ポリ臭素化有機化合物分解微生物
【課題】ポリ臭素化有機化合物分解能を有する微生物、ならびにその微生物を使用する有機化合物分解方法及び浄化システムの提供。
【解決手段】ポリ臭素化有機化合物としてヘキサブロモシクロドデカン（ＨＢＣＤ）、トリブロモフェノール（ＴＢＰ）、テトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＰＡ）を効率よく分解する微生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を分離し、環境浄化、有害物質除去に利用する。
【解決手段】ポリ臭素化有機化合物としてヘキサブロモシクロドデカン（ＨＢＣＤ）、トリブロモフェノール（ＴＢＰ）、テトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＰＡ）を効率よく分解する微生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を分離し、環境浄化、有害物質除去に利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ臭素化有機化合物を分解する能力を有する微生物、並びにその微生物を使用する有機化合物分解方法及び浄化システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ臭素化有機化合物の１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン（以下、「ＨＢＣＤ」ともいう）は、主にポリスチレン樹脂やラテックス、カーテン、及びカーペットなどの繊維に添加される環状脂肪族系の難燃剤である。製品のＨＢＣＤにはα、β、γ体の異性体が混在しているが、その主要成分はγ体であり、約９０％を占める。ＨＢＣＤの生産量は全世界で約２０，０００ｔ／年である。難燃剤全体に占めるＨＢＣＤの割合は低く１０％程度であるが、化学的には安定であるので環境中に残留しやすい。その上、脂溶性であることから生体内に取り込まれ蓄積する性質を持つ。人体への影響は不明であるが魚毒性が高く、第一種監視化学物質に認定されている。しかし、現段階では、適当な代替品はなく生産量は伸びており、低コストのＨＢＣＤ処理方法が求められている。
【０００３】
また、同じくポリ臭素化有機化合物の２，４，６−トリブロモフェノール（以下、「ＴＢＰ」ともいう）はプラスチックポリマーや電子基盤、ケーブルなどの製造過程において反応型難燃剤として使用されるほか、製材時において防腐剤としても使用されている。ＴＢＰは化学的に難分解性で環境中に残留しやすい。生体内に取り込まれると蓄積する性質をもち、魚類や藻類などの水系生物に対し高い毒性を示す。現在人体への影響は確認されていないが人の血清において検出される芳香族ハロゲン１００種のうち最も主要な化合物の１つである。インビトロではチロイドホルモン輸送タンパクに競合的に結合し、また神経細胞を分化誘導するなどの活性が示されている。現在難燃剤の需要は全世界で大きな市場（１００万トン／年）を持ち、その中でも臭素系難燃剤の使用量が最も多く、全体の約４０％を占めている。そのうちＴＢＰの使用量は全臭素系難燃剤の１０％弱である。臭素系難燃剤の生産量は今なお伸びており、現在生産と使用が規制されている塩素系難燃剤とは対照的である。このため今後も工業排水などから環境中に漏出し河川におけるＴＢＰ汚染が懸念され、省エネルギー型の浄化システムを確立することが求められている。
【０００４】
同じくポリ臭素化有機化合物のテトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＢＰＡ）は、臭素系難燃剤としては世界で最も多く生産され、需要量は臭素系難燃剤全体の約５０％を占めている。ＴＢＢＰＡは、ＡＢＳ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、エポキシ、ポリカーボネートの各樹脂、耐衝撃性ポリスチレンフェノール樹脂、接着剤などとして、反応性あるいは添加難燃剤として用いられる。一方で化学工場が隣接する河川の汚泥などにおいてＴＢＢＰＡが蓄積していることが確認されており、また水系の藻類や魚類に対し、高い急性毒性を示す。現在までヒトへの生物濃縮性や毒性は観察されていないが、インビトロではチロキシン結合タンパク質に結合し、内分泌系に影響を及ぼす事が懸念されている。したがってＴＢＢＰＡの汚染の拡大を防ぐと共に、増え続ける廃プラスチック中のＴＢＢＰＡを処理するシステムを確立する技術の開発が求められている。
【０００５】
ハロゲン化有機化合物などの化合物については、それらを微生物で分解することにより土壌や海水などの環境を浄化する方法は知られている（特許文献１〜４）。
一方、ポリ臭素化有機化合物については、例えば、ＨＢＣＤの微生物分解が報告されているが、その分解メカニズムは好気的、嫌気的条件ともに不明であり、しかも極低濃度でのＨＢＣＤの微生物分解しか測定されておらず、その上堆積物などを用いての分解を調べただけで、分解菌そのものを単離していない（非特許文献１）。
他のポリ臭素化有機化合物の分解についても、河川堆積物においてＴＢＢＰＡは嫌気的に脱臭素化されてビスフェノールＡになり、続いて好気的に分解されて無機化されること（非特許文献２）、河口堆積物においてＴＢＢＰＡは嫌気的に脱臭素化されてビスフェノールＡとなること（非特許文献３）が、それぞれ報告されているが、分解菌そのものは単離されていない。
【特許文献１】特開平９−１４９７８６号公報
【特許文献２】特開平８−１４０６６５号公報
【特許文献３】特開平１０−５２２５９号公報
【特許文献４】特表２００１−５０７５６７号公報
【非特許文献１】J. W. Davis, S. Gonsior, G. Marty, and J. Ariano: The transformation of hexabromocyclododecane in aerobic and anaerobic soil and aquatic sediments, Water Research, vol. 39, page 1075-1084, 2005.
【非特許文献２】James W. Voordeckers, Donna E. Fennell, Kristi Jones, Max M. Haggbom: Anaerobic Biotransformation of Tetratbromobisphenol A, Tetrachlorobisphenol A, and Bisphenol A in Estuarine Sediments, Environ. Sci. Technol., vol. 36, page 696-701, 2002.
【非特許文献３】Zeev Ronen, Aharon Abeliovich: Anaerobic-Aerobic Process for Microbial Degradation of Tetrabromobisphenol A, Applied and Environmental Microbiology. vol. 66, no. 6, page 2372-2377, 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリ臭素化有機化合物分解能を有する微生物、ならびにその微生物を使用する有機化合物分解方法及び浄化システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、土壌及び海水からポリ臭素化有機化合物分解能を有する微生物を単離し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する微生物であって、ポリ臭素化有機化合物を分解する能力を有する微生物、ならびにその微生物を使用した有機化合物分解方法及び浄化システムに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物は、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを資化する能力を有し、環境中に存在する有機化合物、特にＨＢＣＤ、とりわけα−及びγ−ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡなどのポリ臭素化有機化合物を資化又は分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の微生物としては、配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは１００％の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する微生物であれば特に制限されない。あるいは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種などのシュードモナス属（Pseudomonas）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、又はロドコッカス属（Rhodococcus）に属する、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する微生物であれば特に制限されない。
例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許寄微生物寄託センターに寄託された、下表６４、６５、及び６６に示す微生物が挙げられる。
ハロゲン化脂環式炭化水素及び／又はハロゲン化芳香族炭化水素、特にポリ臭素化有機化合物の分解能に優れている点から、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-181菌株、オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株、及びシュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株が好ましい。
上記微生物の単離方法及び分類学的特性は実施例に具体的に記載する。
【００１０】
上記微生物を自然に又は人工的手段によって変異させて得た変異株も、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能を有する限り、本発明に適用できることは明らかなので、このような変異株又はそれを使用した分解処理方法は本発明の範囲内に包含される。
【００１１】
本発明の微生物は、常用の炭素源及び窒素源の存在下、必要によりさらに無機塩類やビタミン類等の微量要素を含有する培地中で培養することができる。炭素源としては、本発明の微生物が好んで資化する炭水化物、特にグルコースが好ましいが、これらに限定されず、例えばマルトース、フラクトースなども使用可能である。培地中の炭素源の濃度は、炭素源の種類により異なるが、好ましくは、例えば１〜１０ｇ／Ｌである。窒素源としては、有機窒素源、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、等を使用することができ、無機窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、等を使用することができる。窒素源の濃度はその種類により異なるが、好ましくは１〜５ｇ／Ｌである。無機塩類としてはカリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄（ＩＩ）イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等の金属イオンと、塩素イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の陰イオンとから成る塩類が好ましい。
上記培養における温度条件は、通常微生物の生育温度の範囲、好ましくはその最適生育温度に設定するのが好ましい。例えば、２０〜３０℃、好ましくは２８℃に設定することができる。培地のｐＨは、通常使用される微生物が生育できるｐＨの範囲、好ましくはその最適ｐＨに設定する。通常ｐＨ６．５〜７．５の範囲に設定すればよい。培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、通常１日、好ましくは２〜３日である。
また、培養は通常好気的に行われ、例えば振とう培養、あるいは大規模の培養においては、通気・撹拌培養が好ましい。
【００１２】
本発明の微生物はＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する。これはＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを資化又は分解して減少させさえすればよく、減少率の程度は問わないが、例えば、実施例に記載されたＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡの分解能の測定方法に従い、×１／４ＬＢ液体培地中２８℃で６日間培養して、γ−ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを２０％以上、特に６０％以上、とりわけ７０％以上分解するのが好ましい。
【００１３】
本発明の微生物は、有機化合物、特に排水、廃液、河川、湖沼、海水、地下水、及び土壌などの環境に含まれている有機化合物の分解に使用することができる。
上記有機化合物として、鎖状アルカンなどの鎖状炭化水素、環状アルカンなどの脂環式炭化水素、及び芳香族化合物などが例示され、これらは場合によりハロゲンなどで一置換又は多置換されたモノ又はポリハロゲン化有機化合物であってもよく、例えば、モノ及びポリハロゲン化鎖状炭化水素、モノ及びポリハロゲン化脂環式炭化水素、ならびにモノ及びポリハロゲン化芳香族炭化水素などが挙げられる。
上記鎖状アルカンとしては、ドデカン及びオクタンなどの炭素数８〜１２の直鎖状又は分枝鎖状アルカンが例示され、これらはカルボキシル基などの置換基によって場合により置換されていてもよく、ドデカンジカルボン酸が例示される。
上記環状アルカンとして、シクロドデカン及びシクロオクタンなどの８〜１２員環のシクロアルカンが例示され、これらはカルボニル基又はヒドロキシ基などの置換基によって場合により置換されていてもよく、シクロドデカノン及びシクロドデカノールなどが例示される。
上記芳香族化合物として、安息香酸及びフェノールなどが例示される。
上記モノ及びポリハロゲン化鎖状炭化水素としては、炭素数８〜１２の直鎖状又は分枝鎖状のモノ及びポリハロゲン化アルカンが例示される。例えば、ブロモドデカン、特にジブロモドデカン、とりわけ１，１２−ジブロモドデカンが挙げられる。
