プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法
【課題】蛍光偏光度を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を分析する方法を提供する。
【解決手段】１）蛍光物質が付着したハイドロキシプロリン(hydroxyproline)基を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察することによりＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質結合体の形成を定量的に分析する方法；前記方法を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を妨害する物質を検索する方法；及び前記方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法。該方法は、結合の有無による蛍光偏光度の変化で、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を簡単に分析することができ、ウェルプレートを利用した超高速検索に効果的に適用できる。
【解決手段】１）蛍光物質が付着したハイドロキシプロリン(hydroxyproline)基を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察することによりＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質結合体の形成を定量的に分析する方法；前記方法を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を妨害する物質を検索する方法；及び前記方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法。該方法は、結合の有無による蛍光偏光度の変化で、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を簡単に分析することができ、ウェルプレートを利用した超高速検索に効果的に適用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシプロリンを含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣタンパク質との相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法および該方法を利用してこれら間の相互作用を阻害する阻害剤を検索する方法、並びに該方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼの活性を分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＦ−１(hypoxia inducible factor-1；低酸素誘導因子)は、エネルギー代謝、血管運動制御、新血管形成及びアポトーシスに関与する遺伝子の発現調節をはじめ低酸素状態に対する多様な細胞反応において重要な役目をするタンパク質である。特に、ＨＩＦ−１αは、正常酸素状態ではプロテオゾーム(proteosome)により分解されるが、低酸素状態では安定化される。このような調節機序は、ｐＶＨＬ(von Hippel-Lindau tumour suppressor)タンパク質とＨＩＦ−１αとの相互作用によって起きる。ＨＩＦ−１αとｐＶＨＬ間の相互作用を抑制すれば、低酸素状態で細胞周期の進行が促進されたり血管形成の亢進または細胞生存機能が亢進されたりするため、冠状動脈不全、脳不全及び血管不全のような虚血状態の治療に好ましい（特許文献１）。一方、これら間の相互作用を促進させる場合には正常酸素状態で血管形成の抑制を通じて癌組職の成長を抑制することができ、癌治療研究に非常に有用である（非特許文献１）。
【０００３】
ＶＨＬタンパク質とヒトＨＩＦ−１αの結合は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列の中で４０２番目または５６４番目に位置したハイドロキシプロリン基に依存する。プロリルハイドロキシラーゼという酵素によってＨＩＦ−１αタンパク質の特定プロリン基が水酸化されてＶＨＬタンパク質との相互作用が調節される（非特許文献２）。特に、プロリルハイドロキシラーゼ−２酵素は、酸素、鉄及び補助因子(cofactor)である２−オキソグルタレート(2-oxoglutarate)の存在下で反応が進行される。ここで、酵素自体が酸化されることにより早い速度で非活性化されることを防ぐためには、アスコルベート(ascorbate)が必要とされる（非特許文献３）。このような水酸化反応を通じて転写とタンパク質加水分解(proteolytic destruction)を調節するメカニズムを形成することにより、さまざまな病的機序研究に役立つ。
【０００４】
ＶＨＬタンパク質は、約１００個のアミノ酸を有するβ領域(β domain)と約３５個のアミノ酸からなるα領域(α domain)で構成されている。この中でβ領域は、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質と結合してＶＨＬ−Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ複合体を形成し、該複合体のＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ部分にＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質が結合することによりＶＢＣタンパク質を形成する。前記ＶＢＣタンパク質の残りのα領域にＨＩＦ−１αが結合する。ここで、ＶＨＬタンパク質の１１５番目のＨｉｓ基、１１１番目のＳｅｒ基とＨＩＦ−１αの５６４番目の水酸化−Ｐｒｏ基との水素結合が重要な役目を担当する（非特許文献４）。
【０００５】
このようなＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αとの相互作用を観察するために多くの生化学的または免疫学的方法が使われている。まず、２種のタンパク質間の相互作用を研究するために広く使われているツーハイブリッド分析法(two-hybrid assay)を利用する場合、酵母ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン(DNA binding domain, DBD)はＶＨＬタンパク質に、転写活性化ドメイン(transcriptional activation domain, TAD)はＨＩＦ−１αに、各々融合させて二つのタンパク質が結合してはじめて転写を活性化させることができる特徴を利用する。ここで、ＧＦＰ(green fluorescent protein)、ルシフェラーゼ(luciferase)、β−ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)等のリポーター(reporter)遺伝子を利用すれば、前記二つのタンパク質の結合による転写活性を容易に追跡することができる。すなわち、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αタンパク質が結合すれば、リポーター遺伝子が活性化され、二つのタンパク質間の相互作用の有無を観察することができる（特許文献１）。
【０００６】
その他の方法としては、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αタンパク質中の一方のタンパク質は検出可能な物質で標識させて、残りのタンパク質は固体担体に固定させて二つのタンパク質の相互作用を測定する方法がある。検出可能な標識としては、組換えによって生産されるタンパク質に導入することができる３５Ｓ−メチオニン(35S-methionine)、ＨＡ標識(tag)、ＧＳＴ標識、ヒスチジン標識等がある（特許文献１）。この中でＨＩＦ−１αにＧＳＴを標識させてＶＨＬタンパク質に３５Ｓを標識させて電気泳動(SDS-PAGE)と磁気放射法(autoradiography)を利用して相互作用を観察する方法が普遍的に利用されている（非特許文献５）。しかし、この方法は大量の試料を必要とし過程が複雑で実験所要時間が長くなり放射性アイソトープを使わなければならない等の短所がある。
【０００７】
これ以外にもＶＨＬタンパク質と特定の部分のＨＩＦ−１αを一緒に免疫沈降(coimunoprecipitation)させる方法が、ＶＨＬタンパク質と相互作用するＨＩＦ−１αの部分をスクリーニングするのに利用されている（非特許文献６）。また、標的化合物に放射能を標識してタンパク質が結合する時にシンチレーション(scintillation)が起きることを感知するシンチレーション近接分析法(scintillation proximity assay)も利用されている（特許文献１）。
【０００８】
しかし、上記のような生化学的または免疫学的方法や放射能を標識する方法は、過程が複雑で費用がたくさんかかる短所があるため、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αの結合に係わる特性を観察するためのより簡単な分析法の開発が求められている。このような研究の一環として放射線元素を使わないで短時間にＨＩＦとＶＢＣタンパク質間の結合と水酸化反応の特性を観察することができる９６−ウェルプレートを利用した分析法が開発された（非特許文献７）。前記方法は、ビオチン(biotin)が標識されたＨＩＦ−１α(biotinyl-HIF-1α)とＶＢＣ複合体を反応させた後、アビジン(avidin)がコーティングされたプレートに入れた後、波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定して定量する方法である。この方法は、数十ナノモル水準の濃度範囲でもＨＩＦの水酸化反応を観察して簡単に測定できるという長所があるが、高価なアビジンがコーティングされたプレートを必ず使わなければならないという問題点がある。
【０００９】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を容易に定量的に分析することができる方法を開発しようと研究努力を重ねた結果、ハイドロキシプロリンを含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣタンパク質の相互作用の有無を蛍光偏光度の変化を利用して定量的に分析する方法を開発した。本発明の分析方法は、結合体を別に分離する必要がないため、既存の方法に比べて過程が単純でウェルプレートを利用した自動化が可能であり、分析費用を大きく節減することができるので、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の結合体形成に寄与するペプチド断片を分析したり、それらの間の相互作用を阻害する物質を検索したり、ＨＩＦ−１を水酸化させるプロリンハイドロキシラーゼの活性を分析したりするのに非常に有用に適用することができる。
【００１０】
【特許文献１】米国特許番号第6,787,326号B1
【非特許文献１】Amato G.等, Nature Reviews 2003年, 第2巻, 1-9頁
【非特許文献２】Masson N. and Ratcliffe P.J., Journal of Cell Science 2003年, 第116巻, 041-3049頁
【非特許文献３】Ivan M.等, PNAS 2002年, 第99(21)巻, 3459-13464頁
【非特許文献４】Min J.H. et al., Science 2002年, 第296巻, 886-1889頁
【非特許文献５】Yu F.等, PNAS 2001年, 第98(17)巻, 630-9635頁
【非特許文献６】Yu F.等, Cancer Research 2001年, 第61巻, 4136-4142頁
【非特許文献７】F. Oehme等, Analytical Biochemistry 2004年, 第330巻, 74-80頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との相互作用を簡単に定量的に分析することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、光偏光度を利用してプロリン水酸化反応の有無によってＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を定量的に分析する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は前記分析方法を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を妨害する物質を検索する方法を提供する。
【００１４】
同時に、本発明は前記分析方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法を提供する。
【００１５】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法を提供する。
【００１６】
本発明による好ましい分析方法は、
１）ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して、光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む。
【００１７】
工程１）で蛍光プローブは、公知されたＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列の中でＶＢＣタンパク質に結合すると知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成した後、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けてその終りに蛍光物質を標識させて準備する。このように準備したペプチド配列の中で特定プロリン残基を水和させて蛍光プローブがハイドロキシプロリン基を含むようにする。
