プロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物
【課題】５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の集積量を増加させることができるＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を提供すること。
【解決手段】ＡＬＡと１８−クラウン−６エーテルとを併用して、光線力学的療法や光線力学的診断に用いると、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができ、ＡＬＡ−ＰＤＤやＡＬＡ−ＰＤＴの効果を増大させることができる。特に、ＡＬＡ−ＰＤＴについては相乗効果が期待できる。
【解決手段】ＡＬＡと１８−クラウン−６エーテルとを併用して、光線力学的療法や光線力学的診断に用いると、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができ、ＡＬＡ−ＰＤＤやＡＬＡ−ＰＤＴの効果を増大させることができる。特に、ＡＬＡ−ＰＤＴについては相乗効果が期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロトポルフィリンＩＸ（以下「ＰｐＩＸ」ともいう）細胞内集積増強組成物に関し、より詳しくは、５−アミノレブリン酸（以下「ＡＬＡ」ともいう）類と、１８−クラウン−６又はその誘導体とを含有するＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物や、該組成物を有効成分として含有するＡＬＡ−ＰＤＴ用薬剤やＡＬＡ−ＰＤＤ用診断剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん、イボ、ニキビのような疾患組織の診断及び治療方法として光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより標的箇所の特定や治療を行う光線力学的診断（Photodynamic diagnosis、以下ＰＤＤと略す）や、光線力学的治療（Photodynamic therapy、以下ＰＤＴと略す）が注目されている。ＰＤＤは、例えば、ポルフィリン系又はクロリン系光増感剤を患者に投与し、これを疾患組織に集積させ、波長４００ｎｍ付近の光を照射することによって蛍光発光させ、これを観察することにより、疾病の有無及び患部を特定する診断法であり、またＰＤＴは、集積した光増感剤に波長６００〜７００ｎｍの光を照射することによって活性酸素種を生成させ、これにより疾患組織のみを選択的に壊死させる治療法である。これらのＰＤＤ及びＰＤＴは、これまでの診断法及び治療法と比較して、低侵襲で副作用が少ないため、患者に対する負担が少ないという利点がある。
【０００３】
このＰＤＤ及びＰＤＴで用いる光増感剤として、ＡＬＡを用いる光線力学的診断（以下「ＡＬＡ−ＰＤＤ」ともいう）や、ＡＬＡを用いる光線力学的療法（以下「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）の開発がすすんでおり、ＡＬＡは、細胞内でヘム生合成経路の一連の酵素群によりＰｐＩＸに代謝活性化される（特許文献１参照）が、ＰｐＩＸはガン組織に対する集積性が非常に高いとは言えず、十分な治療効果を得るためには、多量のＡＬＡを投与する必要がある。しかしながら、ＡＬＡは、２０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．以上投与すると、嘔吐、日光過敏症あるいは一時的な肝機能障害を惹起することが知られているので、その投与量にはおのずから制限がある。
【０００４】
したがって、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、ＰｐＩＸの疾患組織への集積性を増大させるために、粘着付着性剤、例えば水膨潤性ポリマーを添加したもの（特許文献２参照）、キレート化剤、例えばアミノポリカルボン酸キレート化剤を併用したもの（特許文献３参照）、５−アミノレブリン酸アルキルエステルを前駆体としたもの（特許文献４参照）、担体物質としてリポソームのような脂質を併用したもの（特許文献５参照）などが提案されている。
【０００５】
しかしながら、５−アミノレブリン酸アルキルエステルは、疾患組織内へのＰｐＩＸの集積性は増加するものの、細胞に対する毒性も増加するため、安全性の点で問題があるし、キレート剤は、安全性は高いものの非経口投与製剤として用いなければならないため、患者に対する侵襲性が高くなるという欠点がある。また、リポソームによる送達は安全性の点では問題はないが、調製工程が煩雑であり、コスト高になるのを免れない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平４−５００７７０号公報
【特許文献２】特表２００４−５０５０４０号公報
【特許文献３】特表２００１−５０１９７０号公報
【特許文献４】特表平１１−５０１９１４号公報
【特許文献５】特表２００４−５２００２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができるＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰｐＩＸの前駆物質であるＡＬＡを投与した場合、体内においてＡＬＡから誘導されるＰｐＩＸの疾患組織中への集積量を増大させるため、ＡＬＡの投与方法の他、ＡＬＡ誘導体や併用化合物について鋭意検討してきたが、クラウンエーテルの一種である１８−クラウン−６又はその誘導体が、ＡＬＡと併用することでＰｐＩＸの疾患組織中への集積量を増大させる作用を有することを見い出した。また、他のクラウンエーテルの添加を検討する過程において、１５−クラウン−５を添加した場合には、同様の効果を得られないことを確認し、さらに、１８−クラウン−６又はその誘導体をＡＬＡ類と併用した場合、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量の増加効果では説明しきれないほどのＰＤＴの増強効果も確認し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを含有することを特徴とするプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（２）１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを、１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類との複合体として、含有することを特徴とする上記（１）記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（３）１８−クラウン−６の誘導体が、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（４）ＡＬＡ類が、５−アミノレブリン酸塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、又はリンゴ酸塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物に関する。
