ヘモグロビン比を測定する方法、並びに白血球を計数および識別する方法、並びに適切な媒体
本発明は、血液サンプル中のヘモグロビン比の測定のため、並びに白血球の計数および識別のための方法であって、以下の工程：血液サンプルを、シアン化イオンの不在において、少なくとも１つの四級アンモニウム塩および保存剤を含むｐＨが１０を超えない等張性または高浸透圧性の媒体に持ち込むこと；ヘモグロビンと四級アンモニウム基との間で形成された複合体を分光測定により検出すること；白血球を計数し、少なくとも３つの亜集団に識別すること；を含む方法であって、前記方法が全ての他のリガンドの不在において行われる方法に関する。本発明はまた、当該方法を実行するための媒体に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、同時に、血液サンプルの同一希釈物において、シアン化物などの何れの毒性生成物を伴うことなく、ヘモグロビンレベルを測定し、白血球（ＷＢＣ）を計数且つ識別するための方法および反応媒体に関する。
【０００２】
ヘモグロビンを測定するための従来の方法は、５４０ｎｍでの分光測定により、シアン化イオンと酸化型のヘモグロビン、メトヘモグロビンとの間で形成される発色複合体を検出することに基づいていた。分析されるべき血液サンプルは、シアン化物塩（シアン化カリウム）およびフィリシアン化物塩（フェリシアン化カリウムまたはフェリシアン化ナトリウム）を含む水性反応媒体に曝されていた。水性媒体において、赤血球（ＲＢＣ）は溶解され、ヘモグロビンは、フェリシアン化物およびシアン化物イオンによりメトヘモグロビン（ヘモグロビンとも称される）に酸化され、それらはヘムに関して強力な親和性を有し；それらはメトヘモグロビンのヘムのためのリガンドであり、シアンメトヘモグロビン複合体を形成し、その最大吸光度は５４０ｎｍである。当該ヘモグロビンは分光測定により測定される。
【０００３】
その後、ＲＢＣ溶解を促進するために、四級アンモニウム塩を低濃度で当該反応媒体に対して添加された。しかしながら、これは、フェリシアン化イオンと四級アンモニウム基との間での複合体の凝集の問題を生じた；これらの凝集は、ヘモグロビンの測光分析を障害する濁度を示す。この理由のため、フェリシアン化物塩は放棄され、その間もシアン化物塩は維持されている。
【０００４】
自動化デバイスが、血液サンプルにおけるヘモグロビン並びにＲＢＣおよびＷＢＣの数を迅速に分析するために開発されている。反応媒体もまた、同時に進化してきた；ＲＢＣおよびＷＢＣを計数するために、変更が、水性希釈剤から等張性または僅かに高浸透圧性の希釈剤にされた。これらの条件下、ＲＢＣを溶解するために四級アンモニウムの濃度を上昇することが必要になってきた。
【０００５】
これらの技術は、毒性のあるシアン化イオンを含む重要な欠点を有する。
【０００６】
もはやシアン化イオンを必要とする方法は、開発されていない。
【０００７】
Ｉ．オオシロらのClin. Biochem. 15(1) 83−88 (1982)は、血液サンプルにおけるヘモグロビンレベルを測定するために、何れのシアン化イオンも不在で、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を使用する方法を提案している。サンプルと接触されたＳＬＳは、ＲＢＣの溶血を引き起こし、鉄原子の酸化によるヘモグロビンのメトヘモグロビンへの変換を導く。その形成された安定した複合体は、吸光分光測定により検出される。ＳＬＳは、示される最低濃度でさえ、ＷＢＣを含む全ての細胞の溶解を引き起こし、それは核の状態を低下する。この方法は、強力な希釈を使用するものであり、これは、制限された計数時間での許容できる不正確で、ＷＢＣが測定されることを不可能にする。加えて、差次的な計数には利用できない。
【０００８】
文書ＵＳ５４６８６４０Ａは、血中サンプルにおけるヘモグロビンを測定するための迅速な方法を開示しており、それに従うと、前記サンプルは、１１．３〜１３．７のｐＨで、界面活性剤を含み、また、何れのシアン化イオンを含まない反応媒体と接触される。界面活性剤は、またステアリルトリアルキルアンモニウムヒドロキシドなどの強塩基であり、且つそれがその媒体において必要なｐＨを与えるか、またはそれは、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など、強塩基ではないが、強塩基、例えば、アルカリ金属ヒドロキシドなどが添加されなくてはならないかの何れかである。界面活性剤によるＲＢＣの溶血後、後者の活性および強塩基の活性が、ヘモグロビンの変性を生じ、且つ空気中の酸素へのヘモグロビンのヘムの暴露が鉄原子の酸化を生じる。ヘム第二鉄とヒドロキシドイオンとの間で形成される複合体が吸収分光測定により検出される。従来記載された方法のように、この方法は、ＷＢＣ識別を測定することを可能にするものではなく、それは、過激な条件が必然的に核の状態への前記ＷＢＣの溶解を引き起こすからである。
【０００９】
文書ＵＳ６７４０５２７Ａは、血液サンプル中のヘモグロビンレベルを測定する方法を開示し、何れのシアン化イオンをも欠き、これはまた、ＷＢＣ計数を得ることも可能にする。サンプルは、最初に希釈され、次に、０．１〜２０重量％の少なくとも四級アンモニウム塩と０．１〜１５重量％のヒドロキシルアミン塩とを含む溶解剤を含む反応媒体との接触に持ち込む。この方法は、ヘモグロビンレベルの測定とＷＢＣの計数を可能にするが、後者の識別を可能にすることはできない。
【００１０】
自動化された血液分析器における１つの溶解剤を用いてのヘモグロビンレベルの測定、ＷＢＣ数およびＷＢＣ識別は、使用される試薬の数を減少すること、分析器の流体構成を単純化することが可能になる。これらはシステムを頑強化するための、製造および操作コストを引き下げるための要因となる。
【００１１】
本発明の著者は、全ての予測に反して、１または１以上の四級アンモニウム塩の唯一の存在がＷＢＣを溶解するために十分であり、且つヘムに対する四級アンモニウム塩の結び付きによりヘモグロビン測定を安定化することを発見した。それまたはそれらは、そのため、血液サンプルにおいて、何れの他の溶解剤および何れの他のヘモグロビンヘムリガンドの不在において、ヘモグロビンレベルの測定と、白血球の計数および後者の識別とに十分である。
【００１２】
従って、本発明は、何れの毒性生成物も有さない単純な方法を提供するものであり、これは同じ血液サンプルにおいて、同時にヘモグロビンレベルの測定とＷＢＣの計数を可能にする。この方法は、完全な血液計数分野において使用される慣習的な読み取りおよび測定技術を含み、何れの毒性の化学的実体、例えば、シアン化イオンやヒドロキシルアミン塩などを含まない。
【００１３】
本発明の方法は以下の工程を含む：
血液サンプルは、ｐＨ１０を超えず、シアン化イオンを含まず、少なくとも１つの四級アンモニウム塩および少なくとも保存剤を含む等張性または高浸透圧性の媒体に提供され、
ヘモグロビンと四級アンモニウム塩との間で形成される複合体が分光測定により検出され；および
ＷＢＣが計数され、且つ少なくとも３つの亜集団に識別される；
前記方法は、前記四級アンモニウム塩以外の何れのリガンドの不在において行われる。
【００１４】
血液サンプルを含む媒体は、慣習的に１または２の工程により調製される；１の工程の調製においては、希釈および溶解媒体の構成成分と血液サンプルとが１工程において混合される；２の工程の調製においては、血液サンプルが希釈媒体に持ち込まれ、次に得られる媒体と溶解媒体とが混合される。
