ポリヌクレオチドをライゲーションするための、方法、反応混合物およびキット
本教示は、ポリヌクレオチドをライゲーションする方法、反応混合物およびキットに関する。幾つかの実施形態において、熱活性化可能なライゲーション剤、リン酸化剤および夾雑物除去剤が、少なくとも１組のプローブセット、少なくとも１組のリンカーセット、および少なくとも１種の標的ポリヌクレオチドと共に、同じ反応混合物中に含まれる。第１温度での反応は、標的へのプローブのハイブリダイゼーション、プローブのリン酸化、および不要な反応成分の除去をもたらす。第２温度での反応は、これらのプローブのライゲーションをもたらす。幾つかの実施形態において、本教示は、高度に多重なライゲーション反応に適用され、この高度に多重なライゲーションにおいて、複数の標的ポリヌクレオチドにおける複数の１ヌクレオチド多形が調べられ、最終的に移動度依存的分析技術を用いて検出される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、一般に、ポリヌクレオチドをライゲーションするための方法、キット、および反応混合物に関する。この教示はまた、ポリヌクレオチド配列を決定する（高度に多重化された反応において１ヌクレオチド多形を決定することを含む）ための、ライゲーションベースの方法、キットおよび組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
１以上の標的配列を含むサンプル中の１以上の標的ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在（またはその量）の検出が通常実施される。例えば、ガンおよび多くの感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎）の検出は、診断の核酸配列の存在もしくは非存在について生物学的サンプルをスクリーニングする工程を慣用的に包含する。また、核酸配列の存在もしくは非存在を検出する工程は、法医学、親子鑑定、遺伝子カウンセリングおよび器官移植においてしばしば使用される。
【０００３】
生物の遺伝子構造は、その生物のゲノム内に含まれる遺伝子によって決定される。遺伝子は、タンパク質を生成するために必要な情報をコードする長鎖すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーからなる。生物の特性、能力および形質は、多くの場合、その生物によって産生されているかまたは産生されていない、タンパク質の型および量に関連する。
【０００４】
タンパク質は、遺伝子から以下のように産生され得る。まず、タンパク質（例えば、タンパク質「Ｘ」）をコードするこの遺伝子のＤＮＡを表す情報は、「転写」として知られるプロセスによって、リボ核酸（ＲＮＡ）に変換される。転写の間、この遺伝子の一本鎖相補的ＲＮＡコピーが生成される。次に、このＲＮＡコピー（タンパク質ＸメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる）は、タンパク質Ｘを生成する細胞の生化学的機構（「翻訳」と呼ばれるプロセス）によって使用される。基本的に、細胞のタンパク質製造機構は、このｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡのコードを「読み取り」、そしてそれをタンパク質Ｘのアミノ酸配列に「翻訳」する。まとめると、ＤＮＡは、転写されてｍＲＮＡを生成し、このｍＲＮＡは翻訳されてタンパク質を生成する。
【０００５】
細胞によって生成されるタンパク質Ｘの量は、多くの場合、この細胞中に存在するタンパク質Ｘ ｍＲＮＡの量に大きく依存する。細胞内のタンパク質Ｘ ｍＲＮＡの量は、少なくとも部分的に、遺伝子Ｘが発現される程度に起因する。特定の遺伝子もしくは遺伝子改変体が存在するか否か、および存在する場合にいくつのコピー数が存在するかは、生物に大きな影響を有し得る。特定の遺伝子もしくは遺伝子改変体が発現されるか否か、および発現される場合にはどのレベルで発現されるかは、生物に大きな影響を有し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子標的の存在を、迅速に経済的な様式で、高処理かつ高い精度で測定し得る技術が、当該分野で必要とされる。迅速性は、多くの手段によって達成され得る。この手段としては、例えば、異なるサンプル操作工程の数を減らすこと、ならびに１より多い操作を同じ反応混合物中で実施することが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
幾つかの実施形態において、本教示は、ライゲーション反応におけるワークフロー工程の数を減らすための方法を提供し、この方法は、標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、リン酸化剤および夾雑物除去剤（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を提供し、それによって反応混合物を形成する工程を包含する。次に、上記リン酸化剤を第１温度で含むリン酸化反応を実施する工程、ならびに上記夾雑物除去剤をこの第１温度で含む夾雑物除去反応（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施する工程であって、ここで、上記リガーゼはこの第１温度で実質的に不活性である工程を包含する。次に、反応温度を第２温度まで上昇させ、それによってこのリガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに、上記第１プローブが上記第２プローブにライゲーションするライゲーション反応を実施する工程であって、それにより、リン酸化反応および夾雑物質除去反応がライゲーション反応とは別個の反応において実施されるライゲーション反応と比較して、ライゲーション反応における処理工程の数を減らす工程を包含する。
【０００８】
本教示の幾つかの実施形態は、熱活性化可能リガーゼ、リン酸化剤、夾雑物除去剤、標的ポリヌクレオチド、第１プローブおよび第２プローブを含む反応混合物を提供する。
【０００９】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットを提供し、ここで、このライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝剤を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（例示的な実施形態の説明）
本明細書中で使用される節の表題は、構成目的のみのためであり、記載される内容をいかなるようにも限定すると解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての文献および同様の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文およびインターネットウェブページが挙げられるが、これらに限定されない）は、明白にその全体が任意の目的のために参考として援用される。参考文献に援用される用語の定義が本教示において提供される定義と異なると考えられる場合、本教示において提供される定義が支配する。
【００１１】
上述の概説および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明でしかなく、本発明を限定しないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、文脈が特に他の指示をしない限り、複数形を含む。例えば、「プローブ（ａ ｐｒｏｂｅ）」は、１より多いプローブ（例えば、特定のプローブ種の１以上のコピー、ならびに特定のプローブ型の１種以上の種類）が存在し得ることを意味する。また、「または」の使用は、そうでないことを記載しない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定を意味しない。
【００１２】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「熱活性化可能リガーゼ」は、低温で実質的に不活性であり、活性化のためにより高い温度を必要とするリガーゼをいう。代表的に、熱活性化可能リガーゼは、およそ室温（２５℃）で実質的に不活性であり、より高い温度で活性化され得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「第１プローブ」は、ライゲーション反応におけるプローブをいい、この第１プローブは、連続してハイブリダイズされる第２プローブの５’末端にライゲーションされる遊離した３’末端を提供する。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「第２プローブ」は、ライゲーション反応におけるプローブをいい、この第２プローブは、連続してハイブリダイズされる第１プローブの３’末端にライゲーションされる遊離した５’末端を提供する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「リン酸化剤」は、リン酸基をプローブに付加し得る薬剤をいう。代表的に、リン酸化剤は、ポリヌクレオチドキナーゼである。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「夾雑物除去剤」は、夾雑反応成分を反応物から除去し得る薬剤をいう。代表的に、夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）またはウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。夾雑反応成分は、ウラシルを含むため、従って、夾雑反応成分をＵＮＧまたはＵＤＧによる分解を受けやすくする。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ライゲーション剤」は、２つのプローブをライゲーション反応において一緒にし得る薬剤をいう。代表的に、ライゲーション剤はリガーゼ酵素であるが、本教示に従って、任意の数の酵素的試薬または酵素でない試薬を含み得る。例えば、リガーゼは、酵素的ライゲーション試薬であり、適切な条件下で、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはハイブリッドにおける近接したヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸との間にホスホジエステル結合を形成する。温度感受性リガーゼとしては、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼとしては、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ種のＡＫ１６ＤリガーゼおよびＰｆｕリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、国際出願公開第ＷＯ００／２６３８１号、Ｗｕら，Ｇｅｎｅ，７６（２）：２４５−２５４，（１９８９），Ｌｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１５）：３０７１−３０７８（１９９６）を参照。当業者は、任意の数の熱安定性リガーゼ（ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼを含む）が、好熱性生物もしくは超好熱性生物（例えば、真性細菌および古細菌の特定の種）から得られ得、そしてこのようなリガーゼは、本開示の方法およびキットにおいて使用され得ることを、理解する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブセット」は、少なくとも１種の第２プローブおよび少なくとも１種の第２プローブをいい、このプローブセットは、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、そしてこれを調べることができる。多重反応において、複数の標的ポリヌクレオチドを調べるために、複数のプローブセットが使用される。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「リンカーセット」は、プローブセット中のプローブにライゲーション可能であり、そしてスペーサーおよびその後検出され得る配列情報を導入し得る、ポリヌクレオチドをいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」は、調べられ得る核酸の領域もしくは部分配列をいう。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、天然に存在する分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびに種々の誘導体およびアナログの両方をいう。一般に、本教示のプローブ、リンカーおよび標的ポリヌクレオチドは、核酸であり、代表的にＤＮＡを含む。当業者に理解されるように、さらなる誘導体およびアナログが、使用され得る。例えば、ユニバーサルヌクレオチドとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：デオキシ−７−アザインドール三リン酸（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリル三リン酸（ｄｌＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリル三リン酸（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドール三リン酸（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシｌｍＰｙ三リン酸（ｄｌｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰ三リン酸（ｄＰＰＴＰ）、またはデオキシプロピニル−７−アザインドール三リン酸（ｄＰ７ＡＩＴＰ）。さらなる例は、ユニバーサル塩基に関して、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１，ｖｏｌ ２９：２４３７−２４４７、Ｓｅｅｌａ Ｎ．Ａ．Ｒ．２０００，ｖｏｌ ２８：３２２４−３２３２、米国特許出願公開第１０／２９０６７２号および米国特許第６，４３３，１３４号において見出され得る。ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸に関する教示の例は、国際出願公開第ＷＯ９８／２２４８９号；国際出願公開第ＷＯ９８／３９３５２号；および国際出願公開第ＷＯ９９／１４２２６号において見出され得る。さらに、糖類は、２’−位もしくは３’−位において修飾を含み得る（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミド、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ）。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ立体配置異性体（Ｄ型）ならびにＬ立体配置異性体（Ｌ型）を含み得る（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ，米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ，ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。幾つかの実施形態において、リン酸エステルアナログの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニオチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ブロモホスフェートなど、ならびに、関連の対イオンを含み得る。他の核酸アナログおよび塩基としては、例えば、介在核酸（ＩＮＡ、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ，２００２に記載される）ならびにＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ，米国特許第５，４３２，２７２号）。種々の核酸アナログのさらなる記載はまた、例えば、以下においても見出され得る（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号。他の核酸アナログとしては、以下が挙げられる：ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１ １：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合物（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号，Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１ ９ ４）：ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第２章および第３章，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号、ならびにＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第６章および第７章，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編に記載されるものが挙げられる）。