【００１０】
また、本発明は、（５）上記（１）〜（４）いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的診断剤や、（６）上記（１）〜（４）いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いることにより、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができ、ＡＬＡ−ＰＤＤやＡＬＡ−ＰＤＴの効果を増大させることができる。特に、ＡＬＡ−ＰＤＴについては相乗効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図２】ＡＬＡ塩酸塩無添加系における、１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を示す図である。
【図３】ＡＬＡ塩酸塩と１５−クラウン−５とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図４】ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の細胞接触時間の影響を示す図である。
【図５】ＰＤＴ効果に対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果を示す図である。
【図６】ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性（ＡＬＡ濃度の影響）を示す図である。
【図７】１．０ｍＭのＡＬＡを基準としたＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性を示す図である。
【図８】ＡＬＡ塩酸塩無添加系における、ベンゾ−１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を示す図である
【図９】ＡＬＡ塩酸塩とベンゾ−１８−クラウン−６とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図１０】ＰＤＴ効果に対する１８−クラウン−６の添加効果（ＡＬＡ濃度依存性）を示す図である。
【図１１】ＰＤＴ効果に対するＡＬＡ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６の添加効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物としては、１８−クラウン−６（エーテル）又はその誘導体から構成される１８−クラウン−６類と、ＡＬＡ類とを含有する組成物であれば特に制限されず、上記１８−クラウン−６（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサオキサシクロオクタデカン）の誘導体として、具体的には、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６等を挙げることができる。さらに、Ｏが一箇所以上Ｓに置き換わった１８−チアクラウン−６エーテル又はその誘導体や、Ｏが一箇所以上ＮＨに置き換わった１８−アザクラウン−６エーテル又はその誘導体や、Ｏがそれぞれ一箇所以上Ｓ及びＮＨに置き換わった１８−アザチアクラウン−６エーテル又はその誘導体などを挙げることができる。
【００１４】
上記ＡＬＡ類としては、ＡＬＡ又はＡＬＡの塩が含まれ、ＡＬＡは、式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＮＨ２で表されるアミノ酸の一種であり、例えば特開平４−９３６０号公報等に記載された化学合成法や、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができる。
【００１５】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡの塩としては、ＡＬＡは両性電解質であり、ｐＨを変えることにより、酸性塩、中性塩又は塩基性塩のいずれの塩も形成可能であるが、安定性がよいという点でＡＬＡ酸性塩が好ましく、具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等を挙げることができ、なかでも塩酸塩が好ましい。なお、これらの塩は使用時において、溶液として用いることもでき、その作用は、ＡＬＡの場合と同効なものが好ましい。
【００１６】
以上の１８−クラウン−６類やＡＬＡ類を含む組成物は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、溶媒としては、水又は生理的食塩水が好ましいが、溶解性を高めるために、水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、グリセリン、プロビレングリコール、酢酸、ジメチルスルホキシドを併用することもできる。また、本発明の組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、軟膏、巴布剤等の剤型で経口・経皮・静脈投与することができ、軟膏又は巴布剤として経皮的に施用する場合には、経皮吸収を促進するために経皮吸収促進剤、例えばｌ−メントールやｄ−リモネンなどのテルペン系化合物、Ｌ−α−ホスファチジルコリンなどのリン脂質、Ｔｗｅｅｎ系又はＳｐａｎ系界面活性剤、ラウリン酸やオレイン酸などの脂肪酸又はその塩などを適宜配合して使用してもよい。
【００１７】
また、ＡＬＡ類を経口・静脈投与する場合の、ＡＬＡ類の投与量は、ＡＬＡ類の合計が、ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇである。また、例えばＡＬＡ２０％含有クリームを用いて、ＡＬＡ類を経皮投与する場合の、ＡＬＡ類の投与量は、ＡＬＡ類の合計が、ＡＬＡ換算で、１ｍｇ〜９０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜３０ｍｇである。
【００１８】
ＡＬＡ類と１８−クラウン−６類との使用割合は、モル比で１：１〜１：２０、好ましく１：３〜１：１５であり、また、上記１８−クラウン−６類とＡＬＡ類とは、複合体を形成していてもよく、ＡＬＡ類のアミノ基と１８−クラウン−６類とが複合体を形成すると、ＡＬＡ類は疎水性が増加し、ＡＬＡ類が細胞膜を直接に通過する受動的取込が促進されるため、ＰｐＩＸの細胞内集積性が増加すると考えることもできるが、細胞内ＰｐＩＸ集積性の増加から類推される効果を超えたＡＬＡ−ＰＤＴによる殺細胞効果からすると、本発明におけるＡＬＡ−ＰＤＴ効果の作用機序は不明である。