【００１５】
用語「等張性または高浸透圧性媒体」は、好ましくは等張性または僅かに高浸透圧性である媒体を意味することを意図し、それは、それらの識別を損なうであろうＷＢＣの何れかの過剰な収縮を防止するためのものである。
【００１６】
本発明の方法の実施するために、単数または複数の四級アンモニウム塩は、単独または組合せにおいて考慮される特徴に有利に対応する：
単数または複数の四級アンモニウム塩は、式（Ｉ）の化合物：
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、おのおの独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す；
から選択される。
【００１７】
Ｒ１は、１０〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、従って、当該塩は、単数または複数で、好ましくは、ドデシルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、パルミチルトリメチルアンモニウムおよびステアリルトリメチルアンモニウム塩から選択される。
【００１８】
Ｒ１は、また、１〜６の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、前記塩は、単数または複数で、好ましくはテトラエチルアンモニウム塩から選択される。
【００１９】
勿論、本発明に従って、前記媒体は、幾つかの四級アンモニウム塩、特に幾つかの式（Ｉ）の塩、例えば、１または１以上の式（Ｉ）の塩（ここにおいて、Ｒ１はＣ１０〜Ｃ１８鎖である）、および／または１または１以上の式（Ｉ）（ここにおいて、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６鎖である）の塩を含んでよい。
【００２０】
特に適切な塩は、単独または混合物として使用されるミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択される。
【００２１】
四級アンモニウム塩の割合は、媒体の重量に対して、２重量％〜４重量％の範囲である。
【００２２】
以前の状態の通り、媒体は、１または１以上の保存剤を含む。この薬剤またはこれらの薬剤は、前記方法のおのおのの工程を最適化することに寄与するが、最も詳細には、ＷＢＣの識別を最適化することに寄与する。この薬剤またはこれらの薬剤は、特に、静菌剤、好ましくは、ジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択される。
【００２３】
媒体は、また他の成分を含んでもよい：
安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)など、
少なくとも１つの非イオン性 界面活性剤、例えば、トリトン（Triton（登録商標））など。
【００２４】
上記の成分は、当該方法を行うために必須ではないが、それらはそれらの最適化を可能にするであろう。
【００２５】
ヘモグロビンレベルは、慣習的な分光測定技術により測定できる。ＷＢＣの計数は、それ自身また慣習的な方法により、例えば、本発明の方法に従って、インピーデンスの原理に基づく方法により行われ、ＷＢＣを少なくとも以下の３つの亜集団：リンパ球、（リンパ球以外の）単球および顆粒球：に識別することも可能にする。
【００２６】
本発明の方法の１つの変形に従うと、媒体は、少なくとも１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここにおいて、Ｒ１は１２の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）ともう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここにおいて、Ｒ１は１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含む。これらの条件下で、それ自身また慣習的である、インピーダンスのバイパラメトリック法と広角レーザー測定とを組み合わせて、少なくとも以下の４つの亜集団：リンパ球、単球、好酸性顆粒球および好中性顆粒球：に識別することも可能である。
【００２７】
また媒体は、３つまでの四級アンモニウム塩、またはそれ以上さえも含んでもよい。
【００２８】
本発明の好ましい１つの実施に従うと、血液サンプルは僅かに高浸透圧性であり、中性のｐＨで緩衝化された媒体において希釈される。１０を超えたｐＨが、ＷＢＣの部分的な溶解を引き起こし、その差次的な計数を防止する。
【００２９】
本発明はまた、ヘモグロビンレベルを測定するため、および白血球細胞を計数し、且つ識別するための媒体に関し、前記媒体は、シアン化イオンを含まず、少なくとも１つの四級アンモニウム塩および保存剤を含み、且つ前記媒体は前記塩以外の何れのリガンド薬剤も含まない。従って、本発明に従う媒体は、１または１以上の四級アンモニウム塩からなる溶解剤を含み、後者は、ヘモグロビンのヘムに対して結合する唯一のリガンド剤（単数または複数）を構成する。
【００３０】
この塩またはこれらの塩は、有利に、式（Ｉ）の化合物；
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、おのおの独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す；
から選択される。
【００３１】
この媒体は、有利に、以前記載されたものであり、且つ単独または組合せにおいて考慮され、その同じ特徴を有する。
【００３２】
好ましい媒体は、以下の四級アンモニウム塩を含む：ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド。有利には、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドの割合は、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲であり、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、およびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドの割合は１〜５ｇ／Ｌの範囲である。
【００３３】
またそれは、保存剤として、好ましくはジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択された少なくとも１つの静菌剤を含んでもよい。ジメチルウレアの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、ピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲である。
【００３４】
それはまた、安定剤として、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、好ましくはその割合は１〜１０ｇ／Ｌの範囲である。
【００３５】
本発明の対象は、以下の例において更に詳細に記載し、且つ例証する。
【００３６】
＜例１：本発明に従う媒体の組成物＞
適切な媒体は、希釈剤および溶解および反応剤を、次のように含む：
