ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
試料中のヘモグロビンの干渉を軽減して種々の自動分析装置に適用できる簡便で効率の良い、試料中の基質を測定する方法及びその測定試薬を提供する。 基質に対応するオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより試料中の基質を測定する方法において、ヘモグロビン含有試料をポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤で処理することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の基質の測定。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンによる測定系への干渉を軽減し、試料中の基質を精度よく測定する方法及びその測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの生体試料中に存在する特定成分の測定は、その存在量の変動と疾病との関連が解明されるに従い、疾患の診断、病態の解明、治療効果の判断などを行う上で必須なものとなっている。現在、生体試料（例えば血清）中の特定成分の測定方法としては、目的とする特定成分もしくは当該特定成分由来の成分（以下、総称して「基質」ということがある）に特異的に反応する酵素を用いて酵素反応を行い、その結果生じる生成物を測定することにより定量する酵素法が一般的である。これら酵素法のなかでも、オキシダーゼのような過酸化水素生成酵素（以下、「オキシダーゼ酵素」ということがある）を基質に作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色定量する方法が広く普及している。
【０００３】
前記オキシダーゼ酵素を利用する基質の測定方法における基質としては、例えば、グルコース、コレステロール、中性脂肪、リン脂質、遊離脂肪酸、尿酸、クレアチニン、シアル酸、ポリアミン、糖化ヘモグロビンなどを挙げることができ、臨床検査の領域で実際に測定されている。
【０００４】
しかしながら、当該測定方法は、オキシダーゼ酵素による酸化反応を基礎原理として成り立っているため、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等の生体内還元物質による干渉を受けやすく、測定値に負の誤差を生じるという問題がある。また、ビリルビンやヘモグロビンは、それ自身が可視領域に吸収を有するため、比色定量時の測定波長と重なり誤差の原因となることや、ビリルビンやヘモグロビン自身の吸光が外部からの光あるいは測定試薬中の成分によって経時的に変化し測定結果に影響を与えることも知られている。前述のほか、脂質等による濁りの干渉を受けやすいことも知られている。
【０００５】
上記した物質のうち、ヘモグロビンの生体試料（血清、血漿、尿、唾液、髄液等）への混入は、通常、極微量であるが、溶血をともなう疾患などの場合のほかに、採血など測定用試料の採取条件、血液試料の調製、保存条件によっては二次的に試料中に漏出することがある。また、全血や血球、或いはこれらを処理して得た溶血液を試料とする場合には、自ずとヘモグロビンが混入する。従って、オキシダーゼ酵素を利用する基質の測定方法においてヘモグロビンの干渉を軽減させることは重要な課題となっている。
【０００６】
試料中の基質をオキシダーゼ酵素を用いて定量する際のヘモグロビンの干渉を軽減する方法としては、ヘモグロビン自身の吸収波長を避けた特定波長で測定する方法（例えば、特許文献１参照）、陽イオン系又は両性界面活性剤を用いる方法（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【０００７】
しかしながら、ヘモグロビン自身の吸収波長を避けて特定の検出波長で測定する方法では、比色定量時の検出波長が限定されるとともに、測定装置も限定される。また、陽イオン系又は両性界面活性剤を用いる方法では、試料と混和した際に濁りを生じたり、酵素活性に影響を与える場合がある。
【０００８】
上記の他に、２種類の陰イオン系界面活性剤を組み合わせて使用する方法も知られている（特許文献３参照）が、この方法では、陰イオン系界面活性剤による酵素蛋白質の変性を回避するために、特定量のアルキルスルホン酸塩及びアルキルナフタレンスルホン酸塩を同時に使用する必要があった。
【特許文献１】特開平９−１１９９３２号公報
【特許文献２】特開平３−１０６９６号公報
【特許文献３】特開平８−８９２８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンの測定系への干渉を軽減して種々の自動分析装置に適用できる簡便で効率の良い、試料中の基質を測定する方法及びその測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる実情に鑑み、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンの測定系への干渉を軽減する方法について鋭意検討した結果、試料を特定の陰イオン系界面活性剤で処理することにより測定系へのヘモグロビンの干渉を軽減できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、基質に対応するオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより試料中の基質を測定する方法において、ヘモグロビン含有試料をポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤で処理することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法を提供するものである。
【００１２】
本発明はまた、（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、並びに（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を含むヘモグロビン含有試料中の基質測定用試薬を提供するものである。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも、（１）界面活性剤、（２）糖化蛋白質に作用してフルクトシルペプチドを生成する蛋白質分解酵素及び（３）フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素を含むことを特徴とする糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法を提供するものである。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも界面活性剤で前処理されたヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン測定を行い、更にヘモグロビン測定用反応液にフルクトシルバリルヒスチジンを生成する蛋白質分解酵素を作用させ、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定を行うことを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法を提供するものである。
【００１５】
本発明はまた、血球を含む試料と界面活性剤を含む反応液を混合して血球からヘモグロビンを溶出させる工程、本反応液を希釈して光学的にヘモグロビンの濃度を求める工程、ヘモグロビンに蛋白質分解酵素を作用させて少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産する工程、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンにこれを基質として過酸化水素を産する酵素を作用させる工程、過酸化水素とパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を作用させる工程、呈色化合物の生成による吸光度変化を測定しヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求める工程、並びにヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度からヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を求める工程からなるヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法を提供するものである。
【００１６】
本発明はまた、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定における試料の前処理方法を提供するものである。
【００１７】
本発明はまた、血球からヘモグロビンを溶出させる工程、ヘモグロビンの濃度を求める工程からなるヘモグロビン濃度測定において、少なくともポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度測定方法を提供するものである。
【００１８】
本発明は更に、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する目的で、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできることを特徴とする、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の基質の測定方法によれば、試料中に共存するヘモグロビンの干渉を軽減して、基質を精度よく測定することができる。また、本発明の基質の測定方法は、簡便な操作で測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の基質の測定方法は、試料中に共存するヘモグロビンの干渉を軽減する目的で、試料を特定の陰イオン系界面活性剤で処理する以外は、公知の酵素法に準じて実施することができる。
【００２１】
本発明が適用可能な試料としては、ヘモグロビンを含有する試料であれば特に制限はない。生体試料としては、全血、血球、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等が挙げられる。このうち、全血、血球、血清又は血漿が好ましい。これらの試料は、そのまま測定に供することはもちろん、ろ過や透析処理の後に測定に供してもよく、また必要であれば、試料（基質）を濃縮、抽出、希釈等してもよい。
【００２２】
前記した希釈は、水又は緩衝液で行うことができる。この場合の緩衝液の種類、濃度に特に制限はなく、リン酸、フタル酸、クエン酸、トリス、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、酢酸、グッド（ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＤＡなど）の緩衝液等を０．００００１〜２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌの濃度で使用することができる。
【００２３】
本発明の基質の測定方法に使用できる特定の陰イオン系界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤であり、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類又はアルキルスルホコハク酸類であり、特に好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩又はアルキルスルホコハク酸類であり、最も好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸である。これら特定の陰イオン系界面活性剤は、市販品として入手可能である。
【００２４】
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類としては、例えば、ニッコールＳＢＬ−４Ｎ、ニッコールＳＢＬ−２Ｔ−３６（以上、日本油脂社製）、エマール２０Ｔ、エマール３２７、エマール２０Ｃ（以上、花王社製）、ハイテノール２２５Ｌ、ハイテノール３２５Ｄ、ハイテノールＮＦ１３、ハイテノールＮＦ１５（以上、第一工業製薬社製）、サンノールＬＭＴ−１４３０、サンノールＤＭ１４７０（以上、ライオン社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類としては、例えば、ニッコールＳＮＰ−４Ｎ（日本油脂社製）、エマールＮＣ３５（花王社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類は、リン酸モノエステル、リン酸ジエステル又はその混合物でもよく、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類としては、例えば、プライサーフＡ２０８Ｂ、プライサーフＡ２１９Ｂ、プライサーフＡ２０８Ｓ、プライサーフＡ２１２Ｃ、プライサーフＡ２１２Ｅ、プライサーフＡ２１５Ｃ（以上、第一工業製薬社製）などが挙げられる。これらのポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸のうちで、プライサーフＡ２０８Ｂが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類としては、例えば、ネオハイテノールＳ−７０、ネオハイテノールＬ−３０、ネオハイテノールＬＭ−２０（以上、第一工業製薬社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類としては、例えば、カオーアキポＲＬＭ−１００ＮＶ（花王社製）、ネオハイテノールＥＣＬ−３０（第一工業製薬社製）、エヌジェコブ２ＰＳ３０、エヌジェコブ２ＰＳ４５（以上、新日本理化社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸類としては、例えば、リオノールＯＡＩ−Ｎ、リオノールＯＢＩ（以上、ライオン社製）などが挙げられる。
