ペプチド誘導体
【課題】優れた鎮痛作用を有し、その作用の持続性に優れた新規なオピオイド様ペプチド誘導体を提供する。
【解決手段】下記式（１）
で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’，６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）
【解決手段】下記式（１）
で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’，６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた薬理作用を有する新規なペプチド誘導体に関し、特にオピオイド受容体等に対する作用を介して鎮痛等の薬理作用を発揮する鎮痛剤、癌疼痛剤等として有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来から、オピオイド受容体の作用物質として、モルヒネが知られている。オピオイド受容体は、μ、δおよびκの３種に大別されているが、モルヒネは主にμ受容体にアゴニストとして作用し、鎮痛、腸管運動抑制、呼吸抑制等の薬理作用を発現する。このように生体の神経系に作用してモルヒネ様の麻酔、鎮痛作用を発現する物質は、一般にオピオイドペプチドと総称されている。
【０００３】
オピオイドペプチドの薬理作用は基本的にはモルヒネと同様と考えられ、元来生体内に存在する物質であることから、モルヒネ以上の安全性を有する薬剤となる可能性が予想される。内因性オピオイドペプチドの構造中に含まれるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびチロシン（Ｔｙｒ）などの芳香族アミノ酸はオピオイドペプチドの薬理活性および受容体相互作用において重要な役割を担うことから、それらに着目したオピオイド性ペプチドリガンドの開発と構造活性相関についての研究が盛んに行なわれている。その中でも、近年、Ｐｈｅの類似体である２’６’−ジメチルフェニルアラニンが種々のオピオイド性ペプチドリガンドの開発研究に多く利用されている（例えば、非特許文献１〜７参照）。
【０００４】
一方、内因性オピオイドペプチドであるデルモルフィン（dermorphin）が、１９８１年イタリアのErspamerらにより南アフリカ産amphibian genus Phyllomedusa (メズサアマガエル)の皮膚より単離された。デルモルフィンは、自然界では細菌以外には存在しないと言われてきたD体アミノ酸のＤ−アラニンをN端から２番目に含有するヘプタペプチドで、内因性オピオイドペプチドに特異的なN末端アミノ酸配列を含まず、Ｃ末端にはアミノ基を有している（例えば非特許文献８および９参照）。
【０００５】
デルモルフィンが単離・同定されて以来、その薬理学的作用について数多くの報告がなされている。デルモルフィンは、ラット脳室内投与においてｈｏｔ−ｐｌａｔｅ法ではモルヒネの２０００倍、Ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法では７７０倍もの抗侵害活性を示すことが報告されており、モルヒネに比べ極めて強い抗侵害活性を有する（例えば非特許文献１０および１１参照）。また、マウス皮下投与においてｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法ではモルヒネのＥＤ５０値が１０．８μｍｏｌ／ｋｇであるのに対してデルモルフィンのＥＤ５０値は２．８μｍｏｌ／ｋｇであることから、デルモルフィンは、他のオピオイドペプチドと異なり、中枢のみならず、末梢投与においてもモルヒネより強い抗侵害作用を有しているとされる。さらに、脳のオピオイド受容体に対する結合実験においてもモルヒネおよびＴｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＭｅＰｈｅ−Ｇｌｙ−ｏｌ（ＤＡＭＧＯ）よりもμ受容体に対して高い親和性を有することが報告されている（例えば非特許文献１２参照）。
【０００６】
デルモルフィンの構造活性相関において、その抗侵害活性発現に必要な最小活性構造とされるＮ端のテトラペプチド（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）のアナログ体が数多く合成され、その後、Ｄ−体のアミノ酸を含む合成オピオイドペプチドが、特にκ受容体選択性の高い合成オピオイドペプチドが麻薬性のない鎮痛薬として期待されている。しかしながら、その有効性、κアゴニストであることに起因すると思われる副作用、及び採算性の面で医薬品としての可能性は疑問視されている。
【０００７】
また、近年では、Ｎ末端にアミジノ基を有するＬ−Ｔｙｒ−（Ｌ又はＤ）−Ａｒｇ−Ｐｈｅを基本骨格とするオリゴペプチド誘導体やＮ−末端がアルキル化されたＬ−チロシン−Ｄ−アルギニン−フェニルアラニン−Ｎ−メチル−β−アラニンを基本骨格とするオリゴペプチド誘導体が提案されている（例えば特許文献１〜４参照）。
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９５／２４４２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／１０２６１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／１０２６２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／１２５３９号パンフレット
【非特許文献１】Suzuki K.ら, Chem. Pharm. Bull., 33, 4865-4869 (1985)
【非特許文献２】Chandrakumar N. S.ら、J. Med. Chem., 35, 223-233 (1992).
【非特許文献３】Sasaki Y.ら、Chem. Pharm. Bull., 47, 1506-1509 (1999)
【非特許文献４】Ambo A.ら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 1269-1272 (2003)
【非特許文献５】Sasaki Y.ら、Bioorg. Med. Chem., 11, 675-678 (2003)
【非特許文献６】Ambo A.ら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 879-881 (2002)
【非特許文献７】Sasaki Y.ら、Biol. Pharm. Bull., 27, 244-247 (2004)
【非特許文献８】Montecucchi P. C.ら、Int. J. Pept. Prot. Res., 17, 275-283. (1981)
【非特許文献９】溝口広一, 櫻田忍, 長瀬博, 緩和医療学, 4, 32-38 (2002)
【非特許文献１０】Broccardo M.ら、Br. J. Pharmacol., 73, 625-631 (1981)
【非特許文献１１】De Castiglione R.ら、Peptides, 2, 265-269 (1981)
【非特許文献１２】Rossi A. C.ら、Peptides, 7, 755-759 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これらのペプチド誘導体は、経口吸収性、経皮吸収性には優れているものの、鎮痛作用の持続性の点で十分とは言えない。そこで、本発明の目的は、優れた鎮痛作用を有し、その作用の持続性に優れた新規なオピオイド様ペプチド誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、デルモルフィンのＮ端テトラペプチドの２位のアミノ酸をＤ−アルギニンで置換したペプチド誘導体、Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎ−Ｍｅ−βＡｌａに着目し、化学構造と抗侵害作用との関係について鋭意研究を重ねた結果、３位のＰｈｅをＬ−２’６’−ジメチルフェニルアラニンに置換した新規ペプチド誘導体が、所期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）下記式（１）
【化２】
（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩、
（２）Ｘ１がアミノ基である請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩、
（３）上記（１）又は（２）記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する鎮痛剤、
に関する。
【００１２】
本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩は、優れた鎮痛作用を有し、医薬、特に鎮痛剤の有効成分として有用である。本発明のペプチド誘導体等は、モルヒネに比し、鎮痛作用の持続時間が長いため、既知のオピオイドペプチドの代替薬としての利用が期待される。また、Ｘ１が水酸基である本発明のペプチド誘導体は、モルヒネに比べ、より短時間に鎮痛作用を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１４】
本発明のペプチド誘導体は、Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ）およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から構成され、β−Ａｌａのアミノ基にメチル基を有するテトラペプチドであり、下記式（１）
【化３】
で表される（以下、式（１）で表されるペプチド誘導体のうち、Ｘ１が水酸基のものを「Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ」、Ｘ１がアミノ基のものを「Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２」ということがある）。式（１）中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体である。また、Ｘ１はアミノ基または水酸基であり、鎮痛作用の持続時間が長いという点でアミノ基がより好ましい。
【００１５】
本発明のペプチド誘導体の薬学的に許容される塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられ、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。また、本発明には、上記薬学的に許容される塩の水和物、又はエタノール和物等の溶媒和物も含まれる。好ましい塩としては、例えば、塩酸塩などが挙げられる。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善株式会社）、Ｍ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７６）並びにＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｙｏｕｎｇ，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（１９６９）等に記載されている一般的なペプチド合成法により製造することができる。具体的には、ペプチド液相合成法またはペプチド固相合成法を用いてペプチドカルボキシル末端より順次アミノ酸の縮合反応を行うことにより本発明のペプチド誘導体を製造することができる。また、前記合成法により目的のペプチドの断片を製造した後、これらを前記合成法により本発明のペプチド誘導体を製造してもよい。
【００１７】
