ポリマー粒子の改良
標識たんぱく質をポリマー粒子に共有結合させる方法であり、標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、Ｃｏ2+イオンが配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤Ｃｏ2+イオン錯体を形成することと、前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、任意に行われる前記Ｃｏ2+イオンの除去とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識たんぱく質に共有結合したポリマー粒子に関する。特に、本発明は、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）基の残基を介してＨＡＴ標識たんぱく質のＨＡＴ標識に結合した磁気ポリマー粒子、ならびに前記共有結合を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気ポリマー粒子は、様々な医療および生化学の分野において、例えば、医薬製品の運搬のための輸送ビヒクルとして、診断目的、分離、および合成目的のため、一般に有用である。このような粒子は、機能を発揮するためにその磁気特性に依拠している。診断アッセイへの応用では、例えば、磁気ポリマー粒子に結合した分析物を含有する試料に磁場をかけると、遠心分離またはろ過を使用しなくても前記分析物を単離することが可能となる。また、治療への応用においては、例えば、患者に磁場をかけることにより、薬物を担持する磁気ポリマー粒子を所望の身体部位へと送り込むことができる。
【０００３】
本明細書において、「磁気」とは、ポリマー粒子が超常磁性（superparamagnetic）結晶を含有することを意味する。したがって、この磁気ポリマー粒子は、磁気的に置き換え可能であるが、永久に磁化可能というものではない。磁気ポリマー粒子の製造方法は多数知られており、その大多数には、予め形成された磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトから、マグヘマイトまたはマグネタイトを含有するポリマー粒子を形成することが含まれる。関連する方法のいくつかが、米国特許第４，６５４，２６７号明細書（Ugelstad）（特許文献１）に記載されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
固定金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の使用は、長年にわたって公知である。ＩＭＡＣ精製法は、遷移金属イオン、例えば、Ｃｕ2+またはＮｉ2+（このＣｕ2+またはＮｉ2+は、たんぱく質表面に存在する電子供与基、特に、ヒスチジンのイミダゾール側鎖に結合することができる）を有するキレートマトリックスの使用に基づいている。電子供与基は、前記金属イオンの周りの空配位部位に配位すると考えられている。前記たんぱく質表面に存在する前記電子供与基と前記金属イオンとの間の相互作用は、例えば、ｐＨを変化させることにより変更することができ、ゆえに、可逆性金属錯体／たんぱく質相互作用によって精製を行うことが可能である。最も一般的には、たんぱく質が前記金属イオンとヒスチジンのイミダゾリル側鎖との相互作用によって固相に結合されていれば、前記たんぱく質を、イミダゾール自体の添加、すなわち、競合的溶離によって除去することができる。
【０００５】
数種の異なるキレート化リガンドが、ＩＭＡＣにおいて、たんぱく質の精製に用いられている。ニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）（四座配位子）および五座配位子であるトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンがそのようなリガンドの例であるが、これらには、非特異的たんぱく質相互作用、金属漏れ等の様々な短所がある。
【０００６】
米国特許第６，２４２，５８１号明細書（特許文献２）は、金属漏れの問題に対し、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）基のＩＭＡＣでの使用（ここで、結合した遷移金属イオンは八面体形態を有する）による解決策を提案している。前記リガンドは、ヒスチジン標識組換えたんぱく質を単離するのに理想的であると言われている。Ｃｍ−Ａｓｐの他の長所、例えば、還元剤への耐性が、米国特許第５，９６２，６４１号明細書（特許文献３）で説明されている。
【０００７】
ポリスチレン、ナイロン、およびセファロース等の他のポリマーマトリックスが提案されているが、これらの特許において、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、アガロース固相（架橋しているのが好ましい）に結合している。これらのマトリックスは磁性を有していてもよいが、磁気粒子は懸濁状態を維持しないため、アッセイにおける固相の用途は限られる。
【０００８】
固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー技術は、金属イオンと、キレート化リガンドと、通常は、たんぱく質内に存在するイミダゾール基との間で起こるキレート化に依拠している。しかしながら、前記錯体（すなわち、固相、キレートリガンド、およびたんぱく質）が時々解離し、金属イオン漏れが起こることは避けられない。したがって、ポリマー粒子が実際にたんぱく質に共有結合してこれを固定化することが好ましい。共有結合は、錯体中におけるイオン相互作用と比べてはるかに強力な結合であり、例えば、たんぱく質複合体のプルダウンやスクリーニングのようなアッセイの手順において、多数のさらなる選択肢を当業者に提供するものである。粒子に共有結合したたんぱく質は、はるかに強固なものとなり、より強力な処理および精製方法の実施が可能となる。
【０００９】
米国特許第６，４４１，１４６号明細書（Minh）（特許文献４）においては、たんぱく質の共有結合固定化のための方法であって、銅（II）イオンに配位した五座キレート剤に結合している非磁性樹脂にたんぱく質を接触させることを含む方法が記載されている。得られた錯体をカルボジイミドに接触させ、銅（II）イオンを除去して固定化たんぱく質を形成する。
【特許文献１】米国特許第４，６５４，２６７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２４２，５８１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９６２，６４１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４４１，１４６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この方法での使用が提案されているたんぱく質は、ウシ血清アルブミンであり、好適な樹脂は、セファロースである。しかしながら、銅（II）イオンは、この方法において理想的な金属イオンではないことがわかっている。これは、銅（II）イオンは、五座配位子を強力にキレート化し、この相互作用の強力さにより、前記共有結合固定化工程、すなわち、カルボジイミド処理において、多くの非特異的結合が生じてしまうからである。
【００１１】
Minhに記載の方法によれば、前記キレートリガンドと、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中のあらゆる天然由来のリジン残基との間に結合を生じさせることができる。したがって、MinhにおけるＢＳＡには、結合リガンドの指向が多数存在する場合があり、これにより、この技術が精製または増幅に不適切なものとなっている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
現在、キレート化リガンド、例えば、Ｃｍ−Ａｓｐキレート化リガンドは、ポリマー粒子に共有結合し、組換えたんぱく質の標識に共有結合する能力を有する部分を生じることがわかっている。これにより、熟練の生化学者に、アッセイの手順に関してさらなる融通性を与えることが可能になった。さらに、キレート化リガンドは、固定化の間における非特異的結合を最小限に抑えるため、コバルト（II）イオン等の金属イオンに配位することが好ましい。
【００１３】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、標識たんぱく質、例えば、ＨＡＴ標識たんぱく質を、ポリマー粒子、例えば、磁気ポリマー粒子に共有結合させる方法であり、標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオン（好ましくはＣｏ2+イオン）が配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
見方を変えれば、本発明は、細胞溶解物から標識たんぱく質を単離するための方法であり、少なくとも１つの標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）、例えば、複数の標識たんぱく質を含む細胞溶解物を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオンが配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、標識たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、先に述べたような方法によって得ることが可能な、例えば、得られた標識を介してポリマー粒子に共有結合した標識たんぱく質を提供する。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、以下の式で表される残基を含むリンカーを介して標識たんぱく質に共有結合するポリマー粒子であって、前記標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を含むポリマー粒子を提供する。
【００１７】
【化２】
【００１８】
本発明で使用されるたんぱく質は、標識されている、すなわち、ラベルに結合している。本発明で使用される標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と少なくとも２つのリジン残基、例えば、少なくとも３つのヒスチジン残基と少なくとも３つのリジン残基を有していなければならない。
【００１９】
本発明で使用される最も好ましい標識は、当該技術分野において周知なＨＡＴ標識である。ＨＡＴ標識は、６つのヒスチジン残基と３つのリジン残基を含有するαヘリックスを有している。ヒスチジンのイミダゾール側鎖とリジンのアミノ基側鎖の両方が存在することは、共有結合固定化方法において決定的に重要である。理論によって限定しようとするものではないが、ヒスチジンのイミダゾールにより、前記金属イオンへの、ゆえに、前記キレート化剤への標識たんぱく質の配位が可能になるものと思われる。よって、カルボジイミドによる処理において、リジン残基におけるアミノ基が、アミド結合によって前記キレート化剤に共有結合できる。
【００２０】
このように、配位／結合に利用可能な必要なヒスチジンおよびリジン残基を有するあらゆるたんぱく質標識（すなわち、たんぱく質ラベル）が、この発明における使用に適している。
【００２１】
したがって、別の態様によれば、本発明は、たんぱく質上の標識に共有結合したポリマー粒子、例えば、磁気ポリマー粒子であり、前記標識が、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を有し、前記粒子は、前記少なくとも２つのリジン残基を介し、アミド結合によって前記標識に結合する連結基を有しているポリマー粒子を提供する。
【００２２】
標識、例えば、ＨＡＴ標識のたんぱく質への導入は、従来の方法により、例えば、対象となるたんぱく質のＣまたはＮ末端に対して行える。
【００２３】
カルボジイミド化合物は、公知の方法により、前記キレート化剤のカルボキシル基を活性化する。前記キレート化剤のカルボキシル基は、ジイミドと反応して式−ＣＯＯ−Ｃ（ＮＨＲ）＝ＮＲで表されるリンカーを含む中間生成物を形成し、次に、このリンカーがリジン残基上の遊離アミノ基と反応して前記キレート剤から前記標識たんぱく質へのアミド結合を形成すると考えられている。前記たんぱく質標識中のリジン残基の数は、前記キレート化剤中のカルボキシル基の数と一致していることが好ましい。ＨＡＴ標識たんぱく質は、このような残基を３つ有している。したがって、前記キレート化剤は、カルボキシル基を３つ有し、これにより、３つの共有アミド結合を形成させることが好ましい。
【００２４】
