マクロライド系化合物の水酸化に関与するＤＮＡ
本発明は、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの水酸化に関与するＤＮＡおよびマクロライド系化合物１１１０７Ｄの新規な生産方法を提供する。詳しくは、本発明は、式（Ｉ）で示されるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの、式（ＩＩ）で示される１６位水酸化マクロライド系化合物１１１０７Ｄへの生物学的変換に関与するＤＮＡであって、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンをコードするＤＮＡ、その単離方法、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体およびその形質転換体を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はマクロライド系化合物の水酸化に関与するＤＮＡ、その単離方法、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体およびその形質転換体を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法に関する。
従来技術
式（ＩＩ）
で表される１２員環マクロライド系化合物１１１０７Ｄは、優れた抗腫瘍活性を有する１２員環マクロライド系化合物であり、式（Ｉ）
で表される１２員環マクロライド系化合物１１１０７Ｂとともにストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の培養物より見出されている（ＷＯ ０２／０６０８９０）。マクロライド系化合物１１１０７Ｄは、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化体に相当するが、その生産性はマクロライド系化合物１１１０７Ｂの生産性よりも低く、効率的な製造方法の確立が望まれていた。
【発明の開示】
本発明の課題は、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの水酸化に関与するＤＮＡを見出し、マクロライド系化合物１１１０７Ｄの新規な生産方法を提供することにある。
本発明は、以下の［１］〜［１５］に関する。
［１］：式（Ｉ）
で示されるマクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｂという）の、
式（ＩＩ）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｄという）への生物学的変換に関与するＤＮＡであって、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを一部にもしくは全体としてコードするＤＮＡまたはその改変体を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
［２］：下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示される［１］記載のＤＮＡ。
（ａ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｂ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ａ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ａ）または（ｂ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［３］：［２］記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
［４］：［２］のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［５］：［４］の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
［６］：［２］に記載されたＤＮＡまたはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
［７］：下記の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）で示される［１］記載のＤＮＡ。
（ｄ） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｅ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ） フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ｄ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ｄ）または（ｅ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］：［７］記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
［９］：［７］記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［１０］：［９］記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
［１１］：［７］に記載されたＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
［１２］：［５］または［１０］記載の形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、式（ＩＩＩ）
〔式中、
Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは同一または異なって、
（１）水素原子、
（２）置換基を有していても良いＣ１−２２アルキル基、
（３）−ＯＲ（式中、Ｒは
１）水素原子、
置換基を有していても良い、
２）Ｃ１−２２アルキル基、
３）Ｃ７−２２アラルキル基、
４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基、
５）Ｃ２−２２アルカノイル基、
６）Ｃ７−１５アロイル基、
７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基、
８）−ＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは置換基を有していても良い、
８−１）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
８−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
８−３）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基、
８−４）Ｃ６−１４アリールオキシ基、
８−５）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
もしくは
８−６）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を表す）、
９）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基、
１０）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
または
１１）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は同一または異なって、Ｃ１−６アルキル基またはＣ６−１４アリール基を表す）を表す）、
（４）ハロゲン原子
または
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２
｛式中、ＲＭは単結合または−Ｏ−ＣＯ−を表す；
ＲＮ１およびＲＮ２は
１）同一または異なって、
１−１）水素原子もしくは
１−２）置換基を有していても良い、
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル基、
（ｉｉ）不飽和Ｃ２−２２アルキル基、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アルカノイル基
（ｉｖ）Ｃ７−１５アロイル基、
（ｖ）不飽和Ｃ３−２３アルカノイル基、
（ｖｉ）Ｃ６−１４アリール基、
（ｖｉｉ）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
（ｖｉｉｉ）Ｃ７−２２アラルキル基、
（ｉｘ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基もしくは
（ｘ）Ｃ６−１４アリールスルホニル基を表すか、
または
２）ＲＮ１およびＲＮ２は結合する窒素原子と一緒になって置換基を有していても良い３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を形成する｝を表す；
ただし、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは一緒になって、（ｉ）ケトン構造（＝Ｏ）または（ｉｉ）オキシム構造｛＝ＮＯＲｏｘ（式中、Ｒｏｘは置換基を有していても良い、Ｃ１−２２アルキル基、不飽和Ｃ２−２２アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、５員環ないし１４員環ヘテロアリール基またはＣ７−２２アラルキル基を表す）｝を形成しても良い；
Ｒ１６ａは水素原子を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素原子または
（２）
（式中、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂおよびＲ２２ｃは同一または異なって、
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）−ＯＲ（式中、Ｒは前記の意味を有する）、
４）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）または
５）ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａおよびＲ２２ｂのどちらか一方とが一緒になって部分構造
を形成しても良い；
Ｇｍは
（１）式（ＧＭ−Ｉ）で示される基
｛式中、
Ｒ２およびＲ１０は同一または異なって、水素原子またはＣ１−２２アルキル基を表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは同一または異なって、
１）水素原子、
２）ヒドロキシ基、
３）置換基を有していても良い、
３−１）Ｃ１−２２アルキル基、
３−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
３−３）Ｃ６−１４アリールオキシ基
３−４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
３−５）Ｃ２−２２アルカノイルオキシ基、
３−６）Ｃ７−１５アロイルオキシ基
３−７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイルオキシ基、
３−８）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは前記の意味を有する）、
３−９）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基、
３−１０）Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基
もしくは
３−１１）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は前記の意味を有する）、
４）ハロゲン原子
または
５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）を表す；
あるいは、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは一緒になってケトン構造（＝Ｏ）を形成しても良い；
あるいは、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは一緒になって、スピロオキシラニル基またはエキソメチレン基を形成しても良い；あるいは、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは同一または異なって、水素原子または−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素原子、Ｃ１−２２アルキル基またはＣ２−２２アルカノイル基を表す）を表す｝、
（２）式（ＧＭ−ＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（３）式（ＧＭ−ＩＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（４）式（ＧＭ−ＩＶ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）
または
（５）式（ＧＭ−Ｖ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）を表す〕
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、式（ＩＶ）
（式中、Ｗ、Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２１ｃおよびＧｍは式（ＩＩＩ）の定義と同義を表す）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、こうして変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法。
［１３］：形質転換体が、［５］記載の形質転換体であり、かつフェレドキシンをコードするＤＮＡを有する形質転換体である［１２］記載の生産方法。
［１４］：式（ＩＩＩ−ａ）
（式中、
Ｒ５’は水素原子またはアセトキシ基、Ｒ６’は水素原子またはヒドロキシ基、Ｒ７’は水素原子またはアセチル基を表す）で示される化合物を、式（ＩＶ−ａ）
（式中、
Ｗ’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は式（ＩＩＩ−ａ）の定義と同義である）で示される化合物に変換することを特徴とする［１２］記載の生産方法。
［１５］：式（ＩＩＩ−ａ）の化合物の、式（ＩＶ−ａ）の化合物への変換において、
（１）
Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（２）
Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（３）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（４）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（５）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（６）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（７）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（８）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（９）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（１０）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（１１）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’が水素原子である化合物および
（１２）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物からなる群から選択される化合物を対象とする［１４］記載の生産方法。
［１６］：［５］または［１０］記載の形質転換体を、１６位水酸化マクロライド系化合物の生産に用いる用途。
本発明により、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンをコードするＤＮＡを単離して、その塩基配列を決定することができ、更に、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて、１６位水酸化マクロライド系化合物を効率よく生産することができた。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物
本発明においては、マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物を培養した培養液から集めた菌体から、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することができる。そして、このＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミドを構築し、そのプラスミドを用いて形質転換体を調製する。
このようにして調製した形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物を接触させることにより、式（ＩＶ）で表される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することにより、１６位水酸化マクロライド系化合物を得ることができる。
マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物としては、このような能力を有するものであれば、種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として、いずれも土壌から分離されたストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７、Ａ−１５４４株や、未同定の放線菌Ａ−１５６０株を挙げることができる。
尚、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｍｅｒ−１１１０７は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１４４として平成１２年１２月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成１３年１１月２７日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２に移管された。Ａ−１５４４株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８９４３として平成１４年７月２３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、さらに平成１５年７月３０日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４６に移管された。Ａ−１５６０株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９５８５として平成１５年１１月１３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成１６年８月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０２に移管された。
上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。
［Ｍｅｒ−１１１０７株の菌学的性状］
（１） 形態
基生菌糸より螺旋状（Ｓｐｉｒａｌｅｓ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜２０個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは０．７×１．０μｍ位で、胞子の表面は平滑（ｓｍｏｏｔｈ）を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。
（２） 各種培地における生育状態
各種培地上で２８℃、２週間培養後の培養性状を以下に示す。色調の記載はトレズナーのカラー・ホイールズ（ＴｒｅｓｎｅｒのＣｏｌｏｒ ｗｈｅｅｌｓ）の色標名と括弧内に示す符号で表示する。
１）イースト・麦芽寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｌｉｇｈｔ ｇｒａｙ；ｄ）が見られる。培養裏面はＬｉｇｈｔ ｍｅｌｏｎ ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
２）オートミール寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｇ）が見られる。培養裏面はＮｕｄｅ ｔａｎ（４ｇｃ）またはＰｕｔｔｙ（１ １／２ ｅｃ）である。溶解性色素は産生しない。
３）スターチ・無機塩寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｅ）が見られる。培養裏面はＦａｗｎ（４ｉｇ）またはＧｒａｙ（ｇ）である。溶解性色素は産生しない。
４）グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
５）ペプトン・イースト・鉄寒天培地
生育は悪く、その表面に気中菌糸を着生しない。培養裏面はＬｉｇｈｔ ｍｅｌｏｎ ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
６）チロシン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
（３） 各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、２８℃、培養２週間後の生育状況を以下に示す。
１）Ｌ−アラビノース ±
２）Ｄ−キシロース ±
３）Ｄ−グルコース ＋
４）Ｄ−フルクトース ＋
５）シュークロース ＋
６）イノシトール ＋
７）Ｌ−ラムノース −
８）Ｄ−マンニトール ＋
９）ラフィノース ＋
（＋は同化する、±は多少同化する、−は殆ど同化しない。）
（４） 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
（ａ）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：１２℃〜３７℃
（ｂ）最適温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：２１℃〜３３℃
（ｃ）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陰性
（ｄ）ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陰性
（ｅ）ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陰性
（ｆ）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陽性
（ｇ）メラニン様色素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
（チロシン培地）：陰性
（ｈ）硫化水素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
（ｉ）硝酸塩の還元（０．１％硝酸カリ含有ブロス）：陰性
（ｊ）食塩の耐性（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：食塩含有量４％以下で生育
（５） 菌体成分
本菌の細胞壁からＬＬ−ジアミノピメリン酸及びグリシンが検出された。
［Ａ−１５４４株の菌学的性状］
（１） 形態
基生菌糸より螺旋状（Ｓｐｉｒａ ｔｙｐｅ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜２０個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは１．０×１．２〜１．４μｍ位で、胞子の表面はトゲ状（ｓｐｉｎｙ）を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。
（２） 各種培地における生育状態
各種培地上で２８℃、約２週間培養後の培養性状を表１に示す。色調の記載はトレズナーのカラー・ホイールズ（ＴｒｅｓｎｅｒのＣｏｌｏｒ ｗｈｅｅｌｓ）の色標名と括弧内に示す符号で表示する。
（３） 各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、２８℃、培養２週間後の生育状況を表２に示す。
（４） 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
（ａ）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：１５℃〜４１℃
（ｂ）生育至適温度（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：２０℃〜３７℃
（ｃ）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陽性
（ｄ）ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性
（ｅ）ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陽性
（ｆ）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陽性
（ｇ）メラニン様色素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陽性
（チロシン培地）：陰性
（ｈ）硫化水素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陽性
（ｉ）硝酸塩の還元（０．１％硝酸カリウム含有ブロス）：陰性
（ｊ）食塩の耐性（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：食塩含有量７％以下で生育
（５） 菌体成分
本菌の細胞壁からＬＬ型のジアミノピメリン酸が検出された。
本発明のＤＮＡ
本発明者らは、上記微生物からマクロライド系化合物の１６位水酸化に関与するＤＮＡ、すなわち１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定した。以下、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを総称して、「１６位水酸化酵素関連ＤＮＡ」ということもある。
本発明の１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、下記（１−１）、（１−２）または（１−３）で示されるものである。
（１−１） 配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（１−２） 前記（１−１）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ）前記（１−１）で示されるいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、
（ｉｉ）マクロライド系化合物の１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１−３） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（１−１）に示されるいずれのＤＮＡともストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（１−１）または（１−２）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、「１６位水酸化酵素活性」とは、前記式（Ｉ）で示されるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位を水酸化し、前記式（ＩＩ）で示されるマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する酵素活性を意味する。
また本発明のフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、下記（２−１）、（２−２）または（２−３）で示されるものである。
（２−１） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（２−２） 前記（２−１）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ）前記（２−１）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２−３） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（２−１）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（２−１）または（２−２）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、「フェレドキシン機能」とは、前記１６位水酸化酵素へ電子を伝達し、前記１６位水酸化酵素とともに水酸化反応を担うタンパク質機能を意味する。
また前記ＤＮＡの説明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、前記（１−１）または（２−１）のいずれかのＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて放線菌に属する微生物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡを単離することができる。ＤＮＡライブラリーは、前記の１６位水酸化酵素活性を発現している微生物から常法により作製することができる。