前記合成法に用いるアミノ酸およびアミノ酸誘導体としては、これらのアミノ基が、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）などの保護基で保護されているものが好ましい。また、用いるアミノ酸等の側鎖官能基はそれぞれ好ましい保護基で保護されているものが好ましい。これらアミノ酸側鎖保護基としては、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマンスルフォニル基（Ｐｍｃ）等が挙げられる。
【００１８】
ペプチド結合を形成するための縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ｐｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート等が挙げられる。また、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と上記縮合剤を好ましい割合で混合して用いてもよい。
【００１９】
また、ペプチド結合の形成にはカルボキシル末端を活性化してもよく、その活性化剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルやペンタフルオロフェニルエステル等が挙げられる。ペプチド結合を形成する際に用いる塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等が挙げられ、ペプチド結合形成反応に用いる溶媒としては、例えば、クロロホルム、塩化メチレン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド等が例示できる。
【００２０】
ペプチドまたはアミノ酸のアミノ末端アミノ基の保護基であるＢｏｃおよびＦｍｏｃは、それぞれトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはピペリジンにより除去することができる。ペプチドのアミノ酸残基の側鎖官能基の保護基は、例えば、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロメタンスルホン酸などにより除去することができる。
【００２１】
また、ペプチド固相合成法において、ペプチドまたはアミノ酸残基の側鎖官能基に保護基が付いているペプチドをペプチド固相合成樹脂より脱離させる方法としては、例えば、ＴＦＡが用いられる。ペプチド固相樹脂からのペプチドの脱離と、アミノ酸残基の側鎖官能基の保護基の脱離は、それぞれ同一反応系内で同時に行うこともできる。あるいは、それぞれ独立に行うこともできる。ペプチド固相合成用のペプチド固相合成樹脂としては、例えば、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸−ベンズヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール−ポリスチレン樹脂やオキシム樹脂などの通常市販されているものを用いることができる。
【００２２】
目的のペプチド誘導体またはその中間体は、例えば、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、再結晶、抽出、分別結晶化など、種々の方法により単離、精製を行うことができる。また、こうして得られた目的化合物である本発明のペプチド誘導体は、常法によってそれぞれの塩に変換できる。
【００２３】
本発明のペプチド誘導体およびその薬学的に許容される塩は、オピオイド受容体に対する特異的親和性を有しているため、優れた鎮痛作用のみならず、種々のモルヒネ様生理活性を発現しうる。すなわち、オピオイド受容体を経由して発現する種々の中枢性および末梢性応答、例えば麻酔、鎮静、呼吸、脈動、消化管機能、ホルモン分泌調節、心筋収縮調節などに生理学的作用を発現しうる。なお、本発明の適用対象はこれらに限定されない。
【００２４】
本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩は、医薬として有用であり、例えば、鎮痛剤、癌疼痛剤、鎮痛麻酔剤、催眠剤、抗健忘剤、抗不安剤、消化管ホルモン促進剤、電解質吸収促進剤、腸管ぜん動抑制による下痢改善剤等の有効成分として利用することができ、特に鎮痛剤、癌疼痛剤の有効成分として有用である。
【００２５】
上記薬剤は、一般的な医薬製剤の形態で用いられ、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤等を用いて調製される。この医薬製剤としては各種の形態が使用目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）および坐剤等が挙げられる。
【００２６】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来から知られている各種のものを広く使用することができる。その例としては、例えば乳糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロピルアルコール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、カルメロースカルシウム、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。さらに錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶性被包錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。
【００２７】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として従来この分野で公知のものを広く使用できる。その例としては、例えば結晶セルロース、乳糖、デンプン、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、カルメロースカルシウム、カンテン等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２８】
カプセル剤は、常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００２９】
注射剤として調製する場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているもの、例えば水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。この場合等張性の溶液を調製するのに必要な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００３０】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用することができる。その例としては、例えば半合成グリセライド、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００３１】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させることもできる。本発明のこれらの医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量は、特に限定されずに広範囲から適宜選択されるが、通常製剤組成物中に約０．００１〜５０重量％、好ましくは約０．０１〜５０重量％とするのがよい。
【００３２】
上記薬剤の投与方法には特に制限はなく、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合は、単独でまたはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤として調製された場合には、鼻腔内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合は直腸内投与される。
【００３３】
上記薬剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択されるが、通常、有効成分化合物の量として、1日当たり２〜５００ｍｇ／ｋｇ程度が好ましく、５〜５０ｍｇ／ｋｇがより好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。なお、本発明は、かかる実施例、製造例に限定されるものではない。
【００３５】
下記参考例および実施例において、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ（ＦＴ−ＩＲ）を用いて測定した。水素および炭素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ）は、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７０（１Ｈ：２７０ＭＨｚ、１３Ｃ：６７．８ＭＨｚ）を使用し、化学シフトはテトラメチルシラン（（ＣＨ３）４Ｓｉ）を内部標準として、（ＣＨ３）４Ｓｉからのｐｐｍで示した。各シグナルの分裂様式は、次の略語を使用した。s＝singlet、br s = broad singlet、d = doublet、dd = doublet of doublet、t = triplet、m = multiplet。結合定数（Ｊ）はＨｚで示した。質量分析スペクトル（ＭＳ）は、日本電子製ＪＭＳ−ＤＸ３０３／ＪＭＡ−ＤＡ５０００ ＳＹＳＴＥＭ ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。元素分析は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００ ＣＨＮ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。旋光度は、ＪＡＳＣＯ Ｐ−１０２０旋光度計を用いて測定した。カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（２３０−４００ｍｅｓｈ)を用いて行なった。
【００３６】
（参考例１）
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニンの合成
（１）（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢの合成
（Ｓ）−２−[Ｎ−（Ｎ−ベンジルプロリル）アミノ]ベンゾフェノン（ＢＰＢ）（９．６ｇ、２５ｍｍｏｌ)、Ｎｉ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ（１４．５ｇ、５０ｍｏｌ）、グリシン（９．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１７５ｍＬ)に水酸化カリウム（９．８ｇ、１５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（４０ｍＬ）をアルゴン気流下、４０−５０℃で加え、５５−６５℃で１時間攪拌した。反応液を酢酸で中和した後、水（３８０ｍＬ）を加え、室温に２時間放置した。その溶液にトリクロロメタンを加えて分液し、水層をトリクロロメタンで抽出した。トリクロロメタン層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥ろ過後, 溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリクロロメタン：アセトン＝５：１）に付し、（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ（１１．０６ｇ、９６％）を得た。
【００３７】
融点：217-219℃(エタノール). [a]D12 +2219°(c = 1.1 メタノール中) , [lit.24[a]D25 +2006°(c = 0.1 メタノール中)].