上記モノ及びポリハロゲン化脂環式炭化水素として、８〜１２員環のモノ及びポリハロゲン化シクロアルカンが例示され、例えば、ハロゲン化シクロドテカンである。より具体的には、ブロモ化シクロオクタン及びブロモ化シクロドテカン、例えばテトラブロモシクロオクタン及びヘキサブロモシクロドデカン、特にＨＢＣＤ、とりわけα−及びγ−ＨＢＣＤである。
上記モノ及びポリハロゲン化芳香族炭化水素として、モノ又はポリハロゲン化フェノールが例示され、例えば、モノブロモフェノール、例えば４−ブロモフェノール；ジブロモフェノール、例えば２，６−ジブロモフェノール；トリブロモフェノール、例えば２，４，６−トリブロモフェノール（ＴＢＰ）；ブロモビスフェノール、例えばテトラブロモビスフェノール、特にテトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＢＰＡ）；ならびにモノ又はポリクロロフェノール、特にトリクロロフェノール、とりわけ２，４，６−トリクロロフェノールなどが挙げられる。
本発明の微生物は、上記の有機化合物の中でモノ又はポリ臭素化有機化合物、特にポリ臭素化有機化合物の分解に有用である。このようなモノ及びポリ臭素化有機化合物として、上記の有機化合物中のモノ及びポリ臭素化鎖状炭化水素、モノ及びポリ臭素化脂環式炭化水素、ならびにモノ及びポリ臭素化芳香族炭化水素などが例示される。
【００１４】
本発明では、本発明のいずれの微生物を使用しても、上記のポリ臭素化有機化合物を分解できるが、良好な分解が得られる点から、好適な組み合わせとしては、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株を使用したγ−ＨＢＣＤの分解、オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株を使用したＴＢＰの分解、及びシュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株を使用したＴＢＢＰＡの分解が例示される。
【００１５】
上記の有機化合物の分解処理は、本発明の微生物と分解処理すべき有機化合物とを接触させて行うことができる。例えば、本発明の微生物を上記環境中に添加して行うか、あるいは本発明の微生物を用いる浄化システムに上記排水や廃液、土壌などを導入して行うことができる。
上記微生物は、培養液の形態で使用してもよく、あるいは培養液から分離した菌体（細胞）として、又は菌体処理物として使用してもよい。菌体処理物とは、菌体を加工したものをいい、菌体破砕抽出物、菌体の凍結乾燥物若しくはスプレードライ物、それらをペレット状に固めた物、又は菌体を多孔質担体に担持したものなどが例示される。あるいは、本発明の微生物を含む土壌、スラッジ（汚泥）、コンポスト、又は土壌改良剤として使用してもよい。
【００１６】
本発明の微生物を用いての上記の有機化合物の分解は、例えば、前記した本発明の微生物の生育条件下で行うのが好ましい。すなわち、本発明の微生物の増殖を促進させるために、水や前記の培養条件で示した微生物の増殖を補助する無機栄養塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン類、炭素源などを同時に添加して好気条件下で培養することが好ましい。特に、本発明では、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを良好に分解できる観点から、ＬＢ培地にて培養するのが好ましい。
有機化合物の分解において、本発明の微生物は、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、処理すべき有機化合物の量や種類などに応じて、１菌株のみを使用してもよいし、２菌株以上併用してもよい。
菌体（細胞）の添加量は、使用する微生物の種類及びそのＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、処理すべき有機化合物の量や種類などにより異なるが、処理すべき溶液又は土壌などの量を基準にして１０6〜１０9細胞／ｇ、好ましくは１０6〜１０8細胞／ｇである。
処理すべき有機化合物の溶解度を高めるため有機溶媒（ベンゼン、アセトン、ヘキサンなど）を添加してもよい。
処理に要する時間は、使用する微生物の種類、そのＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、及び添加量、処理すべき有機化合物の量や種類などにより異なるが、１〜１０日間、好ましくは１〜６日間である。
【００１７】
上記有機化合物の分解を本発明の微生物を用いる浄化システムにおいて行うことができる。
この浄化システムは、微生物を使用する慣用の環境浄化システムでよい。例えば、処理すべき排水、廃液、河川水、湖沼水、海水、地下水、又は土壌などを、本発明の微生物が存在する処理槽に投入し、そこにおいてこれら廃液などの有機化合物を分解して浄化し、次いでこの浄化された廃液などを外部に排泄するようなシステムである。
【００１８】
前述した本発明の微生物は、廃液などの環境中やプラスチックなどの製品中のＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡなどの臭素系難燃剤を資化又は分解して、これらを資源化合物などとして有用な有機酸、例えばコハク酸、ピルビン酸などに変換することができる。
すなわち、本発明は、本発明の微生物を用いる、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡなどの臭素系難燃剤を有機酸に変換する方法及びその方法を使用した資源化合物変換システムにも関する。
【実施例】
【００１９】
１．菌の単離
（１）ＨＢＣＤ資化性菌の単離
土壌又は海水からサンプルを採取し、集積培養を行ってＨＢＣＤ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてα−ＨＢＣＤ又はγ−ＨＢＣＤを１０mgそれぞれ加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、α−ＨＢＣＤ又はγ−ＨＢＣＤを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
また、弱アルカリ性条件下でも集積培養を行った。ＰＡＳ集積培養用液体培地に１０％Ｎａ2ＣＯ3を１ml加えｐＨ９．５にし、上記と同様に集積培養を行い（但し、炭素源としてγ−ＨＢＣＤを使用した）、菌を単離した。
その結果、γ−ＨＢＣＤを炭素源とした集積培地から６株（それぞれＨＢ０９、ＨＢ０１、ＨＢ１０、ＨＢ１１、ＨＢ０２、ＨＢ１２株と名付けた）、α−ＨＢＣＤを炭素源とした集積培地から６株（それぞれＨＢ０３、ＨＢ０４、ＨＢ０５、ＨＢ０６、ＨＢ０７、ＨＢ０８株と名付けた）、アルカリ条件下（炭素源としてγ−ＨＢＣＤを使用）の集積培地から１株（ＨＢ１３株と名付けた）の合計１３株のＨＢＣＤ資化性菌を得た。
【００２０】
【表１】
【００２１】
（２）ＴＢＰ資化性菌の単離
土壌からサンプルを採取し、集積培養を行ってＴＢＰ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてＴＢＰを１０mg加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、ＴＢＰを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１、但し、１Ｌに１００mM ＨＢＣＤ／ＤＭＳＯを０．１ml添加する代わり１０mM ＴＢＰ／ＤＭＳＯを１ml添加した）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
その結果、グラム陰性を示す桿菌６株（それぞれＴＢ０１〜ＴＢ０７株と名付けた）の計７株のＴＢＰ資化性菌を得た。
【００２２】
（３）ＴＢＢＰＡ資化性菌の単離
土壌又は海水からサンプルを採取し、集積培養を行ってＴＢＢＰＡ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてＴＢＢＰＡを１０mg加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、ＴＢＢＰＡを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１、但し、１Ｌに１００mM ＨＢＣＤ／ＤＭＳＯを０．１ml添加する代わり１０mM ＴＢＢＰＡ／ＤＭＳＯを１ml添加した）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
その結果、１株（ＴＡ０１株と名付けた）のＴＢＢＰＡ資化性菌を得た。
【００２３】
２．菌学的性質
上記単離したＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の表現形質による菌学的性質は以下の通りである。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
３．１６ＳｒＤＮＡの塩基配列分析
（１）菌体からのＤＮＡ抽出
Applied BiosystemsのPrep Man Ultra Reagentを使用した。
前記単離したＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の菌体プレートから数個のコロニーを１００μlのPrep Man Ultra Reagentに懸濁し、１００℃で１０分間インキュベートした。懸濁液を１３，０００rpm、５分間遠心し、得られた上清をＤＮＡ溶液として用いた。
（２）１６ＳｒＤＮＡ領域の遺伝子増幅
Applied BiosystemsのMicroSeq（登録商標）500 16S rDNA Bacterial Identification Kitを使用した。
＜ＰＣＲ反応＞
上記３．（１）で調製したＤＮＡ溶液の濃度を測定した後、ＤＮＡ ２０ｎｇを使用してMicroSeq（登録商標）のPCR Master Mixにて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００３４】
【表１１】
【００３５】
（３）シーケンス解析
上記反応産物を精製後、MicroSeq（登録商標）を使用してシーケンス反応を実施、ABI Prism（登録商標）3100 Genetic Analyzerを用いて16SrDNAの上流領域約５００bp（４９０bp以上）の塩基配列を決定した。シーケンス反応は各サンプルＦＷ、ＲＶの両方向から実施し、得られた結果のアセンブルを行い各検体より得られた１６ＳｒＤＮＡ増幅産物の塩基配列を決定した（表１２〜２８）。なお、塩基配列は、５’末端から３’末端方向に、左から右へと記載した。また、塩基は一文字記号で表記した。
ＨＢ０３及びＨＢ０９株；ＨＢ０４、ＨＢ０１、及びＨＢ０７株；ならびにＨＢ０６及びＨＢ１１株は、ほぼ同様の塩基配列を有することが認められた。ＨＢ０３及びＨＢ０９株ならびにＨＢ０４、ＨＢ０１、及びＨＢ０７株については１００％一致し、ＨＢ０６及びＨＢ１１株についてはＨＢ０６株において不特定塩基がＨＢ１１株より二塩基多く含まれているが、他は完全に一致した。
また、ＨＢ０５及びＨＢ０２株はほぼ同様の塩基配列を有することが認められた。ＨＢ１３、ＨＢ１２、ＨＢ１０、及びＨＢ０８株はそれぞれ異なる塩基配列を示した。
【００３６】
【表１２】
【００３７】
【表１３】
【００３８】
【表１４】
【００３９】
【表１５】
【００４０】
【表１６】
【００４１】
【表１７】
【００４２】
【表１８】
【００４３】
【表１９】
【００４４】
【表２０】
【００４５】
【表２１】
【００４６】
【表２２】
【００４７】
【表２３】
【００４８】
【表２４】
【００４９】
【表２５】
【００５０】
【表２６】
【００５１】
【表２７】
【００５２】
【表２８】
【００５３】
上記配列表で、部分的にピークの重複した不特定塩基は「ｎ」と表記した。もっとも、「ｎ」のいくつかは、下表２９のとおり塩基が特定された。
【００５４】
【表２９】
【００５５】
４．菌の分類
（１）１６ＳｒＤＮＡ塩基配列のデーターベースによる相同性検索
各ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の上記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を用いて、ＮＣＢＩホームページ（ＨＢＣＤ及びＴＢＰ資化性菌については２００５年１１月２５日現在、ＴＢＢＰＡ資化性菌については２００６年２月１０日現在）においてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。各菌株の検索結果を表３０〜６３に示す。
【００５６】
【表３０】
【００５７】
【表３１】
【００５８】
【表３２】
【００５９】
【表３３】
【００６０】
【表３４】
【００６１】
【表３５】
【００６２】
【表３６】
【００６３】
【表３７】
【００６４】
【表３８】
【００６５】
【表３９】
【００６６】
【表４０】
【００６７】
【表４１】
【００６８】
【表４２】
【００６９】
【表４３】
【００７０】
【表４４】
【００７１】
【表４５】
【００７２】
【表４６】
【００７３】
【表４７】
【００７４】
【表４８】
【００７５】
【表４９】
【００７６】
【表５０】
【００７７】
【表５１】
【００７８】
【表５２】
【００７９】
【表５３】
【００８０】
【表５４】
【００８１】
【表５５】
【００８２】
【表５６】
【００８３】
【表５７】
【００８４】
【表５８】
【００８５】
【表５９】
【００８６】
【表６０】
【００８７】
【表６１】
【００８８】
【表６２】
【００８９】
【表６３】
【００９０】
上記のＢＬＡＳＴによる相同性検索の結果を以下に示す。