【００１８】
本発明でペプチドに標識することができる蛍光物質としては、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び ４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択して使用することができる。特定プロリン残基の水酸化は、水酸化されたプロリンアミノ酸の添加(Merck社のHyPアミノ酸を合成する時に添加して使用)により成される。
【００１９】
本発明の好ましい実施例では、ＧｅｎＢａｎｋ登載番号：(U22431)のＨＩＦ−１αアミノ酸配列の中で５５６乃至５７４ａ．ａ．に該当する部位と３９０乃至４１７ａ．ａ．に該当する部位を選定した後、各々のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にＦＩＴＣを標識して配列番号：１で記載される２０個のアミノ酸を有するＦ−Ｐ５６４及び配列番号：２で記載される２８個のアミノ酸を有するＦ−Ｐ４０２ペプチドを製造する。前記Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチドの５６４番目のプロリン（配列番号：１から１２番目アミノ酸）と４０２番目プロリン（配列番号：２から１６番目アミノ酸）を水酸化されたプロリンアミノ酸の添加により水和させて配列番号：３及び４で記載されるＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドを合成する。
【００２０】
工程２）は、工程１）で準備した蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程で、ＶＢＣタンパク質は通常的な遺伝子組換え技術により製造することができる。
【００２１】
一般的に、ＶＢＣタンパク質は、まずＶＨＬタンパク質のβ領域にＥｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質を結合させてＶＨＬ−Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ複合体を形成し、前記複合体のＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ部分にＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質を結合させて形成される。ＶＨＬ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂ遺伝子は、各々ＧｅｎＢａｎｋに登載番号(NM000551)、(NM007108)及び(NM005648)で公知されている。
【００２２】
本発明の好ましい実施例では、ＶＨＬタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクター、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクター、及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクターを製造した後、これらを適当な宿主細胞に同時に形質転換させて宿主細胞内で、ＶＨＬ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質が一つに連結された複合体形態で発現させて、宿主細胞からこれを分離する。宿主細胞で発現されたＶＢＣタンパク質は、培養された細胞または培養溶液から抽出して分離、精製することができる。ＶＢＣタンパク質の分離、精製は、多くの公知の方法によって実施することができ、透析、限外ろ過、ゲルろ過及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのような分子量の差を利用した方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用した方法、逆相高性能液体クロマトグラフィーのように親水性の差を利用した方法を使用することができる。
【００２３】
上記のように製造された蛍光プローブが付着したペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の適当な緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を誘導する。
【００２４】
工程３）では、蛍光偏光分析機を利用して反応が完了した工程２）の反応物の蛍光偏光度を測定した後、測定された反応物の蛍光偏光度の値を蛍光プローブ自体の蛍光偏光度の値と比べてその変化を観察する。ＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質が付着した蛍光プローブは、相対的に小さな値の蛍光偏光度を有するが、この蛍光プローブが分子量が大きいＶＢＣタンパク質と結合して結合体を形成するようになれば、蛍光偏光度が顕著に増加するようになる。したがって、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質間の反応前後の蛍光偏光度値の変化を観察して、蛍光偏光度に何も変化がない場合にはこれら間の相互作用が起きていないこと示し、蛍光偏光度が顕著に増加した場合にはこれら間の相互作用によって結合体が形成されたと判断することができる。
【００２５】
前記方法によって工程１）で製造されたハイドロキシプロリン基を含むＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２蛍光プローブとハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２蛍光プローブを対象にＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合有無と特性を分析した。
【００２６】
まず、プロリン水酸化反応によってＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合様相が変わるかどうかを調べるために、Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドを各々ＶＢＣタンパク質と２５℃で反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物はＦ−Ｐ５６４ペプチド自体の蛍光偏光度と類似の値を示した一方、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物はＦ−Ｐ５６４ペプチド自体より著しく増加した蛍光偏光度を示し、ハイドロキシプロリン基を有するＨＩＦ−１ペプチドがＶＢＣタンパク質と結合してこれらの結合を蛍光偏光度の変化で容易に分析することができることを確認した（図１参照）。
【００２７】
また、ＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながらＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと反応させた結果、溶液上のＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれて蛍光偏光度が増加して（図２参照）Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドがＶＢＣタンパク質の濃度に依存的様相で相互作用することが分かった。ここで、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数は、１３８．１ｎＭだった（図３参照）。
【００２８】
他のプロリン水酸化反応部位として知られている４０２番目プロリンに対するＦ−ＨｙＰ４０２ペプチド蛍光プローブに対しても上記と同様に実験した結果、ＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質反応物の蛍光偏光度が増加することが示され（図４参照）、ＶＢＣタンパク質の濃度に依存的にＦ−ＨｙＰ４０２ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体が増加することが確認された。ここで、結合定数は、３３７．７９ｎＭと示され（図５参照）５６４番目プロリンの水酸化反応が４０２番目プロリンの水酸化反応よりさらに強いＶＢＣタンパク質との結合を誘発することを分かった。
【００２９】
前記結果から本発明の分析方法が、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用による結合体形成有無を、結合体を別に分離することなしに蛍光偏光度を利用して簡単に定量的に分析することができることを確認した。
【００３０】
また、本発明は、前記分析方法を利用してハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法を提供する。
【００３１】
前記検索方法は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチド蛍光プローブとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させた後、反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加有無による蛍光偏光度の変化を観察する。ここで、阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少すれば、その物質はＨＩＦ−１ペプチドとお互いに競争的にＶＢＣタンパク質に作用して結合体を形成する阻害剤であることが分かる。
【００３２】
本発明の好ましい実施例では、このような競争反応を利用してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成を阻害する物質を検索する可能性をテストするために、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応液にＨｙＰ５６４ペプチドの濃度を増加させながら反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、一定量のＶＢＣタンパク質に対してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＨｙＰ５６４ペプチドがお互いに競争的に作用して、ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成は阻害されて蛍光偏光度が減少することを確認した（図６及び４ｂ参照）。したがって、本発明による蛍光偏光度分析方法にこのような競争反応を適用すれば、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合を抑制する物質を容易に検索することができる。
【００３３】
同時に、本発明は前記蛍光偏光度を利用した分析方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法を提供する。
【００３４】
プロリルハイドロキシラーゼは、ＨＩＦ−１の特定プロリン基を水酸化させる酵素で、前記方法はハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにこの酵素を処理すれば、特定プロリン基が水酸化されてＶＢＣタンパク質と結合することができるのかどうかを分析する方法である。
【００３５】
ハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理した後、酵素反応物の質量を分析してＦ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと比較した結果、プロリルハイドロキシラーゼの作用によりＦ−Ｐ５６４の５６４番目プロリン基が水酸化されたことを確認した（図１０参照）。また、蛍光偏光度分析方法で酵素反応物のＶＢＣタンパク質結合体に対する反応有無を確認するために、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物各々をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、酵素反応物の蛍光偏光度がＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの場合と同じように増加することを確認し（図１１参照）、プロリルハイドロキシラーゼの活性によりＦ−Ｐ５６４ペプチドがＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドに転換されてＶＢＣタンパク質と結合体を形成することができ、このような相互作用を 本発明の分析方法によって蛍光偏光度の変化を観察することによって容易に定量的に分析することができることを確認した。
【００３６】
本発明（１）は、
１）ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法である。