【００１９】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物は、ＡＬＡ−ＰＤＤ用の診断剤として使用することができ、本発明のＡＬＡ−ＰＤＤ診断剤を用いると、皮膚又は他の上皮組織の種々の異常部位、疾患部位等の病変部の範囲を判断することができる。すなわち、病変部の治療（手術）において、病変部の範囲を判断する際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を１８−クラウン−６類と共に投与し、ＡＬＡ類から色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸが、病変部組織内に特異的に蓄積し、紫色〜青色の励起光を照射すると、赤色の蛍光を放射することを利用して、赤色の波長を検出することで、がん等の病変部の範囲を判断することができる。具体的には、本発明の組成物を投与し、３〜６時間経過後、波長４００ｎｍ付近の光を照射して発光させ、生じる蛍光を観察する方法を例示することができる。このように、本発明の実施態様のひとつに、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いたＡＬＡ−ＰＤＤ方法が含まれる。
【００２０】
また、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物は、ＡＬＡ−ＰＤＴ用治療剤として使用することもでき、上記ＡＬＡ−ＰＤＴ治療剤を用いると、皮膚又は他の上皮組織の種々の異常部位、疾患部位等の病変部組織を壊死させることができる。すなわち、光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより病変部組織を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を、１８−クラウン−６類と共に投与し、ＡＬＡ類から色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸが、病変部組織内に特異的に蓄積し、光照射されることにより周囲の酸素分子を光励起し、その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有することを利用する病変部組織を壊死させる方法・手段を挙げることができる。具体的には、本発明の組成物を投与して、３〜６時間経過後、患部に５０〜５００ｍＷ／ｃｍ２で波長６００〜７００ｎｍの光を全照射エネルギーが５０〜３００Ｊ／ｃｍ２になるように照射する方法を例示することができる。このように、本発明の実施態様のひとつに、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いたＡＬＡ−ＰＤＴ方法が含まれる。
【実施例１】
【００２１】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したヒト組織球性リンパ腫由来細胞株Ｕ９３７細胞（以下、Ｕ９３７細胞）５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭと１８−クラウン−６エーテルとを所定濃度添加し、３７℃恒温下にて３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計（ＦＰ-６５００、日本分光社製）を用いて細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。励起波長及び測定波長領域は、それぞれ４１０ｎｍ及び６２０〜６５０ｎｍとした。
【００２２】
（結果）
１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩に１８−クラウン−６を、濃度を変えて添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を図１に示す。ただし蛍光強度比とは、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸに対する蛍光強度の百分率である。この結果、１８−クラウン−６の添加量が増すにつれて。細胞内ＰｐＩＸ集積性が向上し、７．５ｍＭ付近で蛍光強度比が極大値を示した。一方、１０ｍＭ以上添加すると細胞内ＰｐＩＸ集積性が減少するが、これは１８−クラウン−６の細胞毒性によるためと考えられる。このことは、ＡＬＡ塩酸塩無添加系において、１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を検討した図２の結果からも示唆される。
【００２３】
［比較例１］
上記実施例１と同様に調整したＵ９３７細胞に、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭと１５−クラウン−５とを添加した際の細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を図３に示す。１８−クラウン−６と異なり、１５−クラウン−５を添加するとＰｐＩＸの細胞内蛍光強度は増加するどころか、逆に減少する傾向にあることがわかる。このことから、細胞内ＰｐＩＸ集積性に及ぼすクラウンエーテルの添加効果は、１８−クラウン−６にのみ見いだされる現象であることが示唆された。
【実施例２】
【００２４】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の細胞接触時間の影響）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭを添加したものに、さらに１８−クラウン−６を７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で所定時間インキュベーションした。ただし、ＡＬＡ塩酸塩添加後のインキュベーション時間は３時間で固定した。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。
【００２５】
（結果）
図４に、１８−クラウン−６添加後のインキュベーション時間に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし蛍光強度比とは、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸに対する蛍光強度比の百分率である。１８−クラウン−６添加後のインキュベーション時間の増加に伴い細胞内ＰｐＩＸ集積性は増加し、３時間で極大値を示すことがわかった。
【実施例３】
【００２６】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに、ＡＬＡ塩酸塩を１．０ｍＭ及び／又は１８−クラウン−６を７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ヨウ化ナトリウムとヨウ化リチウムとを封入したメタルハライドランプ（ウシオ電機社製）を用いて波長領域５５０〜７５０ｎｍの光（放射強度：４０ｍＷ／ｃｍ２）を６０分間照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００２７】
（結果）