1H-NMR (CDCl3) d : 2.02-2.20 (2H, m), 2.38-2.60 (2H, m), 3.26-3.40 (1H, m), 3.47 (1H, dd, J = 5.44, 10.7 Hz), 3.63-3.75 (4H, m), 4.49 (1H, d, J = 12.5 Hz), 6.70 (1H, t, J = 8.16 Hz), 6.81 (1H, dd, J = 1.73, 8.16 Hz), 6.97-7.18 (1H, m), 7.18-7.34 (2H, m), 7.38-7.57 (5H, m), 8.07 (2H, d, J = 6.93 Hz), 8.29 (1H, d, J = 8.74 Hz).
MS m/z: 497 (M+). HRMS calcd for C27H25N3O3Ni : 497.1249, Found: 497.1175.
【００３８】
（２）（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢと２’，６’−ジメチルベンジルブロミドとの反応
粉末状水酸化ナトリウム（２．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ懸濁溶液（１０ｍＬ）に、前記（１）で得た（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ（２．５ｇ、５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流下、室温で１．５時間攪拌した。反応液に２’，６’−ジメチルベンジルブロミド（１．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を加え、室温で５分間攪拌した。反応液を氷水（３５０ｍＬ）に注ぎ、沈殿物を得た。ろ取した粉末をトリクロロメタンに溶かし、硫酸マグネシウムで乾燥ろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：１）に付し、ニッケル（ＩＩ）錯体のモノアルキル体（収率９３％）を得た。
【００３９】
融点：123 °C (エタノール) [lit.24, 122-124 °C]. [α]D20 +2803° (c = 1.0 トリクロロメタン中).
IR (KBr) cm-1: 3477, 2968, 1669, 1635, 1164, 1070, 752.
1H-NMR (CDCl3) d: 2.07-2.13 (1H, m), 2.14 (6H, s), 2.24-2.36 (1H, m), 2.57-2.61 (1H, m), 2.64-2.74 (1H, m), 3.50-3.58 (2H, m), 3.52 (1H, d, J = 13.7 Hz), 3.82-4.00 (1H, m), 4.08 (1H, dd, J= 10.4, 14.0 Hz), 4.29 (1H, dd, J = 4.2, 10.1 Hz), 4.41 (1H, d, J = 12.5 Hz), 5.57 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.42 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.55 (1H, dd, J = 14.2, 7.1 Hz), 6.80 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.08-7.15 (2H, m), 7.16-7.25 (4H, m), 7.28-7.39 (4H, m), 8.11 (2H, d, J = 7.3 Hz), 8.19 (1H, d, J= 7.9 Hz).
13C-NMR (CDCl3) d: 20.0, 24.3, 30.7, 37.6, 57.1, 63.0, 70.3, 70.4, 120.6, 123.2, 126.1, 126.9, 127.4, 128.1, 128.4, 128.6, 128.8, 128.8, 128.9, 129.0, 131.4, 132.5, 133.2, 133.3, 133.9, 137.9, 142.3, 171.1, 178.9, 180.0.
MS m/z: 615 (M+).
【００４０】
（３）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニンの合成
前記（２）で得たニッケル（ＩＩ）錯体のモノアルキル体（２．４６ｇ，４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５ｍＬ）に７０℃で３Ｎ塩酸（６ｍＬ）のメタノール溶液（６ｍＬ）を滴下し、７０℃のまま反応液の赤色が消えるまで（約３時間）攪拌した。反応液を室温に戻し、減圧濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）に溶かし、炭酸ナトリウム（２．６５ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ジオキサン（４０ｍＬ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（４．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣に水（５０ｍＬ）とトリクロロメタン（５０ｍＬ）を加えて分液後、水層をトリクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した。溶媒を減圧留去後、残渣をエタノールで再結晶し、（Ｓ）−ＢＰＢ（９０−９６％）を回収した。水層を２０％クエン酸でｐＨ３に調整した後、トリクロロメタン（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トリクロロメタン：メタノール：酢酸＝４：１：０．０１）に付し、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（収率８３％）を得た。
【００４１】
融点：１３４−１３６℃(ヘキサン−酢酸エチル） [lit., mp 122-124 °C]. [α]D30 -25.2° (c = 1.02 トリクロロメタン中) [lit., [α]D20 -25° (c = 1 トリクロロメタン中)].
IR (KBr) cm-1: 3421, 2981, 1709, 784.
1H-NMR (CDCl3) d : 1.04, 1.35 (9H, s x 2), 2.41 (6H, s), 3.07-3.25 (2H, m), 4.54-4.60 (1H, m), 6.98-7.08 (3H, m), 7.41 (1H, d, J = 7.9 Hz), 12.77 (1H, br s).
13C-NMR (CDCl3) d : 20.3, 27.6, 34.6, 53.9, 81.2, 126.6, 128.4, 134.3, 137.4, 156.5, 175.5.
MS m/z: 293 (M+).