またＰＣＲ法により本発明の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡを取得することもできる。上記した微生物由来のＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載したいずれかの塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、適当な宿主中で増幅可能なベクター中にクローニングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、ＤＮＡライブラリーの構築、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記に記載した当該タンパク質をコードするＤＮＡを取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトミセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法またはその他の公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法は以下のように行うことができる。外来遺伝子が挿入されたプラスミドをコンピテント細胞の懸濁液に加え、この懸濁液をエレクトロポレーション法専用のキュベットに入れ、そのキュベットに高電圧の電気パルスをかける。その後選択培地で培養し、平板寒天培地上で形質転換体を単離する。
酵母細胞の例としては、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法
本発明は、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を用い、この形質転換体の存在下で前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物を水酸化させることを含む、前記式（ＩＶ）で表される１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法を包含する。
本発明の形質転換体で水酸化できるマクロライド系化合物は、前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物（前記式（ＩＶ）で表されるマクロライド系化合物）であり、好ましくは、前記式（ＩＩＩ−ａ）で表されるマクロライド系化合物（前記式（ＩＶ−ａ）で表されるマクロライド系化合物）であり、さらに好ましくはマクロライド系化合物１１１０７Ｂ（マクロライド系化合物１１１０７Ｄ）である。なお、括弧内は水酸化生成物である１６位水酸化マクロライド系化合物である。
形質転換体の存在下でマクロライド系化合物を水酸化させる条件は、以下の通りである。
まず形質転換体中の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡを必要により誘導物質を添加し菌体内で発現させる。これらのＤＮＡが発現した菌体を基質である前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物と接触させ、変換反応をさせる。変換反応の温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また反応時間も、１６位水酸化マクロライド系化合物への変換率（反応の進行度合い）等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、２０〜３１℃で、１〜５日が好適である。さらに、反応様式は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。
生成した１６位水酸化マクロライド系化合物の単離及び精製は、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、ダイヤイオンＨＰ−２０などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、目的の１６位水酸化マクロライド系化合物を単離精製することができる。
尚、本発明において、ＤＮＡの改変体とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あるいはその誘導体を意味し、もとのものと同じ効果を発現するＤＮＡを意味する。
また、本願明細書において用いる「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキル基」とは、炭素数が１ないし２２個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等があげられ、好ましくは炭素数が１ないし６個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等である。
本願明細書において用いる「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」とは、炭素数２ないし２２個の直鎖または分枝状アルケニル基、あるいは炭素数が２ないし２２個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、１，３−ヘキサンジエニル基、１，５−ヘキサンジエニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−エチニル−２−プロピニル基、２−メチル−２−プロピニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基、１，３−ヘキサンジインイル基、１，５−ヘキサンジインイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし１０個の直鎖または分枝状アルケニル基、あるいは炭素数が２ないし１０個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリール基」とは、６ないし１４個の炭素原子で構成された芳香族炭化水素環式基を意味し、例えば単環式基、二環式基、三環式基等の縮合環も含まれる。例えばフェニル基、インデニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、インダセニル基、アセナフチル基、フルオレニル基、フェナレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基等があげられ、好ましくはフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等である。
本願明細書における「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」とは、窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を１個以上含んでなる単環式、二環式または三環式の５ないし１４員芳香族複素環式基等をいう。好適な例をあげると、含窒素芳香族複素環式基としては、例えばピロリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンツイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、プリニル基、インダゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、キノリジニル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、イミダゾトリアジニル基、ピラジノピリダジニル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、カルバゾリル基、カルバゾリニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基、フェナシニル基、イミダゾピリジニル基、イミダゾピリミジニル基、ピラゾロピリジニル基、ピラゾロピリジニル基等；含硫黄芳香族複素環式基としては、例えばチエニル基、ベンゾチエニル基等；含酸素芳香族複素環式基としては、例えばフリル基、ピラニル基、シクロペンタピラニル基、ベンゾフリル基、イソベンゾフリル基等；２個以上の異種複素原子を含んでなる芳香族複素環式基としては、例えばチアゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズチアジアゾリル基、フェノチアジニル基、イソキサゾリル基、フラザニル基、フェノキサジニル基、オキサゾリル基、イソキサゾイル基、ベンゾオキサゾリル基、オキサジアゾリル基、ピラゾロオキサゾリル基、イミダゾチアゾリル基、チエノフラニル基、フロピロリル基、ピリドオキサジニル基等があげられ、好ましくはチエニル基、フリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基等である。
本願明細書において用いる「３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環」とは、窒素原子を１個以上含む単環式、二環式または三環式の３ないし１４員環非芳香族複素環をいう。好適な例をあげると、例えばアジリジニル基、アゼチジル基、ピロリジニル基、ピロリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ホモピペリジニル基、ホモピペラジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、イミダゾリニル基、オキサゾリニル基、キヌクリジニル基等があげられる。また、当該含窒素非芳香族複素環には、ピリドン環から誘導される基や、非芳香族性の縮合環（例えばフタルイミド環、スクシンイミド環等から誘導される基）も含まれる。
本願明細書において用いる「Ｃ２−２２アルカノイル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、その末端がカルボニル基である基を意味し、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバリル基、カプロイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし６個のアルカノイル基であり、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ７−１５アロイル基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」、「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」において、その末端にカルボニル基が結合した基を意味し、例えばベンゾイル基、１−ナフトイル基、２−ナフトイル基、ピコリノイル基、ニコチノイル基、イソニコチノイル基、フロイル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基」とは、前記定義の「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」において、その末端にカルボニル基が結合した基を意味し、例えばアクリロイル基、プロピオロイル基、クロトノイル基、ｉｓｏ−クロトノイル基、オレロイル基、リノレノイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし６個の不飽和アルカノイル基であり、例えばアクリロイル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ７−２２アラルキル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、置換可能な部分が前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」で置換される７ないし２２個の炭素原子で構成された基を意味し、具体的には例えばベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基等があげられ、好ましくは炭素数７ないし１０個のアラルキル基であり、例えばベンジル基、フェネチル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルコキシ基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、好適な基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉｓｏ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｉｓｏ−ヘキシルオキシ基、１，１−ジメチルプロポキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、２，２−ジメチルプロポキシ基、２−エチルプロポキシ基、１−エチル−２−メチルプロポキシ基、１，１，２−トリメチルプロポキシ基、１，２，２−トリメチルプロポキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基」とは、前記定義の「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、好適な基としては例えばビニロキシ基、アリロキシ基、１−プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、２−メチル−１−プロペニルオキシ基、２−メチル−２−プロペニルオキシ基、１−ブテニルオキシ基、２−ブテニルオキシ基、３−ブテニルオキシ基、１−ペンテニルオキシ基、１−ヘキセニルオキシ基、１，３−ヘキサンジエニルオキシ基、１，５−ヘキサンジエニルオキシ基、プロパルギルオキシ基、２−ブチニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリールオキシ基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には例えばフェノキシ基、インデニルオキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基、アズレニルオキシ基、ヘプタレニルオキシ基、インダセニルオキシ基、アセナフチルオキシ基、フルオレニルオキシ基、フェナレニルオキシ基、フェナントレニルオキシ基、アントラセニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基」とは、前記定義の「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には例えばピロリルオキシ基、ピリジニルオキシ基、ピリダジニルオキシ基、ピリミジニルオキシ基、ピラジニルオキシ基、トリアゾリルオキシ基、テトラゾリルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ピラゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、ベンツイミダゾリルオキシ基、インドリルオキシ基、イソインドリルオキシ基、インドリジニルオキシ基、プリニルオキシ基、インダゾリルオキシ基、キノリニルオキシ基、イソキノリニルオキシ基、キノリジニルオキシ基、フタラジニルオキシ基、ナフチリジニルオキシ基、キノキサリニルオキシ基、キナゾリニルオキシ基、シンノリニルオキシ基、プテリジニルオキシ基、イミダゾトリアジニルオキシ基、ピラジノピリダジニルオキシ基、アクリジニルオキシ基、フェナントリジニルオキシ基、カルバゾリルオキシ基、カルバゾリニルオキシ基、ペリミジニルオキシ基、フェナントロリニルオキシ基、フェナシニルオキシ基、イミダゾピリジニルオキシ基、イミダゾピリミジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、チエニルオキシ基、ベンゾチエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピラニルオキシ基、シクロペンタピラニルオキシ基、ベンゾフリルオキシ基、イソベンゾフリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、イソチアゾリルオキシ基、ベンゾチアゾリルオキシ基、ベンズチアジアゾリルオキシ基、フェノチアジニルオキシ基、イソキサゾリルオキシ基、フラザニルオキシ基、フェノキサジニルオキシ基、オキサゾリルオキシ基、イソキサゾイルオキシ基、ベンゾオキサゾリルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、ピラゾロオキサゾリルオキシ基、イミダゾチアゾリルオキシ基、チエノフラニルオキシ基、フロピロリルオキシ基、ピリドオキサジニルオキシ基等があげられ、好ましくはチエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピリジルオキシ基、ピリダジルオキシ基、ピリミジルオキシ基、ピラジルオキシ基である。
本願明細書において用いる「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基」とは、前記のＣ１−６アルキル基に前記の「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基」が置換した基を示す。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」が結合したスルホニル基を意味し、具体的には例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ｎ−プロパンスルホニル基、ｉｓｏ−プロパンスルホニル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリールスルホニル基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」が結合したスルホニル基を意味し、具体的には例えばベンゼンスルホニル基、１−ナフタレンスルホニル基、２−ナフタレンスルホニル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキルスルホニル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、例えば、メチルスルホニルオキシ基、エチルスルホニルオキシ基、ｎ−プロピルスルホニルオキシ基、ｉｓｏ−プロピルスルホニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「置換基を有していても良い」の置換基とは、
（１）ハロゲン原子、
（２）水酸基、
（３）チオール基、
（４）ニトロ基、
（５）ニトロソ基、
（６）シアノ基、
（７）カルボキシル基、
（８）スルホニルオキシ基、
（９）アミノ基、
（１０）Ｃ１−２２アルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等）、
（１１）不飽和Ｃ２−２２アルキル基
（例えば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基等）、
（１２）Ｃ６−１４アリール基
（例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等）、
（１３）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基
（例えば、チエニル基、フリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基等）、
（１４）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環
（例えば、アジリジニル基、アゼチジル基、ピロリジニル基、ピロリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリジニル基、モルホリニル基、イミダゾリニル基、オキサゾリニル基、キヌクリジル基等）
（１５）Ｃ１−２２アルコキシ基
（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｓｅｃ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等）、
（１６）Ｃ６−１４アリールオキシ基
（例えば、フェノキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基等）、
（１７）Ｃ７−２２アラルキルオキシ基
（例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、３−フェニルプロピルオキシ基、４−フェニルブチルオキシ基、１−ナフチルメチルオキシ基、２−ナフチルメチルオキシ基等）
（１８）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基
（例えば、チエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピリジニルオキシ基、ピリダジニルオキシ基、ピリミジニルオキシ基、ピラジニルオキシ基等）、
（１９）Ｃ２−２３アルカノイル基
（例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバリル基、カプロイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基等）、
（２０）Ｃ７−１５アロイル基
（例えば、ベンゾイル基、１−ナフトイル基、２−ナフトイル基等）、
（２１）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基
（例えば、アクリロイル基、プロピオロイル基、クロトノイル基、ｉｓｏ−クロトノイル基、オレロイル基、リノレイル基等）、
（２２）Ｃ２−２３アルカノイルオキシ基
（例えば、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、アクリルオキシ基等）、
（２３）Ｃ２−２２アルコキシカルボニル基
（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉｓｏ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉｓｏ−ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等）
（２４）不飽和Ｃ３−２２アルコキシカルボニル基
（ビニロキシカルボニル基、アリロキシカルボニル基、１−プロペニルオキシカルボニル基、イソプロペニルオキシカルボニル基、プロパルギルオキシカルボニル基、２−ブチニルオキシカルボニル基）、
（２５）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基
（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ｎ−プロパンスルホニル基、ｉｓｏ−プロパンスルホニル基等）、
（２６）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
（例えば、ベンゼンスルホニル基、１−ナフタレンスルホニル基、２−ナフタレンスルホニル基等）および
（２７）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基
（例えば、メタンスルホニルオキシ基、エタンスルホニルオキシ基、ｎ−プロパンスルホニルオキシ基、ｉｓｏ−プロパンスルホニルオキシ基等）
からなる群から選ばれる基が挙げられる。
【実施例】
参考例１（原料であるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの製造）
ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２）の斜面培養（ＩＳＰ−２培地）から１白金耳を５０ｍｌの種母培地［グルコース２％、エスサンミート（味の素（株）製）１％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製）０．５％、塩化ナトリウム０．２５％、炭酸カルシウム０．３２％、殺菌前ｐＨ６．８］を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で２日間培養して第一段種母培養液を得た。この培養液０．１ｍｌを同じ種母培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で１日間培養して第二段種母培養液を得た。このようにして得た第二段種母培養液８００ｍｌを生産培地［可溶性澱粉５％、ファルマメディア０．８％、グルテンミール０．８％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．１％、殺菌前ｐＨ６．８］１００Ｌを入れた２００Ｌタンクに接種し、培養温度２８℃で攪拌数９０ｒｐｍ、通気量１．０ｖｖｍ、内圧２０ｋＰａの条件で５日間通気攪拌培養を行って培養液を得た。
このようにして得た培養液の一部（１０Ｌ）を１０Ｌの１−ブタノールにて抽出後、ブタノール層を減圧乾固し、１００ｇの粗活性画分を得た。この粗活性画分をセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製、１５００ｍｌ）上に添加し、テトラヒドロフラン−メタノール（１：１）の溶媒で溶出した。５４０ｍｌから６６０ｍｌまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固し、残渣（６６０ｍｇ）を得た。さらにこの残渣を酢酸エチルおよびメタノール（９：１；ｖ／ｖ）の混液に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−２００、５０ｇ）に付した。このカラムをｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（１：９；ｖ／ｖ）の混液（２Ｌ）で溶出し、４６８ｍｌから１２６０ｍｌまでに溶出した画分を集め、減圧下で濃縮し、粗活性画分を２５ｍｇ得た。
得られた粗活性画分を下記のＨＰＬＣ分取条件（Ａ）で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し、保持時間３４分に溶出される画分を集め、アセトニトリルを留去後、下記ＨＰＬＣ分取条件（Ｂ）にてその画分をＨＰＬＣによる脱塩を行うことによりマクロライド系化合物１１１０７Ｂ（保持時間：３７分）を６ｍｇ得た。
ＨＰＬＣ分取条件（Ａ）
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ ＳＨ−３４３−５ＡＭ，φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ（ワイエムシー社製）
温度：室温
流速：１０ｍｌ／分
検出：２４０ｎｍ
溶出液：アセトニトリル／０．１５％リン酸二水素カリウム（ｐＨ３．５）（２：８〜８：２，ｖ／ｖ，０〜５０分，リニアグラジェント）
ＨＰＬＣ分取条件（Ｂ）
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ ＳＨ−３４３−５ＡＭ，φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ（ワイエムシー社製）
温度：室温
流速：１０ｍｌ／分
検出：２４０ｎｍ
溶出液：メタノール／水（２：８〜１０：０，ｖ／ｖ，０〜４０分，リニアグラジェント）。
［実施例１］ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４６）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５４４株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄｍ−３Ｒ（配列番号５））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約５００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ１という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ１は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ１を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ１を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ１を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ１を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ１は電気泳動で約５００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には５２８ｂｐであることが明らかとなった（配列番号１の塩基１７７５〜塩基２３０２参照）。クローニングされた前記の５２８ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ１がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ１の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５４４株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５４４株染色体ＤＮＡ（（１）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中において制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列から、プライマー（６ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号６）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（６ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３５回繰り返した。