結果を図５に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。１８−クラウン−６のみを添加した系ではＰＤＴ効果はまったく認められなかった。また、ＡＬＡ塩酸塩のみを添加した系では細胞生存率は７５．２％であった。しかし、ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを併用すると細胞生存率は２１．０％と急激に低下した。これはＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６共存下において、ＰｐＩＸの細胞内集積性が増加したという理由だけでは説明できない。
【実施例４】
【００２８】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに０．２５、０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加し、さらに１８−クラウン−６をそれぞれ０、２．５、５．０、７．５、又は１０ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。図６に、ＡＬＡ塩酸塩濃度を０．２５、０．５及び１．０ｍＭとした時の１８−クラウン−６の添加濃度に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし蛍光強度比は、各濃度のＡＬＡのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を１００％とした値を示した。また、図６の結果を基に、縦軸の蛍光強度比を１．０ｍＭのＡＬＡのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を基準に整理しなおした図を図７に示す。
【００２９】
（結果）
図６より、いずれのＡＬＡ濃度においてもＡＬＡ単独投与よりも、１８−クラウン−６を添加することで、細胞内ＰｐＩＸ集積性が増加し、その傾向はＡＬＡ濃度が高いほど顕著であることがわかった。また、図７より、ＡＬＡ濃度が０．５ｍＭの場合、１８−クラウン−６を２．５ｍＭ以上共存させると、１．０ｍＭのＡＬＡ単独投与の場合よりもＰｐＩＸの細胞内集積性が増加することがわかった。
【実施例５】
【００３０】
（ＰｐＩＸ集積性に対するベンゾ−１８−クラウン−６添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭとベンゾ−１８−クラウン−６とを所定濃度添加し、３７℃恒温下にて３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。ただし、ベンゾ−１８−クラウン−６を５ｍＭ以上投与すると細胞毒性が大きくなるので（図８参照）、ベンゾ−１８−クラウン−６の添加濃度は５ｍＭ以下とした。
【００３１】
（結果）
図９に、ベンゾ−１８−クラウン−６の添加濃度に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を１００％とした。その結果、１８−クラウン−６と同様に、ＡＬＡ塩酸塩にベンゾ−１８−クラウン−６を添加することによって細胞内ＰｐＩＸ集積性が向上することがわかった。
【実施例６】
【００３２】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに０．２５、０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加し、さらに１８−クラウン−６をそれぞれ７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、上記実施例３と同様な方法で光照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００３３】
（結果）
結果を図１０に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加した系では１８−クラウン−６を併用すると細胞生存率が急激に低下した。しかし、０．２５ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加した系では顕著な変化は認められなかった。
【実施例７】
【００３４】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに、ＡＬＡ塩酸塩を１．０ｍＭ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６を３．７５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、上記実施例３と同様な方法で光照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００３５】
（結果）
結果を図１１に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。ベンゾ−１８−クラウン−６のみを添加した系ではＰＤＴ効果はまったく認められなかった。また、ＡＬＡ塩酸塩のみを添加した系では細胞生存率は８５．０％であった。しかし、ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを併用すると細胞生存率は２０．６％と急激に低下した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロトポルフィリンＩＸ（以下「ＰｐＩＸ」ともいう）細胞内集積増強組成物に関し、より詳しくは、５−アミノレブリン酸（以下「ＡＬＡ」ともいう）類と、１８−クラウン−６又はその誘導体とを含有するＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物や、該組成物を有効成分として含有するＡＬＡ−ＰＤＴ用薬剤やＡＬＡ−ＰＤＤ用診断剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がん、イボ、ニキビのような疾患組織の診断及び治療方法として光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより標的箇所の特定や治療を行う光線力学的診断（Photodynamic diagnosis、以下ＰＤＤと略す）や、光線力学的治療（Photodynamic therapy、以下ＰＤＴと略す）が注目されている。ＰＤＤは、例えば、ポルフィリン系又はクロリン系光増感剤を患者に投与し、これを疾患組織に集積させ、波長４００ｎｍ付近の光を照射することによって蛍光発光させ、これを観察することにより、疾病の有無及び患部を特定する診断法であり、またＰＤＴは、集積した光増感剤に波長６００〜７００ｎｍの光を照射することによって活性酸素種を生成させ、これにより疾患組織のみを選択的に壊死させる治療法である。これらのＰＤＤ及びＰＤＴは、これまでの診断法及び治療法と比較して、低侵襲で副作用が少ないため、患者に対する負担が少ないという利点がある。
【０００３】
