ポリヒドロキシアルカノエート生産の改善を示す脱調節された細菌
改善されたポリ３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産する特徴を持つ突然変異細菌およびそれらを生産し、使用する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高いレベルのポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）バイオポリマーを構成的に生産する突然変異した微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エネルギー貯蔵化合物としてヒドロキシアルカン酸（ポリヒドロキシアルカノエート、ＰＨＡ）のポリマーを合成して蓄積する、非常に多くの微生物の能力が以前から認識されている。このクラスの最も一般に見いだされる化合物はポリ（Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）である。しかし、一部の微生物種はコポリマーを蓄積し、それらはヒドロキシブチレートに加え、より長い鎖のヒドロキシアルカノエートを含むことがある。これらのＰＨＡは、生体適合性、生分解性であり、ポリエチレンおよびポリプロピレンのような石油化学を基礎にしたポリマーの特性に類似する物理的特性を提示する熱可塑性物質であるため、これらのバイオポリマーに関心が集まってきている。
【０００３】
ＰＨＡを生産する代表的な１種の細菌、オーテルシアユートローファ（ラルストニアユートローファまたはアルカリゲネスユートロファスとしても公知）は、ホスフェートまたは窒素のような欠くことのできない栄養素の制限に反応して、発酵中にＰＨＡを蓄積する。ＰＨＡは典型的には２段階（ツーステップ）の細菌発酵によって生産される。第１の段階では細菌は増殖性成長を可能にする十分な供給量の栄養素を含む培地で培養される。細菌は、通常１リットル毎の乾燥細胞重量として測定される十分な生物量に到達するまで、増殖することを許される。第２の段階では、成長に必要な少なくとも１種の栄養素、たとえば窒素またはリンの有用性が制限され、細胞分裂を制限し、ＰＨＡ生産を誘導する効果を有する。栄養素制限がＰＨＡの蓄積を誘導する場合、第２の段階まで顕著なＰＨＡ生産は起こらない。
【０００４】
大部分のＰＨＡ‐生産微生物は、非制限の増殖条件下で顕著なレベルのＰＨＡを生産しない。たとえば、オーテルシアユートローファ（ラルストニアユートローファ）は、栄養素が全く制限されない条件下で培養される場合、乾燥細胞の百分率として３％のＰＨＡだけしか生産しないことが報告されている。Ｒｅｐａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：５８５−５９１，１９７６。
【発明の開示】
【０００５】
制限されないレベルの栄養素の存在下において、顕著なレベルのＰＨＡを生産する改変された細菌の必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、増殖性成長を可能にするために十分な量の栄養素を含む培地の存在下で、非改変細菌に比較して驚くべき量のＰＨＡを生産する、単離された、栄養素‐脱調節、改変細菌を提供する。そのような細菌は、非制限レベルの窒素、リン、マグネシウム、スルフェートおよびカリウムのような重要な栄養素の存在下で顕著なレベルのＰＨＡを生産する。
【０００６】
本発明の新規な単離された細菌は、（ａ）栄養素のレベルが制限されない培養条件下で乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産すること、および（ｂ）鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを生産することが可能である。本発明は場合により、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で約５０％以上のＰＨＡを生産し、鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下、少なくとも１０％のＰＨＡ生産の増加を提示する、以前に当該技術分野で公知の単離された細菌を除外する。
【０００７】
代表的な細菌は、ラルストニア種、アルカリゲネス種、オーテルシア種、ズーグロエア種、バチルス種、アエロモナス種、アゾトバクター種、クロストリジウム種、ノカルジア種、ハロバクテリウム種、もしくはシュードモナス種、またはその組み合わせから選択される。本発明の細菌は、アルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。アルカリゲネスレータスは細胞の重量の約８８．３％でＰＨＢを生産し（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｔａｂ．５９：３８７−３９３，１９９８）、そしてアゾトバクタービンランディは細胞の重量の約９４％でＰＨＡを生産する（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：１０６−１１４，１９９５）。
【０００８】
そのような改変された細菌は、ホスフェート‐脱調節、または窒素‐脱調節のいずれかのように、１種の栄養素に関して調節が解除されてもよく、あるいは、たとえばホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節の両方であるように、２種以上の栄養素に関して調節が解除されてもよい。好ましくは、細菌は栄養素‐脱調節ＰＨＡ‐生産微生物、または付加的に、生来でない（non-native）ＰＨＡ‐生産遺伝子、たとえばｐｈａＣ、Ａおよび／またはＢを含むように工学的に操作される、ＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体である。
【０００９】
代表的な細菌は、それぞれ受託番号ＰＴＡ−６７５９およびＰＴＡ−６７６０のもとで、２００５年６月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【００１０】
本発明はまた、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌の確認された特徴のすべてを提示する単離された細菌を提供する。そのような細菌の代表的な具体化は、寄託された細菌の子孫または寄託された細菌の突然変異体であり、それらは寄託された細菌の確認された特徴を保持する、すなわち、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、改変されていない微生物に比較して、増大したＰＨＡ生産を引き起こす、同じまたは類似の突然変異を保持する。
【００１１】
その上、本発明は本発明の単離された細菌および培地を含む培養物を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載の、本発明のいずれかの細菌を使用してＰＨＡを生産する方法を提供する。そのような生産方法は細菌がＰＨＡを生産するために適切な培地中で細菌を培養する工程を含む。さらに、付加的な工程は、細菌を採取し、および／または細菌からＰＨＡを抽出することを含む。あるいは、ＰＨＡが培地に分泌される場合、方法は適切な培地中で細菌を培養し、培地からＰＨＡを抽出する工程を含んでいてもよい。
【００１２】
十分な栄養素が微生物に供給され、増殖またはＰＨＡの生産を可能にする限り、当該技術分野で公知のどのような培地および培養方法が使用されてもよい。一側面において、本発明はしたがって、必須栄養素が制限されない、すなわち、増殖性成長の停止を引き起こす程度まで決して制限されないような濃度で栄養素が存在する培地中でそのような細菌を培養する方法を提供する。例として、培養プロセスは、培地中の栄養素が増殖性成長を著しく損なうことになる濃度にまで制限されない場合、１つの発酵槽から別のものに細菌を移すこと（スケールアップすること）、ならびにバッチ状であることまたは継続的に栄養を与えることを含む。
【００１３】
別の側面において、本発明はさらに２段階培養法に従った、本発明の細菌を培養する方法を提供し、該方法では、細菌はたとえば無機元素のような１種以上の必須栄養素が制限される培地中における培養の第２の工程を経験する。
【００１４】
本発明はまた、細菌が脱調節されていない微量元素を制限することによってＰＨＡを生産する、改善された方法を提供する。たとえば、十分な期間の増殖性成長後、たとえばマグネシウム、スルフェートまたは鉄、好ましくは鉄のような、リン以外の元素の制限レベルを含む培地中で、ホスフェート‐脱調節細菌を培養することによって、ＰＨＡの高められた生産が達成されてもよい。
【００１５】
Ｃ４と中程度の鎖長のモノマー（たとえば５より多い炭素を持つモノマーユニット）からなるＰＨＡコポリマーを生産する方法が提供される。代表的なコポリマーには、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８コポリマー、たとえば、３−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨ）（Ｃ６）、３−ヒドロキシヘプタノエート（ＨＨｐ）（Ｃ７）および／または３−ヒドロキシオクタノエート（ＨＯ）（Ｃ８）を含むコポリマー、とりわけＣ４およびＣ６（とりわけ３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシヘキサノエートまたは対応する酸）を含むコポリマー、たとえば、ポリヒドロキシブチレート−コ−ヘキサノエート（Ｃ４‐Ｃ６）、そして最もとりわけ８０〜９８ｍｏｌ％Ｃ４および２〜２０ｍｏｌ％Ｃ６の範囲のコポリマーが挙げられる。付加的なコポリマーは米国特許第６，２２５，４３８号に記載される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、増殖性成長を可能にするために十分な量の栄養素を含む培地の存在下で、非改変細菌に比較して驚くべき量のＰＨＡを生産する、単離された、改変「栄養素‐脱調節」細菌を提供する。そのような改変された細菌は、たとえばホスフェート‐脱調節、または窒素‐脱調節のいずれかのように、１種の栄養素に関して調節が解除されてもよく、あるいは、たとえばホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節の両方であるように、２種以上の栄養素に関して調節が解除されてもよい。他の代表的な改変細菌には、マグネシウム‐脱調節、スルフェート‐脱調節、カリウム‐脱調節または鉄‐脱調節微生物が挙げられる。
【００１７】
代表的な態様において、本発明の細菌は、（ａ）栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも１０％、２０％、２５％、もしくは３０％、またはそれより多いＰＨＡを生産すること、および（ｂ）鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは８０％、またはそれより多いＰＨＡを生産することが可能である。そのような細菌には、ＰＨＡを生産する、当該技術分野で公知のどんな細菌も含まれるが、それぞれ細胞重量の９０％を越えるレベルまでＰＨＢを蓄積するアルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ突然変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。
【００１８】
ホスフェート脱調節細菌においてＰＨＡを生産することにより、重要な栄養素の制限を全く含まない栄養に富んだ培地の存在下でさえＰＨＡ生産は構成的に起こる。発酵の間中、栄養に富んだ培地、またはより栄養に富み、安価な培地を利用する能力は、軽減された費用において、より速い細菌の増殖、より多いＰＨＡ生産、そしていっそう工業的に健全なＰＨＡ生産プロセスを可能にする。（実施例８および９を参照されたい）。１種以上の栄養素を制限する必要性を除くことはまた、連続的な発酵を可能にする（すなわち、２段階培養法の必要性を排除する）。
【００１９】
本明細書で使用する“単離された細菌”は、確認され、その自然環境の要素から分離されている細菌の単独株の集団を表す。たとえば、人工的な培地を含む培養組成物の一部である細菌は単離されたと判断される。
【００２０】
本明細書で使用する“非制限レベルの栄養素を含む培地”または“栄養素のレベルが制限されない培地”は、細菌が速やかに増殖することを可能にするためのすべての栄養素の適切な供給量を含む培地を表す。同様に、“栄養素の非制限レベル”は、速やかな増殖性成長を支持するために適切な、培地におけるその栄養素の濃度を表す。逆に、“栄養素が制限される培地”は、細菌の増殖性成長を本質的に停止させる濃度にまでその栄養素のレベルが減らされる培地を表し、そして“栄養素の制限されたレベル”は細菌の増殖性成長を本質的に停止させる、培地中のその栄養素の濃度を表す。
【００２１】
本明細書で使用する“増殖性成長”は、急激な増殖相中に観察されるような、細菌数の速やかな増加を表す。
本明細書で使用する“リン‐脱調節”細菌は、リンまたはホスフェート調節における欠陥を有し、その結果通常はリン枯渇によってアップレギュレートされる（または抑制される）１種以上の遺伝子が構成的にアップレギュレートされる（または抑制される）細菌を表し、たとえリンの枯渇がなくても細菌は増大したレベルのＰＨＡを合成する結果になる。同様に、“窒素‐脱調節”細菌は、窒素調節における欠陥を有し、そのため通常は窒素枯渇によってアップレギュレートされる（または抑制される）１種以上の遺伝子が構成的にアップレギュレートされる（または抑制される）細菌を表し、たとえ窒素が枯渇しなくても細菌は増大したレベルのＰＨＡを合成する結果になる。他の栄養素‐調節が解除された細菌の意味は同様に対応する。
【００２２】
本明細書で使用する“ＰＨＡ‐ネガティブ”突然変異細菌は、ＰＨＢまたはＰＨＡを生産しないように突然変異している細菌を表す。たとえば、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．７１：２８３−４８３０，１９７０］を参照されたい。そのような細菌は、所望するＰＨＡ遺伝子を挿入することにより、たとえば、アエロモナスカビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３により形質転換することによってＰＨＡを生産するように遺伝子工学的に操作されてもよい。
【００２３】
限定的でない例として、たとえば、リン‐脱調節細菌に関しては、そのような細菌は、リンまたはホスフェート検出に関係する遺伝子または調節領域（たとえば、プロモーター、オペレーター、レギュレーターにとってのＤＮＡ結合部位など）（その結果、何もない場合に細菌がリン枯渇を検出するように見える）；またはホスフェート輸送に関係する遺伝子もしくは調節領域；またはリン枯渇に反応して他の遺伝子を活性化するポジティブホスフェートレギュレーター（または逆にリン枯渇に反応して遺伝子を抑制する別のレギュレーター）の遺伝子または調節領域；または過剰なホスフェートに反応して遺伝子を抑制するネガティブホスフェートレギュレーター（または逆に過剰なホスフェートに反応して遺伝子を活性化する別のレギュレーター）の遺伝子または調節領域；または転写がそのようなポジティブまたはネガティブホスフェートレギュレーターによって調節されるダウンストリーム遺伝子（またはその調節領域）の１種；または主要なポジティブおよびネガティブホスフェートレギュレーターを改変するか、または調節する遺伝子（またはその調節領域）の１種、における突然変異を有していてもよい。嫌気的および好気的条件下で異なる調節経路が存在しうる。
【００２４】
