マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）活性を調節するための作用物質及び方法
本発明は、対象の食欲及び／又は体重を調節するための方法及び新規なタイプの作用物質に関する。さらに、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の受容体複合体と相互作用しその活性を調節する作用物質のスクリーニング法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の食欲及び／又は体重を調節するための方法及び新規なタイプの作用物質に関する。さらに、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１、macrophage inhibitory cytokine-1）の受容体複合体と相互作用しその活性を調節する作用物質のスクリーニング法に関する。
【０００２】
（参照による組込み）
本特許出願は、以下の優先権を主張する：
− ２００７年８月１６日に出願された「マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）活性を調節するための作用物質及び方法。」（Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1) activity）という名称の豪州特許第２００７９０４４１２号明細書。
この出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
また、以下の特許明細書が、下記の説明において参照されている：
− 国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）；及び
− 米国特許第５，２２５，５３９号明細書。
これら２つの特許明細書の各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
体重及び食欲制御は、複雑であり、完全には特徴付けられていないプロセスである。それらの調節異常は、世界的に重要な公衆衛生上の問題である肥満に結び付く場合がある。正反対に、食欲不振症／悪液質は、最も一般的には後期癌に起因し、腫瘍又はストローマ細胞由来分子が食欲及び体重の緊縮調節を妨害し、消耗、衰弱、及び時には死に結び付くと考えられている（Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2:862-871 (2002)、Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-related weight loss. Lancet Oncol, 6:334-343 (2005)、Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res, 61:1432-1438 (2001)、Rubin, H. Cancer cachexia: its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci, 100:5384-5389 (2003)、Rall, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology 43:1219-1223 (2004) 、Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85:51-66 (2002)）。いくつかのサイトカインが、食欲不振症／悪液質の病因に関与するとされているが、インターロイキン６（ＩＬ−６、interleukin-6）は、最も可能性の高い病原的作用物質であると考えられている。しかしながら、現在まで、癌性の食欲不振症／悪液質の治療における効力を実証するような、ＩＬ−６に対するモノクローナル抗体のヒト臨床試験は存在していない。
【０００５】
ＧＤＦ−１５、ＰＬＡＢ、ＰＤＦ、及びＮＡＧ−１とも呼ばれるＭＩＣ−１は、基本条件下では発現しないが、炎症、傷害、又は悪性腫瘍の発生により誘導される場合があるＴＧＦ−βスーパーファミリーの分岐メンバーである（Bootcov, MR. et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-βsuperfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94:11514- 11519 (1997)、Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100:3410-3415 (2003)、Buckhaults, P. et al. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours. Cancer Res 61:6996-7001 (2001)、Koopmann,J. et al. Serum Macrophage Inhibitory Cytokine 1 as a Marker of Pancreatic and other Periampullary Cancers. Clin Cancer Res 10:2386-2392 (2004)、Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Hsiao, EC. et al. Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor beta superfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20:3742-51 (2000)、Schober. A. et al. Expression of growth differentiation factor-15/ macrophage inhibitory cytokine-1 (GDF-15/MIC-1) in the perinatal, adult, and injured rat brain. J Comp Neurol 439:32-45 (2001)）。ＭＩＣ−１は、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、及び乳癌を含む多くの癌により過剰発現される（Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)）。進行癌の患者では、この過剰発現は血清ＭＩＣ−１レベルの著しい増加に帰着し、そのレベルは、平均４５０ｐｇ／ｍｌから５〜５０ｎｇ／ｍｌレベル以上にまで、１０〜１００倍上昇する場合がある。個々の腫瘍は、発現レベルの個体差、及びプロコンバターゼによる成熟ＭＩＣ−１プロセシングの違いの両方のため、それらが分泌するＭＩＣ−１の量が異なる場合がある（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。ＭＩＣ−１のプロペプチドは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ、extracellular matrix）に強く結合し、その結果、インビトロ及びインビボの両方で実証可能であるＭＩＣ−１のＥＣＭ貯蔵の形成がもたらされる。プロセシングされた形態のＭＩＣ−１のみが、マトリックス結合プロペプチドを欠如しており、血液循環中へと拡散する。したがって、このプロペプチドは、ＥＣＭ貯蔵とＭＩＣ−１の循環血中レベルとのバランスをインビボで調節する（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。
【０００６】
本出願人は既に、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）に、ＭＩＣ−１活性の調節を伴う対象の食欲及び／又は体重を調節するための方法及び作用物質を記載している。そこに記載されている特定のタイプの作用物質は、ＭＩＣ−１活性の阻害を引き起こし、対象の食欲及び／又は体重の増加を引き起こすことが可能な抗ＭＩＣ−１抗体である。本明細書の下記では、ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍が食欲不振症／悪液質を誘導し、それは、ＭＩＣ−１に対する抗体を投与することにより反転させることができ、組換えＭＩＣ−１の注射により誘導することができるという証拠がさらに提供される。さらに、ＭＩＣ−１作用の機序が研究され、ＭＩＣ−１受容体複合体、並びに食欲及びエネルギー恒常性の調節を達成する潜在的中枢調節因子の特徴付けに結び付いた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）
【特許文献２】米国特許第５，２２５，５３９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】1. Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2:862-871 (2002)
【非特許文献２】2. Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-related weight loss. Lancet Oncol, 6:334-343 (2005)
【非特許文献３】3. Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res, 61:1432-1438 (2001)
【非特許文献４】4. Rubin, H. Cancer cachexia: its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci, 100:5384-5389 (2003)
【非特許文献５】5. Rall, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology 43:1219-1223 (2004)
【非特許文献６】6. Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85:51-66 (2002)
【非特許文献７】7. Bootcov, MR. et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-β superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94:11514- 11519 (1997)
【非特許文献８】8. Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100:3410-3415 (2003)
【非特許文献９】9. Buckhaults, P. et al. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours. Cancer Res 61:6996-7001 (2001)
【非特許文献１０】10. Koopmann,J. et al. Serum Macrophage Inhibitory Cytokine 1 as a Marker of Pancreatic and other Periampullary Cancers. Clin Cancer Res 10:2386-2392 (2004)
【非特許文献１１】11. Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)
【非特許文献１２】12. Hsiao, EC. et al. Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor beta superfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20:3742-51 (2000)
【非特許文献１３】13. Schober. A. et al. Expression of growth differentiation factor-15/ macrophage inhibitory cytokine-1 (GDF-15/MIC-1) in the perinatal, adult, and injured rat brain. J Comp Neurol 439:32-45 (2001)
【非特許文献１４】14. Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本出願人は、とりわけ、食欲及び／又は体重を調節するための方法及び新規なタイプの作用物質を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節するための新規なタイプの作用物質であって、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β、transforming growth factor-β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節する作用物質の同定に関する。この作用物質は、ＭＩＣ−１活性を調節することにより、対象の食欲及び／又は体重を調節可能である。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ＭＩＣ−１活性を調節する作用物質について、作用物質候補又は作用物質ライブラリーをスクリーニングするための方法も提供する。
【００１３】
したがって、第２の態様では、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００１４】
第３の態様では、本発明は、第２の態様のスクリーニング法により同定される新規な作用物質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ−ｅ】ａ．ｈＭＩＣ−１発現プラスミド構築体又は空プラスミドベクターのいずれかで恒久的に形質移入されたＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞系を側腹に皮下注射した４５匹のヌードマウスの体重及び腫瘍サイズに対する効果を示す図である。マウスの体重及び腫瘍サイズを６週間モニターした。屠殺時に血清ｈＭＩＣ−１レベルをＥＬＩＳＡにより決定し、体重減少度の平均及び標準偏差を、ｈＭＩＣ−１の血清レベル範囲に対してプロットした。ｂ．高レベルの血清中ＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスの平均体重変化に対する、ＭＩＣ−１−ＭＡｂの単回投与の効果を示す図である。１１日後、ＭＩＣ−１発現腫瘍を保持するマウスが相当量の体重を失った時、３匹のマウスには１用量ずつ、ＭＩＣ−１−ＭＡｂを単回投与で腹腔内注射し（ｉ．ｐ．）、５匹のマウスには、対照緩衝液（媒体）を注射したか、又は未処置のままにした。マウスの体重を、２０日間毎日モニターした。マウスのピーク体重増加の平均及び標準偏差を、この同じ期間中の対照マウスの平均体重変化と比較したプロットで示す。ｃ．抗体を注射した日のマウス体重に戻るまでの時間として定義したマウスの応答期間の平均及び標準偏差を、「１ｂ」のように示す図であり、投与されたＭＩＣ−１−Ｍａｂの用量に対してプロットされている。ｄ．高レベルの血清中ＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植した２０匹のヌードマウス、及び対照空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植された２０匹のヌードマウスの体重変化を示す図である。注射後８日目、ＭＩＣ−１マウスの平均体重減少が７％であった時、３連続２４時間の期間中の食餌摂取量を測定した。食餌をホッパーに入れ、時点０で計量した。２４時間後、消費された食餌は、拒絶されたもの及び食べこぼされたものを、ホッパーに入れた食餌から差し引くことにより決定した。その結果は、マウス体重１グラム当たりの１日当たりに消費された食餌の重量（グラム）の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｅ．２０匹のヌードマウスを、高レベルのＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞で異種移植し、２０匹を、対照空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞で異種移植した。ＭＩＣ−１腫瘍を保持するマウスが、およそ１８％の体重を失った時、マウスを屠殺した。肩甲骨間の褐色脂肪組織、鼠径、精巣上体、及び後腹膜の白色脂肪組織、並びに脛骨筋及び腓腹筋も解剖、摘出、及び計量した。総白色脂肪は、鼠径、精巣上体、及び後腹膜の脂肪蓄積の総重量を表す。その結果は、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表された試験片重量の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１ｆ−ｈ】ｆ．解剖に先立って、「１．ｅ」のマウスをＤＸＡ走査にかけて、総除脂肪量及び脂肪量を決定した。示されている結果は、全質量の平均及び標準偏差としてグラムで表されている。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｇ．１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、高度に精製された１０μｇの組換えｈＭＩＣ−１で１日２回皮下処置した。実験の開始時に、１０ｍｇのＭＩＣ−１−ＰＡｂ又はＣＯＮ−ＰＡｂの単回腹腔内投与を、マウスの半分に与えた。マウス体重を毎日モニターし、マウスの開始体重の割合として表し、その結果を平均及び標準偏差としてプロットした。ｈ．「１ｇ」で記載したｈＭＩＣ−１処置マウスについて、３連続２４時間の期間中モニターした１日の食餌摂取量を示す図である。食餌をホッパーに入れ、時点０で計量した。２４時間後、消費された食餌は、拒絶されたもの及び食べこぼされたものを、ホッパーに入れた食餌から差し引くことにより決定した。その結果は、マウス体重１グラム当たりの１日当たりに消費された食餌の重量（グラム）の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２】ａ．（Ａ）空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウス、（Ｂ）ＭＩＣ−１過剰発現ＤＵ１４５細胞を異種移植した１４日後、（Ｃ）「Ｂ」のように処置したが、１ｍｇのＭＩＣ−１−Ｍａｂを９日前に腹腔内に与えられたマウスの代表的な写真を示す図である。矢印は、腫瘍増殖部位を指示している。ｂ．ｈＭＩＣ−１発現プラスミド構築体又は空プラスミドベクターのいずれかで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植した、ＭＩＣ−１及び対照腫瘍を有する４０匹のヌードマウスの平均及び標準偏差体重を示す図である。
【図３】高レベルのＭＩＣ−１血清をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスから得られた結果を提供する図である。１１日後、ＭＩＣ−１発現腫瘍を保持するマウスが相当量の体重を失った時、３匹のマウスに１用量ずつ、３つの異なる用量のＭＩＣ−１−Ｍａｂ又は対照緩衝液（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。マウスの体重を、２０日間毎日モニターした。各群について、マウスの相対的な体重変化の平均及び標準偏差は、実験期間中の時間に対してプロットされている。ＭＩＣ−１−Ｍａｂを注射した時点は、矢印の先で示されている。
【図４】体重減少に対するＭＩＣ−１投与の効果を示す図である。１８匹の９週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、媒体対照又は示された量の組換えＭＩＣ−１を１日２回皮下注射した。マウスの体重を３日間毎日モニターし、この期間中の体重変化を算出した。その結果は、媒体対照を注射した初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。
【図５】ａ．自由に食餌を与えられたＭＩＣ−１処置マウス又は媒体（対照）処置マウス、及び対飼養媒体処置動物（１群当たり６匹）の体重変化を示す図である。１０μｇのＭＩＣ−１（又は媒体）を１日２回１０日間、マウスに皮下注射した。その結果は、ＭＩＣ−１注射初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。ＭＩＣ−１処置マウス（ｐ＜０．０５）及び対飼養マウス（ｐ＜０．００１）の体重は、媒体処置対照と比較して有意に低減されている。ＭＩＣ−１処置マウスと対飼養マウスとの違いは、有意ではなかった（反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ）。ｂ．１０日後に、５ａのマウスをＤＸＡ走査にかけて、全身脂肪量及び両後脚の除脂肪量を決定した。その結果は、平均（グラム）及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図６】マウスのエネルギー消費量に対するＭＩＣ−１の効果を示す図である。１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをオープンサーキット熱量計に個々に収容し、ケージに２４時間順応させた。夜間サイクルの開始時に、１０μｇのＭＩＣ−１を８匹のマウスに、対照緩衝液を７匹のマウスに皮下注射した（矢印）。絶食状態におけるＭＩＣ−１誘導性代謝変化をモニターするために、第２の注射（矢印）を次のサイクルの初期に与え、その後食餌を直ちに片付けた。エネルギー消費量（ＨＥＡＴ）、呼吸交換率（ＲＥＲ、respiratory exchange ratio）、酸素消費量及び運動性（ｘ及びｙ総計）を、２７分間の各サイクルで測定した。１２時間の明暗サイクルは、横方向のバーとして示されている。データは、２サイクルの平均であり、平均及び平均の標準誤差としてプロットされている。データを、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより比較した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図７】ｏｂ／ｏｂマウスの体重変化及び食餌摂取量に対するＭＩＣ−１の効果を示す図である。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに、媒体対照（５匹のマウス）又は体重２０ｇ当たり１０μｇの組換えＭＩＣ−１（５匹のマウス）のいずれかを、１日２回皮下注射した。ａ．体重を毎日測定し、その結果は、ＭＩＣ−１注射初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。ｂ．食餌摂取量を最終日に測定し、実験開始時の開始体重に対して標準化した。その結果を、両側ｔ検定を使用して分析した。＊＝ｐ＜０．０５。
【図８】（ａ）対照腫瘍マウス及び（ｂ）ＭＩＣ−１腫瘍マウスの視床下部弓状核におけるＧＨＲＨ ｍＲＮＡ発現のインシトゥハイブリダイゼーションのエマルジョンオートラジオグラフ画像を提供する図である。Ａｒｃ：弓状視床下部核；３Ｖ 第三脳室。スケールバー＝４０μｍ。
【図９】ＭＩＣ−１の血清レベル（ａ）又はＩＬ−６の血清レベル（ｂ）と進行前立腺癌患者の体重変化との相関性を示す図である。
【図１０】ａ．ｆｍｓＭＩＣ−１トランスジェニックマウス及びそれらのＷＴ同腹子の体重を、産後齢（０〜４８時間、Ｎ＝７６）、３週齢（Ｎ＝３６）、及び８〜９週齢（Ｎ＝４０）で測定した。各時点及び性別毎に体重を標準化した。その結果を平均及び標準偏差として示した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｂ．８週齢のｆｍｓＭＩＣ−１及びＷＴ同系対照マウスの１日の食餌摂取量を、図４ａに記載したように、３連続２４時間の期間中モニターした。その結果は平均及び標準偏差として示されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｃ．５匹の雄及び５匹の雌ｆｍｓＭＩＣ−１トランスジェニックマウス、並びに４匹の雄及び５匹の雌同系対照マウスを、５２〜５４日齢で屠殺した。脂肪蓄積並びに脛骨筋及び腓腹筋を、図１ｅのように解剖、摘出、及び計量した。その結果は、マウスの体重の割合として表された試験片重量の平均及び標準偏差として、雄及び雌別々に表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１１】視床下部における直接的ＡＡＶ仲介性ＭＩＣ−１過剰発現が体重減少を引き起こすことを示す結果を提供する図である。マウスには、ＭＩＣ−１を発現するＡＡＶ又は対照ＡＡＶを、一側性視床下部注射で与えた。１２匹のマウスの体重をモニターし、その半分には、ＭＩＣ−１を過剰発現するＡＡＶの一側性視床下部注射を行い、他の半分には、対照ＡＡＶベクターを投与した。マウスを毎日計量し、その結果を平均及び平均の標準誤差としてプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
数多くの癌、特に上皮由来の癌が、ＭＩＣ−１を過剰発現し、ＭＩＣ−１血液循環レベル（つまり血清レベル）の上昇をもたらすことは、以前から見出されている。これらのレベルは、癌疾患の病期及び進行度に比例していることが判明しており、後期癌の場合には、特に顕著な体重減少と関連している。同様に、一般的に体重減少及び食欲不振症／悪液質を伴う状態である慢性腎不全の患者では、ＭＩＣ−１血清レベルの顕著な上昇がボディマス指数（ＢＭＩ、body mass index）の低減との相関性を示すことが、今や判明している。ＭＩＣ−１レベル又はＭＩＣ−１の活性を低減させることによって、癌、慢性腎不全、又はＭＩＣ−１血清レベルの上昇が仲介する他の原因に伴う体重減少の反転又は低減が期待される。実際、上記で言及した国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）において、本出願人は、ＭＩＣ−１活性を阻害する抗ＭＩＣ−１抗体が、ＭＩＣ−１過剰発現腫瘍を有するマウスの体重増加を引き起こすことが可能であるという事実を実証した。体重減少の反転又は低減の達成は、場合によっては、患者の健康及び尊厳、ひいては癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患若しくは状態の治療を成功させる患者の可能性の向上に結び付くと予測されるため、重要な臨床転帰である。
【００１７】
本出願人は、ここではＭＩＣ−１作用機序の研究を行い、ＭＩＣ−１による食欲調節を達成する経路（複数可）及び潜在的中枢調節因子についての理解を深めることに結び付けた。より詳しくは、ＭＩＣ−１受容体複合体はＴＧＦ−βＲII受容体を含んでいることが、ここで特徴付けられた。結果として、本出願人は、食欲及び／又は体重を調節するための新規なタイプの作用物質であって、ＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節することにより作用する作用物質を同定した。さらに、本出願人は、ＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する新規なタイプの作用物質のスクリーニング法を特定した。
【００１８】
