マウスのＳＣＵＲＦＹの表現型を引き起こす遺伝子およびそのヒトのオルソログの同定
【課題】Ｆｋｈsfをコードする単離された核酸分子およびその変異形態を提供すること。
【解決手段】本発明によって、上記課題が解決された。本発明にしたがって、Ｆｋｈsfをコードする単離された核酸分子およびその変異形態が提供される。このような核酸分子の発現のために適切な発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。本明細書中で開示される核酸配列（およびその変異体形態）に基づくアッセイを利用して、免疫系を調節する多数の分子が同定され得る。
【解決手段】本発明によって、上記課題が解決された。本発明にしたがって、Ｆｋｈsfをコードする単離された核酸分子およびその変異形態が提供される。このような核酸分子の発現のために適切な発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。本明細書中で開示される核酸配列（およびその変異体形態）に基づくアッセイを利用して、免疫系を調節する多数の分子が同定され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、ならびにより詳細には、ｓｃｕｒｆｙ関連疾患を診断するために有用な方法および組成物に関し、そして、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
マウスの免疫系に影響を与える遺伝した変異は、免疫系の調節に対して重要な新規の遺伝子の豊富な供給源であることが証明されており、そしてヒトの免疫学的な障害の重要な動物モデルを提供した。これらとしては、ｘｉｄ（Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症のマウスの等価物）（非特許文献１および２）、ｂｅｉｇｅ（チェディアック‐東症候群の等価物）（Ｂａｒｂｏｓａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：２６２、１９９６）、ｌｐｒおよびｇｌｄ（ｆａｓおよびｆａｓリガンドの欠損）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｓｕｇａｍｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１７９、１９９６）、および造血細胞ホスファターゼ変異体ｍｏｔｈｅａｔｅｎ（ＳＨＰ−１）（ＢｉｇｎｏｎおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、７３：１６８、１９９４）が挙げられる。
【０００３】
特定の目的の１つのマウスの変異体は、いまだなおクローン化されていないＸ連鎖マウス変異体、ｓｃｕｒｆｙ（ｓｆ）である。簡潔には、ｓｃｕｒｆｙ変異について半接合性のマウスは、重篤なリンパ増殖障害を示す。詳細には、ｓｃｕｒｆｙ変異について半接合性の雌性（Ｘsf／Ｙ）は、リンパ節、脾臓、肝臓、および皮膚の進行性のリンパ球浸潤を発症し、それによって巨脾腫、肝腫、大いに肥大したリンパ節、矮小、離脱性皮膚炎、および厚くなった奇形の耳を含む、肉眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８、１９９１）。他の臨床的な症状としては、増大した白血球数、高ガンマグロブリン血症、および重篤な貧血が挙げられる（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０）；罹患した雄性の死亡は、通常は３週齢までに生じる。ｓｆ遺伝子座は、Ｘ染色体の極めて近位の領域に、ｓｐａｒｓｅ−ｆｕｒ（ｓｐｆ）（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０；Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ５：６５２、１９９４）（それ自体が、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Ｏｔｃ）内の点変異（Ｖｅｒｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：４１５、１９８７））についての遺伝子座からおよそ０．７センチモルガンに、マップされている。ｓｆ遺伝子座はまた、マウスのＧａｔａ１、Ｔｃｆｅ３、およびＷａｓｐ遺伝子座と密接に連鎖している（Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ５：６５２、１９９４；Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：４７１、１９９５）。ｓｃｕｒｆｙおよびヒトのＷｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群（ＷＡＳ）との間の類似性が報告されており（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、２４３３、１９９０）、そしてマウスのＷａｓｐ遺伝子が、ｓｃｕｒｆｙについての候補として提案されている（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０；Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：４７１、１９９５）。より最近の生物学的な実験は、ＷＡＳとｓｃｕｒｆｙとの間の有意な差異を明らかにするが、しかし、この２つの遺伝子座は、対立遺伝子ではないことが実証されている（ＪｅｆｆｅｒｙおよびＢｒｕｎｋｏｗ、公開されていないデータ）。従って、出願人らの発明の以前には、ｓｃｕｒｆｙ遺伝子の正体は、未決定のままであった。
本発明は、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患の診断のために有用な方法および組成物、ならびに、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法を開示し、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：３５５、１９９３
【非特許文献２】Ｒａｗｌｉｎｇｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：３５８、１９９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
（項目１） Ｆｋｈｓｆをコードする、単離された核酸分子。
（項目２） 前記ＦｋｈｓｆがマウスのＦｋｈｓｆである、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３） 前記ＦｋｈｓｆがヒトのＦＫＨｓｆである、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４） 前記核酸分子が、（ａ）配列番号２または４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子、
からなる群より選択される、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目５） 前記核酸分子が配列番号２のアミノ酸配列をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目６） 前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目５に記載の単離された核酸分子。
（項目７） 項目１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
（項目８） 前記ベクターがウイルスベクターである、項目７に記載のベクター。
（項目９） 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルスからなる群より選択されるウイルスから生成される、項目８に記載のベクター。
（項目１０） 項目１に記載の単離された核酸分子およびプロモーターを含む発現ベクターであって、ここで、該プロモーターが該核酸分子と作動可能に連結されている、発現ベクター。
（項目１１） 項目１０に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
（項目１２） Ｆｋｈｓｆタンパク質を調製するために項目１０に記載の発現ベクターを使用する方法であって、該方法が以下の工程：
（ａ）該発現ベクターを含み、そして該タンパク質を産生する、組換え宿主細胞を培養する工程、および
（ｂ）該培養した組換え宿主細胞から該タンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
（項目１３） 項目１から６のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１４） 項目１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
（項目１５） 前記抗体が、以下：
（ａ）ポリクローナル抗体、
（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、および
（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、
からなる群より選択される、項目１３に記載の抗体。
（項目１６） 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目１４に記載の抗体フラグメント。
（項目１７） 項目１３に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
（項目１８） 被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈｓｆ核酸配列の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブと、（ｉ）該生物学的サンプルから単離した試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成した核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該プローブが、項目１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する、工程、および
（ｂ）該核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１９） 前記試験核酸分子が、ＲＴ−ＰＣＲによって得られる、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 生物学的サンプル中のＦｋｈｓｆまたはその変異形態の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体フラグメントと接触させる工程であって、ここで、該接触工程が、該生物学的サンプルに対する該抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる、工程、および
（ｂ）任意の該結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２１） 前記抗体または前記抗体フラグメントが、以下：
（ａ）ポリクローナル抗体、
（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、
（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、および
（ｅ）（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）から誘導される抗体フラグメント、
からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２３） 前記抗体または前記抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生体発光標識、およびコロイド状の金からなる群より選択される検出可能な標識をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４） 項目１に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、単離されたオリゴヌクレオチド。
（項目２５） 検出可能な標識をさらに含む、項目２４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６） 動物に対して項目１に記載のＦｋｈｓｆ核酸分子を投与する工程を包含する、動物に対してＦｋｈｓｆ核酸分子を導入する方法。
（項目２７） 前記核酸分子がウイルスベクターによって発現される、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記核酸分子がプラスミドベクターによって発現される、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 前記核酸分子がインビボで動物に投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記核酸分子がエキソビボで細胞に投与され、次いで該細胞が前記動物に投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３１） 前記細胞が造血細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３２） 前記造血細胞がＴ細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３３） 前記動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３４） その細胞がＦｋｈｓｆタンパク質をコードする配列を含むトランスジーンを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物。
本発明は、一般的には、変異した場合に、重大なリンパ増殖障害を生じる新規の遺伝子の発見に関する。詳細には、変異マウス（「Ｓｃｕｒｆｙ」と命名された）が、戻し交配分析、物理的なマッピング、および大規模なＤＮＡの配列決定を通じたこの障害の原因遺伝子の同定のために使用された。この遺伝子の配列の分析は、この遺伝子が、関連の遺伝子ファミリー（全てが、翼状（ｗｉｎｇｅｄ）へリックスＤＮＡ結合ドメインを含有する）に属することを、示した。
【０００６】
従って、本発明の１つの局面においては、ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfをコードする単離された核酸分子（それらの変異形態を含む）が提供される。特定の実施態様においては、任意の型のＦｋｈsfは、温血動物（例えば、マウスまたはヒト）に由来し得る。さらなる実施態様においては、単離された核酸分子が提供され、ここで、この核酸分子は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号２または配列番号４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその相補物を有する核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子。好ましくは、核酸分子は、ＪＭ２ではない。関連する局面においては、ベクター（発現ベクターを含む）および組換え宿主細胞、ならびに上記の核酸分子によってコードされるタンパク質もまた、提供される。さらに、別のタンパク質のコード領域と上記の核酸分子の少なくとも一部とを組み合わせた融合タンパク質もまた、提供される。上記の配列に基づくオリゴヌクレオチドフラグメント（プローブおよびプライマーを含む）もまた、提供される。このようなフラグメントは、少なくとも８、１０、１２、１５、２０、または２５ヌクレオチド長であり、そして１００、２００、５００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド長にまで及び得る。
【０００７】
他の局面においては、Ｆｋｈsfタンパク質（任意の型）を産生するために上記の発現ベクターを使用する方法が提供される。この方法は、（ａ）この発現ベクターを含みそしてＦｋｈsfタンパク質を産生する組換え宿主細胞を培養する工程、および（ｂ）培養した組換え宿主細胞からタンパク質を単離する工程、という一般的な工程を包含する。
【０００８】
Ｆｋｈsfタンパク質に特異的に結合する抗体および抗体フラグメントもまた、提供される。このような抗体の代表的な例としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（マウスのハイブリドーマから得られたかまたはヒトの形態に誘導されたかにはかかわらず）の両方が挙げられる。抗体フラグメントの代表的な例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットまたは相補性決定領域が挙げられる。
【０００９】
なお他の局面においては、被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈsf核酸配列の存在を検出するための方法が、提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Ｆｋｈsf特異的核酸プローブと、（ｉ）上記の生物学的サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（ここで、上記のプローブは、請求項１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。
【００１０】
別の関連する実施態様においては、生物学的サンプル中の、Ｆｋｈsfまたはその変異形態の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈsf抗体または抗体フラグメントと接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、上記の生物学的サンプルに対する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる）、および（ｂ）任意の上記の結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程。
【００１１】
本発明の他の局面においては、動物に対してＦｋｈsf核酸分子を導入する方法が提供される。この方法は、動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス）に対して、本明細書中に記載されているようなＦｋｈsf核酸分子を投与する工程を包含する。１つの実施態様においては、核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはアルファウイルスから少なくとも一部生成されたベクター）中に含まれ、そしてそれによって発現される。別の実施態様においては、核酸分子は、プラスミドベクターによって発現されるか、またはその中に含まれる。このようなベクターは、インビボまたはエキソビボのいずれかで、（例えば、Ｔ細胞のような造血細胞に）投与され得る。
【００１２】
他の実施態様においては、ヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。ここで、この動物の細胞は、Ｆｋｈsfタンパク質をコードする配列を含むトランスジーンを発現する。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示されており、そしてそれゆえそれらの全体が、参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１は、マウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。
【図１Ｂ】図１は、マウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。
【図２】図２は、マウスのＦｋｈsfのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。
【図３Ｂ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。
【図４】図４は、ヒトのＦＫＨsfタンパク質の４３１アミノ酸の配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５は、ＦＫＨsfトランスジェニックマウスの生成のためのベクターを模式的に示す。
【図６】図６は、ＦＫＨsfトランスジーンが、ｓｃｕｒｆｙ動物における欠損を修復することを示す写真である。
【図７】図７は、ＦＫＨsf ｔｇマウスが、正常な細胞と比較して、減少したリンパ節細胞を有することを示すグラフである。
【図８】図８は、ＦＫＨsfトランスジェニックマウスがインビトロでの刺激にほとんど応答しないことを示すグラフである。
【図９】図９は、ＦＫＨsfとＪＭ２とのｃＤＮＡの比較である。
【図１０】図１０は、ヒトのＦＫＨsfとマウスのＦｋｈsfとの種々の領域における相同性を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示すこと、および本明細書中で以降に使用される略号を列挙しそしてそれらを定義することは、本発明の理解に役立ち得る。
【００１５】
「Ｓｃｕｒｆｙ」は、重篤なリンパ増殖障害を示すマウスにおける遺伝した疾患をいう（例えば、Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０を参照のこと）。原因遺伝子（その変異形態が、この疾患の原因である）を、配列番号１および３に示す。
【００１６】
「分子」は、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナー、所望される結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、およびＰＮＡのような核酸アナログ）、および有機化合物または無機化合物を含むと理解されるはずである。
【００１７】
「核酸」または「核酸分子」は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、ならびに任意の連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントをいう。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、または天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）であるモノマー、あるいは両方の組み合わせから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分、および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分において修飾を有し得る。糖の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、または糖はエーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに、全体的な糖部分は、立体構造的に、および電気的に類似の構造（例えば、アザ糖、および炭素環式糖アナログ）で置きかえられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸のモノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含む。これは、ポリアミド骨格に対して結合した、天然に存在するかまたは修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００１８】
「単離された核酸分子」は、生物体のゲノムＤＮＡ中には組み込まれていない核酸分子である。例えば、真核生物細胞のゲノムＤＮＡから分離されている遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物体のゲノム中には組み込まれていない、化学的に合成された核酸分子である。
【００１９】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’領域中に配置される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合は、転写速度は、誘導剤に応答して増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合は、転写の速度は、誘導剤によっては調節されない。
【００２０】
「ベクター」は、所望されるタンパク質の発現を指向し得るアセンブリをいう。ベクターは、目的の遺伝子に対して作動可能に連結された転写プロモーターエレメントを含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、またはこの２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、他の遺伝的なエレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択マーカー）もまた、本明細書中に記載されているベクター中に取りこまれ得る。
【００２１】
「単離された」は、タンパク質またはポリペプチドの場合においては、他の生物学的巨大分子の実質的非存在下に存在し、そしてクマシーブルー染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に名目上単一のバンドとして出現する分子をいう。「単離された」は、有機分子について言及する場合は、その化合物が、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して９０％よりも純粋であることを意味する。
【００２２】
「クローニングベクター」は、宿主細胞中で自律複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージのような核酸分子をいう。クローニングベクターは、代表的には、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ここでは、外来のヌクレオチド配列が、ベクターの本質的な生物学的な機能の損失を伴わずに、決定可能な様式で挿入され得る）およびクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子としては、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が挙げられる。
【００２３】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子をいう。代表的には、遺伝子の発現は、プロモーターの制御下に配置され、そして必要に応じて、少なくとも１つの調節エレメントの制御下に配置される。このような遺伝子は、プロモーター「に対して作動可能に連結された」といわれる。同様に、調節エレメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節する場合は、作動可能に連結される。
【００２４】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中のクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作されている、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
【００２５】
真核生物においては、ＲＭＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを産生するように、構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型を含むように設計され得、ここで、ＲＮＡ転写物は、特異的なｍＲＮＡの配列に対して相補的である配列を有する。このＲＮＡ転写物は、「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合し得、それによってｍＲＮＡの翻訳の阻害を生じる。
【００２６】