１以上の環状炭素糖類を含む核酸もまた、核酸の定義内に含まれ得る（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐｌ６９−１７６を参照）。ある種の核酸およびアナログもまた、Ｒａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ（１９９７年６月２日）３５ページに記載される。そうでないと記載されない限り、核酸配列が表される場合はいつでも、５’から３’への順番は左から右へであり、そうでないと記載されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが、理解される。さらに、本教示の「核酸」はまた、「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」を含み得る。ＰＮＡとしては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号および同第６，１０７，４７０号においてペプチド核酸と呼ばれるか、またはペプチド核酸として特許請求される、任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物に記載されるような核酸模倣物の２以上のサブ単位を含む任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントにも適用される：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ｔｅｔｔ Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；および、ＷＯ９６／０４０００に記載されるＳｈａｈらのペプチドベースの核酸模倣物（ＰＥＮＡＭ）。ＰＮＡはまた、米国特許出願第２００３／００７７６０８Ａ１号のパラグラフ７６において見出される、式の２以上の共有結合したサブ単位を含むオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントであり得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「増幅」は、少なくとも１種の標的ポリヌクレオチド、ライゲーション産物、少なくとも１種のライゲーション産物代替物もしくはこれらの組み合わせの少なくとも一部分が、代表的にはテンプレート依存性様式で複製される任意の手段をいう。これらの手段は、限定されないが、核酸配列を（一次的にかもしくは指数関数的に）増幅するための、広い範囲の技術を含む。増幅工程を実施するための例示的な手段としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、ライゲーションの後に行うＱ−レプリカーゼ増幅、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、超分枝鎖（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ）置換増幅、多重置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、２工程多重増幅、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）などが挙げられ、これらの多重バージョンおよびこれらの組み合わせ（例えば、以下に限定されないが、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応、ＣＣＲとしても知られる）など）を含む。このような技術の記載は、他でも見られるが、以下に見出され得る：ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）（「Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ」）；Ｍｓｕｉｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）（「Ｒａｐｌｅｙ」）；Ａｂｒａｍｓｏｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３ Ｆｅｂ；４（１）：４１−７，米国特許第６，０２７，９９８号；米国特許第６，６０５，４５１号，Ｂａｒａｎｙら，国際公開第ＷＯ９７／３１２５６号；Ｗｅｎｚら，国際公開第ＷＯ０１／９２５７９号；Ｄａｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５），Ｅｈｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；およびＲａｂｅｎａｕら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｂａｒａｎｙ，およびＬｕｂｉｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９５（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌにおいて利用可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔ．＃２００５２０，Ｒｅｖ．＃０５０００２，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００２；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３（１９９１）；ＢｉおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｒｖｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９）；Ｄｅａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）；ＢａｒａｎｙおよびＧｅｌｆａｎｄ，Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；Ｐｏｌｓｔｒａら，ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２）；Ｌａｇｅら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｆｅｂ；１３（２）：２９４−３０７，ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８），Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２ Ｎｏｖ；２（６）：５４２−８．，Ｃｏｏｋら，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｍａｙ；５３（２）：１６５−７４，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ ２月；１２（１）：２１−７、米国特許第５，８３０，７１１号、米国特許第６，０２７，８８９号、米国特許第５，６８６，２４３号，国際出願公開第ＷＯ００５６９２７Ａ３号，および国際出願公開第ＷＯ９８０３６７３Ａ１号。
【００２３】
幾つかの実施形態において、増幅は、少なくとも１サイクルの、以下の連続手順を包含する：少なくとも１つのライゲーション産物、少なくとも１つのライゲーション産物代替物もしくはこれらの組み合わせにおいて、少なくとも１つのプライマーと相補的配列もしくは実質的に相補的な配列とをハイブリダイズさせる工程；ポリメラーゼを用いて、少なくとも１本のヌクレオチド鎖をテンプレート依存的様式で合成する工程；ならびに、新しく形成された核酸二本鎖を変性させ、鎖を分離させる工程。このサイクルは、繰り返されても繰り返されなくてもよい。増幅は、熱サイクリングを含み得るか、もしくは等温的に実施され得る。幾つかの実施形態において、新しく形成された核酸二本鎖は、最初は変性されていないが、その後の１以上の工程において、二本鎖形態で使用され得る。
【００２４】
プライマー伸長は、増幅手段であり、５’から３’の方向でテンプレートにアニーリングされた少なくとも１つのプローブもしくは少なくとも１つのプライマーを、例えばポリメラーゼのような増幅手段を用いて伸長させる工程を包含する。幾つかの実施形態に従い、適切な緩衝剤、塩、ｐＨ、温度およびヌクレオチド三リン酸（そのアナログを含む）を用い、すなわち適切な条件下で、ポリメラーゼは、アニーリングしたプローブもしくはプライマーの３’末端から開始してテンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを組み込み、相補鎖を生成する。幾つかの実施形態において、プライマー伸長は、少なくとも１つの標的核酸配列の標的配列にハイブリダイズしたプローブセットの２つのプローブの間のギャップを埋めるために使用され得る。従って、２つのプローブは、互いにライゲーションされ得る。幾つかの実施形態において、プライマー伸長に使用されるポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、実質的に欠く。
【００２５】
本教示の幾つかの実施形態において、従来的でないヌクレオチド塩基が増幅反応産物内に組み込まれ得、そしてこの産物は、この産物をその後の増幅のテンプレートとして作用することができなくさせるために、酵素的手段（例えば、グリコシラーゼ）および／または物理化学的手段によって処理され得る。幾つかの実施形態において、ウラシルは、反応混合物中に核酸塩基として含まれ得、それによって、その後の反応のために、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用により上記ウラシル含有産物のキャリーオーバーを除去する（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）ことができる（例えば、国際出願公開第ＷＯ９２０１８１４Ａ２号を参照）。本教示の幾つかの実施形態において、種々の技術のうちのいずれかが、増幅の成功を促進するために増幅前に使用され得る（例えば、Ｒａｄｓｔｒｏｍら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ ２月；２６（２）：１３３−４６に記載される）。幾つかの実施形態において、増幅は、サンプル調製および検出を包含する自己含有組み込みアプローチ（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）において達成され得る（例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号において記載される）。
【００２６】
（検出）
ライゲーション産物もしくはライゲーション産物代替物の検出は、存在するにせよ本教示の限定ではないことが理解される。検出は、ドナー部分およびシグナル部分を用いることによって、幾つかの実施形態において達成され得、このライゲーション産物の検出のために、特定のエネルギー移動蛍光色素を使用することができる。ドナー（ドナー部分）およびアクセプター（シグナル部分）の対の特定の非限定例は、例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号において説明される。このようなドナーとアクセプターとの幾つかの組み合わせの使用は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ））とも呼ばれている。幾つかの実施形態において、シグナリングプローブとして使用され得るフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ローダミン、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、および６−ＦａｍＴＭは、全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）。幾つかの実施形態において、励起光に反応して蛍光シグナルを生じるシグナリングプローブの量は、代表的に、増幅反応において産生される核酸の量に関連する。従って、幾つかの実施形態において、蛍光シグナルの量は、増幅反応において生成される産物の量に関連する。このような実施形態において、従って、蛍光指示薬からの蛍光シグナルの強度を測定することによって、増幅産物の量を、測定することができる。幾つかの実施形態に従い、蛍光シグナルによって示される増幅産物を定量するために、内部標準を使用することができる。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号を参照。
【００２７】
幾つかの実施形態において、増幅されたライゲーション産物は、ＳＹＢＲグリーン１色素の臭化エチジウムのような、ＤＮＡ結合色素によって測定され得る。
【００２８】
蛍光指示薬を含む組成物を用いて熱サイクリング反応を実施し、特定の波長のビームを放出させ、蛍光色素の強度を読み取り、そして各サイクルの後に蛍光の強度を表示し得るデバイスが、開発されている。サーマルサイクラー、ビーム光放出器、および蛍光シグナル検出器を備えるデバイスが、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；および同第６，１７４，６７０号に記載され、これらのデバイスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ならびにＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００２９】
幾つかの実施形態において、これらの機能の各々は、別々のデバイスによって実施され得る。例えば、増幅のためにＱ−βレプリカーゼ反応を行う場合、この反応は、サーマルサイクラー内で起こらなくてもよいが、特定の波長でのビーム光放出、蛍光シグナルの検出および増幅産物量の計算および表示が含まれ得る。
【００３０】
幾つかの実施形態において、熱サイクリングと蛍光検出とを合わせたデバイスが、サンプル中の標的核酸の正確な定量のために使用され得る。幾つかの実施形態において、１以上の熱サイクルの間および／もしくは１以上の熱サイクルの後に、蛍光シグナルが検出されて表示され得、これによって反応が起こる「実時間」で増幅産物のモニタリングを可能にする。幾つかの実施形態において、増幅産物の量および増幅サイクルの数を使用して、増幅前のサンプル中に標的核酸配列がどのくらいの量で存在したかを計算できる。
【００３１】
幾つかの実施形態に従い、サンプル中の標的核酸配列の存在を示すために十分な所定のサイクル数の後に、増幅産物の量を単純にモニタリングすることができる。当業者は、任意の所定のサンプル、プライマー配列および反応条件について、所定の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するために何回のサイクルが十分であるかを、容易に決定することができる。
【００３２】
幾つかの実施形態に従い、増幅産物は、所定のサイクル数が完了したらすぐに、ポジティブもしくはネガティブとしてスコア付けされ得る。幾つかの実施形態において、結果は、電子的に直接データベースに伝達され得、作表され得る。従って、幾つかの実施形態において、多数のサンプルが、より短い時間およびより少ない労力しか要さずに、処理されそして分析され得る。
【００３３】
幾つかの実施形態に従い、異なるシグナリングプローブは、異なる標的核酸配列間を識別し得る。このようなプローブの非限定の例は、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子）であり、このプローブにおいて、蛍光分子は、オリゴヌクレオチド連結エレメントを介して、蛍光クエンチング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）分子に結合される。幾つかの実施形態において、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブのオリゴヌクレオチド連結エレメントは、同定部分の特定の配列もしくはその相補鎖に結合する。幾つかの実施形態において、異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（各々異なる波長の蛍光を発する）は、同じ増幅反応物中の異なる増幅産物間を識別し得る。例えば、幾つかの実施形態において、２つの異なるライゲーション産物（それぞれＡ’およびＢ’）の異なる２つの同定部位に特異的な、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）の蛍光を発する２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブを使用することができる。ライゲーション産物Ａ’は、標的化核酸Ａがサンプル中に存在する場合に形成され、そしてライゲーション産物Ｂ’は、標的化核酸Ｂがサンプル中に存在する場合に形成される。幾つかの実施形態において、ライゲーション産物Ａ’および／またはＢ’は、
適切な標的核酸がサンプル中に存在しない場合でさえも形成され得るが、このようなライゲーションは、適切な標的核酸配列がサンプル中に存在する場合よりも測定可能に少ない程度に起こる。増幅後、どの特定の標的核酸配列がサンプル中に存在するかを、検出されたシグナルの波長に基づいて決定することができる。従って、波長ＷＬＡのみの適切な検出可能シグナル値が検出される場合、このサンプルは、標的核酸配列Ａを含むが、標的核酸配列Ｂは含まないことが分かる。ＷＬＡおよびＷＬＢの両波長の適切な検出可能シグナル値が検出される場合、このサンプルは、標的核酸配列Ａおよび標的核酸配列Ｂの両方を含むことが分かる。
【００３４】