本発明（２）は、工程１）で蛍光プローブが、ＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列(GenBank 登載番号:U22431)中でＶＢＣタンパク質に結合することが知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成し、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けて、その終りに蛍光物質を標識した後、特定プロリン残基を水和させてハイドロキシプロリン基を含むように製造することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが、配列番号：３または４で記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（４）は、蛍光物質が、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択されることを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（５）は、工程２）で、蛍光物質が付着したＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合して即時に測定可能であることを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（６）は、工程３）で測定された工程２）反応物の蛍光偏光度が、蛍光プローブの蛍光偏光度より増加した場合には、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質が結合体を形成したと判断することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（７）は、本発明(1)の方法を利用して、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法である。
本発明（８）は、
１）蛍光物質が結合されたハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させる工程；
２）前記反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加可否による蛍光偏光度の変化を観察する工程；及び
３）阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少した場合に、前記候補物質を阻害剤であると判定する工程を含むことを特徴とする本発明(7)の方法である。
本発明（９）は、本発明(1)の方法を利用して、プロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法である。
本発明（１０）は、
１）ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理する工程；
２）前記酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定する工程；及び
３）工程２）で測定された蛍光偏光度をハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合体の蛍光偏光度と比べる工程を含む本発明(9)の方法である。
【発明の効果】
【００３７】
したがって、本発明の蛍光偏光度を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を分析する方法を利用すれば、ハイドロキシプロリンを持ったＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を定量的に評価することができ、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の結合を阻害する物質を容易に検索できるだけではなく、プロリルハイドロキシラーゼの活性を簡便に測定できる。また、前記方法は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合体を別に分離する必要がないので工程が簡単でウェルプレート上に適用して超高速検索に利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
ＶＢＣタンパク質の製造
ヒトフォン・ヒッペル・リンダウ(Human von Hippel-Lindau)遺伝子断片(GenBank登載番号:NM000551のアミノ酸配列中54乃至213a.a.に該当)とヒトＥｌｏｎｇｉｎ Ｂ断片(GenBank登載番号:NM007108のアミノ酸配列中1乃至118a.a.に該当)が、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１の変形されたベクターに挿入されたプラスミド(pGEX4T-VHL-EB)とヒトＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ断片(GenBank登載番号:NM005648のアミノ酸配列中17乃至112a.a.に該当)が、ｐＥＴ２９ｂのベクターに挿入されたプラスミド(pDEV-EC)(Novagen)を大膓菌ＢＬ２１(DE3)(Novagen)に同時に形質転換して大量発現させた。
【００４０】
形質転換された細胞を３７℃で５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ampicillin)を含んだＬＢ培地に接種して吸光度が０．８乃至０．９になるまで培養した後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で発現を誘導して、１８℃で１５時間培養した。１０ｍＭリン酸塩緩衝溶液(PBS, pH 7.4, 110mM NaCl及び1mM DTT [dithiotheitol])に、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）とライソザイム(lysozyme)を最終濃度が各々０．２ｍＭ及び１ｍｇ／ｍｌになるように添加した後、遠心分離により回収された細胞を前記緩衝溶液に懸濁して４℃で超音波処理で破壊した。細胞抽出物に２％トリトンＸ−１００(Triton X-100)を添加してよく攪拌後、１０分間氷に置いてから１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。それから分離した上層液に１ｍＭ ＤＴＴを添加してグルタチオン−セパロース(glutathione-sepharose)４Ｂ樹脂(Bio-Rad)と混合した後、４℃で２時間撹拌した。反応した樹脂混合液に１０倍容積のリン酸塩緩衝溶液を添加して、２１００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液を除去した。上記過程を３回繰り返して反応しない上層液を除去した。
【００４１】
バイオスピンディスポーザブルクロマトグラフィーカラム(Bio-Spin Disposable Chromatography Columns, Bio-Rad)に反応した樹脂混合物を入れて、５ｍｌのＰＢＳでろ過させて、２ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ溶液でろ過させることにより不必要な反応物を除去した。前記カラムを１０ｍＭグルタチオン(GSH)で溶離させてＧＳＴ−ＶＢＣタンパク質を回収した。回収されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、ＢＣＡタンパク質分析法(Pierce)で定量した。
【実施例２】
【００４２】
蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合力分析
＜２−１＞ 蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドの製造
ＨＩＦ−１α(hypoxia-inducible factor)の蛍光プローブを製作するために、ＨＩＦ−１αタンパク質の中でＶＢＣタンパク質と結合することが知られている部分（非特許文献４）のアミノ酸配列中５６乃至５７４番目アミノ酸部位と３９０乃至４１７番目アミノ酸部位を対象配列に選定して、そのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けてその終りにＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)が標識された形態にペプチドを設計した後、合成した(Anygen, Korea)。このように合成した蛍光プローブを各々Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチドと命名し、それらは配列番号：１及び２で記載されるアミノ酸配列を有する。また、前記Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチド各々の５６４番目プロリン（配列番号：１から１２番目のアミノ酸）と４０２番目プロリン（配列番号：２から１６番目アミノ酸）が水和されたＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドを合成した(Anygen, Korea)。これらは各々配列番号：３及び４で記載されるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
実施例１で製造されたＶＢＣタンパク質と上記のように合成されたペプチドを使って、タンパク質リガンドの複合体形成の時、変化する蛍光偏光度を測定することによりこれら間の結合有無と結合特性を下記のように分析した。ここで、蛍光偏光度は、蛍光偏光分析機(fluorometer, Perkin-Elmer)を利用して測定し、スリットの大きさは５ｎｍ、積分時間は５秒に設定した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１２０ｍＭ ＮａＣｌを含みｐＨが８．０に調整された緩衝溶液にＮＰ−４０(nonidet P40)を０．５％になるように実験前に添加して結合実験に使用した。
【００４４】
＜２−２＞ 蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合分析
前記実施例＜２−１＞で合成されたペプチド蛍光プローブがＶＢＣタンパク質と結合するのかどうかを蛍光偏光度の変化で分析するために、上記であらかじめ準備した緩衝溶液にＦ−Ｐ５６４ペプチドとＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドを各々濃度１００ｎＭで溶解させた後、８００ｎＭＶＢＣタンパク質を添加して２５℃で混合した。混合後、蛍光偏光度を測定した結果、ハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４ペプチドの蛍光偏光度は０．０６６だった。一方、ハイドロキシプロリン基を含むＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの蛍光偏光度は０．３２４に増加した（図１）。このような結果は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが分子量が大きいＶＢＣタンパク質との相互作用により結合体を形成することにより蛍光偏光度が顕著に増加したことを示し、このような結合体の形成を蛍光偏光度の変化で簡単に分析することができることを示すものである。
【００４５】
＜２−３＞ＶＢＣタンパク質の濃度変化による蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合分析
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドにＶＢＣタンパク質の濃度を０から１４００ｎＭに増加させながら前記実施例＜２−２＞と同じ条件で反応させた後、蛍光偏光度の変化を測定した結果、溶液のＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれて蛍光偏光度も比例的に増加して、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合体形成がＶＢＣタンパク質の濃度につれて増加することが確認された（図２）。
【００４６】
図２の結果からＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数を求めるために下記式１及び２を使ってカレイダグラフ(KaleidaGraph)プログラムで計算した結果、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合定数は、１３８．１ｎＭだった（図５）。
【００４７】
【数１】
【００４８】
ＦＰ：試料の蛍光偏光度
ＦＰ０：［ＶＢＣ］＝０の時の蛍光偏光度
ＦＰｍａｘ：Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドがすべてＶＢＣタンパク質と結合体を形成した時の蛍光偏光度
［ＶＢＣ］０：試料中のＶＢＣタンパク質の濃度
［Ｆ−ＨｙＰ５６４］０：試料中のＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの濃度
Ｋｄ：ＶＢＣタンパク質とＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド間の結合定数
【００４９】
【数２】
【００５０】
［ＨｙＰ５６４］：試料中のＨｙＰ５６４ペプチドの濃度
ＫＤ：ＶＢＣとＨｙＰ５６４ペプチド間の結合定数
【００５１】
また、他のプロリン水酸化反応部位として知られている４０２番目プロリンを対象にしたＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドに対しても上記と同じ方法でＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドの場合にもＶＢＣタンパク質の濃度が増加するほど蛍光偏光度が増加した（図４）。式１及び２を利用してカレイダグラフプログラムで計算した結果、Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数は、３３７．７９ｎＭだった（図５）。
【００５２】
