マクロラクトン誘導体、その製造方法、及びがんの処置のためのその使用
本発明は式（Ｉ)
【化１】
［式中、Ｘ及びＹは互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そしてＲ５はメチル又はエチルである］の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の、がん疾患の処置及び／又は予防のための使用、式（Ｉ)の化合物を含むがん疾患の処置及び／又は予防のための医薬組成物、式（Ｉ)の化合物、並びに化合物（Ｉ)の製造方法に関する。
【化１】
［式中、Ｘ及びＹは互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そしてＲ５はメチル又はエチルである］の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の、がん疾患の処置及び／又は予防のための使用、式（Ｉ)の化合物を含むがん疾患の処置及び／又は予防のための医薬組成物、式（Ｉ)の化合物、並びに化合物（Ｉ)の製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんは、大部分が致死的であり、そして内在細胞の制御不能な増殖により引き起こされる、ヒト及び動物の疾患である。がんは、悪性腫瘍（マリグノーマ（ｍａｌｉｇｎｏｍａｓ））及び新生物（腫瘍又はがん腫）の形成、又は白血球の悪性変性及び成熟障害（白血病、血液のがん）についての用語である。がん細胞又は腫瘍細胞は、内在細胞の形質転換の結果として生じる。がん細胞の悪性度は、細胞が無抑制の様式でかつ器官の構造に適合することなく増殖する能力、また浸潤する様式で増殖し、それにより組織を破壊する能力における、その増殖の自律性で表される。腫瘍細胞が血液又はリンパにより広がった後の腫瘍から距離を置いた播種（転移）の形成は、悪性の確実な徴候である。がんは、ヒトにおける最も頻繁な死因の１つであり、従って悪性変性を治癒又は処置するための方法及び手段に対する大きな必要性が存在する。
【０００２】
可能であれば根治的な、腫瘍の外科的除去に加えて、悪性腫瘍を処置する可能性には、Ｘ線、α線、β線及びγ線を使用する放射線学的治療、免疫療法並びに化学療法が含まれる。現在、免疫療法は限られた程度しか使用することができない。腫瘍の化学療法は、通常は局所的な外科的処置又は照射後に残存している腫瘍及び腫瘍細胞を処置するための細胞毒（細胞分裂阻害剤）の投与を意味すると理解される。これらの物質は細胞分裂の特定のプロセスに特異的に干渉し、これは、急速に増殖する腫瘍細胞のような高比率の分裂細胞を含む組織がより鋭敏に反応するということを意味する。使用される細胞分裂阻害剤は、アルキル化化合物（例えばシクロホスファミド）、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート）、アルカロイド（例えばビンクリスチン）及び抗生物質（例えばダウノマイシン又はアドリアマイシン）である。しかし、全てのこれらの薬剤は、大量の副作用に起因する深刻な不利益という欠点を有するので、罹患した患者の死亡が遅らされるだけで回避されない。さらに、変性した（がん）細胞は、使用される薬剤に対する耐性を発生させ；その時点で使用されている薬剤はその後細胞分裂阻害作用をもはや持たなくなるが、それらは副作用の結果として依然として毒性なままである。さらに、細胞分裂阻害剤を組み合わせて又は順々に使用することにより達成される有効性は、単一の細胞分裂阻害剤を使用すること（単剤療法）により達成される効率よりも高く、結果として、実質的な副作用は多剤化学療法に関連して付加的ではないということが見出されている。全てのこれらの理由から、新規な化学療法剤が緊急に必要とされており、従って世界中で探求されている。
【０００３】
特許文献１は、式
【化１】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ又はＣｌであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はエチルである］
のマクロサイクル（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ）又は上記化合物の生理学的許容しうる塩を記載する。
【０００４】
特許文献１に記載される化合物は、微生物株ナノシスティス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．） ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵及び任意のさらなる誘導体化により入手可能であり、そしてこれは真菌性疾患の処置及び／又は予防に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４９７１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式（Ｉ）
【化２】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の、
がん疾患の処置及び／又は予防のための使用に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、がん疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のための、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０００８】
Ｘ及びＹは、一緒になって好ましくは、それらが結合しているＣ原子間に結合を形成し、結果として上記Ｃ原子間の二重結合をさらに生じるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成し、結果として対応する好ましい化合物におけるＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子と一緒になってエポキシド基を形成する。より好ましくは、Ｘ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成する。
【０００９】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはＣｌ又はＢｒである。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌである。
【００１０】
