰＫＣの両方で覆われ、活性化の際のみに、結合に対して接近可能である、という予測に一致する。
【００９９】
（実施例６）
（細胞内のεＰＫＣおよびεＰＫＣ変異体の転位の割合）
本明細書中に記載されるΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣのインビトロの研究は、ΨεＲＡＣＫは、不活性な閉じた状態を安定化する分子内相互作用に関するという、本明細書中で提案された仮説を支持する。この仮説をさらに試験するために、刺激に対する応答において、細胞内のΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣの転位の割合を、試験した。転位プロセスの一部は、ΨεＲＡＣＫ部位と、εＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の妨害を必要とする、と本明細書中で仮定した。この分子内相互作用の調節が、εＰＫＣの転位の割合に影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体を、そのアミノ末端に、ＧＦＰタンパク質、ＣＦＰタンパク質またはＹＦＰタンパク質を融合させ、そして、細胞分画法およびリアルタイム画像化法の両方により転位を分析した。
【０１００】
（キナーゼアッセイ）
異なるεＰＫＣ変異体の基質をリン酸化する能力を、Ｋｉｋｋａｗａ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３５：６３６−６４３（１９８６）から改変された方法により、以下の［γ３２Ｐ］ＡＴＰのミエリン塩基性タンパク質への取り込みによりアッセイした。ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を、液体シンチレーションによるか、または免疫沈降実験については、オートラジオグラフィーにより測定した。免疫沈降した酵素のキナーゼ反応について、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、一回の反応あたり０．３μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、一回の反応あたり９μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、一回の反応あたり１２μｇのミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ）および一回の反応あたり５０ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる、２０μｌのキナーゼ反応緩衝液に再懸濁した。必要とされる場合、一回の反応あたり４μｌのリン脂質を添加した。リン脂質を、上記のとおりに調製した。キナーゼ反応を、ＳＤＳサンプル緩衝液を用いて、煮沸して停止した。次いで、サンプルを１２％ ＳＤＳ ＰＡＧＥを進行させ、ニトロセルロースに移して、オートラジオグラフィーに曝露した。次いで、同じニトロセルロースを、抗εＰＫＣ（Ｖ５）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で発展させて（ｄｅｖｅｌｏｐ）、免疫沈降した融合タンパク質の量を検証した。
【０１０１】
（ウェスタンブロットによるＰＫＣ転位の分析）
トランスフェクションから２４時間後の細胞を、以前に記載されたように（Ｓｃｈｅｃｈｔｍａｎ，Ｄ ＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４５：４７０−４８９（２００２））、さらに２４時間、血清を欠乏させ、そしてホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、指定された時間および濃度で、室温にてインキュベートし、その後、分画した。ＰＫＣの分布を評価するために、異なる細胞画分を、ＳＤＳ ＰＡＧＥを進行させ、ウェスタンブロット分析に移し、そして抗εＰＫＣ Ｖ５抗体でプローブした。過剰発現したＧＦＰ−εＰＫＣの溶解物を、約０．２μｇ／ウェルに希釈した。この濃度においては、内因性εＰＫＣは、検出されなかった。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例４に記載されるとおりに実施した。
【０１０２】
（顕微鏡検査および分析）
ＣＨＯ細胞を、カバーガラス上で増殖させ、実施例４に記載されるように、血清を欠乏させた。各々の実験について、細胞を、市販の金属製カバーガラスホルダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に移した。このホルダ内において、カバーガラスは、１ｍｌ浴の底部を構成した。次いで、培地を、細胞外緩衝液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび３０ｍＭ グルコース）で置き換えた。細胞を、細胞外緩衝液中で、ＰＭＡ（１００ｎＭ）またはＡＴＰ（１ｍＭ）のいずれかで、刺激した。ＧＦＰで標識した構築物の蛍光画像を、レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｐａｓｃａｌ，Ｚｅｉｓｓ）の、４８８ｎｍの励起光線を使用して達成し、発光を、５０５〜５５０ｎｍの帯域フィルタを通して収集した。細胞を、１．２開口数（ＮＡ）で４０×Ｚｅｉｓｓ Ｐｌａｎ−ａｐｏ油浸対物レンズを使用して、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ、１００Ｍ）のステージ上で画像化した。ＣＦＰとＹＦＰとの融合タンパク質の２色の画像化について、回転盤Ｎｉｐｋｏｗ共焦点顕微鏡を使用した。４０×油浸Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズ（１．３５ＮＡ）を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察し、ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）および２×２ピクセルビニングで、画像を入手した。ＣＦＰを４４２ｎｍのヘリウム−カドミウムレーザー（Ｋｉｍｍｏｎ）のレーザー光線で励起し、これに対して、ＹＦＰを、５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザー（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ）の光線で画像化した。ＦＲＡＰ実験について、細胞質の局在領域のＹＦＰ標識タンパク質を選択的に光脱色する（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ）するために、５１４ｎｍのＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）の光線を、最大出力（約４００ｍＷ）にて使用した。これらの実験について、６０×油浸対物レンズ（１．４ＮＡ）を、使用した。これらの条件下で、そしてビーム経路に虹彩絞りを配置することにより、約３５μｍ２を測定する細胞質の領域内において、５００ｍｓのＹＦＰ蛍光の８０％の脱色を可能にした。リアルタイム共焦点画像を、ＰＭＡを利用する実験について、２０分間の間１０〜１５秒間ごとに入手し、ＡＴＰで刺激した細胞の場合においては、３分の全継続時間の間、５秒ごとに入手した。各々の時間の連続において、第５の画像の後に、試薬を、細胞チャンバに添加した。一般的な色素の光脱色レベルが１０〜３０％を超えないことを確認する実験において使用されたものと、同じ画像化条件を使用して、コントロール時間経過（ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ）を入手した。全ての画像を、室温で入手した。画像を１２ビットまたは１６ビットのファイルに書き出し、蛍光強度における変化を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）データ分析ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定した。ＰＫＣの転位をモニタリングするために、対象の小さな領域を、各細胞の細胞質内で選択し、蛍光強度値を、バックグラウンド値の減算後に、時間に対してグラフ化し、そして、正規化し、その結果、最初の蛍光値は、１００％であった。３つの独立した実験からの１０〜１５個の細胞の平均を、使用した。統計学的有意性を決定するために、ａ１テイル２型のＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ）を使用した。
【０１０３】
（免疫沈降）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞を、血清を含まない培地中で２回洗浄し、トランスフェクションから１２〜２４時間後に血清を枯渇させた。次いで、細胞を、血清を含まない培地中に約１２時間維持し、その後、実験に供した。細胞を、ホモジネート緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２５Ｍ スクロース、１２ｍＭ β−メルカプトエタノール、ＰＭＳＦ（１７μｇ／ｍｌ）、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（２５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５μｇ／ｍｌ）、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ））で溶解し、そして、１０００×ｇで３０分間遠心分離した。次いで、その上清を、免疫沈降実験のために使用した。免疫沈降を、抗ＧＦＰモノクローナル抗体３Ｅ６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、製造者の指示書に従って実施した。簡単に述べると、溶解物（約２ｍｇ／ｍｌ）を、プロテインＧアガロースビーズ（２５μｌにパックされた容量、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、少なくとも３０分間、前もって清澄化し、そして１０００×ｇで回転した。次いで、この上清を、１μｇの抗ＧＦＰモノクローナル抗体で、少なくとも２時間インキュベートした。次いで、プロテインＧアガロースビーズ（２５μｌパックされた容量）を、溶解物−抗体複合体に添加し、少なくとも２時間インキュベートした（全てのインキュベーションは、４℃にて行った）。その後、ビーズを、緩衝液１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で３回、緩衝液２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で１回、そして緩衝液３（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。キナーゼアッセイについて、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でさらに１回洗浄した。
【０１０４】
（結果）
インビトロキナーゼアッセイにおいて、ＧＦＰ融合タンパク質が、類似の触媒活性を有することは、最初に確認された。図６Ａおよび図６Ｂに見られるように、免疫沈降したＧＦＰ−εＰＫＣ変異体は、活性化の際に、ミエリン塩基性タンパク質を同じ程度までリン酸化した。
【０１０５】
ＷｔおよびΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体は、ホルボールエステルによる活性化に感受性であり、そしてこれらは、活性化の際に、細胞の可溶性画分から、粒子画分へ転位したこともまた、確認された。εＰＫＣ変異体の転位を、２つの異なる細胞株（ＭＣＦ−７およびＣＨＯ）を使用して決定した（ＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した（図６Ｃ）。ＭＣＦ−７細胞を、１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した（図６Ｄ、６Ｅ）。なぜならば、より高い用量のＰＭＡを用いたＭＣＦ−７細胞の刺激は、細胞の分離をもたらすためである）。ＰＭＡで処置した後、細胞を、可溶性画分と粒子画分とに分画し、そしてＧＦＰ−εＰＫＣを、抗εＰＫＣを使用するウェスタンブロット解析により、検出して定量した。１レーンあたり２０ｎｇのタンパク質をロードした場合に、ＧＦＰ−εＰＫＣ融合タンパク質（約１１０Ｋｄａ）のみが検出され、内因性εＰＫＣ（約８０Ｋｄａ）は検出されなかった。全ての変異体は、類似の発現レベルを示した（図６Ｃ〜６Ｅ）。ＰＭＡ処理において、粒子画分中に、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりも、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣでより大きな増加が存在した（図６Ｃ、図６Ｄ）。これは、ＰＫＣの分解に起因せず、εＰＫＣの全量は、活性化の際に変化しなかった。したがって、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体は、触媒的に活性であり、そして細胞の可溶性画分から粒子画分へ転位することにより、ＰＭＡによる活性化に応答した。２つの異なる細胞株を使用して、ＰＭＡで処理した１０分後に、ＷｔまたはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣと比較して、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣは、より粒子画分に転位することが、見出された。
【０１０６】
細胞分画実験は、動力学的な研究には適切でないことから、ＧＦＰ標識を使用して、ＣＨＯ細胞においてリアルタイムの顕微鏡分析により、異なるεＰＫＣの転位速度を追跡した（図７Ａ〜７Ｃ）。εＰＫＣの転位は、細胞末梢における蛍光強度の増加に随伴する、細胞質における蛍光強度の減少として見られた。ＰＭＡにより刺激した場合、全てのεＰＫＣ変異体は、同じ位置（細胞末梢）へ移動した（図７Ａ）。Ｄ（８６）Ａ変異体の細胞末梢への転位は、ＰＭＡ刺激の１分間以内に開始し、これに対して、Ｗｔ酵素の転位は、ＰＭＡ刺激のたった２〜３分後に明らかとなった（図７Ａ、矢印）。対照的に、Ｄ（８６）Ｎ変異体の転位は、刺激のたった５分後に明らかとなった。細胞末梢と細胞質との間の各々のεＰＫＣの分布を示す、代表的な株の強度プロフィールを、異なる時点における代表的な細胞について示す（図７Ｂ）。
【０１０７】
細胞質における蛍光強度の減少量は、細胞末梢における蛍光の増加量に比例した（Ｒａｇｈｕｎａｔｈ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０：９０１−９１２（２００３））。なぜならば、全蛍光強度は、変化しなかったためである。異なるεＰＫＣ酵素の転位を定量的にモニタリングするために、蛍光強度の減少を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＰＭＡ刺激の際に、細胞質領域で測定した。細胞質における蛍光の減少により得られたεＰＫＣ転位の図の比較は、転位速度が、２つの変異体とＷｔ εＰＫＣとの間で有意に異なることを示した（ｐ＜０．０００１；図７Ｃ）。Ｄ（８６）Ａ変異体は、ＷｔまたはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣ変異体のいずれかよりも、より速い速度で転位した。Ｗｔ酵素は、Ｄ（８６）Ａ変異体と同様の安定状態レベル（このレベルにおいて、細胞末梢におけるεＰＫＣのさらなる蓄積は存在しなかった）に到達したが、より遅い速度で到達した。対照的に、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、ＷｔまたはＤ（８６）Ａ変異体のいずれかよりも、より高いレベルの安定状態に到達した。従って、Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりもより速い速度で転位し、そして細胞末梢へ到達したＤ（８６）Ｎ εＰＫＣ変異体の量は、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかの量よりも少なかった。
【０１０８】
（実施例７）
（εＰＫＣ転位の数学的モデリングは、εＰＫＣ転位が、少なくとも２つの工程のプロセスであることを支持する）
異なるεＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の転位の初期プロセスをさらに特徴付けるために、細胞質における蛍光の減少を、数学モデルに当てはめた。
【０１０９】
（数学的モデリング）
数学的モデリングを、異なるεＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の類似のレベルを発現する細胞のデータから、得た。非線形最小二乗回帰分析を、ＥＶｉｅｗソフトウェア（ＱＭＳ）を使用して実施し、微分方程式分析を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＭａｄｏｎｎａＴＭを使用して実施した。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例４および実施例６に記載されるとおりに実施した。
【０１１０】
経時的な蛍光を、ＮａｌｅｆｓｋｉおよびＮｅｗｔｏｎ Ｎａｌｅｆｓｋｉ，Ｅ．Ａ．＆ Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１３２１６−１３２２９（２００１）により以前になされたように一次の指数方程式（１）、および二次の指数方程式（２）を用いた非線形回帰分析により分析した。Ｉ（ｔ）は、時間（ｔ）において細胞質内で観察された分子の濃度であり、Ｃ１〜５は定数である。
【０１１１】
１．Ｉ（ｔ）＝Ｃ１＋Ｃ２ｅ（−Ｃ３（ｔ））
２．Ｉ（ｔ）＝Ｃ１＋Ｃ２ｅ（−Ｃ３（ｔ））＋Ｃ４ｅ（−Ｃ５（ｔ））
Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体の転位プロセスについて、一次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ（図８Ａ）および二次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ（図８Ｂ）を、図８Ａ〜図８Ｄに示す。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣについての残差分析は、同様の結果を示した（データは示さず）。より小さく、かつより等しく分布した誤差を有する優れたフィットを、二次の指数方程式で得たことから、２工程のモデルを採用して、εＰＫＣ転位の最初のプロセスを例示した。第１の工程は、εＰＫＣが開くこと（ｏｐｅｎｉｎｇ）およびΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の崩壊であり、第２工程は、εＰＫＣの膜への結合である（この場合、膜への結合とは、脂質またはタンパク質のいずれかへの結合であり得る）。このプロセスは、以下のとおりに記載される：
【０１１２】
【化１】
ここで、ｋ１は、細胞質内で、εＰＫＣが開く速度であり、ｋ−１は、細胞質内で閉じる速度であり、ｋ２は、εＰＫＣが膜へ結合する速度であり、そしてｋ−２は、εＰＫＣが膜から解離する速度である。二次の指数方程式を使用して、定数Ｃ１、Ｃ３およびＣ５の値を、推定した（表１）。
【０１１３】
（表１は、二次の指数方程式を使用して推定した定数およびｋ１、ｋ−１、ｋ２、ｋ−２について計算した値を示す）
【０１１４】
【化２】
＊Ｄ（８６）Ｎについて、ｋ１＝ｃ５の関係は、妥当ではない。なぜならば、ｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２についての対応する値は、微分方程式を使用したシミュレーションにより得たためである。
Ｃ１の値は、安定状態の細胞質ゾルεＰＫＣのレベルに対応する。次に、この値は、Ｄ（８６）ＡならびにＷｔ εＰＫＣのＣ１およびＣ３について得た値が、統計学的に等しいかどうか、という仮説を決定する。ＷＡＬＤパラメータ検定を使用して、そしてＦ検定およびχｉ−Ｓｑｕａｒｅｄ検定を使用して、それぞれ、０．９および０．７のｐ値を得た。したがって、ＡおよびＤ、Ｃ１についての安定状態レベルは等しいと、仮定した。また、第２工程（膜への結合）は、εＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の間で異なるはずはなく、これは、Ｃ３が、Ｗｔ εＰＫＣとＤ（８５）Ａ εＰＫＣとの両方で等しいと想定した。したがって、安定状態レベル（Ｃ１）は、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣおよびＷｔ εＰＫＣについて等しく、そして第２工程（膜への結合）もまた等しい場合、Ｄ（８６）ＡおよびＤ（８６）Ａ εＰＫＣの両方についてのｋ−１（εＰＫＣの閉じる速度）が無視できることは、もっともらしい。ｋ−１が無視できる場合、以下の方程式（３−５）が適用でき、そしてｋ−２（方程式６）およびｋ２を計算するために使用され得る（表１）。
【０１１５】
３．（Ｃ１／１００）＝ｋ−２／（ｋ２＋ｋ−２）
４．Ｃ３＝（ｋ２＋ｋ−２）
５．Ｃ５＝ｋ１
６．ｋ−２＝［（Ｃ１／１００）（Ｃ３］
Ｉ０（ｔ）が、時間（ｔ）において細胞質内の閉じたεＰＫＣの濃度に等しい場合、Ｉ１（ｔ）が、時間（ｔ）において細胞質内の開いたεＰＫＣの濃度に等しい場合Ｉ２（ｔ）が、時間（ｔ）において膜でのεＰＫＣの濃度に等しい場合、そしてＩ（ｔ）が、時間（ｔ）（Ｉ０（ｔ）＋Ｉ１（ｔ））において細胞質内の開いたεＰＫＣおよび閉じたεＰＫＣの濃度に等しい場合、以下の微分方程式（７−９）が、このモデルを記載するために使用され得る。
【０１１６】
７．ｄＩ０（ｔ）／ｄｔ＝−（Ｋ１）（Ｉ０（ｔ））＋（Ｋ−１）（Ｉ１（ｔ））
８．ｄＩ１（ｔ）／ｄｔ＝−（Ｋ−１＋Ｋ２）ｌ１（ｔ）＋（Ｋ１）（Ｉ０（ｔ））＋（Ｋ−２）（Ｉ２（ｔ））
９．ｄＩ２（ｔ）＝−（Ｋ−２）（Ｉ２（ｔ））＋（Ｋ２）（Ｉ１（ｔ））。
【０１１７】
次に、この微分方程式を、Ｒｕｎｇｅ−Ｋｕｔｔａアルゴリズム（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ−Ｍａｄｏｎｎａ）を使用してＩ（ｔ）についての解を導き、そしてこの解を、実験データ（細胞質における蛍光の消失）と比較した。Ｉ（ｔ）の解を導き、そして計算したパラメータを、ｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２について使用し（表１）、細胞質内の（閉じたεＰＫＣの初期量は、１００％［Ｉ０（０）＝１００］に等しいと想定した。図８Ｃは、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣについての未加工のデータの曲線と二次の指数方程式を用いた非線形回帰分析により得た曲線との間のフィットを示す。図８Ｄは、Ｄ（８６）Ａについての未加工のデータの曲線とＩ（ｔ）についての微分方程式を解くことにより得た曲線との間のフィットを示す。同様のフィットの結果が、Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣについて得られた（データは示さず）。全ての曲線のフィットデータについての残差は、二次の指数方程式を使用する非線形回帰分析により得た残差と類似した（図４Ｂ；データは示さず）。
【０１１８】
Ｄ（８６）Ｎについての安定状態レベルは、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔのいずれかについてよりも高く（表１）、したがって、この変異体についてのｋ−１は、無視できない。この場合において、Ｒｕｎｇｅ−Ｋｕｔｔａアルゴリズムをまた使用して、微分方程式の解を導いた。第２工程（膜への結合）の速度は、εＰＫＣ変異体のいずれについても変更されないはずであることから、ｋ２およびｋ−２の値は、Ｄ（８６）ＡおよびＷｔについて得た値の範囲内にあるはずであることを想定した。本明細書中の実験データおよび数学的モデリングは、ともに、活性化の際に、εＰＫＣの細胞膜への２工程の転位プロセスを示唆する。第２工程は、分子内相互作用から独立しているのに対して、第１工程（本明細書中で酵素が開くことに関することが予測された）は、この分子内相互作用に大きく依存した。
【０１１９】
（実施例８）
（同じ細胞内でのＤ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣの同時のトランスフェクション）
１つの細胞内で、εＰＫＣ変異体の挙動をさらに調査するために、２つの異なるεＰＫＣ構築物を、ＹＦＰまたはＣＦＰのいずれかに融合させて、ＣＨＯ細胞内へ同時にトランスフェクトした。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２０】
（結果）
ＹＦＰ−ＡおよびＣＦＰ−Ｄ εＰＫＣを、同様のレベルで同時に発現する代表的な細胞を、図９Ａに示す。ＰＭＡを用いた刺激の際に、Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｗｔ酵素より早く転位した（図９Ａ）。細胞質において蛍光強度の減少を表す、定量分析を、図９Ｃに示す。Ｄ（８６）Ａ変異体を、ＰＭＡ刺激から１．５分後に、細胞末梢にて見出し、それに対して、ＷｔεＰＫＣの転位は、１０分後においてさえも最小限であった（図９Ａ）。したがって、Ｄ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣが、同じ細胞内にある場合でさえも、Ｄ（８６）Ａは、Ｗｔ εＰＫＣより早く転位した。
【０１２１】
（実施例９）
（Ｇタンパク質共役レセプターによる細胞刺激の際のΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の転位速度）
次に、ＰＭＡではなく、レセプターのシグナル伝達を介して、転位を刺激する場合に、異なるεＰＫＣの転位速度における差異も観察されるかどうかを、決定した。ＡＴＰを、事前に使用して、プリン性Ｇタンパク質共役レセプターを刺激することにより、ＣＨＯ細胞中のＰＫＣを活性化した（Ｍａａｓｃｈ，Ｃ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１４：１６５３−１６６３（２０００））。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２２】
（結果）
ＡＴＰを用いた刺激の際に、ＧＦＰ−εＰＫＣの細胞末梢への転位は、ＰＭＡにより誘導される転位よりも速いことが、本明細書中で見出された（図９Ｂに対して、図７Ａ〜図７Ｃ）。Ｄ（８６）ＡおよびＷｔ εＰＫＣの転位は、刺激から１０秒後にすでに明らかであるが、Ｄ（８６）Ｎ εＰＫＣ酵素の転位は、刺激の４０秒後におこり、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりもより有意に高いレベルで安定な状態に到達した（図９Ｂ）。細胞質の蛍光強度の減少で表す定量分析を、図９Ｄに示す。
【０１２３】
（実施例１０）
（εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の拡散速度）
異なる転位速度は、細胞のεＰＫＣの全体的な移動（拡散）における差異を反映し得る。したがって、細胞質酵素の光脱色後の蛍光強度の回復（ＦＲＡＰ）を測定した；εＰＫＣの移動を、脱色した領域において蛍光を回復するのに必要な時間をモニタリングすることにより、測定した。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２４】
全てのεＰＫＣについて、５０％のＦＲＡＰが、同じような時点で到達した（それぞれのεＰＫＣあたり少なくとも１０個の細胞の平均は、Ｗｔ＝９．０±１．２秒、Ｄ（８６）Ａ＝９．２±１．１秒、そしてＤ（８６）Ｎ＝９．１±１．６秒であった）。脱色した領域において完全に回復した後の蛍光（Ｆ∞）と、脱色前に観察された蛍光（Ｆｉ）と、脱色直後の蛍光（Ｆ０）を比較することにより、移動画分＝（Ｆ∞−Ｆ０）（Ｆｉ−Ｆ０）を、決定した。移動画分は、Ｗｔおよび変異体εＰＫＣと他のタンパク質および膜との相互作用における差異により影響を受け得ることから、これは、決定するのに重要であった。移動画分は、全てのεＰＫＣについて等しかった（Ｗｔについて６３±２％、Ｄ（８６）Ａについて６３±４％、およびＤ（８６）Ｎについて６４±２．５％、それぞれ少なくとも１０細胞の平均）ことが見出された。したがって、転位速度における差異は、不活性な酵素の移動における差異に起因しないが、むしろ、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の調節に起因した。
【０１２５】
（考察）
シグナル伝達において重要な要素は、細胞外刺激の非存在下において酵素が不活性なままである、固有の機構である。この機構は、活性部位が曝露されない閉じた立体配座を安定化する、分子内相互作用の使用に関する。刺激の際に、酵素は、開いた立体配座を採用し、これにより、分子内相互作用は中断されて、開いた形態を安定化する分子間相互作用のための結合部位が曝露され、触媒的に活性な酵素をもたらす。ＰＫＣの場合において、分子間相互作用部位は、リン脂質およびアンカータンパク質のための結合部位である（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ．Ｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：３５−４２（１９９８）；Ｏａｎｃｅａ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４０：４８５−４９８（１９９８））。本明細書中で、εＲＡＣＫ結合部位およびΨεＲＡＣＫ部位との間の分子内相互作用における変更は、酵素の転位速度に影響を及ぼし、さらに、εＰＫＣの転位およびシグナル伝達におけるこの分子内相互作用の役割を補助することが実証される。