幾つかの実施形態において、融解曲線分析が、異なる標的核酸配列間を識別するために使用され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、ライゲーション産物もしくはライゲーション産物代替物は、移動度依存的分析技術によって検出され得る。この技術としては、異なる分析物種の間で異なる移動速度に基づく分析技術が挙げられる。例示的な移動度依存的分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、沈降度（ｓｅｄｉｍａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー（ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ）分画、多段階抽出技術などが挙げられる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、ライゲーション産物の検出は、キャピラリー電気泳動によって達成され得る。例えば、ライゲーション反応物中のプローブは、同定部分を含み得、そして増幅後、この同定部分に相補的な配列を含む移動度プローブが増幅産物にハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしなかった移動度プローブの除去後、結合した移動度プローブは、溶出されて、そして移動度依存的分析技術（例えば、キャピラリー電気泳動）によって検出され得る。キャピラリー電気泳動の検出および移動度プローブにおける技術の例については、例えば、米国特許第５，７７７，０９６号、同第６，６２４，８００号、同第５，４７０，７０５号、同第５，５１４，５４３号および同第６，３９５，４８６号を参照のこと。
【００３７】
本教示の局面は、以下の実施例を踏まえてさらに理解され得る。これらの実施例は、本教示の範囲をいかなるようにも限定しないと解釈されるべきである。
【００３８】
（例示的実施形態）
本教示は、種々の状況において、用途を見出し得る。例えば、本教示は、複数の標的ポリヌクレオチドを調べるために設計されたプローブを含む非常に多重のライゲーション反応において適用され得る。いくつかの実施形態において、複数の多重反応がマイクロタイタープレートにおいて実施され得る。マイクロタイタープレートを用いる研究の場合、多数の別個の多重反応の構成が、非常に時間集約的であり得る。例えば、反応成分（酵素、プローブ、緩衝剤など）を９６ウェルマイクロタイターディッシュの各ウェルに入れることは、時間集約的であり得る。複数のマクロタイターディッシュを含む状況において、これはより時間集約的であり得る。３８４ウェルマイクロタイタープレートが含まれる場合は、この状況が悪化し得ることが理解される。種々の化学的操作（例えば、リン酸化、不要な反応夾雑物の分解、ポリメラーゼ伸長およびライゲーション）を含む複合反応において、この状況が悪化し得ることが、さらに理解される。
【００３９】
従来のアプローチにおいて、このような時間集約的反応構成は、中途半端な、多くの場合非特異的なプローブライゲーションを生じ得る。本教示の幾つかの実施形態は、多重ライゲーション反応において、非特異的ライゲーションの量を減らすための方法を提供する。幾つかの実施形態において、非特異的ライゲーションの減少は、リン酸化されない（ライゲーション不能な）プローブを用いること、または熱活性化可能リガーゼを提供することによって達成され得る。熱活性化可能リガーゼは、低い温度において実質的に不活性であるという特性を有し得、実質的な活性を提供するために温度の上昇を要し得る。幾つかの実施形態において、多重反応構成は、低温（例えば、室温もしくは氷上）で起こり得る。構成後、反応温度は、リガーゼの実質的な活性を提供するために上昇され得る。幾つかの実施形態において、処理工程の減少は、下でさらに説明されるように、ライゲーション反応混合物へのさらなる酵素の提供によって達成され得る。幾つかの実施形態において、熱活性化可能酵素（例えば、熱活性化可能リガーゼ）は、以下でより明らかにされるように、さらなる酵素と共に使用され得る。
【００４０】
例えば、本教示の幾つかの実施形態は、熱活性化可能リガーゼおよび少なくとも１種のさらなる酵素を含むライゲーション反応物を提供する。本教示の幾つかの実施形態は、１つの反応混合物中で一緒にポリヌクレオチドをライゲーションする方法を提供する。この方法は、不要な夾雑物を夾雑物除去剤（例えば、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）によって除去する工程、リン酸化剤（例えば、キナーゼ）によってプローブをリン酸化する工程、およびライゲーション剤（例えば、リガーゼ）を用いて一緒にプローブをライゲーションする工程を包含し、ここで、このリガーゼは、第１の温度（リン酸化剤および夾雑物除去剤が活性である間）で実質的に不活性であり、そしてこのリガーゼは、第２の温度で実質的に活性である。幾つかの実施形態において、リン酸化剤および／または夾雑物除去剤は、第２の温度で不活性である。幾つかの実施形態において、反応は、熱活性化可能ライゲーション剤およびリン酸化剤を含み得るが、夾雑物除去剤を含まなくていよい。幾つかの実施形態において、反応は、熱活性化可能ライゲーション剤、夾雑物除去剤を含み得るが、リン酸化剤を含まなくてよい。
【００４１】
種々の熱活性化可能戦略が、本教示の状況において使用され得ることが理解される。例えば、熱活性化可能リン酸化剤は、ライゲーション剤および夾雑物除去剤をさらに含むライゲーション反応において使用され得る。このようなシナリオにおいて、プローブは、最初は５’リン酸基を欠く。結果として、リン酸化剤の活性化を可能にする（従ってプローブのリン酸化を可能にする）温度に達するまでライゲーションは起こり得ない。
【００４２】
また、種々の戦略が、酵素を熱活性化可能にするために使用され得ることが、理解される。このような手順は、最近の分子生物学研究室において慣用的であり、その実行は、過度の実験を全く必要としない。熱活性化可能酵素を作製するための種々のアプローチの代表的な教示が利用可能であり、そして以下が挙げられる：抗体アプローチ（例えば、米国特許第５，３３８，６７１号を参照）、例えば無水シトラコン酸を含む化学的アプローチ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および米国特許第５，６７７，１５２号を参照）、ホルムアルデヒドのようなアルデヒドを含む化学的アプローチ（例えば、米国特許第６，１８３，９９８号を参照）、ならびにアプタマーベースのアプローチ（例えば、米国特許第６，１８３，９６７号を参照）。熱活性化可能酵素を作製するためのさらなる方法は、沈殿物（例えば、米国特許出願公開第２００３００８２５６７Ａ１号を参照）を含む無機物熱活性化可能アプローチ、ならびに蝋（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版を参照）を含む無機物熱活性化可能アプローチが挙げられる。薬剤（例えば、酵素）が熱活性化可能特性を満たすように改変する様式は、本教示の限定ではないことが理解される。
【００４３】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーション反応における異なる試薬処理工程の数を減らすための方法を提供し、ここで、リガーゼは、熱活性化可能リガーゼではない。例えば、本教示の幾つかの実施形態は、１つの反応混合物中で一緒にポリヌクレオチドをライゲーションする工程を包含し、この工程は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼのような夾雑物除去剤によって不要な夾雑物を除去する工程、キナーゼのようなリン酸化剤によってプローブをリン酸化する工程、ならびに熱活性化可能でないリガーゼのようなライゲーション剤を用いて一緒にプローブをライゲーションする工程を、包含する。幾つかの実施形態において、反応は、ライゲーション剤およびリン酸化剤を含み得るが、夾雑物除去剤を含まなくてよい。幾つかの実施形態において、反応は、ライゲーション剤および夾雑物除去剤を含むが、リン酸化剤を含まなくてよい。
【００４４】
種々の夾雑物除去剤のどれもが本教示の文脈において使用され得ることが理解されるが、代表的には、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼが使用される。多くのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（例えば、アルトロバクター属またはミクロコッカス属のようなグラム陽性微生物から収集されたウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）が、利用可能である（例えば、米国特許第６，１８７，５７５号に記載されそしてＲｏｃｈｅからＡｍｐＥｒａｓｅとして購入可能である）。本教示において使用され得るグリコシラーゼの他の例としては、Ｅ．Ｃｏｌｉから単離され、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからＵＤＧとして市販されるウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼが挙げられる（例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．ら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３２８６−３２９４を参照）。一般に、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは夾雑物除去剤の種類は、本教示を限定しないことが理解される。
【００４５】
幾つかの実施形態において、夾雑反応成分は、前に実施されたライゲーション反応由来の産物であり、ここで、Ｕ含有プローブは、ライゲーション前、ＵＮＧに対する基質ではない。
【００４６】
幾つかの実施形態において、熱活性化可能ＵＮＧもしくは熱活性化可ＵＤＧが、企図される。例えば、熱活性化可能でないリガーゼは、熱活性化可能ＵＮＧと共に反応混合物中に存在し得る。適切な位置にウラシルを含むプローブを用いる場合、ＵＮＧを活性化するための反応温度の上昇は、ウラシルの切断をもたらし得、それにより、リガーゼが作用し得るプローブ上の遊離リン酸基を遊離させる。例えば、ウラシルは、第１プローブの５’末端に存在し得、そしてその切断は、ライゲーション能力のある（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）複合体を生じる。また、ウラシルを含むフラップ（ｆｌａｐ）は、切断されて、ライゲーション能力のある複合体を生じ得る。
【００４７】
種々のリン酸化剤のどれもが本教示の文脈において使用され得ることが理解されるが、代表的に、ポリヌクレオチドキナーゼが使用される。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼは、種々の供給源から購入可能であり、この供給原としては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｅｒｓｈａｍが挙げられる。さらに、５’末端の塩基に依存しないオリゴヌクレオチドの改善された均一なリン酸化を有するポリヌクレオチドキナーゼ、ならびにより高い標識化を提供するポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＯｐｔｉＫｉｎａｓｅを参照）もまた、本教示に従って使用され得る。一般に、ポリヌクレオチドキナーゼもしくはリン酸化剤の種類は、一般に本教示の限定ではないことが理解される。また、本教示に従い、リン酸化は、ポリヌクレオチドの５’末端へのリン酸基の付加をもたらす生化学的反応であり、これによって、このポリヌクレオチドを対応するポリヌクレオチドの３’ＯＨ基へのライゲーションに適するようにすることが理解される。
【００４８】
本教示は、標的ポリヌクレオチド配列の同一性を調べるためにライゲーション反応が使用される種々の状況において適用され得ることが理解される。例えば、種々のＯＬＡ戦略（例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｙら，米国特許第６，０５４，２６６号、米国特許第５，９６２，２２２号、米国特許第５，５２１，０６５号、米国特許第５，２４２，７９４号、米国特許第４，８８３，７５０号を参照）、ＦＥＮ−ＬＣＲ（例えば、Ｂｉら，米国特許第６，５１１，８１０号を参照）、南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，米国特許第５，８７１，９２１号を参照）、ライゲーションと増幅とを合わせた方法（例えば、Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇら，米国特許第６，１３０，０７３号および米国特許第５，９１２，１４８号を参照）、ＯＬＡ、ＬＤＲ、ＬＣＲのギャップバージョン、ならびに当業者に一般に公知のこのような戦略は、最新の総説から、当業者に公知である（Ｃａｏら，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１を参照のこと）。
【００４９】
本教示は、第１プローブおよび第２プローブのみが異なる分子である実施形態を企図するのではなく、第１プローブおよび第２プローブが同じ分子の一部分である実施形態もまた企図する（例えば、ＰａｒＡｌｌｅｌｅから購入可能である分子インバージョンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ）、および米国特許第５，８７１，９２１号）。
【００５０】
本教示は、種々のリンカーライゲーション戦略の状況において使用され得ることが理解される（例えば、米国非仮特許出願第１０／９８２，６１９号、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能であるＳＮＰｌｅｘＴＭＳｙｓｔｅｍ使用者マニュアルにおいて考察される）。このような戦略は、標的ポリヌクレオチド配列上での幾つかのプローブのコンカテマーライゲーションを使用し得る。これらおよび他の戦略（例えば、米国特許第６，０２７，８８９号を参照）もまた、ヌクレアーゼ媒介性消化により、組み込まれなかった反応成分を除去するための種々のアプローチを可能にし得るために使用され得る。
【００５１】
本教示は、種々のポジティブコントロールライゲーション反応およびネガティブライゲーション反応（既知の単一形の標的ポリヌクレオチドを含み、それによってライゲーション効率を決定することを可能にする）の状況において使用され得ることが理解される（例えば、Ｗｅｎｚらに対する米国仮特許出願第６０／５８４，８７３号、およびその優先権を主張する同時出願された非仮特許出願公開において記載される）。
【００５２】
幾つかの実施形態において、ライゲーション反応のためのマスター混合物は、以下を含む。
【００５３】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２５℃でｐＨ７．６
７ｍＭ ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ ＫＣｌ
０．１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＮＡＤ
２．５単位／μｌ 熱活性化可能リガーゼ
２単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
０．０１単位／μｌ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ
０．０５ｍＭ Ｄｅｓｆｅｒａｌ
１ｍＭ ｄＡＴＰ
５％ ＰＥＧ８０００。
【００５４】
幾つかの実施形態において、ＤＴＴが使用され得る。ＤＴＴは、本来、酵素の安定のための（スルフヒドリル）還元剤である。幾つかの実施形態において、ＴＣＥＰ Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌが、還元剤として使用され得（０．１〜２ｍＭ）、これはより効果的であり得、そしてより安定であり得る。
【００５５】
（本教示の幾つかの実施形態に従う例示的キット）
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法の実施を促進するために設計されたキットを提供する。幾つかの実施形態において、キットは、方法の実施において使用される２以上の成分を組合わせることによって、目的の方法の性能を高めるのに役立つ。幾つかの実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要を最小限にするために、事前に測定された単位量の成分を含み得る。幾つかの実施形態において、キットは、１以上の本教示の方法を実施するための指示書を含み得る。幾つかの実施形態において、キット成分は、互いに協同して操作するために最適化される。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドをライゲーションするためのキットを提供する。本教示によって企図される例示的なキット構成について、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能であるＳＮＰｌｅｘＴＭＳｙｓｔｅｍ使用者マニュアルを調べることを読み手に奨励する。
【００５７】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットを提供する。ここで、このライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝剤を含む。幾つかの実施形態において、キットは、少なくとも１組のリンカーセットをさらに含む。幾つかの実施形態において、リン酸化剤は、キナーゼである。幾つかの実施形態において、このキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。幾つかの実施形態において、夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである。幾つかの実施形態において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである。幾つかの実施形態において、熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである。幾つかの実施形態において、このリガーゼは熱活性化可能リガーゼではない。幾つかの実施形態において、リン酸化剤および／または夾雑物除去剤は、熱活性化可能である。