リン調節に関係する代表的な遺伝子には、大腸菌遺伝子ｐｓｔＡ（ｐｈｏＡ）（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｓｔＢ（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｈｏＷ（ｐｓｔＣ）（ホスフェート輸送に関係）、ｐｈｏＳ（ホスフェート結合タンパク質）、ｐｈｏＵ（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｈｏＥ（外膜タンパク質ポーリン）、ｕｇｐＢ（グルセロール−３−ホスフェート結合タンパク質）、ｐｈｏＲ（ネガティブホスフェートレギュレーター）、ｐｈｏＢ（ポジティブホスフェートレギュレーター）、ｐｈｏＭ（ポジティブホスフェートレギュレーター）、ｐｓｉＥ（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）、ｐｈｎ（ｐｓｉＤ）（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）、ｐｈｏＧ（ｐｓｉＨ）（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）に相同な遺伝子が挙げられる。たとえば以下の参考文献中のそのような遺伝子および経路の説明を参照されたい：Ａｍｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１８４：２４１−２５０，１９８４；Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｏｉｌ．１９０：３７−４４，１９８６；Ｗａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ １３２６−１３３３，１９８７；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５６０１−５６０６，１９８９；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２１８６−２１９３，１９９８；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１１２６−１１３３，１９９９；ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：５５９６−５５９９，２０００。
【００２５】
窒素調節に関係する代表的な遺伝子には、ＡｍｔＡ（アンモニウム輸送に関係する）、ＧＩｎＤ（ウリジリルトランスフェラーゼ／ウリジリル‐除去酵素）（細胞内窒素状態を感知することに関係する）、ＧＩｎＢ（Ｐｌ１）（細胞内窒素状態を感知することに関係する）、ＧＩｎＫ（窒素調節に関係するシグナル伝達タンパク質）、ｇｌｎＥ（アデニリルトランスフェラーゼ）、ＮｔｒＢ（窒素レギュレーターである感覚ヒスチジンタンパク質キナーゼ）、ＮｔｒＣ（窒素反応レギュレーターであるＤＮＡ結合タンパク質）、ｒｐｏＮ（一部のシュードモナス種）、ＧＩｎＲ（過剰な窒素によって活性化されるバチルスにおけるネガティブ窒素レギュレーター）、ＴｎｒＡ（窒素制限によって活性化されるバチルスにおけるレギュレーター）、ＣｏｄＹ（過剰な窒素によって活性化されるバチルスにおけるネガティブレギュレーター）が挙げられる。ＮｔｒＢＣによって転写的に調節される遺伝子には、ｇｌｎＡＬＧ、ｇｌｎＨＰＱ、ａｒｇＴ、ｈｉｓＪＱＭＰ、ｎａｓＦＥＤＣＢＡ、ｎａｃ、ｇｌｔＦが挙げられる。たとえば以下の参考文献中のそのような遺伝子および経路の説明を参照されたい：Ｍｅｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：６０４−６２２，１９９５；Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：４３１−４３７，１９９８；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：２２３−２３２，１９９９；およびＢｌａｕｗｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：２０３−２１４，２００２。
【００２６】
ラルストニアメタリデュランスＣＨ３４、以前はラルストニアユートローファおよびアルカリゲネスユートロファス（そしてクプリアビドスネカターもしくはオーテルシアユートローファとしても呼ばれていた）は配列決定されていて、配列データはＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）から利用可能である。ラルストニアユートローファ、以前はアルカリゲネスユートロファスＣＨ３４のゲノム配列もＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから利用可能である。ラルストニアソラナセラムのゲノム配列は、ＧｅｎｏｓｃｏｐｅおよびＮＣＢＩから利用可能である。ラルストニアゲノム配列は、たとえばＢＬＡＳＴを使用して検索し、大腸菌または他の細菌のレギュレーターに対する相同性を持つ配列を確認してもよい。
【００２７】
細菌は放射能または他の突然変異誘発物質の適用により改変されてもよく、あるいは細菌は遺伝子工学により改変されてもよい。実施例１〜３は所望する特徴を持つ細菌の変異誘発および選択を説明する。手短に述べると、Ｒ．ユートローファのＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体は突然変異を誘発され、ホスフェートの非制限濃度を含む培地で突然変異を誘発された細菌を培養し、アルカリ性ホスファターゼ活性を検出することにより、ホスフェート脱調節に関して選択される。他の栄養素‐脱調節突然変異細菌は、類似の手順（たとえば、突然変異を誘発し、その後窒素、または他の所望する栄養素の非制限量を含む培地で培養すること）を使用して得られる。
【００２８】
好ましい突然変異細菌は活発な増殖性成長相（対数相としても公知）中に、構成的なＰＨＡ生産の増大したレベルを提示し、ホスフェート、窒素などのような栄養素の非制限濃度の存在下においてさえ、より早い時点で、ほぼ最大に近いＰＨＡの蓄積を導く。
【００２９】
このような方法で作製された代表的な細菌は、２００５年６月１日にそれぞれ受託番号ＰＴＡ−６７５９およびＰＴＡ−６７６０のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されている。
【００３０】
所望する脱調節の特徴に帰着する、同じか、または類似の突然変異を保持する細菌の子孫または突然変異体は本発明によって企図される。たとえば、そのような細菌は、それらが栄養素‐脱調節の特徴を保持する限り、さらに突然変異を誘発されて、付加的な望ましい特徴を持つ細菌が単離されてもよい。付加的な望ましい特徴はまた、組換え遺伝子工学的操作を通じて与えられてもよい。たとえば、所望する特徴に関与する新規な遺伝子がプラスミドまたは組換えにより導入されてもよく、あるいは細菌のゲノム中の既存の遺伝子または調節領域が変異してそれらが活性化または不活性化されてもよい。
【００３１】
その上、観察されたホスフェート‐または窒素‐脱調節表現型に関与する突然変異は、たとえば、変異した細菌のゲノムまたは遺伝子産物を配列決定して突然変異を確認すること、または制限フラグメント長多形解析（制限酵素により消化して突然変異によって作製された異なる制限部位を確認すること）、またはハブリダイゼーションパターン解析（プローブと同であるゲノム配列と突然変異を含むゲノム配列を識別するハイブリダイゼーション条件下での、既知の配列のプローブへのハイブリダイゼーション）、または当該技術分野で公知の突然変異検出のための他の方法により確認することができる。突然変異を確認した後で、野生型細菌はそれらのゲノムにおける挿入または欠失により同じ領域（たとえば、調節領域または遺伝子）に突然変異を含むように遺伝子工学的に操作されてもよい。
【００３２】
細菌がＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体である場合、それらは好ましくは、たとえば、アエロモナスカビアエ由来のｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するプラスミドにより形質転換することによって、所望するＰＨＡ‐生産遺伝子、たとえばｐｈａＣ、Ａおよび／またはＢを含むように付加的に工学的に操作され、そのことがＰＨＡ生産を可能にする。代わりとなる代表的な遺伝子には、シュードモナスフルオレセンス由来のｐｈａＣ（米国特許第６，４７５，７３４号）またはアエロモナスハイドロフィラ４ＡＫ４由来のｐｈａＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が挙げられる。米国特許第５，６６１，０２６号および５，７９８，２３５号を参照されたい。
【００３３】
細菌
本発明はポリヒドロキシアルカノエートを生産しうる任意の細菌を企図する。これらはには、オーテルシア、アルカリゲネス、ラルストニア、ズーグロエア、バチルス、アエロモナス、アゾトバクター、クロストリジウム、ノカルジア、ハロバクテリウムおよびシュードモナス属に属する種が挙げられるが、それらに限定されない。細菌は自然のままでも、遺伝子工学的に操作されてもよい。とりわけ、ラルストニア、バチルス、シュードモナスおよびアゾトバクターが典型的に使用される。以前にラルストニアユートローファとして公知であり、以前アルカリゲネスユートロファスとして呼ばれた、オーテルシアユートローファが最も典型的に使用される。ラルストニア（アルカリゲネス）属に属する、これらの細菌の細菌学的特性はたとえば、“ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＶＥ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，８版，Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ”に記載される。本発明の細菌は、それぞれ細胞重量の９０％を越えるレベルまでＰＨＡを蓄積するアルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ突然変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。
【００３４】
培地
細菌の増殖に必要な必須栄養素には炭素源および、通常容易に吸収可能な形態で、典型的には水溶性の塩として存在する少なくとも以下の無機元素：窒素、リン、イオウ、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄が挙げられ、場合により、微量のマンガン、亜鉛、ニッケル、クロム、コバルトおよび／または銅を伴う。
【００３５】
炭素源は、合成の、天然の、または改変された天然の炭素源を含む、細菌によって利用されうるいずれかの物質である。代表的な炭素源には、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、およびより長い鎖の脂肪酸を含む脂肪酸；または脂肪酸の塩、エステル（ヒドロキシルが置換された酸の場合にはラクトンを含む）、無水物、アミドもしくはハライド；コーン油、ダイズ油、パーム核油、綿実油、菜種油、ピーナッツ油、これらの型の植物油のいずれかの分別蒸留されたオイル、および／またはその誘導体、および／またはその混合物のような植物油源を含むオイル；メタノール、エタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールおよびデカノールを含むアルコールならびにイソおよび他の分岐鎖脂肪酸またはアルコールおよび酢酸；二酸化炭素、酵母抽出物、糖蜜、ペプトン、および食肉抽出物のような他の炭素源、アラビノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトールおよびイノシトールのような糖類が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
代表的な窒素源には、アンモニア、アンモニウム塩、ニトレートのような無機窒素化合物、および／または尿素、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、カゼイン、ペプトン、酵母抽出物、および食肉抽出物のような有機窒素含有化合物が挙げられる。
【００３７】
代表的な無機成分には、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム塩、ホウ素化合物、またはヨウ素化合物が挙げられる。
【００３８】
場合により、ビタミンが培地に含まれうる。
細菌培養法
本発明の栄養素‐脱調節細菌は必須栄養素が制限されない培地においても、十分なレベルのＰＨＡ生産を達成しうる。細菌を培養する方法は、単に適切な培地で細菌を培養することを含む。細菌は増殖中でさえ、顕著なレベルのＰＨＡを生産することになる。当該技術分野で公知の、および／または本明細書に記載の細菌の増殖性成長を促進する、任意の培地および適切な培養条件が使用されてよい。
【００３９】
培養温度は、微生物に依存して変化してもよい。ラルストニアの場合、代表的な培養温度は、約２０〜４０℃、好ましくは約２５℃〜３５℃の範囲であってもよく、そしてｐＨはたとえば、約６〜１０、好ましくは約６．５〜９．５である。培養はこれらの条件下、好気的に行われる。
【００４０】
速やかな増殖およびＰＨＡの生産を考慮する栄養に富んだ培地を使用して、生産費用を著しく下げることができる連続的な発酵装置が設計可能である。（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２版，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈａｌｌ編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ発行，１９８４，ｐｐ．１６−２７；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：２３６１−２３７１，１９９７；Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ５９：１８３−１８６，１９９８を参照されたい。）
例として、ワンステップ培養プロセスは、１つの発酵槽から別のものに細菌を移すこと（スケールアップすること））、ならびにバッチ状であることまたは連続的に培地に栄養を与えることを含む。１種以上の必須栄養素が制限される第２培養工程の欠如は、より速い細菌の増殖、より多いＰＨＡ生産、そして安い費用でのいっそう工業的に活発なＰＨＡ生産プロセスを提供する。
【００４１】
ツーステップ培養
あるいは、細菌はたとえば、米国特許第５，３６４，７７８号または米国特許第５，８７１，９８０号または米国特許第６，２２５，４３８号に記載の慣用の方法を含む、ツーステップ培養法に従って培養されてもよい。本発明の細菌にとってそのようなツーステップ培養法を利用することは必ずしも必要ではないが、本発明の細菌はそのような慣用の方法に従って培養されてもよい。
【００４２】
手短に述べると、第１ステージでは、細菌は非増殖制限条件下で培養され、そして細菌は、通常決まった１リットル毎の乾燥細胞重量として測定される、十分な生物量に到達するまで増殖することが許される。第２ステージでは、増殖に必要な少なくとも１種の栄養素が制限され、それで増殖性成長が停止し、増大したＰＨＡ生産が開始する。酸素供給を制限することによりＰＨＡ生産を高めることは可能であるが、制限するための最も実用的な栄養素は窒素、リン、またはやや好ましいものはマグネシウム、イオウ、カリウム、もしくは鉄である。
【００４３】
任意の炭素源がどのステージでも使用されうる。ある先行技術プロセスでは、第１ステージで使用される培地は容易に代謝可能な炭素源、たとえばグルコースのような炭水化物を含み、一方、第２ステージで使用される培地はたとえば脂肪酸または脂肪アルコールのような、より複雑な炭素源を含む。
【００４４】
一部のプロセスでは、細菌細胞は、第１工程で得られた培養液から分離によって、濾過または遠心分離のような慣用の固体‐液体分離手段によって回収され、そのようにして得られた細胞は第２工程で培養に供される。あるいは、第１工程の培養では、欠くことのできない栄養素が実質的に枯渇し、そして、その中で培養されることになる細胞を分離によって回収せずに、培養液は第２工程での培養に移すことができる。
【００４５】
代表的な１方法では、細菌ははじめにすべての栄養素の十分な供給量を含む培地に置かれ、増殖性成長が許される。細胞が増殖し栄養素を消費するに従い、少なくとも１種の必須栄養素、たとえば無機元素の供給は、増殖性成長の停止、および増大したＰＨＡ生産を引き起こす制限レベルに減らされる。栄養素を含む培地が細菌に再供給される場合、そのような培地は少なくともこの必須栄養素において制限され続ける。
【００４６】