【００４２】
〔実施例１〕
（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨの合成）
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９５）， ２， ５５２−５５４に記載のＦＭＯＣプ口トコルにより、Ｗａｎｇ樹脂を用いてＰｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ＳＰ ６５０（Ｌａｂｏｒｔｅｃ ＡＧ）上で実施した。加ヒドラジン分解により、樹脂からペプチドを分離した。得られた生成物を脱保護し酸化的環化に付して、目的のペプチドを得た。精製したペプチドが同質であることは、分析的ＲＰＨＰＬＣにより確認し、分子量はＩＳＰにより５９８．３［Ｍ＋Ｈ］＋と決定した（Ｃ３０Ｈ４３Ｎ７Ｏ６として計算して５９７．３）。
【００４３】
〔実施例２〕
（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２の合成）
各ペプチドは、市販のペプチド合成機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品、ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＥＲ ９０５０）を用いて固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（Ａｐｎｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸はＮＯＶＡ ｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（１００〜２００ｍｅｓｈ）」を使用した。
【００４４】
次に、上記ペプチド合成機の合成プ口グラムに準じて脱保護基反応及び縮合反応を反復して樹脂に結合するＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の合成ペプチドを得た。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（関東化学社製品ペプチド、合成用グレード）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（−ＯＨ）各４ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりＦｍｏｃ基を切断し、ＤＭＦ、メタノールの順で上記反応物を洗浄した。
【００４５】
固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール１．８ｍＬ、ｍ−クレゾール０．６ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２４ｍＬを加え、室温で２時間撹拝した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂をろ過して除去した。次いで、ろ液に冷却エタノールを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。その後、遠心分離（２１０００ｒｐｍで５分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジエチルエーテルを新たに加えて十分に撹伴した後、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この撹拝と遠心分離の処理を計３回反復して行った。
【００４６】
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ ６００：Ｗａｔｅｒｓ社製品）を用いて精製を行った。
【００４７】
より具体的には、プレカラム（日本ウオーターズ社製品、Ｇｕａｒｄ−Ｐａｃｋ Ｄｅｌｔａ−ｐａｋ Ｃ１８ Ａ３００）及びＣ１８逆相力ラム（日本ウオーターズ社製品、ＸＴｅｒｒａ力ラム、ＭＳＣ１８、５μｍ、４．６×１１００ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオ口酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。ここで、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、１．５ｍＬ／分の流速で上記力ラムを用いて３０〜４０分間の分離精製を行った。なお、逆相力ラムから溶離したペブチドは紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ社製品、４９０Ｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて波長：２２０ｎｍで検出され、記録チャート上にピークとして示される。
【００４８】
また、溶離した各ポリペプチドの分子量をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＲＰを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ ＳＰｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。その結果、目的のポリペプチドが合成・精製されていることが確認された。
【００４９】
〔試験例１〕
実施例１および２で合成したペプチド誘導体の抗侵害作用を、熱侵害刺激であるｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法を用いて評価した。
【００５０】
＜使用動物＞
実験には体重２２−２５ｇのｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用した。動物は実験に供するまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期 ９：００−２１：００、暗期 ２１：００−９：００）の一定環境で飼育した。なお、動物にはマウス用固形飼料（F２・船橋農場・船橋）および水道水を自由に摂取させた。
【００５１】
＜使用薬物＞
薬物として、実施例１および２で得たペプチド誘導体ならびにモルヒネを用いた。薬物はすべてリンゲル液にそれぞれ溶解した。
【００５２】
＜投与方法＞
皮下（ｓ．ｃ．）投与はマウス後背部へ２７番ゲージ注射針（テルモ（株））を用いて、マウス体重１０ｇあたり０．１ｍL（０．１ｍL／１０ｇ）投与した。
【００５３】
＜抗侵害作用の評価＞
抗侵害効果の指標として、熱侵害刺激であるｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法により評価した。動物を測定環境に慣れさせるために６０分間測定プラスチックケージ内に放置してから実験を行った。マウス尾先端部より２ｃｍの部分に輻射熱照射を行い、尾を振るまでの潜時を仮性疼痛閾値として評価した。マウスはあらかじめ刺激に対して２．５−３．５秒で反応するものを選択して用いた。また、刺激部位の損傷を最小限にするため、最長刺激時間（ｃｕｔ−ｏｆｆ ｔｉｍｅ）は１０秒とした。抗侵害作用は、％ＭＰＥ（% of maximum possible effect）として下記式から算出した。
【数１】
【００５４】
＜統計処理＞
実験は一群１０匹で行い、抗侵害効果は平均値および標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。有意差検定については、二元配置の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ)により処理した後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔに従い、危険率５％以下を有意差ありと判断した（図に表された符号は、以下の通りである。*；対照に対してＰ＜０．０５、**；対照に対してＰ＜０．０１）。用量-反応曲線は、曲線解析プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ３．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析し、５０％有効用量（５０％ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ：ＥＤ５０）とその９５％信頼限界を算出した。
【００５５】
図１にモルヒネを皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。モルヒネの皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現した。作用ピーク時間である皮下投与後３０分におけるＥＤ５０値は３．５６３（１．６５４−７．６７４）ｍｇ／ｋｇであった。モルヒネ５ｍｇ／ｋｇの皮下投与は、作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後９０分間持続した。
【００５６】
図２に実施例１のペプチド誘導体を皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。実施例１のペプチド誘導体の皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現し、作用ピーク時間である皮下投与後２０分におけるＥＤ５０値は３．１２３(２．７６０−３．５３４）ｍｇ／ｋｇであった。実施例１のペプチド誘導体１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与は作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後１２０分間持続した。
【００５７】
図３に実施例２のペプチド誘導体を皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。実施例２のペプチド誘導体の皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現した。実施例２のペプチド誘導体の作用ピーク時間である皮下投与後６０分におけるＥＤ５０値は５．６７６(２．３４３−１２．７５）ｍｇ／ｋｇであった。実施例２のペプチド誘導体１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与は作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後１８０分間持続した。
【００５８】
上記のように、実施例１および実施例２のペプチド誘導体は皮下投与において熱侵害刺激に対する抗侵害作用を示した。約８０％の抗侵害作用を示す用量における作用持続時間はいずれのペプチドもモルヒネよりも持続的であり、特にＣ末端のカルボキシル基をアミド化した実施例２のペプチド誘導体においてより長い作用の持続が認められた。また、実施例１のペプチド誘導体では、モルヒネの場合に比べ、抗侵害作用が短時間に発現された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】モルヒネのｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【図２】Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ（実施例１）のｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【図３】Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２（実施例２）のｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた薬理作用を有する新規なペプチド誘導体に関し、特にオピオイド受容体等に対する作用を介して鎮痛等の薬理作用を発揮する鎮痛剤、癌疼痛剤等として有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来から、オピオイド受容体の作用物質として、モルヒネが知られている。オピオイド受容体は、μ、δおよびκの３種に大別されているが、モルヒネは主にμ受容体にアゴニストとして作用し、鎮痛、腸管運動抑制、呼吸抑制等の薬理作用を発現する。このように生体の神経系に作用してモルヒネ様の麻酔、鎮痛作用を発現する物質は、一般にオピオイドペプチドと総称されている。