前記結果から、ＨＩＦ−１タンパク質の５６４番目プロリンの水酸化反応が４０２番目プロリンの水酸化反応よりさらに強いＶＢＣタンパク質との相互作用を誘発し、このような相互作用により形成された結合体の形成を蛍光偏光度の変化で簡便に分析することができることを確認した。
【実施例３】
【００５３】
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質結合体形成の阻害物質検索
前記実施例２で検証された蛍光偏光度分析方法を利用して競争反応でＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質結合体の形成を阻害する物質を検索することができるのかどうかを調査するために蛍光物質が標識されないＨｙＰ５６４ペプチドを阻害剤に利用して次のような実験を遂行した。
【００５４】
前記実施例２と同じ緩衝溶液に１００ｎＭのＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと５００ｎＭのＶＢＣタンパク質を添加した後、ここにＨｙＰ５６４ペプチドの濃度を０から５００μＭに増加させながら２５℃で混合した。前記反応液の蛍光偏光度を測定した結果、ＨｙＰ５６４ペプチドを添加しない場合に比べて添加した場合に蛍光偏光度が減少した（図６）。ここで、ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合定数は、３．７１μＭだった（図７）。前記結果は、ＨｙＰ５６４ペプチドがＶＢＣタンパク質に対してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとお互いに競争的に作用するため、ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成が阻害されたこともので、これを利用すれば、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の間の相互作用を阻害する物質を容易に検索することができることを示すものである。
【実施例４】
【００５５】
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成に決定的な部位確認
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドでＶＢＣタンパク質と特異的に結合する部分を決定するために、配列番号：１で記載されるアミノ酸配列の中でＮ断片（アミノ酸配列 ALAPYPA）とＣ断片（アミノ酸配列 DDDFQLR）、及びＮ断片のプロリン基が水酸化されたＨｙ−Ｎ断片ペプチド（アミノ酸配列 ALAHyPYPA）を合成した(Anygen, Korea)。
【００５６】
前記実施例＜２−２＞と同じ条件で１００ｎＭのＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと５００ｎＭのＶＢＣタンパク質を含む試料を製造し、そこにＰ５６４ペプチド、Ｎ、Ｃ及びＨｙ−Ｎ断片各々の濃度を０から５００μＭに増加させながら添加して混合後、これらの蛍光偏光度の変化を測定した。
【００５７】
その結果、図８に示したように、Ｐ５６４ペプチド、Ｎ断片及びＣ断片が添加された試料では、微々たる蛍光偏光度の減少だけが高い濃度のペプチドで観察され、競争反応によりＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成があまり阻害されなかったことが分かった。一方、Ｈｙ−Ｎ断片ペプチドが添加された試料では、この濃度が増加するにつれて蛍光偏光度の急激な減少を見せたが、前記ペプチドによる阻害効果を式１及び２を利用してカレイダグラフプログラムで定量分析した結果、２０μＭの結合定数を得た（図９）。
【００５８】
以上のことから、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドでＶＢＣタンパク質との相互作用に重要な役目を担当する部位がハイドロキシプロリン基を含む部位であることを確認した。
【実施例５】
【００５９】
蛍光偏光度測定によるプロリルハイドロキシラーゼ活性分析
ＨＩＦ−１αの特定プロリン基を水酸化反応させる酵素として知られたＨＩＦ−１α特異的なプロリル−４−ハイドロキシラーゼ−２（ＰＨＤ−２）でＦ−Ｐ５６４ペプチドを処理した後、このペプチドがＶＢＣタンパク質と結合するのかどうかを蛍光偏光度を利用して調査した。
【００６０】
まず、ヒトのリンパ球ｃＤＮＡライブラリからクローニングしたヒトＰＨＤ２遺伝子（GenBank登載番号:AJ310543）をｐＥＴ２１ｂベクター(Novagen)にクローニングして得たプラスミドｐＥＴ２１ｂ−ＰＨＤ２を大膓菌に形質転換させた後、大量発現させた。前記大膓菌形質転換体から大量発現されたＰＨＤ２タンパク質をヒスチジン標識(Histidine-tag)を利用してニッケル親和性クロマトグラフィー(Ni-affinity chromatography)とゲルろ過(gel-filtration)で精製した後、超遠心分離(ultracentrifμgation)で濃縮して得たプロリルハイドロキシラーゼを以後の分析に利用した。
【００６１】
プロリン水酸化反応分析のために最終濃度が２ｍＭのアスコルビン酸、５ｍＭのα−ケトグルタレート(α-ketoglutarate)及び１００μＭの塩化第２鉄水和物(Iron (II) Chloride Hydrate)になるように緩衝溶液（20mM Tris-HCl, pH8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.5% NP-40)に分析の直前に添加した。ここに上記で精製されたプロリンハイドロキシラーゼ４μｇとＦ−Ｐ５６４ペプチド１６μＭを混合した後、３０℃で９０分間反応させた。反応後、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物をＭＡＬＤＩ質量分析機(mass spectrometry)で分析して、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドのプロリン基が水酸化されたことを確認した（図１０）。
【００６２】
前記実施例＜２−２＞と同じ緩衝液及び反応条件で、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物(F-P564:100nM,F-HyP564:100nM, 酵素反応物:500nM)各々を５００ｎＭＶＢＣタンパク質と２５℃で混合後、蛍光偏光度を測定した。その結果、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドを添加した場合に比べて酵素反応物を添加した場合の蛍光偏光度が、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドを添加した場合と同様の水準で著しく増加したことを確認した（図１１）。
【００６３】
以上のことから、ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドがプロリルハイドロキシラーゼにより特定プロリン基が水酸化されてＶＢＣタンパク質と結合することができることを蛍光偏光度の変化で簡単に確認することができ、これを利用してプロリルハイドロキシラーゼの活性も分析することができることが分かる。
【００６４】
したがって、本発明の分析法を利用すれば、ハイドロキシプロリンを持ったＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣの結合を定量的に評価することができ、ＨＩＦ−１−ＶＢＣ結合を阻害する物質の検索及びプロリルハイドロキシラーゼ酵素の活性を簡便に測定できる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
上記で詳しく見たように、本発明の蛍光偏光度を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合様相を分析する方法は、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質結合体を別に分離する過程なしに、蛍光偏光度の増減を通じて簡単に分析することができ、前記分析方法は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索してプロリルハイドロキシラーゼの活性を分析するのに非常に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド各々をＶＢＣタンパク質と反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図２】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドをＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図３】図２で形成されたＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合体の結合定数をカレイダグラフ(KaleidaGraph)プログラムを利用して分析した結果である。
【図４】Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドをＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図５】図４で形成されたＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合体の結合定数をカレイダグラフプログラムを利用して分析した結果である。
【図６】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応時阻害剤候補物質の各々を添加した後、結合体の形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図７】図６で阻害剤と確認されたＨｙＰ５６４ペプチドの５０％阻害濃度をカレイダグラフプログラムを利用して測定した結果である。
【図８】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応時の結合部位を確認するために阻害剤であるＨｙＰ５６４ペプチドの各種断片を添加した後、蛍光偏光度の変化を測定した結果である。
【図９】図８で阻害効果を示すＨｙＰ５６４ペプチドのＮ−断片ペプチドの５０％阻害濃度をカレイダグラフプログラムを利用して測定した結果である。
【図１０】Ｆ−Ｐ５６４ペプチドをプロリルハイドロキシラーゼで処理した後、前記ペプチドの水酸化反応の有無を質量分析機(mass spectrometry)で確認した結果である。
【図１１】Ｆ−Ｐ５６４ペプチドとプロリルハイドロキシラーゼの酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定してＦ−Ｐ５６４ペプチドまたはＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合による蛍光偏光度の変化と比べた結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシプロリンを含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣタンパク質との相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法および該方法を利用してこれら間の相互作用を阻害する阻害剤を検索する方法、並びに該方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼの活性を分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＦ−１(hypoxia inducible factor-1；低酸素誘導因子)は、エネルギー代謝、血管運動制御、新血管形成及びアポトーシスに関与する遺伝子の発現調節をはじめ低酸素状態に対する多様な細胞反応において重要な役目をするタンパク質である。特に、ＨＩＦ−１αは、正常酸素状態ではプロテオゾーム(proteosome)により分解されるが、低酸素状態では安定化される。このような調節機序は、ｐＶＨＬ(von Hippel-Lindau tumour suppressor)タンパク質とＨＩＦ−１αとの相互作用によって起きる。ＨＩＦ−１αとｐＶＨＬ間の相互作用を抑制すれば、低酸素状態で細胞周期の進行が促進されたり血管形成の亢進または細胞生存機能が亢進されたりするため、冠状動脈不全、脳不全及び血管不全のような虚血状態の治療に好ましい（特許文献１）。一方、これら間の相互作用を促進させる場合には正常酸素状態で血管形成の抑制を通じて癌組職の成長を抑制することができ、癌治療研究に非常に有用である（非特許文献１）。
【０００３】
ＶＨＬタンパク質とヒトＨＩＦ−１αの結合は、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列の中で４０２番目または５６４番目に位置したハイドロキシプロリン基に依存する。プロリルハイドロキシラーゼという酵素によってＨＩＦ−１αタンパク質の特定プロリン基が水酸化されてＶＨＬタンパク質との相互作用が調節される（非特許文献２）。特に、プロリルハイドロキシラーゼ−２酵素は、酸素、鉄及び補助因子(cofactor)である２−オキソグルタレート(2-oxoglutarate)の存在下で反応が進行される。ここで、酵素自体が酸化されることにより早い速度で非活性化されることを防ぐためには、アスコルベート(ascorbate)が必要とされる（非特許文献３）。このような水酸化反応を通じて転写とタンパク質加水分解(proteolytic destruction)を調節するメカニズムを形成することにより、さまざまな病的機序研究に役立つ。
【０００４】