【００５８】
幾つかの実施形態において、このキットは、例えばＰａｒＡｌｌｅｌｅから購入可能である分子インバージョンプローブにおいて説明されるように、例えば、ミスマッチ修復において使用されるポリメラーゼを含み得る（米国特許第５，８７１，９２１号もまた参照）。幾つかの実施形態において、このポリメラーゼは、熱活性化可能ポリメラーゼである。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
実施例１は、熱活性化可能リガーゼ、ウラシル−ＮグリコシラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含むライゲーション反応混合物によって多重ライゲーション反応が実施される、本教示の説明を提供する。この実験のワークフローを、図３に図示する。１ヌクレオチド多形の収集のためのホモ接合性対立遺伝子およびヘテロ接合性対立遺伝子の首尾よい決定を、夾雑物除去剤を含む反応について、夾雑物除去剤を欠く反応と比較して見出した。
【００６０】
プロトコールは、基本的に、以下である：
ゲノムＤＮＡを、煮沸によって断片化し、定量し、そして３８４ウェル光学プレート中に３７ｎｇ／ウェルを分配し、そして乾燥させた。
【００６１】
室温で、マスター混合物をピペッティングした。この混合物は、以下を含んだ：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２５℃でｐｈ７．６
７ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＮＡＤ
５単位／μｌ 熱活性化可能リガーゼ
０．１単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
０．０１単位／μｌ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（また、ＵＮＧを含まないコントロール反応を実施した）
０．０５ｍＭ Ｄｅｓｆｅｒａｌ
１．２５ｍＭ ｄＡＴＰ
５％ ＰＥＧ８０００。
【００６２】
室温において、５μｌのプローブ（各１００ｎＭ）およびリンカー（各５０ｎＭのＡＳＯ（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）リンカーおよび各８５ｎＭのＬＳＯ（遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド）リンカー）を、Ｈｙｄｒａ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｏｎｅロボットを使用して３８４ウェル光学プレートの各ウェルにピペット分配した。
【００６３】
マスター混合物（１つの反応につき４．５μｌ）を、Ｈｙｄｒａ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｏｎｅロボットを使用して３８４ウェル光学プレートの各ウェルにピペット分配した。
【００６４】
ライゲーション反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ファームウェア３．０５）上で、以下のサイクリング条件で実施した：
工程 工程型 温度（℃） 時間
１ 維持 ３７ ６０分間
２ 維持 ８５ ３０分間
２ ３０サイクル ９０ １５秒間
６０ ３０秒間
５１（２％傾斜で） ３０秒間
３ 維持 ９９ １０分間
４ 維持 ４ 無期限維持。
【００６５】
次いで、エキソヌクレアーゼ浄化を実施した。これは、以下を含んだ：
各反応につき：
４．２μｌ ヌクレアーゼ非含有水
０．５μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ エキソヌクレアーゼ緩衝剤
０．２μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ λエキソヌクレアーゼ
０．１μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ エキソヌクレアーゼ １
５μｌ ライゲーション反応物、
３７℃で９０分間、その後８０℃で１０分間。
【００６６】
エキソヌクレアーゼ浄化の後、１０μｌの水を各反応物に添加し、そしてライゲーション反応のＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ ３８４−ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 製品番号４３０９８４９）中で、ＡＢＩ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ（製品番号４３１１９７１）を用いて実施した。
【００６７】
まず、以下を含む２０×ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー混合物を作製した：
１０μＭ ユニバーサル順方向プライマー（ＵＦ １９）
１０μＭ ビオチン化ユニバーサル逆方向プライマー（ＵＲ １９）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５℃でｐＨ８．０
１ｍＭ ＥＤＴＡ。
【００６８】
次いで、複数の１０μｌのＰＣＲ反応物を、以下のように構成した：
５．０μｌ ２×ＳＮＰｌｅｘＴＭ ＰＣＲ混合物
０．５μｌ ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー混合物（上記から）
２．５μｌ Ｈ２Ｏ
２．０μｌ ヌクレアーゼ処理済みライゲーション反応物。
【００６９】
ＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００上で、以下のサイクリング条件で実施した：
工程 工程型 温度（℃） 時間
１ 維持 ９５ １０分間
２ ３０サイクル ９５ １５秒間
７０ ６０秒間
３ 維持 ４ 無期限維持
ＰＣＲ後、ビオチン化鎖を捕捉して分離し、そして移動度プローブを、固定化した鎖にハイブリダイズした。次いで、溶離した移動度プローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０上のキャピラリー電気泳動を介して検出した。
【００７０】
記載のように実施した４７重実験から得られたデータを表すクラスタープロットは、本方法の有効性を実証した（プロットは示さず）。
【００７１】
本教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者は、これらの例示的実施形態の多くの変更および改変が、過度の実験なしで可能であることを、容易に理解する。全てのこのような変更および改変は、本教示の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本教示に従う幾つかのワークフロー特性の図解を提供する。ここで、複数の異なる反応は、別個の反応容器中で実施される。
【図２】図２は、本教示に従う幾つかのワークフロー特性の図解を提供する。ここで、複数の異なる反応は、同じ反応容器中で実施される。
【図３−１】図３は、本教示の実施例１に従う反応工程の図解を提供する。ここで、１ヌクレオチド多形の同一性が、調べられる。第１プローブ１および第１プローブ２は、ＡＳＯａ１およびＡＳＯａ２（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド１および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド２）として示され、第２プローブは、ＬＳＯ（遺伝子座特異的オリゴ）として示され、そして移動度プローブは、Ｚｉｐｃｈｕｔｅプローブと称される。
【図３−２】（図３−１の続き）
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、一般に、ポリヌクレオチドをライゲーションするための方法、キット、および反応混合物に関する。この教示はまた、ポリヌクレオチド配列を決定する（高度に多重化された反応において１ヌクレオチド多形を決定することを含む）ための、ライゲーションベースの方法、キットおよび組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
１以上の標的配列を含むサンプル中の１以上の標的ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在（またはその量）の検出が通常実施される。例えば、ガンおよび多くの感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎）の検出は、診断の核酸配列の存在もしくは非存在について生物学的サンプルをスクリーニングする工程を慣用的に包含する。また、核酸配列の存在もしくは非存在を検出する工程は、法医学、親子鑑定、遺伝子カウンセリングおよび器官移植においてしばしば使用される。
【０００３】
生物の遺伝子構造は、その生物のゲノム内に含まれる遺伝子によって決定される。遺伝子は、タンパク質を生成するために必要な情報をコードする長鎖すなわちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーからなる。生物の特性、能力および形質は、多くの場合、その生物によって産生されているかまたは産生されていない、タンパク質の型および量に関連する。
【０００４】
タンパク質は、遺伝子から以下のように産生され得る。まず、タンパク質（例えば、タンパク質「Ｘ」）をコードするこの遺伝子のＤＮＡを表す情報は、「転写」として知られるプロセスによって、リボ核酸（ＲＮＡ）に変換される。転写の間、この遺伝子の一本鎖相補的ＲＮＡコピーが生成される。次に、このＲＮＡコピー（タンパク質ＸメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる）は、タンパク質Ｘを生成する細胞の生化学的機構（「翻訳」と呼ばれるプロセス）によって使用される。基本的に、細胞のタンパク質製造機構は、このｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡのコードを「読み取り」、そしてそれをタンパク質Ｘのアミノ酸配列に「翻訳」する。まとめると、ＤＮＡは、転写されてｍＲＮＡを生成し、このｍＲＮＡは翻訳されてタンパク質を生成する。
【０００５】
細胞によって生成されるタンパク質Ｘの量は、多くの場合、この細胞中に存在するタンパク質Ｘ ｍＲＮＡの量に大きく依存する。細胞内のタンパク質Ｘ ｍＲＮＡの量は、少なくとも部分的に、遺伝子Ｘが発現される程度に起因する。特定の遺伝子もしくは遺伝子改変体が存在するか否か、および存在する場合にいくつのコピー数が存在するかは、生物に大きな影響を有し得る。特定の遺伝子もしくは遺伝子改変体が発現されるか否か、および発現される場合にはどのレベルで発現されるかは、生物に大きな影響を有し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子標的の存在を、迅速に経済的な様式で、高処理かつ高い精度で測定し得る技術が、当該分野で必要とされる。迅速性は、多くの手段によって達成され得る。この手段としては、例えば、異なるサンプル操作工程の数を減らすこと、ならびに１より多い操作を同じ反応混合物中で実施することが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
幾つかの実施形態において、本教示は、ライゲーション反応におけるワークフロー工程の数を減らすための方法を提供し、この方法は、標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、リン酸化剤および夾雑物除去剤（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を提供し、それによって反応混合物を形成する工程を包含する。次に、上記リン酸化剤を第１温度で含むリン酸化反応を実施する工程、ならびに上記夾雑物除去剤をこの第１温度で含む夾雑物除去反応（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施する工程であって、ここで、上記リガーゼはこの第１温度で実質的に不活性である工程を包含する。次に、反応温度を第２温度まで上昇させ、それによってこのリガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに、上記第１プローブが上記第２プローブにライゲーションするライゲーション反応を実施する工程であって、それにより、リン酸化反応および夾雑物質除去反応がライゲーション反応とは別個の反応において実施されるライゲーション反応と比較して、ライゲーション反応における処理工程の数を減らす工程を包含する。
【０００８】
本教示の幾つかの実施形態は、熱活性化可能リガーゼ、リン酸化剤、夾雑物除去剤、標的ポリヌクレオチド、第１プローブおよび第２プローブを含む反応混合物を提供する。
【０００９】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットを提供し、ここで、このライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝剤を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（例示的な実施形態の説明）
本明細書中で使用される節の表題は、構成目的のみのためであり、記載される内容をいかなるようにも限定すると解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての文献および同様の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文およびインターネットウェブページが挙げられるが、これらに限定されない）は、明白にその全体が任意の目的のために参考として援用される。参考文献に援用される用語の定義が本教示において提供される定義と異なると考えられる場合、本教示において提供される定義が支配する。
【００１１】
上述の概説および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明でしかなく、本発明を限定しないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、文脈が特に他の指示をしない限り、複数形を含む。例えば、「プローブ（ａ ｐｒｏｂｅ）」は、１より多いプローブ（例えば、特定のプローブ種の１以上のコピー、ならびに特定のプローブ型の１種以上の種類）が存在し得ることを意味する。また、「または」の使用は、そうでないことを記載しない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定を意味しない。