「Ｆｋｈsfに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈsfアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成し得るか、または（ｂ）ｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。同様に、「Ｆｋｈsfに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈsfアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）Ｆｋｈsf遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成し得るか、または（ｂ）Ｆｋｈsf遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
「リボザイム」は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
【００２８】
略号：ＹＡＣ、酵母人工染色体；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して最初の工程でＲＮＡが最初にＤＮＡに転写されるＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ、ＤＮＡ形態にＲＮＡ配列をコピーすることによって作成される、任意のＤＮＡ。本明細書中で利用される場合は、「Ｆｋｈsf」は、（この遺伝子が、ヒト、哺乳動物、または任意の他の温血動物から得られたかどうかにはかかわらず）Ｆｋｈsf遺伝子の遺伝子産物をいう。「ＦＫＨsf」と大文字になっている場合は、この遺伝子産物（および遺伝子）は、ヒトに由来すると理解されるべきである。
【００２９】
上記のように、本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、そしてより詳細には、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患を診断するために有用な方法および組成物、ならびに免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。
【００３０】
従って、以下により詳細に議論されるように、この発見は、免疫系のアゴニストまたは、あるいはアンタゴニストとして作用し得る分子を選択するために利用され得るアッセイの開発を導いた。さらに、このようなアッセイは、免疫系を調節することにおいて同様に活性である、他の遺伝子および遺伝子産物を同定するために利用され得る。
【００３１】
（ＳＣＵＲＦＹ） 簡潔には、本発明は、Ｆｋｈsfをコードする遺伝子における変異が稀な状態（ｓｃｕｒｆｙ）を生じるという予想外の発見に基づく。この状態は、リンパ節、脾臓、肝臓、および皮膚の進行性のリンパ球浸潤によって特徴付けられ、それによって巨脾腫、肝腫、大いに肥大したリンパ節、矮小、脱離性皮膚炎、および厚くなった奇形の耳を含む、肉眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５５２８、１９９１）。この翼状ヘリックスのファミリーの新規のメンバーは、免疫系の新規の成分を示す。
【００３２】
ｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子を発見するために利用された方法は、以下の実施例１に提供される。マウスのｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子、およびヒトのオルソログをクローニングするための方法は、実施例２および３において以下に提供される。トランスジェニックマウスを使用して決定されるような、遺伝子の正体および遺伝子機能との相関の確認のための方法もまた、実施例において提供される。
【００３３】
Ｆｋｈsf遺伝子および遺伝子産物の存在を決定するための方法もまた、本発明によって提供される。１つの実施態様においては、このような方法は、以下の一般的な工程を包含する：（ａ）Ｆｋｈsf特異的核酸プローブと、（ｉ）生物学的サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（ここで、プローブは、Ｆｋｈsfのヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。種々の方法（例えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２、１９８８；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：４０１−４０２、１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．３５（９）：１８２６−１８３１、１９８９；米国特許第４，７８６，６００号を参照のこと）、およびポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を利用する核酸の増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと）、逆転写酵素ＰＣＲおよびＣＰＴ（米国特許第４，８７６，１８７号および同第５，０１１，７６９号を参照のこと）を含む）が、選択された配列を増幅するために利用され得る。
【００３４】
あるいは、抗体は、Ｆｋｈsf遺伝子産物の存在を検出するために利用され得る。より詳細には、１つの実施態様においては、生物学的サンプル中のＦｋｈsfペプチドまたはその変異体形態の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）抗Ｆｋｈsf抗体または抗体フラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、生物学的サンプルに対する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる）、および（ｂ）任意の結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程。
【００３５】
このような方法は、例えば、向流免疫電気泳動（Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＩＥＰ）、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイを含む、広範な種々のアッセイ形式において達成され得る（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、前出もまた参照のこと）。
【００３６】
（核酸分子、タンパク質、およびタンパク質の産生方法） 種々のＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのタンパク質および核酸分子（またはその一部）が本明細書中で提供されているが、本発明の状況においては、１つ以上のこれらのタンパク質に関する言及は、実質的に類似の活性のタンパク質を含むと理解されるべきであると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合は、タンパク質は、（ａ）これらがこのタンパク質をコードする遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列（例えば、この配列の一部、またはこの配列の対立遺伝子改変体を含む）によってコードされる；（ｂ）このヌクレオチド配列が、中程度、高い、または非常に高いストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）の下で本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションし得るか、または本明細書中で開示されている配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれより高い相同性を有する；あるいは（ｃ）このＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）において定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮重している場合に、「実質的に類似」であると考えられる。さらに、本明細書中で開示されている核酸分子は、配列が、他の点では本明細書中に示される基準を満たす限りは、相補配列および非相補配列の両方を含む。本発明の状況においては、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、またはそれに等価なもの）を意味する。ハイブリダイゼーションの目的のためには、アミノ末端ドメイン、ジンクフィンガードメイン、中央ドメイン、またはフォークヘッドドメイン（実施例１０を参照のこと）をコードする核酸分子が、利用され得る。
【００３７】
本明細書中に記載されている核酸分子によってコードされるタンパク質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ遺伝子またはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の疎水性プロット関数を使用して、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２、１９８２）によって記載されている方法に従って、一次翻訳産物から推定され得る。
【００３８】
本発明のタンパク質は、酸の塩もしくは塩基の塩の形態で、または中性の形態で、調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸の配列に対して行われ得、その正味の影響は、変異体または野生型のタンパク質の生物学的な活性を維持するか、またはさらに増強もしくは減少させる。さらに、遺伝コードの縮重に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列におけるかなりのバリエーションが存在し得る。
【００３９】
本明細書中に開示されているタンパク質の他の誘導体としては、他のタンパク質またはポリペプチドとのタンパク質の結合体が挙げられる。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を容易にするために付加され得る、Ｎ末端融合タンパク質またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと、また、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８をもまた参照のこと）。あるいは、融合タンパク質（例えば、ＦＫＨもしくはＦｋｈ−ルシフェラーゼ、またはＦＫＨもしくはＦｋｈ−ＧＦＰ）が、タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために構築され得る。
【００４０】
本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されている広範な種々の技術を使用して構築され得る。さらに、変異は、天然の配列のフラグメントに対する連結を可能にする制限部位に隣接した、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【００４１】
あるいは、オリゴヌクレオチドによって指向される部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順が、要求される置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供するために使用され得る。上記に示される変更を作成する例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３、１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３、１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８５年１月、１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８１）：およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって開示されている。タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体（例えば、可溶性の細胞外部分）もまた、所望される欠失に対して隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、構築され得る。制限消化に続いて、突出がフィルインされ得、そしてＤＮＡが再連結され得る。上記に示される変更を作成する例示的な方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）によって開示されている。
【００４２】
本発明の核酸分子中に作成される変異は、好ましくは、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、変異は、好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳に有害な影響を与える二次的なｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生じるようにハイブリダイズし得る相補性領域を作成しない。変異部位は予め決定され得るが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位で変異体の最適の特徴について選択するためには、ランダムな変異誘発が標的のコドンで行われ得、そして発現された変異体が表示生物学的活性についてスクリーニングされ得る。あるいは、変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣接した変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。変異は、タンパク質の活性を保存するかもしくは増大させる、またはタンパク質（例えば、変異体Ｆｋｈ）を減少させるかもしくは不能にする目的のために導入され得る。
【００４３】
本発明のタンパク質をコードする核酸分子もまた、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発の技術（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６、１９８６）を利用して、ヌクレオチドの誤った取りこみを強制することによって（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ、Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１、１９９０）、またはランダムに変異誘発したオリゴヌクレオチドの使用によって（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７、１９８９）、構築され得る。
【００４４】
本発明はまた、上記に記載されている遺伝子を発現し得るベクターを含有する宿主細胞を培養することによって、上記に記載されている遺伝子の操作および発現を提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに対して作動可能に連結された所望のタンパク質をコードする、合成核酸分子またはｃＤＮＡから誘導される核酸分子のいずれかを含む。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または植物の遺伝子を含む種々の供給源から誘導され得る。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、以下が挙げられる：転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、およびリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）。
【００４５】
上記に記載されている任意のタンパク質をコードする核酸分子は、細菌、哺乳動物、酵母もしくは他の真菌、ウイルス、または植物細胞を含む、広範な種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞によって容易に発現され得る。このような細胞を外来ＤＮＡを発現するように形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと；植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０４：１０６７−１０７１、１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。
【００４６】
本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、ＤＨ５αが挙げられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００４７】
細菌の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で機能するプロモーター、１つ以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８を参照のこと）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロモーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５、１９８３）、およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ２０：２３１、１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドが、当該分野で周知であり、中でも、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７、１９８３、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８、１９８２を参照のこと）、ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００４８】
本発明を実行するために適切な酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種々の種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）が挙げられる。酵母および真菌についての適切な発現ベクターとしては、中でも、酵母についてはＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ第３７４１９号）、およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９、１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ ８：１２１−１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０８、１９７８）およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
酵母中での使用に好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４、１９８２）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１、１９８３）が挙げられる。真菌ベクターについての有用なプロモーターの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ解糖遺伝子に由来するプロモーター（例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９、１９８５）が挙げられる。発現ユニットはまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書、１９８５）。
【００５０】
細菌のベクターを用いる場合は、酵母のベクターは、一般的には、表現型アッセイが存在して形質転換体が選択されることを可能にする優性表現型を示す任意の数の遺伝子の１つであり得る、選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補するか、抗生物質耐性を提供するか、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするものであり、そしてｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら、同書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ８：１７、１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）を含む。別の適切な選択マーカーは、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を付与する、ｃａｔ遺伝子である。
【００５１】
真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−１６９、１９８３）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって相補される遺伝的な欠損を含み得る。特定の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００５２】
酵母を形質転換するためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを用いた酵母スフェロプラストの調製によるか（Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）、またはＬｉＣｌのようなアルカリ塩での処理による（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３、１９８３を参照のこと）かのいずれかによって、容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９、１９８７）によって記載されているようにポリエチレングリコールを使用して行われ得る。
【００５３】
ウイルスベクターとしては、上記に記載されているような所望のタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターが挙げられる。以下を含む広範な種々のプロモーターが、本発明の状況において利用され得る：例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、Ｈｅｒｐｅｓ ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス即時後期プロモーターのようなプロモーター。本発明の特定の好ましい実施態様においては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである（例えば、第ＷＯ９１／０２８０５号；第ＥＰ ０，４１５，７３１号；および第ＷＯ９０／０７９３６号を参照のこと）。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子βプロモーター、ヒトα１−キマエリン（ｃｈｉｍａｅｒｉｎ）プロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンＩＩプロモーターが挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーターおよびＨＩＶプロモーターのような他のプロモーターを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌、または寄生生物（例えば、マラリア）特異的プロモーター）が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染した特異的な細胞または組織を標的化するために利用され得る。
【００５４】
本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞としては、中でも以下が挙げられる：ＰＣ１２（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７２１号）、Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５アドレナリン作動性神経芽細胞腫、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスコリン作用性細胞株、またはラットのＦ２後根神経節株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５０号または同第１６５１号）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ ６２８１号；ＢＨＫ５７０細胞株（登録番号第ＣＲＬ１０３１４号のもとで、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された））、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ６１号）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＣＬ２号）、２９３（ＡＴＣＣ第１５７３号；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２、１９７７）、およびＮＳ−１細胞。以下を含む他の哺乳動物細胞株が、本発明において使用され得る：ラットのＨｅｐ１（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６００号）、ラットのＨｅｐＩＩ（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５４８号）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ１３９号）、ヒトの肺（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ７５．１号）、ヒトの肝ガン（ＡＴＣＣ第ＨＴＢ−５２号）、Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ第ＨＢ８０６５号）、マウスの肝臓（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ２９．１号）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ９．１号）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ第１５８１号）、ＨＩＴ−Ｔ１５（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７７７号）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ第Ｔｉｂ １５２号）、およびＲＩＮｍ ５ＡＨＴ2Ｂ（ＯｒｓｋｏｖおよびＮｉｅｌｓｅｎ、ＦＥＢＳ ２２
９（１）：１７５−１７８、１９８８）。
【００５５】
本発明を実行することにおける使用のための哺乳動物の発現ベクターとしては、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性のプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）、サイトメガロウイルス即時後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞性のプロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）、マウスＶKプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７０４１−７０４５、１９８３）；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８７）、およびマウスＶHプロモ
ーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３、１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部、所望される発現のレベル、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存する。
【００５６】
このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流、および目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置された、ＲＮＡスプライス部位のセットを含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の下流に配置されたポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５ Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０、１９８１）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に配置された、アデノウイルス２ 三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｌｅ）リーダーのような、非コードウイルスリーダー配列を含み得る。好ましいベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列を含み得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスのＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含み得る。適切な発現ベクターは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得ることができる。
【００５７】
クローン化されたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７）によって、培養された哺乳動物細胞中に導入され得る。クローン化されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが一般的には、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞中に導入される。培養された哺乳動物細胞における使用に好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。他の選択マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＢＦＰ（青色蛍光タンパク質））が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。適切なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ、これは、本明細書中で参考として援用されている）によって概説されている。
【００５８】
適切なベクターを含有する哺乳動物細胞は、目的のＤＮＡ配列（単数または複数）の発現を開始するために、一定の期間（代表的には、１〜２日間）増殖させることが可能である。次いで、薬物選択が、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされている細胞については、薬物濃度が、クローン化された配列の増大したコピー数について選択するために、段階的な様式で増大させられ得、それによって発現レベルを増大させる。導入された配列を発現する細胞が選択され、そして所望の形態または所望のレベルでの目的のタンパク質の産生についてスクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローン化され得、そして産生のためにスケールアップされ得る。細胞はまた、フローサイトメーターを使用してＧＦＰ陽性細胞について分類することによって、それらのＧＦＰ発現に基づいて、トランスフェクションについて選択され得る。
【００５９】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法としては、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、アデノウイルス、およびプロトプラスト融合によって媒介されるトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。裸のベクター構築物もまた、筋肉細胞または他の適切な細胞によって取りこまれ得、続いて、哺乳動物（または他の動物）の筋肉中に注射され得る。
【００６０】
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用が、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４、１９９０）によって概説されている。
【００６１】
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明において有用であり得る。例えば、植物細胞中での遺伝子の発現のためのベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用が、Ｓｉｎｋａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８、１９８７）によって概説されている。
【００６２】
本発明の関連する局面においては、所望のタンパク質をコードし、そして遺伝子の発現に有効なプロモーターに対して作動可能に連結されている遺伝子をその生殖細胞および体細胞が含むトランスジェニック動物中で本発明のタンパク質は発現され得る。あるいは、類似の様式においては、所望の遺伝子を欠失しているトランスジェニック動物が、調製され得る（例えば、「ノックアウト」マウス）。このようなトランスジェニックは、ヒト以外の種々の動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタを含む）において調製され得る（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３、１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２、１９８５、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ、Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５、１９８５、ならびに米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５，３８４号を参照のこと）。簡潔には、発現される核酸分子を、適切に配置された発現制御配列とともに含む発現ベクターは、例えば、マイクロインジェクションによって、受精卵の前核中に導入される。注入されたＤＮＡの組込みは、組織サンプルから、ＤＮＡのブロット分析によって検出される。導入されたＤＮＡが、動物の生殖列系中に取りこまれ、その結果、その動物の子孫に伝達されることが、好ましい。組織特異的な発現は、組織特異的プロモーターの使用を通じて、またはトランスジーンの調節された発現を可能にする誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、同書））の使用を通じて、達成され得る。
【００６３】
天然に存在するｓｃｕｒｆｙ変異体（「ｓｆ」）以外のＦｋｈsfの変異体形態を産生するか、または天然に存在する変異体とは異なる遺伝的なバックグラウンドにある動物は、本明細書中に提供される開示を考慮して容易に産生され得る。
【００６４】
タンパク質は、数ある方法の中でも、本発明の組換え翻訳産物を産生するために適切な宿主およびベクターシステムを培養することによって単離され得る。次いで、このような細胞株に由来する上清、またはタンパク質が上清中には分泌されない場合はタンパク質封入物もしくは細胞全体が、所望のタンパク質を単離するために種々の精製手順によって処理され得る。例えば、上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮され得る。濃縮後、濃縮物は、適切な精製マトリックス（例えば、適切な支持体に結合させられた抗タンパク質抗体のような）に対して適用され得る。あるいは、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために使用され得る。さらに別のものとしては、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、タンパク質をさらに精製するために使用され得る。本発明のタンパク質を単離する他の方法は、当該分野で周知である。
【００６５】
タンパク質は、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、続いてクマシーブルーでの染色によって検出されない場合は、本発明の状況において「単離された」と考えられる。他の実施態様においては、所望されるタンパク質は、従って、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＡＧＥ分析、続いて銀染色によって検出されないように、単離され得る。
【００６６】
（免疫系を調節する分子を選択するためのアッセイ） 上記のように、本発明は、免疫系を調節し得る分子を選択および／または単離するための方法を提供する。適切なアッセイの代表的な例としては、酵母および哺乳動物の２−ハイブリッドシステム（例えば、Ｄａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９５４、１９９１；Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７９５８、１９９２）、ＤＮＡ結合アッセイ、アンチセンスアッセイ、伝統的なタンパク質結合アッセイ（例えば、125Ｉまたは時間消散蛍光を利用する）、ゲル電気泳動と組み合わせた免疫沈降、および直接的なタンパク質配列決定、Ｆｋｈsfによって調節される遺伝子の転写分析、サイトカイン産生、ならびに増殖アッセイが挙げられる。
【００６７】
例えば、１つの実施態様においては、Ｆｋｈsfと直接相互作用するタンパク質は、酵母の２−ハイブリッド結合システム（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、同第５，６１０，０１５号、および同第５，６６７，９７３号を参照のこと）のようなアッセイによって検出され得る。簡潔には、２−ハイブリッドシステムにおいては、ＤＮＡ−結合ドメイン−Ｆｋｈsfタンパク質の融合体（例えば、ＧＡＬ４−Ｆｋｈsf融合体）が構築され、そして選択マーカー遺伝子に連結されたＧＡＬ４結合部位を含む細胞中にトランスフェクトされる。全Ｆｋｈsfタンパク質またはＦｋｈsfのサブ領域が、使用され得る。ＧＡＬ４活性化ドメインに対して融合されたｃＤＮＡのライブラリーもまた、構築され、そして同時トランスフェクトされる、ｃＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化ドメイン融合体中のｃＤＮＡがＦｋｈsfと相互作用するタンパク質をコードする場合は、選択マーカーが発現される、次いで、ｃＤＮＡを含有する細胞が増殖させられ、構築物が単離され、そして特徴付けられる。他のアッセイもまた、相互作用するタンパク質を同定するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、同時免疫沈降、インビトロでの転写／翻訳分析などが挙げられる。
【００６８】
本発明の別の局面においては、選択された分子が免疫系を調節し得るかどうかを決定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＦｋｈsfまたはＦｋｈsfの変異体を発現する細胞に対して選択された候補分子を曝露する工程、および（ｂ）この分子がＦｋｈsfの活性を調節するかどうかを決定する工程、およびそれによって上記の分子が免疫系を調節するかどうかを決定する工程。このような試験のための細胞は、（ａ）正常なリンパ球、（ｂ）ＦＫＨsf（もしくはＦｋｈsf）タンパク質（またはその変異形態）を過剰発現するように操作された細胞株、あるいは（ｃ）上記のタンパク質を発現するように操作されたトランスジェニック動物に由来し得る。このようなトランスジェニックマウスに由来する細胞は、減少した細胞数および種々の刺激に対する減少した応答性を含む、低応答性（ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）状態によって、一部特徴付けられる（例えば、実施例８）。
【００６９】
本明細書中に記載されている方法は、個々の試験分子の分析を言及し得るが、本発明がそのようには限定されるべきでないことが、注意されるべきである。特に、選択された分子は、化合物の混合物中に含まれ得る。従って、記載されている方法は、さらに、所望される分子を単離する工程を包含し得る。さらに、候補分子が、多数のパラメーター（例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生などを含む）によって、免疫系を調節するそれらの能力について評価され得る。
【００７０】
（候補分子）
広範な種々の分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。より詳細に以下で議論される代表的な例としては、有機分子、タンパク質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
【００７１】
（１．有機分子）
多数の有機分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。例えば、本発明の１つの実施態様においては、適切な有機分子が、化学的なライブラリー（ここでは、化合物が別々にアッセイされる）から、またはコンビナトリアル化学ライブラリー（ここでは、複数の化合物が一度にアッセイされ、次いで、最も活性な化合物を決定および単離するために取り組まれる）から、のいずれかから選択され得る。
【００７２】
このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表的な例としては、以下に記載されているものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」、第ＷＯ９５／０２５６６号；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」、第ＷＯ９５／２４１８６号；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｄｅｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ ｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／３０６４２号；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．、「Ｎｅｗ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９５／１６９１８号；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、第ＷＯ９５／１６７１２号；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．、「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ」、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら、「Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９５／１６２０９号：Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら、「Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９３／２０２４２号；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ら、「Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／０４２７７号；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＤ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ、「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ、Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」、第ＷＯ９６／００１４８号；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：４８８７−９０、１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−４、１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら、「Ｔｈｅ Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ４−Ｔｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７０７−１２、１９９６。
【００７３】
（２．タンパク質およびペプチド）
広範なタンパク質およびペプチドは、同様に、免疫系を調節するための候補分子として利用される。
【００７４】
（ａ．コンビナトリアルペプチドライブラリー）
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製され得る（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号、および同第４，３５９，５３５号、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９２／１５６７７号、同第ＷＯ９０／０７８６２号、同第ＷＯ９０／０２８０９号を参照のこと）か、または市販の供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．TM Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ）から購入され得るかのいずれかであり得る。
【００７５】
（ｂ．抗体）
免疫系を調節する抗体は、本明細書中に提供されている開示を考慮すれば、容易に調製され得る。本発明の状況においては、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2、Ｆｖ可変領域、または相補性決定領域）を含むことが理解される。上記で議論されているように、抗体は、それらが、１０7Ｍよりも大きいかまたはそれと同等である、好ましくは、１０8Ｍよりも大きいかまたはそれと同等であるＫａを有して結合する場合は、Ｆｋｈsfに対して特異的であると理解される。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。
【００７６】
簡潔には、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス、またはラットのような種々の温血動物から、当業者によって容易に生成され得る。代表的には、Ｆｋｈsfまたは１３−２０アミノ酸のその特有のペプチド（好ましくは、グルタルアルデヒドでの架橋によってキーホルリンペットヘモシアニンに対して結合体化される）が、フロイト完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントと組み合わせて、腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注射を通じて動物を免疫するために利用される。数回の追加免疫後、血清のサンプルが回収され、そしてタンパク質またはペプチドに対する反応性について試験される。特に好ましいポリクローナル抗血清は、少なくともバックグラウンドよりも３倍大きい、これらのアッセイの１つに対するシグナルを生じる。一旦、タンパク質に対するその反応性に関して、動物の力価がプラトーに到達すると、より大量の抗血清が、毎週の採血によるか、または動物を瀉血するかのいずれかによって、容易に得られ得る。
【００７７】
モノクローナル抗体はまた、従来技術を使用して容易に生成され得る（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号（これらは、本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８（これもまた、本明細書中で参考として援用されている）もまた参照のこと）。
【００７８】
他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１、１９８９年１２月を参照のこと；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５７２８−５７３２、１９８９年８月もまた参照のこと；Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９、１９９０年１月もまた参照のこと）。
【００７９】
以下を含む広範な種々のアッセイが、Ｆｋｈsf（または本明細書中に記載されているＦｋｈsfの変異形態）に対して反応性である抗体の存在を決定するために利用され得る：例えば、向流免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８もまた参照のこと）。
【００８０】
一旦、適切な抗体が得られると、それらは、当業者に周知の多くの技術によって単離または精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）。適切な技術としては、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム上での精製、または任意のこれらの技術の組み合わせが挙げられる。
【００８１】
本発明の抗体は、免疫系を調節するためだけではなく、診断試験のため（例えば、ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのタンパク質またはペプチドの存在を決定するため）、治療目的のため、またはタンパク質の精製のためにも利用され得る。
【００８２】
（ｃ．変異体Ｆｋｈsf）
本明細書中および以下の実施例において記載されているように、Ｆｋｈsfの改変されたバージョンが、Ｆｋｈsfの正常な活性を阻害し、それによって免疫系を調節するために利用され得る（一般的には、上記の核酸分子およびタンパク質を参照のこと）。
【００８３】
ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのさらなる変異体または改変された形態は、広範な種々のインビトロでのアッセイのため（例えば、種々のモデルにおいてこのようなタンパク質の影響を試験するため）、または抗体の開発のために、利用され得る。
【００８４】
（３．核酸分子）
本発明の他の局面においては、免疫系を調節し得る核酸分子が提供される。例えば、１つの実施態様においては、ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの核酸配列、または変異体ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、提供される（一般的には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ：Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ．編、１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１００４−１０１２、１９９３；第ＷＯ９５／１０６０７号；米国特許第５，３５９，０５１号；同第ＷＯ９２／０６６９３号；およびＥＰ−Ａ２−６１２８４４号を参照のこと）。簡潔には、このような分子は、それらが、転写されるＦｋｈsfのｍＲＮＡ配列の領域と相補的であり、そしてワトソン−クリック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖の核酸は、ｍＲＮＡの続くプロセシングを妨害し、それによってタンパク質の合成を妨げる。
【００８５】
本発明の他の局面においては、ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsf、またはＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの変異形態を阻害し得るリボザイムが提供される。本明細書中で使用される場合、「リボザイム」は、特異的認識のためのアンチセンス配列およびＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことが意図される。触媒的な鎖は、化学量論的な濃度を超える濃度で、標的ＲＮＡの特異的な部位を切断する。広範な種々のリボザイムが、本発明の状況において利用され得る。これは例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２２０、１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５９６−６００、１９８８；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：１９６、１９８８、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５、１９８８によって記載されている）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９３年１０月１９日に発行された米国特許第５，２５４，６７８号、Ｈｅｍｐｅｌら、１９９０年３月２６日に公開された、欧州特許公開番号第０ ３６０ ２５７号によって記載されている）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａのリボソームＲＮＡに基づくリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）を含む。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡから構成されるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそれらのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。
【００８６】
（４．標識）
ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsf（ならびにそれらの変異形態）、または上記または下記の任意の候補分子が、以下を含む種々の化合物で標識され得る：例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質（例えば、フィコエリトリン）、ローダミン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａが挙げられる。放射性核種の代表的な例としては、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８，Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９，Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに、上記の抗体もまた、標識され得るか、またはリガンド結合対の１つのパートナーに対して結合体化され得る。代表的な例としては、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
【００８７】
上記の代表的な標識と本明細書中に記載されている分子とを結合体化または標識するための方法は、当業者によって容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第４，７４４，９８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許第４，８９７，２５５号；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；Ｉｎｍａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、ＪａｋｏｂｙおよびＷｉｌｃｈｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３０頁、１９７４をもまた参照のこと；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２、１９８８をもまた参照のこと）。
