ポリマー結合のための一本鎖抗原結合ポリペプチド
本発明は部位特異的修飾を有する１価および多価一本鎖抗原結合ポリペプチドに関する。提供されるポリペプチドは、ポリアルキレンオキシドと修飾部位で共有結合または複合体化することができる。結果として生じる複合体は抗原結合特性を保持し、および複合体化されていない一本鎖抗原結合ポリペプチドと相対的に、延長された循環時間および低下した抗原性を示す。部位特異的修飾を有する一本鎖抗原結合ポリペプチドを作製および使用するための方法および組成物もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドへのポリマーの部位特異的共有結合を促進する部位特異的修飾を有する１価および多価一本鎖抗原結合ポリペプチドに関する。本発明は、そのような修飾一本鎖抗原結合ポリペプチド、それをコードするベクターおよび宿主細胞、ならびにそのポリペプチドを作製および使用する方法を提供する。本発明はまた、新規でかつ改良されたプロドラッグを提供するための、修飾一本鎖抗原結合ポリペプチドとポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）といったポリマーとの複合体、ならびにそのような複合体を作製および使用する方法を提供する。
【０００２】
関連分野の説明
天然に存在する抗体は、１以上の特定物質すなわち抗原が動物の免疫細胞によって外来物と認識されたときに、それら抗原の存在に応答して、哺乳類を含む脊椎動物の免疫系によって産生される免疫グロブリンである。ヒトでは、特異的抗原を選択的に認識しおよび差別的に結合する能力を有する５つのクラスの抗体が存在する。各抗体クラスは同一の基本構造または複数のその構造を有する。基本単位は、重鎖またはＨ鎖（ＩｇＧで分子量各約５０，０００ダルトン）と呼ばれる２個の同一のポリペプチドおよび、軽鎖またはＬ鎖（分子量各約２５，０００ダルトン）と呼ばれる２個の同一のポリペプチドから成る。５つの抗体クラスのそれぞれは類似の組の軽鎖のおよび異なる組の重鎖を有する。軽鎖は１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインから構成され、一方、重鎖は１つの可変ドメインおよび３つ以上の定常ドメインから構成される。可変ドメインは免疫グロブリンの特異性を決定し、定常領域は他の機能を有する。
【０００３】
概して、適当なポリペプチド軽鎖および重鎖の対が、天然抗体および他の種類の抗体において結合して、抗原結合部位を形成する。それぞれの個々の軽鎖および重鎖は約１１０アミノ酸の領域に折りたたまれ、保存された３次元立体構造を取る。軽鎖は１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含み、一方、重鎖は１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。対の領域が結合して、別個の構造を形成する。特に、軽鎖および重鎖可変領域は結合して、抗原結合部位を含む「Ｆｖ」部分を形成する。定常領域は抗原結合に必要でなく、場合によっては抗体分子からタンパク質分解によって分離することができ、軽鎖の半分および重鎖の四分の一から成る生物学的に活性な（すなわち、結合する）可変領域を与える。
【０００４】
さらに、Ｘ線結晶構造解析によって構造が決定されている特定のクラスのすべての抗体およびそのＦａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１で構成される断片）は、超可変部分の配列における大きな差にもかかわらず、異なる動物種に由来する場合さえ、同様の可変領域構造を示す。免疫グロブリン可変領域は、抗原結合ループにおける突然変異に対して寛容であるように見える。したがって、超可変領域内以外では、重鎖および軽鎖の両方によって定められる抗体のいわゆる「可変」領域の大部分は、実際、３次元構造において非常に定常的である。例えば、参照により本開示に含まれる非特許文献１を参照。
【０００５】
天然抗体は通常不均一であり、多数の異なるエピトープ、または外来抗原の一部と結合する。対照的に、モノクローナル抗体（「Ｍａｂ」）は結合親和性が均一である抗体である。Ｍａｂは診断薬および治療薬として両方で有用であることが示されている。ＭＡｂは例えば、マウスリンパ球様細胞の適当なマウス骨髄腫細胞株との融合によって、およびより進んだ組換え法によって作製されたハイブリドーマから、確立された方法によって定型的に製造されている。
【０００６】
より小さな抗体様タンパク質またはポリペプチドは、最小限の追加の構造を有する抗原結合部位から成る。これらは、一本鎖抗原結合タンパク質またはポリペプチド（「ＳＣＡ」）、または抗体の一本鎖可変断片（「ｓＦｖ」）として本分野で公知である。これらは、リンカーポリペプチドを組み込んで、個々の可変領域、ＶＬおよびＶＨを繋げて、単一のポリペプチド鎖とすることができる。
【０００７】
一本鎖抗原結合タンパク質の理論の説明および製造は、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４に、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，特許文献５（「生合成抗体結合部位」（ＢＡＢＳ））に見出され、それらの開示はすべて参照により本開示に含まれる。上記の特許に記載された方法のもとに製造された一本鎖抗原結合タンパク質は、対応するＦａｂ断片と実質的に同様な結合特異性および親和性を有する。
【０００８】
概して、適当な軽鎖および重鎖の対は、結合して抗原結合部位を形成することができる。それぞれの個別の軽鎖および重鎖は約１１０アミノ酸の領域に折りたたまれ、保存された３次元立体構造を取る。軽鎖は１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含み、一方、重鎖は１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。領域の対は結合して、別々の構造を形成する。特に、軽鎖および重鎖可変領域は結合して、抗原結合部位を含む「Ｆｖ」部分を形成する。定常領域は抗原結合に必要でなく、および一部の場合には抗体分子からタンパク質分解によって分離することができ、軽鎖の半分および重鎖の四分の一から成る生物学的に活性な（すなわち、結合する）可変領域を与える。
【０００９】
さらに、Ｘ線結晶構造解析によって構造が決定されている特定のクラスのすべての抗体およびそのＦａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１で構成される断片）は、同様の可変領域構造を示すが、しかしそれぞれの超可変部分の配列には大きな差を示す。これはまた、それぞれ異なる動物種に由来する抗体の比較においても観察される。免疫グロブリン可変領域は、抗原結合ループにおける突然変異に対して寛容であるように見える。したがって、超可変領域内以外では、重鎖および軽鎖の両方によって定められる抗体のいわゆる「可変」領域の大部分は、実際、３次元構造において非常に定常的である。例えば、参照により本開示に含まれる非特許文献１を参照。
【００１０】
ＳＣＡポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ特性は、ＭＡｂおよびより大きな従来の抗体断片とは異なる。サイズの小ささは、ＳＣＡが血液からより早く消失し、および組織へより速やかに浸透することを可能にする（非特許文献２； 非特許文献３； 非特許文献４）。加えて、ＳＣＡポリペプチドは、抗体分子中に通常存在する定常領域が無いため、肝臓および腎臓といった組織中に保持されない。したがって、ＳＣＡポリペプチドは、迅速な組織浸透およびクリアランスが有利である癌診断および治療に有用である。
【００１１】
合成抗原結合タンパク質はまた、参照により本開示に含まれる特許文献５（Ｈｕｓｔｏｎら）に記載されている。記載されたタンパク質は、生合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）として挙動する領域を構成するアミノ酸の１つ以上の配列によって特徴づけられる。その部位は、（１）非共有的に結合したかまたはジスルフィド結合した合成ＶＨおよびＶＬ領域、（２）ＶＨおよびＶＬがポリペプチドリンカーに結合しているＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ一本鎖、または（３）個別のＶＨまたはＶＬドメインを含む。結合ドメインはフレームワーク領域（ＦＲ）と結合した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、それらは別々の免疫グロブリンに由来し得る。Ｈｕｓｔｏｎらのタンパク質は最初の重鎖、すなわち、ＶＨ−ペプチドリンカー−ＶＬドメインを有することによって特徴づけられるものを含むことに注意する。
【００１２】
多価抗原結合タンパク質は公知である。本開示に記載される通り、多価抗原結合タンパク質は２つ以上の一本鎖タンパク質分子を含む。これらは共有または非共有結合によって随伴または結合され得る。多価抗原結合タンパク質の、抗原結合活性の上昇、２特異的および多特異的結合、および他の新規の用途が実証されている。例えば、すべて参照により本開示に含まれる、非特許文献５； 非特許文献６；および特許文献６、および共有の特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、および特許文献１２を参照。
【００１３】
上述の一本鎖ポリペプチド、およびその融合タンパク質といったペプチドは、哺乳類における顕著な抗原性と関連づけられていないが、循環寿命を延長しおよび抗原性反応の可能性をさらに低減さえすることが望ましい。
【００１４】
循環寿命を延長しおよびタンパク質およびポリペプチドの抗原性を低下させる１つの方法は、それらをポリアルキレンオキシドといったポリマーに結合(conjugate)させることである。しかし、そのポリペプチドの相対的に小さなサイズおよびその繊細な構造／活性関係は、ポリエチレングリコール修飾を困難におよび予測不能にしている。
【００１５】
ポリアルキレンオキシドのタンパク質との共有結合を行うためには、ポリマーの末端水酸基を最初に反応性官能基へ変換しなければならない。この過程はしばしば「活性化」と呼ばれ、およびその産物は「活性化ＰＥＧ」または活性化ポリアルキレンオキシドと呼ばれる。例えば、一方の末端が官能基でキャッピングされた、タンパク質分子上のアミンに対して反応性である、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）が大部分の場合に用いられる。
【００１６】
ＰＥＧのスクシンイミジルスクシナート誘導体（「ＳＳ−ＰＥＧ」）といったいくつかの活性化ポリマーが紹介されている（非特許文献７）。ＳＳ−ＰＥＧはタンパク質（３０分間）と穏和な条件下で迅速に反応し、活性でありながらよく修飾された複合体を与える。Ｚａｌｉｐｓｋｙは、特許文献１３で、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカルボナートおよびその調製を開示する。この形のポリマーは、タンパク質，および低分子量ペプチドおよび遊離アミノ基を含む他の材料の、アミノ基と容易に反応すると言われている。ウレタン結合（非特許文献８）、カルバマート結合（非特許文献９）、などといった、タンパク質のアミノ基とＰＥＧとの間の他の結合もまた本分野で公知である。
【００１７】
しかし、これらおよび他の方法にもかかわらず、結果として生じる複合体が十分な保持された活性を欠くことがしばしば見出されている。例えば、Ｂｅｎｈａｒら（非特許文献１０）は、組換え一本鎖免疫毒素のＰＥＧ化が結果としてその免疫毒素の特異的標的免疫反応性の消失を生じたことを観察した。その免疫毒素の活性消失は、免疫毒素の抗体結合領域内部の２個のリジン残基でのＰＥＧ結合の結果であった。この問題を克服するために、Ｂｅｎｈａｒらはこれらの２個のリジン残基をアルギニン残基で置き換え、および誘導体化によって、不活性化に対する耐性が３倍高い活性な免疫毒素を得ることができた。
【００１８】
上記で考察したこれらの問題を克服するための別の提案は、より長い、より高い分子量のポリマーを用いることである。これらの材料は、しかし、調製が困難でありおよび使用するのが高価である。さらに、それらは、より容易に入手可能なポリマーに対してわずかな改善しか提供しない。提案された別の代替案は、ポリマーの２本の鎖を、トリアジン環を介してタンパク質のアミノ基へ付加することである。例えば、非特許文献１１および非特許文献１２を参照。しかし、トリアジンは、結合後に許容し得るレベルへ低減するのが困難な有毒物質である。
【００１９】
ＳＣＡタンパク質の３次元構造の検討は、Ｃ末端およびリンカー領域は抗原結合部位から非常に遠く離れており、したがって、それらタンパク質の製造中にｉｎ ｖｉｖｏでグリコシル化される挿入基へのポリマー結合のための部位を位置決定する中で、結合したポリマーが抗原結合部位または周囲のＦｖ構造の立体構造を立体的に妨害または破壊しない、ポリマー結合(polymer conjugation)のための部位となり得ることを明らかにした（非特許文献１３）。
【００２０】
より効果的なポリマー結合のために、ＳＣＡ構造内部のアミノ酸残基を位置決定する試みは、本特許出願の下記の共有発明者によって記載されており、そのすべてが参照により本開示に含まれる：選択的に位置決定されたＣｙｓおよびオリゴＬｙｓ残基を記載する、共に２００１年２月２６日出願の、特許文献１４および特許文献１５。
【００２１】
共有の、共に２００１年９月２０日の特許文献１６および特許文献１７は、ポリマーが選択的に結合する、選択的に位置決定されたグリコシル化のための、ＳＣＡ中のタンデムおよびトリプレットＡＳＮ、および関連する部位を記載する。しかし、ポリマーのＳＣＡタンパク質への位置依存的結合における他の選択肢および改善、および、ポリペプチドの結合活性および特異性の保持を、ポリマー結合のすべての利益と共に可能にする、共役化学(conjugation chemistry)における他の選択肢および改善の本分野における必要性が残っている。
【特許文献１】米国特許第４，９４６，７７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２６０，２０３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４５５，０３０号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５１８，８８９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０９１，５１３号明細書
【特許文献６】国際公開第９３／１１１６１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，８６９，６２０号明細書
【特許文献８】米国特許第６，０２５，１６５号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０２７，７２５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１０３，８８９号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１２１，４２４号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，５１５，１１０号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，１２２，６１４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第０９／７９１，５７８号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第０９／７９１，５４０号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第０９／９５６，０８７号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第０９／９５６，０８６号明細書
【非特許文献１】Huber,R.,Science 233: 702-703 (1986)
【非特許文献２】Milenic,D.E.et al.,Cancer Research 51: 6363-6371(1991)
【非特許文献３】Colcher et al.,J.Natl.Cancer Inst.82: 1191 (1990)
【非特許文献４】Yokota et al.,Cancer Research 52: 3402 (1992)
【非特許文献５】Whitlow,M.,et al.,Protein Engng.7: 1017-1026 (1994)
【非特許文献６】Hoogenboom,H.R.,Nature Biotech.15:125-126 (1997)
【非特許文献７】Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.7: 175-186 (1984)
【非特許文献８】Veronese et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.11: 141-152(1985)
【非特許文献９】Beauchamp et al,Anal.Biochem.131: 25-33 (1983)
【非特許文献１０】Benhar et al.(Biocomueate Chem.5: 321-326 (1994))
【非特許文献１１】Enzyme 26: 49-53 (1981)
【非特許文献１２】Proc.Soc.Exper.Biol.Med.,188:364-369 (1988)
【非特許文献１３】Wang M.,et al.,1998 Protein Engng 11: 1277-1283
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
これらの長年のニーズに対応するために、本発明は、
抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第１ポリペプチド；
抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第２ポリペプチド；および
第１および第２ポリペプチドを繋ぐペプチドリンカーを含み、
ポリアルキレンオキシドポリマーに結合可能な少なくとも１つのＣｙｓ残基を有し、かつ少なくとも１つの抗原結合部位を有する、ポリアルキレンオキシドポリマーに部位特異的結合可能なＴＮＦ−α結合一本鎖抗原結合ポリペプチド（「ＳＣＡ」）を提供する。Ｃｙｓ残基は好ましくは下記の位置の１以上に位置する：
重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端；
重鎖または軽鎖可変領域のＮ末端；
ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置；
Ｎ末端およびＣ末端の両方；
リンカーの２位；
リンカーの５位；
リンカーの２位およびＣ末端の両方；および
それらの組合せ。
【００２３】
好ましくは、ＴＮＦ−α結合ＳＣＡはＴＮＦ−αに選択的に結合する。
【００２４】
より好ましいＣｙｓ位置は、例えば、リンカーの２位、Ｃ末端およびそれらの組合せを含む。Ｃ末端は好ましくは天然に存在するＣ末端であるが、しかしその当該分野で既知である任意の修飾を含み得る。
【００２５】
本発明のＳＣＡは必要に応じて、目的の抗体、例えば、好ましくは抗ＴＮＦ−α抗体の軽鎖および／または重鎖に由来する可変領域から成る。
【００２６】
本発明はまた、本発明の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたはタンパク質を含む複合体であって、実質的に非抗原性のポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドポリマーを含む複合体を提供する。ポリアルキレンオキシドは好ましくはポリエチレングリコールすなわち「ＰＥＧ」ポリマーである。
【００２７】
ポリアルキレンオキシドは任意の適当なサイズ範囲であるが、しかし好ましくはサイズが約５，０００から約４０，０００ダルトンの範囲にわたる。
【００２８】
好ましくは、ポリアルキレンオキシドポリマーは一本鎖抗原結合ポリペプチドにＣｙｓ残基で共有結合する。
【００２９】
好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィドおよび／またはヨードアセトアミドリンカーといったリンカーを介して、一本鎖抗原結合ポリペプチドにＣｙｓ残基で結合する。マレイミドリンカーが非常に好ましい。
【００３０】
本発明のポリマー結合した実施形態では、ポリアルキレンオキシドは必要に応じて、各一本鎖抗原結合ポリペプチドが同一であるかまたは異なる少なくとも２つの一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合している。
【００３１】
必要に応じて、複合体、例えばＰＡＯまたはＳＣＡのどちらか、または両方のような複合体は、さらに別の機能部分、例えば、検出可能な標識またはタグと結合または複合体化している。
【００３２】
本発明はまた、一本鎖抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む複製可能な発現ベクター、およびそれを発現するための適当な宿主細胞を提供する。
【００３３】
本発明のＳＣＡタンパク質は、任意の適当な本分野で公知の工程または方法によって製造されるが、好ましくは、本明細書に例示される通り、ＳＣＡをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、さらにその宿主細胞によって発現された一本鎖抗原結合ポリペプチドを回収することによって製造される。
【００３４】
本発明はさらに、部位特異的結合可能な２以上の一本鎖抗原結合ポリペプチドを含むタンパク質を、二量体、三量体、四量体などの形態の多価抗原結合タンパク質として提供する。
【００３５】
本発明の多価タンパク質は、個々のＳＣＡが共有結合または非共有結合リンカー、例えば、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、などによって連結される、本分野で公知の方法によって調製される。別の選択肢では、タンパク質は、非共有結合リンカーを用いて、構成的ＳＣＡポリペプチドを還元および再折りたたみすることによって組み立てられる。後者の選択肢では、構成的一本鎖抗原結合タンパク質またはポリペプチドのペプチドリンカーが、２から１８残基の大きさであることが特に好ましい。
【００３６】
本発明はさらに、単一の多価タンパク質としてコードされる構成的ＳＣＡポリペプチドの１つ以上に特定のＣｙｓ残基を有する多価タンパク質を提供する。そのような一本鎖多価タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部として考えられている。
【００３７】
本発明のＳＣＡおよびポリマー複合体を用いる方法もまた提供される。単に一例として、そのような方法の１つは下記の工程を含む：ＴＮＦ−αを含む疑いのある試料を、本発明に記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたは多価タンパク質を含む試薬と接触させ、および、本発明に記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたは多価タンパク質がＴＮＦ−αと結合したか否かを検出する。有利なことに、本発明に記載のポリペプチドまたは多価タンパク質は、ポリアルキレンオキシドポリマーと結合している。
【００３８】
上記の方法のすべてについて、複合体は、ＳＣＡまたはポリマーのどちらかにおいて、必要に応じて固相担体に固定される。
【００３９】
哺乳類、例えばヒトにおいて疾患または病気を治療または診断する方法であって、本発明のＴＮＦ−α結合一本鎖抗原結合ポリペプチドの有効量を投与することを含み、一本鎖抗原結合ポリペプチドがＴＮＦ−αと結合しおよびＴＮＦ−α関連中毒を阻害するのに有効な量で投与される方法も提供される。本発明の一本鎖抗原結合ポリペプチドおよび／またはそのポリマー複合体は、約１０μｇ／ｋｇから約４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で、およびより好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約８００μｇ／ｋｇの範囲の量で、およびさらに好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇで、本分野で公知である全身経路によって投与され、用量は臨床反応を生じるために必要に応じて反復される。体腔内への潅流、吸入または鼻腔内経路による投与もまた、局所投与と共に、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド，タンパク質およびポリマー複合体化合物から利益を受ける全身症状およびより局所的な症状を治療するために考えられている。そのような症状は、例えば、毒素性ショック症候群、および、抗ＴＮＦ−α治療に反応する、本分野で公知である任意の他の炎症過程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
したがって、本発明は、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマーへの部位特異的結合を促進するために選択された、操作された官能基を有する改良された抗ＴＮＦ−α一本鎖抗原結合ポリペプチドおよび／またはそのようなポリペプチドから成る多価タンパク質を提供する。本発明のポリペプチドとポリマーとの複合体、およびそれを作製および使用する方法もまた提供される。
【００４１】
本発明は概して、一本鎖抗原結合タンパク質（「ＳＣＡ」）または抗体の一本鎖可変断片（「ｓＦｖ」）が、適当なポリアルキレンオキシドポリマーとＳＣＡポリペプチド上の特定位置で結合した場合、向上した性質を有するという発見に基づく。本発明のＳＣＡは、そのような特異的位置での選択的なポリマー結合のための官能基を含むように設計される。ポリマー結合の利益は概して、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原性の実質的低減、および動物またはヒト患者への投与後の循環半減期の延長を含む。本発明のＳＣＡが望ましい性質の複合体をどのように提供するかに関するいかなる理論または仮説に縛られることを意図することなく、１または複数のポリペプチド鎖上の選択された位置に結合部位を設計することによって、結合ポリマーの存在による抗原結合機能および鎖三次構造との干渉が回避されるかまたは最小化されると信じられている。
【００４２】
本発明の範囲をよりよく理解するため、下記の用語が定義される。「一本鎖抗原結合分子」（「ＳＣＡ」）または「一本鎖Ｆｖ」（ｓＦｖ）の語は別に記載されない限り本明細書では相互に交換可能に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」の語もまた、別に記載されない限り互換的に用いられる。概して、ＳＣＡは、抗体ＶＨ（またはＶＬ）の可変領域に由来する第２ポリペプチドの結合部分と結合した、抗体ＶＬ（またはＶＨ）の可変領域に由来する第１ポリペプチドの結合部分を含み、その２つのポリペプチドは第１および第２ポリペプチドを繋いで単一のポリペプチド鎖とするペプチドリンカーによって、第１ポリペプチドがリンカーに対してＮ末端となりおよび第２ポリペプチドが第１ポリペプチドおよびリンカーに対してＣ末端となるように連結されていると構造的に定義される。
【００４３】
ＳＣＡはこのように、ポリペプチドリンカーによって結合された可変領域の一対を含む。その領域は、適切に対となった相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖および重鎖可変領域対を領域が含む場合のように、結合して機能的抗原結合部位を形成し得る。この場合、一本鎖タンパク質は概して「一本鎖抗原結合タンパク質」または「一本鎖抗原結合分子」または「一本鎖抗原結合ポリペプチド」と呼ばれる。上で定義される通り、ＳＣＡは必要に応じて「１価」または「多価」である。１価ＳＣＡは、単一の抗原結合部位、すなわち、抗原結合部位を形成するように結合するポリペプチドリンカーによって連結された１対の可変領域のみを含むように設計される。多価ＳＣＡは、２つ以上の抗原結合部位、すなわち、ポリペプチドリンカーによって結合された可変領域を２対以上含むように改変された抗原結合タンパク質であり、２つ以上の上記の一本鎖抗原結合ポリペプチドを含むＳＣＡを含む。構成的ＳＣＡ部分は本分野で公知である任意の方法によって結合している。
【００４４】
一実施形態では、本発明に記載の多価結合タンパク質は、抗原結合タンパク質として完全に機能を維持するように非共有結合した２つ以上のＳＣＡを含む。別の一実施形態では、多価結合タンパク質は、共有結合によって、例えば、本分野で公知であるペプチドまたは非ペプチドリンカー化学のいくつかのうちの１つによって結合している２つ以上のＳＣＡを含む。さらに、例えば複数のＳＣＡから成る多価結合タンパク質を、１価ＳＣＡに類似しているが同一かまたは異なる２つ以上の反復ＳＣＡドメインを有する単一のペプチド鎖として発現するかまたは合成によって構築することができる。
【００４５】
ＳＣＡは、ＶＬがＮ末端ドメインでありその後にリンカーおよびＶＨが続くように構築されている（ＶＬ−リンカー−ＶＨ構造）。別の一実施形態では、ＳＣＡは、ＶＨがＮ末端ドメインでありその後にリンカーおよびＶＬが続くように構築されている（ＶＨ−リンカー−ＶＬ構造）。その好ましい実施形態は、ＶＬをＮ末端ドメインに含む（Anand,N.N.,et al.,J.Biol.Chem.266: 21874-21879 (1991)を参照）。必要に応じて、複数のリンカーが用いられる。
【００４６】
一本鎖抗原結合タンパク質の理論および製造の説明は、すべて参照により本開示に含まれる、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号明細書、第５，２６０，２０３号明細書、第５，４５５，０３０号明細書および第５，５１８，８８９号明細書、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０９１，５１３号明細書（「生合成抗体結合部位」（ＢＡＢＳ））に見出される。上記の特許に従って製造されたＳＣＡは、対応するＦａｂ断片と実質的に同様の結合特異性および親和性を有する。
【００４７】
可変ドメイン（Ｆｖ）
本発明のＳＣＡは、任意の望ましい天然または人工抗体から選択されるかそれに由来するかまたはそれを原型とした可変ドメイン（「Ｆｖ」）を用いて構築される。別の好ましい一実施形態では、本発明における用途のためのＦｖは、置換ライブラリとして構成されるＦｖライブラリから得られ、目的の結合標的に対してスクリーニングされる。単に一例として、Ｆｖドメインを得るために多数のＭａｂが本分野で用いられており、および、Ｆｖドメインはこれらのうちの任意のものから得ることができ、および本発明のＳＣＡに用いることができると考えられている。単に一例として、および無制限に、下記のＭａｂがＦｖドメインを得るために用いられる：
26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, murinephOx, human phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel55-4, 18-2-3, 4-4-20, 7A4-1, B6.2, CC49, 3C2, 2c, MA-15C5/Kl2Go, Ox, etc. (See, Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5879-5883 (1988); Huston, J.S. et al., SIM News 38 4 (Supp.): 11 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 114 (1990); McCartney, J.E. et al., unpublished results (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med.32 (Supp.): 1005(1991); Huston, J. S. et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, edited by J. J. Langone, Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Huston, J. S. et al., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos, A. A. (Ed.), London, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242: 423-426 (1988); Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265: 18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990); Gibbs, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 4001-4004 (1991) ; Milenic, D. E. et al., Cancer Research 51: 6363-6371(1991) ; Pantoliano, M. W. et al., Biochemistrv 30: 10117-10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339: 394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1066-1070 (1990); Batra, J. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171: 1-6 (1990); Batra, J. K et al., J. Biol. Chem. 265: 15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 9491-9494 (1990); Batra, J. K. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2200-2205 (1991) ;Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 8616-8620 (1991); Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266: 17376-17381 (1991); Brinkmann, U. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 3075-3079 (1992); Glockshuber, R. et al., Biochemistry 29: 1362-1367 (1990); Skerra, A. et al., Bio/Technol. 9: 273-278 (1991); Pack, P. et al., Biochemistry 31 : 1579-1534 (1992); Clackson, T. et al., Nature 352: 624-628 (1991) ; Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) ; Iverson, B. L. et al., Science 249: 659-662 (1990); Roberts, V. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87 : 6654-6658 (1990); Condra, J. H. et al., J. Biol. Chem. 265: 2292-2295 (1990); Laroche, Y. et al., J. Biol. Chem. 266: 16343-16349 (1991); Holvoet, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 19717-19724 (1991); Anand, N. N. et al., J. Biol. Chem. 266: 21874-21879 (1991) ; Fuchs, P. et al., Bio/Technol. 9: 1369-1372 (1991); Breitling, F. et al., Gene 104: 104-153 (1991); Seehaus, T. et al., Gene 114:235-237 (1992); Taldcinen, K. et al., Protein Engng. 4 : 837-841 (1991); Dreher, M. L. et al., J. Immunol. Methods 139:197-205 (1991); Mottez, E. et al., Eur. J. Immunol. 21: 467-471 (1991); Traunecker, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 8646-8650 (1991) ; Traunecker, A. et al., EMBO J.10: 3655-3659 (1991); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4759-4763 (1993) 。上記の引用の全ては参照により本開示に含まれる。
【００４８】
特に、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によってＤ２Ｅ７として記載される抗ＴＮＦ−αＭＡｂ、およびＣａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （ＵＳＡ） ８９： ４２８５−４２８９に記載される抗ｅｒｂＢ−２ ＭＡｂ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、本発明に記載のＳＣＡおよびＳＣＡ−ポリアルキレンオキシド複合体の作製のためのモデル例の役割を果たした。Ｄ２Ｅ７はＨｕｍｉｒａ（登録商標）（Abbott Immunology,Abbott Park,Illinois）として市販されている。加えて、ＣＣ４９ ＭａｂはLaboratory of Tumor Immunology and Biology,National Cancer Institute のDr.Jeffrey Schlomのグループによって開発された。それは汎癌腫瘍抗原ＴＡＧ−７２に特異的に結合する。Muraro,R.et al.,Cancer Research 48: 4588-4596 (1988)を参照。Filpula et al.1996 (Antibody Engineering: A Practical Approach,Oxford University Press,pp 253-268)に記載された抗ＴＡＧ−７２ ＣＣ−４９ＳＣＡは、本発明に記載のＣｙｓ−修飾ＳＣＡとしておよび典型的な複合体としても調製された。上記の引用の全ては参照により本開示に含まれる。
【００４９】
ペプチドリンカー
本発明に記載のＳＣＡは、ＶＬのＣ末端、またはその隣接部位、およびＶＨのＮ末端、またはその隣接部位にわたるように、または、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とを連結するように設計されたペプチドリンカーを含む。
【００５０】
リンカーの長さは、連結されるべきポリペプチドの性質、および連結の結果として生じる連結された融合ポリペプチドの目的の活性に依存することを当業者は理解する。一般的に、リンカーは、結果として生じる連結された融合ポリペプチドが適切に立体構造へ折りたたまれ、目的の生物活性すなわち抗原結合を与えることを可能にする長さを有するべきである。個別の具体例では、好ましい長さは連結されるべきポリペプチドの性質、および連結の結果として生じる連結された融合ポリペプチドの目的の活性に依存する。
【００５１】
下記で考察するＳＣＡポリペプチドの場合のように、立体構造情報が入手可能である場合は、適当なリンカーの長さは、置換ポリペプチドの三次元立体構造および結果として生じる連結した融合ポリペプチドの目的の立体構造の検討によって推定することができる。そのような情報が入手できない場合は、適当なリンカーの長さは、さまざまな長さのリンカーを有する連結された融合ポリペプチドを目的の生物活性について試験することによって経験的に決定することができる。そのようなリンカーは、参照により本開示に含まれる国際公開第９４／１２５２０号パンフレットに詳細に記載される。
【００５２】
ＳＣＡポリペプチドを構築するのに用いられるペプチドリンカーは一般的に、大きさが長さ２から約５０アミノ酸残基、および好ましくは、約２から約１０残基の範囲にわたる。別のある実施形態では、リンカーは大きさが約１０から約３０残基の範囲にわたる。より好ましいある実施形態では、特に２つ以上の非共有的に結合したＳＣＡポリペプチドを含む多価結合体に関する実施形態については、リンカーは大きさが約２から約２０アミノ酸残基の範囲にわたることが好ましい。より好ましくは、そのようなリンカーはセリンに富むかまたはグリシンに富む。
【００５３】
リンカーは柔軟性となるように設計され、および、交互のＧｌｙおよびＳｅｒ残基の基礎配列を用いることが推奨される。リンカーおよびそれと結合した一本鎖Ｆｖタンパク質の溶解度を高めるために、３個の荷電残基すなわち２個の正に荷電したリジン残基（Ｋ）および１個の負に荷電したグルタミン酸残基（Ｅ）を含めることができる。好ましくは、リジン残基のうち１個はＶＨのＮ末端付近に配置され、リンカーとＶＨとのペプチド結合を形成する際に失われる正電荷の代替となる。そのようなリンカーは、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第５，８５６，４５６号明細書によって詳細に記載される。参照により本開示に含まれるWhitlow,M.,et al.,Protein Engng.7: 1017-1026 (1994)も参照。
【００５４】
本発明に記載の多価抗原結合タンパク質については、２つ以上のＳＣＡポリペプチドの共有または非共有結合が、それらのタンパク質の形成のために好ましい。しかし、多価ＳＣＡを、長さ２５残基のリンカーを用いてＳＣＡから作製することができるが、それは不安定となる傾向がある。Holliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 90: 6444-6448 (1993)は、長さ０から１５残基のリンカーが２価Ｆｖの形成を促進することを近年実証している。参照により本開示に含まれる、Whitlow,M.,et al.,Protein Ensns 7 :1017-1026 (1994); Hoogenboom,H.R.,Nature Biotech.15: 125-126 (1997);および国際公開第９３／１１１６１号パンフレットを参照。
【００５５】
部位特異的ＰＥＧ化配列の同定および合成
本発明は、ポリペプチド（ＶＬ、ＶＨまたはその隣接部位）のＣ末端、ポリペプチド（ＶＬ、ＶＨまたはその隣接部位）のＮ末端、第１および第２ポリペプチド領域の間のリンカー領域、またはそれら領域の組合せの領域に隣接する、チオール官能基部分、例えば、ＶＬおよびＶＨ領域中の特定部位に位置するチオール含有アミノ酸残基を提供する。本発明では、ポリマー結合のための特異的部位が、ポリペプチドリンカーに、Ｃ末端に、またはＳＣＡのＣ末端に隣接して、および好ましくは、リンカーの第２の残基に位置することが好ましい。
【００５６】
チオールを含む官能基は、天然アミノ酸残基、および／または天然に存在しないアミノ酸残基を含む、本分野で公知の任意のものであることができ、およびそれらのチオール官能基化誘導体を有する。好ましい一実施形態では、チオール官能基部分はシステイン残基である。ＳＣＡ タンパク質は通常は２個の埋め込まれたジスルフィド結合を有するが （Padlan EA,1994,Antibody-Antigen Complexes,R.G.Landes Company,Austin）、しかし遊離システインを有しないため、このことは好ましい。したがって、改変されたＣｙｓチオールだけが、チオールとの反応に選択的である活性化ポリマーとの結合に利用可能である。
【００５７】
Ｃｙｓ部位をさまざまな位置へ導入するために用いられる特定のヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列に依存する。最も好ましい部位は、Ｃｙｓ挿入を生じるために必要な変化の数が最小である一方で上述の立体構造の必要条件もまた満たす部位である。もちろん、遺伝コードの重複に基づき、特定のアミノ酸が複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００５８】
天然のタンパク質配列を、Ｃｙｓ残基を組み込んだものに変えるために、部位特異的突然変異誘発のための本分野で公知である任意の適当な方法が用いられる。突然変異タンパク質遺伝子は、細菌細胞、酵母または他の真菌細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞といった他の発現系へ入れられる。突然変異タンパク質はその後、タンパク質の回収のための標準的な方法によって精製される。
【００５９】
好ましくは、ＳＣＡムテインを発現している核酸分子は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって作製される。部位特異的Ｃｙｓムテイン (Cys mutain)を作製するためのそのような方法およびクローンＤＮＡの突然変異誘発のための関連する方法は、本分野でよく知られている。共に参照により本開示に含まれる、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989) ; Ausubel et al.(eds.)、 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley and Sons (1987)を参照。
【００６０】
宿主およびベクター
目的のＳＣＡのヌクレオチド配列を突然変異させて希望の位置にＣｙｓ残基を提供した後、突然変異させた核酸は好ましくは適当なクローニングベクターへ挿入され、そこでＳＣＡをコードするヌクレオチドは転写発現を調節する調節配列へ調節可能に結合される。これらは、希望の宿主細胞系からのＳＣＡ産生を最適化するために、好ましくは本分野で公知である方法によって選択される。
【００６１】
ＳＣＡは原核または真核宿主細胞によって発現されおよび産生されることが知られているが、多くの目的のためには真核宿主細胞が好ましい。好ましい原核宿主は、バチルス、ストレプトミセス、ストレプトコッカス、および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉといった細菌を含むがそれらに限定されない。好ましい真核宿主細胞は、酵母または他の真菌細胞、昆虫細胞および／または哺乳類細胞を含む。好ましくは、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏ、または組織培養中のどちらかに存在する、ヒトまたは霊長類細胞を含む。より好ましくは、本発明のＳＣＡはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓといった形質転換酵母によって産生される。発現ベクターは、宿主細胞において一過性発現を提供するように、または宿主細胞ゲノムと一体化して形質転換細胞株を生じるように任意に選択される。
【００６２】
標準的なタンパク質精製法を用いてこれらの突然変異タンパク質が精製される。天然タンパク質精製方法へのわずかな改変だけが必要であり得る。例えば、ベクター、宿主の選択、タンパク質、特にＳＣＡポリペプチドの１価、多価および融合形の産生、単離および精製の方法は、例えば、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第４，９４６，７７８号明細書および米国特許第６，３２３，３２２号明細書によって十分に記載されている。
【００６３】
好ましい一実施形態では、目的のＳＣＡおよび選択マーカーをコードする核酸分子は宿主細胞染色体中へ、単一のベクターまたは同時導入される複数のベクターとして導入される。マーカーは、宿主における栄養要求性（例えば一般的な酵母栄養要求性マーカーであるｈｉｓ４、ｌｅｕ２、またはｕｒａ３）、例えば抗生物質といった殺生物物質耐性、または銅といった重金属に対する耐性、などを補足し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＳＣＡ ＤＮＡ配列と直接結合しているか、または同時トランスフェクションによって同一の細胞へ導入される。導入された核酸を安定して組み込んでいる細胞は、所定の系における生存またはマーカーのその他の効果によって選択される。
【００６４】
別の一実施形態では、目的のＳＣＡは、レシピエント宿主細胞における自律的複製の能力を有する適当なプラスミドベクターによってコードされる。本分野で公知である幅広いベクターのうち任意のものをこの目的に用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択における重要な要素は下記を含む：ベクターを含むレシピエント細胞が、ベクターを含まないレシピエント細胞から識別されおよび選択されることの容易さ；特定の宿主中で望まれるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復」することができることが望ましいかどうか。
【００６５】
一連の酵母ベクター系のうち任意のものを利用することができる。そのような発現ベクターの例は、酵母２ミクロンサークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰおよびＹＲＰなど、またはそれらの誘導体を含む。そのようなプラスミドは本分野でよく知られている（Botstein et al.,Miami Wntr.Sump.19:265-274 (1982); Broach,J.R.,In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,p.445-470 (1981); Broach,J.R.,Cell 28: 203-204 (1982)) 115。
【００６６】
哺乳類宿主については、本分野で公知であるいくつかのベクター系を利用可能である。ある種類のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルスといった動物ウイルスに由来する、自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ配列を利用する。別の種類のベクターは、目的の遺伝子配列の宿主染色体への組み込みを基にする。導入されたＤＮＡを染色体に安定して組み込んでいる細胞は、上記で考察した通り、マーカーによって選択される。ｍＲＮＡの最適な合成のためには追加の配列もまた必要である。これらの配列は、スプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含む。そのような配列を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターは、Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.3: 280 (1983)に記載されたもの、および本分野によく知られているものを含む。
【００６７】
ベクターの中でも、細菌における使用のために好ましいベクターは、Ｑｉａｇｅｎより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。好ましい真核ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。Ｐｉｃｈｉａにおける発現に好ましいベクターは、ｐＨＩＬ−Ｓ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）およびｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかとなる。
【００６８】
その構造を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために一旦調製されると、そのＤＮＡ構築物は適当な宿主へ導入され、または形質転換され得る。形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、または他の従来の方法といったさまざまな技術が使用可能である。細胞が組換えＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子で形質転換された後、細胞を培地中で増殖させ、および適当な活性についてスクリーニングする。その配列の発現は、結果として本発明のＰＥＧ結合のための突然変異ＳＣＡの産生を生じる。
【００６９】
ＳＣＡタンパク質の産生および精製
本発明の１価または多価抗原結合タンパク質は、本分野で公知である適当な任意の方法によって産生することができる。概して、その方法は、適当な発現ベクターを作製すること、そのベクターを適合する宿主細胞中で発現させること、宿主細胞を培養することおよび、目的のタンパク質を回収することを含む。
【００７０】
組換えタンパク質を培地中へ分泌することができない原核細胞または他の培養細胞における発現については、回収は採取した細胞からである。採取された細胞物質は、細胞溶解および洗浄、形成された封入体の適合する変性溶媒中での可溶化、機能する結合タンパク質への再折りたたみを与えるために有効である条件下での希釈による再折りたたみ、および２つのイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィー工程に供される。好ましい原核発現系は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）を含む。例えば、また参照により本開示に含まれる、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、第５，２６０，２０３号明細書、第５，４５５，０３０号明細書、第５，５１８，８８９号明細書、および第５，５３４，６２１号明細書、およびＢｉｒｄｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３ （１９８８）を参照。
【００７１】
例示されたＳＣＡタンパク質の発現に関する最初の研究は、Ｘｏｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手したＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用した（ａｒａＢプロモーターおよびｐｅｌＢシグナル）。ＳＣＡタンパク質の発現に成功した。しかし、Ｘｏｍａ Ｃｏｒｐ．系によって発現されたタンパク質は、周辺質(periplasm)中で細胞に結合したまま留まり、および追加の精製工程を必要とした。
【００７２】
より好ましい発現系は、真核宿主細胞および、分泌シグナル配列を有する発現ベクターを用いる。この好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からの不溶性の封入体として、発現されたＳＣＡを回収する必要性を回避する。
【００７３】
必要な場合には、グリコシル化。酵母における目的タンパク質の産生に用いることができる、強力なプロモーター配列およびプラスミドの大きいコピー数を利用する、いくつかの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母は、クローニングされた哺乳類遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、およびリーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。
【００７４】
このため、本明細書で例示するＳＣＡ タンパク質はすべて、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの分泌によって発現されおよび溶液から回収された。