【０１２６】
以前に記載されたように、εＰＫＣにおけるΨεＲＡＣＫ配列は、εＲＡＣＫ配列と約２５％異なる。電荷の変化（Ｎ−Ｄ）は、εＰＫＣとそのＲＡＣＫ（εＲＡＣＫ）との間の分子間相互作用と比較して、εＰＫＣ内の分子内相互作用力価の差異に寄与することを、本明細書中で示唆した（Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎ，Ｍ．Ｃ． ＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９１９−９２４（１９９８）；Ｄｏｒｎ，Ｇ．Ｗ．ら，第２版，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７９８−１２８０３（１９９９））。εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ配列のＤ（８６）をＮへ変異させることで、ΨεＲＡＣＫとεＰＫＣのＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が増加することにおそらく起因する、野生型の酵素よりもよりゆっくりと転位する酵素を、作製した。εＰＫＣのＤ（８６）をＡへと変異することにより、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を無効にし、そして野生型酵素よりもより速い速度で転位する酵素をもたらした。
【０１２７】
（εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ部位の変異は、εＰＫＣの内因性の性質に影響を及ぼす）
３つの基準を使用して、εＰＫＣ内の分子内相互作用におけるΨεＲＡＣＫ部位の役割、およびこの相互作用におけるＤ８６の役割を実証した。第１の基準は、プロテアーゼに対する酵素の感受性であった；開いた酵素は、活性化後のプロテアーゼ分解により感受性であった（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））。Ｄ（８６）Ｎ変異体は、タンパク質分解により耐性であり；Ｄ（８６）Ｎ変異体は、Ｄ（８６）Ａ酵素またはＷｔ酵素のいずれかと同じ程度の分解について２倍の時間を必要とすることが、本明細書中で示された（図５）。したがって、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じているか、または不活性な酵素である。Ａ変異体のタンパク質分解に対する感受性は、野生型Ｄ（８６）εＰＫＣと同じであったことから、この変異体は、野生型酵素と立体配座的に異なるかどうかは、この方法をもちいては、決定できなかった。
【０１２８】
第２の判断基準は、野生型酵素および変異体酵素のεＲＡＣＫへのＰＬ依存性結合を試験した。Ｄ（８６）が、細胞内相互作用のために重要であるなら、Ｄ（８６）Ａは、εＲＡＣＫ結合についての脂質の活性化にそれほど依存しないはずである。実際には、１つのアミノ酸置換は、ΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を調節した；Ｄ（８６）Ｎ変異体は、εＲＡＣＫとより大きな類似性を有し、そしてそのεＲＡＣＫへ結合する能力を減少した。このことは、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じた立体配座であることを示す。対照的に、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体は、ＲＡＣＫ結合についてのアクチベーターにそれほど依存せず、このことはこの変異体が、より開いた立体配座であることを示す。
【０１２９】
（ΨεＲＡＣＫ部位の変異および細胞のεＰＫＣの転位速度）
細胞内相互作用におけるΨεＲＡＣＫ部位の重要な役割を実証する、第３の基準は、細胞の活性化の際に、酵素の転位速度を試験した。Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体は、細胞分画研究により測定すると、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのどちらかよりも、有意に早く転位した。リアルタイム共焦点顕微鏡法を使用して、Ｄ（８６）Ａ変異体は、野生型εＰＫＣよりも速く転位し、次に、Ｄ（８６）Ｎ変異体よりも速く転位することを、本明細書中で実証した。同時に、ΨεＲＡＣＫ部位は、刺激の非存在下において、εＰＫＣの閉じた立体配座を安定化する、重要な分子内相互作用を媒介するようである。
【０１３０】
異なるεＰＫＣ変異体の転位機構についてのスキームを図１０に示す。ΨεＲＡＣＫ部位とεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の崩壊は、膜への結合を促進し、そしてこのプロセスにおける律速段階であるはずである。Ｄ（８６）を変異することにより、この分子内相互作用を調節することは、転位プロセスの第１工程に影響を及ぼすことにより、εＰＫＣの転位速度を変化する。本明細書中のデータの数学的モデリングはさらに、転位を導く分子事象を解明した（図８を参照のこと）。非線形回帰分析を使用して、２次の指数方程式は、１次の指数方程式よりも良好にフィットし、このことは、ＰＭＡにより誘導される転位は、少なくとも２つの工程を含むことを示唆する（図７）。第１の工程は、酵素が開くプロセスおよび閉じるプロセスを表し、そして第２の工程は、細胞膜への開いた酵素の結合を表すことを、本明細書中で提案した。重要なことに、Ｄ（８６）Ｎ変異体の安定状態レベルは、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ ＰＫＣのいずれかのレベルよりも高く、このことは、細胞末梢へ到達したＤ（８６）Ｎの量は、ＷｔまたはＤ（８６）Ａ εＰＫＣのいずれかの量よりも少ないことを示唆する。Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりも、有意により速く転位した。粒子画分におけるＤ（８６）Ａの安定状態レベルは、Ｗｔ酵素の安定状態レベルと同様であり、かつ、転位の第２工程（膜への結合）は、全ての変異体について等しいことから、酵素の閉じる速度は、酵素が一旦開くと、無視できると考えることができた。Ｏｃｈｏａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．３１１：８３７−８４９（２００１））らは、Ｖ１ドメインのＰＬへの結合は、Ｄ（８６）Ａ変異により変更され、このことは、本明細書中で、転位の第２工程（膜への結合）は、変化されないと提案する仮説を支持することを実証した（Ｏｃｈｏａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．３１１：８３７−８４９（２００１））。しかし、Ｎ変異体について、ｋ１（ＰＫＣが開く速度）は、Ｄ（８６）Ａよりも低く、Ｗｔ εＰＫＣに類似し、そしてｋ−１（εＰＫＣが閉じる速度）は、ＰＫＣを無視できなかった。
【０１３１】
Ｓｈｉｒａｉら，（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４３：５１１−５２１（１９９８））と同様に、εＰＫＣのＡＴＰにより誘導される転位は、ＰＭＡに誘導される転位よりも非常に迅速であったことが見出された（図９Ｂ対図７）。ＡＴＰにより媒介される転位は、迅速なプロセスであることから、ＷｔとＤ（８６）Ａ変異体との間の差異は、分析した時間間隔では観察されなかった。しかし、Ｄ（８６）Ｎ変異体の転位は、野生型またはＡ変異体のいずれよりも有意に低く、このことは、εＲＡＣＫ部位の重要性、およびＰＫＣ転位についての分子内相互作用の崩壊を支持した。
【０１３２】
Ｓｃｈａｅｆｅｒらは、古典的ＰＫＣと新規ＰＫＣとの間の転位における差異が、拡散速度、および膜との衝突効率における差に起因することを示唆した（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｍ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５：１６３４−１６３６（２００１）；Ｌｅｎｚ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：２９１−３０２（２００２））。拡散および膜への衝突は、転位速度の要因であるようであるが、本明細書中のデータは、酵素における立体配座の変化もまた生じ、少なくとも２工程のプロセスを導くことを実証する。
【０１３３】
新規ＰＫＣ（カルシウム誘導性）のアイソザイムの場合、酵素の開裂を誘発するものが何であるかは、なお明らかでない。本明細書において、εＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を崩壊することは、転位に先行し、細胞末梢へアンカーする、活性化における重要な工程であることが示されている。このアンカーが、主に膜への結合により媒介されるかどうか、アンカータンパク質に関するかどうか、そして脂質への結合は、タンパク質への結合に先行するかどうかは、εＰＫＣを過剰発現する細胞において決定することができなかった。しかし、内因性εＰＫＣの転位は、そのεＲＡＣＫとの同時局在化をもたらし（Ｃｓｕｋａｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９２００−２９２０６ （１９９７））、そして、εＰＫＣ内のＲＡＣＫ結合部位の１つに対応するペプチド（εＶ１−１ペプチド）を有する細胞内εＲＡＣＫへの結合の崩壊は、εＰＫＣの転位およびεＲＡＣＫとの同時の局在化を阻害する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４９６２−２４９６６（１９９６）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：１１７３−１１７９（２０００））ことが、以前に実証されていた。重要なことに、ΨεＲＡＣＫ配列に対応するペプチドは、εＰＫＣの転位、およびεＲＡＣＫとの同時局在化を誘導し、そして、εＰＫＣの機能を誘発することが、以前に示されている（Ｄｏｒｎ， Ｇ．Ｗ．ら，第２版，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７９８−１２８０３（１９９９））。
【０１３４】
酵素が過剰発現する場合、この研究においては、ＲＡＣＫを含む結合タンパク質は、酵素に対してもはや化学量論的量で存在しないようである。実際には、過剰発現した野生型εＰＫＣおよび内因性εＲＡＣＫは、細胞内に同時に局在せず、それに対して、内因性εＰＫＣは、εＲＡＣＫとともに同時局在し、その後、非トランスフェクト細胞において活性化した（示さず）。εＰＫＣとともにεＲＡＣＫを同時発現する多くの試みが、失敗したことから、本実施例において実施した転位の試験は、おもに、ＧＦＰ−酵素と細胞膜内の脂質との相互作用を主に反映している。
【０１３５】
εＰＫＣにおいて、このＲＡＣＫ結合部位はどこにあるのか。εＰＫＣのＶ１ドメインは、βＰＫＣのＣ２ドメインに対して相同である（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｌ．Ｖ．，ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３９６−４０２（１９９５））。しかし、βＰＫＣ（３０）のＶ５領域にはさらなるＲＡＣＫ結合部位が存在し、βＰＫＣのＣ２領域を用いた分子動力学研究は、ΨＲＡＣＫとＣ２領域内のＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が、不可能であることを示した（Ｂａｎｃｉ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２９８８−１２９９７（２００２））。かわりに、εＲＡＣＫとβＰＫＣのＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用は、βＰＫＣのＣ２領域とＶ５領域との間に起こるようであることが本明細書中で示唆される。これはまた、εＰＫＣについても原因となり得る。近年の研究員および共同研究者により、αＰＫＣにおいてもまた、不活性な状態で酵素を維持する、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインとの間のさらなる分子内相互作用が存在することを実証した（Ｓｌａｔｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５２７７−１５２８５（２００２））。さらに、αＰＫＣは、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインとの間の分子内相互作用を介して、ダイマーを形成することが示唆された。このことが、εＲＡＣＫ結合部位およびΨεＲＡＣＫについてあてはまるという仮説は、排除された（Ｓｌａｔｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５２７７−１５２８５（２００２））。
【０１３６】
インタクトなεＰＫＣのΨεＲＡＣＫ部位を変異させることにより、本明細書中において、εＰＫＣの転位プロセスにおいて、ΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との分子内相互作用の崩壊の重要性が実証された。発明者の知る限りでは、これが、（Ψ−基質）部位、または触媒部位、あるいはカルシウム結合部位の外側でなされた一電荷の変化が、転位速度の変化を誘発した最初である。まとめると、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の相互作用の崩壊は、ＰＫＣ転位の基準であり、律速段階であることが、本明細書中で結論付けられる。
【０１３７】
前述より、本発明の種々の目的および特徴が、いかに満たされるかが明らかになり得る。例えば、アミノ酸残基を置換してアゴニスト中の電荷の変化を達成することにより、ＰＫＣペプチドアゴニストをＰＫＣペプチドアンタゴニストへ変換するための方法（その結果、本発明の１つの形態において、改変されたアゴニストペプチドは、ＲＡＣＫにより類似する）が、記載される。ＰＫＣアイソザイム選択的アンタゴニストおよびアゴニストを同定するために現在使用されるこのアプローチは、多くのタンパク質の一次配列を含む巨大なデータベースの利用可能性から利益を得る。本明細書中で、ペプチドアゴニスト（ΨεＲＡＣＫが挙げられる）を取り扱い、そして１つのアミノ酸残基を置換する（ＤをＮへ）ことにより、アイソザイム特異的転位アゴニストを、アンタゴニストへ変換するためにこのアプローチを使用した。この変化は、ＲＡＣＫ由来の配列に対するペプチドの類似性を増加し、そしてまた、ペプチドの電荷の変化を達成した。心筋細胞収縮速度の調節（ψεＲＡＣＫによって誘導され得るεＰＫＣ媒介性機能）が、上記ψεＲＡＣＫ中のアスパラギン酸（Ｄ）の残基の位置においてアスパラギン（Ｎ−ψεＲＡＣＫ）またはアラニン（Ａ−ψεＲＡＣＫ）を含むペプチドによって誘導されないことを示すことによって、この改変されたペプチドの活性における変化は、本明細書中に記載される実施例において例証される。さらに、Ｎ−ψεＲＡＣＫは、収縮のＰＭＡ調節またはψεＲＡＣＫ調節、ならびにＰＭＡ誘導性εＰＫＣ転位またはΨεＲＡＣＫ誘導性εＰＫＣ転位を阻害した。したがって、電荷の変化を引き起こす単一アミノ酸置換は、上記ＲＡＣＫ配列に対する上記ペプチドの類似点を増加させ、そしてアゴニスト活性の喪失およびアンタゴニスト活性の獲得を生じた。
【０１３８】
本発明は、特定の実施形態について記載されているが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが当業者に対して明白となる。特に指示の無い限り、本明細書中の全ての用語は、本発明の分野における当業者が有する意味と同様の意味を有する。実施者は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ Ｐａ．）（これは、当該分野の定義および用語について定期的かつ周期的に更新される）に対して、特に従う。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１Ａは、新生児ラットの心筋細胞において、コントロール、キャリアペプチド（正方形）、およびΨεＲＡＣＫペプチド（三角形）で処理した細胞における時間の関数として、１５秒間隔で測定した収縮の回数を示すグラフである。両方の細胞集団（コントロールおよびΨεＲＡＣペプチド処理）は、実施例１により十分に記載されるように、３０分間において、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で処理した。図１Ｂは、実施例１により十分に記載されるように、（ｉ）εＰＫＣアゴニストペプチド（ΨεＲＡＣＫペプチド）、（ｉｉ）ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、（ｉｉｉ）ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫペプチド、（ｉｖ）ＰＭＡ、ΨεＲＡＣＫペプチド、およびεＶ１−２ペプチド、または（ｖ）ＰＭＡ、ΨεＲＡＣＫペプチド、およびケレリトリン（Ｃｈｅ）で処理した後に基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現される、新生児ラット心筋細胞の収縮頻度を示す棒グラフである。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、実施例１により十分に記載されるように、時間の関数として、基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現される、新生児ラット心筋細胞の収縮速度のグラフである。図２Ａ〜２Ｂは、ΨεＲＡＣＫペプチド（Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド）由来のεＰＫＣアンタゴニストペプチドで処理されない細胞（四角形）、およびＮ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号２）で処理された細胞（菱形）についてのデータを示す。両方の細胞集合は、ＮΨεＲＡＣＫペプチドの投与後１５〜２０分で、１ｎＭ（図２Ａ）または５ｎＭ（図２Ｂ）のＰＭＡで処理した。そして、図２Ｃは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドで処理し、次いでΨεＲＡＣＫ（配列番号１）および１ｎＭ ＰＭＡで処理した細胞（菱形）、およびΨεＲＡＣＫで処理し、次いで１ｎＭ ＰＭＡで処理した細胞についてのデータ（三角形）を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、コントロール、ペプチドキャリア（レーン番号１）、１ｎＭ ＰＭＡ（レーン番号２）、ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫ（配列番号１、レーン番号３）、あるいは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫ、ΨεＲＡＣＫ、およびＰＭＡ（レーン番号４）で処理した、心筋細胞の細胞溶解性画分（Ｓ）から細胞粒子画分（Ｐ）へのεＰＫＣ（図３Ａ）およびαＰＫＣ（図３Ｂ）へのＰＭＡ誘導性転位のウェスタンブロット分析を示す。これは、実施例２により完全に記載される。
【図４】図４は、虚血エピソードより得られたラット心筋細胞に対する細胞損傷の％を示す棒グラフである。虚血に供されない筋細胞は、各々の棒の白抜きの領域により表し、虚血損傷の％を、塗りつぶした領域により表す。細胞を、虚血エピソード前に、ΨεＲＡＣＫペプチド、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド、Ａ−ΨεＲＡＣＫペプチド、εＶ１−２および実施例３により十分に示されるとおりのこれらのペプチドの種々の組み合わせで、前処理した。
【図５】図５Ａは、実施例４により十分に記載されるとおりに抗εＰＫＣＶ５抗体を使用してプロテアーゼ、Ａｒｇ Ｃにより、ΨεＲＡＣＫ変異体の分解速度を示す、ウェスタンブロット分析を示す。Ｗｔ、野生型；Ｄ（８６）Ａ、εＰＫＣ変異体（ここでεＰＫＣに対するΨεＲＡＣＫの８６位におけるＤは、Ａで置換される）；Ｄ（８６）Ｎ、εｐＫＣ変異体（ここでεｐＫＣにおけるΨεＲＡＣＫの８６位におけるＤは、Ｎで置換される）。図５Ｂは、時間の関数として、Ａｒｇ ＣによるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の分解速度を示すグラフであり、ここでこのデータは、実施例４により十分に記載されるとおりの、５回の独立した実験の平均を表す。データは、酵素の最初の量に対して正規化し、全長εＰＫＣの％として表現する。Ｗｔ（黒い四角形）；Ｄ（８６）Ａ（白い三角形）；Ｄ（８６）Ｎ（白い丸）；＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５。図５Ｃは、実施例５により十分に記載されるように、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体を使用して決定する場合の、ＰＬの存在下および非存在下におけるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体のＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合を示すウェスタンブロット分析である。ＰＬはリン脂質アクチベーター（ホスファチジルセリンおよびＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）である。図５Ｄは、実施例５により十分に記載されるとおりの、ＰＬの非存在下（白い棒）および存在下（黒い棒）におけるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体のＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合についての、（４回の独立した実験の平均の）ＰＫＣ野生型および変異体における結合の正規化を示すグラフである（＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５）。ＰＬはリン脂質アクチベーター（ホスファチジルセリンおよびＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）である。
【図６】図６Ａは、実施例６により十分に記載されるように、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体で検出した、免疫沈降ＧＦＰ−εＰＫＣ変異体のウェスタンブロット分析（パネル上部）、および［γ３２Ｐ］標識ミエリン塩基性タンパク質のオートラジオグラフィーにより測定したその触媒活性（パネル下部、代表的な実験）を示す。図６Ｂは、実施例６により十分に記載されるように、εＰＫＣ野生型または変異体におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）リン酸化のグラフを示す（３回の独立したキナーゼ反応の平均は、ＰＬの存在下にてミエリン塩基性タンパク質リン酸化により見られるように、活性化の際にεＰＫＣ変異体の等しい活性を示す）（反応を３分間および１５分間実施した）。図６Ｃは、実施例６により十分に記載されるように、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体でトランスフェクトし、次に、１００ｎＭ ＰＭＡで１０分間処理したＣＨＯ細胞の転位を示すウェスタンブロット分析である。ＧＦＰ−εＰＫＣは、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体で検出された。図６Ｄは、実施例６により十分に記載されるように、１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激する際に、ＭＣＦ−７細胞におけるＧＦＰ−εＰＫＣ変異体の転位を示すウェスタンブロット分析を示す。図６Ｅは、実施例６により十分に記載されるように、ＰＭＡ刺激後のＷｔ、Ｄ（８６）Ｎ変異体、またはＤ（８６）Ａ変異体における、ＧＦＰ−εＰＫＣの転位のグラフを示す。ＭＣＦ−７コントロール（白い棒）および１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した細胞（黒い棒）における、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫの転位の４回の独立した実験の平均を、図に示す（＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５）。
【図７】図７Ａは、実施例６により十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡでの刺激の際に、異なる時点における、ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の共焦点図を示す。パネル内の矢印は、各々のεＰＫＣ変異体について、細胞末梢への転位が明らかとなった時点を示す。図７Ｂは、実施例７により十分に記載されるように、異なる時点（Ａのラインにより示される、左のパネル）において、代表的なトランスフェクトされた細胞についての、細胞末梢と細胞質との間のＰＫＣの分布を示す、代表的なライン強度プロフィールを示す。図７Ｃは、実施例６により十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡによる刺激後、時間の関数として、Ｗｔ細胞、またはＤ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体、またはＤ（８６）Ｎ ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の細胞質における蛍光％のグラフを示す：Ｗｔ（黒い四角）、Ｄ（８６）Ａ（白い三角）；Ｄ（８６）Ｎ（白い丸）。平均転位速度は、最初の蛍光強度を１００％に正規化することにより表現した（少なくとも３回の独立した実験の平均、各々の実験について少なくとも３個の細胞を分析した）。変異体およびＷｔ酵素についての時間の経過は、ｐ＜０．００１の二元配置ＡＮＯＶＡにより統計学的に互いに異なる。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、実施例７により十分に記載されるように、Ｄ（８６）Ａの数学的モデル分析を示し、ＰＭＡによる刺激後、時間の関数として、蛍光％のグラフ表示して分析した。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣに関して同様の結果が得られた。図８Ａは、一次の指数方程式を用いた非線形回帰分析を示し、図８Ｂは、二次の指数方程式を用いた非線形回帰分析を示し、図８Ｃは、Ｄ（８６）Ａの未加工データの曲線の間のフィットを表すグラフである。この曲線は、二次の指数方程式を用いた非線形回帰により得られた。図８Ｄは、Ｄ（８６）Ａの未加工データの曲線の間のフィットを表すグラフである。この曲線は、表１に提供されるｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２に対する値を使用して微分方程式により得られた。データに適合させた全ての曲線に対する残差は、二次の指数方程式を使用する非線形回帰を用いて得られた残差と類似していた。
【図９】図９Ａは、実施例８においてより十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡでの刺激後の種々の時間での、ＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）ＡおよびＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の共焦点像を示す。図９Ｂは、実施例９においてより十分に記載されるように、１ｍＭ ＡＴＰでの刺激後の時間の関数としての、Ｄ（８６）Ａ変異体およびＤ（８６）Ｎ変異体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の共焦点像を示す。１ｍＭ ＡＴＰを用いた刺激に対して、このＤ（８６）Ａ変異体は、野生型と比較して同等の転位速度を有し、そしてＲＡＣＫ Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より遅い転位速度を有した。矢印は、各々のεＰＫＣ酵素について細胞抹消への転位が明白になり始める時間を示す。図９Ｃは、実施例９においてより十分に記載されるように、Ｄ（８６）ＡおよびＤ（８６）Ｎでトランスフェクトした細胞におけるＰＭＡ刺激後の、時間の関数としての蛍光強度を示す。１ｍＭ ＡＴＰの添加後の時間に比例して細胞質中の蛍光の喪失を測定することにより、転位速度を分析した：Ｗｔ（黒四角形）、Ｄ（８６）Ａ（白三角形）、Ｄ（８６）Ｎ（白丸）。データは、それぞれの実験で少なくとも３つの細胞を用いた少なくとも３回の独立した実験の平均である。Ｄ（８６）Ｎ変異体の時間経過は、ｐ＜０．００１での二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかとは統計学的に異なる。図９Ｄは、実施例８においてより十分に記載されるように、ＡＴＰ刺激後の時間の関数としての、ＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔ（黒四角形）およびＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）Ａ（白三角形）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の蛍光強度を示す。細胞質中のＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）Ａ変異体のレベルは、ＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔのレベルと比較して、より早く減少した。