【００８８】
（薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とともに、免疫系を調節する上記の分子の１つを含む、種々の薬学的組成物を提供する。一般的には、このようなキャリアは、使用される投与量および濃度では、レシピエントに対しては非毒性である。通常は、このような組成物の調製は、緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む））、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオンなど）、安定剤、および賦形剤と、治療薬との混合を含む。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。好ましくは、薬学的組成物（または「医薬品」）は、滅菌の、発熱物質を含まない形態で提供される。
【００８９】
さらに、本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に関する説明書を提供するパッケージング材料とともに、容器内に配置され得る。一般的には、このような説明者は、試薬の濃度、ならびに特定の実施態様においては、薬学的組成物の再構成のために必要とされ得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、もしくはＰＢＳ）の相対的な量を記載する具体的な表現を含む。
【００９０】
（処置方法）
本発明はまた、免疫系を調節するための方法を提供する。免疫系を調節する、本明細書中に記載されている分子の使用を通じて、温血動物中の広範な種々の状態が、容易に処置され得るかまたは予防され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含む）の両方が挙げられる。このような方法は、変更された免疫系を有する患者において治療的な価値があり得る。これは、種々の免疫不全症候群、ならびにＴ細胞媒介自己免疫疾患を有する患者の、化学療法を受けている患者を含む。治療的な価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性によって認識され得る。
【００９１】
治療用分子は、分子の型に依存して、種々の処方物において種々の経路を介して投与され得る。例えば、１つの実施態様においては、有機分子が、経口もしくは鼻内経路によって送達され得るか、または注射（例えば、筋肉内、静脈内など）によって送達され得る。
【００９２】
１つの局面においては、免疫系を調節するための方法が提供される。この方法は、免疫系を調節する分子の発現を指向するベクターを、リンパ系細胞中に導入する工程、および温血動物にベクターを含有する細胞を投与する工程を包含する。他の関連する実施態様においては、このベクターは、所望される標的の位置（例えば、骨髄）に直接投与され得る。
【００９３】
ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を含む、広範な種々のベクターが、このような治療目的のために利用され得る。適切なウイルスベクターの代表的な例としては、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、第ＷＯ９４／２６９１４号、第ＷＯ９３／９１９１号、第ＷＯ９９／２０７７８号、第ＷＯ９９／２０７７３号；第ＷＯ９９／２０７７９号；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７、１９９３；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、７５（２）：２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９、１９９３：Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８、１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（第ＷＯ９５／１３３６５号；Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ、７９：４９２７−４９３１，１９８２；およびＯｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０、１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、第ＥＰ０，４１５，７３１号；第ＷＯ９０／０７９３６号；第ＷＯ９１／０２８５号、第ＷＯ９４／０３６２２号；第ＷＯ９３／２５６９８号；第ＷＯ９３／２５２３４号；米国特許第５，２１９，７４０号；第ＷＯ９３／１１２３０号；第ＷＯ９３／１０２１８号）が挙げられる。同様に、種々のウイルスまたは非ウイルス供給源に由来する種々のエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列など）の混合物を含むウイルスベクターが、構築され得る。種々の実施態様においては、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかが、以下に記載されている方法および組成物において利用され得る。
【００９４】
本発明の他の実施態様においては、免疫系を調節する分子（例えば、変異体Ｆｋｈsf、またはアンチセンスもしくはＦｋｈsfを切断するリボザイム分子）をコードする核酸分子が、以下を含む種々の別の技術によって投与され得る：例えば、ポリ−Ｌ−リジンＤＮＡ複合体と結合体化したアシアロオソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら、ＰＮＡＳ ９２１２２−９２１２６，１９９３）、殺傷したアデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、１９９２）、サイトフェクチンによって媒介される導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接的なＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８１５−８１８、１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４；１６９８５−１６９８７、１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｃｉｒｃ、８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ、８４：７８５１−７８５５、１９８７）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ、８８：２７２６−２７３０、１９９１）；およびタンパク質自体をコードする核酸分子の、単独（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３）またはＰＥＧ−核酸複合体を利用するかのいずれかである直接的な送達。
【００９５】
本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例としては、リボザイムおよびアンチセンス分子（これらのそれぞれは、以下により詳細に議論されている）が挙げられる。
【００９６】
当業者に明らかであるように、投与の量および頻度は、もちろん、処置される徴候の性質および重篤度、所望される応答、患者の状態のような因子に依存する。代表的には、組成物は、上記のような種々の技術によって投与され得る。
【００９７】
以下の実施例は、例示によって付与され，そして限定によっては与えられない。
【００９８】
（実施例）
（実施例１）
（ＳＣＵＲＦＹ変異体の原因である遺伝子の同定）
（Ａ．ＳＣＵＲＦＹ遺伝子のクローニング）
もともとのｓｃｕｒｆｙ変異は、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）に１９４９年にストックされた一部近交系のＭＲにおいて自発的に生じた。戻し交配分析を、マウスＳｃｕｒｆｙ変異を含むＸ染色体の動原体周辺領域（ｐｅｒｉ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）を詳細にマップするために使用した。同じ領域をカバーする物理的なマップを、重複している酵母および細菌の人工染色体（ＹＡＣおよびＢＡＣ）の単離を通じて並行して生成した。一旦、候補領域が、約５００キロ塩基対（ｋｂ）にまで狭められると、大規模なＤＮＡ配列決定を、４個の重複するＢＡＣクローンについて行った。この５００ｋｂの領域内の全ての転写ユニットを、配列データベースの検索とコンピューターによるエキソン予想プログラムの適用との組合せにより同定した。次いで、候補遺伝子を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙに由来するＲＮＡサンプルからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得たｃＤＮＡの配列を比較することによって、Ｓｃｕｒｆｙ特異的変異についてスクリーニングした。Ｆｋｈsfと本明細書中で呼ばれる１つの遺伝子においては、２塩基対（ｂｐ）の挿入が、正常なｃＤＮＡと比較してＳｃｕｒｆｙ ｃＤＮＡのコード領域中に見出された。挿入を、いくつかのマウスの株（Ｓｃｕｒｆｙ変異体を含む）のゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を比較することによって確認した。再び、２ｂｐの挿入を、Ｓｃｕｒｆｙサンプル中でのみ見出し、これによって、これをＳｃｕｒｆｙ欠失の原因である可能性があると確定した。
【００９９】
マウスのＦｋｈsf遺伝子は、ＢＡＣクローン８Ｃ２２中に含まれ、そして完全に配列決定されている。これは約１４ｋｂにまたがり、そして１１個のコードエキソンを含む。エキソン中断の位置は、ＧｅｎＳｃａｎエキソン推定プログラムを使用して、ゲノムＤＮＡ配列のコンピューターによる分析によって最初に同定した；次いで、エキソンの位置を、ゲノム配列に対する正常なマウスの組織に由来するｃＤＮＡ配列の直接的な比較によって確認した。
【０１００】
得られたｃＤＮＡの長さは、２１６０ｂｐである；コード領域は、その１２８７ｂｐにまたがり、４２９アミノ酸のタンパク質をコードする。図１はマウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す；翻訳は、２５９位で開始し、そして１５４６位で終結すると推定される。図２は、マウスのＦｋｈsfのアミノ酸配列を示す。
【０１０１】
（ｂ．Ｆｋｈsfトランスジェニックマウスの生成）
Ｓｃｕｒｆｙ表現型の真の原因としてのＦｋｈsf遺伝子の実態を、トランスジェニックマウスにおいて確認した。簡潔には、Ｆｋｈsf遺伝子の約７ｋｂのコード領域、ならびに隣接する配列の上流の約２０ｋｂ、および下流の配列の約４ｋｂ（図５）を含む正常なゲノムＤＮＡの３０ｋｂのフラグメントを、正常なマウスの１細胞胚中にマイクロインジェクションした。それぞれが別々のインテグリンを有する５匹の個々の崩壊させた動物を生成し、そして各トランスジェニック株に由来する雄性の動物を、雌性のｓｆキャリアと交配した。トランスジーン（正常なＦｋｈsf）およびｓｆ変異（変異Ｆｋｈsf）の両方を有する雄性の子孫を、分析した。
【０１０２】
分析は、倭小（ｒｕｎｔｉｎｇ）、鱗状の皮膚、毛皮の異常、およびｓｃｕｒｆｙ表現型の他の特徴についての動物の試験からなる。さらに、リンパ系組織（胸腺、脾臓、および結節）を回収し、そしてそれらの大きさおよび細胞数を試験し、そして正常な動物およびｓｃｕｒｆｙマウスの両方について比較した。全ての５個のトランスジェニック株について、トランスジーンを保有した雄性のｓｆ子孫は、大きさおよび重量において正常であり、そして全ての点で健常であるように見えた。これらのトランスジェニックマウスにおけるリンパ節の大きさは、正常な動物にものと類似（またはそれよりも小さい）であり（図６）、そして活性化されたＴ細胞の徴候はなかった。これらのパラメーターは、ｓｆマウスとは極端に異なり、そして正常なＦｋｈsf遺伝子の添加が、ｓｃｕｒｆｙマウス中に見出される欠損を克服し得ることを示す。従って、これによって、Ｆｋｈsf遺伝子中の変異がＳｃｕｒｆｙ疾患の原因であることを確認する。
【０１０３】
（実施例２）
（ＦＫＨsf ｃＤＮＡの生成）
完全なマウスのＦｋｈsfタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得られ得る。より詳細には、第１鎖のｃＤＮＡが、適切な供給源（例えば、マウスの脾臓）に由来する５μｇの全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングすること、および標準的な条件下で逆転写酵素を用いて伸張すること（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔキット）によって、生成する。次いで、第１鎖のｃＤＮＡのアリコートを、正方向および逆方向プライマー（正方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣ ＴＴＣ；逆方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ ＣＴＧ）（０．２ｍＭの最終濃度））、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼの存在下での、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間）に供する。
【０１０４】
（実施例３）
（マウスのＦｋｈsfに対するヒトのオルソログの生成）
完全なＦＫＨsfタンパク質をコードするヒトＦＫＨsf ｃＤＮＡは、実施例２に記載されているものと本質的に同じ手順によって得ることができる。詳細には、全脾臓ＲＮＡを用いて開始し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマー（正方向プライマー：ＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴ ＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡ Ｃ；逆方向プライマー：ＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡ Ｃ）、および６０℃のアニーリング温度を除いて上記と同じＰＣＲ条件を利用する。
【０１０５】
図４は、今日までに得られた１８６９ｂｐのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、１８９位で開始し、そして１４８２位で終結すると推定される。図４は、４３１アミノ酸のヒトＦＫＨsfタンパク質の配列を示す。マウスｃＤＮＡ配列に対するヒト遺伝子の推定されるコード領域の比較は、ほぼ同一であるエキソン構造、および全タンパク質にわたる８６．１％のアミノ酸配列同一性を明らかにする。
【０１０６】
（実施例４）
（ＳＣＵＲＦＹ変異体を検出するための方法）
上記のように、Ｓｃｕｒｆｙ変異体を、最初に、ｓｆのＲＴ−ＰＣＲによって誘導されたｃＤＮＡおよび正常なマウスのＲＮＡサンプルを直接配列決定することによって発見し、そしてゲノムＤＮＡに由来する同じ領域を配列決定することによって確認した。変異の性質（すなわち、２ｂｐの挿入）は、それ自体を、多数の種々の変異検出アッセイに導く。これは、最初に、オリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このような、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、対立遺伝子特異的発現の定量的な分析を可能にし得る。
【０１０７】
一例としては、３６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴを使用して、第１鎖のｃＤＮＡから増幅する：
ＤＭＯ５９８５（正方向）：ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧ（図１のｎｔｄ．８２５−８４４）
ＤＭＯ６７２４（逆方向）：ＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣ（ｎｔｄ １２２１−１１９９）。
【０１０８】
ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜に移し、そしてＳｃｕｒｆｙ特異的な２ｂｐの挿入部位に対応する領域に相補的である末端標識オリゴヌクレオチドで標識する。２つの別々のハイブリダイゼーション反応を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙ ＰＣＲ産物を検出するために、以下のオリゴヌクレオチド（２ｂｐの挿入部位を太字で示す）を使用して行う：
正常：ＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＤＭＯ７４３９
Ｓｃｕｒｆｙ：ＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＤＭＯ６９１９。
【０１０９】
Ｓｃｕｒｆｙ変異はまた、冷却一本鎖立体構造多形性（ｃＳＳＣＰ）アッセイによっても検出され得る。このアッセイにおいては、上記と同じＰＣＲ産物を、２０％のアクリルアミド（ＴＢＥ）ゲル上で、鎖の変性後に泳動する。Ｓｃｕｒｆｙの挿入は、正常な配列と比較して鎖の移動においてシフトを生じ、そして別の鎖が、エチジウムブロマイドでの染色後に検出される。
【０１１０】
（実施例５）
（ＦＫＨSF遺伝子の発現）
半定量的なＲＴ−ＰＣＲが、広範な種々の組織および細胞株中におけるマウスおよびヒトのＦｋｈsf遺伝子の発現パターンを分析するために使用されている。発現のレベルは、偏在して発現されるＤＡＤ−１遺伝子について正規化される。簡潔には、Ｆｋｈsf遺伝子は、非常に低いレベルではあるが、これまでに試験されたほぼ全ての組織（胸腺、脾臓、分類されたＣＤ４＋およびＣＤ４−ＣＤ８−、Ｔリンパ球、ならびに腎臓、脳、ならびに種々のマウスおよびヒトのＴ細胞株、ならびにヒト腫瘍を含む）中で発現される。しかし、発現がないことが、新たに分類したマウスのＢ細胞において注目された。
【０１１１】
予想されるように、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける正常な組織対Ｓｃｕｒｆｙ組織において、発現レベルにおける差異は観察されなかった。
【０１１２】
（実施例６）
（インビトロでのＦＫＨSFの発現）
全長のマウスおよびヒトのＦｋｈsf ｃＤＮＡ、ならびに種々のｃＤＮＡのサブ領域を、哺乳動物細胞（たとえば、ヒトのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母中での発現が可能であるベクター中にクローン化した。Ｅ．ｃｏｌｉ系または酵母系を、Ｆｋｈsf特異的抗体を惹起する目的のためのタンパク質の産生に使用し得る（以下を参照のこと）。
【０１１３】
（実施例７）
（抗ＦＫＨSF抗体の生成）
実施例６に記載されているベクターから発現されるタンパク質を、ＦＫＨsf特異的抗体の産生のために適切な動物を免疫化するために使用する。全長または短縮されたタンパク質のいずれかを、この目的のために使用し得る。タンパク質を、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から、入手し得る。動物種としては、マウス、ウサギ、モルモット、ニワトリ、または他のものが挙げられ得る。ＦＫＨsfに対して特異的なウサギ抗血清は、生化学的な特徴によって決定されるように、生成されている（免疫沈降およびウェスタンブロッティング）。
【０１１４】
（実施例８）
（ＦＫＨSF遺伝子の機能についてのアッセイ）
ＦＫＨsfタンパク質の機能の欠損が、ｓｃｕｒｆｙ動物において観察される表現型（るいそう、敏感な免疫応答、および死）を生じるので、ＦＫＨsfタンパク質の過剰な発現を評価するためのアッセイを記載する。トランスジェニック動物（実施例１に記載されている）を、それらの免疫応答能力の状態について、いくつかの異なるパラメーターを使用して試験する。動物を、リンパ節および胸腺中に存在するリンパ系細胞の数について（図７）、およびインビトロでの刺激に対するＴ細胞の応答性について（図８）試験する。
【０１１５】
Ｓｃｕｒｆｙ変異動物は、正常な動物のそれらのリンパ節中の細胞よりもほぼ２倍多い細胞を有する。しかし、正常なＦＫＨsfタンパク質の過剰なレベルを発現するマウスは、ほぼ３倍多い細胞を含む（図７）。さらに、標準的な抗血清を使用するフローサイトメトリーによって評価される場合に、それらの細胞表面の表現型である場合（示さない）は、胸腺細胞の数は正常であり（図７）、このことは、過剰のＦＫＨsfタンパク質に関連する発達的欠損が存在しないことを示す。
【０１１６】
正常なｓｃｕｒｆｙ動物およびトランスジェニック動物はさらに、Ｔ細胞の刺激に対するそれらの増殖性応答について試験される。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体と反応し、そしてそれらの増殖性応答が、放射活性チミジンの取りこみを使用して測定される。ｓｃｕｒｆｙ細胞は、刺激の非存在下でのみ分裂するが、正常な細胞は、刺激の後に十分応答する。ＦＫＨsfトランスジェニック細胞もまた刺激に対して応答するが、応答は、正常な細胞のものよりも有意に少ない（図８）。このことは、過剰のＦＫＨsfを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が、刺激に対して応答する能力を低下させられたことを示す。
【０１１７】
（実施例９）
（ＪＭ２に関連するヒトのＦＫＨSF ｃＤＮＡ配列）
ヒトＦＫＨsf ｃＤＮＡ配列の改変されたバージョンが、ＧｅｎＢａｎｋによって公開されている配列データベース中に存在する。この配列は、ＪＭ２と呼ばれ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１号）、そしてＦＫＨsf遺伝子を含むゲノム配列に対するエキソン推定プログラムの適用の結果である（Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．ら、未公開−ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１を参照のこと）。対称的に、ＦＫＨsf ｃＤＮＡの構造は、実験によって決定された。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＧＡＰプログラムを、２つの配列を比較するために使用し、そして差異を図９に示す。２つの配列の５’末端は、ゲノムＤＮＡ配列の状況におけるそれらの位置において異なり、ＦＫＨsfの第２のコードエキソンがＪＭ２から欠落しており、そしてＦＫＨsf遺伝子の最後のイントロンが、ＪＭ２配列中ではスプライシングされない。これらの差異は、ＦＫＨsfと比較して、より短いアミノ末端ドメイン、カルボキシ末端でのフォークヘッドドメイン（以下を参照のこと）中への大きい挿入を有するＪＭ２タンパク質を生じる。
【０１１８】
（実施例１０）
（ＦＫＨsfタンパク質は種を超えて保存されている）
ＦＫＨsfタンパク質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づいて、サブ領域に分けられ得る。ＦＫＨsf中の２つの重要なモチーフは、タンパク質の中央部分中のＣ2
ＩＩ2クラスの単一のジンクフィンガー（ＺＮＦ）、およびタンパク質の最もカルボキシ
末端での二股の矢じりまたは翼状のへリックスドメインである。ＦＫＨsfと他のタンパク質との間での相同性の程度を特徴付ける目的のために、本発明者らは、タンパク質を以下の４つの領域に分けた：
アミノ末端ドメイン ：図２の残基１−１９７
図４の残基１−１９８
ジンクフィンガードメイン ：図２の残基１９８−２２１
図４の残基１９９−２２２
中央ドメイン ：図２の残基２２２−３３６
図４の残基２２３−３３６
フォークヘッドドメイン ：図２の残基３３７−４２９
図４の残基３３７−４３１。
【０１１９】
ＤＮＡＳｔａｒ配列分析パッケージによるＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを使用して、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを、これらの４つのドメインにわたる、ヒトＦＫＨsfとマウスＦｋｈsfタンパク質との間での類似性の程度を決定するために使用した。結果を、図１０に示す。類似性は、８２．８％から９６．４％までの範囲を示し、このことは、このタンパク質が非常に高度に種をこえて保存されていることを示す。
【０１２０】
（実施例１１）
（新規のＦＫＨSFに関連する遺伝子の同定）
ＦＫＨsf遺伝子配列の特有の特徴を利用して、二股の矢じりを含む分子の同じサブクラスに入る他の新規の遺伝子（およびタンパク質）を同定し得る。ＦＫＨsfタンパク質は、それが、フォークヘッドドメインに対して単一のジンクフィンガードメインのアミノ末端を、そしてフォークヘッドドメインの最もカルボキシ末端に有する点で、特有である。縮重ＰＣＲアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規の遺伝子を単離するために行い得る。例えば、以下の縮重プライマーを合成した（縮重の位置を括弧で示し、そして「Ｉ」はヌクレオシドイノシンを示す）：
正方向プライマー：ＣＡ（ＴＣ）ＧＧＩＧＡ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ）ＴＧＧ 逆方向プライマー：（ＧＡ）ＡＡＣＣＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＧ）ＴＡ（ＡＧＴ）ＡＴ（ＣＴ）ＴＣ（ＧＡ）ＴＴ。
【０１２１】
正方向プライマーは、ジンクフィンガー配列中の領域に対応し、そして逆方向プライマーは、フォークヘッドドメインの中央の領域に対応する。これらのプライマーを使用して、種々のヒト組織（肝臓、脾臓、脳、肺、腎臓などを含む）から実施例２のように産生した第１鎖のｃＤＮＡを増幅した。以下のＰＣＲ条件：０．２ｍＭの最終濃度の正方向プライマーおよび逆方向プライマー、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼ、を使用し３５サイクル（９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間）に供した。ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル（１×ＴＡＥ中で泳動）上で可視化し、そしてＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にサブクローン化した；個々のクローンを配列決定し、そして全長ｃＤＮＡのさらなる特徴付けのために使用した。
【０１２２】
あるいは、ＦＫＨsf遺伝子の特有の領域（すなわち、「アミノ末端」ドメインおよび「中央」ドメイン）を、ハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために使用し得る。種々のヒトおよび／またはマウスの組織に由来し、そしてλファージベクター（例えば、λｇｔ１１）中で増殖させたｃＤＮＡライブラリーをアガロース上にプレートし、プラークをナイロン膜に移し、そしてＦＫＨsf遺伝子の特有の領域に由来するフラグメントを用いてプローブした。高ストリンジェンシーの条件（例えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、６５℃にて、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄）下では、密接に関連するごくわずかな配列のみが、ハイブリダイズすると予想した（すなわち、９０−１００％の相同性）。上記と同じ緩衝液中での４５−５５℃でのこのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のような低いストリンジェンシーの下では、ＦＫＨsfに関連する遺伝子（６５−９０％の相同性）が同定され得る。ＦＫＨsfの特有の配列を用いて公開されているデータベースの検索によって得られる結果に基づくと、低いストリンジェンシーから中程度のストリンジェンシーまでのハイブダイゼーション実験を通じて同定される任意の遺伝子が、「ＦＫＨsfファミリー」の新規のメンバーを提示すると予想される。
【０１２３】
上記から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書中で記載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、ならびにより詳細には、ｓｃｕｒｆｙ関連疾患を診断するために有用な方法および組成物に関し、そして、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