希釈剤として、以下を含む水性溶液：
有機リン酸緩衝剤、例えば、無水リン酸二ナトリウムまたはリン酸水素ナトリウムなど：
膜安定剤、例えば、硫酸クロライドまたは硫酸ナトリウムなど、
静菌剤、例えば、ジメチルウレアまたはピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムなど、
安定剤、例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ．Ｎａ２）など；
および溶解剤として、以下を含む水性溶液：
ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドの混合物、
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））、非イオン性界面活性剤として、
膜安定剤として、塩化ナトリウム、希釈剤のものと同じまたは異なってよく、および、
脱イオン水。
【００３７】
希釈剤は、中性のｐＨで３２０〜３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の浸透圧を有し、溶解剤は、ｐＨが１０．５＋／−０．４である。得られる反応媒体は、ｐＨが８に近い。
【００３８】
＜例２：「３集団」分析における方法の実施＞
血液サンプルの調製
約１６μＬの血液を、サンプルが採取された試験管から取り出す。針は、濯ぎ盆上で、希釈剤で内側および外側を濯ぐ。次に、例１で記載された３．５ｍＬの希釈剤を、第１の希釈物（１／２１９）を得るために添加する。第２の希釈は、この第１の希釈物に３１．２μＬと４ｍＬの希釈剤を用いておこなう（１／１２８）。その希釈物を、吸引により計数チャンバーに移動する。ＲＢＣの希釈の間に、０．４１ｍＬの溶解剤をＷＢＣ計数チャンバー中の第１の希釈物に対して添加する。最終希釈物は、ＷＢＣについて約１／２４４であり、ＲＢＣ／血小板について１／２８２００である。一旦、移動が実施されたならば、希釈盆は、希釈剤で満たされ、それによって濯がれる。
【００３９】
計数：
一連の計数は次のように実施される：
１８０μＬの第１希釈物をＷＢＣの計数のために、容積測定的に測定し、同時に約１００μＬの第２の希釈物をＲＢＣ／血小板について測定する。
【００４０】
ＷＢＣ希釈物の容積は、容積測定チューブにおける２つの光学的バリアにより調節される。容積的計数の間に、データを２秒の４つのテーブルに分割する。
【００４１】
ＲＢＣ／血小板の計数が、ＷＢＣ計数と共に開始し、正確に８秒後に停止する。
【００４２】
３つのＷＢＣ集団への識別：
種々のＷＢＣ亜集団を、サイズ基準に基づいて溶解条件（希釈剤、溶解剤、作用時間）を調節することにより識別する。これらの条件が共に持ち込まれたときに、生じた化学反応が、３つのＷＢＣ集団：リンパ球、顆粒球および平均サイズの細胞（好塩基球＋単球＋好酸球の一部分＋若い顆粒球）を識別することを可能にする。
【００４３】
溶解処理後、リンパ球は、それらの小さい核を有する最小の細胞であり、（ヒトモードにおける）ＷＢＣ識別ヒストグラム上で（パラメーター化可能な）２０〜９０±５ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。
【００４４】
平均細胞は、リンパ球と顆粒球との間に位置する領域にある。
【００４５】
溶解が作用した後、それらは、（変更可能な）ＷＢＣ識別ヒストグラム上で９０±５〜１４０±５ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。幾つかの好酸球は、しかしながら、２２０ｆＬを超え得る。
【００４６】
好中性の顆粒球は、溶解の作用の後、細胞質の一部分を保持するそれらの複数のセグメント化された核を有する最大の細胞である。好中球は、ＷＢＣ識別ヒストグラムにおいて１４０±１０〜４４９ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。
【００４７】
ヘモグロビン
光源、緑色光発光ダイオード（ＬＥＤ）（５５５Ｎｍ）により、吸光度の算出が可能になり、これはサンプル中のヘモグロビンの濃度に比例する。光学軌道（optical track）は、ＷＢＣチャンバーにおける２つの光路により測定した。Ｈｂ参照は、起動中またはチャンバーが希釈剤で充填される時に記憶される。
【００４８】
＜例３：少なくとも４集団分析器における方法の実施＞
血液サンプルの調製
１５０μＬの血液を、予め血液が採取された試験管から取り出す。血液のカラムが、セラミックバルブを通して分析器により引き上げられ、２５±１μＬがサンプリングされ、第１の希釈物が、中性のｐＨで弱い高浸透圧性の希釈剤の１８００μＬで約１／７２に形成された。
【００４９】
第２の希釈物は、２５±１μＬと約２ｍＬの希釈剤とでカスケード内で調製され、それにより１／６０００でＲＢＣと血小板が測定される。
【００５０】
４７５μＬの前希釈物が、２１０μＬの溶解剤と約１４４０μＬの希釈剤とで溶解され、それにより最終希釈物１／２５１を得る。
【００５１】
測定：
ヘモグロビンは、５６０ｎｍで、ＷＢＣを調製するためのキュベット内で直接に１５秒後に測定される。
【００５２】
この１／２５１までのＷＢＣ／Ｈｂ希釈物を、次に、二重流体力学的流体構造（dual hydrodynamic flow architecture）において、２６７μＬが７５μｍのマイクロ開口部と近接焦点レーザービームとを通って注入される血球計算器に移動する。電気的インピーダンス測定のためのこの二重デバイスと、広角レーザー測定が、ＷＢＣの計数と少なくとも４つの白血球亜集団：リンパ球、単球、赤血球顆粒球および好中性顆粒球：の測定を可能にするが、また、変形体三日熱(マラリア)プラスモジウムの顆粒球の減少した好中性顆粒球、血小板凝集または有核ＲＢＣのシグナリングの測定も可能である。
【００５３】
１／６０００への希釈物の６７μＬを、順番に移動し、７５μｍのマイクロ開口部を通して二重流体力学的流体構造に注入し、それによりＲＢＣおよび血小板を計数する。
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、同時に、血液サンプルの同一希釈物において、シアン化物などの何れの毒性生成物を伴うことなく、ヘモグロビンレベルを測定し、白血球（ＷＢＣ）を計数且つ識別するための方法および反応媒体に関する。
【０００２】
ヘモグロビンを測定するための従来の方法は、５４０ｎｍでの分光測定により、シアン化イオンと酸化型のヘモグロビン、メトヘモグロビンとの間で形成される発色複合体を検出することに基づいていた。分析されるべき血液サンプルは、シアン化物塩（シアン化カリウム）およびフィリシアン化物塩（フェリシアン化カリウムまたはフェリシアン化ナトリウム）を含む水性反応媒体に曝されていた。水性媒体において、赤血球（ＲＢＣ）は溶解され、ヘモグロビンは、フェリシアン化物およびシアン化物イオンによりメトヘモグロビン（ヘモグロビンとも称される）に酸化され、それらはヘムに関して強力な親和性を有し；それらはメトヘモグロビンのヘムのためのリガンドであり、シアンメトヘモグロビン複合体を形成し、その最大吸光度は５４０ｎｍである。当該ヘモグロビンは分光測定により測定される。
【０００３】
その後、ＲＢＣ溶解を促進するために、四級アンモニウム塩を低濃度で当該反応媒体に対して添加された。しかしながら、これは、フェリシアン化イオンと四級アンモニウム基との間での複合体の凝集の問題を生じた；これらの凝集は、ヘモグロビンの測光分析を障害する濁度を示す。この理由のため、フェリシアン化物塩は放棄され、その間もシアン化物塩は維持されている。