【００２５】
ラウリル硫酸トリエタノールアミンとしては、例えば、エマールＴＤ（花王社製）が挙げられる。アルキルスルホコハク酸類としては、例えば、ペレックスＣＳ（花王社製）が挙げられる。アルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類としては、例えば、ペレックスＳＳ−Ｈ（花王社製）が挙げられる。
【００２６】
ヘモグロビン含有試料の処理は、当該特定の陰イオン系界面活性剤と試料を混合することにより行うことができる。特定の陰イオン系界面活性剤の使用量は、前記した全血、血球、血清などの試料と混合した後の濃度として、０．０００１〜１０％、好ましくは０．００１〜３％である。ヘモグロビン含有試料の処理の時間、処理の温度は特に制限されず、例えば、自動分析装置へ適用する場合、処理時間５分、処理温度３７℃などが好ましい。また自動分析装置に適用する前に別途処理をすることもできる。これら処理の条件はいずれも実験によって適宜選択することができる。同様に特定の陰イオン系界面活性剤により試料を処理する際のｐＨや添加物等も、酵素反応を利用して基質を測定する際の障害とならない範囲で制限がない。
【００２７】
本発明の基質の測定方法で測定可能な基質は、オキシダーゼを用いる酵素法で測定できるものであれば制限されない。従って、本発明における「基質」には、それ自体がオキシダーゼの基質になりうる物質である場合、及び酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合（前述した特定成分由来の成分に相当）が含まれる。これらの基質として、グルコース、マンノース、ガラクトース等の糖類；コレステロ−ル、中性脂肪、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質類；糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン等の糖化蛋白質類；尿酸、尿素、クレアチニン、シアル酸、ポリアミンなどを例示することができる。
【００２８】
これらのうち、グルコース、尿酸などが、それ自体がオキシダーゼの基質となりうる物質である場合に該当し、血清中のエステル型コレステロールを加水分解酵素で処理して得られるコレステロールや血清中の糖化蛋白質を蛋白質分解酵素で処理して得られる糖化ペプチド及び糖化アミノ酸などが、酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合に該当する。
【００２９】
酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合のうち、糖化蛋白質を蛋白質分解酵素で処理してオキシダーゼの基質となる糖化ペプチド及び糖化アミノ酸を得ようとする場合を例にさらに説明する。
【００３０】
この場合の蛋白質分解酵素は、蛋白質分解活性、ペプチド分解活性を有していれば由来は微生物由来、動物由来、植物由来などの何れでもよく特に制限されない。短時間で効率よく目的とする糖化蛋白質（例えばヘモグロビンＡ１ｃ）から糖化ペプチド又は糖化アミノ酸、好ましくはフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸、特に好ましくはフルクトシルバリルヒスチジン又はフルクトシルバリンを遊離するものが使用される。具体的には、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、アミノペプチダーゼなど研究用試薬として広く市販されているものや、ニュートラルプロテイナーゼ、トヨチームＮＥＰ（以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、モルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（以上、新日本化学工業社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＣ、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＳ１０、プロチンＮＹ１０、プロチンＮＬ１０、プロチンＮＣ２５（以上、大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）、プロナーゼＥ（ロシュ社製）、ウマミザイム、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（以上、アマノエンザイム社製）など工業用として市販されているものが挙げられる。これら蛋白質分解酵素は、目的とする糖化蛋白質、フルクトシルペプチドと作用させ、作用の前後の試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析、比較することにより効果を確認できる。上記蛋白質分解酵素は、単独で用いても、また二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのなかで、バチルス属、アスペルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子により産生されるもの、又は、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしくは塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。
【００３１】
蛋白質分解酵素の濃度は、目的とする基質を効率よく遊離できる濃度であれば特に制限はない。使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。蛋白質分解酵素で処理するときのｐＨは、特に調整しなくてもよいが、使用する酵素の作用に好適なｐＨとなるように、適当なｐＨ調整剤、例えば緩衝液によってｐＨ３〜１１に調整してもよい。処理温度は、１０〜４０℃が好ましい。
【００３２】
本発明の基質の測定方法において使用できるオキシダーゼとしては、測定すべき基質を酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であり、公知のオキシダーゼを使用できる。例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開２００３−７９３８６号公報及び国際公開第９７／２００３９号パンフレット）、ケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９号公報）、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開２００１−９５５９８号公報及び特開２００３−２３５５８５号公報）などを挙げることができる。これらの酵素は、微生物由来、動物由来、植物由来等のいずれでもよく、また遺伝子操作により作られたものでもよい。更に、化学修飾の有無も問わない。これらの酵素は、溶液状態でも乾燥状態でもよく、不溶性担体に保持又は結合されていてもよく、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３３】
これらの酵素の使用量は、酵素の種類によっても異なるが、使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができ、特に制限はない。好ましくは０．００１〜１０００単位／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜１０００単位／ｍＬである。作用させるときのｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨを考慮し、緩衝液を用いて調整する。作用温度は、例えば、１０〜４０℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【００３４】
上記オキシダーゼは、必要に応じて、他の酵素、補酵素、被酸化性呈色試薬等と組み合わせて使用することができる。他の酵素としては、パーオキシダーゼ、ジアホラーゼ又はフルクトシルバリンを基質としないアミノ酸代謝酵素などが挙げられる。また、ヘモグロビン以外の生体内干渉物質を処理する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等の酵素も使用できる。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸（ＮＡＤＰＨ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等が挙げられる。
【００３５】
被酸化性呈色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば如何なるものでもよい。例えば、４−アミノアンチピリンと、フェノール系、ナフトール系又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組み合わせなどが挙げられる。４−アミノアンチピリンと組み合わせることができるフェノール系化合物としては、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールなどが挙げられ、アニリン系化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）などが挙げられる。その他、Ｎ−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン・ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミンなどが挙げられる。
【００３６】
本発明の基質の測定方法では、試料を前記陰イオン系界面活性剤で処理して試料中のヘモグロビンの干渉を軽減する工程とオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を測定する工程とを別々に行って基質を測定することもできるし、これらの工程を連続的に一段階で行って基質を測定することもできる。反応温度は、これら２つの工程で同一でも異なってもよく、本発明の基質測定用試薬が溶液状態にある温度、例えば、１０〜４０℃が好ましい。
【００３７】
本発明の基質の測定方法は、オキシダーゼ反応により基質を測定する際のヘモグロビンの干渉を軽減する一方で、本発明に係る陰イオン系界面活性剤で試料を処理した段階でヘモグロビンの有する吸収波長域における吸光度を測定すれば試料中のヘモグロビンを測定することができる。これにより糖化ヘモグロビン（好ましくはヘモグロビンＡ１ｃ）を測定することができるので、本発明の基質の測定方法によりヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合について説明する。
【００３８】
ヘモグロビンＡ１ｃは、赤血球に含有されるヘモグロビンが非酵素的に糖化されて形成されたものであり、過去一定期間の平均血糖値を反映することから臨床検査における指標として重要視されている。ヘモグロビンＡ１ｃは総ヘモグロビン存在量に対する比率（％）で表示されることから、その測定には、（ｉ）赤血球を溶血させてヘモグロビンを赤血球外に放出させ、測定可能な状態にする工程、（ｉｉ）ヘモグロビンの存在量を測定する工程、（ｉｉｉ）ヘモグロビンＡ１ｃの存在量を測定する工程（酵素法の場合、ヘモグロビンＡ１ｃから蛋白質分解酵素により特異的な糖化ペプチドあるいは糖化アミノ酸を遊離させる工程と当該遊離した糖化ペプチド又は糖化アミノ酸を特異的オキシダーゼを使用して測定する工程が含まれる）、（ｉｖ）ヘモグロビンＡ１ｃの存在量を総ヘモグロビンの存在量で除し比率を求める工程（演算工程）、が必要である。なお、ここで述べるように、本明細書において「基質の測定」の語は、試料中の基質の存在量（例えば濃度）の測定のほか、特定の基準物質に占める存在割合（例えば濃度比）の測定も含む。
【００３９】
本発明に係る陰イオン系界面活性剤は、ヘモグロビンのメト化処理能も有しているため、ヘモグロビンの吸収波長域の吸光度を測定して（ｉｉ）の工程を問題なく実施できる。
【００４０】
（ｉ）の工程には、従来公知の各種界面活性剤（例えば、非イオン系界面活性剤であるトリトンＸ−１００など）が使用できるが、本発明に係る陰イオン系界面活性剤、特にポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、或いはラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類、アルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる陰イオン系界面活性剤は、（ｉ）の工程においても使用可能であり、単独もしくは従来公知の各種界面活性剤と併用しても差し支えない。また（ｉ）の工程で単独もしくは本発明に係る陰イオン系界面活性剤と併用可能な非イオン系界面活性剤としては、従来公知のもののほかに、ポリオキシエチレン誘導体であるエマルゲン類（花王社製、エマルゲン７０９、エマルゲン１０８、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６など）、ニッコール類（ニッコーケミカルズ社製、ニッコールＢＣ２０ＴＸ、ニッコールＯＰ−１０、ニッコールＢＴ９など）、リポノックス類（ライオン社製、リポノックスＮＣ８０、リポノックスＯＣ１００など）レオコール類（ライオン社製、レオコールＴＤ９０、レオコールＳＣ１２０など）ノイゲン類（第一工業製薬社製、ノイゲンＥＡ１２０、ノイゲンＥＴ１４７など）、エパン類（第一工業製薬社製、エパン４８５、エパンＵ１０３など）、プルロニック類（旭電化社製、プルロニックＦ、プルロニックＴＲ７０４など）、アデカトール類（旭電化社製、アデカトールＳＯ１２０など）が使用できる。