したがって、第１の態様では、本発明は、対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、本作用物質はＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節するが、本作用物質はＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節することによりその他の形で作用してもよい。
【００２０】
本作用物質は、ＭＩＣ−１活性を調節することにより、対象の食欲及び／又は体重を調節可能である。
【００２１】
より詳しくは、本作用物質は、ＭＩＣ−１の活性を阻害する（つまり、アンタゴナイズする）ことにより（例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体に結合し、それを遮断することにより）、対象の食欲及び／又は体重を増加させることが可能である。その場合には、本方法は、癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患、状態、若しくは治療によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質を治療するために好適である。
【００２２】
他方では、本作用物質は、ＭＩＣ−１の活性を増強する（つまり、アゴナイズする）ことにより（例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体に結合しその活性を刺激することによって、ＭＩＣ−１活性を模倣することにより）、対象の食欲及び／又は体重を減少させることが可能である。その場合には、本方法は、例えば肥満の治療に好適であり得る。
【００２３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（ＭＩＣ−１を含む）に対する受容体スーパーファミリーに属する受容体は、２つのＲＩ受容体モノマー及び２つのＲII受容体モノマーを含む四量体複合体である。ＭＩＣ−１受容体は、２つのＲＩ受容体及び２つのＴＧＦ−βＲII受容体を含む四量体複合体である。ＴＧＦ−βＲII受容体には多数のスプライス変異体及び他の変異体が存在し（例えば、Konrad, Lら（Konrad, L et al. Alternative splicing of TGF-betas and their high-affinity receptors TβRI, TβRII and TβRIII (betaglycan) reveal new variants in human prostatic cells. BMC Genomics 8:318 (2007)）により記載されている変異体を参照されたい）、したがって、「ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）」という用語は、本明細書中で使用される場合、そのような変異体を包含することが理解されるべきである。
【００２４】
第１の態様の方法で使用される作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーの１つ若しくは両方、及び／又はＲＩ受容体モノマーの１つ若しくは両方と相互作用することができる。しかしながら、好ましくは、この作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーの１つ又は両方と相互作用する。好ましくはＴＧＦ−βＲII受容体モノマーは、視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーである。
【００２５】
好ましくは、本方法は、ＭＩＣ−１活性を阻害することを伴い、対象（癌、（前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、及び乳癌などの、特に上皮癌）、慢性腎不全、又は他の原因疾患（例えば、関節リウマチなどの炎症性疾患）、状態（例えば、傷害、炎症、又はストレス）、若しくは治療（例えば、放射線療法又は化学療法）によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質に罹患している可能性がある）の食欲及び／又は体重を増加させるために実施される。ＭＩＣ−１活性を阻害するためには、本作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）、好ましくは視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）に結合しそれを遮断する作用物質から選択されることが好ましいが、ＲＩ受容体（複数可）に結合しそれを遮断する作用物質、又はそうでなければ、四量体ＭＩＣ−１受容体複合体のモノマー間の相互作用を阻害する作用物質も好適であることが予測される。
【００２６】
ＴＧＦ−βＲII受容体に結合しそれを遮断する好適な作用物質の例としては、ＭＩＣ−１の阻害性ペプチド断片及び模倣体が挙げられる。しかしながら、そのような作用物質は、抗ＴＧＦ−βＲII抗体（例えば、R&D Systems Inc.社、ミネアポリス、ミシガン州、アメリカ合衆国から入手可能な抗ＴＧＦ−βＲII抗体ＡＦ５３２）及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片及び組換えｓｃＦＶ断片）からなる群から選択されることが望ましい。より好ましくは、本作用物質は、ヒト化抗ＴＧＦ−βＲIIモノクローナル抗体である。ヒト化抗ＴＧＦ−βＲIIモノクローナル抗体は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書（その全開示は、参照により本明細書中に組み込まれるとみなされるべきである）に記載の方法により調製することができる。
【００２７】
ＲＩ受容体に結合しそれを遮断する好適な作用物質の例には、ＳＢ−４３１５４２（４−（５−ベンゾ（１，３）ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（Sigma Aldrich社製、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（DaCosta Byfield, S. et al. SB-505124 is a selective inhibitor of transforming growth factor-beta type I receptors, ALK4, ALK5 and ALK7. Mol Pharmacol 65:744-752 (2004)）、ＳＤ−２０８（Bonniaud, P. et al. Progressive transforming growth factor β1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am J Respir Crit Care Med 171:889-898 (2005)）（Scios, Inc.社製、フリーモント、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）、及びＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（de Gouville, AC. et al. Inhibition of TGF-beta signaling by an ALK5 inhibitor protects rats from dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis. Br J Pharmacol 145:166-177 (2005)）を含むＡＬＫ５阻害剤などの周知の阻害剤、並びにＭＩＣ−１の阻害性ペプチド断片及び模倣体が挙げられる。しかしながら、そのような作用物質は、抗ＲＩ抗体及び抗体断片（例えば、ＡＬＫ５細胞外ドメインに対するｈＡＰ−００１６抗体、Angio-Proteomie社、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国から入手可能）からなる群から選択されることが好ましい。より好ましくは、本作用物質は、ヒト化抗ＲＩモノクローナル抗体である。
【００２８】
ＭＩＣ−１活性を阻害するように実施される場合、第１の態様の方法を用いた治療に好適な対象は、ＭＩＣ−１の過剰発現を示しているか、又は少なくとも、ＭＩＣ−１の血清レベルが一貫して、２００〜１２００ｐｇ／ｍｌの正常ヒト血清レベルの高値域にある対象に限定してもよい。そのような対象は、ＭＩＣ−１のアッセイ（例えば、ＭＩＣ−I ＥＬＩＳＡ（Moore, AG. et al. TGF-β superfamily cytokine MIC-1 is present in high concentrations in the serum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 85:4781-4788 (2000)））を使用して、高い血清ＭＩＣ−１レベル（例えば、全血又は血清試料から）を検出することにより選択することができる。「高い」血清ＭＩＣ−１レベルには、８５０ｐｇ／ｍｌを超える、より好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌを超える、最も好ましくは１２００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルが含まれる。
【００２９】
或いは、本方法は、ＭＩＣ−１活性の増強させることを含み、対象（肥満に苦しんでいるか、又はそうでなければ、健康又は顕示欲のために体重減少を熱望していてもよい）の食欲及び／又は体重を減少させるために実施される。ＭＩＣ−１の活性を増強するための作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）に結合しその活性を刺激することによりＭＩＣ−１の活性を模倣する作用物質から選択されることが好ましいが、ＲＩ受容体（複数可）に結合しその活性を刺激する作用物質も好適であることが予想される。ＴＧＦ−βＲII受容体に結合しそれを刺激する好適な作用物質の例には、ＭＩＣ−１の刺激性ペプチド断片及び模倣体が含まれ、ＲＩ受容体に結合しそれを刺激する好適な作用物質の例には、ＭＩＣ−１刺激性ペプチド断片及び模倣体が含まれる。
【００３０】
さらに、第１の態様の方法は、ＭＩＣ−１受容体複合体の量（つまり、対象の内因性ＭＩＣ−１受容体複合体の量）を調整することによるＭＩＣ−１活性の調節を伴っていてもよい。ＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節するためには、本作用物質は、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる作用物質から選択されることが好ましく、ＭＩＣ−１受容体複合体をコードする遺伝子（複数可）を標的とする触媒性及び阻害性オリゴヌクレオチド分子（例えば、リボザイム、ＤＮＡザイム、アンチセンスＲＮＡ、及び低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small inhibitory RNA））、及びＭＩＣ−１受容体複合体の転写又は翻訳の阻害剤から選択されてもよい。そのような作用物質は、内因性ＴＧＦ―βＲII受容体、好ましくは内因性視床下部ＴＧＦ―βＲII受容体の量を減少させることが好ましいが、内因性ＲＩ受容体の量を減少させる作用物質も好適であり得る。そのような作用物質は、癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患、状態、若しくは治療によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質を治療に好適であることが予測される。
【００３１】
第１の態様の方法で使用するための作用物質は、任意の好適な医薬組成物／獣医学的組成物又は剤形（例えば、経口、頬腔、経鼻、筋肉内、及び静脈内投与用の組成物）に製剤することができる。典型的には、そのような組成物は、食欲及び／又は体重を調節するのに有効な量で対象に投与されることになり、したがって、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの作用物質、より好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０５〜２５μｇの作用物質を提供してもよい。好適な組成物は、最も有効な結果を達成するために必要な、１日１回の投与、１日複数回の投与、又は制御放出若しくは持続性放出用のものであってもよい。
【００３２】
さらに、本発明は、ＭＩＣ−１活性を調節する作用物質について、作用物質候補又は作用物質ライブラリーをスクリーニングするための方法も提供する。
【００３３】
したがって、第２の態様では、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、前記方法は、例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーを発現する培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を使用して、インビトロで実施される。ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性の変化は、ｅｒｋ１／２、Ｐ−ｓｔａｔ３などの１又は複数のシグナル伝達分子、及びｓｍａｄシグナル伝達経路の（例えば、リン酸化による）活性化、又は活性化の欠如を検出することにより検出することができる。或いは、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性の変化は、ＭＩＣ−１活性に関連していることが以前に報告されているａｋｔシグナル伝達経路の１又は複数のシグナル伝達分子の活性化、又は活性化の欠如を検出することにより検出することができる（Wollman, W. et al. The macrophage inhibitory cytokine integrates AKT/PKB and MAP kinase signaling pathways in breast cancer cells. Carcinogenesis 26(5):900-907 (2005)）。
【００３５】
本方法のステップ（ｉ）が、ＭＩＣ−１受容体複合体のモノマーを使用して実施される場合、モノマーは、好ましくはＴＧＦ−βＲII受容体、より好ましくは視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である。
【００３６】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマー活性の減少が検出されることは、作用物質が、対象の食欲及び／又は体重を増加させる可能性が高いことを示し得る。一方では、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマー活性の増加が検出されることは、作用物質が、対象の食欲及び／又は体重を減少させる可能性が高いことを示し得る。
【００３７】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法により同定される新規な作用物質を提供する。
【００３８】
以下の非限定的な実施例及び添付の図面を参照することにより、本発明を本明細書の下記でさらに説明する。
［実施例］
【実施例１】
【００３９】
材料及び方法
腫瘍異種移植モデル
８週齢ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹に、２００ｍｌのＰＢＳ中の５〜７×１０６個の形質移入ＤＵ１４５細胞を皮下注射した。ＤＵ１４５細胞を、成熟ＭＩＣ−１（ＭＩＣ−１）、全長ＭＩＣ−１、ＭＩＣ−１のプロコンバターゼ部位欠失変異体、又は空ベクターを含むpIRES2-EGFPプラスミド（Clontech社製、マウンテンビュー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）で形質移入した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。目視で確認できるようになったら、腫瘍サイズを測定し、マウスを６週間１〜３日毎に計量した。
【００４０】
除脂肪量及び脂肪量を、二重Ｘ線吸光光度計（ＤＸＡ、dual X-ray absorptiometer）（Lunar Piximus II、GE Medical Systems社製、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）、並びに白色及び褐色脂肪組織蓄積、脛骨筋及び腓腹筋の解剖の両方によって決定し、その後マウスの体重を、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表した。
【００４１】
ＭＩＣ−１過剰発現トランスジェニックマウスの作製
従来の方法により、トランスジェニックマウスを構築した。手短かに言えば、マウスＭＩＣ−１の全長コード配列の発現をマクロファージ特異的に進める修飾ｃ−ｆｍｓプロモーター配列を含有するプラスミド構築体を線形化し、Ｃ５７ＢＬ６卵母細胞に注入した。その後、その結果生じたトランスジェニックマウスをＷＴＣ５７ＢＬ６マウスと交尾させ、その結果生じたトランスジェニックマウス系をｆｍｓＭＩＣ−１と呼び、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価される、脾臓（マクロファージが豊富な組織）におけるＭＩＣ−１発現の増加に基づいて選択した。ＭＩＣ−１は、マウス血清で容易に検知可能な程度にまで強力に発現した。
【００４２】
ＭＩＣ−１試薬
ＭＩＣ−１抗体及び組換えタンパク質はすべて、文献に記載されているように調製及び精製した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Fairlie, WD. et al. Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-β superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1): Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 40:65-73 (2001)、Brown, DA. et al. Concentration in plasma of macrophage inhibitory cytokine-1 and the risk of cardiovascular events in women. Lancet 359:2159-2163 (2002)）。組換えＭＩＣ−１を、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の順化培地中で発現させ、酵母ピキア・パストリスの順化培地から疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、その後逆相ＨＰＬＣの組合せを使用して精製した。組換えＭＩＣ−１で免疫したか又は未免疫のどちらかのヒツジに由来する血清のプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって、ＭＩＣ−１ ＰＡｂ又は対照ＩｇＧをそれぞれ調製した。いくつかの実験では、精製組換えＭＩＣ−１がカップリングされていたセファロースカラムでＭＩＣ−１ ＰＡｂを精製することにより、アフィニティー精製抗ＭＩＣ−１抗体を調製した。ＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体をハイブリドーマから取得し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００４３】
ＭＩＣ−１発現用に操作されたＡＡＶベクターの作製
ヒトＭＩＣ−１のｃＤＮＡを、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、woodchuck hepatitis virus post-transcriptional-regulatory element）、及びＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ、inverted terminal repeat）が隣接するウシ成長ホルモンポリアデニル化（plyadenylation）シグナルを含有するＡＡＶ発現プラスミドに、ＣＢＡ（ニワトリβ−アクチン、chicken β-actin）プロモーターの制御下でサブクローニングした。導入遺伝子インサートを有していないＡＡＶ発現プラスミドをＡＡＶにパッケージングし、対照ベクターとして使用した。その後、本質的に記載されているように、感染性ＡＡＶ粒子を産生した（Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。手短かに言えば、標準的ＣａＰＯ４形質移入法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞をＡＡＶ及びヘルパープラスミドで同時形質移入した。形質移入６０時間後に細胞を回収し、イオジキサノール密度勾配の超遠心分離により、ＡＡＶベクターを細胞溶解物から精製し、その後ＰＢＳに対して濃縮及び透析した。リアルタイムＰＣＲ（ABI Prism 7700型）を使用してベクターを滴定し、ベクター保存液はすべて１ｍｌ当たりゲノム数１×１０１３に希釈した。
【００４４】
代謝率、呼吸交換率、及び身体活動の測定
代謝率は、８チャンバーオープンサーキット熱量計（Oxymaxシリーズ、Columbus Instruments社製、コロンバス、オハイオ州、アメリカ合衆国）を使用して、８〜１０週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ、ｆｍｓＭＩＣ−１、又はＣ５７Ｂｌ６マウスのいずれかで、間接熱量測定法により測定した。マウスは、特別に作製されたプレキシガラスケージ（２０．１ｃｍ×１０．１ｃｍ×１２．７ｃｍ）に個々に収容されていた。温度は、０．６ｌ／分の空気流を用いて２２℃に維持されていた。食餌及び水はどちらも自由に摂取可能であったか、又はいくつかの実験では、ＭＩＣ−１注射後１２時間はマウスに食餌を与えなかった。記録を始める前に、マウスを２４時間ケージに順応させた。その後、１０μｇのＭＩＣ−１又は対照緩衝液のいずれかをマウスに皮下注射し、その後、１２時間モニターした。酸素消費量（ＶＯ２）を２７分毎に測定し、呼吸交換率（ＲＥＲ）を、ＶＣＯ２／ＶＯ２として算出した。エネルギー消費量（生成されたｋｃａｌの熱）は、発熱量（ＣＶ、Calorific Value）×ＶＯ２として算出し、ＣＶは３．８１５＋１．２３２×ＲＥＲであった。熱発生データの統計分析は、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡにより行った。
【００４５】
対飼養実験
実験は、３群の８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して実施した。マウスは、実験開始前に１週間個々に収容されていた。１群のマウスを、１０μｇのＭＩＣ−１の皮下注射で１日２回処置し、食餌は自由に与えた。第２の群の対照マウスにはビヒクルのみを注射し、この場合も食餌は自由に与えた。第３の対飼養の群にはビヒクルのみを注射し、ＭＩＣ−１注射マウスと対飼養した。
【００４６】
対飼養は、ＭＩＣ−１処置群により消費された食餌を２４時間毎に測定することにより行った。その翌日、対飼養マウスには、前日にそれらのＭＩＣ−１処置対により消費されたのと同じ量の食餌を与えた。食餌摂取量を測定するために、ペレット食餌を計量し食餌ホッパーに入れ、２４時間後に残っていた食餌を再び計量し、食べこぼし及び糞便を補正した差は、１日の食餌摂取量を表していた。
【００４７】
癌性悪液質患者コホート
ＭＩＣ−１レベルを推定するための血清試料を、癌性悪液質に関する文献に公表された研究に参加した患者から取得した（Pfitzenmaier, J. et al. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 97:1211-1216 (2003)）。手短かに言えば、これは、前立腺疾患を有していない１０患者の対照群、器官内限局の前立腺癌（ＣａＰ、cancer of the prostate）を有すると新たに診察された１９患者の群、及び進行ＣａＰを有する３８患者の群であった。さらなる分析のために、この群を２つの亜群：悪液質を示していない進行前立腺癌及び悪液質を示している進行前立腺癌に分割した。進行前立腺癌患者を、研究参加に先立って腫瘍学者により決定された臨床状態に基づいて分類した。患者が３〜６か月の期間にわたる体重減少及び食欲減少（食欲不振症）を示した場合、その患者を悪液質であると決定した。両症状が存在しなかった場合、患者は非悪液質であるとみなした。単一の症状が存在した場合、低エネルギーレベル、疲労、又は低運動耐容能のうち１つの症状が存在した場合のみ、悪液質と診断した。進行ＰＣａ非悪液質亜群は、１４患者で構成されていた。３／１４患者で体重減少が見られ、平均±ＳＥＭ体重減少は０．８７±０．５１ｋｇ（中央値：０ｋｇ；範囲：０〜６．２ｋｇ）であった。幾人かの患者は、体重減少にもかかわらず、所属腫瘍学者により決定された彼らの臨床状態に従うと悪液質であるとはみなされなかった。年齢の中央値は、７２．５歳であった。悪液質亜群は、２４患者で構成されていた。１人の患者だけが、第２の基準に基づいて悪液質群に分類された。この群のすべての患者が体重減少を示し、平均±ＳＥＭ体重減少は６．８９±１．００ｋｇ（中央値：４．７ｋｇ；範囲：１．５〜２１．９ｋｇ）であった。年齢の中央値は、６８．５歳であった。
【００４８】
マウス視床下部内注射
実験はすべて下記の手順を使用して行われた。マウスに、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン（keatmine）及び２０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Parke Davis-Pfizer社製、シドニー、オーストラリア、及びBayer AG社製、レーヴァークーゼン、ドイツ）で麻酔をかけ、頭を頭蓋骨が水平となる位置にして、Kopf定位固定フレーム（David Kopf製、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）に固定した。マウスには、マイクロ４マイクロシリンジポンプコントローラー（World Precision Instruments Inc.社製、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国）に取り付けられた１０μｌハミルトンシリンジを使用して、視床下部に関連物質を０．１μｌ／分の速度で一側性に注射した。
【００４９】
サイトカインの直接注射の場合、成体ＷＴマウスに、１μｌのＭＩＣ−１、１μｌのレプチン、又は１μｌの対照溶液を、ブレグマを基準にして２．３ｍｍ後側、±０．３ｍｍ外側、５．６ｍｍ腹側の、ＡＲＣに対応する座標を使用して注射した（Sainsbury, A. Schwarzer, C. Couzens, M. Herzog, H. Y2 receptor deletion attenuates the type 2 diabetic syndrome of ob/ob mice. Diabetes 51:3420-3427 (2002)）。注射開始３０分後に、マウスを屠殺した。灌流により脳を固定し、Ｐ−ｓｔａｔ３ニューロンを下記のように免疫組織化学検査により識別した。
【００５０】
抗ＴＧＦ−β受容体抗体の投与