【０００４】
自動化デバイスが、血液サンプルにおけるヘモグロビン並びにＲＢＣおよびＷＢＣの数を迅速に分析するために開発されている。反応媒体もまた、同時に進化してきた；ＲＢＣおよびＷＢＣを計数するために、変更が、水性希釈剤から等張性または僅かに高浸透圧性の希釈剤にされた。これらの条件下、ＲＢＣを溶解するために四級アンモニウムの濃度を上昇することが必要になってきた。
【０００５】
これらの技術は、毒性のあるシアン化イオンを含む重要な欠点を有する。
【０００６】
もはやシアン化イオンを必要とする方法は、開発されていない。
【０００７】
Ｉ．オオシロらのClin. Biochem. 15(1) 83−88 (1982)は、血液サンプルにおけるヘモグロビンレベルを測定するために、何れのシアン化イオンも不在で、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を使用する方法を提案している。サンプルと接触されたＳＬＳは、ＲＢＣの溶血を引き起こし、鉄原子の酸化によるヘモグロビンのメトヘモグロビンへの変換を導く。その形成された安定した複合体は、吸光分光測定により検出される。ＳＬＳは、示される最低濃度でさえ、ＷＢＣを含む全ての細胞の溶解を引き起こし、それは核の状態を低下する。この方法は、強力な希釈を使用するものであり、これは、制限された計数時間での許容できる不正確で、ＷＢＣが測定されることを不可能にする。加えて、差次的な計数には利用できない。
【０００８】
文書ＵＳ５４６８６４０Ａは、血中サンプルにおけるヘモグロビンを測定するための迅速な方法を開示しており、それに従うと、前記サンプルは、１１．３〜１３．７のｐＨで、界面活性剤を含み、また、何れのシアン化イオンを含まない反応媒体と接触される。界面活性剤は、またステアリルトリアルキルアンモニウムヒドロキシドなどの強塩基であり、且つそれがその媒体において必要なｐＨを与えるか、またはそれは、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）など、強塩基ではないが、強塩基、例えば、アルカリ金属ヒドロキシドなどが添加されなくてはならないかの何れかである。界面活性剤によるＲＢＣの溶血後、後者の活性および強塩基の活性が、ヘモグロビンの変性を生じ、且つ空気中の酸素へのヘモグロビンのヘムの暴露が鉄原子の酸化を生じる。ヘム第二鉄とヒドロキシドイオンとの間で形成される複合体が吸収分光測定により検出される。従来記載された方法のように、この方法は、ＷＢＣ識別を測定することを可能にするものではなく、それは、過激な条件が必然的に核の状態への前記ＷＢＣの溶解を引き起こすからである。
【０００９】
文書ＵＳ６７４０５２７Ａは、血液サンプル中のヘモグロビンレベルを測定する方法を開示し、何れのシアン化イオンをも欠き、これはまた、ＷＢＣ計数を得ることも可能にする。サンプルは、最初に希釈され、次に、０．１〜２０重量％の少なくとも四級アンモニウム塩と０．１〜１５重量％のヒドロキシルアミン塩とを含む溶解剤を含む反応媒体との接触に持ち込む。この方法は、ヘモグロビンレベルの測定とＷＢＣの計数を可能にするが、後者の識別を可能にすることはできない。
【００１０】
自動化された血液分析器における１つの溶解剤を用いてのヘモグロビンレベルの測定、ＷＢＣ数およびＷＢＣ識別は、使用される試薬の数を減少すること、分析器の流体構成を単純化することが可能になる。これらはシステムを頑強化するための、製造および操作コストを引き下げるための要因となる。
【００１１】
本発明の著者は、全ての予測に反して、１または１以上の四級アンモニウム塩の唯一の存在がＷＢＣを溶解するために十分であり、且つヘムに対する四級アンモニウム塩の結び付きによりヘモグロビン測定を安定化することを発見した。それまたはそれらは、そのため、血液サンプルにおいて、何れの他の溶解剤および何れの他のヘモグロビンヘムリガンドの不在において、ヘモグロビンレベルの測定と、白血球の計数および後者の識別とに十分である。
【００１２】
従って、本発明は、何れの毒性生成物も有さない単純な方法を提供するものであり、これは同じ血液サンプルにおいて、同時にヘモグロビンレベルの測定とＷＢＣの計数を可能にする。この方法は、完全な血液計数分野において使用される慣習的な読み取りおよび測定技術を含み、何れの毒性の化学的実体、例えば、シアン化イオンやヒドロキシルアミン塩などを含まない。
【００１３】
本発明の方法は以下の工程を含む：
血液サンプルは、ｐＨ１０を超えず、シアン化イオンを含まず、少なくとも１つの四級アンモニウム塩および少なくとも保存剤を含む等張性または高浸透圧性の媒体に提供され、
ヘモグロビンと四級アンモニウム塩との間で形成される複合体が分光測定により検出され；および
ＷＢＣが計数され、且つ少なくとも３つの亜集団に識別される；
前記方法は、前記四級アンモニウム塩以外の何れのリガンドの不在において行われる。
【００１４】
血液サンプルを含む媒体は、慣習的に１または２の工程により調製される；１の工程の調製においては、希釈および溶解媒体の構成成分と血液サンプルとが１工程において混合される；２の工程の調製においては、血液サンプルが希釈媒体に持ち込まれ、次に得られる媒体と溶解媒体とが混合される。
【００１５】
用語「等張性または高浸透圧性媒体」は、好ましくは等張性または僅かに高浸透圧性である媒体を意味することを意図し、それは、それらの識別を損なうであろうＷＢＣの何れかの過剰な収縮を防止するためのものである。
【００１６】
本発明の方法の実施するために、単数または複数の四級アンモニウム塩は、単独または組合せにおいて考慮される特徴に有利に対応する：
単数または複数の四級アンモニウム塩は、式（Ｉ）の化合物：
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、おのおの独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す；
から選択される。
【００１７】
Ｒ１は、１０〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、従って、当該塩は、単数または複数で、好ましくは、ドデシルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、パルミチルトリメチルアンモニウムおよびステアリルトリメチルアンモニウム塩から選択される。
【００１８】
Ｒ１は、また、１〜６の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、前記塩は、単数または複数で、好ましくはテトラエチルアンモニウム塩から選択される。
【００１９】
勿論、本発明に従って、前記媒体は、幾つかの四級アンモニウム塩、特に幾つかの式（Ｉ）の塩、例えば、１または１以上の式（Ｉ）の塩（ここにおいて、Ｒ１はＣ１０〜Ｃ１８鎖である）、および／または１または１以上の式（Ｉ）（ここにおいて、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６鎖である）の塩を含んでよい。
【００２０】
特に適切な塩は、単独または混合物として使用されるミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択される。