【００４１】
（ｉｉｉ）の工程は、ヘモグロビンＡ１ｃに由来する糖化ペプチド又は糖化アミノ酸をヘモグロビンＡ１ｃから蛋白質分解酵素により遊離させ、さらにフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを使用して実施できる。（ｉｉｉ）の工程について前述しているが、さらに詳細に説明する。ヘモグロビンＡ１ｃの測定では、ヘモグロビンβ−サブユニットのアミノ末端のバリンが糖化されたフルクトシルバリンやフルクトシルバリルヒスチジンと、ε−フルクトシルリジンに対するオキシダーゼ酵素の反応性の違いが特異性を決定するが、ヘモグロビン分子中には４４個のリジン残基が存在しており、ε−フルクトシルリジンに対する反応性が低くとも、その影響を無視できない。またヘモグロビンのα鎖Ｎ末端のバリンも糖化によりフルクトシルバリンとなるが、バリンと隣接して結合しているアミノ酸はヒスチジンではないのでフルクトシルバリルヒスチジンは生成しない。従って酵素法によるヘモグロビンＡ１ｃ測定の特異性を確保するためには、フルクトシルリジンの測り込みを出来る限り排除することはもちろん、フルクトシルバリンだけを測定するよりもフルクトシルバリルヒスチジルペプチドを測定した方が有利となる。これより、蛋白質分解酵素がフルクトシルバリルヒスチジルペプチド、好ましくはフルクトシルバリルヒスチジンを遊離させるもので、フルクトシルペプチドオキシダーゼがフルクトシルバリルヒスチジンに作用するものが、特異性向上の観点から最も好ましい。
【００４２】
上記のような蛋白質分解酵素として、前述したバチルス属、アスペルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子組み換えにより産生されるものが好適である。バチルス属由来の酵素としては、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＮＣ２５（大和化成社製）、トヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）など、アスペルギルス属由来の酵素としては、モルシン（キッコーマン社製）、ストレプトマシシス属由来の酵素としては、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＡＦ、アクチナーゼＥ（科研製薬）、プロテアーゼＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）などが挙げられる。これらは単独で使用できるほか、トヨチームＮＥＰなどはプロテイナーゼＫと混合して併用することもできる。これら酵素は、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしくは塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。使用濃度や使用条件は前述したとおりである。
【００４３】
上記のようなフルクトシルペプチドオキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属菌の産生するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを改変した酵素（特開２００１−９５５９８号公報）、糸状菌由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開２００３−２３５５８５号公報）などが挙げられる。ＦＰＯＸ−ＣＥ又はＦＰＯＸ−ＥＥ（ともにキッコーマン社製）が特に好適である。
【００４４】
（ｉ）の工程から（ｉｖ）の工程までを順次、実施しても良いが、複数の工程を同時に実施することもできる。例えば、トリトンＸ−１００などの溶血を目的とした界面活性剤、プライサーフＡ２０８Ｂなどの本発明に係る陰イオン系界面活性剤をともに含む試薬で全血あるいは血球を処理すれば（ｉ）、（ｉｉ）の工程を同時に実施することができ、さらにプロテイナーゼＫやアクチナーゼＡＳなどの蛋白質分解酵素を共存させれば、（ｉｉｉ）の工程の一部も同時に実施することができる。
【００４５】
またさらに、本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法によれば、日立７１５０形自動分析装置など臨床検査（特に生化学検査）の領域で汎用される自動分析装置（以下「生化学自動分析装置」ということがある）を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比（％）（以下「ヘモグロビンＡ１ｃ（％）」と言うことがある）を測定する場合において、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定用試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にすることができる。これら（１）〜（４）を特徴とする、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を測定する方法も提供される。
【００４６】
本発明の試薬はヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する際に、１つの反応容器を用いてヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定しても、また生化学自動分析装置を用いて測定する際に構成試薬の連続した添加を行ういわゆる１チャンネル法で使用してもよいが、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の試薬使用量など操作条件を個別に設定するのが好ましい。本発明の試薬はヘモグロビン濃度測定用試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用でき、試料も共用できる。測定条件のうち、ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできる。
【００４７】
本発明の基質測定用試薬は、（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して、又は酵素反応により生成した基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、及び（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬、を含む。
【００４８】
更に、前記（Ｂ）記載のオキシダーゼを作用させた結果生じる生成物からさらに過酸化水素を生成させ感度増加を図ることもできる。例えばヘモグロビンＡ１ｃから遊離した糖化ペプチド又は糖化アミノ酸とフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが作用した際に生成するグルコソンに糖酸化分解酵素を含ませても良い（特開２０００−３３３６９６号公報）。この場合の糖酸化分解酵素としては、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ピラノースオキシダーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酸化酵素であることが好ましい。このほか、赤血球からヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤が使用できることは前述した。さらにまた、血液中の夾雑成分を処理する酵素、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フェロシアン化カリウム等の塩、反応調整剤、還元性物質の影響回避のためのテトラゾリウム塩、防腐剤としての抗生物質、アジ化ナトリウム等も添加できる。
【００４９】
本発明の基質測定用試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態やゲル状態でも提供できる。また、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の他、不溶性担体への塗布、含浸などの形態で提供できる。不溶性担体としては、例えば、ラテックス、ガラス、コロイドなどの粒子・球状担体、半導体やガラスなどの平板状担体、紙やニトロセルロースなどの膜状担体、繊維状担体が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１〜６］尿酸の測定
（１）試料の調製
血清９容に対して生理食塩液又はヒトヘモグロビン液１容を加えて、ヘモグロビン濃度が０、１００、３００、及び５００ｍｇ／ｄＬのヘモグロビン含有試料を調製した。
【００５２】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例１；０．５％ エマール２０Ｃ（花王社製）
実施例２；０．５％ ハイテノールＮＦ１３（第一工業製薬社製）
実施例３；０．０５％ ハイテノールＮＦ１５（第一工業製薬社製）
実施例４；０．５％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
実施例５；０．０５％ ペレックスＣＳ（花王社製）
実施例６；０．１％ ペレックスＳＳ−Ｈ（花王社製）
比較例１；陰イオン系界面活性剤を含まない
比較例２；０．０５％ ラテムルＰＳ＋０．０５％ ペレックスＮＢＬ
比較例３；０．１％ ラテムルＰＳ＋０．１％ ペレックスＮＢＬ
５００μｍｏｌ／Ｌ ＴＯＯＳ（同仁化学社製）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（陰イオン系界面活性剤を組み合わせてヘモグロビンの干渉を回避する従来公知（特開平８−８９２８８）の方法に記載されたアルキルスルホン酸ナトリウム塩（商品名ラテムルＰＳ：花王社製）及びアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（商品名ペレックスＮＢ−Ｌ：花王社製）の組み合わせを比較例２、３とした。）
＜第二試薬＞
２単位／ｍＬ ウリカーゼ（東洋紡社製）
１０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
１ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００５３】
各試料７μＬに第一試薬２６０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度Ｉ）。次いで第二試薬１３０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩ）。吸光度の測定は主波長５４６ｎｍ（副波長８００ｎｍ）で行い、試料の代わりに生理食塩水を用いて同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照とした。各試料の吸光度Ｉ及び吸光度ＩＩから式Ａを用いて各試料の吸光度変化量を算出し、濃度既知の尿酸溶液（２０ｍｇ／ｄＬ）を試料として上記と同様に操作した場合の吸光度変化量と比較し尿酸濃度を算出した。
式Ａ：試料の吸光度＝吸光度ＩＩ−（吸光度Ｉ×（７＋２６０）／（７＋２６０＋１３０））
得られた尿酸の測定値について、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの場合の測定値を１００％として比較した。結果を表１に示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から明らかなように、従来公知の陰イオン系界面活性剤の組み合せ（比較例２及び３）では、界面活性剤無添加の比較例１に比べて、むしろヘモグロビンの干渉が増大した。これに対し、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には（実施例１〜６）、何れも界面活性剤無添加の比較例１に比べてヘモグロビンの干渉が軽減されていた。これより、本発明の基質の測定方法は、従来公知の方法が有効でない場合でも、有効であることがわかった。
【００５６】
［実施例７］フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
５４２ｎｍにおける吸光度が５ ＯＤとなるように調製したヘモグロビン−生理食塩水希釈液を用い、フルクトシルバリン（ｆＶ）濃度が５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌのヘモグロビン含有試料を調製した。コントロールとして、ヘモグロビン−生理食塩水希釈液に代えて生理食塩水を用いた。ｆＶはバイオクエスト社製を使用した。