ＶＨＬタンパク質は、約１００個のアミノ酸を有するβ領域(β domain)と約３５個のアミノ酸からなるα領域(α domain)で構成されている。この中でβ領域は、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質と結合してＶＨＬ−Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ複合体を形成し、該複合体のＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ部分にＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質が結合することによりＶＢＣタンパク質を形成する。前記ＶＢＣタンパク質の残りのα領域にＨＩＦ−１αが結合する。ここで、ＶＨＬタンパク質の１１５番目のＨｉｓ基、１１１番目のＳｅｒ基とＨＩＦ−１αの５６４番目の水酸化−Ｐｒｏ基との水素結合が重要な役目を担当する（非特許文献４）。
【０００５】
このようなＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αとの相互作用を観察するために多くの生化学的または免疫学的方法が使われている。まず、２種のタンパク質間の相互作用を研究するために広く使われているツーハイブリッド分析法(two-hybrid assay)を利用する場合、酵母ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン(DNA binding domain, DBD)はＶＨＬタンパク質に、転写活性化ドメイン(transcriptional activation domain, TAD)はＨＩＦ−１αに、各々融合させて二つのタンパク質が結合してはじめて転写を活性化させることができる特徴を利用する。ここで、ＧＦＰ(green fluorescent protein)、ルシフェラーゼ(luciferase)、β−ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)等のリポーター(reporter)遺伝子を利用すれば、前記二つのタンパク質の結合による転写活性を容易に追跡することができる。すなわち、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αタンパク質が結合すれば、リポーター遺伝子が活性化され、二つのタンパク質間の相互作用の有無を観察することができる（特許文献１）。
【０００６】
その他の方法としては、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αタンパク質中の一方のタンパク質は検出可能な物質で標識させて、残りのタンパク質は固体担体に固定させて二つのタンパク質の相互作用を測定する方法がある。検出可能な標識としては、組換えによって生産されるタンパク質に導入することができる３５Ｓ−メチオニン(35S-methionine)、ＨＡ標識(tag)、ＧＳＴ標識、ヒスチジン標識等がある（特許文献１）。この中でＨＩＦ−１αにＧＳＴを標識させてＶＨＬタンパク質に３５Ｓを標識させて電気泳動(SDS-PAGE)と磁気放射法(autoradiography)を利用して相互作用を観察する方法が普遍的に利用されている（非特許文献５）。しかし、この方法は大量の試料を必要とし過程が複雑で実験所要時間が長くなり放射性アイソトープを使わなければならない等の短所がある。
【０００７】
これ以外にもＶＨＬタンパク質と特定の部分のＨＩＦ−１αを一緒に免疫沈降(coimunoprecipitation)させる方法が、ＶＨＬタンパク質と相互作用するＨＩＦ−１αの部分をスクリーニングするのに利用されている（非特許文献６）。また、標的化合物に放射能を標識してタンパク質が結合する時にシンチレーション(scintillation)が起きることを感知するシンチレーション近接分析法(scintillation proximity assay)も利用されている（特許文献１）。
【０００８】
しかし、上記のような生化学的または免疫学的方法や放射能を標識する方法は、過程が複雑で費用がたくさんかかる短所があるため、ＶＨＬタンパク質とＨＩＦ−１αの結合に係わる特性を観察するためのより簡単な分析法の開発が求められている。このような研究の一環として放射線元素を使わないで短時間にＨＩＦとＶＢＣタンパク質間の結合と水酸化反応の特性を観察することができる９６−ウェルプレートを利用した分析法が開発された（非特許文献７）。前記方法は、ビオチン(biotin)が標識されたＨＩＦ−１α(biotinyl-HIF-1α)とＶＢＣ複合体を反応させた後、アビジン(avidin)がコーティングされたプレートに入れた後、波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定して定量する方法である。この方法は、数十ナノモル水準の濃度範囲でもＨＩＦの水酸化反応を観察して簡単に測定できるという長所があるが、高価なアビジンがコーティングされたプレートを必ず使わなければならないという問題点がある。
【０００９】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を容易に定量的に分析することができる方法を開発しようと研究努力を重ねた結果、ハイドロキシプロリンを含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣタンパク質の相互作用の有無を蛍光偏光度の変化を利用して定量的に分析する方法を開発した。本発明の分析方法は、結合体を別に分離する必要がないため、既存の方法に比べて過程が単純でウェルプレートを利用した自動化が可能であり、分析費用を大きく節減することができるので、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の結合体形成に寄与するペプチド断片を分析したり、それらの間の相互作用を阻害する物質を検索したり、ＨＩＦ−１を水酸化させるプロリンハイドロキシラーゼの活性を分析したりするのに非常に有用に適用することができる。
【００１０】
【特許文献１】米国特許番号第6,787,326号B1
【非特許文献１】Amato G.等, Nature Reviews 2003年, 第2巻, 1-9頁
【非特許文献２】Masson N. and Ratcliffe P.J., Journal of Cell Science 2003年, 第116巻, 041-3049頁
【非特許文献３】Ivan M.等, PNAS 2002年, 第99(21)巻, 3459-13464頁
【非特許文献４】Min J.H. et al., Science 2002年, 第296巻, 886-1889頁
【非特許文献５】Yu F.等, PNAS 2001年, 第98(17)巻, 630-9635頁
【非特許文献６】Yu F.等, Cancer Research 2001年, 第61巻, 4136-4142頁
【非特許文献７】F. Oehme等, Analytical Biochemistry 2004年, 第330巻, 74-80頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との相互作用を簡単に定量的に分析することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、光偏光度を利用してプロリン水酸化反応の有無によってＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を定量的に分析する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は前記分析方法を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を妨害する物質を検索する方法を提供する。
【００１４】
同時に、本発明は前記分析方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法を提供する。
【００１５】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法を提供する。
【００１６】
本発明による好ましい分析方法は、
１）ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して、光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む。
【００１７】
工程１）で蛍光プローブは、公知されたＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列の中でＶＢＣタンパク質に結合すると知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成した後、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けてその終りに蛍光物質を標識させて準備する。このように準備したペプチド配列の中で特定プロリン残基を水和させて蛍光プローブがハイドロキシプロリン基を含むようにする。
【００１８】
本発明でペプチドに標識することができる蛍光物質としては、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び ４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択して使用することができる。特定プロリン残基の水酸化は、水酸化されたプロリンアミノ酸の添加(Merck社のHyPアミノ酸を合成する時に添加して使用)により成される。
【００１９】
本発明の好ましい実施例では、ＧｅｎＢａｎｋ登載番号：(U22431)のＨＩＦ−１αアミノ酸配列の中で５５６乃至５７４ａ．ａ．に該当する部位と３９０乃至４１７ａ．ａ．に該当する部位を選定した後、各々のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にＦＩＴＣを標識して配列番号：１で記載される２０個のアミノ酸を有するＦ−Ｐ５６４及び配列番号：２で記載される２８個のアミノ酸を有するＦ−Ｐ４０２ペプチドを製造する。前記Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチドの５６４番目のプロリン（配列番号：１から１２番目アミノ酸）と４０２番目プロリン（配列番号：２から１６番目アミノ酸）を水酸化されたプロリンアミノ酸の添加により水和させて配列番号：３及び４で記載されるＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドを合成する。
【００２０】
工程２）は、工程１）で準備した蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程で、ＶＢＣタンパク質は通常的な遺伝子組換え技術により製造することができる。
【００２１】
一般的に、ＶＢＣタンパク質は、まずＶＨＬタンパク質のβ領域にＥｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質を結合させてＶＨＬ−Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ複合体を形成し、前記複合体のＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ部分にＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質を結合させて形成される。ＶＨＬ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂ遺伝子は、各々ＧｅｎＢａｎｋに登載番号(NM000551)、(NM007108)及び(NM005648)で公知されている。
【００２２】
本発明の好ましい実施例では、ＶＨＬタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクター、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクター、及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクターを製造した後、これらを適当な宿主細胞に同時に形質転換させて宿主細胞内で、ＶＨＬ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ及びＥｌｏｎｇｉｎ Ｂタンパク質が一つに連結された複合体形態で発現させて、宿主細胞からこれを分離する。宿主細胞で発現されたＶＢＣタンパク質は、培養された細胞または培養溶液から抽出して分離、精製することができる。ＶＢＣタンパク質の分離、精製は、多くの公知の方法によって実施することができ、透析、限外ろ過、ゲルろ過及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのような分子量の差を利用した方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用した方法、逆相高性能液体クロマトグラフィーのように親水性の差を利用した方法を使用することができる。
【００２３】
上記のように製造された蛍光プローブが付着したペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の適当な緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を誘導する。
【００２４】
工程３）では、蛍光偏光分析機を利用して反応が完了した工程２）の反応物の蛍光偏光度を測定した後、測定された反応物の蛍光偏光度の値を蛍光プローブ自体の蛍光偏光度の値と比べてその変化を観察する。ＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質が付着した蛍光プローブは、相対的に小さな値の蛍光偏光度を有するが、この蛍光プローブが分子量が大きいＶＢＣタンパク質と結合して結合体を形成するようになれば、蛍光偏光度が顕著に増加するようになる。したがって、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質間の反応前後の蛍光偏光度値の変化を観察して、蛍光偏光度に何も変化がない場合にはこれら間の相互作用が起きていないこと示し、蛍光偏光度が顕著に増加した場合にはこれら間の相互作用によって結合体が形成されたと判断することができる。