この反応に好適なカルボジイミドとしては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、ｔ−ブチルエチルカルボジイミド、ｔ−ブチル−メチルカルボジイミドまたはそれらの塩が挙げられる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）が好ましい。
【００２５】
カルボジイミドがこの反応に最適であるが、その他のカルボキシル基活性化物質もまた好適である場合がある。活性化物質の代表例としては、ホスホニウム塩（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ）、ウロニウム塩（例えば、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＳＴＵ）、ピリジニウム塩−Ｂｕ3Ｎ、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールおよびＴｉ（ＯＢｕ）4が挙げられる。
【００２６】
使用されるジイミド化合物の量は、決定的に重要ではないものの、キレート剤に対して過量のジイミドを存在させるべきである。
【００２７】
金属イオンは、周期表の１から１３族の任意の金属、ランタニドもしくはアクチニドまたは金属Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｂｉ、Ｔｅ、ＰｏもしくはＡｔであってもよい。金属イオンは、銅イオンでないことが好ましい。金属イオンは、遷移金属イオン（すなわち、周期表の３から１２族）であることが好ましい。好ましい金属イオンは、２＋または３＋の酸化状態、特に、２＋の酸化状態にあるイオンである。金属イオンが２＋の酸化状態にある場合、粒子−リンカー−リガンド−金属イオンの集合体全体が非荷電であり、これにより、非特異性結合の可能性が減少する。
【００２８】
好ましい金属は、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、Ｃｏ、およびＺｎであり、そのうち、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、およびＣｏが好ましく、特に、Ｃｏ2+が好ましい。
【００２９】
前記キレート化剤に配位した金属イオンは、共有結合により固定化されたたんぱく質の形成後に除去してもよく、このような除去は、前記イオンに配位する別のキレート化剤を使用することによって行える。これは従来、強力なキレート化剤であるＥＤＴＡによって行われているが、ＤＴＰＡ等のその他のキレート化剤もまた好適である。金属イオンを除去することが好ましいが、これは必須ではない。
【００３０】
本発明で使用されるキレート化リガンドは、少なくとも２つのカルボキシル基を有する三座、四座または五座配位子である。キレート化リガンドは、四座または三座、特に、四座であることが好ましい。好適なリガンドとしては、イミノ二酢酸、ニトリロトリ酢酸、トリス（カルボキシメチルエチレンジアミンまたはＣｍ−Ａｓｐが挙げられる。これらの中でも、Ｃｍ−Ａｓｐが特に好ましい。
【００３１】
任意に磁性を有するポリマー粒子（ＭＰＰ）に結合したＣｍ−Ａｓｐリガンド（すなわち、粒子−キレート化剤結合体）を、その非配位状態および金属イオンに配位した状態の両方で以下に示す（波線は、Ｃｍ−Ａｓｐと粒子との間の結合またはリンカーを表す）。窒素原子もまた配位に関与する、すなわち、Ｃｍ−Ａｓｐは四座であると考えられている。
【００３２】
【化３】
【００３３】
驚くべきことに、上述の反応により、配向が制御された固定化標識たんぱく質が得られることがわかった。前記標識は、たんぱく質のＮ末端かＣ末端のいずれかに位置し、たんぱく質配向の容易な測定を可能にすることが好ましい。
【００３４】
本発明の方法で使用されるポリマー粒子は、磁性を有することが好ましく、どのような磁気ポリマー粒子であってもよく、例えば、米国特許第４,６５４,２６７号明細書（特許文献１）に記載のようなものであってもよい。前記粒子は、多孔性のものであると、その孔中に超常磁気結晶が存在することが可能なので好ましい。前記粒子の表面は、通常、官能化され、前記キレートリガンドが前記ポリマー粒子にカップリングできるようにされており、例えば、官能化により、カルボキシル基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、マレアミド基、チオール基等の任意の公知の表面構造体を有していてもよい。ゆえに、その表面は、リガンドカップリングの前にアミン官能化されてもよい。あるいは、アミン官能化表面自体をさらに官能化し、他の官能基、例えばＣＯＯＨ基を有するようにしてもよい。
【００３５】
前記ポリマー粒子は、ビニル系ポリマー（例えば、スチレン）、アクリレート類および／またはメタクリレート類の組み合わせから形成されるのが好ましい。ポリマー材料は、例えば、コモノマーである架橋剤（例えば、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはエチレングリコールジメタクリレート）の取り込みによって、任意に架橋されてもよい。必要な架橋剤（例えば、コモノマー）の適切な量は、当業者には周知であろう。前記ポリマーは、架橋スチレン系ポリマー（例えば、ニトロ基含有コモノマー（例えば、ニトロスチレン）の使用、およびその後の還元によって表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー）または、エポキシ基含有コモノマー（例えば、グリシジルメタクリレート）の使用、およびその後のアミノ化（例えば、エチレンジアミンとの反応によるアミノ化）によって表面官能化された架橋（メタ）アクリル系ポリマーが好ましい。
【００３６】
本発明の方法で用いるポリマー粒子における超常磁性結晶は、多孔性ポリマー粒子中に超常磁気結晶の形態で沈積することが可能な材料であれば、いかなる材料の結晶であってもよい。磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトまたはマグヘマイトが好ましいが、前記結晶は、望ましい場合には、混合金属酸化物または他の磁気材料の結晶であってもよい。存在する結晶磁気材料の総量は、通常１％より多く、好ましくは３％より多く、望ましくは５％以上である（重量比であり、例えば、４０重量％まで）。パーセンテージは、Ｆｅ（または酸化鉄以外の磁気材料の場合、同等の金属）について、被覆粒子の乾燥総重量に基づき、重量ベースで計算される。
【００３７】
本発明の様々な態様に係るポリマー粒子は、概して、一般にマイクロメーター範囲のサイズ（すなわち、直径）を有し、０．２〜１２０ミクロン等の範囲、例えば、０．３〜１００μｍ、特に、０．５〜５０μｍ、より特に、０．８〜５μｍ、例えば、０．８〜１．５μｍ、好ましくは１〜１．２μｍが挙げられる。
【００３８】
典型的には、使用される多孔性粒子は、平均粒子直径を２．７μｍに補正した場合（すなわち、表面積に２．７／ＭＤを乗じた場合。ここで、ＭＤとはマイクロメーターで表した平均直径である。）に、少なくとも１５ｍ2／ｇ（ＢＥＴ窒素吸着法により測定）、より好ましくは少なくとも３０ｍ2／ｇ、例えば、７００ｍ2／ｇまでの表面積を有する。同様に縮尺を合わせたとき、前記粒子の孔容積は、少なくとも０．１ｍｌ／ｇであることが好ましい。
【００３９】
前記ポリマー粒子は、それらがコーティングされる前は、球状でありかつ、実質的には単分散であることが典型的であり、それら粒子がコーティングされても、球状かつ実質的に単分散のままであることが特に好ましい。
【００４０】
「実質的に単分散」とは、複数の粒子（例えば、少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１０００個）について、これらの粒子が、２０％未満の変動係数（ＣＶ）、例えば１５％未満、好ましくは１２％未満、より好ましくは１１％未満、さらにより好ましくは１０％未満、最も好ましくは約８％以下、例えば、２％から５％の変動係数（ＣＶ）を有することを意味する。ＣＶは、以下のようにパーセンテージで求められる。
【００４１】
【数１】
【００４２】
前記式中、「平均」は、平均粒子直径であり、「標準偏差」は、粒子サイズにおける標準偏差である。ＣＶは、主最頻値を基に、すなわち、単峰性（monomodal）分布曲線を検出粒子サイズ分布に適合させることにより、計算されることが好ましい。したがって、最頻値サイズより小さいかまたは大きい粒子の幾つかは、計算において無視されてもよく、例えば、約９０％（すなわち、検出可能な粒子の）の全粒子数を基にしてもよい。そのようなＣＶの測定は、コールター（Coulter）ＬＳ１３０粒子サイズ分析器で行うことができる。
【００４３】
ポリマー材料の官能化は、重合の後、例えば、ニトロ化、次いで形成したニトロ基をペンダント・アミン基へ還元することによって、あるいは、直接アミノ化（例えば、アミノエタノール処理による）によって行うことができる。さらに別の選択肢としては、周知のUgelstadの２工程膨潤方法、および国際公開第００／６１６４７号パンフレット（Dyno）に記載のその改良法により製造されたポリマー粒子を用いてもよい。この公報に記載の方法にしたがって製造された多孔性ポリマー粒子は、標準的技術により、その孔中に磁気粒子が沈積されていてもよい。
【００４４】
さらなる可能性としては、多孔性ポリマー粒子は、ニトロスチレンおよびＤＶＢや、米国特許第４，６５４，２６７号明細書に教示されているように導入した磁気材料から製造してもよい。
【００４５】
商標名ダイナビーズ（Dynabeads）、特にダイナビーズマイワン（Dynabeads MyOne）でダイナル・バイオテック・エイエスエー（Dynal Biotech ASA）により販売されている超常磁性ポリマービーズが、特に好ましい。ダイナビーズは、懸濁状態を維持し、しばしば他の磁気ビーズと関連して起こる磁気粒子沈降を示さないことから、特に有利である。ダイナビーズはまた、鉄を高濃度で含む他の磁気粒子と比較して優れた磁気可動性を示す。ダイナビーズは、反応時間の短縮と処理量の増加を可能にする有益な動態を示す。ダイナビーズは他の磁気ビーズと比べて非特異的結合の程度が低く、ダイナビーズを適切に使用することにより、所望の材料の集結が起こり、その結果、より容易でより効率的な洗浄手順を行える。最後に、ダイナビーズ、例えば、マイワンビーズは、自動化するのが容易であり、かつ単分散である。
【００４６】
キレート化リガンドは、ポリマー粒子に結合して結合体を形成している。「結合する」とは、前記リガンドが、以下にＣｍ−Ａｓｐリガンドとの関連において詳細に説明する連結基を任意に用いて、ポリマー粒子に共有結合することを意味する。当業者であれば、上述の原理および化学作用は、他のリガンドのポリマー粒子への結合においても同様に当てはまることを認識するであろう。
【００４７】
Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、様々な方法によってポリマー粒子に結合させることができるが、前記ポリマー粒子の表面と前記Ｃｍ−Ａｓｐの窒素原子との間、例えば、スチレン表面とＣｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子との間に、連結原子が少なくとも３つ存在することが好ましい。前記ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる少なくとも６つの原子が存在することが好ましく、前記ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる６から２０の原子が存在することがより好ましい。
【００４８】
米国特許第６，２４２，５８１号明細書においては、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを形成するカルボキシメチル化に先立ち、アスパラギン酸を固相にカップリングさせる。しかしながら、この技術を用いてポリマー粒子上にＣｍ−Ａｓｐ基を供することは不可能であった。そこで、本発明者らは、磁気ポリマー粒子へのカップリング前にＣｍ−Ａｓｐリガンドが完全に形成されている別の合成を考案した。
【００４９】
この点に関し、ポリマー表面とＣｍ−Ａｓｐリガンドとの間に存在する原子が３個未満の場合には、カップリング収率が低いことがわかった。Ｃｍ−Ａｓｐを有するアガロース支持体（米国特許第５，９６２，６４１号明細書に記載）とは対照的に、本発明においては、ポリマー粒子とＣｍ−Ａｓｐとの間において比較的高いカップリング収率を確保することが必要である。アガロース支持体の表面積は、ポリマー粒子の表面積と比べてかなり大きく、したがって、Ｃｍ−Ａｓｐの前記支持体への結合は、高収率で生じる必要はない。本件において、充分なポリマー粒子がＣｍ−Ａｓｐリガンドを担持することを確実にするため、より高い収率が必要である。