【００５７】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用い、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例７；０．２％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
比較例４；陰イオン系界面活性剤を含まない
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
１５単位／ｍＬ フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００５８】
各試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度Ｉ）。次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩ）。吸光度の測定及び試料の吸光度変化量の算出は、実施例１〜６に準じた。結果を表２に示した。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には、ヘモグロビンの干渉が軽減されていた。
【００６１】
［実施例８］フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
実施例７と同様にしてヘモグロビン含有試料及びコントロールを調製した。
【００６２】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、第二試薬を以下とする以外は、実施例７と同様の操作により各試料の測定を行った。
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には、ヘモグロビンの干渉が軽減されていた。
【００６５】
［実施例９〜１３］ヘモグロビンＡ１ｃの測定
（１）試料の調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として含む採血管を用いて被検者１０人から常法により採血した全血を、冷室に一晩静置して赤血球を沈降させた。沈降した各赤血球層より１０μＬを分取し、これに０．１％ トリトンＸ−１００水溶液 ３００μＬを添加混合し、血球溶血試料を調製した。
【００６６】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例９；０．５％ プライサーフＡ２１２Ｅ（第一工業製薬社製）
実施例１０；０．５％ プライサーフＡ２１５Ｃ（第一工業製薬社製）
実施例１１；０．２％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
実施例１２；０．５％ ニッコールＳＢＬ−４Ｎ（日本油脂社製）
実施例１３；３．０％ エマールＮＣ３５（花王社製）
比較例６；陰イオン系界面活性剤を含まない
１単位／ｍＬ プロテイナーゼＫ
０．０２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
７５００単位／ｍＬトヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）＊
３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）
＊トヨチームＮＥＰは、１０万単位／ｍＬの濃厚液を５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対し、４℃で４時間透析した後使用した。
【００６７】
各試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩＩ）。次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＶ）。吸光度の測定は波長６００ｎｍで行い、試料の代わりに生理食塩水を用い同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照とした。
各々の試料の吸光度ＩＩＩ及び吸光度ＩＶから、式Ｂを用いて各試料中のフルクトシルペプチド量に基づく吸光度変化量（吸光度Ｖ）を算出した。
式Ｂ：吸光度Ｖ＝吸光度ＩＶ−（吸光度ＩＩＩ×（２０＋２４０）／（２０＋２４０＋８０））
上記の吸光度ＩＩＩは、試料中の総ヘモグロビン濃度に比例するので、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）既知の血球溶血液（ヘモグロビンＡ１ｃ値として８．６％）を上記と同様に操作した場合の吸光度ＩＩＩ及びＶと比較し、各試料のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を算出した。
実施例９〜１３及び比較例６により求めたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を市販キット「ラピディアＡ１ｃ」（富士レビオ社製）により測定した各試料のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）（参照例）とそれぞれ比較した。結果を表４に示した。
【００６８】
【表４】
【００６９】
表４から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を含まない比較例６では、本来起こりえない負の値となってしまう場合があり、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の測定が全くできていなかった。これに対し本発明の基質の測定方法によって得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、参照例の結果と良好な相関性を示した。本発明の基質の測定方法により、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの干渉を回避して試料中のヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンを測定できることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンによる測定系への干渉を軽減し、試料中の基質を精度よく測定する方法及びその測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの生体試料中に存在する特定成分の測定は、その存在量の変動と疾病との関連が解明されるに従い、疾患の診断、病態の解明、治療効果の判断などを行う上で必須なものとなっている。現在、生体試料（例えば血清）中の特定成分の測定方法としては、目的とする特定成分もしくは当該特定成分由来の成分（以下、総称して「基質」ということがある）に特異的に反応する酵素を用いて酵素反応を行い、その結果生じる生成物を測定することにより定量する酵素法が一般的である。これら酵素法のなかでも、オキシダーゼのような過酸化水素生成酵素（以下、「オキシダーゼ酵素」ということがある）を基質に作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色定量する方法が広く普及している。
【０００３】
前記オキシダーゼ酵素を利用する基質の測定方法における基質としては、例えば、グルコース、コレステロール、中性脂肪、リン脂質、遊離脂肪酸、尿酸、クレアチニン、シアル酸、ポリアミン、糖化ヘモグロビンなどを挙げることができ、臨床検査の領域で実際に測定されている。
【０００４】
しかしながら、当該測定方法は、オキシダーゼ酵素による酸化反応を基礎原理として成り立っているため、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等の生体内還元物質による干渉を受けやすく、測定値に負の誤差を生じるという問題がある。また、ビリルビンやヘモグロビンは、それ自身が可視領域に吸収を有するため、比色定量時の測定波長と重なり誤差の原因となることや、ビリルビンやヘモグロビン自身の吸光が外部からの光あるいは測定試薬中の成分によって経時的に変化し測定結果に影響を与えることも知られている。前述のほか、脂質等による濁りの干渉を受けやすいことも知られている。
【０００５】
上記した物質のうち、ヘモグロビンの生体試料（血清、血漿、尿、唾液、髄液等）への混入は、通常、極微量であるが、溶血をともなう疾患などの場合のほかに、採血など測定用試料の採取条件、血液試料の調製、保存条件によっては二次的に試料中に漏出することがある。また、全血や血球、或いはこれらを処理して得た溶血液を試料とする場合には、自ずとヘモグロビンが混入する。従って、オキシダーゼ酵素を利用する基質の測定方法においてヘモグロビンの干渉を軽減させることは重要な課題となっている。
【０００６】
試料中の基質をオキシダーゼ酵素を用いて定量する際のヘモグロビンの干渉を軽減する方法としては、ヘモグロビン自身の吸収波長を避けた特定波長で測定する方法（例えば、特許文献１参照）、陽イオン系又は両性界面活性剤を用いる方法（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【０００７】
しかしながら、ヘモグロビン自身の吸収波長を避けて特定の検出波長で測定する方法では、比色定量時の検出波長が限定されるとともに、測定装置も限定される。また、陽イオン系又は両性界面活性剤を用いる方法では、試料と混和した際に濁りを生じたり、酵素活性に影響を与える場合がある。
【０００８】
上記の他に、２種類の陰イオン系界面活性剤を組み合わせて使用する方法も知られている（特許文献３参照）が、この方法では、陰イオン系界面活性剤による酵素蛋白質の変性を回避するために、特定量のアルキルスルホン酸塩及びアルキルナフタレンスルホン酸塩を同時に使用する必要があった。
【特許文献１】特開平９−１１９９３２号公報
【特許文献２】特開平３−１０６９６号公報
【特許文献３】特開平８−８９２８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンの測定系への干渉を軽減して種々の自動分析装置に適用できる簡便で効率の良い、試料中の基質を測定する方法及びその測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる実情に鑑み、酵素反応を利用して試料中の基質を測定する方法において、試料中に共存するヘモグロビンの測定系への干渉を軽減する方法について鋭意検討した結果、試料を特定の陰イオン系界面活性剤で処理することにより測定系へのヘモグロビンの干渉を軽減できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、基質に対応するオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより試料中の基質を測定する方法において、ヘモグロビン含有試料をポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤で処理することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法を提供するものである。
【００１２】
本発明はまた、（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、並びに（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を含むヘモグロビン含有試料中の基質測定用試薬を提供するものである。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも、（１）界面活性剤、（２）糖化蛋白質に作用してフルクトシルペプチドを生成する蛋白質分解酵素及び（３）フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素を含むことを特徴とする糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法を提供するものである。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも界面活性剤で前処理されたヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン測定を行い、更にヘモグロビン測定用反応液にフルクトシルバリルヒスチジンを生成する蛋白質分解酵素を作用させ、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定を行うことを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法を提供するものである。
【００１５】
本発明はまた、血球を含む試料と界面活性剤を含む反応液を混合して血球からヘモグロビンを溶出させる工程、本反応液を希釈して光学的にヘモグロビンの濃度を求める工程、ヘモグロビンに蛋白質分解酵素を作用させて少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産する工程、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンにこれを基質として過酸化水素を産する酵素を作用させる工程、過酸化水素とパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を作用させる工程、呈色化合物の生成による吸光度変化を測定しヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求める工程、並びにヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度からヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を求める工程からなるヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法を提供するものである。