別の代表的な方法では、培地は連続的に、または種々の時間間隔で供給され、供給される初期の培地は非‐制限レベルの栄養素を含み、十分な増殖性成長の期間後、供給される培地は少なくとも１種の必須栄養素において制限される。
【００４７】
米国特許第６，２２５，４３８号は、ＰＨＡ‐生産細菌が、より高いレベルの中程度の鎖長のモノマー（たとえば、５炭素より大きいモノマーユニット）を含むＰＨＡコポリマーを生産するようにそれらを培養し、増大した柔軟性およびプロセッシング能、減少した成形中の熱分解および優れた成形性を持ち、好ましくは約３０〜１５０℃の融点温度を有するコポリマーを生じることになる付加的な方法を記載する。方法は、６以上の炭素を含む炭素鎖を持つ脂肪酸および／または脂肪アルコールおよび脂肪酸酸化阻害剤の存在下で細菌を培養することを含む。そのような方法は本発明の細菌と共に使用することができる。
【００４８】
炭素源および脂肪酸酸化阻害剤は、第２工程の培養中、培養の初めのステージから最後のステージまでの任意の時期に添加されてもよい。初めのステージでの添加が好ましい。この方法に記載の適切な脂肪酸酸化阻害剤の例としては、：アクリル酸、２−ブチン酸、２−オクチン酸、Ｓ−フェニルプロプリオン酸、Ｒ−フェニルプロプリオン酸、プロピオール酸、およびｔｒａｎｓ‐桂皮酸が挙げられるが、それらに限定されない。阻害剤は酸自体またはその塩でありうる。アクリル酸ナトリウムは１種の好ましい脂肪酸酸化阻害剤である。脂肪酸酸化阻害剤は、３−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨ）（Ｃ６）、３−ヒドロキシヘプタノエート（ＨＨｐ）（Ｃ７）および／または３−ヒドロキシオクタノエート（ＨＯ）（Ｃ８）コポリマーの蓄積を所望する量まで増やすことができる量で使用してもよいが、細胞への受容可能なレベルの毒性を有する。たとえば、アクリル酸ナトリウムは約１〜４０ｍＭ、好ましくは１０〜３５ｍＭそしてより好ましくは２５〜３２ｍＭの培地中濃度で使用されてもよい。
【００４９】
栄養素制限によるＰＨＡ生産の増大
本発明の細菌は培養中にいずれかの必須栄養素を制限する必要なしに、構成的に顕著なレベルのＰＨＡを生産する。しかし、たとえば、リン、窒素、マグネシウム、スルフェート、カリウムまたは鉄の制限のような栄養素制限により、より高いレベルのＰＨＡ生産が達成されてもよい。好ましくは、制限された栄養素は細菌が脱調節しない栄養素である。たとえば、本明細書に記載の１種のホスフェート‐脱調節微生物由来のＰＨＡ生産はホスフェート制限によって増大しないが、鉄制限によって増大する。ＰＨＡの生産は鉄と別の無機元素の種々の組み合わせを制限することによって最大化されてもよい。
【００５０】
一態様において、培地の鉄濃度はホスフェート対鉄の比が、約５０もしくはそれより高い、約３５０もしくはそれより高い、または約５００もしくはそれより高い、または約２８００もしくはそれより低い、または約１４００もしくはそれより低い、または約９００もしくはそれより低いように制限される。代表的な範囲としては、約５８〜約２７７３、または約３５０〜約１４００、または約５００〜９００、または約６００〜８００、たとえば６９３が挙げられる。
【００５１】
ＰＨＡコポリマーの抽出
細菌は、濾過または遠心分離のような慣用の固体‐液体分離手段を含むがそれらに限定されない、当該技術分野で公知のいずれかの手段によって培養液から採取されてもよい。
【００５２】
ＰＨＡコポリマーは、以下の代表的な手順を含む、当該技術分野で公知のいずれかの方法により細菌から抽出されてもよい。
細菌細胞は培養液から採取され、細胞は水に懸濁した０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で１回洗浄され、その後凍結乾燥される。ＰＨＡコポリマーは細胞乾燥重量に対して約５０：１のクロロホルムで、少なくとも約５時間、還流することによってクロロホルムに抽出される。抽出物はＷｈａｔｍａｎ ＃４濾紙を通して濾過し、最少容積にまで乾燥して濃縮し、１０ｘ容積のジエチルエーテル／ヘキサン３／１ｖ／ｖに粘性溶液を添加することによりＰＨＡコポリマーが沈殿する。材料は栓をしたテフロン遠心分離チューブで遠心分離し、エチルエーテル／ヘキサンで１回洗浄し、その後真空下で一晩乾燥する。それ以上のＰＨＡコポリマーの分別蒸留は沸騰アセトン中で、５時間、固体エチルエーテル／ヘキサン沈殿ＰＨＡコポリマーを還流することによって行われる。アセトン抽出物は窒素下で乾燥し、ＰＨＡコポリマーはクロロホルムに溶かし、エチルエーテル／ヘキサンで沈殿する。あるいは、乾燥した細胞はアセトンで直接抽出し、可溶性ＰＨＡコポリマーは窒素下で乾燥し、クロロホルムに溶かし、そしてエチルエーテル／ヘキサンで沈殿させることにより単離される。
【００５３】
その上、コポリマー生成物は、種々の有用な物理的形態でＰＨＡコポリマーを生産するための種々の刊行された手順を使用して、細菌から回収することができる。これらには、、塩素化溶媒（たとえば、米国特許第４，５６２，２４５号）、非‐塩素化溶媒（ＷＯ公開番号９７／０７２３０）、マージナル（ｍａｒｇｉｎａｌ）溶媒（米国特許第５，８２１，２９９号）を使用した化学的抽出、例が米国特許第４，９１０，１４５号に記載される、ＰＨＡ粒子を分離するための熱および酵素の使用、または空気分級（米国特許第５，８４９，８５４号）および遠心分離（米国特許第５，８９９，３３９号）のような物理的手段の使用が挙げられる。
【００５４】
ＰＨＡ生産の定量化または比較評価
採取された細胞は、乾燥し、重量を量り、そしてＰＨＡは記載された塩素化溶媒を使用して抽出される。抽出されたＰＨＡは一晩真空下で乾燥し、重量を測定し、乾燥した生物量中のＰＨＡ百分率および発酵した培養液中の力価を得る。あるいは、ＰＨＡはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により定量的および定性的に分析される。液体培養物は１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、その後細胞は０．９％塩化ナトリウム生理食塩水で２回洗浄し、一晩凍結乾燥する。乾燥した凍結乾燥細胞材料（８〜１０ｍｇ）は１５％（ｖ／ｖ）硫酸の存在下で加メタノール分解される。成分３−ヒドロキシアルカン酸の得られたメチルエステルはＢｒａｎｄｌ ｅｔ． ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１９７７，１９８８）に従い、（Ｔｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０，１９９０）に詳細に記載されたようにＧＣによりアッセイされる。ＧＣ分析は、直径０．５ｍ Ｐｅｒｍｐｈａｓｅ ＰＥＧ２５Ｍｘキャピラリーカラム 長さ６０ｍを使用して、３Ｌの試料をＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｍｏｄｅｌ ６８５０ガスクロマトグラフ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に注入することにより行われる。
【００５５】
生産されたＰＨＡの使用
本発明はまた、本発明の細菌により生産されたＰＨＡを提供する。そのようなＰＨＡは繊維、成形された品物、およびフィルムに変換され、ＰＨＡに関して当該技術分野で公知のいずれかの適用、または、手術用の糸もしくは骨固定材料（ｂｏｎｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）のような医用材料、おむつもしくはトイレ用品のような衛生用品、マルチフィルム、徐放化学製品のような農業もしくは園芸材料、魚網のような漁業材料、および／またはビン、ファストフードラップおよび箱のような包装材料を含む他のプラスチックに使用される。
【００５６】
実施例
本発明は以下の限定的でない実施例を参照することにより、いっそう詳細に記載され、それらはいっそう十分に本発明を説明することを意図されるが、その範囲を限定すると解釈されることにはならない。本実施例は栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの単離、ＰＨＡ生産のための、上記の脱調節ラルストニアユートローファの発酵プロセス、および微量元素を制限することによるＰＨＡの改善された生産を説明する。
【実施例１】
【００５７】
ホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの単離
ホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファは以下のように単離される。ラルストニアユートローファのＰＨＡネガティブ突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物（３ｍｌ）は２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で連続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた、栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最少化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、比色定量用アルカリ性ホスファターゼ基質、ＢＣＩＰ（４０ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（１％ｗ／ｖ トリプトン、０．５％ｗ／ｖ 酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、ｐＨ７）で培養され、そして細胞は２〜３日間、３０℃でインキュベートされる。非常に濃い暗青色コロニーがラルストニアユートローファのホスフェート‐脱調節株候補として単離される。代表的なホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファは、２００５年６月１日に受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【実施例２】
【００５８】
窒素‐脱調節ラルストニアユートローファの単離
窒素‐脱調節ラルストニアユートローファは以下のように単離される。ラルストニアユートローファのＰＨＡネガティブ突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物（３ｍｌ）は２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で連続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた、栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最少化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、２００ｍＭのアンモニウム類似体メチルアミンと０．１％ｗ／ｖグリシンのような複合窒素源を含む最少寒天培地で培養し、少なくとも３日間、３０℃でインキュベートする。十分に増殖するように見えるコロニーが窒素‐脱調節株候補として単離される。
【実施例３】
【００５９】
二重‐脱調節（ホスフェート‐および窒素共に脱調節された）ラルストニアユートローファの単離
ホスフェートおよび窒素の両方が脱調節されたラルストニアユートローファは以下のように単離される。実施例１由来のラルストニアユートローファのＤＳＭ５４１ホスフェート‐脱調節突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物３ｍｌは２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で継続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最小化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、２００ｍＭのアンモニウム類似体メチルアミンと０．１％ｗ／ｖグリシンのような複合窒素源を含む最少寒天培地で培養し、少なくとも３日間、３０℃でインキュベートする。十分に増殖するように見えるコロニーが二重‐脱調節（ホスフェート‐および窒素共に脱調節された）株候補として単離される。代表的なホスフェート‐および窒素‐脱調節ラルストニアユートローファは２００５年６月１日に受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【実施例４】
【００６０】
ＰＨＡ遺伝子を持つ栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの形質転換
栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファ細胞は種々のＰＨＡ生産遺伝子により形質転換され、たとえばアエロモナスカビアエ由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３により形質転換され、ＰＨＡ生産を可能にする。多様な形質転換法、たとえば、Ｐａｒｋ ｅｔ．ａｌ．に記載されたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：３１−３４，１９９５）またはＦｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ．ａｌ．に記載された大腸菌Ｓ１７−１によるトランス接合（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４７：１９８−２０５，１９８１）によるものが当該技術分野で公知である。
【００６１】
その後、細菌は、脱調節された栄養素、たとえばリン（または二重に脱調節された栄養素、たとえばリンおよび窒素）の非制限濃度を含む培地中で培養され、以下に示すようにＰＨＡ蓄積が測定される。
【実施例５】
【００６２】
ＰＨＡ蓄積の測定
細菌は遠心分離し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ８．０で１回洗浄し、遠心分離し、２〜３ｍＬの水に懸濁し、凍結し、２日間凍結乾燥する。乾燥した細胞は、１ｍＬクロロホルム＋１ｍＬメタノール中１５％硫酸の中で、１００℃で４時間反応させる。試料は１ｍＬのクロロホルムプラス１ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌの添加により相分離される。クロロホルム相は無水硫酸ナトリウム処理して乾燥し、１ｍＬを除去し、窒素下で、またはフード中で一晩、試料バイアル中で乾燥する。試料は１ｍＬアセトンプラス１ｇ／Ｌ安息香酸メチルに溶解し、栓をする。あるいは、１０ｇ／Ｌの安息香酸メチル１００μＬを１ｍＬのクロロホルムに直接添加し；試料に栓をして、分析する。
【００６３】
試料は、２０ｃｍ／秒直線流速に等しい１ｃｍ３／秒流速のヘリウムを使用して、３０ｍ、０．３２ｍｍＩＤ、０．２５μｍフィルムＳｕｐｅｌｃｏｗａｘ１０カラムを使用してＨＰ５８９０ ＧＣで分析する。インジェクターは２２５℃にセットし、ＦＩＤ検出器は３００℃にセットする。１μＬ（５０：１スプリット）注入後、オーブン温度は２分間、８０℃に保ち、１０℃／分で２３０℃まで徐々に温度を上げ、１２分間２３０℃に保つ。あるいは、試料は上記と同じプログラムを使用して、Ｊ＆Ｗ ＤＢ−５ＭＳ（ｐａｒｔ１２２−５５３１、３０ｍ、０．２５ｍｍ ＩＤ、０．１μｍフィルム）で分析するが、最終温度は２３０℃に７分間保つ。
【００６４】
標準物として使用する３−ヒドロキシアルカノエートおよびメチル３−ヒドロキシアルカノエートはＳｉｇｍａ（カタログ＃Ｈ６５０１ ｄｌ−β−ヒドロキシブチル酸、カタログ＃Ｈ４０２３ ３−ヒドロキシカプリル酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ３７７３ ３−ヒドロキシカプリン酸メチルエステル、カタログ＃ Ｈ３５２３ ３−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ４２７３ ３−ヒドロキシミリスチン酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ４５２３ ３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステル）から購入し、３−ヒドロキシカプロン酸メチルエステルはラウリン酸上で培養したアエロモナスヒドロフィラから調製されたＰＨＡコポリマーから確認される。