このＰＤＤ及びＰＤＴで用いる光増感剤として、ＡＬＡを用いる光線力学的診断（以下「ＡＬＡ−ＰＤＤ」ともいう）や、ＡＬＡを用いる光線力学的療法（以下「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）の開発がすすんでおり、ＡＬＡは、細胞内でヘム生合成経路の一連の酵素群によりＰｐＩＸに代謝活性化される（特許文献１参照）が、ＰｐＩＸはガン組織に対する集積性が非常に高いとは言えず、十分な治療効果を得るためには、多量のＡＬＡを投与する必要がある。しかしながら、ＡＬＡは、２０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．以上投与すると、嘔吐、日光過敏症あるいは一時的な肝機能障害を惹起することが知られているので、その投与量にはおのずから制限がある。
【０００４】
したがって、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、ＰｐＩＸの疾患組織への集積性を増大させるために、粘着付着性剤、例えば水膨潤性ポリマーを添加したもの（特許文献２参照）、キレート化剤、例えばアミノポリカルボン酸キレート化剤を併用したもの（特許文献３参照）、５−アミノレブリン酸アルキルエステルを前駆体としたもの（特許文献４参照）、担体物質としてリポソームのような脂質を併用したもの（特許文献５参照）などが提案されている。
【０００５】
しかしながら、５−アミノレブリン酸アルキルエステルは、疾患組織内へのＰｐＩＸの集積性は増加するものの、細胞に対する毒性も増加するため、安全性の点で問題があるし、キレート剤は、安全性は高いものの非経口投与製剤として用いなければならないため、患者に対する侵襲性が高くなるという欠点がある。また、リポソームによる送達は安全性の点では問題はないが、調製工程が煩雑であり、コスト高になるのを免れない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平４−５００７７０号公報
【特許文献２】特表２００４−５０５０４０号公報
【特許文献３】特表２００１−５０１９７０号公報
【特許文献４】特表平１１−５０１９１４号公報
【特許文献５】特表２００４−５２００２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができるＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰｐＩＸの前駆物質であるＡＬＡを投与した場合、体内においてＡＬＡから誘導されるＰｐＩＸの疾患組織中への集積量を増大させるため、ＡＬＡの投与方法の他、ＡＬＡ誘導体や併用化合物について鋭意検討してきたが、クラウンエーテルの一種である１８−クラウン−６又はその誘導体が、ＡＬＡと併用することでＰｐＩＸの疾患組織中への集積量を増大させる作用を有することを見い出した。また、他のクラウンエーテルの添加を検討する過程において、１５−クラウン−５を添加した場合には、同様の効果を得られないことを確認し、さらに、１８−クラウン−６又はその誘導体をＡＬＡ類と併用した場合、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量の増加効果では説明しきれないほどのＰＤＴの増強効果も確認し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを含有することを特徴とするプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（２）１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを、１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類との複合体として、含有することを特徴とする上記（１）記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（３）１８−クラウン−６の誘導体が、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物や、（４）ＡＬＡ類が、５−アミノレブリン酸塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、又はリンゴ酸塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物に関する。
【００１０】
また、本発明は、（５）上記（１）〜（４）いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的診断剤や、（６）上記（１）〜（４）いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いることにより、ＡＬＡの投与量を増加させることなく、安全かつ簡単に疾患組織中へのＰｐＩＸの集積量を増加させることができ、ＡＬＡ−ＰＤＤやＡＬＡ−ＰＤＴの効果を増大させることができる。特に、ＡＬＡ−ＰＤＴについては相乗効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図２】ＡＬＡ塩酸塩無添加系における、１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を示す図である。
【図３】ＡＬＡ塩酸塩と１５−クラウン−５とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図４】ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の細胞接触時間の影響を示す図である。
【図５】ＰＤＴ効果に対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果を示す図である。
【図６】ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性（ＡＬＡ濃度の影響）を示す図である。
【図７】１．０ｍＭのＡＬＡを基準としたＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性を示す図である。
【図８】ＡＬＡ塩酸塩無添加系における、ベンゾ−１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を示す図である
【図９】ＡＬＡ塩酸塩とベンゾ−１８−クラウン−６とを添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を示す図である。
【図１０】ＰＤＴ効果に対する１８−クラウン−６の添加効果（ＡＬＡ濃度依存性）を示す図である。