【００１６】
本発明はまた、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定における試料の前処理方法を提供するものである。
【００１７】
本発明はまた、血球からヘモグロビンを溶出させる工程、ヘモグロビンの濃度を求める工程からなるヘモグロビン濃度測定において、少なくともポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度測定方法を提供するものである。
【００１８】
本発明は更に、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する目的で、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできることを特徴とする、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の基質の測定方法によれば、試料中に共存するヘモグロビンの干渉を軽減して、基質を精度よく測定することができる。また、本発明の基質の測定方法は、簡便な操作で測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の基質の測定方法は、試料中に共存するヘモグロビンの干渉を軽減する目的で、試料を特定の陰イオン系界面活性剤で処理する以外は、公知の酵素法に準じて実施することができる。
【００２１】
本発明が適用可能な試料としては、ヘモグロビンを含有する試料であれば特に制限はない。生体試料としては、全血、血球、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等が挙げられる。このうち、全血、血球、血清又は血漿が好ましい。これらの試料は、そのまま測定に供することはもちろん、ろ過や透析処理の後に測定に供してもよく、また必要であれば、試料（基質）を濃縮、抽出、希釈等してもよい。
【００２２】
前記した希釈は、水又は緩衝液で行うことができる。この場合の緩衝液の種類、濃度に特に制限はなく、リン酸、フタル酸、クエン酸、トリス、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、酢酸、グッド（ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＤＡなど）の緩衝液等を０．００００１〜２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌの濃度で使用することができる。
【００２３】
本発明の基質の測定方法に使用できる特定の陰イオン系界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤であり、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類又はアルキルスルホコハク酸類であり、特に好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩又はアルキルスルホコハク酸類であり、最も好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸である。これら特定の陰イオン系界面活性剤は、市販品として入手可能である。
【００２４】
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類としては、例えば、ニッコールＳＢＬ−４Ｎ、ニッコールＳＢＬ−２Ｔ−３６（以上、日本油脂社製）、エマール２０Ｔ、エマール３２７、エマール２０Ｃ（以上、花王社製）、ハイテノール２２５Ｌ、ハイテノール３２５Ｄ、ハイテノールＮＦ１３、ハイテノールＮＦ１５（以上、第一工業製薬社製）、サンノールＬＭＴ−１４３０、サンノールＤＭ１４７０（以上、ライオン社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類としては、例えば、ニッコールＳＮＰ−４Ｎ（日本油脂社製）、エマールＮＣ３５（花王社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類は、リン酸モノエステル、リン酸ジエステル又はその混合物でもよく、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類としては、例えば、プライサーフＡ２０８Ｂ、プライサーフＡ２１９Ｂ、プライサーフＡ２０８Ｓ、プライサーフＡ２１２Ｃ、プライサーフＡ２１２Ｅ、プライサーフＡ２１５Ｃ（以上、第一工業製薬社製）などが挙げられる。これらのポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸のうちで、プライサーフＡ２０８Ｂが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類としては、例えば、ネオハイテノールＳ−７０、ネオハイテノールＬ−３０、ネオハイテノールＬＭ−２０（以上、第一工業製薬社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類としては、例えば、カオーアキポＲＬＭ−１００ＮＶ（花王社製）、ネオハイテノールＥＣＬ−３０（第一工業製薬社製）、エヌジェコブ２ＰＳ３０、エヌジェコブ２ＰＳ４５（以上、新日本理化社製）などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸類としては、例えば、リオノールＯＡＩ−Ｎ、リオノールＯＢＩ（以上、ライオン社製）などが挙げられる。
【００２５】
ラウリル硫酸トリエタノールアミンとしては、例えば、エマールＴＤ（花王社製）が挙げられる。アルキルスルホコハク酸類としては、例えば、ペレックスＣＳ（花王社製）が挙げられる。アルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類としては、例えば、ペレックスＳＳ−Ｈ（花王社製）が挙げられる。
【００２６】
ヘモグロビン含有試料の処理は、当該特定の陰イオン系界面活性剤と試料を混合することにより行うことができる。特定の陰イオン系界面活性剤の使用量は、前記した全血、血球、血清などの試料と混合した後の濃度として、０．０００１〜１０％、好ましくは０．００１〜３％である。ヘモグロビン含有試料の処理の時間、処理の温度は特に制限されず、例えば、自動分析装置へ適用する場合、処理時間５分、処理温度３７℃などが好ましい。また自動分析装置に適用する前に別途処理をすることもできる。これら処理の条件はいずれも実験によって適宜選択することができる。同様に特定の陰イオン系界面活性剤により試料を処理する際のｐＨや添加物等も、酵素反応を利用して基質を測定する際の障害とならない範囲で制限がない。
【００２７】
本発明の基質の測定方法で測定可能な基質は、オキシダーゼを用いる酵素法で測定できるものであれば制限されない。従って、本発明における「基質」には、それ自体がオキシダーゼの基質になりうる物質である場合、及び酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合（前述した特定成分由来の成分に相当）が含まれる。これらの基質として、グルコース、マンノース、ガラクトース等の糖類；コレステロ−ル、中性脂肪、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質類；糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン等の糖化蛋白質類；尿酸、尿素、クレアチニン、シアル酸、ポリアミンなどを例示することができる。
【００２８】
これらのうち、グルコース、尿酸などが、それ自体がオキシダーゼの基質となりうる物質である場合に該当し、血清中のエステル型コレステロールを加水分解酵素で処理して得られるコレステロールや血清中の糖化蛋白質を蛋白質分解酵素で処理して得られる糖化ペプチド及び糖化アミノ酸などが、酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合に該当する。
【００２９】
酵素反応や何らかの処理により生成した生成物がオキシダーゼの基質になりうる場合のうち、糖化蛋白質を蛋白質分解酵素で処理してオキシダーゼの基質となる糖化ペプチド及び糖化アミノ酸を得ようとする場合を例にさらに説明する。
【００３０】
この場合の蛋白質分解酵素は、蛋白質分解活性、ペプチド分解活性を有していれば由来は微生物由来、動物由来、植物由来などの何れでもよく特に制限されない。短時間で効率よく目的とする糖化蛋白質（例えばヘモグロビンＡ１ｃ）から糖化ペプチド又は糖化アミノ酸、好ましくはフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸、特に好ましくはフルクトシルバリルヒスチジン又はフルクトシルバリンを遊離するものが使用される。具体的には、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、アミノペプチダーゼなど研究用試薬として広く市販されているものや、ニュートラルプロテイナーゼ、トヨチームＮＥＰ（以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、モルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（以上、新日本化学工業社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＣ、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＳ１０、プロチンＮＹ１０、プロチンＮＬ１０、プロチンＮＣ２５（以上、大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）、プロナーゼＥ（ロシュ社製）、ウマミザイム、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（以上、アマノエンザイム社製）など工業用として市販されているものが挙げられる。これら蛋白質分解酵素は、目的とする糖化蛋白質、フルクトシルペプチドと作用させ、作用の前後の試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析、比較することにより効果を確認できる。上記蛋白質分解酵素は、単独で用いても、また二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのなかで、バチルス属、アスペルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子により産生されるもの、又は、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしくは塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。
【００３１】
蛋白質分解酵素の濃度は、目的とする基質を効率よく遊離できる濃度であれば特に制限はない。使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。蛋白質分解酵素で処理するときのｐＨは、特に調整しなくてもよいが、使用する酵素の作用に好適なｐＨとなるように、適当なｐＨ調整剤、例えば緩衝液によってｐＨ３〜１１に調整してもよい。処理温度は、１０〜４０℃が好ましい。
【００３２】
本発明の基質の測定方法において使用できるオキシダーゼとしては、測定すべき基質を酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であり、公知のオキシダーゼを使用できる。例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開２００３−７９３８６号公報及び国際公開第９７／２００３９号パンフレット）、ケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９号公報）、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開２００１−９５５９８号公報及び特開２００３−２３５５８５号公報）などを挙げることができる。これらの酵素は、微生物由来、動物由来、植物由来等のいずれでもよく、また遺伝子操作により作られたものでもよい。更に、化学修飾の有無も問わない。これらの酵素は、溶液状態でも乾燥状態でもよく、不溶性担体に保持又は結合されていてもよく、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３３】
これらの酵素の使用量は、酵素の種類によっても異なるが、使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができ、特に制限はない。好ましくは０．００１〜１０００単位／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜１０００単位／ｍＬである。作用させるときのｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨを考慮し、緩衝液を用いて調整する。作用温度は、例えば、１０〜４０℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【００３４】