マウスの免疫系に影響を与える遺伝した変異は、免疫系の調節に対して重要な新規の遺伝子の豊富な供給源であることが証明されており、そしてヒトの免疫学的な障害の重要な動物モデルを提供した。これらとしては、ｘｉｄ（Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症のマウスの等価物）（非特許文献１および２）、ｂｅｉｇｅ（チェディアック‐東症候群の等価物）（Ｂａｒｂｏｓａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：２６２、１９９６）、ｌｐｒおよびｇｌｄ（ｆａｓおよびｆａｓリガンドの欠損）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｓｕｇａｍｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１７９、１９９６）、および造血細胞ホスファターゼ変異体ｍｏｔｈｅａｔｅｎ（ＳＨＰ−１）（ＢｉｇｎｏｎおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、７３：１６８、１９９４）が挙げられる。
【０００３】
特定の目的の１つのマウスの変異体は、いまだなおクローン化されていないＸ連鎖マウス変異体、ｓｃｕｒｆｙ（ｓｆ）である。簡潔には、ｓｃｕｒｆｙ変異について半接合性のマウスは、重篤なリンパ増殖障害を示す。詳細には、ｓｃｕｒｆｙ変異について半接合性の雌性（Ｘsf／Ｙ）は、リンパ節、脾臓、肝臓、および皮膚の進行性のリンパ球浸潤を発症し、それによって巨脾腫、肝腫、大いに肥大したリンパ節、矮小、離脱性皮膚炎、および厚くなった奇形の耳を含む、肉眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５５２８、１９９１）。他の臨床的な症状としては、増大した白血球数、高ガンマグロブリン血症、および重篤な貧血が挙げられる（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０）；罹患した雄性の死亡は、通常は３週齢までに生じる。ｓｆ遺伝子座は、Ｘ染色体の極めて近位の領域に、ｓｐａｒｓｅ−ｆｕｒ（ｓｐｆ）（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０；Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ５：６５２、１９９４）（それ自体が、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Ｏｔｃ）内の点変異（Ｖｅｒｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：４１５、１９８７））についての遺伝子座からおよそ０．７センチモルガンに、マップされている。ｓｆ遺伝子座はまた、マウスのＧａｔａ１、Ｔｃｆｅ３、およびＷａｓｐ遺伝子座と密接に連鎖している（Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ５：６５２、１９９４；Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：４７１、１９９５）。ｓｃｕｒｆｙおよびヒトのＷｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群（ＷＡＳ）との間の類似性が報告されており（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、２４３３、１９９０）、そしてマウスのＷａｓｐ遺伝子が、ｓｃｕｒｆｙについての候補として提案されている（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０；Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：４７１、１９９５）。より最近の生物学的な実験は、ＷＡＳとｓｃｕｒｆｙとの間の有意な差異を明らかにするが、しかし、この２つの遺伝子座は、対立遺伝子ではないことが実証されている（ＪｅｆｆｅｒｙおよびＢｒｕｎｋｏｗ、公開されていないデータ）。従って、出願人らの発明の以前には、ｓｃｕｒｆｙ遺伝子の正体は、未決定のままであった。
本発明は、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患の診断のために有用な方法および組成物、ならびに、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法を開示し、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：３５５、１９９３
【非特許文献２】Ｒａｗｌｉｎｇｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：３５８、１９９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
（項目１） Ｆｋｈｓｆをコードする、単離された核酸分子。
（項目２） 前記ＦｋｈｓｆがマウスのＦｋｈｓｆである、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３） 前記ＦｋｈｓｆがヒトのＦＫＨｓｆである、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４） 前記核酸分子が、（ａ）配列番号２または４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子、
からなる群より選択される、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目５） 前記核酸分子が配列番号２のアミノ酸配列をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目６） 前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目５に記載の単離された核酸分子。
（項目７） 項目１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
（項目８） 前記ベクターがウイルスベクターである、項目７に記載のベクター。
（項目９） 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルスからなる群より選択されるウイルスから生成される、項目８に記載のベクター。
（項目１０） 項目１に記載の単離された核酸分子およびプロモーターを含む発現ベクターであって、ここで、該プロモーターが該核酸分子と作動可能に連結されている、発現ベクター。
（項目１１） 項目１０に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
（項目１２） Ｆｋｈｓｆタンパク質を調製するために項目１０に記載の発現ベクターを使用する方法であって、該方法が以下の工程：
（ａ）該発現ベクターを含み、そして該タンパク質を産生する、組換え宿主細胞を培養する工程、および
（ｂ）該培養した組換え宿主細胞から該タンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
（項目１３） 項目１から６のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１４） 項目１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
（項目１５） 前記抗体が、以下：
（ａ）ポリクローナル抗体、
（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、および
（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、
からなる群より選択される、項目１３に記載の抗体。
（項目１６） 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目１４に記載の抗体フラグメント。
（項目１７） 項目１３に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
（項目１８） 被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈｓｆ核酸配列の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）Ｆｋｈｓｆ特異的核酸プローブと、（ｉ）該生物学的サンプルから単離した試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成した核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該プローブが、項目１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する、工程、および
（ｂ）該核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１９） 前記試験核酸分子が、ＲＴ−ＰＣＲによって得られる、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 生物学的サンプル中のＦｋｈｓｆまたはその変異形態の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈｓｆ抗体または抗体フラグメントと接触させる工程であって、ここで、該接触工程が、該生物学的サンプルに対する該抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる、工程、および
（ｂ）任意の該結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２１） 前記抗体または前記抗体フラグメントが、以下：
（ａ）ポリクローナル抗体、
（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、
（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、および
（ｅ）（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）から誘導される抗体フラグメント、
からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２３） 前記抗体または前記抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生体発光標識、およびコロイド状の金からなる群より選択される検出可能な標識をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４） 項目１に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、単離されたオリゴヌクレオチド。
（項目２５） 検出可能な標識をさらに含む、項目２４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６） 動物に対して項目１に記載のＦｋｈｓｆ核酸分子を投与する工程を包含する、動物に対してＦｋｈｓｆ核酸分子を導入する方法。
（項目２７） 前記核酸分子がウイルスベクターによって発現される、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記核酸分子がプラスミドベクターによって発現される、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 前記核酸分子がインビボで動物に投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記核酸分子がエキソビボで細胞に投与され、次いで該細胞が前記動物に投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３１） 前記細胞が造血細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３２） 前記造血細胞がＴ細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３３） 前記動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３４） その細胞がＦｋｈｓｆタンパク質をコードする配列を含むトランスジーンを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物。
本発明は、一般的には、変異した場合に、重大なリンパ増殖障害を生じる新規の遺伝子の発見に関する。詳細には、変異マウス（「Ｓｃｕｒｆｙ」と命名された）が、戻し交配分析、物理的なマッピング、および大規模なＤＮＡの配列決定を通じたこの障害の原因遺伝子の同定のために使用された。この遺伝子の配列の分析は、この遺伝子が、関連の遺伝子ファミリー（全てが、翼状（ｗｉｎｇｅｄ）へリックスＤＮＡ結合ドメインを含有する）に属することを、示した。
【０００６】
従って、本発明の１つの局面においては、ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfをコードする単離された核酸分子（それらの変異形態を含む）が提供される。特定の実施態様においては、任意の型のＦｋｈsfは、温血動物（例えば、マウスまたはヒト）に由来し得る。さらなる実施態様においては、単離された核酸分子が提供され、ここで、この核酸分子は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号２または配列番号４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその相補物を有する核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子。好ましくは、核酸分子は、ＪＭ２ではない。関連する局面においては、ベクター（発現ベクターを含む）および組換え宿主細胞、ならびに上記の核酸分子によってコードされるタンパク質もまた、提供される。さらに、別のタンパク質のコード領域と上記の核酸分子の少なくとも一部とを組み合わせた融合タンパク質もまた、提供される。上記の配列に基づくオリゴヌクレオチドフラグメント（プローブおよびプライマーを含む）もまた、提供される。このようなフラグメントは、少なくとも８、１０、１２、１５、２０、または２５ヌクレオチド長であり、そして１００、２００、５００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド長にまで及び得る。
【０００７】
他の局面においては、Ｆｋｈsfタンパク質（任意の型）を産生するために上記の発現ベクターを使用する方法が提供される。この方法は、（ａ）この発現ベクターを含みそしてＦｋｈsfタンパク質を産生する組換え宿主細胞を培養する工程、および（ｂ）培養した組換え宿主細胞からタンパク質を単離する工程、という一般的な工程を包含する。
【０００８】
Ｆｋｈsfタンパク質に特異的に結合する抗体および抗体フラグメントもまた、提供される。このような抗体の代表的な例としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（マウスのハイブリドーマから得られたかまたはヒトの形態に誘導されたかにはかかわらず）の両方が挙げられる。抗体フラグメントの代表的な例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットまたは相補性決定領域が挙げられる。
【０００９】
なお他の局面においては、被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈsf核酸配列の存在を検出するための方法が、提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Ｆｋｈsf特異的核酸プローブと、（ｉ）上記の生物学的サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（ここで、上記のプローブは、請求項１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。
【００１０】
別の関連する実施態様においては、生物学的サンプル中の、Ｆｋｈsfまたはその変異形態の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈsf抗体または抗体フラグメントと接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、上記の生物学的サンプルに対する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる）、および（ｂ）任意の上記の結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程。
【００１１】
本発明の他の局面においては、動物に対してＦｋｈsf核酸分子を導入する方法が提供される。この方法は、動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、またはマウス）に対して、本明細書中に記載されているようなＦｋｈsf核酸分子を投与する工程を包含する。１つの実施態様においては、核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはアルファウイルスから少なくとも一部生成されたベクター）中に含まれ、そしてそれによって発現される。別の実施態様においては、核酸分子は、プラスミドベクターによって発現されるか、またはその中に含まれる。このようなベクターは、インビボまたはエキソビボのいずれかで、（例えば、Ｔ細胞のような造血細胞に）投与され得る。
【００１２】
他の実施態様においては、ヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。ここで、この動物の細胞は、Ｆｋｈsfタンパク質をコードする配列を含むトランスジーンを発現する。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示されており、そしてそれゆえそれらの全体が、参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１は、マウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。
【図１Ｂ】図１は、マウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。
【図２】図２は、マウスのＦｋｈsfのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。
【図３Ｂ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆ ｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。
【図４】図４は、ヒトのＦＫＨsfタンパク質の４３１アミノ酸の配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５は、ＦＫＨsfトランスジェニックマウスの生成のためのベクターを模式的に示す。
【図６】図６は、ＦＫＨsfトランスジーンが、ｓｃｕｒｆｙ動物における欠損を修復することを示す写真である。
【図７】図７は、ＦＫＨsf ｔｇマウスが、正常な細胞と比較して、減少したリンパ節細胞を有することを示すグラフである。
【図８】図８は、ＦＫＨsfトランスジェニックマウスがインビトロでの刺激にほとんど応答しないことを示すグラフである。
【図９】図９は、ＦＫＨsfとＪＭ２とのｃＤＮＡの比較である。
【図１０】図１０は、ヒトのＦＫＨsfとマウスのＦｋｈsfとの種々の領域における相同性を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示すこと、および本明細書中で以降に使用される略号を列挙しそしてそれらを定義することは、本発明の理解に役立ち得る。
【００１５】
「Ｓｃｕｒｆｙ」は、重篤なリンパ増殖障害を示すマウスにおける遺伝した疾患をいう（例えば、Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４３３、１９９０を参照のこと）。原因遺伝子（その変異形態が、この疾患の原因である）を、配列番号１および３に示す。
【００１６】
「分子」は、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナー、所望される結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、およびＰＮＡのような核酸アナログ）、および有機化合物または無機化合物を含むと理解されるはずである。
【００１７】
「核酸」または「核酸分子」は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、ならびに任意の連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントをいう。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、または天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）であるモノマー、あるいは両方の組み合わせから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分、および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分において修飾を有し得る。糖の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、または糖はエーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに、全体的な糖部分は、立体構造的に、および電気的に類似の構造（例えば、アザ糖、および炭素環式糖アナログ）で置きかえられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸のモノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、いわゆる「ペプチド核酸」を含む。これは、ポリアミド骨格に対して結合した、天然に存在するかまたは修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００１８】
「単離された核酸分子」は、生物体のゲノムＤＮＡ中には組み込まれていない核酸分子である。例えば、真核生物細胞のゲノムＤＮＡから分離されている遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物体のゲノム中には組み込まれていない、化学的に合成された核酸分子である。
【００１９】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’領域中に配置される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合は、転写速度は、誘導剤に応答して増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合は、転写の速度は、誘導剤によっては調節されない。
【００２０】
「ベクター」は、所望されるタンパク質の発現を指向し得るアセンブリをいう。ベクターは、目的の遺伝子に対して作動可能に連結された転写プロモーターエレメントを含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、またはこの２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、他の遺伝的なエレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択マーカー）もまた、本明細書中に記載されているベクター中に取りこまれ得る。
【００２１】
「単離された」は、タンパク質またはポリペプチドの場合においては、他の生物学的巨大分子の実質的非存在下に存在し、そしてクマシーブルー染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に名目上単一のバンドとして出現する分子をいう。「単離された」は、有機分子について言及する場合は、その化合物が、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して９０％よりも純粋であることを意味する。
【００２２】
「クローニングベクター」は、宿主細胞中で自律複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージのような核酸分子をいう。クローニングベクターは、代表的には、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ここでは、外来のヌクレオチド配列が、ベクターの本質的な生物学的な機能の損失を伴わずに、決定可能な様式で挿入され得る）およびクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子としては、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が挙げられる。
【００２３】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子をいう。代表的には、遺伝子の発現は、プロモーターの制御下に配置され、そして必要に応じて、少なくとも１つの調節エレメントの制御下に配置される。このような遺伝子は、プロモーター「に対して作動可能に連結された」といわれる。同様に、調節エレメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節する場合は、作動可能に連結される。
【００２４】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中のクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作されている、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
【００２５】
真核生物においては、ＲＭＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを産生するように、構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型を含むように設計され得、ここで、ＲＮＡ転写物は、特異的なｍＲＮＡの配列に対して相補的である配列を有する。このＲＮＡ転写物は、「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合し得、それによってｍＲＮＡの翻訳の阻害を生じる。
【００２６】
「Ｆｋｈsfに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈsfアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成し得るか、または（ｂ）ｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。同様に、「Ｆｋｈsfに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈsfアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）Ｆｋｈsf遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成し得るか、または（ｂ）Ｆｋｈsf遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
「リボザイム」は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
【００２８】
