マイクロチャネル分離用マトリックス、ダイナミックポリマーシステム及び組成物
式 −[ＣＨ2Ｃ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)ＮＲ’Ｒ”]n−（式中、ＲはＨ及びメチルから選択され、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ１〜約Ｃ８の直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８の分岐アルキル基及びＣ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換分岐アルキル基及びそれらのコポリマーから選択される）のポリアクリルアミドを含む疎水性分離マトリクス成分と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を含む親水性壁コーティング成分とを含有し、前記ポリアクリルアミドは少なくとも部分的に水溶性である、マイクロチャネル電気泳動用ＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピング組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、２００５年１１月１日出願の出願第６０／７３２３９８号の優先権に利益を享受し、全趣旨を参照することによりここに取り込む。
米国政府は、それぞれ、国立衛生研究所及び全米科学財団からノースウェスタン大学への第１Ｒ０１ＨＧ０１９７７０−０１及びＤＭＲ−００７６０９７に従って、この発明に対する特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列用のマイクロ流体チップ系の電気泳動は、コスト、時間及び試薬の消費の減少のための高いスループットシーケンシングプロジェクトに対する将来性ならびに全体のマイクロ分析システムに、他の遺伝子分析を伴うシーケンシングを統合する可能性を提示する。このためには、マイクロ流体チップのＤＮＡシーケンシング用の最適な重合分離マトリックス及び壁コーティングの開発が重要となる。
【０００３】
親水性分離マトリックス（例えば、線形ポリアクリルアミド（ＬＰＡ））は、共有結合親水性コーティングとともに用いられ、マイクロチャネル電気泳動による５００の塩基より長い読み取り長さを達成しているが、その分離は、すべてを行うために１５〜１８分以上の長時間を要する。ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）は、複合型分離メカニズムであるため、先行技術のポリマーと同様の読み取り長さを、より速い時間で達成する疎水性分離マトリクスである。共有結合コーティングは、すべての公表されたマイクロチャネルＤＮＡシーケンシング結果のためにほとんど排他的に使われている一方、ダイナミックコーティングは、それほど高価でなく、また、実行するのが非常に簡単であり、マイクロチャネルフォーマットに対して非常に好ましい。しかし、ＤＮＡシーケンシング用に実証された全てのダイナミックコーティングは、ＤＮＡ断片及び壁コーティングの相互作用のために分離効率の損失をもたらし、いくぶん疎水性であった。先の研究では、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）は、タンパク質分離及びＤＮＡシーケンシングの双方のためのキャピラリに対して適当な親水性ダイナミックコーティングであることを示したが、ｐＨＥＡもまた分離マトリクスである場合のみである。マイクロチップ系ＤＮＡシーケンシングに関する大部分の発表されたデータは４００を超えるが、チップにおけるシーケンス時間は、一般に１８〜３０分の範囲である。そして、キャピラリ電気泳動は、相当する結果を得るために、約６０〜９０分間を要する。時間及び読み取り長さの問題は、電気泳動による分離に関する当該技術分野で進行中の懸念を提示する。
【発明の開示】
【０００４】
上記を考慮して、本発明の目的は、マイクロチャネル分離における使用に対して１以上の高分子組成物、システム及び／又は方法を提供することであり、それによって、上述されたことを含む先行技術の種々の不足及び欠点を解消することができる。１以上の側面が特定の他の目的に対処することができると同時に、本発明の１以上の側面が特定の目的に対処することができ、一方、１以上の側面が他の目的に対処することができることは当業者によってよく理解されている。本発明のすべての面、すべてのその点において、各目的は等しくあてはまらないかもしれない。従って、以下の目的は、本発明のいかなる唯一の側面に関しても、代替として捉えることができる。
【０００５】
本発明の目的は、疎水性分離マトリクスと関連した利点をよりよく使用するためにダイナミック壁コーティングポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、単独又は上記の目的とともに、電気浸透流及び／又は分析物−壁相互作用の発生率又は影響を減少させるために、親水性壁コーティングポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、先行技術と比較してより短い時間で配列の読み取り長を増大させるために、マトリクス／壁コーティングシステムとともに関連方法の使用を提供することである。
本発明の他の目的は、より長く、速い配列読み取り、流マイクロチャネル電気泳動を提供する１以上のマトリクス／壁コーティングシステムを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的、特徴、利益及び利点が、この要旨及び特定の実施形態の以下の説明から明らかとなり、種々の電気泳動法及び技術分野の当業者に容易に明らかとなるであろう。そのような目的、特徴、利益及び利点は、添付の実施例、データ、図面及びそれらから引き出されるすべての合理的な結論と上記とを考慮することにより明らかとなるだろう。
【０００７】
本発明は、比較的短い分離チャンネルで、印加電界下、マイクロチップ電気泳動によって超高速のＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピングを可能にすることができる新しいシステムに関するものである。そのようなシステムは、重合分離成分及び重合コーティング成分を含むことができる。特定の実施形態では、高分子量ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）又はそれらのコポリマーを含むＤＮＡ分離マトリックスを、親水性水溶性ポリマー成分、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）とともに、マイクロチャネル電気泳動によってＤＮＡシーケンシング断片の非常に高速の分離を提供するために用いることができる。限定されずに、ｐＨＥＡはダイナミック（つまり、物理的に吸着された）ポリマー壁コーティング成分と見なすことができる。それは、マイクロチャネル壁にプレコートすることができ及び／又は重合分離マトリックス成分を含む組成物の一部として提供することができる。特定の他の実施形態では、本発明のそのようなシステム又は組成物は、ＤＮＡマイグレーション（つまり、ＤＮＡレプテーションと一時的な絡み合い結合（ＴＥＣ）とを組み合わせる新規なＤＮＡ分離メカニズム）の新規なモードを提供するための分子量及び／又は十分量でのそのような分離及びコーティング成分を含むことができる。
【０００８】
より一般的には、一部には、本発明は、マイクロチャネル電気泳動用のＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピング組成物に指向することができる。そのような組成物は、式
−[ＣＨ2Ｃ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”]n
（式中、Ｒは水素原子及びメチルから選択することができ、Ｒ’及びＲ”は独立して、Ｃ1〜Ｃ8の直線状アルキル基、Ｃ1〜Ｃ8のアルコキシ置換直線状アルキル基、Ｃ1〜Ｃ8の分岐状アルキル基及びＣ1〜Ｃ8のアルコキシ置換分岐状アルキル基から選択することができる）
のポリアクリルアミド、それらのコポリマー及びそのようなポリマー及び／又はコポリマーの組み合わせからなる疎水性分離マトリクスと、そのようなマトリクス成分よりもより親水性のポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）からなる疎水性壁コーティング成分とを含むことができる。
【０００９】
一実施形態では、ホモポリマー、ランダム又はブロックコポリマーあるいはいずれかの組み合わせであるとしても、Ｒは水素原子、Ｒ’及びＲ”は置換（例えば、メトキシ又はエトキシ、プロポキシ等）又は非置換のＣ１〜約Ｃ４アルキル基とすることができる。他の実施形態では、Ｒ’及びＲ”はメチルとすることができ、そのような成分は、ｐＤＭＡ又はＰＤＭＡコポリマーを含むことができる。そのような式について、ｎはそのようなポリマーの平均モル質量に対応する１より大の整数である。特定の実施形態では、そのようなポリマーは、当該分野で十分理解されているように、適度に疎水性とすることができ、水又は水性媒体に少なくとも部分的に溶解する。従って、そのような成分は、ｐＭＤＡ、ポリ（Ｎ−メトキシエチルアクリルアミド又はポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、それらの組み合わせならびに上述した又はここで記載したポリマー成分（例えば、限定されることなく、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジヘキシルアクリルアミド等）の１以上に対応するモノマーについてのそれらのコポリマーを含むことができる。
【００１０】
とにかく、Ｒ’及びＲ”のいずれかの組み合わせは、以下で詳細に説明する種類の機能効果を与えるのに少なくとも部分的に十分な程度で、そのような重合成分に与えられる疎水性及び、分子内又は分子間のいずれかで、物理的に相互作用する及び／又は他のそのような基又はポリマー成分に結合する能力によってのみ制限される。
【００１１】
そのような親水性壁コーティング成分は、少なくとも部分的に電気浸透流を減少させ及び／又は悪影響のある分析物−壁相互作用を減少させるために十分な親水性に照らして検討することができる。ｐＨＥＡは、約６００，０００から約４００万ｇ／ｍｏｌ（ＭＤａ）又は約５００万ｇ／ｍｏｌ（ＭＤａ）以上の範囲の分子量を有することができる。いずれにしても、分子量及び／又は最終用途適用によって、ｐＨＥＡは、媒体の０．５％（ｗ／ｖ）未満で流媒体中に存在することができる。他のある実施形態では、ｐＨＥＡは、当業者に理解されるように、約０．１から約０．４％（ｗ／ｖ）未満で媒体中（例えば、水性）に存在することができる。いずれにしても、一実施形態では、ｐＨＥＡコーティング成分は、１以上の上述した疎水性のポリアクリルアミド分離マトリックス成分と組成的に協働して用いるか、それに添加することができる。
【００１２】
いずれにしても、得られたマトリクス成分は、約５％以上までの範囲の割合（ｗ／ｖ）（そのような濃度は、平均分子質量に依存することができる）での濃度で、ここで記載した種類の、例えば、水又は水性媒体（例えば、限定されることなく、緩衝液）のような流媒体を含む組成物中に存在させることができる。一実施形態では、そのようなマトリックス成分は、約３％（ｗ／ｖ）までの、重量平均モル質量が約３〜約５ＭＤａのｐＤＭＡを含むことができる。他の実施形態では、マトリクス成分は、約１％から約２％（ｗ／ｖ）の範囲の、より小さい平均重量モル質量、例えば、限定されることなく約２００〜約３００ｋＤａのさらなるｐＤＭＡを含むことができる。種々の他のマトリクス成分を、モノマー成分及び対応基の選択によってのみ決定され、限定される濃度範囲にわたって、利用することができる。
【００１３】
特記しない限り、ここで用いられている、例えば、モル質量、割合等の特性を表す全ての数値は、用語「約」によって全ての例で修正されるものとして理解される。従って、反対に示されない限り、ここでの数値のパラメータは、望ましいポリマー又はシステム特性あるいはそれに関連するいずれかの方法を使用して達成される結果によって変化することができる近似であり、そのような割合及びモル質量は、本発明を認識する当業者によって変化させることができるものである。
【００１４】
本発明の組成物、システム、方法及び／又は装置のいずれに関しても、ここで記載又は示すポリマーは、いずれの対応ポリマーにおけるいずれのそのようなモノマーの割合にかかわらず、上述したモノマーのいずれかを含む、いずれかからなる又は実質的にからなることができる。そのような各々の重合、共重合化合物又はそれらのモノマー成分は、分離して又は他から単離して、組成的に区別することができ、特徴的に対比することができ、本発明とともに実行することができる。従って、実例としてここに明らかにされるように、発明の組成物、システム、方法及び／又は装置は、ここに開示、参照又は表示されるかまたはされないいずれか一つのポリマー、モノマー成分及び／又は工程が欠如していても実行又は利用することができ、欠如は、特に、ここで開示、参照又は表示されないかもしれない。
【００１５】
一つには、本発明は、また、ＲＮＡ及びＤＮＡ分離用のマイクロチャネル電気泳動システムに指向することができる。そのようなシステムは、ｐＤＭＡを含む疎水性分離マトリクス成分と、ｐＨＥＡを含む親水性壁コーティング成分と、マイクロ寸法のキャピラリ（例えば、特に限定されないが、約１０ミクロン〜約１５０ミクロンまでの範囲の内径が定義される）から選択されたマイクロチャネル基体又はそのようなマイクロチャネル寸法と類似のマイクロ流体電気泳動チップとを含むことができる。そのようシステムは、上述のタイプのｐＤＭＡマトリックス成分を含むことができる。限定されない特定の実施形態では、マトリックス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡと、低重量平均モル質量（例えば、約２００〜約３００ｋＤａの範囲のひとつ）の約１％〜約２％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡを含むことができる。
【００１６】
一つには、本発明は、また、いずれかの電気泳動ＤＮＡ又はＲＮＡ分離のいずれかのためのポリマー壁コーティング及び分離マトリクスシステムを用いる方法に指向することができる。そのような方法は、そのようなシステムの約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）を含むｐＤＭＡ成分と、ｐＨＥＡ成分とを含有するシステムを提供し、マイクロシャネル電気液動キャピラリ及びマイクロ流体シーケンシングチップから選択される種類の基体にシステムを導入し、電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、ＤＮＡシーケンシング反応生成物又はＲＮＡ成分のいずれかの混合物とシステムとを接触させることを含むことができる。そのような方法は、上述のタイプのｐＤＭＡ成分を含むシステムを含有することができる。一実施形態では、ｐＨＥＡ成分は分離マトリクスシステムの導入の前に基体に接触させることができる。そのような実施形態では、ｐＨＥＡ成分を水溶液として用いることができ、ここで記載した種類の壁コーティング成分を与えるのに十分な時間基体に接触させる。いずれにしても、そのような方法は、約８００塩基までの長さのＤＮＡ配列（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を分離するために用いることができ、そのような分離は、時間及びマイクロチャネル長に依存する。そのような分離／シーケンシング法は、限定されない実施例で、以下に示される。
【００１７】
上記と関連して、本発明は、マイクロチャネル電気泳動装置に指向することもできる。そのような装置は、ミクロン寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体とともに、基体及びそれらの上のポリマーシステムとを含むことができる。マイクロチャネル基体、又は装置構成に限定されることなく、そのようなシステムは、そのようなシステムの約３％〜約５％（ｗ／ｖ）を含むｐＤＭＡ成分を含むポリマーシステムと、上述した種類のｐＨＥＡ成分とを含有することができる。そのようなポリマーシステムは、分離及び／又は壁−コーティング特性を示しており、当該分野で公知の他のタイプのキャピラリ又はマイクロチャネルマトリックス又は壁コーティング材料との併用又は組合せで用いることもできる。
【００１８】
一つには、本発明は、ＤＮＡ分離速度を高めるための疎水性ポリマーマトリックスの使用方法にも指向することができる。そのような方法は、マイクロ寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択されたマイクロチャネル基体を準備し、そのような基体に親水性ｐＨＥＡ壁コーティング成分を結合又は適用し、疎水性分離マトリクスをその基体に導入し、そのようなマトリクス成分は、ここに記載されるポリアクリルアミド、それらのコポリマー及びそのようなポリアクリルアミド及び／又はそのようなコポリマーとの組み合わせから選択され、そのような混合物、分子量のマトリクス成分の電気的動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、混合物中のＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションの少なくとも１つのために、少なくとも部分的に十分な濃度で、ＤＮＡ配列成分の混合物とそのようなマトリクス成分とを接触させることを含むことができる。一実施形態では、分離は、一時的な絡み合い結合又はレプテーションの組み合わせとすることができる。そのような一実施形態では、ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びマイクグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートさせることができる。いずれにしても、そのようなマイグレーション動力学は、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光ビデオ顕微鏡法によってモニターすることができる。一実施形態では、そのような方法は、先行技術のＬＰＡマトリクスを用いる分離と比較して、最高約３倍速い分離を提供することができる。
【００１９】