【実施例６】
【００６５】
ポリ３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生産のためのホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
ポリヒドロキシブチレート‐コ‐ヘキサノエートを生産できるように工学的に操作された、組換えホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの流加培養（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）は、植物油、脂肪酸、脂肪アルコールおよびエステルをフィード基質として使用して行われる。植物油には：コーン油、ダイズ油、パーム核油、綿実油、菜種油、ピーナッツ油、それらの分別蒸留されたオイル、それらの混合物が挙げられる。流加培養はまた：フルクトース、グルコン酸、グルコース、および糖蜜を含む炭水化物フィードを利用するＰＨＡを作ることを可能にし、その一部は特定のフィード上での増殖に関して選択された株を必要とする。
【００６６】
株は初めに栄養素培養液１００ｍＬ中、３０℃でＯＤ６００が２．０になるまで培養される。次にこの培養液を使用して、以下の培地を使用する３Ｌの種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）発酵槽に接種し、培養する：
【００６７】
【表１】
【００６８】
培地を１２１℃で２０分間滅菌し、冷やし、３０ｇ／Ｌ植物油および５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加する。以下で操作する：
【００６９】
【表２】
【００７０】
培養物はＯＤ６００＝６９．９の時に採取し、１７５ｍＬの培養物を３．５Ｌの主発酵槽に接種する。培地中のホスフェートの濃度はＮｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ３００ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、決して制限していないことを示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
以下で操作する：
【００７３】
【表４】
【００７４】
以下の時点に、全部で１１０ｇ／Ｌの植物油を与える：
【００７５】
【表５】
【００７６】
株はホスフェート制限培地中でも培養され、その培地において通常２０ｈ〜３６ｈの培養時間の培養中に添加されたリンの完全な利用は、ＰＨＡ生産を増すように野生型株を誘導する。
【００７７】
【表６】
【００７８】
種発酵槽の５％ｖ／ｖを接種する。
以下で操作する：
【００７９】
【表７】
【００８０】
以下の時点に、全部で１１０ｇ／Ｌの植物油を与える：
【００８１】
【表８】
【００８２】
より栄養豊富な培地は、最小のラグタイムで細胞が増殖することを可能にする。より高いホスフェート濃度で培養された細胞は、ＰＨＡ生産に関して構成的であり、細胞増殖のすべての時点でＰＨＡを蓄積する。より高いホスフェート濃度で培養された細胞は、制限ホスフェートで培養された細胞によって生産されたＰＨＡ量の１６５％でＰＨＡを生産する。比べると、脱調節されないバックグラウンドを持つＰＨＡ生産Ｒ．ユートローファは、高ホスフェート培地において、制限ホスフェート培地の５５％だけのＰＨＡしか生産しない。
【００８３】
Ｒ．ユートローファの活発な増殖相（対数増殖期）中の顕著なレベルの構成的なＰＨＡ生産が証明されるのはこれが初めてであり、非制限ホスフェート濃度の存在にかかわらず、より早い時点における最大に近いＰＨＡの取込を導く。
【実施例７】
【００８４】
ＰＨＡ生産のための、窒素‐脱調節、二重‐脱調節、および他の栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
Ｒ．ユートローファの窒素‐脱調節株、二重‐脱調節株（ホスフェート‐および窒素‐の両方の脱調節）、および他の栄養素‐脱調節株は実施例６に記載のように非制限栄養素培養液中で培養され、生来のＲ．ユートローファより高い濃度でＰＨＡを生産する。
【実施例８】
【００８５】
ＰＨＡ生産のための栄養に富んだ培地中での栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
栄養素‐脱調節株は、大量のＰＨＡを生産するために、栄養素を制限することによる誘導を必要としない。したがって、栄養素の豊富な供与源である複合培地が添加されて、高いＰＨＡ生産を保持しながら全体的な生物量生産を増し、そうして定められた培養容器中のＰＨＡの全体的な力価を増やしてもよい。栄養に富んだ培地は酵母抽出物、ペプトン、トリプトン、アミノ酸、牛肉抽出物、ならびに有機窒素、ホスフェートおよび他の栄養素の他の供与源を含んでいてもよい。
【実施例９】
【００８６】
ＰＨＡ生産のためのより栄養に富み、安価な培地中での栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
栄養素‐脱調節株は、大量のＰＨＡを作るために栄養素を制限することによる誘導を必要としない；しかし、高価な栄養に富んだ培地を添加することは依然として経済的であるはずがない。欠くことのできない栄養素を過剰に供給することによりＰＨＡ生産を阻止することを懸念せずに、たとえばリン酸、アンモニウム塩、ニトレート、ニトライト、コーンスティープリカー、ダイズ加水分解物、未精製グリセリン、乳清、工業用プロセスオイル、炭水化物もしくはタンパク質廃物流（ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓｔｅ ｓｔｒｅａｍｓ）、または他の高価でない単純な、もしくは複雑な培地を供給することにより、いっそう経済的に栄養素が補足される。
【実施例１０】
【００８７】
微量元素を制限することによる栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファにおける高レベルのＰＨＡ生産の誘導
Ｒ．ユートローファのホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節株は、それぞれ非制限リンおよび窒素培地におけるＰＨＡの構成的生産者である。培地における微量元素を制限しながら、植物油を与えることにより、ＰＨＡ生産は増加する。
【００８８】
ホスフェートの、またはホスフェートおよび窒素の栄養素‐調節が解除され、そしてポリヒドロキシブチレート‐コ‐ヘキサノエート（Ｃ４Ｃ６）を生産することが可能なラルストニアユートローファは、以下のものを含む培地で培養される：
【００８９】
【表９】
【００９０】
細菌はバッチ毎に植物油を与えられる。典型的なレベルは５ｍｌ／Ｌ微量元素、３．８５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．６７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４である。
細胞重量で８５％を越えるレベルのＰＨＡが観察される。比較して、ホスフェート脱調節細胞はホスフェート制限培地において３５％のＰＨＡ、そして非‐制限培地において４９％のＰＨＡを蓄積する。脱調節されない細胞は非‐制限培地においてＰＨＡを蓄積せず、微量元素制限培地において１．９％だけのＰＨＡを蓄積する。
【００９１】
その上、アエロモナスカビアエ由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（ｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３）（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するホスフェート‐脱調節突然変異体の場合、培地中の微量元素を８０％まで制限することは、同じ生物量においてホスフェート制限条件下の３５％ＰＨＡのＰＨＡ生産に比較して、７４％ＰＨＡまでＰＨＡ生産を改善する。
【００９２】
アエロモナスカビアエｐｈａＣ遺伝子を含むプラスミドによって形質転換されたＲ．ユートローファ（実施例１に記載）は、２倍のリン酸塩が添加される対照培地、および微量元素の量が調節される試験培地を使用して、３．５Ｌの出発容量で発酵を行う。細菌はコーン油を与えられ、酸は水酸化アンモニウムによって中和される。試験培地中の微量元素の制限により、対照培地に比較して細胞のＰＨＡ含量が倍加する。微量元素の量を対照培地の量の２０％に制限することが、対照培地上での増殖に等価な細胞増殖を支持するために十分でありながら、なおかつ細胞の増加したＰＨＡ含量を提供する。
【００９３】
以下の表１は、ホスフェート脱調節細胞の増殖に対する微量元素制限の効果およびＰＨＡ蓄積対微量元素を示す。ホスフェート制限条件下で培養される場合、細胞はＰＨＡの重量（乾燥細胞重量ごとのＰＨＡの重量（ＤＣＷ））で３５％を含み、０．５１ｇＰＨＡ／Ｌ／ｈの生産性を有し、３９．３ｇ／ｌのＰＨＡを生産する。過剰なホスフェートを供給しながら、９０％以上まで微量元素を厳しく制限することは、細胞毎の高いＰＨＡ蓄積を可能にするが、細胞増殖およびＰＨＡ生産を制限する。８０％まで微量元素を枯渇することは完全な細胞増殖および８４．１ｇ／ＬのＰＨＡ生産を可能にする（重量で７３．６％のＰＨＡおよび１．１７ｇＰＨＡ／Ｌ／ｈの生産性）。
【００９４】
【表１０】
【実施例１１】
【００９５】
鉄を制限することによる栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファにおける改善されたＰＨＡ生産
微量元素の量を変化させる別の試験において、対照培地に存在する鉄の２０％を含むが、他の微量元素は完全な量を含む培地は同じ結果を生じる。これらの結果は、鉄の制限が所望するＰＨＡ生産増大効果を提供することを示唆する。
【００９６】
増大したＰＨＡ蓄積を証明する、培養に使用される代表的なホスフェート対鉄の比（モル濃度／モル濃度）は以下に示す。改善されたＰＨＡ蓄積を証明する発酵培地は６９３：１の比のホスフェート（４１．６ｍＭ）と鉄（０．０６ｍＭ）を含む。１，３８７：１の比の場合、鉄濃度を半分に減らすか、ホスフェート濃度を倍にすることも可能である。ホスフェート対鉄の比は、約５８：１〜約２７７３：１まで変化してもよい。Ｐ対Ｆｅの代表的な比は限定することを意図しない。当業者はそのような比を決定しうる。
【００９７】
本出願を通じて、種々の刊行物が引用される。本明細書で引用される開示の特定の側面を含むがそれらに限定されないこれらの刊行物全体のその開示は本出願に参照として援用され、本明細書に記載されクレームされる本発明のされた日における当業者に公知の当該技術分野の水準をその中により十分に説明する。
【００９８】
本特許文書の開示は著作権保護に供される要素を含む。Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ特許ファイルおよび記録に見られるように、著作権所有者は、だれであれ特許文書または特許開示を複写することに意義はないが、それ以外の点ではすべての著作権はどんなものでも確保される。
【００９９】
本発明の特定の態様は説明され、記載されているが、本発明の意図および範囲から逸脱せずに、種々の他の変更および改変を行いうることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内であるそのような変更および改変のすべてを添付の特許請求の範囲に包含することが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は高いレベルのポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）バイオポリマーを構成的に生産する突然変異した微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エネルギー貯蔵化合物としてヒドロキシアルカン酸（ポリヒドロキシアルカノエート、ＰＨＡ）のポリマーを合成して蓄積する、非常に多くの微生物の能力が以前から認識されている。このクラスの最も一般に見いだされる化合物はポリ（Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）である。しかし、一部の微生物種はコポリマーを蓄積し、それらはヒドロキシブチレートに加え、より長い鎖のヒドロキシアルカノエートを含むことがある。これらのＰＨＡは、生体適合性、生分解性であり、ポリエチレンおよびポリプロピレンのような石油化学を基礎にしたポリマーの特性に類似する物理的特性を提示する熱可塑性物質であるため、これらのバイオポリマーに関心が集まってきている。
【０００３】
ＰＨＡを生産する代表的な１種の細菌、オーテルシアユートローファ（ラルストニアユートローファまたはアルカリゲネスユートロファスとしても公知）は、ホスフェートまたは窒素のような欠くことのできない栄養素の制限に反応して、発酵中にＰＨＡを蓄積する。ＰＨＡは典型的には２段階（ツーステップ）の細菌発酵によって生産される。第１の段階では細菌は増殖性成長を可能にする十分な供給量の栄養素を含む培地で培養される。細菌は、通常１リットル毎の乾燥細胞重量として測定される十分な生物量に到達するまで、増殖することを許される。第２の段階では、成長に必要な少なくとも１種の栄養素、たとえば窒素またはリンの有用性が制限され、細胞分裂を制限し、ＰＨＡ生産を誘導する効果を有する。栄養素制限がＰＨＡの蓄積を誘導する場合、第２の段階まで顕著なＰＨＡ生産は起こらない。
【０００４】
大部分のＰＨＡ‐生産微生物は、非制限の増殖条件下で顕著なレベルのＰＨＡを生産しない。たとえば、オーテルシアユートローファ（ラルストニアユートローファ）は、栄養素が全く制限されない条件下で培養される場合、乾燥細胞の百分率として３％のＰＨＡだけしか生産しないことが報告されている。Ｒｅｐａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：５８５−５９１，１９７６。
【発明の開示】
【０００５】
制限されないレベルの栄養素の存在下において、顕著なレベルのＰＨＡを生産する改変された細菌の必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、増殖性成長を可能にするために十分な量の栄養素を含む培地の存在下で、非改変細菌に比較して驚くべき量のＰＨＡを生産する、単離された、栄養素‐脱調節、改変細菌を提供する。そのような細菌は、非制限レベルの窒素、リン、マグネシウム、スルフェートおよびカリウムのような重要な栄養素の存在下で顕著なレベルのＰＨＡを生産する。
【０００６】
本発明の新規な単離された細菌は、（ａ）栄養素のレベルが制限されない培養条件下で乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産すること、および（ｂ）鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを生産することが可能である。本発明は場合により、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で約５０％以上のＰＨＡを生産し、鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下、少なくとも１０％のＰＨＡ生産の増加を提示する、以前に当該技術分野で公知の単離された細菌を除外する。
【０００７】
代表的な細菌は、ラルストニア種、アルカリゲネス種、オーテルシア種、ズーグロエア種、バチルス種、アエロモナス種、アゾトバクター種、クロストリジウム種、ノカルジア種、ハロバクテリウム種、もしくはシュードモナス種、またはその組み合わせから選択される。本発明の細菌は、アルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。アルカリゲネスレータスは細胞の重量の約８８．３％でＰＨＢを生産し（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｔａｂ．５９：３８７−３９３，１９９８）、そしてアゾトバクタービンランディは細胞の重量の約９４％でＰＨＡを生産する（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：１０６−１１４，１９９５）。