略号：ＹＡＣ、酵母人工染色体；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して最初の工程でＲＮＡが最初にＤＮＡに転写されるＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ、ＤＮＡ形態にＲＮＡ配列をコピーすることによって作成される、任意のＤＮＡ。本明細書中で利用される場合は、「Ｆｋｈsf」は、（この遺伝子が、ヒト、哺乳動物、または任意の他の温血動物から得られたかどうかにはかかわらず）Ｆｋｈsf遺伝子の遺伝子産物をいう。「ＦＫＨsf」と大文字になっている場合は、この遺伝子産物（および遺伝子）は、ヒトに由来すると理解されるべきである。
【００２９】
上記のように、本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、そしてより詳細には、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患を診断するために有用な方法および組成物、ならびに免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。
【００３０】
従って、以下により詳細に議論されるように、この発見は、免疫系のアゴニストまたは、あるいはアンタゴニストとして作用し得る分子を選択するために利用され得るアッセイの開発を導いた。さらに、このようなアッセイは、免疫系を調節することにおいて同様に活性である、他の遺伝子および遺伝子産物を同定するために利用され得る。
【００３１】
（ＳＣＵＲＦＹ） 簡潔には、本発明は、Ｆｋｈsfをコードする遺伝子における変異が稀な状態（ｓｃｕｒｆｙ）を生じるという予想外の発見に基づく。この状態は、リンパ節、脾臓、肝臓、および皮膚の進行性のリンパ球浸潤によって特徴付けられ、それによって巨脾腫、肝腫、大いに肥大したリンパ節、矮小、脱離性皮膚炎、および厚くなった奇形の耳を含む、肉眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５５２８、１９９１）。この翼状ヘリックスのファミリーの新規のメンバーは、免疫系の新規の成分を示す。
【００３２】
ｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子を発見するために利用された方法は、以下の実施例１に提供される。マウスのｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子、およびヒトのオルソログをクローニングするための方法は、実施例２および３において以下に提供される。トランスジェニックマウスを使用して決定されるような、遺伝子の正体および遺伝子機能との相関の確認のための方法もまた、実施例において提供される。
【００３３】
Ｆｋｈsf遺伝子および遺伝子産物の存在を決定するための方法もまた、本発明によって提供される。１つの実施態様においては、このような方法は、以下の一般的な工程を包含する：（ａ）Ｆｋｈsf特異的核酸プローブと、（ｉ）生物学的サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（ここで、プローブは、Ｆｋｈsfのヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出する工程。種々の方法（例えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２、１９８８；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：４０１−４０２、１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．３５（９）：１８２６−１８３１、１９８９；米国特許第４，７８６，６００号を参照のこと）、およびポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を利用する核酸の増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと）、逆転写酵素ＰＣＲおよびＣＰＴ（米国特許第４，８７６，１８７号および同第５，０１１，７６９号を参照のこと）を含む）が、選択された配列を増幅するために利用され得る。
【００３４】
あるいは、抗体は、Ｆｋｈsf遺伝子産物の存在を検出するために利用され得る。より詳細には、１つの実施態様においては、生物学的サンプル中のＦｋｈsfペプチドまたはその変異体形態の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）抗Ｆｋｈsf抗体または抗体フラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、生物学的サンプルに対する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる）、および（ｂ）任意の結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程。
【００３５】
このような方法は、例えば、向流免疫電気泳動（Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＩＥＰ）、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイを含む、広範な種々のアッセイ形式において達成され得る（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、前出もまた参照のこと）。
【００３６】
（核酸分子、タンパク質、およびタンパク質の産生方法） 種々のＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのタンパク質および核酸分子（またはその一部）が本明細書中で提供されているが、本発明の状況においては、１つ以上のこれらのタンパク質に関する言及は、実質的に類似の活性のタンパク質を含むと理解されるべきであると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合は、タンパク質は、（ａ）これらがこのタンパク質をコードする遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列（例えば、この配列の一部、またはこの配列の対立遺伝子改変体を含む）によってコードされる；（ｂ）このヌクレオチド配列が、中程度、高い、または非常に高いストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）の下で本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションし得るか、または本明細書中で開示されている配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれより高い相同性を有する；あるいは（ｃ）このＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）において定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮重している場合に、「実質的に類似」であると考えられる。さらに、本明細書中で開示されている核酸分子は、配列が、他の点では本明細書中に示される基準を満たす限りは、相補配列および非相補配列の両方を含む。本発明の状況においては、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、またはそれに等価なもの）を意味する。ハイブリダイゼーションの目的のためには、アミノ末端ドメイン、ジンクフィンガードメイン、中央ドメイン、またはフォークヘッドドメイン（実施例１０を参照のこと）をコードする核酸分子が、利用され得る。
【００３７】
本明細書中に記載されている核酸分子によってコードされるタンパク質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ遺伝子またはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の疎水性プロット関数を使用して、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２、１９８２）によって記載されている方法に従って、一次翻訳産物から推定され得る。
【００３８】
本発明のタンパク質は、酸の塩もしくは塩基の塩の形態で、または中性の形態で、調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸の配列に対して行われ得、その正味の影響は、変異体または野生型のタンパク質の生物学的な活性を維持するか、またはさらに増強もしくは減少させる。さらに、遺伝コードの縮重に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列におけるかなりのバリエーションが存在し得る。
【００３９】
本明細書中に開示されているタンパク質の他の誘導体としては、他のタンパク質またはポリペプチドとのタンパク質の結合体が挙げられる。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を容易にするために付加され得る、Ｎ末端融合タンパク質またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと、また、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８をもまた参照のこと）。あるいは、融合タンパク質（例えば、ＦＫＨもしくはＦｋｈ−ルシフェラーゼ、またはＦＫＨもしくはＦｋｈ−ＧＦＰ）が、タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために構築され得る。
【００４０】
本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されている広範な種々の技術を使用して構築され得る。さらに、変異は、天然の配列のフラグメントに対する連結を可能にする制限部位に隣接した、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【００４１】
あるいは、オリゴヌクレオチドによって指向される部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順が、要求される置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供するために使用され得る。上記に示される変更を作成する例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３、１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３、１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８５年１月、１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８１）：およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって開示されている。タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体（例えば、可溶性の細胞外部分）もまた、所望される欠失に対して隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、構築され得る。制限消化に続いて、突出がフィルインされ得、そしてＤＮＡが再連結され得る。上記に示される変更を作成する例示的な方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）によって開示されている。
【００４２】
本発明の核酸分子中に作成される変異は、好ましくは、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、変異は、好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳に有害な影響を与える二次的なｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生じるようにハイブリダイズし得る相補性領域を作成しない。変異部位は予め決定され得るが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位で変異体の最適の特徴について選択するためには、ランダムな変異誘発が標的のコドンで行われ得、そして発現された変異体が表示生物学的活性についてスクリーニングされ得る。あるいは、変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣接した変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。変異は、タンパク質の活性を保存するかもしくは増大させる、またはタンパク質（例えば、変異体Ｆｋｈ）を減少させるかもしくは不能にする目的のために導入され得る。
【００４３】
本発明のタンパク質をコードする核酸分子もまた、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発の技術（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６、１９８６）を利用して、ヌクレオチドの誤った取りこみを強制することによって（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ、Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１、１９９０）、またはランダムに変異誘発したオリゴヌクレオチドの使用によって（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７、１９８９）、構築され得る。
【００４４】
本発明はまた、上記に記載されている遺伝子を発現し得るベクターを含有する宿主細胞を培養することによって、上記に記載されている遺伝子の操作および発現を提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに対して作動可能に連結された所望のタンパク質をコードする、合成核酸分子またはｃＤＮＡから誘導される核酸分子のいずれかを含む。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または植物の遺伝子を含む種々の供給源から誘導され得る。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、以下が挙げられる：転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、およびリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）。
【００４５】
上記に記載されている任意のタンパク質をコードする核酸分子は、細菌、哺乳動物、酵母もしくは他の真菌、ウイルス、または植物細胞を含む、広範な種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞によって容易に発現され得る。このような細胞を外来ＤＮＡを発現するように形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと；植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０４：１０６７−１０７１、１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。
【００４６】
本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、ＤＨ５αが挙げられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００４７】
細菌の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で機能するプロモーター、１つ以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８を参照のこと）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロモーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５、１９８３）、およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ２０：２３１、１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドが、当該分野で周知であり、中でも、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７、１９８３、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８、１９８２を参照のこと）、ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００４８】
本発明を実行するために適切な酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種々の種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）が挙げられる。酵母および真菌についての適切な発現ベクターとしては、中でも、酵母についてはＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ第３７４１９号）、およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９、１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ ８：１２１−１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０８、１９７８）およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
酵母中での使用に好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４、１９８２）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１、１９８３）が挙げられる。真菌ベクターについての有用なプロモーターの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ解糖遺伝子に由来するプロモーター（例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９、１９８５）が挙げられる。発現ユニットはまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書、１９８５）。
【００５０】
細菌のベクターを用いる場合は、酵母のベクターは、一般的には、表現型アッセイが存在して形質転換体が選択されることを可能にする優性表現型を示す任意の数の遺伝子の１つであり得る、選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補するか、抗生物質耐性を提供するか、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするものであり、そしてｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら、同書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ８：１７、１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）を含む。別の適切な選択マーカーは、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を付与する、ｃａｔ遺伝子である。
【００５１】
真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−１６９、１９８３）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって相補される遺伝的な欠損を含み得る。特定の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００５２】
酵母を形質転換するためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを用いた酵母スフェロプラストの調製によるか（Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）、またはＬｉＣｌのようなアルカリ塩での処理による（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３、１９８３を参照のこと）かのいずれかによって、容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９、１９８７）によって記載されているようにポリエチレングリコールを使用して行われ得る。
【００５３】
ウイルスベクターとしては、上記に記載されているような所望のタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターが挙げられる。以下を含む広範な種々のプロモーターが、本発明の状況において利用され得る：例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、Ｈｅｒｐｅｓ ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス即時後期プロモーターのようなプロモーター。本発明の特定の好ましい実施態様においては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである（例えば、第ＷＯ９１／０２８０５号；第ＥＰ ０，４１５，７３１号；および第ＷＯ９０／０７９３６号を参照のこと）。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子βプロモーター、ヒトα１−キマエリン（ｃｈｉｍａｅｒｉｎ）プロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンＩＩプロモーターが挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーターおよびＨＩＶプロモーターのような他のプロモーターを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌、または寄生生物（例えば、マラリア）特異的プロモーター）が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染した特異的な細胞または組織を標的化するために利用され得る。
【００５４】
本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞としては、中でも以下が挙げられる：ＰＣ１２（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７２１号）、Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５アドレナリン作動性神経芽細胞腫、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスコリン作用性細胞株、またはラットのＦ２後根神経節株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５０号または同第１６５１号）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ ６２８１号；ＢＨＫ５７０細胞株（登録番号第ＣＲＬ１０３１４号のもとで、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された））、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ６１号）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＣＬ２号）、２９３（ＡＴＣＣ第１５７３号；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２、１９７７）、およびＮＳ−１細胞。以下を含む他の哺乳動物細胞株が、本発明において使用され得る：ラットのＨｅｐ１（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６００号）、ラットのＨｅｐＩＩ（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５４８号）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ１３９号）、ヒトの肺（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ７５．１号）、ヒトの肝ガン（ＡＴＣＣ第ＨＴＢ−５２号）、Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ第ＨＢ８０６５号）、マウスの肝臓（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ２９．１号）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ９．１号）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ第１５８１号）、ＨＩＴ−Ｔ１５（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７７７号）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ第Ｔｉｂ １５２号）、およびＲＩＮｍ ５ＡＨＴ2Ｂ（ＯｒｓｋｏｖおよびＮｉｅｌｓｅｎ、ＦＥＢＳ ２２
９（１）：１７５−１７８、１９８８）。
【００５５】
本発明を実行することにおける使用のための哺乳動物の発現ベクターとしては、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性のプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）、サイトメガロウイルス即時後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞性のプロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）、マウスＶKプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７０４１−７０４５、１９８３）；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８７）、およびマウスＶHプロモ
ーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３、１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部、所望される発現のレベル、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存する。
【００５６】
このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流、および目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置された、ＲＮＡスプライス部位のセットを含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の下流に配置されたポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５ Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０、１９８１）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に配置された、アデノウイルス２ 三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｌｅ）リーダーのような、非コードウイルスリーダー配列を含み得る。好ましいベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列を含み得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスのＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含み得る。適切な発現ベクターは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得ることができる。