【図１１】ＰＤＴ効果に対するＡＬＡ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６の添加効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物としては、１８−クラウン−６（エーテル）又はその誘導体から構成される１８−クラウン−６類と、ＡＬＡ類とを含有する組成物であれば特に制限されず、上記１８−クラウン−６（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサオキサシクロオクタデカン）の誘導体として、具体的には、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６等を挙げることができる。さらに、Ｏが一箇所以上Ｓに置き換わった１８−チアクラウン−６エーテル又はその誘導体や、Ｏが一箇所以上ＮＨに置き換わった１８−アザクラウン−６エーテル又はその誘導体や、Ｏがそれぞれ一箇所以上Ｓ及びＮＨに置き換わった１８−アザチアクラウン−６エーテル又はその誘導体などを挙げることができる。
【００１４】
上記ＡＬＡ類としては、ＡＬＡ又はＡＬＡの塩が含まれ、ＡＬＡは、式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＮＨ２で表されるアミノ酸の一種であり、例えば特開平４−９３６０号公報等に記載された化学合成法や、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができる。
【００１５】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡの塩としては、ＡＬＡは両性電解質であり、ｐＨを変えることにより、酸性塩、中性塩又は塩基性塩のいずれの塩も形成可能であるが、安定性がよいという点でＡＬＡ酸性塩が好ましく、具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等を挙げることができ、なかでも塩酸塩が好ましい。なお、これらの塩は使用時において、溶液として用いることもでき、その作用は、ＡＬＡの場合と同効なものが好ましい。
【００１６】
以上の１８−クラウン−６類やＡＬＡ類を含む組成物は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、溶媒としては、水又は生理的食塩水が好ましいが、溶解性を高めるために、水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、グリセリン、プロビレングリコール、酢酸、ジメチルスルホキシドを併用することもできる。また、本発明の組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、軟膏、巴布剤等の剤型で経口・経皮・静脈投与することができ、軟膏又は巴布剤として経皮的に施用する場合には、経皮吸収を促進するために経皮吸収促進剤、例えばｌ−メントールやｄ−リモネンなどのテルペン系化合物、Ｌ−α−ホスファチジルコリンなどのリン脂質、Ｔｗｅｅｎ系又はＳｐａｎ系界面活性剤、ラウリン酸やオレイン酸などの脂肪酸又はその塩などを適宜配合して使用してもよい。
【００１７】
また、ＡＬＡ類を経口・静脈投与する場合の、ＡＬＡ類の投与量は、ＡＬＡ類の合計が、ＡＬＡ換算で体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇである。また、例えばＡＬＡ２０％含有クリームを用いて、ＡＬＡ類を経皮投与する場合の、ＡＬＡ類の投与量は、ＡＬＡ類の合計が、ＡＬＡ換算で、１ｍｇ〜９０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜３０ｍｇである。
【００１８】
ＡＬＡ類と１８−クラウン−６類との使用割合は、モル比で１：１〜１：２０、好ましく１：３〜１：１５であり、また、上記１８−クラウン−６類とＡＬＡ類とは、複合体を形成していてもよく、ＡＬＡ類のアミノ基と１８−クラウン−６類とが複合体を形成すると、ＡＬＡ類は疎水性が増加し、ＡＬＡ類が細胞膜を直接に通過する受動的取込が促進されるため、ＰｐＩＸの細胞内集積性が増加すると考えることもできるが、細胞内ＰｐＩＸ集積性の増加から類推される効果を超えたＡＬＡ−ＰＤＴによる殺細胞効果からすると、本発明におけるＡＬＡ−ＰＤＴ効果の作用機序は不明である。
【００１９】
本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物は、ＡＬＡ−ＰＤＤ用の診断剤として使用することができ、本発明のＡＬＡ−ＰＤＤ診断剤を用いると、皮膚又は他の上皮組織の種々の異常部位、疾患部位等の病変部の範囲を判断することができる。すなわち、病変部の治療（手術）において、病変部の範囲を判断する際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を１８−クラウン−６類と共に投与し、ＡＬＡ類から色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸが、病変部組織内に特異的に蓄積し、紫色〜青色の励起光を照射すると、赤色の蛍光を放射することを利用して、赤色の波長を検出することで、がん等の病変部の範囲を判断することができる。具体的には、本発明の組成物を投与し、３〜６時間経過後、波長４００ｎｍ付近の光を照射して発光させ、生じる蛍光を観察する方法を例示することができる。このように、本発明の実施態様のひとつに、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いたＡＬＡ−ＰＤＤ方法が含まれる。
【００２０】
また、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物は、ＡＬＡ−ＰＤＴ用治療剤として使用することもでき、上記ＡＬＡ−ＰＤＴ治療剤を用いると、皮膚又は他の上皮組織の種々の異常部位、疾患部位等の病変部組織を壊死させることができる。すなわち、光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより病変部組織を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を、１８−クラウン−６類と共に投与し、ＡＬＡ類から色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸが、病変部組織内に特異的に蓄積し、光照射されることにより周囲の酸素分子を光励起し、その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有することを利用する病変部組織を壊死させる方法・手段を挙げることができる。具体的には、本発明の組成物を投与して、３〜６時間経過後、患部に５０〜５００ｍＷ／ｃｍ２で波長６００〜７００ｎｍの光を全照射エネルギーが５０〜３００Ｊ／ｃｍ２になるように照射する方法を例示することができる。このように、本発明の実施態様のひとつに、本発明のＰｐＩＸ細胞内集積増強組成物を用いたＡＬＡ−ＰＤＴ方法が含まれる。
【実施例１】