【００５０】
少なくとも３つの原子からなるリンカーがアミノ基（−ＮＨ−）を有することが好ましい。ポリマービーズは、硝酸処理によって表面にＮＯ2基を形成したスチレンポリマーで形成されることが多い。これらの基の還元、例えばアンモニアを使用した還元処理の後、アミノ基が形成され、これらのアミノ基は、前記ポリマー粒子表面から最も一般的な結合を形成する。
【００５１】
したがって、前記リンカーの隣の部分は、求電子剤の残基、すなわち、求核剤と求電子剤の反応後に残存している基を含むことが好ましい。したがって、前記リンカーは、オキソ基（Ｃ＝Ｏ、エステル／カルボキシル基の残基）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−基（エポキシドの残基）、−ＣＨ2−（ここで、前記求電子剤は、例えば、ＣＨ2Ｈａｌである）を含んでいてもよい。前記リンカーは、実際の求電子剤を前記−ＮＨ−基に連結する多数の原子、例えば、アルキレン鎖またはエーテル鎖、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−におけるアルキレン鎖またはエーテル鎖をさらに組み込んでもよい。
【００５２】
前記リンカーの最後の部分は、前記Ｃｍ−Ａｓｐ由来の求核剤の残基、すなわち、この求核剤と前記求電子剤との反応後に得られる残基を表している。以下にさらに詳細に述べるように、これは、アミノアルキレンまたはアミノエーテル／ポリエーテル、チオールまたはヒドロキシル残基であってもよい。
【００５３】
したがって、下記式（Ｉ）中の波線は、−ＮＨ−Ｌ1−Ｅｒ−Ｎｒ−Ｌ2−を表していてもよく、ここで、L1は、１〜１０の原子からなる、前記求電子剤残基（Ｅｒ）へのリンカー、L2は、１〜１０の原子からなる、前記求核剤残基（Ｎｒ）に対するリンカーを表す。
【００５４】
【化４】
【００５５】
言うまでもなく、前記磁気ポリマー粒子が求核剤を有し、前記Ｃｍ−Ａｓｐが求電子性基を有するように官能化されていることは、本発明の範囲内である。
【００５６】
好ましい実施形態においては、ポリマー粒子は、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと反応して前記粒子を前記Ｃｍ−Ａｓｐにカップリングさせることができるコーティングを備えるように官能化されるべきである。
【００５７】
特に好ましい実施形態においては、炭素−炭素二重結合を有する粒子コーティングが施されている。このようなコーティングは、例えば、アリルまたはビニル化合物、例えばブテン酸と前記粒子との反応によって施すことができる。ヒドロキシ官能化粒子表面は、臭化アリルと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。また、カルボキシ官能化粒子表面は、アリルアミンと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。前記Ｃｍ−Ａｓｐは、その後、適切な化学を用いて二重結合に直接カップリングさせてもよいし、あるいは、より好ましくは、その後、前記二重結合を還元、例えば、水性ハロゲン（aqueous halide）の存在下で還元し、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと反応して首尾よくカップリングし得るハロゲン求電子剤（halide electrophile）を生じてもよい。
【００５８】
別の好ましい製造方法には、前記ポリマー粒子の表面を、カルボキシル基を担持するように官能化させることが含まれる。カルボン酸基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により活性化され、上述のようにＣｍ−Ａｓｐリガンドと反応させてもよい。
【００５９】
前記リガンドは、金属イオン、特に、Ｃｏ2+に配位している。配位は、前記Ｃｍ−Ａｓｐを、例えば、金属塩化物（例えば、塩化コバルト（II））に暴露することにより、容易に行うことができる。コバルトの使用により、銅使用時とは対照的に、非特異的結合の発生量が最小限に抑えられる。銅（II）等の金属イオンを本明細書に記載の方法において使用した場合、キレート化リガンドが標識に直接結合するのではなく、たんぱく質に含まれる天然由来のｌｙｓ／ｈｉｓ残基に結合してしまう可能性がある。このような非特異的結合がおこると、意味のあるたんぱく質の単離がもはや不可能になるため、本明細書に記載の技術の有用性が著しく低減してしまう。コバルトイオンを使用することにより、キレート化結合は、実質的にたんぱく質の標識のみに結合するようになり、熟練の生化学者に対し、さらなる研究の対象となる理想的な結合体を提供する。
【００６０】
前記リガンドもまた、前記ポリマー粒子とのカップリング前に、官能化されてもよい。例えば、前記粒子表面上の求電子性基との反応を助ける、第１級求核剤を担持する連結基を、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドが備えていれば有利であることが証明されている。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子は第２級求核剤であり、この原子は、おそらくは立体障害のため、前記粒子表面上の求電子性基、例えば、ハロゲンと高収率で反応するには反応性が低すぎることがわかっている。
【００６１】
したがって、少なくとも２つの原子を有し、求核剤（例えば、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基）を含むリンカー基に、前記Ｃｍ−Ａｓｐをカップリングさせることが好ましい。前記リンカーは、アルキルアミン、例えば、Ｃ５／６−アルキルアミンリンカーまたはエーテル／ポリエーテル結合、例えば、１個または２個の酸素原子と３〜６個の炭素原子とを含むものが好ましい。前記リンカーの前記Ｃｍ−Ａｓｐへのカップリング（前記Ｃｍ−Ａｓｐの窒素原子を介する）は、実施例で説明するように、公知の化学作用を用いて達成される。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンド自体は、公知の化学作用を用いて製造することができる。また、リンカーＣｍ−Ａｓｐ構造体全体を、実施例に示すような標準的な化学作用を用いて合成することも可能である。熟練した化学者であれば、本発明で使用されるＣｍ−Ａｓｐリンカー分子のさらなる合成方法を考案することができるであろう。
【００６２】
同様の化学作用を使用して、上記以外のキレート剤を作成することが可能である。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態において、合成の間、前記リガンドのカルボキシル基の保護が必要とされる場合がある。このような保護は、公知の保護方法を用いることにより、例えば、当該技術分野で公知のように、酸または塩基中で加水分解可能なエステル保護基を用いることにより、容易に達成することができる。
【００６４】
金属イオンが結合したリガンドを担持するポリマー粒子は、一般に、適切に標識されたたんぱく質に付着し結合するために用いることができ、ゆえに、多種多様なアッセイにおいて有用である。しかしながら、このようなポリマー粒子は、組換えたんぱく質のＨＡＴ標識の単離に特に有用である。したがって、別の態様によれば、本発明は、ＨＡＴ標識たんぱく質に共有結合した磁気ポリマー粒子のアッセイでの使用を提供する。あるいは、本発明は、本明細書中で先に定義した方法を含むアッセイを提供する。好適なアッセイおよびこれらを行う方法は、熟練の生化学者には公知である。
【００６５】
例えば、本発明の官能化粒子上の標識たんぱく質の捕捉には、様々な用途がある。単離されたたんぱく質は反応動態が迅速で、かつ扱いやすいことから、この技術は、大きなたんぱく質複合体の「プルダウン」に非常に適している。したがって、官能化ビーズを、マススペクトロメトリ分析のためのサンプル調製に用いることができる。共有結合固定化ビーズを用いて単離した複合体は、カラムまたは凹凸のある表面を有するその他の磁気粒子を含む他の固体支持体を用いて単離された複合体よりも損傷が少なく、したがって、マススペクトロメトリのサンプル単離での使用に理想的と考えられている。
【００６６】
前記固定化技術を、アッセイの手順において使用される固相に応用することもできる。本発明のビーズは、凝集しにくく、溶液中での分散性が高く、非特異性結合の程度が低い。これらの特性により、高品位なスクリーニング結果や、広範囲の自動化プラットフォームで容易に自動化できるプロトコルが可能となる。前記ビーズはさらに、ファージディスプレイにおいて、おそらくは固相として使用できるか、あるいは、ライブラリから発現ファージディスプレイ選択たんぱく質を精製するために使用することができる。
【００６７】
したがって、一般に、標識たんぱく質の捕捉により、マイクロスケールのたんぱく質精製、突然変異たんぱく質ライブラリの除去、たんぱく質／ペプチドの変性溶離、たんぱく質／ペプチドの穏やかな溶離、たんぱく質−たんぱく質間の相互作用研究、ならびにスクリーニング技術が、例えば、薬物の発見、分子表示、アプタマー・スクリーニング、ファージディスプレイ、設計酵素スクリーニング、および診断といった目的のために、可能となりうる。
【００６８】
以下に挙げる非限定的な実施例を参照し、本発明についてさらに説明する。
【００６９】
反応物の製造
以下のＣｍ−Ａｓｐトリエステルを、次のように製造した。
【００７０】
【化５】
【実施例１】
【００７１】
臭素化
アリル基を０．５ｍｍｏｌ／ｇ有する磁気スチレン粒子のメタノール懸濁液１７．３ｇを、４５ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．９）で４回洗浄した。粒子含有量を９重量％へ調節した後、１０ｍｌのＤＭＦ中に溶解された０．９６ｇのピリジニウムトリブロマイドを、３５０ｒｐｍで攪拌しながら添加した。室温で５分後、前記粒子を４５ｍｌの脱イオン水で５回洗浄した。
【実施例２】
【００７２】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
実施例１に記載の方法で製造した粒子の懸濁液１８．０ｇを、２０ｍｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した。その懸濁液に、Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）を０．１７ｇ添加した。５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを、粒子含有量が１０重量％となるまで添加した。反応混合物を、６００ｒｐｍ、４０℃で１５時間振盪した。次いで、前記粒子を、２０ｍｌの脱イオン水で４回洗浄した。
【実施例３】
【００７３】
加水分解
実施例２に記載の方法で製造した粒子の懸濁液２０．０ｇを、２０ｍｌの１M水酸化リチウムで２回洗浄した。粒子含有量を１０重量％に調節した後、混合物を、２５０ｒｐｍ、室温で４時間振盪した。次いで、前記粒子を、ｐＨが６〜７となるまで脱イオン水で洗浄した。
【実施例４】
【００７４】
コバルト負荷
実施例３に記載の方法で製造した粒子２５０ｍｇを、５ｍｌの逆浸透水で２回洗浄した。５ｍｌの２．５ｍＭ ＣｏＣｌ2を前記粒子に添加し、５時間インキュベートした。管を磁石中に配置し、上澄み液を除去した。前記粒子を、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。その後、前記粒子を２０％エタノールで１回洗浄した。前記粒子を２０％エタノール中で保管した。
【実施例５】
【００７５】
細胞溶解物の製造
１０ｍｌの培養液から採取したＨＡＴ−ＣＡＴ（ＨＡＴ標識クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含有する細菌ペレットを、９００μｌの結合／洗浄緩衝液で、全体が１０００μｌとなるように再懸濁した。細胞を、次のようにして溶解させた。１０００μｌの細胞懸濁液、５００μｌのポップカルチャー（Popculture（商標））試薬（ノバゲン（Novagen）社）、および１００μｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００μｇ／ｍｌ）を、ピペットを用いて混合し、室温または氷上で１０分間インキュベートした。
【００７６】
ビーズの平衡化
ダイナビーズ（登録商標）タロン（Talon（商標））（すなわち、実施例４で得られたビーズ）４０ｍｇを、３ｍｌの結合／洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２回洗浄することにより平衡化した。
【００７７】
ポリヒスチジン標識（すなわち、ＨＡＴ標識）たんぱく質のダイナビーズ（登録商標）タロン（商標）への結合