【００７５】
Ｄ２Ｅ７ ＭＡｂ可変ドメインを有するＳＣＡタンパク質
特に好ましい一実施形態では、本発明に記載のＳＣＡがＤ２Ｅ７ Ｍａｂの可変ドメインを用いて開発された。Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された。それはヒトサイトカイン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）と特異的に結合し、およびそのＭａｂは、参照により本開示に含まれる米国特許第６，０９，０３８２号明細書、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によって詳細に記載される。この抗体の選択されたドメインは、それぞれのポリペプチド配列中へ特定の位置に組み込まれた１つ以上のＣｙｓ残基を有するいくつかの典型的なＳＣＡ分子を調製するためのモデルの役割を果たした。
【００７６】
要約すると、完全に合成された遺伝子がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、長さが２０塩基から１０２塩基の範囲にわたる１４種類の長い重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発がさらに用いられ、もとの配列の他の変異体を構築した。結果として生じるベクターによってコードされるＳＣＡは、ペプチドリンカーによって結合した、Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂの完全な可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）部分を含む。例示されたリンカーは、「２１８リンカー」で表される１８残基リンカー、および１５残基リンカーであった。
【００７７】
１８アミノ酸の「２１８リンカー」は、Filpula et al,1996,Antibody Engineering : A Practical Approach,1996,Oxford University Press,pp 253-268)に記載されている。長さ１５アミノ酸の（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号４２）は、Huston JS et al,1988,Proc Natl Acad Sci (USA) 85:5879-5883に記載されている。一部の場合には、Ｃ末端にヒスチジン６個のタグ（ｈｉｓ６）（配列番号４３）が、金属固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製を簡略化するために含められた。完成した遺伝子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （以前はＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって製造）でのＤＮＡ配列確認のために、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドへクローニングされた。ドメイン方向、リンカー、および遊離システインの配置を下記の表１に要約する。
【表１】
【００７８】
上記の表１によって要約される通り、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈおよび１−Ｉは、上の９つの遺伝子のＤＮＡおよびコードされるポリペプチド配列を示す。
【００７９】
ＳＣＡタンパク質の組換え発現および精製
上述の通り、上に記載したＳＣＡ変異タンパク質の産生のためにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが用いられた。酵母α接合因子由来のシグナル配列が、これらのＳＣＡタンパク質それぞれについての成熟コード配列の直接前に挿入された。このシグナルペプチドのアミノ酸配列はＭｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ^ Ａｌａ （配列番号３６）であり、「^」は切断部位を示す。そのシグナルの２０番目のアミノ酸（^の次のアラニン）もまたこれらの構造に含められた。したがって、成熟ＳＣＡタンパク質のアミノ末端はこのアラニンを含み、例示されたＳＣＡのそれぞれにおいて、図２Ａ〜２Ｈ（配列番号１〜９）によって図示される完全なアミノ酸配列がそれぞれ続く；表１に列挙する通り）。Ｎ末端タンパク質配列分析は、これらの配列は正しくプロセシングされたことを確認した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡを発現する突然変異遺伝子を、Ｐｉｃｈｉａ転移プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中にＥｃｏＲＩ部位で個別にライゲーションさせ、および酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主ＧＳ−１１５へ形質転換した。
【００８０】
これらの手続のための詳細な手順書は、参照により本開示に含まれるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＰｉｃｈｉａ発現キット取扱説明書カタログ番号Ｘ１７１０−０１（１９９４）に示される。発現の最初の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって実施した。個々のＳＣＡタンパク質に関して、Ｐｉｃｈｉａ発現株についてのクローン番号は、前出の表１の２−７−ＳＣ番号に対応する。
【００８１】
ＳＣＡタンパク質（〜２７ｋＤａ）は、組換えＰｉｃｈｉａにおいて高いレベルで発現されおよび分泌された（約２０〜１００ｍｇ／Ｌ）。還元剤の非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについての分析は、単量体および２個の単量体の単一のジスルフィド架橋によって形成される二量体の両方の、予想された存在を実証した。精製２−７−ＳＣ−１ＳＣＡタンパク質に対するウサギ抗血清を調製した。この試薬を用いたウェスタン分析は、発現されたＳＣＡタンパク質の同一性を立証した。
【００８２】
例えば、図８はＤ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ化型の代表的なウェスタンブロット分析を示し、組換えＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体とのこの抗Ｄ２Ｅ７抗血清の反応性を確認する。抗２１８−リンカー抗体を使用した。各試料の１μｇを、４〜２０％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。一次および二次抗体は、それぞれ、ウサギで作製した抗１８−リンカー抗体、およびヤギ抗ウサギ抗体結合ホースラディッシュペルオキシダーゼであった。酵素基質は、Ｍｏｓｓ，ＩｎからのＴＭＢＭペルオキシダーゼ基質であった。Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２はＣ末端にＰＥＧを有し、および２−７−ＳＣ−５は２１８リンカーにＰＥＧを有する。バンドＡは２−７−ＳＣ−２であり、バンドＢは２−７−ＳＣ−５であり、バンドＣはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＤはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−５であり、バンドＥはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＦはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−５である。
【００８３】
ＳＣＡタンパク質は上清から純度９５％超へ、単純な２または３のカラムクロマトグラフィー手順によって精製された。ｈｉｓ６タグ（配列番号４３）を有するＳＣＡタンパク質については、透析した発酵培地をダイアフィルトレーションに供しおよびＤＥＡＥカラムを通し、次いでＩＭＡＣニッケル親和性カラム（ＱＩＡＧＥＮ）に結合させた。結合したＳＣＡタンパク質はイミダゾールを用いて溶出し、次いで第２のＤＥＡＥ陰イオン交換カラムを通した。素通り画分を、ＳＣＡタンパク質の濃縮のためにダイアフィルトレーションに供し、およびさらに特徴づけを行った。ｈｉｓ６タグ（配列番号４３）を欠くＳＣＡタンパク質については、ＳＣＡタンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手したプロテインＬ−アガロースカラムで低ｐＨ溶出を用いて精製したか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手したＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィーに捕捉し、次いで塩濃度勾配溶出およびダイアフィルトレーションを実施した。ＨＳクロマトグラフィーが好ましい方法であった。
【００８４】
図２Ａおよび２Ｂは、クローン２−７−ＳＣ−２についての代表的な発現および精製データを示し、画分のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析、および各工程での収率を含む。少量の５４ｋＤａジスルフィド結合二量体が染色ゲルに見られる。
【００８５】
チオール特異的活性化ポリマー
好ましくは、本発明のＳＣＡはチオール特異的活性化ポリマーに結合している。具体的には、本発明に好ましくは使用される活性化ポリマーは、スルフヒドリル−またはチオール−選択性末端結合基を、その少なくとも一方の末端に有するものである。本分野で公知であるいくつかの活性化ポリマー、例えば、遊離チオールと反応するポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ポリマーが、本発明の実施に容易に用いられる。反応基の例は、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィド、およびヨードアセトアミドを含み、マレイミド基がチオールに対して高度に特異的であることおよび結合反応が穏和な条件下で起こることから見てマレイミド活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ｍａｌ'ｓ）が好ましい。また、例えば、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第５，７３０，９９０号明細書を参照。別のスルフヒドラル選択的活性化ＰＥＧ−ポリマーが、参照により本開示に含まれる２００１Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログに図解の通り（前Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能である。また、参照により本開示に含まれるGoodson,R.J.& Katre,N.V.1990,Bio/Technology 8: 343; Kogan,T.P.1992,Snythetic Comm.22,2417を参照。
【００８６】
例えば、本発明のＳＣＡと結合した、直鎖ポリマーｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５ｋＤａ）（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒカタログ番号２Ｄ３ＸＯＴ０１）およびｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）、および分枝鎖ポリマーｍＰＥＧ２−ＭＡＬ（４０ｋＤａ）（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒカタログ番号２Ｄ２ＭＯＨ０１）複合体が本明細書で例示される。これらのマレイミド−ＰＥＧポリマーの構造、および共役化学を、便宜のために図３Ａ〜３Ｅに示す。図３ＦはｍＰＥＧ−ビニルスルホンを示す。さまざまなマレイミド活性化ポリマーは、図３Ｅに示す通り、遊離チオールと容易に反応する。図３Ｅでは、「ＳＣＡ」は、少なくとも１つの遊離チオール（Ｓ−Ｈ）を有する本発明に記載のタンパク質である。下記の表２を参照。
【表２】
【００８７】
スルフヒドリル特異的リンカーを含み得る他のポリマー基本骨格は、同一出願人による米国特許第５，６４３，５７５号明細書、米国特許第５，９１９，４５５号明細書、米国特許第６，１１３，９０６号明細書（Ｕ−ＰＥＧ）、米国特許第６，１５３，６５５号明細書および米国特許第６，３９５，２６６号明細書（末端分岐ＰＥＧ）、米国特許第６，２５１，３８２号明細書（ポリＰＥＧ）および米国特許出願公開第１０／２１８，１６７号明細書（ビシン）などで開示されたものを含む。また、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ『Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ２００１』も参照。前記のそれぞれの開示は、参照により本開示に含まれる。
【００８８】
上述の通り、複合体のポリマー部分は好ましくはポリアルキレンオキシドである。より好ましくは、ポリマー部分は、実質的に非抗原性であるポリエチレングリコールである。ＰＡＯおよびＰＥＧは重量平均分子量において相当に異なり得るが、本発明の組成物に含まれるものは、独立して、約２，０００Ｄａから約１３６，０００Ｄａの重量平均分子量を本発明の大部分の態様で有する。より好ましくは、ポリマーは約３，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。非常に好ましくは、ポリマー部分は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。
【００８９】
本明細書に含まれるポリマー物質は、好ましくは 室温にて水溶性である。そのようなポリマーの非限定的な一覧は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールといったポリアルキレンオキシドホモポリマー、その共重合体およびそのブロック共重合体を含み、ただしブロック共重合体の水への溶解度が維持されることを条件とする。
【００９０】
マレイミドポリマーの、遊離システインとの、しかしリジンまたはヒスチジンとではない特異的な反応性の確認は、これらの各遊離アミノ酸とのマレイミドの反応によって達成された。
【００９１】
図４は、活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとのシステインの反応性を確認する。３ｍＭ溶液としてのシステインについての吸収が曲線Ａで表される。濃度１ｍＭでの活性化ＰＥＧ−ＭＡＬについての吸収曲線は曲線Ｃで示され、および３００ｎｍを中心とする幅広い吸収ピークによって特徴づけられる。吸収曲線Ｂは、システインおよび活性化ＰＥＧ−ＭＡＬを１：３比で合わせた溶液について取った（１ｍＭ ＰＥＧ−ＭＡＬおよび３ｍＭシステイン、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５℃）。Ｂ曲線はＡ曲線を右にシフトしてたどるが、ＰＥＧ−ＭＡＬの特徴的な３００ｎＭの幅広ピークは存在せず、活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとのシステインの反応性を確認する。ヒスチジンまたはリジンについての類似の吸収曲線（記載せず）が、使用した条件下ではこれらの残基は高度に反応性ではないことを確認する。
【００９２】
標識化またはタグ化複合体
本発明に記載のポリアルキレンオキシド結合ＳＣＡの製造に際して、複合体は、診断薬または治療薬をＳＣＡ−ポリマー複合体へ結合または複合化することによって、必要に応じてさらに修飾される。本発明に記載の抗体複合体を調製する一般的方法は、参照により本開示に含まれるShih,L.B.,et al.,Cancer Res.51: 4192 (1991) ; Shih,L.B.,and D.M.Goldenberg,Cander Immunol.Immunother.31: 197 (1990); Shih,L.B.,et al.,Intl.J.Cancer 46 : 1101 (1990); Shih,L.B.,et al.,Intl.J.Cancer 41 : 832 (1988)に記載される。間接的な方法は、ポリアルキレンオキシドが官能基を有する抗体（またはＳＣＡ）を、１または複数の生物活性分子、例えば、ペプチド、脂質、核酸（すなわち、リン酸−リジン複合体）、医薬、毒素、キレート剤、ホウ素添加剤、または検出可能な標識分子を有するキャリヤーポリマーと反応させることを含む。
【００９３】
一部の別の実施形態では、ポリアルキレンオキシド結合ＳＣＡが診断薬または治療薬と直接に複合体化または結合される。一般的手順は、診断薬または治療薬が酸化されたｓＦｖ部分へ直接結合される以外は、複合体化の間接法と同様である。参照により本開示に含まれるＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４４３，９５３号明細書を参照。
【００９４】
医薬組成物およびＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の投与
本発明の医薬組成物は、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の「治療上有効な量」または「予防的に有効な量」を含み得る。「治療上有効な量」は、目的の治療結果を達成するために、必要な投与量および期間にわたる、有効な量をいう。ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の治療上有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重といった要素、および抗体または抗体部分がその個体において目的の反応を導く能力に応じて変化し得る。治療上有効な量はまた、抗体または抗体部分の毒性または有害な作用を治療上の有益な作用が上回る量である。「予防的に有効な量」は、目的の予防結果を達成するために、必要な投与量および期間にわたる、有効な量をいう。典型的には、予防的用量は疾患以前にまたは疾患のより早期の段階で用いられるため、予防的に有効な量は治療上有効な量より少なくなる。
【００９５】
投与計画は、最適な望ましい反応（例えば治療的または予防的反応）を与えるように調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を啓示的に投与することができ、または治療状況の要件によって指示される通りに用量を比例的に低減または増加することができる。非経口 組成物を単位用量剤形で処方することは、投与の容易さおよび投与量の均一性のために特に有益である。ここで用いられる単位用量剤形とは、治療すべき哺乳類対象のための単位用量として適している物理的に別個の単位をいい；各単位は目的の治療効果を生じるよう計算された規定量の活性化合物を、必要な医薬キャリヤーと共に含む。本発明の単位用量剤形についての規格は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療的または予防的効果、および（ｂ）そのような活性化合物を各対象の感受性の治療のために混合することの本分野に内在する制限に決定されおよびそれらに直接依存する。
【００９６】
本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の治療上または予防的に有効な量の、典型的な、非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。用量の値は、緩和すべき症状の種類および重症度に伴って変化し得ることに注意する。さらに、いずれの特定の対象についても、具体的な投与計画は、個別の必要性、および組成物の投与を実施または監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整すべきであること、および、本明細書に示す投与量範囲は単なる例でありおよび請求される組成物の範囲または実施を制限しないことが意図されることを理解すべきである。
【００９７】
医薬組成物
好ましい別の一実施形態では、本発明のＳＣＡは、目的の特定のＳＣＡタンパク質の結合特異性に関係する症状を治療および／または診断するために用いられる。したがって、ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、本分野で公知である方法によって、投与されるＳＣＡの結合特性が疾患または障害の治療に有用である疾患または障害を有する動物または人へ投与される。好ましくは、ＳＣＡは本発明にしたがってポリマー結合される。
【００９８】
本発明のＳＣＡおよび複合体化ＳＣＡは、例えば投与を必要とする動物または人のような対象への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、その医薬組成物は、少なくとも１種類の結合特異性を有するＳＣＡポリペプチド、および医薬品として許容されるキャリヤーを含む。
【００９９】
「医薬品として許容されるキャリヤー」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、例えば、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、などを含む。医薬品として許容されるキャリヤーの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。多くの場合で、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールといったポリアルコール、または塩化ナトリウムを、組成物に含むことが好ましい。医薬品として許容されるキャリヤーはさらに、抗体または抗体部分の保存期間または有効性を増大する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液といった補助的物質の微量成分を含み得る。
【０１００】
本発明の組成物は必要に応じてさまざまな形に調製される。これらは、例えば、液剤（例えば注射用および輸液用溶液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームおよび坐剤といった、液体、半固体および固体剤形を含む。好ましい剤形は目的の投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体を用いる人の受動免疫化に用いられるものと同様の組成物といった、注射用または輸液用液剤の形である。好ましい投与様式は非経口である（例えば、静脈、皮下、腹腔内、筋肉内）。
【０１０１】
好ましい一実施形態では、ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は静脈輸液または注射によって投与される。別の好ましい一実施形態では、抗体は筋肉内または皮下注射によって投与される。スプレー、エアロゾルまたはミストとしての吸入による投与もまた、例えば全身吸収および／または呼吸系内での局所作用のために、その経路が有利である場合に考慮される。
【０１０２】
治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高い医薬濃度に適した他の規則的構造として処方することができる。無菌注射液は、活性化合物（すなわち，抗体または抗体部分）を、上で挙げた成分の１または組合せを含む適当な溶媒に必要に応じて組み込み、次いで滅菌ろ過を実施することによって調製することができる。
【０１０３】
一般的に，分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および上で挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌賦形剤に組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末剤の場合には、調製の好ましい方法は、あらかじめ滅菌ろ過した溶液から活性成分および他の目的の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンといったコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の遅い吸収は、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンといった、吸収を遅らせる物質を組成物に含めることによって実現できる。
【０１０４】
本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、本分野で公知であるさまざまな方法によって投与することができるが、多くの治療用途については、好ましい投与経路／様式は静脈注射または輸液である。当業者に理解される通り、投与経路／様式は目的とされる結果に応じて変化する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、例えば、不活性な希釈剤または吸収できる食用のキャリヤーと共に、経口投与することができる。ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体（および必要に応じて他の成分）は、必要に応じて、硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または対象の食事に直接組み込まれる。治療的な経口投与のためには、化合物は添加物と組み合わされおよび経口錠、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエファーなどの形で用いることができる。本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を非経口投与以外によって投与するためには、その化合物を、不活性化を防ぐ物質でコーティングするかまたはそれと同時投与する必要があり得る。
【０１０６】
補助的な活性化合物もまた医薬組成物に組み込むことができる。一部の実施形態では、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、疾患または障害に対して相加的、相乗的または補完的な治療活性または診断活性を提供する、１つ以上の追加の治療剤と共に処方されおよび／または同時に投与される。
【０１０７】
抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の投与
例えば、本発明の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、他の標的を結合する１つ以上の別の抗体またはＳＣＡ（例えば、他のサイトカインを結合するもの、または細胞表面分子を結合するもの）、１つ以上のサイトカイン、可溶性ｈＴＮＦ−α受容体（例えば、国際公開第９４／０６４７６号パンフレット）および／またはｈＴＮＦ−α産生または活性を阻害する１つ以上の化学物質（例えば国際公開第９３１１９７５１号パンフレットに記載されたシクロヘキサン−イリデン誘導体）と共に処方および／または同時に投与することができる。さらに、本発明の１つ以上のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、前記の治療剤の２つ以上と組合せて用いることができる。そのような併用治療は、有利なことに、個別に投与された治療剤の、より低い用量を利用し得る。
【０１０８】
抗ＴＮＦ−α ＳＣＡの適応および好ましい同時投与剤
単に一例として、参照により本開示に含まれる米国特許第６，２５８，５６２号明細書および第６，０９０，３８２号明細書は、ＴＮＦ−αが疾患過程の一次または他の面の媒介因子または共媒介因子である疾患および障害の網羅的一覧を提供する。そのような疾患または障害を治療または緩和するための本分野で公知であるである薬剤が、本発明のＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡの抗ＴＮＦ−α実施形態と共に処方または同時投与されることが考えられている。要約すると、ＴＮＦ−αによって媒介されるかまたはその作用と関連する、およびしたがって、必要に応じて本分野で公知である他の治療剤と併用して、ＴＮＦ−α結合物質によって合理的に治療される疾患および障害の一覧は、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によって例えば、敗血症、自己免疫疾患、感染症、移植／拒絶、悪性腫瘍、呼吸器障害および腸障害を含むと記載されている。
【０１０９】
これらの適応症および、適用可能な場合には、そのような適応症の治療において抗ＴＮＦ−α ＳＣＡと必要に応じて同時処方される薬剤は、下記の通りである。
【０１１０】
敗血症。
【０１１１】
敗血症に随伴する治療可能な症状は、ＴＮＦ−α媒介性敗血性ショック症候群、および随伴する低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、臓器壊死、毒性二次媒介因子の放出の刺激および凝固カスケードの活性化、内毒素性ショック、グラム陰性敗血症および毒素性ショック症候群を含む。
【０１１２】
自己免疫疾患
自己免疫疾患に随伴する治療可能な症状は、慢性関節リウマチにおける組織炎症および関節破壊、糖尿病における膵島細胞死およびインシュリン抵抗性、多発性硬化症における希突起膠細胞に対する細胞毒性および炎症性プラークの誘導を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと共に処方または同時投与することが考えられている薬剤は、ほんの数例を挙げると、例えば、副腎皮質ステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ−５７１１１ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）Ｖｏｌ．３７．Ｓ２９５ ； Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｍｅｄ．（１９９６） Ｖｏｌ．４４ ２３５Ａを参照）；５５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｉｎａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９．Ｉ／ＳＢ２１０３９６（非減少性霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅを含む、そのような自己免疫障害を治療するために利用可能な任意の本分野で公知の薬剤を含む。
【０１１３】
感染症
感染症に随伴する治療可能な症状は、ＴＮＦ−α−媒介性脳炎症、マラリアにおける毛細管血栓症および梗塞、髄膜炎における静脈梗塞、感染症例えばＨＩＶウイルス感染に二次的なカヘキシー、ＨＩＶ感染におけるウイルス増殖の刺激および中枢神経系傷害、インフルエンザといった感染症が原因の発熱および筋肉痛）を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、本分野で公知である任意の、例えば、抗生物質、抗細菌剤、抗ウイルス剤などといった抗感染剤、および非ステロイド抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）および／または感染物質および／またはその毒素または本質的成分と結合する抗体またはＳＣＡを含む。
【０１１４】
移植
移植医療、移植片の拒絶、または必要な免疫抑制剤の副作用に随伴する治療可能な症状は、移植関連効果のほんの数例を挙げると、ＴＮＦ−α媒介性同種移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、例えば、ＯＫＴ３誘導性反応を阻害する、副腎皮質ステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、および／またはＯＫＴ３、および、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体−ａ）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７−２）への抗体またはＳＣＡ結合といった免疫細胞受容体への結合に向けられる結合物質を含む。
【０１１５】
悪性腫瘍
悪性腫瘍に随伴する治療可能な症状は、悪性腫瘍におけるＴＮＦ−α−媒介性悪液質(TNFα-mediated cachexia)、腫瘍増殖、転移可能性および細胞毒性を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、本分野で公知である任意の抗腫瘍または抗癌剤を含む。
【０１１６】
肺障害
肺障害に随伴する治療可能な症状は、成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性肺炎、肺サルコイドーシス、肺線維症および珪肺症を含む。肺障害については、本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡは必要に応じて経口または鼻腔内スプレーによって投与され、または、任意の標準的な吸入系によるエアロゾルとしての投与のために処方される。そのような処方は、そのような肺疾患または障害を治療するのに適した他の薬剤、またはＳＣＡ処方の気管支への接近を促進する薬剤と同時に処方または投与することができる。
【０１１７】
腸障害
腸障害に随伴する治療可能な症状は、例えば、クローン病および／または潰瘍性大腸炎といった、炎症性腸障害の範囲を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、ブデソニド；上皮増殖因子；副腎皮質ステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害因子；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害因子；ＩＬ−１受容体拮抗因子；抗ＩＬ−１βＭＡｂ；抗ＩＬ−６ＭＡｂ；増殖因子；エラスターゼ阻害因子；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤＴＮＦ受容体ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；５５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；インターロイキン−１０（ＳＣＨ５２０００；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）；ＩＬ４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ４作用因子（例えば、作用因子抗体）；インターロイキン−１１；プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはブデソニドのグルクロニド−またはデキストラン−結合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０ ； Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）の拮抗因子；シプロフロキサシン；およびリグノカインを含む。
【０１１８】
診断法および測定法：抗ＴＮＦ−α ＳＣＡまたはＳＣＡ−複合体
本発明の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、従来のイムノアッセイを用いて、血清または血漿または他の臨床標本を含む生物試料中といった目的の試料中のｈＴＮＦ−αを検出するのに用いることができる。これらは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫化学法を含む。
【０１１９】
本発明は、生物試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させること、およびｈＴＮＦ−αと結合した抗体（または抗体部分）または非結合ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を検出し、それによって生物試料中の生物試料中のｈＴＮＦ−αを検出することを含む、ｈＴＮＦ−αを検出するための方法を提供する。結合または非結合抗体の検出を円滑にするため、ＳＣＡは検出可能な物質を用いて直接的にまたは間接的に標識化されている。適当な検出可能な物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例はルミノールを含む；および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０１２０】
随意的な一実施形態では、本発明のＳＣＡは標識化されていないが、ｈＴＮＦ−αは、ｒｈＴＮＦ−α標準物質が検出可能な物質で標識化されており、かつ未標識の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を用いる競合免疫測定法によって体液中で測定される。この測定法では、生物試料、標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質、および抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を混合し、さらに未標識のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体と結合した標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質の量が測定される。生物試料中のｈＴＮＦ−αの量は、抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体と結合した標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質の量と反比例する。
【０１２１】
米国特許第６，２５８，５６２号明細書および第６，０９０，３８２号明細書は、Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂはまたヒト以外の種に由来するＴＮＦ−α、特に霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよびアカゲザル）、ブタおよびマウス由来のＴＮＦ−αを検出するのに用いることができることを示し、本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体はその目的にもまた容易に使用されると考えられる。
【実施例】
【０１２２】
下記の実施例は本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、しかし本発明の有効な範囲をいかなる方法でも制限しないことが意図される。
【０１２３】
実施例１
少なくとも１つの遊離チオールを有するＳＣＡタンパク質の設計
Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂの可変ドメインに基づいて、９種類のＳＣＡポリペプチドが設計された。本明細書で「Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ」の語は、別に示されない限り、本明細書に例示するようにＤ２Ｅ７可変ドメインを用いて作製されたＳＣＡの任意のものを称する。それぞれ下記の通り構築された。
【０１２４】
上記の通り、完全に合成の遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって、長さ２０塩基から１０２塩基の範囲にわたる１４種類の長い重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発をさらに用いて、元の配列の他の変異体を構築した。発現されたＳＣＡタンパク質は、ペプチドリンカーによって連結された、Ｄ２Ｅ７Ｍａｂの完全な可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）部分を含む。２つのリンカーが用いられた。
【０１２５】
リンカー「２１８」は、Filpula et al.,1996 (Antibody Engineering: A Practical Approach,Oxford University Press,pp 253-268)に記載されている１８アミノ酸残基２１８−リンカーである。
【０１２６】
「（ＧＧＧＧＳ）３リンカー」（配列番号４２）は、Huston JS et al,1988,Proc Natl Acad Sci (USA) 85 : 5879-5883に記載された１５アミノ酸残基リンカーである。上の表１に記載される通り、一部の場合には、金属固定化金属イオン親和性 クロマトグラフィー （「ＩＭＡＣ」）による精製を容易にするために、Ｃ末端のヒスチジン６個のタグ（ｈｉｓ６）（配列番号４３）が含められた。
【０１２７】
完成した遺伝子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （以前はＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって製造）でのＤＮＡ配列確認のために、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドへクローニングされた。ドメイン方向、リンカー、および遊離システインの配置を上記の表１に要約する（クローン番号２−７−ＳＣ−１から９）。
【０１２８】
クローン番号２−７−ＳＣ−１から９のそれぞれを発現している核酸鎖は下記の通り調製された。
【０１２９】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡのクローニングおよび発現の方法
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ遺伝子の合成ＶＬ−ＶＨ型は、２回のＰＣＲによって、６種類の重複するオリゴヌクレオチドをＶＬ鎖のテンプレートとして、および６種類の重複するオリゴヌクレオチドをＶＨ鎖のテンプレートとして用いて構築した。Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子のＶＬ鎖およびＶＨ鎖は、２１８リンカーで連結された。コードされたタンパク質のＣ末端には、ＩＭＡＣ精製目的のための６個の反復するヒスチジンが続いた。
【０１３０】
ＶＬについての５’から３’末端への６種類のオリゴヌクレオチドは下記の通り設計された：
ＶＬ１：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号１９）
ＶＬ２：ＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧ
ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣ
ＣＣＴ（配列番号２０）
ＶＬ３：
ＣＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＧＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＧＧ
（配列番号４５）
ＶＬ４：ＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴ
ＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣ（配列番号２１）
ＶＬ５：ＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧ
ＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＧＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＴＴＴ
ＴＧＧＣＣＡＧ（配列番号２２）
ＶＬ６：ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣ
ＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡ（配列番号２３）。
【０１３１】
そのうち、ＶＬ１、２、４および５は順方向（センス）オリゴヌクレオチドであり、およびＶＬ３および６は逆方向オリゴヌクレオチドであった。
【０１３２】
ＶＨについての５’から３’末端への６種類のオリゴヌクレオチドは下記の通り設計された：
ＶＨ１：ＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ（配列番号２４）。
【０１３３】
ＶＨ２：ＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡ
ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧ
ＧＧＴＣＣＧＧ（配列番号２５）
ＶＨ３：ＣＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣ
ＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＴ（配列番号２６）
ＶＨ４：ＴＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧ
ＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣ（配列番号２７）
ＶＨ５：ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣ
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴ
ＴＡＣＴＧＴＧＣＧ（配列番号２８）
ＶＨ６：ＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＡ
ＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＡＣ（配列番号２９）
そのうち、ＶＬ１、２、４および５は順方向オリゴヌクレオチドであり、およびＶＬ３および６は逆方向オリゴヌクレオチドであった。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの合成ＶＬおよびＶＨのために設計されたすべてのオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって合成された。
【０１３４】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ 遺伝子のＶＬは１回目のＰＣＲで、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてオリゴヌクレオチドＶＬ１、２、３、４、５および６（各１ｐｍｏｌ）、順方向プライマーとして５'ＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ（配列番号３０）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ（配列番号３１）（５０ｐｍｏｌ）を用いて組み立てられた。
【０１３５】
ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１３６】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子のＶＨは１回目のＰＣＲで、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてオリゴヌクレオチドＶＨ１、２、３、４、５および６（各１ｐｍｏｌ）、順方向プライマーとして５'ＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡ（配列番号３２）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号３３）（５０ｐｍｏｌ）を用いて組み立てられた。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１３７】
表１の変異ＳＣＡタンパク質をコードする変異Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の遺伝子構造は、部位特異的突然変異誘発によって達成された。例えば、２−７−ＳＣ−５はＤ２Ｅ７ＳＣＡ（２−７−ＳＣ−１）の突然変異体であり、２１８リンカー中の残基１０９でのセリンからシステインへのアミノ酸変化を有する。この遺伝子は２回のＰＣＲによって、２−７−ＳＣ−１ ＤＮＡをテンプレートとしておよび４種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて作製された。
【０１３８】
クローン２−７−ＳＣ−８の構造のためのプライマーは下記の通り設計された：
順方向プライマー１：ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣ（配列番号３７）
順方向プライマー２：
ＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＣ（配列番号３８）
逆方向プライマー１：ＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴ（配列番号３９）
逆方向プライマー２：ＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＣＣ（配列番号４０）
２つの断片が別々に、１回目のＰＣＲで、２通りのプライマー組合せ（順方向プライマー１および逆方向プライマー１、および順方向プライマー２および逆方向プライマー２、各５０ｐｍｏｌ）によって、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびテンプレートとして２−７−ＳＣ−８ ＤＮＡ（１０ｎｇ）を用いて増幅された。２−７−ＳＣ−８ についてのＤ２Ｅ７ ＳＣＡ 遺伝子変異体は、２回目のＰＣＲでのハイブリッド伸張によって、順方向プライマー１および逆方向プライマー２（各５０ｐｍｏｌ）、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびテンプレートとして１回目のＰＣＲからの２つの断片（各１０ｎｇ）を用いて完成した。
【０１３９】
残基１０９にシステインを有する、２−７−ＳＣ−８ＳＣＡ遺伝子の完成したＰＣＲ産物は、下記の通り、ベクターｐＨｉｌＤ２にクローニングされおよびＰｉｃｈｉａＧＳ１１５株を形質転換するのに用いられた。
【０１４０】
表１の残りの遺伝子は、同様の部位特異的突然変異誘発工程によって作製された。２−７−ＳＣ−２遺伝子（配列番号２）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にシステインコドンＴＧＣをコードした。２−７−ＳＣ−３遺伝子（配列番号３）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にシステインコドンＴＧＣをコードした。２−７−ＳＣ−４遺伝子（配列番号４）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、システインコドンＴＧＣをＣ末端ＶＨセリンコドンの直後にコードした。２−７−ＳＣ−６遺伝子（配列番号６）については、中央のオリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを２１８リンカーの２位にコードし、およびＣ末端逆方向プライマーがシステインコドンＴＧＣを、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にコードした。２−７−ＳＣ−７遺伝子（配列番号７）については、中央のオリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号４２）の残基５位に対応する、ヌクレオチド３７６〜３７８にコードした（図１Ｇ）。
【０１４１】
２−７−ＳＣ−８遺伝子（配列番号８）については、ＰＣＲ順方向オリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣをＮ末端ＶＬアミノ酸Ａｓｐの前にコードし、およびＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にコードした。２−７−ＳＣ−９遺伝子（配列番号９）については、ＧＧＧＧＳ（配列番号４４）をコードする５コドンリンカーが１８コドン２１８リンカーを代替した。
【０１４２】
完全なＤ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の組み立ておよびＤ２Ｅ７ＳＣＡのＰｉｃｈｉａにおける発現のために、シグナル配列をＤ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の５’末端に、２回目のＰＣＲにおいて、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてＤ２Ｅ７ＳＣＡ 遺伝子のＶＬおよびＶＨの１回目のＰＣＲ産物（各１ｎｇ）、順方向プライマーとして５'ＣＣＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号３４）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号３５）（５０ｐｍｏｌ）を用いて加えた。
【０１４３】
ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１４４】
５'末端シグナル配列を有する、２回目のＰＣＲで組み立てられたＤ２Ｅ７ＳＣＡの遺伝子産物は、１％アガロースゲルで精製され、ＥｃｏＲ１で３７にて６０分間消化され、およびベクターｐＨｉｌＤ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲ１部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃にて６０分間ライゲーションした。１００μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション反応産物で形質転換し、および氷上で３０分間、および４２℃にて４５秒間インキュベートし、次いで１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ培地を添加し、および３７℃にて５０分間、２５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。０．１ｍｌの形質転換混合物をＬＢアンピシリン（１０ｍｇ／Ｌ）平板に播種しおよび３７℃にて１６時間インキュベートした。
【０１４５】
ＬＢアンピシリン（１０ｍｇ／Ｌ）平板上のｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドで形質転換されたＤＨ５ａクローンのいくつかを、２ｍｌのＬＢ培地中で３７℃にて１６時間培養した。各クローンからのＤ２Ｅ７ＳＣＡのプラスミドミニプレパレーションを調製した。ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドのＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルＤＮＡ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによって確認された。
【０１４６】
表１に列挙された変異ＳＣＡクローンのそれぞれは、下記の手順によって作製された。Ｐｉｃｈｉａ形質転換のために、ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドをＳａｌ１を用いて３７℃にて６０分間消化し、および、フェノール抽出およびエタノール沈澱後に、１０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＰｉｃｈｉａＧＳ１１５細胞を、５０ｍｌのＹＰＤ培地中で３０℃にて１６時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら培養し（ＯＤ６００＝１．２）、氷冷蒸留水で３回および１Ｍソルビトールで１回洗浄し、および最後に０．１ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁した。
【０１４７】