この結果、約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ１）と約２．８ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ１）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ１（約３．５ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ１（約２．８ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１配列から、配列番号１に示された３７９３ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この３７９３ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号１の塩基１３２２〜塩基２５４８にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＡという）が存在した。そしてｐｓｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列と、ストレプトミセス・リビダンスのチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ４）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７２．６％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６９．４％）。このことからｐｓｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｐｓｍＡのすぐ下流（配列番号１の塩基２５６４〜塩基２７６１）には３Ｆ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＢという）が存在した。ｐｓｍＢがコードするタンパク質は６６個のアミノ酸からなり、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（８３．３％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのフェレドキシンｓｏｙ（ｓｏｙＢ）にも比較的高い相同性を有した（相同性５７．６％）。そのため、ｐｓｍＢは電子伝達を担い、ｐｓｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
［実施例２］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ａ−１５４４株由来のｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例１において解析した配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＮｄｅＦ（配列番号８）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＳｐｅＲ（配列番号９）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＮｄｅＦおよびＤＭ−ＳｐｅＲ）と実施例１（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｄ１という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｄ１をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−ＤＭの構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｄ１を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｄ１の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｄ１と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−ＤＭと称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭの調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−ＤＭを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−ＤＭで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株を得た。
［実施例３］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ大腸菌形質転換体による下記式で表されるＭＥ−２６５のＭＥ−２８２への変換
（１） 形質転換体反応液の調製
実施例２（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で３時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、８ｍｇ／ｍＬ ＭＥ−２６５を５０μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣでＭＥ−２６５およびＭＥ−２８２量を測定した。測定結果を表３に示す。
また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：４５％アセトニトリル（０〜１５分）
６０％アセトニトリル（１５〜３０分）
４５％アセトニトリル（３０〜４５分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：４５分
保持時間：ＭＥ−２６５ ２４．８分
ＭＥ−２８２ １２．７分
（２） 形質転換体反応液からのＭＥ−２８２の取得
２４時間反応した反応液１．８ｍＬに水４ｍＬを加え、酢酸エチル８ｍＬで１回、４ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を除去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ ０．２５ｍｍ展開液；ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）により精製し、ＭＥ−２８２を０．２ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．２１−１．２６（１Ｈ，ｍ），１．２９−１．３７（３Ｈ，ｍ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．４４−１．５２（２Ｈ，ｍ），１．６０−１．６４（１Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１３．９Ｈｚ），１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１３．９Ｈｚ），１．８９−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．００（３Ｈ，ｓ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．９Ｈｚ），２．５０−２．６０（１Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，１３．９Ｈｚ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，７．７Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，６．２Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ），３．７５−３．８０（１Ｈ，ｍ），４．９０（１Ｈ，ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｄ２Ｏ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．０Ｈｚ）。
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではＭＥ−２８２とみられるピークは得られなかったのに対して、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株では、ＭＥ−２６５をほとんど消費してＭＥ−２８２とみられるピークが得られた。このことより、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢがＭＥ−２６５からＭＥ−２８２への変換に関与していることを示唆している。
［実施例４］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化合物１１１０７Ｂのマクロライド系化合物１１１０７Ｄへの変換
（１） 形質転換体反応液の調製
実施例３と同様にマクロライド系化合物１１１０７Ｂを基質とした試験を行った。実施例２（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３０℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で５時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、２５℃で２０時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを５０μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣでマクロライド系化合物１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表４に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：３５％ アセトニトリル（０〜１０分）
３５％〜６５％ アセトニトリル（１０〜１２分）
６５％ アセトニトリル（１２〜１５分）
３５％アセトニトリル（１５〜２０分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２０分
保持時間：１１１０７Ｂ １４．３分
１１１０７Ｄ ７．９分
（２） 形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７Ｄの取得
２４時間反応した反応液１．８ｍＬに水４ｍＬを加え、酢酸エチル８ｍＬで１回、４ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を除去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ ０．２５ｍｍ展開液；酢酸エチル）により精製し、１１１０７Ｄを０．１ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．１８（３Ｈ，ｓ），１．１８−１．６９（８Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８２−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．４９−２．６０（３Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．２Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．４，５．７Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．８，８．３Ｈｚ），３．７３−３．８２（１Ｈ，ｍ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），６．３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１５．２Ｈｚ）。
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではマクロライド系化合物１１１０７Ｄとみられるピークは得られなかったのに対して、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株では、マクロライド系化合物１１１０７Ｄとみられるピークが得られた。このことより、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢがマクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例５］Ａ−１５４４セルフクローニング株での変換試験
（１） Ａ−１５４４株由来のｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製（セルフクローニング用）
実施例１において解析した配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＦ（配列番号１０）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＲ（配列番号１１）を設計し作成した。
次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＢｇｌＦおよびＤＭ−ＢｇｌＲ）と実施例１（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを６３℃、３０秒間、伸長を６８℃、４分間行う３段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｅ１という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液を、アガロースゲル電気泳動にかけて分画した。上記の約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片−Ｅ１をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ ０１（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＩＪＤＭＧの構築
ｐＩＪ７０２をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＢｇｌＩＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｅ１を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｅ１の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅ１と、プラスミドｐＩＪ７０２とが連結された約８．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＩＪＤＭＧと称する）が構築された。
（３）セルフクローニング株Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株の調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＩＪＤＭＧを用い、Ａ−１５４４株を、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５に記載された方法に従い形質転換した。こうして、プラスミドｐＩＪＤＭＧで形質転換されたＡ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を得た。
［実施例６］セルフクローニング株による１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換
実施例５（３）で得た形質転換体Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株、Ａ−１５４４／ｐＩＪ７０２株、および元のＡ−１５４４株の凍結種母を、チオストレプトン２５μｇ／ｍＬを含むＳＭＮ培地（スタビローズ２％、グルコース２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％ ｐＨ７．４）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で４８時間振とう培養した（種母培養、但し、Ａ−１５４４株にはチオストレプトンを加えない）。得られた種母培養液の０．５ｍＬをチオストレプトン２５μｇ／ｍＬを含むＳＭＮ培地５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で７２時間振とう培養した（但し、Ａ−１５４４株にはチオストレプトンを加えない）。得られた培養液２ｍＬを分注し、これに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１００μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを５０μＬ添加した。こうして得られた変換培養液を２８℃、１２時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣで１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄ量を測定した。測定結果を表５に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：３５％アセトニトリル（０〜１０分）
３５％〜６５％アセトニトリル（１０〜１２分）
６５％アセトニトリル（１２〜１５分）
３５％アセトニトリル（１５〜２０分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２０分
保持時間：１１１０７Ｂ １４．３分
１１１０７Ｄ ７．９分
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むプラスミドが形質転換されたＡ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株は、元のＡ−１５４４株に比べ、１２時間の反応で約２．７倍の変換活性を示した。このことは、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢのセルフクローニングが、マクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に貢献できることを示唆している。
［実施例７］ストレプトミセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） ストレプトミセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＭｅｒ−１１１０７株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄ−１Ｒ（配列番号１２））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）と前項（１）で得たＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約３００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ２という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ２は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ２を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ２を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ２を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ２を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ２は電気泳動で約３００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には３２５ｂｐであることが明らかとなった（配列番号２の塩基８３７〜塩基１１６１参照）。クローニングされた前記の３２５ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ２がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ２の周辺領域の解析
前記のとおり、Ｍｅｒ−１１１０７株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ｍｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡ（（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＫＣｌ）中で制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列から、プライマー（７ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号１３）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（７ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応３５回繰り返した。
この結果、約１．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ２）と約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ２）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ２（約１．３ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ２（約１．４ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２配列から、配列番号２に示された２３２９ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この２３２９ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号２の塩基４２０〜塩基１６０４にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する３９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＡという）が存在した。そしてｂｐｍＡは、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性６７．４％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６４．８％）。このことからｂｐｍＡがチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする可能性が高いと考えられた。
またｂｐｍＡのすぐ下流（配列番号２の塩基１６４３〜塩基１８３４）には３Ｆｅ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＢという）が存在した。ｂｐｍＢがコードするタンパク質は６４個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８１．０％）、さらにストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも比較的高い相同性を有した（７６．２％）。そのため、ｂｐｍＢは電子伝達を担い、ｂｐｍＡと共に水酸化を行うものと考えられた。
［実施例８］ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ｍｅｒ−１１１０７株由来のｂｐｍＡおよびｂｐｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例７において解析した配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマー０７−ＮｄｅＦ（配列番号１４）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマー０７−ＳｐｅＲ（配列番号１５）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（０７−ＮｄｅＦおよび０７−ＳｐｅＲ）と実施例７（１）で得たＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｄ２という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｄ２をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７の構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｄ２を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｄ２の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｄ２と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７と称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７の調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−Ｄ０７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株を得た。
［実施例９］ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢをもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの１１１０７Ｄへの変換
実施例８（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で４時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で５時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬマクロライド系化合物１１１０７Ｂを１２．５μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液４００μＬをメタノール６００μＬで抽出し、ＨＰＬＣでマクロライド系化合物１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表６に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％ メタノール（０〜５分）
５５％ メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％ メタノール（１３〜１７分）
７０％ メタノール（１７〜２１分）
４５％ メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：１１１０７Ｂ １２．２分
１１１０７Ｄ ４．２分
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではマクロライド系化合物１１１０７Ｄのピークは得られなかったのに対して、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株では、マクロライド系化合物１１１０７Ｄのピークが得られた。このことより、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢがマクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例１０］Ａ−１５６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０２）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） Ａ−１５６０株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５６０株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄｍ−２Ｒ（配列番号１６））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約７５０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ３という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ３は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ３を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ３を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ３を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ３を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ３は電気泳動で約７５０ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には７４１ｂｐであることが明らかとなった（配列番号３の塩基６１６〜塩基１３５６参照）。クローニングされた前記の７４１ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ３がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ３の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５６０株由来の水酸化活性を有するクンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５６０株染色体ＤＮＡ（（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＫＣｌ）中において制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール）中において制限酵素ＫｐｎＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中において制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列から、プライマー（５ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号１７）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（５ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応３５回繰り返した。