ＨＢ０１株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＨＢ０２株は、Pseudomonas fluorescensと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．８％であった。ＨＢ０３株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．１％であった。ＨＢ０４株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ０５株は、Pseudomonas fluorescensと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．４％であった。ＨＢ０６株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．９％であった。ＨＢ０７株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ０８株は、Stenotrophomonas maltrophiliaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＨＢ０９株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９７．９％であった。ＨＢ１０株は、Stenotrophomonas rhizophilaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ１１株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＨＢ１２株は、Pseudomonas alcaligenesと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．０％であった。ＨＢ１３株は、Rhodococcus erythropolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＴＢ０１株は、Ochrobactrum triticiと最も高い相同性を示し、その相同性は１００％であった。ＴＢ０２株は、Burkholderia fungorumと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．４％であった。ＴＢ０３株は、Pseudomonas nitroredencesと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＴＢ０４株は、Achromobacter xylosoxidansと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．４％であった。ＴＢ０５株は、Pseudomonas veroniiと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．９％であった。ＴＢ０６株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＴＢ０７株は、Pseudomonas plecoglossicida並びにPseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＴＡ０１株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．０％であった。
【００９１】
（２）分類・同定の結果
前記の菌株の分類学的性質に基づき、Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, Vol.1又はVol.2, N.R. Krieg, J. G. Holt (ed), Williams & Wilkins, Baltimore (1984)及びBergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed), J. G. Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (ed), Williams & Wilkins, Baltimore (1994）を参考に分類・同定を行った結果を以下に示す。
ＨＢ０１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０２株は、Pseudomonas fluorescensと同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０３株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０４株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０５株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０６株は、本株はPseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０７株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０８株は、Stenotrophomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもStenotrophomonas属であることが示された。
ＨＢ０９株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１０株は、本株はStenotrophomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもStenotrophomonas属であることが示された。
ＨＢ１１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１２株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１３株は、Rhodococcus属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもRhodococcus属であることが示された。
ＴＢ０１株は、Ochrobactrum属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもOchrobactrum属であることが示された。
ＴＢ０２株は、Burkholderia属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもBurkholderia属であることが示された。
ＴＢ０３株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０４株は、Achromobacter属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもAchromobacter属であることが示された。
ＴＢ０５株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０６株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０７株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＡ０１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
上記の各菌株の分類等を以下に示す（表６４、６５、及び６６）。
【００９２】
【表６４】
【００９３】
【表６５】
【００９４】
【表６６】
【００９５】
ＨＢ０１株及びＴＢ０１株について、上記の相同性の結果に基づいて、MicroSeqTM Analysis software（Applied Biosystems）を用いて系統樹を作成した（図１５、１６）。分子系統樹の推定は近接結合法を用い、樹型の妥当性を示すブートストラップは１０００回発生させた。
【００９６】
５．菌の分解性の検討
ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、ＴＢＢＰＡ、及びそれらの類縁物資を基質とした生育テスト
集積培養で得られた上記各資化性菌の性質を調べるため生育テストを試みた。ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、ＴＢＢＰＡ、又はこれらに構造式が類縁の化合物を基質としてＰＡＳ寒天培地に加えて培養し、各資化性菌の生育を調べた。本実験で用いた化合物を表６７に、結果を表６８及び６９に示した。
なお、＋＋＋：大変良く資化する（寒天培地上で大きなコロニーを形成する）、＋＋：良く資化する（寒天培地上で直径１〜２mm程度のコロニーを形成する）、＋：資化する（寒天培地上で小さなコロニーを形成する）、−：資化しない、である。
【００９７】
【表６７】
【００９８】
【表６８】
【００９９】
【表６９】
【０１００】
ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡの分解能の測定
（１）ＨＢＣＤの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１００mMγ−ＨＢＣＤを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５又は７日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにγ−ＨＢＣＤを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝１．０となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１００mM γ−ＨＢＣＤ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（２，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＤＭＳＯを１ml加えてγ−ＨＢＣＤを溶かし、ＭｅＯＨで１００倍に希釈した。続いてＬＣ−ＭＳ（Waters Quattro Micro）でγ−ＨＢＣＤ量を分析した（表７０）。
【０１０１】
【表７０】
【０１０２】
（２）ＴＢＰの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１０mMＴＢＰを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５又は６日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにＴＢＰを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝０．５となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１０mM ＴＢＰ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（３，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＭｅＯＨを１ml加えてＴＢＰを溶かした。続いてＨＰＬＣ（Hitachi L-7100）でＴＢＰ量を分析した（表７１）。
【０１０３】
【表７１】
【０１０４】
（３）ＴＢＢＰＡの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１０mMＴＢＢＰＡを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５〜８日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにＴＢＢＰＡを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝０．５となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１０mM ＴＢＢＰＡ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（３，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＭｅＯＨを１ml加えてＴＢＢＰＡを溶かした。続いてＨＰＬＣ（Hitachi L-7100）でＴＢＰ量を分析した（表７１）。
【０１０５】
（４）ＨＢＣＤの定量系の確立
γ−ＨＢＣＤをMSで測定した結果、ｍ／ｚ ６４０．４付近に５つの主要なフラグメントが認められた（図１）。もっとも主要な６４０．４のイオンをＬＣ−MSで分析し、１１．３０分付近にピークを検出することが出来た（図２）。検出限界は５ppmであった。γ−ＨＢＣＤの検量線を作成した（図３）。
（５）ＴＢＰの定量系の確立
表７１のＨＰＬＣ分析条件で、溶出時間約８．６分にＴＢＰのピークが検出された（図４）。そのＴＢＰの検量線を図５に示す。
（６）ＴＢＢＰＡの定量系の確立
表７１の分析条件で、溶出時間１２．２分にＴＢＢＰＡのピークが検出された（図１８）。そのＴＢＢＰＡの検量線を図１９に示す。
【０１０６】
（７）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（１）
ＨＢ０１、ＨＢ０２、ＨＢ０８、ＨＢ０９、ＨＢ１２株のγ−ＨＢＣＤの分解能を、上記のＨＢＣＤ分析方法に従い調べた。６日間の培養において、ＨＢ０１株では７３．９％、ＨＢ０２株では６０％、ＨＢ０８及びＨＢ０９株では２７．０％、ＨＢ１２株では７３．１％のγ−ＨＢＣＤ分解率が、それぞれ認められた。
（８）ＴＢＰ資化性菌おけるＴＢＰ分解
ＴＢ０１〜ＴＢ０５株について、上記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢＰの分解能を調べた。５日間の培養において、ＴＢ０５株では６０％、特にＴＢ０１〜ＴＢ０４株については各々１００％のＴＢＰ分解率が認められた。
（９）ＴＢＢＰＡ資化性菌おけるＴＢＢＰＡ分解
ＴＡ０１株について、上記のＴＢＢＰＡ分析方法に従いＴＢＢＰＡの分解能を調べた。５日間の培養において、約５０％のＴＢＢＰＡ分解率が認められた（図１４）。
【０１０７】
（１０）ＨＢ０１株の生育曲線とγ−ＨＢＣＤの経時的分解
上記のＨＢＣＤ分析方法に従いＨＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培地のｐＨと共に培養後２日目まで上昇し、以降プラトーに達した。一方、γ−ＨＢＣＤ濃度は培養後４日目まで減少を続け、約８０％が分解された。
（１１）ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解（１）
上記のＴＢＰ分析方法に準じてＴＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培養後２４時間から上昇し、対数増殖を示した。一方ＴＢＰ濃度は培養後１２時間から３６時間にかけて減少し、１００％分解された。
【０１０８】
（１２）ＨＢ０１株の休止菌体反応におけるγ−ＨＢＣＤの分解（１）
上記のＨＢＣＤ分析方法に従いＨＢ０１株の休止菌体反応によるγ−ＨＢＣＤの分解を調べた。菌体濃度をＯＤ600＝１．０としたとき１mMγ−ＨＢＣＤは４日目で６３％分解された。
（１３）ＴＢ０１株の休止菌体反応におけるＴＢＰの経時的分解（１）
上記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの分解を調べた。菌体濃度をＯＤ６００＝０．５としたとき１００μＭＴＢＰは２４時間で８０％分解され、４８時間で１００％分解された。