調製されたＰｉｃｈｉａＧＳ１１５細胞を、Ｓａｌ１消化した１０μｇのｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドと、氷冷した０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベット中で混合し、および、８００Ｖ、１０ｐＦおよび１２９ の条件下で、エレクトロセルマニピュレーター（ＢＴＸ）によってパルスを加えた。パルス後に、１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールをエレクトロポレーションキュベットに加えた。内容物全部を１５ｍｌ試験管へ移し、および３０℃にて１時間インキュベートした。形質転換混合物の０．２ｍｌをＲＤＢ培地平板に播種し、および３０℃にて４日間インキュベートした。
【０１４８】
ＲＤＢ平板由来の、ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドで形質転換されたＰｉｃｈｉａクローンのいくつかを、５００ｍｌフラスコ中の２５ｍｌのＢＭＧＹ培地に接種し、および３０℃にて２５０ｒｐｍで振とうしながら２日間インキュベートした。細胞を３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって室温にて採取し、５０ｍｌフラスコ中の５ｍｌのＢＭＭＹ培地に再懸濁して発現を誘導し、および３０℃にて振とうしながらさらに２日間インキュベートした。各培養から１ｍｌの試料を超遠心管に移し、および１４，０００ｒｐｍで２分間室温にて遠心分離した。各培養の上清からの４０μｌの試料を、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。
【０１４９】
実施例２
ＳＣＡタンパク質の組換え発現および精製。
【０１５０】
実施例１に記載のＳＣＡタンパク質（クローン番号２−７−ＳＣ−１から９）は、すべて酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの発現および分泌によって作製された。酵母α接合因子に由来する分泌シグナル配列が、これらのＳＣＡタンパク質それぞれについての成熟コード配列の直接前に挿入された。
【０１５１】
このシグナルペプチドのアミノ酸配列はＭｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ ^ Ａｌａ （配列番号３６）であり、「^」は切断部位を示す。我々はまた、そのシグナルのこの２０番目のアミノ酸（^の次のアラニン）も我々の構造に含めた。したがって、各成熟ＳＣＡタンパク質のそれぞれのアミノ末端はこのアラニンを含み、その後に図１Ａ〜１Ｆに記録される完全なアミノ酸配列が続く。Ｎ末端タンパク質配列分析は、これらの正しくプロセシングされた配列を確認した。これらの変異ＳＣＡ遺伝子は、Ｐｉｃｈｉａ転移プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中へＥｃｏＲＩ部位で個別にライゲーションされ、および酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主ＧＳ−１１５へ形質転換した。これらの手続のための詳細な手順書は、参照により本開示に含まれるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＰｉｃｈｉａ発現キット取扱説明書カタログ番号Ｘ１７１０−０１（１９９４）に示される。発現の最初の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって実施した。
【０１５２】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡクローンのＰｉｃｈｉａ発酵
クローン２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−４、２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７を含む、抗ＴＮＦ−α ＳＣＡＤ２Ｅ７のすべての発現クローンは、メタノール資化性酵母であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生成され、およびタンパク質は培地中へ分泌された。Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ変異株の高密度発酵はＹＮＢおよびビオチンを添加した基礎培地であるＢＭＧＹ培地中で（「培地組成物」を参照）、自動供給制御発酵槽（型番：ＢｉｏＦｌｏｗ３０００およびＢｉｏＦｌｏｗ ＩＶ； ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０１５３】
ＢＭＧＹ中で１６〜２０時間、（ｃ）グリセロール（５０％）中で増殖期４時間、および（ｄ）メタノールを用いて４５時間Ｄ２Ｅ７変異株の誘導。各成分の供給は、３０％に設定された溶存酸素レベルに関して最適化された。培養温度は２９℃に設定され、およびｐＨは運転中には水酸化アンモニウムおよびリン酸を用いて６．０に維持された。さまざまなパラメーターを６８時間の発酵期間にわたって監視し、ここで、生育する培養のＯＤ６００値は（ｂ）期の終わりに０．５から１２５へ、グリセロール供給期（ｃ期）の終わりに１２５から２００へ、および最終的に，誘導期（ｄ期）の終わりに２００から３００へ到達した。
【０１５４】
平均して、発酵上清中のＤ２Ｅ７変異株の発現は５０ から１００ ｍｇ／Ｌの間であった。カルボキシル末端に遊離 システインが組み込まれヒスチジン尾部が続くＶＬ−ＶＨ変異株である２−７−ＳＣ−２は、発酵中に優れた再現性で良好な成績を上げた最も頑健なクローンであることが見出された。
【０１５５】
供給品の説明
ＢＭＧＹ（Ｌ当たり）
酵母抽出物：
ペプトン：
グリセロール：
リン酸緩衝液：（１Ｍ、ｐＨ６．０）
ＹＮＢ：
ビオチン：
ＦＭＴ３０（Ｂｒｅｏｘ）：
誘導物質
メタノール
酸素
圧縮酸素。
【０１５６】
実施例１のＳＣＡタンパク質は上清から純度９５％超へ、単純な２または３のカラムクロマトグラフィー手順によって精製された。
【０１５７】
ヒスチジンタグを用いたクローン２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−５、２−７−ＳＣ−７ Ｄ２Ｅ７ＳＣＡからのタンパク質の精製
Ｄ２Ｅ７変異体の、２−７−ＳＣ−２、ＳＣＡ２−７−ＳＣ−３、ＳＣＡ２−７−ＳＣ−４、ＳＣＡ２−７−ＳＣ− ５、および ２−７−ＳＣ−７は発酵上清から、イオン交換およびアフィニティカラムクロマトグラフィーの組合せを用いて精製した。使用した培地を２０ｍＭトリスｐＨ７．４および５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで交換する一方、上清を高度にダイアフィルトレーションして試料を濃縮した。緩衝液を交換した試料を次いでＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー（品番１７−０７０９−０１；Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡは指定の条件下ではＤＥＡＥカラムに結合しなかった。ＤＥＡＥカラムからの素通り画分を、５０ｍＭトリスｐＨ８．０および０．３ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析し、および同一の緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に加えた。非特異的結合は、１０％グリセロールを緩衝液Ａに含む緩衝液Ｂを用いた厳密な洗浄を用いて破壊され、その後に緩衝液Ａによるグリセロールの除去を行った。さらに低親和性の相互作用は、カラムの３倍容量の６０〜１００ｍＭイミダゾール（２−７−ＳＣ−２についてのみ１００ｍＭ）を通すことによって洗い流した。最後に、結合したＳＣＡをＮｉ−ＮＴＡカラムから、カラムの３〜５倍容量の２５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。洗浄および溶出の両方について、イミダゾールは緩衝液Ａで調製した。
【０１５８】
ピーク画分をプールし、およびＤＥＡＥ緩衝液である緩衝液Ｃに対してよく透析した。透析した試料は高速遠心分離によって清澄化し、および精製の最終段階としてＤＥＡＥカラムを通した。次いで、将来の使用のために−２０℃にて保存する前に、精製された試料のタンパク質濃度をＵＶ２８０によって、およびＢＣＡ法によって測定した。
【０１５９】
ヒスチジンタグの無いタンパク質２−７−ＳＣ−４Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの精製
プロテインＬは多数の異なる種のＶＬドメインと強く結合する。その結合は極めて種特異的であり、およびまたサブタイプ特異的である。２−７−ＳＣ−４のＶＬドメインをプロテインＬによって認識でき、および相互作用のこの特異性を利用して、我々は２−７−ＳＣ−４を１段階で、ダイアフィルトレーションした試料から直接精製した。プロテインＬカラム（品番ＣＬＢＬ ２０１−５，ＣＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）からの２−７−ＳＣ−４の低ｐＨ溶出は、ＳＣＡの構造的または機能的完全性に影響しなかった。要約すると、発酵上清をダイアフィルトレーションし、およびカラムへ試料を負荷するためにＰＢＳで交換した。非特異的に結合したタンパク質は、負荷後に多量のＰＢＳを用いて洗い流した。
【０１６０】
ＳＣＡタンパク質はカラムからｐＨ２．０のグリシン緩衝液（１０ｍＭ）を用いて溶出し、および溶液を中和するために直ちに３Ｍトリスへ回収した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、ポジティブ画分をプールし、およびＰＢＳに対して透析した。ＳＣＡタンパク質は透析後に高速遠心分離によって清澄化し、タンパク質濃度を測定し、および将来の使用のために−２０℃にて保存した。
【０１６１】
代替の、ＨＳ（ＰＯＲＯＳ５０ＨＳ、コード：１−３３５９−０７；Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＱ−セファロースＦＦ（品番１７−０５１０−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のようなより好ましくない方法もまた、ＳＣＡ精製に効果的に用いられた。
【０１６２】
下記の表は、さまざまなカラムによる２−７−ＳＣ−２ Ｄ２Ｅ７変異体の精製、各精製工程後の収率パーセンテージ、および各変異体についての精製の品質を示す。
【表３】
【０１６３】
図２Ａおよび２Ｂは、２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡタンパク質の各精製工程からの試料の代表的なＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。ゲルはクマシーブルーを用いて染色した。最終試料の純度はゲルデンシトメトリースキャンから９５％と推定された。少量の５４ｋＤａジスルフィド結合二量体を染色ゲル上に見ることができる。
【０１６４】
実施例３
ポリエチレングリコールのマレイミド誘導体の安定性および反応性
アミノ酸残基とのマレイミド反応性
マレイミドポリマーの、リジンまたはヒスチジンとでなく、遊離システインとの特異的反応性の確認は、これらの各遊離アミノ酸とのこれらの化合物の反応によって達成された。図４Ａ〜４Ｃに示す通り、使用した標準的な反応条件下で、システインは、ＰＥＧ−マレイミドと高度に反応性であるが、ヒスチジンまたはリジン（記載せず）はそうではない。
【０１６５】
活性マレイミド基の分析および安定性
官能基分析は下記の通り２段階で実施した：
ＭＡＬ−ＰＥＧのシステインとの反応、および
反応後の残りの未反応システインの、ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（「ＤＴＮＢ」）を用いた滴定による測定
活性ＭＡＬ−ＰＥＧの測定は、反応モル比１：３（ＭＡＬ−ＰＥＧ：システイン）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６および１ｍＭ ＥＤＴＡで実施した。
【０１６６】
反応は下記の通り実施した：
システインのＨ２Ｏ溶液の１／４０容量を１ｍＭ ＰＥＧ溶液へ加え、終濃度３ｍＭとした。混合物を２５℃にて暗所で１０分間インキュベートし、その後ＤＴＮＢ滴定を実施した。ＤＴＮＢ滴定で、システインおよびＣｙｓ−ＭＡＬ−ＰＥＧ混合物を含む反応混合物の１／５０容量を、０．２〜０．３ｍＭ ＤＴＮＢを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３および１ｍＭ ＥＤＴＡへ加えた。残留システインの終濃度は０．０４〜０．０６ｍＭの間であった。
【０１６７】
４１２ｎｍでの吸光度を、２５℃にて５分間の平衡後に、１３，３００Ｍ−１ｃｍ−１をＤＴＮＢの吸光係数として用いて記録した。ＭＡＬ−ＰＥＧのベータ−メルカプトエチルアミンとの反応もまた調べた。ベータ−メルカプトエチルアミンは空気に敏感でありおよび吸湿性であるため、この反応は定量的でない。ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性は２４０から４００ｎｍの間のＵＶスキャンによって監視した。ＭＡＬ−ＰＥＧは３００ｎｍに最大吸収を有した。そのピークは、システインとの反応後または０．１ Ｎ ＮａＯＨの存在下で３７℃にて２時間加水分解後に消失した。
【０１６８】
ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性
ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性は、ｐＨ、温度、およびインキュベート時間に依存する。３００ｎｍでの吸光度の低下が１０％未満であれば安定とみなした。
【０１６９】
１ｍＭ ＭＡＬ−ＰＥＧは４℃にて少なくとも２４時間、試験したすべての緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ６、およびｐＨ７リン酸緩衝液）中で安定である。２５℃およびｐＨ５．０で、ＭＡＬ−ＰＥＧは３３時間安定である。したがって、好ましいＰＥＧ化条件は、ｐＨ５またはｐＨ６、２５℃２時間；または４℃２４時間；またはｐＨ５、２５℃２４時間である。
【０１７０】
システインとのＭａｌ−ＰＥＧ反応の特異性
システインとの反応は、反応ｐＨ（５、６、または７）および温度（４℃または２５℃）にかかわらず、２分未満で完了した。
【０１７１】
リジンとの反応（Ｌｙｓ：ＭＡＬ−ＰＥＧ＝１５：１）は、ｐＨ５およびｐＨ６緩衝液中の４℃または２５℃にての２４時間インキュベート中に観察されなかった。しかし、ｐＨ７、２５℃で、１０％を超えるＭＡＬ−ＰＥＧが２４時間のインキュベート中にリジンと反応した。ヒスチジンとの反応は、モル比１５：１（ヒスチジン：ＭＡＬ−ＰＥＧ）ｐＨ５、６、および７での４℃または２５℃にての２４時間インキュベート中にみられなかった。
【０１７２】
実施例４
ＳＣＡタンパク質のＰＥＧ化
４Ａ．材料および方法
ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０およびＧ−２５ ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７−１４０８−０１，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびＰｏｒｏｓ５０ミクロンＨＳメディア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ｍＰＥＧ−マレイミド化合物はＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ； ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）から購入したかまたはＥｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．にて合成した。
【０１７３】
この試験で使用したＰＥＧ−ＭＡＬポリマーは、４０ｋＤａ分枝鎖ＰＥＧ２、２０ｋＤａ直鎖ＰＥＧ、５ｋＤａ直鎖ＰＥＧ、２０ｋＤａビス−ＭＡＬ二官能性ＰＥＧ、および４０ｋＤａ分枝鎖Ｕ−ＰＥＧを含んだ。Ｎ−エチルマレイミドおよび６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはＳｉｇｍａから購入した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ（登録商標）はＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手した。 ＤＭＳＯ，（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｉｓｓｏｔａ）。ストレプトアビジン−フィコエリトリンはＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。９６ウェルマイクロタイタープレートはＭｉｄｗｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。
【０１７４】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼはＳｉｇｍａから、および ＴＭＢペルオキシダーゼ基質はＭｏｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）からであった。ＴＮＦ−αはＣｈｅｍｉｃｏｎ （Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。Ｔｉｔｒｉｓｏｌ（登録商標）ヨウ素溶液はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。
【０１７５】
４Ｂ．Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの還元
実施例３によって単離されたＳＣＡのＣ末端遊離システイン残基またはリンカーを、ＭＡＬ−ＰＥＧとの反応の前に還元した。還元溶液は、３ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８を含んだ。還元は３７℃にて２時間実施した。遊離ＤＴＴは１５ｍｌの試料についてはＨｉＰｒｅｐ（登録商標）脱塩カラムで、または４ｍｌの試料についてはＰＤ−１０で除去した。カラムは１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、２ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した。還元および脱塩後のＤ２Ｅ７ＳＣＡの回収率は８５％であった。ベータ−メルカプトエチルアミンおよびベータ−メルカプトエタノールを含む他の還元剤もまた、改変した手順での使用に成功した。スルフヒドリル基定量を、参照により本開示に含まれるＧｒａｓｓｅｔｔｉ ＤＲ ｅｔ ａｌ，１９６７，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ １１９： ４１−４９，および Ｒｉｄｄｌｅｓ ＰＷ ｅｔ ａｌ，１９７９，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９４： ７５−８１による記載通りに実施した。ＳＣＡ１当たり１のチオールのほぼ定量的な還元が達成された。
【０１７６】
４Ｃ．ＳＣＡのＰＥＧ化および精製
方法
実施例３によって単離されたＳＣＡタンパク質を、ＰＥＧマレイミド化合物とのシステイン特異的反応によってＰＥＧ化した。２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５を、ＰＥＧ−ＳＣＡ特徴づけの広範囲な試験のために選択した。これらのＳＣＡタンパク質に関して、５ｋＤａ、２０ｋＤａ、４０ｋＤａ（分枝鎖）およびビス−マレイミド化合物とのマレイミド−ＰＥＧ複合体を調べた。Ｎ−エチルマレイミドとのＳＣＡタンパク質の反応は、遊離チオールをブロックするが加わる分子量が最小である対照結合反応を提供した。他のＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質を、ＢＩＡｃｏｒｅ分析の項に列挙する通りの選択されたＰＥＧ−マレイミドポリマーを用いて修飾した。
【０１７７】
反応緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ還元ＳＣＡ、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、およびＰＥＧマレイミド化合物を、１０：１の反応モル比（ＰＥＧ：Ｄ２Ｅ７）で含んだ。反応は２５℃にて窒素中で２時間実施した。
【０１７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した複合体化の典型的な収率は８０％であった。未反応ＳＣＡ、高分子量不純物、遊離ＰＥＧ、副反応産物、およびエンドトキシンからのＰＥＧ−ＳＣＡの精製にＨＳカラムを用いた。より好ましくない方法では、ＳおよびＳＰカラムもまた使用に成功した。カラム平衡化緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含み、および溶出緩衝液は１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０から成った。遊離ＰＥＧは素通り画分に含まれた。ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体は、結合したＰＥＧをより多数有する複合体が先に溶出し、単一のポリマーが結合した複合体が続き、および最後に未反応Ｄ２Ｅ７ＳＣＡが、連続的に溶出した。異なるサイズのＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７複合体は、したがって、異なる濃度のＮａＣｌで溶出した。
【０１７９】
４Ｄ．Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの還元−結果要約
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中で作製されおよび 記載の通り精製されたＤ２Ｅ７ ＳＣＡは、ＭＡＬ−ＰＥＧ．との反応の前に還元しなければならない。
【０１８０】
濃度０．５ｍＭから５０ｍＭのＤＴＴを試験した。二量体を単量体に還元するためには０．５ｍＭが十分であることが示された。１０ｍＭより高濃度のＤＴＴはいくらかの沈澱を生じた。使用したＤＴＴの濃度が高いほど、沈澱したＤ２Ｅ７ ＳＣＡの量は多かった。沈澱は変性Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡと思われた。２ｍＭ ＤＴＴが標準的なＰＥＧ化手順に選択された。
【０１８１】
２ｍＭから１０ｍＭのベータ−メルカプトエチルアミン、グルタチオン、およびシステインもまた調べた。二量体を単量体へ還元するためには１０ｍＭより高い濃度が必要であったことが示された。
【０１８２】
０．５ｍＭのＤＴＴは、２−７−ＳＣ−２二量体から単量体への還元において、１０ｍＭの他の還元剤と同程度に効率的であった。
【０１８３】
還元後の複合体の収率は、開始時の還元ＳＣＡタンパク質の約８０％であった。
【０１８４】
４Ｅ．ＰＥＧ化−結果要約
１：１から１０：１（ＭＡＬ−ＰＥＧ：Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ）にわたる反応比をＰＥＧ化収率についてｐＨ６．０で調べた。複合体の公衆率を与えるためには、１：４の比が必要な最小限であった。
【０１８５】
１０分から２４時間の反応時間を２５℃にて、および１８時間４℃にて試験した。反応は２５℃では１０分間（試験した最短時間）で完了したことが示された。
【０１８６】
タンパク質の高濃度（例えば、１ｍｇ／ｍｌより大）は、収率が低下するため、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの遊離システイン残基のＭＡＬ−ＰＥＧとの反応には望ましくない。このことは、非特異的複数ＰＥＧ化のための最適手法とは対照的である。タンパク質濃度０．５、１．５、２．０、２．５、および３ｍｇ／ｍｌを試験した。０．２〜１ｍｇ／ｍｌのＤ２Ｅ７ ＳＣＡタンパク質が、複合体を構築するために好ましい濃度として用いられた。
【０１８７】
反応ｐＨ５〜８を調べた。ＰＥＧ化には、ｐＨ６．０を用いた。
【０１８８】
複合体化していないＤ２Ｅ７ＳＣＡは、再複合体化に再利用することができた。第２の複合体化反応からの収率は、最初のＤ２Ｅ７ ＳＣＡ ＰＥＧ化について得られた収率と同様であった。
【０１８９】
複合体化の最高収率は８５％であった。全体として、結果は、設計された１遊離チオール変異ＳＣＡタンパク質を用いた頑健な複合体化法によって、モノＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質が良好な収率で生じ得ることを実証した。
【０１９０】
４Ｆ．精製結果要約
ポリエーテルスルホン膜を用いた限外濾過は、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質の大部分が膜に吸着されて失われたため、このタンパク質およびその複合体の濃縮および緩衝液交換に用いることはできない。
【０１９１】
Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、およびＡｍｉｃｏｎといったＭｉｌｌｉｐｏｒｅ再生セルロース膜では本タンパク質の回収率１００％であった。０．２μｍ低タンパク質結合無菌フィルターではタンパク質の１０％損失があった。２段階の精製、２段階の濃縮、および１段階のろ過後の総収率は３０〜４０％であった。
【０１９２】
精製されたＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質はＳＤＳＰＡＧＥ分析に供し、およびクマシーブルー染色で可視化した（データ記載せず）。分析は、痕跡量（１％以下）の未反応ＳＣＡタンパク質が精製４０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧおよび２０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ反応物中に残存したことを示した。ＳＤＳＰＡＧＥゲルのヨウ素染色は、ポリエチレングリコール含有化合物を示すが、また精製４０ｋＤａＭＡＬ−ＰＥＧおよび２０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ反応物中に検出可能であった痕跡量（＜１％）の遊離ＰＥＧを明らかにした。
【０１９３】
４０ ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ 反応物はまた時々、痕跡量（~１％） の非常に高い分子量の ＰＥＧ不純物を示した。 非常に高い分子量範囲のポリマーはまた、開始材料の未反応４０ ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ ポリマー中にも検出可能であった。Ｎ−エチルマレイミド還元は、１個の遊離システインを有するＳＣＡ タンパク質における二量体形成を完全に遮断する。
【０１９４】
４Ｇ．イオン交換クロマトグラフィーによるエンドトキシンの除去
タンパク質試料中に存在するエンドトキシンを、ＤＥＡＥまたはＨＳカラムによって除去した。ｐＨ７〜８で、エンドトキシンはＤＥＡＥカラムに結合した一方、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡは素通り画分中に存在し、これに対してｐＨ５．０では、エンドトキシンは素通り画分中に存在しおよびＤ２Ｅ７ＳＣＡはＨＳカラムに結合した。ＨＳカラムはエンドトキシンをＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質から除去するのに用いられた。カラム平衡化緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含み、および溶出緩衝液は１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含んだ。精製試料中の典型的なエンドトキシン値は１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１９５】
実施例５
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの分析的特徴づけ。
【０１９６】
５Ａ．タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度はＵＶによって２８０ｎｍにて測定した。実施例３で得られたＳＣＡの吸光係数は１．２４ｍｌ／ｍｇ・ｃｍであった。濃度はまた、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からのＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質検定試薬キットとして入手したビシンコニン酸検定法（「ＢＣＡ」）によって、リゾチームまたはＦａｂを標準物質として使用して確認した。ＢＣＡ検定法は、取扱説明書に従って、および本質的に、参照により本開示に含まれるＳｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．１９８５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６−８５の方法に従って実施した。
【０１９７】
タンパク質濃度測定結果
２８０ｎｍでのＵＶ（データ記載せず）および、上記で考察した通り、ヒトＦａｂを標準物質として用いたＢＣＡは、タンパク質濃度測定において同様の結果を与えた。
【０１９８】
ＢＣＡ分析のために、ＥＤＴＡは還元後のＤＴＴと共に除去すべきであり、それはこれらの試薬は本検定法に干渉するからである。
【０１９９】
動物実験についてのすべての試料は、タンパク質含量に関してＵＶによって分析しおよびリゾチームを標準物質として用いてＢＣＡによって確認した。
【０２００】
５Ｂ．抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡポリクローナル抗体およびビオチン化抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体
抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体の精製
抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡ抗体をウサギで作製し、および、プロテインＡクロマトグラフィーおよびＤ２Ｅ７ＳＣＡ−結合アフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製した。プロテインＡカラム精製のために、抗体を２倍容量のトリス緩衝液で希釈して終濃度を０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０２％ＮａＮ３とした。希釈した試料を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０２％ＮａＮ３で平衡化した２ｍｌプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに、プロテインＡ樹脂に対して等量の抗血清として負荷した。
【０２０１】
抗２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡは５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて、１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０へ溶出した。抗体濃度は２８０ｎｍにて、吸光係数０．８ｍｌ／ｍｇ・ｃｍを用いて測定した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ−結合アフィニティカラムを、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質の遊離システイン残基とのＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌのカップリング反応によって作製した。具体的には、２倍容量の５０ｍＭリン酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を用いて洗浄した７ｍｌまでのＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ樹脂を、６．５ｍｌまでの１．４５ｍｇ／ｍｌ ２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡと２５℃にて１５分間混合した。カップリング反応を、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定することによって監視した。上清中のタンパク質濃度は８０％減少した。樹脂を３倍容量の５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．８、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、および次いで５０ｍＭシステインで４０分間処理した。試料を次いでカラムへ移し、および１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄し、および次にＰＢＳで洗浄した。プロテインＡカラムから精製した抗２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ抗体を、標準ＰＢＳで平衡化したＤ２Ｅ７ＳＣＡ−結合カラムに通した。カラムをＰＢＳでベースラインへ戻し、および抗体を、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０へ溶出した。
【０２０２】
ビオチン化抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体
試料中のグリシンおよびトリス成分を、５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムによって除去した。抗体溶液へ、１／１０容量の活性化ビオチン含有ＤＭＳＯを、反応モル比４０：１（ビオチン：抗体）で加えた。２５℃にて１時間後、ビオチン化抗体を、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣ１、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。
【０２０３】
５Ｃ．ウェスタンブロット
抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡウサギ抗血清を一次抗体として使用し、およびヤギ抗ウサギＨＲＰを二次抗体として使用した。結合はＴＭＢＭペルオキシダーゼ基質を用いて測定した。ウサギ抗血清はまた、合成１８残基２１８−リンカーペプチドに対してから以前も作製された。このリンカーを含むＳＣＡタンパク質との反応性もまた確立された。
【０２０４】
ウェスタンブロット結果
精製された調製物からのゲル上に示されたすべてのバンドはウェスタンブロット陽性であった。図７は、抗２−７−ＳＣ−１抗血清を用いて検出した、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物のウェスタン分析の一例を示す。一次検出抗体は、精製組換えＳＣＡタンパク質を用いて免疫されたウサギから作製された抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡウサギ抗血清であった。レーン１および７、分子量マーカー（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６および４ｋＤａ）；レーン２、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質；レーン３、エチル−２−７−ＳＣ−２；レーン４、ＰＥＧ（５ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン５、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン６、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２。
【０２０５】
血漿中の低濃度のために、単量体および二量体として存在する２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質がどのような比率かは動物実験で明らかにならなかった。しかし、Ｎ−エチルマレイミドで修飾された２−７−ＳＣ−２タンパク質のわずかにより速いクリアランスは、開始ＳＣＡタンパク質の一部が二量体であったことおよびより大きな質量または親和力のためにより遅いクリアランスを示したことを示唆する可能性があった。
【０２０６】
５Ｄ．純度分析
Ｎ−エチル−マレイミドで修飾された２−７−ＳＣ−２ＳＣＡは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで二量体を示さなかったため、二量体型は遊離システイン残基の架橋によって生じた。精製されたＰＥＧ−ＳＣＡ複合体は、典型的には、ヨード染色によって検出された通り本質的に遊離ＰＥＧを含まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出された通り１％未満の未修飾ＳＣＡおよび１％未満の高分子量分子を含んだ。
【０２０７】
５Ｅ．ヨード染色
ＳＤＳＰＡＧＥゲルをｄＨ２Ｏで洗浄し、および５％塩化バリウム溶液に入れた。１０分間緩やかに混合後、ゲルをＨ２Ｏで洗浄し、および次いで発色のために０．１Ｍ Ｔｉｔｒｉｓｏｌ（登録商標）ヨード溶液に入れた。
【０２０８】
５Ｆ．質量測定
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の正確な質量値はマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ」；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ ＯｍｎｉＦｌｅｘ ＮＴ）によって、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）マトリクス上の同様の分子量を有する内部標準物質を用いて測定した。ＳＣＡタンパク質の見かけの分子量（Ｓｔｏｋｅ半径）は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルろ過カラムクロマトグラフィー[Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、取扱説明書による]を用いて推定した
さらに、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分子量の分析を、適当なタンパク質およびＰＥＧ−タンパク質標準物質を用いて実施した。サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された、ＰＥＧ−４０ｋ−ＳＣＡの見かけの分子量は、６７０ｋＤａ、すなわち分子量の約１０倍であった。
【０２０９】
２−７−ＳＣ−２の分子量測定結果：
分子量測定結果を表４に示す。
【表４】
【０２１０】
４〜２０％ＳＤＳゲル上でのタンパク質サイズに対するＰＥＧサイズの相関はＹ＝０．００１５６Ｘであった。
【０２１１】
他のＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物は、その分子量およびポリマーサイズと合致する同等の質量値を示した。
【０２１２】
５Ｇ．Ｎ末端配列決定およびペプチドマッピング：
２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５のＮ末端配列決定は、分泌されたＳＣＡタンパク質のＮ末端アミノ酸がアラニンでありその後にＶＬの第１の残基が続くような、シグナル配列の予測されたプロセシングを確認した。
【０２１３】
２−７−ＳＣ−５−４０ｋＤａＰＥＧ上のペプチドマッピング
タンパク質（計０．２ｍｇ）を変性し、および、１ｍＭＥＤＴＡおよび５ｍＭＤＴＴを含む６ＭグアニジンＨＣｌ中で還元した。溶液を３７℃にて１時間インキュベートした。アルキル化試薬ヨードアセトアミドを終濃度１５ｍＭとなるように加え、および反応を室温にて１時間実施した。アルキル化後、β−メルカプトエタノールを４５ｍＭ（終濃度）となるように加えることによって過剰のヨードアセトアミドを不活性化し、および、溶液をＰＤ１０脱塩カラムに供した。アルキル化されたＰＥＧ−２−７−ＳＣ−５を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｍ１０を用いて濃縮し、および次いでＴＰＣＫ処理トリプシンによって、酵素対タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ）で用いて加水分解した。加水分解は６〜８時間、３７℃にて行わせ、およびその後、同量の新しいトリプシンを加えて一夜反応させた。加水分解されたタンパク質溶液をＳｐｅｅｄｖａｃによって乾燥し、およびＨＰＬＣ用水で再構成した。
【０２１４】
結果として得られたペプチド混合物をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）によってＨＰＬＣ用水を用いて分画した。画分を手作業で回収しおよびヨード溶液（２０ｍＭを含む５％ＢａＣＩ）を用いて染色するＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ポジティブ染色された画分を、逆相ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃｌ ８，２ｘ２５０ ｍｍ）によって、６０分間に５〜７０％のアセトニトリル勾配（０．０５％ＴＦＡを含む）を用いてさらに分離した。ピークを手作業で回収し、およびＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥した。ピークを１０μｌの水で再構成し、および５μｌをＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に採取した。ヨード染色ポジティブの画分（１つのみ、保持時間４０分まで）をアミノ酸シークエンサー分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供した。分析から得られた配列はＧ□ＴＳＧＳＧＫＰＧ（配列番号４１）であり、ここで空白の四角は修飾アミノ酸を表し、マレイミド−ＰＥＧ４０Ｋがシステイン（Ｎ末端Ａｌａ１から１１０位）へ正確に付加されていることを示す。
【０２１５】
５Ｈ．Ｄ２Ｅ７およびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７の安定性−結果
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体は凍結融解の１０サイクル後に安定であることが示された。未修飾の２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ（濃度１．１ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭトリス／グリシン緩衝液、ｐＨ７．０）の部分標本を−８０℃にて１５分間の凍結に供し、その後３７℃にて１０分間の融解を行った。凍結融解の操作を３、５、および１０サイクル実施し、および未修飾のＳＣＡの完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、および確立されたＴＮＦ感受性細胞レスキュー検定法によって分析した。ＳＣＡは非常に安定であることが見出され、およびポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色によって判定された通り分解を示すことなく少なくとも１０回の凍結融解サイクルに耐えられた（データ記載せず）。５回の凍結融解サイクルに際して、２−７−ＳＣ−２の生物活性に変化は無かった（ＩＣ５０：２２４．６ｎＭ）。
【０２１６】
本試験においてすべてのＤ２Ｅ７ＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質は、３０日間４℃にて２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で安定であることが見出された。２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質は、ｐＨ３〜１０、２５℃、１８時間インキュベートで安定であった。最大１．２Ｍまでの濃度のＮａＣｌは、２５℃にて２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の２−７−ＳＣ−２の活性または溶解度に影響しなかった。
【０２１７】
５Ｉ．抗原性
ＰＥＧ化Ｄ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質は、抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡポリクローナル抗体との結合効率に顕著な低下を示す。ＰＥＧ−ＳＣＡ２−７−ＳＣ−５は、ウェスタンブロットによって抗２１８抗血清を用いて分析した際、抗２１８ペプチドウサギ血清とわずかに反応性である。
【０２１８】
実施例６
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質のフローサイトメトリー分析
２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−４、２−７−ＳＣ−５についての細胞表面受容体結合検定法
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞株を用いて、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの存在下での細胞受容体へのＴＮＦ−α結合を分析した。ビオチンＴＮＦ−α（０．０４μｇ）をＤ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ（１〜４μｇ）と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中で２５℃にて３０分間、および次いで４℃にて１５分間振とうしながら予備インキュベートした。
【０２１９】
同時に、ビオチン化ダイズトリプシンインヒビター（０．０５μｇ）、ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ヒトＴＮＦ−α抗体（２０μｇ）、およびＣＣ４９ＳＣＡ（４μｇ）といった対照もまた、ビオチン−ＴＮＦ−α（０．０４μｇ）と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で予備インキュベートした。ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞は氷冷２０ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いて、３７℃にて２〜３分でフラスコから剥がした。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、および２０００ｒｐｍにて５分間遠沈した。細胞を次いで培地で１回、およびＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、および血球計算盤を用いて計数した。
【０２２０】
細胞をＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、終濃度２ｘ１０６細胞／ｍｌとした。細胞に使用した褐色エッペンドルフチューブすべてを、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて少なくとも１時間４℃にてブロックした。細胞受容体へのＴＮＦ−α結合に対するアクチノマイシンＤおよびＦｃブロック試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の作用については、細胞（１０５個）を０．０５μｇアクチノマイシンＤ／１ｘ１０６細胞または１μｇＦｃブロッキング／１ｘ１０６細胞と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で１５〜３０分間４℃にて予備インキュベートした。ＴＮＦ−αおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの混合物５０μｌに、５０μｌの１ｘ１０５ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を加えた。６０分間４℃にて暗所でのインキュベート後、細胞を遠沈し、および８０μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ストレプトアビジン−フィコエリトリンの全部を加えた。混合物を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をその後冷ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌで２回洗浄し、および分析のために０．３ｍｌＦＡＣＳ洗浄緩衝液に再懸濁した。
【０２２１】
フローサイトメトリー分析−結果
ビオチン化ダイズトリプシンインヒビター、ポリクローナルヤギ抗ヒトインターフェロン−αＩｇＧ、およびＣＣ４９ＳＣＡ（Ｅｎｚｏｎ）は結合を示さず、およびネガティブ対照の役割を果たした。細胞へのＦｃブロック試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアクチノマイシンＤを用いた予備インキュベートは、ＴＮＦ−α結合に対して効果が無かった。ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ複合体（エチル−、５ｋ、２０ｋまたは４０ｋＰＥＧ）は、１６：１（Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ：ＴＮＦ−α）より高いモル比で、細胞へのＴＮＦ−α結合を完全に消失させた。
【０２２２】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡのＴＮＦ−αに対するその同じモル比で、未修飾のＤ２Ｅ７ＳＣＡはまた細胞へのＴＮＦ−α結合を低下させたが完全にではなかった。したがって、この分析では、Ｄ２Ｅ７のＰＥＧ−ＳＣＡ型は未修飾のＳＣＡタンパク質よりも強力であった。
【０２２３】
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞上の受容体とのビオチン標識化ＴＮＦ−αの結合を妨げるこれらの化合物の能力のフローサイトメトリー分析における、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の代表的なデータを示す。これらのデータは、抗ＴＮＦ−αＰＥＧ−ＳＣＡ化合物が、細胞系における受容体へのこのサイトカインの結合の阻害において活性が高いことを示す。
【０２２４】
２−７−ＳＣ−２またはＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２の存在下での、細胞受容体へのＴＮＦ−α結合のフローサイトメトリー分析。１、蛍光標識化無しの細胞集団；２、ビオチン−ＴＮＦ−αとの、および次いでストレプトアビジン−フィコエリトリンとの結合後の細胞集団；および３、細胞受容体へのＴＮＦ−α結合に及ぼす２−７−ＳＣ−２（図６Ａ）、ＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２（図６Ｂ）、およびＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２（図６Ｃ）の作用。２−７−ＳＣ−２またはＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２のＴＮＦ−αに対するモル比は１６：１である。低い蛍光強度へのシフトは、細胞へのＴＮＦ−αの結合の減少を示す。
【０２２５】
実施例７
ＢＩＡＣＯＲＥ分析
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡとの組換えｈＴＮＦ−αの相互作用の動態分析
ＴＮＦ−αとＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびそのＰＥＧ化型との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって、ＢｉａＣｏｒｅＸ装置（ＢｉａＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて分析した。純度＞９７％の組換えヒトＴＮＦ−α（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、ＣＭ５チップ（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１０００−１４）上に、１０μｇ／ｍｌ溶液ｐＨ５．０（酢酸緩衝液、ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−５１）として固定化した。固定化した表面を酢酸緩衝液、ｐＨ４．５（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−５０）で３回洗浄し、および５００ ｎＭの未修飾ＳＣＡを用いる６サイクルのリガンド安定性分析に供した。
【０２２６】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡは分析対象となり、共にｐＨ４．５の酢酸は再生緩衝液となった。安定なＴＮＦ−α−結合表面上で、異なる濃度のＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡが結合（３分間）および解離（２分間または５分間）について調べられ、およびデータを動態パラメーター（例えば、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ＫＡ、およびＫＤ値）についてＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．０）を用いて分析した。ＨＢＳ−Ｎ（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−６９）を本手順における泳動緩衝液として使用した。
【０２２７】
固定化ｒｈＴＮＦ−αとＤ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡとの間の相互作用の動態分析
方法
ＴＮＦ−α
起源：Ｐｉｅｒｃｅ、組換え型、品番ＲＴＮＦＡ５０
ＭＷ：１７．４ｋＤ、１５７アミノ酸
純度：＞９７％
再構成：蒸留水（ＤＷ）中で１００μｇ／ｍｌの濃度へ。調製物中に添加物は存在しない
保存：−７０℃にて保存
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ：クローン２−７−ＳＣ−２
起源：Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、組換え型、Ｐｉｃｈｉａで発現
ＭＷ：２７ｋＤ、２１８リンカーを有する
純度：＞９０％
再構成：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中
保存：４．０℃にて保存
固定化：新しいＣＭ５チップを用いて
ＴＮＦ濃度：１０μｇ／ｍｌ、酢酸緩衝液ｐＨ５．０溶液のストックから直接希釈
流速：５．０μｌ／分
チャンネル：ＦＣ１〜２、１：１ＮＨＳ／ＥＤＣ混合物で３．０分活性化
チャンネル：ＦＣ２、１５μｌのＴＮＦを手動注入、１０μｇ／ｍｌ
（より低いＲＵを達成するために、より小さい容量を注入する）
チャンネル：ＦＣ１〜２、１Ｍメタノールアミン、ｐＨ８．５で３分間不活性化