抗ＴＧＦ−β受容体抗体の注射を伴う実験の場合、１．５μｌの抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１μｌ／分の速度で、３匹の成体マウスの後視床下部区域に一側性に注射した。注射した抗体は、ＴＧＦ−βＲII（R&D Systems, Inc.社製）、又はＢＭＰ ＲII（GeneTex, Inc.社製、サンアントニオ、テキサス州、アメリカ合衆国）、又はレプチン受容体（Upstate Biotech.社製、レークプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ合衆国）に対する阻害性ヤギ抗体であった。この例では、注射後１０分間は針を刺したままにしておき、拡散を可能にした。注射座標は（ブレグマから）：前側−後側、−２．３ｍｍ；中央−外側、−０．５ｍｍ；背側−腹側、−４．５ｍｍであり、後視床下部区域に対応していた（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）。ＴＧＦ−βＲII抗体の注射２４時間後、午前１０時〜午後１２時に１００μｇのｈＭＩＣ−１を動物に腹腔内注射した。注射した正確に３０分後、下記に記載するように後視床下部区域のｃ−ｆｏｓ及びＴＧＦ−βＲII免疫反応性ニューロンを検出するために、マウスを屠殺して脳を回収した。
【００５１】
代替実験では、６匹の成体雄マウスを３群に分割した：１．５μｌ抗ＴＧＦ−βＲII抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（R&D Systems, Inc.社製）、１．５μｌ抗ＢＭＰ ＲII抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（GeneTex Inc.社製、サンアントニオ、テキサス州、アメリカ合衆国）、又は１．５μｌ抗レプチン抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Upstate Biotech.社製）を、ＡＲＣに一側性に注射した。注射後１０分間は針を刺したままにしておき、拡散を可能にした。注射座標は（ブレグマから）：前側−後側、−１．９４ｍｍ；中央−外側、−０．４ｍｍ；背側−腹側、−５．５ｍｍであり、弓状視床下部核に対応していた（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）。注射２４時間後、午前１０時〜午後１２時に１００μｇのｈＭＩＣ−１を動物に腹腔内注射し、注射３０分後に、下記に記載するように弓状視床下部区域のｃ−ｆｏｓ免疫反応性を検出するために、マウスを屠殺して脳を回収した。
【００５２】
マウス脳の免疫組織化学検査及び免疫蛍光検査
当日の定時（午前１０時〜午後１２時）に、１０μｇ又は１００μｇいずれかのｈＭＩＣ−１又は対照緩衝液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。ｃ−ｆｏｓ免疫反応性における変動を可能な限り最小にするのを保証するため、マウスはすべて、１０μｇのｈＭＩＣ−１の腹腔内注射後、正確に６０±１分後に屠殺された。Ｐ−ｓｔａｔ３の場合は、５ｍｇ／ｋｇ（約１００μｇ）のレプチン、１００μｇのｈＭＩＣ−１、又は対照緩衝液でマウスを処置し、腹腔内注射した正確に３０分後、マウスを屠殺した。マウスに深い麻酔をかけ、２５ｍｌのリン酸緩衝液中０．９％生理食塩水で、その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．４）で調製した冷却４％パラホルムアルデヒドで灌流することにより、脳を固定した。脳を直ちに摘出し、３０分間４％パラホルムアルデヒド中に置き、その後、リン酸緩衝液中３０％スクロース溶液の中に終夜置いた。脳を３０μｍの冠状切片に薄切し、５０％アルコール中１％Ｈ２Ｏ２で２０分間洗浄して内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させた。一次抗体、ウサギ抗マウスｃ−Ｆｏｓ（ｓｃ−５２；Santa Cruz Biotechnology Inc.社製、サンタクルーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を、０．１％トリトンｘ−１００を含有するＰＢＳで１：５０００に希釈し、その後終夜インキュベートした。ウサギ抗マウスホスホ−Ｓｔａｔ３（Cell Signaling Technology Inc.社製、ダンバーズ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２抗体（Cell Signaling社製）、及びヤギ抗マウスＴＧＦ−βＲII（R&D Systems社製）を、それぞれ１：５００、１：２０００、及び１：２０００に希釈したという点を除いて、同様に処理した。ＰＢＳ−トリトンで３回各１０分間洗浄した後、切片を、ＰＢＳで１：２５０に希釈したビオチン化抗ウサギ二次抗体（Sigma Aldrich社製）又は抗ヤギ二次抗体（Chemicon社製、テメキュラ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）と共に２時間インキュベートした。切片を、３０分間ＰＢＳで洗浄し、その後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（Vectastain社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）で、３０分間室温でインキュベートした。ニッケル増強染色を使用して１切片上の２つの抗体の反応性を区別したいくつかの実験の場合、切片をＰＢＳで洗浄し、その後０．０４％硫酸ニッケルアンモニウムの存在下で、０．０５％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Sigma社製）及び０．００７％過酸化水素を用いて処理した。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、DAKO社製（カーピンテリア、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）ジアミノベンジジンで５分間処理した。スライドを水中ですすぎ、カバーガラスをかける前にキシレンに通して脱水した。核内Ｆｏｓ陽性ニューロンを、Zeiss Axioplan光学顕微鏡のグリッドレチクル及び１０×対物レンズを用いて計数した。違いが見てすぐに分かったところを含む領域では、ｃ−ｆｏｓ陽性核を計数した。目的の各脳核の場合、Franklin及びPaxinos（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）による定位固定座標におけるマウス脳の図譜に従って、切片を３枚毎に計数して、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロンを定量化した。同時に染色した２群（１群当たり５匹のマウス）間で比較を行い、各核中のニューロン計数の平均数を、左側及び右側の両方から決定した。すべての群を最終分析用にプールし、群間の違いは、ＡＮＯＶＡ及び、その後フィッシャーの事後検定により評価した。
【００５３】
免疫蛍光検査の場合、一次抗体、ウサギ抗マウスＰ−Ｓｔａｔ３（Cell Signaling社製）及びヒツジ抗マウスα−ＭＳＨ（ＡＢ５０８７；Chemicon社製）を、０．１％トリトンｘ−１００を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、phosphate-buffered saline）で１：５０００及び１：４０００に希釈し、次いで終夜インキュベートした。ＰＢＳ−トリトンで３回各１０分間洗液した後、ＰＢＳで１：２５０に希釈したAlexaフルオロフォア（Alexa Fluor（登録商標）５９４及びAlexa Fluor（登録商標）４８８；Molecular Probes社製、ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国）とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体及びロバ抗ヒツジ二次抗体で、切片を３時間インキュベートした。切片を、ＰＢＳで３回各１０分間洗浄し、フルオロフォアシグナル（ｃ−Ｆｏｓの場合は赤色、及びα−ＭＳＨニューロンの場合は緑色）を、Zeiss Axioplan光学顕微鏡（Oberkochen、ドイツ）で検査した。
【００５４】
インシトゥハイブリダイゼーション
当日の定時（午前１０時〜午後１２時）に、１０μｇのｈＭＩＣ−１又は対照緩衝液のいずれかを、マウスに腹腔内注射した。マウスはすべて、腹腔内注射した正確に６０分後に屠殺し、直ちに脳を摘出し、ドライアイスで凍結した。冠状切片（２０μｍ）をクリオスタットで切断し、Superfrost（登録商標）スライド（Menzel-Glaser社製、ブラウンシュワイク、ドイツ）に解凍マウントした。ＭＩＣ−１注射マウス及びＰＢＳ注射マウス（ｎ＝５匹のマウス／群）の同じ冠脳側位に由来するマッチング切片を、以前に記載されているように（Sainsbury, A. Schwarzer, C. Couzens, M. Herzog, H. Y2 receptor deletion attenuates the type 2 diabetic syndrome of ob/ob mice. Diabetes 51:3420-3427 (2002)）、マウスＮＰＹ（5'-GAGGGTCAGTCCACACAGCCCCATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3'）（配列番号１）；マウスＰＯＭＣ（5'-TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCACACATCTATGGAGG-3'）（配列番号２）；マウスＧＨＲＨ（5'-GCTTGTCCTCTGTCCACATGCTGTCTTCCTGGCGGCTGAGCCTGG-3'）（配列番号３）に相補的な放射性同位体標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して一緒にアッセイした。
【００５５】
散在性ニューロンのｍＲＮＡレベルを評価する場合、浸漬切片の画像を、Zeiss Axiophot顕微鏡に取り付けられたProgRes 3008カメラ（Zeiss社製、イェーナ、ドイツ）を使用してデジタル化した。単一ニューロン上の銀色粒子密度を、ＮＩＨイメージ１．６１ソフトウェア（Wayne Rasband作成、zippy.nimh.nih.govの匿名ＦＴＰから入手可能）を使用して評価した。バックグラウンド標識化は一定であり、特定シグナルの５％を超過することはまったくなかった。
【００５６】
混合免疫組織化学検査（インシトゥハイブリダイゼーション）
Ｃ５７Ｂ６マウスを、上記で概説したように組換えｈＭＩＣ−１で処理し、Ｐ−ｓｔａｔ３免疫組織化学検査の場合とまったく同様に処理した。以前に概説したものに軽微な変更を加えて、Ｐ−ｓｔａｔ３の免疫組織化学標識化を実行した。抗Ｐ−ｓｔａｔ３抗体を、０．３％トリトンＸ−１００、０．１％ＢＳＡ、及びヘパリン５ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳで１：２０００に希釈した。切片を４℃で４８時間インキュベートし、特異的抗体標識化を、上記と同じ手順を使用して検出した。上記で概説したように、切片をマウントし、ＮＰＹインシトゥハイブリダイゼーションを実施した。
【００５７】
統計分析。
前立腺癌患者のデータを、線形回帰分析、単変量ロジスティック回帰分析、及び多変量ロジスティク回帰分析に加えて、マンホイットニーＵ検定を使用して分析した。癌関連体重減少の予測に関する独立型検査としての血清ＭＩＣ−１とＩＬ−６との比較は、マクネマーの検定（GraphPad社製、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用して行った。代謝データの比較は、PRISM4を使用して二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより行った。特に指定のない限り、違いに関する他のすべての統計学的評価は、独立両側Ｔ検定を使用して行った。特に指定のない限り、グラフのエラーバーはすべて標準偏差を示す。特に明記しない限り、分析はすべて、STATVIEW VERSION 4.5（Abacus Concepts社製、バークレー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用して実施した。
【００５８】
結果
ＭＩＣ−１は急激な体重減少を誘導し、それはＭＩＣ−１に対する抗体によって反転可能である
ＭＩＣ−１の局所的及び全身性過剰発現の効果を理解するために、ＭＩＣ−１を構成的に産生しないヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５を、ヒトＭＩＣ−１（ｈＭＩＣ−１）発現プラスミド構築体で恒久的に形質移入した。これらの構築体は、ＭＩＣ−１のマトリックス結合を仲介するプロペプチドドメインを保持していたか、又は欠損していた（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。形質移入されたＤＵ１４５細胞系をヌードマウスの側腹に皮下注射して、異種移植腫瘍を確立した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。マウスを６週間モニターした後、血清ｈＭＩＣ−１レベルを高度に特異的なＥＬＩＳＡを使用して決定した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Fairlie, WD. et al. Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-β superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1): Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 40:65-73 (2001)、Brown, DA. et al. Concentration in plasma of macrophage inhibitory cytokine-1 and the risk of cardiovascular events in women. Lancet 359:2159-2163 (2002)）。腫瘍由来ｈＭＩＣ−１が上昇したマウスでは、エンドポイント血清ＭＩＣ−１濃度に比例して、進行的に体重が減少した（図１ａ、２ａ、及び２ｂ）。正常なヒトに見出されるレベルと類似した、低血清レベルの腫瘍由来ｈＭＩＣ−１（０〜１５００ｐｇ／ｍｌ）を示すマウスでは、体重が約１９％増加し、これらのマウスの若年齢と一致した（図１ａ）。ＭＩＣ−１レベルが中程度に上昇したマウスでは（１５０１〜８５００ｐｇ／ｍｌ）、それらの体重の約３％が失われ、ＭＩＣ−１レベルが顕著に上昇したマウスでは（８５００ｐｇ／ｍｌを超える）、実験期間中に約２８％の体重が失われた（図１ａ）。対照腫瘍を有するマウスでは、体重増加が実験期間中継続したため、対照群に対するＭＩＣ−１の実効的な効果は、ｈＭＩＣ−１の血清レベルが中程度であるマウス及びｈＭＩＣ−１の血清レベルが高いマウスで、それぞれ２２％及び４７％の体重減少であった。
【００５９】
体重減少に対するＭＩＣ−１効果の特異性を直接的に実証するために、ポリクローナルヒツジ抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧ（ＭＩＣ−１−ＰＡｂ）を腫瘍保持マウスに注射することにより、その作用を反転させた。ＭＩＣ−１の体重低減効果のこの反転は、対照ＩｇＧ（ＣＯＮ−ＩｇＧ）を使用した際には見られなかった（データ非表示）。加えて、ｈＭＩＣ−１（ＭＩＣ−１−ＭＡｂ）に特異的なモノクローナル抗体の単回注射は、このＭＩＣ−１関連体重減少（図１ｂ、１ｃ、２ａ、及び３）及び腫瘍サイズに対するあらゆる影響（データ非表示）を迅速に反転させたが、媒体対照では反転しなかった。ＭＩＣ−１誘導性体重減少の反転の規模及び持続期間は、投与されたＭＩＣ−１−ＭＡｂの量に比例していた。１ｍｇのＭＩＣ−１−ＭＡｂを注射は、１４％のピーク体重増加に結び付き、その結果、腫瘍誘導性体重減少の完全な反転がもたらされた。これを、媒体対照を投与したＭＩＣ−１腫瘍保持マウスにおける顕著で継続的な体重減少と比較した（図３）。このＭＩＣ−１−ＭＡｂが効果的だった持続期間は、１７日間だった（図１ｃ）。また、抗体処置は、腫瘍サイズに影響を与えなかった（データ非表示）。これらのデータは、ＭＩＣ−１発現腫瘍によって誘導された体重減少が、ＭＩＣ−１によって特異的に仲介されていることを示す。
【００６０】
ＭＩＣ−１がこの効果の原因だったことをさらに実証するために、用量を増加させた精製組換えｈＭＩＣ−１を、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１日２回３日間投与し、この期間中のマウスの体重変化を測定した。これにより、ＭＩＣ−１が用量依存的に体重減少を誘導することが実証され（図４）、精製組換えｈＭＩＣ−１を１０μｇ投与すると、その結果として顕著で速効性の体重減少がもたらされ、それはマウスにＭＩＣ−１−ＰＡｂを与えることによって完全に反転できたが、ＣＯＮ−ＰＡｂでは反転できなかった（図１ｇ）。
【００６１】
マウスにおけるＭＩＣ−１誘導性体重減少の特徴付け
ＭＩＣ−１発現腫瘍によって誘導された体重減少の性質をより詳しく特徴付けるために、白色及び褐色脂肪組織蓄積、脛骨筋及び腓腹筋の解剖により、種々の区域における脂肪量及び除脂肪量の変化を決定し、その後それらの重量を、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表した（図１ｅ）。ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍を保持するマウスには、後腹膜脂肪は残っておらず、鼠径脂肪蓄積及び精巣上体脂肪蓄積のそれぞれ５４％及び８９％減少が示された。対照腫瘍を保持するマウスと比較して、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスの肩甲骨間褐色脂肪組織蓄積（４０％）並びに脛骨筋及び腓腹筋（それぞれ２５％及び２９％）の重量は、少量ではあるが有意に減少した。二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＸＡ、Dual Energy X-ray Absorptiometry）走査データにより、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスでは、対照と比較して平均５．３ｇの除脂肪量及び平均１．１ｇの脂肪量の減少が確認された（図１ｆ）。
【００６２】
ＭＩＣ−１過剰発現腫瘍を保持するマウスの体重減少が、摂食減少のためだったかどうか決定するために、食餌摂取量を３日連続で測定した。高血清レベルのＭＩＣ−１を伴うＤＵ１４５細胞腫瘍を有するマウスを、空ベクターで形質移入した対照ＤＵ１４５細胞腫瘍を保持するマウスと比較した。ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍を保持するマウスの摂食は、それらの対照腫瘍保持マウスより、平均で１日当たり３２％少なかった（図１ｄ）。ＭＩＣ−１−ＰＡｂ又はＣＯＮ−ＰＡｂのいずれかを投与された組換えＭＩＣ−１注射ＢＡＬＢ／ｃマウスの食餌消費量も測定した。腫瘍保持マウスのデータと類似して、組換えＭＩＣ−１の投与は、食餌摂取量の顕著な減少を誘導した（図１ｈ）。重要なことは、ＭＩＣ−１−Ｐａｂ処置によってこの過小食が反転されて体重増加がもたらされたことであり（図１ｈ）、食餌摂取量の減少が、ＭＩＣ−１により仲介される体重減少の主要な要素であることが立証された。
【００６３】
ＭＩＣ−１誘導性の脂肪量減少、除脂肪量減少、及び体重減少が、完全に過小食によるものかどうか、又は代謝的要因も役割を果たしているのかどうかを見い出すために、ビヒクル注射マウスを、ＭＩＣ−１の１日２回注射を受容したマウスにより消費された食餌量で対飼養した。対飼養ビヒクル注射マウスでは、少なくともＭＩＣ−１注射動物と同じ程度の体重が減少し、除脂肪量又は脂肪量の減少に関しては、ＭＩＣ−１注射マウスとの有意差を示さなかった（図５ａ及び５ｂ）。対飼養動物に観察されたわずかに大きな体重減少は、食餌制限により引き起こされた誘発ストレス応答及び身体活動の増加（例えば、食餌探索行動）による可能性が最も高いが（Challet, E. et al. Involvement of corticosterone in the fasting-induced rise in protein utilization and locomotor activity. Pharmacol Biochem Behav 50:405-412 (1995)）、身体活動のそのような増加は、ＭＩＣ−１注射後には起こらなかっただろう。まとめると、これらのデータは、ＭＩＣ−１が体重を減少させ、それに伴う脂肪量及び除脂肪量を減少させる手段が過小食であることを確立する。
【００６４】
代謝率の増加が、ＭＩＣ−１処置マウスの体重減少及び体組成変化に寄与する一因であることを完全に除外するために、対照緩衝液又は組換えＭＩＣ−１の単回注射で処置した正常マウスのエネルギー消費量を、間接熱量測定法により調査した。対照と比較して、１０μｇのＭＩＣ−１を注射したマウスは、小さいが有意であるエネルギー消費量の低減を示した（図６）。ＭＩＣ−１注射後１２時間にわたってマウスを断食させると、エネルギー消費量におけるこの小さな相対的減少は消失した（図６）。したがって、エネルギー消費量の増加では、ＭＩＣ−１処置マウスの体重減少及び体組成の変更を説明することができず、エネルギー摂取の減少が唯一の原因であることをさらに裏付けている。
【００６５】
ＭＩＣ−１が肥満動物にも効果を示すかどうかを試験するために、遺伝性肥満レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに、体重２０ｇ当たり１０μｇのＭＩＣ−１を１日２回で３日間注射した。痩せたマウスにおけるＭＩＣ−１の効果に類似して、ｏｂ／ｏｂ動物は、体重の著しい減少を示した（図７ａ）。この体重低減は、対照注射マウスと比較して、ＭＩＣ−１注射ｏｂ／ｏｂマウスの食餌摂取量が著しく減少した結果であった（図７ｂ）。これらのデータは、ＭＩＣ−１が、極度の肥満動物モデルにさえ、過小食及び体重減少を強力に誘導することを示す。
【００６６】
ホルモン及び代謝産物の血清レベルを評価することにより、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスが、遊離脂肪酸、トリグリセリド、グルコース、グルカゴン、レプチン、及びＩＧＦ−１の血清レベルの大幅な低減を示し、それらの除脂肪量及び脂肪量の減少と一致していたことが示された（データ非表示）。ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスは、血清コルチコステロンレベルが増加する傾向も示した。循環ＩＧＦ−１レベルの変化は、視床下部−下垂体成長ホルモン系の阻害を示唆しており、したがって、視床下部における成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、growth hormone releasing hormone）ｍＲＮＡの発現を測定した。図８に示されているように、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスの脳におけるＧＨＲＨ発現のレベルは、強力に低減されており、これらの動物では、成長ホルモン系が中枢を介して下方制御されることを実証している。血清ＩＧＦ−１レベルの低減は、ＭＩＣ−１の効果のいくつか、特に除脂肪組織の減少に寄与している可能性があるが（Kamel, HK. Maas, D. Duthie, EH. Role of hormones in the pathogenesis and management of sarcopenia. Drugs Aging 19:865-877 (2002)）、この神経内分泌の変化では、ＭＩＣ−１処置動物に見られた脂肪減少を説明することができない。実際、血清ＩＧＦ−１レベルが低い同系マウスは、体脂肪の著しい増加を示した（Rosen, CJ. et al. Congenic mice with low serum IGF-I have increased body fat, reduced bone mineral density, and an altered osteoblast differentiation program. Bone 35:1046-1058 (2004)）。
【００６７】
成長ホルモン系の阻害は、ＭＩＣ−１によって引き起こされる食欲不振症及び体重減少の保護的順応である可能性が高い。これと一致して、エネルギー摂取の制限は、げっ歯動物及びヒトにおいて、視床下部−脳下垂体−成長ホルモン系を阻害、及び／又は血清ＩＧＦ−１レベルを低減させる（Park, S. Sohn, S. Kineman, RD. Fasting-induced changes in the hypothalamic-pituitary-GH axis in the absence of GH expression: lessons from the spontaneous dwarf rat. J Endocrinol 180:369-378 (2004)、Lewitt, MS et al. Responses of insulin-like growth factor (IGF)-I and IGF-binding proteins to nutritional status in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha knockout mice. Growth Horm IGF Res 11:303-313 (2001)、Friedl, KE. et al. Endocrine markers of semistarvation in healthy lean men in a multistressor environment. J Appl Physiol 88:1820-1830 (2000)）。したがって、成長ホルモン系に対するＭＩＣ−１処置の効果は、ＭＩＣ−１効果の一次メディエーターではなく、ＭＩＣ−１の一次効果（食欲不振症及び体重減少）の二次的帰結である可能性が高い。
【００６８】
ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスは、過小食であると同時に、それにもかかわらず血清レプチンレベルの著しい減少も示した。これは、ＭＩＣ−１が、血清レプチンレベルの低減による食欲促進効果を無効にすることを示唆し、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスも、痩せた動物のようにＭＩＣ−１に応答して過小食及び体重減少を示すという観察と一致している。
【００６９】
血清ＭＩＣ−１レベルは、進行前立腺癌患者の体重減少と直接相関する