【図１０】図１０は、活性化に対する膜へのεＰＫＣ転位における最初の段階；実施例の考察の節においてより十分に説明される、２段階の工程を示す画像（ｐｉｃｔｏｒｉａｌ）を示す。転位のプロセスにおけるさらなる工程としては、ＲＡＣＫに対する結合が挙げられる（スキーム中には示さず）。簡単にするために、ΨεＲＡＣＫ結合部位とεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用のみが示される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アゴニストの生物学的作用をアンタゴニストへ変換する方法、特に、プロテインキナーゼＣのアゴニストを、プロテインキナーゼＣのアンタゴニストへ変換する方法に関する。本発明はまた、プロテインキナーゼＣのアイソザイム特異的調節のためのペプチド組成物、およびプロテインキナーゼＣの特定のアイソザイムの作用に拮抗する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プロテインキナーゼＣ（「ＰＫＣ」）は、種々の細胞機能（細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性が挙げられる）に関するシグナル伝達において、重要な酵素である。ＰＫＣファミリーのアイソザイムとしては、少なくとも１１の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、このプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて、少なくとも３つのサブファミリーに分けられ得る。各々のアイソザイムは、アイソザイム固有（「可変」または「Ｖ」）ドメインが散在する、多くの相同（「保存」または「Ｃ」）ドメインを含む。「古典的」または「ｃＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（αＰＫＣ、βＩＰＫＣ、βＩＩＰＫＣ、およびγＰＫＣ）は、４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を含み、そしてカルシウム、ホスファチジルセリン、およびジアシルグリセロールまたはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。「新規」または「ｎＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（δＰＫＣ、εＰＫＣ、ηＰＫＣ、およびθＰＫＣ）において、Ｃ２様ドメインは、Ｃ１ドメインの上位にある。しかし、Ｃ２ドメインは、カルシウムに結合せず、したがって、ｎＰＫＣサブファミリーは、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、「異型」または「αＰＫＣ」サブファミリーのメンバー（ζＰＫＣ、およびλ／ιＰＫＣ）は、Ｃ２ドメインおよびＣ１相同ドメインの半分の両方を欠き、そしてジアセチルグリセロール、ホルボールエステルおよびカルシウムに、感受性である。
【０００３】
ＰＫＣアイソザイムの細胞内分布に対する研究は、ＰＫＣの活性化が、その細胞内での再分布（転位とも称される）をもたらし、その結果、活性化ＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格要素、核および他の細胞内区画と結合することを実証する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。異なるＰＫＣアイソザイムの固有の細胞機能は、細胞内の局在により決定され得る。例えば、活性化βＩＰＫＣは、核の内側に見出され、対照的に、活性化βＩＩＰＫＣは、核周囲および心筋細胞の細胞末梢に見出される（非特許文献４）。εＰＫＣ（カルシウムとは無関係であるが、活性化のためにリン脂質を必要とする、新規ＰＫＣファミリーのメンバー）は、脊髄神経節および脊髄の表層の両方において主要な求心性ニューロンに見出される。
【０００４】
種々のＰＫＣアイソザイムの細胞内の異なる領域への局在は、次に、活性化アイソザイムの、特定のアンカー分子（活性化Ｃキナーゼのレセプター（ＲＡＣＫ）とも称される）への結合に起因するようである。ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムとそれぞれの細胞内部位とを選択的に固定することにより、機能すると考えられる。ＲＡＣＫは、完全に活性化したＰＫＣにのみ結合し、そして必ずしも酵素の基質ではない。そしてまた、このキナーゼの触媒ドメインにより媒介されるＲＡＣＫへも結合しない（非特許文献５）。ＰＫＣの転位は、活性化酵素のＲＡＣＫへの結合を反映し、ＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣにその細胞応答を発生するために必要である（非特許文献６）。インビボにおいてＲＡＣＫに対するＰＫＣの阻害は、ＰＫＣ結合の転位およびＰＫＣに媒介される機能を阻害する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００５】
一般に、ＰＫＣの転位は、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能のために必要である。ＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位を模倣するペプチド（非特許文献８；非特許文献７）は、インビボにて酵素の機能を選択的に阻害する、ＰＫＣのアイソザイム特異的転位インヒビターである。このようなＰＫＣのアイソザイム選択的インヒビターは、活性化アイソザイムと、そのそれぞれのアンカータンパク質（ＲＡＣＫ）との相互作用を選択的に阻害する能力に基づいて同定されている（非特許文献１０）。これらの短いペプチドのインヒビター（７〜１２アミノ酸長）は、個別のアイソザイムの機能に選択的に干渉することが示されている（非特許文献５；非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献１２；非特許文献１４）。
【０００６】
βＰＫＣおよびεＰＫＣ、ならびに他のＰＫＣアイソザイムの転位アゴニストペプチドもまた、同定されている（非特許文献８；非特許文献１４）。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位を模倣するペプチド（非特許文献１５；非特許文献６）は、インビボにて酵素の機能を選択的に阻害する、ＰＫＣのアイソザイム特異的転位アクチベーターである（非特許文献８；非特許文献１５）。これらのＰＫＣ由来の６〜８個のアミノ酸ペプチドは、その対応するＲＡＣＫ内の配列に対して相同であり、したがって、これらは、それぞれ偽βＲＡＣＫ（ΨβＲＡＣＫ）および偽εＲＡＣＫ（ΨεＲＡＣＫ）と称される。ΨβＲＡＣＫまたはΨεＲＡＣＫの細胞内への導入は、対応するアイソザイムの選択的転位を引き起こし、インビトロおよびインビボにおける基質のリン酸化により測定される場合の、その触媒活性を増加する（非特許文献８；非特許文献１４）。アイソザイム（そのＲＡＣＫは、まだ同定されていない（例えば、δＰＫＣおよびθＰＫＣ））のΨＲＡＣＫ配列のＣ２ドメインまたはＣ２様ドメインの位置もまた、転位アゴニストペプチドに対応して見出された（非特許文献１６）。たとえば、ΨεＲＡＣＫの細胞内への導入は、δＰＫＣの選択的転位を引き起こし、その触媒活性を増加する（非特許文献１６）。これらのペプチドはまた、細胞内およびインビボにおいて、βＰＫＣ、δＰＫＣおよびεＰＫＣの役割を同定するために使用されている（非特許文献８；非特許文献１６；非特許文献１４）。
【０００７】
治療の観点から、ＰＫＣの個別のアイソザイムは、種々の疾患状態の機構に関連する。この疾患状態としては、以下が挙げられる：癌（αＰＫＣおよびδＰＫＣ）；心肥大および心不全（βＩＰＫＣおよびβＩＩＰＫＣ）；侵害受容（γＰＫＣおよびεＰＫＣ）；虚血（心筋梗塞が挙げられる）（εＰＫＣおよびδＰＫＣ）；免疫応答（特にＴ細胞媒介性）（θＰＫＣ）；ならびに線維芽細胞増殖および記憶（δＰＫＣおよびζＰＫＣ）。種々のＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドおよび可変領域特異的ペプチドが、以前に記載されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。疼痛の知覚におけるεＰＫＣの役割（特許文献１に最初に記載されたεＰＫＣの選択的インヒビターである、εＶ１−２ペプチドの治療的使が挙げられる）は、近年報告された（特許文献２；特許文献３）。
【特許文献１】米国特許第５，７８３，４０５号明細書
【特許文献２】国際公開第００／０１４１５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，３７６，４６７号明細書
【非特許文献１】Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９年、第８６巻：ｐ．３４０９−３４１３
【非特許文献２】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．およびＨａｌｌ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９年、第１０８巻：ｐ．５５３−５６７
【非特許文献３】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（公式にはＣｅｌｌ Ｒｅｇ．）１９９０年、第１巻：ｐ．６９３−７０６
【非特許文献４】Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９４年，第２１０巻：ｐ２８７−２９７
【非特許文献５】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９１年、第８８巻：ｐ３９９７−４０００
【非特許文献６】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５年、第２６８巻：ｐ．２４７−２５１
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年、第２７１巻：ｐ．２４９６２−２４９６６
【非特許文献８】Ｒｏｎ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５年、第９２巻：ｐ４９２−４９６
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｌ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２年、第１８８巻：ｐ．１２３５−１２４０
【非特許文献１０】Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎ，Ｍ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年、第１６巻：ｐ．９１９−９２４
【非特許文献１１】Ｒｏｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、第２７０巻：ｐ．２４１８０−２４１８７
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９６年、第７０巻（２，第２版）：Ａ３９１
【非特許文献１３】Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、第２７２巻：ｐ．３０９４５−３０９５１
【非特許文献１４】Ｄｏｒｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９年、第９６巻：ｐ．１２７９８−１２８０３
【非特許文献１５】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１年、第２２６巻：ｐ．１４６６−１４６８
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１年、第９８巻：ｐ．１１１４−１１１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＰＫＣアイソザイムは、種々の疾患状態に関連することは明らかであり、そしてヒト疾患を処置するための治療剤を開発するために、特定のＰＫＣアイソザイムの作用を調節する方法についての必要性が存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を別のアミノ酸で置換して、（例えば、置換した位置における電荷を変化させることにより）ペプチドの電子分布を変更すること、そして／または、活性化Ｃキナーゼについてのレセプター（ＲＡＣＫ）タンパク質にのそれぞれの上のプロテインキナーゼＣ結合部位内の配列に、このペプチドがより類似するように変更することは、ＰＫＣ酵素の活性を阻害するために使用され得るＰＫＣアンタゴニストを産生することが発見された。したがって、プロテインキナーゼＣアゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアゴニストペプチド模倣物をプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する。本発明の特定の形態において、このペプチドアンタゴニストは、アンタゴニストが誘導されるアイソザイムの選択的インヒビターである。
【００１０】
本発明のさらに別の局面において、ＰＫＣ酵素の活性を阻害する方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、この酵素をＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、ここで、このペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な、別のアミノ酸で置換される。本発明の特定の形態において、この置換は、置換された残基位置における電荷の変化をもたらす。
【００１１】
処置方法もまた提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはεＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する。この方法は、εＰＫＣ酵素の活性を調節することにより、多種多様の疾患または状態を処置するために使用され得る。
【００１２】
ＰＫＣ拮抗性活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物もまた、提供される。本発明の１つの形態において、このペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。本発明のさらに他の形態において、このペプチドは、本明細書中に示される配列を有する。
【００１３】
ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、プロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
ＰＫＣ酵素の活性を阻害する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
本明細書中に記載されるＰＫＣアンタゴニストを使用する処置方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
εＰＫＣ拮抗性活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
本発明のこれら目的および他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の記述を、添付の図面とともに読むときに、より十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（好ましい実施形態の説明）
本発明の原理の理解を進める目的のために、ここで、好ましい実施形態に対して参照がなされ、特定の用語が、同じものを記載するために使用される。それにもかかわらず、本発明の範囲が限定されないことが意図され、このような本発明の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書中に例示されるこのような本発明の原理のさらなる適用は、本発明に関する当業者に通常想像されるように企図されることが理解される。
【００１９】
本発明は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチドに変換する方法を提供する。ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、このペプチドまたはペプチド模倣物の電子分布が変化され、そして／または、ペプチドまたはペプチド模倣物は、それぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列により近く類似するように別のアミノ酸で置換する工程は、ＰＫＣ酵素の活性を阻害するために使用され得るアンタゴニストを産生することが発見された。１つの形態において、方法は、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物に変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する。本発明のさらに他の形態において、この置換は、異なるアミノ酸を有するペプチドまたはペプチド模倣物を合成するか、あるいは、既存のペプチドまたはペプチド模倣物のアミノ酸を改変し、その結果、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物が、アンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物に変換されることにより、なされ得る。本明細書中のペプチド模倣物は、それぞれのＰＫＣ酵素上の分子間結合部位に選択的に結合する低分子を含む。
【００２０】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣ酵素と、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来のＰＫＣインヒビターペプチドあるいはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物とを接触させる工程を包含し、ここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。
【００２１】
処置方法もまた、提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはこのεＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する。この方法は、εＰＫＣ酵素の活性を調節することにより、多種多様な疾患または状態を処置するために使用され得る。
【００２２】
ＰＫＣ拮抗活性を有するペプチドまたはペプチド模倣物もまた、提供される。本発明の特定の形態において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、ここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。
【００２３】
本発明の１つの局面において、ＰＫＣ酵素アゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣ酵素アンタゴニストペプチドまたはＰＫＣ酵素アンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換する工程を包含する。「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基の鎖からなる化合物をいう。そうではないと指定されない限り、ペプチドについてのこの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で提供される。
【００２４】
この方法は、多種多様なＰＫＣ酵素に適用可能である。上記のように、ＰＫＣ酵素は、その調節ドメインの相同性に基づいて、３つのファミリーに分類される：従来のＰＫＣ（ｃＰＫＣ；α、βＩ、βＩＩ、およびγが挙げられる）、新規ＰＫＣ（ｎＰＫＣ；ε、δ、η、およびθが挙げられる）、および異型ＰＫＣ（ａＰＫＣ；ζ、ιおよびλが挙げられる）。本明細書中で以前に記載されたように、ＰＫＣ酵素について、その生物学的効果を発揮するためには、これらの酵素は、活性化されて、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質へ結合されなければならない。例として、εＰＫＣ結合部位は、εＲＡＣＫ上に存在する（このアミノ酸配列は、配列番号１にＮＮＶＡＬＧＹＤとして示される）。そのそれぞれのＰＫＣ酵素との結合相互作用のためのＰＫＣ結合部位はまた、他のＲＡＣＫ上にも存在する。例えば、ＲＡＣＫ１上のβＰＫＣ結合部位は、ＳＩＫＩＷＤとして配列番号２に示される。この配列は、βＩとβＩＩとの間で同一である。なぜならば、これらは、最後の５０アミノ酸のみ異なり、そしてαＰＫＣおよびγＰＫＣにおいて同一であるからである。本発明の１つの形態において、特定のアゴニスト由来の特定のアンタゴニストを設計する場合、これらの結合部位の配列は、少なくとも１つのアミノ酸が、ペプチドまたはペプチド模倣物をそれぞれのＰＫＣ酵素上のＰＫＣ結合部位により厳密に類似させるようなアミノ酸で置換されることを確実にするために、あるいは、そうでなければ、ペプチドまたはペプチド模倣物の結合部位に対する結合親和性を、増加させるために、適用され得る。本発明のさらに他の形態において、本明細書中に記載されるペプチドアゴニストまたはペプチドアゴニスト模倣物の少なくとも１つの荷電アミノ酸を、非荷電アミノ酸で置換することは、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換すると予測されている。
【００２５】
多種多様なＰＫＣペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物のアゴニストは、改変されても、あるいは、そうでないならＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換されてもよく、結果的に本発明における用途が見い出される。ＰＫＣアゴニストは、少なくとも約４〜約３０アミノ酸の配列、または少なくとも約５〜約１５アミノ酸の配列を含み得る。ＰＫＣアゴニストは、約３０アミノ酸より長い配列から構成され得ることが、理解される。「ＰＫＣアゴニスト」は、本明細書中で、ＰＫＣを活性化して活性化されたＰＫＣを形成し、ＰＫＣがその生物学的機能を実施することを容易にするか、または可能にし、あるいは、ＰＫＣの活性を模倣して、その模倣物がＰＫＣの１つ以上の生物学的機能を実施することを可能にする、化合物を意味する。アゴニストは、例えば、活性化されたＰＫＣが、細胞の特定の領域に転位されて、その結果、その生物学的効果を発揮させ得る。当該分野で公知のように、ＰＫＣの酵素のファミリーは、セリン／スレオニンキナーゼであり、そして、無数の細胞のプロセス（細胞増殖、遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性が挙げられる）に関連する。「ＰＫＣアンタゴニスト」または「ＰＫＣインヒビター」は、本明細書中において、ＰＫＣ酵素を阻害して不活性化ＰＫＣ酵素を形成し、ＰＫＣがその生物学的機能を実施することを予防するか、その予防を容易にし、あるいは、ＰＫＣアンタゴニストの活性を模倣して、その模倣物がＰＫＣの生物学的機能を阻害することを可能にする化合物を意味する。アンタゴニストは、例えば、活性化されたＰＫＣが細胞の特異的な領域に転位されて、その結果、ＰＫＣが、その生物学的機能を発揮することを防ぎ得る。用語「アンタゴニスト」および「インヒビター」は、本明細書中で交換可能に使用されることに注意が必要である。
【００２６】
このようなアゴニストとしては、ｃＰＫＣアゴニスト（例えば、αＰＫＣアゴニスト、βＩＰＫＣアゴニスト、βＩＩＰＫＣアゴニスト、およびγＰＫＣアゴニストが挙げられる）；ｎＰＫＣアゴニスト（εＰＫＣアゴニスト、δＰＫＣアゴニスト、ηＰＫＣアゴニスト、およびθＰＫＣアゴニストが挙げられる）；ならびにａＰＫＣアゴニスト（ξＰＫＣアゴニスト、ιＰＫＣアゴニスト、およびλＰＫＣアゴニストが挙げられる）が挙げられる。それぞれのＰＫＣアゴニストは、各々のＰＫＣ酵素（例えば、ΨαＲＡＣＫ、ΨβＩＲＡＣＫ、ΨεＲＡＣＫ、ΨλＲＡＣＫなど）に存在するΨＲＡＣＫ配列由来であり得る。ペプチドまたはペプチドフラグメントは、そのペプチドが、同一であるアミノ酸配列を有する場合か、あるいはそうでないなら、親ペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列に特定の％の同一性（少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、そして少なくとも約９５％の同一性を含む）を有する場合、親ペプチドまたは親ポリペプチド「由来である」。このような定義は、親ペプチドまたは親ポリペプチドまたは親ペプチド模倣物と比較した場合に、その配列の中に少なくとも１アミノ酸の置換を有する、ペプチドまたはペプチド模倣物を包含する。理論に限定されるべきではないが、これらのΨＲＡＣＫ配列は、本明細書中の実施例においてより完全に考察されるように、ＰＫＣ酵素のそれぞれのＲＡＣＫ結合部位との阻害性の分子内相互作用に少なくとも関連することが見出された。
【００２７】
同一性％は、例えば、高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈより利用可能な、２．２．９版が挙げられる）を使用して、配列情報を比較することにより、決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアライメント方法に基づき、そしてＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）で議論されるとおりである。簡単に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を２つの配列のうち短いのものの記号の全数で除算した同一なアライメントされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数と規定する。このプログラムは、比較されるタンパク質の全長にわたって、同一性％を決定するために使用され得る。例えば、そのプログラムの中のｂｌａｓｔｐにおいて、短いクエリー配列に関する探索を最適化するために、デフォルトのパラメータが提供される。このプログラムはまた、ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムにより決定されるように、ＳＥＧフィルタの使用により、クエリー配列の断片の正体を明らかにすることを可能にする。
【００２８】
多種多様なこのようなΨＲＡＣＫ配列は、様々な種（以下のヒト配列が挙げられる）において当該分野で公知である：例えば、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ，配列番号３）；ΨδＲＡＣＫ（ＭＲＡＡＥＥＰＭ，配列番号４）；ΨθＲＡＣＫ（ＫＧＫＮＶＤＬＩ、配列番号５）；ΨηＲＡＣＫ（ＨＥＴＰＬＧＹＤ、配列番号６）；およびΨβＲＡＣＫ（ＳＶＥＩＷＤ、配列番号７）。ＲＡＣＫ配列は、各々のＰＫＣアイソザイムとそのＲＡＣＫとの相同性領域を探索することにより同定された。εＰＫＣにおいて、例えば、ΨεＲＡＣＫ配列ＨＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号３；εＰＫＣ ８５−９２）は、アミノ酸ＮＮＶＡＬＧＹＤ（配列番号１；εＲＡＣＫ ２８５−２９２）を構成するεＲＡＣＫの配列と、約７５％の相同性を有する。ΨＲＡＣＫ配列に対応するペプチド（εＰＫＣが挙げられる）は、εＰＫＣ選択的アゴニストとして機能する。
【００２９】
このアゴニストは、上記の配列（そのフラグメントまたは改変体を含む）の誘導体であり得る。改変体は、本発明におけるアゴニストとして有利に利用され得るペプチドの誘導体を得るために、アミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む。
【００３０】
保存的アミノ酸置換は、選択されたペプチドまたはポリペプチドの活性（例えば、εＰＫＣアゴニスト活性またはΨεＲＡＣＫアゴニスト活性）または三次構造に有意な変化をもたらさない置換である。このような置換は、代表的に、選択されたアミノ酸残基を、類似の構造、大きさまたは他の物理化学的性質を有する異なる残基で置き換える工程を包含する。例えば、ＧｌｕのＡｓｐへの置換は、保存的置換であるみなされる。なぜならば、この両方は、類似の大きさの、負に荷電したアミノ酸であるためである。物理化学性質なアミノ酸の分類は、当業者に公知である。例えば、以下の群の各々の中のアミノ酸は、同じ群の中のほかのアミノ酸と相互交換可能され得る：脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる）；非芳香族であり、ヒドロキシルを含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；アミド側鎖を有するアミノ酸（グルタミン、およびアスパラギンが挙げられる）；塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる）；芳香族環の側鎖を有するアミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる）；および硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸（システインおよびメチオニンが挙げられる）。