【０００３】
オピオイドペプチドの薬理作用は基本的にはモルヒネと同様と考えられ、元来生体内に存在する物質であることから、モルヒネ以上の安全性を有する薬剤となる可能性が予想される。内因性オピオイドペプチドの構造中に含まれるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびチロシン（Ｔｙｒ）などの芳香族アミノ酸はオピオイドペプチドの薬理活性および受容体相互作用において重要な役割を担うことから、それらに着目したオピオイド性ペプチドリガンドの開発と構造活性相関についての研究が盛んに行なわれている。その中でも、近年、Ｐｈｅの類似体である２’６’−ジメチルフェニルアラニンが種々のオピオイド性ペプチドリガンドの開発研究に多く利用されている（例えば、非特許文献１〜７参照）。
【０００４】
一方、内因性オピオイドペプチドであるデルモルフィン（dermorphin）が、１９８１年イタリアのErspamerらにより南アフリカ産amphibian genus Phyllomedusa (メズサアマガエル)の皮膚より単離された。デルモルフィンは、自然界では細菌以外には存在しないと言われてきたD体アミノ酸のＤ−アラニンをN端から２番目に含有するヘプタペプチドで、内因性オピオイドペプチドに特異的なN末端アミノ酸配列を含まず、Ｃ末端にはアミノ基を有している（例えば非特許文献８および９参照）。
【０００５】
デルモルフィンが単離・同定されて以来、その薬理学的作用について数多くの報告がなされている。デルモルフィンは、ラット脳室内投与においてｈｏｔ−ｐｌａｔｅ法ではモルヒネの２０００倍、Ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法では７７０倍もの抗侵害活性を示すことが報告されており、モルヒネに比べ極めて強い抗侵害活性を有する（例えば非特許文献１０および１１参照）。また、マウス皮下投与においてｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法ではモルヒネのＥＤ５０値が１０．８μｍｏｌ／ｋｇであるのに対してデルモルフィンのＥＤ５０値は２．８μｍｏｌ／ｋｇであることから、デルモルフィンは、他のオピオイドペプチドと異なり、中枢のみならず、末梢投与においてもモルヒネより強い抗侵害作用を有しているとされる。さらに、脳のオピオイド受容体に対する結合実験においてもモルヒネおよびＴｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＭｅＰｈｅ−Ｇｌｙ−ｏｌ（ＤＡＭＧＯ）よりもμ受容体に対して高い親和性を有することが報告されている（例えば非特許文献１２参照）。
【０００６】
デルモルフィンの構造活性相関において、その抗侵害活性発現に必要な最小活性構造とされるＮ端のテトラペプチド（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）のアナログ体が数多く合成され、その後、Ｄ−体のアミノ酸を含む合成オピオイドペプチドが、特にκ受容体選択性の高い合成オピオイドペプチドが麻薬性のない鎮痛薬として期待されている。しかしながら、その有効性、κアゴニストであることに起因すると思われる副作用、及び採算性の面で医薬品としての可能性は疑問視されている。
【０００７】
また、近年では、Ｎ末端にアミジノ基を有するＬ−Ｔｙｒ−（Ｌ又はＤ）−Ａｒｇ−Ｐｈｅを基本骨格とするオリゴペプチド誘導体やＮ−末端がアルキル化されたＬ−チロシン−Ｄ−アルギニン−フェニルアラニン−Ｎ−メチル−β−アラニンを基本骨格とするオリゴペプチド誘導体が提案されている（例えば特許文献１〜４参照）。
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９５／２４４２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／１０２６１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／１０２６２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／１２５３９号パンフレット
【非特許文献１】Suzuki K.ら, Chem. Pharm. Bull., 33, 4865-4869 (1985)
【非特許文献２】Chandrakumar N. S.ら、J. Med. Chem., 35, 223-233 (1992).
【非特許文献３】Sasaki Y.ら、Chem. Pharm. Bull., 47, 1506-1509 (1999)
【非特許文献４】Ambo A.ら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 1269-1272 (2003)
【非特許文献５】Sasaki Y.ら、Bioorg. Med. Chem., 11, 675-678 (2003)
【非特許文献６】Ambo A.ら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 879-881 (2002)
【非特許文献７】Sasaki Y.ら、Biol. Pharm. Bull., 27, 244-247 (2004)
【非特許文献８】Montecucchi P. C.ら、Int. J. Pept. Prot. Res., 17, 275-283. (1981)
【非特許文献９】溝口広一, 櫻田忍, 長瀬博, 緩和医療学, 4, 32-38 (2002)
【非特許文献１０】Broccardo M.ら、Br. J. Pharmacol., 73, 625-631 (1981)
【非特許文献１１】De Castiglione R.ら、Peptides, 2, 265-269 (1981)
【非特許文献１２】Rossi A. C.ら、Peptides, 7, 755-759 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これらのペプチド誘導体は、経口吸収性、経皮吸収性には優れているものの、鎮痛作用の持続性の点で十分とは言えない。そこで、本発明の目的は、優れた鎮痛作用を有し、その作用の持続性に優れた新規なオピオイド様ペプチド誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、デルモルフィンのＮ端テトラペプチドの２位のアミノ酸をＤ−アルギニンで置換したペプチド誘導体、Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎ−Ｍｅ−βＡｌａに着目し、化学構造と抗侵害作用との関係について鋭意研究を重ねた結果、３位のＰｈｅをＬ−２’６’−ジメチルフェニルアラニンに置換した新規ペプチド誘導体が、所期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）下記式（１）
【化２】
（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩、
（２）Ｘ１がアミノ基である請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩、
（３）上記（１）又は（２）記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する鎮痛剤、
に関する。
【００１２】
本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩は、優れた鎮痛作用を有し、医薬、特に鎮痛剤の有効成分として有用である。本発明のペプチド誘導体等は、モルヒネに比し、鎮痛作用の持続時間が長いため、既知のオピオイドペプチドの代替薬としての利用が期待される。また、Ｘ１が水酸基である本発明のペプチド誘導体は、モルヒネに比べ、より短時間に鎮痛作用を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１４】
本発明のペプチド誘導体は、Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ）およびβ−アラニン（β−Ａｌａ）から構成され、β−Ａｌａのアミノ基にメチル基を有するテトラペプチドであり、下記式（１）
【化３】
で表される（以下、式（１）で表されるペプチド誘導体のうち、Ｘ１が水酸基のものを「Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ」、Ｘ１がアミノ基のものを「Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２」ということがある）。式（１）中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体である。また、Ｘ１はアミノ基または水酸基であり、鎮痛作用の持続時間が長いという点でアミノ基がより好ましい。
【００１５】
本発明のペプチド誘導体の薬学的に許容される塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられ、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。また、本発明には、上記薬学的に許容される塩の水和物、又はエタノール和物等の溶媒和物も含まれる。好ましい塩としては、例えば、塩酸塩などが挙げられる。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体は、例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善株式会社）、Ｍ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７６）並びにＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｙｏｕｎｇ，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（１９６９）等に記載されている一般的なペプチド合成法により製造することができる。具体的には、ペプチド液相合成法またはペプチド固相合成法を用いてペプチドカルボキシル末端より順次アミノ酸の縮合反応を行うことにより本発明のペプチド誘導体を製造することができる。また、前記合成法により目的のペプチドの断片を製造した後、これらを前記合成法により本発明のペプチド誘導体を製造してもよい。
【００１７】
前記合成法に用いるアミノ酸およびアミノ酸誘導体としては、これらのアミノ基が、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）などの保護基で保護されているものが好ましい。また、用いるアミノ酸等の側鎖官能基はそれぞれ好ましい保護基で保護されているものが好ましい。これらアミノ酸側鎖保護基としては、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｔ−ブチル基（ｔＢｕ）、トリチル基（Ｔｒｔ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマンスルフォニル基（Ｐｍｃ）等が挙げられる。