前記細胞溶解物を平衡化した前記ビーズに添加し、結合／洗浄緩衝液により、体積を７．５ｍｌまで増加させた。前記ビーズを室温で１０分間転がした。
【００７８】
前記結合工程の終了後、ピペットを用いて上澄み液を除去し、前記ビーズを３ｍｌの結合／洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【００７９】
前記ビーズ２０ｍｇを、ｐＨ６の１５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。ＲＯ水（逆浸透水）に溶解した５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＥＤＣを添加した。管を、２時間回転させた。上澄み液を除去し、前記ビーズを１ｍｌの溶離緩衝液（１５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＰ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に再懸濁させた。
【００８０】
前記ビーズ２０ｍｇを、１ｍｌの溶離緩衝液で洗浄した。前記ビーズを、１ｍｌのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に再懸濁させた。
【００８１】
ビーズ上のＨＡＴ−ＣＡＴの検出
共有結合によりカップリングされたＨＡＴ−ＣＡＴを、「Ｅｕ」で標識した抗ＣＡＴを用いた時間分解蛍光を用いて検出した。
結果
ＥＤＣで処理したビーズ：ビーズ１ｍｇ当たり抗ＣＡＴ２．６μｇ
溶離緩衝液で処理したビーズ：ビーズ１ｍｇ当たり抗ＣＡＴ０．１μｇ
【実施例６】
【００８２】
カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの官能化
マイワンカルボン酸ビーズの粒子５．０ｇの懸濁液５０ｇを、０．１Ｍ酢酸（３×５０ｍｌ）で洗浄することにより酸性化した。次いで、酸性化した粒子（０．５ｍｍｏｌ／ｇ ＤＳのカルボン酸含有量を有している）を、アセトン（４×５０ｍｌ）で洗浄し、磁石上で集めた。アセトンを懸濁液全体が３５．６ｇに達するまでさらに添加した。その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．９０ｇ、２５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルカルボジイミド（３．１６ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を、室温で５時間攪拌した。次いで、前記粒子をアセトン（５×５０ｍｌ）で洗浄した。
【実施例７】
【００８３】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
実施例６のビーズのアセトン懸濁液４４ｇを、５０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した後、トリエチルアミンを５．６ｇ添加した。その後、イソプロパノールに溶解した０．１０ｇのＣｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）を添加した。この結果、粒子含有量は１０重量％となる。次いで、反応混合物を２５０ｒｐｍ、室温で２０時間振盪した。前記粒子を５０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例８】
【００８４】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤およびエタノールアミンによる官能化
実施例７に記載の方法で製造した粒子のイソプロパノール懸濁液１０ｇに、エタノールアミンを０．３２ｇ添加した。次いで、反応混合物を、２５０ｒｐｍ、室温で１８時間振盪した。その後、前記粒子を、１０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例９】
【００８５】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
乾燥ダイナビーズ２７０エポキシ１．２ｇを、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム８．８ｇと混合した。この懸濁液に、Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）０．１７ｇを添加し、反応混合物を、６００ｒｐｍ、６０℃で１６時間振盪した。前記粒子を、２０ｍｌの脱イオン水で４回洗浄することにより後処理した。
【実施例１０】
【００８６】
Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル合成の別の例
【００８７】
【化６】
【００８８】
２−アミノ−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００８９】
【化７】
【００９０】
ＤＬ−アスパラギン酸（９１．５ｇ、０．６９ｍｏｌ）の無水エタノール（８００ｍｌ）中の懸濁液に、０℃で塩化チオニル（１５０ｍｌ、２．０６ｍｏｌ）を滴下により添加した。冷却浴を除去して、前記混合物を３時間還流した。周囲温度に冷却した後、溶媒を真空下に蒸発させ、残渣にＫ2ＣＯ3の飽和水溶液をｐＨ８となるまで添加した。ろ過、真空下への蒸発に先立ち、水相を酢酸エチルで抽出し（×３）、合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ4）。これにより、１２４．８ｇ（９６％）の化合物１を黄色油状物として生じた。粗生成物を次の工程で直接用いた。
【００９１】
【数２】
【００９２】
２−（４−シアノ−ブチルアミノ）−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００９３】
【化８】
【００９４】
化合物１（９３．０ｇ、０．４９ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（３４．０ｇ、０．２５ｍｏｌ）およびＫＩ（１２．３ｇ、０．０７ｍｏｌ）のＴＨＦ（６００ｍｌ）中懸濁液に、５−ブロモバレロニトリル（２８．４ｍｌ、０．２５ｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を還流加熱して５日間攪拌した。周囲温度に冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（７：３）で溶離するシリカゲルでの精製により、６４．１ｇ（９７％）の化合物２を黄色油状物として生じた。
【００９５】
【数３】
【００９６】
２−［（４−シアノ−ブチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００９７】
【化９】
【００９８】
化合物２（８６．６ｇ、０．３２ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４４．３ｇ、０．３２ｍｏｌ）、およびＫＩ（１６．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）のＴＨＦ（６５０ｍｌ）中の混合物に、ブロモ酢酸エチル（４２．５ｍｌ、０．３８ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を加熱還流し、５日間攪拌した。周囲温度まで冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（８：２）で溶離するシリカゲルでの精製により、１０３．７ｇ（９１％）の化合物３を生じた。
【００９９】
【数４】
【０１００】
２−［（５−アミノ−ペンチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【０１０１】
【化１０】
【０１０２】
化合物３（１５ｇ、４２ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（６０ｍｌ）および濃ＨＣｌ（１０ｍｌ）の溶液に、ＰｔＯ2（６００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（２０ｍｌ）中の懸濁液を添加した。反応混合物に対し、５０ｐｓｉで一晩水素添加した。前記混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させ、一晩空気を吸い出して、定量的な収率の標題化合物をＨＣｌ塩として生じた。
【０１０３】
【数５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識たんぱく質に共有結合したポリマー粒子に関する。特に、本発明は、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）基の残基を介してＨＡＴ標識たんぱく質のＨＡＴ標識に結合した磁気ポリマー粒子、ならびに前記共有結合を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気ポリマー粒子は、様々な医療および生化学の分野において、例えば、医薬製品の運搬のための輸送ビヒクルとして、診断目的、分離、および合成目的のため、一般に有用である。このような粒子は、機能を発揮するためにその磁気特性に依拠している。診断アッセイへの応用では、例えば、磁気ポリマー粒子に結合した分析物を含有する試料に磁場をかけると、遠心分離またはろ過を使用しなくても前記分析物を単離することが可能となる。また、治療への応用においては、例えば、患者に磁場をかけることにより、薬物を担持する磁気ポリマー粒子を所望の身体部位へと送り込むことができる。
【０００３】
本明細書において、「磁気」とは、ポリマー粒子が超常磁性（superparamagnetic）結晶を含有することを意味する。したがって、この磁気ポリマー粒子は、磁気的に置き換え可能であるが、永久に磁化可能というものではない。磁気ポリマー粒子の製造方法は多数知られており、その大多数には、予め形成された磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトから、マグヘマイトまたはマグネタイトを含有するポリマー粒子を形成することが含まれる。関連する方法のいくつかが、米国特許第４，６５４，２６７号明細書（Ugelstad）（特許文献１）に記載されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
固定金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の使用は、長年にわたって公知である。ＩＭＡＣ精製法は、遷移金属イオン、例えば、Ｃｕ2+またはＮｉ2+（このＣｕ2+またはＮｉ2+は、たんぱく質表面に存在する電子供与基、特に、ヒスチジンのイミダゾール側鎖に結合することができる）を有するキレートマトリックスの使用に基づいている。電子供与基は、前記金属イオンの周りの空配位部位に配位すると考えられている。前記たんぱく質表面に存在する前記電子供与基と前記金属イオンとの間の相互作用は、例えば、ｐＨを変化させることにより変更することができ、ゆえに、可逆性金属錯体／たんぱく質相互作用によって精製を行うことが可能である。最も一般的には、たんぱく質が前記金属イオンとヒスチジンのイミダゾリル側鎖との相互作用によって固相に結合されていれば、前記たんぱく質を、イミダゾール自体の添加、すなわち、競合的溶離によって除去することができる。
【０００５】
数種の異なるキレート化リガンドが、ＩＭＡＣにおいて、たんぱく質の精製に用いられている。ニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）（四座配位子）および五座配位子であるトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンがそのようなリガンドの例であるが、これらには、非特異的たんぱく質相互作用、金属漏れ等の様々な短所がある。
【０００６】
米国特許第６，２４２，５８１号明細書（特許文献２）は、金属漏れの問題に対し、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩（Ｃｍ−Ａｓｐ）基のＩＭＡＣでの使用（ここで、結合した遷移金属イオンは八面体形態を有する）による解決策を提案している。前記リガンドは、ヒスチジン標識組換えたんぱく質を単離するのに理想的であると言われている。Ｃｍ−Ａｓｐの他の長所、例えば、還元剤への耐性が、米国特許第５，９６２，６４１号明細書（特許文献３）で説明されている。
【０００７】