限定されることなく、一実施形態では、そのような方法のマトリックス成分は、ｐＤＭＡ及び／又はそれらのコポリマーから選択することができる。前者に関して、そのようなマトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量で、約３％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡと、低重量平均モル質量（例えば、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の一つ）の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡとを含むことができる。いずれにしても、そのような実施形態では、マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴づけることができ、分子サイズの範囲は、塩基及び／又は塩基対に換算して測定することができる。例えば、限定されることなく、ＤＮＡ分子サイズの範囲は、約−４．４０〜−０．６０の間でスロープを有するログ−ログプロットのような線形領域で、約２００塩基〜約８００塩基とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳによるｐＤＭＡの特性。ｐＤＭＡモル質量分布は限定されないいくつかの実施例で使用した。分布は３回の平均値である。
【図２】ｐＤＭＡマトリクスの粘度はシーケンシングに適する濃度で劇的に増大する。しかし、簡易マイクロチャネル充填のための粘度は、従来例のＬＰＡマトリクスよりも非常に低いままである。
【図３】従来のＬＰＡマトリクスと比較したｐＤＭＡマトリクスのＤＮＡ分離。全３７のピークは、３％及び４％のｐＤＭＡで解像した。解像のロスが５％ｐＤＭＡ及びＬＰＡマトリクスで観察された。ＤＮＡ断片のマイグレーション時間は濃度に依存する。
【図４Ａ】図２の分離からのピークの選択性（μi-μi-1／μavg）。両マトリクスは、同じピーク分離を示す。
【図４Ｂ】LongRead（登録商標）マトリクスにおけるピークは、２５０塩基以上のｐＤＭＡにおけるよりも一層広い（このバンド拡張は、このマトリクスの低いシーケンシング性能の主な原因である）。
【図５】ｐＤＭＡマトリクスにおけるｓｓＤＮＡラダーに対する移動度データ。条件は図１のものと同じである、破線は、プロットが線形の領域のＤＮＡサイズを示す。線形領域の傾きは、−０．５４、−０．５９及び−０．５０（それぞれ３％、４％、５％マトリクス）である。
【図６】ＤＮＡ画像から捕捉されたデジタル画像である。示された時間間隔での一連のフレームは、本発明の代表的なネットワクークを通して移動する２つのＤＮＡ分子を示す。上部の分子は、所定時間において示された全部のフレームにわたってレプテートしている。下部の分子は、最初レプテートし、次いで、一時的な絡み合い結合と同様のメカニズムにおいて示されたフレームにわたって、ポリマーネットワークを、フック及び引き込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
電気泳動におけるＤＮＡ分離に影響し得る絡み合いポリマー溶液の特性
本発明の特定の実施形態をさらに理解するために、以下を考慮する。
シーケンシング用最適ポリマーマトリックスを開発することは、マイクロチャネルシステムを商業化するために最も大きな制約のうちの１つである。ＤＮＡシーケンシングは、ポリマー鎖がネットワークにオーバーラップし、ネットワークを形成し、絡み合う半希釈ポリマー溶液中で可能であるのみである。オーバーラップ濃度（ｃ*）を、コイル内のポリマー濃度に正確に匹敵するバルク溶液濃度と定義する。方程式（１）は、この定義に基づくｃ*の推定値を与える。
【数１】
（式中、Ｍwは重量平均モル質量、ＮAはアボガドロ数、Ｒgはポリマー回転半径である）
式（１）から、オーバーラップ濃度は、光散乱のような技術によって、Ｍw及びＲgの双方を測定することによって算出することができる。あるいは、オーバーラップ濃度は、一連のポリマー濃度のゼロせん断粘度を測定し、ログ−ログスケールで粘度対ポリマー濃度をプロットすることによって決定することができる。プロットが非線形になる濃度は、オーバーラップ濃度であり、ネットワークが絡み合う程度では、ｃ／ｃ*比として表わすことができる。
【００２２】
ＤＮＡが、絡み合ったポリマーネットワークを移動するため、ネットワークを規定するための臨界パラメータは、ポリマースクリーニング長（ξ）である。ポリマー溶液について、スクリーニング長は、ポリマーＲg及び濃度に依存する。
【数２】
【００２３】
ゲル電気泳動では、平均孔サイズは、分離メカニズムを決定するために及び、ゲルから絡み合ったネットワークへの分離メカニズムに関する理論についての試みにおいて重要であった。絡み合い点間の平均鎖長として、「ブロブ」サイズ（ξb）を定義することによって、わずかに変化したこの見解で、これらの溶液における「孔サイズ」としてスクリーニング長を用いることが提案されている。この調整は、定義における新たなプレファクターを導入したのみであり、
【数３】
として定義される。よって、一般にポリマーネットワークは、ポリマー濃度及びコイルサイズの双方に依存するこのブロブサイズに換算して定義することができる。
【００２４】
絡み合いポリマー溶液中のＤＮＡ分離メカニズム
上述のポリマーネットワークパラメータは、絡み合いネットワークにわたってＤＮＡマイグレーションの種々のメカニズムを示すために用いることができる。分離のメカニズムは、ネットワーク中でのブロブのサイズと比較して、ＤＮＡ分子のＲgに依存する。ネットワークの孔サイズより小さいＤＮＡサイズは、繊維の緻密なアレイ中を移動する球体に対するオグストンによって示されたものと類似したメカニズムで、溶液中をマイグレートする。これは、通常、オグストンふるい分けとして呼称されており、自由溶液移動度に対して、ＤＮＡの移動度は、
【数４】
（式中、Ｋrは、ＤＮＡコイル半径の正方形と比例している遅延係数であり、ｃはゲル又はポリマー濃度である。）
によって、数学的に示すことができる。このメカニズムは、試料の移動度対ポリマー濃度のゲルの自然対数をプロットするファーガソンプロットによって分析される。よって、線の傾斜は、遅滞係数に対する値を与える。
【００２５】
ＤＮＡ移動度に対するオグストンモデルは、ＤＮＡ分子のコイルサイズがネットワークの孔サイズに近づき、それを超えるために、作用しなくなることが予想される。
孔サイズより大きなＤＮＡがＤＮＡ移動度の偏ったレプテーションモデルに至ったという観察。このモデルは、ＤＮＡ分子長が変動、つまり変動で偏ったレプテーションに付されたことを考慮することによって、再評価された。これらのモデルは、ＤＮＡの移動度が溶液の絡み合いポリマー溶融体に対するレプテーション理論に類似したネットワークによって、曲がりくねると予測される。このメカニズムの重要なパラメータは、低減した電界であり、これは、
【数５】
（式中、ηsは溶媒粘度、Ｅは電界強度、ｋbはボルツマン定数、Ｔは絶対温度である）
によって与えられる。これらのモデルは、一般に、低電界の存在又はε＜＜１に対して誘導された。ＢＲＦモデルに対する移動度の得られた形態は、
【数６】
（式中、Ｎは塩基中のＤＮＡサイズ、αは調節因子である）
によって与えられる。このモデルに関して、臨界ＤＮＡサイズは、以下の第１項のＤＮＡサイズが支配して存在し、ＤＮＡ移動度はサイズ依存性である。
【数７】
【００２６】
ＤＮＡレプテーションのこの領域は、未配向レプテーションとして知られており、シーケンシングを含む大部分のＤＮＡ分離は、この領域内で行われる。臨界サイズ以上のＤＮＡに対して、第２項が支配し、サイズに基づく分離は消失する。レプテーションのこの領域は、配向レプテーションとして知られている。ＤＮＡの臨界サイズは、孔サイズ及び電界強度の双方に依存する。
【数８】
【００２７】
臨界サイズは、メッシュサイズと無関係に予測されるが、先の研究は、無配向から配向レプテーションへの移行は、メッシュサイズに依存することを示した。そのような結果は、より小さい孔サイズが、配向レプテーションをより小さいＤＮＡサイズへシフトさせる傾向があることを示す。よって、電界強度並びに絡み合いネットワークのブロブサイズは電気泳動によるＤＮＡサイズに基づく分離に対する上限を決定する臨界パラメータである。
【００２８】
オグストンふるい分け及びバイアスレプテーションのメカニズムが、絡み合い溶液に適用可能である一方、バロンらは、オーバーラップ濃度以下のポリマー溶液中で一般に行われている種々の分離メカニズムを発見した。ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）の超希薄溶液において、大きなｄｓＤＮＡ分子（＞１ｋｂｐ）の分離が可能であり、絡み合いポリマー溶液に対する理論は、その結果を説明するには不十分であったことを示す。従って、一時的な絡み合い結合と呼ばれる新しいメカニズムが、その分離を説明するために提案された。このメカニズムでは、ＤＮＡは、マイグレーション間にポリマー鎖に遭遇し、２つの結合がＤＮＡ分子の連結を増大する。ポリマー鎖に遭遇する可能性は、ＤＮＡサイズ依存性であり、よって、分離が可能となる。
【００２９】
ポリマーの物理的特性は、シーケンシング特性に影響を及ぼす。通常、親水性の高モル質量のポリマーが、より長いＤＮＡシーケンシング読み取り長に対して必要である。同時に、低粘度及びガラス表面への被覆能が、システムの操作に対する技術的及びコスト的な利点を提供する。合成条件は、１×１０6ｇ／ｍｏｌを超えるｐＤＭＡ及びｐＨＥＡモル質量を目標とした。一般的に、より長いＤＮＡシーケンシング読み取りを与える閾値となり、その一方で、安定なダイナミックコーティングの必要条件をも満たす。図１は、ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳで測定した、この研究において用いられたｐＤＭＡのモル質量分布を示す。ｐＤＭＡ及びｐＨＥＡに対して室温で測定されたポリマー特性を、表１にまとめた。ｐＤＭＡ溶液のゼロ剪断粘性を図２に示す。多くのＬＰＡマトリックスは、１００，０００ｃＰ28オーダーにおける粘度を有し、シーケンシングに有用な濃度範囲におけるｐＤＭＡマトリクスは、マイクロチャネルに充填することが大変容易であろう。
【００３０】
【表１】
【００３１】
ｓｓＤＮＡ分離
ｐＤＭＡは、キャピラリ電気泳動器具における有効なシーケンシングマトリックスとして探究されたが、このポリマーは、マイクロチャネルシステムにおけるシーケンシングに対して試験されなかった。ｓｓＤＮＡ断片の分離は、対照として、市販のＬＰＡマトリックスとともに、３〜５％の濃度のｐＤＭＡを用いたマイクロチャネル電気泳動システムで行われた。サンプルは、３７ＤＮＡ断片サイズを含む２５塩基ラダーである。これらの分離での電気泳動図を図３に示す。３％及び４％のｐＤＭＡマトリックスが全３７のピークを分離した一方、５％のｐＤＭＡ及びＬＰＡマトリックスは最大のＤＮＡ断片を完全には分解しない。そのため、低粘度を有することに加えて、ｐＤＭＡ溶液は、４％のＬＰＡマトリックスよりも良好に、９００の塩基まで、２５塩基ラダーを分離する。このシステムにおける有効な分離距離は、市販のＣＡＥ手段におけるよりも相当小さい、７．５ｃｍである。マイクロチャネルシステムが、より有効な分離を可能にするクロスインジェクターデザインを採用するため、必要とされるチャンネル長が非常に低減され、よって、分離はより速い。
【００３２】
ｐＤＭＡマトリックスに関して、ポリマー濃度におけるＤＮＡマイグレーション時間の依存性は明らかであり、マイグレーション時間は、ＬＰＡマトリックスよりも、一般に、これらのｐＤＭＡに対して短い。大部分のマイクロチャネルシーケンシング研究では、それらの個々のシステムを最適化する取り組みにおいて、種々の電界強度及び温度と同様により長いチャンネルを用いたため、直接マイグレーション時間を比較することは困難である。しかし、多くのマイクロチャネル研究（４％のＬＰＡ）に対して選択したマトリクスは、同様の電気泳動条件下で、ここで使用したｐＤＭＡマトリックスより長いマイクレーション時間である。
【００３３】
ＤＮＡシーケンシング結果
ＬＰＡと比較して分離速度が速くなったことに加えて、ｐＤＭＡは、高価で長時間かかるかもしれない共有結合的にチャネル壁を被覆する必要を解消する自己コーティングマトリクスとして作用することができる。ダイナミックに吸着されたポリマー壁コーティングは、それらのコストを低減させ、より簡便な実施のため、高いスループット環境のための共有結合コーティングよりも一層魅力的である。しかし、ｐＤＭＡコーティングは、若干疎水性で、試料と相互に作用するかもしれない。電気浸透流及び試料−壁相互作用は低減させることができるため、ｐＨＥＡの親水性が壁コーティングを良好にする。
【００３４】
ｐＤＭＡ及び市販のＰｏｐ−５（登録商標）及びベックマンLongRead（登録商標）マトリックスの種々の濃度に対するシーケンシング結果を、種々のダイナミックコーティングを用いた結果とともに表２に示す。ポリマーコーティングの化学作用は、読み取り長にかなり影響する。４％のｐＤＭＡマトリックスについて、ダイナミックコーティングとしてｐＤＭＡを用いることにより、４２０塩基の読み取り長を実現することができる。ｐＨＥＡがダイナミックコーティングとして適用される際、読み取り長は１３０塩基まで拡張される。読み取り長のこの増大は、分離の間、バンド拡大を増加させることができる壁−試料相互作用の減少に起因している。
【００３５】
【表２】
【００３６】
もう一つの興味深い結果は、Ｐｏｐ−５（登録商標）が、ＡＢＩ ＣＡＥ器具におけるその市販の用途と対照的に、自己コーティングマトリクスとして使用することができないということである。これは、この研究におけるマイクロ流体チップを作製するために用いられるガラスの化学と、キャピラリで用いられる溶融石英ガラスとの基本的な差異によって説明されるかもしれない。塩類及びガラスチップのガラスの結合特性を増大させる他の不純物の存在が、Ｐｏｐ−５（登録商標）ポリマーのコーティング能を変化させることができた。しかし、ｐＨＥＡは、Ｐｏｐ−５（登録商標）をチップに充填する前に適用される場合、読み取り長は非常に低い読み取り（＜５０塩基）から約３８０塩基に増大される。Ｐｏｐ−５（登録商標）マトリックスと、ｐＤＭＡマトリックスに対する結果とを比較することは、キャピラリシステムのために開発されるポリマーマトリックスが必ずしもマイクロチャネルシステムのために最高のマトリックスであるというわけではないことを証明する。この結果は、ｐＤＭＡマトリックス対ベックマンLongRead（登録商標）マトリックスで（キャピラリシステムのために最適化されたＬＰＡマトリックス）得られたより良好なシーケンシング読み取り長によって、さらに確認される。
【００３７】
ｐＤＭＡシーケンシングマトリクスとｐＨＥＡダイナミックコーティングの最適配合の組合せは、より短時間において、市販のマトリックスより長い読み取り長を与える。４％のｐＤＭＡマトリックスは、５５０塩基の長い読み取りを含む９８．５％の精度で平均５１２塩基を与えた。種々のｐＤＭＡ濃度を比較することにより、３％のｐＤＭＡマトリックスがｓｓＤＮＡ分離において５００塩基断片に対するマイグレーション時間において、２５％の改善をもたらすことが明らかにされるが、わずか３４９塩基が、シーケンシングに対する平均を正確にもたらすことができたのみであった。このように、より長い読み取り長に対して、この特定のｐＤＭＡモル質量について３％よりも高濃度が必要である。しかし、読み取り長が５％の濃度で減少するため、４％の配合が最適濃度を表す。
【００３８】
図３における分離から、３％のｐＤＭＡマトリックスは、迅速に、高解像度で大きなＤＮＡ断片を分離したが、より高いｐＤＭＡ濃度に匹敵するシーケンシング読み取り長を得なかった。より高いポリマー濃度が、短いＤＮＡ断片を分離するために重要なパラメータであり、より低い濃度が大きな断片を分離するために有利であるため、ポリマーマトリクスを、より高い平均モル質量及びより低い平均モル質量のポリマーをブレンドすることにより処方した。表３は、ｐＤＭＡポリマー（９８．５％の精度で）の２つの「ブレンド」の結果を示す。高い平均モル質量（３．４ＭＤａ）のｐＤＭＡを、３％（ｗ／ｖ）の濃度で用い、一方、２つのマトリックスに対する総ｐＤＭＡ濃度が４％及び５％（ｗ／ｖ）となるように、低い平均モル質量（２４０ｋＤａ）のｐＤＭＡを、１％及び２％（ｗ／ｖ）の双方で用いた。一つの平均モル質量によるマトリックスは非常によく機能するが、混合したモル質量マトリクスは、よりよく機能する。４％の混合マトリックスは５６０塩基（６分間の５８７塩基の長い読み取りで）で最高平均読み取り長を達成し、一方、５％の混合マトリックスは６０１塩基で最も長い個々の読み取りを達成した（達成するためにわずか６．５分間であった）。(最長シーケンシング作動のための４色シーケンシング電気泳動図は示さない)
【００３９】
ｐＤＭＡマトリックス及びLongRead（登録商標）ＬＰＡマトリックスでの分離をさらに分析して、この市販のマトリックスの乏しいパフォーマンス源を決定することができる。ｓｓＤＮＡ分離から、分離選択性及びピーク幅の双方を、図４Ａ〜Ｂにおける種々のＤＮＡ断片サイズでプロットした。選択性は、マトリックスの分離能の測定基準であり、それらの平均移動度によって標準化した隣接したピーク間の移動度における差異として定義した。ピークの幅は、システムにおいて全てのバンド拡大源の複合効果を測定する。図４Ａから、４％のｐＤＭＡポリマー及びLongRead（登録商標）マトリックスの選択性が類似し、シーケンシングパフォーマンスの違いを説明することができないことが明瞭である。しかし、図４Ｂは、約２５０塩基より大きなＤＮＡサイズで、ＬＰＡベースマトリクスでのピーク幅において大きな増大があることを示す。このバンド拡大作用は、このシステムにおける乏しい特性の主な原因であり、ｐＤＭＡマトリクスにおけるより高いピーク効率（小さな幅）がこれらポリマーの増大したシーケンシング読み取り長をもたらすと考えられる。さらに、LongRead（登録商標）ＬＰＡシステムのより広いピークは、おそらく、同程度の読み取り長（それは、また、より長い時間を必要とする）を達成するために非常に長い分離チャンネルを必要とするであろう。
【００４０】
【表３】
【００４１】
ｐＤＭＡマトリックスにおけるＤＮＡ分離メカニズムの調査
絡み合いポリマー溶液によるＤＮＡ分離は、上述した２つのメカニズムを経由して進行すると考えられる。小さなＤＮＡ断片がオグストンふるい分けによってポリマーネットワークを通してふるいにかけられる傾向があり、一方、ＤＮＡレプテーションはより大きな断片に対する分離メカニズムである。レプテーションは、より高解像度分離を提供し、高性能シーケンシングのための望ましいメカニズムに違いない。これにより、高濃度でのより小さなメッシュサイズが、レプテーションメカニズム開始点をより小さなＤＮＡサイズにシフトさせるため、より小さなＤＮＡサイズをシーケンスするためになぜ高濃度を必要とするかを説明することができる。類似の理由により、低濃度がより長い読み取りのためになぜ必要とされるかについて説明することができる。メカニズムが、配向レプテーションにシフトするため、マトリックスにおける全ての分解能が失われる。この移行はメッシュサイズ（Ｅｑ８参照）に依存するため、ＤＮＡは、より高いポリマー濃度のためにより小さいサイズで配向する傾向がある。
【００４２】