【００１８】
ペプチド結合を形成するための縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ｐｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート等が挙げられる。また、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と上記縮合剤を好ましい割合で混合して用いてもよい。
【００１９】
また、ペプチド結合の形成にはカルボキシル末端を活性化してもよく、その活性化剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルやペンタフルオロフェニルエステル等が挙げられる。ペプチド結合を形成する際に用いる塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等が挙げられ、ペプチド結合形成反応に用いる溶媒としては、例えば、クロロホルム、塩化メチレン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド等が例示できる。
【００２０】
ペプチドまたはアミノ酸のアミノ末端アミノ基の保護基であるＢｏｃおよびＦｍｏｃは、それぞれトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはピペリジンにより除去することができる。ペプチドのアミノ酸残基の側鎖官能基の保護基は、例えば、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロメタンスルホン酸などにより除去することができる。
【００２１】
また、ペプチド固相合成法において、ペプチドまたはアミノ酸残基の側鎖官能基に保護基が付いているペプチドをペプチド固相合成樹脂より脱離させる方法としては、例えば、ＴＦＡが用いられる。ペプチド固相樹脂からのペプチドの脱離と、アミノ酸残基の側鎖官能基の保護基の脱離は、それぞれ同一反応系内で同時に行うこともできる。あるいは、それぞれ独立に行うこともできる。ペプチド固相合成用のペプチド固相合成樹脂としては、例えば、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸−ベンズヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール−ポリスチレン樹脂やオキシム樹脂などの通常市販されているものを用いることができる。
【００２２】
目的のペプチド誘導体またはその中間体は、例えば、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、再結晶、抽出、分別結晶化など、種々の方法により単離、精製を行うことができる。また、こうして得られた目的化合物である本発明のペプチド誘導体は、常法によってそれぞれの塩に変換できる。
【００２３】
本発明のペプチド誘導体およびその薬学的に許容される塩は、オピオイド受容体に対する特異的親和性を有しているため、優れた鎮痛作用のみならず、種々のモルヒネ様生理活性を発現しうる。すなわち、オピオイド受容体を経由して発現する種々の中枢性および末梢性応答、例えば麻酔、鎮静、呼吸、脈動、消化管機能、ホルモン分泌調節、心筋収縮調節などに生理学的作用を発現しうる。なお、本発明の適用対象はこれらに限定されない。
【００２４】
本発明のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩は、医薬として有用であり、例えば、鎮痛剤、癌疼痛剤、鎮痛麻酔剤、催眠剤、抗健忘剤、抗不安剤、消化管ホルモン促進剤、電解質吸収促進剤、腸管ぜん動抑制による下痢改善剤等の有効成分として利用することができ、特に鎮痛剤、癌疼痛剤の有効成分として有用である。
【００２５】
上記薬剤は、一般的な医薬製剤の形態で用いられ、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤等を用いて調製される。この医薬製剤としては各種の形態が使用目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）および坐剤等が挙げられる。
【００２６】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来から知られている各種のものを広く使用することができる。その例としては、例えば乳糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロピルアルコール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、カルメロースカルシウム、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。さらに錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶性被包錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。
【００２７】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として従来この分野で公知のものを広く使用できる。その例としては、例えば結晶セルロース、乳糖、デンプン、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、カルメロースカルシウム、カンテン等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２８】
カプセル剤は、常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００２９】
注射剤として調製する場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているもの、例えば水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。この場合等張性の溶液を調製するのに必要な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００３０】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用することができる。その例としては、例えば半合成グリセライド、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００３１】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させることもできる。本発明のこれらの医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量は、特に限定されずに広範囲から適宜選択されるが、通常製剤組成物中に約０．００１〜５０重量％、好ましくは約０．０１〜５０重量％とするのがよい。
【００３２】
上記薬剤の投与方法には特に制限はなく、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合は、単独でまたはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤として調製された場合には、鼻腔内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合は直腸内投与される。
【００３３】
上記薬剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択されるが、通常、有効成分化合物の量として、1日当たり２〜５００ｍｇ／ｋｇ程度が好ましく、５〜５０ｍｇ／ｋｇがより好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。なお、本発明は、かかる実施例、製造例に限定されるものではない。
【００３５】
下記参考例および実施例において、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ（ＦＴ−ＩＲ）を用いて測定した。水素および炭素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ）は、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７０（１Ｈ：２７０ＭＨｚ、１３Ｃ：６７．８ＭＨｚ）を使用し、化学シフトはテトラメチルシラン（（ＣＨ３）４Ｓｉ）を内部標準として、（ＣＨ３）４Ｓｉからのｐｐｍで示した。各シグナルの分裂様式は、次の略語を使用した。s＝singlet、br s = broad singlet、d = doublet、dd = doublet of doublet、t = triplet、m = multiplet。結合定数（Ｊ）はＨｚで示した。質量分析スペクトル（ＭＳ）は、日本電子製ＪＭＳ−ＤＸ３０３／ＪＭＡ−ＤＡ５０００ ＳＹＳＴＥＭ ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。元素分析は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００ ＣＨＮ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。旋光度は、ＪＡＳＣＯ Ｐ−１０２０旋光度計を用いて測定した。カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（２３０−４００ｍｅｓｈ)を用いて行なった。
【００３６】
（参考例１）
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニンの合成
（１）（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢの合成
（Ｓ）−２−[Ｎ−（Ｎ−ベンジルプロリル）アミノ]ベンゾフェノン（ＢＰＢ）（９．６ｇ、２５ｍｍｏｌ)、Ｎｉ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ（１４．５ｇ、５０ｍｏｌ）、グリシン（９．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１７５ｍＬ)に水酸化カリウム（９．８ｇ、１５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（４０ｍＬ）をアルゴン気流下、４０−５０℃で加え、５５−６５℃で１時間攪拌した。反応液を酢酸で中和した後、水（３８０ｍＬ）を加え、室温に２時間放置した。その溶液にトリクロロメタンを加えて分液し、水層をトリクロロメタンで抽出した。トリクロロメタン層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥ろ過後, 溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トリクロロメタン：アセトン＝５：１）に付し、（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ（１１．０６ｇ、９６％）を得た。
【００３７】
融点：217-219℃(エタノール). [a]D12 +2219°(c = 1.1 メタノール中) , [lit.24[a]D25 +2006°(c = 0.1 メタノール中)].