ＭＩＣ−１と食欲不振症／悪液質との関連性をヒトにおいて決定するために、血清ＩＬ−６レベルが悪液質と関連づけられた進行前立腺癌（ＰＣａ）患者を、よく特徴付けられた患者コホートの患者として集め、これらの患者の血清ＭＩＣ−１レベルを測定した（Pfitzenmaier, J. et al. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 97:1211-1216 (2003)）。血清ＭＩＣ−１レベルは、悪液質を示さない進行癌患者と比較して、悪液質を示す進行癌患者で有意に上昇した。（１２４１６±１０２３５ｐｇ／ｍｌ対３２６５±６３７０ｐｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ）；ｐ＜０．０００１；マンホイットニーＵ検定）。同様に、ＩＬ−６の血清レベルは、悪液質患者で上昇した（３３．８±６４．２ｐｇ／ｍｌ対７．８±３．４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００２；マンホイットニーＵ検定）。血清ＭＩＣ−１は、血清ＩＬ−６レベルと、弱いが有意である正の相関性を示した（ｒ＝０．２９４９、ｐ＜０．０４；線形回帰分析）。加えて、単変量及び多変量ロジスティク回帰分析では、血清ＭＩＣ−１レベル及びＩＬ−６レベルの両方が、癌性悪液質の存在の独立予測因子であった（それぞれ、ｐ＝０．０００２、ｐ＜０．０００１；単変量ロジスティク回帰分析：それぞれ、ｐ＝０．００１７、ｐ＝０．０００５；多変量ロジスティク回帰分析）。しかしながら、食欲不振症／悪液質に関する最も良好な客観的で定量化可能な尺度は、体重減少である。血清ＭＩＣ−１レベルは、前立腺癌関連体重減少の程度と有意に関連していたが（図４ａ；ｐ＝０．０００２、ｒ＝０．４８９９；線形回帰分析）、血清ＩＬ−６にはそのような関係性はなかった（ｐ＝０．６３０３；線形回帰分析）（図９ｂ）。
【００７０】
これらの結果により、血清ＭＩＣ−１の推定が、前立腺癌関連悪液質を予測するための検査に有用であり得る可能性も高まった。この可能性を評価するために、現行の最も良好な血清マーカー（ＩＬ−６）を、受信者動作曲線（ＲＯＣ、receiver operator curve）分析による癌診断の際に存在する血清ＭＩＣ−１レベルと比較した。血清ＭＩＣ−１レベルは、癌関連体重減少の予測因子としてＩＬ−６より有意に優れていた。（曲線下面積（ＡＵＣ、Area Under the Curve）０．６８２９対０．３５０５；ｐ＝０．００４６）。血清ＭＩＣ−１の癌性悪液質診断能力を背景状況と比べると、前立腺癌の診断用に最も広く用いられている血清マーカー、ＰＳＡのＲＯＣは、０．６７８のＡＵＣを示し（９５％信頼区間、０．６６６〜０．６８９）（Thompson, IM. et al. Operating characteristics of prostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0 ng/ml or lower. JAMA 294:66-70 (2005)）、ＭＩＣ−１のＡＵＣとほとんど同一の特徴を示している。したがって、血清ＭＩＣ−１の測定は、前立腺癌に伴う癌性悪液質の予測に有用であることを立証し、さらに、ＭＩＣ−１の血清レベルを低減することを目指す任意の将来的治療から利益を得る可能性のある患者が識別されるはずである。
【００７１】
血清ＭＩＣ−１レベルは、慢性腎不全の患者のＢＭＩと関係している
慢性腎不全も、進行癌のように、体重減少及び悪液質と関連している場合がある。食欲不振症、体重減少、及びＢＭＩ等の、このプロセスのマーカーは、末期腎不全の死亡率の強力な予測因子である（Kovesdy, C. P., Anderson, J. E. & Kalantar-Zadeh, K. Inverse association between lipid levels and mortality in men with chronic kidney disease who are not yet on dialysis: effects of case mix and the malnutrition-inflammation-cachexia syndrome. J Am Soc Nephrol 18:304-311 (2007)）。ＢＭＩがこのように強力な死亡率の予測因子であり、血清ＭＩＣ−１レベルの上昇が、動物において同様の変化に関連していたため、末期腎不全の血清ＭＩＣ−１レベルとＢＭＩとの関係性を調査した。この調査を行うため、悪液質又は他の代謝プロセスを研究するため集められたものではなかった末期腎不全の３８１患者コホートに由来する血清試料を検査した（Apple, FS., Murakami, MM., Pearce, LA. & Herzog, CA. Predictive value of cardiac troponin I and T for subsequent death in end-stage renal disease. Circulation 106:2941-2945 (2002)）。
【００７２】
研究期間中（３年まで）に死亡した患者は、有意により低いＢＭＩを示した（２６．１７±５．６３；２６６（平均±ＳＤ；ｎ）、２３．１５±４．９２；１０４：ｐ＜０．０００１；独立ｔ検定）。透析前の血清試料を研究参加時に取得し、ＭＩＣ−１血清レベルを決定した。血清ＭＩＣ−１レベルは、血清ＭＩＣ−１レベルの増加がより低いＢＭＩと関連するように、ＢＭＩと相関していた（ｐ＝０．０００３；ｒ＝０．１８９；線形回帰分析）。
【００７３】
ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、より小さくて、より食べる量が少ない
ＭＩＣ−１の長期投与で生じる可能性のある効果を決定するために、ＣＳＦ−１プロモーターの制御下でＭＩＣ−１を過剰発現するＣ５７ＢＬ６トランスジェニックマウス（ｆｍｓＭＩＣ−１マウス）を検査した。これらのマウスは、出生後の最初の４８時間以内に測定した時に、それらのＷＴ対照と同じような体重を有していた（図１０ａ）。しかしながら、２１日齢までに、雄及び雌ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、両方ともそれらの性別一致ＷＴ同腹子より１８％少ない体重となり（図１０ａ）、違いは成年期まで続いた。ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、食べる量が対照より絶対値では少なかったが、この違いは、食餌摂取量をマウス体重で補正すると消失した（図１０ｂ）。出生時から食餌摂取量が少なかったことが、同系同腹子より小さく、その結果それに比例して食べる量が少なかったマウスの発育に結び付いた可能性が高い。ＭＩＣ−１で急性処置したマウスのように、雄及び雌ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、測定した蓄積のすべてで脂肪を減少させた（図１０ｃ）。全体として、ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスのデータは、このサイトカインで急性処置されたマウスと大まかに一致している。
【００７４】
全身投与されたＭＩＣ−１は視床下部ニューロンを活性化する
食欲及び体重制御の主要な調節中枢は、視床下部、特に弓状核（ＡＲＣ）区域に存在し、この区域は、半透過性血液脳関門を有すると考えられ、潜在的に、血液由来のメディエーターと脳のこの区域との直接的相互作用可能にする（Naylor, JL. et al. Further evidence that the blood/brain barrier impedes paraquat entry into the brain. Human & Experimental Toxicology 14:587-594 (1995)）。ＭＩＣ−１が脳に直接その効果を及ぼしていたかどうか決定するため、マウスに組換えｈＭＩＣ−１を腹腔内注射し、次いで１時間後にマウスを屠殺して前初期遺伝子ｃ−ｆｏｓの脳内発現パターンを検査した。この転写因子は、幅広く多様な刺激によって迅速に誘導され、頻繁に用いられる信頼性の高い、ニューロン活性化の指標である（Karl, T. et al. Y1 receptors regulate aggressive behavior by modulating serotonin pathways. Proc. Natl. Acad. Sci 101:12742-12747 (2004)）。ＭＩＣ−１注射後、視床下部のＡＲＣ及び室傍核（ＰＶＮ、paraventricular nucleus）においてｃ−ｆｏｓ免疫反応性が著しく増加し、これらの核にあるニューロンがＭＩＣ−１作用の下流メディエーターであることを示した。興味深いことには、脳幹の最後野（ＡＰ、area postrema）も、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロン数の著しい増加を示し（表１）、ＭＩＣ−１作用に対する応答にこの核が潜在的な役割を果たしていること示唆した。孤束核（ＮＴＳ、nucleus tractus solitarus）、又は視床下部若しくは脳幹の任意の他の区域では、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロン数に変化はなかった（データ非表示）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
これらの知見は、ＭＩＣ−１の中枢効果が、食欲制御の主要中枢であるＡＲＣに向けられていることを示唆する。ＡＲＣからの突起は、ＡＰを含む脳幹区域との接続がそれから形成されるＰＶＮなどの他の視床下部核に達しており、それにより迷走神経交感神経系活性を特異的に調節する（Bouret, S. et al. Formation of Projection Pathways from the Arcuate Nucleus of the Hypothalamus to Hypothalamic Regions Implicated in the Neural Control of Feeding Behavior in Mice. J NeuroSci 24:2797-2805 (2004)）。しかしながら、ＭＩＣ−１によるＡＰの直接的活性化を除外することはできない。ＮＴＳにおけるｃ−ｆｏｓ活性化に変化が欠如していることは、末梢に由来して迷走神経を経由する求心性シグナルが、ＭＩＣ−１効果の仲介に関与していないことを示唆する。
【００７７】
ＭＩＣ−１の視床下部特異的過剰発現は体重減少を誘導する
ＭＩＣ−１が、視床下部仲介性効果により生じる体重減少を誘導することをさらに実証するため、視床下部の弓状核にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、adeno-associated virus）を直接的に一側性注射することによって、ＭＩＣ−１発現を誘導した。このウイルスは、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターの制御下で全長ヒトＭＩＣ−１を発現するように操作されていた。ヒトＭＩＣ−１に特異的な抗体を用いた免疫組織化学検査により、ＡＲＣの細胞によるこのタンパク質の発現が実証された（図１１）。ＭＩＣ−１発現ＡＡＶをこのように注射したマウスは、体重が急激に減少したが、空対照ベクターを注射したマウスは、体重が正常に増加した。これにより、視床下部の細胞に対するＭＩＣ−１の直接的効果を立証するさらなる強力な証拠が提供される。
【００７８】
全身投与されたＭＩＣ−１は、ＴＧＦ−βＲII受容体を介してＡＲＣに作用する
ＭＩＣ−１のようなＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、各々がセリン／トレオニンキナーゼドメインを含有する４つの個別のII（ＲII）受容体及び７つのＩ受容体（ＲＩ）で構成される、高度に保存された受容体スーパーファミリーに結合し、それを介して作用する。リガンドが結合すると、２つのＲII受容体及び２つのＲＩ受容体が四量体に組み立てられ、そこでＲIIは、ＲＩの細胞質ドメインにあるセリン残基をトランスリン酸化する。このトランスリン酸化は、保存されているｓｍａｄファミリーの転写因子が高い頻度で関与するシグナル伝達カスケードを開始する。以前にＭＩＣ−１誘発受容体活性と結び付けられている、ｅｒｋ１／２を含む他の多くのシグナル伝達分子も活性化される（Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)、Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。
【００７９】
ＭＩＣ−１が優先する（preferred）ＲII受容体を決定するため、異なるＲII受容体に対する種々の抗体を使用して、免疫組織化学検査を実施した。これにより、ＴＧＦ−βＲIIのみが、屠殺の３０分前にＭＩＣ−１を注射したマウスの視床下部において、ｃ−ｆｏｓと共局在化していたことが実証された（データ非表示）。ＴＧＦ−βＲII受容体が、ＭＩＣ−１結合受容体複合体の一部を形成するかどうかを決定するため、この受容体に対する遮断抗体を視床下部に一側性注射した。２４時間後、これらのマウスに１０μｇのＭＩＣ−１を腹腔内注射した。マウスを３０分後に屠殺し、視床下部におけるｃ−ｆｏｓ発現を検査した。
【００８０】
免疫組織化学的な核内ｃ−ｆｏｓ発現は、ＴＧＦ−βＲII抗体を注射した側では遮断されたが、反対側では遮断されなかった。重要なことは、密接に関連した骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、bone morphogenetic protein）のＲII又はレプチン受容体に向けられた遮断抗体の注射が、ＭＩＣ−１誘導性ｃ−ｆｏｓ発現の阻害に帰着しなかったことである（データ非表示）。これは、ＴＧＦ−βＲII受容体が、それを介してＭＩＣ−１がその効果を視床下部に及ぼす複合体の一部を形成しなければならないことを明らかに実証する。
【００８１】
ＭＩＣ−１が視床下部で下流効果を誘導する機序を調査するため、屠殺する１５〜６０分前に１００μｇのＭＩＣ−１を腹腔内注射したマウスの視床下部に、さらなる免疫組織化学を実施した。ｓｍａｄシグナル伝達経路：ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ３、及びｓｍａｄ１、５、８のメンバーのリン酸化形態に特異的であった抗体を利用した。各々の場合、未処置マウスのＡＲＣでは、視床下部におけるこれらの経路の構成的活性化を示唆する抗体すべてによる核染色の存在がすでに実証されていた（データ非表示）。ＭＩＣ−１処置マウスにおけるｓｍａｄ染色の実質的な増加は検出できず、これらの経路が使用されていないか、おそらくはこれらの経路の構成的活性化が、ｓｍａｄリン酸化の著しい増加をすべて覆い隠していることを示唆した。しかしながら、ＭＩＣ−１がｅｒｋ１／２のリン酸化を直接誘導することを、いくつかのグループが報告している（Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。したがって、屠殺する１０〜６０分前に１００μｇのＭＩＣ−１を注射したマウスの視床下部において、この分子の活性化を検査した。ＭＩＣ−１の腹腔内注射後、Ｐ−ｅｒｋ１／２染色がＡＲＣで検出され、ＭＩＣ−１注射２０分後に最も多く生じた。対照緩衝液を注射したマウスでは、この経路の活性化はなかった。まとめると、これらのデータは、ＭＩＣ−１がｅｒｋ１／２経路の活性化によって効果を仲介することを示す。
【００８２】
全身投与されたＭＩＣ−１は、ＡＲＣ ＮＰＹ及びＰＯＭＣ発現を調節し、転写因子、ｓｔａｔ３を活性化する
ＭＩＣ−１の全身性注射が、食欲調節に関連することが知られているＡＲＣニューロン経路を活性化していたかどうか決定するため、２つの主要な食欲調節因子、ＮＰＹ及びＰＯＭＣの発現を調査した。ＭＩＣ−１注射が、ＡＲＣにおけるＮＰＹ ｍＲＮＡ発現のレベルを３４％低減させ、ＰＯＭＣのｍＲＮＡレベルを４７％増加させたことが、インシトゥハイブリダイゼーションを使用して認められ、摂食衝動の低減と一致していた（表２）。
【００８３】
【表２】
【００８４】
主要なＰＯＭＣ食欲不振症誘発性経路のこの上方制御、及びＮＰＹ食欲促進性経路の下方制御は、レプチン処置マウスで観察されたものと類似したパターンである（データ非表示）。このように類似しているため、ＭＩＣ−１処置マウスの視床下部も、リン酸化されたｓｔａｔ３（Ｐ−ｓｔａｔ３）、レプチン受容体シグナル伝達経路の中枢分子に対する抗体を用いて調査した（データ非表示）。これにより、ＭＩＣ−１処置マウスの側方ＡＲＣ及び視床下部腹内側野（venteromedial hypothalamus）のＰ−ｓｔａｔ３染色ニューロンの顕著な上方制御が明白に示された。興味深いことには、ＭＩＣ−１処置マウスにおけるＰ−ｓｔａｔ３染色のパターンは、レプチン注射により誘導されたパターンとは異なっており、ＭＩＣ−１注射マウスのＰ−ｓｔａｔ３陽性ニューロンの大多数は、レプチン注射の場合の背側ＡＲＣと比較して、側方ＡＲＣに存在した。したがって、ＭＩＣ−１及びレプチンは、両方がＡＲＣのｓｔａｔ３シグナル伝達経路を活性化する一方で、ＡＲＣニューロンの異なるサブセットでＰ−ｓｔａｔ３を誘導した。これらの知見は、ＭＩＣ−１及びレプチンが、別々の経路経由でそれらの効果を誘導することを示唆する。これと一致して、ＭＩＣ−１をレプチン受容体欠損ｄｂ／ｄｂマウスに注射すると、ＷＴＭＩＣ−１注射マウスで見られるものと同等のＰ−ｓｔａｔ３染色がＡＲＣでも生じ、ＭＩＣ−１はレプチン受容体を介して作用しないことを決定的に実証した。
【００８５】
ＭＩＣ−１誘導性Ｐ−ｓｔａｔ３陽性ニューロンをさらに識別するため、ＮＰＹの場合はインシトゥハイブリダイゼーションを、アルファメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、alpha melanocyte stimulating hormone）、ＰＯＭＣの生物学的に活性なプロセシング産物の場合は免疫組織化学検査を、Ｐ−ｓｔａｔ３の場合の免疫組織化学検査／免疫蛍光検査と共に実施した（データ非表示）。これにより、α−ＭＳＨ及びＮＰＹニューロンが、ＭＩＣ−１の標的の主要なクラスであることが識別され、このモデルの体重減少に結び付く食餌摂取量の低減は、ＮＰＹ及びα−ＭＳＨ産生の変化に起因することが示された。さらに、及びｃ−ｆｏｓ活性化の結果と一致して、大多数のこれらのＰ−ｓｔａｔ３／ＮＰＹ及びＰ−ｓｔａｔ３／α−ＭＳＨ陽性ニューロンは、レプチンにより活性化されるニューロンとは異なるニューロンのサブセットを表しており、それによりＭＩＣ−１がそれを介して食欲を調節する新規な経路を示す。
【００８６】
ＡＲＣに対するＭＩＣ−１の直接注射もｓｔａｔ３を活性化する
ＭＩＣ−１がＡＲＣに直接作用するというさらなる証拠を提供するため、ＡＲＣに対するＭＩＣ−１、レプチン、又は対照緩衝液の直接的一側性注射を調査した。注射が終了した２０分後にマウスを屠殺し、脳切片をＰ−ｓｔａｔ３について染色した。対照注射は効果を示さなかったが、レプチン及びＭＩＣ−１は両方とも、ＡＲＣにおけるＰ−ｓｔａｔ３の活性化を明白に誘導した（データ非表示）。染色パターンは、全身投与されたメディエーターで見られたパターンと類似しており、ＭＩＣ−１注射は、ＡＲＣの側方部及び視床下部腹内側核（ＶＭＨＤＭ、ventromedial hypothalamic nucleus）の背側部分にあるニューロンのｓｔａｔ３のリン酸化を誘導した。対照的に、レプチン注射は、ＡＲＣの背側部分、ＶＭＨＤＭの背側部分、及び視床下部外側野（ＬＨＡ、lateral hypothalamic area）にあるニューロンのＳｔａｔ３経路を活性化する（データ非表示）。これにより、これらの２つのメディエーターが、視床下部の異なるニューロンのサブセットに作用することがさらに示される。
【００８７】
考察
腫瘍のＭＩＣ−１過剰産生、及び前立腺癌を有する動物モデル及び患者の両方における、血清ＭＩＣ−１レベルと体重減少との強い相関性は、ＭＩＣ−１が、癌性食欲不振症／悪液質及びおそらくは心不全及び腎不全に伴うものなどの他の悪液質状態の病因に関与していることを示す。癌性食欲不振症／悪液質を示す人々の群におけるサイトカインレベルは、この合併症のない人々と比較して上昇していることは、多くの研究により記載されているが、ＭＩＣ−１では明らかである、サイトカインレベルと体重減少の程度との直接的相関性を実証した者はいない。この関係性、並びに本明細書中で提供されている強力な一連の機構的データは、ＭＩＣ−１が、視床下部ニューロンのＴＧＦ−βＲII受容体に作用して食欲を減少させることを示し、ＭＩＣ−１が癌関連食欲不振症及び体重減少の重要な原因であることを立証する。加えて、ＭＩＣ−１に対する抗体により食欲不振症／悪液質が反転することは、この重度の障害を治療するために、治療用抗体（及び他のＭＩＣ−１アンタゴニスト）が使用できる可能性を示す。最後になるが、本明細書中で示された結果は、ＭＩＣ−１が過小食を引き起こし、食餌摂取量及びエネルギー恒常性の主要な視床下部調節因子、ＮＰＹ及びＰＯＭＣ由来のα−ＭＳＨに直接影響を及ぼすことができることを示す。さらに、ＭＩＣ−１は、食欲不振症、体重減少、並びに視床下部ＮＰＹの減少及びＰＯＭＣ発現の増加というレプチン様効果を誘導するが、ＭＩＣ−１により活性化されたＮＰＹ及びＰＯＭＣニューロンのサブセットは、レプチンと比較して異なる。これは、エネルギー恒常性の様々な局面を調節するニューロンのより多様な機能的ネットワークを示しており、まとめると、ＭＩＣ−１は、食欲及び体重の中枢調節因子であり、その受容体複合体に加えて、癌性食欲不振症／悪液質及び肥満の両治療のための標的として、大きな可能性を提供することを実証する。
【００８８】
本明細書の全体にわたって、「含む（comprise）」という単語、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」などの変異形は、記載されている要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されよう。
【００８９】
本明細書中で言及された出版物はすべて、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、物質、デバイス、又は物品などに関するいかなる議論も、もっぱら本発明に背景状況を提供するためだけである。これらのもののいずれか又はすべてが、従来技術基盤の一部を形成する、又は本発明の関連分野における通常の一般的知識であり、本出願の各特許請求の範囲の優先日前にオーストラリア又は他所に存在していたことの承認として受け取られるべきではない。
【００９０】
当業者であれば、特定の実施形態で示された本発明に対して、広範に記載されている本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、多数の変異及び／又は改変をなすことができることを理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的とみなされるべきではない。
【００９１】
（参考文献）
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の食欲及び／又は体重を調節するための方法及び新規なタイプの作用物質に関する。さらに、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１、macrophage inhibitory cytokine-1）の受容体複合体と相互作用しその活性を調節する作用物質のスクリーニング法に関する。
【０００２】
（参照による組込み）
本特許出願は、以下の優先権を主張する：
− ２００７年８月１６日に出願された「マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）活性を調節するための作用物質及び方法。」（Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1) activity）という名称の豪州特許第２００７９０４４１２号明細書。
この出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
また、以下の特許明細書が、下記の説明において参照されている：
− 国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）；及び
− 米国特許第５，２２５，５３９号明細書。
これら２つの特許明細書の各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
体重及び食欲制御は、複雑であり、完全には特徴付けられていないプロセスである。それらの調節異常は、世界的に重要な公衆衛生上の問題である肥満に結び付く場合がある。正反対に、食欲不振症／悪液質は、最も一般的には後期癌に起因し、腫瘍又はストローマ細胞由来分子が食欲及び体重の緊縮調節を妨害し、消耗、衰弱、及び時には死に結び付くと考えられている（Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2:862-871 (2002)、Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-related weight loss. Lancet Oncol, 6:334-343 (2005)、Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res, 61:1432-1438 (2001)、Rubin, H. Cancer cachexia: its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci, 100:5384-5389 (2003)、Rall, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology 43:1219-1223 (2004) 、Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85:51-66 (2002)）。いくつかのサイトカインが、食欲不振症／悪液質の病因に関与するとされているが、インターロイキン６（ＩＬ−６、interleukin-6）は、最も可能性の高い病原的作用物質であると考えられている。しかしながら、現在まで、癌性の食欲不振症／悪液質の治療における効力を実証するような、ＩＬ−６に対するモノクローナル抗体のヒト臨床試験は存在していない。
【０００５】