【００２１】
四級アンモニウム塩の割合は、媒体の重量に対して、２重量％〜４重量％の範囲である。
【００２２】
以前の状態の通り、媒体は、１または１以上の保存剤を含む。この薬剤またはこれらの薬剤は、前記方法のおのおのの工程を最適化することに寄与するが、最も詳細には、ＷＢＣの識別を最適化することに寄与する。この薬剤またはこれらの薬剤は、特に、静菌剤、好ましくは、ジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択される。
【００２３】
媒体は、また他の成分を含んでもよい：
安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)など、
少なくとも１つの非イオン性 界面活性剤、例えば、トリトン（Triton（登録商標））など。
【００２４】
上記の成分は、当該方法を行うために必須ではないが、それらはそれらの最適化を可能にするであろう。
【００２５】
ヘモグロビンレベルは、慣習的な分光測定技術により測定できる。ＷＢＣの計数は、それ自身また慣習的な方法により、例えば、本発明の方法に従って、インピーデンスの原理に基づく方法により行われ、ＷＢＣを少なくとも以下の３つの亜集団：リンパ球、（リンパ球以外の）単球および顆粒球：に識別することも可能にする。
【００２６】
本発明の方法の１つの変形に従うと、媒体は、少なくとも１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここにおいて、Ｒ１は１２の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）ともう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここにおいて、Ｒ１は１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含む。これらの条件下で、それ自身また慣習的である、インピーダンスのバイパラメトリック法と広角レーザー測定とを組み合わせて、少なくとも以下の４つの亜集団：リンパ球、単球、好酸性顆粒球および好中性顆粒球：に識別することも可能である。
【００２７】
また媒体は、３つまでの四級アンモニウム塩、またはそれ以上さえも含んでもよい。
【００２８】
本発明の好ましい１つの実施に従うと、血液サンプルは僅かに高浸透圧性であり、中性のｐＨで緩衝化された媒体において希釈される。１０を超えたｐＨが、ＷＢＣの部分的な溶解を引き起こし、その差次的な計数を防止する。
【００２９】
本発明はまた、ヘモグロビンレベルを測定するため、および白血球細胞を計数し、且つ識別するための媒体に関し、前記媒体は、シアン化イオンを含まず、少なくとも１つの四級アンモニウム塩および保存剤を含み、且つ前記媒体は前記塩以外の何れのリガンド薬剤も含まない。従って、本発明に従う媒体は、１または１以上の四級アンモニウム塩からなる溶解剤を含み、後者は、ヘモグロビンのヘムに対して結合する唯一のリガンド剤（単数または複数）を構成する。
【００３０】
この塩またはこれらの塩は、有利に、式（Ｉ）の化合物；
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、おのおの独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す；
から選択される。
【００３１】
この媒体は、有利に、以前記載されたものであり、且つ単独または組合せにおいて考慮され、その同じ特徴を有する。
【００３２】
好ましい媒体は、以下の四級アンモニウム塩を含む：ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド。有利には、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドの割合は、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲であり、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、およびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドの割合は１〜５ｇ／Ｌの範囲である。
【００３３】
またそれは、保存剤として、好ましくはジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択された少なくとも１つの静菌剤を含んでもよい。ジメチルウレアの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、ピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムの割合は、１〜１０ｇ／Ｌの範囲である。
【００３４】
それはまた、安定剤として、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、好ましくはその割合は１〜１０ｇ／Ｌの範囲である。
【００３５】
本発明の対象は、以下の例において更に詳細に記載し、且つ例証する。
【００３６】
＜例１：本発明に従う媒体の組成物＞
適切な媒体は、希釈剤および溶解および反応剤を、次のように含む：
希釈剤として、以下を含む水性溶液：
有機リン酸緩衝剤、例えば、無水リン酸二ナトリウムまたはリン酸水素ナトリウムなど：
膜安定剤、例えば、硫酸クロライドまたは硫酸ナトリウムなど、
静菌剤、例えば、ジメチルウレアまたはピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムなど、
安定剤、例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ．Ｎａ２）など；
および溶解剤として、以下を含む水性溶液：
ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドの混合物、
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））、非イオン性界面活性剤として、
膜安定剤として、塩化ナトリウム、希釈剤のものと同じまたは異なってよく、および、
脱イオン水。
【００３７】
希釈剤は、中性のｐＨで３２０〜３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の浸透圧を有し、溶解剤は、ｐＨが１０．５＋／−０．４である。得られる反応媒体は、ｐＨが８に近い。
【００３８】
＜例２：「３集団」分析における方法の実施＞
血液サンプルの調製
約１６μＬの血液を、サンプルが採取された試験管から取り出す。針は、濯ぎ盆上で、希釈剤で内側および外側を濯ぐ。次に、例１で記載された３．５ｍＬの希釈剤を、第１の希釈物（１／２１９）を得るために添加する。第２の希釈は、この第１の希釈物に３１．２μＬと４ｍＬの希釈剤を用いておこなう（１／１２８）。その希釈物を、吸引により計数チャンバーに移動する。ＲＢＣの希釈の間に、０．４１ｍＬの溶解剤をＷＢＣ計数チャンバー中の第１の希釈物に対して添加する。最終希釈物は、ＷＢＣについて約１／２４４であり、ＲＢＣ／血小板について１／２８２００である。一旦、移動が実施されたならば、希釈盆は、希釈剤で満たされ、それによって濯がれる。
【００３９】
計数：
一連の計数は次のように実施される：