【００２１】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したヒト組織球性リンパ腫由来細胞株Ｕ９３７細胞（以下、Ｕ９３７細胞）５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭと１８−クラウン−６エーテルとを所定濃度添加し、３７℃恒温下にて３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計（ＦＰ-６５００、日本分光社製）を用いて細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。励起波長及び測定波長領域は、それぞれ４１０ｎｍ及び６２０〜６５０ｎｍとした。
【００２２】
（結果）
１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩に１８−クラウン−６を、濃度を変えて添加した場合の、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を図１に示す。ただし蛍光強度比とは、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸに対する蛍光強度の百分率である。この結果、１８−クラウン−６の添加量が増すにつれて。細胞内ＰｐＩＸ集積性が向上し、７．５ｍＭ付近で蛍光強度比が極大値を示した。一方、１０ｍＭ以上添加すると細胞内ＰｐＩＸ集積性が減少するが、これは１８−クラウン−６の細胞毒性によるためと考えられる。このことは、ＡＬＡ塩酸塩無添加系において、１８−クラウン−６の細胞生存率に対する影響を検討した図２の結果からも示唆される。
【００２３】
［比較例１］
上記実施例１と同様に調整したＵ９３７細胞に、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭと１５−クラウン−５とを添加した際の細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比の変化を図３に示す。１８−クラウン−６と異なり、１５−クラウン−５を添加するとＰｐＩＸの細胞内蛍光強度は増加するどころか、逆に減少する傾向にあることがわかる。このことから、細胞内ＰｐＩＸ集積性に及ぼすクラウンエーテルの添加効果は、１８−クラウン−６にのみ見いだされる現象であることが示唆された。
【実施例２】
【００２４】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の細胞接触時間の影響）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭを添加したものに、さらに１８−クラウン−６を７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で所定時間インキュベーションした。ただし、ＡＬＡ塩酸塩添加後のインキュベーション時間は３時間で固定した。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。
【００２５】
（結果）
図４に、１８−クラウン−６添加後のインキュベーション時間に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし蛍光強度比とは、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸに対する蛍光強度比の百分率である。１８−クラウン−６添加後のインキュベーション時間の増加に伴い細胞内ＰｐＩＸ集積性は増加し、３時間で極大値を示すことがわかった。
【実施例３】
【００２６】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに、ＡＬＡ塩酸塩を１．０ｍＭ及び／又は１８−クラウン−６を７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ヨウ化ナトリウムとヨウ化リチウムとを封入したメタルハライドランプ（ウシオ電機社製）を用いて波長領域５５０〜７５０ｎｍの光（放射強度：４０ｍＷ／ｃｍ２）を６０分間照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００２７】
（結果）
結果を図５に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。１８−クラウン−６のみを添加した系ではＰＤＴ効果はまったく認められなかった。また、ＡＬＡ塩酸塩のみを添加した系では細胞生存率は７５．２％であった。しかし、ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを併用すると細胞生存率は２１．０％と急激に低下した。これはＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６共存下において、ＰｐＩＸの細胞内集積性が増加したという理由だけでは説明できない。
【実施例４】
【００２８】
（ＰｐＩＸ集積性に対する１８−クラウン−６の濃度依存性）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに０．２５、０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加し、さらに１８−クラウン−６をそれぞれ０、２．５、５．０、７．５、又は１０ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。図６に、ＡＬＡ塩酸塩濃度を０．２５、０．５及び１．０ｍＭとした時の１８−クラウン−６の添加濃度に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし蛍光強度比は、各濃度のＡＬＡのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を１００％とした値を示した。また、図６の結果を基に、縦軸の蛍光強度比を１．０ｍＭのＡＬＡのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を基準に整理しなおした図を図７に示す。
【００２９】
（結果）
図６より、いずれのＡＬＡ濃度においてもＡＬＡ単独投与よりも、１８−クラウン−６を添加することで、細胞内ＰｐＩＸ集積性が増加し、その傾向はＡＬＡ濃度が高いほど顕著であることがわかった。また、図７より、ＡＬＡ濃度が０．５ｍＭの場合、１８−クラウン−６を２．５ｍＭ以上共存させると、１．０ｍＭのＡＬＡ単独投与の場合よりもＰｐＩＸの細胞内集積性が増加することがわかった。
【実施例５】
【００３０】
（ＰｐＩＸ集積性に対するベンゾ−１８−クラウン−６添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬにＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭとベンゾ−１８−クラウン−６とを所定濃度添加し、３７℃恒温下にて３時間インキュベーションした。インキュベーション後、ハンクス緩衝溶液を用いて２回洗浄し、蛍光分光光度計を用いて上記実施例１と同様の方法で、細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度を測定した。ただし、ベンゾ−１８−クラウン−６を５ｍＭ以上投与すると細胞毒性が大きくなるので（図８参照）、ベンゾ−１８−クラウン−６の添加濃度は５ｍＭ以下とした。