ＧＤＦ−１５、ＰＬＡＢ、ＰＤＦ、及びＮＡＧ−１とも呼ばれるＭＩＣ−１は、基本条件下では発現しないが、炎症、傷害、又は悪性腫瘍の発生により誘導される場合があるＴＧＦ−βスーパーファミリーの分岐メンバーである（Bootcov, MR. et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-βsuperfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94:11514- 11519 (1997)、Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100:3410-3415 (2003)、Buckhaults, P. et al. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours. Cancer Res 61:6996-7001 (2001)、Koopmann,J. et al. Serum Macrophage Inhibitory Cytokine 1 as a Marker of Pancreatic and other Periampullary Cancers. Clin Cancer Res 10:2386-2392 (2004)、Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Hsiao, EC. et al. Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor beta superfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20:3742-51 (2000)、Schober. A. et al. Expression of growth differentiation factor-15/ macrophage inhibitory cytokine-1 (GDF-15/MIC-1) in the perinatal, adult, and injured rat brain. J Comp Neurol 439:32-45 (2001)）。ＭＩＣ−１は、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、及び乳癌を含む多くの癌により過剰発現される（Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)）。進行癌の患者では、この過剰発現は血清ＭＩＣ−１レベルの著しい増加に帰着し、そのレベルは、平均４５０ｐｇ／ｍｌから５〜５０ｎｇ／ｍｌレベル以上にまで、１０〜１００倍上昇する場合がある。個々の腫瘍は、発現レベルの個体差、及びプロコンバターゼによる成熟ＭＩＣ−１プロセシングの違いの両方のため、それらが分泌するＭＩＣ−１の量が異なる場合がある（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。ＭＩＣ−１のプロペプチドは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ、extracellular matrix）に強く結合し、その結果、インビトロ及びインビボの両方で実証可能であるＭＩＣ−１のＥＣＭ貯蔵の形成がもたらされる。プロセシングされた形態のＭＩＣ−１のみが、マトリックス結合プロペプチドを欠如しており、血液循環中へと拡散する。したがって、このプロペプチドは、ＥＣＭ貯蔵とＭＩＣ−１の循環血中レベルとのバランスをインビボで調節する（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。
【０００６】
本出願人は既に、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）に、ＭＩＣ−１活性の調節を伴う対象の食欲及び／又は体重を調節するための方法及び作用物質を記載している。そこに記載されている特定のタイプの作用物質は、ＭＩＣ−１活性の阻害を引き起こし、対象の食欲及び／又は体重の増加を引き起こすことが可能な抗ＭＩＣ−１抗体である。本明細書の下記では、ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍が食欲不振症／悪液質を誘導し、それは、ＭＩＣ−１に対する抗体を投与することにより反転させることができ、組換えＭＩＣ−１の注射により誘導することができるという証拠がさらに提供される。さらに、ＭＩＣ−１作用の機序が研究され、ＭＩＣ−１受容体複合体、並びに食欲及びエネルギー恒常性の調節を達成する潜在的中枢調節因子の特徴付けに結び付いた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）
【特許文献２】米国特許第５，２２５，５３９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】1. Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2:862-871 (2002)
【非特許文献２】2. Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-related weight loss. Lancet Oncol, 6:334-343 (2005)
【非特許文献３】3. Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res, 61:1432-1438 (2001)
【非特許文献４】4. Rubin, H. Cancer cachexia: its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci, 100:5384-5389 (2003)
【非特許文献５】5. Rall, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology 43:1219-1223 (2004)
【非特許文献６】6. Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85:51-66 (2002)
【非特許文献７】7. Bootcov, MR. et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-β superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94:11514- 11519 (1997)
【非特許文献８】8. Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100:3410-3415 (2003)
【非特許文献９】9. Buckhaults, P. et al. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours. Cancer Res 61:6996-7001 (2001)
【非特許文献１０】10. Koopmann,J. et al. Serum Macrophage Inhibitory Cytokine 1 as a Marker of Pancreatic and other Periampullary Cancers. Clin Cancer Res 10:2386-2392 (2004)
【非特許文献１１】11. Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)
【非特許文献１２】12. Hsiao, EC. et al. Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor beta superfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20:3742-51 (2000)
【非特許文献１３】13. Schober. A. et al. Expression of growth differentiation factor-15/ macrophage inhibitory cytokine-1 (GDF-15/MIC-1) in the perinatal, adult, and injured rat brain. J Comp Neurol 439:32-45 (2001)
【非特許文献１４】14. Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本出願人は、とりわけ、食欲及び／又は体重を調節するための方法及び新規なタイプの作用物質を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節するための新規なタイプの作用物質であって、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β、transforming growth factor-β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節する作用物質の同定に関する。この作用物質は、ＭＩＣ−１活性を調節することにより、対象の食欲及び／又は体重を調節可能である。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ＭＩＣ−１活性を調節する作用物質について、作用物質候補又は作用物質ライブラリーをスクリーニングするための方法も提供する。
【００１３】
したがって、第２の態様では、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００１４】
第３の態様では、本発明は、第２の態様のスクリーニング法により同定される新規な作用物質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ−ｅ】ａ．ｈＭＩＣ−１発現プラスミド構築体又は空プラスミドベクターのいずれかで恒久的に形質移入されたＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞系を側腹に皮下注射した４５匹のヌードマウスの体重及び腫瘍サイズに対する効果を示す図である。マウスの体重及び腫瘍サイズを６週間モニターした。屠殺時に血清ｈＭＩＣ−１レベルをＥＬＩＳＡにより決定し、体重減少度の平均及び標準偏差を、ｈＭＩＣ−１の血清レベル範囲に対してプロットした。ｂ．高レベルの血清中ＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスの平均体重変化に対する、ＭＩＣ−１−ＭＡｂの単回投与の効果を示す図である。１１日後、ＭＩＣ−１発現腫瘍を保持するマウスが相当量の体重を失った時、３匹のマウスには１用量ずつ、ＭＩＣ−１−ＭＡｂを単回投与で腹腔内注射し（ｉ．ｐ．）、５匹のマウスには、対照緩衝液（媒体）を注射したか、又は未処置のままにした。マウスの体重を、２０日間毎日モニターした。マウスのピーク体重増加の平均及び標準偏差を、この同じ期間中の対照マウスの平均体重変化と比較したプロットで示す。ｃ．抗体を注射した日のマウス体重に戻るまでの時間として定義したマウスの応答期間の平均及び標準偏差を、「１ｂ」のように示す図であり、投与されたＭＩＣ−１−Ｍａｂの用量に対してプロットされている。ｄ．高レベルの血清中ＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植した２０匹のヌードマウス、及び対照空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植された２０匹のヌードマウスの体重変化を示す図である。注射後８日目、ＭＩＣ−１マウスの平均体重減少が７％であった時、３連続２４時間の期間中の食餌摂取量を測定した。食餌をホッパーに入れ、時点０で計量した。２４時間後、消費された食餌は、拒絶されたもの及び食べこぼされたものを、ホッパーに入れた食餌から差し引くことにより決定した。その結果は、マウス体重１グラム当たりの１日当たりに消費された食餌の重量（グラム）の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｅ．２０匹のヌードマウスを、高レベルのＭＩＣ−１をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞で異種移植し、２０匹を、対照空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞で異種移植した。ＭＩＣ−１腫瘍を保持するマウスが、およそ１８％の体重を失った時、マウスを屠殺した。肩甲骨間の褐色脂肪組織、鼠径、精巣上体、及び後腹膜の白色脂肪組織、並びに脛骨筋及び腓腹筋も解剖、摘出、及び計量した。総白色脂肪は、鼠径、精巣上体、及び後腹膜の脂肪蓄積の総重量を表す。その結果は、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表された試験片重量の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１ｆ−ｈ】ｆ．解剖に先立って、「１．ｅ」のマウスをＤＸＡ走査にかけて、総除脂肪量及び脂肪量を決定した。示されている結果は、全質量の平均及び標準偏差としてグラムで表されている。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｇ．１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、高度に精製された１０μｇの組換えｈＭＩＣ−１で１日２回皮下処置した。実験の開始時に、１０ｍｇのＭＩＣ−１−ＰＡｂ又はＣＯＮ−ＰＡｂの単回腹腔内投与を、マウスの半分に与えた。マウス体重を毎日モニターし、マウスの開始体重の割合として表し、その結果を平均及び標準偏差としてプロットした。ｈ．「１ｇ」で記載したｈＭＩＣ−１処置マウスについて、３連続２４時間の期間中モニターした１日の食餌摂取量を示す図である。食餌をホッパーに入れ、時点０で計量した。２４時間後、消費された食餌は、拒絶されたもの及び食べこぼされたものを、ホッパーに入れた食餌から差し引くことにより決定した。その結果は、マウス体重１グラム当たりの１日当たりに消費された食餌の重量（グラム）の平均及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２】ａ．（Ａ）空ベクターで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウス、（Ｂ）ＭＩＣ−１過剰発現ＤＵ１４５細胞を異種移植した１４日後、（Ｃ）「Ｂ」のように処置したが、１ｍｇのＭＩＣ−１−Ｍａｂを９日前に腹腔内に与えられたマウスの代表的な写真を示す図である。矢印は、腫瘍増殖部位を指示している。ｂ．ｈＭＩＣ−１発現プラスミド構築体又は空プラスミドベクターのいずれかで形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植した、ＭＩＣ−１及び対照腫瘍を有する４０匹のヌードマウスの平均及び標準偏差体重を示す図である。
【図３】高レベルのＭＩＣ−１血清をもたらす構築体で恒久的に形質移入されたＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスから得られた結果を提供する図である。１１日後、ＭＩＣ−１発現腫瘍を保持するマウスが相当量の体重を失った時、３匹のマウスに１用量ずつ、３つの異なる用量のＭＩＣ−１−Ｍａｂ又は対照緩衝液（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。マウスの体重を、２０日間毎日モニターした。各群について、マウスの相対的な体重変化の平均及び標準偏差は、実験期間中の時間に対してプロットされている。ＭＩＣ−１−Ｍａｂを注射した時点は、矢印の先で示されている。
【図４】体重減少に対するＭＩＣ−１投与の効果を示す図である。１８匹の９週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、媒体対照又は示された量の組換えＭＩＣ−１を１日２回皮下注射した。マウスの体重を３日間毎日モニターし、この期間中の体重変化を算出した。その結果は、媒体対照を注射した初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。
【図５】ａ．自由に食餌を与えられたＭＩＣ−１処置マウス又は媒体（対照）処置マウス、及び対飼養媒体処置動物（１群当たり６匹）の体重変化を示す図である。１０μｇのＭＩＣ−１（又は媒体）を１日２回１０日間、マウスに皮下注射した。その結果は、ＭＩＣ−１注射初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。ＭＩＣ−１処置マウス（ｐ＜０．０５）及び対飼養マウス（ｐ＜０．００１）の体重は、媒体処置対照と比較して有意に低減されている。ＭＩＣ−１処置マウスと対飼養マウスとの違いは、有意ではなかった（反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ）。ｂ．１０日後に、５ａのマウスをＤＸＡ走査にかけて、全身脂肪量及び両後脚の除脂肪量を決定した。その結果は、平均（グラム）及び標準偏差として表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図６】マウスのエネルギー消費量に対するＭＩＣ−１の効果を示す図である。１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをオープンサーキット熱量計に個々に収容し、ケージに２４時間順応させた。夜間サイクルの開始時に、１０μｇのＭＩＣ−１を８匹のマウスに、対照緩衝液を７匹のマウスに皮下注射した（矢印）。絶食状態におけるＭＩＣ−１誘導性代謝変化をモニターするために、第２の注射（矢印）を次のサイクルの初期に与え、その後食餌を直ちに片付けた。エネルギー消費量（ＨＥＡＴ）、呼吸交換率（ＲＥＲ、respiratory exchange ratio）、酸素消費量及び運動性（ｘ及びｙ総計）を、２７分間の各サイクルで測定した。１２時間の明暗サイクルは、横方向のバーとして示されている。データは、２サイクルの平均であり、平均及び平均の標準誤差としてプロットされている。データを、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより比較した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図７】ｏｂ／ｏｂマウスの体重変化及び食餌摂取量に対するＭＩＣ−１の効果を示す図である。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに、媒体対照（５匹のマウス）又は体重２０ｇ当たり１０μｇの組換えＭＩＣ−１（５匹のマウス）のいずれかを、１日２回皮下注射した。ａ．体重を毎日測定し、その結果は、ＭＩＣ−１注射初日の体重に対して標準化され、平均及び標準誤差としてプロットされている。ｂ．食餌摂取量を最終日に測定し、実験開始時の開始体重に対して標準化した。その結果を、両側ｔ検定を使用して分析した。＊＝ｐ＜０．０５。
【図８】（ａ）対照腫瘍マウス及び（ｂ）ＭＩＣ−１腫瘍マウスの視床下部弓状核におけるＧＨＲＨ ｍＲＮＡ発現のインシトゥハイブリダイゼーションのエマルジョンオートラジオグラフ画像を提供する図である。Ａｒｃ：弓状視床下部核；３Ｖ 第三脳室。スケールバー＝４０μｍ。
【図９】ＭＩＣ−１の血清レベル（ａ）又はＩＬ−６の血清レベル（ｂ）と進行前立腺癌患者の体重変化との相関性を示す図である。
【図１０】ａ．ｆｍｓＭＩＣ−１トランスジェニックマウス及びそれらのＷＴ同腹子の体重を、産後齢（０〜４８時間、Ｎ＝７６）、３週齢（Ｎ＝３６）、及び８〜９週齢（Ｎ＝４０）で測定した。各時点及び性別毎に体重を標準化した。その結果を平均及び標準偏差として示した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｂ．８週齢のｆｍｓＭＩＣ−１及びＷＴ同系対照マウスの１日の食餌摂取量を、図４ａに記載したように、３連続２４時間の期間中モニターした。その結果は平均及び標準偏差として示されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｃ．５匹の雄及び５匹の雌ｆｍｓＭＩＣ−１トランスジェニックマウス、並びに４匹の雄及び５匹の雌同系対照マウスを、５２〜５４日齢で屠殺した。脂肪蓄積並びに脛骨筋及び腓腹筋を、図１ｅのように解剖、摘出、及び計量した。その結果は、マウスの体重の割合として表された試験片重量の平均及び標準偏差として、雄及び雌別々に表されている。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１１】視床下部における直接的ＡＡＶ仲介性ＭＩＣ−１過剰発現が体重減少を引き起こすことを示す結果を提供する図である。マウスには、ＭＩＣ−１を発現するＡＡＶ又は対照ＡＡＶを、一側性視床下部注射で与えた。１２匹のマウスの体重をモニターし、その半分には、ＭＩＣ−１を過剰発現するＡＡＶの一側性視床下部注射を行い、他の半分には、対照ＡＡＶベクターを投与した。マウスを毎日計量し、その結果を平均及び平均の標準誤差としてプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
数多くの癌、特に上皮由来の癌が、ＭＩＣ−１を過剰発現し、ＭＩＣ−１血液循環レベル（つまり血清レベル）の上昇をもたらすことは、以前から見出されている。これらのレベルは、癌疾患の病期及び進行度に比例していることが判明しており、後期癌の場合には、特に顕著な体重減少と関連している。同様に、一般的に体重減少及び食欲不振症／悪液質を伴う状態である慢性腎不全の患者では、ＭＩＣ−１血清レベルの顕著な上昇がボディマス指数（ＢＭＩ、body mass index）の低減との相関性を示すことが、今や判明している。ＭＩＣ−１レベル又はＭＩＣ−１の活性を低減させることによって、癌、慢性腎不全、又はＭＩＣ−１血清レベルの上昇が仲介する他の原因に伴う体重減少の反転又は低減が期待される。実際、上記で言及した国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５号パンフレット（国際公開第２００５／０９９７４６号パンフレット）において、本出願人は、ＭＩＣ−１活性を阻害する抗ＭＩＣ−１抗体が、ＭＩＣ−１過剰発現腫瘍を有するマウスの体重増加を引き起こすことが可能であるという事実を実証した。体重減少の反転又は低減の達成は、場合によっては、患者の健康及び尊厳、ひいては癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患若しくは状態の治療を成功させる患者の可能性の向上に結び付くと予測されるため、重要な臨床転帰である。
【００１７】
本出願人は、ここではＭＩＣ−１作用機序の研究を行い、ＭＩＣ−１による食欲調節を達成する経路（複数可）及び潜在的中枢調節因子についての理解を深めることに結び付けた。より詳しくは、ＭＩＣ−１受容体複合体はＴＧＦ−βＲII受容体を含んでいることが、ここで特徴付けられた。結果として、本出願人は、食欲及び／又は体重を調節するための新規なタイプの作用物質であって、ＭＩＣ−１受容体複合体の活性を調節することにより作用する作用物質を同定した。さらに、本出願人は、ＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する新規なタイプの作用物質のスクリーニング法を特定した。
【００１８】
したがって、第１の態様では、本発明は、対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、本作用物質はＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節するが、本作用物質はＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節することによりその他の形で作用してもよい。
【００２０】
本作用物質は、ＭＩＣ−１活性を調節することにより、対象の食欲及び／又は体重を調節可能である。
【００２１】
より詳しくは、本作用物質は、ＭＩＣ−１の活性を阻害する（つまり、アンタゴナイズする）ことにより（例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体に結合し、それを遮断することにより）、対象の食欲及び／又は体重を増加させることが可能である。その場合には、本方法は、癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患、状態、若しくは治療によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質を治療するために好適である。
【００２２】
他方では、本作用物質は、ＭＩＣ−１の活性を増強する（つまり、アゴナイズする）ことにより（例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体に結合しその活性を刺激することによって、ＭＩＣ−１活性を模倣することにより）、対象の食欲及び／又は体重を減少させることが可能である。その場合には、本方法は、例えば肥満の治療に好適であり得る。
【００２３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（ＭＩＣ−１を含む）に対する受容体スーパーファミリーに属する受容体は、２つのＲＩ受容体モノマー及び２つのＲII受容体モノマーを含む四量体複合体である。ＭＩＣ−１受容体は、２つのＲＩ受容体及び２つのＴＧＦ−βＲII受容体を含む四量体複合体である。ＴＧＦ−βＲII受容体には多数のスプライス変異体及び他の変異体が存在し（例えば、Konrad, Lら（Konrad, L et al. Alternative splicing of TGF-betas and their high-affinity receptors TβRI, TβRII and TβRIII (betaglycan) reveal new variants in human prostatic cells. BMC Genomics 8:318 (2007)）により記載されている変異体を参照されたい）、したがって、「ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）」という用語は、本明細書中で使用される場合、そのような変異体を包含することが理解されるべきである。
【００２４】
第１の態様の方法で使用される作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーの１つ若しくは両方、及び／又はＲＩ受容体モノマーの１つ若しくは両方と相互作用することができる。しかしながら、好ましくは、この作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーの１つ又は両方と相互作用する。好ましくはＴＧＦ−βＲII受容体モノマーは、視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体モノマーである。
【００２５】
好ましくは、本方法は、ＭＩＣ−１活性を阻害することを伴い、対象（癌、（前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、及び乳癌などの、特に上皮癌）、慢性腎不全、又は他の原因疾患（例えば、関節リウマチなどの炎症性疾患）、状態（例えば、傷害、炎症、又はストレス）、若しくは治療（例えば、放射線療法又は化学療法）によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質に罹患している可能性がある）の食欲及び／又は体重を増加させるために実施される。ＭＩＣ−１活性を阻害するためには、本作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）、好ましくは視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）に結合しそれを遮断する作用物質から選択されることが好ましいが、ＲＩ受容体（複数可）に結合しそれを遮断する作用物質、又はそうでなければ、四量体ＭＩＣ−１受容体複合体のモノマー間の相互作用を阻害する作用物質も好適であることが予測される。
【００２６】
ＴＧＦ−βＲII受容体に結合しそれを遮断する好適な作用物質の例としては、ＭＩＣ−１の阻害性ペプチド断片及び模倣体が挙げられる。しかしながら、そのような作用物質は、抗ＴＧＦ−βＲII抗体（例えば、R&D Systems Inc.社、ミネアポリス、ミシガン州、アメリカ合衆国から入手可能な抗ＴＧＦ−βＲII抗体ＡＦ５３２）及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片及び組換えｓｃＦＶ断片）からなる群から選択されることが望ましい。より好ましくは、本作用物質は、ヒト化抗ＴＧＦ−βＲIIモノクローナル抗体である。ヒト化抗ＴＧＦ−βＲIIモノクローナル抗体は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書（その全開示は、参照により本明細書中に組み込まれるとみなされるべきである）に記載の方法により調製することができる。