対数関数スケールにおけるＤＮＡの移動度対断片サイズをプロットする場合、図１からｓｓＤＮＡラダーの分離に関して図５で示すように、未配向レプテーションによる分離は、データの線形部分で観察することができる。図５に示されるデータは、ｐＤＭＡマトリクスに対するキャピラリシステムの初期に提示されるデータと類似している。特に、スムーズな移行が、未配向レプテーションに対する及び未配向レプテーションから配向レプテーションへの移行に関するオグストン型ふるい分け間に存在する。
【００４３】
長いＤＮＡシーケンシング読み取りに関して、図５においてプロットされた線形領域のより高いＤＮＡサイズへの拡張は、重要かもしれない。４％のｐＤＭＡマトリックスの移動度は、５％のｐＤＭＡと比較してより大きなＤＮＡサイズのために線形領域に残り、そのため、配向レプテーションへの移行は、より小さなＤＮＡサイズにシフトする。このように、４％のｐＤＭＡは、５％のマトリックスより長い読み取り長を与え、この研究の結果は、この制限下のＤＮＡサイズのためにさえ、４％のマトリックスがより良好なシーケンシング結果を与えることを示す。しかし、移動度のプロットは、シーケンシングに必要とする一塩基決定を減少させるかもしれないバンド拡大効果を説明しない点に注意されなければならず、シーケンシング読み取り長がｓｓＤＮＡラダーの移動度のプロットからまさに予測されるかもしれないものよりも小さい。
【００４４】
絡み合いネットワーク破断
３％のｐＤＭＡマトリックスは、２つのより高い濃度よりもさらに拡大した移動度のプロットについて線形領域を示し、それでも、このマトリックスに対する読み取り長は、通常、非常に低い。この１つの理由は、より高いポリマー濃度が上述したように小さいＤＮＡサイズのより良好な分離に必要とされるからである。より大きなＤＮＡサイズに対する分離パフォーマンスに影響するもう１つの要因は、ポリマーネットワークの絡み合いの強さである。通常、所定の分子量で、ポリマー濃度が増大し、鎖がより絡み合うため、絡み合いネットワークの強度が増大し、よって、より大きなＤＮＡサイズをシーケンスするためにメッシュサイズをより大きくする必要がある場合、より高いモル質量ポリマーがより有効である。また、絡み合い強度は、個々の鎖のコイルサイズにも影響を受ける。ｐＤＭＡ鎖は、一般に、ＬＰＡのようなより親水性ポリマーより小さいコイルサイズを有する。
【００４５】
強く絡み合うネットワークは、レプテーションによってＤＮＡを分離するために必要であり、よって、ＤＮＡをマイグレートすることによるポリマーネットワークにおける破断は、分離力及び読み取り長を低減する傾向がなければならない。わずかに絡み合うネットワークでは、特により大きなＤＮＡによって、破断はより頻繁である。しかし、ネットワークが破壊されるにつれて、ポリマー鎖とともに絡み合うＤＮＡ分子の現象は、まだサイズに依存する傾向がある。このメカニズムは、一時的な絡み合い結合（ＴＥＣ）、当該分野でよく理解され、かつ確立された現象に関連し、希釈ポリマー溶液中でのｄｓＤＮＡ分離についてバロンらによって発見された（例えば、Barron, A. E., Soane, D. S. & Blanch, H. W. (1993) J. Chrom. A 652: 316; Barron, A. E., Blanch, H. W. & Soane, D. S. (1994) Electrophoresis 15: 597-615及びBarron, A. E., Sunada, W. M. & Blanch, H. W. (1996) Biotech. Bioeng. 52: 259270参照、全趣旨を参照することによりここに取り込む）。よって、未配向レプテーションが、これらのマトリックスにおけるＤＮＡ分離の優位なメカニズムであるが、ネットワーク破断及びＤＮＡポリマー絡み合いも、分離に貢献している可能性がある。フッキングを伴うこのネットワークの破断は、レプテーションより迅速であることが予想されるため、このメカニズムは、ＬＰＡシーケンシングマトリックスと比較してｐＤＭＡのより弱い絡み合い溶液中での分離で速度を速める原因となるかもしれない。
【００４６】
ＤＮＡ分離のこの複合型メカニズムは、ｐＤＭＡマトリックス中でｄｓＤＮＡの画像顕微鏡法研究によってさらに示唆される。図６は、２５℃での３．０％のｐＤＭＡマトリクス中で２つのＤＮＡ分子の時間進展を表し、１つの分子がレプテーションによって移動し、一方他の分子がネットワークを破壊し、溶液によってポリマー鎖を連結する。下部のＤＮＡ分子は溶液によってレプテートし、次いで、ネットワークへのフック及びそれに沿って連結する一方、上部のＤＮＡ分子がフレームシリーズの間、レプテートし続ける。これは、これらの２つのメカニズムが同時に同じマトリックス中で起こり得ることを証明する。
【００４７】
以下に示すように、キャピラリ及びマイクロチップ用の新規のポリマーマトリックス／ポリマー壁コーティングシステムは、ＤＮＡ分離マトリクスとしての疎水性ポリマー、例えば、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、親水性ダイナミック壁コーティングとしての親水性ポリマー、例えば、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）との組み合わせを含み、キャピラリ及び特にマイクロチップ電気泳動によるＤＮＡ配列の超高速分離をもたらす。ダイナミック親水性ポリマー壁コーティングとの疎水性シーケンシングポリマーの組み合わせは、マイクロ流体電気泳動装置で以前に示されていなかった。５００〜６００の塩基シーケンシングは、塩基−呼び出しの高い正確さで、まさに７．５ｃｍの有効分離距離で、（最適に）印加された電界強度（例えば、２３５Ｖ／ｃｍ）及び温度（例えば、５０℃）のような他の条件下、マイクロチャネル電気泳動フォーマットにおけるそのような２つのポリマーの組み合わせによって、特に７分より短時間で達成することができる。
【００４８】
１×ＴＴＥ＋７Ｍ尿素バッファ中の３〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解したＰＤＭＡ（最適には約３〜約４ＭＤａのＭｗで）は、シーケンシングマトリクスを与える一方、ｐＨＥＡダイナミックコーティングはマイクロ流体チップでの適用のために前適用される。さらに、約１〜約２％の間の低モル質量ｐＤＭＡ（〜２００〜３００ｋＤａ）を、３％（ｗ／ｖ）高モル質量ｐＤＭＡ（３〜４ＭＤａ）溶液（総ポリマー濃度４％（ｗ／ｖ））に添加することによって、６．５分間の電気泳動で最高６００の塩基のさらにより長いシーケンシング読み取りをもたらす。詳しくは、いずれの１つの理論又は操作モードに限定されず、そのような条件は、一時的な絡み合い結合及びレプテーションの間のいずれかのハイブリッドＤＮＡ分離メカニズムを経由する超高速ＤＮＡシーケンシングを与え、それはＤＮＡシーケンシング用のメカニズムとしてこれまで示されていなかった。そのメカニズムは、ＤＮＡ移動度対断片サイズのログ−ログプロットを見ることによって演繹することができ、単分子落射蛍光顕微鏡画像実験によって補強される。ＤＮＡ移動度対ＤＮＡサイズのログ−ログプロットにおいて、超高速のシーケンシング条件下の線形領域の傾斜は、−０．４０〜−０．６０である。
【００４９】
分子量、組成及び溶液濃度ならびに壁−コーティングポリマーの最適化のようなポリマー特性に関するそのような分離媒体のさらなる最適化は、この短時間でのより長い読み取りを可能にすることができる。得られた結果は、これまで報告されたそのような長い読み取りのための最速のシーケンシング時間を示し、よって、マイクロチャネルベースのシーケンシング技術の開発での発展を提供する。
【００５０】
実施例
マイクロチャネル電気泳動のために、以下の非限定的な実施例及びデータは、疎水性分離マトリックスポリマー成分及び親水性壁コーティングポリマー成分の使用を含む、本発明の組成物、システム、方法及び／又は装置に関連する種々の観点及び特長を示す。先行技術との比較において、本発明の組成物、方法、システム及び／又は装置は、意外で、予想外で、対照的な結果及びデータを提供する。発明の有用性は、ここで用いることができるいくつかのポリマー成分、組成物及び装置の使用によって示される一方、匹敵する結果が、種々の他のポリマー成分、組成物及び装置でえることができる当業者によって理解され、それは本発明の範囲に相当するようである。
【００５１】
実施例１
ＰＤＭＡ合成
高分子量ｐＤＭＡ分離マトリックスポリマーを、モノマーＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（９９＋％純度でMonomer-Polymer & Dajac Labs (Feasterville, PA USA)から購入）から合成した。ＤＩ水中の４重量％モノマー溶液を、４７℃に設定された水浴中で、３０分間Ｎ2流で脱気し、続いて、Ｖ−５０（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩化水素（和光純薬、リッチモンド、ＶＡ、ＵＳ）で開始した。１６時間後、粘稠ポリマー溶液を、１０日間、頻繁な水交換で透析した１０００００ＭＷカットオフ透析膜に移した。透析後、サンプルを凍結乾燥し、１ＭＤａを超えるモル質量で、固体ｐＤＭＡポリマーを回収した。本発明の種々の他のマトリックスポリマー及び共重合体は市販であるか、上述したように、対応するモノマーから又は本発明を認識する当業者によく知られているようなその既知の合成技術もしくはそれらの改変を用いた類似の方法で製造することができる。
【００５２】
さらに、５ｍＬのイソプロピルアルコールを上述の反応混合物に加え、ブレンドのために適当なｐＤＭＡのモル質量を、混合モル質量マトリクスに低減させる。モノマー溶液に５ｍＬのイソプロピルアルコールを添加し、重合及び精製を行い、約２００〜約３００ｋＤａのモル質量でポリマー生成物を得る。
【００５３】
実施例２
ｐＨＥＡ合成
壁−コーティングポリマー（ｐＨＥＡ）を合成するために、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドモノマーを、Ｃａｍｂｒｅｘ（商品名：Ｄｕｒａｍｉｄｅ（登録商標）で販売）から４５％溶液として購入した。モノマーの最終濃度が０．５ｗｔ％となるように、モノマー溶液の若干を１００ｍＬ量に薄めた。モノマー溶液を、２５℃に設定された水浴で、３０分間、Ｎ2流で脱気した。脱気の後、反応を、１０ｗｔ％アンモニウム過硫酸溶液（Amresco Inc、ソロン、OH、USA）の１００μＬ及び１０重量％のＴＥＭＥＤ（Amresco）１００μＬを加えることによって開始した。１６時間反応を進行させ、その後、ポリマー溶液を、１０日間、頻繁な水交換で透析した１０００００ＭＷカットオフ透析膜に移した。透析後、溶液を凍結乾燥し、１ＭＤａを超えるモル質量で固体ポリマーを回収した。
【００５４】
実施例３
ポリマー分子量の特徴付け
分子量分布を、タンデムゲル−浸透クロマトグラフィ−マルチ角度レーザー光散乱（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）で測定した。希釈ポリマー溶液を、ＳＢ−８０６ＨＱ、ＳＢ−８０４ＨＱ、及びＳＢ−８０２．５ＨＱを直列につないだShodex OH Pakカラムを用いてＧＰＣ（ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）において、最初に分別した。分別後、ＧＰＣからの廃水を、直接、ＤＡＷＮ ＤＳＰレーザー光度計に、次いで、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉計屈折計（両器具は、Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA USAから）に流す。特徴付けの間、１００μＬの希釈（１ｍｇ／ｍＬ）溶液（０．１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4及び２００ｐｐｍのＮａＮ3からなる移動相）を、器具に注入し、０．３００ｍＬ／分で流す。ＧＰＣ ＭＡＬＬＳデータを、Wyatt Technologiesから得たＡＳＴＲＡソフトウェアを使用して処理した。合成したポリマーを、モル質量、回転半径及び多分散係数によって全て特徴付けした。
【００５５】
実施例４
ｐＨＥＡコーティングの適用
Albarghouthiらによって示されたプロトコルに従って、マイクロチャネルを、最初に１ＭのＨＣｌ溶液で充填し、１５分間放置した。１ＭのＨＣｌ溶液の除去後、チャンネルを脱イオン水で洗浄し、次いで、ｐＨＥＡコーティング溶液で充填し、１５分間放置した。ｐＨＥＡコーティング溶液は、脱イオン水中のポリマー０．１％ｗ／ｖの水溶液である。コーティングは、１×１０-5ｃｍ2／Ｖｓより小さい電気浸透流を与える経路をもたらす。
【００５６】
実施例５
マイクロチャネル／マイクロチップ電気泳動
ｓｓＭ１３ｍｐ１８シーケンシング断片及びｓｓＤＮＡ ＥＴ−９００ラダー（双方、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ USA）の分析を、ACLARA Biosciences（マウンテンビュー、CA、USA）によって、この研究所のための特注のマイクロチャネル電気泳動システムにおいて行った。このシステムは、レーザーによって誘導された蛍光（ＬＩＦ）によって、感光性多色検出を可能にする。そのシステムは、２つのサブシステムから構成され、電気システムはマイクロ流体装置に電圧を供給し、光学サブシステムは、チャンネル内のポイントに収束させたレーザーを通すことにより、蛍光分子の検出を可能にする。これら２つのサブシステムは、いずれも、LabViewソフトウェアで書き込まれた単一のプログラムを使用してコントロールすることができる。
【００５７】
実施例６
電気システムを、４つの電極の独立した制御を可能にする高圧電源で作動させる。各電極は、０〜４．５ｋＶの間に設定することができるか、回路から切断することができる（「浮遊」）。ソフトウェアによって、ユーザーは、設定された時間の間、全４つの電極の電圧を、所望の電圧設定ポイントに設定することができ、複数の電圧及び時間ステップを、複雑なチップ機能又は種々の分離方法のために、順番に使うことができる。光学サブシステムは、蛍光体がJDS Uniphase Series 221430sl single-line, ４８８ｎｍアルゴンイオンレーザ(San Jose, CA USA)によって励起される共焦、落射蛍光からなる。ミラーは、反転ＴＥ２００、落射蛍光顕微鏡にレーザービームを導くために用いられる。光線を、次いで、帯域フィルターに通し、二色性のミラーで反射され、ニコン１０ｘ／０．４５顕微鏡対物レンズによって、直径約１０μｍのレーザスポットを生じるマイクロ流体チャネルの中央に集束させる。放出された蛍光を、同じ対物レンズによって集束し、二色性ミラー、その後１秒、広帯域フィルター(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)に通過させる。フィルターに通された光のスペクトルは、透過格子によってそれを指向し、高量子効率に集束させることによって測定し、５３２×６４ピクセルの電荷結合素子（ＣＣＤ）を−１５℃に冷却する（浜松社、Brigewater、NJ USA）。ピクセルビンニングを、特定の範囲にわたる放出強度を定量化するためにＣＣＤカメラからのデータに適用し、溶媒のラマン散乱ラインによって較正する。データ収集は、１０〜５０Ｈｚの範囲で達成することができる。ＣＣＤ出力を収集し、ビンニングし、低パスフィルタリングし、LabViewに書き込まれたプログラムを用いて保存した。
【００５８】
実施例７
実験を、Micronit Microfluidics BV（Enschede、オランダ）から購入した、７．５ｃｍ有効分離距離を有する単一チャネルガラスマイクロチップを用いて行った。チャンネルを、最初に１５分間、１ＭのＨＣｌですすぎ、続いて０．１％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液を１５分間充填することによって、ｐＤＭＡ又はｐＨＥＡのいずれかで被覆した。ｓｓＤＮＡの分離及びシーケンシングを、７Ｍの尿素、Ｐｏｐ−５（登録商標）マトリックス(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA USA) 及びベックマンLongRead（登録商標）ＬＰＡマトリクス(Amersham)を含むＴＴＥバッファ（５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＴＡＰＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡ）中、３〜５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で、ｐＤＭＡ（Ｍｗ＝３．４ＭＤａ）及びＬＰＡ（Ｍｗ＝２．５ＭＤａ）マトリックスで行った。各操作のために、２３５Ｖ／ｃｍの電界を、サンプル注入前に６０秒に印加する。また、混合モル質量ｐＤＭＡマトリックスを、１％又は２％の低モル質量ｐＤＭＡ及び３％〜４％の高モル質量ｐＤＭＡで配合した。１００μｍオフセットでオフセットＴインジェクターを用いて、サンプルを１００Ｖ／ｃｍで４０秒間注入した。分離を、サンプル及びサンプル廃棄用ウェルに、３８Ｖ／ｃｍのバックバイアスを印加して、２３５Ｖ／ｃｍで行った。チップを、操作中、５０℃に維持した。ベースコールを、NNIM Basecaller (NNIM, LLC, SaltLake County, UT USA)及びSequencher v 4.0.5(Gene Codes Corp., AnnArbor, MI USA)を用いて完了した。そのようなｐＤＭＡマトリックスは、６〜７分間で、約５００〜約６００塩基のシーケンシング読み取り長をもたらし、一方、市販のマトリックスは、約４００塩基以上のシーケンシングをしない。
【００５９】
実施例８
レオロジー
ゼロ−剪断粘度を、デジタル制御された再循環水浴(Julabo USA Inc., Allentown, PA, USA)に接続されたペルティエコントローラで温度を維持することにより、温度を維持しながら、Anton Paar Physica MCR 300 (Ashland, VA, USA)を用いて測定した。制御された剪断応力及び剪断率掃引を、２５〜５０℃の温度範囲にわたって、コーン−プレート（モデルＣＰ５０−１）装備及びダブルギャップクエット（モデルＤＧ２６．７）装備で実行した。ゼロ−剪断粘度対ポリマー濃度曲線を、この器具を用いて創出した（図２参照）。
【００６０】
実施例９
画像顕微鏡法