上記オキシダーゼは、必要に応じて、他の酵素、補酵素、被酸化性呈色試薬等と組み合わせて使用することができる。他の酵素としては、パーオキシダーゼ、ジアホラーゼ又はフルクトシルバリンを基質としないアミノ酸代謝酵素などが挙げられる。また、ヘモグロビン以外の生体内干渉物質を処理する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等の酵素も使用できる。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸（ＮＡＤＰＨ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等が挙げられる。
【００３５】
被酸化性呈色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば如何なるものでもよい。例えば、４−アミノアンチピリンと、フェノール系、ナフトール系又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組み合わせなどが挙げられる。４−アミノアンチピリンと組み合わせることができるフェノール系化合物としては、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールなどが挙げられ、アニリン系化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）などが挙げられる。その他、Ｎ−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン・ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミンなどが挙げられる。
【００３６】
本発明の基質の測定方法では、試料を前記陰イオン系界面活性剤で処理して試料中のヘモグロビンの干渉を軽減する工程とオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を測定する工程とを別々に行って基質を測定することもできるし、これらの工程を連続的に一段階で行って基質を測定することもできる。反応温度は、これら２つの工程で同一でも異なってもよく、本発明の基質測定用試薬が溶液状態にある温度、例えば、１０〜４０℃が好ましい。
【００３７】
本発明の基質の測定方法は、オキシダーゼ反応により基質を測定する際のヘモグロビンの干渉を軽減する一方で、本発明に係る陰イオン系界面活性剤で試料を処理した段階でヘモグロビンの有する吸収波長域における吸光度を測定すれば試料中のヘモグロビンを測定することができる。これにより糖化ヘモグロビン（好ましくはヘモグロビンＡ１ｃ）を測定することができるので、本発明の基質の測定方法によりヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合について説明する。
【００３８】
ヘモグロビンＡ１ｃは、赤血球に含有されるヘモグロビンが非酵素的に糖化されて形成されたものであり、過去一定期間の平均血糖値を反映することから臨床検査における指標として重要視されている。ヘモグロビンＡ１ｃは総ヘモグロビン存在量に対する比率（％）で表示されることから、その測定には、（ｉ）赤血球を溶血させてヘモグロビンを赤血球外に放出させ、測定可能な状態にする工程、（ｉｉ）ヘモグロビンの存在量を測定する工程、（ｉｉｉ）ヘモグロビンＡ１ｃの存在量を測定する工程（酵素法の場合、ヘモグロビンＡ１ｃから蛋白質分解酵素により特異的な糖化ペプチドあるいは糖化アミノ酸を遊離させる工程と当該遊離した糖化ペプチド又は糖化アミノ酸を特異的オキシダーゼを使用して測定する工程が含まれる）、（ｉｖ）ヘモグロビンＡ１ｃの存在量を総ヘモグロビンの存在量で除し比率を求める工程（演算工程）、が必要である。なお、ここで述べるように、本明細書において「基質の測定」の語は、試料中の基質の存在量（例えば濃度）の測定のほか、特定の基準物質に占める存在割合（例えば濃度比）の測定も含む。
【００３９】
本発明に係る陰イオン系界面活性剤は、ヘモグロビンのメト化処理能も有しているため、ヘモグロビンの吸収波長域の吸光度を測定して（ｉｉ）の工程を問題なく実施できる。
【００４０】
（ｉ）の工程には、従来公知の各種界面活性剤（例えば、非イオン系界面活性剤であるトリトンＸ−１００など）が使用できるが、本発明に係る陰イオン系界面活性剤、特にポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、或いはラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類、アルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる陰イオン系界面活性剤は、（ｉ）の工程においても使用可能であり、単独もしくは従来公知の各種界面活性剤と併用しても差し支えない。また（ｉ）の工程で単独もしくは本発明に係る陰イオン系界面活性剤と併用可能な非イオン系界面活性剤としては、従来公知のもののほかに、ポリオキシエチレン誘導体であるエマルゲン類（花王社製、エマルゲン７０９、エマルゲン１０８、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６など）、ニッコール類（ニッコーケミカルズ社製、ニッコールＢＣ２０ＴＸ、ニッコールＯＰ−１０、ニッコールＢＴ９など）、リポノックス類（ライオン社製、リポノックスＮＣ８０、リポノックスＯＣ１００など）レオコール類（ライオン社製、レオコールＴＤ９０、レオコールＳＣ１２０など）ノイゲン類（第一工業製薬社製、ノイゲンＥＡ１２０、ノイゲンＥＴ１４７など）、エパン類（第一工業製薬社製、エパン４８５、エパンＵ１０３など）、プルロニック類（旭電化社製、プルロニックＦ、プルロニックＴＲ７０４など）、アデカトール類（旭電化社製、アデカトールＳＯ１２０など）が使用できる。
【００４１】
（ｉｉｉ）の工程は、ヘモグロビンＡ１ｃに由来する糖化ペプチド又は糖化アミノ酸をヘモグロビンＡ１ｃから蛋白質分解酵素により遊離させ、さらにフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを使用して実施できる。（ｉｉｉ）の工程について前述しているが、さらに詳細に説明する。ヘモグロビンＡ１ｃの測定では、ヘモグロビンβ−サブユニットのアミノ末端のバリンが糖化されたフルクトシルバリンやフルクトシルバリルヒスチジンと、ε−フルクトシルリジンに対するオキシダーゼ酵素の反応性の違いが特異性を決定するが、ヘモグロビン分子中には４４個のリジン残基が存在しており、ε−フルクトシルリジンに対する反応性が低くとも、その影響を無視できない。またヘモグロビンのα鎖Ｎ末端のバリンも糖化によりフルクトシルバリンとなるが、バリンと隣接して結合しているアミノ酸はヒスチジンではないのでフルクトシルバリルヒスチジンは生成しない。従って酵素法によるヘモグロビンＡ１ｃ測定の特異性を確保するためには、フルクトシルリジンの測り込みを出来る限り排除することはもちろん、フルクトシルバリンだけを測定するよりもフルクトシルバリルヒスチジルペプチドを測定した方が有利となる。これより、蛋白質分解酵素がフルクトシルバリルヒスチジルペプチド、好ましくはフルクトシルバリルヒスチジンを遊離させるもので、フルクトシルペプチドオキシダーゼがフルクトシルバリルヒスチジンに作用するものが、特異性向上の観点から最も好ましい。
【００４２】
上記のような蛋白質分解酵素として、前述したバチルス属、アスペルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子組み換えにより産生されるものが好適である。バチルス属由来の酵素としては、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＮＣ２５（大和化成社製）、トヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）など、アスペルギルス属由来の酵素としては、モルシン（キッコーマン社製）、ストレプトマシシス属由来の酵素としては、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＡＦ、アクチナーゼＥ（科研製薬）、プロテアーゼＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）などが挙げられる。これらは単独で使用できるほか、トヨチームＮＥＰなどはプロテイナーゼＫと混合して併用することもできる。これら酵素は、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしくは塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。使用濃度や使用条件は前述したとおりである。
【００４３】
上記のようなフルクトシルペプチドオキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属菌の産生するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを改変した酵素（特開２００１−９５５９８号公報）、糸状菌由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開２００３−２３５５８５号公報）などが挙げられる。ＦＰＯＸ−ＣＥ又はＦＰＯＸ−ＥＥ（ともにキッコーマン社製）が特に好適である。
【００４４】
（ｉ）の工程から（ｉｖ）の工程までを順次、実施しても良いが、複数の工程を同時に実施することもできる。例えば、トリトンＸ−１００などの溶血を目的とした界面活性剤、プライサーフＡ２０８Ｂなどの本発明に係る陰イオン系界面活性剤をともに含む試薬で全血あるいは血球を処理すれば（ｉ）、（ｉｉ）の工程を同時に実施することができ、さらにプロテイナーゼＫやアクチナーゼＡＳなどの蛋白質分解酵素を共存させれば、（ｉｉｉ）の工程の一部も同時に実施することができる。
【００４５】
またさらに、本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法によれば、日立７１５０形自動分析装置など臨床検査（特に生化学検査）の領域で汎用される自動分析装置（以下「生化学自動分析装置」ということがある）を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比（％）（以下「ヘモグロビンＡ１ｃ（％）」と言うことがある）を測定する場合において、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定用試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にすることができる。これら（１）〜（４）を特徴とする、生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を測定する方法も提供される。
【００４６】
本発明の試薬はヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する際に、１つの反応容器を用いてヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定しても、また生化学自動分析装置を用いて測定する際に構成試薬の連続した添加を行ういわゆる１チャンネル法で使用してもよいが、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の試薬使用量など操作条件を個別に設定するのが好ましい。本発明の試薬はヘモグロビン濃度測定用試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用でき、試料も共用できる。測定条件のうち、ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできる。
【００４７】
本発明の基質測定用試薬は、（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して、又は酵素反応により生成した基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、及び（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬、を含む。
【００４８】
更に、前記（Ｂ）記載のオキシダーゼを作用させた結果生じる生成物からさらに過酸化水素を生成させ感度増加を図ることもできる。例えばヘモグロビンＡ１ｃから遊離した糖化ペプチド又は糖化アミノ酸とフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが作用した際に生成するグルコソンに糖酸化分解酵素を含ませても良い（特開２０００−３３３６９６号公報）。この場合の糖酸化分解酵素としては、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ピラノースオキシダーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酸化酵素であることが好ましい。このほか、赤血球からヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤が使用できることは前述した。さらにまた、血液中の夾雑成分を処理する酵素、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フェロシアン化カリウム等の塩、反応調整剤、還元性物質の影響回避のためのテトラゾリウム塩、防腐剤としての抗生物質、アジ化ナトリウム等も添加できる。