【００１２】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「熱活性化可能リガーゼ」は、低温で実質的に不活性であり、活性化のためにより高い温度を必要とするリガーゼをいう。代表的に、熱活性化可能リガーゼは、およそ室温（２５℃）で実質的に不活性であり、より高い温度で活性化され得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「第１プローブ」は、ライゲーション反応におけるプローブをいい、この第１プローブは、連続してハイブリダイズされる第２プローブの５’末端にライゲーションされる遊離した３’末端を提供する。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「第２プローブ」は、ライゲーション反応におけるプローブをいい、この第２プローブは、連続してハイブリダイズされる第１プローブの３’末端にライゲーションされる遊離した５’末端を提供する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「リン酸化剤」は、リン酸基をプローブに付加し得る薬剤をいう。代表的に、リン酸化剤は、ポリヌクレオチドキナーゼである。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「夾雑物除去剤」は、夾雑反応成分を反応物から除去し得る薬剤をいう。代表的に、夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）またはウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。夾雑反応成分は、ウラシルを含むため、従って、夾雑反応成分をＵＮＧまたはＵＤＧによる分解を受けやすくする。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ライゲーション剤」は、２つのプローブをライゲーション反応において一緒にし得る薬剤をいう。代表的に、ライゲーション剤はリガーゼ酵素であるが、本教示に従って、任意の数の酵素的試薬または酵素でない試薬を含み得る。例えば、リガーゼは、酵素的ライゲーション試薬であり、適切な条件下で、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはハイブリッドにおける近接したヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸との間にホスホジエステル結合を形成する。温度感受性リガーゼとしては、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼとしては、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ種のＡＫ１６ＤリガーゼおよびＰｆｕリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、国際出願公開第ＷＯ００／２６３８１号、Ｗｕら，Ｇｅｎｅ，７６（２）：２４５−２５４，（１９８９），Ｌｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１５）：３０７１−３０７８（１９９６）を参照。当業者は、任意の数の熱安定性リガーゼ（ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼを含む）が、好熱性生物もしくは超好熱性生物（例えば、真性細菌および古細菌の特定の種）から得られ得、そしてこのようなリガーゼは、本開示の方法およびキットにおいて使用され得ることを、理解する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブセット」は、少なくとも１種の第２プローブおよび少なくとも１種の第２プローブをいい、このプローブセットは、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、そしてこれを調べることができる。多重反応において、複数の標的ポリヌクレオチドを調べるために、複数のプローブセットが使用される。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「リンカーセット」は、プローブセット中のプローブにライゲーション可能であり、そしてスペーサーおよびその後検出され得る配列情報を導入し得る、ポリヌクレオチドをいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」は、調べられ得る核酸の領域もしくは部分配列をいう。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、天然に存在する分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびに種々の誘導体およびアナログの両方をいう。一般に、本教示のプローブ、リンカーおよび標的ポリヌクレオチドは、核酸であり、代表的にＤＮＡを含む。当業者に理解されるように、さらなる誘導体およびアナログが、使用され得る。例えば、ユニバーサルヌクレオチドとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：デオキシ−７−アザインドール三リン酸（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリル三リン酸（ｄｌＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリル三リン酸（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドール三リン酸（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシｌｍＰｙ三リン酸（ｄｌｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰ三リン酸（ｄＰＰＴＰ）、またはデオキシプロピニル−７−アザインドール三リン酸（ｄＰ７ＡＩＴＰ）。さらなる例は、ユニバーサル塩基に関して、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１，ｖｏｌ ２９：２４３７−２４４７、Ｓｅｅｌａ Ｎ．Ａ．Ｒ．２０００，ｖｏｌ ２８：３２２４−３２３２、米国特許出願公開第１０／２９０６７２号および米国特許第６，４３３，１３４号において見出され得る。ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸に関する教示の例は、国際出願公開第ＷＯ９８／２２４８９号；国際出願公開第ＷＯ９８／３９３５２号；および国際出願公開第ＷＯ９９／１４２２６号において見出され得る。さらに、糖類は、２’−位もしくは３’−位において修飾を含み得る（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミド、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ）。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ立体配置異性体（Ｄ型）ならびにＬ立体配置異性体（Ｌ型）を含み得る（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ，米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ，ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。幾つかの実施形態において、リン酸エステルアナログの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニオチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ブロモホスフェートなど、ならびに、関連の対イオンを含み得る。他の核酸アナログおよび塩基としては、例えば、介在核酸（ＩＮＡ、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ，２００２に記載される）ならびにＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ，米国特許第５，４３２，２７２号）。種々の核酸アナログのさらなる記載はまた、例えば、以下においても見出され得る（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号。他の核酸アナログとしては、以下が挙げられる：ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１ １：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合物（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号，Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１ ９ ４）：ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第２章および第３章，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号、ならびにＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第６章および第７章，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編に記載されるものが挙げられる）。１以上の環状炭素糖類を含む核酸もまた、核酸の定義内に含まれ得る（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐｌ６９−１７６を参照）。ある種の核酸およびアナログもまた、Ｒａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ（１９９７年６月２日）３５ページに記載される。そうでないと記載されない限り、核酸配列が表される場合はいつでも、５’から３’への順番は左から右へであり、そうでないと記載されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが、理解される。さらに、本教示の「核酸」はまた、「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」を含み得る。ＰＮＡとしては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号および同第６，１０７，４７０号においてペプチド核酸と呼ばれるか、またはペプチド核酸として特許請求される、任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物に記載されるような核酸模倣物の２以上のサブ単位を含む任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントにも適用される：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ｔｅｔｔ Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；および、ＷＯ９６／０４０００に記載されるＳｈａｈらのペプチドベースの核酸模倣物（ＰＥＮＡＭ）。ＰＮＡはまた、米国特許出願第２００３／００７７６０８Ａ１号のパラグラフ７６において見出される、式の２以上の共有結合したサブ単位を含むオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントであり得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「増幅」は、少なくとも１種の標的ポリヌクレオチド、ライゲーション産物、少なくとも１種のライゲーション産物代替物もしくはこれらの組み合わせの少なくとも一部分が、代表的にはテンプレート依存性様式で複製される任意の手段をいう。これらの手段は、限定されないが、核酸配列を（一次的にかもしくは指数関数的に）増幅するための、広い範囲の技術を含む。増幅工程を実施するための例示的な手段としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、ライゲーションの後に行うＱ−レプリカーゼ増幅、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、超分枝鎖（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ）置換増幅、多重置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、２工程多重増幅、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）などが挙げられ、これらの多重バージョンおよびこれらの組み合わせ（例えば、以下に限定されないが、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応、ＣＣＲとしても知られる）など）を含む。このような技術の記載は、他でも見られるが、以下に見出され得る：ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）（「Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ」）；Ｍｓｕｉｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）（「Ｒａｐｌｅｙ」）；Ａｂｒａｍｓｏｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３ Ｆｅｂ；４（１）：４１−７，米国特許第６，０２７，９９８号；米国特許第６，６０５，４５１号，Ｂａｒａｎｙら，国際公開第ＷＯ９７／３１２５６号；Ｗｅｎｚら，国際公開第ＷＯ０１／９２５７９号；Ｄａｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５），Ｅｈｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；およびＲａｂｅｎａｕら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｂａｒａｎｙ，およびＬｕｂｉｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９５（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌにおいて利用可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔ．＃２００５２０，Ｒｅｖ．＃０５０００２，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００２；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３（１９９１）；ＢｉおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｒｖｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９）；Ｄｅａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）；ＢａｒａｎｙおよびＧｅｌｆａｎｄ，Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；Ｐｏｌｓｔｒａら，ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２）；Ｌａｇｅら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｆｅｂ；１３（２）：２９４−３０７，ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８），Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２ Ｎｏｖ；２（６）：５４２−８．，Ｃｏｏｋら，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｍａｙ；５３（２）：１６５−７４，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ ２月；１２（１）：２１−７、米国特許第５，８３０，７１１号、米国特許第６，０２７，８８９号、米国特許第５，６８６，２４３号，国際出願公開第ＷＯ００５６９２７Ａ３号，および国際出願公開第ＷＯ９８０３６７３Ａ１号。
【００２３】
幾つかの実施形態において、増幅は、少なくとも１サイクルの、以下の連続手順を包含する：少なくとも１つのライゲーション産物、少なくとも１つのライゲーション産物代替物もしくはこれらの組み合わせにおいて、少なくとも１つのプライマーと相補的配列もしくは実質的に相補的な配列とをハイブリダイズさせる工程；ポリメラーゼを用いて、少なくとも１本のヌクレオチド鎖をテンプレート依存的様式で合成する工程；ならびに、新しく形成された核酸二本鎖を変性させ、鎖を分離させる工程。このサイクルは、繰り返されても繰り返されなくてもよい。増幅は、熱サイクリングを含み得るか、もしくは等温的に実施され得る。幾つかの実施形態において、新しく形成された核酸二本鎖は、最初は変性されていないが、その後の１以上の工程において、二本鎖形態で使用され得る。
【００２４】
プライマー伸長は、増幅手段であり、５’から３’の方向でテンプレートにアニーリングされた少なくとも１つのプローブもしくは少なくとも１つのプライマーを、例えばポリメラーゼのような増幅手段を用いて伸長させる工程を包含する。幾つかの実施形態に従い、適切な緩衝剤、塩、ｐＨ、温度およびヌクレオチド三リン酸（そのアナログを含む）を用い、すなわち適切な条件下で、ポリメラーゼは、アニーリングしたプローブもしくはプライマーの３’末端から開始してテンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを組み込み、相補鎖を生成する。幾つかの実施形態において、プライマー伸長は、少なくとも１つの標的核酸配列の標的配列にハイブリダイズしたプローブセットの２つのプローブの間のギャップを埋めるために使用され得る。従って、２つのプローブは、互いにライゲーションされ得る。幾つかの実施形態において、プライマー伸長に使用されるポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、実質的に欠く。
【００２５】
本教示の幾つかの実施形態において、従来的でないヌクレオチド塩基が増幅反応産物内に組み込まれ得、そしてこの産物は、この産物をその後の増幅のテンプレートとして作用することができなくさせるために、酵素的手段（例えば、グリコシラーゼ）および／または物理化学的手段によって処理され得る。幾つかの実施形態において、ウラシルは、反応混合物中に核酸塩基として含まれ得、それによって、その後の反応のために、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用により上記ウラシル含有産物のキャリーオーバーを除去する（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）ことができる（例えば、国際出願公開第ＷＯ９２０１８１４Ａ２号を参照）。本教示の幾つかの実施形態において、種々の技術のうちのいずれかが、増幅の成功を促進するために増幅前に使用され得る（例えば、Ｒａｄｓｔｒｏｍら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ ２月；２６（２）：１３３−４６に記載される）。幾つかの実施形態において、増幅は、サンプル調製および検出を包含する自己含有組み込みアプローチ（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）において達成され得る（例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号において記載される）。