【００３１】
したがって、εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ配列由来の適切なεＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＨＤＡＰＩＧＹＤ（配列番号３）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号８（ＨＥＡＤＩＧＹＤ）；配列番号９（ＨＤＡＰＩＧＹＥ）；配列番号１０（ＨＤＡＰＶＧＹＥ）；配列番号１１（ＨＤＡＰＬＧＹＥ）；配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）；配列番号１３（ＨＤＡＰＩＧＥＹ）；配列番号１４（ＡＤＡＰＩＧＹＤ）；配列番号１５（ＨＤＧＰＩＧＹＤ）；配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）；配列番号１７（ＡＥＡＰＶＧＥＹ）；配列番号１８（ＨＥＡＰＩＧＤＮ）；配列番号１９（ＨＤＧＤＩＧＹＤ）；配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）および配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）。
【００３２】
δＰＫＣのΨδＲＡＣＫ配列由来の適切なδＰＫＣアゴニストとしては、例えば、配列番号４（ＭＲＡＡＥＥＰＶ）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号２２（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）；配列番号２３（ＭＲＶＶＥＥＰＶ）；配列番号２４（ＭＲＡＡＤＥＰＶ）；配列番号２５（ＭＲＡＡＥＥＰ）；配列番号２６（ＭＲＬＬＥＥＰＶ）；配列番号２７（ＭＲＬＡＥＥＰＶ）；および配列番号２８（ＭＲＡＡＥＥ）。
【００３３】
ηＰＫＣ上のΨηＲＡＣＫ配列由来の例示的なηＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＨＥＴＰＬＧＹＤ（配列番号６）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号２９（ＨＤＴＰＬＧＹＤ）；配列番号３０（ＨＤＴＰＬＧ）；配列番号３１（ＨＤＴＰＩＧＹＤ）；配列番号３２（ＨＥＴＰＡＧＹＤ）；配列番号３３（ＨＥＴＰＡＧＹＥ）；配列番号３４（ＫＥＴＰＡＧＹＤ）；配列番号３５（ＫＥＴＰＶＧＹＤ）および配列番号３６（ＫＥＴＰＶＧ）。
【００３４】
θＰＫＣ上のΨθＲＡＣＫ配列由来の例示的なθＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＫＧＫＮＶＤＬＩ（配列番号５）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下の配列が挙げられる：配列番号３７（ＲＧＫＮＶＥＬＡ）；配列番号３８（ＫＮＶＤＬＩ）；配列番号３９（ＲＧＲＮＶＤＬＩ）；配列番号４０（ＫＧＲＮＡＤＬＩ）；配列番号４１（ＫＧＫＮＶＥＬＩ）；配列番号４２（ＫＧＫＮＶＥＬＡ）；配列番号４３（ＫＧＫＱＶＤＬＩ）および配列番号４４（ＲＧＫＮＬＤＬＩ）。
【００３５】
βＰＫＣ上のΨβＲＡＣＫ配列由来の例示的なβＰＫＣアゴニストとしては、例えば、ＳＶＥＩＷＤ（配列番号７）ならびにその改変体および／またはフラグメントが挙げられる。この配列としては、以下が挙げられる：配列番号４５（ＳＡＥＩＷＤ）；配列番号４６（ＳＶＥＬＷＤ）；配列番号４７（ＴＶＥＩＷＤ）；配列番号４８（ＳＶＥＩＷＥ）および配列番号４９（ＳＶＥＩＷ）。
【００３６】
他の適切なアゴニストとしては、本明細書中に記載されるアゴニストのアミノ酸配列（配列番号３〜４９が挙げられる）に対して、少なくとも約５０％の同一性、さらに少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、さらに少なくとも約８０％の同一性、およびさらに少なくとも約９０％の同一性を有し、そしてそれぞれのＰＫＣ酵素についてのアゴニストとして機能するアゴニストが挙げられることが理解される。
【００３７】
また、本明細書中に記載されるΨＲＡＣＫ配列はまた、本明細書中に示される残基を越える１つ以上のアミノ酸残基を含み得ることが理解される。例えば、８５〜９２位のΨεＲＡＣＫ配列（配列ＨＤＡＰＩＧＹＤ；配列番号３に対応する）に関して、配列番号９３（ＴＤＶＣＮＧＲＫＩＥＬＡＶＦＨＤＡＰＩＧＹＤＤＦＶＡＮＣＴＩ）は、εＰＫＣのアミノ酸７１〜１００の残基の配列を示す。７４〜８１位のΨδＲＡＣＫ配列（配列ＭＲＡＡＥＥＰＶ；配列番号４に対応）に関して、配列番号９４（ＩＱＩＶＬＭＲＡＡＥＥＰＶＳＥＶＴＶ）は、δＰＫＣのアミノ酸６９〜８６の残基の配列を示す。７５〜８２位のΨθＲＡＣＫ配列（配列ＫＧＫＮＶＤＬＩ；配列番号５に対応）に関して、配列番号９５（ＭＱＩＩＶＫＧＫＮＶＤＬＩＳＥＴＴＶ）は、θＰＫＣのアミノ酸７０〜８７の残基の配列を示す。８８〜９５位におけるΨηＲＡＣＫ配列（配列ＨＥＴＰＬＧＹＤ；配列番号６に対応）に関して、配列番号９６（ＥＬＡＶＦＨＥＴＰＬＧＹＤＨＦＶＡＮ）は、ηＰＫＣのアミノ酸８３〜１００の残基の配列を示す。２４１〜２４６位におけるΨβＲＡＣＫ配列（配列ＳＶＥＩＷＤ；配列番号７に対応）に関して、配列番号９７（ＫＤＲＲＬＳＶＥＩＷＤＷＤＷＤＬ）は、βＰＫＣ由来のアミノ酸２３６〜２５１の残基の配列を示す。配列９３〜９６由来であり、εＰＫＣアゴニスト、δＰＫＣアゴニスト、θＰＫＣアゴニストおよびηＰＫＣアゴニストとしての活性を有する配列は、例えば、本明細書中の教示にしたがって、置換位置におけるペプチドの電荷の変化を達成する置換アミノ酸を選択することにより（例えば、置換位置における電荷を減少するか、または増加させることにより）改変されて、その生物学的活性をアンタゴニストの活性へと変換し得る。例えば、負に荷電するか、正に荷電するアミノ酸は、非荷電アミノ酸を置換し得る。本発明の特定の形態において、改変された配列は、そのそれぞれの酵素についての天然のＲＡＣＫの電子分布により厳密に類似する。
【００３８】
ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力があるＰＫＣアゴニストペプチドに存在するアミノ酸は、本発明の１つの形態において、アゴニストペプチドを、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列に、より近接に類似させるアミノ酸である。したがって、この置換は、アゴニストペプチド上の特定の位置に存在し、そして、置換前に２つの配列の間の同一性％を比較する場合に、ＰＫＣアゴニストと、それぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の参照配列との間の同一性％を増加させるアミノ酸配列を用いる。置換されるアミノ酸を置き換えるこのようなアミノ酸は、ペプチド内で非保存的アミノ酸置換を提供するアミノ酸を含み得る。
【００３９】
ペプチド配列が比較されるＲＡＣＫタンパク質上の参照配列は、本明細書中で以前に記載されたＢＬＡＳＴプログラム、または当該分野で公知の他の類似のプログラムを使用して、比較される２つの配列を最適にアライメントすることから導き出される配列であり、そして、例えば、約４〜約３０アミノ酸、または約５〜約１５アミノ酸に相当し得る。それぞれのＲＡＣＫのＰＫＣ結合部位において３０アミノ酸より長い参照配列はまた、参照配列に対して構築されたペプチドアンタゴニストを比較する場合（ペプチドアンタゴニストの長さが、約３０アミノ酸より長いような状況が挙げられる）に、利用され得ることが理解される。参照配列が、本明細書中で議論されるＰＫＣの種々のアイソタイプから選択され得るような配列の例は、本明細書中で以前に列挙されている。置換されるアミノ酸は、本明細書中に記載されるとおりの別の適切なアミノ酸で置換される場合に、ＰＫＣ酵素のＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位内の配列に対して、同一性％の増加したペプチド配列をもたらし、そして結果として、ＰＫＣアゴニストペプチドのＰＫＣアンタゴニストペプチドへの変換をもたらすペプチド中の任意のアミノ酸であり得る。この適切なアミノ酸は、ペプチドまたはペプチド模倣物と、ＰＫＣ酵素のＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位との間の結合親和性を増加させるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明の他の形態において、ＰＫＣアゴニストをＰＫＣアンタゴニストへ変換するのに十分な能力があるアミノ酸は、そのペプチドまたはペプチド模倣物が、そのそれぞれのＲＡＣＫタンパク質上のＰＫＣ結合部位から選択される参照ペプチドの電子分布に、より厳密に近づくことを可能にするか、あるいは、荷電アミノ酸を非荷電アミノ酸で置換する、アミノ酸である。置換されるアミノ酸を置き換えるこのようなアミノ酸は、ペプチド中の非保存的アミノ酸置換を提供するアミノ酸であり得る。例として、８アミノ酸の参照ペプチドが、２位において非荷電アミノ酸を有し、そしてＢＬＡＳＴプログラムを使用して最適にアライメントすると、このアゴニストが、同じ位置に荷電アミノ酸を有する場合に、このアゴニスト中のアミノ酸は、このアゴニストペプチドが、参照ペプチドの特定の位置における電荷をより厳密に近づけ、そしてＰＫＣアゴニストをアンタゴニストへ変換することを可能にするために、非荷電アミノ酸で置換され得る。したがって、ＰＫＣアゴニスト中の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）を、極性の非荷電アミノ酸（例えば、アスパラギンまたはグルタミン）で置換し得、これにより、ペプチド中の置換位置における電荷を減少し得る。いくつかの場合において、所与の配列における極性の非荷電残基は、荷電残基（例えば、正または負に荷電したアミノ酸残基）で置換され得、これにより、ペプチド中の置換位置における電荷を増加して、ペプチド機能における変化を達成することが理解される。
【００４１】
アゴニスト中の少なくとも１つのアミノ酸が、置換される。本発明の特定の形態において、２、３、または４以上のアミノ酸が、置換され得る。アゴニスト中の置換され得るアミノ酸の数または％はまた、ペプチドまたはペプチド模倣物中のアミノ酸の数に依存し得る。アゴニストの長さがより長いほど、および／またはこのアゴニストペプチドと、それぞれのＲＡＣＫのＰＫＣ結合部位内の配列との間の同一性％もしくは電子分布の差が大きいほど、より多い置換数が可能である。約８アミノ酸のアゴニスト中の適切な置換数は、約４未満を含む。例として、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物のアミノ酸の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、さらに少なくとも約４０％、さらに少なくとも約５０％、および少なくとも約６０％が、置換され得る。
【００４２】
本発明の方法にしたがって、εＰＫＣアゴニストペプチド由来である、εＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号５０〜５７に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）、配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）、配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）および配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）（これらは、米国特許第６，１６５，９７７号に開示される）として同定される、代替のΨεＲＡＣＫ配列に基づき、そして、例えば、εＲＡＣＫ上のεＰＫＣ結合部位内の配列（例えば、ＮＮＶＡＬＧＹＤ（配列番号１）により類似するように、そして／または、選択されたアミノ酸残基において電荷の変化を含むように改変され得る。これらの代替のΨεＲＡＣＫ配列は、本明細書中に開示される方法にしたがって改変され得、ここで、１つ以上のアミノ酸残基は、ペプチド中の電荷の変化を達成するアミノ酸残基で置換され得る。例えば、配列番号１２（ＨＤＡＰＩＧＤＹ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５０（ＨＮＡＰＩＧＤＹ）および配列番号５１（ＨＤＡＰＩＧＮＹ）に到達する。配列番号２０（ＨＤＡＰＩＧ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５２（ＨＮＡＰＩＧ）に到達する。配列番号２１（ＨＤＡＰＩＰＹＤ）は、ＮのＤへの置換により改変されて、配列番号５３（ＨＮＡＰＩＰＹＤ）および配列番号５４（ＨＤＡＰＩＰＹＮ）に到達し得る。さらに、配列番号３（ＨＤＡＰＩＧＹＤ）は、最初のＤのＮへの置換により改変されて、配列番号５５（ＨＮＡＰＩＧＹＤ）に到達し得る。配列番号１６（ＨＤＡＡＩＧＹＤ）は、第１または第２のＤのいずれかをＮで置換することにより改変されて、それぞれ、配列番号５６（ＨＮＡＡＩＧＹＤ）および配列番号５７（ＨＤＡＡＩＧＹＮ）に到達し得る。
【００４３】
本発明の方法にしたがって、δＰＫＣアゴニストペプチド由来である、δＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号５８〜６５に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記の代替のΨδＲＡＣＫ配列に基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号４（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）は、ＲをＤまたはＥへ交換することにより改変されて、それぞれ、配列番号５８（ＭＤＶＡＥＥＰＶ）および配列番号５９（ＭＥＶＡＥＥＰＶ）に到達し得る。あるいは、配列番号４（ＭＲＶＡＥＥＰＶ）における第２のＥは、ＮまたはＱで置換されて、配列番号６０（ＭＲＶＡＥＮＰＶ）および配列番号６１（ＭＲＶＡＥＱＰＶ）に到達し得る。類似の改変は、例えば、配番号２７（ＭＲＬＡＥＥＰＶ）に対してなされ、配列番号６２（ＭＤＬＡＥＥＰＶ）に到達し得る（ＲをＤに交換する）；配列番号６３（ＭＥＬＡＥＥＰＶ）（ＲをＥに交換する）；配列番号６４（ＭＲＬＡＥＮＰＶ）（第２のＥをＮで交換する）；および配列番号６５（ＭＲＬＡＥＱＰＶ）（第２のＥをＱで交換する）。
【００４４】
本発明の方法にしたがって、ηＰＫＣアゴニストペプチド由来である、ηＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号６６〜６９に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨηＲＡＣＫ配列および代替のΨηＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号６（ＨＥＴＰＬＧＹＤ）および配列番号３４（ＫＥＴＰＡＧＹＤ）は、ＱのＥとの置換により改変されて、配列番号６６（ＨＱＴＰＬＧＹＤ）；配列番号６７（ＫＮＴＰＡＧＹＤ）；配列番号６８（ＫＱＴＰＡＧＹＤ）；および配列番号６９（ＫＮＴＰＡＧＹＤ）に到達し得る。
【００４５】
本発明の方法にしたがって、θＰＫＣアゴニストペプチド由来である、θＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号７０〜７８に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨθＲＡＣＫ配列および代替のΨθＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号５（ＫＧＫＮＶＤＬＩ）は、第２のＫを、ＤまたはＥのいずれかで置換することにより改変されて、配列番号７０（ＫＧＤＮＶＤＬＩ）および配列番号７１（ＫＧＥＮＶＤＬＩ）に到達し得；ＥをＮで置換して、配列番号７２（ＫＧＫＥＶＤＬＩ）に到達し得；あるいは、ＮをＤで置換して配列番号７３（ＫＧＫＮＶＮＬＩ）に到達し得る；同様に、配列番号３７（ＲＧＫＮＶＥＬＡ）は、ＫをＤまたはＥのいずれかで置換することにより改変されて、それぞれ、配列番号７４（ＲＧＤＮＶＥＬＡ）および配列番号７５（ＲＧＥＮＶＥＬＡ）に到達し得る。さらに、配列番号４３（ＫＧＫＱＶＤＬＩ）は、ＮをＤで置換することにより改変されて、配列番号７６（ＫＧＫＱＶＮＬＩ）に到達し得るか、あるいは、第２のＫをＤまたはＥで置換することにより、改変されて、それぞれ、配列番号７７（ＫＧＤＱＶＮＬＩ）および配列番号７８（ＫＧＥＱＶＮＬＩ）に到達し得る。
【００４６】
本発明の方法にしたがって、βＰＫＣアゴニストペプチド由来である、βＰＫＣ拮抗活性を有し得る例示的なペプチドとしては、配列番号７９〜８５に示される配列が挙げられる。これらのアンタゴニストは、上記のΨβＲＡＣＫ配列および代替のΨβＲＡＣＫに基づき、そして、本発明によるアンタゴニストを形成するように改変され得る。例えば、配列番号７（ＳＶＥＩＷＤ）、配列番号４５（ＳＡＥＩＷＤ）；配列番号４６（ＳＶＥＬＷＤ）：配列番号４７（ＴＶＥＩＷＥ）；配列番号４８（ＳＶＥＩＷＥ）；および配列番号４９（ＳＶＥＩＷ）は全て、ＥをＫで置換することにより改変されて、配列番号８０（ＳＶＫＩＷＤ）；配列番号８１（ＳＡＫＩＷＤ）；配列番号８２（ＳＶＫＬＷＤ）；配列番号８３（ＴＶＫＩＷＥ）；配列番号８４（ＳＶＫＩＷＥ）；および配列番号８５（ＳＶＫＩＷ）に到達し得る。
【００４７】
これは、本明細書中に記載される種々のアゴニストにより産生され得るアンタゴニストの網羅的な列挙ではないことが、理解される。本明細書中で記載されるそれぞれのＰＫＣアイソザイムについてか、および／または当該分野で公知の、他の特定の他の類似のＰＫＣアゴニスト配列または代替のΨＲＡＣＫ配列は、本明細書中に記載される方法を使用して改変され得、ＰＫＣアンタゴニストを産生する。方法論は、本明細書中に記載される特定の置換を超えて広がることが、本明細書中の記載から理解される。ペプチド中の負に荷電したか、または正に荷電したアミノ酸残基の、極性の非荷電アミノ酸残基との置換は、ペプチドまたはペプチド模倣物の活性における変化を提供するように企図され、極性の非荷電アミノ酸の、正または負に荷電したアミノ酸との置換もまた、同様である。正に荷電したアミノ酸の、負に荷電したアミノ酸との置換、および、負に荷電したアミノ酸の、正に荷電したアミノ酸との置換もまた、想定される。正に荷電したアミノ酸としては、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。選択したアミノ酸について置換可能である、極性の非荷電アミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。これらのアミノ酸は、少なくとも生物学的ｐＨ（例えば、約ｐＨ７）で前述の電荷を有することが期待される。したがって、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され得る。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、リジンまたはアルギニンで置換され得る。セリンおよびスレオニンは、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンまたはアスパラギンで置換され得る。
【００４８】
本明細書中に記載されるＰＫＣペプチドアゴニストまたはペプチドアンタゴニストは、当業者に公知の方法により得られ得る。例えば、このタンパク質アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、当該分野で公知の種々の固相合成技術ならびに、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐａｕｌ Ｌｌｏｙｄら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９７）に記載されるような技術を使用して化学合成され得る。さらに、ペプチドを、ペプチド模倣物へ変換する方法もまた、当業者に周知である。
【００４９】
あるいは、タンパク質アゴニストまたはタンパク質アンタゴニストは、当業者に周知の組換え技術、ならびに例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｏｂｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ（１９９８）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら．，編．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（これは、規則的に、かつ周期的にアップデートされる）に記載されるとおりの技術により作製され得る。例えば、発現ベクターは、所望されるペプチドアゴニストまたはペプチドアンタゴニストを、適切な宿主細胞中で産生するために使用され得、次いで、この生産物は、公知の方法により単離され得る。この発現ベクターは、例えば、所望されるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで、このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に作動可能に連結される。
【００５０】
本明細書中で定義される場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的関係のある位置に置かれる場合、別のヌクレオチドに「作動可能に連結」される。例えば、コード配列が、プロモーター配列に作動可能に連結される場合、これは、一般に、プロモーターがコード配列の転写を促進し得ることを意味する。作動可能に連結されたとは、連結されたＤＮＡ配列が、代表的に近接し、そして、２つのタンパク質コード領域に結合し、近接し、そして読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、数キロ塩基対までプロモーターから離れ、そしてイントロン配列が、可変長の中に存在し得る場合に、機能し得ることから、数ヌクレオチドの配列は、連結され得るが、近接しない。さらに、本明細書中で定義される場合、ヌクレオチド配列は、天然のまたは合成のヌクレオチドおよび／もしくはヌクレオシドの直線かつ連続したアレイ、ならびにその誘導体を指すことが意図される。用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードすること（ｃｏｄｉｎｇ）」とは、ヌクレオチド配列により、転写および翻訳の機構を介して、その情報を、細胞に提供し、その情報から、一連のアミノ酸が、特定のアミノ酸配列へと組み立てられて、ポリペプチドを産生するプロセスをいう。
【００５１】
アゴニストまたはアンタゴニストは、天然のアミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、または非天然のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を含み得る。ペプチド中のアミノ酸は、ペプチド結合により連結され得るか、または改変されたペプチド（本明細書中に記載されるペプチド模倣物が挙げられる）においては、非ペプチド結合により連結され得る。
【００５２】
アミノ酸を連結するアミド結合に対する多種多様な改変が、なされ得、そしてこれは当該分野において公知である。このような改変は、一般的な論評（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５５３（２００３），およびＲｉｐｋａ，Ａ．Ｓ．，Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１（１９９８））で議論される。これらの改変は、２つの方法の内の一方でペプチドの性質を改善するために設計される：（ａ）立体配座の柔軟性を制限することにより、ペプチドの効力を増加させる；（ｂ）非分解性の部分をペプチドに導入することにより、ペプチドの半減期を増加させる。
【００５３】
ストラテジー（ａ）の例としては、アミド結合の窒素またはα炭素上にさらなるアルキル基を配置すること（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎらのペプトイドストラテジー）、および、例えばＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．らのα改変（Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３（１９９６））が、挙げられる。アミドの窒素およびα炭素は、ともに連結されて、さらなる制限を提供し得る（Ｓｃｏｔｔら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．６：１６２９−１６３２（２００４））。
【００５４】
ストラテジー（ｂ）の例として、アミド結合の、例えば、ウレア残基（Ｐａｔｉｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：７２７４−７２８０（２００３））、またはアザ−ペプチド連結（ＺｅｇａおよびＵｒｌｅｂ，Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓｌｏｖ．４９：６４９−６６２（２００２））による置換が挙げられる。他の例もまた周知である：例えば、銀にさらなる炭素（「ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１：１７３（１９９８））、またはエテン単位（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））を導入すること、またはヒドロキシエチレン部分の使用（Ｐａｔａｎｉ，Ｇ．Ａ．，Ｌａｖｏｉｅ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：３１４７−３１７６（１９９６））。１つ以上のアミノ酸は、等配電子の部分（例えば、ピロリノン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１１０３７（２０００））、またはテトラヒドロフラン（Ｋｕｌｅｓｚａ，Ａ．ら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．５：１１６３（２００３）））により置換され得る。
【００５５】
本発明のさらに別の局面において、インビトロまたはインビボにおいて、ＰＫＣアンタゴニストを投与することにより、ＰＫＣ酵素（例えば、εＰＫＣ）の活性を調節する方法が、提供される。ＰＫＣアンタゴニストは、ぺプチド（すなわち、アミノ酸配列）、またはそのペプチドの作用に刺激するように選択されたペプチド模倣物の有機分子であり得る。例として、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、ＰＫＣ酵素をＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、ここでこのペプチドまたはペプチド模倣物は、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、そしてここで、アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、このアゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な能力がある別のアミノ酸で置換される。使用に適切なこのアゴニストペプチドは、本明細書中で以前に記載されているとおりである。アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換しやすいアミノ酸置換もまた、本明細書中で以前に記載されている。
【００５６】
本発明のさらに別の局面において、ＰＫＣ酵素により調節される状態を処置する方法が、提供される。１つの形態において、方法は、治療有効量のペプチドまたはペプチド模倣物を、それらを必要とする患者へ投与する工程を包含し、このペプチドまたはペプチド模倣物は、対応するＰＫＣアイソザイムの拮抗性の調節因子として作用する。１つのＰＫＣアンタゴニストまたはＰＫＣアンタゴニストとの組み合わせが、投与され得る。このようなアンタゴニストは、本明細書中で以前に記載されたアンタゴニストである。
【００５７】
ＰＫＣにより調節される多種多様な疾患または状態は、処置され得る。本明細書中で処置される疾患または状態は、代表的に、それぞれのＰＫＣアイソザイムの活性の増加に関連する疾患または状態であり、そしてＰＫＣアンタゴニストの投与から恩恵を被る。１つの例として、種々の炎症性疾患および線維症疾患は、εＰＫＣの活性の増加に関連している（Ａｋｓｏｙ，Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３６：１８３−１８８（２００４）；Ｆａｎｇ，Ｑ．ら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２４：９１８−９２４（２００４））。
【００５８】
したがって、εＰＫＣアンタゴニストを用いた処置に影響を受けやすい状態としては、例えば、線維症疾患（肺線維症または強皮症）、および炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、アレルギー性鼻炎が挙げられる）；肺疾患（慢性閉塞性肺疾患およびぜん息が挙げられる）；自己免疫疾患（多発性硬化症、ギャン−バレー症候群、乾癬、グレーブス病、慢性関節リウマチが挙げられる）、および免疫媒介性の糖尿病（１型真性糖尿病が挙げられる）が挙げられる。