Ｒ３は好ましくはＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである。より好ましくは、Ｒ３はＨ又はメチルである。
【００１１】
Ｒ４は好ましくはＨである。
【００１２】
Ｒ５は好ましくはエチルである。
【００１３】
特に好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、Ｒ３及びＲ４は互いに独立してＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１４】
より好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、Ｒ４はＨであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１５】
最も好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹはそれらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌであり、Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、好ましくはＨ又はメチルであり、Ｒ４はＨであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１６】
（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基であり、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル又はｎ−ヘキシルである。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の例は以下のとおりである：
【化３】
【００１８】
【化４】
【００１９】
本発明はさらに、式（Ｉ）
【化５】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩に関する。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物の例は、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の化合物（上記参照）である。
【００２１】
式（Ｉ）の化合物中にキラル中心が存在していてもよく、別の指示がなければＲ又はＳ配置である。本発明は、光学的に純粋な化合物と、鏡像異性体混合物及びジアステレオマー混合物のような立体異性体混合物の両方に関する。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、１４１８頁（１９８５））に記載されるような、それらの有機塩及び無機塩の両方を意味すると理解される。物理的及び化学的な安定性及び溶解性の理由で、とりわけナトリウム、カリウム、カルシウム及びアンモニウム塩が酸性基に好ましく；とりわけ塩酸、硫酸、リン酸又はカルボン酸若しくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸及びｐ−トルエンスルホン酸の塩が、塩基性基には好ましい。
【００２３】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の全ての明らかな化学的等価物、及び式（Ｉ）の化合物の明らかな化学的等価物の使用に関する。この種の等価物は、わずかな化学的差異を示し、それ故同じ作用を有するか、又は本発明の化合物に穏やかな条件下で変換される化合物である。上述の等価物には、例えば式（Ｉ）の化合物の塩、還元生成物、酸化生成物、エステル、エーテル、アセタール、又はアミド、及び当業者が標準的な方法を使用して製造することができる等価物も含まれる。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物は、一般的には特許文献１に記載されるように製造することができる。
【００２５】
本発明はさらに、式（Ｉ）
【化６】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を製造するための方法に関し、該方法は、
１． 株ナノシスティス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．） ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）又はその変異株（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び／若しくは突然変異株（ｍｕｔａｎｔｓ）の１つを、適切な条件下で、Ｃｌ源及び／又はＢｒ源を含む培地中で、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中に蓄積するまで発酵させること、並びに
２． 培地から式（Ｉ）の化合物を単離すること、並びに
３． 場合により、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、そして／又はそれを生理学的に許容しうる塩に変換すること
を含む。
【００２６】
好ましくは、少なくとも１つのＢｒ源が培地中に存在する。
【００２７】
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６の分離菌をＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、ブダペスト条約（０９．１１．２００３）の規則にしたがって以下の番号で寄託した。以下の番号が寄託番号として割り当てられた：ＤＳＭ１８８７０。
【００２８】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の栄養細胞は特徴的な杆状形態を有する。固形栄養素培地において、ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は橙黄色の子実体を形成し、これは丸い粘菌胞子を含む。従って株ＳＴ２０１１９６の分類はミクソバクテリア属（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と記載され得る。
【００２９】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の代わりに、本発明の化合物の１つ又はそれ以上を合成するその突然変異株及び／又は変異株を使用することも可能である。
【００３０】