【００２５】
前記方法によって工程１）で製造されたハイドロキシプロリン基を含むＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２蛍光プローブとハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２蛍光プローブを対象にＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合有無と特性を分析した。
【００２６】
まず、プロリン水酸化反応によってＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合様相が変わるかどうかを調べるために、Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドを各々ＶＢＣタンパク質と２５℃で反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物はＦ−Ｐ５６４ペプチド自体の蛍光偏光度と類似の値を示した一方、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物はＦ−Ｐ５６４ペプチド自体より著しく増加した蛍光偏光度を示し、ハイドロキシプロリン基を有するＨＩＦ−１ペプチドがＶＢＣタンパク質と結合してこれらの結合を蛍光偏光度の変化で容易に分析することができることを確認した（図１参照）。
【００２７】
また、ＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながらＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと反応させた結果、溶液上のＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれて蛍光偏光度が増加して（図２参照）Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドがＶＢＣタンパク質の濃度に依存的様相で相互作用することが分かった。ここで、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数は、１３８．１ｎＭだった（図３参照）。
【００２８】
他のプロリン水酸化反応部位として知られている４０２番目プロリンに対するＦ−ＨｙＰ４０２ペプチド蛍光プローブに対しても上記と同様に実験した結果、ＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質反応物の蛍光偏光度が増加することが示され（図４参照）、ＶＢＣタンパク質の濃度に依存的にＦ−ＨｙＰ４０２ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体が増加することが確認された。ここで、結合定数は、３３７．７９ｎＭと示され（図５参照）５６４番目プロリンの水酸化反応が４０２番目プロリンの水酸化反応よりさらに強いＶＢＣタンパク質との結合を誘発することを分かった。
【００２９】
前記結果から本発明の分析方法が、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用による結合体形成有無を、結合体を別に分離することなしに蛍光偏光度を利用して簡単に定量的に分析することができることを確認した。
【００３０】
また、本発明は、前記分析方法を利用してハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法を提供する。
【００３１】
前記検索方法は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチド蛍光プローブとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させた後、反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加有無による蛍光偏光度の変化を観察する。ここで、阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少すれば、その物質はＨＩＦ−１ペプチドとお互いに競争的にＶＢＣタンパク質に作用して結合体を形成する阻害剤であることが分かる。
【００３２】
本発明の好ましい実施例では、このような競争反応を利用してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成を阻害する物質を検索する可能性をテストするために、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応液にＨｙＰ５６４ペプチドの濃度を増加させながら反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、一定量のＶＢＣタンパク質に対してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＨｙＰ５６４ペプチドがお互いに競争的に作用して、ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質の結合体形成は阻害されて蛍光偏光度が減少することを確認した（図６及び４ｂ参照）。したがって、本発明による蛍光偏光度分析方法にこのような競争反応を適用すれば、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合を抑制する物質を容易に検索することができる。
【００３３】
同時に、本発明は前記蛍光偏光度を利用した分析方法を利用してプロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法を提供する。
【００３４】
プロリルハイドロキシラーゼは、ＨＩＦ−１の特定プロリン基を水酸化させる酵素で、前記方法はハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにこの酵素を処理すれば、特定プロリン基が水酸化されてＶＢＣタンパク質と結合することができるのかどうかを分析する方法である。
【００３５】
ハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理した後、酵素反応物の質量を分析してＦ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと比較した結果、プロリルハイドロキシラーゼの作用によりＦ−Ｐ５６４の５６４番目プロリン基が水酸化されたことを確認した（図１０参照）。また、蛍光偏光度分析方法で酵素反応物のＶＢＣタンパク質結合体に対する反応有無を確認するために、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物各々をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、酵素反応物の蛍光偏光度がＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの場合と同じように増加することを確認し（図１１参照）、プロリルハイドロキシラーゼの活性によりＦ−Ｐ５６４ペプチドがＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドに転換されてＶＢＣタンパク質と結合体を形成することができ、このような相互作用を 本発明の分析方法によって蛍光偏光度の変化を観察することによって容易に定量的に分析することができることを確認した。
【００３６】
本発明（１）は、
１）ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法である。
本発明（２）は、工程１）で蛍光プローブが、ＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列(GenBank 登載番号:U22431)中でＶＢＣタンパク質に結合することが知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成し、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けて、その終りに蛍光物質を標識した後、特定プロリン残基を水和させてハイドロキシプロリン基を含むように製造することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが、配列番号：３または４で記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（４）は、蛍光物質が、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択されることを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（５）は、工程２）で、蛍光物質が付着したＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合して即時に測定可能であることを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（６）は、工程３）で測定された工程２）反応物の蛍光偏光度が、蛍光プローブの蛍光偏光度より増加した場合には、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質が結合体を形成したと判断することを特徴とする本発明(1)の方法である。
本発明（７）は、本発明(1)の方法を利用して、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法である。
本発明（８）は、
１）蛍光物質が結合されたハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させる工程；
２）前記反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加可否による蛍光偏光度の変化を観察する工程；及び
３）阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少した場合に、前記候補物質を阻害剤であると判定する工程を含むことを特徴とする本発明(7)の方法である。
本発明（９）は、本発明(1)の方法を利用して、プロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法である。
本発明（１０）は、
１）ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理する工程；
２）前記酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定する工程；及び
３）工程２）で測定された蛍光偏光度をハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合体の蛍光偏光度と比べる工程を含む本発明(9)の方法である。
【発明の効果】
【００３７】
したがって、本発明の蛍光偏光度を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を分析する方法を利用すれば、ハイドロキシプロリンを持ったＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合を定量的に評価することができ、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の結合を阻害する物質を容易に検索できるだけではなく、プロリルハイドロキシラーゼの活性を簡便に測定できる。また、前記方法は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合体を別に分離する必要がないので工程が簡単でウェルプレート上に適用して超高速検索に利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
ＶＢＣタンパク質の製造
ヒトフォン・ヒッペル・リンダウ(Human von Hippel-Lindau)遺伝子断片(GenBank登載番号:NM000551のアミノ酸配列中54乃至213a.a.に該当)とヒトＥｌｏｎｇｉｎ Ｂ断片(GenBank登載番号:NM007108のアミノ酸配列中1乃至118a.a.に該当)が、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１の変形されたベクターに挿入されたプラスミド(pGEX4T-VHL-EB)とヒトＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ断片(GenBank登載番号:NM005648のアミノ酸配列中17乃至112a.a.に該当)が、ｐＥＴ２９ｂのベクターに挿入されたプラスミド(pDEV-EC)(Novagen)を大膓菌ＢＬ２１(DE3)(Novagen)に同時に形質転換して大量発現させた。
【００４０】