【００５９】
本明細書中に記載されるインヒビターは、融合タンパク質の一部となることにより改変され得る。この融合タンパク質は、ペプチドインヒビターの細胞内摂取を増加させるように機能するタンパク質またはペプチドを含むか、別の所望される生物学的効果（例えば、治療効果）を有するか、あるいはこれらの機能の両方を有し得る。例えば、εＰＫＣまたは他のペプチドアンタゴニストもしくはペプチド模倣物アンタゴニストを、サイトカインまたは所望される生物学的応答を誘発する他のタンパク質に共役するか、あるいはそうでないなら付着することが、所望であり得る。この融合タンパク質は、当業者に公知の方法により産生され得る。このインヒビターペプチドは、当該分野で公知の種々の手段で、別のペプチドへ結合されるか、またはそうでないなら、共役され得る。例えば、インヒビターペプチドまたはインヒビターペプチド模倣物は、架橋を介して、キャリアペプチドまたは本明細書に記載される他のペプチドに結合され得、ここで、融合タンパク質の両方のペプチドは、その活性を保持する。さらなる例として、このペプチドは、一方のぺプチドのＣ末端から他方のペプチドのＮ末端へのアミド結合により、互いに連結され得るか、またはそうでないなら共益され得る。インヒビターぺプチドと、融合タンパク質の他のメンバーとの間の連結は、ペプチド結合により切断不可能であるか、あるいは、例えば、エステルまたは当該分野で公知のほかの切断可能な結合により切断可能であり得る。
【００６０】
さらに、本発明の他の形態において、ペプチドアンタゴニストの細胞内摂取を増加し得るキャリアタンパク質またはペプチドは、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来の配列（配列番号９１（ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）で示される）であり得、そしてＮ末端のＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を介する架橋によるインヒビターへ結合され得る（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８−７１６７（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ ７９：１０８６（１９９６）において議論される）。あるいは、インヒビターは、１型ヒト免疫不全ウイルス由来のトランス活性化調節タンパク質（Ｔａｔ）由来の輸送ポリペプチド（例えば、配列番号９２に示されるＴａｔのアミノ酸４７〜５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ））（Ｖｉｖｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２：１６０１０−１６０１７（１９９７）、米国特許第５，８０４，６０４号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＴ４８０７０に記載される）、あるいは、ポリアルギニン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５６：３１８−３２５（２０００）およびＲｏｌｈｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：１２５３−１２５７（２０００）に記載される）により改変され得る。このインヒビターは、インヒビターの細胞摂取を増加するために、当業者に公知の他の方法により改変され得る。
【００６１】
このインヒビターは、種々の形態で有利に投与され得る。例えば、このインヒビターは、溶液または懸濁液中で舌下投与のために錠剤形態で投与され得る。このインヒビターはまた、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルと混合され得る。このキャリアは、例えば非経口投与に適切な液体（水、生理食塩水、または他の水溶液が挙げられる）であっても、油であってもよい。このキャリアは、静脈内投与または関節内投与のために選択され得、そして、当該分野で公知の防腐剤、静菌剤、緩衝液および抗酸化剤を含有し得る、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液を含み得る。錠剤形態において、固体キャリアとしては、例えば、ラクトース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、カルシウム、ホスフェート、炭酸カルシウム、合成カルシウムまたは天然カルシウムの割り当て、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、乾燥酵母、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。この錠剤は、好ましくは、口内での溶解を補助する１つ以上の薬剤を含む。このインヒビターはまた、当該分野で公知の他の類似の薬物が投与される形態で投与され得る。
【００６２】
このインヒビターは、種々の経路により患者へ投与され得る。例えば、このインヒビターは、非経口（腹腔内、静脈内、関節内、皮下、または筋肉内が挙げられる）で投与され得る。このインヒビターはまた、粘膜表面（直腸内、および膣内が挙げられる）；鼻内（吸入が挙げられる）；舌下；眼内および経皮により投与され得る。これらの投与経路の組み合わせもまた、想定される。
【００６３】
治療有効量のεＰＫＣまたは他のインヒビターペプチドが、提供される。本明細書中で使用される場合、インヒビターの治療有効量は、特定の疾患または状態に付随する症状を減少させるか、あるいは排除するために必要とされるインヒビターの量である。このような臨床エンドポインド（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）は、多種多様な疾患または状態について当該分野で周知である。この量は、それぞれのＰＫＣ酵素の活性を調節する（例えば、減少する）のに有効な量を含む。例えば、治療有効量は、ＰＫＣ酵素の細胞内活性（キナーゼ活性、ＰＫＣ酵素転位活性が挙げられる）に影響を及ぼし、そして／または、その他にＰＫＣがその生物学的機能を果たすことを防ぐのに有効な量を含む。この量は、当該分野で公知の投与経路、処置期間、使用される特定のインヒビター、特定の疾患または状態、および患者の健康に依存して変動する。当業者は、最適な投薬量を決定することができる。一般に、代表的に利用されているインヒビターの量は、例えば、体重１ｋｇあたり約０．０００５ｍｇ〜約２０ｍｇであるが、好ましくは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００６４】
処置されるべき患者は、代表的には、このような処置を必要とする患者（ＰＫＣアンタゴニストでの処置に影響を受けやすい特定の疾患または状態により影響を受ける患者が挙げられる）である。患者は、さらに代表的には、脊椎動物、好ましくは哺乳動物（ヒトが挙げられる）である。処置され得る他の動物としては、家畜（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシおよびブタ）が挙げられる。処置され得る他の例示的な動物としては、ネコ、イヌ；げっ歯類（げっ歯目のげっ歯類が挙げられる（例えば、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、およびモルモット））；ウサギ目のメンバー（ウサギおよびノウサギが挙げられる）、およびこのような処置から恩恵を受け得る任意の他の哺乳動物が挙げられる。患者は、好ましくは、インビボで処置される。
【００６５】
したがって、ＰＫＣペプチドアンタゴニスト（本明細書中に記載されるεＰＫＣアンタゴニストが挙げられる）は、εＰＫＣの転位、または他の活性に関する状態の処置のために治療剤としての用途が発見される。ＰＫＣアンタゴニストの投与は、例えば、転位およびその後のシグナル伝達事象のカスケードを阻害する。アンタゴニストはまた、虚血および他の状態におけるＰＫＣアイソザイムの効果に対する研究において、用途が発見され、そしてまた、拮抗活性を有するか、またはペプチドの模倣物として作用する治療剤の設計において、スクリーニングの補助として使用され得る。
【００６６】
ここで、上記の本発明を例示する特定の実施例に対して、参照がなされる。実施例は、好ましい実施形態を例示するために提供され、これにより本発明の範囲に対する限定が意図されないことが理解されるべきである。さらに、本明細書中で引用された全ての文書は、当該分野における技術レベルを表しており、その全体が、本明細書により参考として援用される。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
（心筋細胞に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
（Ａ．ペプチドの調製および細胞への送達）
以下のペプチドを、従来の技術により、合成し、そして精製した（９５％より高く）：
ΨεＲＡＣＫ（配列番号３、ＨＤＡＰＩＧＹＤ、εＰＫＣアミノ酸残基８５−９２）；
Ｎ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号５５、ＨＮＡＰＩＧＹＤ）；
Ａ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号７９、ＨＡＡＰＩＧＹＤ）；
εＶ１−２（配列番号８６、ＥＡＶＳＬＫＰＴ；εＰＫＣアミノ酸残基１４〜２１、そして米国特許第６，１６５，９７７号に記載される）；
ΨβＲＡＣＫ（配列番号７、ＳＶＥＩＷＤ、βＰＫＣアミノ酸２４１−２４６）。
【００６８】
このぺプチドは、未改変であるか、あるいは、Ｎ−末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介してＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来のキャリアペプチド（配列番号６，Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０，（１９９４）；Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８１８８−１８１９３，（１９９６）；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８−７１６７，（１９９５））に架橋したかのどちらかであった。このキャリアペプチド（配列番号６）を、コントロールペプチドとして使用した。
【００６９】
一次心筋細胞培養物（９０〜９５％純度）を、前述のように新生児ラットから調製した（Ｇｒａｙ，Ｍ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０９４５−３０９５１，（１９９７）；Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．−Ｈ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２１０：２８７−２９７，（１９９４））。ペプチド（適用された濃度は１００ｎＭ〜１μＭ）を、コントロールとしての見せ掛けの透過とともに、一過性の透過により細胞内に導入するか（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６−１０９９，（１９９６））、あるいは、コントロールとしてキャリア−キャリアのダイマーとともに、キャリア−ペプチドの結合体として細胞内に導入した（３０ｎＭ〜１μＭ）（Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，前述（１９９４）；Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ら，前述（１９９６）；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら，前述（１９９５））。
【００７０】
細胞を、ペプチドの非存在下、または存在下で１０〜２０分間処理し、次に、１ｎＭ ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてか、または用いずに１０分間または２０分間さらにインキュベートした。あるいは、細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡ（ポジティブコントロール）を用いて１０分間インキュベートするか、またはＰＭＡの非存在下でインキュベートした。
【００７１】
（Ｂ．心筋細胞の収縮頻度の測定）
心筋細胞の収縮頻度の測定を、実質的に以前に記載されたとおりに実施した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４９６２−２４９６６，（１９９６））。簡単に述べると、３５ｍｍプレート上で培養した心筋細胞を、３７℃において、温度調節装置（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．）に置き、そして倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）のステージ上に配置した。１つの顕微鏡内の視野において、４つの細胞の収縮頻度を、２分間ごとに各々１５秒間定量した。基底収縮頻度（約３００ビート／分）は、長い時間にわたり、安定であった。
【００７２】
（結果）
上記のように、配列番号１〜５により表されるペプチドを、合成し、そして精製した。詳細には、ΨεＲＡＣＫ（配列番号３、ＨＤＡＰＩＧＹＤ）、 Ｎ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号５５、ＨＮＡＰＩＧＹＤ）、Ａ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号７９、ＨＡＡＰＩＧＹＤ）；εＶ１−２（配列番号８６、ＥＡＶＳＬＫＰＴ）；ΨβＲＡＣＫ（配列番号７、ＳＶＥＩＷＤ）を、調製した。これらのペプチドを、改変しないか、あるいは、Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメイン由来のキャリアペプチド（配列番号８１、Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）に架橋した。
【００７３】
配列番号３、配列番号５５および配列番号７９のペプチドを、新生児ラットから調製した心筋細胞培養物内に、コントロールとしての見せ掛けの透過とともに、一過性の透過により導入するか、あるいは、コントロールとしてキャリア−キャリアのダイマーとともに、キャリア−ペプチドの結合体として導入した。この細胞を、ペプチドの非存在下、または存在下で１０〜２０分間処理し、次に、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてか、または用いずに１０分間または２０分間さらにインキュベートした。あるいは、細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡを用いて１０分間インキュベートする（ポジティブコントロール）か、またはＰＭＡの非存在下でインキュベートした。ペプチドおよび／またはＰＭＡの効果を、実施例１Ｂに記載されるように、筋細胞の収縮頻度を測定することにより、決定した。
【００７４】
図１Ａは、ΨεＲＡＣＫで処理し（三角形）、およびコントロールペプチドで処理し（正方形）、次に、実験の開始から約３０分後に培地に添加されたＰＭＡでのインキュベーションについての結果を示す（ＰＭＡの添加を、図１Ａのグラフ上の矢印により示す）。細胞に対するΨεＲＡＣＫペプチドの適用から約１０分後、コントロール細胞と比較して心筋細胞の収縮頻度の減少が誘導された。ΨεＲＡＣＫの存在下で観察された減少は、ＰＭＡの添加によりかなり増強された。このことは、心筋細胞の収縮頻度の減少を誘導することが公知である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２４９６２（１９９６））。
【００７５】
図１Ｂは、新生児ラットの心筋細胞の収縮頻度の減少％を示す。この減少％は、細胞の基底収縮頻度に対するものであり、この細胞は、１分間あたり約３００ビートで自然に、かつ安定にうつ。ΨεＲＡＣＫペプチドで処理した細胞は、ペプチド添加の２０分後に、コントロールペプチドで処理した細胞についての２±１％と比較して、収縮頻度において、ΨεＲＡＣＫについての基底頻度から９±２％の減少を有した。ＰＭＡとともにΨεＲＡＣＫで処理した細胞は、基底収縮頻度から４４±６％の減少を経験し、対して、ＰＭＡ単独での処置は、わずか１１±４％の減少を引き起こした。
【００７６】
引き続き図１Ｂを参照して、細胞を、εＰＫＣ特異的インヒビターペプチド（εＶ１−２）で処理して、収縮頻度に対するΨεＲＡＣＫの効果は、その能力に起因してεＰＫＣの転位を誘導し、そこから、誘導する場合に、εＰＫＣ選択的転位インヒビターが、転位を阻害するか否かを、決定した。実際には、図１Ｂに示すように、心筋細胞の収縮に対するΨεＲＡＣＫの効果を、εＰＫＣ特異的インヒビターペプチドεＶ１−２の事前の適用により、無効にした。さらに、ΨεＲＡＣＫ効果が、εＰＫＣの触媒活性の増加に起因する場合、この効果は、触媒活性のインヒビターにより無効にされるはずである。示されるように、非選択的ＰＫＣインヒビターのケレリスリン（ｃｈｅ）が、ΨεＲＡＣＫにより誘導される調律運動の変化（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ）を阻害した。これらのデータは、新生児の心筋細胞における陰性の調律運動の変化を誘導するために、εＰＫＣ活性化が必要とされ、そして誘導するのに十分であることを、実証する。
【００７７】
図１Ａ〜１Ｂにおける結果は、ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞における収縮頻度の抑制を刺激することを確実にする。この方法論は、εＰＫＣの転位に対して、他のペプチドおよびペプチド模倣物の効果を定量するための手段を提供する。このようにして、配列ＨＮＡＰＩＧＹＤ（配列番号５５）を有するペプチドを設計し、Ｎ−ΨεＲＡＣＫとして、本明細書中で参照する。この配列は、アスパラギン酸（Ｄ）（負に荷電したアミノ酸）を、アスパラギン（Ｎ）（極性の非荷電アミノ酸）へ置換することを除いて、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ、配列番号３）と同一である。心筋細胞の収縮頻度に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果を、研究した。その結果を、図２Ａ〜２Ｃに示す。
【００７８】
図２Ａは、コントロールペプチド（正方形）、またはＮ−ΨεＲＡＣＫ（菱形）での処理後の時間の関数として、新生児ラットの心筋細胞の収縮頻度を示す。上および実施例１において議論するように、収縮頻度を、基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現する。ΨεＲＡＣＫと対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した細胞の収縮頻度は、図２Ａ〜２Ｂに提示されるデータの最初の２０分間の間（ＰＭＡ処理の前）、コントロールペプチドで処理した細胞とほとんど等しかったという事実に見られるように、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞の収縮頻度に対する拮抗効果を有さなかった。この細胞を、ペプチド処理から約２０分後に、ＰＭＡで処理し、図２Ａ〜２Ｂに見られるように、約２０分間より長い時間において、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、εＰＫＣのアンタゴニストとして作用した。すなわち、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ＰＭＡにより誘導される収縮頻度の減少を軽減することができた。図２Ｂに見られるように、ΨεＲＡＣＫは、５ｎＭ ＰＭＡにより誘導される収縮頻度の減少を軽減した。本明細書中には示さない研究において、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、１０ｎＭ ＰＭＡにより誘導される収縮頻度における減少を、ＰＭＡ添加後４０分間で、４７±３％〜２４±５％軽減した（ｎ＝４；Ｐ＜０．０５）。
【００７９】
図２Ｃは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した心筋細胞（菱形）についての収縮速度の減少％を示す。Ｎ−ΨεＲＡＣＫでの処理から約１５分後、この細胞を、１５分の時点の矢印で示されるように、さらにΨεＲＡＣＫで処理した。１５分の時点でΨεＲＡＣＫで処理したコントロール細胞（三角形）は、収縮頻度において直接的な減少を示した；しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫと、ΨεＲＡＣＫとの両方で処理した細胞は、収縮頻度においてほとんど変化を示さなかった。３０分の時点における細胞のＰＭＡでの処理により、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理しないコントロール細胞において、収縮頻度のさらなる減少を誘導した。しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫで処理した細胞は、収縮頻度における１０％未満の減少を有し、このことは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、収縮頻度の減少において、ΨεＲＡＣＫとＰＭＡとの合わせた効果を、ほとんど完全に無効にし得ることを示す。したがって、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、心筋細胞において、εＰＫＣ機能のアゴニストとして作用する。
【００８０】
理論に限定されるわけではないが、ΨεＲＡＣＫおよびＮ−ΨεＲＡＣＫの両方は、εｐＫＣのＲＡＣＫ結合部位に結合することが企図される。ΨεＲＡＣＫは、ＲＡＣＫ結合部位とΨεＲＡＣＫ配列との間の分子内相互作用に逆に干渉することにより、作用し、対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ＲＡＣＫ結合部位とεＲＡＣＫとの間の分子間相互作用に干渉することにより、作用する。ペプチドは、酵素のその基質への接触に影響を及ぼすか、またはεＰＫＣの翻訳後改変（例えばリン酸化；リン酸化は、従来ＰＫＣアイソザイムの活性化および転位を調節する）に影響を及ぼす可能性もある。本明細書中で記載される実施例において、荷電アミノ酸を、非荷電アミノ酸で置換して、内因性アンカータンパク質により厳密に類似するペプチドに到達した。任意の配列についての同属のレセプターの配列は、置換の確認における指針を提供する。
【００８１】
（実施例２）
（εＰＫＣの転位に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
新生児ラットおよび成体ラットの心筋細胞における特異的ＰＫＣアイソザイムの転位を、以前に記載されたように（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：６５４−６６３，（１９９５））、処理した細胞の細胞質ゾル画分および粒子画分のウェスタンブロット分析（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）においてＰＫＣアイソザイム特異的抗体を使用することにより、ペプチド処理後に、評価した。簡単に述べると、ペプチド処理後の細胞を、ホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εＰＫＣでプローブし（図３Ａ）、次にはがし、そして抗αＰＫＣについて再度プローブした（図３Ｂ）。転位％（細胞内のＰＫＣの全量にわたる、粒子画分中のＰＫＣの量）を、図３Ａ〜３Ｂのヒストグラムに示す。
【００８２】
（結果）
ウェスタンブロット解析を使用して、εＰＫＣの、細胞質ゾルから細胞下の粒子画分への転位（ＰＫＣ活性化の特徴）を評価した。Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドまたはΨεＲＡＣＫペプチドを、ＰＭＡの用量（１ｎＭ）の存在下にて、一過性の透過により細胞内へ導入した。実施例２に記載されるように、次いで、この細胞をホモジナイズし、分画し、そしてウェスタンブロットにより分析した。最初にブロットを、抗εＰＫＣでプローブした（図３Ａ）。次いで、このブロットをはがし、図３Ｂに示されるように、抗αＰＫＣで再度プローブした。転位％を、細胞のＰＫＣの全量にわたる粒子画分のＰＫＣの量として図３Ａ〜３Ｂにヒストグラムで示す。ウェスタンブロットは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫが、ＰＭＡにより誘導される転位を阻害し、したがって、ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫにより誘導されるεＰＫＣ転位のアンタゴニスト、そしてεＰＫＣ機能のアンタゴニストであることを示す（図２）。
【００８３】
（実施例３）
（虚血からのΨεＲＡＣＫに誘導される保護に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果）
心筋細胞を、以前に記載された（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７８４（１９９９））とおりに、成体雄ラットから単離した。インキュベーション緩衝液中の筋細胞を、実施例１に記載されたように調製した、ペプチドまたはペプチドの組み合わせで、１５分間処理した。次いで、筋細胞を、窒素で飽和した脱気したインキュベーション緩衝液中で、１分間１０００ｒｐｍにてペレット化し、３７℃にて３時間インキュベーションして虚血を刺激した。細胞の損傷を、トリパンブルーの除去により、３時間後に評価し、損傷を有する細胞％を、以前に記載された（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７８４（１９９９））ように、決定した。
【００８４】
（結果）
ΨεＲＡＣＫ（配列番号１）は、細胞に投与される場合、虚血に対する保護を与える（Ｄｏｒｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６（２２）：１２７９８（１９９９））。この実施例において、虚血エピソードに曝露された細胞に対するＮ−ΨεＲＡＣＫの効果を、評価した。さらに、配列ＨＡＡＰＩＧＹＤ（配列番号３）を有するペプチドを（Ａ−ΨεＲＡＣＫと称される）を調製して、ΨεＲＡＣＫ（ＨＤＡＰＩＧＹＤ；配列番号３）におけるアスパラギン酸残基（Ｄ）の変化の効果を決定し、そこから、この残基が、アゴニストとしてのペプチドの作用に重要である場合、そのアラニン（Ａ）（非荷電の、非極性アミノ酸）への置換により、ペプチドを不活性にさせるはずである。心臓の保護に対するこのペプチドの効果もまた、評価した。この実施例において記載されるように、心筋細胞を、虚血を刺激する前に、ΨεＲＡＣＫペプチド、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド、Ａ−ΨεＲＡＣＫペプチド、εＶ１−２ペプチド、およびこれらのペプチドの種々の組み合わせで処理した。虚血エピソードの刺激の後に、細胞損傷を、トリパンブルー色素排除により、評価した。結果を、図４に示す。
【００８５】
図４は、虚血エピソードから得られた、ラット心筋細胞に対する細胞損傷の％を示す棒グラフである。虚血に供されない筋細胞を、各々の棒の透明な領域で表し、虚血損傷の％を、黒く塗った領域により表す。ＰＫＣ活性に対するコントロールとして、筋細胞を、ケレリスリン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）（ｃｈｅ）およびΨεＲＡＣＫペプチドの組み合わせで処理した。ΨεＲＡＣＫペプチドによる処理は、虚血により誘導される細胞損傷を、６０％まで減少した。しかし、Ｎ−ΨεＲＡＣＫおよびＡ−ΨεＲＡＣＫは、虚血に対する応答の効果を有さず、このことは、アスパラギン酸の、アスパラギンまたはアラニンへの変化は、ΨεＲＡＣＫのアゴニスト活性の喪失をもたらすことを示す。さらに、Ｎ−ΨεＲＡＣＫとΨεＲＡＣＫとの組み合わせは、虚血性の損傷からの保護を無効にした。選択的インヒビター（εＶ１−２）またはＰＫＣ触媒活性のインヒビター（Ｃｈｅ）を用いた、εＰＫＣの阻害は、ΨεＲＡＣＫにより誘導される保護効果を取り消した。Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、ΨεＲＡＣＫにより誘導される保護を無効にし、これに対して、不活性なペプチド（Ａ−ΨεＲＡＣＫ）は無効にせず、このことは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫは、εＰＫＣインヒビターであることを示す。
【００８６】
これらの知見は、１個のアミノ酸置換（εＲＡＣＫ配列に対するΨεＲＡＣＫの類似性を増加する）は、アゴニスト活性の喪失、およびアンタゴニスト活性の取得をもたらすことを示す。ΨεＲＡＣＫペプチドアゴニストは、ＰＫＣの、そのＲＡＣＫまたは脂質との分子間相互作用を変更することなく、ＰＫＣの分子内相互作用に干渉する。さらに、このペプチドを、εＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位の少なくとも一部に曝露し、次いで、εＲＡＣＫにより置換されて、十分な活性を得る。対照的に、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドは、ＲＡＣＫ結合部位とΨεＲＡＣＫとの間の分子間相互作用だけではなく、εＰＫＣとεＲＡＣＫとの間の分子内相互作用にも干渉する。εＰＫＣとεＲＡＣＫとの間の相互作用が阻害されることから、転位およびεＰＫＣの機能もまた、結果として阻害される。