ＤＮＡを、ＹＯＹＯ−１(Molecular Probes, Eugene, OR USA)で蛍光標識した。すべてのタンパク質及び糖試薬を、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA USA)から購入し、４８ｋｂｐのｄｓλＤＮＡを、インビトロゲン(San Diego, CA USA)から購入し、ベタメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USAから購入した。標識方法では、ｄｓＤＮＡの５〜１０の塩基対につき約１つの標識を行った。蛍光標識したＤＮＡを観察するために、着色溶液を、溶媒化するために２４時間混合しておいた、カタラーゼ保存液、グルコースオキシダーゼ保存液、ＢＭＥ、２０％のグルコースバッファ及びポリマー溶液に混合した。一晩穏やかに混合した後、ポリマー／ＤＮＡ溶液を、画像化するために準備した。
【００６１】
実施例１０
ＤＮＡを画像化するために用いたハイブリッドチップを、Sylgard 184のポリ（ジメチルシロキサン）(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)マイクロチャネル及び１．５の厚いガラスカバースリップ(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)で構成した。ＰＤＭＡチャネルを、プレポリマー：硬化剤を１０：１の重量比で混合することにより形成した。脱気したScotch Magic Tape（登録商標）の幅狭ストライプ上に注ぎ、一晩真空チャンバで硬化させた。硬化したＰＤＭＡを０．５ｃｍ長の正方形に切断し、カバースリップに取り付けた。得られたチャネルは、約５０〜６０ミクロンの深さであった。
【００６２】
実施例１１
ＤＮＡマイグレーションを、ミシガン大学(Albarghouthi, M. N., Stein, T. M. & Barron, A. E. (2003) Electrophoresis 24: 1166-1175; de Carmejane, O., Yamaguchi, Y., Todorov, T. I.& Morris, M. D. (2001) Electrophoresis 22: 2433-2441)のモリス研究室をモデルする自家製システムを用いて視覚化した。画像処理システムは、ニコンＣＦＩ １００ｘ／Ｎ．Ａ．１．４油浸入顕微鏡対物レンズを装備したニコンＴＥ２００(Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA)反転落射蛍光顕微鏡からなる。ＤＮＡ蛍光を、青色光励起フィルターキューブ(４６０ｎｍ〜５００ｎｍ)(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)で、順次熱吸収フィルターによって集束した１００ワットの水銀灯光源を使って行った。ＤＮＡから放出された蛍光を、０．５インチのＣＣＤ（５１０ｎｍのロングパスフィルタ(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)及びＶＳ４ １８４５ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ３イメージ増倍管(Videoscope International, Dulles, VA USA)によるＴＭ ６７１０ ＣＬカメラ(JAI Pulnix, Sunnyvale, CA USA)で収集した。高速度カメラは、６４８×４８４ピクセルの全空間分解能で、１２０フレーム／秒が可能な可調フレーム速度を有する。全ての画像を、ＸＣＡＰ−ＳＴＤ(EPIX INC, Buffalo Grove, IL USA)ソフトウェアを利用するＰＩＸＣＩ制御盤(EPIX INC., Buffalo Grove, IL USA)によって、直接コンピュータに３０フレーム／秒で取り込んだ。電気泳動電圧を、Micronitから購入した高電圧電源を用いて行った。ポリマーマトリックス中をマイグレートする単一のＤＮＡ分子を、この技術を用いて画像化することができる。
【００６３】
実施例１２
ダイナミックｐＨＥＡポリマーでプレコートしたマイクロチャネルを使って、４％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ−メトキシエチルアクリルアミド）（ｐＮＭＥＡ）ポリマー溶液を、シーケンシングマトリクスとしてチャネルに充填した。７．５ｃｍ長の分離チャネルにおいて、温度を５０℃、電界を２３５Ｖ／ｃｍに設定した場合、５４０塩基のＤＮＡシーケンシング読み取り長が、約６．５分間で９８．５％の精度で達成することができる。ベースコールを、ＮＮＩＭ ベースコーラ及びシーケンサー４．０．５版によって実行した(シーケンシング電気泳動図は図示せず)。
【００６４】
実施例１３
マイクロチップでのシーケンシングＤＮＡに加えて、本発明のポリマーシステム（例えば、ｐＤＭＡマトリックス及びｐＨＥＡダイナミックコーティング）は、ＡＢＩ ３１００市販装置にて、２２ｃｍキャピラリで用いる。全てのシーケンシング操作は、５０℃の温度、２５０Ｖ／ｃｍの電界で行った。市販のＰＯＰ（登録商標）−６マトリクスに対して、生のシーケンシングデータは、４％の混合モル質量のｐＤＭＡ（１％の低モル質量及び３％の高モル質量）が迅速にシーケンスできることを示す。そのようなｐＤＭＡマトリックス分離は、より迅速なシーケンシングがキャピラリ器具で可能であることを示すＰＯＰ（登録商標）−６マトリックスでよりも３倍速い。シーケンシング結果を表４に示す。４％混合モル質量ｐＤＭＡ及びＰＯＰ（登録商標）−６（双方とも４％ｐＨＥＡ被覆キャピラリ）を比較している。分離は、混合モル質量ｐＤＭＡで非常に速い。このマトリックスは、約２２分間で６５０の塩基をシーケンシングした。ベースコールは、ＮＮ１Ｍベースコーラ及びシーケンサー４．０．５版を使って完了させた（４％混合モル質量でのシーケンシング気泳動図は図示せず）。
【００６５】
【表４】
【００６６】
上述した実施例に示したように、６００の塩基までのＤＮＡシーケンシングが、ｐＨＥＡダイナミックコーティングとともにｐＤＭＡマトリクスを用いて６．５分間で示された。この研究のために合成したｐＤＭＡは、市販のマトリックスより非常に良好に機能し、より疎水性のコーティングに関するｐＨＥＡの選択は、読み取り長を拡張するために重要である。一本鎖ＤＮＡ断片は、先のマイクロチャネル研究において使用された代表的なＬＰＡマトリックスよりも、この研究で用いられたｐＤＭＡマトリックスにおいて、より高い移動度を有している。ｐＤＭＡマトリックスは、わずか７．５ｃｍの分離距離において６００の塩基よりも、より長いシーケンシング読み取り長を可能にするという事実は、高速にも貢献する。
【００６７】
レオロジーデータ及び画像顕微鏡研究は、マイグレートするＤＮＡ分子がより頻繁にネットワークを破断するため、わずかに絡み合うｐＤＭＡネットワークが、より絡み合うネットワークよりも、より迅速にシーケンシングを可能にするかもしれないことを示唆する。ネットワーク破断は一般に低分離能につながるが、ＤＮＡはルーズなポリマー鎖をフックすることもでき、引くこともでき、それはＤＮＡ移動度がサイズに依存するＴＥＣメカニズムと類似している。このハイブリッド分離メカニズムが、画像顕微鏡法によって示される一方、ＤＮＡ分離の現在の理論を、同時にこれらのメカニズムに考慮されることはない。
【００６８】
このシステムを最適化することができ、移動度対ＤＮＡサイズの分析は、より長い読み取り長を可能にすることを示唆する。シーケンシングを、１１．５ｃｍ及び１５．９ｃｍのチャンネル長で示した。拡散限定システムと仮定すると、移動時間が線形的に増加しながら、ベースコーラーが塩基を正確にコールすることができる最小限の解像が、チャンネル長の平方根をスケールする。従って、１１．５ｃｍのチャンネルを用いて、１５．９ｃｍのチャンネルが〜１２分間で８００の塩基読みをもたらす一方、このシステムでは、〜９分間で６３０の塩基読み取りまでを実現するために用いることができる。そのような結果は、４％ｐＤＭＡマトリクスのために８５０程度の配向レプテーションへの移行によって加減し、それは、長に依存する移動度を変化させるかもしれず、より短い時間での読み取りが期待されるかもしれない。それでも、より短い時間での長いシーケンシング読み取りを与えるｐＨＥＡダイナミックコーティングとともにｐＤＭＡマトリックス能は、マイクロチップシーケンシングシステムの重要な一歩前進を意味し、シーケンシング技術の次世代の発展を促進する。
【００６９】
本発明のシステム／組成物は、シーケンシング中心又は線形ポリマーマトリックス及びダイナミックポリマーコーティングを用いることができる他のシーケンシング適用に拡張させることができる。電気泳動によるＤＮＡ分離を必要とするような、多くのゲノタイピング及び法医学適用もまた、広範囲にわたるＤＮＡサイズが、例えば、図１Ａで示すようにマトリックス及びコーティングの組合せで、分解することができるため、興味深いかもしれない。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、２００５年１１月１日出願の出願第６０／７３２３９８号の優先権に利益を享受し、全趣旨を参照することによりここに取り込む。
米国政府は、それぞれ、国立衛生研究所及び全米科学財団からノースウェスタン大学への第１Ｒ０１ＨＧ０１９７７０−０１及びＤＭＲ−００７６０９７に従って、この発明に対する特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列用のマイクロ流体チップ系の電気泳動は、コスト、時間及び試薬の消費の減少のための高いスループットシーケンシングプロジェクトに対する将来性ならびに全体のマイクロ分析システムに、他の遺伝子分析を伴うシーケンシングを統合する可能性を提示する。このためには、マイクロ流体チップのＤＮＡシーケンシング用の最適な重合分離マトリックス及び壁コーティングの開発が重要となる。
【０００３】
親水性分離マトリックス（例えば、線形ポリアクリルアミド（ＬＰＡ））は、共有結合親水性コーティングとともに用いられ、マイクロチャネル電気泳動による５００の塩基より長い読み取り長さを達成しているが、その分離は、すべてを行うために１５〜１８分以上の長時間を要する。ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）は、複合型分離メカニズムであるため、先行技術のポリマーと同様の読み取り長さを、より速い時間で達成する疎水性分離マトリクスである。共有結合コーティングは、すべての公表されたマイクロチャネルＤＮＡシーケンシング結果のためにほとんど排他的に使われている一方、ダイナミックコーティングは、それほど高価でなく、また、実行するのが非常に簡単であり、マイクロチャネルフォーマットに対して非常に好ましい。しかし、ＤＮＡシーケンシング用に実証された全てのダイナミックコーティングは、ＤＮＡ断片及び壁コーティングの相互作用のために分離効率の損失をもたらし、いくぶん疎水性であった。先の研究では、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）は、タンパク質分離及びＤＮＡシーケンシングの双方のためのキャピラリに対して適当な親水性ダイナミックコーティングであることを示したが、ｐＨＥＡもまた分離マトリクスである場合のみである。マイクロチップ系ＤＮＡシーケンシングに関する大部分の発表されたデータは４００を超えるが、チップにおけるシーケンス時間は、一般に１８〜３０分の範囲である。そして、キャピラリ電気泳動は、相当する結果を得るために、約６０〜９０分間を要する。時間及び読み取り長さの問題は、電気泳動による分離に関する当該技術分野で進行中の懸念を提示する。
【発明の開示】
【０００４】
上記を考慮して、本発明の目的は、マイクロチャネル分離における使用に対して１以上の高分子組成物、システム及び／又は方法を提供することであり、それによって、上述されたことを含む先行技術の種々の不足及び欠点を解消することができる。１以上の側面が特定の他の目的に対処することができると同時に、本発明の１以上の側面が特定の目的に対処することができ、一方、１以上の側面が他の目的に対処することができることは当業者によってよく理解されている。本発明のすべての面、すべてのその点において、各目的は等しくあてはまらないかもしれない。従って、以下の目的は、本発明のいかなる唯一の側面に関しても、代替として捉えることができる。
【０００５】
本発明の目的は、疎水性分離マトリクスと関連した利点をよりよく使用するためにダイナミック壁コーティングポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、単独又は上記の目的とともに、電気浸透流及び／又は分析物−壁相互作用の発生率又は影響を減少させるために、親水性壁コーティングポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、先行技術と比較してより短い時間で配列の読み取り長を増大させるために、マトリクス／壁コーティングシステムとともに関連方法の使用を提供することである。
本発明の他の目的は、より長く、速い配列読み取り、流マイクロチャネル電気泳動を提供する１以上のマトリクス／壁コーティングシステムを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的、特徴、利益及び利点が、この要旨及び特定の実施形態の以下の説明から明らかとなり、種々の電気泳動法及び技術分野の当業者に容易に明らかとなるであろう。そのような目的、特徴、利益及び利点は、添付の実施例、データ、図面及びそれらから引き出されるすべての合理的な結論と上記とを考慮することにより明らかとなるだろう。
【０００７】
本発明は、比較的短い分離チャンネルで、印加電界下、マイクロチップ電気泳動によって超高速のＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピングを可能にすることができる新しいシステムに関するものである。そのようなシステムは、重合分離成分及び重合コーティング成分を含むことができる。特定の実施形態では、高分子量ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）又はそれらのコポリマーを含むＤＮＡ分離マトリックスを、親水性水溶性ポリマー成分、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）とともに、マイクロチャネル電気泳動によってＤＮＡシーケンシング断片の非常に高速の分離を提供するために用いることができる。限定されずに、ｐＨＥＡはダイナミック（つまり、物理的に吸着された）ポリマー壁コーティング成分と見なすことができる。それは、マイクロチャネル壁にプレコートすることができ及び／又は重合分離マトリックス成分を含む組成物の一部として提供することができる。特定の他の実施形態では、本発明のそのようなシステム又は組成物は、ＤＮＡマイグレーション（つまり、ＤＮＡレプテーションと一時的な絡み合い結合（ＴＥＣ）とを組み合わせる新規なＤＮＡ分離メカニズム）の新規なモードを提供するための分子量及び／又は十分量でのそのような分離及びコーティング成分を含むことができる。
【０００８】
より一般的には、一部には、本発明は、マイクロチャネル電気泳動用のＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピング組成物に指向することができる。そのような組成物は、式
−[ＣＨ2Ｃ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”]n
（式中、Ｒは水素原子及びメチルから選択することができ、Ｒ’及びＲ”は独立して、Ｃ1〜Ｃ8の直線状アルキル基、Ｃ1〜Ｃ8のアルコキシ置換直線状アルキル基、Ｃ1〜Ｃ8の分岐状アルキル基及びＣ1〜Ｃ8のアルコキシ置換分岐状アルキル基から選択することができる）
のポリアクリルアミド、それらのコポリマー及びそのようなポリマー及び／又はコポリマーの組み合わせからなる疎水性分離マトリクスと、そのようなマトリクス成分よりもより親水性のポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ｐＨＭＡ）からなる疎水性壁コーティング成分とを含むことができる。
【０００９】
一実施形態では、ホモポリマー、ランダム又はブロックコポリマーあるいはいずれかの組み合わせであるとしても、Ｒは水素原子、Ｒ’及びＲ”は置換（例えば、メトキシ又はエトキシ、プロポキシ等）又は非置換のＣ１〜約Ｃ４アルキル基とすることができる。他の実施形態では、Ｒ’及びＲ”はメチルとすることができ、そのような成分は、ｐＤＭＡ又はＰＤＭＡコポリマーを含むことができる。そのような式について、ｎはそのようなポリマーの平均モル質量に対応する１より大の整数である。特定の実施形態では、そのようなポリマーは、当該分野で十分理解されているように、適度に疎水性とすることができ、水又は水性媒体に少なくとも部分的に溶解する。従って、そのような成分は、ｐＭＤＡ、ポリ（Ｎ−メトキシエチルアクリルアミド又はポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、それらの組み合わせならびに上述した又はここで記載したポリマー成分（例えば、限定されることなく、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジヘキシルアクリルアミド等）の１以上に対応するモノマーについてのそれらのコポリマーを含むことができる。
【００１０】
とにかく、Ｒ’及びＲ”のいずれかの組み合わせは、以下で詳細に説明する種類の機能効果を与えるのに少なくとも部分的に十分な程度で、そのような重合成分に与えられる疎水性及び、分子内又は分子間のいずれかで、物理的に相互作用する及び／又は他のそのような基又はポリマー成分に結合する能力によってのみ制限される。
【００１１】
そのような親水性壁コーティング成分は、少なくとも部分的に電気浸透流を減少させ及び／又は悪影響のある分析物−壁相互作用を減少させるために十分な親水性に照らして検討することができる。ｐＨＥＡは、約６００，０００から約４００万ｇ／ｍｏｌ（ＭＤａ）又は約５００万ｇ／ｍｏｌ（ＭＤａ）以上の範囲の分子量を有することができる。いずれにしても、分子量及び／又は最終用途適用によって、ｐＨＥＡは、媒体の０．５％（ｗ／ｖ）未満で流媒体中に存在することができる。他のある実施形態では、ｐＨＥＡは、当業者に理解されるように、約０．１から約０．４％（ｗ／ｖ）未満で媒体中（例えば、水性）に存在することができる。いずれにしても、一実施形態では、ｐＨＥＡコーティング成分は、１以上の上述した疎水性のポリアクリルアミド分離マトリックス成分と組成的に協働して用いるか、それに添加することができる。
【００１２】
いずれにしても、得られたマトリクス成分は、約５％以上までの範囲の割合（ｗ／ｖ）（そのような濃度は、平均分子質量に依存することができる）での濃度で、ここで記載した種類の、例えば、水又は水性媒体（例えば、限定されることなく、緩衝液）のような流媒体を含む組成物中に存在させることができる。一実施形態では、そのようなマトリックス成分は、約３％（ｗ／ｖ）までの、重量平均モル質量が約３〜約５ＭＤａのｐＤＭＡを含むことができる。他の実施形態では、マトリクス成分は、約１％から約２％（ｗ／ｖ）の範囲の、より小さい平均重量モル質量、例えば、限定されることなく約２００〜約３００ｋＤａのさらなるｐＤＭＡを含むことができる。種々の他のマトリクス成分を、モノマー成分及び対応基の選択によってのみ決定され、限定される濃度範囲にわたって、利用することができる。