【００２７】
ＲＩ受容体に結合しそれを遮断する好適な作用物質の例には、ＳＢ−４３１５４２（４−（５−ベンゾ（１，３）ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（Sigma Aldrich社製、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（DaCosta Byfield, S. et al. SB-505124 is a selective inhibitor of transforming growth factor-beta type I receptors, ALK4, ALK5 and ALK7. Mol Pharmacol 65:744-752 (2004)）、ＳＤ−２０８（Bonniaud, P. et al. Progressive transforming growth factor β1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am J Respir Crit Care Med 171:889-898 (2005)）（Scios, Inc.社製、フリーモント、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）、及びＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（de Gouville, AC. et al. Inhibition of TGF-beta signaling by an ALK5 inhibitor protects rats from dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis. Br J Pharmacol 145:166-177 (2005)）を含むＡＬＫ５阻害剤などの周知の阻害剤、並びにＭＩＣ−１の阻害性ペプチド断片及び模倣体が挙げられる。しかしながら、そのような作用物質は、抗ＲＩ抗体及び抗体断片（例えば、ＡＬＫ５細胞外ドメインに対するｈＡＰ−００１６抗体、Angio-Proteomie社、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国から入手可能）からなる群から選択されることが好ましい。より好ましくは、本作用物質は、ヒト化抗ＲＩモノクローナル抗体である。
【００２８】
ＭＩＣ−１活性を阻害するように実施される場合、第１の態様の方法を用いた治療に好適な対象は、ＭＩＣ−１の過剰発現を示しているか、又は少なくとも、ＭＩＣ−１の血清レベルが一貫して、２００〜１２００ｐｇ／ｍｌの正常ヒト血清レベルの高値域にある対象に限定してもよい。そのような対象は、ＭＩＣ−１のアッセイ（例えば、ＭＩＣ−I ＥＬＩＳＡ（Moore, AG. et al. TGF-β superfamily cytokine MIC-1 is present in high concentrations in the serum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 85:4781-4788 (2000)））を使用して、高い血清ＭＩＣ−１レベル（例えば、全血又は血清試料から）を検出することにより選択することができる。「高い」血清ＭＩＣ−１レベルには、８５０ｐｇ／ｍｌを超える、より好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌを超える、最も好ましくは１２００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルが含まれる。
【００２９】
或いは、本方法は、ＭＩＣ−１活性の増強させることを含み、対象（肥満に苦しんでいるか、又はそうでなければ、健康又は顕示欲のために体重減少を熱望していてもよい）の食欲及び／又は体重を減少させるために実施される。ＭＩＣ−１の活性を増強するための作用物質は、ＴＧＦ−βＲII受容体（複数可）に結合しその活性を刺激することによりＭＩＣ−１の活性を模倣する作用物質から選択されることが好ましいが、ＲＩ受容体（複数可）に結合しその活性を刺激する作用物質も好適であることが予想される。ＴＧＦ−βＲII受容体に結合しそれを刺激する好適な作用物質の例には、ＭＩＣ−１の刺激性ペプチド断片及び模倣体が含まれ、ＲＩ受容体に結合しそれを刺激する好適な作用物質の例には、ＭＩＣ−１刺激性ペプチド断片及び模倣体が含まれる。
【００３０】
さらに、第１の態様の方法は、ＭＩＣ−１受容体複合体の量（つまり、対象の内因性ＭＩＣ−１受容体複合体の量）を調整することによるＭＩＣ−１活性の調節を伴っていてもよい。ＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節するためには、本作用物質は、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる作用物質から選択されることが好ましく、ＭＩＣ−１受容体複合体をコードする遺伝子（複数可）を標的とする触媒性及び阻害性オリゴヌクレオチド分子（例えば、リボザイム、ＤＮＡザイム、アンチセンスＲＮＡ、及び低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small inhibitory RNA））、及びＭＩＣ−１受容体複合体の転写又は翻訳の阻害剤から選択されてもよい。そのような作用物質は、内因性ＴＧＦ―βＲII受容体、好ましくは内因性視床下部ＴＧＦ―βＲII受容体の量を減少させることが好ましいが、内因性ＲＩ受容体の量を減少させる作用物質も好適であり得る。そのような作用物質は、癌、慢性腎不全、又は他の原因疾患、状態、若しくは治療によるＭＩＣ−１過剰発現を伴う食欲不振症／悪液質を治療に好適であることが予測される。
【００３１】
第１の態様の方法で使用するための作用物質は、任意の好適な医薬組成物／獣医学的組成物又は剤形（例えば、経口、頬腔、経鼻、筋肉内、及び静脈内投与用の組成物）に製剤することができる。典型的には、そのような組成物は、食欲及び／又は体重を調節するのに有効な量で対象に投与されることになり、したがって、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの作用物質、より好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０５〜２５μｇの作用物質を提供してもよい。好適な組成物は、最も有効な結果を達成するために必要な、１日１回の投与、１日複数回の投与、又は制御放出若しくは持続性放出用のものであってもよい。
【００３２】
さらに、本発明は、ＭＩＣ−１活性を調節する作用物質について、作用物質候補又は作用物質ライブラリーをスクリーニングするための方法も提供する。
【００３３】
したがって、第２の態様では、本発明は、マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、前記方法は、例えば、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーを発現する培養細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を使用して、インビトロで実施される。ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性の変化は、ｅｒｋ１／２、Ｐ−ｓｔａｔ３などの１又は複数のシグナル伝達分子、及びｓｍａｄシグナル伝達経路の（例えば、リン酸化による）活性化、又は活性化の欠如を検出することにより検出することができる。或いは、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性の変化は、ＭＩＣ−１活性に関連していることが以前に報告されているａｋｔシグナル伝達経路の１又は複数のシグナル伝達分子の活性化、又は活性化の欠如を検出することにより検出することができる（Wollman, W. et al. The macrophage inhibitory cytokine integrates AKT/PKB and MAP kinase signaling pathways in breast cancer cells. Carcinogenesis 26(5):900-907 (2005)）。
【００３５】
本方法のステップ（ｉ）が、ＭＩＣ−１受容体複合体のモノマーを使用して実施される場合、モノマーは、好ましくはＴＧＦ−βＲII受容体、より好ましくは視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である。
【００３６】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマー活性の減少が検出されることは、作用物質が、対象の食欲及び／又は体重を増加させる可能性が高いことを示し得る。一方では、ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマー活性の増加が検出されることは、作用物質が、対象の食欲及び／又は体重を減少させる可能性が高いことを示し得る。
【００３７】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法により同定される新規な作用物質を提供する。
【００３８】
以下の非限定的な実施例及び添付の図面を参照することにより、本発明を本明細書の下記でさらに説明する。
［実施例］
【実施例１】
【００３９】
材料及び方法
腫瘍異種移植モデル
８週齢ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹に、２００ｍｌのＰＢＳ中の５〜７×１０６個の形質移入ＤＵ１４５細胞を皮下注射した。ＤＵ１４５細胞を、成熟ＭＩＣ−１（ＭＩＣ−１）、全長ＭＩＣ−１、ＭＩＣ−１のプロコンバターゼ部位欠失変異体、又は空ベクターを含むpIRES2-EGFPプラスミド（Clontech社製、マウンテンビュー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）で形質移入した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。目視で確認できるようになったら、腫瘍サイズを測定し、マウスを６週間１〜３日毎に計量した。
【００４０】
除脂肪量及び脂肪量を、二重Ｘ線吸光光度計（ＤＸＡ、dual X-ray absorptiometer）（Lunar Piximus II、GE Medical Systems社製、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）、並びに白色及び褐色脂肪組織蓄積、脛骨筋及び腓腹筋の解剖の両方によって決定し、その後マウスの体重を、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表した。
【００４１】
ＭＩＣ−１過剰発現トランスジェニックマウスの作製
従来の方法により、トランスジェニックマウスを構築した。手短かに言えば、マウスＭＩＣ−１の全長コード配列の発現をマクロファージ特異的に進める修飾ｃ−ｆｍｓプロモーター配列を含有するプラスミド構築体を線形化し、Ｃ５７ＢＬ６卵母細胞に注入した。その後、その結果生じたトランスジェニックマウスをＷＴＣ５７ＢＬ６マウスと交尾させ、その結果生じたトランスジェニックマウス系をｆｍｓＭＩＣ−１と呼び、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価される、脾臓（マクロファージが豊富な組織）におけるＭＩＣ−１発現の増加に基づいて選択した。ＭＩＣ−１は、マウス血清で容易に検知可能な程度にまで強力に発現した。
【００４２】
ＭＩＣ−１試薬
ＭＩＣ−１抗体及び組換えタンパク質はすべて、文献に記載されているように調製及び精製した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Fairlie, WD. et al. Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-β superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1): Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 40:65-73 (2001)、Brown, DA. et al. Concentration in plasma of macrophage inhibitory cytokine-1 and the risk of cardiovascular events in women. Lancet 359:2159-2163 (2002)）。組換えＭＩＣ−１を、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の順化培地中で発現させ、酵母ピキア・パストリスの順化培地から疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、その後逆相ＨＰＬＣの組合せを使用して精製した。組換えＭＩＣ−１で免疫したか又は未免疫のどちらかのヒツジに由来する血清のプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって、ＭＩＣ−１ ＰＡｂ又は対照ＩｇＧをそれぞれ調製した。いくつかの実験では、精製組換えＭＩＣ−１がカップリングされていたセファロースカラムでＭＩＣ−１ ＰＡｂを精製することにより、アフィニティー精製抗ＭＩＣ−１抗体を調製した。ＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体をハイブリドーマから取得し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００４３】
ＭＩＣ−１発現用に操作されたＡＡＶベクターの作製
ヒトＭＩＣ−１のｃＤＮＡを、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、woodchuck hepatitis virus post-transcriptional-regulatory element）、及びＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ、inverted terminal repeat）が隣接するウシ成長ホルモンポリアデニル化（plyadenylation）シグナルを含有するＡＡＶ発現プラスミドに、ＣＢＡ（ニワトリβ−アクチン、chicken β-actin）プロモーターの制御下でサブクローニングした。導入遺伝子インサートを有していないＡＡＶ発現プラスミドをＡＡＶにパッケージングし、対照ベクターとして使用した。その後、本質的に記載されているように、感染性ＡＡＶ粒子を産生した（Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。手短かに言えば、標準的ＣａＰＯ４形質移入法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞をＡＡＶ及びヘルパープラスミドで同時形質移入した。形質移入６０時間後に細胞を回収し、イオジキサノール密度勾配の超遠心分離により、ＡＡＶベクターを細胞溶解物から精製し、その後ＰＢＳに対して濃縮及び透析した。リアルタイムＰＣＲ（ABI Prism 7700型）を使用してベクターを滴定し、ベクター保存液はすべて１ｍｌ当たりゲノム数１×１０１３に希釈した。
【００４４】
代謝率、呼吸交換率、及び身体活動の測定
代謝率は、８チャンバーオープンサーキット熱量計（Oxymaxシリーズ、Columbus Instruments社製、コロンバス、オハイオ州、アメリカ合衆国）を使用して、８〜１０週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ、ｆｍｓＭＩＣ−１、又はＣ５７Ｂｌ６マウスのいずれかで、間接熱量測定法により測定した。マウスは、特別に作製されたプレキシガラスケージ（２０．１ｃｍ×１０．１ｃｍ×１２．７ｃｍ）に個々に収容されていた。温度は、０．６ｌ／分の空気流を用いて２２℃に維持されていた。食餌及び水はどちらも自由に摂取可能であったか、又はいくつかの実験では、ＭＩＣ−１注射後１２時間はマウスに食餌を与えなかった。記録を始める前に、マウスを２４時間ケージに順応させた。その後、１０μｇのＭＩＣ−１又は対照緩衝液のいずれかをマウスに皮下注射し、その後、１２時間モニターした。酸素消費量（ＶＯ２）を２７分毎に測定し、呼吸交換率（ＲＥＲ）を、ＶＣＯ２／ＶＯ２として算出した。エネルギー消費量（生成されたｋｃａｌの熱）は、発熱量（ＣＶ、Calorific Value）×ＶＯ２として算出し、ＣＶは３．８１５＋１．２３２×ＲＥＲであった。熱発生データの統計分析は、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡにより行った。
【００４５】
対飼養実験
実験は、３群の８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して実施した。マウスは、実験開始前に１週間個々に収容されていた。１群のマウスを、１０μｇのＭＩＣ−１の皮下注射で１日２回処置し、食餌は自由に与えた。第２の群の対照マウスにはビヒクルのみを注射し、この場合も食餌は自由に与えた。第３の対飼養の群にはビヒクルのみを注射し、ＭＩＣ−１注射マウスと対飼養した。
【００４６】
対飼養は、ＭＩＣ−１処置群により消費された食餌を２４時間毎に測定することにより行った。その翌日、対飼養マウスには、前日にそれらのＭＩＣ−１処置対により消費されたのと同じ量の食餌を与えた。食餌摂取量を測定するために、ペレット食餌を計量し食餌ホッパーに入れ、２４時間後に残っていた食餌を再び計量し、食べこぼし及び糞便を補正した差は、１日の食餌摂取量を表していた。
【００４７】
癌性悪液質患者コホート
ＭＩＣ−１レベルを推定するための血清試料を、癌性悪液質に関する文献に公表された研究に参加した患者から取得した（Pfitzenmaier, J. et al. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 97:1211-1216 (2003)）。手短かに言えば、これは、前立腺疾患を有していない１０患者の対照群、器官内限局の前立腺癌（ＣａＰ、cancer of the prostate）を有すると新たに診察された１９患者の群、及び進行ＣａＰを有する３８患者の群であった。さらなる分析のために、この群を２つの亜群：悪液質を示していない進行前立腺癌及び悪液質を示している進行前立腺癌に分割した。進行前立腺癌患者を、研究参加に先立って腫瘍学者により決定された臨床状態に基づいて分類した。患者が３〜６か月の期間にわたる体重減少及び食欲減少（食欲不振症）を示した場合、その患者を悪液質であると決定した。両症状が存在しなかった場合、患者は非悪液質であるとみなした。単一の症状が存在した場合、低エネルギーレベル、疲労、又は低運動耐容能のうち１つの症状が存在した場合のみ、悪液質と診断した。進行ＰＣａ非悪液質亜群は、１４患者で構成されていた。３／１４患者で体重減少が見られ、平均±ＳＥＭ体重減少は０．８７±０．５１ｋｇ（中央値：０ｋｇ；範囲：０〜６．２ｋｇ）であった。幾人かの患者は、体重減少にもかかわらず、所属腫瘍学者により決定された彼らの臨床状態に従うと悪液質であるとはみなされなかった。年齢の中央値は、７２．５歳であった。悪液質亜群は、２４患者で構成されていた。１人の患者だけが、第２の基準に基づいて悪液質群に分類された。この群のすべての患者が体重減少を示し、平均±ＳＥＭ体重減少は６．８９±１．００ｋｇ（中央値：４．７ｋｇ；範囲：１．５〜２１．９ｋｇ）であった。年齢の中央値は、６８．５歳であった。
【００４８】
マウス視床下部内注射
実験はすべて下記の手順を使用して行われた。マウスに、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン（keatmine）及び２０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Parke Davis-Pfizer社製、シドニー、オーストラリア、及びBayer AG社製、レーヴァークーゼン、ドイツ）で麻酔をかけ、頭を頭蓋骨が水平となる位置にして、Kopf定位固定フレーム（David Kopf製、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）に固定した。マウスには、マイクロ４マイクロシリンジポンプコントローラー（World Precision Instruments Inc.社製、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国）に取り付けられた１０μｌハミルトンシリンジを使用して、視床下部に関連物質を０．１μｌ／分の速度で一側性に注射した。
【００４９】
サイトカインの直接注射の場合、成体ＷＴマウスに、１μｌのＭＩＣ−１、１μｌのレプチン、又は１μｌの対照溶液を、ブレグマを基準にして２．３ｍｍ後側、±０．３ｍｍ外側、５．６ｍｍ腹側の、ＡＲＣに対応する座標を使用して注射した（Sainsbury, A. Schwarzer, C. Couzens, M. Herzog, H. Y2 receptor deletion attenuates the type 2 diabetic syndrome of ob/ob mice. Diabetes 51:3420-3427 (2002)）。注射開始３０分後に、マウスを屠殺した。灌流により脳を固定し、Ｐ−ｓｔａｔ３ニューロンを下記のように免疫組織化学検査により識別した。
【００５０】
抗ＴＧＦ−β受容体抗体の投与
抗ＴＧＦ−β受容体抗体の注射を伴う実験の場合、１．５μｌの抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１μｌ／分の速度で、３匹の成体マウスの後視床下部区域に一側性に注射した。注射した抗体は、ＴＧＦ−βＲII（R&D Systems, Inc.社製）、又はＢＭＰ ＲII（GeneTex, Inc.社製、サンアントニオ、テキサス州、アメリカ合衆国）、又はレプチン受容体（Upstate Biotech.社製、レークプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ合衆国）に対する阻害性ヤギ抗体であった。この例では、注射後１０分間は針を刺したままにしておき、拡散を可能にした。注射座標は（ブレグマから）：前側−後側、−２．３ｍｍ；中央−外側、−０．５ｍｍ；背側−腹側、−４．５ｍｍであり、後視床下部区域に対応していた（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）。ＴＧＦ−βＲII抗体の注射２４時間後、午前１０時〜午後１２時に１００μｇのｈＭＩＣ−１を動物に腹腔内注射した。注射した正確に３０分後、下記に記載するように後視床下部区域のｃ−ｆｏｓ及びＴＧＦ−βＲII免疫反応性ニューロンを検出するために、マウスを屠殺して脳を回収した。
【００５１】
代替実験では、６匹の成体雄マウスを３群に分割した：１．５μｌ抗ＴＧＦ−βＲII抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（R&D Systems, Inc.社製）、１．５μｌ抗ＢＭＰ ＲII抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（GeneTex Inc.社製、サンアントニオ、テキサス州、アメリカ合衆国）、又は１．５μｌ抗レプチン抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Upstate Biotech.社製）を、ＡＲＣに一側性に注射した。注射後１０分間は針を刺したままにしておき、拡散を可能にした。注射座標は（ブレグマから）：前側−後側、−１．９４ｍｍ；中央−外側、−０．４ｍｍ；背側−腹側、−５．５ｍｍであり、弓状視床下部核に対応していた（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）。注射２４時間後、午前１０時〜午後１２時に１００μｇのｈＭＩＣ−１を動物に腹腔内注射し、注射３０分後に、下記に記載するように弓状視床下部区域のｃ−ｆｏｓ免疫反応性を検出するために、マウスを屠殺して脳を回収した。
【００５２】
マウス脳の免疫組織化学検査及び免疫蛍光検査
当日の定時（午前１０時〜午後１２時）に、１０μｇ又は１００μｇいずれかのｈＭＩＣ−１又は対照緩衝液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。ｃ−ｆｏｓ免疫反応性における変動を可能な限り最小にするのを保証するため、マウスはすべて、１０μｇのｈＭＩＣ−１の腹腔内注射後、正確に６０±１分後に屠殺された。Ｐ−ｓｔａｔ３の場合は、５ｍｇ／ｋｇ（約１００μｇ）のレプチン、１００μｇのｈＭＩＣ−１、又は対照緩衝液でマウスを処置し、腹腔内注射した正確に３０分後、マウスを屠殺した。マウスに深い麻酔をかけ、２５ｍｌのリン酸緩衝液中０．９％生理食塩水で、その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．４）で調製した冷却４％パラホルムアルデヒドで灌流することにより、脳を固定した。脳を直ちに摘出し、３０分間４％パラホルムアルデヒド中に置き、その後、リン酸緩衝液中３０％スクロース溶液の中に終夜置いた。脳を３０μｍの冠状切片に薄切し、５０％アルコール中１％Ｈ２Ｏ２で２０分間洗浄して内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させた。一次抗体、ウサギ抗マウスｃ−Ｆｏｓ（ｓｃ−５２；Santa Cruz Biotechnology Inc.社製、サンタクルーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を、０．１％トリトンｘ−１００を含有するＰＢＳで１：５０００に希釈し、その後終夜インキュベートした。ウサギ抗マウスホスホ−Ｓｔａｔ３（Cell Signaling Technology Inc.社製、ダンバーズ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２抗体（Cell Signaling社製）、及びヤギ抗マウスＴＧＦ−βＲII（R&D Systems社製）を、それぞれ１：５００、１：２０００、及び１：２０００に希釈したという点を除いて、同様に処理した。ＰＢＳ−トリトンで３回各１０分間洗浄した後、切片を、ＰＢＳで１：２５０に希釈したビオチン化抗ウサギ二次抗体（Sigma Aldrich社製）又は抗ヤギ二次抗体（Chemicon社製、テメキュラ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）と共に２時間インキュベートした。切片を、３０分間ＰＢＳで洗浄し、その後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（Vectastain社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）で、３０分間室温でインキュベートした。ニッケル増強染色を使用して１切片上の２つの抗体の反応性を区別したいくつかの実験の場合、切片をＰＢＳで洗浄し、その後０．０４％硫酸ニッケルアンモニウムの存在下で、０．０５％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Sigma社製）及び０．００７％過酸化水素を用いて処理した。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、DAKO社製（カーピンテリア、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）ジアミノベンジジンで５分間処理した。スライドを水中ですすぎ、カバーガラスをかける前にキシレンに通して脱水した。核内Ｆｏｓ陽性ニューロンを、Zeiss Axioplan光学顕微鏡のグリッドレチクル及び１０×対物レンズを用いて計数した。違いが見てすぐに分かったところを含む領域では、ｃ−ｆｏｓ陽性核を計数した。目的の各脳核の場合、Franklin及びPaxinos（Paxinos, G. Franklin, KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. San Diego, USA）による定位固定座標におけるマウス脳の図譜に従って、切片を３枚毎に計数して、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロンを定量化した。同時に染色した２群（１群当たり５匹のマウス）間で比較を行い、各核中のニューロン計数の平均数を、左側及び右側の両方から決定した。すべての群を最終分析用にプールし、群間の違いは、ＡＮＯＶＡ及び、その後フィッシャーの事後検定により評価した。