【００８７】
（実施例４）
（異なるΨεＲＡＣＫのεＰＫＣ変異体のプロテアーゼ分解に対する感受性）
ΨεＲＡＣＫのＤ８６部位が、ＲＡＣＫ結合部位との分子内相互作用において、係合される場合、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じた状態（ｃｌｏｓｅｄ ｓｔａｔｅ）で存在し得、したがって、タンパク質分解により耐性である。対照的に、Ｄ（８６）Ａ変異体は、開いた立体配座を支持するはずであり得、したがって、タンパク質分解により感受性であるはずである。この仮説を試験するために、昆虫細胞内で発現されたεＰＫＣ Ｗｔおよび変異体を、εＰＫＣについて以前に示したように（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））、エンドペプチダーゼ（Ａｒｇ Ｃ）によりタンパク質分解に供した。Ａｒｇ Ｃによる分解を、全長εＰＫＣの減少によりモニタリングした。
【００８８】
（材料）
制限酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより得た。抗εＰＫＣ Ｖ５抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより得た。
【００８９】
（細胞培養）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞（ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ， Ｓｏｅｂｏｒｇ， Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された）を、ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）、１０％ウシ胎仔血清（米国で認可された、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）、および抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）を補充した、Ｆ−１２（ＨＡＭ）培養混合物の培地に維持した。ＭＣＦ７細胞（Ｊａｍｅｓ Ｆｏｒｄ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの贈与物）を、５％ ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）中に維持した。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養した。昆虫細胞を、２６℃で増殖し、Ｓｆ９細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）および抗生物質を補充したＳＦ９００ＩＩ ＳＦＭ培地、Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）で培養した。Ｈｉ５昆虫細胞を、抗生物質を含有するＩｎｓｅｃｔ Ｘｐｒｅｓｓ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養した。
【００９０】
（構築物）
これらの研究において使用したＥＧＦＰ−εＰＫＣ構築物は、ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ，Ｓｏｅｂｏｒｇ，Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された。この構築物は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６５２９３で受託されたヒトεＰＫＣ配列と比較して、２つのアミノ酸置換（Ｑ（３４）ＡおよびＳ（３３６）Ｇ）を含んだ。このクローンの部位特異的変異誘発を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ特定部位変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の指示書に従って使用して実施した。この部位特異的変異誘発について使用したプライマーは：Ｄ（８６）Ｎについて、順方向プライマー（５’−ＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号８７）、および逆方向プライマー（５’−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣ−３’）（配列番号８８）であった。Ｄ（８６）Ａについて、順方向プライマー（５’−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣ−３’）（配列番号８９）、および逆方向プライマー（５’−ＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号９０）であった。εＰＫＣ変異体を完全に配列決定し、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）部位に切断して、ｐＥＹＦＰＣ１およびｐＥＣＦＰ Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に再度ライゲーションすることにより、サブクローン化した。バキュロウイルス発現系における発現について、ＧＦＰ−εＰＫＣを、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩで切断して、インサートを放出し、Ｋｌｅｎｏｗ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で満たし、そしてＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化したｐｖＬ １３９２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化した。これらの研究において使用した、ＰＺｅｏＳＶへクローン化したヒトεＲＡＣＫ構築物は、ＢｉｏＩｍａｇｅ Ａ／Ｓ， Ｓｏｅｂｏｒｇ， Ｄｅｎｍａｒｋより好意で提供された。εＲＡＣＫインサートを、Ｓｃａ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＸｈｏ１で切断することにより放出し、Ｋｌｅｎｏｗで端部を平滑にし、そしてＰａｃＧ３Ｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＳｍａ１部位へ再度ライゲーションした。εＲＡＣＫを、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。
【００９１】
（一過性のトランスフェクション）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＨｉ５細胞のトランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造者の指示書に従って、実施した。
【００９２】
（昆虫細胞タンパク質の発現）
バキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞で産生し、全てのタンパク質を、Ｈｉ５細胞で発現した。全ての構築物の発現は、トランスフェクション後７２時間で最適であった。感染されたＨｉ５細胞を、ホモジナイズ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２５Ｍスクロース、１２ｍＭ βＭＥ、およびプロテアーゼインヒビター：ロイペプチン（２５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５μｇ／ｍｌ）、ＰＭＳＦ（１７μｇ／ｍｌ）、ＳＢＴＩ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｅ６４（２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ））で溶解した。４９０００ｇにて３０分間スピン後に、可溶性画分を単離し、その上清を、さらに使用するまで、−２０℃にて５０％グリセロール中で保存した。
【００９３】
（Ａｒｇ Ｃタンパク質分解アッセイ）
Ａｒｇ Ｃ消化を、記載されるとおりに実施した（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））。約７０ｎｇのＰＫＣを含有する粗昆虫細胞溶解物（標準（ＰＫＣ（ＰａｎＶｅｒａ））とのウェスタンブロット比較により決定した）を、室温にて、２０μｌのエンドプロテイナーゼＡｒｇ Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ２５ユニット／ｍｌ）を含む５２０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で消化した。アリコートを、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で指定された時点において取り出し、次に抗εＰＫＣ抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
【００９４】
（統計分析）
定量分析について、オートラジオグラフを走査し、そしてＮＩＨ画像化ソフトウェアを使用して定量した。吸光度データの分析を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。統計的有意差を決定するために、ａ１テイル２型のＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ）を使用した。時間の経過による曲線の有意差を、２つの様式のＡＮＯＶＡ試験（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ（登録商標））を使用して決定した。
【００９５】
（結果）
これらの実験条件下で、Ｄ（８６）Ａ変異体は、野生型（Ｗｔ）酵素を比較した場合に、Ａｒｇ Ｃによる分解に対する酵素の感受性を変化しなかったが、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔのいずれよりも、タンパク質分解に対してより有意に耐性であった（図５Ａ、Ｂ）。
【００９６】
（実施例５）
（εＰＫＣ変異体のεＲＡＣＫへの結合）
ＲＡＣＫは、活性なＰＫＣに結合する（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．＆ Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ．Ｓ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：３５−４２（１９９８）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．（公式にはＣｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）１：６９３−７０６（１９９０）。ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が、不活性な閉じた形態（ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｍ）を安定化する場合、この分子内相互作用の親和性の増加または減少は、酵素のそのＲＡＣＫに対する結合能力において、対応する減少または増加を引き起こすはずである。不活性な閉じた形態を安定化する、本明細書中で提案されるΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の親和性の増加または減少が、酵素のそのＲＡＣＫに対する結合能力において、減少または増加を引き起こすかどうかを試験するために、リン脂質（ＰＬ）アクチベーターの存在下および非存在下にて、昆虫細胞で発現するεＰＫＣ（ＷｔおよびΨεＲＡＣＫ変異体）の免疫化されたＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合を、定量した。
【００９７】
（εＲＡＣＫ結合アッセイ）
εＰＫＣまたはＧＳＴ−εＲＡＣＫのどちらかを発現する昆虫細胞を、実施例４に記載されるとおりに溶解した。ＧＳＴ−εＲＡＣＫ １０ｎｇを、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ｂｅａｄ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定し、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ βＭＥ、および０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、全体を洗浄した。次いで、固定したＧＳＴ−εＲＡＣＫを、リン脂質アクチベーター（ＰＬ）（１回の反応あたり１２μｇのホスファチジルセリン、１回の反応あたり４００ｎｇのＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）の存在下または非存在下にて、１００ｎｇのＷｔ、Ｄ（８６）Ａ、またはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣタンパク質を含有する昆虫細胞溶解物の可溶性画分とともに４℃にて１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で全体を洗浄する際に、結合されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶出させ、タンパク質を、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。εＲＡＣＫと相互作用するεＰＫＣの量を、抗εＰＫＣ−Ｖ５抗体を用いて、εＰＫＣについてのウェスタンブロットプローブにより定量した。次いで、ブロットを、抗ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で再度プローブ化し、等量のＧＳＴ−εＲＡＣＫが、各々の結合アッセイにおいて存在することを検証した。この実施例についての全ての他の方法を、例えば、実施例４に記載されるとおりに実施した。
【００９８】
（結果）
ＰＬアクチベーターの非存在下において、Ｄ（８６）ＡεＰＫＣ変異体のεＲＡＣＫへの結合は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ酵素のいずれかの結合よりも、少なくとも２倍大きかった（図５Ｃ、Ｄ）。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ酵素のεＲＡＣＫへの結合は、ＰＬの存在下にて、有意に増加し、これに対して、Ｄ（８６）Ａ変異体のεＲＡＣＫへの結合は、増加しなかった（図５Ｃ、Ｄ）。等しい濃度のＰＬの存在下にて、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔεＰＫＣのいずれかよりも、Ｄ（８６）ＮεＰＫＣのεＲＡＣＫ結合は少なかった。これらの結果は、Ｄ（８６）Ａ変異体のεＲＡＣＫ結合部位は、εＲＡＣＫへの結合についてすでに利用可能であるが、これに対して、この部位は、ＷｔまたはＤ（８６）ＮεＰＫＣの両方で覆われ、活性化の際のみに、結合に対して接近可能である、という予測に一致する。
【００９９】
（実施例６）
（細胞内のεＰＫＣおよびεＰＫＣ変異体の転位の割合）
本明細書中に記載されるΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣのインビトロの研究は、ΨεＲＡＣＫは、不活性な閉じた状態を安定化する分子内相互作用に関するという、本明細書中で提案された仮説を支持する。この仮説をさらに試験するために、刺激に対する応答において、細胞内のΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣの転位の割合を、試験した。転位プロセスの一部は、ΨεＲＡＣＫ部位と、εＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の妨害を必要とする、と本明細書中で仮定した。この分子内相互作用の調節が、εＰＫＣの転位の割合に影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体を、そのアミノ末端に、ＧＦＰタンパク質、ＣＦＰタンパク質またはＹＦＰタンパク質を融合させ、そして、細胞分画法およびリアルタイム画像化法の両方により転位を分析した。
【０１００】
（キナーゼアッセイ）
異なるεＰＫＣ変異体の基質をリン酸化する能力を、Ｋｉｋｋａｗａ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３５：６３６−６４３（１９８６）から改変された方法により、以下の［γ３２Ｐ］ＡＴＰのミエリン塩基性タンパク質への取り込みによりアッセイした。ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を、液体シンチレーションによるか、または免疫沈降実験については、オートラジオグラフィーにより測定した。免疫沈降した酵素のキナーゼ反応について、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、一回の反応あたり０．３μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、一回の反応あたり９μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、一回の反応あたり１２μｇのミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ）および一回の反応あたり５０ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる、２０μｌのキナーゼ反応緩衝液に再懸濁した。必要とされる場合、一回の反応あたり４μｌのリン脂質を添加した。リン脂質を、上記のとおりに調製した。キナーゼ反応を、ＳＤＳサンプル緩衝液を用いて、煮沸して停止した。次いで、サンプルを１２％ ＳＤＳ ＰＡＧＥを進行させ、ニトロセルロースに移して、オートラジオグラフィーに曝露した。次いで、同じニトロセルロースを、抗εＰＫＣ（Ｖ５）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で発展させて（ｄｅｖｅｌｏｐ）、免疫沈降した融合タンパク質の量を検証した。
【０１０１】
（ウェスタンブロットによるＰＫＣ転位の分析）
トランスフェクションから２４時間後の細胞を、以前に記載されたように（Ｓｃｈｅｃｈｔｍａｎ，Ｄ ＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４５：４７０−４８９（２００２））、さらに２４時間、血清を欠乏させ、そしてホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、指定された時間および濃度で、室温にてインキュベートし、その後、分画した。ＰＫＣの分布を評価するために、異なる細胞画分を、ＳＤＳ ＰＡＧＥを進行させ、ウェスタンブロット分析に移し、そして抗εＰＫＣ Ｖ５抗体でプローブした。過剰発現したＧＦＰ−εＰＫＣの溶解物を、約０．２μｇ／ウェルに希釈した。この濃度においては、内因性εＰＫＣは、検出されなかった。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例４に記載されるとおりに実施した。
【０１０２】
（顕微鏡検査および分析）
ＣＨＯ細胞を、カバーガラス上で増殖させ、実施例４に記載されるように、血清を欠乏させた。各々の実験について、細胞を、市販の金属製カバーガラスホルダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に移した。このホルダ内において、カバーガラスは、１ｍｌ浴の底部を構成した。次いで、培地を、細胞外緩衝液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび３０ｍＭ グルコース）で置き換えた。細胞を、細胞外緩衝液中で、ＰＭＡ（１００ｎＭ）またはＡＴＰ（１ｍＭ）のいずれかで、刺激した。ＧＦＰで標識した構築物の蛍光画像を、レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｐａｓｃａｌ，Ｚｅｉｓｓ）の、４８８ｎｍの励起光線を使用して達成し、発光を、５０５〜５５０ｎｍの帯域フィルタを通して収集した。細胞を、１．２開口数（ＮＡ）で４０×Ｚｅｉｓｓ Ｐｌａｎ−ａｐｏ油浸対物レンズを使用して、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ、１００Ｍ）のステージ上で画像化した。ＣＦＰとＹＦＰとの融合タンパク質の２色の画像化について、回転盤Ｎｉｐｋｏｗ共焦点顕微鏡を使用した。４０×油浸Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズ（１．３５ＮＡ）を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡を使用して、細胞を観察し、ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）および２×２ピクセルビニングで、画像を入手した。ＣＦＰを４４２ｎｍのヘリウム−カドミウムレーザー（Ｋｉｍｍｏｎ）のレーザー光線で励起し、これに対して、ＹＦＰを、５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザー（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ）の光線で画像化した。ＦＲＡＰ実験について、細胞質の局在領域のＹＦＰ標識タンパク質を選択的に光脱色する（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ）するために、５１４ｎｍのＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）の光線を、最大出力（約４００ｍＷ）にて使用した。これらの実験について、６０×油浸対物レンズ（１．４ＮＡ）を、使用した。これらの条件下で、そしてビーム経路に虹彩絞りを配置することにより、約３５μｍ２を測定する細胞質の領域内において、５００ｍｓのＹＦＰ蛍光の８０％の脱色を可能にした。リアルタイム共焦点画像を、ＰＭＡを利用する実験について、２０分間の間１０〜１５秒間ごとに入手し、ＡＴＰで刺激した細胞の場合においては、３分の全継続時間の間、５秒ごとに入手した。各々の時間の連続において、第５の画像の後に、試薬を、細胞チャンバに添加した。一般的な色素の光脱色レベルが１０〜３０％を超えないことを確認する実験において使用されたものと、同じ画像化条件を使用して、コントロール時間経過（ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ）を入手した。全ての画像を、室温で入手した。画像を１２ビットまたは１６ビットのファイルに書き出し、蛍光強度における変化を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）データ分析ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定した。ＰＫＣの転位をモニタリングするために、対象の小さな領域を、各細胞の細胞質内で選択し、蛍光強度値を、バックグラウンド値の減算後に、時間に対してグラフ化し、そして、正規化し、その結果、最初の蛍光値は、１００％であった。３つの独立した実験からの１０〜１５個の細胞の平均を、使用した。統計学的有意性を決定するために、ａ１テイル２型のＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌ）を使用した。
【０１０３】
（免疫沈降）
ＣＨＯ−Ｈｉｒ細胞を、血清を含まない培地中で２回洗浄し、トランスフェクションから１２〜２４時間後に血清を枯渇させた。次いで、細胞を、血清を含まない培地中に約１２時間維持し、その後、実験に供した。細胞を、ホモジネート緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２５Ｍ スクロース、１２ｍＭ β−メルカプトエタノール、ＰＭＳＦ（１７μｇ／ｍｌ）、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（２５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５μｇ／ｍｌ）、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（Ｓｉｇｍａ））で溶解し、そして、１０００×ｇで３０分間遠心分離した。次いで、その上清を、免疫沈降実験のために使用した。免疫沈降を、抗ＧＦＰモノクローナル抗体３Ｅ６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、製造者の指示書に従って実施した。簡単に述べると、溶解物（約２ｍｇ／ｍｌ）を、プロテインＧアガロースビーズ（２５μｌにパックされた容量、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、少なくとも３０分間、前もって清澄化し、そして１０００×ｇで回転した。次いで、この上清を、１μｇの抗ＧＦＰモノクローナル抗体で、少なくとも２時間インキュベートした。次いで、プロテインＧアガロースビーズ（２５μｌパックされた容量）を、溶解物−抗体複合体に添加し、少なくとも２時間インキュベートした（全てのインキュベーションは、４℃にて行った）。その後、ビーズを、緩衝液１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で３回、緩衝液２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で１回、そして緩衝液３（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。キナーゼアッセイについて、ビーズを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でさらに１回洗浄した。
【０１０４】
（結果）
インビトロキナーゼアッセイにおいて、ＧＦＰ融合タンパク質が、類似の触媒活性を有することは、最初に確認された。図６Ａおよび図６Ｂに見られるように、免疫沈降したＧＦＰ−εＰＫＣ変異体は、活性化の際に、ミエリン塩基性タンパク質を同じ程度までリン酸化した。
【０１０５】
ＷｔおよびΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体は、ホルボールエステルによる活性化に感受性であり、そしてこれらは、活性化の際に、細胞の可溶性画分から、粒子画分へ転位したこともまた、確認された。εＰＫＣ変異体の転位を、２つの異なる細胞株（ＭＣＦ−７およびＣＨＯ）を使用して決定した（ＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した（図６Ｃ）。ＭＣＦ−７細胞を、１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した（図６Ｄ、６Ｅ）。なぜならば、より高い用量のＰＭＡを用いたＭＣＦ−７細胞の刺激は、細胞の分離をもたらすためである）。ＰＭＡで処置した後、細胞を、可溶性画分と粒子画分とに分画し、そしてＧＦＰ−εＰＫＣを、抗εＰＫＣを使用するウェスタンブロット解析により、検出して定量した。１レーンあたり２０ｎｇのタンパク質をロードした場合に、ＧＦＰ−εＰＫＣ融合タンパク質（約１１０Ｋｄａ）のみが検出され、内因性εＰＫＣ（約８０Ｋｄａ）は検出されなかった。全ての変異体は、類似の発現レベルを示した（図６Ｃ〜６Ｅ）。ＰＭＡ処理において、粒子画分中に、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりも、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣでより大きな増加が存在した（図６Ｃ、図６Ｄ）。これは、ＰＫＣの分解に起因せず、εＰＫＣの全量は、活性化の際に変化しなかった。したがって、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体は、触媒的に活性であり、そして細胞の可溶性画分から粒子画分へ転位することにより、ＰＭＡによる活性化に応答した。２つの異なる細胞株を使用して、ＰＭＡで処理した１０分後に、ＷｔまたはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣと比較して、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣは、より粒子画分に転位することが、見出された。
【０１０６】
細胞分画実験は、動力学的な研究には適切でないことから、ＧＦＰ標識を使用して、ＣＨＯ細胞においてリアルタイムの顕微鏡分析により、異なるεＰＫＣの転位速度を追跡した（図７Ａ〜７Ｃ）。εＰＫＣの転位は、細胞末梢における蛍光強度の増加に随伴する、細胞質における蛍光強度の減少として見られた。ＰＭＡにより刺激した場合、全てのεＰＫＣ変異体は、同じ位置（細胞末梢）へ移動した（図７Ａ）。Ｄ（８６）Ａ変異体の細胞末梢への転位は、ＰＭＡ刺激の１分間以内に開始し、これに対して、Ｗｔ酵素の転位は、ＰＭＡ刺激のたった２〜３分後に明らかとなった（図７Ａ、矢印）。対照的に、Ｄ（８６）Ｎ変異体の転位は、刺激のたった５分後に明らかとなった。細胞末梢と細胞質との間の各々のεＰＫＣの分布を示す、代表的な株の強度プロフィールを、異なる時点における代表的な細胞について示す（図７Ｂ）。
【０１０７】