【０１０９】
（１４）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（２）
ＨＢ０１株のγ−ＨＢＣＤの分解能に及ぼす培地の影響を、前記のＨＢＣＤ分析方法に準じて調べた。但し、培地として×１／４ＬＢ液体培地（表７０）、ＬＢ液体培地（ポリペプトン：１０ｇ、酵母エキス：５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、グルコース：１ｇ、ｐＨ７．０）、及びＰＡＳ培地（表１の×１０ＰＡ及び×１０ＭＳをそれぞれ１容量部加え、さらに水を８容量部加えて調製する、組成はＫ２ＨＰＯ４：４．３５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．７ｇ、ＮＨ４Ｃｌ：２．１ｇ、ＭｇＳＯ４：０．２ｇ、ＭｎＳＯ４：０．０５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ）を用いた。ＬＢ液体培地を使用したときに最もＨＢＣＤ分解能が高まり、培養３日程度で約８０％程度まで分解されることが認められた（図６）。
【０１１０】
（１５）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（３）
前記のＨＢＣＤ分析方法に準じて、ＨＢ０１株を植菌して、５日間培養後、ジエチルエーテル抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってγ―ＨＢＣＤの残量を調べた。展開液としてヘキサン：酢酸エチル＝４：１の混液を用いた。培養液中からγ−ＨＢＣＤの消失が確認でき、また脂溶性の中間体の蓄積は認められなかった（図７）。
【０１１１】
（１６）ＨＢ０１株の休止菌体反応におけるγ−ＨＢＣＤの分解（２）
前記のＨＢＣＤ分析方法で示した菌体反応に準じた。すなわち、ＨＢ０１株を培養し、得られた菌体を遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分）によって回収し、ＫＰＢに懸濁した。この懸濁液にγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加し、次いでグルコースを１mMの濃度になるように添加するか又は添加せずに、２８℃、１５０rpmで反応させ、ジエチルエーテル抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。その結果、γ−ＨＢＣＤの分解は、グルコースの有無に関わらず認められるが、グルコースがあると分解が高まることが認められた（図８）。
【０１１２】
（１７）ＨＢ０１株の培養液上清及び菌体粗抽出物によるγ−ＨＢＣＤの分解
前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてＨＢ０１株を培養し、培養液１２０mlを遠心分離（１４，４００×ｇ、１０分）して上清を得、この上清を濾過して菌体を除去した。この得られたろ液にγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加し、２８℃、１５０rpmで、４８時間反応させてから、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてジエチルエーテルで抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。
同様に、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてＨＢ０１株を培養し、培養液６０mlを遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分）して菌体を回収し、ＫＰＢに懸濁した。この懸濁液を５分間ソニケーションにかけて菌体を破壊してから、そこにγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加して、３０℃で３０分間反応させさせてから、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてジエチルエーテルで抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。
その結果、培養液上清ではγ−ＨＢＣＤの分解は認められなかったが、菌体粗抽出物ではγ−ＨＢＣＤの分解は認められた（図９）。
【０１１３】
（１８）ＨＢＣＤ資化性菌における工場廃水中のＨＢＣＤ分解
ＨＢ０１株による工場廃水中のＨＢＣＤ分解を、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じて調べた。但し、ＤＭＳＯに溶解させた１００mMγ−ＨＢＣＤを１００μl添加する代わりに、採取してきた工場廃水を５％になるように培地に添加した。その結果、工場廃水中のγ−ＨＢＣＤの分解が認められた（図１０）。
【０１１４】
（１９）Pseudomonas putida KT2440におけるＨＢＣＤ分解
Pseudomonas putida KT2440のγ−ＨＢＣＤの分解能を、前記のＨＢＣＤの分析方法に従い調べた。５日間の培養により、γ−ＨＢＣＤの分解が認められた（図１１）。
【０１１５】
（２０）ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解（２）
前記のＴＢＰの分析方法に準じてＴＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培養後２４時間から上昇して対数増殖を示し、６０時間後にプラトーに達した。一方、ＴＢＰ濃度は培養後１２時間から３６時間にかけて減少し、１００％分解された（図１２）。
【０１１６】
（２１）ＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの経時的分解（２）
前記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの分解及び臭素イオンの発生を調べた。臭素イオン量はイオンクロマトグラフィー法で測定した。ＴＢＰの分解が進むに連れて、臭素イオン量が増加することが確認できた（図１３）。
【０１１７】
（２２）ＨＢ０１株の工場廃水に対する馴化
１００ml容三角フラスコにＰＡＳ培地を１０ml加え、採取してきた工場廃水を１０％になるように添加した。その培地に上記単離したＨＢ０１株及びＨＢ０２株の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）をそれぞれ植菌して、２週間、２８℃、１５０rpmで培養を行った。その後、この菌培養液１００μｌを、工場廃水を１１％含むＰＡＳ培地に植菌して同様に２週間培養した。以下、同様にして、工場廃水を１２％、１３％、１４％と増やしていったＰＡＳ培地に順に菌培養液を植え継いでいったところ、各培地にて菌の生育が観察できた。図１７に１３％のＰＡＳ培地で２週間培養した状態を示す。ＨＢ０１株及びＨＢ０２株を培養させた培地の入ったフラスコは、植菌しなかったブランクのフラスコと比べて白濁しており、菌の生育が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の微生物は、排水、廃液、河川、湖沼、海水、地下水、及び土壌などの環境に含まれている有機化合物の分解処理に使用でき、これら環境の浄化又はこれら環境の汚染防止などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】γ−ＨＢＣＤのマススペクトルである。
【図２】γ−ＨＢＣＤのＬＣ−MSの液体クロマトグラムである。
【図３】γ−ＨＢＣＤの検量線である。
【図４】ＴＢＰのＨＰＬＣの液体クロマトグラムである。
【図５】ＴＢＰの検量線である。
【図６】ＨＢ０１株によるγ−ＨＢＣＤの経時的分解を示す図である。
【図７】ＨＢ０１株の培養液中のγ−ＨＢＣＤの薄層クロマトグラムである。
【図８】ＨＢ０１株の休止菌体反応によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。Ａはグルコース非存在下での、Ｂはグルコース存在下での分解をそれぞれ示す図である。
【図９】ＨＢ０１株の培養液上清及び菌体粗抽出物によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。Ａは培養液上清による、Ｂは菌体抽出物による分解を、それぞれ示す図である。
【図１０】ＨＢ０１株による工場廃水中のγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。
【図１１】Pseudomonas putida KT2440によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。
【図１２】ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解を示す図である。
【図１３】ＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの経時的分解を示す図である。
【図１４】ＴＡ０１株におけるＴＢＢＰＡの分解を示す図である。
【図１５】ＨＢ０１株の系統樹を示す図である。分岐点に示された点はブートストラップ信頼値である。
【図１６】ＴＢ０１株の系統樹を示す図である。分岐点に示された点はブートストラップ信頼値である。
【図１７】ＨＢ０１株を２週間培養した１３％工場廃水含有ＰＡＳ培地の状態を示す図である。
【図１８】ＴＢＢＰＡのＨＰＬＣの液体クロマトグラムである。
【図１９】ＴＢＢＰＡの検量線である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ臭素化有機化合物を分解する能力を有する微生物、並びにその微生物を使用する有機化合物分解方法及び浄化システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ臭素化有機化合物の１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン（以下、「ＨＢＣＤ」ともいう）は、主にポリスチレン樹脂やラテックス、カーテン、及びカーペットなどの繊維に添加される環状脂肪族系の難燃剤である。製品のＨＢＣＤにはα、β、γ体の異性体が混在しているが、その主要成分はγ体であり、約９０％を占める。ＨＢＣＤの生産量は全世界で約２０，０００ｔ／年である。難燃剤全体に占めるＨＢＣＤの割合は低く１０％程度であるが、化学的には安定であるので環境中に残留しやすい。その上、脂溶性であることから生体内に取り込まれ蓄積する性質を持つ。人体への影響は不明であるが魚毒性が高く、第一種監視化学物質に認定されている。しかし、現段階では、適当な代替品はなく生産量は伸びており、低コストのＨＢＣＤ処理方法が求められている。
【０００３】
また、同じくポリ臭素化有機化合物の２，４，６−トリブロモフェノール（以下、「ＴＢＰ」ともいう）はプラスチックポリマーや電子基盤、ケーブルなどの製造過程において反応型難燃剤として使用されるほか、製材時において防腐剤としても使用されている。ＴＢＰは化学的に難分解性で環境中に残留しやすい。生体内に取り込まれると蓄積する性質をもち、魚類や藻類などの水系生物に対し高い毒性を示す。現在人体への影響は確認されていないが人の血清において検出される芳香族ハロゲン１００種のうち最も主要な化合物の１つである。インビトロではチロイドホルモン輸送タンパクに競合的に結合し、また神経細胞を分化誘導するなどの活性が示されている。現在難燃剤の需要は全世界で大きな市場（１００万トン／年）を持ち、その中でも臭素系難燃剤の使用量が最も多く、全体の約４０％を占めている。そのうちＴＢＰの使用量は全臭素系難燃剤の１０％弱である。臭素系難燃剤の生産量は今なお伸びており、現在生産と使用が規制されている塩素系難燃剤とは対照的である。このため今後も工業排水などから環境中に漏出し河川におけるＴＢＰ汚染が懸念され、省エネルギー型の浄化システムを確立することが求められている。
【０００４】
同じくポリ臭素化有機化合物のテトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＢＰＡ）は、臭素系難燃剤としては世界で最も多く生産され、需要量は臭素系難燃剤全体の約５０％を占めている。ＴＢＢＰＡは、ＡＢＳ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、エポキシ、ポリカーボネートの各樹脂、耐衝撃性ポリスチレンフェノール樹脂、接着剤などとして、反応性あるいは添加難燃剤として用いられる。一方で化学工場が隣接する河川の汚泥などにおいてＴＢＢＰＡが蓄積していることが確認されており、また水系の藻類や魚類に対し、高い急性毒性を示す。現在までヒトへの生物濃縮性や毒性は観察されていないが、インビトロではチロキシン結合タンパク質に結合し、内分泌系に影響を及ぼす事が懸念されている。したがってＴＢＢＰＡの汚染の拡大を防ぐと共に、増え続ける廃プラスチック中のＴＢＢＰＡを処理するシステムを確立する技術の開発が求められている。
【０００５】
ハロゲン化有機化合物などの化合物については、それらを微生物で分解することにより土壌や海水などの環境を浄化する方法は知られている（特許文献１〜４）。
一方、ポリ臭素化有機化合物については、例えば、ＨＢＣＤの微生物分解が報告されているが、その分解メカニズムは好気的、嫌気的条件ともに不明であり、しかも極低濃度でのＨＢＣＤの微生物分解しか測定されておらず、その上堆積物などを用いての分解を調べただけで、分解菌そのものを単離していない（非特許文献１）。
他のポリ臭素化有機化合物の分解についても、河川堆積物においてＴＢＢＰＡは嫌気的に脱臭素化されてビスフェノールＡになり、続いて好気的に分解されて無機化されること（非特許文献２）、河口堆積物においてＴＢＢＰＡは嫌気的に脱臭素化されてビスフェノールＡとなること（非特許文献３）が、それぞれ報告されているが、分解菌そのものは単離されていない。
【特許文献１】特開平９−１４９７８６号公報
【特許文献２】特開平８−１４０６６５号公報
【特許文献３】特開平１０−５２２５９号公報
【特許文献４】特表２００１−５０７５６７号公報
【非特許文献１】J. W. Davis, S. Gonsior, G. Marty, and J. Ariano: The transformation of hexabromocyclododecane in aerobic and anaerobic soil and aquatic sediments, Water Research, vol. 39, page 1075-1084, 2005.