【００１３】
特記しない限り、ここで用いられている、例えば、モル質量、割合等の特性を表す全ての数値は、用語「約」によって全ての例で修正されるものとして理解される。従って、反対に示されない限り、ここでの数値のパラメータは、望ましいポリマー又はシステム特性あるいはそれに関連するいずれかの方法を使用して達成される結果によって変化することができる近似であり、そのような割合及びモル質量は、本発明を認識する当業者によって変化させることができるものである。
【００１４】
本発明の組成物、システム、方法及び／又は装置のいずれに関しても、ここで記載又は示すポリマーは、いずれの対応ポリマーにおけるいずれのそのようなモノマーの割合にかかわらず、上述したモノマーのいずれかを含む、いずれかからなる又は実質的にからなることができる。そのような各々の重合、共重合化合物又はそれらのモノマー成分は、分離して又は他から単離して、組成的に区別することができ、特徴的に対比することができ、本発明とともに実行することができる。従って、実例としてここに明らかにされるように、発明の組成物、システム、方法及び／又は装置は、ここに開示、参照又は表示されるかまたはされないいずれか一つのポリマー、モノマー成分及び／又は工程が欠如していても実行又は利用することができ、欠如は、特に、ここで開示、参照又は表示されないかもしれない。
【００１５】
一つには、本発明は、また、ＲＮＡ及びＤＮＡ分離用のマイクロチャネル電気泳動システムに指向することができる。そのようなシステムは、ｐＤＭＡを含む疎水性分離マトリクス成分と、ｐＨＥＡを含む親水性壁コーティング成分と、マイクロ寸法のキャピラリ（例えば、特に限定されないが、約１０ミクロン〜約１５０ミクロンまでの範囲の内径が定義される）から選択されたマイクロチャネル基体又はそのようなマイクロチャネル寸法と類似のマイクロ流体電気泳動チップとを含むことができる。そのようシステムは、上述のタイプのｐＤＭＡマトリックス成分を含むことができる。限定されない特定の実施形態では、マトリックス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡと、低重量平均モル質量（例えば、約２００〜約３００ｋＤａの範囲のひとつ）の約１％〜約２％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡを含むことができる。
【００１６】
一つには、本発明は、また、いずれかの電気泳動ＤＮＡ又はＲＮＡ分離のいずれかのためのポリマー壁コーティング及び分離マトリクスシステムを用いる方法に指向することができる。そのような方法は、そのようなシステムの約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）を含むｐＤＭＡ成分と、ｐＨＥＡ成分とを含有するシステムを提供し、マイクロシャネル電気液動キャピラリ及びマイクロ流体シーケンシングチップから選択される種類の基体にシステムを導入し、電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、ＤＮＡシーケンシング反応生成物又はＲＮＡ成分のいずれかの混合物とシステムとを接触させることを含むことができる。そのような方法は、上述のタイプのｐＤＭＡ成分を含むシステムを含有することができる。一実施形態では、ｐＨＥＡ成分は分離マトリクスシステムの導入の前に基体に接触させることができる。そのような実施形態では、ｐＨＥＡ成分を水溶液として用いることができ、ここで記載した種類の壁コーティング成分を与えるのに十分な時間基体に接触させる。いずれにしても、そのような方法は、約８００塩基までの長さのＤＮＡ配列（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を分離するために用いることができ、そのような分離は、時間及びマイクロチャネル長に依存する。そのような分離／シーケンシング法は、限定されない実施例で、以下に示される。
【００１７】
上記と関連して、本発明は、マイクロチャネル電気泳動装置に指向することもできる。そのような装置は、ミクロン寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体とともに、基体及びそれらの上のポリマーシステムとを含むことができる。マイクロチャネル基体、又は装置構成に限定されることなく、そのようなシステムは、そのようなシステムの約３％〜約５％（ｗ／ｖ）を含むｐＤＭＡ成分を含むポリマーシステムと、上述した種類のｐＨＥＡ成分とを含有することができる。そのようなポリマーシステムは、分離及び／又は壁−コーティング特性を示しており、当該分野で公知の他のタイプのキャピラリ又はマイクロチャネルマトリックス又は壁コーティング材料との併用又は組合せで用いることもできる。
【００１８】
一つには、本発明は、ＤＮＡ分離速度を高めるための疎水性ポリマーマトリックスの使用方法にも指向することができる。そのような方法は、マイクロ寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択されたマイクロチャネル基体を準備し、そのような基体に親水性ｐＨＥＡ壁コーティング成分を結合又は適用し、疎水性分離マトリクスをその基体に導入し、そのようなマトリクス成分は、ここに記載されるポリアクリルアミド、それらのコポリマー及びそのようなポリアクリルアミド及び／又はそのようなコポリマーとの組み合わせから選択され、そのような混合物、分子量のマトリクス成分の電気的動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、混合物中のＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションの少なくとも１つのために、少なくとも部分的に十分な濃度で、ＤＮＡ配列成分の混合物とそのようなマトリクス成分とを接触させることを含むことができる。一実施形態では、分離は、一時的な絡み合い結合又はレプテーションの組み合わせとすることができる。そのような一実施形態では、ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びマイクグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートさせることができる。いずれにしても、そのようなマイグレーション動力学は、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光ビデオ顕微鏡法によってモニターすることができる。一実施形態では、そのような方法は、先行技術のＬＰＡマトリクスを用いる分離と比較して、最高約３倍速い分離を提供することができる。
【００１９】
限定されることなく、一実施形態では、そのような方法のマトリックス成分は、ｐＤＭＡ及び／又はそれらのコポリマーから選択することができる。前者に関して、そのようなマトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量で、約３％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡと、低重量平均モル質量（例えば、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の一つ）の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）のｐＤＭＡとを含むことができる。いずれにしても、そのような実施形態では、マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴づけることができ、分子サイズの範囲は、塩基及び／又は塩基対に換算して測定することができる。例えば、限定されることなく、ＤＮＡ分子サイズの範囲は、約−４．４０〜−０．６０の間でスロープを有するログ−ログプロットのような線形領域で、約２００塩基〜約８００塩基とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳによるｐＤＭＡの特性。ｐＤＭＡモル質量分布は限定されないいくつかの実施例で使用した。分布は３回の平均値である。
【図２】ｐＤＭＡマトリクスの粘度はシーケンシングに適する濃度で劇的に増大する。しかし、簡易マイクロチャネル充填のための粘度は、従来例のＬＰＡマトリクスよりも非常に低いままである。
【図３】従来のＬＰＡマトリクスと比較したｐＤＭＡマトリクスのＤＮＡ分離。全３７のピークは、３％及び４％のｐＤＭＡで解像した。解像のロスが５％ｐＤＭＡ及びＬＰＡマトリクスで観察された。ＤＮＡ断片のマイグレーション時間は濃度に依存する。
【図４Ａ】図２の分離からのピークの選択性（μi-μi-1／μavg）。両マトリクスは、同じピーク分離を示す。
【図４Ｂ】LongRead（登録商標）マトリクスにおけるピークは、２５０塩基以上のｐＤＭＡにおけるよりも一層広い（このバンド拡張は、このマトリクスの低いシーケンシング性能の主な原因である）。
【図５】ｐＤＭＡマトリクスにおけるｓｓＤＮＡラダーに対する移動度データ。条件は図１のものと同じである、破線は、プロットが線形の領域のＤＮＡサイズを示す。線形領域の傾きは、−０．５４、−０．５９及び−０．５０（それぞれ３％、４％、５％マトリクス）である。
【図６】ＤＮＡ画像から捕捉されたデジタル画像である。示された時間間隔での一連のフレームは、本発明の代表的なネットワクークを通して移動する２つのＤＮＡ分子を示す。上部の分子は、所定時間において示された全部のフレームにわたってレプテートしている。下部の分子は、最初レプテートし、次いで、一時的な絡み合い結合と同様のメカニズムにおいて示されたフレームにわたって、ポリマーネットワークを、フック及び引き込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
電気泳動におけるＤＮＡ分離に影響し得る絡み合いポリマー溶液の特性
本発明の特定の実施形態をさらに理解するために、以下を考慮する。
シーケンシング用最適ポリマーマトリックスを開発することは、マイクロチャネルシステムを商業化するために最も大きな制約のうちの１つである。ＤＮＡシーケンシングは、ポリマー鎖がネットワークにオーバーラップし、ネットワークを形成し、絡み合う半希釈ポリマー溶液中で可能であるのみである。オーバーラップ濃度（ｃ*）を、コイル内のポリマー濃度に正確に匹敵するバルク溶液濃度と定義する。方程式（１）は、この定義に基づくｃ*の推定値を与える。
【数１】
（式中、Ｍwは重量平均モル質量、ＮAはアボガドロ数、Ｒgはポリマー回転半径である）
式（１）から、オーバーラップ濃度は、光散乱のような技術によって、Ｍw及びＲgの双方を測定することによって算出することができる。あるいは、オーバーラップ濃度は、一連のポリマー濃度のゼロせん断粘度を測定し、ログ−ログスケールで粘度対ポリマー濃度をプロットすることによって決定することができる。プロットが非線形になる濃度は、オーバーラップ濃度であり、ネットワークが絡み合う程度では、ｃ／ｃ*比として表わすことができる。
【００２２】
ＤＮＡが、絡み合ったポリマーネットワークを移動するため、ネットワークを規定するための臨界パラメータは、ポリマースクリーニング長（ξ）である。ポリマー溶液について、スクリーニング長は、ポリマーＲg及び濃度に依存する。
【数２】
【００２３】
ゲル電気泳動では、平均孔サイズは、分離メカニズムを決定するために及び、ゲルから絡み合ったネットワークへの分離メカニズムに関する理論についての試みにおいて重要であった。絡み合い点間の平均鎖長として、「ブロブ」サイズ（ξb）を定義することによって、わずかに変化したこの見解で、これらの溶液における「孔サイズ」としてスクリーニング長を用いることが提案されている。この調整は、定義における新たなプレファクターを導入したのみであり、
【数３】
として定義される。よって、一般にポリマーネットワークは、ポリマー濃度及びコイルサイズの双方に依存するこのブロブサイズに換算して定義することができる。
【００２４】
絡み合いポリマー溶液中のＤＮＡ分離メカニズム
上述のポリマーネットワークパラメータは、絡み合いネットワークにわたってＤＮＡマイグレーションの種々のメカニズムを示すために用いることができる。分離のメカニズムは、ネットワーク中でのブロブのサイズと比較して、ＤＮＡ分子のＲgに依存する。ネットワークの孔サイズより小さいＤＮＡサイズは、繊維の緻密なアレイ中を移動する球体に対するオグストンによって示されたものと類似したメカニズムで、溶液中をマイグレートする。これは、通常、オグストンふるい分けとして呼称されており、自由溶液移動度に対して、ＤＮＡの移動度は、
【数４】
（式中、Ｋrは、ＤＮＡコイル半径の正方形と比例している遅延係数であり、ｃはゲル又はポリマー濃度である。）
によって、数学的に示すことができる。このメカニズムは、試料の移動度対ポリマー濃度のゲルの自然対数をプロットするファーガソンプロットによって分析される。よって、線の傾斜は、遅滞係数に対する値を与える。
【００２５】
ＤＮＡ移動度に対するオグストンモデルは、ＤＮＡ分子のコイルサイズがネットワークの孔サイズに近づき、それを超えるために、作用しなくなることが予想される。
孔サイズより大きなＤＮＡがＤＮＡ移動度の偏ったレプテーションモデルに至ったという観察。このモデルは、ＤＮＡ分子長が変動、つまり変動で偏ったレプテーションに付されたことを考慮することによって、再評価された。これらのモデルは、ＤＮＡの移動度が溶液の絡み合いポリマー溶融体に対するレプテーション理論に類似したネットワークによって、曲がりくねると予測される。このメカニズムの重要なパラメータは、低減した電界であり、これは、
【数５】
（式中、ηsは溶媒粘度、Ｅは電界強度、ｋbはボルツマン定数、Ｔは絶対温度である）
によって与えられる。これらのモデルは、一般に、低電界の存在又はε＜＜１に対して誘導された。ＢＲＦモデルに対する移動度の得られた形態は、
【数６】
（式中、Ｎは塩基中のＤＮＡサイズ、αは調節因子である）
によって与えられる。このモデルに関して、臨界ＤＮＡサイズは、以下の第１項のＤＮＡサイズが支配して存在し、ＤＮＡ移動度はサイズ依存性である。
【数７】
【００２６】
ＤＮＡレプテーションのこの領域は、未配向レプテーションとして知られており、シーケンシングを含む大部分のＤＮＡ分離は、この領域内で行われる。臨界サイズ以上のＤＮＡに対して、第２項が支配し、サイズに基づく分離は消失する。レプテーションのこの領域は、配向レプテーションとして知られている。ＤＮＡの臨界サイズは、孔サイズ及び電界強度の双方に依存する。
【数８】
【００２７】
臨界サイズは、メッシュサイズと無関係に予測されるが、先の研究は、無配向から配向レプテーションへの移行は、メッシュサイズに依存することを示した。そのような結果は、より小さい孔サイズが、配向レプテーションをより小さいＤＮＡサイズへシフトさせる傾向があることを示す。よって、電界強度並びに絡み合いネットワークのブロブサイズは電気泳動によるＤＮＡサイズに基づく分離に対する上限を決定する臨界パラメータである。
【００２８】
オグストンふるい分け及びバイアスレプテーションのメカニズムが、絡み合い溶液に適用可能である一方、バロンらは、オーバーラップ濃度以下のポリマー溶液中で一般に行われている種々の分離メカニズムを発見した。ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）の超希薄溶液において、大きなｄｓＤＮＡ分子（＞１ｋｂｐ）の分離が可能であり、絡み合いポリマー溶液に対する理論は、その結果を説明するには不十分であったことを示す。従って、一時的な絡み合い結合と呼ばれる新しいメカニズムが、その分離を説明するために提案された。このメカニズムでは、ＤＮＡは、マイグレーション間にポリマー鎖に遭遇し、２つの結合がＤＮＡ分子の連結を増大する。ポリマー鎖に遭遇する可能性は、ＤＮＡサイズ依存性であり、よって、分離が可能となる。
【００２９】
ポリマーの物理的特性は、シーケンシング特性に影響を及ぼす。通常、親水性の高モル質量のポリマーが、より長いＤＮＡシーケンシング読み取り長に対して必要である。同時に、低粘度及びガラス表面への被覆能が、システムの操作に対する技術的及びコスト的な利点を提供する。合成条件は、１×１０6ｇ／ｍｏｌを超えるｐＤＭＡ及びｐＨＥＡモル質量を目標とした。一般的に、より長いＤＮＡシーケンシング読み取りを与える閾値となり、その一方で、安定なダイナミックコーティングの必要条件をも満たす。図１は、ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳで測定した、この研究において用いられたｐＤＭＡのモル質量分布を示す。ｐＤＭＡ及びｐＨＥＡに対して室温で測定されたポリマー特性を、表１にまとめた。ｐＤＭＡ溶液のゼロ剪断粘性を図２に示す。多くのＬＰＡマトリックスは、１００，０００ｃＰ28オーダーにおける粘度を有し、シーケンシングに有用な濃度範囲におけるｐＤＭＡマトリクスは、マイクロチャネルに充填することが大変容易であろう。
【００３０】
【表１】
【００３１】
ｓｓＤＮＡ分離
ｐＤＭＡは、キャピラリ電気泳動器具における有効なシーケンシングマトリックスとして探究されたが、このポリマーは、マイクロチャネルシステムにおけるシーケンシングに対して試験されなかった。ｓｓＤＮＡ断片の分離は、対照として、市販のＬＰＡマトリックスとともに、３〜５％の濃度のｐＤＭＡを用いたマイクロチャネル電気泳動システムで行われた。サンプルは、３７ＤＮＡ断片サイズを含む２５塩基ラダーである。これらの分離での電気泳動図を図３に示す。３％及び４％のｐＤＭＡマトリックスが全３７のピークを分離した一方、５％のｐＤＭＡ及びＬＰＡマトリックスは最大のＤＮＡ断片を完全には分解しない。そのため、低粘度を有することに加えて、ｐＤＭＡ溶液は、４％のＬＰＡマトリックスよりも良好に、９００の塩基まで、２５塩基ラダーを分離する。このシステムにおける有効な分離距離は、市販のＣＡＥ手段におけるよりも相当小さい、７．５ｃｍである。マイクロチャネルシステムが、より有効な分離を可能にするクロスインジェクターデザインを採用するため、必要とされるチャンネル長が非常に低減され、よって、分離はより速い。
【００３２】
ｐＤＭＡマトリックスに関して、ポリマー濃度におけるＤＮＡマイグレーション時間の依存性は明らかであり、マイグレーション時間は、ＬＰＡマトリックスよりも、一般に、これらのｐＤＭＡに対して短い。大部分のマイクロチャネルシーケンシング研究では、それらの個々のシステムを最適化する取り組みにおいて、種々の電界強度及び温度と同様により長いチャンネルを用いたため、直接マイグレーション時間を比較することは困難である。しかし、多くのマイクロチャネル研究（４％のＬＰＡ）に対して選択したマトリクスは、同様の電気泳動条件下で、ここで使用したｐＤＭＡマトリックスより長いマイクレーション時間である。