【００４９】
本発明の基質測定用試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態やゲル状態でも提供できる。また、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の他、不溶性担体への塗布、含浸などの形態で提供できる。不溶性担体としては、例えば、ラテックス、ガラス、コロイドなどの粒子・球状担体、半導体やガラスなどの平板状担体、紙やニトロセルロースなどの膜状担体、繊維状担体が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１〜６］尿酸の測定
（１）試料の調製
血清９容に対して生理食塩液又はヒトヘモグロビン液１容を加えて、ヘモグロビン濃度が０、１００、３００、及び５００ｍｇ／ｄＬのヘモグロビン含有試料を調製した。
【００５２】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例１；０．５％ エマール２０Ｃ（花王社製）
実施例２；０．５％ ハイテノールＮＦ１３（第一工業製薬社製）
実施例３；０．０５％ ハイテノールＮＦ１５（第一工業製薬社製）
実施例４；０．５％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
実施例５；０．０５％ ペレックスＣＳ（花王社製）
実施例６；０．１％ ペレックスＳＳ−Ｈ（花王社製）
比較例１；陰イオン系界面活性剤を含まない
比較例２；０．０５％ ラテムルＰＳ＋０．０５％ ペレックスＮＢＬ
比較例３；０．１％ ラテムルＰＳ＋０．１％ ペレックスＮＢＬ
５００μｍｏｌ／Ｌ ＴＯＯＳ（同仁化学社製）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（陰イオン系界面活性剤を組み合わせてヘモグロビンの干渉を回避する従来公知（特開平８−８９２８８）の方法に記載されたアルキルスルホン酸ナトリウム塩（商品名ラテムルＰＳ：花王社製）及びアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（商品名ペレックスＮＢ−Ｌ：花王社製）の組み合わせを比較例２、３とした。）
＜第二試薬＞
２単位／ｍＬ ウリカーゼ（東洋紡社製）
１０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
１ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００５３】
各試料７μＬに第一試薬２６０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度Ｉ）。次いで第二試薬１３０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩ）。吸光度の測定は主波長５４６ｎｍ（副波長８００ｎｍ）で行い、試料の代わりに生理食塩水を用いて同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照とした。各試料の吸光度Ｉ及び吸光度ＩＩから式Ａを用いて各試料の吸光度変化量を算出し、濃度既知の尿酸溶液（２０ｍｇ／ｄＬ）を試料として上記と同様に操作した場合の吸光度変化量と比較し尿酸濃度を算出した。
式Ａ：試料の吸光度＝吸光度ＩＩ−（吸光度Ｉ×（７＋２６０）／（７＋２６０＋１３０））
得られた尿酸の測定値について、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの場合の測定値を１００％として比較した。結果を表１に示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から明らかなように、従来公知の陰イオン系界面活性剤の組み合せ（比較例２及び３）では、界面活性剤無添加の比較例１に比べて、むしろヘモグロビンの干渉が増大した。これに対し、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には（実施例１〜６）、何れも界面活性剤無添加の比較例１に比べてヘモグロビンの干渉が軽減されていた。これより、本発明の基質の測定方法は、従来公知の方法が有効でない場合でも、有効であることがわかった。
【００５６】
［実施例７］フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
５４２ｎｍにおける吸光度が５ ＯＤとなるように調製したヘモグロビン−生理食塩水希釈液を用い、フルクトシルバリン（ｆＶ）濃度が５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌのヘモグロビン含有試料を調製した。コントロールとして、ヘモグロビン−生理食塩水希釈液に代えて生理食塩水を用いた。ｆＶはバイオクエスト社製を使用した。
【００５７】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用い、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例７；０．２％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
比較例４；陰イオン系界面活性剤を含まない
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
１５単位／ｍＬ フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００５８】
各試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度Ｉ）。次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩ）。吸光度の測定及び試料の吸光度変化量の算出は、実施例１〜６に準じた。結果を表２に示した。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には、ヘモグロビンの干渉が軽減されていた。
【００６１】
［実施例８］フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
実施例７と同様にしてヘモグロビン含有試料及びコントロールを調製した。
【００６２】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、第二試薬を以下とする以外は、実施例７と同様の操作により各試料の測定を行った。
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を使用した場合には、ヘモグロビンの干渉が軽減されていた。
【００６５】
［実施例９〜１３］ヘモグロビンＡ１ｃの測定
（１）試料の調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として含む採血管を用いて被検者１０人から常法により採血した全血を、冷室に一晩静置して赤血球を沈降させた。沈降した各赤血球層より１０μＬを分取し、これに０．１％ トリトンＸ−１００水溶液 ３００μＬを添加混合し、血球溶血試料を調製した。
【００６６】
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
陰イオン系界面活性剤
実施例９；０．５％ プライサーフＡ２１２Ｅ（第一工業製薬社製）
実施例１０；０．５％ プライサーフＡ２１５Ｃ（第一工業製薬社製）
実施例１１；０．２％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
実施例１２；０．５％ ニッコールＳＢＬ−４Ｎ（日本油脂社製）
実施例１３；３．０％ エマールＮＣ３５（花王社製）
比較例６；陰イオン系界面活性剤を含まない
１単位／ｍＬ プロテイナーゼＫ
０．０２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
７５００単位／ｍＬトヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）＊
３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）
＊トヨチームＮＥＰは、１０万単位／ｍＬの濃厚液を５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対し、４℃で４時間透析した後使用した。
【００６７】
各試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩＩ）。次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＶ）。吸光度の測定は波長６００ｎｍで行い、試料の代わりに生理食塩水を用い同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照とした。
各々の試料の吸光度ＩＩＩ及び吸光度ＩＶから、式Ｂを用いて各試料中のフルクトシルペプチド量に基づく吸光度変化量（吸光度Ｖ）を算出した。
式Ｂ：吸光度Ｖ＝吸光度ＩＶ−（吸光度ＩＩＩ×（２０＋２４０）／（２０＋２４０＋８０））
上記の吸光度ＩＩＩは、試料中の総ヘモグロビン濃度に比例するので、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）既知の血球溶血液（ヘモグロビンＡ１ｃ値として８．６％）を上記と同様に操作した場合の吸光度ＩＩＩ及びＶと比較し、各試料のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を算出した。
実施例９〜１３及び比較例６により求めたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を市販キット「ラピディアＡ１ｃ」（富士レビオ社製）により測定した各試料のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）（参照例）とそれぞれ比較した。結果を表４に示した。
【００６８】
【表４】
【００６９】
表４から明らかなように、本発明に係る陰イオン系界面活性剤を含まない比較例６では、本来起こりえない負の値となってしまう場合があり、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の測定が全くできていなかった。これに対し本発明の基質の測定方法によって得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、参照例の結果と良好な相関性を示した。本発明の基質の測定方法により、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンの干渉を回避して試料中のヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンを測定できることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質に対応するオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより試料中の基質を測定する方法において、ヘモグロビン含有試料をポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤で処理することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法。
【請求項２】
上記陰イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類又はアルキルスルホコハク酸類である請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
試料中の基質が尿酸であって、オキシダーゼがウリカーゼである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
試料中の基質がフルクトシルアミノ酸又はフルクトシルペプチドであって、オキシダーゼがフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ又はフルクトシルペプチドオキシダーゼである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項５】
（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、並びに（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を含むヘモグロビン含有試料中の基質測定用試薬。
【請求項６】
少なくとも、（１）界面活性剤、（２）糖化蛋白質に作用してフルクトシルペプチドを生成する蛋白質分解酵素及び（３）フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素を含むことを特徴とする糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法。
【請求項７】
界面活性剤が非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤であって、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれることを特徴とする請求項６記載の糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法。