【非特許文献２】James W. Voordeckers, Donna E. Fennell, Kristi Jones, Max M. Haggbom: Anaerobic Biotransformation of Tetratbromobisphenol A, Tetrachlorobisphenol A, and Bisphenol A in Estuarine Sediments, Environ. Sci. Technol., vol. 36, page 696-701, 2002.
【非特許文献３】Zeev Ronen, Aharon Abeliovich: Anaerobic-Aerobic Process for Microbial Degradation of Tetrabromobisphenol A, Applied and Environmental Microbiology. vol. 66, no. 6, page 2372-2377, 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリ臭素化有機化合物分解能を有する微生物、ならびにその微生物を使用する有機化合物分解方法及び浄化システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、土壌及び海水からポリ臭素化有機化合物分解能を有する微生物を単離し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する微生物であって、ポリ臭素化有機化合物を分解する能力を有する微生物、ならびにその微生物を使用した有機化合物分解方法及び浄化システムに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物は、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを資化する能力を有し、環境中に存在する有機化合物、特にＨＢＣＤ、とりわけα−及びγ−ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡなどのポリ臭素化有機化合物を資化又は分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の微生物としては、配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは１００％の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する微生物であれば特に制限されない。あるいは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）種などのシュードモナス属（Pseudomonas）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、又はロドコッカス属（Rhodococcus）に属する、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する微生物であれば特に制限されない。
例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許寄微生物寄託センターに寄託された、下表６４、６５、及び６６に示す微生物が挙げられる。
ハロゲン化脂環式炭化水素及び／又はハロゲン化芳香族炭化水素、特にポリ臭素化有機化合物の分解能に優れている点から、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-181菌株、オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株、及びシュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株が好ましい。
上記微生物の単離方法及び分類学的特性は実施例に具体的に記載する。
【００１０】
上記微生物を自然に又は人工的手段によって変異させて得た変異株も、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能を有する限り、本発明に適用できることは明らかなので、このような変異株又はそれを使用した分解処理方法は本発明の範囲内に包含される。
【００１１】
本発明の微生物は、常用の炭素源及び窒素源の存在下、必要によりさらに無機塩類やビタミン類等の微量要素を含有する培地中で培養することができる。炭素源としては、本発明の微生物が好んで資化する炭水化物、特にグルコースが好ましいが、これらに限定されず、例えばマルトース、フラクトースなども使用可能である。培地中の炭素源の濃度は、炭素源の種類により異なるが、好ましくは、例えば１〜１０ｇ／Ｌである。窒素源としては、有機窒素源、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、等を使用することができ、無機窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、等を使用することができる。窒素源の濃度はその種類により異なるが、好ましくは１〜５ｇ／Ｌである。無機塩類としてはカリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄（ＩＩ）イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等の金属イオンと、塩素イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の陰イオンとから成る塩類が好ましい。
上記培養における温度条件は、通常微生物の生育温度の範囲、好ましくはその最適生育温度に設定するのが好ましい。例えば、２０〜３０℃、好ましくは２８℃に設定することができる。培地のｐＨは、通常使用される微生物が生育できるｐＨの範囲、好ましくはその最適ｐＨに設定する。通常ｐＨ６．５〜７．５の範囲に設定すればよい。培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、通常１日、好ましくは２〜３日である。
また、培養は通常好気的に行われ、例えば振とう培養、あるいは大規模の培養においては、通気・撹拌培養が好ましい。
【００１２】
本発明の微生物はＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを分解する能力を有する。これはＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを資化又は分解して減少させさえすればよく、減少率の程度は問わないが、例えば、実施例に記載されたＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡの分解能の測定方法に従い、×１／４ＬＢ液体培地中２８℃で６日間培養して、γ−ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡを２０％以上、特に６０％以上、とりわけ７０％以上分解するのが好ましい。
【００１３】
本発明の微生物は、有機化合物、特に排水、廃液、河川、湖沼、海水、地下水、及び土壌などの環境に含まれている有機化合物の分解に使用することができる。
上記有機化合物として、鎖状アルカンなどの鎖状炭化水素、環状アルカンなどの脂環式炭化水素、及び芳香族化合物などが例示され、これらは場合によりハロゲンなどで一置換又は多置換されたモノ又はポリハロゲン化有機化合物であってもよく、例えば、モノ及びポリハロゲン化鎖状炭化水素、モノ及びポリハロゲン化脂環式炭化水素、ならびにモノ及びポリハロゲン化芳香族炭化水素などが挙げられる。
上記鎖状アルカンとしては、ドデカン及びオクタンなどの炭素数８〜１２の直鎖状又は分枝鎖状アルカンが例示され、これらはカルボキシル基などの置換基によって場合により置換されていてもよく、ドデカンジカルボン酸が例示される。
上記環状アルカンとして、シクロドデカン及びシクロオクタンなどの８〜１２員環のシクロアルカンが例示され、これらはカルボニル基又はヒドロキシ基などの置換基によって場合により置換されていてもよく、シクロドデカノン及びシクロドデカノールなどが例示される。
上記芳香族化合物として、安息香酸及びフェノールなどが例示される。
上記モノ及びポリハロゲン化鎖状炭化水素としては、炭素数８〜１２の直鎖状又は分枝鎖状のモノ及びポリハロゲン化アルカンが例示される。例えば、ブロモドデカン、特にジブロモドデカン、とりわけ１，１２−ジブロモドデカンが挙げられる。
上記モノ及びポリハロゲン化脂環式炭化水素として、８〜１２員環のモノ及びポリハロゲン化シクロアルカンが例示され、例えば、ハロゲン化シクロドテカンである。より具体的には、ブロモ化シクロオクタン及びブロモ化シクロドテカン、例えばテトラブロモシクロオクタン及びヘキサブロモシクロドデカン、特にＨＢＣＤ、とりわけα−及びγ−ＨＢＣＤである。
上記モノ及びポリハロゲン化芳香族炭化水素として、モノ又はポリハロゲン化フェノールが例示され、例えば、モノブロモフェノール、例えば４−ブロモフェノール；ジブロモフェノール、例えば２，６−ジブロモフェノール；トリブロモフェノール、例えば２，４，６−トリブロモフェノール（ＴＢＰ）；ブロモビスフェノール、例えばテトラブロモビスフェノール、特にテトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＢＰＡ）；ならびにモノ又はポリクロロフェノール、特にトリクロロフェノール、とりわけ２，４，６−トリクロロフェノールなどが挙げられる。
本発明の微生物は、上記の有機化合物の中でモノ又はポリ臭素化有機化合物、特にポリ臭素化有機化合物の分解に有用である。このようなモノ及びポリ臭素化有機化合物として、上記の有機化合物中のモノ及びポリ臭素化鎖状炭化水素、モノ及びポリ臭素化脂環式炭化水素、ならびにモノ及びポリ臭素化芳香族炭化水素などが例示される。
【００１４】
本発明では、本発明のいずれの微生物を使用しても、上記のポリ臭素化有機化合物を分解できるが、良好な分解が得られる点から、好適な組み合わせとしては、シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株を使用したγ−ＨＢＣＤの分解、オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株を使用したＴＢＰの分解、及びシュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株を使用したＴＢＢＰＡの分解が例示される。
【００１５】
上記の有機化合物の分解処理は、本発明の微生物と分解処理すべき有機化合物とを接触させて行うことができる。例えば、本発明の微生物を上記環境中に添加して行うか、あるいは本発明の微生物を用いる浄化システムに上記排水や廃液、土壌などを導入して行うことができる。
上記微生物は、培養液の形態で使用してもよく、あるいは培養液から分離した菌体（細胞）として、又は菌体処理物として使用してもよい。菌体処理物とは、菌体を加工したものをいい、菌体破砕抽出物、菌体の凍結乾燥物若しくはスプレードライ物、それらをペレット状に固めた物、又は菌体を多孔質担体に担持したものなどが例示される。あるいは、本発明の微生物を含む土壌、スラッジ（汚泥）、コンポスト、又は土壌改良剤として使用してもよい。
【００１６】
本発明の微生物を用いての上記の有機化合物の分解は、例えば、前記した本発明の微生物の生育条件下で行うのが好ましい。すなわち、本発明の微生物の増殖を促進させるために、水や前記の培養条件で示した微生物の増殖を補助する無機栄養塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン類、炭素源などを同時に添加して好気条件下で培養することが好ましい。特に、本発明では、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡを良好に分解できる観点から、ＬＢ培地にて培養するのが好ましい。
有機化合物の分解において、本発明の微生物は、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、処理すべき有機化合物の量や種類などに応じて、１菌株のみを使用してもよいし、２菌株以上併用してもよい。
菌体（細胞）の添加量は、使用する微生物の種類及びそのＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、処理すべき有機化合物の量や種類などにより異なるが、処理すべき溶液又は土壌などの量を基準にして１０6〜１０9細胞／ｇ、好ましくは１０6〜１０8細胞／ｇである。
処理すべき有機化合物の溶解度を高めるため有機溶媒（ベンゼン、アセトン、ヘキサンなど）を添加してもよい。
処理に要する時間は、使用する微生物の種類、そのＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及び／又はＴＢＢＰＡ分解能、及び添加量、処理すべき有機化合物の量や種類などにより異なるが、１〜１０日間、好ましくは１〜６日間である。
【００１７】
上記有機化合物の分解を本発明の微生物を用いる浄化システムにおいて行うことができる。