【００３１】
（結果）
図９に、ベンゾ−１８−クラウン−６の添加濃度に対する細胞内ＰｐＩＸの蛍光強度比を示す。ただし、ＡＬＡ塩酸塩１．０ｍＭのみを添加した際のＰｐＩＸの蛍光強度を１００％とした。その結果、１８−クラウン−６と同様に、ＡＬＡ塩酸塩にベンゾ−１８−クラウン−６を添加することによって細胞内ＰｐＩＸ集積性が向上することがわかった。
【実施例６】
【００３２】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又は１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに０．２５、０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加し、さらに１８−クラウン−６をそれぞれ７．５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、上記実施例３と同様な方法で光照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００３３】
（結果）
結果を図１０に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。０．５、又は１．０ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加した系では１８−クラウン−６を併用すると細胞生存率が急激に低下した。しかし、０．２５ｍＭのＡＬＡ塩酸塩を添加した系では顕著な変化は認められなかった。
【実施例７】
【００３４】
（ＰＤＴに対するＡＬＡ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６の添加効果）
５×１０５個／ｍＬに調整したＵ９３７細胞５ｍＬに、ＡＬＡ塩酸塩を１．０ｍＭ及び／又はベンゾ−１８−クラウン−６を３．７５ｍＭ添加し、３７℃恒温下で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、上記実施例３と同様な方法で光照射し、生細胞数を測定して細胞生存率を算出した。ただし、コントロールには生理食塩水を用いた。
【００３５】
（結果）
結果を図１１に示す。細胞生存率はコントロールの細胞生存数を１００％として表した。細胞生存率が低いほどＰＤＴ効果が高いことを意味する。ベンゾ−１８−クラウン−６のみを添加した系ではＰＤＴ効果はまったく認められなかった。また、ＡＬＡ塩酸塩のみを添加した系では細胞生存率は８５．０％であった。しかし、ＡＬＡ塩酸塩と１８−クラウン−６とを併用すると細胞生存率は２０．６％と急激に低下した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを含有することを特徴とするプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項２】
１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを、１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類との複合体として、含有することを特徴とする請求項１記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項３】
１８−クラウン−６の誘導体が、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６であることを特徴とする請求項１又は２記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項４】
ＡＬＡ類が、５−アミノレブリン酸塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、又はリンゴ酸塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的診断剤。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的治療剤。
【請求項１】
１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを含有することを特徴とするプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項２】
１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類とを、１８−クラウン−６又はその誘導体と、５−アミノレブリン酸類との複合体として、含有することを特徴とする請求項１記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項３】
１８−クラウン−６の誘導体が、ベンゾ−１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、シクロヘキサノ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、２−アミノメチル−１８−クラウン−６、２−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６であることを特徴とする請求項１又は２記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項４】
ＡＬＡ類が、５−アミノレブリン酸塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、又はリンゴ酸塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的診断剤。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載のプロトポルフィリンＩＸ細胞内集積増強組成物を有効成分として含有する、５−アミノレブリン酸−光線力学的治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−２６２２１（Ｐ２０１１−２６２２１Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７１５９９（Ｐ２００９−１７１５９９）
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【出願人】（５０８１２３８５８）ＳＢＩアラプロモ株式会社 (13)
【出願人】（５９３２３２２０６）学校法人桐蔭学園 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【出願人】（５０８１２３８５８）ＳＢＩアラプロモ株式会社 (13)
【出願人】（５９３２３２２０６）学校法人桐蔭学園 (33)
【Ｆターム（参考）】
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