この結果、約４．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ３）と約３．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ３と約１．７ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ３）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ３（約４．５ｋｂｐのサイズ）、ＤＮＡ断片−Ｃ３（約３．０ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｄ３（約１．７ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の配列の中から、配列番号３に示された１８６０ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この１８６０ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号３の塩基１７２〜塩基１３８３にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＡという）が存在した。そしてｔｐｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７７．４％）、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列にも高い相同性を有した（相同性７６．６％）。このことからｔｐｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｔｐｍＡのすぐ下流（配列番号３の塩基１３９９〜塩基１５９３）には３Ｆｅ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＢという）が存在した。ｔｐｍＢがコードするタンパク質は６５個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８１．０％）、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも高い相同性を有した（８２．５％）。そのため、ｔｐｍＢは電子伝達を担い、ｔｐｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
［実施例１１］ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ａ−１５６０株由来のｔｐｍＡおよびｔｐｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例１０において解析した配列番号３の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｔｐｍ−ＮｄｅＦ（配列番号１８）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーｔｐｍ−ＳｐｅＲ（配列番号１９）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ｔｐｍ−ＮｄｅＦおよびｔｐｍ−ＳｐｅＲ）と実施例１０（１）で得たＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｅ３という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｅ３をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢの構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｅ３を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｅ３の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅ３と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢと称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢの調製
実施例１１（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株を得た。
［実施例１２］ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢをもつ大腸菌形質転換体による１１１０７Ｂの１１１０７Ｄへの変換
前項（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で４時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で５時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを１２．５μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液４００μＬをメタノール６００μＬで抽出し、ＨＰＬＣで１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表７に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−３（φ４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％ メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％ メタノール（１３〜１７分）
７０％ メタノール（１７〜２１分）
４５％ メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：１１１０７Ｂ １２．２分
１１１０７Ｄ ４．２分
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株では１１１０７Ｄのピークは得られなかったのに対して、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株では、１１１０７Ｄのピークが得られた。このことより、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢが１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例１３］セルフクローニング株による下記式で表わされる１１１０７Ｈの１１１０７ＣＢへの変換
（１）形質転換体反応液の調製
スタビローズ２．０％、グルコース２．０％、大豆粉（豊年ソイプロ）２．０％、酵母エキス０．５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％からなるｐＨ７．４の培地を調製し、２５０ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの培地を入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。この培地にチオストレプトンを終濃度２５ｍｇ／Ｌになるように添加した後、Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を凍結種母より１％接種し２８℃、２２０ｒｐｍで３日間、種母培養を行った。この種母培養液を同様の組成の培地に１％添加し、２８℃、２２０ｒｐｍで２日間、本培養を行った。本培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌し、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液２０ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に基質１１１０７Ｈ（１００ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液）を終濃度２０００ｍｇ／Ｌになるように添加し２８℃、２２０ｒｐｍで１６時間変換反応を行った。
（２）形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７ＣＢの取得
同様の操作を行った変換反応液（フラスコ６本分）から遠心分離により菌体を分離し、遠心上清を等量の酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４’ ０．５ｍｍ 展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製し、１１１０７ＣＥを１１９．５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５７３（Ｍ＋Ｎａ）＋
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．２０（１Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．５５−１．４０（２Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，１４．０Ｈｚ），１．７５（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．０Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．６８−２．４０（４Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｍ），３．５１（１Ｈ，ｍ），４．５１（１Ｈ，ｍ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，１５．２Ｈｚ），５．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，１５．２Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，１５．５Ｈｚ），５．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１５．５Ｈｚ），５．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），６．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．３Ｈｚ）
［実施例１４］セルフクローニング株による下記式で表わされる１１１０７Ｌの１１１０７ＣＧへの変換
（１）形質転換体反応液の調製
スタビローズ２．０％、グルコース２．０％、大豆粉（豊年ソイプロ）２．０％、酵母エキス０．５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％からなるｐＨ７．４の培地を調製し、２５０ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの培地を入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。この培地にチオストレプトンを終濃度２５ｍｇ／Ｌになるように添加した後、Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を凍結種母より１％接種し２８℃、２２０ｒｐｍで３日間、種母培養を行った。この種母培養液を同様の組成の培地に１％添加し、２８℃、２２０ｒｐｍで２日間、本培養を行った。本培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌し、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液２０ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に基質１１１０７Ｌ（１００ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液）を終濃度１６００ｍｇ／Ｌになるように添加し２８℃、２２０ｒｐｍで１６時間変換反応を行った。
（２）形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７ＣＧの取得
この変換反応液から遠心分離により菌体を分離し、遠心上清を等量の酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４’ ０．２５ｍｍ 展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製し、１１１０７ＣＧを２５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ６３３（Ｍ＋Ｎａ）＋
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１８（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．２０（１Ｈ，ｍ），１．３４，（３Ｈ，ｓ），１．５６−１．４０（２Ｈ，ｍ），１．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１４．０Ｈｚ），１．７９−．１６９（２Ｈ，ｍ），１．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．０Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ），２．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１５．２Ｈｚ），２．６４−２．５５（１Ｈ，ｍ），２．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，７．９Ｈｚ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，１５．２Ｈｚ），２．９０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，５．６Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，８．８Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｍ），４．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１１．３Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．９，１５．２Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，１５．２Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），６．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．３Ｈｚ）
【産業上の利用可能性】
本発明のＤＮＡを担持するプラスミドで形質転換した形質転換体を用いることにより、優れた抗腫瘍活性を有し、水溶液中での安定性にも優れた１６位に水酸基を有する１２員環マクロライド化合物を効率よく生産することができる。
【技術分野】
本発明はマクロライド系化合物の水酸化に関与するＤＮＡ、その単離方法、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体およびその形質転換体を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法に関する。
従来技術
式（ＩＩ）
で表される１２員環マクロライド系化合物１１１０７Ｄは、優れた抗腫瘍活性を有する１２員環マクロライド系化合物であり、式（Ｉ）
で表される１２員環マクロライド系化合物１１１０７Ｂとともにストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の培養物より見出されている（ＷＯ ０２／０６０８９０）。マクロライド系化合物１１１０７Ｄは、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化体に相当するが、その生産性はマクロライド系化合物１１１０７Ｂの生産性よりも低く、効率的な製造方法の確立が望まれていた。
【発明の開示】
本発明の課題は、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの水酸化に関与するＤＮＡを見出し、マクロライド系化合物１１１０７Ｄの新規な生産方法を提供することにある。
本発明は、以下の［１］〜［１５］に関する。
［１］：式（Ｉ）
で示されるマクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｂという）の、
式（ＩＩ）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｄという）への生物学的変換に関与するＤＮＡであって、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを一部にもしくは全体としてコードするＤＮＡまたはその改変体を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
［２］：下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示される［１］記載のＤＮＡ。
（ａ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｂ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ａ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ａ）または（ｂ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［３］：［２］記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
［４］：［２］のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［５］：［４］の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
［６］：［２］に記載されたＤＮＡまたはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
［７］：下記の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）で示される［１］記載のＤＮＡ。
（ｄ） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｅ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ） フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ｄ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ｄ）または（ｅ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］：［７］記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
［９］：［７］記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
［１０］：［９］記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
［１１］：［７］に記載されたＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
［１２］：［５］または［１０］記載の形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、式（ＩＩＩ）
〔式中、
Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは同一または異なって、
（１）水素原子、
（２）置換基を有していても良いＣ１−２２アルキル基、
（３）−ＯＲ（式中、Ｒは
１）水素原子、
置換基を有していても良い、
２）Ｃ１−２２アルキル基、
３）Ｃ７−２２アラルキル基、
４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基、
５）Ｃ２−２２アルカノイル基、
６）Ｃ７−１５アロイル基、
７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基、
８）−ＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは置換基を有していても良い、
８−１）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
８−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
８−３）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基、
８−４）Ｃ６−１４アリールオキシ基、
８−５）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
もしくは
８−６）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を表す）、
９）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基、
１０）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
または
１１）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は同一または異なって、Ｃ１−６アルキル基またはＣ６−１４アリール基を表す）を表す）、
（４）ハロゲン原子
または
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２
｛式中、ＲＭは単結合または−Ｏ−ＣＯ−を表す；
ＲＮ１およびＲＮ２は
１）同一または異なって、
１−１）水素原子もしくは
１−２）置換基を有していても良い、
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル基、
（ｉｉ）不飽和Ｃ２−２２アルキル基、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アルカノイル基
（ｉｖ）Ｃ７−１５アロイル基、
（ｖ）不飽和Ｃ３−２３アルカノイル基、
（ｖｉ）Ｃ６−１４アリール基、
（ｖｉｉ）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
（ｖｉｉｉ）Ｃ７−２２アラルキル基、
（ｉｘ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基もしくは
（ｘ）Ｃ６−１４アリールスルホニル基を表すか、
または
２）ＲＮ１およびＲＮ２は結合する窒素原子と一緒になって置換基を有していても良い３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を形成する｝を表す；
ただし、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは一緒になって、（ｉ）ケトン構造（＝Ｏ）または（ｉｉ）オキシム構造｛＝ＮＯＲｏｘ（式中、Ｒｏｘは置換基を有していても良い、Ｃ１−２２アルキル基、不飽和Ｃ２−２２アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、５員環ないし１４員環ヘテロアリール基またはＣ７−２２アラルキル基を表す）｝を形成しても良い；
Ｒ１６ａは水素原子を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素原子または
（２）
（式中、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂおよびＲ２２ｃは同一または異なって、
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）−ＯＲ（式中、Ｒは前記の意味を有する）、
４）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）または
５）ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａおよびＲ２２ｂのどちらか一方とが一緒になって部分構造
を形成しても良い；
Ｇｍは
（１）式（ＧＭ−Ｉ）で示される基
｛式中、
Ｒ２およびＲ１０は同一または異なって、水素原子またはＣ１−２２アルキル基を表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは同一または異なって、
１）水素原子、
２）ヒドロキシ基、
３）置換基を有していても良い、
３−１）Ｃ１−２２アルキル基、
３−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
３−３）Ｃ６−１４アリールオキシ基
３−４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
３−５）Ｃ２−２２アルカノイルオキシ基、
３−６）Ｃ７−１５アロイルオキシ基
３−７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイルオキシ基、
３−８）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは前記の意味を有する）、
３−９）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基、
３−１０）Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基
もしくは
３−１１）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は前記の意味を有する）、
４）ハロゲン原子
または
５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）を表す；
あるいは、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは一緒になってケトン構造（＝Ｏ）を形成しても良い；
あるいは、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは一緒になって、スピロオキシラニル基またはエキソメチレン基を形成しても良い；あるいは、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは同一または異なって、水素原子または−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素原子、Ｃ１−２２アルキル基またはＣ２−２２アルカノイル基を表す）を表す｝、
（２）式（ＧＭ−ＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（３）式（ＧＭ−ＩＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（４）式（ＧＭ−ＩＶ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）
または
（５）式（ＧＭ−Ｖ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）を表す〕
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、式（ＩＶ）
（式中、Ｗ、Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２１ｃおよびＧｍは式（ＩＩＩ）の定義と同義を表す）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、こうして変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法。
［１３］：形質転換体が、［５］記載の形質転換体であり、かつフェレドキシンをコードするＤＮＡを有する形質転換体である［１２］記載の生産方法。
［１４］：式（ＩＩＩ−ａ）
（式中、
Ｒ５’は水素原子またはアセトキシ基、Ｒ６’は水素原子またはヒドロキシ基、Ｒ７’は水素原子またはアセチル基を表す）で示される化合物を、式（ＩＶ−ａ）
（式中、
Ｗ’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は式（ＩＩＩ−ａ）の定義と同義である）で示される化合物に変換することを特徴とする［１２］記載の生産方法。
［１５］：式（ＩＩＩ−ａ）の化合物の、式（ＩＶ−ａ）の化合物への変換において、
（１）
Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（２）
Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（３）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（４）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（５）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（６）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（７）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（８）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（９）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（１０）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（１１）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’が水素原子である化合物および