この浄化システムは、微生物を使用する慣用の環境浄化システムでよい。例えば、処理すべき排水、廃液、河川水、湖沼水、海水、地下水、又は土壌などを、本発明の微生物が存在する処理槽に投入し、そこにおいてこれら廃液などの有機化合物を分解して浄化し、次いでこの浄化された廃液などを外部に排泄するようなシステムである。
【００１８】
前述した本発明の微生物は、廃液などの環境中やプラスチックなどの製品中のＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡなどの臭素系難燃剤を資化又は分解して、これらを資源化合物などとして有用な有機酸、例えばコハク酸、ピルビン酸などに変換することができる。
すなわち、本発明は、本発明の微生物を用いる、ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、又はＴＢＢＰＡなどの臭素系難燃剤を有機酸に変換する方法及びその方法を使用した資源化合物変換システムにも関する。
【実施例】
【００１９】
１．菌の単離
（１）ＨＢＣＤ資化性菌の単離
土壌又は海水からサンプルを採取し、集積培養を行ってＨＢＣＤ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてα−ＨＢＣＤ又はγ−ＨＢＣＤを１０mgそれぞれ加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、α−ＨＢＣＤ又はγ−ＨＢＣＤを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
また、弱アルカリ性条件下でも集積培養を行った。ＰＡＳ集積培養用液体培地に１０％Ｎａ2ＣＯ3を１ml加えｐＨ９．５にし、上記と同様に集積培養を行い（但し、炭素源としてγ−ＨＢＣＤを使用した）、菌を単離した。
その結果、γ−ＨＢＣＤを炭素源とした集積培地から６株（それぞれＨＢ０９、ＨＢ０１、ＨＢ１０、ＨＢ１１、ＨＢ０２、ＨＢ１２株と名付けた）、α−ＨＢＣＤを炭素源とした集積培地から６株（それぞれＨＢ０３、ＨＢ０４、ＨＢ０５、ＨＢ０６、ＨＢ０７、ＨＢ０８株と名付けた）、アルカリ条件下（炭素源としてγ−ＨＢＣＤを使用）の集積培地から１株（ＨＢ１３株と名付けた）の合計１３株のＨＢＣＤ資化性菌を得た。
【００２０】
【表１】
【００２１】
（２）ＴＢＰ資化性菌の単離
土壌からサンプルを採取し、集積培養を行ってＴＢＰ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてＴＢＰを１０mg加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、ＴＢＰを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１、但し、１Ｌに１００mM ＨＢＣＤ／ＤＭＳＯを０．１ml添加する代わり１０mM ＴＢＰ／ＤＭＳＯを１ml添加した）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
その結果、グラム陰性を示す桿菌６株（それぞれＴＢ０１〜ＴＢ０７株と名付けた）の計７株のＴＢＰ資化性菌を得た。
【００２２】
（３）ＴＢＢＰＡ資化性菌の単離
土壌又は海水からサンプルを採取し、集積培養を行ってＴＢＢＰＡ資化性菌を単離した。
先ず、１００ml容三角フラスコに×１０ＰＡ（表１）を１ml、Ｈ2Ｏを８mlそれぞれ加えオートクレーブ（１２０℃，２０分）をした。室温程度まで冷ました後にフィルター濾過した×１０MS（表１）を１ml、炭素源としてＴＢＢＰＡを１０mg加えた。これをＰＡＳ集積培養用液体培地として、そこに上記サンプルを植菌して２８℃、１５０rpmで培養した。
１４日間ごとに新たなＰＡＳ集積培養用液体培地に１００μlを植え継ぐことによってサンプル由来の炭素源が希釈され、その結果、ＴＢＢＰＡを分解する微生物を単離することが出来る。この作業を９〜１０回程度行ってから、寒天培地（表１、但し、１Ｌに１００mM ＨＢＣＤ／ＤＭＳＯを０．１ml添加する代わり１０mM ＴＢＢＰＡ／ＤＭＳＯを１ml添加した）に塗布し３０℃で７日間培養して菌を単離した。
その結果、１株（ＴＡ０１株と名付けた）のＴＢＢＰＡ資化性菌を得た。
【００２３】
２．菌学的性質
上記単離したＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の表現形質による菌学的性質は以下の通りである。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
３．１６ＳｒＤＮＡの塩基配列分析
（１）菌体からのＤＮＡ抽出
Applied BiosystemsのPrep Man Ultra Reagentを使用した。
前記単離したＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の菌体プレートから数個のコロニーを１００μlのPrep Man Ultra Reagentに懸濁し、１００℃で１０分間インキュベートした。懸濁液を１３，０００rpm、５分間遠心し、得られた上清をＤＮＡ溶液として用いた。
（２）１６ＳｒＤＮＡ領域の遺伝子増幅
Applied BiosystemsのMicroSeq（登録商標）500 16S rDNA Bacterial Identification Kitを使用した。
＜ＰＣＲ反応＞
上記３．（１）で調製したＤＮＡ溶液の濃度を測定した後、ＤＮＡ ２０ｎｇを使用してMicroSeq（登録商標）のPCR Master Mixにて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００３４】
【表１１】
【００３５】
（３）シーケンス解析
上記反応産物を精製後、MicroSeq（登録商標）を使用してシーケンス反応を実施、ABI Prism（登録商標）3100 Genetic Analyzerを用いて16SrDNAの上流領域約５００bp（４９０bp以上）の塩基配列を決定した。シーケンス反応は各サンプルＦＷ、ＲＶの両方向から実施し、得られた結果のアセンブルを行い各検体より得られた１６ＳｒＤＮＡ増幅産物の塩基配列を決定した（表１２〜２８）。なお、塩基配列は、５’末端から３’末端方向に、左から右へと記載した。また、塩基は一文字記号で表記した。
ＨＢ０３及びＨＢ０９株；ＨＢ０４、ＨＢ０１、及びＨＢ０７株；ならびにＨＢ０６及びＨＢ１１株は、ほぼ同様の塩基配列を有することが認められた。ＨＢ０３及びＨＢ０９株ならびにＨＢ０４、ＨＢ０１、及びＨＢ０７株については１００％一致し、ＨＢ０６及びＨＢ１１株についてはＨＢ０６株において不特定塩基がＨＢ１１株より二塩基多く含まれているが、他は完全に一致した。
また、ＨＢ０５及びＨＢ０２株はほぼ同様の塩基配列を有することが認められた。ＨＢ１３、ＨＢ１２、ＨＢ１０、及びＨＢ０８株はそれぞれ異なる塩基配列を示した。
【００３６】
【表１２】
【００３７】
【表１３】
【００３８】
【表１４】
【００３９】
【表１５】
【００４０】
【表１６】
【００４１】
【表１７】
【００４２】
【表１８】
【００４３】
【表１９】
【００４４】
【表２０】
【００４５】
【表２１】
【００４６】
【表２２】
【００４７】
【表２３】
【００４８】
【表２４】
【００４９】
【表２５】
【００５０】
【表２６】
【００５１】
【表２７】
【００５２】
【表２８】
【００５３】
上記配列表で、部分的にピークの重複した不特定塩基は「ｎ」と表記した。もっとも、「ｎ」のいくつかは、下表２９のとおり塩基が特定された。
【００５４】
【表２９】
【００５５】
４．菌の分類
（１）１６ＳｒＤＮＡ塩基配列のデーターベースによる相同性検索
各ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡ資化性菌の上記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を用いて、ＮＣＢＩホームページ（ＨＢＣＤ及びＴＢＰ資化性菌については２００５年１１月２５日現在、ＴＢＢＰＡ資化性菌については２００６年２月１０日現在）においてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。各菌株の検索結果を表３０〜６３に示す。
【００５６】
【表３０】
【００５７】
【表３１】
【００５８】
【表３２】
【００５９】
【表３３】
【００６０】
【表３４】
【００６１】
【表３５】
【００６２】
【表３６】
【００６３】
【表３７】
【００６４】
【表３８】
【００６５】
【表３９】
【００６６】
【表４０】
【００６７】
【表４１】
【００６８】
【表４２】
【００６９】
【表４３】
【００７０】
【表４４】
【００７１】
【表４５】
【００７２】
【表４６】
【００７３】
【表４７】
【００７４】
【表４８】
【００７５】
【表４９】
【００７６】
【表５０】
【００７７】
【表５１】
【００７８】
【表５２】
【００７９】
【表５３】
【００８０】
【表５４】
【００８１】
【表５５】
【００８２】
【表５６】
【００８３】
【表５７】
【００８４】
【表５８】
【００８５】
【表５９】
【００８６】
【表６０】
【００８７】
【表６１】
【００８８】
【表６２】
【００８９】
【表６３】
【００９０】
上記のＢＬＡＳＴによる相同性検索の結果を以下に示す。
ＨＢ０１株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＨＢ０２株は、Pseudomonas fluorescensと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．８％であった。ＨＢ０３株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．１％であった。ＨＢ０４株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ０５株は、Pseudomonas fluorescensと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．４％であった。ＨＢ０６株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．９％であった。ＨＢ０７株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ０８株は、Stenotrophomonas maltrophiliaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＨＢ０９株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９７．９％であった。ＨＢ１０株は、Stenotrophomonas rhizophilaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．８％であった。ＨＢ１１株は、Pseudomonas citronellolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＨＢ１２株は、Pseudomonas alcaligenesと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．０％であった。ＨＢ１３株は、Rhodococcus erythropolisと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＴＢ０１株は、Ochrobactrum triticiと最も高い相同性を示し、その相同性は１００％であった。ＴＢ０２株は、Burkholderia fungorumと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．４％であった。ＴＢ０３株は、Pseudomonas nitroredencesと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．６％であった。ＴＢ０４株は、Achromobacter xylosoxidansと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．４％であった。ＴＢ０５株は、Pseudomonas veroniiと最も高い相同性を示し、その相同性は９８．９％であった。ＴＢ０６株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＴＢ０７株は、Pseudomonas plecoglossicida並びにPseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．２％であった。ＴＡ０１株は、Pseudomonas putidaと最も高い相同性を示し、その相同性は９９．０％であった。
【００９１】
（２）分類・同定の結果
前記の菌株の分類学的性質に基づき、Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, Vol.1又はVol.2, N.R. Krieg, J. G. Holt (ed), Williams & Wilkins, Baltimore (1984)及びBergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed), J. G. Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (ed), Williams & Wilkins, Baltimore (1994）を参考に分類・同定を行った結果を以下に示す。