【００５７】
クローン化されたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７）によって、培養された哺乳動物細胞中に導入され得る。クローン化されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが一般的には、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞中に導入される。培養された哺乳動物細胞における使用に好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。他の選択マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＢＦＰ（青色蛍光タンパク質））が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。適切なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ、これは、本明細書中で参考として援用されている）によって概説されている。
【００５８】
適切なベクターを含有する哺乳動物細胞は、目的のＤＮＡ配列（単数または複数）の発現を開始するために、一定の期間（代表的には、１〜２日間）増殖させることが可能である。次いで、薬物選択が、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされている細胞については、薬物濃度が、クローン化された配列の増大したコピー数について選択するために、段階的な様式で増大させられ得、それによって発現レベルを増大させる。導入された配列を発現する細胞が選択され、そして所望の形態または所望のレベルでの目的のタンパク質の産生についてスクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローン化され得、そして産生のためにスケールアップされ得る。細胞はまた、フローサイトメーターを使用してＧＦＰ陽性細胞について分類することによって、それらのＧＦＰ発現に基づいて、トランスフェクションについて選択され得る。
【００５９】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法としては、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、アデノウイルス、およびプロトプラスト融合によって媒介されるトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。裸のベクター構築物もまた、筋肉細胞または他の適切な細胞によって取りこまれ得、続いて、哺乳動物（または他の動物）の筋肉中に注射され得る。
【００６０】
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用が、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４、１９９０）によって概説されている。
【００６１】
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明において有用であり得る。例えば、植物細胞中での遺伝子の発現のためのベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用が、Ｓｉｎｋａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８、１９８７）によって概説されている。
【００６２】
本発明の関連する局面においては、所望のタンパク質をコードし、そして遺伝子の発現に有効なプロモーターに対して作動可能に連結されている遺伝子をその生殖細胞および体細胞が含むトランスジェニック動物中で本発明のタンパク質は発現され得る。あるいは、類似の様式においては、所望の遺伝子を欠失しているトランスジェニック動物が、調製され得る（例えば、「ノックアウト」マウス）。このようなトランスジェニックは、ヒト以外の種々の動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタを含む）において調製され得る（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３、１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２、１９８５、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ、Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５、１９８５、ならびに米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５，３８４号を参照のこと）。簡潔には、発現される核酸分子を、適切に配置された発現制御配列とともに含む発現ベクターは、例えば、マイクロインジェクションによって、受精卵の前核中に導入される。注入されたＤＮＡの組込みは、組織サンプルから、ＤＮＡのブロット分析によって検出される。導入されたＤＮＡが、動物の生殖列系中に取りこまれ、その結果、その動物の子孫に伝達されることが、好ましい。組織特異的な発現は、組織特異的プロモーターの使用を通じて、またはトランスジーンの調節された発現を可能にする誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、同書））の使用を通じて、達成され得る。
【００６３】
天然に存在するｓｃｕｒｆｙ変異体（「ｓｆ」）以外のＦｋｈsfの変異体形態を産生するか、または天然に存在する変異体とは異なる遺伝的なバックグラウンドにある動物は、本明細書中に提供される開示を考慮して容易に産生され得る。
【００６４】
タンパク質は、数ある方法の中でも、本発明の組換え翻訳産物を産生するために適切な宿主およびベクターシステムを培養することによって単離され得る。次いで、このような細胞株に由来する上清、またはタンパク質が上清中には分泌されない場合はタンパク質封入物もしくは細胞全体が、所望のタンパク質を単離するために種々の精製手順によって処理され得る。例えば、上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮され得る。濃縮後、濃縮物は、適切な精製マトリックス（例えば、適切な支持体に結合させられた抗タンパク質抗体のような）に対して適用され得る。あるいは、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために使用され得る。さらに別のものとしては、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、タンパク質をさらに精製するために使用され得る。本発明のタンパク質を単離する他の方法は、当該分野で周知である。
【００６５】
タンパク質は、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、続いてクマシーブルーでの染色によって検出されない場合は、本発明の状況において「単離された」と考えられる。他の実施態様においては、所望されるタンパク質は、従って、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＡＧＥ分析、続いて銀染色によって検出されないように、単離され得る。
【００６６】
（免疫系を調節する分子を選択するためのアッセイ） 上記のように、本発明は、免疫系を調節し得る分子を選択および／または単離するための方法を提供する。適切なアッセイの代表的な例としては、酵母および哺乳動物の２−ハイブリッドシステム（例えば、Ｄａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９５４、１９９１；Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７９５８、１９９２）、ＤＮＡ結合アッセイ、アンチセンスアッセイ、伝統的なタンパク質結合アッセイ（例えば、125Ｉまたは時間消散蛍光を利用する）、ゲル電気泳動と組み合わせた免疫沈降、および直接的なタンパク質配列決定、Ｆｋｈsfによって調節される遺伝子の転写分析、サイトカイン産生、ならびに増殖アッセイが挙げられる。
【００６７】
例えば、１つの実施態様においては、Ｆｋｈsfと直接相互作用するタンパク質は、酵母の２−ハイブリッド結合システム（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、同第５，６１０，０１５号、および同第５，６６７，９７３号を参照のこと）のようなアッセイによって検出され得る。簡潔には、２−ハイブリッドシステムにおいては、ＤＮＡ−結合ドメイン−Ｆｋｈsfタンパク質の融合体（例えば、ＧＡＬ４−Ｆｋｈsf融合体）が構築され、そして選択マーカー遺伝子に連結されたＧＡＬ４結合部位を含む細胞中にトランスフェクトされる。全Ｆｋｈsfタンパク質またはＦｋｈsfのサブ領域が、使用され得る。ＧＡＬ４活性化ドメインに対して融合されたｃＤＮＡのライブラリーもまた、構築され、そして同時トランスフェクトされる、ｃＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化ドメイン融合体中のｃＤＮＡがＦｋｈsfと相互作用するタンパク質をコードする場合は、選択マーカーが発現される、次いで、ｃＤＮＡを含有する細胞が増殖させられ、構築物が単離され、そして特徴付けられる。他のアッセイもまた、相互作用するタンパク質を同定するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、同時免疫沈降、インビトロでの転写／翻訳分析などが挙げられる。
【００６８】
本発明の別の局面においては、選択された分子が免疫系を調節し得るかどうかを決定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＦｋｈsfまたはＦｋｈsfの変異体を発現する細胞に対して選択された候補分子を曝露する工程、および（ｂ）この分子がＦｋｈsfの活性を調節するかどうかを決定する工程、およびそれによって上記の分子が免疫系を調節するかどうかを決定する工程。このような試験のための細胞は、（ａ）正常なリンパ球、（ｂ）ＦＫＨsf（もしくはＦｋｈsf）タンパク質（またはその変異形態）を過剰発現するように操作された細胞株、あるいは（ｃ）上記のタンパク質を発現するように操作されたトランスジェニック動物に由来し得る。このようなトランスジェニックマウスに由来する細胞は、減少した細胞数および種々の刺激に対する減少した応答性を含む、低応答性（ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）状態によって、一部特徴付けられる（例えば、実施例８）。
【００６９】
本明細書中に記載されている方法は、個々の試験分子の分析を言及し得るが、本発明がそのようには限定されるべきでないことが、注意されるべきである。特に、選択された分子は、化合物の混合物中に含まれ得る。従って、記載されている方法は、さらに、所望される分子を単離する工程を包含し得る。さらに、候補分子が、多数のパラメーター（例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生などを含む）によって、免疫系を調節するそれらの能力について評価され得る。
【００７０】
（候補分子）
広範な種々の分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。より詳細に以下で議論される代表的な例としては、有機分子、タンパク質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
【００７１】
（１．有機分子）
多数の有機分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。例えば、本発明の１つの実施態様においては、適切な有機分子が、化学的なライブラリー（ここでは、化合物が別々にアッセイされる）から、またはコンビナトリアル化学ライブラリー（ここでは、複数の化合物が一度にアッセイされ、次いで、最も活性な化合物を決定および単離するために取り組まれる）から、のいずれかから選択され得る。
【００７２】
このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表的な例としては、以下に記載されているものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」、第ＷＯ９５／０２５６６号；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」、第ＷＯ９５／２４１８６号；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｄｅｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ ｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／３０６４２号；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．、「Ｎｅｗ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９５／１６９１８号；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、第ＷＯ９５／１６７１２号；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．、「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ」、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら、「Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９５／１６２０９号：Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら、「Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９３／２０２４２号；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ら、「Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／０４２７７号；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＤ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ、「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ、Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」、第ＷＯ９６／００１４８号；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：４８８７−９０、１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−４、１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら、「Ｔｈｅ Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ４−Ｔｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：７０７−１２、１９９６。
【００７３】
（２．タンパク質およびペプチド）
広範なタンパク質およびペプチドは、同様に、免疫系を調節するための候補分子として利用される。
【００７４】
（ａ．コンビナトリアルペプチドライブラリー）
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製され得る（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号、および同第４，３５９，５３５号、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９２／１５６７７号、同第ＷＯ９０／０７８６２号、同第ＷＯ９０／０２８０９号を参照のこと）か、または市販の供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．TM Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ）から購入され得るかのいずれかであり得る。
【００７５】
（ｂ．抗体）
免疫系を調節する抗体は、本明細書中に提供されている開示を考慮すれば、容易に調製され得る。本発明の状況においては、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2、Ｆｖ可変領域、または相補性決定領域）を含むことが理解される。上記で議論されているように、抗体は、それらが、１０7Ｍよりも大きいかまたはそれと同等である、好ましくは、１０8Ｍよりも大きいかまたはそれと同等であるＫａを有して結合する場合は、Ｆｋｈsfに対して特異的であると理解される。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。
【００７６】
簡潔には、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス、またはラットのような種々の温血動物から、当業者によって容易に生成され得る。代表的には、Ｆｋｈsfまたは１３−２０アミノ酸のその特有のペプチド（好ましくは、グルタルアルデヒドでの架橋によってキーホルリンペットヘモシアニンに対して結合体化される）が、フロイト完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントと組み合わせて、腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注射を通じて動物を免疫するために利用される。数回の追加免疫後、血清のサンプルが回収され、そしてタンパク質またはペプチドに対する反応性について試験される。特に好ましいポリクローナル抗血清は、少なくともバックグラウンドよりも３倍大きい、これらのアッセイの１つに対するシグナルを生じる。一旦、タンパク質に対するその反応性に関して、動物の力価がプラトーに到達すると、より大量の抗血清が、毎週の採血によるか、または動物を瀉血するかのいずれかによって、容易に得られ得る。
【００７７】
モノクローナル抗体はまた、従来技術を使用して容易に生成され得る（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号（これらは、本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８（これもまた、本明細書中で参考として援用されている）もまた参照のこと）。
【００７８】
他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１、１９８９年１２月を参照のこと；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５７２８−５７３２、１９８９年８月もまた参照のこと；Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９、１９９０年１月もまた参照のこと）。
【００７９】
以下を含む広範な種々のアッセイが、Ｆｋｈsf（または本明細書中に記載されているＦｋｈsfの変異形態）に対して反応性である抗体の存在を決定するために利用され得る：例えば、向流免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８もまた参照のこと）。
【００８０】
一旦、適切な抗体が得られると、それらは、当業者に周知の多くの技術によって単離または精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）。適切な技術としては、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム上での精製、または任意のこれらの技術の組み合わせが挙げられる。
【００８１】
本発明の抗体は、免疫系を調節するためだけではなく、診断試験のため（例えば、ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのタンパク質またはペプチドの存在を決定するため）、治療目的のため、またはタンパク質の精製のためにも利用され得る。
【００８２】
（ｃ．変異体Ｆｋｈsf）
本明細書中および以下の実施例において記載されているように、Ｆｋｈsfの改変されたバージョンが、Ｆｋｈsfの正常な活性を阻害し、それによって免疫系を調節するために利用され得る（一般的には、上記の核酸分子およびタンパク質を参照のこと）。
【００８３】
ＦＫＨsfまたはＦｋｈsfのさらなる変異体または改変された形態は、広範な種々のインビトロでのアッセイのため（例えば、種々のモデルにおいてこのようなタンパク質の影響を試験するため）、または抗体の開発のために、利用され得る。
【００８４】
（３．核酸分子）
本発明の他の局面においては、免疫系を調節し得る核酸分子が提供される。例えば、１つの実施態様においては、ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの核酸配列、または変異体ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、提供される（一般的には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ：Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ．編、１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１００４−１０１２、１９９３；第ＷＯ９５／１０６０７号；米国特許第５，３５９，０５１号；同第ＷＯ９２／０６６９３号；およびＥＰ−Ａ２−６１２８４４号を参照のこと）。簡潔には、このような分子は、それらが、転写されるＦｋｈsfのｍＲＮＡ配列の領域と相補的であり、そしてワトソン−クリック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖の核酸は、ｍＲＮＡの続くプロセシングを妨害し、それによってタンパク質の合成を妨げる。
【００８５】
本発明の他の局面においては、ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsf、またはＦＫＨsfもしくはＦｋｈsfの変異形態を阻害し得るリボザイムが提供される。本明細書中で使用される場合、「リボザイム」は、特異的認識のためのアンチセンス配列およびＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことが意図される。触媒的な鎖は、化学量論的な濃度を超える濃度で、標的ＲＮＡの特異的な部位を切断する。広範な種々のリボザイムが、本発明の状況において利用され得る。これは例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２２０、１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５９６−６００、１９８８；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：１９６、１９８８、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５、１９８８によって記載されている）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９３年１０月１９日に発行された米国特許第５，２５４，６７８号、Ｈｅｍｐｅｌら、１９９０年３月２６日に公開された、欧州特許公開番号第０ ３６０ ２５７号によって記載されている）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａのリボソームＲＮＡに基づくリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）を含む。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡから構成されるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそれらのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。
【００８６】
（４．標識）
ＦＫＨsfもしくはＦｋｈsf（ならびにそれらの変異形態）、または上記または下記の任意の候補分子が、以下を含む種々の化合物で標識され得る：例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質（例えば、フィコエリトリン）、ローダミン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａが挙げられる。放射性核種の代表的な例としては、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８，Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９，Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに、上記の抗体もまた、標識され得るか、またはリガンド結合対の１つのパートナーに対して結合体化され得る。代表的な例としては、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
【００８７】
上記の代表的な標識と本明細書中に記載されている分子とを結合体化または標識するための方法は、当業者によって容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第４，７４４，９８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許第４，８９７，２５５号；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；Ｉｎｍａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、ＪａｋｏｂｙおよびＷｉｌｃｈｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３０頁、１９７４をもまた参照のこと；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２、１９８８をもまた参照のこと）。
【００８８】
（薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とともに、免疫系を調節する上記の分子の１つを含む、種々の薬学的組成物を提供する。一般的には、このようなキャリアは、使用される投与量および濃度では、レシピエントに対しては非毒性である。通常は、このような組成物の調製は、緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む））、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオンなど）、安定剤、および賦形剤と、治療薬との混合を含む。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。好ましくは、薬学的組成物（または「医薬品」）は、滅菌の、発熱物質を含まない形態で提供される。
【００８９】
さらに、本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に関する説明書を提供するパッケージング材料とともに、容器内に配置され得る。一般的には、このような説明者は、試薬の濃度、ならびに特定の実施態様においては、薬学的組成物の再構成のために必要とされ得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、もしくはＰＢＳ）の相対的な量を記載する具体的な表現を含む。