形質転換された細胞を３７℃で５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ampicillin)を含んだＬＢ培地に接種して吸光度が０．８乃至０．９になるまで培養した後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で発現を誘導して、１８℃で１５時間培養した。１０ｍＭリン酸塩緩衝溶液(PBS, pH 7.4, 110mM NaCl及び1mM DTT [dithiotheitol])に、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）とライソザイム(lysozyme)を最終濃度が各々０．２ｍＭ及び１ｍｇ／ｍｌになるように添加した後、遠心分離により回収された細胞を前記緩衝溶液に懸濁して４℃で超音波処理で破壊した。細胞抽出物に２％トリトンＸ−１００(Triton X-100)を添加してよく攪拌後、１０分間氷に置いてから１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。それから分離した上層液に１ｍＭ ＤＴＴを添加してグルタチオン−セパロース(glutathione-sepharose)４Ｂ樹脂(Bio-Rad)と混合した後、４℃で２時間撹拌した。反応した樹脂混合液に１０倍容積のリン酸塩緩衝溶液を添加して、２１００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液を除去した。上記過程を３回繰り返して反応しない上層液を除去した。
【００４１】
バイオスピンディスポーザブルクロマトグラフィーカラム(Bio-Spin Disposable Chromatography Columns, Bio-Rad)に反応した樹脂混合物を入れて、５ｍｌのＰＢＳでろ過させて、２ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ溶液でろ過させることにより不必要な反応物を除去した。前記カラムを１０ｍＭグルタチオン(GSH)で溶離させてＧＳＴ−ＶＢＣタンパク質を回収した。回収されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、ＢＣＡタンパク質分析法(Pierce)で定量した。
【実施例２】
【００４２】
蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合力分析
＜２−１＞ 蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドの製造
ＨＩＦ−１α(hypoxia-inducible factor)の蛍光プローブを製作するために、ＨＩＦ−１αタンパク質の中でＶＢＣタンパク質と結合することが知られている部分（非特許文献４）のアミノ酸配列中５６乃至５７４番目アミノ酸部位と３９０乃至４１７番目アミノ酸部位を対象配列に選定して、そのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けてその終りにＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)が標識された形態にペプチドを設計した後、合成した(Anygen, Korea)。このように合成した蛍光プローブを各々Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチドと命名し、それらは配列番号：１及び２で記載されるアミノ酸配列を有する。また、前記Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−Ｐ４０２ペプチド各々の５６４番目プロリン（配列番号：１から１２番目のアミノ酸）と４０２番目プロリン（配列番号：２から１６番目アミノ酸）が水和されたＦ−ＨｙＰ５６４及びＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドを合成した(Anygen, Korea)。これらは各々配列番号：３及び４で記載されるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
実施例１で製造されたＶＢＣタンパク質と上記のように合成されたペプチドを使って、タンパク質リガンドの複合体形成の時、変化する蛍光偏光度を測定することによりこれら間の結合有無と結合特性を下記のように分析した。ここで、蛍光偏光度は、蛍光偏光分析機(fluorometer, Perkin-Elmer)を利用して測定し、スリットの大きさは５ｎｍ、積分時間は５秒に設定した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１２０ｍＭ ＮａＣｌを含みｐＨが８．０に調整された緩衝溶液にＮＰ−４０(nonidet P40)を０．５％になるように実験前に添加して結合実験に使用した。
【００４４】
＜２−２＞ 蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合分析
前記実施例＜２−１＞で合成されたペプチド蛍光プローブがＶＢＣタンパク質と結合するのかどうかを蛍光偏光度の変化で分析するために、上記であらかじめ準備した緩衝溶液にＦ−Ｐ５６４ペプチドとＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドを各々濃度１００ｎＭで溶解させた後、８００ｎＭＶＢＣタンパク質を添加して２５℃で混合した。混合後、蛍光偏光度を測定した結果、ハイドロキシプロリン基を含まないＦ−Ｐ５６４ペプチドの蛍光偏光度は０．０６６だった。一方、ハイドロキシプロリン基を含むＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの蛍光偏光度は０．３２４に増加した（図１）。このような結果は、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが分子量が大きいＶＢＣタンパク質との相互作用により結合体を形成することにより蛍光偏光度が顕著に増加したことを示し、このような結合体の形成を蛍光偏光度の変化で簡単に分析することができることを示すものである。
【００４５】
＜２−３＞ＶＢＣタンパク質の濃度変化による蛍光標識されたＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合分析
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドにＶＢＣタンパク質の濃度を０から１４００ｎＭに増加させながら前記実施例＜２−２＞と同じ条件で反応させた後、蛍光偏光度の変化を測定した結果、溶液のＶＢＣタンパク質の濃度が増加するにつれて蛍光偏光度も比例的に増加して、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合体形成がＶＢＣタンパク質の濃度につれて増加することが確認された（図２）。
【００４６】
図２の結果からＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数を求めるために下記式１及び２を使ってカレイダグラフ(KaleidaGraph)プログラムで計算した結果、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合定数は、１３８．１ｎＭだった（図５）。
【００４７】
【数１】
【００４８】
ＦＰ：試料の蛍光偏光度
ＦＰ０：［ＶＢＣ］＝０の時の蛍光偏光度
ＦＰｍａｘ：Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドがすべてＶＢＣタンパク質と結合体を形成した時の蛍光偏光度
［ＶＢＣ］０：試料中のＶＢＣタンパク質の濃度
［Ｆ−ＨｙＰ５６４］０：試料中のＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドの濃度
Ｋｄ：ＶＢＣタンパク質とＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド間の結合定数
【００４９】
【数２】
【００５０】
［ＨｙＰ５６４］：試料中のＨｙＰ５６４ペプチドの濃度
ＫＤ：ＶＢＣとＨｙＰ５６４ペプチド間の結合定数
【００５１】
また、他のプロリン水酸化反応部位として知られている４０２番目プロリンを対象にしたＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドに対しても上記と同じ方法でＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後、蛍光偏光度を測定した結果、Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドの場合にもＶＢＣタンパク質の濃度が増加するほど蛍光偏光度が増加した（図４）。式１及び２を利用してカレイダグラフプログラムで計算した結果、Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合定数は、３３７．７９ｎＭだった（図５）。
【００５２】
前記結果から、ＨＩＦ−１タンパク質の５６４番目プロリンの水酸化反応が４０２番目プロリンの水酸化反応よりさらに強いＶＢＣタンパク質との相互作用を誘発し、このような相互作用により形成された結合体の形成を蛍光偏光度の変化で簡便に分析することができることを確認した。
【実施例３】
【００５３】
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質結合体形成の阻害物質検索
前記実施例２で検証された蛍光偏光度分析方法を利用して競争反応でＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド−ＶＢＣタンパク質結合体の形成を阻害する物質を検索することができるのかどうかを調査するために蛍光物質が標識されないＨｙＰ５６４ペプチドを阻害剤に利用して次のような実験を遂行した。
【００５４】
前記実施例２と同じ緩衝溶液に１００ｎＭのＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと５００ｎＭのＶＢＣタンパク質を添加した後、ここにＨｙＰ５６４ペプチドの濃度を０から５００μＭに増加させながら２５℃で混合した。前記反応液の蛍光偏光度を測定した結果、ＨｙＰ５６４ペプチドを添加しない場合に比べて添加した場合に蛍光偏光度が減少した（図６）。ここで、ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の間の結合定数は、３．７１μＭだった（図７）。前記結果は、ＨｙＰ５６４ペプチドがＶＢＣタンパク質に対してＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとお互いに競争的に作用するため、ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成が増加するにつれてＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成が阻害されたこともので、これを利用すれば、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質の間の相互作用を阻害する物質を容易に検索することができることを示すものである。
【実施例４】
【００５５】
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成に決定的な部位確認
Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドでＶＢＣタンパク質と特異的に結合する部分を決定するために、配列番号：１で記載されるアミノ酸配列の中でＮ断片（アミノ酸配列 ALAPYPA）とＣ断片（アミノ酸配列 DDDFQLR）、及びＮ断片のプロリン基が水酸化されたＨｙ−Ｎ断片ペプチド（アミノ酸配列 ALAHyPYPA）を合成した(Anygen, Korea)。
【００５６】
前記実施例＜２−２＞と同じ条件で１００ｎＭのＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドと５００ｎＭのＶＢＣタンパク質を含む試料を製造し、そこにＰ５６４ペプチド、Ｎ、Ｃ及びＨｙ−Ｎ断片各々の濃度を０から５００μＭに増加させながら添加して混合後、これらの蛍光偏光度の変化を測定した。
【００５７】
その結果、図８に示したように、Ｐ５６４ペプチド、Ｎ断片及びＣ断片が添加された試料では、微々たる蛍光偏光度の減少だけが高い濃度のペプチドで観察され、競争反応によりＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質結合体の形成があまり阻害されなかったことが分かった。一方、Ｈｙ−Ｎ断片ペプチドが添加された試料では、この濃度が増加するにつれて蛍光偏光度の急激な減少を見せたが、前記ペプチドによる阻害効果を式１及び２を利用してカレイダグラフプログラムで定量分析した結果、２０μＭの結合定数を得た（図９）。
【００５８】
以上のことから、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドでＶＢＣタンパク質との相互作用に重要な役目を担当する部位がハイドロキシプロリン基を含む部位であることを確認した。
【実施例５】
【００５９】
蛍光偏光度測定によるプロリルハイドロキシラーゼ活性分析
ＨＩＦ−１αの特定プロリン基を水酸化反応させる酵素として知られたＨＩＦ−１α特異的なプロリル−４−ハイドロキシラーゼ−２（ＰＨＤ−２）でＦ−Ｐ５６４ペプチドを処理した後、このペプチドがＶＢＣタンパク質と結合するのかどうかを蛍光偏光度を利用して調査した。
【００６０】
まず、ヒトのリンパ球ｃＤＮＡライブラリからクローニングしたヒトＰＨＤ２遺伝子（GenBank登載番号:AJ310543）をｐＥＴ２１ｂベクター(Novagen)にクローニングして得たプラスミドｐＥＴ２１ｂ−ＰＨＤ２を大膓菌に形質転換させた後、大量発現させた。前記大膓菌形質転換体から大量発現されたＰＨＤ２タンパク質をヒスチジン標識(Histidine-tag)を利用してニッケル親和性クロマトグラフィー(Ni-affinity chromatography)とゲルろ過(gel-filtration)で精製した後、超遠心分離(ultracentrifμgation)で濃縮して得たプロリルハイドロキシラーゼを以後の分析に利用した。