【００５３】
免疫蛍光検査の場合、一次抗体、ウサギ抗マウスＰ−Ｓｔａｔ３（Cell Signaling社製）及びヒツジ抗マウスα−ＭＳＨ（ＡＢ５０８７；Chemicon社製）を、０．１％トリトンｘ−１００を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、phosphate-buffered saline）で１：５０００及び１：４０００に希釈し、次いで終夜インキュベートした。ＰＢＳ−トリトンで３回各１０分間洗液した後、ＰＢＳで１：２５０に希釈したAlexaフルオロフォア（Alexa Fluor（登録商標）５９４及びAlexa Fluor（登録商標）４８８；Molecular Probes社製、ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国）とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体及びロバ抗ヒツジ二次抗体で、切片を３時間インキュベートした。切片を、ＰＢＳで３回各１０分間洗浄し、フルオロフォアシグナル（ｃ−Ｆｏｓの場合は赤色、及びα−ＭＳＨニューロンの場合は緑色）を、Zeiss Axioplan光学顕微鏡（Oberkochen、ドイツ）で検査した。
【００５４】
インシトゥハイブリダイゼーション
当日の定時（午前１０時〜午後１２時）に、１０μｇのｈＭＩＣ−１又は対照緩衝液のいずれかを、マウスに腹腔内注射した。マウスはすべて、腹腔内注射した正確に６０分後に屠殺し、直ちに脳を摘出し、ドライアイスで凍結した。冠状切片（２０μｍ）をクリオスタットで切断し、Superfrost（登録商標）スライド（Menzel-Glaser社製、ブラウンシュワイク、ドイツ）に解凍マウントした。ＭＩＣ−１注射マウス及びＰＢＳ注射マウス（ｎ＝５匹のマウス／群）の同じ冠脳側位に由来するマッチング切片を、以前に記載されているように（Sainsbury, A. Schwarzer, C. Couzens, M. Herzog, H. Y2 receptor deletion attenuates the type 2 diabetic syndrome of ob/ob mice. Diabetes 51:3420-3427 (2002)）、マウスＮＰＹ（5'-GAGGGTCAGTCCACACAGCCCCATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3'）（配列番号１）；マウスＰＯＭＣ（5'-TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCACACATCTATGGAGG-3'）（配列番号２）；マウスＧＨＲＨ（5'-GCTTGTCCTCTGTCCACATGCTGTCTTCCTGGCGGCTGAGCCTGG-3'）（配列番号３）に相補的な放射性同位体標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して一緒にアッセイした。
【００５５】
散在性ニューロンのｍＲＮＡレベルを評価する場合、浸漬切片の画像を、Zeiss Axiophot顕微鏡に取り付けられたProgRes 3008カメラ（Zeiss社製、イェーナ、ドイツ）を使用してデジタル化した。単一ニューロン上の銀色粒子密度を、ＮＩＨイメージ１．６１ソフトウェア（Wayne Rasband作成、zippy.nimh.nih.govの匿名ＦＴＰから入手可能）を使用して評価した。バックグラウンド標識化は一定であり、特定シグナルの５％を超過することはまったくなかった。
【００５６】
混合免疫組織化学検査（インシトゥハイブリダイゼーション）
Ｃ５７Ｂ６マウスを、上記で概説したように組換えｈＭＩＣ−１で処理し、Ｐ−ｓｔａｔ３免疫組織化学検査の場合とまったく同様に処理した。以前に概説したものに軽微な変更を加えて、Ｐ−ｓｔａｔ３の免疫組織化学標識化を実行した。抗Ｐ−ｓｔａｔ３抗体を、０．３％トリトンＸ−１００、０．１％ＢＳＡ、及びヘパリン５ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳで１：２０００に希釈した。切片を４℃で４８時間インキュベートし、特異的抗体標識化を、上記と同じ手順を使用して検出した。上記で概説したように、切片をマウントし、ＮＰＹインシトゥハイブリダイゼーションを実施した。
【００５７】
統計分析。
前立腺癌患者のデータを、線形回帰分析、単変量ロジスティック回帰分析、及び多変量ロジスティク回帰分析に加えて、マンホイットニーＵ検定を使用して分析した。癌関連体重減少の予測に関する独立型検査としての血清ＭＩＣ−１とＩＬ−６との比較は、マクネマーの検定（GraphPad社製、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用して行った。代謝データの比較は、PRISM4を使用して二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより行った。特に指定のない限り、違いに関する他のすべての統計学的評価は、独立両側Ｔ検定を使用して行った。特に指定のない限り、グラフのエラーバーはすべて標準偏差を示す。特に明記しない限り、分析はすべて、STATVIEW VERSION 4.5（Abacus Concepts社製、バークレー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用して実施した。
【００５８】
結果
ＭＩＣ−１は急激な体重減少を誘導し、それはＭＩＣ−１に対する抗体によって反転可能である
ＭＩＣ−１の局所的及び全身性過剰発現の効果を理解するために、ＭＩＣ−１を構成的に産生しないヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５を、ヒトＭＩＣ−１（ｈＭＩＣ−１）発現プラスミド構築体で恒久的に形質移入した。これらの構築体は、ＭＩＣ−１のマトリックス結合を仲介するプロペプチドドメインを保持していたか、又は欠損していた（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。形質移入されたＤＵ１４５細胞系をヌードマウスの側腹に皮下注射して、異種移植腫瘍を確立した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)）。マウスを６週間モニターした後、血清ｈＭＩＣ−１レベルを高度に特異的なＥＬＩＳＡを使用して決定した（Bauskin, AR. et al. The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC-1: Role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 65:2330-2336 (2005)、Fairlie, WD. et al. Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-β superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1): Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 40:65-73 (2001)、Brown, DA. et al. Concentration in plasma of macrophage inhibitory cytokine-1 and the risk of cardiovascular events in women. Lancet 359:2159-2163 (2002)）。腫瘍由来ｈＭＩＣ−１が上昇したマウスでは、エンドポイント血清ＭＩＣ−１濃度に比例して、進行的に体重が減少した（図１ａ、２ａ、及び２ｂ）。正常なヒトに見出されるレベルと類似した、低血清レベルの腫瘍由来ｈＭＩＣ−１（０〜１５００ｐｇ／ｍｌ）を示すマウスでは、体重が約１９％増加し、これらのマウスの若年齢と一致した（図１ａ）。ＭＩＣ−１レベルが中程度に上昇したマウスでは（１５０１〜８５００ｐｇ／ｍｌ）、それらの体重の約３％が失われ、ＭＩＣ−１レベルが顕著に上昇したマウスでは（８５００ｐｇ／ｍｌを超える）、実験期間中に約２８％の体重が失われた（図１ａ）。対照腫瘍を有するマウスでは、体重増加が実験期間中継続したため、対照群に対するＭＩＣ−１の実効的な効果は、ｈＭＩＣ−１の血清レベルが中程度であるマウス及びｈＭＩＣ−１の血清レベルが高いマウスで、それぞれ２２％及び４７％の体重減少であった。
【００５９】
体重減少に対するＭＩＣ−１効果の特異性を直接的に実証するために、ポリクローナルヒツジ抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧ（ＭＩＣ−１−ＰＡｂ）を腫瘍保持マウスに注射することにより、その作用を反転させた。ＭＩＣ−１の体重低減効果のこの反転は、対照ＩｇＧ（ＣＯＮ−ＩｇＧ）を使用した際には見られなかった（データ非表示）。加えて、ｈＭＩＣ−１（ＭＩＣ−１−ＭＡｂ）に特異的なモノクローナル抗体の単回注射は、このＭＩＣ−１関連体重減少（図１ｂ、１ｃ、２ａ、及び３）及び腫瘍サイズに対するあらゆる影響（データ非表示）を迅速に反転させたが、媒体対照では反転しなかった。ＭＩＣ−１誘導性体重減少の反転の規模及び持続期間は、投与されたＭＩＣ−１−ＭＡｂの量に比例していた。１ｍｇのＭＩＣ−１−ＭＡｂを注射は、１４％のピーク体重増加に結び付き、その結果、腫瘍誘導性体重減少の完全な反転がもたらされた。これを、媒体対照を投与したＭＩＣ−１腫瘍保持マウスにおける顕著で継続的な体重減少と比較した（図３）。このＭＩＣ−１−ＭＡｂが効果的だった持続期間は、１７日間だった（図１ｃ）。また、抗体処置は、腫瘍サイズに影響を与えなかった（データ非表示）。これらのデータは、ＭＩＣ−１発現腫瘍によって誘導された体重減少が、ＭＩＣ−１によって特異的に仲介されていることを示す。
【００６０】
ＭＩＣ−１がこの効果の原因だったことをさらに実証するために、用量を増加させた精製組換えｈＭＩＣ−１を、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１日２回３日間投与し、この期間中のマウスの体重変化を測定した。これにより、ＭＩＣ−１が用量依存的に体重減少を誘導することが実証され（図４）、精製組換えｈＭＩＣ−１を１０μｇ投与すると、その結果として顕著で速効性の体重減少がもたらされ、それはマウスにＭＩＣ−１−ＰＡｂを与えることによって完全に反転できたが、ＣＯＮ−ＰＡｂでは反転できなかった（図１ｇ）。
【００６１】
マウスにおけるＭＩＣ−１誘導性体重減少の特徴付け
ＭＩＣ−１発現腫瘍によって誘導された体重減少の性質をより詳しく特徴付けるために、白色及び褐色脂肪組織蓄積、脛骨筋及び腓腹筋の解剖により、種々の区域における脂肪量及び除脂肪量の変化を決定し、その後それらの重量を、腫瘍を注射した日のマウス体重の割合として表した（図１ｅ）。ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍を保持するマウスには、後腹膜脂肪は残っておらず、鼠径脂肪蓄積及び精巣上体脂肪蓄積のそれぞれ５４％及び８９％減少が示された。対照腫瘍を保持するマウスと比較して、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスの肩甲骨間褐色脂肪組織蓄積（４０％）並びに脛骨筋及び腓腹筋（それぞれ２５％及び２９％）の重量は、少量ではあるが有意に減少した。二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＸＡ、Dual Energy X-ray Absorptiometry）走査データにより、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスでは、対照と比較して平均５．３ｇの除脂肪量及び平均１．１ｇの脂肪量の減少が確認された（図１ｆ）。
【００６２】
ＭＩＣ−１過剰発現腫瘍を保持するマウスの体重減少が、摂食減少のためだったかどうか決定するために、食餌摂取量を３日連続で測定した。高血清レベルのＭＩＣ−１を伴うＤＵ１４５細胞腫瘍を有するマウスを、空ベクターで形質移入した対照ＤＵ１４５細胞腫瘍を保持するマウスと比較した。ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍を保持するマウスの摂食は、それらの対照腫瘍保持マウスより、平均で１日当たり３２％少なかった（図１ｄ）。ＭＩＣ−１−ＰＡｂ又はＣＯＮ−ＰＡｂのいずれかを投与された組換えＭＩＣ−１注射ＢＡＬＢ／ｃマウスの食餌消費量も測定した。腫瘍保持マウスのデータと類似して、組換えＭＩＣ−１の投与は、食餌摂取量の顕著な減少を誘導した（図１ｈ）。重要なことは、ＭＩＣ−１−Ｐａｂ処置によってこの過小食が反転されて体重増加がもたらされたことであり（図１ｈ）、食餌摂取量の減少が、ＭＩＣ−１により仲介される体重減少の主要な要素であることが立証された。
【００６３】
ＭＩＣ−１誘導性の脂肪量減少、除脂肪量減少、及び体重減少が、完全に過小食によるものかどうか、又は代謝的要因も役割を果たしているのかどうかを見い出すために、ビヒクル注射マウスを、ＭＩＣ−１の１日２回注射を受容したマウスにより消費された食餌量で対飼養した。対飼養ビヒクル注射マウスでは、少なくともＭＩＣ−１注射動物と同じ程度の体重が減少し、除脂肪量又は脂肪量の減少に関しては、ＭＩＣ−１注射マウスとの有意差を示さなかった（図５ａ及び５ｂ）。対飼養動物に観察されたわずかに大きな体重減少は、食餌制限により引き起こされた誘発ストレス応答及び身体活動の増加（例えば、食餌探索行動）による可能性が最も高いが（Challet, E. et al. Involvement of corticosterone in the fasting-induced rise in protein utilization and locomotor activity. Pharmacol Biochem Behav 50:405-412 (1995)）、身体活動のそのような増加は、ＭＩＣ−１注射後には起こらなかっただろう。まとめると、これらのデータは、ＭＩＣ−１が体重を減少させ、それに伴う脂肪量及び除脂肪量を減少させる手段が過小食であることを確立する。
【００６４】
代謝率の増加が、ＭＩＣ−１処置マウスの体重減少及び体組成変化に寄与する一因であることを完全に除外するために、対照緩衝液又は組換えＭＩＣ−１の単回注射で処置した正常マウスのエネルギー消費量を、間接熱量測定法により調査した。対照と比較して、１０μｇのＭＩＣ−１を注射したマウスは、小さいが有意であるエネルギー消費量の低減を示した（図６）。ＭＩＣ−１注射後１２時間にわたってマウスを断食させると、エネルギー消費量におけるこの小さな相対的減少は消失した（図６）。したがって、エネルギー消費量の増加では、ＭＩＣ−１処置マウスの体重減少及び体組成の変更を説明することができず、エネルギー摂取の減少が唯一の原因であることをさらに裏付けている。
【００６５】
ＭＩＣ−１が肥満動物にも効果を示すかどうかを試験するために、遺伝性肥満レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスに、体重２０ｇ当たり１０μｇのＭＩＣ−１を１日２回で３日間注射した。痩せたマウスにおけるＭＩＣ−１の効果に類似して、ｏｂ／ｏｂ動物は、体重の著しい減少を示した（図７ａ）。この体重低減は、対照注射マウスと比較して、ＭＩＣ−１注射ｏｂ／ｏｂマウスの食餌摂取量が著しく減少した結果であった（図７ｂ）。これらのデータは、ＭＩＣ−１が、極度の肥満動物モデルにさえ、過小食及び体重減少を強力に誘導することを示す。
【００６６】
ホルモン及び代謝産物の血清レベルを評価することにより、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスが、遊離脂肪酸、トリグリセリド、グルコース、グルカゴン、レプチン、及びＩＧＦ−１の血清レベルの大幅な低減を示し、それらの除脂肪量及び脂肪量の減少と一致していたことが示された（データ非表示）。ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスは、血清コルチコステロンレベルが増加する傾向も示した。循環ＩＧＦ−１レベルの変化は、視床下部−下垂体成長ホルモン系の阻害を示唆しており、したがって、視床下部における成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、growth hormone releasing hormone）ｍＲＮＡの発現を測定した。図８に示されているように、ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスの脳におけるＧＨＲＨ発現のレベルは、強力に低減されており、これらの動物では、成長ホルモン系が中枢を介して下方制御されることを実証している。血清ＩＧＦ−１レベルの低減は、ＭＩＣ−１の効果のいくつか、特に除脂肪組織の減少に寄与している可能性があるが（Kamel, HK. Maas, D. Duthie, EH. Role of hormones in the pathogenesis and management of sarcopenia. Drugs Aging 19:865-877 (2002)）、この神経内分泌の変化では、ＭＩＣ−１処置動物に見られた脂肪減少を説明することができない。実際、血清ＩＧＦ−１レベルが低い同系マウスは、体脂肪の著しい増加を示した（Rosen, CJ. et al. Congenic mice with low serum IGF-I have increased body fat, reduced bone mineral density, and an altered osteoblast differentiation program. Bone 35:1046-1058 (2004)）。
【００６７】
成長ホルモン系の阻害は、ＭＩＣ−１によって引き起こされる食欲不振症及び体重減少の保護的順応である可能性が高い。これと一致して、エネルギー摂取の制限は、げっ歯動物及びヒトにおいて、視床下部−脳下垂体−成長ホルモン系を阻害、及び／又は血清ＩＧＦ−１レベルを低減させる（Park, S. Sohn, S. Kineman, RD. Fasting-induced changes in the hypothalamic-pituitary-GH axis in the absence of GH expression: lessons from the spontaneous dwarf rat. J Endocrinol 180:369-378 (2004)、Lewitt, MS et al. Responses of insulin-like growth factor (IGF)-I and IGF-binding proteins to nutritional status in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha knockout mice. Growth Horm IGF Res 11:303-313 (2001)、Friedl, KE. et al. Endocrine markers of semistarvation in healthy lean men in a multistressor environment. J Appl Physiol 88:1820-1830 (2000)）。したがって、成長ホルモン系に対するＭＩＣ−１処置の効果は、ＭＩＣ−１効果の一次メディエーターではなく、ＭＩＣ−１の一次効果（食欲不振症及び体重減少）の二次的帰結である可能性が高い。
【００６８】
ＭＩＣ−１腫瘍保持マウスは、過小食であると同時に、それにもかかわらず血清レプチンレベルの著しい減少も示した。これは、ＭＩＣ−１が、血清レプチンレベルの低減による食欲促進効果を無効にすることを示唆し、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスも、痩せた動物のようにＭＩＣ−１に応答して過小食及び体重減少を示すという観察と一致している。
【００６９】
血清ＭＩＣ−１レベルは、進行前立腺癌患者の体重減少と直接相関する
ＭＩＣ−１と食欲不振症／悪液質との関連性をヒトにおいて決定するために、血清ＩＬ−６レベルが悪液質と関連づけられた進行前立腺癌（ＰＣａ）患者を、よく特徴付けられた患者コホートの患者として集め、これらの患者の血清ＭＩＣ−１レベルを測定した（Pfitzenmaier, J. et al. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 97:1211-1216 (2003)）。血清ＭＩＣ−１レベルは、悪液質を示さない進行癌患者と比較して、悪液質を示す進行癌患者で有意に上昇した。（１２４１６±１０２３５ｐｇ／ｍｌ対３２６５±６３７０ｐｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ）；ｐ＜０．０００１；マンホイットニーＵ検定）。同様に、ＩＬ−６の血清レベルは、悪液質患者で上昇した（３３．８±６４．２ｐｇ／ｍｌ対７．８±３．４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００２；マンホイットニーＵ検定）。血清ＭＩＣ−１は、血清ＩＬ−６レベルと、弱いが有意である正の相関性を示した（ｒ＝０．２９４９、ｐ＜０．０４；線形回帰分析）。加えて、単変量及び多変量ロジスティク回帰分析では、血清ＭＩＣ−１レベル及びＩＬ−６レベルの両方が、癌性悪液質の存在の独立予測因子であった（それぞれ、ｐ＝０．０００２、ｐ＜０．０００１；単変量ロジスティク回帰分析：それぞれ、ｐ＝０．００１７、ｐ＝０．０００５；多変量ロジスティク回帰分析）。しかしながら、食欲不振症／悪液質に関する最も良好な客観的で定量化可能な尺度は、体重減少である。血清ＭＩＣ−１レベルは、前立腺癌関連体重減少の程度と有意に関連していたが（図４ａ；ｐ＝０．０００２、ｒ＝０．４８９９；線形回帰分析）、血清ＩＬ−６にはそのような関係性はなかった（ｐ＝０．６３０３；線形回帰分析）（図９ｂ）。
【００７０】
これらの結果により、血清ＭＩＣ−１の推定が、前立腺癌関連悪液質を予測するための検査に有用であり得る可能性も高まった。この可能性を評価するために、現行の最も良好な血清マーカー（ＩＬ−６）を、受信者動作曲線（ＲＯＣ、receiver operator curve）分析による癌診断の際に存在する血清ＭＩＣ−１レベルと比較した。血清ＭＩＣ−１レベルは、癌関連体重減少の予測因子としてＩＬ−６より有意に優れていた。（曲線下面積（ＡＵＣ、Area Under the Curve）０．６８２９対０．３５０５；ｐ＝０．００４６）。血清ＭＩＣ−１の癌性悪液質診断能力を背景状況と比べると、前立腺癌の診断用に最も広く用いられている血清マーカー、ＰＳＡのＲＯＣは、０．６７８のＡＵＣを示し（９５％信頼区間、０．６６６〜０．６８９）（Thompson, IM. et al. Operating characteristics of prostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0 ng/ml or lower. JAMA 294:66-70 (2005)）、ＭＩＣ−１のＡＵＣとほとんど同一の特徴を示している。したがって、血清ＭＩＣ−１の測定は、前立腺癌に伴う癌性悪液質の予測に有用であることを立証し、さらに、ＭＩＣ−１の血清レベルを低減することを目指す任意の将来的治療から利益を得る可能性のある患者が識別されるはずである。
【００７１】
血清ＭＩＣ−１レベルは、慢性腎不全の患者のＢＭＩと関係している
慢性腎不全も、進行癌のように、体重減少及び悪液質と関連している場合がある。食欲不振症、体重減少、及びＢＭＩ等の、このプロセスのマーカーは、末期腎不全の死亡率の強力な予測因子である（Kovesdy, C. P., Anderson, J. E. & Kalantar-Zadeh, K. Inverse association between lipid levels and mortality in men with chronic kidney disease who are not yet on dialysis: effects of case mix and the malnutrition-inflammation-cachexia syndrome. J Am Soc Nephrol 18:304-311 (2007)）。ＢＭＩがこのように強力な死亡率の予測因子であり、血清ＭＩＣ−１レベルの上昇が、動物において同様の変化に関連していたため、末期腎不全の血清ＭＩＣ−１レベルとＢＭＩとの関係性を調査した。この調査を行うため、悪液質又は他の代謝プロセスを研究するため集められたものではなかった末期腎不全の３８１患者コホートに由来する血清試料を検査した（Apple, FS., Murakami, MM., Pearce, LA. & Herzog, CA. Predictive value of cardiac troponin I and T for subsequent death in end-stage renal disease. Circulation 106:2941-2945 (2002)）。
【００７２】
研究期間中（３年まで）に死亡した患者は、有意により低いＢＭＩを示した（２６．１７±５．６３；２６６（平均±ＳＤ；ｎ）、２３．１５±４．９２；１０４：ｐ＜０．０００１；独立ｔ検定）。透析前の血清試料を研究参加時に取得し、ＭＩＣ−１血清レベルを決定した。血清ＭＩＣ−１レベルは、血清ＭＩＣ−１レベルの増加がより低いＢＭＩと関連するように、ＢＭＩと相関していた（ｐ＝０．０００３；ｒ＝０．１８９；線形回帰分析）。
【００７３】
ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、より小さくて、より食べる量が少ない