チャンネル：ＦＣ１〜２、ＢＳＡ１μｇ／ｍｌを含むＨＢＳ−Ｎ緩衝液２５μｌを手動注入
チャンネル：ＦＣ１〜２、インジェクションポートを洗浄するため、１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５を１分間注入、１００μｌ／分
最終ＲＵ（応答単位）は１９９であった。
【０２２８】
ＣＭ５チップをＨＢＳＮ緩衝液で洗浄し、および少なくとも６サイクルの安定性について５００ｎＭ２−７−ＳＣ−２で試験した。ＣＭ５チップを次いで動態分析に用いた。
【０２２９】
Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２の動態分析
２−７−ＳＣ−２の濃度：注入直前にＨＢＳ−Ｎで希釈
２．９８ｇ／ｍｌ（１０８０ｎＭ）
１．４９μｇ／ｍｌ（５４０ｎＭ）
０．７４５μｇ／ｍｌ（２７０ｎＭ）
０．３７２５μｇ／ｍｌ（１３５ｎＭ）
０．１８６μｇ／ｍｌ（６７．５ｎＭ）
９３ｎｇ／ｍｌ（３３．７５ｎＭ）
４６．５ｎｇ／ｍｌ（１６．８７５ｎＭ）
２３．２８ｎｇ／ｍｌ（８．４３７５ｎＭ）
０ｇ／ｍｌ（０ｎＭ）
流速：２５μｌ／分（注：３０μｌ／分は２０および２５ｌ／分と同様の結合を結果として生じた）
結合期間：３分間
解離期間：２分間および５分間
再生緩衝液：１０ｍＭ酢酸，ｐＨ４．５
再生は２段階で実施し、洗浄１回目として１００μｌ／分で１００μｌ洗浄および４０
洗浄１回目の後にチップに残ったＲＵに応じて、洗浄２回目として１００μｌ／分で８０μｌ洗浄。
【０２３０】
データ分析
２分子結合反応について結合および解離動態曲線を、質量移動限界と適合するおよびしない１： １ 結合 を用いて分析した。質量移動パラメーターを含めることによって導体の顕著な改善は達成されず、本実験において質量移動現象は有力でなかったことを示した。
【０２３１】
２−７−ＳＣ−４およびＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−４をこの目的のために調製した。
【０２３２】
ＦＡＣＳ結果は、ＳＣＡ ｈｉｓ−タグ部分の有無でＴＮＦ−αへのＤ２Ｅ７／ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ結合に差は無かったことを、独立して示した。
【０２３３】
Ｂｉａｃｏｒｅおよび細胞レスキュー試験からの結果はまた、ｈｉｓ−タグ部分は抗原およびＳＣＡの結合現象の原因でないことを確認した。
【０２３４】
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−２の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表５は、異なる型の２−７−ＳＣ−２ＳＣＡのｋａ（ｋｏｎ）、ｋｄ（ｋｏｆｆ）、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表５】
【０２３５】
上記の表５は、ＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質がリガンドに対する高い親和性を維持することを確認する。しかし、異なるＰＥＧ−ＳＣＡ設計分子はｏｎ速度およびｏｆｆ速度に差を示す。特に、２−７−ＳＣ−２の４０ｋＤａＰＥＧ型は、親ＳＣＡと比較した際に顕著に減少したｏｎ速度としかし保たれたｏｆｆ速度を有する。これは、ＢＩＡＣｏｒｅチップ上のこの人工結合環境における、大きくおよび可塑性であるＰＥＧポリマーによる立体障害作用を反映する可能性がある。対照的に、本研究で別に記載する細胞系検定法は、未修飾のおよび４０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質について同様の結合効力を示した。
【０２３６】
ＰＥＧ化によるｏｎ速度およびｏｆｆ速度動揺における特異的な傾向は、複合体化タンパク質に関してポリマーの化合物特異的な立体構造または配置を明らかにする可能性がある。追加の下記のＰＥＧ−ＳＣＡ化合物についてのさらなる試験はこの可能性を強調する。２−７−ＳＣ−４−４０ｋＤａ−ＰＥＧデータは、ＰＥＧポリマーのＣ末端への直接の配置は実質的にｏｆｆ速度を改善したことを示す。この試験で開示された通りの、ＳＣＡシステイン配置およびＰＥＧポリマー質量の規定のパラメーターを用いた戦略は、任意の個別のＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質複合体について結合および活性特性の最適化を可能にする。
【０２３７】
２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７のｒｈＴＮＦへの結合動態
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表は、異なる型の２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７のｋａ、ｋｄ、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表６】
【表７Ａ】
【表７Ｂ】
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−３／２−７−ＳＣ−７の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表は、異なる型の２−７−ＳＣ−３および２−７−ＳＣ−７のｋａ、ｋｄ、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表８Ａ】
【表８Ｂ】
実施例８
ＴＮＦ−α細胞毒性の中和の検定
ＴＮＦ−α細胞毒性の中和の細胞系検定法を下記の通り実施した。
【０２３８】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１４８）はアクチノマイシンＤの存在下でＴＮＦ−αに対してより感受性が高く、および検定に用いられた。
【０２３９】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞にて播種し、および一夜３７℃にて加湿インキュベーター内で５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２４０】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質およびそのＰＥＧ化型の、ある範囲の濃度を、９６ウェルプレート中の播種された細胞へ、培地中の１０ｇ／ｍｌから２．５ｎｇ／ｍｌの段階希釈で加えた。
【０２４１】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ化合物の添加の直後に、ｒｈＴＮＦ−α（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルへ１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。細胞を次いで２４時間増殖させ、および細胞の生存を、１５μｌのＭＩＴ色素試薬（品番Ｇ４０００，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ [Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ]）（３−（４，５，ジメチルチアゾール２イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）の添加によって取扱説明書に従って判定した。細胞レスキューの分析は、Ｄ２Ｅ７処理細胞の生存度を未処理細胞と、ＴＮＦ−αの存在下で比較することによって実施した。
【０２４２】
対照ウェルは、未処理細胞、およびＴＮＦ−αだけで処理した細胞から成った。対照ウェルの細胞は、生存度の完全な消失を示した。実験ウェル中の生存細胞（またはレスキューされた細胞）の割合をＤ２Ｅ７濃度の対数に対してプロットし、およびデータの各セットについてＩＣ５０値を決定した。それぞれの値は３連の実験セットに由来した。
【０２４３】
ＴＮＦ−α致死性からのＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質による細胞レスキュー
後掲の表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに列記されたもののような抗ＴＮＦ−α ＳＣＡタンパク質の、細胞をＴＮＦ−αのネガティブな作用から保護する能力は、ＴＮＦ−α感受性細胞株を使用し、およびその細胞を、ＳＣＡタンパク質２−７−ＳＣ−２と共にまたはそれ無しで、ＴＮＦ−αと接触させることによって確認された。結果は、実施例１によって調製された他のＳＣＡタンパク質を用いて実施された別の試験と合致した。
【０２４４】
材料および方法
細胞株：ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１４８、マウス細胞株
増殖：２ｍＭ Ｇ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
凍結保存用試薬：培地９５％およびＤＭＳＯ５％。
【０２４５】
測定方法
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞をトリプシン処理しおよび９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に播種し、および１２時間、３７℃にて５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で定着させた。
【０２４６】
細胞をＰＢＳで洗浄し、および各ウェルに新しい培地を加えた。後掲の表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに列記されたものを含む、さまざまなＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびそのＰＥＧ化型をウェルに加えた。ＳＣＡは１０μｇ／ｍｌから２．５ｎｇ／ｍｌまで段階希釈した（完全ＲＰＭＩ培地で希釈）。対照細胞にはＤ２Ｅ７を加えなかった。
【０２４７】
Ｄ２Ｅ７化合物の添加直後に、組換えｈＴＮＦ−α（１．０ｎｇ／ｍｌ、完全培地でないＲＰＭＩ培地で希釈）を各ウェルに加えた。未処理の対照細胞にはＴＮＦ−αを加えなかった。
【０２４８】
細胞を２４時間、３７℃にて５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。インキュベート期間の終了時に、１５μｌのＭＴＴ染色試薬（品番Ｇ４０００，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を各ウェルに加え、および、停止溶液を各ウェルに加えるまで、プレートを４時間３７℃にてインキュベートした。各ウェルの内容物をよく混合し、および結晶を一夜室温にて溶解させた。
【０２４９】
プレートを５７０ｎｍおよび６３０ｎｍにて９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取り、および吸光度単位における差（細胞生存度の指標）を、ＴＮＦ−α細胞毒性に対して細胞をレスキューするために用いたＤ２Ｅ７化合物の濃度に対してプロットした。
【０２５０】
５０％の細胞がレスキューされたＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質濃度を、ｌｏｇ[Ｄ２Ｅ７]をＸ軸および％レスキューをＹ軸パラメーターとして用いた生存度グラフから、実験の各セットについて決定した。
【０２５１】
２５℃、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡでのＭａｌ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）ポリマーの安定性を、２２０ｎｍから４００ｎｍまで０、２、４、２２、および３３時間のＵＶ吸収スキャンによって調べた。３３時間後２５℃にて、３ｍＭシステインを加え、および混合物を５分間インキュベート後にスキャンした。時間依存性３００ｎｍの特徴的なピークの時間依存的な変換が定量された。
【０２５２】
注：ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞はＴＮＦ−αおよびリン補トキシンに対して、Ｌ９２９（ＡＴＣＣＣＣＬ−１）よりも感受性が高い。アクチノマイシンＤの非存在下ではこれらの細胞はＴＮＦに対する感受性を３０日以内に失う。また、アクチノマイシンＤの添加はＤ２Ｅ７化合物による細胞のレスキューに有害であることが見出された。
【０２５３】
未修飾の２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−２−ＮＥ−マレイミド、ＳＫ、２０Ｋ、および４０ＫＰＥＧ化２−７−ＳＣ−２を、細胞をＴＮＦ媒介性死滅からレスキューする能力について分析した。表９Ａは２−７−ＳＣ−２の各型についてＩＣ５０値（５０％のＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を１．０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦによる死滅からレスキューする）を提供する。
【表９Ａ】
【表９Ｂ】
【表９Ｃ】
これらのデータは、Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの設計されたＰＥＧ化型が、サイトカインＴＮＦ−αの結合および中和における同様の生物活性をこの細胞系検定において示すことを確認する。ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物は、したがって、このサイトカインを効果的に中和しおよびこれらの細胞上のＴＮＦ−α受容体へのその結合を妨げることができる。
【０２５４】
実施例９
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの薬物動態
試験手順：ＩＣＲマウスにおけるＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の薬物動態。
【０２５５】
試験目的
本試験は、ＳＣＡＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５）、および、ＰＥＧ（５ｋｄ）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）およびＰＥＧ（４３ｋｄ）複合体を含むＰＥＧ化型の、ＩＣＲマウスにおける血漿薬物動態を調べるために設計された。
【０２５６】
被験物質（投与前−２０℃保存）
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（１００％活性ｗ／ｗ）
ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（５７．４％活性ｗ／ｗ）
ＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（３８．６％活性ｗ／ｗ）。
【０２５７】
試験システム
種：ＩＣＲ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｈａｒｌａｎ）マウス
週齢：７〜８週
性別：雌
体重：開始時体重範囲：約２５ｇ。
【０２５８】
動物管理：
マウスはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （「ＵＭＤＮＪ」）動物施設で飼育箱にケージ当たり５個体を飼育した。ケージは"Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ"，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに準拠したサイズとした。汚物は少なくとも週２回除去した。ケージには試験、被験物質、動物数、性別、および用量レベルを示すケージカードを明瞭に標示した。動物は試験開始前１週間にわたって順化した。
【０２５９】
飼料
マウスは水道水および市販の実験動物飼料を自由摂取させた。
【０２６０】
試料調製
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５５６ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７に希釈した；
ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５０３ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７当量に希釈した；
ＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５４１ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７当量に希釈した；
リン酸緩衝生理食塩水；１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５。
【０２６１】
投与部位
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、およびＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）複合体は単回投与（１日目）として尾静脈から静脈投与した。
【０２６２】
実験計画
５４個体のマウスは下記の表１０の図式に従って割付、投与および採血した。
【表１０】
【０２６３】
未処理対照血清の採取のため、２個体の未処理マウスを心臓穿刺によりＥＤＴＡ入り試験管へ採血した。
【０２６４】
マウスに個体当たり２００μＬのＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）、個体当たり１８０μＬのＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）、および個体当たり１９０μＬのＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）複合体を静脈注射した。０．０９％アベルチンを用いて鎮静後、マウスを後眼窩洞からＥＤＴＡ入りバイアルへ採血した。２分、１５分、３０分および１時間にマウスを１００μＬ採血し、および３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間にマウスを心臓穿刺により〜１０００μＬ採血して死亡させた。血液の遠心分離後に血漿を回収し、およびドライアイス上で−８０℃にて直ちに凍結させた。
【０２６５】
血漿試料を融解し、およびＤ２Ｅ７化合物の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。データをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを用いてモデル化してＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、およびＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）薬物動態パラメーターを決定した。
【０２６６】
臨床試験：マウスは受領時に目視検査した。臨床的異常の徴候に関する詳細な身体診察は、過剰な取り扱いを避けるために、目視評価に従って必要な場合のみに実施した。マウスを被験物質の輸液後に毎日１回、死亡および処置に対する反応の徴候に関して目視検査した。死亡および臨床徴候はすべて記録した。状況に応じて、より頻回の検査を実施した。
【０２６７】
動物管理規定：本試験は動物福祉に関する現行ガイドライン（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６−２３，１９８５）に準拠して実施した。
【０２６８】
マウスにおけるＤ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体の薬物動態：Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
試料調製
試験したＳＣＡの直線範囲は０．２ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間であった。直線範囲内のタンパク質濃度ｎｇ／ｍｌおよび光学測定値を分析に用いた。
【０２６９】
標準ＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡを、分析した血漿試料と同様の希釈係数となるように血漿で希釈したか、または直接に希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈した。手順を簡略化するため、標準品を血漿試料分析用の希釈緩衝液で希釈した。静脈または皮下投与による投与量は４．５ｍｇ／ｋｇであった。静脈投与による血漿試料に関する希釈係数は、０．０３〜３時間の試料について５００、およびＳＣＡの６〜９６時間試料について１０、ＰＥＧ−５ｋ−ＳＣＡの０．０３〜２４時間試料について５００および４〜９６時間試料について１０、ＰＥＧ−２０ｋ−ＳＣＡの０．０３３〜６時間試料について８００および２４〜９６時間試料について１００、およびＰＥＧ−４０ｋ−ＳＣＡのすべての試料について８００であった。皮下投与による血漿試料の希釈係数は、ＳＣＡのすべての試料について２００、およびＰＥＧ（２０ｋ）−ＳＣＡ．のすべての試料について３００であった。
【０２７０】
ＥＬＩＳＡ手順
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の血漿濃度を測定した。試料は抗体によって検出された規定の組成物に関して測定した。捕捉抗体は、プロテインＡおよびＤ２Ｅ７−結合アフィニティカラムによって精製したポリクローナル抗Ｄ２Ｅ７抗体であった。ＴＮＦ−αへの結合のために、プレートをＴＮＦ−αでコーティングした。一次および二次抗体はそれぞれ、ビオチン化抗Ｄ２Ｅ７抗体およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼであった。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４００ｎｇ／ウェルの抗Ｄ２Ｅ７抗体またはＴＮＦ−αを含む５０μｌの５０ｍＭ重炭酸ナトリウムで２５℃にて一夜コーティングした。同時に、試料希釈のために、Ｎｕｎｃマイクロウェルプレートまたはタンパク質の吸収が最小である任意の標準９６−ウェルプレートを、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、５％スクロース、および０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて４℃にて一夜ブロッキングした。翌日、コーティング溶液およびブロッキング溶液をＥＬＩＳＡおよびＮｕｎｃプレートの両方からアスピレーターを用いて除去した。ＥＬＩＳＡプレートはブロッキング溶液（２５０ｕｌ／ウェル）を用いて少なくとも１時間２５℃にてブロッキングし、およびＮｕｎｃプレートは、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄したかまたは２５℃にて風乾させおよび以降の分析のために４℃にて保存した。ブロッキング溶液を除去後のＥＬＩＳＡプレートは洗浄緩衝液を用いて３回洗浄したかまたは２５℃にて風乾させおよび以降の使用のために４℃にて密封して保存した。血漿試料はＮｕｎｃプレートの上から下へ連続的に１：２希釈し、各ウェルに１２０μｌを残した。希釈緩衝液を用いた前希釈後に、１００μｌの試料をＥＬＩＳＡプレートへ移し、および４℃にて一夜インキュベートした。試料溶液を除去しおよびプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄後、２０ｎｇビオチン抗Ｄ２Ｅ７抗体を含む５０μｌの希釈緩衝液を各ウェルに加えた。試料は２５℃にて２時間インキュベートした。一次抗体を除去しおよびプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した後、１００−ｕｌストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを１：１６、０００希釈で加えた。プレートを２５℃にて１時間インキュベートした。溶液を除去しおよびプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した１００μｌのＴＭＢＥ基質を添加後１０〜２０分で発色し、および５０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止した。４５０ｎｍでの吸高度を記録した。
【０２７１】
データ取り込みおよび分析
データはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで取り込みおよび分析した。標準曲線は、標準物質の濃度に対する４５０ｎｍでのエンドポイントの光学密度をプロットすることにより、および０．９９以上の相関係数を有する最適な曲線を描くことによって得た。すべての未知試料濃度は、希釈係数を組み込んだ後に標準曲線から計算した。適当な光学密度を有するすべてのデータ点の最も近い数がその結果のために平均されている。
【０２７２】
マウスにおけるＤ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体の薬物動態
すべての２−７−ＳＣ−２系（２−７−ＳＣ−２、エチル−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−５ｋ−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−２）についてのＰＫパラメーターを決定した。２−７−ＳＣ−５、ＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−５、およびＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−５についてのＰＫパラメーターを決定した。２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−２についての皮下注射によるＰＫパラメーターもまた決定した。
【０２７３】
予備実験から、抗２１８リンカーを用いた２−７−ＳＣ−２のより低い検出感度（５０ｎｇ／ｍｌ）が観察された。マウスにおける循環半減期の約１００倍の延長が、４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）において、未修飾ＳＣＡタンパク質と比較した際に観察された。
【０２７４】
下記の表１１は、静脈注射（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射によって投与された２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５、ＰＥＧ−２−７−ＳＣ−５について決定された薬物動態パラメーターを示す。
【表１１】
【０２７５】
これらの結果は、ＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質の循環寿命を、治療上有用な薬物動態の範囲にわたるように設計できることを実証する。４０ｋＤａＰＥＧ結合ＳＣＡにおける血清半減期の２ｌｏｇの延長は、これらの化合物を完全なモノクローナル抗体の薬物動態範囲に置く。抗原結合部位から離れた独特の部位でのＰＥＧポリマーの部位特異的結合は、活性な抗原結合タンパク質の製造だけでなく、ランダムなアミン化学を用いたＳＣＡタンパク質ＰＥＧ化の相当な不均一性とは対照的な、組成が相対的に均一な製品の製造もまた可能にする。２０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質と比較した際の本試験の４０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質の循環寿命の大差は、いくぶん意外であった。約２０ｋＤａＰＥＧでの薬物動態のプラトーの証拠があったランダムＰＥＧ化（ＣＣ４９）ＳＣＡタンパク質の我々の結果に基づき、１２ｋＤａＰＥＧは同等の循環寿命を示したため、我々はこれを予測しなかった。
【０２７６】
本発明がどのように作用し得るかに関してはいずれの理論または仮説にも拘束されない一方、４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の大幅に延長された循環寿命にも寄与するのは分枝鎖構造であると考えられている。特に興味深いのは、ＰＥＧ−ＳＣＡ（２０ｋＤａＰＥＧ）の皮下注射での使用における成功である。この投与経路は、静脈投与よりも顕著に良好なＡＵＣ値を与えた。皮下経路は、ＰＥＧ−ＳＣＡ治療薬の処方のために最終的に好ましい可能性がある。ＳＣＡへのＰＥＧのリンカー結合は成功し、Ｃ末端ＰＥＧ結合についての動物実験に劣らなかった。おそらく、ＰＥＧのリンカー結合はまた、ＳＣＡ安定性の増大および、抗原性および／またはタンパク質分解の低下にも寄与し得る。
【０２７７】
実施例１０
ビス−マレイミド−ＰＥＧを介する二量体Ｄ２Ｅ７ＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質
ポリマー１個当たりＳＣＡタンパク質２個を有する２価ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を作製するために、ビス−マレイミド−ＰＥＧポリマーを使用した。これらは活性化マレイミド基をポリマーの両端に有する。ＳＤＳＰＡＧＥ分析は、ＳＣＡ−ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を本開示の方法を用いて合成できたことを実証した。反応ｐＨおよび反応モル比の影響はそれぞれ表１２および表１３に示す。
【表１２】
【０２７８】
データは４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについてのゲル画像分析によって得られた。ビス−ｍａｌ−ＰＥＧ（２０ｋ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６に溶解して濃度３．７ｍｇ／ｍｌとした。それを次いで１ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６および１ｍＭ ＥＤＴＡへ、Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２の１／３０から１／１０容量を徐々に加え、および反応モル比を示した。反応は２５℃にて窒素中で１．５時間実施した。
【表１３】
【０２７９】
反応は、１ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２および０．１２ｍｇ／ｍｌビス−ｍａｌ−ＰＥＧ化合物を０．１６５：１（ビス−ｍａｌ−ＰＥＧ：２−７−ＳＣ−２）の反応モル比で含む１００ｍＭリン酸ナトリウムを、表記のｐＨで含んだ。反応は２５℃にて窒素中で２時間実施した。試料は４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、および各化合物の相当するバンドを定量した。高分子量不純物は１％未満であり、および２−７−ＳＣ−２の二量体は５％未満であった。
【０２８０】
実施例１１
マウスにおける抗ＴＮＦ−α活性の確認
本実施例は、参照により本開示に含まれるＧａｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７６： ５９３９−５９４３に記載された通り、ＴＮＦ−α曝露に基づく標準動物モデルにおいて、ＴＮＦ−αによって促された炎症カスケードの中和（予防）における、ＰＥＧ化抗腫瘍壊死因子−α一本鎖抗体（Ｐｅｇ−抗ＴＮＦ−α ＳＣＡ）、未修飾抗ＴＮＦ−α ＳＣＡ、およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）（完全なＤ２Ｅ７）抗ＴＮＦ−α抗体の抗力を確認した。
【０２８１】
要約すると、ＴＮＦ−αをＤ−ガラクトサミン（ＮＧａｌ）感作マウスへ腹腔内経路（ｉ．ｐ．）で注射することにより、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてエンドトキシン血症が誘導された。要約すると、マウスを組換えヒトＴＮＦ−α（１．０μｇ／個体）およびＮ−ガラクトサミン（２０ｍｇ／個体）の組合せに曝露する３０分前に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに異なる用量の未修飾ＳＣＡ、ＰＥＧ−ＳＣＡ、およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）をｉ．ｐ．注射した。生存したマウスを２４時間後に安楽死させた。
【０２８２】
ＮＧａｌおよびＴＮＦの同時注射は、ほぼすべての動物に２４時間以内に致死を生じた。１マイクログラムのＴＮＦおよび２０ｍｇのＮｇａｌの腹腔内（「ＩＰ」）投与の３０分前に、さまざまな用量のＤ２Ｅ７ＭＡｂ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、ＴＮＦを中和するＭａｂ、または２０または４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を投与した。Ｅ２Ｅ７ＭＡｂおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の両方で処理したマウスは、同等の用量で比較的高い生存率を示した。
【０２８３】
材料および方法
供試動物は雌Ｃ５７Ｂ１／６（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｈａｒｌａｎ）マウス、７〜８週齢、開始時に体重約２５ｇであった。マウスは水道水および市販の実験用飼料の自由摂取で維持された。ＴＮＦ−αによる曝露に対する保護的性質について試験した物質は、上述の通り調製した２−７−ＳＣ−５未修飾ＳＣＡ；２−７−ＳＣ−５−２０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡ；２−７−ＳＣ−５−４３Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡ、および未修飾ｄ２Ｅ７ＭＡｂ（Ａｂｂｏｔｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩｌｌｉｎｏｉｓからのＨｕｍｉｒａ（登録商標））であった。対照はリン酸緩衝溶液（「ＰＢＳ」）であった。物質は単回腹腔内（「ＩＰ」）注射によって投与した。
【０２８４】
マウス１２６個体を下記の手順書に従って割り付けた：
【表１４】
【０２８５】
少なくとも１週間の順化後、マウスに上記に示した指定の処置をｉ．ｐ．注射した。この注射（ｔ＝０）の３０分後、マウスに指定の刺激物質をｉ．ｐ．曝露した。（マウスは１．０μｇ／個体の組換えＴＮＦ−αを含む５０μｌ ＰＢＳおよび／または２０ｍｇ／個体のＤ−ガラクトサミンを含む２００μｌ ＰＢＳを投与された。）
上記の実験を、その後同一の手順を用いて、しかしより高用量の被験化合物を用いて繰り返した：２−７−ＳＣ−５−２０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡおよび２−７−ＳＣ−５−４０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡのそれぞれについて１個体当たり０．１２５ｇ、０．６２５μｇ、２．５ｇおよび１０．０ｇ。非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡを２０μｇで試験し、および完全なＤ２Ｅ５（Ｈｕｍｉｒａ）を０．６２５ｇ／個体で試験した。
【０２８６】
結果
％生存データを化合物の用量に対してプロットした（データ記載せず）。ＴＮＦ−αに曝露されたマウスに少なくとも７０％保護を与える化合物の用量を効力比較のベースラインと考えた。同一の用量（０．６２５ｇ／動物）のＨｕｍｉｒａ（登録商標）およびＰＥＧ−ＳＣＡ（２０ｋ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳＣＡの両方）が、ＴＮＦに誘導される致死からマウスを保護した。しかし、これらのマウスで同様のレベルの保護を達成するためには、より高用量の、未修飾の非複合体化ＳＣＡ（２０μｇ／動物すなわち約８００μｇ／ｋｇ）が必要であった。モル比では、完全長抗体と同等の生存の等価を達成するためには、約３倍過剰の２０−または４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳＣＡが必要であることを、得られたデータは実証した。一方、ＴＮＦに誘導される致死に対する同様の保護を達成するためには１００倍モル過剰の未修飾ＳＣＡが必要であった。これらのデータは、ＰＥＧによるＤ２Ｅ７ＳＣＡの修飾は、血漿中のタンパク質の循環半減期を増大させることによって、未修飾のタンパク質に対して明らかな長所を提供することを示唆する。
【０２８７】
供試動物は平均して約２５グラムであったため、０．６２５μｇ／個体は約２５μｇ／ｋｇの用量に相当し、および１０μｇ／個体は約４００μｇ／ｋｇに相当する。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】図１Ａは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＣｙｓムテインを持たないＳＣＡ２−７−ＳＣ−１をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号１）、および発現されたタンパク質（配列番号１０）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−２をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号２）、および発現されたタンパク質（配列番号１１）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、構造ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬ−ｈｉｓ６を有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−３をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号３）、および発現されたタンパク質（配列番号１２）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨを有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−４をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号４）、および発現されたタンパク質（配列番号１３）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー２位にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−５をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号５）、および発現されたタンパク質（配列番号１４）を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー２位にＣｙｓおよびＣ末端にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−６をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号６）、および発現されたタンパク質（配列番号１５）を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、構造ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー５位にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−７をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号７）、および発現されたタンパク質（配列番号１６）を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＮ末端およびＣ末端の両方にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−８をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号８）、および発現されたタンパク質（配列番号１７）を示す。
【図１Ｉ】図１−Ｉは、構造ＶＬ−ＧＧＧＧＳ−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつ遊離のＣｙｓを持たないＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−９をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号９）、および発現されたタンパク質（配列番号１８）を示す。
【図２】図２Ａはクローン２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ発現を示す。ＳＣＡタンパク質の発現は、１％メタノールすなわちＭｅＯＨによってＰｉｃｈｉａ培養で誘導した。２７ｋＤａを矢印（「→」）で示す。 図２Ｂは、クローン２−７−ＳＣ−２についての、画分のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析、および各工程の収率を含む、発現および精製データを示す。少量の５４ｋＤａ以下のジスルフィド結合二量体を染色ゲルに見ることができる。図注：ＳＴＤ、Ｍａｒｋ１２タンパク質分子量標準物質；ＳＵＰ、発酵採取物上清；ＤＩＡ、ダイアフィルトレーション上清；ＤＥＡＥ、第１のＤＥＡＥクロマトグラフィー非吸着画分；Ｎｉ＋＋、ニッケル親和性クロマトグラフィー後の溶出試料；ＤＥＡＥ、第２のＤＥＡＥクロマトグラフィー。ピークは、矢印（「→」）で示す通り、約２７ｋＤａに見ることができる。
【図３Ａ】図３ＡはｍＰＥＧ−ＭＡＬの構造を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）の構造を示す。
【図３Ｃ】図３ＣはｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２の構造を示す。
【図３Ｄ】図３ＤはｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）２の構造を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅはチオール−ＳＣＡと活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとの反応を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆはビニルスルホン活性ＰＥＧを示す。
【図４】図４は、２００から４００ｎｍの間の波長に対する吸収のスペクトルプロットである。曲線Ａはシステイン、３ｍＭである；曲線ＢはＰＥＧ−ＭＡＬ（１ｍＭ）＋システイン（３ｍＭ）反応後である；および曲線ＣはＰＥＧ−ＭＡＬ １ｍＭである。
【図５】図５Ａは、ブリリアントブルー染色によって可視化した２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−５複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はＭＡＲＫ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）タンパク質サイズ標準物質を提供し、レーン２は非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、レーン３はＰＥＧ（２０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、およびレーン４はＰＥＧ（４０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡである。 図５Ｂは、ヨード染色によって可視化した２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−５複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はＭＡＲＫ１２タンパク質サイズ標準物質を提供し、レーン２は非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、レーン３はＰＥＧ（２０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、およびレーン４はＰＥＧ（４０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡである。
【図６Ａ】図６Ａは、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ（２０Ｋ）ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＰＥＧ−ＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ（４０Ｋ）ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＰＥＧ−ＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図７】図７は、Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ誘導体のウェスタンブロット分析を示す。一次検出抗体は、精製組換えＳＣＡタンパク質で免疫したウサギから調製した抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡウサギ抗血清であった。レーン１および７、分子量マーカー（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６および４ｋＤａ）；レーン２、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質；レーン３、エチル−２−７−ＳＣ−２；レーン４、ＰＥＧ（５ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン５、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン６、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２。
【図８】図８は、Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ化型のバンドのスキャン画像濃度を示し、組換えＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体とのこの抗Ｄ２Ｅ７抗血清の反応性を確認する。バンドＡは２−７−ＳＣ−２であり、バンドＢは２−７−ＳＣ−５であり、バンドＣはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＤはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−５であり、バンドＥはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＦはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−５である。
【図９】図９は、薬物動態試験のための代表的な一連の試料のＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質および２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ−ＳＣＡ複合体はクマシーブルー染色ゲル上で調べた。左側のゲル上で、付加した試料は非還元であった。右側のゲル上で、試料は負荷前に３ｍＭベータ−メルカプトエタノールで還元しおよび８５℃へ２分間加熱した。約１０マイクログラムのタンパク質を各レーンに負荷した。図注：ＭＭ−分子量標準物質；レーン１、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ；レーン２、Ｎ−エチルマレイミドで修飾した２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ；レーン３、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）；レーン４、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドへのポリマーの部位特異的共有結合を促進する部位特異的修飾を有する１価および多価一本鎖抗原結合ポリペプチドに関する。本発明は、そのような修飾一本鎖抗原結合ポリペプチド、それをコードするベクターおよび宿主細胞、ならびにそのポリペプチドを作製および使用する方法を提供する。本発明はまた、新規でかつ改良されたプロドラッグを提供するための、修飾一本鎖抗原結合ポリペプチドとポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）といったポリマーとの複合体、ならびにそのような複合体を作製および使用する方法を提供する。
【０００２】
関連分野の説明
天然に存在する抗体は、１以上の特定物質すなわち抗原が動物の免疫細胞によって外来物と認識されたときに、それら抗原の存在に応答して、哺乳類を含む脊椎動物の免疫系によって産生される免疫グロブリンである。ヒトでは、特異的抗原を選択的に認識しおよび差別的に結合する能力を有する５つのクラスの抗体が存在する。各抗体クラスは同一の基本構造または複数のその構造を有する。基本単位は、重鎖またはＨ鎖（ＩｇＧで分子量各約５０，０００ダルトン）と呼ばれる２個の同一のポリペプチドおよび、軽鎖またはＬ鎖（分子量各約２５，０００ダルトン）と呼ばれる２個の同一のポリペプチドから成る。５つの抗体クラスのそれぞれは類似の組の軽鎖のおよび異なる組の重鎖を有する。軽鎖は１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインから構成され、一方、重鎖は１つの可変ドメインおよび３つ以上の定常ドメインから構成される。可変ドメインは免疫グロブリンの特異性を決定し、定常領域は他の機能を有する。
【０００３】
概して、適当なポリペプチド軽鎖および重鎖の対が、天然抗体および他の種類の抗体において結合して、抗原結合部位を形成する。それぞれの個々の軽鎖および重鎖は約１１０アミノ酸の領域に折りたたまれ、保存された３次元立体構造を取る。軽鎖は１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含み、一方、重鎖は１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。対の領域が結合して、別個の構造を形成する。特に、軽鎖および重鎖可変領域は結合して、抗原結合部位を含む「Ｆｖ」部分を形成する。定常領域は抗原結合に必要でなく、場合によっては抗体分子からタンパク質分解によって分離することができ、軽鎖の半分および重鎖の四分の一から成る生物学的に活性な（すなわち、結合する）可変領域を与える。
【０００４】
さらに、Ｘ線結晶構造解析によって構造が決定されている特定のクラスのすべての抗体およびそのＦａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１で構成される断片）は、超可変部分の配列における大きな差にもかかわらず、異なる動物種に由来する場合さえ、同様の可変領域構造を示す。免疫グロブリン可変領域は、抗原結合ループにおける突然変異に対して寛容であるように見える。したがって、超可変領域内以外では、重鎖および軽鎖の両方によって定められる抗体のいわゆる「可変」領域の大部分は、実際、３次元構造において非常に定常的である。例えば、参照により本開示に含まれる非特許文献１を参照。
【０００５】
天然抗体は通常不均一であり、多数の異なるエピトープ、または外来抗原の一部と結合する。対照的に、モノクローナル抗体（「Ｍａｂ」）は結合親和性が均一である抗体である。Ｍａｂは診断薬および治療薬として両方で有用であることが示されている。ＭＡｂは例えば、マウスリンパ球様細胞の適当なマウス骨髄腫細胞株との融合によって、およびより進んだ組換え法によって作製されたハイブリドーマから、確立された方法によって定型的に製造されている。
【０００６】
より小さな抗体様タンパク質またはポリペプチドは、最小限の追加の構造を有する抗原結合部位から成る。これらは、一本鎖抗原結合タンパク質またはポリペプチド（「ＳＣＡ」）、または抗体の一本鎖可変断片（「ｓＦｖ」）として本分野で公知である。これらは、リンカーポリペプチドを組み込んで、個々の可変領域、ＶＬおよびＶＨを繋げて、単一のポリペプチド鎖とすることができる。
【０００７】
一本鎖抗原結合タンパク質の理論の説明および製造は、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４に、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，特許文献５（「生合成抗体結合部位」（ＢＡＢＳ））に見出され、それらの開示はすべて参照により本開示に含まれる。上記の特許に記載された方法のもとに製造された一本鎖抗原結合タンパク質は、対応するＦａｂ断片と実質的に同様な結合特異性および親和性を有する。
【０００８】
概して、適当な軽鎖および重鎖の対は、結合して抗原結合部位を形成することができる。それぞれの個別の軽鎖および重鎖は約１１０アミノ酸の領域に折りたたまれ、保存された３次元立体構造を取る。軽鎖は１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含み、一方、重鎖は１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。領域の対は結合して、別々の構造を形成する。特に、軽鎖および重鎖可変領域は結合して、抗原結合部位を含む「Ｆｖ」部分を形成する。定常領域は抗原結合に必要でなく、および一部の場合には抗体分子からタンパク質分解によって分離することができ、軽鎖の半分および重鎖の四分の一から成る生物学的に活性な（すなわち、結合する）可変領域を与える。
【０００９】
さらに、Ｘ線結晶構造解析によって構造が決定されている特定のクラスのすべての抗体およびそのＦａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１で構成される断片）は、同様の可変領域構造を示すが、しかしそれぞれの超可変部分の配列には大きな差を示す。これはまた、それぞれ異なる動物種に由来する抗体の比較においても観察される。免疫グロブリン可変領域は、抗原結合ループにおける突然変異に対して寛容であるように見える。したがって、超可変領域内以外では、重鎖および軽鎖の両方によって定められる抗体のいわゆる「可変」領域の大部分は、実際、３次元構造において非常に定常的である。例えば、参照により本開示に含まれる非特許文献１を参照。
【００１０】
ＳＣＡポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ特性は、ＭＡｂおよびより大きな従来の抗体断片とは異なる。サイズの小ささは、ＳＣＡが血液からより早く消失し、および組織へより速やかに浸透することを可能にする（非特許文献２； 非特許文献３； 非特許文献４）。加えて、ＳＣＡポリペプチドは、抗体分子中に通常存在する定常領域が無いため、肝臓および腎臓といった組織中に保持されない。したがって、ＳＣＡポリペプチドは、迅速な組織浸透およびクリアランスが有利である癌診断および治療に有用である。
【００１１】