１８０μＬの第１希釈物をＷＢＣの計数のために、容積測定的に測定し、同時に約１００μＬの第２の希釈物をＲＢＣ／血小板について測定する。
【００４０】
ＷＢＣ希釈物の容積は、容積測定チューブにおける２つの光学的バリアにより調節される。容積的計数の間に、データを２秒の４つのテーブルに分割する。
【００４１】
ＲＢＣ／血小板の計数が、ＷＢＣ計数と共に開始し、正確に８秒後に停止する。
【００４２】
３つのＷＢＣ集団への識別：
種々のＷＢＣ亜集団を、サイズ基準に基づいて溶解条件（希釈剤、溶解剤、作用時間）を調節することにより識別する。これらの条件が共に持ち込まれたときに、生じた化学反応が、３つのＷＢＣ集団：リンパ球、顆粒球および平均サイズの細胞（好塩基球＋単球＋好酸球の一部分＋若い顆粒球）を識別することを可能にする。
【００４３】
溶解処理後、リンパ球は、それらの小さい核を有する最小の細胞であり、（ヒトモードにおける）ＷＢＣ識別ヒストグラム上で（パラメーター化可能な）２０〜９０±５ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。
【００４４】
平均細胞は、リンパ球と顆粒球との間に位置する領域にある。
【００４５】
溶解が作用した後、それらは、（変更可能な）ＷＢＣ識別ヒストグラム上で９０±５〜１４０±５ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。幾つかの好酸球は、しかしながら、２２０ｆＬを超え得る。
【００４６】
好中性の顆粒球は、溶解の作用の後、細胞質の一部分を保持するそれらの複数のセグメント化された核を有する最大の細胞である。好中球は、ＷＢＣ識別ヒストグラムにおいて１４０±１０〜４４９ｆＬの間の細胞に一致する（示さず）。
【００４７】
ヘモグロビン
光源、緑色光発光ダイオード（ＬＥＤ）（５５５Ｎｍ）により、吸光度の算出が可能になり、これはサンプル中のヘモグロビンの濃度に比例する。光学軌道（optical track）は、ＷＢＣチャンバーにおける２つの光路により測定した。Ｈｂ参照は、起動中またはチャンバーが希釈剤で充填される時に記憶される。
【００４８】
＜例３：少なくとも４集団分析器における方法の実施＞
血液サンプルの調製
１５０μＬの血液を、予め血液が採取された試験管から取り出す。血液のカラムが、セラミックバルブを通して分析器により引き上げられ、２５±１μＬがサンプリングされ、第１の希釈物が、中性のｐＨで弱い高浸透圧性の希釈剤の１８００μＬで約１／７２に形成された。
【００４９】
第２の希釈物は、２５±１μＬと約２ｍＬの希釈剤とでカスケード内で調製され、それにより１／６０００でＲＢＣと血小板が測定される。
【００５０】
４７５μＬの前希釈物が、２１０μＬの溶解剤と約１４４０μＬの希釈剤とで溶解され、それにより最終希釈物１／２５１を得る。
【００５１】
測定：
ヘモグロビンは、５６０ｎｍで、ＷＢＣを調製するためのキュベット内で直接に１５秒後に測定される。
【００５２】
この１／２５１までのＷＢＣ／Ｈｂ希釈物を、次に、二重流体力学的流体構造（dual hydrodynamic flow architecture）において、２６７μＬが７５μｍのマイクロ開口部と近接焦点レーザービームとを通って注入される血球計算器に移動する。電気的インピーダンス測定のためのこの二重デバイスと、広角レーザー測定が、ＷＢＣの計数と少なくとも４つの白血球亜集団：リンパ球、単球、赤血球顆粒球および好中性顆粒球：の測定を可能にするが、また、変形体三日熱(マラリア)プラスモジウムの顆粒球の減少した好中性顆粒球、血小板凝集または有核ＲＢＣのシグナリングの測定も可能である。
【００５３】
１／６０００への希釈物の６７μＬを、順番に移動し、７５μｍのマイクロ開口部を通して二重流体力学的流体構造に注入し、それによりＲＢＣおよび血小板を計数する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルにおいて、ヘモグロビンレベルを測定するため、および白血球を計数および識別するための方法であって、前記方法は、如何なる他のリガンドも不在で行われ、以下の工程を含むことを特徴する方法；
当該血液サンプルを、ｐｈが１０を超えず、シアン化イオンを含まず、且つ少なくとも１つの四級アンモニウム塩と１つの保存剤を含む等張性または高浸透圧性媒体に供給すること；
ヘモグロビンと四級アンモニウム基の間で形成された複合体を分光測定により検出すること；および
白血球細胞を計数し、且つ少なくとも３つの亜集団に識別すること。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該四級アンモニウム塩が単数または複数で式（Ｉ）ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−の化合物から選択されることを特徴とする方法；
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、Ｒ１が、１０〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表すことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、アンモニウム塩が、単数または複数で、ドデシルトリメチルアンモニム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、パルミチルトリメチルアンモニウムおよびステアリルトリメチルアンモニウム塩から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、Ｒ１が１〜６の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、当該アンモニウム塩が、単数または複数で、テトラエチルアンモニウム塩から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４または６に記載の方法であって、当該アンモニウムが、単数または複数で、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、当該四級アンモニウム塩の割合が、当該媒体の重量に対して、２重量％〜４重量％の範囲であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、当該保存剤が、静菌剤、好ましくはジメチルウレアであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記媒体が更に安定剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、当該安定剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記媒体が更に少なくとも１の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記鎖の方法であって、前記非イオン性界面活性剤がトリトン（登録商標）であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、前記白血球が、インピーダンスにより計数され、以下の３つの亜集団；リンパ球、リンパ球以外の単球および顆粒球；が認識されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、当該媒体が、少なくとも式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、１２の炭素原子を含むＲ１は炭化水素を基礎とする鎖を表す）と、もう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１が１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、当該白血球がインピーダンスのバイパラメトリック法と広角レーザー測定とにより計数され、以下の４つの亜集団；リンパ球、単球、好酸球および好中球；が識別されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、当該媒体が３つの四級アンモニウム塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