（１２）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物からなる群から選択される化合物を対象とする［１４］記載の生産方法。
［１６］：［５］または［１０］記載の形質転換体を、１６位水酸化マクロライド系化合物の生産に用いる用途。
本発明により、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンをコードするＤＮＡを単離して、その塩基配列を決定することができ、更に、そのＤＮＡを担持するプラスミド、そのプラスミドで形質転換した形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて、１６位水酸化マクロライド系化合物を効率よく生産することができた。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物
本発明においては、マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物を培養した培養液から集めた菌体から、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質またはフェレドキシンを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することができる。そして、このＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミドを構築し、そのプラスミドを用いて形質転換体を調製する。
このようにして調製した形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物を接触させることにより、式（ＩＶ）で表される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することにより、１６位水酸化マクロライド系化合物を得ることができる。
マクロライド系化合物１１１０７Ｂからマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する能力を有する微生物としては、このような能力を有するものであれば、種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として、いずれも土壌から分離されたストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７、Ａ−１５４４株や、未同定の放線菌Ａ−１５６０株を挙げることができる。
尚、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｍｅｒ−１１１０７は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８１４４として平成１２年１２月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成１３年１１月２７日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２に移管された。Ａ−１５４４株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８９４３として平成１４年７月２３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、さらに平成１５年７月３０日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４６に移管された。Ａ−１５６０株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９５８５として平成１５年１１月１３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成１６年８月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０２に移管された。
上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。
［Ｍｅｒ−１１１０７株の菌学的性状］
（１） 形態
基生菌糸より螺旋状（Ｓｐｉｒａｌｅｓ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜２０個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは０．７×１．０μｍ位で、胞子の表面は平滑（ｓｍｏｏｔｈ）を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。
（２） 各種培地における生育状態
各種培地上で２８℃、２週間培養後の培養性状を以下に示す。色調の記載はトレズナーのカラー・ホイールズ（ＴｒｅｓｎｅｒのＣｏｌｏｒ ｗｈｅｅｌｓ）の色標名と括弧内に示す符号で表示する。
１）イースト・麦芽寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｌｉｇｈｔ ｇｒａｙ；ｄ）が見られる。培養裏面はＬｉｇｈｔ ｍｅｌｏｎ ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
２）オートミール寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｇ）が見られる。培養裏面はＮｕｄｅ ｔａｎ（４ｇｃ）またはＰｕｔｔｙ（１ １／２ ｅｃ）である。溶解性色素は産生しない。
３）スターチ・無機塩寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色の胞子（Ｇｒａｙ；ｅ）が見られる。培養裏面はＦａｗｎ（４ｉｇ）またはＧｒａｙ（ｇ）である。溶解性色素は産生しない。
４）グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
５）ペプトン・イースト・鉄寒天培地
生育は悪く、その表面に気中菌糸を着生しない。培養裏面はＬｉｇｈｔ ｍｅｌｏｎ ｙｅｌｌｏｗ（３ｅａ）である。溶解性色素は産生しない。
６）チロシン寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子（Ｗｈｉｔｅ；ａ）が見られる。培養裏面はＰｅａｒｌ ｐｉｎｋ（３ｃａ）である。溶解性色素は産生しない。
（３） 各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、２８℃、培養２週間後の生育状況を以下に示す。
１）Ｌ−アラビノース ±
２）Ｄ−キシロース ±
３）Ｄ−グルコース ＋
４）Ｄ−フルクトース ＋
５）シュークロース ＋
６）イノシトール ＋
７）Ｌ−ラムノース −
８）Ｄ−マンニトール ＋
９）ラフィノース ＋
（＋は同化する、±は多少同化する、−は殆ど同化しない。）
（４） 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
（ａ）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：１２℃〜３７℃
（ｂ）最適温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：２１℃〜３３℃
（ｃ）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陰性
（ｄ）ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陰性
（ｅ）ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陰性
（ｆ）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陽性
（ｇ）メラニン様色素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
（チロシン培地）：陰性
（ｈ）硫化水素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陰性
（ｉ）硝酸塩の還元（０．１％硝酸カリ含有ブロス）：陰性
（ｊ）食塩の耐性（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：食塩含有量４％以下で生育
（５） 菌体成分
本菌の細胞壁からＬＬ−ジアミノピメリン酸及びグリシンが検出された。
［Ａ−１５４４株の菌学的性状］
（１） 形態
基生菌糸より螺旋状（Ｓｐｉｒａ ｔｙｐｅ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜２０個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子の大きさは１．０×１．２〜１．４μｍ位で、胞子の表面はトゲ状（ｓｐｉｎｙ）を示し、胞子のう、菌核、鞭毛などの特殊な器官は認められない。
（２） 各種培地における生育状態
各種培地上で２８℃、約２週間培養後の培養性状を表１に示す。色調の記載はトレズナーのカラー・ホイールズ（ＴｒｅｓｎｅｒのＣｏｌｏｒ ｗｈｅｅｌｓ）の色標名と括弧内に示す符号で表示する。
（３） 各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、２８℃、培養２週間後の生育状況を表２に示す。
（４） 生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
（ａ）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：１５℃〜４１℃
（ｂ）生育至適温度（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：２０℃〜３７℃
（ｃ）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陽性
（ｄ）ミルクの凝固（スキムミルク培地）：陽性
（ｅ）ミルクのペプトン化（スキムミルク培地）：陽性
（ｆ）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陽性
（ｇ）メラニン様色素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陽性
（チロシン培地）：陰性
（ｈ）硫化水素の産生（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）：陽性
（ｉ）硝酸塩の還元（０．１％硝酸カリウム含有ブロス）：陰性
（ｊ）食塩の耐性（イースト・麦芽寒天培地、２週間培養）：食塩含有量７％以下で生育
（５） 菌体成分
本菌の細胞壁からＬＬ型のジアミノピメリン酸が検出された。
本発明のＤＮＡ
本発明者らは、上記微生物からマクロライド系化合物の１６位水酸化に関与するＤＮＡ、すなわち１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定した。以下、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを総称して、「１６位水酸化酵素関連ＤＮＡ」ということもある。
本発明の１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、下記（１−１）、（１−２）または（１−３）で示されるものである。
（１−１） 配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（１−２） 前記（１−１）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ）前記（１−１）で示されるいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、
（ｉｉ）マクロライド系化合物の１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１−３） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（１−１）に示されるいずれのＤＮＡともストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（１−１）または（１−２）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、「１６位水酸化酵素活性」とは、前記式（Ｉ）で示されるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位を水酸化し、前記式（ＩＩ）で示されるマクロライド系化合物１１１０７Ｄへ変換する酵素活性を意味する。
また本発明のフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、下記（２−１）、（２−２）または（２−３）で示されるものである。
（２−１） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（２−２） 前記（２−１）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ）前記（２−１）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２−３） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（２−１）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（２−１）または（２−２）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、「フェレドキシン機能」とは、前記１６位水酸化酵素へ電子を伝達し、前記１６位水酸化酵素とともに水酸化反応を担うタンパク質機能を意味する。
また前記ＤＮＡの説明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、前記（１−１）または（２−１）のいずれかのＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて放線菌に属する微生物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡを単離することができる。ＤＮＡライブラリーは、前記の１６位水酸化酵素活性を発現している微生物から常法により作製することができる。
またＰＣＲ法により本発明の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡを取得することもできる。上記した微生物由来のＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載したいずれかの塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、適当な宿主中で増幅可能なベクター中にクローニングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、ＤＮＡライブラリーの構築、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記に記載した当該タンパク質をコードするＤＮＡを取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトミセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法またはその他の公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法は以下のように行うことができる。外来遺伝子が挿入されたプラスミドをコンピテント細胞の懸濁液に加え、この懸濁液をエレクトロポレーション法専用のキュベットに入れ、そのキュベットに高電圧の電気パルスをかける。その後選択培地で培養し、平板寒天培地上で形質転換体を単離する。
酵母細胞の例としては、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法
本発明は、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡまたはフェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を用い、この形質転換体の存在下で前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物を水酸化させることを含む、前記式（ＩＶ）で表される１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法を包含する。
本発明の形質転換体で水酸化できるマクロライド系化合物は、前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物（前記式（ＩＶ）で表されるマクロライド系化合物）であり、好ましくは、前記式（ＩＩＩ−ａ）で表されるマクロライド系化合物（前記式（ＩＶ−ａ）で表されるマクロライド系化合物）であり、さらに好ましくはマクロライド系化合物１１１０７Ｂ（マクロライド系化合物１１１０７Ｄ）である。なお、括弧内は水酸化生成物である１６位水酸化マクロライド系化合物である。
形質転換体の存在下でマクロライド系化合物を水酸化させる条件は、以下の通りである。
まず形質転換体中の１６位水酸化酵素関連ＤＮＡを必要により誘導物質を添加し菌体内で発現させる。これらのＤＮＡが発現した菌体を基質である前記式（ＩＩＩ）で表されるマクロライド系化合物と接触させ、変換反応をさせる。変換反応の温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また反応時間も、１６位水酸化マクロライド系化合物への変換率（反応の進行度合い）等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、２０〜３１℃で、１〜５日が好適である。さらに、反応様式は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。
生成した１６位水酸化マクロライド系化合物の単離及び精製は、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、ダイヤイオンＨＰ−２０などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、目的の１６位水酸化マクロライド系化合物を単離精製することができる。
尚、本発明において、ＤＮＡの改変体とは、構成塩基の削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あるいはその誘導体を意味し、もとのものと同じ効果を発現するＤＮＡを意味する。
また、本願明細書において用いる「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキル基」とは、炭素数が１ないし２２個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等があげられ、好ましくは炭素数が１ないし６個の直鎖または分枝状アルキル基を示し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等である。
本願明細書において用いる「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」とは、炭素数２ないし２２個の直鎖または分枝状アルケニル基、あるいは炭素数が２ないし２２個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、１，３−ヘキサンジエニル基、１，５−ヘキサンジエニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−エチニル−２−プロピニル基、２−メチル−２−プロピニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基、１，３−ヘキサンジインイル基、１，５−ヘキサンジインイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし１０個の直鎖または分枝状アルケニル基、あるいは炭素数が２ないし１０個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、例えばビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリール基」とは、６ないし１４個の炭素原子で構成された芳香族炭化水素環式基を意味し、例えば単環式基、二環式基、三環式基等の縮合環も含まれる。例えばフェニル基、インデニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、インダセニル基、アセナフチル基、フルオレニル基、フェナレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基等があげられ、好ましくはフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等である。
本願明細書における「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」とは、窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を１個以上含んでなる単環式、二環式または三環式の５ないし１４員芳香族複素環式基等をいう。好適な例をあげると、含窒素芳香族複素環式基としては、例えばピロリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンツイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、プリニル基、インダゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、キノリジニル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、イミダゾトリアジニル基、ピラジノピリダジニル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、カルバゾリル基、カルバゾリニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基、フェナシニル基、イミダゾピリジニル基、イミダゾピリミジニル基、ピラゾロピリジニル基、ピラゾロピリジニル基等；含硫黄芳香族複素環式基としては、例えばチエニル基、ベンゾチエニル基等；含酸素芳香族複素環式基としては、例えばフリル基、ピラニル基、シクロペンタピラニル基、ベンゾフリル基、イソベンゾフリル基等；２個以上の異種複素原子を含んでなる芳香族複素環式基としては、例えばチアゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズチアジアゾリル基、フェノチアジニル基、イソキサゾリル基、フラザニル基、フェノキサジニル基、オキサゾリル基、イソキサゾイル基、ベンゾオキサゾリル基、オキサジアゾリル基、ピラゾロオキサゾリル基、イミダゾチアゾリル基、チエノフラニル基、フロピロリル基、ピリドオキサジニル基等があげられ、好ましくはチエニル基、フリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基等である。
本願明細書において用いる「３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環」とは、窒素原子を１個以上含む単環式、二環式または三環式の３ないし１４員環非芳香族複素環をいう。好適な例をあげると、例えばアジリジニル基、アゼチジル基、ピロリジニル基、ピロリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ホモピペリジニル基、ホモピペラジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、イミダゾリニル基、オキサゾリニル基、キヌクリジニル基等があげられる。また、当該含窒素非芳香族複素環には、ピリドン環から誘導される基や、非芳香族性の縮合環（例えばフタルイミド環、スクシンイミド環等から誘導される基）も含まれる。
本願明細書において用いる「Ｃ２−２２アルカノイル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、その末端がカルボニル基である基を意味し、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバリル基、カプロイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし６個のアルカノイル基であり、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ７−１５アロイル基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」、「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」において、その末端にカルボニル基が結合した基を意味し、例えばベンゾイル基、１−ナフトイル基、２−ナフトイル基、ピコリノイル基、ニコチノイル基、イソニコチノイル基、フロイル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基」とは、前記定義の「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」において、その末端にカルボニル基が結合した基を意味し、例えばアクリロイル基、プロピオロイル基、クロトノイル基、ｉｓｏ−クロトノイル基、オレロイル基、リノレノイル基等があげられ、好ましくは炭素数２ないし６個の不飽和アルカノイル基であり、例えばアクリロイル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ７−２２アラルキル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、置換可能な部分が前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」で置換される７ないし２２個の炭素原子で構成された基を意味し、具体的には例えばベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基等があげられ、好ましくは炭素数７ないし１０個のアラルキル基であり、例えばベンジル基、フェネチル基等である。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルコキシ基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、好適な基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉｓｏ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｉｓｏ−ヘキシルオキシ基、１，１−ジメチルプロポキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、２，２−ジメチルプロポキシ基、２−エチルプロポキシ基、１−エチル−２−メチルプロポキシ基、１，１，２−トリメチルプロポキシ基、１，２，２−トリメチルプロポキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基」とは、前記定義の「不飽和Ｃ２−２２アルキル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、好適な基としては例えばビニロキシ基、アリロキシ基、１−プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、２−メチル−１−プロペニルオキシ基、２−メチル−２−プロペニルオキシ基、１−ブテニルオキシ基、２−ブテニルオキシ基、３−ブテニルオキシ基、１−ペンテニルオキシ基、１−ヘキセニルオキシ基、１，３−ヘキサンジエニルオキシ基、１，５−ヘキサンジエニルオキシ基、プロパルギルオキシ基、２−ブチニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリールオキシ基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には例えばフェノキシ基、インデニルオキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基、アズレニルオキシ基、ヘプタレニルオキシ基、インダセニルオキシ基、アセナフチルオキシ基、フルオレニルオキシ基、フェナレニルオキシ基、フェナントレニルオキシ基、アントラセニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基」とは、前記定義の「５員環ないし１４員環ヘテロアリール基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、具体的には例えばピロリルオキシ基、ピリジニルオキシ基、ピリダジニルオキシ基、ピリミジニルオキシ基、ピラジニルオキシ基、トリアゾリルオキシ基、テトラゾリルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ピラゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、ベンツイミダゾリルオキシ基、インドリルオキシ基、イソインドリルオキシ基、インドリジニルオキシ基、プリニルオキシ基、インダゾリルオキシ基、キノリニルオキシ基、イソキノリニルオキシ基、キノリジニルオキシ基、フタラジニルオキシ基、ナフチリジニルオキシ基、キノキサリニルオキシ基、キナゾリニルオキシ基、シンノリニルオキシ基、プテリジニルオキシ基、イミダゾトリアジニルオキシ基、ピラジノピリダジニルオキシ基、アクリジニルオキシ基、フェナントリジニルオキシ基、カルバゾリルオキシ基、カルバゾリニルオキシ基、ペリミジニルオキシ基、フェナントロリニルオキシ基、フェナシニルオキシ基、イミダゾピリジニルオキシ基、イミダゾピリミジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、ピラゾロピリジニルオキシ基、チエニルオキシ基、ベンゾチエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピラニルオキシ基、シクロペンタピラニルオキシ基、ベンゾフリルオキシ基、イソベンゾフリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、イソチアゾリルオキシ基、ベンゾチアゾリルオキシ基、ベンズチアジアゾリルオキシ基、フェノチアジニルオキシ基、イソキサゾリルオキシ基、フラザニルオキシ基、フェノキサジニルオキシ基、オキサゾリルオキシ基、イソキサゾイルオキシ基、ベンゾオキサゾリルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、ピラゾロオキサゾリルオキシ基、イミダゾチアゾリルオキシ基、チエノフラニルオキシ基、フロピロリルオキシ基、ピリドオキサジニルオキシ基等があげられ、好ましくはチエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピリジルオキシ基、ピリダジルオキシ基、ピリミジルオキシ基、ピラジルオキシ基である。
本願明細書において用いる「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基」とは、前記のＣ１−６アルキル基に前記の「５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基」が置換した基を示す。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニル基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキル基」が結合したスルホニル基を意味し、具体的には例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ｎ−プロパンスルホニル基、ｉｓｏ−プロパンスルホニル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ６−１４アリールスルホニル基」とは、前記定義の「Ｃ６−１４アリール基」が結合したスルホニル基を意味し、具体的には例えばベンゼンスルホニル基、１−ナフタレンスルホニル基、２−ナフタレンスルホニル基等があげられる。
本願明細書において用いる「Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基」とは、前記定義の「Ｃ１−２２アルキルスルホニル基」において、その末端に酸素原子が結合した基を意味し、例えば、メチルスルホニルオキシ基、エチルスルホニルオキシ基、ｎ−プロピルスルホニルオキシ基、ｉｓｏ−プロピルスルホニルオキシ基等があげられる。
本願明細書において用いる「置換基を有していても良い」の置換基とは、
（１）ハロゲン原子、
（２）水酸基、
（３）チオール基、
（４）ニトロ基、
（５）ニトロソ基、
（６）シアノ基、
（７）カルボキシル基、
（８）スルホニルオキシ基、
（９）アミノ基、
（１０）Ｃ１−２２アルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等）、
（１１）不飽和Ｃ２−２２アルキル基
（例えば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基等）、
（１２）Ｃ６−１４アリール基
（例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等）、
（１３）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基
（例えば、チエニル基、フリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基等）、
（１４）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環
（例えば、アジリジニル基、アゼチジル基、ピロリジニル基、ピロリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリジニル基、モルホリニル基、イミダゾリニル基、オキサゾリニル基、キヌクリジル基等）
（１５）Ｃ１−２２アルコキシ基
（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｓｅｃ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等）、
（１６）Ｃ６−１４アリールオキシ基
（例えば、フェノキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基等）、
（１７）Ｃ７−２２アラルキルオキシ基
（例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、３−フェニルプロピルオキシ基、４−フェニルブチルオキシ基、１−ナフチルメチルオキシ基、２−ナフチルメチルオキシ基等）
（１８）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基
（例えば、チエニルオキシ基、フリルオキシ基、ピリジニルオキシ基、ピリダジニルオキシ基、ピリミジニルオキシ基、ピラジニルオキシ基等）、
（１９）Ｃ２−２３アルカノイル基
（例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ｉｓｏ−ブチリル基、バレリル基、ｉｓｏ−バレリル基、ピバリル基、カプロイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基等）、
（２０）Ｃ７−１５アロイル基
（例えば、ベンゾイル基、１−ナフトイル基、２−ナフトイル基等）、
（２１）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基
（例えば、アクリロイル基、プロピオロイル基、クロトノイル基、ｉｓｏ−クロトノイル基、オレロイル基、リノレイル基等）、
（２２）Ｃ２−２３アルカノイルオキシ基
（例えば、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、アクリルオキシ基等）、
（２３）Ｃ２−２２アルコキシカルボニル基
（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉｓｏ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉｓｏ−ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等）
（２４）不飽和Ｃ３−２２アルコキシカルボニル基
（ビニロキシカルボニル基、アリロキシカルボニル基、１−プロペニルオキシカルボニル基、イソプロペニルオキシカルボニル基、プロパルギルオキシカルボニル基、２−ブチニルオキシカルボニル基）、
（２５）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基
（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ｎ−プロパンスルホニル基、ｉｓｏ−プロパンスルホニル基等）、
（２６）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
（例えば、ベンゼンスルホニル基、１−ナフタレンスルホニル基、２−ナフタレンスルホニル基等）および
（２７）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基
（例えば、メタンスルホニルオキシ基、エタンスルホニルオキシ基、ｎ−プロパンスルホニルオキシ基、ｉｓｏ−プロパンスルホニルオキシ基等）
からなる群から選ばれる基が挙げられる。
【実施例】
参考例１（原料であるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの製造）
ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２）の斜面培養（ＩＳＰ−２培地）から１白金耳を５０ｍｌの種母培地［グルコース２％、エスサンミート（味の素（株）製）１％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製）０．５％、塩化ナトリウム０．２５％、炭酸カルシウム０．３２％、殺菌前ｐＨ６．８］を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で２日間培養して第一段種母培養液を得た。この培養液０．１ｍｌを同じ種母培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２８℃で１日間培養して第二段種母培養液を得た。このようにして得た第二段種母培養液８００ｍｌを生産培地［可溶性澱粉５％、ファルマメディア０．８％、グルテンミール０．８％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．１％、殺菌前ｐＨ６．８］１００Ｌを入れた２００Ｌタンクに接種し、培養温度２８℃で攪拌数９０ｒｐｍ、通気量１．０ｖｖｍ、内圧２０ｋＰａの条件で５日間通気攪拌培養を行って培養液を得た。
このようにして得た培養液の一部（１０Ｌ）を１０Ｌの１−ブタノールにて抽出後、ブタノール層を減圧乾固し、１００ｇの粗活性画分を得た。この粗活性画分をセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製、１５００ｍｌ）上に添加し、テトラヒドロフラン−メタノール（１：１）の溶媒で溶出した。５４０ｍｌから６６０ｍｌまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固し、残渣（６６０ｍｇ）を得た。さらにこの残渣を酢酸エチルおよびメタノール（９：１；ｖ／ｖ）の混液に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ワコーゲルＣ−２００、５０ｇ）に付した。このカラムをｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（１：９；ｖ／ｖ）の混液（２Ｌ）で溶出し、４６８ｍｌから１２６０ｍｌまでに溶出した画分を集め、減圧下で濃縮し、粗活性画分を２５ｍｇ得た。
得られた粗活性画分を下記のＨＰＬＣ分取条件（Ａ）で分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し、保持時間３４分に溶出される画分を集め、アセトニトリルを留去後、下記ＨＰＬＣ分取条件（Ｂ）にてその画分をＨＰＬＣによる脱塩を行うことによりマクロライド系化合物１１１０７Ｂ（保持時間：３７分）を６ｍｇ得た。
ＨＰＬＣ分取条件（Ａ）
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ ＳＨ−３４３−５ＡＭ，φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ（ワイエムシー社製）
温度：室温
流速：１０ｍｌ／分
検出：２４０ｎｍ
溶出液：アセトニトリル／０．１５％リン酸二水素カリウム（ｐＨ３．５）（２：８〜８：２，ｖ／ｖ，０〜５０分，リニアグラジェント）
ＨＰＬＣ分取条件（Ｂ）
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ ＳＨ−３４３−５ＡＭ，φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ（ワイエムシー社製）
温度：室温
流速：１０ｍｌ／分
検出：２４０ｎｍ
溶出液：メタノール／水（２：８〜１０：０，ｖ／ｖ，０〜４０分，リニアグラジェント）。
［実施例１］ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４６）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５４４株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄｍ−３Ｒ（配列番号５））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約５００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ１という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ１は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ１を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ１を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ１を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ１を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ１は電気泳動で約５００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には５２８ｂｐであることが明らかとなった（配列番号１の塩基１７７５〜塩基２３０２参照）。クローニングされた前記の５２８ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ１がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ１の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５４４株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５４４株染色体ＤＮＡ（（１）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中において制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列から、プライマー（６ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号６）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（６ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３５回繰り返した。
この結果、約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ１）と約２．８ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ１）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ１（約３．５ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ１（約２．８ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１配列から、配列番号１に示された３７９３ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この３７９３ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号１の塩基１３２２〜塩基２５４８にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＡという）が存在した。そしてｐｓｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列と、ストレプトミセス・リビダンスのチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ４）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７２．６％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６９．４％）。このことからｐｓｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｐｓｍＡのすぐ下流（配列番号１の塩基２５６４〜塩基２７６１）には３Ｆ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＢという）が存在した。ｐｓｍＢがコードするタンパク質は６６個のアミノ酸からなり、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（８３．３％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのフェレドキシンｓｏｙ（ｓｏｙＢ）にも比較的高い相同性を有した（相同性５７．６％）。そのため、ｐｓｍＢは電子伝達を担い、ｐｓｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
［実施例２］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ａ−１５４４株由来のｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例１において解析した配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＮｄｅＦ（配列番号８）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＳｐｅＲ（配列番号９）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＮｄｅＦおよびＤＭ−ＳｐｅＲ）と実施例１（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｄ１という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｄ１をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−ＤＭの構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｄ１を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｄ１の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｄ１と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−ＤＭと称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭの調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−ＤＭを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−ＤＭで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株を得た。
［実施例３］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ大腸菌形質転換体による下記式で表されるＭＥ−２６５のＭＥ−２８２への変換
（１） 形質転換体反応液の調製
実施例２（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で３時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、８ｍｇ／ｍＬ ＭＥ−２６５を５０μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣでＭＥ−２６５およびＭＥ−２８２量を測定した。測定結果を表３に示す。
また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：４５％アセトニトリル（０〜１５分）
６０％アセトニトリル（１５〜３０分）
４５％アセトニトリル（３０〜４５分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：４５分
保持時間：ＭＥ−２６５ ２４．８分
ＭＥ−２８２ １２．７分
（２） 形質転換体反応液からのＭＥ−２８２の取得
２４時間反応した反応液１．８ｍＬに水４ｍＬを加え、酢酸エチル８ｍＬで１回、４ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を除去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ ０．２５ｍｍ展開液；ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）により精製し、ＭＥ−２８２を０．２ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．２１−１．２６（１Ｈ，ｍ），１．２９−１．３７（３Ｈ，ｍ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．４４−１．５２（２Ｈ，ｍ），１．６０−１．６４（１Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１３．９Ｈｚ），１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１３．９Ｈｚ），１．８９−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．００（３Ｈ，ｓ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．９Ｈｚ），２．５０−２．６０（１Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，１３．９Ｈｚ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，７．７Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，６．２Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ），３．７５−３．８０（１Ｈ，ｍ），４．９０（１Ｈ，ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｄ２Ｏ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．０Ｈｚ）。
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではＭＥ−２８２とみられるピークは得られなかったのに対して、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株では、ＭＥ−２６５をほとんど消費してＭＥ−２８２とみられるピークが得られた。このことより、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢがＭＥ−２６５からＭＥ−２８２への変換に関与していることを示唆している。
［実施例４］ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢをもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化合物１１１０７Ｂのマクロライド系化合物１１１０７Ｄへの変換
（１） 形質転換体反応液の調製
実施例３と同様にマクロライド系化合物１１１０７Ｂを基質とした試験を行った。実施例２（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３０℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で５時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、２５℃で２０時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを５０μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣでマクロライド系化合物１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表４に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：３５％ アセトニトリル（０〜１０分）
３５％〜６５％ アセトニトリル（１０〜１２分）
６５％ アセトニトリル（１２〜１５分）
３５％アセトニトリル（１５〜２０分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２０分
保持時間：１１１０７Ｂ １４．３分
１１１０７Ｄ ７．９分
（２） 形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７Ｄの取得
２４時間反応した反応液１．８ｍＬに水４ｍＬを加え、酢酸エチル８ｍＬで１回、４ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を除去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ ０．２５ｍｍ展開液；酢酸エチル）により精製し、１１１０７Ｄを０．１ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．１８（３Ｈ，ｓ），１．１８−１．６９（８Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８２−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．４９−２．６０（３Ｈ，ｍ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．２Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．４，５．７Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．８，８．３Ｈｚ），３．７３−３．８２（１Ｈ，ｍ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），６．３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１５．２Ｈｚ）。
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではマクロライド系化合物１１１０７Ｄとみられるピークは得られなかったのに対して、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ＤＭ株では、マクロライド系化合物１１１０７Ｄとみられるピークが得られた。このことより、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢがマクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例５］Ａ−１５４４セルフクローニング株での変換試験
（１） Ａ−１５４４株由来のｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製（セルフクローニング用）
実施例１において解析した配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＦ（配列番号１０）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＲ（配列番号１１）を設計し作成した。
次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＢｇｌＦおよびＤＭ−ＢｇｌＲ）と実施例１（１）で得たＡ−１５４４株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを６３℃、３０秒間、伸長を６８℃、４分間行う３段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｅ１という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液を、アガロースゲル電気泳動にかけて分画した。上記の約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片−Ｅ１をアガロースゲルから切り出して、ＳＵＰＲＥＣ ０１（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＩＪＤＭＧの構築
ｐＩＪ７０２をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＢｇｌＩＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｅ１を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｅ１の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅ１と、プラスミドｐＩＪ７０２とが連結された約８．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＩＪＤＭＧと称する）が構築された。
（３）セルフクローニング株Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株の調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＩＪＤＭＧを用い、Ａ−１５４４株を、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５に記載された方法に従い形質転換した。こうして、プラスミドｐＩＪＤＭＧで形質転換されたＡ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を得た。
［実施例６］セルフクローニング株による１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換