合成抗原結合タンパク質はまた、参照により本開示に含まれる特許文献５（Ｈｕｓｔｏｎら）に記載されている。記載されたタンパク質は、生合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）として挙動する領域を構成するアミノ酸の１つ以上の配列によって特徴づけられる。その部位は、（１）非共有的に結合したかまたはジスルフィド結合した合成ＶＨおよびＶＬ領域、（２）ＶＨおよびＶＬがポリペプチドリンカーに結合しているＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ一本鎖、または（３）個別のＶＨまたはＶＬドメインを含む。結合ドメインはフレームワーク領域（ＦＲ）と結合した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、それらは別々の免疫グロブリンに由来し得る。Ｈｕｓｔｏｎらのタンパク質は最初の重鎖、すなわち、ＶＨ−ペプチドリンカー−ＶＬドメインを有することによって特徴づけられるものを含むことに注意する。
【００１２】
多価抗原結合タンパク質は公知である。本開示に記載される通り、多価抗原結合タンパク質は２つ以上の一本鎖タンパク質分子を含む。これらは共有または非共有結合によって随伴または結合され得る。多価抗原結合タンパク質の、抗原結合活性の上昇、２特異的および多特異的結合、および他の新規の用途が実証されている。例えば、すべて参照により本開示に含まれる、非特許文献５； 非特許文献６；および特許文献６、および共有の特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、および特許文献１２を参照。
【００１３】
上述の一本鎖ポリペプチド、およびその融合タンパク質といったペプチドは、哺乳類における顕著な抗原性と関連づけられていないが、循環寿命を延長しおよび抗原性反応の可能性をさらに低減さえすることが望ましい。
【００１４】
循環寿命を延長しおよびタンパク質およびポリペプチドの抗原性を低下させる１つの方法は、それらをポリアルキレンオキシドといったポリマーに結合(conjugate)させることである。しかし、そのポリペプチドの相対的に小さなサイズおよびその繊細な構造／活性関係は、ポリエチレングリコール修飾を困難におよび予測不能にしている。
【００１５】
ポリアルキレンオキシドのタンパク質との共有結合を行うためには、ポリマーの末端水酸基を最初に反応性官能基へ変換しなければならない。この過程はしばしば「活性化」と呼ばれ、およびその産物は「活性化ＰＥＧ」または活性化ポリアルキレンオキシドと呼ばれる。例えば、一方の末端が官能基でキャッピングされた、タンパク質分子上のアミンに対して反応性である、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）が大部分の場合に用いられる。
【００１６】
ＰＥＧのスクシンイミジルスクシナート誘導体（「ＳＳ−ＰＥＧ」）といったいくつかの活性化ポリマーが紹介されている（非特許文献７）。ＳＳ−ＰＥＧはタンパク質（３０分間）と穏和な条件下で迅速に反応し、活性でありながらよく修飾された複合体を与える。Ｚａｌｉｐｓｋｙは、特許文献１３で、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカルボナートおよびその調製を開示する。この形のポリマーは、タンパク質，および低分子量ペプチドおよび遊離アミノ基を含む他の材料の、アミノ基と容易に反応すると言われている。ウレタン結合（非特許文献８）、カルバマート結合（非特許文献９）、などといった、タンパク質のアミノ基とＰＥＧとの間の他の結合もまた本分野で公知である。
【００１７】
しかし、これらおよび他の方法にもかかわらず、結果として生じる複合体が十分な保持された活性を欠くことがしばしば見出されている。例えば、Ｂｅｎｈａｒら（非特許文献１０）は、組換え一本鎖免疫毒素のＰＥＧ化が結果としてその免疫毒素の特異的標的免疫反応性の消失を生じたことを観察した。その免疫毒素の活性消失は、免疫毒素の抗体結合領域内部の２個のリジン残基でのＰＥＧ結合の結果であった。この問題を克服するために、Ｂｅｎｈａｒらはこれらの２個のリジン残基をアルギニン残基で置き換え、および誘導体化によって、不活性化に対する耐性が３倍高い活性な免疫毒素を得ることができた。
【００１８】
上記で考察したこれらの問題を克服するための別の提案は、より長い、より高い分子量のポリマーを用いることである。これらの材料は、しかし、調製が困難でありおよび使用するのが高価である。さらに、それらは、より容易に入手可能なポリマーに対してわずかな改善しか提供しない。提案された別の代替案は、ポリマーの２本の鎖を、トリアジン環を介してタンパク質のアミノ基へ付加することである。例えば、非特許文献１１および非特許文献１２を参照。しかし、トリアジンは、結合後に許容し得るレベルへ低減するのが困難な有毒物質である。
【００１９】
ＳＣＡタンパク質の３次元構造の検討は、Ｃ末端およびリンカー領域は抗原結合部位から非常に遠く離れており、したがって、それらタンパク質の製造中にｉｎ ｖｉｖｏでグリコシル化される挿入基へのポリマー結合のための部位を位置決定する中で、結合したポリマーが抗原結合部位または周囲のＦｖ構造の立体構造を立体的に妨害または破壊しない、ポリマー結合(polymer conjugation)のための部位となり得ることを明らかにした（非特許文献１３）。
【００２０】
より効果的なポリマー結合のために、ＳＣＡ構造内部のアミノ酸残基を位置決定する試みは、本特許出願の下記の共有発明者によって記載されており、そのすべてが参照により本開示に含まれる：選択的に位置決定されたＣｙｓおよびオリゴＬｙｓ残基を記載する、共に２００１年２月２６日出願の、特許文献１４および特許文献１５。
【００２１】
共有の、共に２００１年９月２０日の特許文献１６および特許文献１７は、ポリマーが選択的に結合する、選択的に位置決定されたグリコシル化のための、ＳＣＡ中のタンデムおよびトリプレットＡＳＮ、および関連する部位を記載する。しかし、ポリマーのＳＣＡタンパク質への位置依存的結合における他の選択肢および改善、および、ポリペプチドの結合活性および特異性の保持を、ポリマー結合のすべての利益と共に可能にする、共役化学(conjugation chemistry)における他の選択肢および改善の本分野における必要性が残っている。
【特許文献１】米国特許第４，９４６，７７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２６０，２０３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４５５，０３０号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５１８，８８９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０９１，５１３号明細書
【特許文献６】国際公開第９３／１１１６１号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，８６９，６２０号明細書
【特許文献８】米国特許第６，０２５，１６５号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０２７，７２５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１０３，８８９号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１２１，４２４号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，５１５，１１０号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，１２２，６１４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第０９／７９１，５７８号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第０９／７９１，５４０号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第０９／９５６，０８７号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第０９／９５６，０８６号明細書
【非特許文献１】Huber,R.,Science 233: 702-703 (1986)
【非特許文献２】Milenic,D.E.et al.,Cancer Research 51: 6363-6371(1991)
【非特許文献３】Colcher et al.,J.Natl.Cancer Inst.82: 1191 (1990)
【非特許文献４】Yokota et al.,Cancer Research 52: 3402 (1992)
【非特許文献５】Whitlow,M.,et al.,Protein Engng.7: 1017-1026 (1994)
【非特許文献６】Hoogenboom,H.R.,Nature Biotech.15:125-126 (1997)
【非特許文献７】Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.7: 175-186 (1984)
【非特許文献８】Veronese et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.11: 141-152(1985)
【非特許文献９】Beauchamp et al,Anal.Biochem.131: 25-33 (1983)
【非特許文献１０】Benhar et al.(Biocomueate Chem.5: 321-326 (1994))
【非特許文献１１】Enzyme 26: 49-53 (1981)
【非特許文献１２】Proc.Soc.Exper.Biol.Med.,188:364-369 (1988)
【非特許文献１３】Wang M.,et al.,1998 Protein Engng 11: 1277-1283
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
これらの長年のニーズに対応するために、本発明は、
抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第１ポリペプチド；
抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第２ポリペプチド；および
第１および第２ポリペプチドを繋ぐペプチドリンカーを含み、
ポリアルキレンオキシドポリマーに結合可能な少なくとも１つのＣｙｓ残基を有し、かつ少なくとも１つの抗原結合部位を有する、ポリアルキレンオキシドポリマーに部位特異的結合可能なＴＮＦ−α結合一本鎖抗原結合ポリペプチド（「ＳＣＡ」）を提供する。Ｃｙｓ残基は好ましくは下記の位置の１以上に位置する：
重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端；
重鎖または軽鎖可変領域のＮ末端；
ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置；
Ｎ末端およびＣ末端の両方；
リンカーの２位；
リンカーの５位；
リンカーの２位およびＣ末端の両方；および
それらの組合せ。
【００２３】
好ましくは、ＴＮＦ−α結合ＳＣＡはＴＮＦ−αに選択的に結合する。
【００２４】
より好ましいＣｙｓ位置は、例えば、リンカーの２位、Ｃ末端およびそれらの組合せを含む。Ｃ末端は好ましくは天然に存在するＣ末端であるが、しかしその当該分野で既知である任意の修飾を含み得る。
【００２５】
本発明のＳＣＡは必要に応じて、目的の抗体、例えば、好ましくは抗ＴＮＦ−α抗体の軽鎖および／または重鎖に由来する可変領域から成る。
【００２６】
本発明はまた、本発明の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたはタンパク質を含む複合体であって、実質的に非抗原性のポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドポリマーを含む複合体を提供する。ポリアルキレンオキシドは好ましくはポリエチレングリコールすなわち「ＰＥＧ」ポリマーである。
【００２７】
ポリアルキレンオキシドは任意の適当なサイズ範囲であるが、しかし好ましくはサイズが約５，０００から約４０，０００ダルトンの範囲にわたる。
【００２８】
好ましくは、ポリアルキレンオキシドポリマーは一本鎖抗原結合ポリペプチドにＣｙｓ残基で共有結合する。
【００２９】
好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィドおよび／またはヨードアセトアミドリンカーといったリンカーを介して、一本鎖抗原結合ポリペプチドにＣｙｓ残基で結合する。マレイミドリンカーが非常に好ましい。
【００３０】
本発明のポリマー結合した実施形態では、ポリアルキレンオキシドは必要に応じて、各一本鎖抗原結合ポリペプチドが同一であるかまたは異なる少なくとも２つの一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合している。
【００３１】
必要に応じて、複合体、例えばＰＡＯまたはＳＣＡのどちらか、または両方のような複合体は、さらに別の機能部分、例えば、検出可能な標識またはタグと結合または複合体化している。
【００３２】
本発明はまた、一本鎖抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む複製可能な発現ベクター、およびそれを発現するための適当な宿主細胞を提供する。
【００３３】
本発明のＳＣＡタンパク質は、任意の適当な本分野で公知の工程または方法によって製造されるが、好ましくは、本明細書に例示される通り、ＳＣＡをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、さらにその宿主細胞によって発現された一本鎖抗原結合ポリペプチドを回収することによって製造される。
【００３４】
本発明はさらに、部位特異的結合可能な２以上の一本鎖抗原結合ポリペプチドを含むタンパク質を、二量体、三量体、四量体などの形態の多価抗原結合タンパク質として提供する。
【００３５】
本発明の多価タンパク質は、個々のＳＣＡが共有結合または非共有結合リンカー、例えば、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、などによって連結される、本分野で公知の方法によって調製される。別の選択肢では、タンパク質は、非共有結合リンカーを用いて、構成的ＳＣＡポリペプチドを還元および再折りたたみすることによって組み立てられる。後者の選択肢では、構成的一本鎖抗原結合タンパク質またはポリペプチドのペプチドリンカーが、２から１８残基の大きさであることが特に好ましい。
【００３６】
本発明はさらに、単一の多価タンパク質としてコードされる構成的ＳＣＡポリペプチドの１つ以上に特定のＣｙｓ残基を有する多価タンパク質を提供する。そのような一本鎖多価タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部として考えられている。
【００３７】
本発明のＳＣＡおよびポリマー複合体を用いる方法もまた提供される。単に一例として、そのような方法の１つは下記の工程を含む：ＴＮＦ−αを含む疑いのある試料を、本発明に記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたは多価タンパク質を含む試薬と接触させ、および、本発明に記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドまたは多価タンパク質がＴＮＦ−αと結合したか否かを検出する。有利なことに、本発明に記載のポリペプチドまたは多価タンパク質は、ポリアルキレンオキシドポリマーと結合している。
【００３８】
上記の方法のすべてについて、複合体は、ＳＣＡまたはポリマーのどちらかにおいて、必要に応じて固相担体に固定される。
【００３９】
哺乳類、例えばヒトにおいて疾患または病気を治療または診断する方法であって、本発明のＴＮＦ−α結合一本鎖抗原結合ポリペプチドの有効量を投与することを含み、一本鎖抗原結合ポリペプチドがＴＮＦ−αと結合しおよびＴＮＦ−α関連中毒を阻害するのに有効な量で投与される方法も提供される。本発明の一本鎖抗原結合ポリペプチドおよび／またはそのポリマー複合体は、約１０μｇ／ｋｇから約４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で、およびより好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約８００μｇ／ｋｇの範囲の量で、およびさらに好ましくは約２０μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇで、本分野で公知である全身経路によって投与され、用量は臨床反応を生じるために必要に応じて反復される。体腔内への潅流、吸入または鼻腔内経路による投与もまた、局所投与と共に、本発明の抗ＴＮＦ−αポリペプチド，タンパク質およびポリマー複合体化合物から利益を受ける全身症状およびより局所的な症状を治療するために考えられている。そのような症状は、例えば、毒素性ショック症候群、および、抗ＴＮＦ−α治療に反応する、本分野で公知である任意の他の炎症過程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
したがって、本発明は、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマーへの部位特異的結合を促進するために選択された、操作された官能基を有する改良された抗ＴＮＦ−α一本鎖抗原結合ポリペプチドおよび／またはそのようなポリペプチドから成る多価タンパク質を提供する。本発明のポリペプチドとポリマーとの複合体、およびそれを作製および使用する方法もまた提供される。
【００４１】
本発明は概して、一本鎖抗原結合タンパク質（「ＳＣＡ」）または抗体の一本鎖可変断片（「ｓＦｖ」）が、適当なポリアルキレンオキシドポリマーとＳＣＡポリペプチド上の特定位置で結合した場合、向上した性質を有するという発見に基づく。本発明のＳＣＡは、そのような特異的位置での選択的なポリマー結合のための官能基を含むように設計される。ポリマー結合の利益は概して、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原性の実質的低減、および動物またはヒト患者への投与後の循環半減期の延長を含む。本発明のＳＣＡが望ましい性質の複合体をどのように提供するかに関するいかなる理論または仮説に縛られることを意図することなく、１または複数のポリペプチド鎖上の選択された位置に結合部位を設計することによって、結合ポリマーの存在による抗原結合機能および鎖三次構造との干渉が回避されるかまたは最小化されると信じられている。
【００４２】
本発明の範囲をよりよく理解するため、下記の用語が定義される。「一本鎖抗原結合分子」（「ＳＣＡ」）または「一本鎖Ｆｖ」（ｓＦｖ）の語は別に記載されない限り本明細書では相互に交換可能に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」の語もまた、別に記載されない限り互換的に用いられる。概して、ＳＣＡは、抗体ＶＨ（またはＶＬ）の可変領域に由来する第２ポリペプチドの結合部分と結合した、抗体ＶＬ（またはＶＨ）の可変領域に由来する第１ポリペプチドの結合部分を含み、その２つのポリペプチドは第１および第２ポリペプチドを繋いで単一のポリペプチド鎖とするペプチドリンカーによって、第１ポリペプチドがリンカーに対してＮ末端となりおよび第２ポリペプチドが第１ポリペプチドおよびリンカーに対してＣ末端となるように連結されていると構造的に定義される。
【００４３】
ＳＣＡはこのように、ポリペプチドリンカーによって結合された可変領域の一対を含む。その領域は、適切に対となった相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖および重鎖可変領域対を領域が含む場合のように、結合して機能的抗原結合部位を形成し得る。この場合、一本鎖タンパク質は概して「一本鎖抗原結合タンパク質」または「一本鎖抗原結合分子」または「一本鎖抗原結合ポリペプチド」と呼ばれる。上で定義される通り、ＳＣＡは必要に応じて「１価」または「多価」である。１価ＳＣＡは、単一の抗原結合部位、すなわち、抗原結合部位を形成するように結合するポリペプチドリンカーによって連結された１対の可変領域のみを含むように設計される。多価ＳＣＡは、２つ以上の抗原結合部位、すなわち、ポリペプチドリンカーによって結合された可変領域を２対以上含むように改変された抗原結合タンパク質であり、２つ以上の上記の一本鎖抗原結合ポリペプチドを含むＳＣＡを含む。構成的ＳＣＡ部分は本分野で公知である任意の方法によって結合している。
【００４４】
一実施形態では、本発明に記載の多価結合タンパク質は、抗原結合タンパク質として完全に機能を維持するように非共有結合した２つ以上のＳＣＡを含む。別の一実施形態では、多価結合タンパク質は、共有結合によって、例えば、本分野で公知であるペプチドまたは非ペプチドリンカー化学のいくつかのうちの１つによって結合している２つ以上のＳＣＡを含む。さらに、例えば複数のＳＣＡから成る多価結合タンパク質を、１価ＳＣＡに類似しているが同一かまたは異なる２つ以上の反復ＳＣＡドメインを有する単一のペプチド鎖として発現するかまたは合成によって構築することができる。
【００４５】
ＳＣＡは、ＶＬがＮ末端ドメインでありその後にリンカーおよびＶＨが続くように構築されている（ＶＬ−リンカー−ＶＨ構造）。別の一実施形態では、ＳＣＡは、ＶＨがＮ末端ドメインでありその後にリンカーおよびＶＬが続くように構築されている（ＶＨ−リンカー−ＶＬ構造）。その好ましい実施形態は、ＶＬをＮ末端ドメインに含む（Anand,N.N.,et al.,J.Biol.Chem.266: 21874-21879 (1991)を参照）。必要に応じて、複数のリンカーが用いられる。
【００４６】
一本鎖抗原結合タンパク質の理論および製造の説明は、すべて参照により本開示に含まれる、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号明細書、第５，２６０，２０３号明細書、第５，４５５，０３０号明細書および第５，５１８，８８９号明細書、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０９１，５１３号明細書（「生合成抗体結合部位」（ＢＡＢＳ））に見出される。上記の特許に従って製造されたＳＣＡは、対応するＦａｂ断片と実質的に同様の結合特異性および親和性を有する。
【００４７】
可変ドメイン（Ｆｖ）
本発明のＳＣＡは、任意の望ましい天然または人工抗体から選択されるかそれに由来するかまたはそれを原型とした可変ドメイン（「Ｆｖ」）を用いて構築される。別の好ましい一実施形態では、本発明における用途のためのＦｖは、置換ライブラリとして構成されるＦｖライブラリから得られ、目的の結合標的に対してスクリーニングされる。単に一例として、Ｆｖドメインを得るために多数のＭａｂが本分野で用いられており、および、Ｆｖドメインはこれらのうちの任意のものから得ることができ、および本発明のＳＣＡに用いることができると考えられている。単に一例として、および無制限に、下記のＭａｂがＦｖドメインを得るために用いられる：
26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, murinephOx, human phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel55-4, 18-2-3, 4-4-20, 7A4-1, B6.2, CC49, 3C2, 2c, MA-15C5/Kl2Go, Ox, etc. (See, Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5879-5883 (1988); Huston, J.S. et al., SIM News 38 4 (Supp.): 11 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 114 (1990); McCartney, J.E. et al., unpublished results (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med.32 (Supp.): 1005(1991); Huston, J. S. et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, edited by J. J. Langone, Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Huston, J. S. et al., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos, A. A. (Ed.), London, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242: 423-426 (1988); Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265: 18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990); Gibbs, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 : 4001-4004 (1991) ; Milenic, D. E. et al., Cancer Research 51: 6363-6371(1991) ; Pantoliano, M. W. et al., Biochemistrv 30: 10117-10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339: 394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1066-1070 (1990); Batra, J. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171: 1-6 (1990); Batra, J. K et al., J. Biol. Chem. 265: 15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 9491-9494 (1990); Batra, J. K. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2200-2205 (1991) ;Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 8616-8620 (1991); Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266: 17376-17381 (1991); Brinkmann, U. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 3075-3079 (1992); Glockshuber, R. et al., Biochemistry 29: 1362-1367 (1990); Skerra, A. et al., Bio/Technol. 9: 273-278 (1991); Pack, P. et al., Biochemistry 31 : 1579-1534 (1992); Clackson, T. et al., Nature 352: 624-628 (1991) ; Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) ; Iverson, B. L. et al., Science 249: 659-662 (1990); Roberts, V. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87 : 6654-6658 (1990); Condra, J. H. et al., J. Biol. Chem. 265: 2292-2295 (1990); Laroche, Y. et al., J. Biol. Chem. 266: 16343-16349 (1991); Holvoet, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 19717-19724 (1991); Anand, N. N. et al., J. Biol. Chem. 266: 21874-21879 (1991) ; Fuchs, P. et al., Bio/Technol. 9: 1369-1372 (1991); Breitling, F. et al., Gene 104: 104-153 (1991); Seehaus, T. et al., Gene 114:235-237 (1992); Taldcinen, K. et al., Protein Engng. 4 : 837-841 (1991); Dreher, M. L. et al., J. Immunol. Methods 139:197-205 (1991); Mottez, E. et al., Eur. J. Immunol. 21: 467-471 (1991); Traunecker, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 8646-8650 (1991) ; Traunecker, A. et al., EMBO J.10: 3655-3659 (1991); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4759-4763 (1993) 。上記の引用の全ては参照により本開示に含まれる。
【００４８】
特に、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によってＤ２Ｅ７として記載される抗ＴＮＦ−αＭＡｂ、およびＣａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （ＵＳＡ） ８９： ４２８５−４２８９に記載される抗ｅｒｂＢ−２ ＭＡｂ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、本発明に記載のＳＣＡおよびＳＣＡ−ポリアルキレンオキシド複合体の作製のためのモデル例の役割を果たした。Ｄ２Ｅ７はＨｕｍｉｒａ（登録商標）（Abbott Immunology,Abbott Park,Illinois）として市販されている。加えて、ＣＣ４９ ＭａｂはLaboratory of Tumor Immunology and Biology,National Cancer Institute のDr.Jeffrey Schlomのグループによって開発された。それは汎癌腫瘍抗原ＴＡＧ−７２に特異的に結合する。Muraro,R.et al.,Cancer Research 48: 4588-4596 (1988)を参照。Filpula et al.1996 (Antibody Engineering: A Practical Approach,Oxford University Press,pp 253-268)に記載された抗ＴＡＧ−７２ ＣＣ−４９ＳＣＡは、本発明に記載のＣｙｓ−修飾ＳＣＡとしておよび典型的な複合体としても調製された。上記の引用の全ては参照により本開示に含まれる。
【００４９】
ペプチドリンカー
本発明に記載のＳＣＡは、ＶＬのＣ末端、またはその隣接部位、およびＶＨのＮ末端、またはその隣接部位にわたるように、または、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とを連結するように設計されたペプチドリンカーを含む。
【００５０】
リンカーの長さは、連結されるべきポリペプチドの性質、および連結の結果として生じる連結された融合ポリペプチドの目的の活性に依存することを当業者は理解する。一般的に、リンカーは、結果として生じる連結された融合ポリペプチドが適切に立体構造へ折りたたまれ、目的の生物活性すなわち抗原結合を与えることを可能にする長さを有するべきである。個別の具体例では、好ましい長さは連結されるべきポリペプチドの性質、および連結の結果として生じる連結された融合ポリペプチドの目的の活性に依存する。
【００５１】
下記で考察するＳＣＡポリペプチドの場合のように、立体構造情報が入手可能である場合は、適当なリンカーの長さは、置換ポリペプチドの三次元立体構造および結果として生じる連結した融合ポリペプチドの目的の立体構造の検討によって推定することができる。そのような情報が入手できない場合は、適当なリンカーの長さは、さまざまな長さのリンカーを有する連結された融合ポリペプチドを目的の生物活性について試験することによって経験的に決定することができる。そのようなリンカーは、参照により本開示に含まれる国際公開第９４／１２５２０号パンフレットに詳細に記載される。
【００５２】
ＳＣＡポリペプチドを構築するのに用いられるペプチドリンカーは一般的に、大きさが長さ２から約５０アミノ酸残基、および好ましくは、約２から約１０残基の範囲にわたる。別のある実施形態では、リンカーは大きさが約１０から約３０残基の範囲にわたる。より好ましいある実施形態では、特に２つ以上の非共有的に結合したＳＣＡポリペプチドを含む多価結合体に関する実施形態については、リンカーは大きさが約２から約２０アミノ酸残基の範囲にわたることが好ましい。より好ましくは、そのようなリンカーはセリンに富むかまたはグリシンに富む。
【００５３】
リンカーは柔軟性となるように設計され、および、交互のＧｌｙおよびＳｅｒ残基の基礎配列を用いることが推奨される。リンカーおよびそれと結合した一本鎖Ｆｖタンパク質の溶解度を高めるために、３個の荷電残基すなわち２個の正に荷電したリジン残基（Ｋ）および１個の負に荷電したグルタミン酸残基（Ｅ）を含めることができる。好ましくは、リジン残基のうち１個はＶＨのＮ末端付近に配置され、リンカーとＶＨとのペプチド結合を形成する際に失われる正電荷の代替となる。そのようなリンカーは、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第５，８５６，４５６号明細書によって詳細に記載される。参照により本開示に含まれるWhitlow,M.,et al.,Protein Engng.7: 1017-1026 (1994)も参照。
【００５４】
本発明に記載の多価抗原結合タンパク質については、２つ以上のＳＣＡポリペプチドの共有または非共有結合が、それらのタンパク質の形成のために好ましい。しかし、多価ＳＣＡを、長さ２５残基のリンカーを用いてＳＣＡから作製することができるが、それは不安定となる傾向がある。Holliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 90: 6444-6448 (1993)は、長さ０から１５残基のリンカーが２価Ｆｖの形成を促進することを近年実証している。参照により本開示に含まれる、Whitlow,M.,et al.,Protein Ensns 7 :1017-1026 (1994); Hoogenboom,H.R.,Nature Biotech.15: 125-126 (1997);および国際公開第９３／１１１６１号パンフレットを参照。
【００５５】
部位特異的ＰＥＧ化配列の同定および合成
本発明は、ポリペプチド（ＶＬ、ＶＨまたはその隣接部位）のＣ末端、ポリペプチド（ＶＬ、ＶＨまたはその隣接部位）のＮ末端、第１および第２ポリペプチド領域の間のリンカー領域、またはそれら領域の組合せの領域に隣接する、チオール官能基部分、例えば、ＶＬおよびＶＨ領域中の特定部位に位置するチオール含有アミノ酸残基を提供する。本発明では、ポリマー結合のための特異的部位が、ポリペプチドリンカーに、Ｃ末端に、またはＳＣＡのＣ末端に隣接して、および好ましくは、リンカーの第２の残基に位置することが好ましい。
【００５６】
チオールを含む官能基は、天然アミノ酸残基、および／または天然に存在しないアミノ酸残基を含む、本分野で公知の任意のものであることができ、およびそれらのチオール官能基化誘導体を有する。好ましい一実施形態では、チオール官能基部分はシステイン残基である。ＳＣＡ タンパク質は通常は２個の埋め込まれたジスルフィド結合を有するが （Padlan EA,1994,Antibody-Antigen Complexes,R.G.Landes Company,Austin）、しかし遊離システインを有しないため、このことは好ましい。したがって、改変されたＣｙｓチオールだけが、チオールとの反応に選択的である活性化ポリマーとの結合に利用可能である。
【００５７】
Ｃｙｓ部位をさまざまな位置へ導入するために用いられる特定のヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列に依存する。最も好ましい部位は、Ｃｙｓ挿入を生じるために必要な変化の数が最小である一方で上述の立体構造の必要条件もまた満たす部位である。もちろん、遺伝コードの重複に基づき、特定のアミノ酸が複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００５８】
天然のタンパク質配列を、Ｃｙｓ残基を組み込んだものに変えるために、部位特異的突然変異誘発のための本分野で公知である任意の適当な方法が用いられる。突然変異タンパク質遺伝子は、細菌細胞、酵母または他の真菌細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞といった他の発現系へ入れられる。突然変異タンパク質はその後、タンパク質の回収のための標準的な方法によって精製される。
【００５９】
好ましくは、ＳＣＡムテインを発現している核酸分子は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって作製される。部位特異的Ｃｙｓムテイン (Cys mutain)を作製するためのそのような方法およびクローンＤＮＡの突然変異誘発のための関連する方法は、本分野でよく知られている。共に参照により本開示に含まれる、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989) ; Ausubel et al.(eds.)、 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley and Sons (1987)を参照。
【００６０】
宿主およびベクター
目的のＳＣＡのヌクレオチド配列を突然変異させて希望の位置にＣｙｓ残基を提供した後、突然変異させた核酸は好ましくは適当なクローニングベクターへ挿入され、そこでＳＣＡをコードするヌクレオチドは転写発現を調節する調節配列へ調節可能に結合される。これらは、希望の宿主細胞系からのＳＣＡ産生を最適化するために、好ましくは本分野で公知である方法によって選択される。
【００６１】
ＳＣＡは原核または真核宿主細胞によって発現されおよび産生されることが知られているが、多くの目的のためには真核宿主細胞が好ましい。好ましい原核宿主は、バチルス、ストレプトミセス、ストレプトコッカス、および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉといった細菌を含むがそれらに限定されない。好ましい真核宿主細胞は、酵母または他の真菌細胞、昆虫細胞および／または哺乳類細胞を含む。好ましくは、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏ、または組織培養中のどちらかに存在する、ヒトまたは霊長類細胞を含む。より好ましくは、本発明のＳＣＡはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓといった形質転換酵母によって産生される。発現ベクターは、宿主細胞において一過性発現を提供するように、または宿主細胞ゲノムと一体化して形質転換細胞株を生じるように任意に選択される。
【００６２】
標準的なタンパク質精製法を用いてこれらの突然変異タンパク質が精製される。天然タンパク質精製方法へのわずかな改変だけが必要であり得る。例えば、ベクター、宿主の選択、タンパク質、特にＳＣＡポリペプチドの１価、多価および融合形の産生、単離および精製の方法は、例えば、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第４，９４６，７７８号明細書および米国特許第６，３２３，３２２号明細書によって十分に記載されている。
【００６３】
好ましい一実施形態では、目的のＳＣＡおよび選択マーカーをコードする核酸分子は宿主細胞染色体中へ、単一のベクターまたは同時導入される複数のベクターとして導入される。マーカーは、宿主における栄養要求性（例えば一般的な酵母栄養要求性マーカーであるｈｉｓ４、ｌｅｕ２、またはｕｒａ３）、例えば抗生物質といった殺生物物質耐性、または銅といった重金属に対する耐性、などを補足し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＳＣＡ ＤＮＡ配列と直接結合しているか、または同時トランスフェクションによって同一の細胞へ導入される。導入された核酸を安定して組み込んでいる細胞は、所定の系における生存またはマーカーのその他の効果によって選択される。
【００６４】
別の一実施形態では、目的のＳＣＡは、レシピエント宿主細胞における自律的複製の能力を有する適当なプラスミドベクターによってコードされる。本分野で公知である幅広いベクターのうち任意のものをこの目的に用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択における重要な要素は下記を含む：ベクターを含むレシピエント細胞が、ベクターを含まないレシピエント細胞から識別されおよび選択されることの容易さ；特定の宿主中で望まれるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復」することができることが望ましいかどうか。
【００６５】
一連の酵母ベクター系のうち任意のものを利用することができる。そのような発現ベクターの例は、酵母２ミクロンサークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰおよびＹＲＰなど、またはそれらの誘導体を含む。そのようなプラスミドは本分野でよく知られている（Botstein et al.,Miami Wntr.Sump.19:265-274 (1982); Broach,J.R.,In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,p.445-470 (1981); Broach,J.R.,Cell 28: 203-204 (1982)) 115。
【００６６】
哺乳類宿主については、本分野で公知であるいくつかのベクター系を利用可能である。ある種類のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルスといった動物ウイルスに由来する、自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ配列を利用する。別の種類のベクターは、目的の遺伝子配列の宿主染色体への組み込みを基にする。導入されたＤＮＡを染色体に安定して組み込んでいる細胞は、上記で考察した通り、マーカーによって選択される。ｍＲＮＡの最適な合成のためには追加の配列もまた必要である。これらの配列は、スプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含む。そのような配列を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターは、Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.3: 280 (1983)に記載されたもの、および本分野によく知られているものを含む。
【００６７】
ベクターの中でも、細菌における使用のために好ましいベクターは、Ｑｉａｇｅｎより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。好ましい真核ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。Ｐｉｃｈｉａにおける発現に好ましいベクターは、ｐＨＩＬ−Ｓ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）およびｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかとなる。
【００６８】
その構造を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために一旦調製されると、そのＤＮＡ構築物は適当な宿主へ導入され、または形質転換され得る。形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、または他の従来の方法といったさまざまな技術が使用可能である。細胞が組換えＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子で形質転換された後、細胞を培地中で増殖させ、および適当な活性についてスクリーニングする。その配列の発現は、結果として本発明のＰＥＧ結合のための突然変異ＳＣＡの産生を生じる。
【００６９】
ＳＣＡタンパク質の産生および精製
本発明の１価または多価抗原結合タンパク質は、本分野で公知である適当な任意の方法によって産生することができる。概して、その方法は、適当な発現ベクターを作製すること、そのベクターを適合する宿主細胞中で発現させること、宿主細胞を培養することおよび、目的のタンパク質を回収することを含む。
【００７０】
組換えタンパク質を培地中へ分泌することができない原核細胞または他の培養細胞における発現については、回収は採取した細胞からである。採取された細胞物質は、細胞溶解および洗浄、形成された封入体の適合する変性溶媒中での可溶化、機能する結合タンパク質への再折りたたみを与えるために有効である条件下での希釈による再折りたたみ、および２つのイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィー工程に供される。好ましい原核発現系は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）を含む。例えば、また参照により本開示に含まれる、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、第５，２６０，２０３号明細書、第５，４５５，０３０号明細書、第５，５１８，８８９号明細書、および第５，５３４，６２１号明細書、およびＢｉｒｄｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３ （１９８８）を参照。
【００７１】
例示されたＳＣＡタンパク質の発現に関する最初の研究は、Ｘｏｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手したＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用した（ａｒａＢプロモーターおよびｐｅｌＢシグナル）。ＳＣＡタンパク質の発現に成功した。しかし、Ｘｏｍａ Ｃｏｒｐ．系によって発現されたタンパク質は、周辺質(periplasm)中で細胞に結合したまま留まり、および追加の精製工程を必要とした。
【００７２】
より好ましい発現系は、真核宿主細胞および、分泌シグナル配列を有する発現ベクターを用いる。この好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からの不溶性の封入体として、発現されたＳＣＡを回収する必要性を回避する。
【００７３】
必要な場合には、グリコシル化。酵母における目的タンパク質の産生に用いることができる、強力なプロモーター配列およびプラスミドの大きいコピー数を利用する、いくつかの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母は、クローニングされた哺乳類遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、およびリーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。
【００７４】
このため、本明細書で例示するＳＣＡ タンパク質はすべて、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの分泌によって発現されおよび溶液から回収された。
【００７５】
Ｄ２Ｅ７ ＭＡｂ可変ドメインを有するＳＣＡタンパク質
特に好ましい一実施形態では、本発明に記載のＳＣＡがＤ２Ｅ７ Ｍａｂの可変ドメインを用いて開発された。Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された。それはヒトサイトカイン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）と特異的に結合し、およびそのＭａｂは、参照により本開示に含まれる米国特許第６，０９，０３８２号明細書、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によって詳細に記載される。この抗体の選択されたドメインは、それぞれのポリペプチド配列中へ特定の位置に組み込まれた１つ以上のＣｙｓ残基を有するいくつかの典型的なＳＣＡ分子を調製するためのモデルの役割を果たした。
【００７６】
要約すると、完全に合成された遺伝子がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、長さが２０塩基から１０２塩基の範囲にわたる１４種類の長い重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発がさらに用いられ、もとの配列の他の変異体を構築した。結果として生じるベクターによってコードされるＳＣＡは、ペプチドリンカーによって結合した、Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂの完全な可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）部分を含む。例示されたリンカーは、「２１８リンカー」で表される１８残基リンカー、および１５残基リンカーであった。
【００７７】
１８アミノ酸の「２１８リンカー」は、Filpula et al,1996,Antibody Engineering : A Practical Approach,1996,Oxford University Press,pp 253-268)に記載されている。長さ１５アミノ酸の（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号４２）は、Huston JS et al,1988,Proc Natl Acad Sci (USA) 85:5879-5883に記載されている。一部の場合には、Ｃ末端にヒスチジン６個のタグ（ｈｉｓ６）（配列番号４３）が、金属固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製を簡略化するために含められた。完成した遺伝子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （以前はＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって製造）でのＤＮＡ配列確認のために、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドへクローニングされた。ドメイン方向、リンカー、および遊離システインの配置を下記の表１に要約する。
【表１】
【００７８】
上記の表１によって要約される通り、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈおよび１−Ｉは、上の９つの遺伝子のＤＮＡおよびコードされるポリペプチド配列を示す。
【００７９】
ＳＣＡタンパク質の組換え発現および精製
上述の通り、上に記載したＳＣＡ変異タンパク質の産生のためにＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが用いられた。酵母α接合因子由来のシグナル配列が、これらのＳＣＡタンパク質それぞれについての成熟コード配列の直接前に挿入された。このシグナルペプチドのアミノ酸配列はＭｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ^ Ａｌａ （配列番号３６）であり、「^」は切断部位を示す。そのシグナルの２０番目のアミノ酸（^の次のアラニン）もまたこれらの構造に含められた。したがって、成熟ＳＣＡタンパク質のアミノ末端はこのアラニンを含み、例示されたＳＣＡのそれぞれにおいて、図２Ａ〜２Ｈ（配列番号１〜９）によって図示される完全なアミノ酸配列がそれぞれ続く；表１に列挙する通り）。Ｎ末端タンパク質配列分析は、これらの配列は正しくプロセシングされたことを確認した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡを発現する突然変異遺伝子を、Ｐｉｃｈｉａ転移プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中にＥｃｏＲＩ部位で個別にライゲーションさせ、および酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主ＧＳ−１１５へ形質転換した。
【００８０】
これらの手続のための詳細な手順書は、参照により本開示に含まれるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＰｉｃｈｉａ発現キット取扱説明書カタログ番号Ｘ１７１０−０１（１９９４）に示される。発現の最初の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって実施した。個々のＳＣＡタンパク質に関して、Ｐｉｃｈｉａ発現株についてのクローン番号は、前出の表１の２−７−ＳＣ番号に対応する。
【００８１】
ＳＣＡタンパク質（〜２７ｋＤａ）は、組換えＰｉｃｈｉａにおいて高いレベルで発現されおよび分泌された（約２０〜１００ｍｇ／Ｌ）。還元剤の非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについての分析は、単量体および２個の単量体の単一のジスルフィド架橋によって形成される二量体の両方の、予想された存在を実証した。精製２−７−ＳＣ−１ＳＣＡタンパク質に対するウサギ抗血清を調製した。この試薬を用いたウェスタン分析は、発現されたＳＣＡタンパク質の同一性を立証した。
【００８２】
例えば、図８はＤ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ化型の代表的なウェスタンブロット分析を示し、組換えＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体とのこの抗Ｄ２Ｅ７抗血清の反応性を確認する。抗２１８−リンカー抗体を使用した。各試料の１μｇを、４〜２０％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。一次および二次抗体は、それぞれ、ウサギで作製した抗１８−リンカー抗体、およびヤギ抗ウサギ抗体結合ホースラディッシュペルオキシダーゼであった。酵素基質は、Ｍｏｓｓ，ＩｎからのＴＭＢＭペルオキシダーゼ基質であった。Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２はＣ末端にＰＥＧを有し、および２−７−ＳＣ−５は２１８リンカーにＰＥＧを有する。バンドＡは２−７−ＳＣ−２であり、バンドＢは２−７−ＳＣ−５であり、バンドＣはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＤはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−５であり、バンドＥはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＦはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−５である。
【００８３】