【００３３】
ＤＮＡシーケンシング結果
ＬＰＡと比較して分離速度が速くなったことに加えて、ｐＤＭＡは、高価で長時間かかるかもしれない共有結合的にチャネル壁を被覆する必要を解消する自己コーティングマトリクスとして作用することができる。ダイナミックに吸着されたポリマー壁コーティングは、それらのコストを低減させ、より簡便な実施のため、高いスループット環境のための共有結合コーティングよりも一層魅力的である。しかし、ｐＤＭＡコーティングは、若干疎水性で、試料と相互に作用するかもしれない。電気浸透流及び試料−壁相互作用は低減させることができるため、ｐＨＥＡの親水性が壁コーティングを良好にする。
【００３４】
ｐＤＭＡ及び市販のＰｏｐ−５（登録商標）及びベックマンLongRead（登録商標）マトリックスの種々の濃度に対するシーケンシング結果を、種々のダイナミックコーティングを用いた結果とともに表２に示す。ポリマーコーティングの化学作用は、読み取り長にかなり影響する。４％のｐＤＭＡマトリックスについて、ダイナミックコーティングとしてｐＤＭＡを用いることにより、４２０塩基の読み取り長を実現することができる。ｐＨＥＡがダイナミックコーティングとして適用される際、読み取り長は１３０塩基まで拡張される。読み取り長のこの増大は、分離の間、バンド拡大を増加させることができる壁−試料相互作用の減少に起因している。
【００３５】
【表２】
【００３６】
もう一つの興味深い結果は、Ｐｏｐ−５（登録商標）が、ＡＢＩ ＣＡＥ器具におけるその市販の用途と対照的に、自己コーティングマトリクスとして使用することができないということである。これは、この研究におけるマイクロ流体チップを作製するために用いられるガラスの化学と、キャピラリで用いられる溶融石英ガラスとの基本的な差異によって説明されるかもしれない。塩類及びガラスチップのガラスの結合特性を増大させる他の不純物の存在が、Ｐｏｐ−５（登録商標）ポリマーのコーティング能を変化させることができた。しかし、ｐＨＥＡは、Ｐｏｐ−５（登録商標）をチップに充填する前に適用される場合、読み取り長は非常に低い読み取り（＜５０塩基）から約３８０塩基に増大される。Ｐｏｐ−５（登録商標）マトリックスと、ｐＤＭＡマトリックスに対する結果とを比較することは、キャピラリシステムのために開発されるポリマーマトリックスが必ずしもマイクロチャネルシステムのために最高のマトリックスであるというわけではないことを証明する。この結果は、ｐＤＭＡマトリックス対ベックマンLongRead（登録商標）マトリックスで（キャピラリシステムのために最適化されたＬＰＡマトリックス）得られたより良好なシーケンシング読み取り長によって、さらに確認される。
【００３７】
ｐＤＭＡシーケンシングマトリクスとｐＨＥＡダイナミックコーティングの最適配合の組合せは、より短時間において、市販のマトリックスより長い読み取り長を与える。４％のｐＤＭＡマトリックスは、５５０塩基の長い読み取りを含む９８．５％の精度で平均５１２塩基を与えた。種々のｐＤＭＡ濃度を比較することにより、３％のｐＤＭＡマトリックスがｓｓＤＮＡ分離において５００塩基断片に対するマイグレーション時間において、２５％の改善をもたらすことが明らかにされるが、わずか３４９塩基が、シーケンシングに対する平均を正確にもたらすことができたのみであった。このように、より長い読み取り長に対して、この特定のｐＤＭＡモル質量について３％よりも高濃度が必要である。しかし、読み取り長が５％の濃度で減少するため、４％の配合が最適濃度を表す。
【００３８】
図３における分離から、３％のｐＤＭＡマトリックスは、迅速に、高解像度で大きなＤＮＡ断片を分離したが、より高いｐＤＭＡ濃度に匹敵するシーケンシング読み取り長を得なかった。より高いポリマー濃度が、短いＤＮＡ断片を分離するために重要なパラメータであり、より低い濃度が大きな断片を分離するために有利であるため、ポリマーマトリクスを、より高い平均モル質量及びより低い平均モル質量のポリマーをブレンドすることにより処方した。表３は、ｐＤＭＡポリマー（９８．５％の精度で）の２つの「ブレンド」の結果を示す。高い平均モル質量（３．４ＭＤａ）のｐＤＭＡを、３％（ｗ／ｖ）の濃度で用い、一方、２つのマトリックスに対する総ｐＤＭＡ濃度が４％及び５％（ｗ／ｖ）となるように、低い平均モル質量（２４０ｋＤａ）のｐＤＭＡを、１％及び２％（ｗ／ｖ）の双方で用いた。一つの平均モル質量によるマトリックスは非常によく機能するが、混合したモル質量マトリクスは、よりよく機能する。４％の混合マトリックスは５６０塩基（６分間の５８７塩基の長い読み取りで）で最高平均読み取り長を達成し、一方、５％の混合マトリックスは６０１塩基で最も長い個々の読み取りを達成した（達成するためにわずか６．５分間であった）。(最長シーケンシング作動のための４色シーケンシング電気泳動図は示さない)
【００３９】
ｐＤＭＡマトリックス及びLongRead（登録商標）ＬＰＡマトリックスでの分離をさらに分析して、この市販のマトリックスの乏しいパフォーマンス源を決定することができる。ｓｓＤＮＡ分離から、分離選択性及びピーク幅の双方を、図４Ａ〜Ｂにおける種々のＤＮＡ断片サイズでプロットした。選択性は、マトリックスの分離能の測定基準であり、それらの平均移動度によって標準化した隣接したピーク間の移動度における差異として定義した。ピークの幅は、システムにおいて全てのバンド拡大源の複合効果を測定する。図４Ａから、４％のｐＤＭＡポリマー及びLongRead（登録商標）マトリックスの選択性が類似し、シーケンシングパフォーマンスの違いを説明することができないことが明瞭である。しかし、図４Ｂは、約２５０塩基より大きなＤＮＡサイズで、ＬＰＡベースマトリクスでのピーク幅において大きな増大があることを示す。このバンド拡大作用は、このシステムにおける乏しい特性の主な原因であり、ｐＤＭＡマトリクスにおけるより高いピーク効率（小さな幅）がこれらポリマーの増大したシーケンシング読み取り長をもたらすと考えられる。さらに、LongRead（登録商標）ＬＰＡシステムのより広いピークは、おそらく、同程度の読み取り長（それは、また、より長い時間を必要とする）を達成するために非常に長い分離チャンネルを必要とするであろう。
【００４０】
【表３】
【００４１】
ｐＤＭＡマトリックスにおけるＤＮＡ分離メカニズムの調査
絡み合いポリマー溶液によるＤＮＡ分離は、上述した２つのメカニズムを経由して進行すると考えられる。小さなＤＮＡ断片がオグストンふるい分けによってポリマーネットワークを通してふるいにかけられる傾向があり、一方、ＤＮＡレプテーションはより大きな断片に対する分離メカニズムである。レプテーションは、より高解像度分離を提供し、高性能シーケンシングのための望ましいメカニズムに違いない。これにより、高濃度でのより小さなメッシュサイズが、レプテーションメカニズム開始点をより小さなＤＮＡサイズにシフトさせるため、より小さなＤＮＡサイズをシーケンスするためになぜ高濃度を必要とするかを説明することができる。類似の理由により、低濃度がより長い読み取りのためになぜ必要とされるかについて説明することができる。メカニズムが、配向レプテーションにシフトするため、マトリックスにおける全ての分解能が失われる。この移行はメッシュサイズ（Ｅｑ８参照）に依存するため、ＤＮＡは、より高いポリマー濃度のためにより小さいサイズで配向する傾向がある。
【００４２】
対数関数スケールにおけるＤＮＡの移動度対断片サイズをプロットする場合、図１からｓｓＤＮＡラダーの分離に関して図５で示すように、未配向レプテーションによる分離は、データの線形部分で観察することができる。図５に示されるデータは、ｐＤＭＡマトリクスに対するキャピラリシステムの初期に提示されるデータと類似している。特に、スムーズな移行が、未配向レプテーションに対する及び未配向レプテーションから配向レプテーションへの移行に関するオグストン型ふるい分け間に存在する。
【００４３】
長いＤＮＡシーケンシング読み取りに関して、図５においてプロットされた線形領域のより高いＤＮＡサイズへの拡張は、重要かもしれない。４％のｐＤＭＡマトリックスの移動度は、５％のｐＤＭＡと比較してより大きなＤＮＡサイズのために線形領域に残り、そのため、配向レプテーションへの移行は、より小さなＤＮＡサイズにシフトする。このように、４％のｐＤＭＡは、５％のマトリックスより長い読み取り長を与え、この研究の結果は、この制限下のＤＮＡサイズのためにさえ、４％のマトリックスがより良好なシーケンシング結果を与えることを示す。しかし、移動度のプロットは、シーケンシングに必要とする一塩基決定を減少させるかもしれないバンド拡大効果を説明しない点に注意されなければならず、シーケンシング読み取り長がｓｓＤＮＡラダーの移動度のプロットからまさに予測されるかもしれないものよりも小さい。
【００４４】
絡み合いネットワーク破断
３％のｐＤＭＡマトリックスは、２つのより高い濃度よりもさらに拡大した移動度のプロットについて線形領域を示し、それでも、このマトリックスに対する読み取り長は、通常、非常に低い。この１つの理由は、より高いポリマー濃度が上述したように小さいＤＮＡサイズのより良好な分離に必要とされるからである。より大きなＤＮＡサイズに対する分離パフォーマンスに影響するもう１つの要因は、ポリマーネットワークの絡み合いの強さである。通常、所定の分子量で、ポリマー濃度が増大し、鎖がより絡み合うため、絡み合いネットワークの強度が増大し、よって、より大きなＤＮＡサイズをシーケンスするためにメッシュサイズをより大きくする必要がある場合、より高いモル質量ポリマーがより有効である。また、絡み合い強度は、個々の鎖のコイルサイズにも影響を受ける。ｐＤＭＡ鎖は、一般に、ＬＰＡのようなより親水性ポリマーより小さいコイルサイズを有する。
【００４５】
強く絡み合うネットワークは、レプテーションによってＤＮＡを分離するために必要であり、よって、ＤＮＡをマイグレートすることによるポリマーネットワークにおける破断は、分離力及び読み取り長を低減する傾向がなければならない。わずかに絡み合うネットワークでは、特により大きなＤＮＡによって、破断はより頻繁である。しかし、ネットワークが破壊されるにつれて、ポリマー鎖とともに絡み合うＤＮＡ分子の現象は、まだサイズに依存する傾向がある。このメカニズムは、一時的な絡み合い結合（ＴＥＣ）、当該分野でよく理解され、かつ確立された現象に関連し、希釈ポリマー溶液中でのｄｓＤＮＡ分離についてバロンらによって発見された（例えば、Barron, A. E., Soane, D. S. & Blanch, H. W. (1993) J. Chrom. A 652: 316; Barron, A. E., Blanch, H. W. & Soane, D. S. (1994) Electrophoresis 15: 597-615及びBarron, A. E., Sunada, W. M. & Blanch, H. W. (1996) Biotech. Bioeng. 52: 259270参照、全趣旨を参照することによりここに取り込む）。よって、未配向レプテーションが、これらのマトリックスにおけるＤＮＡ分離の優位なメカニズムであるが、ネットワーク破断及びＤＮＡポリマー絡み合いも、分離に貢献している可能性がある。フッキングを伴うこのネットワークの破断は、レプテーションより迅速であることが予想されるため、このメカニズムは、ＬＰＡシーケンシングマトリックスと比較してｐＤＭＡのより弱い絡み合い溶液中での分離で速度を速める原因となるかもしれない。
【００４６】
ＤＮＡ分離のこの複合型メカニズムは、ｐＤＭＡマトリックス中でｄｓＤＮＡの画像顕微鏡法研究によってさらに示唆される。図６は、２５℃での３．０％のｐＤＭＡマトリクス中で２つのＤＮＡ分子の時間進展を表し、１つの分子がレプテーションによって移動し、一方他の分子がネットワークを破壊し、溶液によってポリマー鎖を連結する。下部のＤＮＡ分子は溶液によってレプテートし、次いで、ネットワークへのフック及びそれに沿って連結する一方、上部のＤＮＡ分子がフレームシリーズの間、レプテートし続ける。これは、これらの２つのメカニズムが同時に同じマトリックス中で起こり得ることを証明する。
【００４７】
以下に示すように、キャピラリ及びマイクロチップ用の新規のポリマーマトリックス／ポリマー壁コーティングシステムは、ＤＮＡ分離マトリクスとしての疎水性ポリマー、例えば、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、親水性ダイナミック壁コーティングとしての親水性ポリマー、例えば、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）との組み合わせを含み、キャピラリ及び特にマイクロチップ電気泳動によるＤＮＡ配列の超高速分離をもたらす。ダイナミック親水性ポリマー壁コーティングとの疎水性シーケンシングポリマーの組み合わせは、マイクロ流体電気泳動装置で以前に示されていなかった。５００〜６００の塩基シーケンシングは、塩基−呼び出しの高い正確さで、まさに７．５ｃｍの有効分離距離で、（最適に）印加された電界強度（例えば、２３５Ｖ／ｃｍ）及び温度（例えば、５０℃）のような他の条件下、マイクロチャネル電気泳動フォーマットにおけるそのような２つのポリマーの組み合わせによって、特に７分より短時間で達成することができる。
【００４８】
１×ＴＴＥ＋７Ｍ尿素バッファ中の３〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解したＰＤＭＡ（最適には約３〜約４ＭＤａのＭｗで）は、シーケンシングマトリクスを与える一方、ｐＨＥＡダイナミックコーティングはマイクロ流体チップでの適用のために前適用される。さらに、約１〜約２％の間の低モル質量ｐＤＭＡ（〜２００〜３００ｋＤａ）を、３％（ｗ／ｖ）高モル質量ｐＤＭＡ（３〜４ＭＤａ）溶液（総ポリマー濃度４％（ｗ／ｖ））に添加することによって、６．５分間の電気泳動で最高６００の塩基のさらにより長いシーケンシング読み取りをもたらす。詳しくは、いずれの１つの理論又は操作モードに限定されず、そのような条件は、一時的な絡み合い結合及びレプテーションの間のいずれかのハイブリッドＤＮＡ分離メカニズムを経由する超高速ＤＮＡシーケンシングを与え、それはＤＮＡシーケンシング用のメカニズムとしてこれまで示されていなかった。そのメカニズムは、ＤＮＡ移動度対断片サイズのログ−ログプロットを見ることによって演繹することができ、単分子落射蛍光顕微鏡画像実験によって補強される。ＤＮＡ移動度対ＤＮＡサイズのログ−ログプロットにおいて、超高速のシーケンシング条件下の線形領域の傾斜は、−０．４０〜−０．６０である。
【００４９】
分子量、組成及び溶液濃度ならびに壁−コーティングポリマーの最適化のようなポリマー特性に関するそのような分離媒体のさらなる最適化は、この短時間でのより長い読み取りを可能にすることができる。得られた結果は、これまで報告されたそのような長い読み取りのための最速のシーケンシング時間を示し、よって、マイクロチャネルベースのシーケンシング技術の開発での発展を提供する。
【００５０】
実施例
マイクロチャネル電気泳動のために、以下の非限定的な実施例及びデータは、疎水性分離マトリックスポリマー成分及び親水性壁コーティングポリマー成分の使用を含む、本発明の組成物、システム、方法及び／又は装置に関連する種々の観点及び特長を示す。先行技術との比較において、本発明の組成物、方法、システム及び／又は装置は、意外で、予想外で、対照的な結果及びデータを提供する。発明の有用性は、ここで用いることができるいくつかのポリマー成分、組成物及び装置の使用によって示される一方、匹敵する結果が、種々の他のポリマー成分、組成物及び装置でえることができる当業者によって理解され、それは本発明の範囲に相当するようである。
【００５１】
実施例１
ＰＤＭＡ合成
高分子量ｐＤＭＡ分離マトリックスポリマーを、モノマーＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（９９＋％純度でMonomer-Polymer & Dajac Labs (Feasterville, PA USA)から購入）から合成した。ＤＩ水中の４重量％モノマー溶液を、４７℃に設定された水浴中で、３０分間Ｎ2流で脱気し、続いて、Ｖ−５０（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩化水素（和光純薬、リッチモンド、ＶＡ、ＵＳ）で開始した。１６時間後、粘稠ポリマー溶液を、１０日間、頻繁な水交換で透析した１０００００ＭＷカットオフ透析膜に移した。透析後、サンプルを凍結乾燥し、１ＭＤａを超えるモル質量で、固体ｐＤＭＡポリマーを回収した。本発明の種々の他のマトリックスポリマー及び共重合体は市販であるか、上述したように、対応するモノマーから又は本発明を認識する当業者によく知られているようなその既知の合成技術もしくはそれらの改変を用いた類似の方法で製造することができる。
【００５２】
さらに、５ｍＬのイソプロピルアルコールを上述の反応混合物に加え、ブレンドのために適当なｐＤＭＡのモル質量を、混合モル質量マトリクスに低減させる。モノマー溶液に５ｍＬのイソプロピルアルコールを添加し、重合及び精製を行い、約２００〜約３００ｋＤａのモル質量でポリマー生成物を得る。
【００５３】
実施例２
ｐＨＥＡ合成
壁−コーティングポリマー（ｐＨＥＡ）を合成するために、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドモノマーを、Ｃａｍｂｒｅｘ（商品名：Ｄｕｒａｍｉｄｅ（登録商標）で販売）から４５％溶液として購入した。モノマーの最終濃度が０．５ｗｔ％となるように、モノマー溶液の若干を１００ｍＬ量に薄めた。モノマー溶液を、２５℃に設定された水浴で、３０分間、Ｎ2流で脱気した。脱気の後、反応を、１０ｗｔ％アンモニウム過硫酸溶液（Amresco Inc、ソロン、OH、USA）の１００μＬ及び１０重量％のＴＥＭＥＤ（Amresco）１００μＬを加えることによって開始した。１６時間反応を進行させ、その後、ポリマー溶液を、１０日間、頻繁な水交換で透析した１０００００ＭＷカットオフ透析膜に移した。透析後、溶液を凍結乾燥し、１ＭＤａを超えるモル質量で固体ポリマーを回収した。
【００５４】
実施例３
ポリマー分子量の特徴付け
分子量分布を、タンデムゲル−浸透クロマトグラフィ−マルチ角度レーザー光散乱（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）で測定した。希釈ポリマー溶液を、ＳＢ−８０６ＨＱ、ＳＢ−８０４ＨＱ、及びＳＢ−８０２．５ＨＱを直列につないだShodex OH Pakカラムを用いてＧＰＣ（ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）において、最初に分別した。分別後、ＧＰＣからの廃水を、直接、ＤＡＷＮ ＤＳＰレーザー光度計に、次いで、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉計屈折計（両器具は、Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA USAから）に流す。特徴付けの間、１００μＬの希釈（１ｍｇ／ｍＬ）溶液（０．１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4及び２００ｐｐｍのＮａＮ3からなる移動相）を、器具に注入し、０．３００ｍＬ／分で流す。ＧＰＣ ＭＡＬＬＳデータを、Wyatt Technologiesから得たＡＳＴＲＡソフトウェアを使用して処理した。合成したポリマーを、モル質量、回転半径及び多分散係数によって全て特徴付けした。