【００６１】
プロリン水酸化反応分析のために最終濃度が２ｍＭのアスコルビン酸、５ｍＭのα−ケトグルタレート(α-ketoglutarate)及び１００μＭの塩化第２鉄水和物(Iron (II) Chloride Hydrate)になるように緩衝溶液（20mM Tris-HCl, pH8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.5% NP-40)に分析の直前に添加した。ここに上記で精製されたプロリンハイドロキシラーゼ４μｇとＦ−Ｐ５６４ペプチド１６μＭを混合した後、３０℃で９０分間反応させた。反応後、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物をＭＡＬＤＩ質量分析機(mass spectrometry)で分析して、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドのプロリン基が水酸化されたことを確認した（図１０）。
【００６２】
前記実施例＜２−２＞と同じ緩衝液及び反応条件で、Ｆ−Ｐ５６４、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチド及び酵素反応物(F-P564:100nM,F-HyP564:100nM, 酵素反応物:500nM)各々を５００ｎＭＶＢＣタンパク質と２５℃で混合後、蛍光偏光度を測定した。その結果、Ｆ−Ｐ５６４ペプチドを添加した場合に比べて酵素反応物を添加した場合の蛍光偏光度が、Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドを添加した場合と同様の水準で著しく増加したことを確認した（図１１）。
【００６３】
以上のことから、ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドがプロリルハイドロキシラーゼにより特定プロリン基が水酸化されてＶＢＣタンパク質と結合することができることを蛍光偏光度の変化で簡単に確認することができ、これを利用してプロリルハイドロキシラーゼの活性も分析することができることが分かる。
【００６４】
したがって、本発明の分析法を利用すれば、ハイドロキシプロリンを持ったＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着したプローブとＶＢＣの結合を定量的に評価することができ、ＨＩＦ−１−ＶＢＣ結合を阻害する物質の検索及びプロリルハイドロキシラーゼ酵素の活性を簡便に測定できる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
上記で詳しく見たように、本発明の蛍光偏光度を利用してＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合様相を分析する方法は、ＨＩＦ−１−ＶＢＣタンパク質結合体を別に分離する過程なしに、蛍光偏光度の増減を通じて簡単に分析することができ、前記分析方法は、ＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索してプロリルハイドロキシラーゼの活性を分析するのに非常に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｆ−Ｐ５６４及びＦ−ＨｙＰ５６４ペプチド各々をＶＢＣタンパク質と反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図２】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドをＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図３】図２で形成されたＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合体の結合定数をカレイダグラフ(KaleidaGraph)プログラムを利用して分析した結果である。
【図４】Ｆ−ＨｙＰ４０２ペプチドをＶＢＣタンパク質の濃度を増加させながら反応させた後の結合体形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図５】図４で形成されたＦ−ＨｙＰ４０２ペプチドとＶＢＣタンパク質間の結合体の結合定数をカレイダグラフプログラムを利用して分析した結果である。
【図６】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応時阻害剤候補物質の各々を添加した後、結合体の形成有無を蛍光偏光度の変化で調査した結果である。
【図７】図６で阻害剤と確認されたＨｙＰ５６４ペプチドの５０％阻害濃度をカレイダグラフプログラムを利用して測定した結果である。
【図８】Ｆ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応時の結合部位を確認するために阻害剤であるＨｙＰ５６４ペプチドの各種断片を添加した後、蛍光偏光度の変化を測定した結果である。
【図９】図８で阻害効果を示すＨｙＰ５６４ペプチドのＮ−断片ペプチドの５０％阻害濃度をカレイダグラフプログラムを利用して測定した結果である。
【図１０】Ｆ−Ｐ５６４ペプチドをプロリルハイドロキシラーゼで処理した後、前記ペプチドの水酸化反応の有無を質量分析機(mass spectrometry)で確認した結果である。
【図１１】Ｆ−Ｐ５６４ペプチドとプロリルハイドロキシラーゼの酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定してＦ−Ｐ５６４ペプチドまたはＦ−ＨｙＰ５６４ペプチドとＶＢＣタンパク質の結合による蛍光偏光度の変化と比べた結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法。
【請求項２】
工程１）で蛍光プローブが、ＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列(GenBank 登載番号:U22431)中でＶＢＣタンパク質に結合することが知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成し、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けて、その終りに蛍光物質を標識した後、特定プロリン残基を水和させてハイドロキシプロリン基を含むように製造することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが、配列番号：３または４で記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
蛍光物質が、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程２）で、蛍光物質が付着したＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合して即時に測定可能であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程３）で測定された工程２）反応物の蛍光偏光度が、蛍光プローブの蛍光偏光度より増加した場合には、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質が結合体を形成したと判断することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法を利用して、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法。
【請求項８】
１）蛍光物質が結合されたハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させる工程；
２）前記反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加可否による蛍光偏光度の変化を観察する工程；及び
３）阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少した場合に、前記候補物質を阻害剤であると判定する工程を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法を利用して、プロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法。
【請求項１０】
１）ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理する工程；
２）前記酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定する工程；及び
３）工程２）で測定された蛍光偏光度をハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合体の蛍光偏光度と比べる工程を含む請求項９記載の方法。
【請求項１】
１）ハイドロキシプロリン基(hydroxyproline)を含むＨＩＦ−１ペプチドに蛍光物質を付着して蛍光プローブを製造する工程；
２）前記蛍光プローブをＶＢＣタンパク質と反応させる工程；及び
３）前記反応物の蛍光偏光度を測定した後、蛍光プローブ自体の蛍光偏光度と比べて蛍光偏光度の変化を観察する工程を含む、プロリン水酸化反応によるＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の相互作用を蛍光偏光度を利用して定量的に分析する方法。
【請求項２】
工程１）で蛍光プローブが、ＨＩＦ−１タンパク質のアミノ酸配列(GenBank 登載番号:U22431)中でＶＢＣタンパク質に結合することが知られている部位を対象に特定ペプチド配列を選定して合成し、合成されたペプチドのＮ−末端にアミノカプロン酸リンカー(aminocaproic acid linker)を付けて、その終りに蛍光物質を標識した後、特定プロリン残基を水和させてハイドロキシプロリン基を含むように製造することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドが、配列番号：３または４で記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
蛍光物質が、フルオレシンカルボキシル酸(FCA)、フルオレシンイソチオシアネート(FITC)、フルオレシンチオＯウレア(FTH)、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレシン−５−イル、フルオレシン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレシン−６−イル、ジハイドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチル及び４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程２）で、蛍光物質が付着したＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質を２５℃の緩衝溶液で１：１から１：１４の割合で混合して即時に測定可能であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程３）で測定された工程２）反応物の蛍光偏光度が、蛍光プローブの蛍光偏光度より増加した場合には、蛍光プローブとＶＢＣタンパク質が結合体を形成したと判断することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法を利用して、ハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質間の相互作用を阻害する物質を検索する方法。
【請求項８】
１）蛍光物質が結合されたハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応溶液に阻害剤候補物質を添加して反応させる工程；
２）前記反応溶液の蛍光偏光度を測定して阻害剤候補物質の添加可否による蛍光偏光度の変化を観察する工程；及び
３）阻害剤候補物質の添加によりハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質の反応物の蛍光偏光度が減少した場合に、前記候補物質を阻害剤であると判定する工程を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法を利用して、プロリルハイドロキシラーゼ(prolyl hydroxylase)の活性を分析する方法。
【請求項１０】
１）ハイドロキシプロリン基を含まないＨＩＦ−１ペプチドにプロリルハイドロキシラーゼを処理する工程；
２）前記酵素反応物をＶＢＣタンパク質と反応させた後、蛍光偏光度を測定する工程；及び
３）工程２）で測定された蛍光偏光度をハイドロキシプロリン基を含むＨＩＦ−１ペプチドとＶＢＣタンパク質との結合体の蛍光偏光度と比べる工程を含む請求項９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−３３４３０（Ｐ２００７−３３４３０Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４６５３９（Ｐ２００５−３４６５３９）
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月３０日（２００５．１１．３０）
【出願人】（５９５００１１８１）コリア インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (25)
【Ｆターム（参考）】
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