ポリスチレン、ナイロン、およびセファロース等の他のポリマーマトリックスが提案されているが、これらの特許において、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、アガロース固相（架橋しているのが好ましい）に結合している。これらのマトリックスは磁性を有していてもよいが、磁気粒子は懸濁状態を維持しないため、アッセイにおける固相の用途は限られる。
【０００８】
固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー技術は、金属イオンと、キレート化リガンドと、通常は、たんぱく質内に存在するイミダゾール基との間で起こるキレート化に依拠している。しかしながら、前記錯体（すなわち、固相、キレートリガンド、およびたんぱく質）が時々解離し、金属イオン漏れが起こることは避けられない。したがって、ポリマー粒子が実際にたんぱく質に共有結合してこれを固定化することが好ましい。共有結合は、錯体中におけるイオン相互作用と比べてはるかに強力な結合であり、例えば、たんぱく質複合体のプルダウンやスクリーニングのようなアッセイの手順において、多数のさらなる選択肢を当業者に提供するものである。粒子に共有結合したたんぱく質は、はるかに強固なものとなり、より強力な処理および精製方法の実施が可能となる。
【０００９】
米国特許第６，４４１，１４６号明細書（Minh）（特許文献４）においては、たんぱく質の共有結合固定化のための方法であって、銅（II）イオンに配位した五座キレート剤に結合している非磁性樹脂にたんぱく質を接触させることを含む方法が記載されている。得られた錯体をカルボジイミドに接触させ、銅（II）イオンを除去して固定化たんぱく質を形成する。
【特許文献１】米国特許第４，６５４，２６７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２４２，５８１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９６２，６４１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４４１，１４６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この方法での使用が提案されているたんぱく質は、ウシ血清アルブミンであり、好適な樹脂は、セファロースである。しかしながら、銅（II）イオンは、この方法において理想的な金属イオンではないことがわかっている。これは、銅（II）イオンは、五座配位子を強力にキレート化し、この相互作用の強力さにより、前記共有結合固定化工程、すなわち、カルボジイミド処理において、多くの非特異的結合が生じてしまうからである。
【００１１】
Minhに記載の方法によれば、前記キレートリガンドと、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中のあらゆる天然由来のリジン残基との間に結合を生じさせることができる。したがって、MinhにおけるＢＳＡには、結合リガンドの指向が多数存在する場合があり、これにより、この技術が精製または増幅に不適切なものとなっている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
現在、キレート化リガンド、例えば、Ｃｍ−Ａｓｐキレート化リガンドは、ポリマー粒子に共有結合し、組換えたんぱく質の標識に共有結合する能力を有する部分を生じることがわかっている。これにより、熟練の生化学者に、アッセイの手順に関してさらなる融通性を与えることが可能になった。さらに、キレート化リガンドは、固定化の間における非特異的結合を最小限に抑えるため、コバルト（II）イオン等の金属イオンに配位することが好ましい。
【００１３】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、標識たんぱく質、例えば、ＨＡＴ標識たんぱく質を、ポリマー粒子、例えば、磁気ポリマー粒子に共有結合させる方法であり、標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオン（好ましくはＣｏ2+イオン）が配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
見方を変えれば、本発明は、細胞溶解物から標識たんぱく質を単離するための方法であり、少なくとも１つの標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）、例えば、複数の標識たんぱく質を含む細胞溶解物を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオンが配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、標識たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、先に述べたような方法によって得ることが可能な、例えば、得られた標識を介してポリマー粒子に共有結合した標識たんぱく質を提供する。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、以下の式で表される残基を含むリンカーを介して標識たんぱく質に共有結合するポリマー粒子であって、前記標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を含むポリマー粒子を提供する。
【００１７】
【化２】
【００１８】
本発明で使用されるたんぱく質は、標識されている、すなわち、ラベルに結合している。本発明で使用される標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と少なくとも２つのリジン残基、例えば、少なくとも３つのヒスチジン残基と少なくとも３つのリジン残基を有していなければならない。
【００１９】
本発明で使用される最も好ましい標識は、当該技術分野において周知なＨＡＴ標識である。ＨＡＴ標識は、６つのヒスチジン残基と３つのリジン残基を含有するαヘリックスを有している。ヒスチジンのイミダゾール側鎖とリジンのアミノ基側鎖の両方が存在することは、共有結合固定化方法において決定的に重要である。理論によって限定しようとするものではないが、ヒスチジンのイミダゾールにより、前記金属イオンへの、ゆえに、前記キレート化剤への標識たんぱく質の配位が可能になるものと思われる。よって、カルボジイミドによる処理において、リジン残基におけるアミノ基が、アミド結合によって前記キレート化剤に共有結合できる。
【００２０】
このように、配位／結合に利用可能な必要なヒスチジンおよびリジン残基を有するあらゆるたんぱく質標識（すなわち、たんぱく質ラベル）が、この発明における使用に適している。
【００２１】
したがって、別の態様によれば、本発明は、たんぱく質上の標識に共有結合したポリマー粒子、例えば、磁気ポリマー粒子であり、前記標識が、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を有し、前記粒子は、前記少なくとも２つのリジン残基を介し、アミド結合によって前記標識に結合する連結基を有しているポリマー粒子を提供する。
【００２２】
標識、例えば、ＨＡＴ標識のたんぱく質への導入は、従来の方法により、例えば、対象となるたんぱく質のＣまたはＮ末端に対して行える。
【００２３】
カルボジイミド化合物は、公知の方法により、前記キレート化剤のカルボキシル基を活性化する。前記キレート化剤のカルボキシル基は、ジイミドと反応して式−ＣＯＯ−Ｃ（ＮＨＲ）＝ＮＲで表されるリンカーを含む中間生成物を形成し、次に、このリンカーがリジン残基上の遊離アミノ基と反応して前記キレート剤から前記標識たんぱく質へのアミド結合を形成すると考えられている。前記たんぱく質標識中のリジン残基の数は、前記キレート化剤中のカルボキシル基の数と一致していることが好ましい。ＨＡＴ標識たんぱく質は、このような残基を３つ有している。したがって、前記キレート化剤は、カルボキシル基を３つ有し、これにより、３つの共有アミド結合を形成させることが好ましい。
【００２４】
この反応に好適なカルボジイミドとしては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、ｔ−ブチルエチルカルボジイミド、ｔ−ブチル−メチルカルボジイミドまたはそれらの塩が挙げられる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）が好ましい。
【００２５】
カルボジイミドがこの反応に最適であるが、その他のカルボキシル基活性化物質もまた好適である場合がある。活性化物質の代表例としては、ホスホニウム塩（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ）、ウロニウム塩（例えば、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＳＴＵ）、ピリジニウム塩−Ｂｕ3Ｎ、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールおよびＴｉ（ＯＢｕ）4が挙げられる。
【００２６】
使用されるジイミド化合物の量は、決定的に重要ではないものの、キレート剤に対して過量のジイミドを存在させるべきである。
【００２７】
金属イオンは、周期表の１から１３族の任意の金属、ランタニドもしくはアクチニドまたは金属Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｂｉ、Ｔｅ、ＰｏもしくはＡｔであってもよい。金属イオンは、銅イオンでないことが好ましい。金属イオンは、遷移金属イオン（すなわち、周期表の３から１２族）であることが好ましい。好ましい金属イオンは、２＋または３＋の酸化状態、特に、２＋の酸化状態にあるイオンである。金属イオンが２＋の酸化状態にある場合、粒子−リンカー−リガンド−金属イオンの集合体全体が非荷電であり、これにより、非特異性結合の可能性が減少する。
【００２８】
好ましい金属は、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、Ｃｏ、およびＺｎであり、そのうち、Ｆｅ、Ｇａ、Ｍｎ、およびＣｏが好ましく、特に、Ｃｏ2+が好ましい。
【００２９】
前記キレート化剤に配位した金属イオンは、共有結合により固定化されたたんぱく質の形成後に除去してもよく、このような除去は、前記イオンに配位する別のキレート化剤を使用することによって行える。これは従来、強力なキレート化剤であるＥＤＴＡによって行われているが、ＤＴＰＡ等のその他のキレート化剤もまた好適である。金属イオンを除去することが好ましいが、これは必須ではない。
【００３０】
本発明で使用されるキレート化リガンドは、少なくとも２つのカルボキシル基を有する三座、四座または五座配位子である。キレート化リガンドは、四座または三座、特に、四座であることが好ましい。好適なリガンドとしては、イミノ二酢酸、ニトリロトリ酢酸、トリス（カルボキシメチルエチレンジアミンまたはＣｍ−Ａｓｐが挙げられる。これらの中でも、Ｃｍ−Ａｓｐが特に好ましい。
【００３１】
任意に磁性を有するポリマー粒子（ＭＰＰ）に結合したＣｍ−Ａｓｐリガンド（すなわち、粒子−キレート化剤結合体）を、その非配位状態および金属イオンに配位した状態の両方で以下に示す（波線は、Ｃｍ−Ａｓｐと粒子との間の結合またはリンカーを表す）。窒素原子もまた配位に関与する、すなわち、Ｃｍ−Ａｓｐは四座であると考えられている。
【００３２】
【化３】
【００３３】
驚くべきことに、上述の反応により、配向が制御された固定化標識たんぱく質が得られることがわかった。前記標識は、たんぱく質のＮ末端かＣ末端のいずれかに位置し、たんぱく質配向の容易な測定を可能にすることが好ましい。
【００３４】
本発明の方法で使用されるポリマー粒子は、磁性を有することが好ましく、どのような磁気ポリマー粒子であってもよく、例えば、米国特許第４,６５４,２６７号明細書（特許文献１）に記載のようなものであってもよい。前記粒子は、多孔性のものであると、その孔中に超常磁気結晶が存在することが可能なので好ましい。前記粒子の表面は、通常、官能化され、前記キレートリガンドが前記ポリマー粒子にカップリングできるようにされており、例えば、官能化により、カルボキシル基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、マレアミド基、チオール基等の任意の公知の表面構造体を有していてもよい。ゆえに、その表面は、リガンドカップリングの前にアミン官能化されてもよい。あるいは、アミン官能化表面自体をさらに官能化し、他の官能基、例えばＣＯＯＨ基を有するようにしてもよい。
【００３５】