1H-NMR (CDCl3) d : 2.02-2.20 (2H, m), 2.38-2.60 (2H, m), 3.26-3.40 (1H, m), 3.47 (1H, dd, J = 5.44, 10.7 Hz), 3.63-3.75 (4H, m), 4.49 (1H, d, J = 12.5 Hz), 6.70 (1H, t, J = 8.16 Hz), 6.81 (1H, dd, J = 1.73, 8.16 Hz), 6.97-7.18 (1H, m), 7.18-7.34 (2H, m), 7.38-7.57 (5H, m), 8.07 (2H, d, J = 6.93 Hz), 8.29 (1H, d, J = 8.74 Hz).
MS m/z: 497 (M+). HRMS calcd for C27H25N3O3Ni : 497.1249, Found: 497.1175.
【００３８】
（２）（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢと２’，６’−ジメチルベンジルブロミドとの反応
粉末状水酸化ナトリウム（２．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ懸濁溶液（１０ｍＬ）に、前記（１）で得た（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ（２．５ｇ、５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流下、室温で１．５時間攪拌した。反応液に２’，６’−ジメチルベンジルブロミド（１．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を加え、室温で５分間攪拌した。反応液を氷水（３５０ｍＬ）に注ぎ、沈殿物を得た。ろ取した粉末をトリクロロメタンに溶かし、硫酸マグネシウムで乾燥ろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：１）に付し、ニッケル（ＩＩ）錯体のモノアルキル体（収率９３％）を得た。
【００３９】
融点：123 °C (エタノール) [lit.24, 122-124 °C]. [α]D20 +2803° (c = 1.0 トリクロロメタン中).
IR (KBr) cm-1: 3477, 2968, 1669, 1635, 1164, 1070, 752.
1H-NMR (CDCl3) d: 2.07-2.13 (1H, m), 2.14 (6H, s), 2.24-2.36 (1H, m), 2.57-2.61 (1H, m), 2.64-2.74 (1H, m), 3.50-3.58 (2H, m), 3.52 (1H, d, J = 13.7 Hz), 3.82-4.00 (1H, m), 4.08 (1H, dd, J= 10.4, 14.0 Hz), 4.29 (1H, dd, J = 4.2, 10.1 Hz), 4.41 (1H, d, J = 12.5 Hz), 5.57 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.42 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.55 (1H, dd, J = 14.2, 7.1 Hz), 6.80 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.08-7.15 (2H, m), 7.16-7.25 (4H, m), 7.28-7.39 (4H, m), 8.11 (2H, d, J = 7.3 Hz), 8.19 (1H, d, J= 7.9 Hz).
13C-NMR (CDCl3) d: 20.0, 24.3, 30.7, 37.6, 57.1, 63.0, 70.3, 70.4, 120.6, 123.2, 126.1, 126.9, 127.4, 128.1, 128.4, 128.6, 128.8, 128.8, 128.9, 129.0, 131.4, 132.5, 133.2, 133.3, 133.9, 137.9, 142.3, 171.1, 178.9, 180.0.
MS m/z: 615 (M+).
【００４０】
（３）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニンの合成
前記（２）で得たニッケル（ＩＩ）錯体のモノアルキル体（２．４６ｇ，４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５ｍＬ）に７０℃で３Ｎ塩酸（６ｍＬ）のメタノール溶液（６ｍＬ）を滴下し、７０℃のまま反応液の赤色が消えるまで（約３時間）攪拌した。反応液を室温に戻し、減圧濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）に溶かし、炭酸ナトリウム（２．６５ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ジオキサン（４０ｍＬ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（４．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣に水（５０ｍＬ）とトリクロロメタン（５０ｍＬ）を加えて分液後、水層をトリクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した。溶媒を減圧留去後、残渣をエタノールで再結晶し、（Ｓ）−ＢＰＢ（９０−９６％）を回収した。水層を２０％クエン酸でｐＨ３に調整した後、トリクロロメタン（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トリクロロメタン：メタノール：酢酸＝４：１：０．０１）に付し、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（収率８３％）を得た。
【００４１】
融点：１３４−１３６℃(ヘキサン−酢酸エチル） [lit., mp 122-124 °C]. [α]D30 -25.2° (c = 1.02 トリクロロメタン中) [lit., [α]D20 -25° (c = 1 トリクロロメタン中)].
IR (KBr) cm-1: 3421, 2981, 1709, 784.
1H-NMR (CDCl3) d : 1.04, 1.35 (9H, s x 2), 2.41 (6H, s), 3.07-3.25 (2H, m), 4.54-4.60 (1H, m), 6.98-7.08 (3H, m), 7.41 (1H, d, J = 7.9 Hz), 12.77 (1H, br s).
13C-NMR (CDCl3) d : 20.3, 27.6, 34.6, 53.9, 81.2, 126.6, 128.4, 134.3, 137.4, 156.5, 175.5.
MS m/z: 293 (M+).