細胞質における蛍光強度の減少量は、細胞末梢における蛍光の増加量に比例した（Ｒａｇｈｕｎａｔｈ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０：９０１−９１２（２００３））。なぜならば、全蛍光強度は、変化しなかったためである。異なるεＰＫＣ酵素の転位を定量的にモニタリングするために、蛍光強度の減少を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＰＭＡ刺激の際に、細胞質領域で測定した。細胞質における蛍光の減少により得られたεＰＫＣ転位の図の比較は、転位速度が、２つの変異体とＷｔ εＰＫＣとの間で有意に異なることを示した（ｐ＜０．０００１；図７Ｃ）。Ｄ（８６）Ａ変異体は、ＷｔまたはＤ（８６）Ｎ εＰＫＣ変異体のいずれかよりも、より速い速度で転位した。Ｗｔ酵素は、Ｄ（８６）Ａ変異体と同様の安定状態レベル（このレベルにおいて、細胞末梢におけるεＰＫＣのさらなる蓄積は存在しなかった）に到達したが、より遅い速度で到達した。対照的に、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、ＷｔまたはＤ（８６）Ａ変異体のいずれかよりも、より高いレベルの安定状態に到達した。従って、Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりもより速い速度で転位し、そして細胞末梢へ到達したＤ（８６）Ｎ εＰＫＣ変異体の量は、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかの量よりも少なかった。
【０１０８】
（実施例７）
（εＰＫＣ転位の数学的モデリングは、εＰＫＣ転位が、少なくとも２つの工程のプロセスであることを支持する）
異なるεＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の転位の初期プロセスをさらに特徴付けるために、細胞質における蛍光の減少を、数学モデルに当てはめた。
【０１０９】
（数学的モデリング）
数学的モデリングを、異なるεＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の類似のレベルを発現する細胞のデータから、得た。非線形最小二乗回帰分析を、ＥＶｉｅｗソフトウェア（ＱＭＳ）を使用して実施し、微分方程式分析を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＭａｄｏｎｎａＴＭを使用して実施した。この実施例について、全ての他の方法を、例えば、実施例４および実施例６に記載されるとおりに実施した。
【０１１０】
経時的な蛍光を、ＮａｌｅｆｓｋｉおよびＮｅｗｔｏｎ Ｎａｌｅｆｓｋｉ，Ｅ．Ａ．＆ Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１３２１６−１３２２９（２００１）により以前になされたように一次の指数方程式（１）、および二次の指数方程式（２）を用いた非線形回帰分析により分析した。Ｉ（ｔ）は、時間（ｔ）において細胞質内で観察された分子の濃度であり、Ｃ１〜５は定数である。
【０１１１】
１．Ｉ（ｔ）＝Ｃ１＋Ｃ２ｅ（−Ｃ３（ｔ））
２．Ｉ（ｔ）＝Ｃ１＋Ｃ２ｅ（−Ｃ３（ｔ））＋Ｃ４ｅ（−Ｃ５（ｔ））
Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体の転位プロセスについて、一次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ（図８Ａ）および二次の指数方程式を使用して得た残差のグラフ（図８Ｂ）を、図８Ａ〜図８Ｄに示す。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣについての残差分析は、同様の結果を示した（データは示さず）。より小さく、かつより等しく分布した誤差を有する優れたフィットを、二次の指数方程式で得たことから、２工程のモデルを採用して、εＰＫＣ転位の最初のプロセスを例示した。第１の工程は、εＰＫＣが開くこと（ｏｐｅｎｉｎｇ）およびΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の崩壊であり、第２工程は、εＰＫＣの膜への結合である（この場合、膜への結合とは、脂質またはタンパク質のいずれかへの結合であり得る）。このプロセスは、以下のとおりに記載される：
【０１１２】
【化１】
ここで、ｋ１は、細胞質内で、εＰＫＣが開く速度であり、ｋ−１は、細胞質内で閉じる速度であり、ｋ２は、εＰＫＣが膜へ結合する速度であり、そしてｋ−２は、εＰＫＣが膜から解離する速度である。二次の指数方程式を使用して、定数Ｃ１、Ｃ３およびＣ５の値を、推定した（表１）。
【０１１３】
（表１は、二次の指数方程式を使用して推定した定数およびｋ１、ｋ−１、ｋ２、ｋ−２について計算した値を示す）
【０１１４】
【化２】
＊Ｄ（８６）Ｎについて、ｋ１＝ｃ５の関係は、妥当ではない。なぜならば、ｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２についての対応する値は、微分方程式を使用したシミュレーションにより得たためである。
Ｃ１の値は、安定状態の細胞質ゾルεＰＫＣのレベルに対応する。次に、この値は、Ｄ（８６）ＡならびにＷｔ εＰＫＣのＣ１およびＣ３について得た値が、統計学的に等しいかどうか、という仮説を決定する。ＷＡＬＤパラメータ検定を使用して、そしてＦ検定およびχｉ−Ｓｑｕａｒｅｄ検定を使用して、それぞれ、０．９および０．７のｐ値を得た。したがって、ＡおよびＤ、Ｃ１についての安定状態レベルは等しいと、仮定した。また、第２工程（膜への結合）は、εＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の間で異なるはずはなく、これは、Ｃ３が、Ｗｔ εＰＫＣとＤ（８５）Ａ εＰＫＣとの両方で等しいと想定した。したがって、安定状態レベル（Ｃ１）は、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣおよびＷｔ εＰＫＣについて等しく、そして第２工程（膜への結合）もまた等しい場合、Ｄ（８６）ＡおよびＤ（８６）Ａ εＰＫＣの両方についてのｋ−１（εＰＫＣの閉じる速度）が無視できることは、もっともらしい。ｋ−１が無視できる場合、以下の方程式（３−５）が適用でき、そしてｋ−２（方程式６）およびｋ２を計算するために使用され得る（表１）。
【０１１５】
３．（Ｃ１／１００）＝ｋ−２／（ｋ２＋ｋ−２）
４．Ｃ３＝（ｋ２＋ｋ−２）
５．Ｃ５＝ｋ１
６．ｋ−２＝［（Ｃ１／１００）（Ｃ３］
Ｉ０（ｔ）が、時間（ｔ）において細胞質内の閉じたεＰＫＣの濃度に等しい場合、Ｉ１（ｔ）が、時間（ｔ）において細胞質内の開いたεＰＫＣの濃度に等しい場合Ｉ２（ｔ）が、時間（ｔ）において膜でのεＰＫＣの濃度に等しい場合、そしてＩ（ｔ）が、時間（ｔ）（Ｉ０（ｔ）＋Ｉ１（ｔ））において細胞質内の開いたεＰＫＣおよび閉じたεＰＫＣの濃度に等しい場合、以下の微分方程式（７−９）が、このモデルを記載するために使用され得る。
【０１１６】
７．ｄＩ０（ｔ）／ｄｔ＝−（Ｋ１）（Ｉ０（ｔ））＋（Ｋ−１）（Ｉ１（ｔ））
８．ｄＩ１（ｔ）／ｄｔ＝−（Ｋ−１＋Ｋ２）ｌ１（ｔ）＋（Ｋ１）（Ｉ０（ｔ））＋（Ｋ−２）（Ｉ２（ｔ））
９．ｄＩ２（ｔ）＝−（Ｋ−２）（Ｉ２（ｔ））＋（Ｋ２）（Ｉ１（ｔ））。
【０１１７】
次に、この微分方程式を、Ｒｕｎｇｅ−Ｋｕｔｔａアルゴリズム（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ−Ｍａｄｏｎｎａ）を使用してＩ（ｔ）についての解を導き、そしてこの解を、実験データ（細胞質における蛍光の消失）と比較した。Ｉ（ｔ）の解を導き、そして計算したパラメータを、ｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２について使用し（表１）、細胞質内の（閉じたεＰＫＣの初期量は、１００％［Ｉ０（０）＝１００］に等しいと想定した。図８Ｃは、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣについての未加工のデータの曲線と二次の指数方程式を用いた非線形回帰分析により得た曲線との間のフィットを示す。図８Ｄは、Ｄ（８６）Ａについての未加工のデータの曲線とＩ（ｔ）についての微分方程式を解くことにより得た曲線との間のフィットを示す。同様のフィットの結果が、Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣについて得られた（データは示さず）。全ての曲線のフィットデータについての残差は、二次の指数方程式を使用する非線形回帰分析により得た残差と類似した（図４Ｂ；データは示さず）。
【０１１８】
Ｄ（８６）Ｎについての安定状態レベルは、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔのいずれかについてよりも高く（表１）、したがって、この変異体についてのｋ−１は、無視できない。この場合において、Ｒｕｎｇｅ−Ｋｕｔｔａアルゴリズムをまた使用して、微分方程式の解を導いた。第２工程（膜への結合）の速度は、εＰＫＣ変異体のいずれについても変更されないはずであることから、ｋ２およびｋ−２の値は、Ｄ（８６）ＡおよびＷｔについて得た値の範囲内にあるはずであることを想定した。本明細書中の実験データおよび数学的モデリングは、ともに、活性化の際に、εＰＫＣの細胞膜への２工程の転位プロセスを示唆する。第２工程は、分子内相互作用から独立しているのに対して、第１工程（本明細書中で酵素が開くことに関することが予測された）は、この分子内相互作用に大きく依存した。
【０１１９】
（実施例８）
（同じ細胞内でのＤ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣの同時のトランスフェクション）
１つの細胞内で、εＰＫＣ変異体の挙動をさらに調査するために、２つの異なるεＰＫＣ構築物を、ＹＦＰまたはＣＦＰのいずれかに融合させて、ＣＨＯ細胞内へ同時にトランスフェクトした。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２０】
（結果）
ＹＦＰ−ＡおよびＣＦＰ−Ｄ εＰＫＣを、同様のレベルで同時に発現する代表的な細胞を、図９Ａに示す。ＰＭＡを用いた刺激の際に、Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｗｔ酵素より早く転位した（図９Ａ）。細胞質において蛍光強度の減少を表す、定量分析を、図９Ｃに示す。Ｄ（８６）Ａ変異体を、ＰＭＡ刺激から１．５分後に、細胞末梢にて見出し、それに対して、ＷｔεＰＫＣの転位は、１０分後においてさえも最小限であった（図９Ａ）。したがって、Ｄ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ変異体およびＷｔεＰＫＣが、同じ細胞内にある場合でさえも、Ｄ（８６）Ａは、Ｗｔ εＰＫＣより早く転位した。
【０１２１】
（実施例９）
（Ｇタンパク質共役レセプターによる細胞刺激の際のΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の転位速度）
次に、ＰＭＡではなく、レセプターのシグナル伝達を介して、転位を刺激する場合に、異なるεＰＫＣの転位速度における差異も観察されるかどうかを、決定した。ＡＴＰを、事前に使用して、プリン性Ｇタンパク質共役レセプターを刺激することにより、ＣＨＯ細胞中のＰＫＣを活性化した（Ｍａａｓｃｈ，Ｃ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１４：１６５３−１６６３（２０００））。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２２】
（結果）
ＡＴＰを用いた刺激の際に、ＧＦＰ−εＰＫＣの細胞末梢への転位は、ＰＭＡにより誘導される転位よりも速いことが、本明細書中で見出された（図９Ｂに対して、図７Ａ〜図７Ｃ）。Ｄ（８６）ＡおよびＷｔ εＰＫＣの転位は、刺激から１０秒後にすでに明らかであるが、Ｄ（８６）Ｎ εＰＫＣ酵素の転位は、刺激の４０秒後におこり、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりもより有意に高いレベルで安定な状態に到達した（図９Ｂ）。細胞質の蛍光強度の減少で表す定量分析を、図９Ｄに示す。
【０１２３】
（実施例１０）
（εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体の拡散速度）
異なる転位速度は、細胞のεＰＫＣの全体的な移動（拡散）における差異を反映し得る。したがって、細胞質酵素の光脱色後の蛍光強度の回復（ＦＲＡＰ）を測定した；εＰＫＣの移動を、脱色した領域において蛍光を回復するのに必要な時間をモニタリングすることにより、測定した。この実施例について、全ての方法を、例えば、実施例４、実施例６および実施例７に記載されるとおりに実施した。
【０１２４】
全てのεＰＫＣについて、５０％のＦＲＡＰが、同じような時点で到達した（それぞれのεＰＫＣあたり少なくとも１０個の細胞の平均は、Ｗｔ＝９．０±１．２秒、Ｄ（８６）Ａ＝９．２±１．１秒、そしてＤ（８６）Ｎ＝９．１±１．６秒であった）。脱色した領域において完全に回復した後の蛍光（Ｆ∞）と、脱色前に観察された蛍光（Ｆｉ）と、脱色直後の蛍光（Ｆ０）を比較することにより、移動画分＝（Ｆ∞−Ｆ０）（Ｆｉ−Ｆ０）を、決定した。移動画分は、Ｗｔおよび変異体εＰＫＣと他のタンパク質および膜との相互作用における差異により影響を受け得ることから、これは、決定するのに重要であった。移動画分は、全てのεＰＫＣについて等しかった（Ｗｔについて６３±２％、Ｄ（８６）Ａについて６３±４％、およびＤ（８６）Ｎについて６４±２．５％、それぞれ少なくとも１０細胞の平均）ことが見出された。したがって、転位速度における差異は、不活性な酵素の移動における差異に起因しないが、むしろ、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の調節に起因した。
【０１２５】
（考察）
シグナル伝達において重要な要素は、細胞外刺激の非存在下において酵素が不活性なままである、固有の機構である。この機構は、活性部位が曝露されない閉じた立体配座を安定化する、分子内相互作用の使用に関する。刺激の際に、酵素は、開いた立体配座を採用し、これにより、分子内相互作用は中断されて、開いた形態を安定化する分子間相互作用のための結合部位が曝露され、触媒的に活性な酵素をもたらす。ＰＫＣの場合において、分子間相互作用部位は、リン脂質およびアンカータンパク質のための結合部位である（Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ．Ｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：３５−４２（１９９８）；Ｏａｎｃｅａ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４０：４８５−４９８（１９９８））。本明細書中で、εＲＡＣＫ結合部位およびΨεＲＡＣＫ部位との間の分子内相互作用における変更は、酵素の転位速度に影響を及ぼし、さらに、εＰＫＣの転位およびシグナル伝達におけるこの分子内相互作用の役割を補助することが実証される。
【０１２６】
以前に記載されたように、εＰＫＣにおけるΨεＲＡＣＫ配列は、εＲＡＣＫ配列と約２５％異なる。電荷の変化（Ｎ−Ｄ）は、εＰＫＣとそのＲＡＣＫ（εＲＡＣＫ）との間の分子間相互作用と比較して、εＰＫＣ内の分子内相互作用力価の差異に寄与することを、本明細書中で示唆した（Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎ，Ｍ．Ｃ． ＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９１９−９２４（１９９８）；Ｄｏｒｎ，Ｇ．Ｗ．ら，第２版，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７９８−１２８０３（１９９９））。εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ配列のＤ（８６）をＮへ変異させることで、ΨεＲＡＣＫとεＰＫＣのＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が増加することにおそらく起因する、野生型の酵素よりもよりゆっくりと転位する酵素を、作製した。εＰＫＣのＤ（８６）をＡへと変異することにより、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を無効にし、そして野生型酵素よりもより速い速度で転位する酵素をもたらした。
【０１２７】
（εＰＫＣのΨεＲＡＣＫ部位の変異は、εＰＫＣの内因性の性質に影響を及ぼす）
３つの基準を使用して、εＰＫＣ内の分子内相互作用におけるΨεＲＡＣＫ部位の役割、およびこの相互作用におけるＤ８６の役割を実証した。第１の基準は、プロテアーゼに対する酵素の感受性であった；開いた酵素は、活性化後のプロテアーゼ分解により感受性であった（Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２６３−１５２６６（１９９２））。Ｄ（８６）Ｎ変異体は、タンパク質分解により耐性であり；Ｄ（８６）Ｎ変異体は、Ｄ（８６）Ａ酵素またはＷｔ酵素のいずれかと同じ程度の分解について２倍の時間を必要とすることが、本明細書中で示された（図５）。したがって、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じているか、または不活性な酵素である。Ａ変異体のタンパク質分解に対する感受性は、野生型Ｄ（８６）εＰＫＣと同じであったことから、この変異体は、野生型酵素と立体配座的に異なるかどうかは、この方法をもちいては、決定できなかった。
【０１２８】
第２の判断基準は、野生型酵素および変異体酵素のεＲＡＣＫへのＰＬ依存性結合を試験した。Ｄ（８６）が、細胞内相互作用のために重要であるなら、Ｄ（８６）Ａは、εＲＡＣＫ結合についての脂質の活性化にそれほど依存しないはずである。実際には、１つのアミノ酸置換は、ΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を調節した；Ｄ（８６）Ｎ変異体は、εＲＡＣＫとより大きな類似性を有し、そしてそのεＲＡＣＫへ結合する能力を減少した。このことは、Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より閉じた立体配座であることを示す。対照的に、Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体は、ＲＡＣＫ結合についてのアクチベーターにそれほど依存せず、このことはこの変異体が、より開いた立体配座であることを示す。
【０１２９】
（ΨεＲＡＣＫ部位の変異および細胞のεＰＫＣの転位速度）
細胞内相互作用におけるΨεＲＡＣＫ部位の重要な役割を実証する、第３の基準は、細胞の活性化の際に、酵素の転位速度を試験した。Ｄ（８６）Ａ εＰＫＣ変異体は、細胞分画研究により測定すると、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのどちらかよりも、有意に早く転位した。リアルタイム共焦点顕微鏡法を使用して、Ｄ（８６）Ａ変異体は、野生型εＰＫＣよりも速く転位し、次に、Ｄ（８６）Ｎ変異体よりも速く転位することを、本明細書中で実証した。同時に、ΨεＲＡＣＫ部位は、刺激の非存在下において、εＰＫＣの閉じた立体配座を安定化する、重要な分子内相互作用を媒介するようである。
【０１３０】
異なるεＰＫＣ変異体の転位機構についてのスキームを図１０に示す。ΨεＲＡＣＫ部位とεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用の崩壊は、膜への結合を促進し、そしてこのプロセスにおける律速段階であるはずである。Ｄ（８６）を変異することにより、この分子内相互作用を調節することは、転位プロセスの第１工程に影響を及ぼすことにより、εＰＫＣの転位速度を変化する。本明細書中のデータの数学的モデリングはさらに、転位を導く分子事象を解明した（図８を参照のこと）。非線形回帰分析を使用して、２次の指数方程式は、１次の指数方程式よりも良好にフィットし、このことは、ＰＭＡにより誘導される転位は、少なくとも２つの工程を含むことを示唆する（図７）。第１の工程は、酵素が開くプロセスおよび閉じるプロセスを表し、そして第２の工程は、細胞膜への開いた酵素の結合を表すことを、本明細書中で提案した。重要なことに、Ｄ（８６）Ｎ変異体の安定状態レベルは、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ ＰＫＣのいずれかのレベルよりも高く、このことは、細胞末梢へ到達したＤ（８６）Ｎの量は、ＷｔまたはＤ（８６）Ａ εＰＫＣのいずれかの量よりも少ないことを示唆する。Ｄ（８６）Ａ変異体は、Ｄ（８６）ＮまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかよりも、有意により速く転位した。粒子画分におけるＤ（８６）Ａの安定状態レベルは、Ｗｔ酵素の安定状態レベルと同様であり、かつ、転位の第２工程（膜への結合）は、全ての変異体について等しいことから、酵素の閉じる速度は、酵素が一旦開くと、無視できると考えることができた。Ｏｃｈｏａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．３１１：８３７−８４９（２００１））らは、Ｖ１ドメインのＰＬへの結合は、Ｄ（８６）Ａ変異により変更され、このことは、本明細書中で、転位の第２工程（膜への結合）は、変化されないと提案する仮説を支持することを実証した（Ｏｃｈｏａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．３１１：８３７−８４９（２００１））。しかし、Ｎ変異体について、ｋ１（ＰＫＣが開く速度）は、Ｄ（８６）Ａよりも低く、Ｗｔ εＰＫＣに類似し、そしてｋ−１（εＰＫＣが閉じる速度）は、ＰＫＣを無視できなかった。
【０１３１】
Ｓｈｉｒａｉら，（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４３：５１１−５２１（１９９８））と同様に、εＰＫＣのＡＴＰにより誘導される転位は、ＰＭＡに誘導される転位よりも非常に迅速であったことが見出された（図９Ｂ対図７）。ＡＴＰにより媒介される転位は、迅速なプロセスであることから、ＷｔとＤ（８６）Ａ変異体との間の差異は、分析した時間間隔では観察されなかった。しかし、Ｄ（８６）Ｎ変異体の転位は、野生型またはＡ変異体のいずれよりも有意に低く、このことは、εＲＡＣＫ部位の重要性、およびＰＫＣ転位についての分子内相互作用の崩壊を支持した。
【０１３２】
Ｓｃｈａｅｆｅｒらは、古典的ＰＫＣと新規ＰＫＣとの間の転位における差異が、拡散速度、および膜との衝突効率における差に起因することを示唆した（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｍ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５：１６３４−１６３６（２００１）；Ｌｅｎｚ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：２９１−３０２（２００２））。拡散および膜への衝突は、転位速度の要因であるようであるが、本明細書中のデータは、酵素における立体配座の変化もまた生じ、少なくとも２工程のプロセスを導くことを実証する。
【０１３３】
新規ＰＫＣ（カルシウム誘導性）のアイソザイムの場合、酵素の開裂を誘発するものが何であるかは、なお明らかでない。本明細書において、εＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用を崩壊することは、転位に先行し、細胞末梢へアンカーする、活性化における重要な工程であることが示されている。このアンカーが、主に膜への結合により媒介されるかどうか、アンカータンパク質に関するかどうか、そして脂質への結合は、タンパク質への結合に先行するかどうかは、εＰＫＣを過剰発現する細胞において決定することができなかった。しかし、内因性εＰＫＣの転位は、そのεＲＡＣＫとの同時局在化をもたらし（Ｃｓｕｋａｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９２００−２９２０６ （１９９７））、そして、εＰＫＣ内のＲＡＣＫ結合部位の１つに対応するペプチド（εＶ１−１ペプチド）を有する細胞内εＲＡＣＫへの結合の崩壊は、εＰＫＣの転位およびεＲＡＣＫとの同時の局在化を阻害する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４９６２−２４９６６（１９９６）；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：１１７３−１１７９（２０００））ことが、以前に実証されていた。重要なことに、ΨεＲＡＣＫ配列に対応するペプチドは、εＰＫＣの転位、およびεＲＡＣＫとの同時局在化を誘導し、そして、εＰＫＣの機能を誘発することが、以前に示されている（Ｄｏｒｎ， Ｇ．Ｗ．ら，第２版，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７９８−１２８０３（１９９９））。
【０１３４】
酵素が過剰発現する場合、この研究においては、ＲＡＣＫを含む結合タンパク質は、酵素に対してもはや化学量論的量で存在しないようである。実際には、過剰発現した野生型εＰＫＣおよび内因性εＲＡＣＫは、細胞内に同時に局在せず、それに対して、内因性εＰＫＣは、εＲＡＣＫとともに同時局在し、その後、非トランスフェクト細胞において活性化した（示さず）。εＰＫＣとともにεＲＡＣＫを同時発現する多くの試みが、失敗したことから、本実施例において実施した転位の試験は、おもに、ＧＦＰ−酵素と細胞膜内の脂質との相互作用を主に反映している。
【０１３５】
εＰＫＣにおいて、このＲＡＣＫ結合部位はどこにあるのか。εＰＫＣのＶ１ドメインは、βＰＫＣのＣ２ドメインに対して相同である（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｌ．Ｖ．，ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３９６−４０２（１９９５））。しかし、βＰＫＣ（３０）のＶ５領域にはさらなるＲＡＣＫ結合部位が存在し、βＰＫＣのＣ２領域を用いた分子動力学研究は、ΨＲＡＣＫとＣ２領域内のＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用が、不可能であることを示した（Ｂａｎｃｉ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２９８８−１２９９７（２００２））。かわりに、εＲＡＣＫとβＰＫＣのＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用は、βＰＫＣのＣ２領域とＶ５領域との間に起こるようであることが本明細書中で示唆される。これはまた、εＰＫＣについても原因となり得る。近年の研究員および共同研究者により、αＰＫＣにおいてもまた、不活性な状態で酵素を維持する、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインとの間のさらなる分子内相互作用が存在することを実証した（Ｓｌａｔｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５２７７−１５２８５（２００２））。さらに、αＰＫＣは、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインとの間の分子内相互作用を介して、ダイマーを形成することが示唆された。このことが、εＲＡＣＫ結合部位およびΨεＲＡＣＫについてあてはまるという仮説は、排除された（Ｓｌａｔｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５２７７−１５２８５（２００２））。
【０１３６】
インタクトなεＰＫＣのΨεＲＡＣＫ部位を変異させることにより、本明細書中において、εＰＫＣの転位プロセスにおいて、ΨεＲＡＣＫとεＲＡＣＫ結合部位との分子内相互作用の崩壊の重要性が実証された。発明者の知る限りでは、これが、（Ψ−基質）部位、または触媒部位、あるいはカルシウム結合部位の外側でなされた一電荷の変化が、転位速度の変化を誘発した最初である。まとめると、ΨεＲＡＣＫとＲＡＣＫ結合部位との間の相互作用の崩壊は、ＰＫＣ転位の基準であり、律速段階であることが、本明細書中で結論付けられる。
【０１３７】
前述より、本発明の種々の目的および特徴が、いかに満たされるかが明らかになり得る。例えば、アミノ酸残基を置換してアゴニスト中の電荷の変化を達成することにより、ＰＫＣペプチドアゴニストをＰＫＣペプチドアンタゴニストへ変換するための方法（その結果、本発明の１つの形態において、改変されたアゴニストペプチドは、ＲＡＣＫにより類似する）が、記載される。ＰＫＣアイソザイム選択的アンタゴニストおよびアゴニストを同定するために現在使用されるこのアプローチは、多くのタンパク質の一次配列を含む巨大なデータベースの利用可能性から利益を得る。本明細書中で、ペプチドアゴニスト（ΨεＲＡＣＫが挙げられる）を取り扱い、そして１つのアミノ酸残基を置換する（ＤをＮへ）ことにより、アイソザイム特異的転位アゴニストを、アンタゴニストへ変換するためにこのアプローチを使用した。この変化は、ＲＡＣＫ由来の配列に対するペプチドの類似性を増加し、そしてまた、ペプチドの電荷の変化を達成した。心筋細胞収縮速度の調節（ψεＲＡＣＫによって誘導され得るεＰＫＣ媒介性機能）が、上記ψεＲＡＣＫ中のアスパラギン酸（Ｄ）の残基の位置においてアスパラギン（Ｎ−ψεＲＡＣＫ）またはアラニン（Ａ−ψεＲＡＣＫ）を含むペプチドによって誘導されないことを示すことによって、この改変されたペプチドの活性における変化は、本明細書中に記載される実施例において例証される。さらに、Ｎ−ψεＲＡＣＫは、収縮のＰＭＡ調節またはψεＲＡＣＫ調節、ならびにＰＭＡ誘導性εＰＫＣ転位またはΨεＲＡＣＫ誘導性εＰＫＣ転位を阻害した。したがって、電荷の変化を引き起こす単一アミノ酸置換は、上記ＲＡＣＫ配列に対する上記ペプチドの類似点を増加させ、そしてアゴニスト活性の喪失およびアンタゴニスト活性の獲得を生じた。