ＭＩＣ−１の長期投与で生じる可能性のある効果を決定するために、ＣＳＦ−１プロモーターの制御下でＭＩＣ−１を過剰発現するＣ５７ＢＬ６トランスジェニックマウス（ｆｍｓＭＩＣ−１マウス）を検査した。これらのマウスは、出生後の最初の４８時間以内に測定した時に、それらのＷＴ対照と同じような体重を有していた（図１０ａ）。しかしながら、２１日齢までに、雄及び雌ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、両方ともそれらの性別一致ＷＴ同腹子より１８％少ない体重となり（図１０ａ）、違いは成年期まで続いた。ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、食べる量が対照より絶対値では少なかったが、この違いは、食餌摂取量をマウス体重で補正すると消失した（図１０ｂ）。出生時から食餌摂取量が少なかったことが、同系同腹子より小さく、その結果それに比例して食べる量が少なかったマウスの発育に結び付いた可能性が高い。ＭＩＣ−１で急性処置したマウスのように、雄及び雌ｆｍｓＭＩＣ−１マウスは、測定した蓄積のすべてで脂肪を減少させた（図１０ｃ）。全体として、ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスのデータは、このサイトカインで急性処置されたマウスと大まかに一致している。
【００７４】
全身投与されたＭＩＣ−１は視床下部ニューロンを活性化する
食欲及び体重制御の主要な調節中枢は、視床下部、特に弓状核（ＡＲＣ）区域に存在し、この区域は、半透過性血液脳関門を有すると考えられ、潜在的に、血液由来のメディエーターと脳のこの区域との直接的相互作用可能にする（Naylor, JL. et al. Further evidence that the blood/brain barrier impedes paraquat entry into the brain. Human & Experimental Toxicology 14:587-594 (1995)）。ＭＩＣ−１が脳に直接その効果を及ぼしていたかどうか決定するため、マウスに組換えｈＭＩＣ−１を腹腔内注射し、次いで１時間後にマウスを屠殺して前初期遺伝子ｃ−ｆｏｓの脳内発現パターンを検査した。この転写因子は、幅広く多様な刺激によって迅速に誘導され、頻繁に用いられる信頼性の高い、ニューロン活性化の指標である（Karl, T. et al. Y1 receptors regulate aggressive behavior by modulating serotonin pathways. Proc. Natl. Acad. Sci 101:12742-12747 (2004)）。ＭＩＣ−１注射後、視床下部のＡＲＣ及び室傍核（ＰＶＮ、paraventricular nucleus）においてｃ−ｆｏｓ免疫反応性が著しく増加し、これらの核にあるニューロンがＭＩＣ−１作用の下流メディエーターであることを示した。興味深いことには、脳幹の最後野（ＡＰ、area postrema）も、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロン数の著しい増加を示し（表１）、ＭＩＣ−１作用に対する応答にこの核が潜在的な役割を果たしていること示唆した。孤束核（ＮＴＳ、nucleus tractus solitarus）、又は視床下部若しくは脳幹の任意の他の区域では、ｃ−ｆｏｓ陽性ニューロン数に変化はなかった（データ非表示）。
【００７５】
【表１】
【００７６】
これらの知見は、ＭＩＣ−１の中枢効果が、食欲制御の主要中枢であるＡＲＣに向けられていることを示唆する。ＡＲＣからの突起は、ＡＰを含む脳幹区域との接続がそれから形成されるＰＶＮなどの他の視床下部核に達しており、それにより迷走神経交感神経系活性を特異的に調節する（Bouret, S. et al. Formation of Projection Pathways from the Arcuate Nucleus of the Hypothalamus to Hypothalamic Regions Implicated in the Neural Control of Feeding Behavior in Mice. J NeuroSci 24:2797-2805 (2004)）。しかしながら、ＭＩＣ−１によるＡＰの直接的活性化を除外することはできない。ＮＴＳにおけるｃ−ｆｏｓ活性化に変化が欠如していることは、末梢に由来して迷走神経を経由する求心性シグナルが、ＭＩＣ−１効果の仲介に関与していないことを示唆する。
【００７７】
ＭＩＣ−１の視床下部特異的過剰発現は体重減少を誘導する
ＭＩＣ−１が、視床下部仲介性効果により生じる体重減少を誘導することをさらに実証するため、視床下部の弓状核にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、adeno-associated virus）を直接的に一側性注射することによって、ＭＩＣ−１発現を誘導した。このウイルスは、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターの制御下で全長ヒトＭＩＣ−１を発現するように操作されていた。ヒトＭＩＣ−１に特異的な抗体を用いた免疫組織化学検査により、ＡＲＣの細胞によるこのタンパク質の発現が実証された（図１１）。ＭＩＣ−１発現ＡＡＶをこのように注射したマウスは、体重が急激に減少したが、空対照ベクターを注射したマウスは、体重が正常に増加した。これにより、視床下部の細胞に対するＭＩＣ−１の直接的効果を立証するさらなる強力な証拠が提供される。
【００７８】
全身投与されたＭＩＣ−１は、ＴＧＦ−βＲII受容体を介してＡＲＣに作用する
ＭＩＣ−１のようなＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、各々がセリン／トレオニンキナーゼドメインを含有する４つの個別のII（ＲII）受容体及び７つのＩ受容体（ＲＩ）で構成される、高度に保存された受容体スーパーファミリーに結合し、それを介して作用する。リガンドが結合すると、２つのＲII受容体及び２つのＲＩ受容体が四量体に組み立てられ、そこでＲIIは、ＲＩの細胞質ドメインにあるセリン残基をトランスリン酸化する。このトランスリン酸化は、保存されているｓｍａｄファミリーの転写因子が高い頻度で関与するシグナル伝達カスケードを開始する。以前にＭＩＣ−１誘発受容体活性と結び付けられている、ｅｒｋ１／２を含む他の多くのシグナル伝達分子も活性化される（Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res 66:4983-4986 (2006)、Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。
【００７９】
ＭＩＣ−１が優先する（preferred）ＲII受容体を決定するため、異なるＲII受容体に対する種々の抗体を使用して、免疫組織化学検査を実施した。これにより、ＴＧＦ−βＲIIのみが、屠殺の３０分前にＭＩＣ−１を注射したマウスの視床下部において、ｃ−ｆｏｓと共局在化していたことが実証された（データ非表示）。ＴＧＦ−βＲII受容体が、ＭＩＣ−１結合受容体複合体の一部を形成するかどうかを決定するため、この受容体に対する遮断抗体を視床下部に一側性注射した。２４時間後、これらのマウスに１０μｇのＭＩＣ−１を腹腔内注射した。マウスを３０分後に屠殺し、視床下部におけるｃ−ｆｏｓ発現を検査した。
【００８０】
免疫組織化学的な核内ｃ−ｆｏｓ発現は、ＴＧＦ−βＲII抗体を注射した側では遮断されたが、反対側では遮断されなかった。重要なことは、密接に関連した骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、bone morphogenetic protein）のＲII又はレプチン受容体に向けられた遮断抗体の注射が、ＭＩＣ−１誘導性ｃ−ｆｏｓ発現の阻害に帰着しなかったことである（データ非表示）。これは、ＴＧＦ−βＲII受容体が、それを介してＭＩＣ−１がその効果を視床下部に及ぼす複合体の一部を形成しなければならないことを明らかに実証する。
【００８１】
ＭＩＣ−１が視床下部で下流効果を誘導する機序を調査するため、屠殺する１５〜６０分前に１００μｇのＭＩＣ−１を腹腔内注射したマウスの視床下部に、さらなる免疫組織化学を実施した。ｓｍａｄシグナル伝達経路：ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ３、及びｓｍａｄ１、５、８のメンバーのリン酸化形態に特異的であった抗体を利用した。各々の場合、未処置マウスのＡＲＣでは、視床下部におけるこれらの経路の構成的活性化を示唆する抗体すべてによる核染色の存在がすでに実証されていた（データ非表示）。ＭＩＣ−１処置マウスにおけるｓｍａｄ染色の実質的な増加は検出できず、これらの経路が使用されていないか、おそらくはこれらの経路の構成的活性化が、ｓｍａｄリン酸化の著しい増加をすべて覆い隠していることを示唆した。しかしながら、ＭＩＣ−１がｅｒｋ１／２のリン酸化を直接誘導することを、いくつかのグループが報告している（Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15):4648-4655 (2003)）。したがって、屠殺する１０〜６０分前に１００μｇのＭＩＣ−１を注射したマウスの視床下部において、この分子の活性化を検査した。ＭＩＣ−１の腹腔内注射後、Ｐ−ｅｒｋ１／２染色がＡＲＣで検出され、ＭＩＣ−１注射２０分後に最も多く生じた。対照緩衝液を注射したマウスでは、この経路の活性化はなかった。まとめると、これらのデータは、ＭＩＣ−１がｅｒｋ１／２経路の活性化によって効果を仲介することを示す。
【００８２】
全身投与されたＭＩＣ−１は、ＡＲＣ ＮＰＹ及びＰＯＭＣ発現を調節し、転写因子、ｓｔａｔ３を活性化する
ＭＩＣ−１の全身性注射が、食欲調節に関連することが知られているＡＲＣニューロン経路を活性化していたかどうか決定するため、２つの主要な食欲調節因子、ＮＰＹ及びＰＯＭＣの発現を調査した。ＭＩＣ−１注射が、ＡＲＣにおけるＮＰＹ ｍＲＮＡ発現のレベルを３４％低減させ、ＰＯＭＣのｍＲＮＡレベルを４７％増加させたことが、インシトゥハイブリダイゼーションを使用して認められ、摂食衝動の低減と一致していた（表２）。
【００８３】
【表２】
【００８４】
主要なＰＯＭＣ食欲不振症誘発性経路のこの上方制御、及びＮＰＹ食欲促進性経路の下方制御は、レプチン処置マウスで観察されたものと類似したパターンである（データ非表示）。このように類似しているため、ＭＩＣ−１処置マウスの視床下部も、リン酸化されたｓｔａｔ３（Ｐ−ｓｔａｔ３）、レプチン受容体シグナル伝達経路の中枢分子に対する抗体を用いて調査した（データ非表示）。これにより、ＭＩＣ−１処置マウスの側方ＡＲＣ及び視床下部腹内側野（venteromedial hypothalamus）のＰ−ｓｔａｔ３染色ニューロンの顕著な上方制御が明白に示された。興味深いことには、ＭＩＣ−１処置マウスにおけるＰ−ｓｔａｔ３染色のパターンは、レプチン注射により誘導されたパターンとは異なっており、ＭＩＣ−１注射マウスのＰ−ｓｔａｔ３陽性ニューロンの大多数は、レプチン注射の場合の背側ＡＲＣと比較して、側方ＡＲＣに存在した。したがって、ＭＩＣ−１及びレプチンは、両方がＡＲＣのｓｔａｔ３シグナル伝達経路を活性化する一方で、ＡＲＣニューロンの異なるサブセットでＰ−ｓｔａｔ３を誘導した。これらの知見は、ＭＩＣ−１及びレプチンが、別々の経路経由でそれらの効果を誘導することを示唆する。これと一致して、ＭＩＣ−１をレプチン受容体欠損ｄｂ／ｄｂマウスに注射すると、ＷＴＭＩＣ−１注射マウスで見られるものと同等のＰ−ｓｔａｔ３染色がＡＲＣでも生じ、ＭＩＣ−１はレプチン受容体を介して作用しないことを決定的に実証した。
【００８５】
ＭＩＣ−１誘導性Ｐ−ｓｔａｔ３陽性ニューロンをさらに識別するため、ＮＰＹの場合はインシトゥハイブリダイゼーションを、アルファメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、alpha melanocyte stimulating hormone）、ＰＯＭＣの生物学的に活性なプロセシング産物の場合は免疫組織化学検査を、Ｐ−ｓｔａｔ３の場合の免疫組織化学検査／免疫蛍光検査と共に実施した（データ非表示）。これにより、α−ＭＳＨ及びＮＰＹニューロンが、ＭＩＣ−１の標的の主要なクラスであることが識別され、このモデルの体重減少に結び付く食餌摂取量の低減は、ＮＰＹ及びα−ＭＳＨ産生の変化に起因することが示された。さらに、及びｃ−ｆｏｓ活性化の結果と一致して、大多数のこれらのＰ−ｓｔａｔ３／ＮＰＹ及びＰ−ｓｔａｔ３／α−ＭＳＨ陽性ニューロンは、レプチンにより活性化されるニューロンとは異なるニューロンのサブセットを表しており、それによりＭＩＣ−１がそれを介して食欲を調節する新規な経路を示す。
【００８６】
ＡＲＣに対するＭＩＣ−１の直接注射もｓｔａｔ３を活性化する
ＭＩＣ−１がＡＲＣに直接作用するというさらなる証拠を提供するため、ＡＲＣに対するＭＩＣ−１、レプチン、又は対照緩衝液の直接的一側性注射を調査した。注射が終了した２０分後にマウスを屠殺し、脳切片をＰ−ｓｔａｔ３について染色した。対照注射は効果を示さなかったが、レプチン及びＭＩＣ−１は両方とも、ＡＲＣにおけるＰ−ｓｔａｔ３の活性化を明白に誘導した（データ非表示）。染色パターンは、全身投与されたメディエーターで見られたパターンと類似しており、ＭＩＣ−１注射は、ＡＲＣの側方部及び視床下部腹内側核（ＶＭＨＤＭ、ventromedial hypothalamic nucleus）の背側部分にあるニューロンのｓｔａｔ３のリン酸化を誘導した。対照的に、レプチン注射は、ＡＲＣの背側部分、ＶＭＨＤＭの背側部分、及び視床下部外側野（ＬＨＡ、lateral hypothalamic area）にあるニューロンのＳｔａｔ３経路を活性化する（データ非表示）。これにより、これらの２つのメディエーターが、視床下部の異なるニューロンのサブセットに作用することがさらに示される。
【００８７】
考察
腫瘍のＭＩＣ−１過剰産生、及び前立腺癌を有する動物モデル及び患者の両方における、血清ＭＩＣ−１レベルと体重減少との強い相関性は、ＭＩＣ−１が、癌性食欲不振症／悪液質及びおそらくは心不全及び腎不全に伴うものなどの他の悪液質状態の病因に関与していることを示す。癌性食欲不振症／悪液質を示す人々の群におけるサイトカインレベルは、この合併症のない人々と比較して上昇していることは、多くの研究により記載されているが、ＭＩＣ−１では明らかである、サイトカインレベルと体重減少の程度との直接的相関性を実証した者はいない。この関係性、並びに本明細書中で提供されている強力な一連の機構的データは、ＭＩＣ−１が、視床下部ニューロンのＴＧＦ−βＲII受容体に作用して食欲を減少させることを示し、ＭＩＣ−１が癌関連食欲不振症及び体重減少の重要な原因であることを立証する。加えて、ＭＩＣ−１に対する抗体により食欲不振症／悪液質が反転することは、この重度の障害を治療するために、治療用抗体（及び他のＭＩＣ−１アンタゴニスト）が使用できる可能性を示す。最後になるが、本明細書中で示された結果は、ＭＩＣ−１が過小食を引き起こし、食餌摂取量及びエネルギー恒常性の主要な視床下部調節因子、ＮＰＹ及びＰＯＭＣ由来のα−ＭＳＨに直接影響を及ぼすことができることを示す。さらに、ＭＩＣ−１は、食欲不振症、体重減少、並びに視床下部ＮＰＹの減少及びＰＯＭＣ発現の増加というレプチン様効果を誘導するが、ＭＩＣ−１により活性化されたＮＰＹ及びＰＯＭＣニューロンのサブセットは、レプチンと比較して異なる。これは、エネルギー恒常性の様々な局面を調節するニューロンのより多様な機能的ネットワークを示しており、まとめると、ＭＩＣ−１は、食欲及び体重の中枢調節因子であり、その受容体複合体に加えて、癌性食欲不振症／悪液質及び肥満の両治療のための標的として、大きな可能性を提供することを実証する。
【００８８】
本明細書の全体にわたって、「含む（comprise）」という単語、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」などの変異形は、記載されている要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されよう。
【００８９】
本明細書中で言及された出版物はすべて、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、物質、デバイス、又は物品などに関するいかなる議論も、もっぱら本発明に背景状況を提供するためだけである。これらのもののいずれか又はすべてが、従来技術基盤の一部を形成する、又は本発明の関連分野における通常の一般的知識であり、本出願の各特許請求の範囲の優先日前にオーストラリア又は他所に存在していたことの承認として受け取られるべきではない。
【００９０】
当業者であれば、特定の実施形態で示された本発明に対して、広範に記載されている本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、多数の変異及び／又は改変をなすことができることを理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的とみなされるべきではない。
【００９１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法。
【請求項２】
作用物質が、ＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
作用物質が、ＭＩＣ−１の活性を阻害して、対象の食欲及び／又は体重の増加をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＩＣ−１過剰発現に関連する食欲不振症／悪液質の治療に用いるための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
作用物質がＴＧＦ−βＲII受容体と相互作用する、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
作用物質が、ＡＬＫ５阻害剤、ＭＩＣ−１阻害性ペプチド断片及び模倣体、抗ＴＧＦ−βＲII抗体及びその断片、並びに抗ＲＩ抗体及びその断片からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
作用物質が、ＭＩＣ−１の活性を増強して、対象の食欲及び／又は体重の減少をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
肥満の治療に用いるための、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
作用物質がＴＧＦ−βＲII受容体と相互作用する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
作用物質が、ＭＩＣ−１刺激性ペプチド断片及び模倣体からなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質が、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
作用物質が、ＭＩＣ−１受容体複合体をコードする遺伝子（複数可）を標的とする触媒性及び阻害性オリゴヌクレオチド分子、及びＭＩＣ−１受容体複合体の転写又は翻訳の阻害剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
作用物質が、内因性ＴＧＦ−βＲII受容体の量を減少させることにより、ＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＩＣ−１過剰発現に関連する食欲不振症／悪液質の治療に用いるための、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＩＣ−１過剰発現が癌に起因する、請求項４又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＩＣ−１過剰発現が慢性腎不全に起因する、請求項４又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーが、培養細胞の表面に備えられている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における変化が、ｅｒｋ１／２、Ｐ−ｓｔａｔ３シグナル伝達分子、又はｓｍａｄ及び／若しくはａｋｔシグナル伝達経路の活性化、或いは活性化の欠如を検出することにより検出することができる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法により同定される新規な作用物質。
【請求項１】
対象のマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）の活性を調節する方法であって、前記対象に、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する有効量の作用物質を、任意には薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物として投与することを含む方法。
【請求項２】
作用物質が、ＭＩＣ−１受容体複合体と相互作用しその活性を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
作用物質が、ＭＩＣ−１の活性を阻害して、対象の食欲及び／又は体重の増加をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＩＣ−１過剰発現に関連する食欲不振症／悪液質の治療に用いるための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
作用物質がＴＧＦ−βＲII受容体と相互作用する、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
作用物質が、ＡＬＫ５阻害剤、ＭＩＣ−１阻害性ペプチド断片及び模倣体、抗ＴＧＦ−βＲII抗体及びその断片、並びに抗ＲＩ抗体及びその断片からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
作用物質が、ＭＩＣ−１の活性を増強して、対象の食欲及び／又は体重の減少をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
肥満の治療に用いるための、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
作用物質がＴＧＦ−βＲII受容体と相互作用する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
作用物質が、ＭＩＣ−１刺激性ペプチド断片及び模倣体からなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質が、対象のＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
作用物質が、ＭＩＣ−１受容体複合体をコードする遺伝子（複数可）を標的とする触媒性及び阻害性オリゴヌクレオチド分子、及びＭＩＣ−１受容体複合体の転写又は翻訳の阻害剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
作用物質が、内因性ＴＧＦ−βＲII受容体の量を減少させることにより、ＭＩＣ−１受容体複合体の量を減少させる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＩＣ−１過剰発現に関連する食欲不振症／悪液質の治療に用いるための、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＩＣ−１過剰発現が癌に起因する、請求項４又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＩＣ−１過剰発現が慢性腎不全に起因する、請求項４又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
マクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）の活性を調節する能力について、作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）前記作用物質を、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に対するＲII受容体を含むＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーと接触させるステップと、
（ii）前記ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における任意の変化を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーが、培養細胞の表面に備えられている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＩＣ−１受容体複合体又はそのモノマーの活性における変化が、ｅｒｋ１／２、Ｐ−ｓｔａｔ３シグナル伝達分子、又はｓｍａｄ及び／若しくはａｋｔシグナル伝達経路の活性化、或いは活性化の欠如を検出することにより検出することができる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＧＦ−βＲII受容体が視床下部ＴＧＦ−βＲII受容体である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法により同定される新規な作用物質。
【図１ａ−ｅ】
【図１ｆ−ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１ｆ−ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３６７１７（Ｐ２０１０−５３６７１７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０３８４（Ｐ２０１０−５２０３８４）
【出願日】平成２０年８月１８日（２００８．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１２０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１２９３
【国際公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５１００２９８８５）セントビンセンツ ホスピタル シドニー リミテッド (4)
【出願人】（５１００２９９９９）ガーバン インスティテュート オブ メディカル リサーチ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１８日（２００８．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１２０７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１２９３
【国際公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５１００２９８８５）セントビンセンツ ホスピタル シドニー リミテッド (4)
【出願人】（５１００２９９９９）ガーバン インスティテュート オブ メディカル リサーチ (2)
【Ｆターム（参考）】
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