【００２６】
（検出）
ライゲーション産物もしくはライゲーション産物代替物の検出は、存在するにせよ本教示の限定ではないことが理解される。検出は、ドナー部分およびシグナル部分を用いることによって、幾つかの実施形態において達成され得、このライゲーション産物の検出のために、特定のエネルギー移動蛍光色素を使用することができる。ドナー（ドナー部分）およびアクセプター（シグナル部分）の対の特定の非限定例は、例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号において説明される。このようなドナーとアクセプターとの幾つかの組み合わせの使用は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ））とも呼ばれている。幾つかの実施形態において、シグナリングプローブとして使用され得るフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ローダミン、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、および６−ＦａｍＴＭは、全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）。幾つかの実施形態において、励起光に反応して蛍光シグナルを生じるシグナリングプローブの量は、代表的に、増幅反応において産生される核酸の量に関連する。従って、幾つかの実施形態において、蛍光シグナルの量は、増幅反応において生成される産物の量に関連する。このような実施形態において、従って、蛍光指示薬からの蛍光シグナルの強度を測定することによって、増幅産物の量を、測定することができる。幾つかの実施形態に従い、蛍光シグナルによって示される増幅産物を定量するために、内部標準を使用することができる。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号を参照。
【００２７】
幾つかの実施形態において、増幅されたライゲーション産物は、ＳＹＢＲグリーン１色素の臭化エチジウムのような、ＤＮＡ結合色素によって測定され得る。
【００２８】
蛍光指示薬を含む組成物を用いて熱サイクリング反応を実施し、特定の波長のビームを放出させ、蛍光色素の強度を読み取り、そして各サイクルの後に蛍光の強度を表示し得るデバイスが、開発されている。サーマルサイクラー、ビーム光放出器、および蛍光シグナル検出器を備えるデバイスが、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；および同第６，１７４，６７０号に記載され、これらのデバイスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ならびにＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００２９】
幾つかの実施形態において、これらの機能の各々は、別々のデバイスによって実施され得る。例えば、増幅のためにＱ−βレプリカーゼ反応を行う場合、この反応は、サーマルサイクラー内で起こらなくてもよいが、特定の波長でのビーム光放出、蛍光シグナルの検出および増幅産物量の計算および表示が含まれ得る。
【００３０】
幾つかの実施形態において、熱サイクリングと蛍光検出とを合わせたデバイスが、サンプル中の標的核酸の正確な定量のために使用され得る。幾つかの実施形態において、１以上の熱サイクルの間および／もしくは１以上の熱サイクルの後に、蛍光シグナルが検出されて表示され得、これによって反応が起こる「実時間」で増幅産物のモニタリングを可能にする。幾つかの実施形態において、増幅産物の量および増幅サイクルの数を使用して、増幅前のサンプル中に標的核酸配列がどのくらいの量で存在したかを計算できる。
【００３１】
幾つかの実施形態に従い、サンプル中の標的核酸配列の存在を示すために十分な所定のサイクル数の後に、増幅産物の量を単純にモニタリングすることができる。当業者は、任意の所定のサンプル、プライマー配列および反応条件について、所定の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するために何回のサイクルが十分であるかを、容易に決定することができる。
【００３２】
幾つかの実施形態に従い、増幅産物は、所定のサイクル数が完了したらすぐに、ポジティブもしくはネガティブとしてスコア付けされ得る。幾つかの実施形態において、結果は、電子的に直接データベースに伝達され得、作表され得る。従って、幾つかの実施形態において、多数のサンプルが、より短い時間およびより少ない労力しか要さずに、処理されそして分析され得る。
【００３３】
幾つかの実施形態に従い、異なるシグナリングプローブは、異なる標的核酸配列間を識別し得る。このようなプローブの非限定の例は、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子）であり、このプローブにおいて、蛍光分子は、オリゴヌクレオチド連結エレメントを介して、蛍光クエンチング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）分子に結合される。幾つかの実施形態において、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブのオリゴヌクレオチド連結エレメントは、同定部分の特定の配列もしくはその相補鎖に結合する。幾つかの実施形態において、異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（各々異なる波長の蛍光を発する）は、同じ増幅反応物中の異なる増幅産物間を識別し得る。例えば、幾つかの実施形態において、２つの異なるライゲーション産物（それぞれＡ’およびＢ’）の異なる２つの同定部位に特異的な、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）の蛍光を発する２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブを使用することができる。ライゲーション産物Ａ’は、標的化核酸Ａがサンプル中に存在する場合に形成され、そしてライゲーション産物Ｂ’は、標的化核酸Ｂがサンプル中に存在する場合に形成される。幾つかの実施形態において、ライゲーション産物Ａ’および／またはＢ’は、
適切な標的核酸がサンプル中に存在しない場合でさえも形成され得るが、このようなライゲーションは、適切な標的核酸配列がサンプル中に存在する場合よりも測定可能に少ない程度に起こる。増幅後、どの特定の標的核酸配列がサンプル中に存在するかを、検出されたシグナルの波長に基づいて決定することができる。従って、波長ＷＬＡのみの適切な検出可能シグナル値が検出される場合、このサンプルは、標的核酸配列Ａを含むが、標的核酸配列Ｂは含まないことが分かる。ＷＬＡおよびＷＬＢの両波長の適切な検出可能シグナル値が検出される場合、このサンプルは、標的核酸配列Ａおよび標的核酸配列Ｂの両方を含むことが分かる。
【００３４】
幾つかの実施形態において、融解曲線分析が、異なる標的核酸配列間を識別するために使用され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、ライゲーション産物もしくはライゲーション産物代替物は、移動度依存的分析技術によって検出され得る。この技術としては、異なる分析物種の間で異なる移動速度に基づく分析技術が挙げられる。例示的な移動度依存的分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、沈降度（ｓｅｄｉｍａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー（ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ）分画、多段階抽出技術などが挙げられる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、ライゲーション産物の検出は、キャピラリー電気泳動によって達成され得る。例えば、ライゲーション反応物中のプローブは、同定部分を含み得、そして増幅後、この同定部分に相補的な配列を含む移動度プローブが増幅産物にハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしなかった移動度プローブの除去後、結合した移動度プローブは、溶出されて、そして移動度依存的分析技術（例えば、キャピラリー電気泳動）によって検出され得る。キャピラリー電気泳動の検出および移動度プローブにおける技術の例については、例えば、米国特許第５，７７７，０９６号、同第６，６２４，８００号、同第５，４７０，７０５号、同第５，５１４，５４３号および同第６，３９５，４８６号を参照のこと。
【００３７】
本教示の局面は、以下の実施例を踏まえてさらに理解され得る。これらの実施例は、本教示の範囲をいかなるようにも限定しないと解釈されるべきである。
【００３８】
（例示的実施形態）
本教示は、種々の状況において、用途を見出し得る。例えば、本教示は、複数の標的ポリヌクレオチドを調べるために設計されたプローブを含む非常に多重のライゲーション反応において適用され得る。いくつかの実施形態において、複数の多重反応がマイクロタイタープレートにおいて実施され得る。マイクロタイタープレートを用いる研究の場合、多数の別個の多重反応の構成が、非常に時間集約的であり得る。例えば、反応成分（酵素、プローブ、緩衝剤など）を９６ウェルマイクロタイターディッシュの各ウェルに入れることは、時間集約的であり得る。複数のマクロタイターディッシュを含む状況において、これはより時間集約的であり得る。３８４ウェルマイクロタイタープレートが含まれる場合は、この状況が悪化し得ることが理解される。種々の化学的操作（例えば、リン酸化、不要な反応夾雑物の分解、ポリメラーゼ伸長およびライゲーション）を含む複合反応において、この状況が悪化し得ることが、さらに理解される。
【００３９】
従来のアプローチにおいて、このような時間集約的反応構成は、中途半端な、多くの場合非特異的なプローブライゲーションを生じ得る。本教示の幾つかの実施形態は、多重ライゲーション反応において、非特異的ライゲーションの量を減らすための方法を提供する。幾つかの実施形態において、非特異的ライゲーションの減少は、リン酸化されない（ライゲーション不能な）プローブを用いること、または熱活性化可能リガーゼを提供することによって達成され得る。熱活性化可能リガーゼは、低い温度において実質的に不活性であるという特性を有し得、実質的な活性を提供するために温度の上昇を要し得る。幾つかの実施形態において、多重反応構成は、低温（例えば、室温もしくは氷上）で起こり得る。構成後、反応温度は、リガーゼの実質的な活性を提供するために上昇され得る。幾つかの実施形態において、処理工程の減少は、下でさらに説明されるように、ライゲーション反応混合物へのさらなる酵素の提供によって達成され得る。幾つかの実施形態において、熱活性化可能酵素（例えば、熱活性化可能リガーゼ）は、以下でより明らかにされるように、さらなる酵素と共に使用され得る。
【００４０】
例えば、本教示の幾つかの実施形態は、熱活性化可能リガーゼおよび少なくとも１種のさらなる酵素を含むライゲーション反応物を提供する。本教示の幾つかの実施形態は、１つの反応混合物中で一緒にポリヌクレオチドをライゲーションする方法を提供する。この方法は、不要な夾雑物を夾雑物除去剤（例えば、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）によって除去する工程、リン酸化剤（例えば、キナーゼ）によってプローブをリン酸化する工程、およびライゲーション剤（例えば、リガーゼ）を用いて一緒にプローブをライゲーションする工程を包含し、ここで、このリガーゼは、第１の温度（リン酸化剤および夾雑物除去剤が活性である間）で実質的に不活性であり、そしてこのリガーゼは、第２の温度で実質的に活性である。幾つかの実施形態において、リン酸化剤および／または夾雑物除去剤は、第２の温度で不活性である。幾つかの実施形態において、反応は、熱活性化可能ライゲーション剤およびリン酸化剤を含み得るが、夾雑物除去剤を含まなくていよい。幾つかの実施形態において、反応は、熱活性化可能ライゲーション剤、夾雑物除去剤を含み得るが、リン酸化剤を含まなくてよい。
【００４１】
種々の熱活性化可能戦略が、本教示の状況において使用され得ることが理解される。例えば、熱活性化可能リン酸化剤は、ライゲーション剤および夾雑物除去剤をさらに含むライゲーション反応において使用され得る。このようなシナリオにおいて、プローブは、最初は５’リン酸基を欠く。結果として、リン酸化剤の活性化を可能にする（従ってプローブのリン酸化を可能にする）温度に達するまでライゲーションは起こり得ない。
【００４２】
また、種々の戦略が、酵素を熱活性化可能にするために使用され得ることが、理解される。このような手順は、最近の分子生物学研究室において慣用的であり、その実行は、過度の実験を全く必要としない。熱活性化可能酵素を作製するための種々のアプローチの代表的な教示が利用可能であり、そして以下が挙げられる：抗体アプローチ（例えば、米国特許第５，３３８，６７１号を参照）、例えば無水シトラコン酸を含む化学的アプローチ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および米国特許第５，６７７，１５２号を参照）、ホルムアルデヒドのようなアルデヒドを含む化学的アプローチ（例えば、米国特許第６，１８３，９９８号を参照）、ならびにアプタマーベースのアプローチ（例えば、米国特許第６，１８３，９６７号を参照）。熱活性化可能酵素を作製するためのさらなる方法は、沈殿物（例えば、米国特許出願公開第２００３００８２５６７Ａ１号を参照）を含む無機物熱活性化可能アプローチ、ならびに蝋（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版を参照）を含む無機物熱活性化可能アプローチが挙げられる。薬剤（例えば、酵素）が熱活性化可能特性を満たすように改変する様式は、本教示の限定ではないことが理解される。
【００４３】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーション反応における異なる試薬処理工程の数を減らすための方法を提供し、ここで、リガーゼは、熱活性化可能リガーゼではない。例えば、本教示の幾つかの実施形態は、１つの反応混合物中で一緒にポリヌクレオチドをライゲーションする工程を包含し、この工程は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼのような夾雑物除去剤によって不要な夾雑物を除去する工程、キナーゼのようなリン酸化剤によってプローブをリン酸化する工程、ならびに熱活性化可能でないリガーゼのようなライゲーション剤を用いて一緒にプローブをライゲーションする工程を、包含する。幾つかの実施形態において、反応は、ライゲーション剤およびリン酸化剤を含み得るが、夾雑物除去剤を含まなくてよい。幾つかの実施形態において、反応は、ライゲーション剤および夾雑物除去剤を含むが、リン酸化剤を含まなくてよい。
【００４４】
種々の夾雑物除去剤のどれもが本教示の文脈において使用され得ることが理解されるが、代表的には、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼが使用される。多くのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（例えば、アルトロバクター属またはミクロコッカス属のようなグラム陽性微生物から収集されたウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）が、利用可能である（例えば、米国特許第６，１８７，５７５号に記載されそしてＲｏｃｈｅからＡｍｐＥｒａｓｅとして購入可能である）。本教示において使用され得るグリコシラーゼの他の例としては、Ｅ．Ｃｏｌｉから単離され、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからＵＤＧとして市販されるウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼが挙げられる（例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．ら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３２８６−３２９４を参照）。一般に、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは夾雑物除去剤の種類は、本教示を限定しないことが理解される。
【００４５】
幾つかの実施形態において、夾雑反応成分は、前に実施されたライゲーション反応由来の産物であり、ここで、Ｕ含有プローブは、ライゲーション前、ＵＮＧに対する基質ではない。
【００４６】
幾つかの実施形態において、熱活性化可能ＵＮＧもしくは熱活性化可ＵＤＧが、企図される。例えば、熱活性化可能でないリガーゼは、熱活性化可能ＵＮＧと共に反応混合物中に存在し得る。適切な位置にウラシルを含むプローブを用いる場合、ＵＮＧを活性化するための反応温度の上昇は、ウラシルの切断をもたらし得、それにより、リガーゼが作用し得るプローブ上の遊離リン酸基を遊離させる。例えば、ウラシルは、第１プローブの５’末端に存在し得、そしてその切断は、ライゲーション能力のある（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）複合体を生じる。また、ウラシルを含むフラップ（ｆｌａｐ）は、切断されて、ライゲーション能力のある複合体を生じ得る。
【００４７】