【０００８】
そのような改変された細菌は、ホスフェート‐脱調節、または窒素‐脱調節のいずれかのように、１種の栄養素に関して調節が解除されてもよく、あるいは、たとえばホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節の両方であるように、２種以上の栄養素に関して調節が解除されてもよい。好ましくは、細菌は栄養素‐脱調節ＰＨＡ‐生産微生物、または付加的に、生来でない（non-native）ＰＨＡ‐生産遺伝子、たとえばｐｈａＣ、Ａおよび／またはＢを含むように工学的に操作される、ＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体である。
【０００９】
代表的な細菌は、それぞれ受託番号ＰＴＡ−６７５９およびＰＴＡ−６７６０のもとで、２００５年６月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【００１０】
本発明はまた、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌の確認された特徴のすべてを提示する単離された細菌を提供する。そのような細菌の代表的な具体化は、寄託された細菌の子孫または寄託された細菌の突然変異体であり、それらは寄託された細菌の確認された特徴を保持する、すなわち、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、改変されていない微生物に比較して、増大したＰＨＡ生産を引き起こす、同じまたは類似の突然変異を保持する。
【００１１】
その上、本発明は本発明の単離された細菌および培地を含む培養物を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載の、本発明のいずれかの細菌を使用してＰＨＡを生産する方法を提供する。そのような生産方法は細菌がＰＨＡを生産するために適切な培地中で細菌を培養する工程を含む。さらに、付加的な工程は、細菌を採取し、および／または細菌からＰＨＡを抽出することを含む。あるいは、ＰＨＡが培地に分泌される場合、方法は適切な培地中で細菌を培養し、培地からＰＨＡを抽出する工程を含んでいてもよい。
【００１２】
十分な栄養素が微生物に供給され、増殖またはＰＨＡの生産を可能にする限り、当該技術分野で公知のどのような培地および培養方法が使用されてもよい。一側面において、本発明はしたがって、必須栄養素が制限されない、すなわち、増殖性成長の停止を引き起こす程度まで決して制限されないような濃度で栄養素が存在する培地中でそのような細菌を培養する方法を提供する。例として、培養プロセスは、培地中の栄養素が増殖性成長を著しく損なうことになる濃度にまで制限されない場合、１つの発酵槽から別のものに細菌を移すこと（スケールアップすること）、ならびにバッチ状であることまたは継続的に栄養を与えることを含む。
【００１３】
別の側面において、本発明はさらに２段階培養法に従った、本発明の細菌を培養する方法を提供し、該方法では、細菌はたとえば無機元素のような１種以上の必須栄養素が制限される培地中における培養の第２の工程を経験する。
【００１４】
本発明はまた、細菌が脱調節されていない微量元素を制限することによってＰＨＡを生産する、改善された方法を提供する。たとえば、十分な期間の増殖性成長後、たとえばマグネシウム、スルフェートまたは鉄、好ましくは鉄のような、リン以外の元素の制限レベルを含む培地中で、ホスフェート‐脱調節細菌を培養することによって、ＰＨＡの高められた生産が達成されてもよい。
【００１５】
Ｃ４と中程度の鎖長のモノマー（たとえば５より多い炭素を持つモノマーユニット）からなるＰＨＡコポリマーを生産する方法が提供される。代表的なコポリマーには、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、およびＣ１８コポリマー、たとえば、３−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨ）（Ｃ６）、３−ヒドロキシヘプタノエート（ＨＨｐ）（Ｃ７）および／または３−ヒドロキシオクタノエート（ＨＯ）（Ｃ８）を含むコポリマー、とりわけＣ４およびＣ６（とりわけ３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシヘキサノエートまたは対応する酸）を含むコポリマー、たとえば、ポリヒドロキシブチレート−コ−ヘキサノエート（Ｃ４‐Ｃ６）、そして最もとりわけ８０〜９８ｍｏｌ％Ｃ４および２〜２０ｍｏｌ％Ｃ６の範囲のコポリマーが挙げられる。付加的なコポリマーは米国特許第６，２２５，４３８号に記載される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、増殖性成長を可能にするために十分な量の栄養素を含む培地の存在下で、非改変細菌に比較して驚くべき量のＰＨＡを生産する、単離された、改変「栄養素‐脱調節」細菌を提供する。そのような改変された細菌は、たとえばホスフェート‐脱調節、または窒素‐脱調節のいずれかのように、１種の栄養素に関して調節が解除されてもよく、あるいは、たとえばホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節の両方であるように、２種以上の栄養素に関して調節が解除されてもよい。他の代表的な改変細菌には、マグネシウム‐脱調節、スルフェート‐脱調節、カリウム‐脱調節または鉄‐脱調節微生物が挙げられる。
【００１７】
代表的な態様において、本発明の細菌は、（ａ）栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも１０％、２０％、２５％、もしくは３０％、またはそれより多いＰＨＡを生産すること、および（ｂ）鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは８０％、またはそれより多いＰＨＡを生産することが可能である。そのような細菌には、ＰＨＡを生産する、当該技術分野で公知のどんな細菌も含まれるが、それぞれ細胞重量の９０％を越えるレベルまでＰＨＢを蓄積するアルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ突然変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。
【００１８】
ホスフェート脱調節細菌においてＰＨＡを生産することにより、重要な栄養素の制限を全く含まない栄養に富んだ培地の存在下でさえＰＨＡ生産は構成的に起こる。発酵の間中、栄養に富んだ培地、またはより栄養に富み、安価な培地を利用する能力は、軽減された費用において、より速い細菌の増殖、より多いＰＨＡ生産、そしていっそう工業的に健全なＰＨＡ生産プロセスを可能にする。（実施例８および９を参照されたい）。１種以上の栄養素を制限する必要性を除くことはまた、連続的な発酵を可能にする（すなわち、２段階培養法の必要性を排除する）。
【００１９】
本明細書で使用する“単離された細菌”は、確認され、その自然環境の要素から分離されている細菌の単独株の集団を表す。たとえば、人工的な培地を含む培養組成物の一部である細菌は単離されたと判断される。
【００２０】
本明細書で使用する“非制限レベルの栄養素を含む培地”または“栄養素のレベルが制限されない培地”は、細菌が速やかに増殖することを可能にするためのすべての栄養素の適切な供給量を含む培地を表す。同様に、“栄養素の非制限レベル”は、速やかな増殖性成長を支持するために適切な、培地におけるその栄養素の濃度を表す。逆に、“栄養素が制限される培地”は、細菌の増殖性成長を本質的に停止させる濃度にまでその栄養素のレベルが減らされる培地を表し、そして“栄養素の制限されたレベル”は細菌の増殖性成長を本質的に停止させる、培地中のその栄養素の濃度を表す。
【００２１】
本明細書で使用する“増殖性成長”は、急激な増殖相中に観察されるような、細菌数の速やかな増加を表す。
本明細書で使用する“リン‐脱調節”細菌は、リンまたはホスフェート調節における欠陥を有し、その結果通常はリン枯渇によってアップレギュレートされる（または抑制される）１種以上の遺伝子が構成的にアップレギュレートされる（または抑制される）細菌を表し、たとえリンの枯渇がなくても細菌は増大したレベルのＰＨＡを合成する結果になる。同様に、“窒素‐脱調節”細菌は、窒素調節における欠陥を有し、そのため通常は窒素枯渇によってアップレギュレートされる（または抑制される）１種以上の遺伝子が構成的にアップレギュレートされる（または抑制される）細菌を表し、たとえ窒素が枯渇しなくても細菌は増大したレベルのＰＨＡを合成する結果になる。他の栄養素‐調節が解除された細菌の意味は同様に対応する。
【００２２】
本明細書で使用する“ＰＨＡ‐ネガティブ”突然変異細菌は、ＰＨＢまたはＰＨＡを生産しないように突然変異している細菌を表す。たとえば、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．７１：２８３−４８３０，１９７０］を参照されたい。そのような細菌は、所望するＰＨＡ遺伝子を挿入することにより、たとえば、アエロモナスカビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３により形質転換することによってＰＨＡを生産するように遺伝子工学的に操作されてもよい。
【００２３】
限定的でない例として、たとえば、リン‐脱調節細菌に関しては、そのような細菌は、リンまたはホスフェート検出に関係する遺伝子または調節領域（たとえば、プロモーター、オペレーター、レギュレーターにとってのＤＮＡ結合部位など）（その結果、何もない場合に細菌がリン枯渇を検出するように見える）；またはホスフェート輸送に関係する遺伝子もしくは調節領域；またはリン枯渇に反応して他の遺伝子を活性化するポジティブホスフェートレギュレーター（または逆にリン枯渇に反応して遺伝子を抑制する別のレギュレーター）の遺伝子または調節領域；または過剰なホスフェートに反応して遺伝子を抑制するネガティブホスフェートレギュレーター（または逆に過剰なホスフェートに反応して遺伝子を活性化する別のレギュレーター）の遺伝子または調節領域；または転写がそのようなポジティブまたはネガティブホスフェートレギュレーターによって調節されるダウンストリーム遺伝子（またはその調節領域）の１種；または主要なポジティブおよびネガティブホスフェートレギュレーターを改変するか、または調節する遺伝子（またはその調節領域）の１種、における突然変異を有していてもよい。嫌気的および好気的条件下で異なる調節経路が存在しうる。
【００２４】
リン調節に関係する代表的な遺伝子には、大腸菌遺伝子ｐｓｔＡ（ｐｈｏＡ）（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｓｔＢ（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｈｏＷ（ｐｓｔＣ）（ホスフェート輸送に関係）、ｐｈｏＳ（ホスフェート結合タンパク質）、ｐｈｏＵ（ホスフェート輸送に関係する）、ｐｈｏＥ（外膜タンパク質ポーリン）、ｕｇｐＢ（グルセロール−３−ホスフェート結合タンパク質）、ｐｈｏＲ（ネガティブホスフェートレギュレーター）、ｐｈｏＢ（ポジティブホスフェートレギュレーター）、ｐｈｏＭ（ポジティブホスフェートレギュレーター）、ｐｓｉＥ（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）、ｐｈｎ（ｐｓｉＤ）（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）、ｐｈｏＧ（ｐｓｉＨ）（ホスフェート飢餓状態誘導性遺伝子）に相同な遺伝子が挙げられる。たとえば以下の参考文献中のそのような遺伝子および経路の説明を参照されたい：Ａｍｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１８４：２４１−２５０，１９８４；Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｏｉｌ．１９０：３７−４４，１９８６；Ｗａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ １３２６−１３３３，１９８７；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５６０１−５６０６，１９８９；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２１８６−２１９３，１９９８；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１１２６−１１３３，１９９９；ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：５５９６−５５９９，２０００。
【００２５】
窒素調節に関係する代表的な遺伝子には、ＡｍｔＡ（アンモニウム輸送に関係する）、ＧＩｎＤ（ウリジリルトランスフェラーゼ／ウリジリル‐除去酵素）（細胞内窒素状態を感知することに関係する）、ＧＩｎＢ（Ｐｌ１）（細胞内窒素状態を感知することに関係する）、ＧＩｎＫ（窒素調節に関係するシグナル伝達タンパク質）、ｇｌｎＥ（アデニリルトランスフェラーゼ）、ＮｔｒＢ（窒素レギュレーターである感覚ヒスチジンタンパク質キナーゼ）、ＮｔｒＣ（窒素反応レギュレーターであるＤＮＡ結合タンパク質）、ｒｐｏＮ（一部のシュードモナス種）、ＧＩｎＲ（過剰な窒素によって活性化されるバチルスにおけるネガティブ窒素レギュレーター）、ＴｎｒＡ（窒素制限によって活性化されるバチルスにおけるレギュレーター）、ＣｏｄＹ（過剰な窒素によって活性化されるバチルスにおけるネガティブレギュレーター）が挙げられる。ＮｔｒＢＣによって転写的に調節される遺伝子には、ｇｌｎＡＬＧ、ｇｌｎＨＰＱ、ａｒｇＴ、ｈｉｓＪＱＭＰ、ｎａｓＦＥＤＣＢＡ、ｎａｃ、ｇｌｔＦが挙げられる。たとえば以下の参考文献中のそのような遺伝子および経路の説明を参照されたい：Ｍｅｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：６０４−６２２，１９９５；Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：４３１−４３７，１９９８；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：２２３−２３２，１９９９；およびＢｌａｕｗｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：２０３−２１４，２００２。
【００２６】
ラルストニアメタリデュランスＣＨ３４、以前はラルストニアユートローファおよびアルカリゲネスユートロファス（そしてクプリアビドスネカターもしくはオーテルシアユートローファとしても呼ばれていた）は配列決定されていて、配列データはＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）から利用可能である。ラルストニアユートローファ、以前はアルカリゲネスユートロファスＣＨ３４のゲノム配列もＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから利用可能である。ラルストニアソラナセラムのゲノム配列は、ＧｅｎｏｓｃｏｐｅおよびＮＣＢＩから利用可能である。ラルストニアゲノム配列は、たとえばＢＬＡＳＴを使用して検索し、大腸菌または他の細菌のレギュレーターに対する相同性を持つ配列を確認してもよい。
【００２７】
細菌は放射能または他の突然変異誘発物質の適用により改変されてもよく、あるいは細菌は遺伝子工学により改変されてもよい。実施例１〜３は所望する特徴を持つ細菌の変異誘発および選択を説明する。手短に述べると、Ｒ．ユートローファのＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体は突然変異を誘発され、ホスフェートの非制限濃度を含む培地で突然変異を誘発された細菌を培養し、アルカリ性ホスファターゼ活性を検出することにより、ホスフェート脱調節に関して選択される。他の栄養素‐脱調節突然変異細菌は、類似の手順（たとえば、突然変異を誘発し、その後窒素、または他の所望する栄養素の非制限量を含む培地で培養すること）を使用して得られる。