前記ポリマー粒子は、ビニル系ポリマー（例えば、スチレン）、アクリレート類および／またはメタクリレート類の組み合わせから形成されるのが好ましい。ポリマー材料は、例えば、コモノマーである架橋剤（例えば、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはエチレングリコールジメタクリレート）の取り込みによって、任意に架橋されてもよい。必要な架橋剤（例えば、コモノマー）の適切な量は、当業者には周知であろう。前記ポリマーは、架橋スチレン系ポリマー（例えば、ニトロ基含有コモノマー（例えば、ニトロスチレン）の使用、およびその後の還元によって表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー）または、エポキシ基含有コモノマー（例えば、グリシジルメタクリレート）の使用、およびその後のアミノ化（例えば、エチレンジアミンとの反応によるアミノ化）によって表面官能化された架橋（メタ）アクリル系ポリマーが好ましい。
【００３６】
本発明の方法で用いるポリマー粒子における超常磁性結晶は、多孔性ポリマー粒子中に超常磁気結晶の形態で沈積することが可能な材料であれば、いかなる材料の結晶であってもよい。磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトまたはマグヘマイトが好ましいが、前記結晶は、望ましい場合には、混合金属酸化物または他の磁気材料の結晶であってもよい。存在する結晶磁気材料の総量は、通常１％より多く、好ましくは３％より多く、望ましくは５％以上である（重量比であり、例えば、４０重量％まで）。パーセンテージは、Ｆｅ（または酸化鉄以外の磁気材料の場合、同等の金属）について、被覆粒子の乾燥総重量に基づき、重量ベースで計算される。
【００３７】
本発明の様々な態様に係るポリマー粒子は、概して、一般にマイクロメーター範囲のサイズ（すなわち、直径）を有し、０．２〜１２０ミクロン等の範囲、例えば、０．３〜１００μｍ、特に、０．５〜５０μｍ、より特に、０．８〜５μｍ、例えば、０．８〜１．５μｍ、好ましくは１〜１．２μｍが挙げられる。
【００３８】
典型的には、使用される多孔性粒子は、平均粒子直径を２．７μｍに補正した場合（すなわち、表面積に２．７／ＭＤを乗じた場合。ここで、ＭＤとはマイクロメーターで表した平均直径である。）に、少なくとも１５ｍ2／ｇ（ＢＥＴ窒素吸着法により測定）、より好ましくは少なくとも３０ｍ2／ｇ、例えば、７００ｍ2／ｇまでの表面積を有する。同様に縮尺を合わせたとき、前記粒子の孔容積は、少なくとも０．１ｍｌ／ｇであることが好ましい。
【００３９】
前記ポリマー粒子は、それらがコーティングされる前は、球状でありかつ、実質的には単分散であることが典型的であり、それら粒子がコーティングされても、球状かつ実質的に単分散のままであることが特に好ましい。
【００４０】
「実質的に単分散」とは、複数の粒子（例えば、少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１０００個）について、これらの粒子が、２０％未満の変動係数（ＣＶ）、例えば１５％未満、好ましくは１２％未満、より好ましくは１１％未満、さらにより好ましくは１０％未満、最も好ましくは約８％以下、例えば、２％から５％の変動係数（ＣＶ）を有することを意味する。ＣＶは、以下のようにパーセンテージで求められる。
【００４１】
【数１】
【００４２】
前記式中、「平均」は、平均粒子直径であり、「標準偏差」は、粒子サイズにおける標準偏差である。ＣＶは、主最頻値を基に、すなわち、単峰性（monomodal）分布曲線を検出粒子サイズ分布に適合させることにより、計算されることが好ましい。したがって、最頻値サイズより小さいかまたは大きい粒子の幾つかは、計算において無視されてもよく、例えば、約９０％（すなわち、検出可能な粒子の）の全粒子数を基にしてもよい。そのようなＣＶの測定は、コールター（Coulter）ＬＳ１３０粒子サイズ分析器で行うことができる。
【００４３】
ポリマー材料の官能化は、重合の後、例えば、ニトロ化、次いで形成したニトロ基をペンダント・アミン基へ還元することによって、あるいは、直接アミノ化（例えば、アミノエタノール処理による）によって行うことができる。さらに別の選択肢としては、周知のUgelstadの２工程膨潤方法、および国際公開第００／６１６４７号パンフレット（Dyno）に記載のその改良法により製造されたポリマー粒子を用いてもよい。この公報に記載の方法にしたがって製造された多孔性ポリマー粒子は、標準的技術により、その孔中に磁気粒子が沈積されていてもよい。
【００４４】
さらなる可能性としては、多孔性ポリマー粒子は、ニトロスチレンおよびＤＶＢや、米国特許第４，６５４，２６７号明細書に教示されているように導入した磁気材料から製造してもよい。
【００４５】
商標名ダイナビーズ（Dynabeads）、特にダイナビーズマイワン（Dynabeads MyOne）でダイナル・バイオテック・エイエスエー（Dynal Biotech ASA）により販売されている超常磁性ポリマービーズが、特に好ましい。ダイナビーズは、懸濁状態を維持し、しばしば他の磁気ビーズと関連して起こる磁気粒子沈降を示さないことから、特に有利である。ダイナビーズはまた、鉄を高濃度で含む他の磁気粒子と比較して優れた磁気可動性を示す。ダイナビーズは、反応時間の短縮と処理量の増加を可能にする有益な動態を示す。ダイナビーズは他の磁気ビーズと比べて非特異的結合の程度が低く、ダイナビーズを適切に使用することにより、所望の材料の集結が起こり、その結果、より容易でより効率的な洗浄手順を行える。最後に、ダイナビーズ、例えば、マイワンビーズは、自動化するのが容易であり、かつ単分散である。
【００４６】
キレート化リガンドは、ポリマー粒子に結合して結合体を形成している。「結合する」とは、前記リガンドが、以下にＣｍ−Ａｓｐリガンドとの関連において詳細に説明する連結基を任意に用いて、ポリマー粒子に共有結合することを意味する。当業者であれば、上述の原理および化学作用は、他のリガンドのポリマー粒子への結合においても同様に当てはまることを認識するであろう。
【００４７】
Ｃｍ−Ａｓｐリガンドは、様々な方法によってポリマー粒子に結合させることができるが、前記ポリマー粒子の表面と前記Ｃｍ−Ａｓｐの窒素原子との間、例えば、スチレン表面とＣｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子との間に、連結原子が少なくとも３つ存在することが好ましい。前記ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる少なくとも６つの原子が存在することが好ましく、前記ポリマー粒子表面から前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを隔てる６から２０の原子が存在することがより好ましい。
【００４８】
米国特許第６，２４２，５８１号明細書においては、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドを形成するカルボキシメチル化に先立ち、アスパラギン酸を固相にカップリングさせる。しかしながら、この技術を用いてポリマー粒子上にＣｍ−Ａｓｐ基を供することは不可能であった。そこで、本発明者らは、磁気ポリマー粒子へのカップリング前にＣｍ−Ａｓｐリガンドが完全に形成されている別の合成を考案した。
【００４９】
この点に関し、ポリマー表面とＣｍ−Ａｓｐリガンドとの間に存在する原子が３個未満の場合には、カップリング収率が低いことがわかった。Ｃｍ−Ａｓｐを有するアガロース支持体（米国特許第５，９６２，６４１号明細書に記載）とは対照的に、本発明においては、ポリマー粒子とＣｍ−Ａｓｐとの間において比較的高いカップリング収率を確保することが必要である。アガロース支持体の表面積は、ポリマー粒子の表面積と比べてかなり大きく、したがって、Ｃｍ−Ａｓｐの前記支持体への結合は、高収率で生じる必要はない。本件において、充分なポリマー粒子がＣｍ−Ａｓｐリガンドを担持することを確実にするため、より高い収率が必要である。
【００５０】
少なくとも３つの原子からなるリンカーがアミノ基（−ＮＨ−）を有することが好ましい。ポリマービーズは、硝酸処理によって表面にＮＯ2基を形成したスチレンポリマーで形成されることが多い。これらの基の還元、例えばアンモニアを使用した還元処理の後、アミノ基が形成され、これらのアミノ基は、前記ポリマー粒子表面から最も一般的な結合を形成する。
【００５１】
したがって、前記リンカーの隣の部分は、求電子剤の残基、すなわち、求核剤と求電子剤の反応後に残存している基を含むことが好ましい。したがって、前記リンカーは、オキソ基（Ｃ＝Ｏ、エステル／カルボキシル基の残基）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−基（エポキシドの残基）、−ＣＨ2−（ここで、前記求電子剤は、例えば、ＣＨ2Ｈａｌである）を含んでいてもよい。前記リンカーは、実際の求電子剤を前記−ＮＨ−基に連結する多数の原子、例えば、アルキレン鎖またはエーテル鎖、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−におけるアルキレン鎖またはエーテル鎖をさらに組み込んでもよい。
【００５２】
前記リンカーの最後の部分は、前記Ｃｍ−Ａｓｐ由来の求核剤の残基、すなわち、この求核剤と前記求電子剤との反応後に得られる残基を表している。以下にさらに詳細に述べるように、これは、アミノアルキレンまたはアミノエーテル／ポリエーテル、チオールまたはヒドロキシル残基であってもよい。
【００５３】
したがって、下記式（Ｉ）中の波線は、−ＮＨ−Ｌ1−Ｅｒ−Ｎｒ−Ｌ2−を表していてもよく、ここで、L1は、１〜１０の原子からなる、前記求電子剤残基（Ｅｒ）へのリンカー、L2は、１〜１０の原子からなる、前記求核剤残基（Ｎｒ）に対するリンカーを表す。
【００５４】
【化４】
【００５５】
言うまでもなく、前記磁気ポリマー粒子が求核剤を有し、前記Ｃｍ−Ａｓｐが求電子性基を有するように官能化されていることは、本発明の範囲内である。
【００５６】
好ましい実施形態においては、ポリマー粒子は、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと反応して前記粒子を前記Ｃｍ−Ａｓｐにカップリングさせることができるコーティングを備えるように官能化されるべきである。
【００５７】
特に好ましい実施形態においては、炭素−炭素二重結合を有する粒子コーティングが施されている。このようなコーティングは、例えば、アリルまたはビニル化合物、例えばブテン酸と前記粒子との反応によって施すことができる。ヒドロキシ官能化粒子表面は、臭化アリルと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。また、カルボキシ官能化粒子表面は、アリルアミンと反応し、前記粒子表面上に二重結合を形成することができる。前記Ｃｍ−Ａｓｐは、その後、適切な化学を用いて二重結合に直接カップリングさせてもよいし、あるいは、より好ましくは、その後、前記二重結合を還元、例えば、水性ハロゲン（aqueous halide）の存在下で還元し、Ｃｍ−Ａｓｐリガンドと反応して首尾よくカップリングし得るハロゲン求電子剤（halide electrophile）を生じてもよい。
【００５８】
別の好ましい製造方法には、前記ポリマー粒子の表面を、カルボキシル基を担持するように官能化させることが含まれる。カルボン酸基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により活性化され、上述のようにＣｍ−Ａｓｐリガンドと反応させてもよい。
【００５９】
前記リガンドは、金属イオン、特に、Ｃｏ2+に配位している。配位は、前記Ｃｍ−Ａｓｐを、例えば、金属塩化物（例えば、塩化コバルト（II））に暴露することにより、容易に行うことができる。コバルトの使用により、銅使用時とは対照的に、非特異的結合の発生量が最小限に抑えられる。銅（II）等の金属イオンを本明細書に記載の方法において使用した場合、キレート化リガンドが標識に直接結合するのではなく、たんぱく質に含まれる天然由来のｌｙｓ／ｈｉｓ残基に結合してしまう可能性がある。このような非特異的結合がおこると、意味のあるたんぱく質の単離がもはや不可能になるため、本明細書に記載の技術の有用性が著しく低減してしまう。コバルトイオンを使用することにより、キレート化結合は、実質的にたんぱく質の標識のみに結合するようになり、熟練の生化学者に対し、さらなる研究の対象となる理想的な結合体を提供する。
【００６０】