【０１３８】
本発明は、特定の実施形態について記載されているが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが当業者に対して明白となる。特に指示の無い限り、本明細書中の全ての用語は、本発明の分野における当業者が有する意味と同様の意味を有する。実施者は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ Ｐａ．）（これは、当該分野の定義および用語について定期的かつ周期的に更新される）に対して、特に従う。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１Ａは、新生児ラットの心筋細胞において、コントロール、キャリアペプチド（正方形）、およびΨεＲＡＣＫペプチド（三角形）で処理した細胞における時間の関数として、１５秒間隔で測定した収縮の回数を示すグラフである。両方の細胞集団（コントロールおよびΨεＲＡＣペプチド処理）は、実施例１により十分に記載されるように、３０分間において、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で処理した。図１Ｂは、実施例１により十分に記載されるように、（ｉ）εＰＫＣアゴニストペプチド（ΨεＲＡＣＫペプチド）、（ｉｉ）ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、（ｉｉｉ）ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫペプチド、（ｉｖ）ＰＭＡ、ΨεＲＡＣＫペプチド、およびεＶ１−２ペプチド、または（ｖ）ＰＭＡ、ΨεＲＡＣＫペプチド、およびケレリトリン（Ｃｈｅ）で処理した後に基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現される、新生児ラット心筋細胞の収縮頻度を示す棒グラフである。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、実施例１により十分に記載されるように、時間の関数として、基底収縮頻度に対する収縮頻度の減少％として表現される、新生児ラット心筋細胞の収縮速度のグラフである。図２Ａ〜２Ｂは、ΨεＲＡＣＫペプチド（Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド）由来のεＰＫＣアンタゴニストペプチドで処理されない細胞（四角形）、およびＮ−ΨεＲＡＣＫ（配列番号２）で処理された細胞（菱形）についてのデータを示す。両方の細胞集合は、ＮΨεＲＡＣＫペプチドの投与後１５〜２０分で、１ｎＭ（図２Ａ）または５ｎＭ（図２Ｂ）のＰＭＡで処理した。そして、図２Ｃは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチドで処理し、次いでΨεＲＡＣＫ（配列番号１）および１ｎＭ ＰＭＡで処理した細胞（菱形）、およびΨεＲＡＣＫで処理し、次いで１ｎＭ ＰＭＡで処理した細胞についてのデータ（三角形）を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、コントロール、ペプチドキャリア（レーン番号１）、１ｎＭ ＰＭＡ（レーン番号２）、ＰＭＡおよびΨεＲＡＣＫ（配列番号１、レーン番号３）、あるいは、Ｎ−ΨεＲＡＣＫ、ΨεＲＡＣＫ、およびＰＭＡ（レーン番号４）で処理した、心筋細胞の細胞溶解性画分（Ｓ）から細胞粒子画分（Ｐ）へのεＰＫＣ（図３Ａ）およびαＰＫＣ（図３Ｂ）へのＰＭＡ誘導性転位のウェスタンブロット分析を示す。これは、実施例２により完全に記載される。
【図４】図４は、虚血エピソードより得られたラット心筋細胞に対する細胞損傷の％を示す棒グラフである。虚血に供されない筋細胞は、各々の棒の白抜きの領域により表し、虚血損傷の％を、塗りつぶした領域により表す。細胞を、虚血エピソード前に、ΨεＲＡＣＫペプチド、Ｎ−ΨεＲＡＣＫペプチド、Ａ−ΨεＲＡＣＫペプチド、εＶ１−２および実施例３により十分に示されるとおりのこれらのペプチドの種々の組み合わせで、前処理した。
【図５】図５Ａは、実施例４により十分に記載されるとおりに抗εＰＫＣＶ５抗体を使用してプロテアーゼ、Ａｒｇ Ｃにより、ΨεＲＡＣＫ変異体の分解速度を示す、ウェスタンブロット分析を示す。Ｗｔ、野生型；Ｄ（８６）Ａ、εＰＫＣ変異体（ここでεＰＫＣに対するΨεＲＡＣＫの８６位におけるＤは、Ａで置換される）；Ｄ（８６）Ｎ、εｐＫＣ変異体（ここでεｐＫＣにおけるΨεＲＡＣＫの８６位におけるＤは、Ｎで置換される）。図５Ｂは、時間の関数として、Ａｒｇ ＣによるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の分解速度を示すグラフであり、ここでこのデータは、実施例４により十分に記載されるとおりの、５回の独立した実験の平均を表す。データは、酵素の最初の量に対して正規化し、全長εＰＫＣの％として表現する。Ｗｔ（黒い四角形）；Ｄ（８６）Ａ（白い三角形）；Ｄ（８６）Ｎ（白い丸）；＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５。図５Ｃは、実施例５により十分に記載されるように、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体を使用して決定する場合の、ＰＬの存在下および非存在下におけるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体のＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合を示すウェスタンブロット分析である。ＰＬはリン脂質アクチベーター（ホスファチジルセリンおよびＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）である。図５Ｄは、実施例５により十分に記載されるとおりの、ＰＬの非存在下（白い棒）および存在下（黒い棒）におけるΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体のＧＳＴ−εＲＡＣＫへの結合についての、（４回の独立した実験の平均の）ＰＫＣ野生型および変異体における結合の正規化を示すグラフである（＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５）。ＰＬはリン脂質アクチベーター（ホスファチジルセリンおよびＳｎ−１，２ジオレオイルグリセロール）である。
【図６】図６Ａは、実施例６により十分に記載されるように、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体で検出した、免疫沈降ＧＦＰ−εＰＫＣ変異体のウェスタンブロット分析（パネル上部）、および［γ３２Ｐ］標識ミエリン塩基性タンパク質のオートラジオグラフィーにより測定したその触媒活性（パネル下部、代表的な実験）を示す。図６Ｂは、実施例６により十分に記載されるように、εＰＫＣ野生型または変異体におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）リン酸化のグラフを示す（３回の独立したキナーゼ反応の平均は、ＰＬの存在下にてミエリン塩基性タンパク質リン酸化により見られるように、活性化の際にεＰＫＣ変異体の等しい活性を示す）（反応を３分間および１５分間実施した）。図６Ｃは、実施例６により十分に記載されるように、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫ変異体でトランスフェクトし、次に、１００ｎＭ ＰＭＡで１０分間処理したＣＨＯ細胞の転位を示すウェスタンブロット分析である。ＧＦＰ−εＰＫＣは、抗εＰＫＣ Ｖ５抗体で検出された。図６Ｄは、実施例６により十分に記載されるように、１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激する際に、ＭＣＦ−７細胞におけるＧＦＰ−εＰＫＣ変異体の転位を示すウェスタンブロット分析を示す。図６Ｅは、実施例６により十分に記載されるように、ＰＭＡ刺激後のＷｔ、Ｄ（８６）Ｎ変異体、またはＤ（８６）Ａ変異体における、ＧＦＰ−εＰＫＣの転位のグラフを示す。ＭＣＦ−７コントロール（白い棒）および１０ｎＭ ＰＭＡで１０分間刺激した細胞（黒い棒）における、ＧＦＰ−εＰＫＣ ΨεＲＡＣＫの転位の４回の独立した実験の平均を、図に示す（＊Ｔ検定を使用してｐ＜０．０５）。
【図７】図７Ａは、実施例６により十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡでの刺激の際に、異なる時点における、ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の共焦点図を示す。パネル内の矢印は、各々のεＰＫＣ変異体について、細胞末梢への転位が明らかとなった時点を示す。図７Ｂは、実施例７により十分に記載されるように、異なる時点（Ａのラインにより示される、左のパネル）において、代表的なトランスフェクトされた細胞についての、細胞末梢と細胞質との間のＰＫＣの分布を示す、代表的なライン強度プロフィールを示す。図７Ｃは、実施例６により十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡによる刺激後、時間の関数として、Ｗｔ細胞、またはＤ（８６）Ａ ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体、またはＤ（８６）Ｎ ΨεＲＡＣＫ εＰＫＣ変異体の細胞質における蛍光％のグラフを示す：Ｗｔ（黒い四角）、Ｄ（８６）Ａ（白い三角）；Ｄ（８６）Ｎ（白い丸）。平均転位速度は、最初の蛍光強度を１００％に正規化することにより表現した（少なくとも３回の独立した実験の平均、各々の実験について少なくとも３個の細胞を分析した）。変異体およびＷｔ酵素についての時間の経過は、ｐ＜０．００１の二元配置ＡＮＯＶＡにより統計学的に互いに異なる。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、実施例７により十分に記載されるように、Ｄ（８６）Ａの数学的モデル分析を示し、ＰＭＡによる刺激後、時間の関数として、蛍光％のグラフ表示して分析した。Ｄ（８６）ＮおよびＷｔ εＰＫＣに関して同様の結果が得られた。図８Ａは、一次の指数方程式を用いた非線形回帰分析を示し、図８Ｂは、二次の指数方程式を用いた非線形回帰分析を示し、図８Ｃは、Ｄ（８６）Ａの未加工データの曲線の間のフィットを表すグラフである。この曲線は、二次の指数方程式を用いた非線形回帰により得られた。図８Ｄは、Ｄ（８６）Ａの未加工データの曲線の間のフィットを表すグラフである。この曲線は、表１に提供されるｋ１、ｋ−１、ｋ２およびｋ−２に対する値を使用して微分方程式により得られた。データに適合させた全ての曲線に対する残差は、二次の指数方程式を使用する非線形回帰を用いて得られた残差と類似していた。
【図９】図９Ａは、実施例８においてより十分に記載されるように、１００ｎＭ ＰＭＡでの刺激後の種々の時間での、ＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）ＡおよびＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の共焦点像を示す。図９Ｂは、実施例９においてより十分に記載されるように、１ｍＭ ＡＴＰでの刺激後の時間の関数としての、Ｄ（８６）Ａ変異体およびＤ（８６）Ｎ変異体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の共焦点像を示す。１ｍＭ ＡＴＰを用いた刺激に対して、このＤ（８６）Ａ変異体は、野生型と比較して同等の転位速度を有し、そしてＲＡＣＫ Ｄ（８６）Ｎ変異体は、より遅い転位速度を有した。矢印は、各々のεＰＫＣ酵素について細胞抹消への転位が明白になり始める時間を示す。図９Ｃは、実施例９においてより十分に記載されるように、Ｄ（８６）ＡおよびＤ（８６）Ｎでトランスフェクトした細胞におけるＰＭＡ刺激後の、時間の関数としての蛍光強度を示す。１ｍＭ ＡＴＰの添加後の時間に比例して細胞質中の蛍光の喪失を測定することにより、転位速度を分析した：Ｗｔ（黒四角形）、Ｄ（８６）Ａ（白三角形）、Ｄ（８６）Ｎ（白丸）。データは、それぞれの実験で少なくとも３つの細胞を用いた少なくとも３回の独立した実験の平均である。Ｄ（８６）Ｎ変異体の時間経過は、ｐ＜０．００１での二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用すると、Ｄ（８６）ＡまたはＷｔ εＰＫＣのいずれかとは統計学的に異なる。図９Ｄは、実施例８においてより十分に記載されるように、ＡＴＰ刺激後の時間の関数としての、ＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔ（黒四角形）およびＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）Ａ（白三角形）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の蛍光強度を示す。細胞質中のＹＦＰ−εＰＫＣ Ｄ（８６）Ａ変異体のレベルは、ＣＦＰ−εＰＫＣ Ｗｔのレベルと比較して、より早く減少した。
【図１０】図１０は、活性化に対する膜へのεＰＫＣ転位における最初の段階；実施例の考察の節においてより十分に説明される、２段階の工程を示す画像（ｐｉｃｔｏｒｉａｌ）を示す。転位のプロセスにおけるさらなる工程としては、ＲＡＣＫに対する結合が挙げられる（スキーム中には示さず）。簡単にするために、ΨεＲＡＣＫ結合部位とεＲＡＣＫ結合部位との間の分子内相互作用のみが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法であって、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記荷電アミノ酸がアスパラギン酸であり、前記非荷電アミノ酸がアスパラギンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、古典的ＰＫＣアゴニスト、新規なＰＫＣアゴニストまたは異型のＰＫＣアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記εＰＫＣアゴニストペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記εＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号１２；配列番号２０；配列番号１６；または配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＫＣアンタゴニストペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するεＰＫＣアンタゴニストペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドであり、前記少なくとも１つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法であって、該酵素を、ＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、該ペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、ここで該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な別のアミノ酸で置換される、方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、前記ＰＫＣ酵素のΨ−ＲＡＣＫ配列由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ψ−ＲＡＣＫ配列が、ΨεＲＡＣＫ配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテインキナーゼＣが、εＰＫＣであり、前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、前記ＰＫＣ酵素のΨ−ＲＡＣＫ配列の誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫアゴニストペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；または配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫペプチドであり、前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有し、該配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、該少なくとも１つのアミノ酸と比較して電荷が低い別のアミノ酸で置換される、方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのアミノ酸は、負に荷電し、前記別のアミノ酸は、非荷電である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのアミノ酸が、アスパラギン酸であり、前記別のアミノ酸が、アスパラギンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドを含むペプチドであって、該ペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチド由来であり、ここで該アゴニストペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドをアンタゴニストペプチドへ変換するのに十分である別のアミノ酸で置換される、ペプチド。
【請求項２２】
前記ＰＫＣが、εＰＫＣであり、前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドは、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記アゴニストペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのアミノ酸は、置換された位置において、電荷の変化を提供するアミノ酸で置換され、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２６】
ＰＫＣ拮抗活性を有するペプチドであって、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、ペプチド。
【請求項２７】
処置方法であって、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列、あるいはこれらの組み合わせを有する治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドを、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記処置は、εＰＫＣにより調節される疾患または状態のためのものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患または状態は、線維症疾患または炎症性疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記線維症疾患は、強皮症、肝線維症、または肺線維症である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記炎症性疾患は、自己免疫疾患または肺疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、ギャン−バレー症候群、乾癬、グレーブス病、慢性関節リウマチ、およびＩ型真性糖尿病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患またはぜん息である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症性疾患は、敗血症性ショックまたは炎症性腸疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチドまたはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アゴニストペプチド模倣物を、ＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣアンタゴニストペプチド模倣物へ変換する方法であって、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物の少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物をＰＫＣアンタゴニストペプチドまたはＰＫＣペプチド模倣物へ変換するアミノ酸で、置換する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記荷電アミノ酸がアスパラギン酸であり、前記非荷電アミノ酸がアスパラギンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、古典的ＰＫＣアゴニスト、新規なＰＫＣアゴニストまたは異型のＰＫＣアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記εＰＫＣアゴニストペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記εＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号１２；配列番号２０；配列番号１６；または配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＫＣアンタゴニストペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するεＰＫＣアンタゴニストペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドであり、前記少なくとも１つのアミノ酸が非荷電アミノ酸で置換される荷電アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素の活性を阻害する方法であって、該酵素を、ＰＫＣインヒビターペプチドまたはＰＫＣインヒビターペプチド模倣物と接触させる工程を包含し、該ペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチドまたはＰＫＣアゴニストペプチド模倣物由来であり、ここで該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物中の少なくとも１つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドまたはアゴニストペプチド模倣物をアンタゴニストペプチドまたはアンタゴニストペプチド模倣物へ変換するのに十分な別のアミノ酸で置換される、方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、前記ＰＫＣ酵素のΨ−ＲＡＣＫ配列由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ψ−ＲＡＣＫ配列が、ΨεＲＡＣＫ配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテインキナーゼＣが、εＰＫＣであり、前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、前記ＰＫＣ酵素のΨ−ＲＡＣＫ配列の誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫアゴニストペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；または配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＫＣアゴニストペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するΨεＲＡＣＫペプチドであり、前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有し、該配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、該少なくとも１つのアミノ酸と比較して電荷が低い別のアミノ酸で置換される、方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのアミノ酸は、負に荷電し、前記別のアミノ酸は、非荷電である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのアミノ酸が、アスパラギン酸であり、前記別のアミノ酸が、アスパラギンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＫＣインヒビターペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＫＣアンタゴニスト活性を有するペプチドを含むペプチドであって、該ペプチドは、ＰＫＣアゴニストペプチド由来であり、ここで該アゴニストペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸は、該アゴニストペプチドをアンタゴニストペプチドへ変換するのに十分である別のアミノ酸で置換される、ペプチド。
【請求項２２】
前記ＰＫＣが、εＰＫＣであり、前記ＰＫＣアゴニストペプチドが、εＰＫＣアゴニストペプチドである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドは、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記アゴニストペプチドは、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのアミノ酸は、置換された位置において、電荷の変化を提供するアミノ酸で置換され、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２６】
ＰＫＣ拮抗活性を有するペプチドであって、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、ペプチド。
【請求項２７】
処置方法であって、配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；または配列番号５７に示されるアミノ酸配列、あるいはこれらの組み合わせを有する治療有効量のεＰＫＣアンタゴニストペプチドを、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記処置は、εＰＫＣにより調節される疾患または状態のためのものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患または状態は、線維症疾患または炎症性疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記線維症疾患は、強皮症、肝線維症、または肺線維症である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記炎症性疾患は、自己免疫疾患または肺疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、ギャン−バレー症候群、乾癬、グレーブス病、慢性関節リウマチ、およびＩ型真性糖尿病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患またはぜん息である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症性疾患は、敗血症性ショックまたは炎症性腸疾患である、請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５１３９７４（Ｐ２００７−５１３９７４Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４１０１（Ｐ２００６−５４４１０１）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１８５４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１２４
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０４３９４５９３）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１８５４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１２４
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０４３９４５９３）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (10)
【Ｆターム（参考）】
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