【００２８】
好ましい突然変異細菌は活発な増殖性成長相（対数相としても公知）中に、構成的なＰＨＡ生産の増大したレベルを提示し、ホスフェート、窒素などのような栄養素の非制限濃度の存在下においてさえ、より早い時点で、ほぼ最大に近いＰＨＡの蓄積を導く。
【００２９】
このような方法で作製された代表的な細菌は、２００５年６月１日にそれぞれ受託番号ＰＴＡ−６７５９およびＰＴＡ−６７６０のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されている。
【００３０】
所望する脱調節の特徴に帰着する、同じか、または類似の突然変異を保持する細菌の子孫または突然変異体は本発明によって企図される。たとえば、そのような細菌は、それらが栄養素‐脱調節の特徴を保持する限り、さらに突然変異を誘発されて、付加的な望ましい特徴を持つ細菌が単離されてもよい。付加的な望ましい特徴はまた、組換え遺伝子工学的操作を通じて与えられてもよい。たとえば、所望する特徴に関与する新規な遺伝子がプラスミドまたは組換えにより導入されてもよく、あるいは細菌のゲノム中の既存の遺伝子または調節領域が変異してそれらが活性化または不活性化されてもよい。
【００３１】
その上、観察されたホスフェート‐または窒素‐脱調節表現型に関与する突然変異は、たとえば、変異した細菌のゲノムまたは遺伝子産物を配列決定して突然変異を確認すること、または制限フラグメント長多形解析（制限酵素により消化して突然変異によって作製された異なる制限部位を確認すること）、またはハブリダイゼーションパターン解析（プローブと同であるゲノム配列と突然変異を含むゲノム配列を識別するハイブリダイゼーション条件下での、既知の配列のプローブへのハイブリダイゼーション）、または当該技術分野で公知の突然変異検出のための他の方法により確認することができる。突然変異を確認した後で、野生型細菌はそれらのゲノムにおける挿入または欠失により同じ領域（たとえば、調節領域または遺伝子）に突然変異を含むように遺伝子工学的に操作されてもよい。
【００３２】
細菌がＰＨＡ‐ネガティブ突然変異体である場合、それらは好ましくは、たとえば、アエロモナスカビアエ由来のｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するプラスミドにより形質転換することによって、所望するＰＨＡ‐生産遺伝子、たとえばｐｈａＣ、Ａおよび／またはＢを含むように付加的に工学的に操作され、そのことがＰＨＡ生産を可能にする。代わりとなる代表的な遺伝子には、シュードモナスフルオレセンス由来のｐｈａＣ（米国特許第６，４７５，７３４号）またはアエロモナスハイドロフィラ４ＡＫ４由来のｐｈａＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が挙げられる。米国特許第５，６６１，０２６号および５，７９８，２３５号を参照されたい。
【００３３】
細菌
本発明はポリヒドロキシアルカノエートを生産しうる任意の細菌を企図する。これらはには、オーテルシア、アルカリゲネス、ラルストニア、ズーグロエア、バチルス、アエロモナス、アゾトバクター、クロストリジウム、ノカルジア、ハロバクテリウムおよびシュードモナス属に属する種が挙げられるが、それらに限定されない。細菌は自然のままでも、遺伝子工学的に操作されてもよい。とりわけ、ラルストニア、バチルス、シュードモナスおよびアゾトバクターが典型的に使用される。以前にラルストニアユートローファとして公知であり、以前アルカリゲネスユートロファスとして呼ばれた、オーテルシアユートローファが最も典型的に使用される。ラルストニア（アルカリゲネス）属に属する、これらの細菌の細菌学的特性はたとえば、“ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＶＥ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，８版，Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ”に記載される。本発明の細菌は、それぞれ細胞重量の９０％を越えるレベルまでＰＨＡを蓄積するアルカリゲネスレータスおよびアゾトバクタービンランディ突然変異体（ＮＡＤＨオキシダーゼにおける突然変異）のような、栄養素のレベルが制限されない培養条件下、乾燥細胞重量で少なくとも５０％を越えるＰＨＡを生産することが公知の細菌を明確に除外する。
【００３４】
培地
細菌の増殖に必要な必須栄養素には炭素源および、通常容易に吸収可能な形態で、典型的には水溶性の塩として存在する少なくとも以下の無機元素：窒素、リン、イオウ、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄が挙げられ、場合により、微量のマンガン、亜鉛、ニッケル、クロム、コバルトおよび／または銅を伴う。
【００３５】
炭素源は、合成の、天然の、または改変された天然の炭素源を含む、細菌によって利用されうるいずれかの物質である。代表的な炭素源には、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、およびより長い鎖の脂肪酸を含む脂肪酸；または脂肪酸の塩、エステル（ヒドロキシルが置換された酸の場合にはラクトンを含む）、無水物、アミドもしくはハライド；コーン油、ダイズ油、パーム核油、綿実油、菜種油、ピーナッツ油、これらの型の植物油のいずれかの分別蒸留されたオイル、および／またはその誘導体、および／またはその混合物のような植物油源を含むオイル；メタノール、エタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールおよびデカノールを含むアルコールならびにイソおよび他の分岐鎖脂肪酸またはアルコールおよび酢酸；二酸化炭素、酵母抽出物、糖蜜、ペプトン、および食肉抽出物のような他の炭素源、アラビノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトールおよびイノシトールのような糖類が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
代表的な窒素源には、アンモニア、アンモニウム塩、ニトレートのような無機窒素化合物、および／または尿素、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、カゼイン、ペプトン、酵母抽出物、および食肉抽出物のような有機窒素含有化合物が挙げられる。
【００３７】
代表的な無機成分には、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム塩、ホウ素化合物、またはヨウ素化合物が挙げられる。
【００３８】
場合により、ビタミンが培地に含まれうる。
細菌培養法
本発明の栄養素‐脱調節細菌は必須栄養素が制限されない培地においても、十分なレベルのＰＨＡ生産を達成しうる。細菌を培養する方法は、単に適切な培地で細菌を培養することを含む。細菌は増殖中でさえ、顕著なレベルのＰＨＡを生産することになる。当該技術分野で公知の、および／または本明細書に記載の細菌の増殖性成長を促進する、任意の培地および適切な培養条件が使用されてよい。
【００３９】
培養温度は、微生物に依存して変化してもよい。ラルストニアの場合、代表的な培養温度は、約２０〜４０℃、好ましくは約２５℃〜３５℃の範囲であってもよく、そしてｐＨはたとえば、約６〜１０、好ましくは約６．５〜９．５である。培養はこれらの条件下、好気的に行われる。
【００４０】
速やかな増殖およびＰＨＡの生産を考慮する栄養に富んだ培地を使用して、生産費用を著しく下げることができる連続的な発酵装置が設計可能である。（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２版，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｈａｌｌ編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ発行，１９８４，ｐｐ．１６−２７；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：２３６１−２３７１，１９９７；Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ５９：１８３−１８６，１９９８を参照されたい。）
例として、ワンステップ培養プロセスは、１つの発酵槽から別のものに細菌を移すこと（スケールアップすること））、ならびにバッチ状であることまたは連続的に培地に栄養を与えることを含む。１種以上の必須栄養素が制限される第２培養工程の欠如は、より速い細菌の増殖、より多いＰＨＡ生産、そして安い費用でのいっそう工業的に活発なＰＨＡ生産プロセスを提供する。
【００４１】
ツーステップ培養
あるいは、細菌はたとえば、米国特許第５，３６４，７７８号または米国特許第５，８７１，９８０号または米国特許第６，２２５，４３８号に記載の慣用の方法を含む、ツーステップ培養法に従って培養されてもよい。本発明の細菌にとってそのようなツーステップ培養法を利用することは必ずしも必要ではないが、本発明の細菌はそのような慣用の方法に従って培養されてもよい。
【００４２】
手短に述べると、第１ステージでは、細菌は非増殖制限条件下で培養され、そして細菌は、通常決まった１リットル毎の乾燥細胞重量として測定される、十分な生物量に到達するまで増殖することが許される。第２ステージでは、増殖に必要な少なくとも１種の栄養素が制限され、それで増殖性成長が停止し、増大したＰＨＡ生産が開始する。酸素供給を制限することによりＰＨＡ生産を高めることは可能であるが、制限するための最も実用的な栄養素は窒素、リン、またはやや好ましいものはマグネシウム、イオウ、カリウム、もしくは鉄である。
【００４３】
任意の炭素源がどのステージでも使用されうる。ある先行技術プロセスでは、第１ステージで使用される培地は容易に代謝可能な炭素源、たとえばグルコースのような炭水化物を含み、一方、第２ステージで使用される培地はたとえば脂肪酸または脂肪アルコールのような、より複雑な炭素源を含む。
【００４４】
一部のプロセスでは、細菌細胞は、第１工程で得られた培養液から分離によって、濾過または遠心分離のような慣用の固体‐液体分離手段によって回収され、そのようにして得られた細胞は第２工程で培養に供される。あるいは、第１工程の培養では、欠くことのできない栄養素が実質的に枯渇し、そして、その中で培養されることになる細胞を分離によって回収せずに、培養液は第２工程での培養に移すことができる。
【００４５】
代表的な１方法では、細菌ははじめにすべての栄養素の十分な供給量を含む培地に置かれ、増殖性成長が許される。細胞が増殖し栄養素を消費するに従い、少なくとも１種の必須栄養素、たとえば無機元素の供給は、増殖性成長の停止、および増大したＰＨＡ生産を引き起こす制限レベルに減らされる。栄養素を含む培地が細菌に再供給される場合、そのような培地は少なくともこの必須栄養素において制限され続ける。
【００４６】
別の代表的な方法では、培地は連続的に、または種々の時間間隔で供給され、供給される初期の培地は非‐制限レベルの栄養素を含み、十分な増殖性成長の期間後、供給される培地は少なくとも１種の必須栄養素において制限される。
【００４７】
米国特許第６，２２５，４３８号は、ＰＨＡ‐生産細菌が、より高いレベルの中程度の鎖長のモノマー（たとえば、５炭素より大きいモノマーユニット）を含むＰＨＡコポリマーを生産するようにそれらを培養し、増大した柔軟性およびプロセッシング能、減少した成形中の熱分解および優れた成形性を持ち、好ましくは約３０〜１５０℃の融点温度を有するコポリマーを生じることになる付加的な方法を記載する。方法は、６以上の炭素を含む炭素鎖を持つ脂肪酸および／または脂肪アルコールおよび脂肪酸酸化阻害剤の存在下で細菌を培養することを含む。そのような方法は本発明の細菌と共に使用することができる。
【００４８】
炭素源および脂肪酸酸化阻害剤は、第２工程の培養中、培養の初めのステージから最後のステージまでの任意の時期に添加されてもよい。初めのステージでの添加が好ましい。この方法に記載の適切な脂肪酸酸化阻害剤の例としては、：アクリル酸、２−ブチン酸、２−オクチン酸、Ｓ−フェニルプロプリオン酸、Ｒ−フェニルプロプリオン酸、プロピオール酸、およびｔｒａｎｓ‐桂皮酸が挙げられるが、それらに限定されない。阻害剤は酸自体またはその塩でありうる。アクリル酸ナトリウムは１種の好ましい脂肪酸酸化阻害剤である。脂肪酸酸化阻害剤は、３−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨ）（Ｃ６）、３−ヒドロキシヘプタノエート（ＨＨｐ）（Ｃ７）および／または３−ヒドロキシオクタノエート（ＨＯ）（Ｃ８）コポリマーの蓄積を所望する量まで増やすことができる量で使用してもよいが、細胞への受容可能なレベルの毒性を有する。たとえば、アクリル酸ナトリウムは約１〜４０ｍＭ、好ましくは１０〜３５ｍＭそしてより好ましくは２５〜３２ｍＭの培地中濃度で使用されてもよい。
【００４９】
栄養素制限によるＰＨＡ生産の増大
本発明の細菌は培養中にいずれかの必須栄養素を制限する必要なしに、構成的に顕著なレベルのＰＨＡを生産する。しかし、たとえば、リン、窒素、マグネシウム、スルフェート、カリウムまたは鉄の制限のような栄養素制限により、より高いレベルのＰＨＡ生産が達成されてもよい。好ましくは、制限された栄養素は細菌が脱調節しない栄養素である。たとえば、本明細書に記載の１種のホスフェート‐脱調節微生物由来のＰＨＡ生産はホスフェート制限によって増大しないが、鉄制限によって増大する。ＰＨＡの生産は鉄と別の無機元素の種々の組み合わせを制限することによって最大化されてもよい。
【００５０】
一態様において、培地の鉄濃度はホスフェート対鉄の比が、約５０もしくはそれより高い、約３５０もしくはそれより高い、または約５００もしくはそれより高い、または約２８００もしくはそれより低い、または約１４００もしくはそれより低い、または約９００もしくはそれより低いように制限される。代表的な範囲としては、約５８〜約２７７３、または約３５０〜約１４００、または約５００〜９００、または約６００〜８００、たとえば６９３が挙げられる。
【００５１】
ＰＨＡコポリマーの抽出
細菌は、濾過または遠心分離のような慣用の固体‐液体分離手段を含むがそれらに限定されない、当該技術分野で公知のいずれかの手段によって培養液から採取されてもよい。
【００５２】
ＰＨＡコポリマーは、以下の代表的な手順を含む、当該技術分野で公知のいずれかの方法により細菌から抽出されてもよい。
細菌細胞は培養液から採取され、細胞は水に懸濁した０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で１回洗浄され、その後凍結乾燥される。ＰＨＡコポリマーは細胞乾燥重量に対して約５０：１のクロロホルムで、少なくとも約５時間、還流することによってクロロホルムに抽出される。抽出物はＷｈａｔｍａｎ ＃４濾紙を通して濾過し、最少容積にまで乾燥して濃縮し、１０ｘ容積のジエチルエーテル／ヘキサン３／１ｖ／ｖに粘性溶液を添加することによりＰＨＡコポリマーが沈殿する。材料は栓をしたテフロン遠心分離チューブで遠心分離し、エチルエーテル／ヘキサンで１回洗浄し、その後真空下で一晩乾燥する。それ以上のＰＨＡコポリマーの分別蒸留は沸騰アセトン中で、５時間、固体エチルエーテル／ヘキサン沈殿ＰＨＡコポリマーを還流することによって行われる。アセトン抽出物は窒素下で乾燥し、ＰＨＡコポリマーはクロロホルムに溶かし、エチルエーテル／ヘキサンで沈殿する。あるいは、乾燥した細胞はアセトンで直接抽出し、可溶性ＰＨＡコポリマーは窒素下で乾燥し、クロロホルムに溶かし、そしてエチルエーテル／ヘキサンで沈殿させることにより単離される。
【００５３】
その上、コポリマー生成物は、種々の有用な物理的形態でＰＨＡコポリマーを生産するための種々の刊行された手順を使用して、細菌から回収することができる。これらには、、塩素化溶媒（たとえば、米国特許第４，５６２，２４５号）、非‐塩素化溶媒（ＷＯ公開番号９７／０７２３０）、マージナル（ｍａｒｇｉｎａｌ）溶媒（米国特許第５，８２１，２９９号）を使用した化学的抽出、例が米国特許第４，９１０，１４５号に記載される、ＰＨＡ粒子を分離するための熱および酵素の使用、または空気分級（米国特許第５，８４９，８５４号）および遠心分離（米国特許第５，８９９，３３９号）のような物理的手段の使用が挙げられる。