【００５５】
実施例４
ｐＨＥＡコーティングの適用
Albarghouthiらによって示されたプロトコルに従って、マイクロチャネルを、最初に１ＭのＨＣｌ溶液で充填し、１５分間放置した。１ＭのＨＣｌ溶液の除去後、チャンネルを脱イオン水で洗浄し、次いで、ｐＨＥＡコーティング溶液で充填し、１５分間放置した。ｐＨＥＡコーティング溶液は、脱イオン水中のポリマー０．１％ｗ／ｖの水溶液である。コーティングは、１×１０-5ｃｍ2／Ｖｓより小さい電気浸透流を与える経路をもたらす。
【００５６】
実施例５
マイクロチャネル／マイクロチップ電気泳動
ｓｓＭ１３ｍｐ１８シーケンシング断片及びｓｓＤＮＡ ＥＴ−９００ラダー（双方、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ USA）の分析を、ACLARA Biosciences（マウンテンビュー、CA、USA）によって、この研究所のための特注のマイクロチャネル電気泳動システムにおいて行った。このシステムは、レーザーによって誘導された蛍光（ＬＩＦ）によって、感光性多色検出を可能にする。そのシステムは、２つのサブシステムから構成され、電気システムはマイクロ流体装置に電圧を供給し、光学サブシステムは、チャンネル内のポイントに収束させたレーザーを通すことにより、蛍光分子の検出を可能にする。これら２つのサブシステムは、いずれも、LabViewソフトウェアで書き込まれた単一のプログラムを使用してコントロールすることができる。
【００５７】
実施例６
電気システムを、４つの電極の独立した制御を可能にする高圧電源で作動させる。各電極は、０〜４．５ｋＶの間に設定することができるか、回路から切断することができる（「浮遊」）。ソフトウェアによって、ユーザーは、設定された時間の間、全４つの電極の電圧を、所望の電圧設定ポイントに設定することができ、複数の電圧及び時間ステップを、複雑なチップ機能又は種々の分離方法のために、順番に使うことができる。光学サブシステムは、蛍光体がJDS Uniphase Series 221430sl single-line, ４８８ｎｍアルゴンイオンレーザ(San Jose, CA USA)によって励起される共焦、落射蛍光からなる。ミラーは、反転ＴＥ２００、落射蛍光顕微鏡にレーザービームを導くために用いられる。光線を、次いで、帯域フィルターに通し、二色性のミラーで反射され、ニコン１０ｘ／０．４５顕微鏡対物レンズによって、直径約１０μｍのレーザスポットを生じるマイクロ流体チャネルの中央に集束させる。放出された蛍光を、同じ対物レンズによって集束し、二色性ミラー、その後１秒、広帯域フィルター(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)に通過させる。フィルターに通された光のスペクトルは、透過格子によってそれを指向し、高量子効率に集束させることによって測定し、５３２×６４ピクセルの電荷結合素子（ＣＣＤ）を−１５℃に冷却する（浜松社、Brigewater、NJ USA）。ピクセルビンニングを、特定の範囲にわたる放出強度を定量化するためにＣＣＤカメラからのデータに適用し、溶媒のラマン散乱ラインによって較正する。データ収集は、１０〜５０Ｈｚの範囲で達成することができる。ＣＣＤ出力を収集し、ビンニングし、低パスフィルタリングし、LabViewに書き込まれたプログラムを用いて保存した。
【００５８】
実施例７
実験を、Micronit Microfluidics BV（Enschede、オランダ）から購入した、７．５ｃｍ有効分離距離を有する単一チャネルガラスマイクロチップを用いて行った。チャンネルを、最初に１５分間、１ＭのＨＣｌですすぎ、続いて０．１％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液を１５分間充填することによって、ｐＤＭＡ又はｐＨＥＡのいずれかで被覆した。ｓｓＤＮＡの分離及びシーケンシングを、７Ｍの尿素、Ｐｏｐ−５（登録商標）マトリックス(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA USA) 及びベックマンLongRead（登録商標）ＬＰＡマトリクス(Amersham)を含むＴＴＥバッファ（５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＴＡＰＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡ）中、３〜５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で、ｐＤＭＡ（Ｍｗ＝３．４ＭＤａ）及びＬＰＡ（Ｍｗ＝２．５ＭＤａ）マトリックスで行った。各操作のために、２３５Ｖ／ｃｍの電界を、サンプル注入前に６０秒に印加する。また、混合モル質量ｐＤＭＡマトリックスを、１％又は２％の低モル質量ｐＤＭＡ及び３％〜４％の高モル質量ｐＤＭＡで配合した。１００μｍオフセットでオフセットＴインジェクターを用いて、サンプルを１００Ｖ／ｃｍで４０秒間注入した。分離を、サンプル及びサンプル廃棄用ウェルに、３８Ｖ／ｃｍのバックバイアスを印加して、２３５Ｖ／ｃｍで行った。チップを、操作中、５０℃に維持した。ベースコールを、NNIM Basecaller (NNIM, LLC, SaltLake County, UT USA)及びSequencher v 4.0.5(Gene Codes Corp., AnnArbor, MI USA)を用いて完了した。そのようなｐＤＭＡマトリックスは、６〜７分間で、約５００〜約６００塩基のシーケンシング読み取り長をもたらし、一方、市販のマトリックスは、約４００塩基以上のシーケンシングをしない。
【００５９】
実施例８
レオロジー
ゼロ−剪断粘度を、デジタル制御された再循環水浴(Julabo USA Inc., Allentown, PA, USA)に接続されたペルティエコントローラで温度を維持することにより、温度を維持しながら、Anton Paar Physica MCR 300 (Ashland, VA, USA)を用いて測定した。制御された剪断応力及び剪断率掃引を、２５〜５０℃の温度範囲にわたって、コーン−プレート（モデルＣＰ５０−１）装備及びダブルギャップクエット（モデルＤＧ２６．７）装備で実行した。ゼロ−剪断粘度対ポリマー濃度曲線を、この器具を用いて創出した（図２参照）。
【００６０】
実施例９
画像顕微鏡法
ＤＮＡを、ＹＯＹＯ−１(Molecular Probes, Eugene, OR USA)で蛍光標識した。すべてのタンパク質及び糖試薬を、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA USA)から購入し、４８ｋｂｐのｄｓλＤＮＡを、インビトロゲン(San Diego, CA USA)から購入し、ベタメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USAから購入した。標識方法では、ｄｓＤＮＡの５〜１０の塩基対につき約１つの標識を行った。蛍光標識したＤＮＡを観察するために、着色溶液を、溶媒化するために２４時間混合しておいた、カタラーゼ保存液、グルコースオキシダーゼ保存液、ＢＭＥ、２０％のグルコースバッファ及びポリマー溶液に混合した。一晩穏やかに混合した後、ポリマー／ＤＮＡ溶液を、画像化するために準備した。
【００６１】
実施例１０
ＤＮＡを画像化するために用いたハイブリッドチップを、Sylgard 184のポリ（ジメチルシロキサン）(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)マイクロチャネル及び１．５の厚いガラスカバースリップ(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)で構成した。ＰＤＭＡチャネルを、プレポリマー：硬化剤を１０：１の重量比で混合することにより形成した。脱気したScotch Magic Tape（登録商標）の幅狭ストライプ上に注ぎ、一晩真空チャンバで硬化させた。硬化したＰＤＭＡを０．５ｃｍ長の正方形に切断し、カバースリップに取り付けた。得られたチャネルは、約５０〜６０ミクロンの深さであった。
【００６２】
実施例１１
ＤＮＡマイグレーションを、ミシガン大学(Albarghouthi, M. N., Stein, T. M. & Barron, A. E. (2003) Electrophoresis 24: 1166-1175; de Carmejane, O., Yamaguchi, Y., Todorov, T. I.& Morris, M. D. (2001) Electrophoresis 22: 2433-2441)のモリス研究室をモデルする自家製システムを用いて視覚化した。画像処理システムは、ニコンＣＦＩ １００ｘ／Ｎ．Ａ．１．４油浸入顕微鏡対物レンズを装備したニコンＴＥ２００(Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA)反転落射蛍光顕微鏡からなる。ＤＮＡ蛍光を、青色光励起フィルターキューブ(４６０ｎｍ〜５００ｎｍ)(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)で、順次熱吸収フィルターによって集束した１００ワットの水銀灯光源を使って行った。ＤＮＡから放出された蛍光を、０．５インチのＣＣＤ（５１０ｎｍのロングパスフィルタ(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)及びＶＳ４ １８４５ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ３イメージ増倍管(Videoscope International, Dulles, VA USA)によるＴＭ ６７１０ ＣＬカメラ(JAI Pulnix, Sunnyvale, CA USA)で収集した。高速度カメラは、６４８×４８４ピクセルの全空間分解能で、１２０フレーム／秒が可能な可調フレーム速度を有する。全ての画像を、ＸＣＡＰ−ＳＴＤ(EPIX INC, Buffalo Grove, IL USA)ソフトウェアを利用するＰＩＸＣＩ制御盤(EPIX INC., Buffalo Grove, IL USA)によって、直接コンピュータに３０フレーム／秒で取り込んだ。電気泳動電圧を、Micronitから購入した高電圧電源を用いて行った。ポリマーマトリックス中をマイグレートする単一のＤＮＡ分子を、この技術を用いて画像化することができる。
【００６３】
実施例１２
ダイナミックｐＨＥＡポリマーでプレコートしたマイクロチャネルを使って、４％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ−メトキシエチルアクリルアミド）（ｐＮＭＥＡ）ポリマー溶液を、シーケンシングマトリクスとしてチャネルに充填した。７．５ｃｍ長の分離チャネルにおいて、温度を５０℃、電界を２３５Ｖ／ｃｍに設定した場合、５４０塩基のＤＮＡシーケンシング読み取り長が、約６．５分間で９８．５％の精度で達成することができる。ベースコールを、ＮＮＩＭ ベースコーラ及びシーケンサー４．０．５版によって実行した(シーケンシング電気泳動図は図示せず)。
【００６４】
実施例１３
マイクロチップでのシーケンシングＤＮＡに加えて、本発明のポリマーシステム（例えば、ｐＤＭＡマトリックス及びｐＨＥＡダイナミックコーティング）は、ＡＢＩ ３１００市販装置にて、２２ｃｍキャピラリで用いる。全てのシーケンシング操作は、５０℃の温度、２５０Ｖ／ｃｍの電界で行った。市販のＰＯＰ（登録商標）−６マトリクスに対して、生のシーケンシングデータは、４％の混合モル質量のｐＤＭＡ（１％の低モル質量及び３％の高モル質量）が迅速にシーケンスできることを示す。そのようなｐＤＭＡマトリックス分離は、より迅速なシーケンシングがキャピラリ器具で可能であることを示すＰＯＰ（登録商標）−６マトリックスでよりも３倍速い。シーケンシング結果を表４に示す。４％混合モル質量ｐＤＭＡ及びＰＯＰ（登録商標）−６（双方とも４％ｐＨＥＡ被覆キャピラリ）を比較している。分離は、混合モル質量ｐＤＭＡで非常に速い。このマトリックスは、約２２分間で６５０の塩基をシーケンシングした。ベースコールは、ＮＮ１Ｍベースコーラ及びシーケンサー４．０．５版を使って完了させた（４％混合モル質量でのシーケンシング気泳動図は図示せず）。
【００６５】
【表４】
【００６６】
上述した実施例に示したように、６００の塩基までのＤＮＡシーケンシングが、ｐＨＥＡダイナミックコーティングとともにｐＤＭＡマトリクスを用いて６．５分間で示された。この研究のために合成したｐＤＭＡは、市販のマトリックスより非常に良好に機能し、より疎水性のコーティングに関するｐＨＥＡの選択は、読み取り長を拡張するために重要である。一本鎖ＤＮＡ断片は、先のマイクロチャネル研究において使用された代表的なＬＰＡマトリックスよりも、この研究で用いられたｐＤＭＡマトリックスにおいて、より高い移動度を有している。ｐＤＭＡマトリックスは、わずか７．５ｃｍの分離距離において６００の塩基よりも、より長いシーケンシング読み取り長を可能にするという事実は、高速にも貢献する。
【００６７】
レオロジーデータ及び画像顕微鏡研究は、マイグレートするＤＮＡ分子がより頻繁にネットワークを破断するため、わずかに絡み合うｐＤＭＡネットワークが、より絡み合うネットワークよりも、より迅速にシーケンシングを可能にするかもしれないことを示唆する。ネットワーク破断は一般に低分離能につながるが、ＤＮＡはルーズなポリマー鎖をフックすることもでき、引くこともでき、それはＤＮＡ移動度がサイズに依存するＴＥＣメカニズムと類似している。このハイブリッド分離メカニズムが、画像顕微鏡法によって示される一方、ＤＮＡ分離の現在の理論を、同時にこれらのメカニズムに考慮されることはない。
【００６８】
このシステムを最適化することができ、移動度対ＤＮＡサイズの分析は、より長い読み取り長を可能にすることを示唆する。シーケンシングを、１１．５ｃｍ及び１５．９ｃｍのチャンネル長で示した。拡散限定システムと仮定すると、移動時間が線形的に増加しながら、ベースコーラーが塩基を正確にコールすることができる最小限の解像が、チャンネル長の平方根をスケールする。従って、１１．５ｃｍのチャンネルを用いて、１５．９ｃｍのチャンネルが〜１２分間で８００の塩基読みをもたらす一方、このシステムでは、〜９分間で６３０の塩基読み取りまでを実現するために用いることができる。そのような結果は、４％ｐＤＭＡマトリクスのために８５０程度の配向レプテーションへの移行によって加減し、それは、長に依存する移動度を変化させるかもしれず、より短い時間での読み取りが期待されるかもしれない。それでも、より短い時間での長いシーケンシング読み取りを与えるｐＨＥＡダイナミックコーティングとともにｐＤＭＡマトリックス能は、マイクロチップシーケンシングシステムの重要な一歩前進を意味し、シーケンシング技術の次世代の発展を促進する。
【００６９】
本発明のシステム／組成物は、シーケンシング中心又は線形ポリマーマトリックス及びダイナミックポリマーコーティングを用いることができる他のシーケンシング適用に拡張させることができる。電気泳動によるＤＮＡ分離を必要とするような、多くのゲノタイピング及び法医学適用もまた、広範囲にわたるＤＮＡサイズが、例えば、図１Ａで示すようにマトリックス及びコーティングの組合せで、分解することができるため、興味深いかもしれない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式 −[ＣＨ2Ｃ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)ＮＲ’Ｒ”]n−
（式中、ＲはＨ及びメチルから選択され、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ１〜約Ｃ８の直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８の分岐アルキル基及びＣ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換分岐アルキル基及びそれらのコポリマーから選択される）
のポリアクリルアミドを含む疎水性分離マトリクス成分と
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を含む親水性壁コーティング成分とを含有し、
前記ポリアクリルアミドは少なくとも部分的に水溶性である、マイクロチャネル電気泳動用ＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピング組成物。
【請求項２】
マトリクス成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）コポリマーから選択される請求項１の組成物。
【請求項３】
マトリクス成分は、水性媒体中に約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項２の組成物。
【請求項４】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項３の組成物。
【請求項５】
マトリクス成分は、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項３の組成物。
【請求項６】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）成分を含む疎水性分離マトリクス成分と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）成分を含む壁コーティング成分とを含有するシーケンシング組成物。
【請求項７】
マトリクス成分は、水性媒体中に約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項６の組成物。
【請求項８】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及び約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項７の組成物。
【請求項９】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む疎水性分離マトリクス成分と、