ＳＣＡタンパク質は上清から純度９５％超へ、単純な２または３のカラムクロマトグラフィー手順によって精製された。ｈｉｓ６タグ（配列番号４３）を有するＳＣＡタンパク質については、透析した発酵培地をダイアフィルトレーションに供しおよびＤＥＡＥカラムを通し、次いでＩＭＡＣニッケル親和性カラム（ＱＩＡＧＥＮ）に結合させた。結合したＳＣＡタンパク質はイミダゾールを用いて溶出し、次いで第２のＤＥＡＥ陰イオン交換カラムを通した。素通り画分を、ＳＣＡタンパク質の濃縮のためにダイアフィルトレーションに供し、およびさらに特徴づけを行った。ｈｉｓ６タグ（配列番号４３）を欠くＳＣＡタンパク質については、ＳＣＡタンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手したプロテインＬ−アガロースカラムで低ｐＨ溶出を用いて精製したか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手したＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィーに捕捉し、次いで塩濃度勾配溶出およびダイアフィルトレーションを実施した。ＨＳクロマトグラフィーが好ましい方法であった。
【００８４】
図２Ａおよび２Ｂは、クローン２−７−ＳＣ−２についての代表的な発現および精製データを示し、画分のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析、および各工程での収率を含む。少量の５４ｋＤａジスルフィド結合二量体が染色ゲルに見られる。
【００８５】
チオール特異的活性化ポリマー
好ましくは、本発明のＳＣＡはチオール特異的活性化ポリマーに結合している。具体的には、本発明に好ましくは使用される活性化ポリマーは、スルフヒドリル−またはチオール−選択性末端結合基を、その少なくとも一方の末端に有するものである。本分野で公知であるいくつかの活性化ポリマー、例えば、遊離チオールと反応するポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ポリマーが、本発明の実施に容易に用いられる。反応基の例は、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィド、およびヨードアセトアミドを含み、マレイミド基がチオールに対して高度に特異的であることおよび結合反応が穏和な条件下で起こることから見てマレイミド活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ｍａｌ'ｓ）が好ましい。また、例えば、参照により本開示に含まれる共有の米国特許第５，７３０，９９０号明細書を参照。別のスルフヒドラル選択的活性化ＰＥＧ−ポリマーが、参照により本開示に含まれる２００１Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログに図解の通り（前Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能である。また、参照により本開示に含まれるGoodson,R.J.& Katre,N.V.1990,Bio/Technology 8: 343; Kogan,T.P.1992,Snythetic Comm.22,2417を参照。
【００８６】
例えば、本発明のＳＣＡと結合した、直鎖ポリマーｍＰＥＧ−ＭＡＬ（５ｋＤａ）（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒカタログ番号２Ｄ３ＸＯＴ０１）およびｍＰＥＧ−ＭＡＬ（２０ｋＤａ）、および分枝鎖ポリマーｍＰＥＧ２−ＭＡＬ（４０ｋＤａ）（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒカタログ番号２Ｄ２ＭＯＨ０１）複合体が本明細書で例示される。これらのマレイミド−ＰＥＧポリマーの構造、および共役化学を、便宜のために図３Ａ〜３Ｅに示す。図３ＦはｍＰＥＧ−ビニルスルホンを示す。さまざまなマレイミド活性化ポリマーは、図３Ｅに示す通り、遊離チオールと容易に反応する。図３Ｅでは、「ＳＣＡ」は、少なくとも１つの遊離チオール（Ｓ−Ｈ）を有する本発明に記載のタンパク質である。下記の表２を参照。
【表２】
【００８７】
スルフヒドリル特異的リンカーを含み得る他のポリマー基本骨格は、同一出願人による米国特許第５，６４３，５７５号明細書、米国特許第５，９１９，４５５号明細書、米国特許第６，１１３，９０６号明細書（Ｕ−ＰＥＧ）、米国特許第６，１５３，６５５号明細書および米国特許第６，３９５，２６６号明細書（末端分岐ＰＥＧ）、米国特許第６，２５１，３８２号明細書（ポリＰＥＧ）および米国特許出願公開第１０／２１８，１６７号明細書（ビシン）などで開示されたものを含む。また、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ『Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ２００１』も参照。前記のそれぞれの開示は、参照により本開示に含まれる。
【００８８】
上述の通り、複合体のポリマー部分は好ましくはポリアルキレンオキシドである。より好ましくは、ポリマー部分は、実質的に非抗原性であるポリエチレングリコールである。ＰＡＯおよびＰＥＧは重量平均分子量において相当に異なり得るが、本発明の組成物に含まれるものは、独立して、約２，０００Ｄａから約１３６，０００Ｄａの重量平均分子量を本発明の大部分の態様で有する。より好ましくは、ポリマーは約３，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。非常に好ましくは、ポリマー部分は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。
【００８９】
本明細書に含まれるポリマー物質は、好ましくは 室温にて水溶性である。そのようなポリマーの非限定的な一覧は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールといったポリアルキレンオキシドホモポリマー、その共重合体およびそのブロック共重合体を含み、ただしブロック共重合体の水への溶解度が維持されることを条件とする。
【００９０】
マレイミドポリマーの、遊離システインとの、しかしリジンまたはヒスチジンとではない特異的な反応性の確認は、これらの各遊離アミノ酸とのマレイミドの反応によって達成された。
【００９１】
図４は、活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとのシステインの反応性を確認する。３ｍＭ溶液としてのシステインについての吸収が曲線Ａで表される。濃度１ｍＭでの活性化ＰＥＧ−ＭＡＬについての吸収曲線は曲線Ｃで示され、および３００ｎｍを中心とする幅広い吸収ピークによって特徴づけられる。吸収曲線Ｂは、システインおよび活性化ＰＥＧ−ＭＡＬを１：３比で合わせた溶液について取った（１ｍＭ ＰＥＧ−ＭＡＬおよび３ｍＭシステイン、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５℃）。Ｂ曲線はＡ曲線を右にシフトしてたどるが、ＰＥＧ−ＭＡＬの特徴的な３００ｎＭの幅広ピークは存在せず、活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとのシステインの反応性を確認する。ヒスチジンまたはリジンについての類似の吸収曲線（記載せず）が、使用した条件下ではこれらの残基は高度に反応性ではないことを確認する。
【００９２】
標識化またはタグ化複合体
本発明に記載のポリアルキレンオキシド結合ＳＣＡの製造に際して、複合体は、診断薬または治療薬をＳＣＡ−ポリマー複合体へ結合または複合化することによって、必要に応じてさらに修飾される。本発明に記載の抗体複合体を調製する一般的方法は、参照により本開示に含まれるShih,L.B.,et al.,Cancer Res.51: 4192 (1991) ; Shih,L.B.,and D.M.Goldenberg,Cander Immunol.Immunother.31: 197 (1990); Shih,L.B.,et al.,Intl.J.Cancer 46 : 1101 (1990); Shih,L.B.,et al.,Intl.J.Cancer 41 : 832 (1988)に記載される。間接的な方法は、ポリアルキレンオキシドが官能基を有する抗体（またはＳＣＡ）を、１または複数の生物活性分子、例えば、ペプチド、脂質、核酸（すなわち、リン酸−リジン複合体）、医薬、毒素、キレート剤、ホウ素添加剤、または検出可能な標識分子を有するキャリヤーポリマーと反応させることを含む。
【００９３】
一部の別の実施形態では、ポリアルキレンオキシド結合ＳＣＡが診断薬または治療薬と直接に複合体化または結合される。一般的手順は、診断薬または治療薬が酸化されたｓＦｖ部分へ直接結合される以外は、複合体化の間接法と同様である。参照により本開示に含まれるＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４４３，９５３号明細書を参照。
【００９４】
医薬組成物およびＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の投与
本発明の医薬組成物は、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の「治療上有効な量」または「予防的に有効な量」を含み得る。「治療上有効な量」は、目的の治療結果を達成するために、必要な投与量および期間にわたる、有効な量をいう。ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の治療上有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重といった要素、および抗体または抗体部分がその個体において目的の反応を導く能力に応じて変化し得る。治療上有効な量はまた、抗体または抗体部分の毒性または有害な作用を治療上の有益な作用が上回る量である。「予防的に有効な量」は、目的の予防結果を達成するために、必要な投与量および期間にわたる、有効な量をいう。典型的には、予防的用量は疾患以前にまたは疾患のより早期の段階で用いられるため、予防的に有効な量は治療上有効な量より少なくなる。
【００９５】
投与計画は、最適な望ましい反応（例えば治療的または予防的反応）を与えるように調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を啓示的に投与することができ、または治療状況の要件によって指示される通りに用量を比例的に低減または増加することができる。非経口 組成物を単位用量剤形で処方することは、投与の容易さおよび投与量の均一性のために特に有益である。ここで用いられる単位用量剤形とは、治療すべき哺乳類対象のための単位用量として適している物理的に別個の単位をいい；各単位は目的の治療効果を生じるよう計算された規定量の活性化合物を、必要な医薬キャリヤーと共に含む。本発明の単位用量剤形についての規格は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療的または予防的効果、および（ｂ）そのような活性化合物を各対象の感受性の治療のために混合することの本分野に内在する制限に決定されおよびそれらに直接依存する。
【００９６】
本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の治療上または予防的に有効な量の、典型的な、非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。用量の値は、緩和すべき症状の種類および重症度に伴って変化し得ることに注意する。さらに、いずれの特定の対象についても、具体的な投与計画は、個別の必要性、および組成物の投与を実施または監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整すべきであること、および、本明細書に示す投与量範囲は単なる例でありおよび請求される組成物の範囲または実施を制限しないことが意図されることを理解すべきである。
【００９７】
医薬組成物
好ましい別の一実施形態では、本発明のＳＣＡは、目的の特定のＳＣＡタンパク質の結合特異性に関係する症状を治療および／または診断するために用いられる。したがって、ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、本分野で公知である方法によって、投与されるＳＣＡの結合特性が疾患または障害の治療に有用である疾患または障害を有する動物または人へ投与される。好ましくは、ＳＣＡは本発明にしたがってポリマー結合される。
【００９８】
本発明のＳＣＡおよび複合体化ＳＣＡは、例えば投与を必要とする動物または人のような対象への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、その医薬組成物は、少なくとも１種類の結合特異性を有するＳＣＡポリペプチド、および医薬品として許容されるキャリヤーを含む。
【００９９】
「医薬品として許容されるキャリヤー」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、例えば、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、などを含む。医薬品として許容されるキャリヤーの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。多くの場合で、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールといったポリアルコール、または塩化ナトリウムを、組成物に含むことが好ましい。医薬品として許容されるキャリヤーはさらに、抗体または抗体部分の保存期間または有効性を増大する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液といった補助的物質の微量成分を含み得る。
【０１００】
本発明の組成物は必要に応じてさまざまな形に調製される。これらは、例えば、液剤（例えば注射用および輸液用溶液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームおよび坐剤といった、液体、半固体および固体剤形を含む。好ましい剤形は目的の投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体を用いる人の受動免疫化に用いられるものと同様の組成物といった、注射用または輸液用液剤の形である。好ましい投与様式は非経口である（例えば、静脈、皮下、腹腔内、筋肉内）。
【０１０１】
好ましい一実施形態では、ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は静脈輸液または注射によって投与される。別の好ましい一実施形態では、抗体は筋肉内または皮下注射によって投与される。スプレー、エアロゾルまたはミストとしての吸入による投与もまた、例えば全身吸収および／または呼吸系内での局所作用のために、その経路が有利である場合に考慮される。
【０１０２】
治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高い医薬濃度に適した他の規則的構造として処方することができる。無菌注射液は、活性化合物（すなわち，抗体または抗体部分）を、上で挙げた成分の１または組合せを含む適当な溶媒に必要に応じて組み込み、次いで滅菌ろ過を実施することによって調製することができる。
【０１０３】
一般的に，分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および上で挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌賦形剤に組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末剤の場合には、調製の好ましい方法は、あらかじめ滅菌ろ過した溶液から活性成分および他の目的の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンといったコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の遅い吸収は、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンといった、吸収を遅らせる物質を組成物に含めることによって実現できる。
【０１０４】
本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、本分野で公知であるさまざまな方法によって投与することができるが、多くの治療用途については、好ましい投与経路／様式は静脈注射または輸液である。当業者に理解される通り、投与経路／様式は目的とされる結果に応じて変化する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、例えば、不活性な希釈剤または吸収できる食用のキャリヤーと共に、経口投与することができる。ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体（および必要に応じて他の成分）は、必要に応じて、硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または対象の食事に直接組み込まれる。治療的な経口投与のためには、化合物は添加物と組み合わされおよび経口錠、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエファーなどの形で用いることができる。本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を非経口投与以外によって投与するためには、その化合物を、不活性化を防ぐ物質でコーティングするかまたはそれと同時投与する必要があり得る。
【０１０６】
補助的な活性化合物もまた医薬組成物に組み込むことができる。一部の実施形態では、本発明のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、疾患または障害に対して相加的、相乗的または補完的な治療活性または診断活性を提供する、１つ以上の追加の治療剤と共に処方されおよび／または同時に投与される。
【０１０７】
抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体の投与
例えば、本発明の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、他の標的を結合する１つ以上の別の抗体またはＳＣＡ（例えば、他のサイトカインを結合するもの、または細胞表面分子を結合するもの）、１つ以上のサイトカイン、可溶性ｈＴＮＦ−α受容体（例えば、国際公開第９４／０６４７６号パンフレット）および／またはｈＴＮＦ−α産生または活性を阻害する１つ以上の化学物質（例えば国際公開第９３１１９７５１号パンフレットに記載されたシクロヘキサン−イリデン誘導体）と共に処方および／または同時に投与することができる。さらに、本発明の１つ以上のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、前記の治療剤の２つ以上と組合せて用いることができる。そのような併用治療は、有利なことに、個別に投与された治療剤の、より低い用量を利用し得る。
【０１０８】
抗ＴＮＦ−α ＳＣＡの適応および好ましい同時投与剤
単に一例として、参照により本開示に含まれる米国特許第６，２５８，５６２号明細書および第６，０９０，３８２号明細書は、ＴＮＦ−αが疾患過程の一次または他の面の媒介因子または共媒介因子である疾患および障害の網羅的一覧を提供する。そのような疾患または障害を治療または緩和するための本分野で公知であるである薬剤が、本発明のＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡの抗ＴＮＦ−α実施形態と共に処方または同時投与されることが考えられている。要約すると、ＴＮＦ−αによって媒介されるかまたはその作用と関連する、およびしたがって、必要に応じて本分野で公知である他の治療剤と併用して、ＴＮＦ−α結合物質によって合理的に治療される疾患および障害の一覧は、米国特許第６，２５８，５６２号明細書によって例えば、敗血症、自己免疫疾患、感染症、移植／拒絶、悪性腫瘍、呼吸器障害および腸障害を含むと記載されている。
【０１０９】
これらの適応症および、適用可能な場合には、そのような適応症の治療において抗ＴＮＦ−α ＳＣＡと必要に応じて同時処方される薬剤は、下記の通りである。
【０１１０】
敗血症。
【０１１１】
敗血症に随伴する治療可能な症状は、ＴＮＦ−α媒介性敗血性ショック症候群、および随伴する低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、臓器壊死、毒性二次媒介因子の放出の刺激および凝固カスケードの活性化、内毒素性ショック、グラム陰性敗血症および毒素性ショック症候群を含む。
【０１１２】
自己免疫疾患
自己免疫疾患に随伴する治療可能な症状は、慢性関節リウマチにおける組織炎症および関節破壊、糖尿病における膵島細胞死およびインシュリン抵抗性、多発性硬化症における希突起膠細胞に対する細胞毒性および炎症性プラークの誘導を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと共に処方または同時投与することが考えられている薬剤は、ほんの数例を挙げると、例えば、副腎皮質ステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ−５７１１１ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）Ｖｏｌ．３７．Ｓ２９５ ； Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｍｅｄ．（１９９６） Ｖｏｌ．４４ ２３５Ａを参照）；５５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｉｎａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９．Ｉ／ＳＢ２１０３９６（非減少性霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅを含む、そのような自己免疫障害を治療するために利用可能な任意の本分野で公知の薬剤を含む。
【０１１３】
感染症
感染症に随伴する治療可能な症状は、ＴＮＦ−α−媒介性脳炎症、マラリアにおける毛細管血栓症および梗塞、髄膜炎における静脈梗塞、感染症例えばＨＩＶウイルス感染に二次的なカヘキシー、ＨＩＶ感染におけるウイルス増殖の刺激および中枢神経系傷害、インフルエンザといった感染症が原因の発熱および筋肉痛）を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、本分野で公知である任意の、例えば、抗生物質、抗細菌剤、抗ウイルス剤などといった抗感染剤、および非ステロイド抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）および／または感染物質および／またはその毒素または本質的成分と結合する抗体またはＳＣＡを含む。
【０１１４】
移植
移植医療、移植片の拒絶、または必要な免疫抑制剤の副作用に随伴する治療可能な症状は、移植関連効果のほんの数例を挙げると、ＴＮＦ−α媒介性同種移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、例えば、ＯＫＴ３誘導性反応を阻害する、副腎皮質ステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、および／またはＯＫＴ３、および、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体−ａ）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７−２）への抗体またはＳＣＡ結合といった免疫細胞受容体への結合に向けられる結合物質を含む。
【０１１５】
悪性腫瘍
悪性腫瘍に随伴する治療可能な症状は、悪性腫瘍におけるＴＮＦ−α−媒介性悪液質(TNFα-mediated cachexia)、腫瘍増殖、転移可能性および細胞毒性を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、本分野で公知である任意の抗腫瘍または抗癌剤を含む。
【０１１６】
肺障害
肺障害に随伴する治療可能な症状は、成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性肺炎、肺サルコイドーシス、肺線維症および珪肺症を含む。肺障害については、本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡは必要に応じて経口または鼻腔内スプレーによって投与され、または、任意の標準的な吸入系によるエアロゾルとしての投与のために処方される。そのような処方は、そのような肺疾患または障害を治療するのに適した他の薬剤、またはＳＣＡ処方の気管支への接近を促進する薬剤と同時に処方または投与することができる。
【０１１７】
腸障害
腸障害に随伴する治療可能な症状は、例えば、クローン病および／または潰瘍性大腸炎といった、炎症性腸障害の範囲を含む。本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはポリマー結合ＳＣＡと同時処方または同時投与することが考えられている薬剤は、ブデソニド；上皮増殖因子；副腎皮質ステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害因子；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害因子；ＩＬ−１受容体拮抗因子；抗ＩＬ−１βＭＡｂ；抗ＩＬ−６ＭＡｂ；増殖因子；エラスターゼ阻害因子；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦ−α抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤＴＮＦ受容体ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；５５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；インターロイキン−１０（ＳＣＨ５２０００；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）；ＩＬ４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ４作用因子（例えば、作用因子抗体）；インターロイキン−１１；プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはブデソニドのグルクロニド−またはデキストラン−結合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０ ； Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）の拮抗因子；シプロフロキサシン；およびリグノカインを含む。
【０１１８】
診断法および測定法：抗ＴＮＦ−α ＳＣＡまたはＳＣＡ−複合体
本発明の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体は、従来のイムノアッセイを用いて、血清または血漿または他の臨床標本を含む生物試料中といった目的の試料中のｈＴＮＦ−αを検出するのに用いることができる。これらは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫化学法を含む。
【０１１９】
本発明は、生物試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させること、およびｈＴＮＦ−αと結合した抗体（または抗体部分）または非結合ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を検出し、それによって生物試料中の生物試料中のｈＴＮＦ−αを検出することを含む、ｈＴＮＦ−αを検出するための方法を提供する。結合または非結合抗体の検出を円滑にするため、ＳＣＡは検出可能な物質を用いて直接的にまたは間接的に標識化されている。適当な検出可能な物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例はルミノールを含む；および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０１２０】
随意的な一実施形態では、本発明のＳＣＡは標識化されていないが、ｈＴＮＦ−αは、ｒｈＴＮＦ−α標準物質が検出可能な物質で標識化されており、かつ未標識の抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を用いる競合免疫測定法によって体液中で測定される。この測定法では、生物試料、標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質、および抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体を混合し、さらに未標識のＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体と結合した標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質の量が測定される。生物試料中のｈＴＮＦ−αの量は、抗ｈＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体と結合した標識化ｒｈＴＮＦ−α標準物質の量と反比例する。
【０１２１】
米国特許第６，２５８，５６２号明細書および第６，０９０，３８２号明細書は、Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂはまたヒト以外の種に由来するＴＮＦ−α、特に霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよびアカゲザル）、ブタおよびマウス由来のＴＮＦ−αを検出するのに用いることができることを示し、本発明の抗ＴＮＦ−α ＳＣＡおよび／またはＳＣＡ−ポリマー複合体はその目的にもまた容易に使用されると考えられる。
【実施例】
【０１２２】
下記の実施例は本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、しかし本発明の有効な範囲をいかなる方法でも制限しないことが意図される。
【０１２３】
実施例１
少なくとも１つの遊離チオールを有するＳＣＡタンパク質の設計
Ｄ２Ｅ７ Ｍａｂの可変ドメインに基づいて、９種類のＳＣＡポリペプチドが設計された。本明細書で「Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ」の語は、別に示されない限り、本明細書に例示するようにＤ２Ｅ７可変ドメインを用いて作製されたＳＣＡの任意のものを称する。それぞれ下記の通り構築された。
【０１２４】
上記の通り、完全に合成の遺伝子が、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって、長さ２０塩基から１０２塩基の範囲にわたる１４種類の長い重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築された。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発をさらに用いて、元の配列の他の変異体を構築した。発現されたＳＣＡタンパク質は、ペプチドリンカーによって連結された、Ｄ２Ｅ７Ｍａｂの完全な可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）部分を含む。２つのリンカーが用いられた。
【０１２５】
リンカー「２１８」は、Filpula et al.,1996 (Antibody Engineering: A Practical Approach,Oxford University Press,pp 253-268)に記載されている１８アミノ酸残基２１８−リンカーである。
【０１２６】
「（ＧＧＧＧＳ）３リンカー」（配列番号４２）は、Huston JS et al,1988,Proc Natl Acad Sci (USA) 85 : 5879-5883に記載された１５アミノ酸残基リンカーである。上の表１に記載される通り、一部の場合には、金属固定化金属イオン親和性 クロマトグラフィー （「ＩＭＡＣ」）による精製を容易にするために、Ｃ末端のヒスチジン６個のタグ（ｈｉｓ６）（配列番号４３）が含められた。
【０１２７】
完成した遺伝子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （以前はＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって製造）でのＤＮＡ配列確認のために、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドへクローニングされた。ドメイン方向、リンカー、および遊離システインの配置を上記の表１に要約する（クローン番号２−７−ＳＣ−１から９）。
【０１２８】
クローン番号２−７−ＳＣ−１から９のそれぞれを発現している核酸鎖は下記の通り調製された。
【０１２９】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡのクローニングおよび発現の方法
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ遺伝子の合成ＶＬ−ＶＨ型は、２回のＰＣＲによって、６種類の重複するオリゴヌクレオチドをＶＬ鎖のテンプレートとして、および６種類の重複するオリゴヌクレオチドをＶＨ鎖のテンプレートとして用いて構築した。Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子のＶＬ鎖およびＶＨ鎖は、２１８リンカーで連結された。コードされたタンパク質のＣ末端には、ＩＭＡＣ精製目的のための６個の反復するヒスチジンが続いた。
【０１３０】
ＶＬについての５’から３’末端への６種類のオリゴヌクレオチドは下記の通り設計された：
ＶＬ１：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号１９）
ＶＬ２：ＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧ
ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣ
ＣＣＴ（配列番号２０）
ＶＬ３：
ＣＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＧＧＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＧＧ
（配列番号４５）
ＶＬ４：ＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴ
ＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣ（配列番号２１）
ＶＬ５：ＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧ
ＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＧＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＴＴＴ
ＴＧＧＣＣＡＧ（配列番号２２）
ＶＬ６：ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣ
ＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡ（配列番号２３）。
【０１３１】
そのうち、ＶＬ１、２、４および５は順方向（センス）オリゴヌクレオチドであり、およびＶＬ３および６は逆方向オリゴヌクレオチドであった。
【０１３２】
ＶＨについての５’から３’末端への６種類のオリゴヌクレオチドは下記の通り設計された：
ＶＨ１：ＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ（配列番号２４）。
【０１３３】
ＶＨ２：ＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡ
ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧ
ＧＧＴＣＣＧＧ（配列番号２５）
ＶＨ３：ＣＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣ
ＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＴ（配列番号２６）
ＶＨ４：ＴＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧ
ＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣ（配列番号２７）
ＶＨ５：ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣ
ＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴ
ＴＡＣＴＧＴＧＣＧ（配列番号２８）
ＶＨ６：ＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＡ
ＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＡＣ（配列番号２９）
そのうち、ＶＬ１、２、４および５は順方向オリゴヌクレオチドであり、およびＶＬ３および６は逆方向オリゴヌクレオチドであった。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの合成ＶＬおよびＶＨのために設計されたすべてのオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって合成された。
【０１３４】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ 遺伝子のＶＬは１回目のＰＣＲで、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてオリゴヌクレオチドＶＬ１、２、３、４、５および６（各１ｐｍｏｌ）、順方向プライマーとして５'ＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ（配列番号３０）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ（配列番号３１）（５０ｐｍｏｌ）を用いて組み立てられた。
【０１３５】
ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１３６】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子のＶＨは１回目のＰＣＲで、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてオリゴヌクレオチドＶＨ１、２、３、４、５および６（各１ｐｍｏｌ）、順方向プライマーとして５'ＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡ（配列番号３２）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号３３）（５０ｐｍｏｌ）を用いて組み立てられた。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１３７】
表１の変異ＳＣＡタンパク質をコードする変異Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の遺伝子構造は、部位特異的突然変異誘発によって達成された。例えば、２−７−ＳＣ−５はＤ２Ｅ７ＳＣＡ（２−７−ＳＣ−１）の突然変異体であり、２１８リンカー中の残基１０９でのセリンからシステインへのアミノ酸変化を有する。この遺伝子は２回のＰＣＲによって、２−７−ＳＣ−１ ＤＮＡをテンプレートとしておよび４種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて作製された。
【０１３８】
クローン２−７−ＳＣ−８の構造のためのプライマーは下記の通り設計された：
順方向プライマー１：ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣ（配列番号３７）
順方向プライマー２：
ＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＣ（配列番号３８）
逆方向プライマー１：ＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴ（配列番号３９）
逆方向プライマー２：ＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＣＣ（配列番号４０）
２つの断片が別々に、１回目のＰＣＲで、２通りのプライマー組合せ（順方向プライマー１および逆方向プライマー１、および順方向プライマー２および逆方向プライマー２、各５０ｐｍｏｌ）によって、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびテンプレートとして２−７−ＳＣ−８ ＤＮＡ（１０ｎｇ）を用いて増幅された。２−７−ＳＣ−８ についてのＤ２Ｅ７ ＳＣＡ 遺伝子変異体は、２回目のＰＣＲでのハイブリッド伸張によって、順方向プライマー１および逆方向プライマー２（各５０ｐｍｏｌ）、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびテンプレートとして１回目のＰＣＲからの２つの断片（各１０ｎｇ）を用いて完成した。
【０１３９】
残基１０９にシステインを有する、２−７−ＳＣ−８ＳＣＡ遺伝子の完成したＰＣＲ産物は、下記の通り、ベクターｐＨｉｌＤ２にクローニングされおよびＰｉｃｈｉａＧＳ１１５株を形質転換するのに用いられた。
【０１４０】
表１の残りの遺伝子は、同様の部位特異的突然変異誘発工程によって作製された。２−７−ＳＣ−２遺伝子（配列番号２）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にシステインコドンＴＧＣをコードした。２−７−ＳＣ−３遺伝子（配列番号３）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にシステインコドンＴＧＣをコードした。２−７−ＳＣ−４遺伝子（配列番号４）については、ＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、システインコドンＴＧＣをＣ末端ＶＨセリンコドンの直後にコードした。２−７−ＳＣ−６遺伝子（配列番号６）については、中央のオリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを２１８リンカーの２位にコードし、およびＣ末端逆方向プライマーがシステインコドンＴＧＣを、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にコードした。２−７−ＳＣ−７遺伝子（配列番号７）については、中央のオリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号４２）の残基５位に対応する、ヌクレオチド３７６〜３７８にコードした（図１Ｇ）。
【０１４１】
２−７−ＳＣ−８遺伝子（配列番号８）については、ＰＣＲ順方向オリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣをＮ末端ＶＬアミノ酸Ａｓｐの前にコードし、およびＰＣＲ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーがシステインコドンＴＧＣを、６個のＣ末端ヒスチジンコドンの後にコードした。２−７−ＳＣ−９遺伝子（配列番号９）については、ＧＧＧＧＳ（配列番号４４）をコードする５コドンリンカーが１８コドン２１８リンカーを代替した。
【０１４２】
完全なＤ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の組み立ておよびＤ２Ｅ７ＳＣＡのＰｉｃｈｉａにおける発現のために、シグナル配列をＤ２Ｅ７ＳＣＡ遺伝子の５’末端に、２回目のＰＣＲにおいて、２ｍＭトリス（ｐＨ８．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭｄＮＴＰ、２単位のＰｌａｔｉｎｕｍタグポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、テンプレートとしてＤ２Ｅ７ＳＣＡ 遺伝子のＶＬおよびＶＨの１回目のＰＣＲ産物（各１ｎｇ）、順方向プライマーとして５'ＣＣＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号３４）（５０ｐｍｏｌ）および逆方向プライマーとして５'ＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号３５）（５０ｐｍｏｌ）を用いて加えた。
【０１４３】
ＰＣＲは、９４℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の３０サイクル、続いて７２℃１０分間で実施した。
【０１４４】
５'末端シグナル配列を有する、２回目のＰＣＲで組み立てられたＤ２Ｅ７ＳＣＡの遺伝子産物は、１％アガロースゲルで精製され、ＥｃｏＲ１で３７にて６０分間消化され、およびベクターｐＨｉｌＤ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲ１部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃にて６０分間ライゲーションした。１００μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション反応産物で形質転換し、および氷上で３０分間、および４２℃にて４５秒間インキュベートし、次いで１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ培地を添加し、および３７℃にて５０分間、２５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。０．１ｍｌの形質転換混合物をＬＢアンピシリン（１０ｍｇ／Ｌ）平板に播種しおよび３７℃にて１６時間インキュベートした。
【０１４５】
ＬＢアンピシリン（１０ｍｇ／Ｌ）平板上のｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドで形質転換されたＤＨ５ａクローンのいくつかを、２ｍｌのＬＢ培地中で３７℃にて１６時間培養した。各クローンからのＤ２Ｅ７ＳＣＡのプラスミドミニプレパレーションを調製した。ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドのＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルＤＮＡ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによって確認された。
【０１４６】
表１に列挙された変異ＳＣＡクローンのそれぞれは、下記の手順によって作製された。Ｐｉｃｈｉａ形質転換のために、ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドをＳａｌ１を用いて３７℃にて６０分間消化し、および、フェノール抽出およびエタノール沈澱後に、１０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＰｉｃｈｉａＧＳ１１５細胞を、５０ｍｌのＹＰＤ培地中で３０℃にて１６時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら培養し（ＯＤ６００＝１．２）、氷冷蒸留水で３回および１Ｍソルビトールで１回洗浄し、および最後に０．１ｍｌの１Ｍソルビトールに再懸濁した。
【０１４７】
調製されたＰｉｃｈｉａＧＳ１１５細胞を、Ｓａｌ１消化した１０μｇのｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドと、氷冷した０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベット中で混合し、および、８００Ｖ、１０ｐＦおよび１２９ の条件下で、エレクトロセルマニピュレーター（ＢＴＸ）によってパルスを加えた。パルス後に、１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールをエレクトロポレーションキュベットに加えた。内容物全部を１５ｍｌ試験管へ移し、および３０℃にて１時間インキュベートした。形質転換混合物の０．２ｍｌをＲＤＢ培地平板に播種し、および３０℃にて４日間インキュベートした。
【０１４８】
ＲＤＢ平板由来の、ｐＨｉｌＤ２−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡプラスミドで形質転換されたＰｉｃｈｉａクローンのいくつかを、５００ｍｌフラスコ中の２５ｍｌのＢＭＧＹ培地に接種し、および３０℃にて２５０ｒｐｍで振とうしながら２日間インキュベートした。細胞を３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって室温にて採取し、５０ｍｌフラスコ中の５ｍｌのＢＭＭＹ培地に再懸濁して発現を誘導し、および３０℃にて振とうしながらさらに２日間インキュベートした。各培養から１ｍｌの試料を超遠心管に移し、および１４，０００ｒｐｍで２分間室温にて遠心分離した。各培養の上清からの４０μｌの試料を、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。
【０１４９】
実施例２
ＳＣＡタンパク質の組換え発現および精製。
【０１５０】
実施例１に記載のＳＣＡタンパク質（クローン番号２−７−ＳＣ−１から９）は、すべて酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの発現および分泌によって作製された。酵母α接合因子に由来する分泌シグナル配列が、これらのＳＣＡタンパク質それぞれについての成熟コード配列の直接前に挿入された。
【０１５１】
このシグナルペプチドのアミノ酸配列はＭｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ ^ Ａｌａ （配列番号３６）であり、「^」は切断部位を示す。我々はまた、そのシグナルのこの２０番目のアミノ酸（^の次のアラニン）も我々の構造に含めた。したがって、各成熟ＳＣＡタンパク質のそれぞれのアミノ末端はこのアラニンを含み、その後に図１Ａ〜１Ｆに記録される完全なアミノ酸配列が続く。Ｎ末端タンパク質配列分析は、これらの正しくプロセシングされた配列を確認した。これらの変異ＳＣＡ遺伝子は、Ｐｉｃｈｉａ転移プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中へＥｃｏＲＩ部位で個別にライゲーションされ、および酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主ＧＳ−１１５へ形質転換した。これらの手続のための詳細な手順書は、参照により本開示に含まれるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＰｉｃｈｉａ発現キット取扱説明書カタログ番号Ｘ１７１０−０１（１９９４）に示される。発現の最初の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって実施した。
【０１５２】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡクローンのＰｉｃｈｉａ発酵
クローン２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−４、２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７を含む、抗ＴＮＦ−α ＳＣＡＤ２Ｅ７のすべての発現クローンは、メタノール資化性酵母であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生成され、およびタンパク質は培地中へ分泌された。Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ変異株の高密度発酵はＹＮＢおよびビオチンを添加した基礎培地であるＢＭＧＹ培地中で（「培地組成物」を参照）、自動供給制御発酵槽（型番：ＢｉｏＦｌｏｗ３０００およびＢｉｏＦｌｏｗ ＩＶ； ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０１５３】
ＢＭＧＹ中で１６〜２０時間、（ｃ）グリセロール（５０％）中で増殖期４時間、および（ｄ）メタノールを用いて４５時間Ｄ２Ｅ７変異株の誘導。各成分の供給は、３０％に設定された溶存酸素レベルに関して最適化された。培養温度は２９℃に設定され、およびｐＨは運転中には水酸化アンモニウムおよびリン酸を用いて６．０に維持された。さまざまなパラメーターを６８時間の発酵期間にわたって監視し、ここで、生育する培養のＯＤ６００値は（ｂ）期の終わりに０．５から１２５へ、グリセロール供給期（ｃ期）の終わりに１２５から２００へ、および最終的に，誘導期（ｄ期）の終わりに２００から３００へ到達した。
【０１５４】
平均して、発酵上清中のＤ２Ｅ７変異株の発現は５０ から１００ ｍｇ／Ｌの間であった。カルボキシル末端に遊離 システインが組み込まれヒスチジン尾部が続くＶＬ−ＶＨ変異株である２−７−ＳＣ−２は、発酵中に優れた再現性で良好な成績を上げた最も頑健なクローンであることが見出された。
【０１５５】
供給品の説明
ＢＭＧＹ（Ｌ当たり）
酵母抽出物：
ペプトン：
グリセロール：
リン酸緩衝液：（１Ｍ、ｐＨ６．０）
ＹＮＢ：
ビオチン：
ＦＭＴ３０（Ｂｒｅｏｘ）：
誘導物質
メタノール
酸素
圧縮酸素。
【０１５６】
実施例１のＳＣＡタンパク質は上清から純度９５％超へ、単純な２または３のカラムクロマトグラフィー手順によって精製された。
【０１５７】
ヒスチジンタグを用いたクローン２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−５、２−７−ＳＣ−７ Ｄ２Ｅ７ＳＣＡからのタンパク質の精製
Ｄ２Ｅ７変異体の、２−７−ＳＣ−２、ＳＣＡ２−７−ＳＣ−３、ＳＣＡ２−７−ＳＣ−４、ＳＣＡ２−７−ＳＣ− ５、および ２−７−ＳＣ−７は発酵上清から、イオン交換およびアフィニティカラムクロマトグラフィーの組合せを用いて精製した。使用した培地を２０ｍＭトリスｐＨ７．４および５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで交換する一方、上清を高度にダイアフィルトレーションして試料を濃縮した。緩衝液を交換した試料を次いでＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー（品番１７−０７０９−０１；Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡは指定の条件下ではＤＥＡＥカラムに結合しなかった。ＤＥＡＥカラムからの素通り画分を、５０ｍＭトリスｐＨ８．０および０．３ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析し、および同一の緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に加えた。非特異的結合は、１０％グリセロールを緩衝液Ａに含む緩衝液Ｂを用いた厳密な洗浄を用いて破壊され、その後に緩衝液Ａによるグリセロールの除去を行った。さらに低親和性の相互作用は、カラムの３倍容量の６０〜１００ｍＭイミダゾール（２−７−ＳＣ−２についてのみ１００ｍＭ）を通すことによって洗い流した。最後に、結合したＳＣＡをＮｉ−ＮＴＡカラムから、カラムの３〜５倍容量の２５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。洗浄および溶出の両方について、イミダゾールは緩衝液Ａで調製した。