実施例５（３）で得た形質転換体Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株、Ａ−１５４４／ｐＩＪ７０２株、および元のＡ−１５４４株の凍結種母を、チオストレプトン２５μｇ／ｍＬを含むＳＭＮ培地（スタビローズ２％、グルコース２％、エスサンミート２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％ ｐＨ７．４）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で４８時間振とう培養した（種母培養、但し、Ａ−１５４４株にはチオストレプトンを加えない）。得られた種母培養液の０．５ｍＬをチオストレプトン２５μｇ／ｍＬを含むＳＭＮ培地５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し２８℃で７２時間振とう培養した（但し、Ａ−１５４４株にはチオストレプトンを加えない）。得られた培養液２ｍＬを分注し、これに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１００μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを５０μＬ添加した。こうして得られた変換培養液を２８℃、１２時間反応させた。反応液２００μＬをアセトニトリル１ｍＬで抽出し、ＨＰＬＣで１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄ量を測定した。測定結果を表５に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＳＧ１２０（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相：３５％アセトニトリル（０〜１０分）
３５％〜６５％アセトニトリル（１０〜１２分）
６５％アセトニトリル（１２〜１５分）
３５％アセトニトリル（１５〜２０分）
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２０分
保持時間：１１１０７Ｂ １４．３分
１１１０７Ｄ ７．９分
この結果、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含むプラスミドが形質転換されたＡ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株は、元のＡ−１５４４株に比べ、１２時間の反応で約２．７倍の変換活性を示した。このことは、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢのセルフクローニングが、マクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に貢献できることを示唆している。
［実施例７］ストレプトミセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１２）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） ストレプトミセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＭｅｒ−１１１０７株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄ−１Ｒ（配列番号１２））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）と前項（１）で得たＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約３００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ２という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ２は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ２を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ２を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ２を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ２を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ２は電気泳動で約３００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には３２５ｂｐであることが明らかとなった（配列番号２の塩基８３７〜塩基１１６１参照）。クローニングされた前記の３２５ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ２がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ２の周辺領域の解析
前記のとおり、Ｍｅｒ−１１１０７株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ｍｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡ（（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＫＣｌ）中で制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列から、プライマー（７ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号１３）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（７ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応３５回繰り返した。
この結果、約１．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ２）と約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ２）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ２（約１．３ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ２（約１．４ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２配列から、配列番号２に示された２３２９ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この２３２９ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号２の塩基４２０〜塩基１６０４にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する３９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＡという）が存在した。そしてｂｐｍＡは、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性６７．４％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６４．８％）。このことからｂｐｍＡがチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする可能性が高いと考えられた。
またｂｐｍＡのすぐ下流（配列番号２の塩基１６４３〜塩基１８３４）には３Ｆｅ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＢという）が存在した。ｂｐｍＢがコードするタンパク質は６４個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８１．０％）、さらにストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも比較的高い相同性を有した（７６．２％）。そのため、ｂｐｍＢは電子伝達を担い、ｂｐｍＡと共に水酸化を行うものと考えられた。
［実施例８］ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ｍｅｒ−１１１０７株由来のｂｐｍＡおよびｂｐｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例７において解析した配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマー０７−ＮｄｅＦ（配列番号１４）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマー０７−ＳｐｅＲ（配列番号１５）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（０７−ＮｄｅＦおよび０７−ＳｐｅＲ）と実施例７（１）で得たＭｅｒ−１１１０７株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｄ２という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｄ２をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７の構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｄ２を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｄ２の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｄ２と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７と称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７の調製
前項（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−Ｄ０７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−Ｄ０７で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株を得た。
［実施例９］ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢをもつ大腸菌形質転換体によるマクロライド系化合物１１１０７Ｂの１１１０７Ｄへの変換
実施例８（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で４時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で５時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬマクロライド系化合物１１１０７Ｂを１２．５μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液４００μＬをメタノール６００μＬで抽出し、ＨＰＬＣでマクロライド系化合物１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表６に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％ メタノール（０〜５分）
５５％ メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％ メタノール（１３〜１７分）
７０％ メタノール（１７〜２１分）
４５％ メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：１１１０７Ｂ １２．２分
１１１０７Ｄ ４．２分
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株ではマクロライド系化合物１１１０７Ｄのピークは得られなかったのに対して、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−Ｄ０７株では、マクロライド系化合物１１１０７Ｄのピークが得られた。このことより、ｂｐｍＡおよびｂｐｍＢがマクロライド系化合物１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例１０］Ａ−１５６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０２）由来遺伝子の塩基配列の決定
（１） Ａ−１５６０株染色体のＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５６０株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。
（２） マクロライド系化合物１１１０７の１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして、ミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆ（配列番号４）および５Ｄｍ−２Ｒ（配列番号１６））を設計し作成した。
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約７５０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ３という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ３は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ３を、反応液からＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ３を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ３を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ３を得た。
（３） クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ３は電気泳動で約７５０ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には７４１ｂｐであることが明らかとなった（配列番号３の塩基６１６〜塩基１３５６参照）。クローニングされた前記の７４１ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ３がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４） ＤＮＡ断片−Ａ３の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５６０株由来の水酸化活性を有するクンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５６０株染色体ＤＮＡ（（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＫＣｌ）中において制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール）中において制限酵素ＫｐｎＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中において制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列から、プライマー（５ＰＩＮ−２Ｆ（配列番号１７）および６ＰＩＮ−２Ｒ（配列番号７））を設計し作成した。
次にこの２種のプライマー（５ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応３５回繰り返した。
この結果、約４．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ３）と約３．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ３と約１．７ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ３）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前記（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５） ＤＮＡ断片−Ｂ３（約４．５ｋｂｐのサイズ）、ＤＮＡ断片−Ｃ３（約３．０ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｄ３（約１．７ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の配列の中から、配列番号３に示された１８６０ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この１８６０ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号３の塩基１７２〜塩基１３８３にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＡという）が存在した。そしてｔｐｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７７．４％）、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列にも高い相同性を有した（相同性７６．６％）。このことからｔｐｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｔｐｍＡのすぐ下流（配列番号３の塩基１３９９〜塩基１５９３）には３Ｆｅ−４Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＢという）が存在した。ｔｐｍＢがコードするタンパク質は６５個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８１．０％）、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも高い相同性を有した（８２．５％）。そのため、ｔｐｍＢは電子伝達を担い、ｔｐｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
［実施例１１］ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢをもつ形質転換体の作成
（１） Ａ−１５６０株由来のｔｐｍＡおよびｔｐｍＢの両方を含有するＤＮＡ断片の調製
実施例１０において解析した配列番号３の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｔｐｍ−ＮｄｅＦ（配列番号１８）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーｔｐｍ−ＳｐｅＲ（配列番号１９）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ｔｐｍ−ＮｄｅＦおよびｔｐｍ−ＳｐｅＲ）と実施例１０（１）で得たＡ−１５６０株染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。
この結果、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ｅ３という）が増幅された。このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｅ３をＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。
（２） プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢの構築
ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ（ＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項（１）で得たＤＮＡ断片−Ｅ３を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片−Ｅ３の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結した。これによって、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片−Ｅ３と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢと称する）が構築された。
（３） 大腸菌形質転換株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢの調製
実施例１１（２）で調製したプラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。こうして、プラスミドｐＴＣ−ｔｐｍＡＢで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株を得た。
［実施例１２］ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢをもつ大腸菌形質転換体による１１１０７Ｂの１１１０７Ｄへの変換
前項（３）で得た形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株の凍結種母をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬの入った１５ｍＬ容の試験管に植菌し３７℃で２０時間振とう培養した。この種母培養液の５００μＬをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍＬの入った２５０ｍＬ容の三角フラスコに植菌し３２℃で４時間振とう培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を５０μＬ、８０ｍｇ／ｍＬ ５−アミノレブリン酸を５０μＬ順次添加し、３２℃で５時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体を集めた。これを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）１．７５ｍＬに懸濁し、これに８０％グリセロールを２５０μＬ、４０ｍｇ／ｍＬ １１１０７Ｂを１２．５μＬ添加した。こうして得られた変換反応液を２８℃、２４時間反応させた。反応液４００μＬをメタノール６００μＬで抽出し、ＨＰＬＣで１１１０７Ｂおよび１１１０７Ｄの量を測定した。その測定結果を表７に示す。また、ＨＰＬＣの詳しい条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−３（φ４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％ メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％ メタノール（１３〜１７分）
７０％ メタノール（１７〜２１分）
４５％ メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：１１１０７Ｂ １２．２分
１１１０７Ｄ ４．２分
この結果、コントロールである大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７ＮＳ−ＣａｍＡＢ株では１１１０７Ｄのピークは得られなかったのに対して、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢを含むＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＣ−ｔｐｍＡＢ株では、１１１０７Ｄのピークが得られた。このことより、ｔｐｍＡおよびｔｐｍＢが１１１０７Ｂから１１１０７Ｄへの変換に関与していることを示唆している。
［実施例１３］セルフクローニング株による下記式で表わされる１１１０７Ｈの１１１０７ＣＢへの変換
（１）形質転換体反応液の調製
スタビローズ２．０％、グルコース２．０％、大豆粉（豊年ソイプロ）２．０％、酵母エキス０．５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％からなるｐＨ７．４の培地を調製し、２５０ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの培地を入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。この培地にチオストレプトンを終濃度２５ｍｇ／Ｌになるように添加した後、Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を凍結種母より１％接種し２８℃、２２０ｒｐｍで３日間、種母培養を行った。この種母培養液を同様の組成の培地に１％添加し、２８℃、２２０ｒｐｍで２日間、本培養を行った。本培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌し、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液２０ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に基質１１１０７Ｈ（１００ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液）を終濃度２０００ｍｇ／Ｌになるように添加し２８℃、２２０ｒｐｍで１６時間変換反応を行った。
（２）形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７ＣＢの取得
同様の操作を行った変換反応液（フラスコ６本分）から遠心分離により菌体を分離し、遠心上清を等量の酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４’ ０．５ｍｍ 展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製し、１１１０７ＣＥを１１９．５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５７３（Ｍ＋Ｎａ）＋
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．２０（１Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．５５−１．４０（２Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，１４．０Ｈｚ），１．７５（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．０Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．６８−２．４０（４Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｍ），３．５１（１Ｈ，ｍ），４．５１（１Ｈ，ｍ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，１５．２Ｈｚ），５．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．４，１５．２Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，１５．５Ｈｚ），５．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１５．５Ｈｚ），５．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），６．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．３Ｈｚ）
［実施例１４］セルフクローニング株による下記式で表わされる１１１０７Ｌの１１１０７ＣＧへの変換
（１）形質転換体反応液の調製
スタビローズ２．０％、グルコース２．０％、大豆粉（豊年ソイプロ）２．０％、酵母エキス０．５％、ＣａＣＯ３ ０．３２％からなるｐＨ７．４の培地を調製し、２５０ｍＬの三角フラスコに２５ｍＬの培地を入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。この培地にチオストレプトンを終濃度２５ｍｇ／Ｌになるように添加した後、Ａ−１５４４／ｐＩＪＤＭＧ株を凍結種母より１％接種し２８℃、２２０ｒｐｍで３日間、種母培養を行った。この種母培養液を同様の組成の培地に１％添加し、２８℃、２２０ｒｐｍで２日間、本培養を行った。本培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌し、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液２０ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に基質１１１０７Ｌ（１００ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液）を終濃度１６００ｍｇ／Ｌになるように添加し２８℃、２２０ｒｐｍで１６時間変換反応を行った。
（２）形質転換体反応液からのマクロライド系化合物１１１０７ＣＧの取得
この変換反応液から遠心分離により菌体を分離し、遠心上清を等量の酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４’ ０．２５ｍｍ 展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製し、１１１０７ＣＧを２５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ６３３（Ｍ＋Ｎａ）＋