ＨＢ０１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０２株は、Pseudomonas fluorescensと同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０３株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０４株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０５株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０６株は、本株はPseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０７株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ０８株は、Stenotrophomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもStenotrophomonas属であることが示された。
ＨＢ０９株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１０株は、本株はStenotrophomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもStenotrophomonas属であることが示された。
ＨＢ１１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１２株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＨＢ１３株は、Rhodococcus属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもRhodococcus属であることが示された。
ＴＢ０１株は、Ochrobactrum属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもOchrobactrum属であることが示された。
ＴＢ０２株は、Burkholderia属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもBurkholderia属であることが示された。
ＴＢ０３株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０４株は、Achromobacter属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもAchromobacter属であることが示された。
ＴＢ０５株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０６株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＢ０７株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
ＴＡ０１株は、Pseudomonas属と同定された。また本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく相同性解析の結果においてもPseudomonas属であることが示された。
上記の各菌株の分類等を以下に示す（表６４、６５、及び６６）。
【００９２】
【表６４】
【００９３】
【表６５】
【００９４】
【表６６】
【００９５】
ＨＢ０１株及びＴＢ０１株について、上記の相同性の結果に基づいて、MicroSeqTM Analysis software（Applied Biosystems）を用いて系統樹を作成した（図１５、１６）。分子系統樹の推定は近接結合法を用い、樹型の妥当性を示すブートストラップは１０００回発生させた。
【００９６】
５．菌の分解性の検討
ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、ＴＢＢＰＡ、及びそれらの類縁物資を基質とした生育テスト
集積培養で得られた上記各資化性菌の性質を調べるため生育テストを試みた。ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、ＴＢＢＰＡ、又はこれらに構造式が類縁の化合物を基質としてＰＡＳ寒天培地に加えて培養し、各資化性菌の生育を調べた。本実験で用いた化合物を表６７に、結果を表６８及び６９に示した。
なお、＋＋＋：大変良く資化する（寒天培地上で大きなコロニーを形成する）、＋＋：良く資化する（寒天培地上で直径１〜２mm程度のコロニーを形成する）、＋：資化する（寒天培地上で小さなコロニーを形成する）、−：資化しない、である。
【００９７】
【表６７】
【００９８】
【表６８】
【００９９】
【表６９】
【０１００】
ＨＢＣＤ、ＴＢＰ、及びＴＢＢＰＡの分解能の測定
（１）ＨＢＣＤの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１００mMγ−ＨＢＣＤを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５又は７日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにγ−ＨＢＣＤを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝１．０となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１００mM γ−ＨＢＣＤ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（２，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＤＭＳＯを１ml加えてγ−ＨＢＣＤを溶かし、ＭｅＯＨで１００倍に希釈した。続いてＬＣ−ＭＳ（Waters Quattro Micro）でγ−ＨＢＣＤ量を分析した（表７０）。
【０１０１】
【表７０】
【０１０２】
（２）ＴＢＰの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１０mMＴＢＰを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５又は６日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにＴＢＰを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝０．５となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１０mM ＴＢＰ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（３，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＭｅＯＨを１ml加えてＴＢＰを溶かした。続いてＨＰＬＣ（Hitachi L-7100）でＴＢＰ量を分析した（表７１）。
【０１０３】
【表７１】
【０１０４】
（３）ＴＢＢＰＡの分析方法
１００ml容三角フラスコに×１／４ＬＢ液体培地（表７０）を１０ml加え、ＤＭＳＯに溶解させた１０mMＴＢＢＰＡを１００μl添加した。その培地に上記単離した資化性菌の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）を植菌して、０日目から５〜８日目まで、２８℃、１５０rpmで培養を行った。一日ごとにＯＤ600とｐＨを測定するとともにＴＢＢＰＡを抽出しその濃度を測定した。
休止菌体反応は以下のように行った。上記×１／４ＬＢ培地で培養した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、５分）によって回収し、カリウムリン酸バッファー（ＫＰＢ；５０mM、ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、０Ｄ600＝０．５となるようにＫＰＢに懸濁した。１００ml容三角フラスコに菌体液１０mlを加え、さらに１０mM ＴＢＢＰＡ１００μlを添加して、２８℃、１５０rpmで反応させた。
抽出方法は以下のとおりである。先ず上記培養液又は菌体反応液を遠心管に移しジエチルエーテル１０mlを加えボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、遠心分離（３，０００×ｇ、５分）し上層を三角フラスコに移した。無水硫酸ナトリウムを適量入れ脱水して濾過し、２．５mlをバイアル瓶に移しロータリーエバポレーターで乾固した。バイアル瓶にＭｅＯＨを１ml加えてＴＢＢＰＡを溶かした。続いてＨＰＬＣ（Hitachi L-7100）でＴＢＰ量を分析した（表７１）。
【０１０５】
（４）ＨＢＣＤの定量系の確立
γ−ＨＢＣＤをMSで測定した結果、ｍ／ｚ ６４０．４付近に５つの主要なフラグメントが認められた（図１）。もっとも主要な６４０．４のイオンをＬＣ−MSで分析し、１１．３０分付近にピークを検出することが出来た（図２）。検出限界は５ppmであった。γ−ＨＢＣＤの検量線を作成した（図３）。
（５）ＴＢＰの定量系の確立
表７１のＨＰＬＣ分析条件で、溶出時間約８．６分にＴＢＰのピークが検出された（図４）。そのＴＢＰの検量線を図５に示す。
（６）ＴＢＢＰＡの定量系の確立
表７１の分析条件で、溶出時間１２．２分にＴＢＢＰＡのピークが検出された（図１８）。そのＴＢＢＰＡの検量線を図１９に示す。
【０１０６】
（７）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（１）
ＨＢ０１、ＨＢ０２、ＨＢ０８、ＨＢ０９、ＨＢ１２株のγ−ＨＢＣＤの分解能を、上記のＨＢＣＤ分析方法に従い調べた。６日間の培養において、ＨＢ０１株では７３．９％、ＨＢ０２株では６０％、ＨＢ０８及びＨＢ０９株では２７．０％、ＨＢ１２株では７３．１％のγ−ＨＢＣＤ分解率が、それぞれ認められた。
（８）ＴＢＰ資化性菌おけるＴＢＰ分解
ＴＢ０１〜ＴＢ０５株について、上記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢＰの分解能を調べた。５日間の培養において、ＴＢ０５株では６０％、特にＴＢ０１〜ＴＢ０４株については各々１００％のＴＢＰ分解率が認められた。
（９）ＴＢＢＰＡ資化性菌おけるＴＢＢＰＡ分解
ＴＡ０１株について、上記のＴＢＢＰＡ分析方法に従いＴＢＢＰＡの分解能を調べた。５日間の培養において、約５０％のＴＢＢＰＡ分解率が認められた（図１４）。
【０１０７】
（１０）ＨＢ０１株の生育曲線とγ−ＨＢＣＤの経時的分解
上記のＨＢＣＤ分析方法に従いＨＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培地のｐＨと共に培養後２日目まで上昇し、以降プラトーに達した。一方、γ−ＨＢＣＤ濃度は培養後４日目まで減少を続け、約８０％が分解された。
（１１）ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解（１）
上記のＴＢＰ分析方法に準じてＴＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培養後２４時間から上昇し、対数増殖を示した。一方ＴＢＰ濃度は培養後１２時間から３６時間にかけて減少し、１００％分解された。
【０１０８】
（１２）ＨＢ０１株の休止菌体反応におけるγ−ＨＢＣＤの分解（１）
上記のＨＢＣＤ分析方法に従いＨＢ０１株の休止菌体反応によるγ−ＨＢＣＤの分解を調べた。菌体濃度をＯＤ600＝１．０としたとき１mMγ−ＨＢＣＤは４日目で６３％分解された。
（１３）ＴＢ０１株の休止菌体反応におけるＴＢＰの経時的分解（１）
上記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの分解を調べた。菌体濃度をＯＤ６００＝０．５としたとき１００μＭＴＢＰは２４時間で８０％分解され、４８時間で１００％分解された。
【０１０９】
（１４）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（２）
ＨＢ０１株のγ−ＨＢＣＤの分解能に及ぼす培地の影響を、前記のＨＢＣＤ分析方法に準じて調べた。但し、培地として×１／４ＬＢ液体培地（表７０）、ＬＢ液体培地（ポリペプトン：１０ｇ、酵母エキス：５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、グルコース：１ｇ、ｐＨ７．０）、及びＰＡＳ培地（表１の×１０ＰＡ及び×１０ＭＳをそれぞれ１容量部加え、さらに水を８容量部加えて調製する、組成はＫ２ＨＰＯ４：４．３５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．７ｇ、ＮＨ４Ｃｌ：２．１ｇ、ＭｇＳＯ４：０．２ｇ、ＭｎＳＯ４：０．０５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ）を用いた。ＬＢ液体培地を使用したときに最もＨＢＣＤ分解能が高まり、培養３日程度で約８０％程度まで分解されることが認められた（図６）。