【請求項８】
リン酸エステルが、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸のモノエステル、ジエステル又はそれらの混合物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
蛋白質分解酵素が糖化蛋白質又は糖化ペプチドに作用して生成するフルクトシルペプチドが、フルクトシルバリルヒスチジンである請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
蛋白質分解酵素が、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイシス属由来のもの又はこれらの遺伝子組換えにより産生されるもので、単独又は複数で糖化蛋白質に作用させた時に、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産することを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素が少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを基質とすることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃである請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも界面活性剤で前処理されたヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン測定を行い、更にヘモグロビン測定用反応液にフルクトシルバリルヒスチジンを生成する蛋白質分解酵素を作用させ、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定を行うことを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法。
【請求項１４】
血球を含む試料と界面活性剤を含む反応液を混合して血球からヘモグロビンを溶出させる工程、本反応液を希釈して光学的にヘモグロビンの濃度を求める工程、ヘモグロビンに蛋白質分解酵素を作用させて少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産する工程、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンにこれを基質として過酸化水素を産する酵素を作用させる工程、過酸化水素とパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を作用させる工程、呈色化合物の生成による吸光度変化を測定しヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求める工程、並びにヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度からヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を求める工程からなるヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法。
【請求項１５】
試料中の基質がフルクトシルバリルヒスチジン又は反応液に添加される試料由来以外の蛋白質分解酵素によりこれらを産する生体成分であって、過酸化水素を産する酵素がフルクトシルペプチドオキシダーゼである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定における試料の前処理方法。
【請求項１７】
血球からヘモグロビンを溶出させる工程、ヘモグロビンの濃度を求める工程からなるヘモグロビン濃度測定において、少なくともポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度測定方法。
【請求項１８】
生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する目的で、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできることを特徴とする生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する方法。
【請求項１】
基質に対応するオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより試料中の基質を測定する方法において、ヘモグロビン含有試料をポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤で処理することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法。
【請求項２】
上記陰イオン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類又はアルキルスルホコハク酸類である請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
試料中の基質が尿酸であって、オキシダーゼがウリカーゼである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
試料中の基質がフルクトシルアミノ酸又はフルクトシルペプチドであって、オキシダーゼがフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ又はフルクトシルペプチドオキシダーゼである請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項５】
（Ａ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸類、ポリオキシエチレンアルキルスルホコハク酸類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルスルホン酸塩類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸塩類から選ばれる陰イオン系界面活性剤、（Ｂ）基質に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、並びに（Ｃ）パーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を含むヘモグロビン含有試料中の基質測定用試薬。
【請求項６】
少なくとも、（１）界面活性剤、（２）糖化蛋白質に作用してフルクトシルペプチドを生成する蛋白質分解酵素及び（３）フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素を含むことを特徴とする糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法。
【請求項７】
界面活性剤が非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤であって、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれることを特徴とする請求項６記載の糖化蛋白質、糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸の濃度又はそれらの濃度比測定方法。
【請求項８】
リン酸エステルが、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸のモノエステル、ジエステル又はそれらの混合物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
蛋白質分解酵素が糖化蛋白質又は糖化ペプチドに作用して生成するフルクトシルペプチドが、フルクトシルバリルヒスチジンである請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
蛋白質分解酵素が、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイシス属由来のもの又はこれらの遺伝子組換えにより産生されるもので、単独又は複数で糖化蛋白質に作用させた時に、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産することを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
フルクトシルペプチドに作用して過酸化水素を産する酵素が少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを基質とすることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃである請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも界面活性剤で前処理されたヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン測定を行い、更にヘモグロビン測定用反応液にフルクトシルバリルヒスチジンを生成する蛋白質分解酵素を作用させ、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定を行うことを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法。
【請求項１４】
血球を含む試料と界面活性剤を含む反応液を混合して血球からヘモグロビンを溶出させる工程、本反応液を希釈して光学的にヘモグロビンの濃度を求める工程、ヘモグロビンに蛋白質分解酵素を作用させて少なくともフルクトシルバリルヒスチジンを産する工程、少なくともフルクトシルバリルヒスチジンにこれを基質として過酸化水素を産する酵素を作用させる工程、過酸化水素とパーオキシダーゼ及び被酸化性呈色試薬を作用させる工程、呈色化合物の生成による吸光度変化を測定しヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求める工程、並びにヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度からヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を求める工程からなるヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定方法。
【請求項１５】
試料中の基質がフルクトシルバリルヒスチジン又は反応液に添加される試料由来以外の蛋白質分解酵素によりこれらを産する生体成分であって、過酸化水素を産する酵素がフルクトシルペプチドオキシダーゼである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン系界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度比の測定における試料の前処理方法。
【請求項１７】
血球からヘモグロビンを溶出させる工程、ヘモグロビンの濃度を求める工程からなるヘモグロビン濃度測定において、少なくともポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの硫酸塩類、リン酸エステル類、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルスルホコハク酸類及びアルキルフェニルエーテルスルホン酸類から選ばれる非イオン性界面活性剤及び／又は陰イオン系界面活性剤を用いることを特徴とするヘモグロビン濃度測定方法。
【請求項１８】
生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する目的で、生化学自動分析装置の操作条件を設定する際に、（１）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の操作条件を個別に設定する、（２）ヘモグロビン濃度測定試薬をヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の構成試薬として共用できる、（３）ヘモグロビン濃度測定用とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定用の試料を共用できる、（４）ヘモグロビン濃度測定とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定の測定波長を同一にできることを特徴とする生化学自動分析装置を用いてヘモグロビンＡ１ｃ濃度比を測定する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８５８
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５６４９（Ｐ２００５−５１５６４９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７１９６
【国際出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７１９６
【国際出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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