【００４２】
〔実施例１〕
（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨの合成）
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９５）， ２， ５５２−５５４に記載のＦＭＯＣプ口トコルにより、Ｗａｎｇ樹脂を用いてＰｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ＳＰ ６５０（Ｌａｂｏｒｔｅｃ ＡＧ）上で実施した。加ヒドラジン分解により、樹脂からペプチドを分離した。得られた生成物を脱保護し酸化的環化に付して、目的のペプチドを得た。精製したペプチドが同質であることは、分析的ＲＰＨＰＬＣにより確認し、分子量はＩＳＰにより５９８．３［Ｍ＋Ｈ］＋と決定した（Ｃ３０Ｈ４３Ｎ７Ｏ６として計算して５９７．３）。
【００４３】
〔実施例２〕
（Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２の合成）
各ペプチドは、市販のペプチド合成機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品、ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＺＥＲ ９０５０）を用いて固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（Ａｐｎｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸はＮＯＶＡ ｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（１００〜２００ｍｅｓｈ）」を使用した。
【００４４】
次に、上記ペプチド合成機の合成プ口グラムに準じて脱保護基反応及び縮合反応を反復して樹脂に結合するＦｍｏｃ−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の合成ペプチドを得た。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（関東化学社製品ペプチド、合成用グレード）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるＦｍｏｃを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（−ＯＨ）各４ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりＦｍｏｃ基を切断し、ＤＭＦ、メタノールの順で上記反応物を洗浄した。
【００４５】
固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール１．８ｍＬ、ｍ−クレゾール０．６ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２４ｍＬを加え、室温で２時間撹拝した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂をろ過して除去した。次いで、ろ液に冷却エタノールを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。その後、遠心分離（２１０００ｒｐｍで５分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジエチルエーテルを新たに加えて十分に撹伴した後、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この撹拝と遠心分離の処理を計３回反復して行った。
【００４６】
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ ６００：Ｗａｔｅｒｓ社製品）を用いて精製を行った。
【００４７】
より具体的には、プレカラム（日本ウオーターズ社製品、Ｇｕａｒｄ−Ｐａｃｋ Ｄｅｌｔａ−ｐａｋ Ｃ１８ Ａ３００）及びＣ１８逆相力ラム（日本ウオーターズ社製品、ＸＴｅｒｒａ力ラム、ＭＳＣ１８、５μｍ、４．６×１１００ｍｍ）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオ口酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。ここで、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、１．５ｍＬ／分の流速で上記力ラムを用いて３０〜４０分間の分離精製を行った。なお、逆相力ラムから溶離したペブチドは紫外線検出器（Ｗａｔｅｒｓ社製品、４９０Ｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて波長：２２０ｎｍで検出され、記録チャート上にピークとして示される。
【００４８】
また、溶離した各ポリペプチドの分子量をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＲＰを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ ＳＰｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析）に基づいて決定した。その結果、目的のポリペプチドが合成・精製されていることが確認された。
【００４９】
〔試験例１〕
実施例１および２で合成したペプチド誘導体の抗侵害作用を、熱侵害刺激であるｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法を用いて評価した。
【００５０】
＜使用動物＞
実験には体重２２−２５ｇのｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用した。動物は実験に供するまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期 ９：００−２１：００、暗期 ２１：００−９：００）の一定環境で飼育した。なお、動物にはマウス用固形飼料（F２・船橋農場・船橋）および水道水を自由に摂取させた。
【００５１】
＜使用薬物＞
薬物として、実施例１および２で得たペプチド誘導体ならびにモルヒネを用いた。薬物はすべてリンゲル液にそれぞれ溶解した。
【００５２】
＜投与方法＞
皮下（ｓ．ｃ．）投与はマウス後背部へ２７番ゲージ注射針（テルモ（株））を用いて、マウス体重１０ｇあたり０．１ｍL（０．１ｍL／１０ｇ）投与した。
【００５３】
＜抗侵害作用の評価＞
抗侵害効果の指標として、熱侵害刺激であるｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ法により評価した。動物を測定環境に慣れさせるために６０分間測定プラスチックケージ内に放置してから実験を行った。マウス尾先端部より２ｃｍの部分に輻射熱照射を行い、尾を振るまでの潜時を仮性疼痛閾値として評価した。マウスはあらかじめ刺激に対して２．５−３．５秒で反応するものを選択して用いた。また、刺激部位の損傷を最小限にするため、最長刺激時間（ｃｕｔ−ｏｆｆ ｔｉｍｅ）は１０秒とした。抗侵害作用は、％ＭＰＥ（% of maximum possible effect）として下記式から算出した。
【数１】
【００５４】
＜統計処理＞
実験は一群１０匹で行い、抗侵害効果は平均値および標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表した。有意差検定については、二元配置の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ)により処理した後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔに従い、危険率５％以下を有意差ありと判断した（図に表された符号は、以下の通りである。*；対照に対してＰ＜０．０５、**；対照に対してＰ＜０．０１）。用量-反応曲線は、曲線解析プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ３．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析し、５０％有効用量（５０％ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ：ＥＤ５０）とその９５％信頼限界を算出した。
【００５５】
図１にモルヒネを皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。モルヒネの皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現した。作用ピーク時間である皮下投与後３０分におけるＥＤ５０値は３．５６３（１．６５４−７．６７４）ｍｇ／ｋｇであった。モルヒネ５ｍｇ／ｋｇの皮下投与は、作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後９０分間持続した。
【００５６】
図２に実施例１のペプチド誘導体を皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。実施例１のペプチド誘導体の皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現し、作用ピーク時間である皮下投与後２０分におけるＥＤ５０値は３．１２３(２．７６０−３．５３４）ｍｇ／ｋｇであった。実施例１のペプチド誘導体１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与は作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後１２０分間持続した。
【００５７】
図３に実施例２のペプチド誘導体を皮下投与した場合の抗侵害作用の結果を示す。実施例２のペプチド誘導体の皮下投与により用量依存的かつ有意な抗侵害作用が発現した。実施例２のペプチド誘導体の作用ピーク時間である皮下投与後６０分におけるＥＤ５０値は５．６７６(２．３４３−１２．７５）ｍｇ／ｋｇであった。実施例２のペプチド誘導体１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与は作用ピーク時間において約８０％の抗侵害作用を示し、その作用は投与後１８０分間持続した。
【００５８】
上記のように、実施例１および実施例２のペプチド誘導体は皮下投与において熱侵害刺激に対する抗侵害作用を示した。約８０％の抗侵害作用を示す用量における作用持続時間はいずれのペプチドもモルヒネよりも持続的であり、特にＣ末端のカルボキシル基をアミド化した実施例２のペプチド誘導体においてより長い作用の持続が認められた。また、実施例１のペプチド誘導体では、モルヒネの場合に比べ、抗侵害作用が短時間に発現された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】モルヒネのｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【図２】Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ（実施例１）のｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【図３】Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−２’，６’−Ｄｍｐ−Ｍｅ−β−Ａｌａ−ＮＨ２（実施例２）のｄｄＹマウスへの皮下投与による抗侵害作用を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘ１がアミノ基である請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する鎮痛剤。
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（式中、アルギニン残基はＤ体であり、チロシン残基および２’６’−ジメチルフェニルアラニン残基はＬ体であり、Ｘ１は水酸基またはアミノ基を表す）で表されるペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘ１がアミノ基である請求項１記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する鎮痛剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２６１９５８（Ｐ２００７−２６１９５８Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８５９４９（Ｐ２００６−８５９４９）
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【出願人】（０００１６２８４７）ステラケミファ株式会社 (81)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２７日（２００６．３．２７）
【出願人】（０００１６２８４７）ステラケミファ株式会社 (81)
【Ｆターム（参考）】
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