【００５４】
ＰＨＡ生産の定量化または比較評価
採取された細胞は、乾燥し、重量を量り、そしてＰＨＡは記載された塩素化溶媒を使用して抽出される。抽出されたＰＨＡは一晩真空下で乾燥し、重量を測定し、乾燥した生物量中のＰＨＡ百分率および発酵した培養液中の力価を得る。あるいは、ＰＨＡはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により定量的および定性的に分析される。液体培養物は１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、その後細胞は０．９％塩化ナトリウム生理食塩水で２回洗浄し、一晩凍結乾燥する。乾燥した凍結乾燥細胞材料（８〜１０ｍｇ）は１５％（ｖ／ｖ）硫酸の存在下で加メタノール分解される。成分３−ヒドロキシアルカン酸の得られたメチルエステルはＢｒａｎｄｌ ｅｔ． ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１９７７，１９８８）に従い、（Ｔｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０，１９９０）に詳細に記載されたようにＧＣによりアッセイされる。ＧＣ分析は、直径０．５ｍ Ｐｅｒｍｐｈａｓｅ ＰＥＧ２５Ｍｘキャピラリーカラム 長さ６０ｍを使用して、３Ｌの試料をＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｍｏｄｅｌ ６８５０ガスクロマトグラフ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に注入することにより行われる。
【００５５】
生産されたＰＨＡの使用
本発明はまた、本発明の細菌により生産されたＰＨＡを提供する。そのようなＰＨＡは繊維、成形された品物、およびフィルムに変換され、ＰＨＡに関して当該技術分野で公知のいずれかの適用、または、手術用の糸もしくは骨固定材料（ｂｏｎｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）のような医用材料、おむつもしくはトイレ用品のような衛生用品、マルチフィルム、徐放化学製品のような農業もしくは園芸材料、魚網のような漁業材料、および／またはビン、ファストフードラップおよび箱のような包装材料を含む他のプラスチックに使用される。
【００５６】
実施例
本発明は以下の限定的でない実施例を参照することにより、いっそう詳細に記載され、それらはいっそう十分に本発明を説明することを意図されるが、その範囲を限定すると解釈されることにはならない。本実施例は栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの単離、ＰＨＡ生産のための、上記の脱調節ラルストニアユートローファの発酵プロセス、および微量元素を制限することによるＰＨＡの改善された生産を説明する。
【実施例１】
【００５７】
ホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの単離
ホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファは以下のように単離される。ラルストニアユートローファのＰＨＡネガティブ突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物（３ｍｌ）は２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で連続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた、栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最少化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、比色定量用アルカリ性ホスファターゼ基質、ＢＣＩＰ（４０ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地（１％ｗ／ｖ トリプトン、０．５％ｗ／ｖ 酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、ｐＨ７）で培養され、そして細胞は２〜３日間、３０℃でインキュベートされる。非常に濃い暗青色コロニーがラルストニアユートローファのホスフェート‐脱調節株候補として単離される。代表的なホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファは、２００５年６月１日に受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【実施例２】
【００５８】
窒素‐脱調節ラルストニアユートローファの単離
窒素‐脱調節ラルストニアユートローファは以下のように単離される。ラルストニアユートローファのＰＨＡネガティブ突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物（３ｍｌ）は２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で連続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた、栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最少化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、２００ｍＭのアンモニウム類似体メチルアミンと０．１％ｗ／ｖグリシンのような複合窒素源を含む最少寒天培地で培養し、少なくとも３日間、３０℃でインキュベートする。十分に増殖するように見えるコロニーが窒素‐脱調節株候補として単離される。
【実施例３】
【００５９】
二重‐脱調節（ホスフェート‐および窒素共に脱調節された）ラルストニアユートローファの単離
ホスフェートおよび窒素の両方が脱調節されたラルストニアユートローファは以下のように単離される。実施例１由来のラルストニアユートローファのＤＳＭ５４１ホスフェート‐脱調節突然変異体は、酵母抽出物（１０ｍＬ、３％）を含む１００ｍＬの振とうフラスコ中、ＯＤ６００が１０を越えるまで、３０℃で１６〜２０時間、２００ｒｐｍで培養される。培養物３ｍｌは２７ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に移される。希釈した細胞５ｍＬは突然変異していない対照として、平板培養するために除去し、残っている懸濁液（２５ｍＬ）は、暗所で継続的に攪拌しながら、十分なＵＶ照射に暴露し、１〜１０％の生存率を得る。照射した培養物のアリコート１ｍＬは、１００ｍＬの振とうフラスコ中のあらかじめ温めた栄養素に富んだ１１ｍＬの培地（１％ｗ／ｖポリペプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ牛肉抽出物、０．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、ｐＨ７）に移す。フラスコはアルミニウムホイルで包み、光回復を最小化し、３０℃で３時間、２００ｒｐｍで、暗所で振とうし、細胞を隔離し、突然変異を“定着”させる。隔離された細胞は、２００ｍＭのアンモニウム類似体メチルアミンと０．１％ｗ／ｖグリシンのような複合窒素源を含む最少寒天培地で培養し、少なくとも３日間、３０℃でインキュベートする。十分に増殖するように見えるコロニーが二重‐脱調節（ホスフェート‐および窒素共に脱調節された）株候補として単離される。代表的なホスフェート‐および窒素‐脱調節ラルストニアユートローファは２００５年６月１日に受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡに寄託されたものである。
【実施例４】
【００６０】
ＰＨＡ遺伝子を持つ栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの形質転換
栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファ細胞は種々のＰＨＡ生産遺伝子により形質転換され、たとえばアエロモナスカビアエ由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３により形質転換され、ＰＨＡ生産を可能にする。多様な形質転換法、たとえば、Ｐａｒｋ ｅｔ．ａｌ．に記載されたエレクトロポレーション（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：３１−３４，１９９５）またはＦｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ．ａｌ．に記載された大腸菌Ｓ１７−１によるトランス接合（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４７：１９８−２０５，１９８１）によるものが当該技術分野で公知である。
【００６１】
その後、細菌は、脱調節された栄養素、たとえばリン（または二重に脱調節された栄養素、たとえばリンおよび窒素）の非制限濃度を含む培地中で培養され、以下に示すようにＰＨＡ蓄積が測定される。
【実施例５】
【００６２】
ＰＨＡ蓄積の測定
細菌は遠心分離し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ８．０で１回洗浄し、遠心分離し、２〜３ｍＬの水に懸濁し、凍結し、２日間凍結乾燥する。乾燥した細胞は、１ｍＬクロロホルム＋１ｍＬメタノール中１５％硫酸の中で、１００℃で４時間反応させる。試料は１ｍＬのクロロホルムプラス１ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌの添加により相分離される。クロロホルム相は無水硫酸ナトリウム処理して乾燥し、１ｍＬを除去し、窒素下で、またはフード中で一晩、試料バイアル中で乾燥する。試料は１ｍＬアセトンプラス１ｇ／Ｌ安息香酸メチルに溶解し、栓をする。あるいは、１０ｇ／Ｌの安息香酸メチル１００μＬを１ｍＬのクロロホルムに直接添加し；試料に栓をして、分析する。
【００６３】
試料は、２０ｃｍ／秒直線流速に等しい１ｃｍ３／秒流速のヘリウムを使用して、３０ｍ、０．３２ｍｍＩＤ、０．２５μｍフィルムＳｕｐｅｌｃｏｗａｘ１０カラムを使用してＨＰ５８９０ ＧＣで分析する。インジェクターは２２５℃にセットし、ＦＩＤ検出器は３００℃にセットする。１μＬ（５０：１スプリット）注入後、オーブン温度は２分間、８０℃に保ち、１０℃／分で２３０℃まで徐々に温度を上げ、１２分間２３０℃に保つ。あるいは、試料は上記と同じプログラムを使用して、Ｊ＆Ｗ ＤＢ−５ＭＳ（ｐａｒｔ１２２−５５３１、３０ｍ、０．２５ｍｍ ＩＤ、０．１μｍフィルム）で分析するが、最終温度は２３０℃に７分間保つ。
【００６４】
標準物として使用する３−ヒドロキシアルカノエートおよびメチル３−ヒドロキシアルカノエートはＳｉｇｍａ（カタログ＃Ｈ６５０１ ｄｌ−β−ヒドロキシブチル酸、カタログ＃Ｈ４０２３ ３−ヒドロキシカプリル酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ３７７３ ３−ヒドロキシカプリン酸メチルエステル、カタログ＃ Ｈ３５２３ ３−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ４２７３ ３−ヒドロキシミリスチン酸メチルエステル、カタログ＃Ｈ４５２３ ３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステル）から購入し、３−ヒドロキシカプロン酸メチルエステルはラウリン酸上で培養したアエロモナスヒドロフィラから調製されたＰＨＡコポリマーから確認される。
【実施例６】
【００６５】
ポリ３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生産のためのホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
ポリヒドロキシブチレート‐コ‐ヘキサノエートを生産できるように工学的に操作された、組換えホスフェート‐脱調節ラルストニアユートローファの流加培養（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）は、植物油、脂肪酸、脂肪アルコールおよびエステルをフィード基質として使用して行われる。植物油には：コーン油、ダイズ油、パーム核油、綿実油、菜種油、ピーナッツ油、それらの分別蒸留されたオイル、それらの混合物が挙げられる。流加培養はまた：フルクトース、グルコン酸、グルコース、および糖蜜を含む炭水化物フィードを利用するＰＨＡを作ることを可能にし、その一部は特定のフィード上での増殖に関して選択された株を必要とする。
【００６６】
株は初めに栄養素培養液１００ｍＬ中、３０℃でＯＤ６００が２．０になるまで培養される。次にこの培養液を使用して、以下の培地を使用する３Ｌの種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）発酵槽に接種し、培養する：
【００６７】
【表１】
【００６８】
培地を１２１℃で２０分間滅菌し、冷やし、３０ｇ／Ｌ植物油および５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加する。以下で操作する：
【００６９】
【表２】
【００７０】
培養物はＯＤ６００＝６９．９の時に採取し、１７５ｍＬの培養物を３．５Ｌの主発酵槽に接種する。培地中のホスフェートの濃度はＮｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ３００ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、決して制限していないことを示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
以下で操作する：
【００７３】
【表４】
【００７４】
以下の時点に、全部で１１０ｇ／Ｌの植物油を与える：
【００７５】
【表５】
【００７６】
株はホスフェート制限培地中でも培養され、その培地において通常２０ｈ〜３６ｈの培養時間の培養中に添加されたリンの完全な利用は、ＰＨＡ生産を増すように野生型株を誘導する。
【００７７】
【表６】
【００７８】
種発酵槽の５％ｖ／ｖを接種する。
以下で操作する：
【００７９】
【表７】
【００８０】
以下の時点に、全部で１１０ｇ／Ｌの植物油を与える：
【００８１】
【表８】
【００８２】
より栄養豊富な培地は、最小のラグタイムで細胞が増殖することを可能にする。より高いホスフェート濃度で培養された細胞は、ＰＨＡ生産に関して構成的であり、細胞増殖のすべての時点でＰＨＡを蓄積する。より高いホスフェート濃度で培養された細胞は、制限ホスフェートで培養された細胞によって生産されたＰＨＡ量の１６５％でＰＨＡを生産する。比べると、脱調節されないバックグラウンドを持つＰＨＡ生産Ｒ．ユートローファは、高ホスフェート培地において、制限ホスフェート培地の５５％だけのＰＨＡしか生産しない。
【００８３】
Ｒ．ユートローファの活発な増殖相（対数増殖期）中の顕著なレベルの構成的なＰＨＡ生産が証明されるのはこれが初めてであり、非制限ホスフェート濃度の存在にかかわらず、より早い時点における最大に近いＰＨＡの取込を導く。
【実施例７】
【００８４】
ＰＨＡ生産のための、窒素‐脱調節、二重‐脱調節、および他の栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
Ｒ．ユートローファの窒素‐脱調節株、二重‐脱調節株（ホスフェート‐および窒素‐の両方の脱調節）、および他の栄養素‐脱調節株は実施例６に記載のように非制限栄養素培養液中で培養され、生来のＲ．ユートローファより高い濃度でＰＨＡを生産する。
【実施例８】
【００８５】
ＰＨＡ生産のための栄養に富んだ培地中での栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