ヘモグロビンレベルを測定するため、且つ白血球を計数し且つ識別するための媒体であって、前記媒体がシアン化イオンを含まず、且つ少なくとも１の式（Ｉ）；
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここで、
Ｒ１は１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し；および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表し；
の四級アンモニウム塩と保存剤を含み、
前記試薬が何れの他のリガンド剤を含まないことを特徴とする媒体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の媒体であって、当該アンモニウムが、単数または複数で、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択される媒体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の媒体であって、当該ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドの濃度が、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲であり、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度が、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、テトラエチルアンモニウムヒドロキシドの濃度が、１〜５ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２１】
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の媒体であって、当該保存剤が静菌剤であり、特に、ジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択されることを特徴とする媒体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の媒体であって、当該ジメチルウレアの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、当該ピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２３】
請求項１８〜２２の何れか１項に記載の媒体であって、更に安定剤を含むことを特徴とする媒体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の媒体であって、当該安定剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする媒体。
【請求項２５】
請求項２４に記載の媒体であって、当該ＥＤＴAの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２６】
請求項１８〜２５の何れか１項に記載の媒体であって、式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１は１２の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）と、もう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１は１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含むことを特徴とする媒体。
【請求項１】
血液サンプルにおいて、ヘモグロビンレベルを測定するため、および白血球を計数および識別するための方法であって、前記方法は、如何なる他のリガンドも不在で行われ、以下の工程を含むことを特徴する方法；
当該血液サンプルを、ｐｈが１０を超えず、シアン化イオンを含まず、且つ少なくとも１つの四級アンモニウム塩と１つの保存剤を含む等張性または高浸透圧性媒体に供給すること；
ヘモグロビンと四級アンモニウム基の間で形成された複合体を分光測定により検出すること；および
白血球細胞を計数し、且つ少なくとも３つの亜集団に識別すること。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該四級アンモニウム塩が単数または複数で式（Ｉ）ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−の化合物から選択されることを特徴とする方法；
ここにおいて、
Ｒ１は、１〜１８炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し、および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表す。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、Ｒ１が、１０〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表すことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、アンモニウム塩が、単数または複数で、ドデシルトリメチルアンモニム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、パルミチルトリメチルアンモニウムおよびステアリルトリメチルアンモニウム塩から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、Ｒ１が１〜６の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、当該アンモニウム塩が、単数または複数で、テトラエチルアンモニウム塩から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４または６に記載の方法であって、当該アンモニウムが、単数または複数で、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、当該四級アンモニウム塩の割合が、当該媒体の重量に対して、２重量％〜４重量％の範囲であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、当該保存剤が、静菌剤、好ましくはジメチルウレアであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記媒体が更に安定剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、当該安定剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記媒体が更に少なくとも１の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記鎖の方法であって、前記非イオン性界面活性剤がトリトン（登録商標）であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、前記白血球が、インピーダンスにより計数され、以下の３つの亜集団；リンパ球、リンパ球以外の単球および顆粒球；が認識されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、当該媒体が、少なくとも式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、１２の炭素原子を含むＲ１は炭化水素を基礎とする鎖を表す）と、もう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１が１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、当該白血球がインピーダンスのバイパラメトリック法と広角レーザー測定とにより計数され、以下の４つの亜集団；リンパ球、単球、好酸球および好中球；が識別されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、当該媒体が３つの四級アンモニウム塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
ヘモグロビンレベルを測定するため、且つ白血球を計数し且つ識別するための媒体であって、前記媒体がシアン化イオンを含まず、且つ少なくとも１の式（Ｉ）；
ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘ−
ここで、
Ｒ１は１〜１８の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して１〜６の炭素原子を含むアルキル基を表し；および
Ｘは、ハロゲンまたはＯＨ、ＣＨ３ＳＯ４およびＰＯ４から選択される基を表し；
の四級アンモニウム塩と保存剤を含み、
前記試薬が何れの他のリガンド剤を含まないことを特徴とする媒体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の媒体であって、当該アンモニウムが、単数または複数で、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよびテトラエチルアンモニウムヒドロキシドから選択される媒体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の媒体であって、当該ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドの濃度が、２０〜４０ｇ／Ｌの範囲であり、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度が、１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、テトラエチルアンモニウムヒドロキシドの濃度が、１〜５ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２１】
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の媒体であって、当該保存剤が静菌剤であり、特に、ジメチルウレアおよびピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムから選択されることを特徴とする媒体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の媒体であって、当該ジメチルウレアの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、当該ピリジンエチオール−１−オキシドナトリウムの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２３】
請求項１８〜２２の何れか１項に記載の媒体であって、更に安定剤を含むことを特徴とする媒体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の媒体であって、当該安定剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする媒体。
【請求項２５】
請求項２４に記載の媒体であって、当該ＥＤＴAの濃度が１〜１０ｇ／Ｌの範囲であることを特徴とする媒体。
【請求項２６】
請求項１８〜２５の何れか１項に記載の媒体であって、式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１は１２の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）と、もう１つの式（Ｉ）の四級アンモニウム塩（ここで、Ｒ１は１４の炭素原子を含む炭化水素を基礎とする鎖を表す）とを含むことを特徴とする媒体。
【公表番号】特表２０１１−５２１２５１（Ｐ２０１１−５２１２５１Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１００１９（Ｐ２０１１−５１００１９）
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００５９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５０３２７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３０９０１９）ビーエイチ・ホールディングス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＨ ＨＯＬＤＩＮＧＳ
【住所又は居所原語表記】Ｒｕｅ ｄｅ Ｇｅｒｈｏｕｉ， ３５６５０ ＬＥ ＲＨＥＵ， ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００５９３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５０３２７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３０９０１９）ビーエイチ・ホールディングス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＨ ＨＯＬＤＩＮＧＳ
【住所又は居所原語表記】Ｒｕｅ ｄｅ Ｇｅｒｈｏｕｉ， ３５６５０ ＬＥ ＲＨＥＵ， ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]