種々のリン酸化剤のどれもが本教示の文脈において使用され得ることが理解されるが、代表的に、ポリヌクレオチドキナーゼが使用される。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼは、種々の供給源から購入可能であり、この供給原としては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｅｒｓｈａｍが挙げられる。さらに、５’末端の塩基に依存しないオリゴヌクレオチドの改善された均一なリン酸化を有するポリヌクレオチドキナーゼ、ならびにより高い標識化を提供するポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＯｐｔｉＫｉｎａｓｅを参照）もまた、本教示に従って使用され得る。一般に、ポリヌクレオチドキナーゼもしくはリン酸化剤の種類は、一般に本教示の限定ではないことが理解される。また、本教示に従い、リン酸化は、ポリヌクレオチドの５’末端へのリン酸基の付加をもたらす生化学的反応であり、これによって、このポリヌクレオチドを対応するポリヌクレオチドの３’ＯＨ基へのライゲーションに適するようにすることが理解される。
【００４８】
本教示は、標的ポリヌクレオチド配列の同一性を調べるためにライゲーション反応が使用される種々の状況において適用され得ることが理解される。例えば、種々のＯＬＡ戦略（例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｙら，米国特許第６，０５４，２６６号、米国特許第５，９６２，２２２号、米国特許第５，５２１，０６５号、米国特許第５，２４２，７９４号、米国特許第４，８８３，７５０号を参照）、ＦＥＮ−ＬＣＲ（例えば、Ｂｉら，米国特許第６，５１１，８１０号を参照）、南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，米国特許第５，８７１，９２１号を参照）、ライゲーションと増幅とを合わせた方法（例えば、Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇら，米国特許第６，１３０，０７３号および米国特許第５，９１２，１４８号を参照）、ＯＬＡ、ＬＤＲ、ＬＣＲのギャップバージョン、ならびに当業者に一般に公知のこのような戦略は、最新の総説から、当業者に公知である（Ｃａｏら，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１を参照のこと）。
【００４９】
本教示は、第１プローブおよび第２プローブのみが異なる分子である実施形態を企図するのではなく、第１プローブおよび第２プローブが同じ分子の一部分である実施形態もまた企図する（例えば、ＰａｒＡｌｌｅｌｅから購入可能である分子インバージョンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ）、および米国特許第５，８７１，９２１号）。
【００５０】
本教示は、種々のリンカーライゲーション戦略の状況において使用され得ることが理解される（例えば、米国非仮特許出願第１０／９８２，６１９号、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能であるＳＮＰｌｅｘＴＭＳｙｓｔｅｍ使用者マニュアルにおいて考察される）。このような戦略は、標的ポリヌクレオチド配列上での幾つかのプローブのコンカテマーライゲーションを使用し得る。これらおよび他の戦略（例えば、米国特許第６，０２７，８８９号を参照）もまた、ヌクレアーゼ媒介性消化により、組み込まれなかった反応成分を除去するための種々のアプローチを可能にし得るために使用され得る。
【００５１】
本教示は、種々のポジティブコントロールライゲーション反応およびネガティブライゲーション反応（既知の単一形の標的ポリヌクレオチドを含み、それによってライゲーション効率を決定することを可能にする）の状況において使用され得ることが理解される（例えば、Ｗｅｎｚらに対する米国仮特許出願第６０／５８４，８７３号、およびその優先権を主張する同時出願された非仮特許出願公開において記載される）。
【００５２】
幾つかの実施形態において、ライゲーション反応のためのマスター混合物は、以下を含む。
【００５３】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２５℃でｐＨ７．６
７ｍＭ ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ ＫＣｌ
０．１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＮＡＤ
２．５単位／μｌ 熱活性化可能リガーゼ
２単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
０．０１単位／μｌ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ
０．０５ｍＭ Ｄｅｓｆｅｒａｌ
１ｍＭ ｄＡＴＰ
５％ ＰＥＧ８０００。
【００５４】
幾つかの実施形態において、ＤＴＴが使用され得る。ＤＴＴは、本来、酵素の安定のための（スルフヒドリル）還元剤である。幾つかの実施形態において、ＴＣＥＰ Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌが、還元剤として使用され得（０．１〜２ｍＭ）、これはより効果的であり得、そしてより安定であり得る。
【００５５】
（本教示の幾つかの実施形態に従う例示的キット）
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法の実施を促進するために設計されたキットを提供する。幾つかの実施形態において、キットは、方法の実施において使用される２以上の成分を組合わせることによって、目的の方法の性能を高めるのに役立つ。幾つかの実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要を最小限にするために、事前に測定された単位量の成分を含み得る。幾つかの実施形態において、キットは、１以上の本教示の方法を実施するための指示書を含み得る。幾つかの実施形態において、キット成分は、互いに協同して操作するために最適化される。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドをライゲーションするためのキットを提供する。本教示によって企図される例示的なキット構成について、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能であるＳＮＰｌｅｘＴＭＳｙｓｔｅｍ使用者マニュアルを調べることを読み手に奨励する。
【００５７】
本教示の幾つかの実施形態は、ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットを提供する。ここで、このライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝剤を含む。幾つかの実施形態において、キットは、少なくとも１組のリンカーセットをさらに含む。幾つかの実施形態において、リン酸化剤は、キナーゼである。幾つかの実施形態において、このキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。幾つかの実施形態において、夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである。幾つかの実施形態において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである。幾つかの実施形態において、熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである。幾つかの実施形態において、このリガーゼは熱活性化可能リガーゼではない。幾つかの実施形態において、リン酸化剤および／または夾雑物除去剤は、熱活性化可能である。
【００５８】
幾つかの実施形態において、このキットは、例えばＰａｒＡｌｌｅｌｅから購入可能である分子インバージョンプローブにおいて説明されるように、例えば、ミスマッチ修復において使用されるポリメラーゼを含み得る（米国特許第５，８７１，９２１号もまた参照）。幾つかの実施形態において、このポリメラーゼは、熱活性化可能ポリメラーゼである。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）
実施例１は、熱活性化可能リガーゼ、ウラシル−ＮグリコシラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含むライゲーション反応混合物によって多重ライゲーション反応が実施される、本教示の説明を提供する。この実験のワークフローを、図３に図示する。１ヌクレオチド多形の収集のためのホモ接合性対立遺伝子およびヘテロ接合性対立遺伝子の首尾よい決定を、夾雑物除去剤を含む反応について、夾雑物除去剤を欠く反応と比較して見出した。
【００６０】
プロトコールは、基本的に、以下である：
ゲノムＤＮＡを、煮沸によって断片化し、定量し、そして３８４ウェル光学プレート中に３７ｎｇ／ウェルを分配し、そして乾燥させた。
【００６１】
室温で、マスター混合物をピペッティングした。この混合物は、以下を含んだ：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２５℃でｐｈ７．６
７ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＮＡＤ
５単位／μｌ 熱活性化可能リガーゼ
０．１単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
０．０１単位／μｌ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（また、ＵＮＧを含まないコントロール反応を実施した）
０．０５ｍＭ Ｄｅｓｆｅｒａｌ
１．２５ｍＭ ｄＡＴＰ
５％ ＰＥＧ８０００。
【００６２】
室温において、５μｌのプローブ（各１００ｎＭ）およびリンカー（各５０ｎＭのＡＳＯ（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）リンカーおよび各８５ｎＭのＬＳＯ（遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド）リンカー）を、Ｈｙｄｒａ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｏｎｅロボットを使用して３８４ウェル光学プレートの各ウェルにピペット分配した。
【００６３】
マスター混合物（１つの反応につき４．５μｌ）を、Ｈｙｄｒａ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｏｎｅロボットを使用して３８４ウェル光学プレートの各ウェルにピペット分配した。
【００６４】
ライゲーション反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ファームウェア３．０５）上で、以下のサイクリング条件で実施した：
工程 工程型 温度（℃） 時間
１ 維持 ３７ ６０分間
２ 維持 ８５ ３０分間
２ ３０サイクル ９０ １５秒間
６０ ３０秒間
５１（２％傾斜で） ３０秒間
３ 維持 ９９ １０分間
４ 維持 ４ 無期限維持。
【００６５】
次いで、エキソヌクレアーゼ浄化を実施した。これは、以下を含んだ：
各反応につき：
４．２μｌ ヌクレアーゼ非含有水
０．５μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ エキソヌクレアーゼ緩衝剤
０．２μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ λエキソヌクレアーゼ
０．１μｌ ＳＮＰｌｅｘＴＭ エキソヌクレアーゼ １
５μｌ ライゲーション反応物、
３７℃で９０分間、その後８０℃で１０分間。
【００６６】
エキソヌクレアーゼ浄化の後、１０μｌの水を各反応物に添加し、そしてライゲーション反応のＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ ３８４−ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 製品番号４３０９８４９）中で、ＡＢＩ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ（製品番号４３１１９７１）を用いて実施した。
【００６７】
まず、以下を含む２０×ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー混合物を作製した：
１０μＭ ユニバーサル順方向プライマー（ＵＦ １９）
１０μＭ ビオチン化ユニバーサル逆方向プライマー（ＵＲ １９）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５℃でｐＨ８．０
１ｍＭ ＥＤＴＡ。
【００６８】
次いで、複数の１０μｌのＰＣＲ反応物を、以下のように構成した：
５．０μｌ ２×ＳＮＰｌｅｘＴＭ ＰＣＲ混合物
０．５μｌ ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー混合物（上記から）
２．５μｌ Ｈ２Ｏ
２．０μｌ ヌクレアーゼ処理済みライゲーション反応物。
【００６９】
ＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００上で、以下のサイクリング条件で実施した：
工程 工程型 温度（℃） 時間
１ 維持 ９５ １０分間
２ ３０サイクル ９５ １５秒間
７０ ６０秒間
３ 維持 ４ 無期限維持
ＰＣＲ後、ビオチン化鎖を捕捉して分離し、そして移動度プローブを、固定化した鎖にハイブリダイズした。次いで、溶離した移動度プローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０上のキャピラリー電気泳動を介して検出した。
【００７０】
記載のように実施した４７重実験から得られたデータを表すクラスタープロットは、本方法の有効性を実証した（プロットは示さず）。
【００７１】
本教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者は、これらの例示的実施形態の多くの変更および改変が、過度の実験なしで可能であることを、容易に理解する。全てのこのような変更および改変は、本教示の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本教示に従う幾つかのワークフロー特性の図解を提供する。ここで、複数の異なる反応は、別個の反応容器中で実施される。
【図２】図２は、本教示に従う幾つかのワークフロー特性の図解を提供する。ここで、複数の異なる反応は、同じ反応容器中で実施される。
【図３−１】図３は、本教示の実施例１に従う反応工程の図解を提供する。ここで、１ヌクレオチド多形の同一性が、調べられる。第１プローブ１および第１プローブ２は、ＡＳＯａ１およびＡＳＯａ２（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド１および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド２）として示され、第２プローブは、ＬＳＯ（遺伝子座特異的オリゴ）として示され、そして移動度プローブは、Ｚｉｐｃｈｕｔｅプローブと称される。
【図３−２】（図３−１の続き）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドをライゲーションする方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブおよび夾雑物除去剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
夾雑物除去反応を実施する工程であって、ここで該夾雑物除去剤は第１温度で実質的に活性であり、ここで該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
該反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブを該第２プローブにライゲーションする工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼであり、そして前記夾雑物除去反応は、夾雑反応成分の除去をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記夾雑反応成分は、前に実施された増幅反応に由来するキャリーオーバー産物である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここで、２〜２４の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項６】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここで、２４〜９６の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項７】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここでプローブセットが１ヌクレオチド多形を調べ、ここで該プローブセットは第１プローブ１および第１プローブ２を含み、ここで該第１プローブ１および該第１プローブ２は、該１ヌクレオチド多形について互いの対立遺伝子間を識別する、方法。