【０１１０】
（１５）ＨＢＣＤ資化性菌におけるＨＢＣＤ分解（３）
前記のＨＢＣＤ分析方法に準じて、ＨＢ０１株を植菌して、５日間培養後、ジエチルエーテル抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってγ―ＨＢＣＤの残量を調べた。展開液としてヘキサン：酢酸エチル＝４：１の混液を用いた。培養液中からγ−ＨＢＣＤの消失が確認でき、また脂溶性の中間体の蓄積は認められなかった（図７）。
【０１１１】
（１６）ＨＢ０１株の休止菌体反応におけるγ−ＨＢＣＤの分解（２）
前記のＨＢＣＤ分析方法で示した菌体反応に準じた。すなわち、ＨＢ０１株を培養し、得られた菌体を遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分）によって回収し、ＫＰＢに懸濁した。この懸濁液にγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加し、次いでグルコースを１mMの濃度になるように添加するか又は添加せずに、２８℃、１５０rpmで反応させ、ジエチルエーテル抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。その結果、γ−ＨＢＣＤの分解は、グルコースの有無に関わらず認められるが、グルコースがあると分解が高まることが認められた（図８）。
【０１１２】
（１７）ＨＢ０１株の培養液上清及び菌体粗抽出物によるγ−ＨＢＣＤの分解
前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてＨＢ０１株を培養し、培養液１２０mlを遠心分離（１４，４００×ｇ、１０分）して上清を得、この上清を濾過して菌体を除去した。この得られたろ液にγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加し、２８℃、１５０rpmで、４８時間反応させてから、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてジエチルエーテルで抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。
同様に、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてＨＢ０１株を培養し、培養液６０mlを遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分）して菌体を回収し、ＫＰＢに懸濁した。この懸濁液を５分間ソニケーションにかけて菌体を破壊してから、そこにγ−ＨＢＣＤを１mMの濃度になるように添加して、３０℃で３０分間反応させさせてから、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じてジエチルエーテルで抽出し、γ−ＨＢＣＤ量を分析した。
その結果、培養液上清ではγ−ＨＢＣＤの分解は認められなかったが、菌体粗抽出物ではγ−ＨＢＣＤの分解は認められた（図９）。
【０１１３】
（１８）ＨＢＣＤ資化性菌における工場廃水中のＨＢＣＤ分解
ＨＢ０１株による工場廃水中のＨＢＣＤ分解を、前記のＨＢＣＤの分析方法に準じて調べた。但し、ＤＭＳＯに溶解させた１００mMγ−ＨＢＣＤを１００μl添加する代わりに、採取してきた工場廃水を５％になるように培地に添加した。その結果、工場廃水中のγ−ＨＢＣＤの分解が認められた（図１０）。
【０１１４】
（１９）Pseudomonas putida KT2440におけるＨＢＣＤ分解
Pseudomonas putida KT2440のγ−ＨＢＣＤの分解能を、前記のＨＢＣＤの分析方法に従い調べた。５日間の培養により、γ−ＨＢＣＤの分解が認められた（図１１）。
【０１１５】
（２０）ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解（２）
前記のＴＢＰの分析方法に準じてＴＢ０１株を培養したところ、菌の濃度は培養後２４時間から上昇して対数増殖を示し、６０時間後にプラトーに達した。一方、ＴＢＰ濃度は培養後１２時間から３６時間にかけて減少し、１００％分解された（図１２）。
【０１１６】
（２１）ＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの経時的分解（２）
前記のＴＢＰ分析方法に従いＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの分解及び臭素イオンの発生を調べた。臭素イオン量はイオンクロマトグラフィー法で測定した。ＴＢＰの分解が進むに連れて、臭素イオン量が増加することが確認できた（図１３）。
【０１１７】
（２２）ＨＢ０１株の工場廃水に対する馴化
１００ml容三角フラスコにＰＡＳ培地を１０ml加え、採取してきた工場廃水を１０％になるように添加した。その培地に上記単離したＨＢ０１株及びＨＢ０２株の生理食塩水懸濁液１００μl（菌体数にして約１０5〜１０6個／ml）をそれぞれ植菌して、２週間、２８℃、１５０rpmで培養を行った。その後、この菌培養液１００μｌを、工場廃水を１１％含むＰＡＳ培地に植菌して同様に２週間培養した。以下、同様にして、工場廃水を１２％、１３％、１４％と増やしていったＰＡＳ培地に順に菌培養液を植え継いでいったところ、各培地にて菌の生育が観察できた。図１７に１３％のＰＡＳ培地で２週間培養した状態を示す。ＨＢ０１株及びＨＢ０２株を培養させた培地の入ったフラスコは、植菌しなかったブランクのフラスコと比べて白濁しており、菌の生育が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の微生物は、排水、廃液、河川、湖沼、海水、地下水、及び土壌などの環境に含まれている有機化合物の分解処理に使用でき、これら環境の浄化又はこれら環境の汚染防止などに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】γ−ＨＢＣＤのマススペクトルである。
【図２】γ−ＨＢＣＤのＬＣ−MSの液体クロマトグラムである。
【図３】γ−ＨＢＣＤの検量線である。
【図４】ＴＢＰのＨＰＬＣの液体クロマトグラムである。
【図５】ＴＢＰの検量線である。
【図６】ＨＢ０１株によるγ−ＨＢＣＤの経時的分解を示す図である。
【図７】ＨＢ０１株の培養液中のγ−ＨＢＣＤの薄層クロマトグラムである。
【図８】ＨＢ０１株の休止菌体反応によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。Ａはグルコース非存在下での、Ｂはグルコース存在下での分解をそれぞれ示す図である。
【図９】ＨＢ０１株の培養液上清及び菌体粗抽出物によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。Ａは培養液上清による、Ｂは菌体抽出物による分解を、それぞれ示す図である。
【図１０】ＨＢ０１株による工場廃水中のγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。
【図１１】Pseudomonas putida KT2440によるγ−ＨＢＣＤの分解を示す図である。
【図１２】ＴＢ０１株の生育曲線とＴＢＰの経時的分解を示す図である。
【図１３】ＴＢ０１株の休止菌体反応によるＴＢＰの経時的分解を示す図である。
【図１４】ＴＡ０１株におけるＴＢＢＰＡの分解を示す図である。
【図１５】ＨＢ０１株の系統樹を示す図である。分岐点に示された点はブートストラップ信頼値である。
【図１６】ＴＢ０１株の系統樹を示す図である。分岐点に示された点はブートストラップ信頼値である。
【図１７】ＨＢ０１株を２週間培養した１３％工場廃水含有ＰＡＳ培地の状態を示す図である。
【図１８】ＴＢＢＰＡのＨＰＬＣの液体クロマトグラムである。
【図１９】ＴＢＢＰＡの検量線である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する、１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン、２，４，６−トリブロモフェノール、又はテトラブロモビスフェノールＡを分解する能力を有する微生物。
【請求項２】
シュードモナス属（Pseudomonas）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、又はアクロモバクター（Achromobacter）属に属する、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株、
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-181菌株、
オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株、及び
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株
から選択される微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、ハロゲン化脂環式炭化水素及び／又はハロゲン化芳香族炭化水素を分解する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、ポリ臭素化有機化合物を分解する方法。
【請求項６】
ポリ臭素化有機化合物が１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン、２，４，６−トリブロモフェノール、又はテトラブロモビスフェノールＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、浄化システム。
【請求項１】
配列番号１〜１７よりなる群から選択される配列の一つと９５％以上の相同性を示す１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を有する、１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン、２，４，６−トリブロモフェノール、又はテトラブロモビスフェノールＡを分解する能力を有する微生物。
【請求項２】
シュードモナス属（Pseudomonas）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、又はアクロモバクター（Achromobacter）属に属する、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-180菌株、
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-181菌株、
オクロバクトラム（Ochrobactrum sp.）NITE P-204菌株、及び
シュードモナス（Pseudomonas sp.）NITE P-311菌株
から選択される微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、ハロゲン化脂環式炭化水素及び／又はハロゲン化芳香族炭化水素を分解する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、ポリ臭素化有機化合物を分解する方法。
【請求項６】
ポリ臭素化有機化合物が１，２，５，６，９，１０−ヘキサブロモシクロドデカン、２，４，６−トリブロモフェノール、又はテトラブロモビスフェノールＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を使用することを特徴とする、浄化システム。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図７】
【図１７】
【図３】
【図４】
【図５】
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【図９】
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【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図７】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−１９４０２３（Ｐ２００８−１９４０２３Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６８９４５（Ｐ２００７−６８９４５）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（５０５０６５９８４）学校法人 福山大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（５０５０６５９８４）学校法人 福山大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
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