【０１５８】
ピーク画分をプールし、およびＤＥＡＥ緩衝液である緩衝液Ｃに対してよく透析した。透析した試料は高速遠心分離によって清澄化し、および精製の最終段階としてＤＥＡＥカラムを通した。次いで、将来の使用のために−２０℃にて保存する前に、精製された試料のタンパク質濃度をＵＶ２８０によって、およびＢＣＡ法によって測定した。
【０１５９】
ヒスチジンタグの無いタンパク質２−７−ＳＣ−４Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの精製
プロテインＬは多数の異なる種のＶＬドメインと強く結合する。その結合は極めて種特異的であり、およびまたサブタイプ特異的である。２−７−ＳＣ−４のＶＬドメインをプロテインＬによって認識でき、および相互作用のこの特異性を利用して、我々は２−７−ＳＣ−４を１段階で、ダイアフィルトレーションした試料から直接精製した。プロテインＬカラム（品番ＣＬＢＬ ２０１−５，ＣＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）からの２−７−ＳＣ−４の低ｐＨ溶出は、ＳＣＡの構造的または機能的完全性に影響しなかった。要約すると、発酵上清をダイアフィルトレーションし、およびカラムへ試料を負荷するためにＰＢＳで交換した。非特異的に結合したタンパク質は、負荷後に多量のＰＢＳを用いて洗い流した。
【０１６０】
ＳＣＡタンパク質はカラムからｐＨ２．０のグリシン緩衝液（１０ｍＭ）を用いて溶出し、および溶液を中和するために直ちに３Ｍトリスへ回収した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、ポジティブ画分をプールし、およびＰＢＳに対して透析した。ＳＣＡタンパク質は透析後に高速遠心分離によって清澄化し、タンパク質濃度を測定し、および将来の使用のために−２０℃にて保存した。
【０１６１】
代替の、ＨＳ（ＰＯＲＯＳ５０ＨＳ、コード：１−３３５９−０７；Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＱ−セファロースＦＦ（品番１７−０５１０−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のようなより好ましくない方法もまた、ＳＣＡ精製に効果的に用いられた。
【０１６２】
下記の表は、さまざまなカラムによる２−７−ＳＣ−２ Ｄ２Ｅ７変異体の精製、各精製工程後の収率パーセンテージ、および各変異体についての精製の品質を示す。
【表３】
【０１６３】
図２Ａおよび２Ｂは、２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡタンパク質の各精製工程からの試料の代表的なＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。ゲルはクマシーブルーを用いて染色した。最終試料の純度はゲルデンシトメトリースキャンから９５％と推定された。少量の５４ｋＤａジスルフィド結合二量体を染色ゲル上に見ることができる。
【０１６４】
実施例３
ポリエチレングリコールのマレイミド誘導体の安定性および反応性
アミノ酸残基とのマレイミド反応性
マレイミドポリマーの、リジンまたはヒスチジンとでなく、遊離システインとの特異的反応性の確認は、これらの各遊離アミノ酸とのこれらの化合物の反応によって達成された。図４Ａ〜４Ｃに示す通り、使用した標準的な反応条件下で、システインは、ＰＥＧ−マレイミドと高度に反応性であるが、ヒスチジンまたはリジン（記載せず）はそうではない。
【０１６５】
活性マレイミド基の分析および安定性
官能基分析は下記の通り２段階で実施した：
ＭＡＬ−ＰＥＧのシステインとの反応、および
反応後の残りの未反応システインの、ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（「ＤＴＮＢ」）を用いた滴定による測定
活性ＭＡＬ−ＰＥＧの測定は、反応モル比１：３（ＭＡＬ−ＰＥＧ：システイン）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６および１ｍＭ ＥＤＴＡで実施した。
【０１６６】
反応は下記の通り実施した：
システインのＨ２Ｏ溶液の１／４０容量を１ｍＭ ＰＥＧ溶液へ加え、終濃度３ｍＭとした。混合物を２５℃にて暗所で１０分間インキュベートし、その後ＤＴＮＢ滴定を実施した。ＤＴＮＢ滴定で、システインおよびＣｙｓ−ＭＡＬ−ＰＥＧ混合物を含む反応混合物の１／５０容量を、０．２〜０．３ｍＭ ＤＴＮＢを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３および１ｍＭ ＥＤＴＡへ加えた。残留システインの終濃度は０．０４〜０．０６ｍＭの間であった。
【０１６７】
４１２ｎｍでの吸光度を、２５℃にて５分間の平衡後に、１３，３００Ｍ−１ｃｍ−１をＤＴＮＢの吸光係数として用いて記録した。ＭＡＬ−ＰＥＧのベータ−メルカプトエチルアミンとの反応もまた調べた。ベータ−メルカプトエチルアミンは空気に敏感でありおよび吸湿性であるため、この反応は定量的でない。ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性は２４０から４００ｎｍの間のＵＶスキャンによって監視した。ＭＡＬ−ＰＥＧは３００ｎｍに最大吸収を有した。そのピークは、システインとの反応後または０．１ Ｎ ＮａＯＨの存在下で３７℃にて２時間加水分解後に消失した。
【０１６８】
ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性
ＭＡＬ−ＰＥＧの安定性は、ｐＨ、温度、およびインキュベート時間に依存する。３００ｎｍでの吸光度の低下が１０％未満であれば安定とみなした。
【０１６９】
１ｍＭ ＭＡＬ−ＰＥＧは４℃にて少なくとも２４時間、試験したすべての緩衝液（ｐＨ５、ｐＨ６、およびｐＨ７リン酸緩衝液）中で安定である。２５℃およびｐＨ５．０で、ＭＡＬ−ＰＥＧは３３時間安定である。したがって、好ましいＰＥＧ化条件は、ｐＨ５またはｐＨ６、２５℃２時間；または４℃２４時間；またはｐＨ５、２５℃２４時間である。
【０１７０】
システインとのＭａｌ−ＰＥＧ反応の特異性
システインとの反応は、反応ｐＨ（５、６、または７）および温度（４℃または２５℃）にかかわらず、２分未満で完了した。
【０１７１】
リジンとの反応（Ｌｙｓ：ＭＡＬ−ＰＥＧ＝１５：１）は、ｐＨ５およびｐＨ６緩衝液中の４℃または２５℃にての２４時間インキュベート中に観察されなかった。しかし、ｐＨ７、２５℃で、１０％を超えるＭＡＬ−ＰＥＧが２４時間のインキュベート中にリジンと反応した。ヒスチジンとの反応は、モル比１５：１（ヒスチジン：ＭＡＬ−ＰＥＧ）ｐＨ５、６、および７での４℃または２５℃にての２４時間インキュベート中にみられなかった。
【０１７２】
実施例４
ＳＣＡタンパク質のＰＥＧ化
４Ａ．材料および方法
ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０およびＧ−２５ ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７−１４０８−０１，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびＰｏｒｏｓ５０ミクロンＨＳメディア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ｍＰＥＧ−マレイミド化合物はＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ； ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）から購入したかまたはＥｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．にて合成した。
【０１７３】
この試験で使用したＰＥＧ−ＭＡＬポリマーは、４０ｋＤａ分枝鎖ＰＥＧ２、２０ｋＤａ直鎖ＰＥＧ、５ｋＤａ直鎖ＰＥＧ、２０ｋＤａビス−ＭＡＬ二官能性ＰＥＧ、および４０ｋＤａ分枝鎖Ｕ−ＰＥＧを含んだ。Ｎ−エチルマレイミドおよび６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはＳｉｇｍａから購入した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ（登録商標）はＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手した。 ＤＭＳＯ，（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｉｓｓｏｔａ）。ストレプトアビジン−フィコエリトリンはＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。９６ウェルマイクロタイタープレートはＭｉｄｗｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。
【０１７４】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼはＳｉｇｍａから、および ＴＭＢペルオキシダーゼ基質はＭｏｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）からであった。ＴＮＦ−αはＣｈｅｍｉｃｏｎ （Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。Ｔｉｔｒｉｓｏｌ（登録商標）ヨウ素溶液はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。
【０１７５】
４Ｂ．Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの還元
実施例３によって単離されたＳＣＡのＣ末端遊離システイン残基またはリンカーを、ＭＡＬ−ＰＥＧとの反応の前に還元した。還元溶液は、３ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８を含んだ。還元は３７℃にて２時間実施した。遊離ＤＴＴは１５ｍｌの試料についてはＨｉＰｒｅｐ（登録商標）脱塩カラムで、または４ｍｌの試料についてはＰＤ−１０で除去した。カラムは１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、２ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した。還元および脱塩後のＤ２Ｅ７ＳＣＡの回収率は８５％であった。ベータ−メルカプトエチルアミンおよびベータ−メルカプトエタノールを含む他の還元剤もまた、改変した手順での使用に成功した。スルフヒドリル基定量を、参照により本開示に含まれるＧｒａｓｓｅｔｔｉ ＤＲ ｅｔ ａｌ，１９６７，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ １１９： ４１−４９，および Ｒｉｄｄｌｅｓ ＰＷ ｅｔ ａｌ，１９７９，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９４： ７５−８１による記載通りに実施した。ＳＣＡ１当たり１のチオールのほぼ定量的な還元が達成された。
【０１７６】
４Ｃ．ＳＣＡのＰＥＧ化および精製
方法
実施例３によって単離されたＳＣＡタンパク質を、ＰＥＧマレイミド化合物とのシステイン特異的反応によってＰＥＧ化した。２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５を、ＰＥＧ−ＳＣＡ特徴づけの広範囲な試験のために選択した。これらのＳＣＡタンパク質に関して、５ｋＤａ、２０ｋＤａ、４０ｋＤａ（分枝鎖）およびビス−マレイミド化合物とのマレイミド−ＰＥＧ複合体を調べた。Ｎ−エチルマレイミドとのＳＣＡタンパク質の反応は、遊離チオールをブロックするが加わる分子量が最小である対照結合反応を提供した。他のＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質を、ＢＩＡｃｏｒｅ分析の項に列挙する通りの選択されたＰＥＧ−マレイミドポリマーを用いて修飾した。
【０１７７】
反応緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ還元ＳＣＡ、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、およびＰＥＧマレイミド化合物を、１０：１の反応モル比（ＰＥＧ：Ｄ２Ｅ７）で含んだ。反応は２５℃にて窒素中で２時間実施した。
【０１７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した複合体化の典型的な収率は８０％であった。未反応ＳＣＡ、高分子量不純物、遊離ＰＥＧ、副反応産物、およびエンドトキシンからのＰＥＧ−ＳＣＡの精製にＨＳカラムを用いた。より好ましくない方法では、ＳおよびＳＰカラムもまた使用に成功した。カラム平衡化緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含み、および溶出緩衝液は１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０から成った。遊離ＰＥＧは素通り画分に含まれた。ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体は、結合したＰＥＧをより多数有する複合体が先に溶出し、単一のポリマーが結合した複合体が続き、および最後に未反応Ｄ２Ｅ７ＳＣＡが、連続的に溶出した。異なるサイズのＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７複合体は、したがって、異なる濃度のＮａＣｌで溶出した。
【０１７９】
４Ｄ．Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの還元−結果要約
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中で作製されおよび 記載の通り精製されたＤ２Ｅ７ ＳＣＡは、ＭＡＬ−ＰＥＧ．との反応の前に還元しなければならない。
【０１８０】
濃度０．５ｍＭから５０ｍＭのＤＴＴを試験した。二量体を単量体に還元するためには０．５ｍＭが十分であることが示された。１０ｍＭより高濃度のＤＴＴはいくらかの沈澱を生じた。使用したＤＴＴの濃度が高いほど、沈澱したＤ２Ｅ７ ＳＣＡの量は多かった。沈澱は変性Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡと思われた。２ｍＭ ＤＴＴが標準的なＰＥＧ化手順に選択された。
【０１８１】
２ｍＭから１０ｍＭのベータ−メルカプトエチルアミン、グルタチオン、およびシステインもまた調べた。二量体を単量体へ還元するためには１０ｍＭより高い濃度が必要であったことが示された。
【０１８２】
０．５ｍＭのＤＴＴは、２−７−ＳＣ−２二量体から単量体への還元において、１０ｍＭの他の還元剤と同程度に効率的であった。
【０１８３】
還元後の複合体の収率は、開始時の還元ＳＣＡタンパク質の約８０％であった。
【０１８４】
４Ｅ．ＰＥＧ化−結果要約
１：１から１０：１（ＭＡＬ−ＰＥＧ：Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ）にわたる反応比をＰＥＧ化収率についてｐＨ６．０で調べた。複合体の公衆率を与えるためには、１：４の比が必要な最小限であった。
【０１８５】
１０分から２４時間の反応時間を２５℃にて、および１８時間４℃にて試験した。反応は２５℃では１０分間（試験した最短時間）で完了したことが示された。
【０１８６】
タンパク質の高濃度（例えば、１ｍｇ／ｍｌより大）は、収率が低下するため、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの遊離システイン残基のＭＡＬ−ＰＥＧとの反応には望ましくない。このことは、非特異的複数ＰＥＧ化のための最適手法とは対照的である。タンパク質濃度０．５、１．５、２．０、２．５、および３ｍｇ／ｍｌを試験した。０．２〜１ｍｇ／ｍｌのＤ２Ｅ７ ＳＣＡタンパク質が、複合体を構築するために好ましい濃度として用いられた。
【０１８７】
反応ｐＨ５〜８を調べた。ＰＥＧ化には、ｐＨ６．０を用いた。
【０１８８】
複合体化していないＤ２Ｅ７ＳＣＡは、再複合体化に再利用することができた。第２の複合体化反応からの収率は、最初のＤ２Ｅ７ ＳＣＡ ＰＥＧ化について得られた収率と同様であった。
【０１８９】
複合体化の最高収率は８５％であった。全体として、結果は、設計された１遊離チオール変異ＳＣＡタンパク質を用いた頑健な複合体化法によって、モノＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質が良好な収率で生じ得ることを実証した。
【０１９０】
４Ｆ．精製結果要約
ポリエーテルスルホン膜を用いた限外濾過は、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質の大部分が膜に吸着されて失われたため、このタンパク質およびその複合体の濃縮および緩衝液交換に用いることはできない。
【０１９１】
Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、およびＡｍｉｃｏｎといったＭｉｌｌｉｐｏｒｅ再生セルロース膜では本タンパク質の回収率１００％であった。０．２μｍ低タンパク質結合無菌フィルターではタンパク質の１０％損失があった。２段階の精製、２段階の濃縮、および１段階のろ過後の総収率は３０〜４０％であった。
【０１９２】
精製されたＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質はＳＤＳＰＡＧＥ分析に供し、およびクマシーブルー染色で可視化した（データ記載せず）。分析は、痕跡量（１％以下）の未反応ＳＣＡタンパク質が精製４０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧおよび２０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ反応物中に残存したことを示した。ＳＤＳＰＡＧＥゲルのヨウ素染色は、ポリエチレングリコール含有化合物を示すが、また精製４０ｋＤａＭＡＬ−ＰＥＧおよび２０ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ反応物中に検出可能であった痕跡量（＜１％）の遊離ＰＥＧを明らかにした。
【０１９３】
４０ ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ 反応物はまた時々、痕跡量（~１％） の非常に高い分子量の ＰＥＧ不純物を示した。 非常に高い分子量範囲のポリマーはまた、開始材料の未反応４０ ｋＤａ ＭＡＬ−ＰＥＧ ポリマー中にも検出可能であった。Ｎ−エチルマレイミド還元は、１個の遊離システインを有するＳＣＡ タンパク質における二量体形成を完全に遮断する。
【０１９４】
４Ｇ．イオン交換クロマトグラフィーによるエンドトキシンの除去
タンパク質試料中に存在するエンドトキシンを、ＤＥＡＥまたはＨＳカラムによって除去した。ｐＨ７〜８で、エンドトキシンはＤＥＡＥカラムに結合した一方、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡは素通り画分中に存在し、これに対してｐＨ５．０では、エンドトキシンは素通り画分中に存在しおよびＤ２Ｅ７ＳＣＡはＨＳカラムに結合した。ＨＳカラムはエンドトキシンをＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質から除去するのに用いられた。カラム平衡化緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含み、および溶出緩衝液は１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含んだ。精製試料中の典型的なエンドトキシン値は１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１９５】
実施例５
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの分析的特徴づけ。
【０１９６】
５Ａ．タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度はＵＶによって２８０ｎｍにて測定した。実施例３で得られたＳＣＡの吸光係数は１．２４ｍｌ／ｍｇ・ｃｍであった。濃度はまた、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からのＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質検定試薬キットとして入手したビシンコニン酸検定法（「ＢＣＡ」）によって、リゾチームまたはＦａｂを標準物質として使用して確認した。ＢＣＡ検定法は、取扱説明書に従って、および本質的に、参照により本開示に含まれるＳｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．１９８５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６−８５の方法に従って実施した。
【０１９７】
タンパク質濃度測定結果
２８０ｎｍでのＵＶ（データ記載せず）および、上記で考察した通り、ヒトＦａｂを標準物質として用いたＢＣＡは、タンパク質濃度測定において同様の結果を与えた。
【０１９８】
ＢＣＡ分析のために、ＥＤＴＡは還元後のＤＴＴと共に除去すべきであり、それはこれらの試薬は本検定法に干渉するからである。
【０１９９】
動物実験についてのすべての試料は、タンパク質含量に関してＵＶによって分析しおよびリゾチームを標準物質として用いてＢＣＡによって確認した。
【０２００】
５Ｂ．抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡポリクローナル抗体およびビオチン化抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体
抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体の精製
抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡ抗体をウサギで作製し、および、プロテインＡクロマトグラフィーおよびＤ２Ｅ７ＳＣＡ−結合アフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製した。プロテインＡカラム精製のために、抗体を２倍容量のトリス緩衝液で希釈して終濃度を０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０２％ＮａＮ３とした。希釈した試料を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０２％ＮａＮ３で平衡化した２ｍｌプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに、プロテインＡ樹脂に対して等量の抗血清として負荷した。
【０２０１】
抗２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡは５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて、１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０へ溶出した。抗体濃度は２８０ｎｍにて、吸光係数０．８ｍｌ／ｍｇ・ｃｍを用いて測定した。Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ−結合アフィニティカラムを、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質の遊離システイン残基とのＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌのカップリング反応によって作製した。具体的には、２倍容量の５０ｍＭリン酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８を用いて洗浄した７ｍｌまでのＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ樹脂を、６．５ｍｌまでの１．４５ｍｇ／ｍｌ ２−７−ＳＣ−２ ＳＣＡと２５℃にて１５分間混合した。カップリング反応を、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定することによって監視した。上清中のタンパク質濃度は８０％減少した。樹脂を３倍容量の５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．８、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、および次いで５０ｍＭシステインで４０分間処理した。試料を次いでカラムへ移し、および１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄し、および次にＰＢＳで洗浄した。プロテインＡカラムから精製した抗２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ抗体を、標準ＰＢＳで平衡化したＤ２Ｅ７ＳＣＡ−結合カラムに通した。カラムをＰＢＳでベースラインへ戻し、および抗体を、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０へ溶出した。
【０２０２】
ビオチン化抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ抗体
試料中のグリシンおよびトリス成分を、５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムによって除去した。抗体溶液へ、１／１０容量の活性化ビオチン含有ＤＭＳＯを、反応モル比４０：１（ビオチン：抗体）で加えた。２５℃にて１時間後、ビオチン化抗体を、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣ１、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。
【０２０３】
５Ｃ．ウェスタンブロット
抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡウサギ抗血清を一次抗体として使用し、およびヤギ抗ウサギＨＲＰを二次抗体として使用した。結合はＴＭＢＭペルオキシダーゼ基質を用いて測定した。ウサギ抗血清はまた、合成１８残基２１８−リンカーペプチドに対してから以前も作製された。このリンカーを含むＳＣＡタンパク質との反応性もまた確立された。
【０２０４】
ウェスタンブロット結果
精製された調製物からのゲル上に示されたすべてのバンドはウェスタンブロット陽性であった。図７は、抗２−７−ＳＣ−１抗血清を用いて検出した、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物のウェスタン分析の一例を示す。一次検出抗体は、精製組換えＳＣＡタンパク質を用いて免疫されたウサギから作製された抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡウサギ抗血清であった。レーン１および７、分子量マーカー（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６および４ｋＤａ）；レーン２、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質；レーン３、エチル−２−７−ＳＣ−２；レーン４、ＰＥＧ（５ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン５、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン６、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２。
【０２０５】
血漿中の低濃度のために、単量体および二量体として存在する２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質がどのような比率かは動物実験で明らかにならなかった。しかし、Ｎ−エチルマレイミドで修飾された２−７−ＳＣ−２タンパク質のわずかにより速いクリアランスは、開始ＳＣＡタンパク質の一部が二量体であったことおよびより大きな質量または親和力のためにより遅いクリアランスを示したことを示唆する可能性があった。
【０２０６】
５Ｄ．純度分析
Ｎ−エチル−マレイミドで修飾された２−７−ＳＣ−２ＳＣＡは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで二量体を示さなかったため、二量体型は遊離システイン残基の架橋によって生じた。精製されたＰＥＧ−ＳＣＡ複合体は、典型的には、ヨード染色によって検出された通り本質的に遊離ＰＥＧを含まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出された通り１％未満の未修飾ＳＣＡおよび１％未満の高分子量分子を含んだ。
【０２０７】
５Ｅ．ヨード染色
ＳＤＳＰＡＧＥゲルをｄＨ２Ｏで洗浄し、および５％塩化バリウム溶液に入れた。１０分間緩やかに混合後、ゲルをＨ２Ｏで洗浄し、および次いで発色のために０．１Ｍ Ｔｉｔｒｉｓｏｌ（登録商標）ヨード溶液に入れた。
【０２０８】
５Ｆ．質量測定
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の正確な質量値はマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ」；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ ＯｍｎｉＦｌｅｘ ＮＴ）によって、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）マトリクス上の同様の分子量を有する内部標準物質を用いて測定した。ＳＣＡタンパク質の見かけの分子量（Ｓｔｏｋｅ半径）は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルろ過カラムクロマトグラフィー[Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、取扱説明書による]を用いて推定した
さらに、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分子量の分析を、適当なタンパク質およびＰＥＧ−タンパク質標準物質を用いて実施した。サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された、ＰＥＧ−４０ｋ−ＳＣＡの見かけの分子量は、６７０ｋＤａ、すなわち分子量の約１０倍であった。
【０２０９】
２−７−ＳＣ−２の分子量測定結果：
分子量測定結果を表４に示す。
【表４】
【０２１０】
４〜２０％ＳＤＳゲル上でのタンパク質サイズに対するＰＥＧサイズの相関はＹ＝０．００１５６Ｘであった。
【０２１１】
他のＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物は、その分子量およびポリマーサイズと合致する同等の質量値を示した。
【０２１２】
５Ｇ．Ｎ末端配列決定およびペプチドマッピング：
２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５のＮ末端配列決定は、分泌されたＳＣＡタンパク質のＮ末端アミノ酸がアラニンでありその後にＶＬの第１の残基が続くような、シグナル配列の予測されたプロセシングを確認した。
【０２１３】
２−７−ＳＣ−５−４０ｋＤａＰＥＧ上のペプチドマッピング
タンパク質（計０．２ｍｇ）を変性し、および、１ｍＭＥＤＴＡおよび５ｍＭＤＴＴを含む６ＭグアニジンＨＣｌ中で還元した。溶液を３７℃にて１時間インキュベートした。アルキル化試薬ヨードアセトアミドを終濃度１５ｍＭとなるように加え、および反応を室温にて１時間実施した。アルキル化後、β−メルカプトエタノールを４５ｍＭ（終濃度）となるように加えることによって過剰のヨードアセトアミドを不活性化し、および、溶液をＰＤ１０脱塩カラムに供した。アルキル化されたＰＥＧ−２−７−ＳＣ−５を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｍ１０を用いて濃縮し、および次いでＴＰＣＫ処理トリプシンによって、酵素対タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ）で用いて加水分解した。加水分解は６〜８時間、３７℃にて行わせ、およびその後、同量の新しいトリプシンを加えて一夜反応させた。加水分解されたタンパク質溶液をＳｐｅｅｄｖａｃによって乾燥し、およびＨＰＬＣ用水で再構成した。
【０２１４】
結果として得られたペプチド混合物をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）によってＨＰＬＣ用水を用いて分画した。画分を手作業で回収しおよびヨード溶液（２０ｍＭを含む５％ＢａＣＩ）を用いて染色するＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ポジティブ染色された画分を、逆相ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃｌ ８，２ｘ２５０ ｍｍ）によって、６０分間に５〜７０％のアセトニトリル勾配（０．０５％ＴＦＡを含む）を用いてさらに分離した。ピークを手作業で回収し、およびＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥した。ピークを１０μｌの水で再構成し、および５μｌをＴｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に採取した。ヨード染色ポジティブの画分（１つのみ、保持時間４０分まで）をアミノ酸シークエンサー分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供した。分析から得られた配列はＧ□ＴＳＧＳＧＫＰＧ（配列番号４１）であり、ここで空白の四角は修飾アミノ酸を表し、マレイミド−ＰＥＧ４０Ｋがシステイン（Ｎ末端Ａｌａ１から１１０位）へ正確に付加されていることを示す。
【０２１５】
５Ｈ．Ｄ２Ｅ７およびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７の安定性−結果
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体は凍結融解の１０サイクル後に安定であることが示された。未修飾の２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ（濃度１．１ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭトリス／グリシン緩衝液、ｐＨ７．０）の部分標本を−８０℃にて１５分間の凍結に供し、その後３７℃にて１０分間の融解を行った。凍結融解の操作を３、５、および１０サイクル実施し、および未修飾のＳＣＡの完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、および確立されたＴＮＦ感受性細胞レスキュー検定法によって分析した。ＳＣＡは非常に安定であることが見出され、およびポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色によって判定された通り分解を示すことなく少なくとも１０回の凍結融解サイクルに耐えられた（データ記載せず）。５回の凍結融解サイクルに際して、２−７−ＳＣ−２の生物活性に変化は無かった（ＩＣ５０：２２４．６ｎＭ）。
【０２１６】
本試験においてすべてのＤ２Ｅ７ＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質は、３０日間４℃にて２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で安定であることが見出された。２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質は、ｐＨ３〜１０、２５℃、１８時間インキュベートで安定であった。最大１．２Ｍまでの濃度のＮａＣｌは、２５℃にて２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の２−７−ＳＣ−２の活性または溶解度に影響しなかった。
【０２１７】
５Ｉ．抗原性
ＰＥＧ化Ｄ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質は、抗Ｄ２Ｅ７ＳＣＡポリクローナル抗体との結合効率に顕著な低下を示す。ＰＥＧ−ＳＣＡ２−７−ＳＣ−５は、ウェスタンブロットによって抗２１８抗血清を用いて分析した際、抗２１８ペプチドウサギ血清とわずかに反応性である。
【０２１８】
実施例６
ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質のフローサイトメトリー分析
２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−３、２−７−ＳＣ−４、２−７−ＳＣ−５についての細胞表面受容体結合検定法
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞株を用いて、Ｄ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの存在下での細胞受容体へのＴＮＦ−α結合を分析した。ビオチンＴＮＦ−α（０．０４μｇ）をＤ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ（１〜４μｇ）と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中で２５℃にて３０分間、および次いで４℃にて１５分間振とうしながら予備インキュベートした。
【０２１９】
同時に、ビオチン化ダイズトリプシンインヒビター（０．０５μｇ）、ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ヒトＴＮＦ−α抗体（２０μｇ）、およびＣＣ４９ＳＣＡ（４μｇ）といった対照もまた、ビオチン−ＴＮＦ−α（０．０４μｇ）と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で予備インキュベートした。ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞は氷冷２０ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いて、３７℃にて２〜３分でフラスコから剥がした。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、および２０００ｒｐｍにて５分間遠沈した。細胞を次いで培地で１回、およびＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、および血球計算盤を用いて計数した。
【０２２０】
細胞をＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、終濃度２ｘ１０６細胞／ｍｌとした。細胞に使用した褐色エッペンドルフチューブすべてを、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて少なくとも１時間４℃にてブロックした。細胞受容体へのＴＮＦ−α結合に対するアクチノマイシンＤおよびＦｃブロック試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の作用については、細胞（１０５個）を０．０５μｇアクチノマイシンＤ／１ｘ１０６細胞または１μｇＦｃブロッキング／１ｘ１０６細胞と共に５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で１５〜３０分間４℃にて予備インキュベートした。ＴＮＦ−αおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡの混合物５０μｌに、５０μｌの１ｘ１０５ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を加えた。６０分間４℃にて暗所でのインキュベート後、細胞を遠沈し、および８０μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ストレプトアビジン−フィコエリトリンの全部を加えた。混合物を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をその後冷ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌで２回洗浄し、および分析のために０．３ｍｌＦＡＣＳ洗浄緩衝液に再懸濁した。
【０２２１】
フローサイトメトリー分析−結果
ビオチン化ダイズトリプシンインヒビター、ポリクローナルヤギ抗ヒトインターフェロン−αＩｇＧ、およびＣＣ４９ＳＣＡ（Ｅｎｚｏｎ）は結合を示さず、およびネガティブ対照の役割を果たした。細胞へのＦｃブロック試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアクチノマイシンＤを用いた予備インキュベートは、ＴＮＦ−α結合に対して効果が無かった。ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ複合体（エチル−、５ｋ、２０ｋまたは４０ｋＰＥＧ）は、１６：１（Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ：ＴＮＦ−α）より高いモル比で、細胞へのＴＮＦ−α結合を完全に消失させた。
【０２２２】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡのＴＮＦ−αに対するその同じモル比で、未修飾のＤ２Ｅ７ＳＣＡはまた細胞へのＴＮＦ−α結合を低下させたが完全にではなかった。したがって、この分析では、Ｄ２Ｅ７のＰＥＧ−ＳＣＡ型は未修飾のＳＣＡタンパク質よりも強力であった。
【０２２３】
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞上の受容体とのビオチン標識化ＴＮＦ−αの結合を妨げるこれらの化合物の能力のフローサイトメトリー分析における、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の代表的なデータを示す。これらのデータは、抗ＴＮＦ−αＰＥＧ−ＳＣＡ化合物が、細胞系における受容体へのこのサイトカインの結合の阻害において活性が高いことを示す。
【０２２４】
２−７−ＳＣ−２またはＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２の存在下での、細胞受容体へのＴＮＦ−α結合のフローサイトメトリー分析。１、蛍光標識化無しの細胞集団；２、ビオチン−ＴＮＦ−αとの、および次いでストレプトアビジン−フィコエリトリンとの結合後の細胞集団；および３、細胞受容体へのＴＮＦ−α結合に及ぼす２−７−ＳＣ−２（図６Ａ）、ＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２（図６Ｂ）、およびＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２（図６Ｃ）の作用。２−７−ＳＣ−２またはＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２のＴＮＦ−αに対するモル比は１６：１である。低い蛍光強度へのシフトは、細胞へのＴＮＦ−αの結合の減少を示す。
【０２２５】
実施例７
ＢＩＡＣＯＲＥ分析
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡとの組換えｈＴＮＦ−αの相互作用の動態分析
ＴＮＦ−αとＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびそのＰＥＧ化型との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって、ＢｉａＣｏｒｅＸ装置（ＢｉａＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて分析した。純度＞９７％の組換えヒトＴＮＦ−α（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、ＣＭ５チップ（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１０００−１４）上に、１０μｇ／ｍｌ溶液ｐＨ５．０（酢酸緩衝液、ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−５１）として固定化した。固定化した表面を酢酸緩衝液、ｐＨ４．５（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−５０）で３回洗浄し、および５００ ｎＭの未修飾ＳＣＡを用いる６サイクルのリガンド安定性分析に供した。
【０２２６】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡは分析対象となり、共にｐＨ４．５の酢酸は再生緩衝液となった。安定なＴＮＦ−α−結合表面上で、異なる濃度のＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡが結合（３分間）および解離（２分間または５分間）について調べられ、およびデータを動態パラメーター（例えば、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ＫＡ、およびＫＤ値）についてＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．０）を用いて分析した。ＨＢＳ−Ｎ（ＢｉａＣｏｒｅ、品番ＢＲ−１００３−６９）を本手順における泳動緩衝液として使用した。
【０２２７】
固定化ｒｈＴＮＦ−αとＤ２Ｅ７ＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡとの間の相互作用の動態分析
方法
ＴＮＦ−α
起源：Ｐｉｅｒｃｅ、組換え型、品番ＲＴＮＦＡ５０
ＭＷ：１７．４ｋＤ、１５７アミノ酸
純度：＞９７％
再構成：蒸留水（ＤＷ）中で１００μｇ／ｍｌの濃度へ。調製物中に添加物は存在しない
保存：−７０℃にて保存
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ：クローン２−７−ＳＣ−２
起源：Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、組換え型、Ｐｉｃｈｉａで発現
ＭＷ：２７ｋＤ、２１８リンカーを有する
純度：＞９０％
再構成：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中
保存：４．０℃にて保存
固定化：新しいＣＭ５チップを用いて
ＴＮＦ濃度：１０μｇ／ｍｌ、酢酸緩衝液ｐＨ５．０溶液のストックから直接希釈
流速：５．０μｌ／分
チャンネル：ＦＣ１〜２、１：１ＮＨＳ／ＥＤＣ混合物で３．０分活性化
チャンネル：ＦＣ２、１５μｌのＴＮＦを手動注入、１０μｇ／ｍｌ
（より低いＲＵを達成するために、より小さい容量を注入する）
チャンネル：ＦＣ１〜２、１Ｍメタノールアミン、ｐＨ８．５で３分間不活性化
チャンネル：ＦＣ１〜２、ＢＳＡ１μｇ／ｍｌを含むＨＢＳ−Ｎ緩衝液２５μｌを手動注入
チャンネル：ＦＣ１〜２、インジェクションポートを洗浄するため、１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５を１分間注入、１００μｌ／分
最終ＲＵ（応答単位）は１９９であった。
【０２２８】
ＣＭ５チップをＨＢＳＮ緩衝液で洗浄し、および少なくとも６サイクルの安定性について５００ｎＭ２−７−ＳＣ−２で試験した。ＣＭ５チップを次いで動態分析に用いた。
【０２２９】
Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２の動態分析
２−７−ＳＣ−２の濃度：注入直前にＨＢＳ−Ｎで希釈
２．９８ｇ／ｍｌ（１０８０ｎＭ）
１．４９μｇ／ｍｌ（５４０ｎＭ）
０．７４５μｇ／ｍｌ（２７０ｎＭ）
０．３７２５μｇ／ｍｌ（１３５ｎＭ）
０．１８６μｇ／ｍｌ（６７．５ｎＭ）
９３ｎｇ／ｍｌ（３３．７５ｎＭ）
４６．５ｎｇ／ｍｌ（１６．８７５ｎＭ）
２３．２８ｎｇ／ｍｌ（８．４３７５ｎＭ）
０ｇ／ｍｌ（０ｎＭ）
流速：２５μｌ／分（注：３０μｌ／分は２０および２５ｌ／分と同様の結合を結果として生じた）
結合期間：３分間
解離期間：２分間および５分間
再生緩衝液：１０ｍＭ酢酸，ｐＨ４．５
再生は２段階で実施し、洗浄１回目として１００μｌ／分で１００μｌ洗浄および４０
洗浄１回目の後にチップに残ったＲＵに応じて、洗浄２回目として１００μｌ／分で８０μｌ洗浄。
【０２３０】
データ分析
２分子結合反応について結合および解離動態曲線を、質量移動限界と適合するおよびしない１： １ 結合 を用いて分析した。質量移動パラメーターを含めることによって導体の顕著な改善は達成されず、本実験において質量移動現象は有力でなかったことを示した。
【０２３１】
２−７−ＳＣ−４およびＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−４をこの目的のために調製した。
【０２３２】
ＦＡＣＳ結果は、ＳＣＡ ｈｉｓ−タグ部分の有無でＴＮＦ−αへのＤ２Ｅ７／ＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ結合に差は無かったことを、独立して示した。
【０２３３】
Ｂｉａｃｏｒｅおよび細胞レスキュー試験からの結果はまた、ｈｉｓ−タグ部分は抗原およびＳＣＡの結合現象の原因でないことを確認した。
【０２３４】
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−２の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表５は、異なる型の２−７−ＳＣ−２ＳＣＡのｋａ（ｋｏｎ）、ｋｄ（ｋｏｆｆ）、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表５】
【０２３５】
上記の表５は、ＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質がリガンドに対する高い親和性を維持することを確認する。しかし、異なるＰＥＧ−ＳＣＡ設計分子はｏｎ速度およびｏｆｆ速度に差を示す。特に、２−７−ＳＣ−２の４０ｋＤａＰＥＧ型は、親ＳＣＡと比較した際に顕著に減少したｏｎ速度としかし保たれたｏｆｆ速度を有する。これは、ＢＩＡＣｏｒｅチップ上のこの人工結合環境における、大きくおよび可塑性であるＰＥＧポリマーによる立体障害作用を反映する可能性がある。対照的に、本研究で別に記載する細胞系検定法は、未修飾のおよび４０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質について同様の結合効力を示した。
【０２３６】
ＰＥＧ化によるｏｎ速度およびｏｆｆ速度動揺における特異的な傾向は、複合体化タンパク質に関してポリマーの化合物特異的な立体構造または配置を明らかにする可能性がある。追加の下記のＰＥＧ−ＳＣＡ化合物についてのさらなる試験はこの可能性を強調する。２−７−ＳＣ−４−４０ｋＤａ−ＰＥＧデータは、ＰＥＧポリマーのＣ末端への直接の配置は実質的にｏｆｆ速度を改善したことを示す。この試験で開示された通りの、ＳＣＡシステイン配置およびＰＥＧポリマー質量の規定のパラメーターを用いた戦略は、任意の個別のＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質複合体について結合および活性特性の最適化を可能にする。
【０２３７】
２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７のｒｈＴＮＦへの結合動態
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表は、異なる型の２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−７のｋａ、ｋｄ、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表６】
【表７Ａ】
【表７Ｂ】
直接結合動態は、ＴＮＦ−αをＣＭ５チップ上に固定化し、および結合したリガンドの上に２−７−ＳＣ−３／２−７−ＳＣ−７の未修飾型およびＰＥＧ型のさまざまな濃度を流すことによって測定した。下記の表は、異なる型の２−７−ＳＣ−３および２−７−ＳＣ−７のｋａ、ｋｄ、ＫＡ、およびＫＤ値を提供する。
【表８Ａ】
【表８Ｂ】
実施例８
ＴＮＦ−α細胞毒性の中和の検定
ＴＮＦ−α細胞毒性の中和の細胞系検定法を下記の通り実施した。
【０２３８】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１４８）はアクチノマイシンＤの存在下でＴＮＦ−αに対してより感受性が高く、および検定に用いられた。
【０２３９】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞にて播種し、および一夜３７℃にて加湿インキュベーター内で５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２４０】
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質およびそのＰＥＧ化型の、ある範囲の濃度を、９６ウェルプレート中の播種された細胞へ、培地中の１０ｇ／ｍｌから２．５ｎｇ／ｍｌの段階希釈で加えた。
【０２４１】
Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡ化合物の添加の直後に、ｒｈＴＮＦ−α（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルへ１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。細胞を次いで２４時間増殖させ、および細胞の生存を、１５μｌのＭＩＴ色素試薬（品番Ｇ４０００，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ [Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ]）（３−（４，５，ジメチルチアゾール２イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）の添加によって取扱説明書に従って判定した。細胞レスキューの分析は、Ｄ２Ｅ７処理細胞の生存度を未処理細胞と、ＴＮＦ−αの存在下で比較することによって実施した。
【０２４２】
対照ウェルは、未処理細胞、およびＴＮＦ−αだけで処理した細胞から成った。対照ウェルの細胞は、生存度の完全な消失を示した。実験ウェル中の生存細胞（またはレスキューされた細胞）の割合をＤ２Ｅ７濃度の対数に対してプロットし、およびデータの各セットについてＩＣ５０値を決定した。それぞれの値は３連の実験セットに由来した。
【０２４３】
ＴＮＦ−α致死性からのＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質による細胞レスキュー
後掲の表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに列記されたもののような抗ＴＮＦ−α ＳＣＡタンパク質の、細胞をＴＮＦ−αのネガティブな作用から保護する能力は、ＴＮＦ−α感受性細胞株を使用し、およびその細胞を、ＳＣＡタンパク質２−７−ＳＣ−２と共にまたはそれ無しで、ＴＮＦ−αと接触させることによって確認された。結果は、実施例１によって調製された他のＳＣＡタンパク質を用いて実施された別の試験と合致した。