栄養素‐脱調節株は、大量のＰＨＡを生産するために、栄養素を制限することによる誘導を必要としない。したがって、栄養素の豊富な供与源である複合培地が添加されて、高いＰＨＡ生産を保持しながら全体的な生物量生産を増し、そうして定められた培養容器中のＰＨＡの全体的な力価を増やしてもよい。栄養に富んだ培地は酵母抽出物、ペプトン、トリプトン、アミノ酸、牛肉抽出物、ならびに有機窒素、ホスフェートおよび他の栄養素の他の供与源を含んでいてもよい。
【実施例９】
【００８６】
ＰＨＡ生産のためのより栄養に富み、安価な培地中での栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファの発酵
栄養素‐脱調節株は、大量のＰＨＡを作るために栄養素を制限することによる誘導を必要としない；しかし、高価な栄養に富んだ培地を添加することは依然として経済的であるはずがない。欠くことのできない栄養素を過剰に供給することによりＰＨＡ生産を阻止することを懸念せずに、たとえばリン酸、アンモニウム塩、ニトレート、ニトライト、コーンスティープリカー、ダイズ加水分解物、未精製グリセリン、乳清、工業用プロセスオイル、炭水化物もしくはタンパク質廃物流（ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓｔｅ ｓｔｒｅａｍｓ）、または他の高価でない単純な、もしくは複雑な培地を供給することにより、いっそう経済的に栄養素が補足される。
【実施例１０】
【００８７】
微量元素を制限することによる栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファにおける高レベルのＰＨＡ生産の誘導
Ｒ．ユートローファのホスフェート‐脱調節および窒素‐脱調節株は、それぞれ非制限リンおよび窒素培地におけるＰＨＡの構成的生産者である。培地における微量元素を制限しながら、植物油を与えることにより、ＰＨＡ生産は増加する。
【００８８】
ホスフェートの、またはホスフェートおよび窒素の栄養素‐調節が解除され、そしてポリヒドロキシブチレート‐コ‐ヘキサノエート（Ｃ４Ｃ６）を生産することが可能なラルストニアユートローファは、以下のものを含む培地で培養される：
【００８９】
【表９】
【００９０】
細菌はバッチ毎に植物油を与えられる。典型的なレベルは５ｍｌ／Ｌ微量元素、３．８５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．６７ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４である。
細胞重量で８５％を越えるレベルのＰＨＡが観察される。比較して、ホスフェート脱調節細胞はホスフェート制限培地において３５％のＰＨＡ、そして非‐制限培地において４９％のＰＨＡを蓄積する。脱調節されない細胞は非‐制限培地においてＰＨＡを蓄積せず、微量元素制限培地において１．９％だけのＰＨＡを蓄積する。
【００９１】
その上、アエロモナスカビアエ由来の野生型ｐｈａＣ遺伝子（ｐＪＲＤＥＥ３２ｄｌ３）（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０，１９９７；および米国特許第５，９８１，２５７号）を発現するホスフェート‐脱調節突然変異体の場合、培地中の微量元素を８０％まで制限することは、同じ生物量においてホスフェート制限条件下の３５％ＰＨＡのＰＨＡ生産に比較して、７４％ＰＨＡまでＰＨＡ生産を改善する。
【００９２】
アエロモナスカビアエｐｈａＣ遺伝子を含むプラスミドによって形質転換されたＲ．ユートローファ（実施例１に記載）は、２倍のリン酸塩が添加される対照培地、および微量元素の量が調節される試験培地を使用して、３．５Ｌの出発容量で発酵を行う。細菌はコーン油を与えられ、酸は水酸化アンモニウムによって中和される。試験培地中の微量元素の制限により、対照培地に比較して細胞のＰＨＡ含量が倍加する。微量元素の量を対照培地の量の２０％に制限することが、対照培地上での増殖に等価な細胞増殖を支持するために十分でありながら、なおかつ細胞の増加したＰＨＡ含量を提供する。
【００９３】
以下の表１は、ホスフェート脱調節細胞の増殖に対する微量元素制限の効果およびＰＨＡ蓄積対微量元素を示す。ホスフェート制限条件下で培養される場合、細胞はＰＨＡの重量（乾燥細胞重量ごとのＰＨＡの重量（ＤＣＷ））で３５％を含み、０．５１ｇＰＨＡ／Ｌ／ｈの生産性を有し、３９．３ｇ／ｌのＰＨＡを生産する。過剰なホスフェートを供給しながら、９０％以上まで微量元素を厳しく制限することは、細胞毎の高いＰＨＡ蓄積を可能にするが、細胞増殖およびＰＨＡ生産を制限する。８０％まで微量元素を枯渇することは完全な細胞増殖および８４．１ｇ／ＬのＰＨＡ生産を可能にする（重量で７３．６％のＰＨＡおよび１．１７ｇＰＨＡ／Ｌ／ｈの生産性）。
【００９４】
【表１０】
【実施例１１】
【００９５】
鉄を制限することによる栄養素‐脱調節ラルストニアユートローファにおける改善されたＰＨＡ生産
微量元素の量を変化させる別の試験において、対照培地に存在する鉄の２０％を含むが、他の微量元素は完全な量を含む培地は同じ結果を生じる。これらの結果は、鉄の制限が所望するＰＨＡ生産増大効果を提供することを示唆する。
【００９６】
増大したＰＨＡ蓄積を証明する、培養に使用される代表的なホスフェート対鉄の比（モル濃度／モル濃度）は以下に示す。改善されたＰＨＡ蓄積を証明する発酵培地は６９３：１の比のホスフェート（４１．６ｍＭ）と鉄（０．０６ｍＭ）を含む。１，３８７：１の比の場合、鉄濃度を半分に減らすか、ホスフェート濃度を倍にすることも可能である。ホスフェート対鉄の比は、約５８：１〜約２７７３：１まで変化してもよい。Ｐ対Ｆｅの代表的な比は限定することを意図しない。当業者はそのような比を決定しうる。
【００９７】
本出願を通じて、種々の刊行物が引用される。本明細書で引用される開示の特定の側面を含むがそれらに限定されないこれらの刊行物全体のその開示は本出願に参照として援用され、本明細書に記載されクレームされる本発明のされた日における当業者に公知の当該技術分野の水準をその中により十分に説明する。
【００９８】
本特許文書の開示は著作権保護に供される要素を含む。Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ特許ファイルおよび記録に見られるように、著作権所有者は、だれであれ特許文書または特許開示を複写することに意義はないが、それ以外の点ではすべての著作権はどんなものでも確保される。
【００９９】
本発明の特定の態様は説明され、記載されているが、本発明の意図および範囲から逸脱せずに、種々の他の変更および改変を行いうることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内であるそのような変更および改変のすべてを添付の特許請求の範囲に包含することが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された栄養素‐脱調節細菌であって、（ａ）乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を栄養素のレベルが制限されない培養条件下で生産する能力、および（ｂ）乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で生産する能力を有し、前記細菌はアルカリゲネスレータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）およびＮＡＤＨオキシダーゼに突然変異を有するアゾトバクタービンランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）突然変異体以外のものである、単離された細菌。
【請求項２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する、単離された細菌。
【請求項３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する、単離された細菌。
【請求項４】
オーテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
ホスフェート‐脱調節オーテルシア種である、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
ホスフェート‐脱調節オーテルシア種である、請求項２に記載の細菌。
【請求項７】
ホスフェート‐および窒素‐調節が解除された、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ホスフェート‐および窒素‐調節が解除された、請求項２に記載の細菌。
【請求項９】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項１１】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項３に記載の細菌。
【請求項１２】
ＰＨＡ‐生産遺伝子がｐｈａＡ、ｐｈａＢ、またはｐｈａＣ遺伝子から選択される、請求項９に記載の細菌。
【請求項１３】
（ａ）乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を栄養素のレベルが制限されない培養条件下で生産する能力、および（ｂ）乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で生産する能力を有する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、前記細菌はアルカリゲネスレータスおよびＮＡＤＨオキシダーゼに突然変異を有するアゾトバクタービンランディ突然変異体以外のものであり、前記方法は、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、生産方法。
【請求項１４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、前記生産方法。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、前記生産方法。
【請求項１６】
必須栄養素が制限されない培地中で前記細菌が培養される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の無機元素が制限される培地中で細菌を培養する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
制限される元素が鉄である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培地が植物油を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
培地が植物油を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
単離された栄養素‐脱調節細菌であって、（ａ）乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を栄養素のレベルが制限されない培養条件下で生産する能力、および（ｂ）乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で生産する能力を有し、前記細菌はアルカリゲネスレータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）およびＮＡＤＨオキシダーゼに突然変異を有するアゾトバクタービンランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）突然変異体以外のものである、単離された細菌。
【請求項２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する、単離された細菌。
【請求項３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する、単離された細菌。
【請求項４】
オーテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
ホスフェート‐脱調節オーテルシア種である、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
ホスフェート‐脱調節オーテルシア種である、請求項２に記載の細菌。
【請求項７】
ホスフェート‐および窒素‐調節が解除された、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ホスフェート‐および窒素‐調節が解除された、請求項２に記載の細菌。
【請求項９】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項１１】
生来でないＰＨＡ‐生産遺伝子を含む、請求項３に記載の細菌。
【請求項１２】
ＰＨＡ‐生産遺伝子がｐｈａＡ、ｐｈａＢ、またはｐｈａＣ遺伝子から選択される、請求項９に記載の細菌。
【請求項１３】
（ａ）乾燥細胞重量で少なくとも１０％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を栄養素のレベルが制限されない培養条件下で生産する能力、および（ｂ）乾燥細胞重量で少なくとも２０％のＰＨＡを鉄は制限されるが他の栄養素は著しく制限されない培養条件下で生産する能力を有する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、前記細菌はアルカリゲネスレータスおよびＮＡＤＨオキシダーゼに突然変異を有するアゾトバクタービンランディ突然変異体以外のものであり、前記方法は、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、生産方法。
【請求項１４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７５９のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、前記生産方法。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６７６０のもとで寄託された細菌のすべての確認された特徴を提示する細菌を使用してＰＨＡを生産する方法であって、細菌がＰＨＡを生産するように培地中で細菌を培養する工程を含む、前記生産方法。
【請求項１６】
必須栄養素が制限されない培地中で前記細菌が培養される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の無機元素が制限される培地中で細菌を培養する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
制限される元素が鉄である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培地が植物油を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
培地が植物油を含む、請求項１４に記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５０７４８３（Ｐ２００９−５０７４８３Ａ）
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２９７６５（Ｐ２００８−５２９７６５）
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０５３１９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２９２１３
【国際公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０８０７３５０８）メレディアン・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０５３１９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２９２１３
【国際公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０８０７３５０８）メレディアン・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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