【請求項８】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように化学的に改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように抗体と複合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるようにアプタマーと複合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＰＥＧ ８０００、ＤＴＴ、ＮＡＤおよびこれらの組み合わせの少なくとも１つの有効量を含有する緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
リン酸化剤をさらに含む請求項１に記載の方法であって、ここで、該リン酸化剤はキナーゼであり、そしてリン酸化反応はプローブのリン酸化をもたらし、ここで、前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼであり、そして前記夾雑物除去反応は夾雑反応成分の除去をもたらす、方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドをライゲーションする方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブおよびリン酸化剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
リン酸化反応を実施する工程であって、ここで該リン酸化剤は第１温度で実質的に活性であり、ここで該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブを該第２プローブにライゲーションする工程、
を包含する方法。
【請求項１５】
前記リン酸化剤はポリヌクレオチドキナーゼであり、そして前記リン酸化反応はプローブのリン酸化をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドキナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸化されたプローブは、後のライゲーション産物の５’末端を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここで、２〜２４の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項１９】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここで、２４〜９６の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項２０】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここでプローブセットが１ヌクレオチド多形を調べ、ここで該プローブセットは第１プローブ１および第１プローブ２を含み、ここで該第１プローブ１および該第１プローブ２は、該１ヌクレオチド多形について互いの対立遺伝子間を識別する、方法。
【請求項２１】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように化学的に改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように抗体と複合体化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるようにアプタマーと複合体化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
Ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＰＥＧ ８０００、ＤＴＴ、ＮＡＤおよびこれらの組み合わせの少なくとも１つの有効量を含有する緩衝液をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
熱活性化可能リガーゼ、リン酸化剤、夾雑物除去剤、標的ポリヌクレオチド、第１プローブ、および第２プローブを含有する、反応混合物。
【請求項２７】
前記リン酸化剤はキナーゼである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記キナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項２７に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２９に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項３２】
ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットであって、ここで、該ライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝液を含む、キット。
【請求項３３】
少なくとも１組のリンカーセットをさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記リン酸化剤はキナーゼである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記キナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
ライゲーション反応におけるワークフロー工程の数を減らすための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、リン酸化剤および夾雑物除去剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
該リン酸化剤を含むリン酸化反応を第１温度で実施する工程、ならびに該夾雑物除去剤を含む夾雑物除去反応を該第１温度で実施する工程であって、ここで、該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブが該第２プローブにライゲーションするライゲーション反応を実施する工程であって、それにより、該リン酸化反応および該夾雑物質除去反応がライゲーション反応とは別個の反応において実施されるライゲーション反応と比較して、ライゲーション反応における処理工程の数を減らす工程、
を包含する方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドをライゲーションするための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、夾雑物除去剤、およびリン酸化剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、ならびに、
該反応混合物中で、夾雑物除去、リン酸化、およびライゲーションを同時に行う工程、
を包含する方法。
【請求項１】
ポリヌクレオチドをライゲーションする方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブおよび夾雑物除去剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
夾雑物除去反応を実施する工程であって、ここで該夾雑物除去剤は第１温度で実質的に活性であり、ここで該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
該反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブを該第２プローブにライゲーションする工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記夾雑物除去剤は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼであり、そして前記夾雑物除去反応は、夾雑反応成分の除去をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記夾雑反応成分は、前に実施された増幅反応に由来するキャリーオーバー産物である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここで、２〜２４の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項６】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここで、２４〜９６の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項７】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１に記載の方法であって、ここでプローブセットが１ヌクレオチド多形を調べ、ここで該プローブセットは第１プローブ１および第１プローブ２を含み、ここで該第１プローブ１および該第１プローブ２は、該１ヌクレオチド多形について互いの対立遺伝子間を識別する、方法。
【請求項８】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように化学的に改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように抗体と複合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるようにアプタマーと複合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＰＥＧ ８０００、ＤＴＴ、ＮＡＤおよびこれらの組み合わせの少なくとも１つの有効量を含有する緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
リン酸化剤をさらに含む請求項１に記載の方法であって、ここで、該リン酸化剤はキナーゼであり、そしてリン酸化反応はプローブのリン酸化をもたらし、ここで、前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼであり、そして前記夾雑物除去反応は夾雑反応成分の除去をもたらす、方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドをライゲーションする方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブおよびリン酸化剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
リン酸化反応を実施する工程であって、ここで該リン酸化剤は第１温度で実質的に活性であり、ここで該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブを該第２プローブにライゲーションする工程、
を包含する方法。
【請求項１５】
前記リン酸化剤はポリヌクレオチドキナーゼであり、そして前記リン酸化反応はプローブのリン酸化をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドキナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸化されたプローブは、後のライゲーション産物の５’末端を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここで、２〜２４の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項１９】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここで、２４〜９６の標的ポリヌクレオチド配列が、対応する第１プローブおよび第２プローブによって調べられる、方法。
【請求項２０】
多重ライゲーション反応を包含する、請求項１４に記載の方法であって、ここでプローブセットが１ヌクレオチド多形を調べ、ここで該プローブセットは第１プローブ１および第１プローブ２を含み、ここで該第１プローブ１および該第１プローブ２は、該１ヌクレオチド多形について互いの対立遺伝子間を識別する、方法。
【請求項２１】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように化学的に改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるように抗体と複合体化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記熱活性化可能リガーゼは、前記第１温度で実質的に不活性になるようにアプタマーと複合体化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
Ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＰＥＧ ８０００、ＤＴＴ、ＮＡＤおよびこれらの組み合わせの少なくとも１つの有効量を含有する緩衝液をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
熱活性化可能リガーゼ、リン酸化剤、夾雑物除去剤、標的ポリヌクレオチド、第１プローブ、および第２プローブを含有する、反応混合物。
【請求項２７】
前記リン酸化剤はキナーゼである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記キナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項２７に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２９に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項３２】
ライゲーションマスター混合物および少なくとも１組のプローブセットを含むキットであって、ここで、該ライゲーションマスター混合物は、少なくとも１種の熱活性化可能リガーゼ、少なくとも１種のリン酸化剤、少なくとも１種の夾雑物除去剤、および少なくとも１種の緩衝液を含む、キット。
【請求項３３】
少なくとも１組のリンカーセットをさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記リン酸化剤はキナーゼである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記キナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記夾雑物除去剤はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
前記ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは、アルトロバクター属、ミクロコッカス属、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記熱活性化可能リガーゼは、Ａｆｕ、Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
ライゲーション反応におけるワークフロー工程の数を減らすための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、熱活性化可能リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、リン酸化剤および夾雑物除去剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、
該リン酸化剤を含むリン酸化反応を第１温度で実施する工程、ならびに該夾雑物除去剤を含む夾雑物除去反応を該第１温度で実施する工程であって、ここで、該リガーゼは該第１温度で実質的に不活性である工程、
反応温度を第２温度まで上昇させ、それによって該リガーゼの活性を上昇させる工程、ならびに
該第１プローブが該第２プローブにライゲーションするライゲーション反応を実施する工程であって、それにより、該リン酸化反応および該夾雑物質除去反応がライゲーション反応とは別個の反応において実施されるライゲーション反応と比較して、ライゲーション反応における処理工程の数を減らす工程、
を包含する方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドをライゲーションするための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的ポリヌクレオチド配列、リガーゼ、第１プローブ、第２プローブ、夾雑物除去剤、およびリン酸化剤を提供し、それによって反応混合物を形成する工程、ならびに、
該反応混合物中で、夾雑物除去、リン酸化、およびライゲーションを同時に行う工程、
を包含する方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【公表番号】特表２００８−５０２３５２（Ｐ２００８−５０２３５２Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１６８５８（Ｐ２００７−５１６８５８）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３７３７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５０５５
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３７３７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５０５５
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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