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を含む親水性壁コーティング成分と、
内径が約１０ミクロン〜約１５０ミクロンのマイクロ寸法のキャピラリ及び約１０ミクロン〜約１５０ミクロンの範囲のマイクロチャネルを有するマイクロ流体電気泳動チップから選択されるマイクロチャネル基体とを含んでなるＤＮＡ及びＲＮＡ分離用マイクロチャネル電気泳動システム。
【請求項１０】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項９のシステム。
【請求項１１】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体と接触してなる請求項１０のシステム。
【請求項１２】
約３％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）のシステムを含むポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）成分とを含むシステムを準備し、
マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を前記システムに導入し、及び
ＤＮＡシーケンシング反応生成物成分及びＲＮＡ成分から選択される混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、前記システムに接触させることを含む電気泳動ＤＮＡ及びＲＮＡ分離用ポリマー壁コーティング及び分離マトリクスシステムの使用方法。
【請求項１３】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体と接触してなる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）は水性媒体中に存在する請求項１４の方法。
【請求項１６】
システムは、ＤＮＡシーケンシングバッファを含み、前記混合物は、ＤＮＡ分子を含む請求項１２の方法。
【請求項１７】
一本鎖ＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡ配列成分の一つは、約８００までの塩基を含み、前記分離は、時間とマイクロチャネル長の機能である請求項１６の方法。
【請求項１８】
マイクロ寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体と、
その上のポリマーシステムとを含み、
前記システムは、該システムの約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）成分と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）とを含むマイクロチャネル電気泳動装置。
【請求項１９】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項１８の装置。
【請求項２０】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体に適用されてなる請求項１８の装置。
【請求項２１】
マイクロ寸法キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は少なくとも部分的に可溶性であり、
ＤＮＡシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
ＤＮＡ分離速度を早めるためのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の使用方法。
【請求項２２】
分離は、一時的な絡み合い結合及びレプテーションの組み合わせである請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートする請求項２２の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項２２の方法。
【請求項２５】
マトリクスは、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチアクリルアミド）とを含む請求項２２の方法。
【請求項２６】
マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、分子サイズは塩基及び塩基対の１つにおけるものである請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ分子サイズは、約２００塩基〜約８００塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−０．４０〜−０．６０の傾きを有する請求項２６の方法。
【請求項２８】
マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性分離マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は請求項１のポリアクリルアミド、それらのコポリマー、ポリアクリルアミドの組み合わせ、コポリマーの組み合わせ及びポリアクリルアミドといずれかの前記コポリマーとの組み合わせから選択され、該マトリクス成分は、少なくとも部分的に可溶性であり、
ＤＮＡシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリアクリルアミドの分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
ＤＮＡ分離速度を早めるための疎水性ポリマーの使用方法。
【請求項２９】
分離は、一時的な絡み合い結合及びラプテーションの組み合わせである請求項２８の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートする請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項２９の方法。
【請求項３２】
マトリクス成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及びそれらのコポリマーから選択される請求項２８の方法。
【請求項３３】
マトリクスは、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチアクリルアミド）とを含む請求項３１の方法。
【請求項３４】
マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、前記分子サイズは、塩基及び塩基対の１つにおけるものである請求項３３の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ分子サイズは、約２００塩基〜約８００塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−０．４０〜−０．６０の傾きを有する請求項３４の方法。
【請求項１】
式 −[ＣＨ2Ｃ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)ＮＲ’Ｒ”]n−
（式中、ＲはＨ及びメチルから選択され、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ１〜約Ｃ８の直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換直鎖アルキル基、Ｃ１〜約Ｃ８の分岐アルキル基及びＣ１〜約Ｃ８のアルコキシ置換分岐アルキル基及びそれらのコポリマーから選択される）
のポリアクリルアミドを含む疎水性分離マトリクス成分と
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を含む親水性壁コーティング成分とを含有し、
前記ポリアクリルアミドは少なくとも部分的に水溶性である、マイクロチャネル電気泳動用ＤＮＡシーケンシング又はゲノタイピング組成物。
【請求項２】
マトリクス成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）コポリマーから選択される請求項１の組成物。
【請求項３】
マトリクス成分は、水性媒体中に約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項２の組成物。
【請求項４】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項３の組成物。
【請求項５】
マトリクス成分は、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項３の組成物。
【請求項６】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）成分を含む疎水性分離マトリクス成分と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）成分を含む壁コーティング成分とを含有するシーケンシング組成物。
【請求項７】
マトリクス成分は、水性媒体中に約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項６の組成物。
【請求項８】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及び約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む請求項７の組成物。
【請求項９】
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む疎水性分離マトリクス成分と、
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）を含む親水性壁コーティング成分と、
内径が約１０ミクロン〜約１５０ミクロンのマイクロ寸法のキャピラリ及び約１０ミクロン〜約１５０ミクロンの範囲のマイクロチャネルを有するマイクロ流体電気泳動チップから選択されるマイクロチャネル基体とを含んでなるＤＮＡ及びＲＮＡ分離用マイクロチャネル電気泳動システム。
【請求項１０】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項９のシステム。
【請求項１１】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体と接触してなる請求項１０のシステム。
【請求項１２】
約３％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）のシステムを含むポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）成分とを含むシステムを準備し、
マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を前記システムに導入し、及び
ＤＮＡシーケンシング反応生成物成分及びＲＮＡ成分から選択される混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、前記システムに接触させることを含む電気泳動ＤＮＡ及びＲＮＡ分離用ポリマー壁コーティング及び分離マトリクスシステムの使用方法。
【請求項１３】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体と接触してなる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）は水性媒体中に存在する請求項１４の方法。
【請求項１６】
システムは、ＤＮＡシーケンシングバッファを含み、前記混合物は、ＤＮＡ分子を含む請求項１２の方法。
【請求項１７】
一本鎖ＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡ配列成分の一つは、約８００までの塩基を含み、前記分離は、時間とマイクロチャネル長の機能である請求項１６の方法。
【請求項１８】
マイクロ寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体と、
その上のポリマーシステムとを含み、
前記システムは、該システムの約３％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）成分と、ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）とを含むマイクロチャネル電気泳動装置。
【請求項１９】
マトリクス成分は、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）とを含む請求項１８の装置。
【請求項２０】
ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）が基体に適用されてなる請求項１８の装置。
【請求項２１】
マイクロ寸法キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は少なくとも部分的に可溶性であり、
ＤＮＡシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
ＤＮＡ分離速度を早めるためのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の使用方法。
【請求項２２】
分離は、一時的な絡み合い結合及びレプテーションの組み合わせである請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートする請求項２２の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項２２の方法。
【請求項２５】
マトリクスは、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチアクリルアミド）とを含む請求項２２の方法。
【請求項２６】
マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、分子サイズは塩基及び塩基対の１つにおけるものである請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ分子サイズは、約２００塩基〜約８００塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−０．４０〜−０．６０の傾きを有する請求項２６の方法。
【請求項２８】
マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性分離マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は請求項１のポリアクリルアミド、それらのコポリマー、ポリアクリルアミドの組み合わせ、コポリマーの組み合わせ及びポリアクリルアミドといずれかの前記コポリマーとの組み合わせから選択され、該マトリクス成分は、少なくとも部分的に可溶性であり、
ＤＮＡシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリアクリルアミドの分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でＤＮＡ成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
ＤＮＡ分離速度を早めるための疎水性ポリマーの使用方法。
【請求項２９】
分離は、一時的な絡み合い結合及びラプテーションの組み合わせである請求項２８の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ成分は、マイグレーション時間の約５０％の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約５０％のレプテーションによってマイグレートする請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたＤＮＡ分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項２９の方法。
【請求項３２】
マトリクス成分は、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）及びそれらのコポリマーから選択される請求項２８の方法。
【請求項３３】
マトリクスは、約３〜約５ＭＤａの範囲の重量平均モル質量の約３％（ｗ／ｖ）のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）と、約２００〜約３００ｋＤａの範囲の重量平均モル質量の約１％（ｗ／ｖ）〜約２％のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチアクリルアミド）とを含む請求項３１の方法。
【請求項３４】
マイグレーションは、ＤＮＡ電気泳動移動度対マトリクスにわたるＤＮＡ分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、前記分子サイズは、塩基及び塩基対の１つにおけるものである請求項３３の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ分子サイズは、約２００塩基〜約８００塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−０．４０〜−０．６０の傾きを有する請求項３４の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５１３９９０（Ｐ２００９−５１３９９０Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３９０５８（Ｐ２００８−５３９０５８）
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２９６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３７６９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５９６０５７８９３）ノースウエスタン ユニバーシティ (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２９６４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３７６９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５９６０５７８９３）ノースウエスタン ユニバーシティ (35)
【Ｆターム（参考）】
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