【００９０】
（処置方法）
本発明はまた、免疫系を調節するための方法を提供する。免疫系を調節する、本明細書中に記載されている分子の使用を通じて、温血動物中の広範な種々の状態が、容易に処置され得るかまたは予防され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含む）の両方が挙げられる。このような方法は、変更された免疫系を有する患者において治療的な価値があり得る。これは、種々の免疫不全症候群、ならびにＴ細胞媒介自己免疫疾患を有する患者の、化学療法を受けている患者を含む。治療的な価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性によって認識され得る。
【００９１】
治療用分子は、分子の型に依存して、種々の処方物において種々の経路を介して投与され得る。例えば、１つの実施態様においては、有機分子が、経口もしくは鼻内経路によって送達され得るか、または注射（例えば、筋肉内、静脈内など）によって送達され得る。
【００９２】
１つの局面においては、免疫系を調節するための方法が提供される。この方法は、免疫系を調節する分子の発現を指向するベクターを、リンパ系細胞中に導入する工程、および温血動物にベクターを含有する細胞を投与する工程を包含する。他の関連する実施態様においては、このベクターは、所望される標的の位置（例えば、骨髄）に直接投与され得る。
【００９３】
ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を含む、広範な種々のベクターが、このような治療目的のために利用され得る。適切なウイルスベクターの代表的な例としては、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、第ＷＯ９４／２６９１４号、第ＷＯ９３／９１９１号、第ＷＯ９９／２０７７８号、第ＷＯ９９／２０７７３号；第ＷＯ９９／２０７７９号；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７、１９９３；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、７５（２）：２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９、１９９３：Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８、１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（第ＷＯ９５／１３３６５号；Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ、７９：４９２７−４９３１，１９８２；およびＯｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０、１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、第ＥＰ０，４１５，７３１号；第ＷＯ９０／０７９３６号；第ＷＯ９１／０２８５号、第ＷＯ９４／０３６２２号；第ＷＯ９３／２５６９８号；第ＷＯ９３／２５２３４号；米国特許第５，２１９，７４０号；第ＷＯ９３／１１２３０号；第ＷＯ９３／１０２１８号）が挙げられる。同様に、種々のウイルスまたは非ウイルス供給源に由来する種々のエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列など）の混合物を含むウイルスベクターが、構築され得る。種々の実施態様においては、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかが、以下に記載されている方法および組成物において利用され得る。
【００９４】
本発明の他の実施態様においては、免疫系を調節する分子（例えば、変異体Ｆｋｈsf、またはアンチセンスもしくはＦｋｈsfを切断するリボザイム分子）をコードする核酸分子が、以下を含む種々の別の技術によって投与され得る：例えば、ポリ−Ｌ−リジンＤＮＡ複合体と結合体化したアシアロオソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら、ＰＮＡＳ ９２１２２−９２１２６，１９９３）、殺傷したアデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、１９９２）、サイトフェクチンによって媒介される導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接的なＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８１５−８１８、１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４；１６９８５−１６９８７、１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｃｉｒｃ、８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ、８４：７８５１−７８５５、１９８７）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ、８８：２７２６−２７３０、１９９１）；およびタンパク質自体をコードする核酸分子の、単独（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３）またはＰＥＧ−核酸複合体を利用するかのいずれかである直接的な送達。
【００９５】
本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例としては、リボザイムおよびアンチセンス分子（これらのそれぞれは、以下により詳細に議論されている）が挙げられる。
【００９６】
当業者に明らかであるように、投与の量および頻度は、もちろん、処置される徴候の性質および重篤度、所望される応答、患者の状態のような因子に依存する。代表的には、組成物は、上記のような種々の技術によって投与され得る。
【００９７】
以下の実施例は、例示によって付与され，そして限定によっては与えられない。
【００９８】
（実施例）
（実施例１）
（ＳＣＵＲＦＹ変異体の原因である遺伝子の同定）
（Ａ．ＳＣＵＲＦＹ遺伝子のクローニング）
もともとのｓｃｕｒｆｙ変異は、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）に１９４９年にストックされた一部近交系のＭＲにおいて自発的に生じた。戻し交配分析を、マウスＳｃｕｒｆｙ変異を含むＸ染色体の動原体周辺領域（ｐｅｒｉ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）を詳細にマップするために使用した。同じ領域をカバーする物理的なマップを、重複している酵母および細菌の人工染色体（ＹＡＣおよびＢＡＣ）の単離を通じて並行して生成した。一旦、候補領域が、約５００キロ塩基対（ｋｂ）にまで狭められると、大規模なＤＮＡ配列決定を、４個の重複するＢＡＣクローンについて行った。この５００ｋｂの領域内の全ての転写ユニットを、配列データベースの検索とコンピューターによるエキソン予想プログラムの適用との組合せにより同定した。次いで、候補遺伝子を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙに由来するＲＮＡサンプルからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得たｃＤＮＡの配列を比較することによって、Ｓｃｕｒｆｙ特異的変異についてスクリーニングした。Ｆｋｈsfと本明細書中で呼ばれる１つの遺伝子においては、２塩基対（ｂｐ）の挿入が、正常なｃＤＮＡと比較してＳｃｕｒｆｙ ｃＤＮＡのコード領域中に見出された。挿入を、いくつかのマウスの株（Ｓｃｕｒｆｙ変異体を含む）のゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を比較することによって確認した。再び、２ｂｐの挿入を、Ｓｃｕｒｆｙサンプル中でのみ見出し、これによって、これをＳｃｕｒｆｙ欠失の原因である可能性があると確定した。
【００９９】
マウスのＦｋｈsf遺伝子は、ＢＡＣクローン８Ｃ２２中に含まれ、そして完全に配列決定されている。これは約１４ｋｂにまたがり、そして１１個のコードエキソンを含む。エキソン中断の位置は、ＧｅｎＳｃａｎエキソン推定プログラムを使用して、ゲノムＤＮＡ配列のコンピューターによる分析によって最初に同定した；次いで、エキソンの位置を、ゲノム配列に対する正常なマウスの組織に由来するｃＤＮＡ配列の直接的な比較によって確認した。
【０１００】
得られたｃＤＮＡの長さは、２１６０ｂｐである；コード領域は、その１２８７ｂｐにまたがり、４２９アミノ酸のタンパク質をコードする。図１はマウスのＦｋｈsf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す；翻訳は、２５９位で開始し、そして１５４６位で終結すると推定される。図２は、マウスのＦｋｈsfのアミノ酸配列を示す。
【０１０１】
（ｂ．Ｆｋｈsfトランスジェニックマウスの生成）
Ｓｃｕｒｆｙ表現型の真の原因としてのＦｋｈsf遺伝子の実態を、トランスジェニックマウスにおいて確認した。簡潔には、Ｆｋｈsf遺伝子の約７ｋｂのコード領域、ならびに隣接する配列の上流の約２０ｋｂ、および下流の配列の約４ｋｂ（図５）を含む正常なゲノムＤＮＡの３０ｋｂのフラグメントを、正常なマウスの１細胞胚中にマイクロインジェクションした。それぞれが別々のインテグリンを有する５匹の個々の崩壊させた動物を生成し、そして各トランスジェニック株に由来する雄性の動物を、雌性のｓｆキャリアと交配した。トランスジーン（正常なＦｋｈsf）およびｓｆ変異（変異Ｆｋｈsf）の両方を有する雄性の子孫を、分析した。
【０１０２】
分析は、倭小（ｒｕｎｔｉｎｇ）、鱗状の皮膚、毛皮の異常、およびｓｃｕｒｆｙ表現型の他の特徴についての動物の試験からなる。さらに、リンパ系組織（胸腺、脾臓、および結節）を回収し、そしてそれらの大きさおよび細胞数を試験し、そして正常な動物およびｓｃｕｒｆｙマウスの両方について比較した。全ての５個のトランスジェニック株について、トランスジーンを保有した雄性のｓｆ子孫は、大きさおよび重量において正常であり、そして全ての点で健常であるように見えた。これらのトランスジェニックマウスにおけるリンパ節の大きさは、正常な動物にものと類似（またはそれよりも小さい）であり（図６）、そして活性化されたＴ細胞の徴候はなかった。これらのパラメーターは、ｓｆマウスとは極端に異なり、そして正常なＦｋｈsf遺伝子の添加が、ｓｃｕｒｆｙマウス中に見出される欠損を克服し得ることを示す。従って、これによって、Ｆｋｈsf遺伝子中の変異がＳｃｕｒｆｙ疾患の原因であることを確認する。
【０１０３】
（実施例２）
（ＦＫＨsf ｃＤＮＡの生成）
完全なマウスのＦｋｈsfタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得られ得る。より詳細には、第１鎖のｃＤＮＡが、適切な供給源（例えば、マウスの脾臓）に由来する５μｇの全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングすること、および標準的な条件下で逆転写酵素を用いて伸張すること（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔキット）によって、生成する。次いで、第１鎖のｃＤＮＡのアリコートを、正方向および逆方向プライマー（正方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣ ＴＴＣ；逆方向プライマー：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴ ＣＴＧ）（０．２ｍＭの最終濃度））、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼの存在下での、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間）に供する。
【０１０４】
（実施例３）
（マウスのＦｋｈsfに対するヒトのオルソログの生成）
完全なＦＫＨsfタンパク質をコードするヒトＦＫＨsf ｃＤＮＡは、実施例２に記載されているものと本質的に同じ手順によって得ることができる。詳細には、全脾臓ＲＮＡを用いて開始し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマー（正方向プライマー：ＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴ ＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡ Ｃ；逆方向プライマー：ＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡ Ｃ）、および６０℃のアニーリング温度を除いて上記と同じＰＣＲ条件を利用する。
【０１０５】
図４は、今日までに得られた１８６９ｂｐのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、１８９位で開始し、そして１４８２位で終結すると推定される。図４は、４３１アミノ酸のヒトＦＫＨsfタンパク質の配列を示す。マウスｃＤＮＡ配列に対するヒト遺伝子の推定されるコード領域の比較は、ほぼ同一であるエキソン構造、および全タンパク質にわたる８６．１％のアミノ酸配列同一性を明らかにする。
【０１０６】
（実施例４）
（ＳＣＵＲＦＹ変異体を検出するための方法）
上記のように、Ｓｃｕｒｆｙ変異体を、最初に、ｓｆのＲＴ−ＰＣＲによって誘導されたｃＤＮＡおよび正常なマウスのＲＮＡサンプルを直接配列決定することによって発見し、そしてゲノムＤＮＡに由来する同じ領域を配列決定することによって確認した。変異の性質（すなわち、２ｂｐの挿入）は、それ自体を、多数の種々の変異検出アッセイに導く。これは、最初に、オリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このような、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、対立遺伝子特異的発現の定量的な分析を可能にし得る。
【０１０７】
一例としては、３６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴを使用して、第１鎖のｃＤＮＡから増幅する：
ＤＭＯ５９８５（正方向）：ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧ（図１のｎｔｄ．８２５−８４４）
ＤＭＯ６７２４（逆方向）：ＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣ（ｎｔｄ １２２１−１１９９）。
【０１０８】
ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜に移し、そしてＳｃｕｒｆｙ特異的な２ｂｐの挿入部位に対応する領域に相補的である末端標識オリゴヌクレオチドで標識する。２つの別々のハイブリダイゼーション反応を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙ ＰＣＲ産物を検出するために、以下のオリゴヌクレオチド（２ｂｐの挿入部位を太字で示す）を使用して行う：
正常：ＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＤＭＯ７４３９
Ｓｃｕｒｆｙ：ＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＤＭＯ６９１９。
【０１０９】
Ｓｃｕｒｆｙ変異はまた、冷却一本鎖立体構造多形性（ｃＳＳＣＰ）アッセイによっても検出され得る。このアッセイにおいては、上記と同じＰＣＲ産物を、２０％のアクリルアミド（ＴＢＥ）ゲル上で、鎖の変性後に泳動する。Ｓｃｕｒｆｙの挿入は、正常な配列と比較して鎖の移動においてシフトを生じ、そして別の鎖が、エチジウムブロマイドでの染色後に検出される。
【０１１０】
（実施例５）
（ＦＫＨSF遺伝子の発現）
半定量的なＲＴ−ＰＣＲが、広範な種々の組織および細胞株中におけるマウスおよびヒトのＦｋｈsf遺伝子の発現パターンを分析するために使用されている。発現のレベルは、偏在して発現されるＤＡＤ−１遺伝子について正規化される。簡潔には、Ｆｋｈsf遺伝子は、非常に低いレベルではあるが、これまでに試験されたほぼ全ての組織（胸腺、脾臓、分類されたＣＤ４＋およびＣＤ４−ＣＤ８−、Ｔリンパ球、ならびに腎臓、脳、ならびに種々のマウスおよびヒトのＴ細胞株、ならびにヒト腫瘍を含む）中で発現される。しかし、発現がないことが、新たに分類したマウスのＢ細胞において注目された。
【０１１１】
予想されるように、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける正常な組織対Ｓｃｕｒｆｙ組織において、発現レベルにおける差異は観察されなかった。
【０１１２】
（実施例６）
（インビトロでのＦＫＨSFの発現）
全長のマウスおよびヒトのＦｋｈsf ｃＤＮＡ、ならびに種々のｃＤＮＡのサブ領域を、哺乳動物細胞（たとえば、ヒトのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）、Ｅ．ｃｏｌｉ、または酵母中での発現が可能であるベクター中にクローン化した。Ｅ．ｃｏｌｉ系または酵母系を、Ｆｋｈsf特異的抗体を惹起する目的のためのタンパク質の産生に使用し得る（以下を参照のこと）。
【０１１３】
（実施例７）
（抗ＦＫＨSF抗体の生成）
実施例６に記載されているベクターから発現されるタンパク質を、ＦＫＨsf特異的抗体の産生のために適切な動物を免疫化するために使用する。全長または短縮されたタンパク質のいずれかを、この目的のために使用し得る。タンパク質を、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から、入手し得る。動物種としては、マウス、ウサギ、モルモット、ニワトリ、または他のものが挙げられ得る。ＦＫＨsfに対して特異的なウサギ抗血清は、生化学的な特徴によって決定されるように、生成されている（免疫沈降およびウェスタンブロッティング）。
【０１１４】
（実施例８）
（ＦＫＨSF遺伝子の機能についてのアッセイ）
ＦＫＨsfタンパク質の機能の欠損が、ｓｃｕｒｆｙ動物において観察される表現型（るいそう、敏感な免疫応答、および死）を生じるので、ＦＫＨsfタンパク質の過剰な発現を評価するためのアッセイを記載する。トランスジェニック動物（実施例１に記載されている）を、それらの免疫応答能力の状態について、いくつかの異なるパラメーターを使用して試験する。動物を、リンパ節および胸腺中に存在するリンパ系細胞の数について（図７）、およびインビトロでの刺激に対するＴ細胞の応答性について（図８）試験する。
【０１１５】
Ｓｃｕｒｆｙ変異動物は、正常な動物のそれらのリンパ節中の細胞よりもほぼ２倍多い細胞を有する。しかし、正常なＦＫＨsfタンパク質の過剰なレベルを発現するマウスは、ほぼ３倍多い細胞を含む（図７）。さらに、標準的な抗血清を使用するフローサイトメトリーによって評価される場合に、それらの細胞表面の表現型である場合（示さない）は、胸腺細胞の数は正常であり（図７）、このことは、過剰のＦＫＨsfタンパク質に関連する発達的欠損が存在しないことを示す。
【０１１６】
正常なｓｃｕｒｆｙ動物およびトランスジェニック動物はさらに、Ｔ細胞の刺激に対するそれらの増殖性応答について試験される。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体と反応し、そしてそれらの増殖性応答が、放射活性チミジンの取りこみを使用して測定される。ｓｃｕｒｆｙ細胞は、刺激の非存在下でのみ分裂するが、正常な細胞は、刺激の後に十分応答する。ＦＫＨsfトランスジェニック細胞もまた刺激に対して応答するが、応答は、正常な細胞のものよりも有意に少ない（図８）。このことは、過剰のＦＫＨsfを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が、刺激に対して応答する能力を低下させられたことを示す。
【０１１７】
（実施例９）
（ＪＭ２に関連するヒトのＦＫＨSF ｃＤＮＡ配列）
ヒトＦＫＨsf ｃＤＮＡ配列の改変されたバージョンが、ＧｅｎＢａｎｋによって公開されている配列データベース中に存在する。この配列は、ＪＭ２と呼ばれ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１号）、そしてＦＫＨsf遺伝子を含むゲノム配列に対するエキソン推定プログラムの適用の結果である（Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．ら、未公開−ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１を参照のこと）。対称的に、ＦＫＨsf ｃＤＮＡの構造は、実験によって決定された。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＧＡＰプログラムを、２つの配列を比較するために使用し、そして差異を図９に示す。２つの配列の５’末端は、ゲノムＤＮＡ配列の状況におけるそれらの位置において異なり、ＦＫＨsfの第２のコードエキソンがＪＭ２から欠落しており、そしてＦＫＨsf遺伝子の最後のイントロンが、ＪＭ２配列中ではスプライシングされない。これらの差異は、ＦＫＨsfと比較して、より短いアミノ末端ドメイン、カルボキシ末端でのフォークヘッドドメイン（以下を参照のこと）中への大きい挿入を有するＪＭ２タンパク質を生じる。
【０１１８】
（実施例１０）
（ＦＫＨsfタンパク質は種を超えて保存されている）
ＦＫＨsfタンパク質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づいて、サブ領域に分けられ得る。ＦＫＨsf中の２つの重要なモチーフは、タンパク質の中央部分中のＣ2
ＩＩ2クラスの単一のジンクフィンガー（ＺＮＦ）、およびタンパク質の最もカルボキシ
末端での二股の矢じりまたは翼状のへリックスドメインである。ＦＫＨsfと他のタンパク質との間での相同性の程度を特徴付ける目的のために、本発明者らは、タンパク質を以下の４つの領域に分けた：
アミノ末端ドメイン ：図２の残基１−１９７
図４の残基１−１９８
ジンクフィンガードメイン ：図２の残基１９８−２２１
図４の残基１９９−２２２
中央ドメイン ：図２の残基２２２−３３６
図４の残基２２３−３３６
フォークヘッドドメイン ：図２の残基３３７−４２９
図４の残基３３７−４３１。
【０１１９】
ＤＮＡＳｔａｒ配列分析パッケージによるＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを使用して、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを、これらの４つのドメインにわたる、ヒトＦＫＨsfとマウスＦｋｈsfタンパク質との間での類似性の程度を決定するために使用した。結果を、図１０に示す。類似性は、８２．８％から９６．４％までの範囲を示し、このことは、このタンパク質が非常に高度に種をこえて保存されていることを示す。
【０１２０】
（実施例１１）
（新規のＦＫＨSFに関連する遺伝子の同定）
ＦＫＨsf遺伝子配列の特有の特徴を利用して、二股の矢じりを含む分子の同じサブクラスに入る他の新規の遺伝子（およびタンパク質）を同定し得る。ＦＫＨsfタンパク質は、それが、フォークヘッドドメインに対して単一のジンクフィンガードメインのアミノ末端を、そしてフォークヘッドドメインの最もカルボキシ末端に有する点で、特有である。縮重ＰＣＲアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規の遺伝子を単離するために行い得る。例えば、以下の縮重プライマーを合成した（縮重の位置を括弧で示し、そして「Ｉ」はヌクレオシドイノシンを示す）：
正方向プライマー：ＣＡ（ＴＣ）ＧＧＩＧＡ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ）ＴＧＧ 逆方向プライマー：（ＧＡ）ＡＡＣＣＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＧ）ＴＡ（ＡＧＴ）ＡＴ（ＣＴ）ＴＣ（ＧＡ）ＴＴ。
【０１２１】
正方向プライマーは、ジンクフィンガー配列中の領域に対応し、そして逆方向プライマーは、フォークヘッドドメインの中央の領域に対応する。これらのプライマーを使用して、種々のヒト組織（肝臓、脾臓、脳、肺、腎臓などを含む）から実施例２のように産生した第１鎖のｃＤＮＡを増幅した。以下のＰＣＲ条件：０．２ｍＭの最終濃度の正方向プライマーおよび逆方向プライマー、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼ、を使用し３５サイクル（９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間）に供した。ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル（１×ＴＡＥ中で泳動）上で可視化し、そしてＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にサブクローン化した；個々のクローンを配列決定し、そして全長ｃＤＮＡのさらなる特徴付けのために使用した。
【０１２２】
あるいは、ＦＫＨsf遺伝子の特有の領域（すなわち、「アミノ末端」ドメインおよび「中央」ドメイン）を、ハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために使用し得る。種々のヒトおよび／またはマウスの組織に由来し、そしてλファージベクター（例えば、λｇｔ１１）中で増殖させたｃＤＮＡライブラリーをアガロース上にプレートし、プラークをナイロン膜に移し、そしてＦＫＨsf遺伝子の特有の領域に由来するフラグメントを用いてプローブした。高ストリンジェンシーの条件（例えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、６５℃にて、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄）下では、密接に関連するごくわずかな配列のみが、ハイブリダイズすると予想した（すなわち、９０−１００％の相同性）。上記と同じ緩衝液中での４５−５５℃でのこのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のような低いストリンジェンシーの下では、ＦＫＨsfに関連する遺伝子（６５−９０％の相同性）が同定され得る。ＦＫＨsfの特有の配列を用いて公開されているデータベースの検索によって得られる結果に基づくと、低いストリンジェンシーから中程度のストリンジェンシーまでのハイブダイゼーション実験を通じて同定される任意の遺伝子が、「ＦＫＨsfファミリー」の新規のメンバーを提示すると予想される。
【０１２３】
上記から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書中で記載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−１９１９４９（Ｐ２０１２−１９１９４９Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５０５５５（Ｐ２０１２−１５０５５５）
【出願日】平成２４年７月４日（２０１２．７．４）
【分割の表示】特願２００９−２５１５２６（Ｐ２００９−２５１５２６）の分割
【原出願日】平成１１年８月１１日（１９９９．８．１１）
【出願人】（３９８０５７４７７）ダーウィン・ディスカバリー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＲＷＩＮ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月４日（２０１２．７．４）
【分割の表示】特願２００９−２５１５２６（Ｐ２００９−２５１５２６）の分割
【原出願日】平成１１年８月１１日（１９９９．８．１１）
【出願人】（３９８０５７４７７）ダーウィン・ディスカバリー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＲＷＩＮ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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