【０２４４】
材料および方法
細胞株：ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１４８、マウス細胞株
増殖：２ｍＭ Ｇ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
凍結保存用試薬：培地９５％およびＤＭＳＯ５％。
【０２４５】
測定方法
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞をトリプシン処理しおよび９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に播種し、および１２時間、３７℃にて５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で定着させた。
【０２４６】
細胞をＰＢＳで洗浄し、および各ウェルに新しい培地を加えた。後掲の表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに列記されたものを含む、さまざまなＤ２Ｅ７ＳＣＡ変異体およびそのＰＥＧ化型をウェルに加えた。ＳＣＡは１０μｇ／ｍｌから２．５ｎｇ／ｍｌまで段階希釈した（完全ＲＰＭＩ培地で希釈）。対照細胞にはＤ２Ｅ７を加えなかった。
【０２４７】
Ｄ２Ｅ７化合物の添加直後に、組換えｈＴＮＦ−α（１．０ｎｇ／ｍｌ、完全培地でないＲＰＭＩ培地で希釈）を各ウェルに加えた。未処理の対照細胞にはＴＮＦ−αを加えなかった。
【０２４８】
細胞を２４時間、３７℃にて５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。インキュベート期間の終了時に、１５μｌのＭＴＴ染色試薬（品番Ｇ４０００，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を各ウェルに加え、および、停止溶液を各ウェルに加えるまで、プレートを４時間３７℃にてインキュベートした。各ウェルの内容物をよく混合し、および結晶を一夜室温にて溶解させた。
【０２４９】
プレートを５７０ｎｍおよび６３０ｎｍにて９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取り、および吸光度単位における差（細胞生存度の指標）を、ＴＮＦ−α細胞毒性に対して細胞をレスキューするために用いたＤ２Ｅ７化合物の濃度に対してプロットした。
【０２５０】
５０％の細胞がレスキューされたＤ２Ｅ７ＳＣＡタンパク質濃度を、ｌｏｇ[Ｄ２Ｅ７]をＸ軸および％レスキューをＹ軸パラメーターとして用いた生存度グラフから、実験の各セットについて決定した。
【０２５１】
２５℃、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡでのＭａｌ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）ポリマーの安定性を、２２０ｎｍから４００ｎｍまで０、２、４、２２、および３３時間のＵＶ吸収スキャンによって調べた。３３時間後２５℃にて、３ｍＭシステインを加え、および混合物を５分間インキュベート後にスキャンした。時間依存性３００ｎｍの特徴的なピークの時間依存的な変換が定量された。
【０２５２】
注：ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞はＴＮＦ−αおよびリン補トキシンに対して、Ｌ９２９（ＡＴＣＣＣＣＬ−１）よりも感受性が高い。アクチノマイシンＤの非存在下ではこれらの細胞はＴＮＦに対する感受性を３０日以内に失う。また、アクチノマイシンＤの添加はＤ２Ｅ７化合物による細胞のレスキューに有害であることが見出された。
【０２５３】
未修飾の２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−２−ＮＥ−マレイミド、ＳＫ、２０Ｋ、および４０ＫＰＥＧ化２−７−ＳＣ−２を、細胞をＴＮＦ媒介性死滅からレスキューする能力について分析した。表９Ａは２−７−ＳＣ−２の各型についてＩＣ５０値（５０％のＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を１．０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦによる死滅からレスキューする）を提供する。
【表９Ａ】
【表９Ｂ】
【表９Ｃ】
これらのデータは、Ｄ２Ｅ７ ＳＣＡの設計されたＰＥＧ化型が、サイトカインＴＮＦ−αの結合および中和における同様の生物活性をこの細胞系検定において示すことを確認する。ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物は、したがって、このサイトカインを効果的に中和しおよびこれらの細胞上のＴＮＦ−α受容体へのその結合を妨げることができる。
【０２５４】
実施例９
Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの薬物動態
試験手順：ＩＣＲマウスにおけるＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の薬物動態。
【０２５５】
試験目的
本試験は、ＳＣＡＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２および２−７−ＳＣ−５）、および、ＰＥＧ（５ｋｄ）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）およびＰＥＧ（４３ｋｄ）複合体を含むＰＥＧ化型の、ＩＣＲマウスにおける血漿薬物動態を調べるために設計された。
【０２５６】
被験物質（投与前−２０℃保存）
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（１００％活性ｗ／ｗ）
ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（５７．４％活性ｗ／ｗ）
ＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）（３８．６％活性ｗ／ｗ）。
【０２５７】
試験システム
種：ＩＣＲ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｈａｒｌａｎ）マウス
週齢：７〜８週
性別：雌
体重：開始時体重範囲：約２５ｇ。
【０２５８】
動物管理：
マウスはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （「ＵＭＤＮＪ」）動物施設で飼育箱にケージ当たり５個体を飼育した。ケージは"Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ"，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに準拠したサイズとした。汚物は少なくとも週２回除去した。ケージには試験、被験物質、動物数、性別、および用量レベルを示すケージカードを明瞭に標示した。動物は試験開始前１週間にわたって順化した。
【０２５９】
飼料
マウスは水道水および市販の実験動物飼料を自由摂取させた。
【０２６０】
試料調製
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５５６ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７に希釈した；
ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５０３ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７当量に希釈した；
ＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）はＰＢＳで０．５４１ｍｇ／ｍＬ Ｄ２Ｅ７当量に希釈した；
リン酸緩衝生理食塩水；１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５。
【０２６１】
投与部位
Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、およびＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）複合体は単回投与（１日目）として尾静脈から静脈投与した。
【０２６２】
実験計画
５４個体のマウスは下記の表１０の図式に従って割付、投与および採血した。
【表１０】
【０２６３】
未処理対照血清の採取のため、２個体の未処理マウスを心臓穿刺によりＥＤＴＡ入り試験管へ採血した。
【０２６４】
マウスに個体当たり２００μＬのＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）、個体当たり１８０μＬのＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）、および個体当たり１９０μＬのＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−５）複合体を静脈注射した。０．０９％アベルチンを用いて鎮静後、マウスを後眼窩洞からＥＤＴＡ入りバイアルへ採血した。２分、１５分、３０分および１時間にマウスを１００μＬ採血し、および３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間にマウスを心臓穿刺により〜１０００μＬ採血して死亡させた。血液の遠心分離後に血漿を回収し、およびドライアイス上で−８０℃にて直ちに凍結させた。
【０２６５】
血漿試料を融解し、およびＤ２Ｅ７化合物の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。データをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを用いてモデル化してＤ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、ＰＥＧ（２０ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）、およびＰＥＧ（４３ｋｄ）−Ｄ２Ｅ７（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）薬物動態パラメーターを決定した。
【０２６６】
臨床試験：マウスは受領時に目視検査した。臨床的異常の徴候に関する詳細な身体診察は、過剰な取り扱いを避けるために、目視評価に従って必要な場合のみに実施した。マウスを被験物質の輸液後に毎日１回、死亡および処置に対する反応の徴候に関して目視検査した。死亡および臨床徴候はすべて記録した。状況に応じて、より頻回の検査を実施した。
【０２６７】
動物管理規定：本試験は動物福祉に関する現行ガイドライン（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６−２３，１９８５）に準拠して実施した。
【０２６８】
マウスにおけるＤ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体の薬物動態：Ｄ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
試料調製
試験したＳＣＡの直線範囲は０．２ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間であった。直線範囲内のタンパク質濃度ｎｇ／ｍｌおよび光学測定値を分析に用いた。
【０２６９】
標準ＳＣＡまたはＰＥＧ−ＳＣＡを、分析した血漿試料と同様の希釈係数となるように血漿で希釈したか、または直接に希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈した。手順を簡略化するため、標準品を血漿試料分析用の希釈緩衝液で希釈した。静脈または皮下投与による投与量は４．５ｍｇ／ｋｇであった。静脈投与による血漿試料に関する希釈係数は、０．０３〜３時間の試料について５００、およびＳＣＡの６〜９６時間試料について１０、ＰＥＧ−５ｋ−ＳＣＡの０．０３〜２４時間試料について５００および４〜９６時間試料について１０、ＰＥＧ−２０ｋ−ＳＣＡの０．０３３〜６時間試料について８００および２４〜９６時間試料について１００、およびＰＥＧ−４０ｋ−ＳＣＡのすべての試料について８００であった。皮下投与による血漿試料の希釈係数は、ＳＣＡのすべての試料について２００、およびＰＥＧ（２０ｋ）−ＳＣＡ．のすべての試料について３００であった。
【０２７０】
ＥＬＩＳＡ手順
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＳＣＡおよびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体の血漿濃度を測定した。試料は抗体によって検出された規定の組成物に関して測定した。捕捉抗体は、プロテインＡおよびＤ２Ｅ７−結合アフィニティカラムによって精製したポリクローナル抗Ｄ２Ｅ７抗体であった。ＴＮＦ−αへの結合のために、プレートをＴＮＦ−αでコーティングした。一次および二次抗体はそれぞれ、ビオチン化抗Ｄ２Ｅ７抗体およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼであった。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４００ｎｇ／ウェルの抗Ｄ２Ｅ７抗体またはＴＮＦ−αを含む５０μｌの５０ｍＭ重炭酸ナトリウムで２５℃にて一夜コーティングした。同時に、試料希釈のために、Ｎｕｎｃマイクロウェルプレートまたはタンパク質の吸収が最小である任意の標準９６−ウェルプレートを、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、５％スクロース、および０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて４℃にて一夜ブロッキングした。翌日、コーティング溶液およびブロッキング溶液をＥＬＩＳＡおよびＮｕｎｃプレートの両方からアスピレーターを用いて除去した。ＥＬＩＳＡプレートはブロッキング溶液（２５０ｕｌ／ウェル）を用いて少なくとも１時間２５℃にてブロッキングし、およびＮｕｎｃプレートは、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄したかまたは２５℃にて風乾させおよび以降の分析のために４℃にて保存した。ブロッキング溶液を除去後のＥＬＩＳＡプレートは洗浄緩衝液を用いて３回洗浄したかまたは２５℃にて風乾させおよび以降の使用のために４℃にて密封して保存した。血漿試料はＮｕｎｃプレートの上から下へ連続的に１：２希釈し、各ウェルに１２０μｌを残した。希釈緩衝液を用いた前希釈後に、１００μｌの試料をＥＬＩＳＡプレートへ移し、および４℃にて一夜インキュベートした。試料溶液を除去しおよびプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄後、２０ｎｇビオチン抗Ｄ２Ｅ７抗体を含む５０μｌの希釈緩衝液を各ウェルに加えた。試料は２５℃にて２時間インキュベートした。一次抗体を除去しおよびプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した後、１００−ｕｌストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを１：１６、０００希釈で加えた。プレートを２５℃にて１時間インキュベートした。溶液を除去しおよびプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した１００μｌのＴＭＢＥ基質を添加後１０〜２０分で発色し、および５０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止した。４５０ｎｍでの吸高度を記録した。
【０２７１】
データ取り込みおよび分析
データはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで取り込みおよび分析した。標準曲線は、標準物質の濃度に対する４５０ｎｍでのエンドポイントの光学密度をプロットすることにより、および０．９９以上の相関係数を有する最適な曲線を描くことによって得た。すべての未知試料濃度は、希釈係数を組み込んだ後に標準曲線から計算した。適当な光学密度を有するすべてのデータ点の最も近い数がその結果のために平均されている。
【０２７２】
マウスにおけるＤ２Ｅ７ＳＣＡおよびＰＥＧ−Ｄ２Ｅ７ＳＣＡ複合体の薬物動態
すべての２−７−ＳＣ−２系（２−７−ＳＣ−２、エチル−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−５ｋ−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−２）についてのＰＫパラメーターを決定した。２−７−ＳＣ−５、ＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−５、およびＰＥＧ−４０ｋ−２−７−ＳＣ−５についてのＰＫパラメーターを決定した。２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ−２０ｋ−２−７−ＳＣ−２についての皮下注射によるＰＫパラメーターもまた決定した。
【０２７３】
予備実験から、抗２１８リンカーを用いた２−７−ＳＣ−２のより低い検出感度（５０ｎｇ／ｍｌ）が観察された。マウスにおける循環半減期の約１００倍の延長が、４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物（２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５）において、未修飾ＳＣＡタンパク質と比較した際に観察された。
【０２７４】
下記の表１１は、静脈注射（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射によって投与された２−７−ＳＣ−２、ＰＥＧ−２−７−ＳＣ−２、２−７−ＳＣ−５、ＰＥＧ−２−７−ＳＣ−５について決定された薬物動態パラメーターを示す。
【表１１】
【０２７５】
これらの結果は、ＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質の循環寿命を、治療上有用な薬物動態の範囲にわたるように設計できることを実証する。４０ｋＤａＰＥＧ結合ＳＣＡにおける血清半減期の２ｌｏｇの延長は、これらの化合物を完全なモノクローナル抗体の薬物動態範囲に置く。抗原結合部位から離れた独特の部位でのＰＥＧポリマーの部位特異的結合は、活性な抗原結合タンパク質の製造だけでなく、ランダムなアミン化学を用いたＳＣＡタンパク質ＰＥＧ化の相当な不均一性とは対照的な、組成が相対的に均一な製品の製造もまた可能にする。２０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質と比較した際の本試験の４０ｋＤａＰＥＧ化ＳＣＡタンパク質の循環寿命の大差は、いくぶん意外であった。約２０ｋＤａＰＥＧでの薬物動態のプラトーの証拠があったランダムＰＥＧ化（ＣＣ４９）ＳＣＡタンパク質の我々の結果に基づき、１２ｋＤａＰＥＧは同等の循環寿命を示したため、我々はこれを予測しなかった。
【０２７６】
本発明がどのように作用し得るかに関してはいずれの理論または仮説にも拘束されない一方、４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の大幅に延長された循環寿命にも寄与するのは分枝鎖構造であると考えられている。特に興味深いのは、ＰＥＧ−ＳＣＡ（２０ｋＤａＰＥＧ）の皮下注射での使用における成功である。この投与経路は、静脈投与よりも顕著に良好なＡＵＣ値を与えた。皮下経路は、ＰＥＧ−ＳＣＡ治療薬の処方のために最終的に好ましい可能性がある。ＳＣＡへのＰＥＧのリンカー結合は成功し、Ｃ末端ＰＥＧ結合についての動物実験に劣らなかった。おそらく、ＰＥＧのリンカー結合はまた、ＳＣＡ安定性の増大および、抗原性および／またはタンパク質分解の低下にも寄与し得る。
【０２７７】
実施例１０
ビス−マレイミド−ＰＥＧを介する二量体Ｄ２Ｅ７ＰＥＧ−ＳＣＡタンパク質
ポリマー１個当たりＳＣＡタンパク質２個を有する２価ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を作製するために、ビス−マレイミド−ＰＥＧポリマーを使用した。これらは活性化マレイミド基をポリマーの両端に有する。ＳＤＳＰＡＧＥ分析は、ＳＣＡ−ＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を本開示の方法を用いて合成できたことを実証した。反応ｐＨおよび反応モル比の影響はそれぞれ表１２および表１３に示す。
【表１２】
【０２７８】
データは４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについてのゲル画像分析によって得られた。ビス−ｍａｌ−ＰＥＧ（２０ｋ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６に溶解して濃度３．７ｍｇ／ｍｌとした。それを次いで１ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６および１ｍＭ ＥＤＴＡへ、Ｄ２Ｅ７ ２−７−ＳＣ−２の１／３０から１／１０容量を徐々に加え、および反応モル比を示した。反応は２５℃にて窒素中で１．５時間実施した。
【表１３】
【０２７９】
反応は、１ｍｇ／ｍｌ Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２および０．１２ｍｇ／ｍｌビス−ｍａｌ−ＰＥＧ化合物を０．１６５：１（ビス−ｍａｌ−ＰＥＧ：２−７−ＳＣ−２）の反応モル比で含む１００ｍＭリン酸ナトリウムを、表記のｐＨで含んだ。反応は２５℃にて窒素中で２時間実施した。試料は４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、および各化合物の相当するバンドを定量した。高分子量不純物は１％未満であり、および２−７−ＳＣ−２の二量体は５％未満であった。
【０２８０】
実施例１１
マウスにおける抗ＴＮＦ−α活性の確認
本実施例は、参照により本開示に含まれるＧａｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７６： ５９３９−５９４３に記載された通り、ＴＮＦ−α曝露に基づく標準動物モデルにおいて、ＴＮＦ−αによって促された炎症カスケードの中和（予防）における、ＰＥＧ化抗腫瘍壊死因子−α一本鎖抗体（Ｐｅｇ−抗ＴＮＦ−α ＳＣＡ）、未修飾抗ＴＮＦ−α ＳＣＡ、およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）（完全なＤ２Ｅ７）抗ＴＮＦ−α抗体の抗力を確認した。
【０２８１】
要約すると、ＴＮＦ−αをＤ−ガラクトサミン（ＮＧａｌ）感作マウスへ腹腔内経路（ｉ．ｐ．）で注射することにより、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてエンドトキシン血症が誘導された。要約すると、マウスを組換えヒトＴＮＦ−α（１．０μｇ／個体）およびＮ−ガラクトサミン（２０ｍｇ／個体）の組合せに曝露する３０分前に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに異なる用量の未修飾ＳＣＡ、ＰＥＧ−ＳＣＡ、およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）をｉ．ｐ．注射した。生存したマウスを２４時間後に安楽死させた。
【０２８２】
ＮＧａｌおよびＴＮＦの同時注射は、ほぼすべての動物に２４時間以内に致死を生じた。１マイクログラムのＴＮＦおよび２０ｍｇのＮｇａｌの腹腔内（「ＩＰ」）投与の３０分前に、さまざまな用量のＤ２Ｅ７ＭＡｂ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、ＴＮＦを中和するＭａｂ、または２０または４０ｋＤａＰＥＧ−ＳＣＡ化合物を投与した。Ｅ２Ｅ７ＭＡｂおよびＰＥＧ−ＳＣＡ化合物の両方で処理したマウスは、同等の用量で比較的高い生存率を示した。
【０２８３】
材料および方法
供試動物は雌Ｃ５７Ｂ１／６（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｈａｒｌａｎ）マウス、７〜８週齢、開始時に体重約２５ｇであった。マウスは水道水および市販の実験用飼料の自由摂取で維持された。ＴＮＦ−αによる曝露に対する保護的性質について試験した物質は、上述の通り調製した２−７−ＳＣ−５未修飾ＳＣＡ；２−７−ＳＣ−５−２０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡ；２−７−ＳＣ−５−４３Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡ、および未修飾ｄ２Ｅ７ＭＡｂ（Ａｂｂｏｔｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩｌｌｉｎｏｉｓからのＨｕｍｉｒａ（登録商標））であった。対照はリン酸緩衝溶液（「ＰＢＳ」）であった。物質は単回腹腔内（「ＩＰ」）注射によって投与した。
【０２８４】
マウス１２６個体を下記の手順書に従って割り付けた：
【表１４】
【０２８５】
少なくとも１週間の順化後、マウスに上記に示した指定の処置をｉ．ｐ．注射した。この注射（ｔ＝０）の３０分後、マウスに指定の刺激物質をｉ．ｐ．曝露した。（マウスは１．０μｇ／個体の組換えＴＮＦ−αを含む５０μｌ ＰＢＳおよび／または２０ｍｇ／個体のＤ−ガラクトサミンを含む２００μｌ ＰＢＳを投与された。）
上記の実験を、その後同一の手順を用いて、しかしより高用量の被験化合物を用いて繰り返した：２−７−ＳＣ−５−２０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡおよび２−７−ＳＣ−５−４０Ｋ−ＰＥＧ−ＳＣＡのそれぞれについて１個体当たり０．１２５ｇ、０．６２５μｇ、２．５ｇおよび１０．０ｇ。非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡを２０μｇで試験し、および完全なＤ２Ｅ５（Ｈｕｍｉｒａ）を０．６２５ｇ／個体で試験した。
【０２８６】
結果
％生存データを化合物の用量に対してプロットした（データ記載せず）。ＴＮＦ−αに曝露されたマウスに少なくとも７０％保護を与える化合物の用量を効力比較のベースラインと考えた。同一の用量（０．６２５ｇ／動物）のＨｕｍｉｒａ（登録商標）およびＰＥＧ−ＳＣＡ（２０ｋ−および４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳＣＡの両方）が、ＴＮＦに誘導される致死からマウスを保護した。しかし、これらのマウスで同様のレベルの保護を達成するためには、より高用量の、未修飾の非複合体化ＳＣＡ（２０μｇ／動物すなわち約８００μｇ／ｋｇ）が必要であった。モル比では、完全長抗体と同等の生存の等価を達成するためには、約３倍過剰の２０−または４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳＣＡが必要であることを、得られたデータは実証した。一方、ＴＮＦに誘導される致死に対する同様の保護を達成するためには１００倍モル過剰の未修飾ＳＣＡが必要であった。これらのデータは、ＰＥＧによるＤ２Ｅ７ＳＣＡの修飾は、血漿中のタンパク質の循環半減期を増大させることによって、未修飾のタンパク質に対して明らかな長所を提供することを示唆する。
【０２８７】
供試動物は平均して約２５グラムであったため、０．６２５μｇ／個体は約２５μｇ／ｋｇの用量に相当し、および１０μｇ／個体は約４００μｇ／ｋｇに相当する。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】図１Ａは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＣｙｓムテインを持たないＳＣＡ２−７−ＳＣ−１をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号１）、および発現されたタンパク質（配列番号１０）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−２をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号２）、および発現されたタンパク質（配列番号１１）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、構造ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬ−ｈｉｓ６を有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−３をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号３）、および発現されたタンパク質（配列番号１２）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨを有しかつＣ末端Ｃｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−４をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号４）、および発現されたタンパク質（配列番号１３）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー２位にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−５をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号５）、および発現されたタンパク質（配列番号１４）を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー２位にＣｙｓおよびＣ末端にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−６をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号６）、および発現されたタンパク質（配列番号１５）を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、構造ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬ−ｈｉｓ６を有しかつリンカー５位にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−７をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号７）、および発現されたタンパク質（配列番号１６）を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、構造ＶＬ−２１８−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつＮ末端およびＣ末端の両方にＣｙｓを持つＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−８をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号８）、および発現されたタンパク質（配列番号１７）を示す。
【図１Ｉ】図１−Ｉは、構造ＶＬ−ＧＧＧＧＳ−ＶＨ−ｈｉｓ６を有しかつ遊離のＣｙｓを持たないＳＣＡをコードする２−７−ＳＣ−９をコードするＤＮＡ分子の配列（配列番号９）、および発現されたタンパク質（配列番号１８）を示す。
【図２】図２Ａはクローン２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ発現を示す。ＳＣＡタンパク質の発現は、１％メタノールすなわちＭｅＯＨによってＰｉｃｈｉａ培養で誘導した。２７ｋＤａを矢印（「→」）で示す。 図２Ｂは、クローン２−７−ＳＣ−２についての、画分のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析、および各工程の収率を含む、発現および精製データを示す。少量の５４ｋＤａ以下のジスルフィド結合二量体を染色ゲルに見ることができる。図注：ＳＴＤ、Ｍａｒｋ１２タンパク質分子量標準物質；ＳＵＰ、発酵採取物上清；ＤＩＡ、ダイアフィルトレーション上清；ＤＥＡＥ、第１のＤＥＡＥクロマトグラフィー非吸着画分；Ｎｉ＋＋、ニッケル親和性クロマトグラフィー後の溶出試料；ＤＥＡＥ、第２のＤＥＡＥクロマトグラフィー。ピークは、矢印（「→」）で示す通り、約２７ｋＤａに見ることができる。
【図３Ａ】図３ＡはｍＰＥＧ−ＭＡＬの構造を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）の構造を示す。
【図３Ｃ】図３ＣはｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２の構造を示す。
【図３Ｄ】図３ＤはｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）２の構造を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅはチオール−ＳＣＡと活性化ＰＥＧ−ＭＡＬとの反応を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆはビニルスルホン活性ＰＥＧを示す。
【図４】図４は、２００から４００ｎｍの間の波長に対する吸収のスペクトルプロットである。曲線Ａはシステイン、３ｍＭである；曲線ＢはＰＥＧ−ＭＡＬ（１ｍＭ）＋システイン（３ｍＭ）反応後である；および曲線ＣはＰＥＧ−ＭＡＬ １ｍＭである。
【図５】図５Ａは、ブリリアントブルー染色によって可視化した２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−５複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はＭＡＲＫ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）タンパク質サイズ標準物質を提供し、レーン２は非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、レーン３はＰＥＧ（２０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、およびレーン４はＰＥＧ（４０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡである。 図５Ｂは、ヨード染色によって可視化した２−７−ＳＣ−５および２−７−ＳＣ−５複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はＭＡＲＫ１２タンパク質サイズ標準物質を提供し、レーン２は非複合体化２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、レーン３はＰＥＧ（２０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡであり、およびレーン４はＰＥＧ（４０Ｋ）２−７−ＳＣ−５ＳＣＡである。
【図６Ａ】図６Ａは、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ（２０Ｋ）ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＰＥＧ−ＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ（４０Ｋ）ＳＣＡの存在下での、細胞受容体へのビオチン化ＴＮＦ−αの結合のフローサイトメトリー分析を示す。曲線１は蛍光標識化なしの細胞集団を表し、曲線２はビオチン−ＴＮＦ−αおよび次いでストレプトアビジン−ＰＥへの結合後の細胞集団を表し、曲線３はＰＥＧ−ＳＣＡ、ビオチン−ＴＮＦ−α、および次いでストレプトアビジン−ＰＥとの予備インキュベート後の細胞集団を表す。
【図７】図７は、Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ誘導体のウェスタンブロット分析を示す。一次検出抗体は、精製組換えＳＣＡタンパク質で免疫したウサギから調製した抗２−７−ＳＣ−１ＳＣＡウサギ抗血清であった。レーン１および７、分子量マーカー（２５０、１４８、９８、６４、５０、３６、２２、１６、６および４ｋＤａ）；レーン２、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質；レーン３、エチル−２−７−ＳＣ−２；レーン４、ＰＥＧ（５ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン５、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２；レーン６、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−２−７−ＳＣ−２。
【図８】図８は、Ｄ２Ｅ７２−７−ＳＣ−２およびＰＥＧ化型のバンドのスキャン画像濃度を示し、組換えＳＣＡタンパク質およびＰＥＧ−ＳＣＡ複合体とのこの抗Ｄ２Ｅ７抗血清の反応性を確認する。バンドＡは２−７−ＳＣ−２であり、バンドＢは２−７−ＳＣ−５であり、バンドＣはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＤはＰＥＧ（２０ｋ）−２−７−ＳＣ−５であり、バンドＥはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−２であり、バンドＦはＰＥＧ（４０ｋ）−２−７−ＳＣ−５である。
【図９】図９は、薬物動態試験のための代表的な一連の試料のＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。２−７−ＳＣ−２ＳＣＡタンパク質および２−７−ＳＣ−２ＰＥＧ−ＳＣＡ複合体はクマシーブルー染色ゲル上で調べた。左側のゲル上で、付加した試料は非還元であった。右側のゲル上で、試料は負荷前に３ｍＭベータ−メルカプトエタノールで還元しおよび８５℃へ２分間加熱した。約１０マイクログラムのタンパク質を各レーンに負荷した。図注：ＭＭ−分子量標準物質；レーン１、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ；レーン２、Ｎ−エチルマレイミドで修飾した２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ；レーン３、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）；レーン４、２−７−ＳＣ−２ＳＣＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルキレンオキシドポリマーに部位特異的結合可能な一本鎖抗原結合ポリペプチドであって：
（ａ）抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第１ポリペプチド；
（ｂ）抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第２ポリペプチド；および
（ｃ）前記第１および第２ポリペプチドを繋ぐペプチドリンカー；を含み、
以下の位置より成る群から選択される位置に存在する、ポリアルキレンオキシドポリマーに結合可能な少なくとも１つのＣｙｓ残基を有し：
（ｉ）重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端；
（ii）重鎖または軽鎖可変領域のＮ末端；
（iii）ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置；
（iv）Ｎ末端およびＣ末端の両方；
（v）リンカーの２位；
（vi）リンカーの２位およびＣ末端の両方；および
（vii）それらの組合せ；
かつ、少なくとも１つの抗原結合部位を有し、さらに
ＴＮＦ−αと結合することを特徴とする一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｃｙｓ残基が、リンカーの２位、Ｃ末端およびそれらの組合せより成る群から選択される位置に存在することを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記第１ポリペプチドが抗体軽鎖の可変領域を含み、かつ前記第２ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域を含むことを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記第２ポリペプチドのＣ末端が天然のＣ末端であることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドリンカーの大きさが２から１８残基であることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドおよびポリアルキレンオキシドポリマーを含み、ポリアルキレンオキシドポリマーが、Ｃｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに共有結合していることを特徴とする複合体。
【請求項７】
前記ポリアルキレンオキシドが、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィドおよびヨードアセトアミドリンカーより成る群から選択されるリンカーを介してＣｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合していることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項８】
前記ポリアルキレンオキシドが、マレイミドリンカーを介してＣｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合していることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項９】
前記ポリアルキレンオキシドの大きさが、約５，０００から約４０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１０】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキシドが、少なくとも２つの一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合しており、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのそれぞれが同一であるかまたは異なることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１２】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、さらに別の機能部分と結合していることを特徴とする請求項１１記載の複合体。
【請求項１３】
前記別の機能部分が、検出可能な標識またはタグであることを特徴とする請求項１２記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４記載のポリヌクレオチドを含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１６】
一本鎖抗原結合ポリペプチドを作製する方法であって：
（ａ）請求項１５記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し；さらに
（ｂ）前記宿主細胞によって発現された一本鎖抗原結合ポリペプチドを回収する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
試料中に含まれることが疑われるＴＮＦ−αを検出する方法であって：
（ａ）前記試料に、請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドを接触させ；
（ｂ）前記一本鎖抗原結合ポリペプチドがＴＮＦ−αに結合したか否かを検出する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのＣｙｓ残基を介して、少なくとも１つのポリアルキレンオキシドポリマーに共有結合して複合体を形成していることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体が固相担体に固定されていることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類においてＴＮＦ−α関連中毒(TNF-α related toxicity)を治療または予防する方法であって、請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドを、哺乳類においてＴＮＦ−α活性を阻害するのに有効な量で該哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記投与される一本鎖抗原結合ポリペプチドが、少なくとも１つのＣｙｓ残基を介して、少なくとも１つのポリアルキレンオキシドポリマーに共有結合していることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、約１０μｇ／ｋｇから約４，０００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、約２０μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドの２つ以上を含み、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのそれぞれが同一であるかまたは異なることを特徴とするタンパク質。
【請求項２５】
２価、３価または４価であることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２６】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドが非共有結合していることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２７】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドのペプチドリンカーの大きさが、２から１８残基であることを特徴とする請求項２６記載のタンパク質。
【請求項２８】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドが共有結合していることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２９】
単一の多価タンパク質としてコードされていることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項３０】
請求項２９記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１】
ポリアルキレンオキシドポリマーに部位特異的結合可能な一本鎖抗原結合ポリペプチドであって：
（ａ）抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第１ポリペプチド；
（ｂ）抗体重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第２ポリペプチド；および
（ｃ）前記第１および第２ポリペプチドを繋ぐペプチドリンカー；を含み、
以下の位置より成る群から選択される位置に存在する、ポリアルキレンオキシドポリマーに結合可能な少なくとも１つのＣｙｓ残基を有し：
（ｉ）重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端；
（ii）重鎖または軽鎖可変領域のＮ末端；
（iii）ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置；
（iv）Ｎ末端およびＣ末端の両方；
（v）リンカーの２位；
（vi）リンカーの２位およびＣ末端の両方；および
（vii）それらの組合せ；
かつ、少なくとも１つの抗原結合部位を有し、さらに
ＴＮＦ−αと結合することを特徴とする一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｃｙｓ残基が、リンカーの２位、Ｃ末端およびそれらの組合せより成る群から選択される位置に存在することを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記第１ポリペプチドが抗体軽鎖の可変領域を含み、かつ前記第２ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域を含むことを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記第２ポリペプチドのＣ末端が天然のＣ末端であることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドリンカーの大きさが２から１８残基であることを特徴とする請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドおよびポリアルキレンオキシドポリマーを含み、ポリアルキレンオキシドポリマーが、Ｃｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに共有結合していることを特徴とする複合体。
【請求項７】
前記ポリアルキレンオキシドが、マレイミド、ビニルスルホン、チオール、オルトピリジルジスルフィドおよびヨードアセトアミドリンカーより成る群から選択されるリンカーを介してＣｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合していることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項８】
前記ポリアルキレンオキシドが、マレイミドリンカーを介してＣｙｓ残基で一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合していることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項９】
前記ポリアルキレンオキシドの大きさが、約５，０００から約４０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１０】
前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンオキシドが、少なくとも２つの一本鎖抗原結合ポリペプチドに結合しており、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのそれぞれが同一であるかまたは異なることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項１２】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、さらに別の機能部分と結合していることを特徴とする請求項１１記載の複合体。
【請求項１３】
前記別の機能部分が、検出可能な標識またはタグであることを特徴とする請求項１２記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４記載のポリヌクレオチドを含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１６】
一本鎖抗原結合ポリペプチドを作製する方法であって：
（ａ）請求項１５記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し；さらに
（ｂ）前記宿主細胞によって発現された一本鎖抗原結合ポリペプチドを回収する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
試料中に含まれることが疑われるＴＮＦ−αを検出する方法であって：
（ａ）前記試料に、請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドを接触させ；
（ｂ）前記一本鎖抗原結合ポリペプチドがＴＮＦ−αに結合したか否かを検出する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのＣｙｓ残基を介して、少なくとも１つのポリアルキレンオキシドポリマーに共有結合して複合体を形成していることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体が固相担体に固定されていることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類においてＴＮＦ−α関連中毒(TNF-α related toxicity)を治療または予防する方法であって、請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドを、哺乳類においてＴＮＦ−α活性を阻害するのに有効な量で該哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記投与される一本鎖抗原結合ポリペプチドが、少なくとも１つのＣｙｓ残基を介して、少なくとも１つのポリアルキレンオキシドポリマーに共有結合していることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、約１０μｇ／ｋｇから約４，０００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記一本鎖抗原結合ポリペプチドが、約２０μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
請求項１記載の一本鎖抗原結合ポリペプチドの２つ以上を含み、該一本鎖抗原結合ポリペプチドのそれぞれが同一であるかまたは異なることを特徴とするタンパク質。
【請求項２５】
２価、３価または４価であることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２６】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドが非共有結合していることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２７】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドのペプチドリンカーの大きさが、２から１８残基であることを特徴とする請求項２６記載のタンパク質。
【請求項２８】
構成的一本鎖抗原結合ポリペプチドが共有結合していることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２９】
単一の多価タンパク質としてコードされていることを特徴とする請求項２４記載のタンパク質。
【請求項３０】
請求項２９記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５２４５１０（Ｐ２００６−５２４５１０Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３２２５（Ｐ２００６−５１３２２５）
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６９８９
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６９８９
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０５３５４８９９）エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド (28)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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