前記リガンドもまた、前記ポリマー粒子とのカップリング前に、官能化されてもよい。例えば、前記粒子表面上の求電子性基との反応を助ける、第１級求核剤を担持する連結基を、前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドが備えていれば有利であることが証明されている。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンドの窒素原子は第２級求核剤であり、この原子は、おそらくは立体障害のため、前記粒子表面上の求電子性基、例えば、ハロゲンと高収率で反応するには反応性が低すぎることがわかっている。
【００６１】
したがって、少なくとも２つの原子を有し、求核剤（例えば、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基）を含むリンカー基に、前記Ｃｍ−Ａｓｐをカップリングさせることが好ましい。前記リンカーは、アルキルアミン、例えば、Ｃ５／６−アルキルアミンリンカーまたはエーテル／ポリエーテル結合、例えば、１個または２個の酸素原子と３〜６個の炭素原子とを含むものが好ましい。前記リンカーの前記Ｃｍ−Ａｓｐへのカップリング（前記Ｃｍ−Ａｓｐの窒素原子を介する）は、実施例で説明するように、公知の化学作用を用いて達成される。前記Ｃｍ−Ａｓｐリガンド自体は、公知の化学作用を用いて製造することができる。また、リンカーＣｍ−Ａｓｐ構造体全体を、実施例に示すような標準的な化学作用を用いて合成することも可能である。熟練した化学者であれば、本発明で使用されるＣｍ−Ａｓｐリンカー分子のさらなる合成方法を考案することができるであろう。
【００６２】
同様の化学作用を使用して、上記以外のキレート剤を作成することが可能である。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態において、合成の間、前記リガンドのカルボキシル基の保護が必要とされる場合がある。このような保護は、公知の保護方法を用いることにより、例えば、当該技術分野で公知のように、酸または塩基中で加水分解可能なエステル保護基を用いることにより、容易に達成することができる。
【００６４】
金属イオンが結合したリガンドを担持するポリマー粒子は、一般に、適切に標識されたたんぱく質に付着し結合するために用いることができ、ゆえに、多種多様なアッセイにおいて有用である。しかしながら、このようなポリマー粒子は、組換えたんぱく質のＨＡＴ標識の単離に特に有用である。したがって、別の態様によれば、本発明は、ＨＡＴ標識たんぱく質に共有結合した磁気ポリマー粒子のアッセイでの使用を提供する。あるいは、本発明は、本明細書中で先に定義した方法を含むアッセイを提供する。好適なアッセイおよびこれらを行う方法は、熟練の生化学者には公知である。
【００６５】
例えば、本発明の官能化粒子上の標識たんぱく質の捕捉には、様々な用途がある。単離されたたんぱく質は反応動態が迅速で、かつ扱いやすいことから、この技術は、大きなたんぱく質複合体の「プルダウン」に非常に適している。したがって、官能化ビーズを、マススペクトロメトリ分析のためのサンプル調製に用いることができる。共有結合固定化ビーズを用いて単離した複合体は、カラムまたは凹凸のある表面を有するその他の磁気粒子を含む他の固体支持体を用いて単離された複合体よりも損傷が少なく、したがって、マススペクトロメトリのサンプル単離での使用に理想的と考えられている。
【００６６】
前記固定化技術を、アッセイの手順において使用される固相に応用することもできる。本発明のビーズは、凝集しにくく、溶液中での分散性が高く、非特異性結合の程度が低い。これらの特性により、高品位なスクリーニング結果や、広範囲の自動化プラットフォームで容易に自動化できるプロトコルが可能となる。前記ビーズはさらに、ファージディスプレイにおいて、おそらくは固相として使用できるか、あるいは、ライブラリから発現ファージディスプレイ選択たんぱく質を精製するために使用することができる。
【００６７】
したがって、一般に、標識たんぱく質の捕捉により、マイクロスケールのたんぱく質精製、突然変異たんぱく質ライブラリの除去、たんぱく質／ペプチドの変性溶離、たんぱく質／ペプチドの穏やかな溶離、たんぱく質−たんぱく質間の相互作用研究、ならびにスクリーニング技術が、例えば、薬物の発見、分子表示、アプタマー・スクリーニング、ファージディスプレイ、設計酵素スクリーニング、および診断といった目的のために、可能となりうる。
【００６８】
以下に挙げる非限定的な実施例を参照し、本発明についてさらに説明する。
【００６９】
反応物の製造
以下のＣｍ−Ａｓｐトリエステルを、次のように製造した。
【００７０】
【化５】
【実施例１】
【００７１】
臭素化
アリル基を０．５ｍｍｏｌ／ｇ有する磁気スチレン粒子のメタノール懸濁液１７．３ｇを、４５ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．９）で４回洗浄した。粒子含有量を９重量％へ調節した後、１０ｍｌのＤＭＦ中に溶解された０．９６ｇのピリジニウムトリブロマイドを、３５０ｒｐｍで攪拌しながら添加した。室温で５分後、前記粒子を４５ｍｌの脱イオン水で５回洗浄した。
【実施例２】
【００７２】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
実施例１に記載の方法で製造した粒子の懸濁液１８．０ｇを、２０ｍｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した。その懸濁液に、Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）を０．１７ｇ添加した。５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを、粒子含有量が１０重量％となるまで添加した。反応混合物を、６００ｒｐｍ、４０℃で１５時間振盪した。次いで、前記粒子を、２０ｍｌの脱イオン水で４回洗浄した。
【実施例３】
【００７３】
加水分解
実施例２に記載の方法で製造した粒子の懸濁液２０．０ｇを、２０ｍｌの１M水酸化リチウムで２回洗浄した。粒子含有量を１０重量％に調節した後、混合物を、２５０ｒｐｍ、室温で４時間振盪した。次いで、前記粒子を、ｐＨが６〜７となるまで脱イオン水で洗浄した。
【実施例４】
【００７４】
コバルト負荷
実施例３に記載の方法で製造した粒子２５０ｍｇを、５ｍｌの逆浸透水で２回洗浄した。５ｍｌの２．５ｍＭ ＣｏＣｌ2を前記粒子に添加し、５時間インキュベートした。管を磁石中に配置し、上澄み液を除去した。前記粒子を、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。その後、前記粒子を２０％エタノールで１回洗浄した。前記粒子を２０％エタノール中で保管した。
【実施例５】
【００７５】
細胞溶解物の製造
１０ｍｌの培養液から採取したＨＡＴ−ＣＡＴ（ＨＡＴ標識クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含有する細菌ペレットを、９００μｌの結合／洗浄緩衝液で、全体が１０００μｌとなるように再懸濁した。細胞を、次のようにして溶解させた。１０００μｌの細胞懸濁液、５００μｌのポップカルチャー（Popculture（商標））試薬（ノバゲン（Novagen）社）、および１００μｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００μｇ／ｍｌ）を、ピペットを用いて混合し、室温または氷上で１０分間インキュベートした。
【００７６】
ビーズの平衡化
ダイナビーズ（登録商標）タロン（Talon（商標））（すなわち、実施例４で得られたビーズ）４０ｍｇを、３ｍｌの結合／洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２回洗浄することにより平衡化した。
【００７７】
ポリヒスチジン標識（すなわち、ＨＡＴ標識）たんぱく質のダイナビーズ（登録商標）タロン（商標）への結合
前記細胞溶解物を平衡化した前記ビーズに添加し、結合／洗浄緩衝液により、体積を７．５ｍｌまで増加させた。前記ビーズを室温で１０分間転がした。
【００７８】
前記結合工程の終了後、ピペットを用いて上澄み液を除去し、前記ビーズを３ｍｌの結合／洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【００７９】
前記ビーズ２０ｍｇを、ｐＨ６の１５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。ＲＯ水（逆浸透水）に溶解した５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＥＤＣを添加した。管を、２時間回転させた。上澄み液を除去し、前記ビーズを１ｍｌの溶離緩衝液（１５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＰ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に再懸濁させた。
【００８０】
前記ビーズ２０ｍｇを、１ｍｌの溶離緩衝液で洗浄した。前記ビーズを、１ｍｌのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に再懸濁させた。
【００８１】
ビーズ上のＨＡＴ−ＣＡＴの検出
共有結合によりカップリングされたＨＡＴ−ＣＡＴを、「Ｅｕ」で標識した抗ＣＡＴを用いた時間分解蛍光を用いて検出した。
結果
ＥＤＣで処理したビーズ：ビーズ１ｍｇ当たり抗ＣＡＴ２．６μｇ
溶離緩衝液で処理したビーズ：ビーズ１ｍｇ当たり抗ＣＡＴ０．１μｇ
【実施例６】
【００８２】
カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの官能化
マイワンカルボン酸ビーズの粒子５．０ｇの懸濁液５０ｇを、０．１Ｍ酢酸（３×５０ｍｌ）で洗浄することにより酸性化した。次いで、酸性化した粒子（０．５ｍｍｏｌ／ｇ ＤＳのカルボン酸含有量を有している）を、アセトン（４×５０ｍｌ）で洗浄し、磁石上で集めた。アセトンを懸濁液全体が３５．６ｇに達するまでさらに添加した。その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．９０ｇ、２５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルカルボジイミド（３．１６ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を、室温で５時間攪拌した。次いで、前記粒子をアセトン（５×５０ｍｌ）で洗浄した。
【実施例７】
【００８３】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
実施例６のビーズのアセトン懸濁液４４ｇを、５０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。粒子含有量を１２重量％に調節した後、トリエチルアミンを５．６ｇ添加した。その後、イソプロパノールに溶解した０．１０ｇのＣｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）を添加した。この結果、粒子含有量は１０重量％となる。次いで、反応混合物を２５０ｒｐｍ、室温で２０時間振盪した。前記粒子を５０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例８】
【００８４】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤およびエタノールアミンによる官能化
実施例７に記載の方法で製造した粒子のイソプロパノール懸濁液１０ｇに、エタノールアミンを０．３２ｇ添加した。次いで、反応混合物を、２５０ｒｐｍ、室温で１８時間振盪した。その後、前記粒子を、１０ｍｌのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例９】
【００８５】
Ｃｍ−Ａｓｐキレート剤による官能化
乾燥ダイナビーズ２７０エポキシ１．２ｇを、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム８．８ｇと混合した。この懸濁液に、Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル（上述のように製造したもの）０．１７ｇを添加し、反応混合物を、６００ｒｐｍ、６０℃で１６時間振盪した。前記粒子を、２０ｍｌの脱イオン水で４回洗浄することにより後処理した。
【実施例１０】
【００８６】
Ｃｍ−Ａｓｐトリエステル合成の別の例
【００８７】
【化６】
【００８８】
２−アミノ−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００８９】
【化７】
【００９０】