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１８（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．２０（１Ｈ，ｍ），１．３４，（３Ｈ，ｓ），１．５６−１．４０（２Ｈ，ｍ），１．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１４．０Ｈｚ），１．７９−．１６９（２Ｈ，ｍ），１．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．０Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ），２．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１５．２Ｈｚ），２．６４−２．５５（１Ｈ，ｍ），２．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，７．９Ｈｚ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，１５．２Ｈｚ），２．９０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，５．６Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，８．８Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｍ），４．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８，１１．３Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），５．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．９，１５．２Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，１５．２Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），６．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．３Ｈｚ）
【産業上の利用可能性】
本発明のＤＮＡを担持するプラスミドで形質転換した形質転換体を用いることにより、優れた抗腫瘍活性を有し、水溶液中での安定性にも優れた１６位に水酸基を有する１２員環マクロライド化合物を効率よく生産することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
で示されるマクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｂという）の、
式（ＩＩ）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物への生物学的変換に関与するＤＮＡであって、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを一部にもしくは全体としてコードするＤＮＡまたはその改変体を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
【請求項２】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示される請求項１記載のＤＮＡ。
（ａ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｂ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ａ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ａ）または（ｂ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項５】
請求項４記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項６】
請求項２に記載されたＤＮＡまたはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
【請求項７】
下記の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）で示される請求項１記載のＤＮＡ。
（ｄ） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｅ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ｄ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ｄ）または（ｅ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項９】
請求項７記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項１０】
請求項９記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項１１】
請求項７に記載されたＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
【請求項１２】
請求項５または請求項１０記載の形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、式（ＩＩＩ）
〔式中、
Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは同一または異なって、
（１）水素原子、
（２）置換基を有していても良いＣ１−２２アルキル基、
（３）−ＯＲ（式中、Ｒは
１）水素原子、
置換基を有していても良い、
２）Ｃ１−２２アルキル基、
３）Ｃ７−２２アラルキル基、
４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基、
５）Ｃ２−２２アルカノイル基、
６）Ｃ７−１５アロイル基、
７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基、
８）−ＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは置換基を有していても良い、
８−１）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
８−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
８−３）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基、
８−４）Ｃ６−１４アリールオキシ基、
８−５）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
もしくは
８−６）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を表す）、
９）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基、
１０）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
または
１１）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は同一または異なって、Ｃ１−６アルキル基またはＣ６−１４アリール基を表す）を表す）、
（４）ハロゲン原子
または
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２
｛式中、ＲＭは単結合または−Ｏ−ＣＯ−を表す；
ＲＮ１およびＲＮ２は
１）同一または異なって、
１−１）水素原子もしくは
１−２）置換基を有していても良い、
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル基、
（ｉｉ）不飽和Ｃ２−２２アルキル基、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アルカノイル基
（ｉｖ）Ｃ７−１５アロイル基、
（ｖ）不飽和Ｃ３−２３アルカノイル基、
（ｖｉ）Ｃ６−１４アリール基、
（ｖｉｉ）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
（ｖｉｉｉ）Ｃ７−２２アラルキル基、
（ｉｘ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基もしくは
（ｘ）Ｃ６−１４アリールスルホニル基を表すか、
または
２）ＲＮ１およびＲＮ２は結合する窒素原子と一緒になって置換基を有していても良い３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を形成する｝を表す；
ただし、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは一緒になって、（ｉ）ケトン構造（＝Ｏ）または（ｉｉ）オキシム構造｛＝ＮＯＲｏｘ（式中、Ｒｏｘは置換基を有していても良い、Ｃ１−２２アルキル基、不飽和Ｃ２−２２アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、５員環ないし１４員環ヘテロアリール基またはＣ７−２２アラルキル基を表す）｝を形成しても良い；
Ｒ１６ａは水素原子を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素原子または
（２）
（式中、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂおよびＲ２２ｃは同一または異なって、
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）−ＯＲ（式中、Ｒは前記の意味を有する）、
４）ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）または
５）ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａおよびＲ２２ｂのどちらか一方とが一緒になって部分構造
を形成しても良い；
Ｇｍは
（１）式（ＧＭ−Ｉ）で示される基
｛式中、
Ｒ２およびＲ１０は同一または異なって、水素原子またはＣ１−２２アルキル基を表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは同一または異なって、
１）水素原子、
２）ヒドロキシ基、
３）置換基を有していても良い、
３−１）Ｃ１−２２アルキル基、
３−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
３−３）Ｃ６−１４アリールオキシ基
３−４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
３−５）Ｃ２−２２アルカノイルオキシ基、
３−６）Ｃ７−１５アロイルオキシ基
３−７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイルオキシ基、
３−８）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは前記の意味を有する）、
３−９）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基、
３−１０）Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基
もしくは
３−１１）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は前記の意味を有する）、
４）ハロゲン原子
または
５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）を表す；
あるいは、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは一緒になってケトン構造（＝Ｏ）を形成しても良い；
あるいは、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは一緒になって、スピロオキシラニル基またはエキソメチレン基を形成しても良い；あるいは、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは同一または異なって、水素原子または−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素原子、Ｃ１−２２アルキル基またはＣ２−２２アルカノイル基を表す）を表す｝
（２）式（ＧＭ−ＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（３）式（ＧＭ−ＩＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（４）式（ＧＭ−ＩＶ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）
または
（５）式（ＧＭ−Ｖ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）を表す〕
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、式（ＩＶ）
（式中、Ｗ、Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ａ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２１ｃおよびＧｍは式（ＩＩＩ）の定義と同義を表す）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、こうして変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法。
【請求項１３】
形質転換体が、請求項５記載の形質転換体であり、かつフェレドキシンをコードするＤＮＡを有する形質転換体である請求項１２記載の生産方法。
【請求項１４】
式（ＩＩＩ−ａ）
（式中、
Ｒ５’は水素原子またはアセトキシ基、Ｒ６’は水素原子またはヒドロキシ基、Ｒ７’は水素原子またはアセチル基を表す）で示される化合物を、式（ＩＶ−ａ）
（式中、
Ｗ’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は式（ＩＩＩ−ａ）の定義と同義である）で示される化合物に変換することを特徴とする請求項１２記載の生産方法。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ−ａ）の化合物の、式（ＩＶ−ａ）の化合物への変換において、
（１）
Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（２）
Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（３）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（４）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（５）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（６）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（７）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（８）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（９）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（１０）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（１１）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’が水素原子である化合物および
（１２）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物からなる群から選択される化合物を対象とする請求項１４記載の生産方法。
【請求項１６】
請求項５または請求項１０記載の形質転換体を、１６位水酸化マクロライド系化合物の生産に用いる用途。
【請求項１】
式（Ｉ）
で示されるマクロライド系化合物（以下マクロライド系化合物１１１０７Ｂという）の、
式（ＩＩ）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物への生物学的変換に関与するＤＮＡであって、１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質もしくはフェレドキシンを一部にもしくは全体としてコードするＤＮＡまたはその改変体を含んでなる単離された純粋なＤＮＡ。
【請求項２】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示される請求項１記載のＤＮＡ。
（ａ） マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｂ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ａ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ａ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ａ）または（ｂ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項５】
請求項４記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項６】
請求項２に記載されたＤＮＡまたはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
【請求項７】
下記の（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）で示される請求項１記載のＤＮＡ。
（ｄ） フェレドキシンをコードするＤＮＡであって、配列番号１の塩基２５６４から塩基２７６１までの連続した塩基配列、配列番号２の塩基１６４３から塩基１８３４までの連続した塩基配列および配列番号３の塩基１３９９から塩基１５９３までの連続した塩基配列からなる群より選択されるＤＮＡ。
（ｅ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡの改変体であって、
（ｉ） 前記（ｄ）で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
（ｉｉ）フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ） 遺伝子コドンの縮重のため、前記（ｄ）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、前記（ｄ）または（ｅ）で示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項９】
請求項７記載のＤＮＡを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
【請求項１０】
請求項９記載の組み換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
【請求項１１】
請求項７に記載されたＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡをプローブまたはプライマーとして用いることを特徴とする、フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法。
【請求項１２】
請求項５または請求項１０記載の形質転換体を培地で培養し、培養中又は培養後に、増殖した形質転換体と、式（ＩＩＩ）
〔式中、
Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ｂ、Ｒ１８、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは同一または異なって、
（１）水素原子、
（２）置換基を有していても良いＣ１−２２アルキル基、
（３）−ＯＲ（式中、Ｒは
１）水素原子、
置換基を有していても良い、
２）Ｃ１−２２アルキル基、
３）Ｃ７−２２アラルキル基、
４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシアルキル基、
５）Ｃ２−２２アルカノイル基、
６）Ｃ７−１５アロイル基、
７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイル基、
８）−ＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは置換基を有していても良い、
８−１）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
８−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
８−３）不飽和Ｃ２−２２アルコキシ基、
８−４）Ｃ６−１４アリールオキシ基、
８−５）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
もしくは
８−６）３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を表す）、
９）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基、
１０）Ｃ６−１４アリールスルホニル基
または
１１）−ＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は同一または異なって、Ｃ１−６アルキル基またはＣ６−１４アリール基を表す）を表す）、
（４）ハロゲン原子
または
（５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２
｛式中、ＲＭは単結合または−Ｏ−ＣＯ−を表す；
ＲＮ１およびＲＮ２は
１）同一または異なって、
１−１）水素原子もしくは
１−２）置換基を有していても良い、
（ｉ）Ｃ１−２２アルキル基、
（ｉｉ）不飽和Ｃ２−２２アルキル基、
（ｉｉｉ）Ｃ２−２２アルカノイル基
（ｉｖ）Ｃ７−１５アロイル基、
（ｖ）不飽和Ｃ３−２３アルカノイル基、
（ｖｉ）Ｃ６−１４アリール基、
（ｖｉｉ）５員環ないし１４員環ヘテロアリール基、
（ｖｉｉｉ）Ｃ７−２２アラルキル基、
（ｉｘ）Ｃ１−２２アルキルスルホニル基もしくは
（ｘ）Ｃ６−１４アリールスルホニル基を表すか、
または
２）ＲＮ１およびＲＮ２は結合する窒素原子と一緒になって置換基を有していても良い３員環ないし１４員環含窒素非芳香族複素環を形成する｝を表す；
ただし、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂは一緒になって、（ｉ）ケトン構造（＝Ｏ）または（ｉｉ）オキシム構造｛＝ＮＯＲｏｘ（式中、Ｒｏｘは置換基を有していても良い、Ｃ１−２２アルキル基、不飽和Ｃ２−２２アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、５員環ないし１４員環ヘテロアリール基またはＣ７−２２アラルキル基を表す）｝を形成しても良い；
Ｒ１６ａは水素原子を表す；
Ｒ２１ｃは
（１）水素原子または
（２）
（式中、Ｒ２２ａ、Ｒ２２ｂおよびＲ２２ｃは同一または異なって、
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）−ＯＲ（式中、Ｒは前記の意味を有する）、
４）ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）または
５）ハロゲン原子
を表す；
あるいは、
Ｒ２１ａおよびＲ２１ｂのどちらか一方とＲ２２ａおよびＲ２２ｂのどちらか一方とが一緒になって部分構造
を形成しても良い；
Ｇｍは
（１）式（ＧＭ−Ｉ）で示される基
｛式中、
Ｒ２およびＲ１０は同一または異なって、水素原子またはＣ１−２２アルキル基を表す；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは同一または異なって、
１）水素原子、
２）ヒドロキシ基、
３）置換基を有していても良い、
３−１）Ｃ１−２２アルキル基、
３−２）Ｃ１−２２アルコキシ基、
３−３）Ｃ６−１４アリールオキシ基
３−４）５員環ないし１４員環ヘテロアリールオキシ基、
３−５）Ｃ２−２２アルカノイルオキシ基、
３−６）Ｃ７−１５アロイルオキシ基
３−７）Ｃ３−２３不飽和アルカノイルオキシ基、
３−８）−ＯＣＯＲｃｏ（式中、Ｒｃｏは前記の意味を有する）、
３−９）Ｃ１−２２アルキルスルホニルオキシ基、
３−１０）Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基
もしくは
３−１１）−ＯＳｉＲｓ１Ｒｓ２Ｒｓ３（式中、Ｒｓ１、Ｒｓ２およびＲｓ３は前記の意味を有する）、
４）ハロゲン原子
または
５）−ＲＭ−ＮＲＮ１ＲＮ２（式中、ＲＭ、ＲＮ１およびＲＮ２は前記の意味を有する）を表す；
あるいは、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは一緒になってケトン構造（＝Ｏ）を形成しても良い；
あるいは、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは一緒になって、スピロオキシラニル基またはエキソメチレン基を形成しても良い；あるいは、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは同一または異なって、水素原子または−ＯＲＨ（式中、ＲＨは水素原子、Ｃ１−２２アルキル基またはＣ２−２２アルカノイル基を表す）を表す｝
（２）式（ＧＭ−ＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（３）式（ＧＭ−ＩＩＩ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）、
（４）式（ＧＭ−ＩＶ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ６ａ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）
または
（５）式（ＧＭ−Ｖ）で示される基
（式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ１０は式（ＧＭ−Ｉ）の定義と同義である）を表す〕
で示されるマクロライド系化合物とを接触させ、式（ＩＶ）
（式中、Ｗ、Ｒ１２、Ｒ１６ｂ、Ｒ１７ａ、Ｒ１７ａ、Ｒ２０ａ、Ｒ２０ｂ、Ｒ２１ａ、Ｒ２１ｂ、Ｒ２１ｃおよびＧｍは式（ＩＩＩ）の定義と同義を表す）
で示される１６位水酸化マクロライド系化合物に変換し、こうして変換された１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする１６位水酸化マクロライド系化合物の生産方法。
【請求項１３】
形質転換体が、請求項５記載の形質転換体であり、かつフェレドキシンをコードするＤＮＡを有する形質転換体である請求項１２記載の生産方法。
【請求項１４】
式（ＩＩＩ−ａ）
（式中、
Ｒ５’は水素原子またはアセトキシ基、Ｒ６’は水素原子またはヒドロキシ基、Ｒ７’は水素原子またはアセチル基を表す）で示される化合物を、式（ＩＶ−ａ）
（式中、
Ｗ’、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’は式（ＩＩＩ−ａ）の定義と同義である）で示される化合物に変換することを特徴とする請求項１２記載の生産方法。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ−ａ）の化合物の、式（ＩＶ−ａ）の化合物への変換において、
（１）
Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（２）
Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（３）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（４）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（５）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’、Ｒ６’およびＲ７’が水素原子である化合物、
（６）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ６’が水素原子、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（７）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（８）
Ｗ’が二重結合、Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（９）
Ｒ５’およびＲ７’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基である化合物、
（１０）
Ｒ５’が水素原子、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物、
（１１）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’が水素原子である化合物および
（１２）
Ｒ５’がアセトキシ基、Ｒ６’がヒドロキシ基、Ｒ７’がアセチル基である化合物からなる群から選択される化合物を対象とする請求項１４記載の生産方法。
【請求項１６】
請求項５または請求項１０記載の形質転換体を、１６位水酸化マクロライド系化合物の生産に用いる用途。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１５２
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５８４４（Ｐ２００５−５１５８４４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７９０６
【国際出願日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（０００００１９１５）メルシャン株式会社 (48)
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７９０６
【国際出願日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（０００００１９１５）メルシャン株式会社 (48)
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]