ＤＬ−アスパラギン酸（９１．５ｇ、０．６９ｍｏｌ）の無水エタノール（８００ｍｌ）中の懸濁液に、０℃で塩化チオニル（１５０ｍｌ、２．０６ｍｏｌ）を滴下により添加した。冷却浴を除去して、前記混合物を３時間還流した。周囲温度に冷却した後、溶媒を真空下に蒸発させ、残渣にＫ2ＣＯ3の飽和水溶液をｐＨ８となるまで添加した。ろ過、真空下への蒸発に先立ち、水相を酢酸エチルで抽出し（×３）、合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ4）。これにより、１２４．８ｇ（９６％）の化合物１を黄色油状物として生じた。粗生成物を次の工程で直接用いた。
【００９１】
【数２】
【００９２】
２−（４−シアノ−ブチルアミノ）−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００９３】
【化８】
【００９４】
化合物１（９３．０ｇ、０．４９ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（３４．０ｇ、０．２５ｍｏｌ）およびＫＩ（１２．３ｇ、０．０７ｍｏｌ）のＴＨＦ（６００ｍｌ）中懸濁液に、５−ブロモバレロニトリル（２８．４ｍｌ、０．２５ｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を還流加熱して５日間攪拌した。周囲温度に冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（７：３）で溶離するシリカゲルでの精製により、６４．１ｇ（９７％）の化合物２を黄色油状物として生じた。
【００９５】
【数３】
【００９６】
２−［（４−シアノ−ブチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【００９７】
【化９】
【００９８】
化合物２（８６．６ｇ、０．３２ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４４．３ｇ、０．３２ｍｏｌ）、およびＫＩ（１６．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）のＴＨＦ（６５０ｍｌ）中の混合物に、ブロモ酢酸エチル（４２．５ｍｌ、０．３８ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を加熱還流し、５日間攪拌した。周囲温度まで冷却した後、混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させた。ヘキサン／酢酸エチル（８：２）で溶離するシリカゲルでの精製により、１０３．７ｇ（９１％）の化合物３を生じた。
【００９９】
【数４】
【０１００】
２−［（５−アミノ−ペンチル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−コハク酸ジエチルエステルの合成
【０１０１】
【化１０】
【０１０２】
化合物３（１５ｇ、４２ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（６０ｍｌ）および濃ＨＣｌ（１０ｍｌ）の溶液に、ＰｔＯ2（６００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の９５％エタノール（２０ｍｌ）中の懸濁液を添加した。反応混合物に対し、５０ｐｓｉで一晩水素添加した。前記混合物をろ過し、ろ液を真空下に蒸発させ、一晩空気を吸い出して、定量的な収率の標題化合物をＨＣｌ塩として生じた。
【０１０３】
【数５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識たんぱく質をポリマー粒子に共有結合させる方法であり、
標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオンが配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、
前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、
任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法。
【請求項２】
前記標識が、ＨＡＴ−標識である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）またはそれらの塩である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記キレート化リガンドが、３つのカルボキシル基を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記キレート化リガンドが、四座である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロトリ酢酸、トリス（カルボキシメチルエチレンジアミンまたはＣｍ−Ａｓｐである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記キレートリガンドが、Ｃｍ−Ａｓｐである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー粒子が、磁性を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマー粒子が、多孔性である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー粒子の直径が、０．２〜１．５ミクロンの範囲である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー粒子が、ダイナビーズ（Dynabead）である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属イオンが、遷移金属イオンである請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属イオンが、２＋酸化状態にある請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属イオンが、Ｃｏ2+である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属イオンが除去される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞溶解物から標識たんぱく質を単離するための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な、標識を介してポリマー粒子に共有結合した標識たんぱく質。
【請求項１８】
以下の式で表される残基を含むリンカーを介して標識たんぱく質に共有結合したポリマー粒子。
【化１】
前記標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を含む。
【請求項１９】
たんぱく質上の標識を介して当該たんぱく質に共有結合する磁気ポリマー粒子であり、前記標識が、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を有し、前記粒子は、前記少なくとも２つのリジン残基を介し、アミド結合によって前記標識に結合する連結基を有している磁気ポリマー粒子。
【請求項２０】
単分散である請求項１９に記載の複数の磁気粒子。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を含むアッセイ。
【請求項２２】
ＨＡＴ標識たんぱく質に共有結合した磁気ポリマー粒子のアッセイでの使用。
【請求項１】
標識たんぱく質をポリマー粒子に共有結合させる方法であり、
標識たんぱく質（標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基とを有する）を、キレート化剤（三座、四座、または五座のキレート化剤であり、少なくとも２つのカルボキシル基を有し、金属イオンが配位されている）−ポリマー粒子結合体と接触させ、たんぱく質−ポリマー粒子−キレート化剤金属イオン錯体を形成することと、
前記錯体をカルボジイミドに接触させることと、
任意に行われる前記金属イオンの除去とを含む方法。
【請求項２】
前記標識が、ＨＡＴ−標識である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）またはそれらの塩である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記キレート化リガンドが、３つのカルボキシル基を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記キレート化リガンドが、四座である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記キレート化リガンドが、イミノ二酢酸、ニトリロトリ酢酸、トリス（カルボキシメチルエチレンジアミンまたはＣｍ−Ａｓｐである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記キレートリガンドが、Ｃｍ−Ａｓｐである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー粒子が、磁性を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマー粒子が、多孔性である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー粒子の直径が、０．２〜１．５ミクロンの範囲である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー粒子が、ダイナビーズ（Dynabead）である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属イオンが、遷移金属イオンである請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属イオンが、２＋酸化状態にある請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属イオンが、Ｃｏ2+である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属イオンが除去される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞溶解物から標識たんぱく質を単離するための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な、標識を介してポリマー粒子に共有結合した標識たんぱく質。
【請求項１８】
以下の式で表される残基を含むリンカーを介して標識たんぱく質に共有結合したポリマー粒子。
【化１】
前記標識は、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を含む。
【請求項１９】
たんぱく質上の標識を介して当該たんぱく質に共有結合する磁気ポリマー粒子であり、前記標識が、少なくとも２つのヒスチジン残基と、少なくとも２つのリジン残基を有し、前記粒子は、前記少なくとも２つのリジン残基を介し、アミド結合によって前記標識に結合する連結基を有している磁気ポリマー粒子。
【請求項２０】
単分散である請求項１９に記載の複数の磁気粒子。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を含むアッセイ。
【請求項２２】
ＨＡＴ標識たんぱく質に共有結合した磁気ポリマー粒子のアッセイでの使用。
【公表番号】特表２００７−５２９４８７（Ｐ２００７−５２９４８７Ａ）
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０３４０５（Ｐ２００７−５０３４０５）
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００９９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９９３３
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６００１５１６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００９９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９９３３
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６００１５１６）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]