突然変異株は、ゲノムの１つ又はそれ以上の遺伝子が改変されている微生物であり、ここで本発明の化合物を産生する生物の能力の原因である遺伝子（単数又は複数）は機能的でかつ遺伝可能なままである。
【００３１】
この型の突然変異体は、それ自体公知のやり方で、物理的手段、例えば紫外線若しくはＸ線ビームを用いるような照射、又は化学変異原、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）若しくはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、若しくはＢｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、３０４−３１５頁（１９８４）に記載されるようなものを用いて製造され得る。
【００３２】
変異株は微生物の表現型である。微生物はそれらの環境に適合する能力を有し、従って顕著な生理学的柔軟性を示す。表現型適合の場合、微生物の全ての細胞が関与し、この場合改変の性質は遺伝的に条件づけられず、改変された条件下では可逆的である（Ｈ． Ｓｔｏｌｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ：ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ｈａｂｉｔａｔｓ、ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＧＢ、ｐａｇｅ １８０、１９８８）。
【００３３】
本発明の化合物の１つ又はそれ以上を合成する突然変異株及び／又は変異株についてのスクリーニングは、以下のスキームにしたがって行われる：
− 発酵培地の凍結乾燥
− 凍結乾燥物の有機溶媒での抽出
− 固相を使用した培養物ろ液からの化合物の抽出
− ＨＰＬＣ、ＴＬＣ又は生物学的活性の試験による分析
【００３４】
記載される発酵条件はナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ １８８７０）並びにその突然変異株及び／又は変異株に適用される。
【００３５】
培地は栄養溶液、又は少なくとも１つの炭素源及び窒素源、並びに慣例の無機塩を含有する固形培地である。
【００３６】
使用されるＣｌ源は、例えばＮａＣｌ又はＣａＣｌ2であり得る。この場合、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は好ましくは、Ｒ１及びＲ２の両方のラジカルがＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物、又はＲ１がＣｌに相当しＲ２がＨに相当する式（Ｉ）の化合物を産生する。好ましくは、本発明はＲ１及びＲ２がＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物を製造する方法に関する。さらに、本発明は好ましくは、Ｒ１がＨに相当し、Ｒ２がＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物の製造方法に関する。
【００３７】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）にＣａＢｒ2を供給することにより、３つの新規なブロモ含有マクロラクトンが得られる。使用されるＢｒ源はアルカリ無機塩（ａｌｋａｌｉ）又はアルカリ金属（ａｌｋａｌｉｎｅ）臭化物、例えばＮａＢｒ又はＣａＢｒ2であり得る。この場合、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は好ましくは、Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ、Ｃｌ若しくはＢｒである式（Ｉ）の化合物、Ｒ１若しくはＲ２の少なくとも１つがＢｒである式（Ｉ）の化合物、好ましくはＲ１がＣｌでありそしてＲ２がＢｒである式（Ｉ）の化合物、又はＲ１がＢｒでありそしてＲ２がＨである式（Ｉ）の化合物を産生する。
【００３８】
本発明の方法は、研究室規模（ミリリットルからリットルの規模）及び産業規模（立方メートル規模）の発酵に使用され得る。
【００３９】
発酵に適した炭素源は、同化炭化水素及び糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、又はＤ−マンニトール及び炭化水素含有天然物、例えば麦芽エキス又は酵母エキスである。適切な窒素含有栄養物は：アミノ酸；合成又は生合成ペプチド及びタンパク質、並びにそれらの分解産物、例えばＰｒｏｂｉｏｎ Ｆ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８４、１９（１）、２３−２８）、カゼイン、ペプトン又はトリプトン；肉エキス；酵母エキス；グルテン；例えばトウモロコシ、小麦、豆類、ダイズ又は綿の木の粉末種子；アルコール製品からの蒸留残滓；肉粉；酵母エキス；アンモニウム塩；硝酸塩（ｎｉｔｒａｔｅｓ）である。無機塩は、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガンの塩化物塩、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩である。微量元素は例えばコバルト及びマンガンである。
【００４０】
本発明に従うＣｌ含有物質の形成に適した条件は以下のとおりである：本発明の従う物質の形成は、好ましくは、０．０５〜５％、好ましくは０．１〜２．５％、の大豆ミール；０．０５〜５％、好ましくは０．２〜２％の可溶性でんぷん；０．０２〜２％、好ましくは０．０５〜０．５％のグルコース；０．０２〜２％、好ましくは０．２〜０．８％のＨＥＰＥＳ；０．０２〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、のＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．０２〜１．５％、好ましくは０．０５〜０．７％、のＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０．００００１％〜０．００１％のシアノコバラミン及び１〜５％の吸着樹脂（ａｄｓｏｒｂｅｒ ｒｅｓｉｎ）ＸＡＤ−１６を含有する培地において進行する。パーセントで示すデータは各場合において栄養溶液全体の質量に基づく。
【００４１】
本発明に従うＢｒ含有物質の形成に適した条件は以下のとおりである：本発明に従う物質の形成は、好ましくは、０．０５〜５％、好ましくは０．１〜２．５％、の大豆ミール；０．０５〜５％、好ましくは０．２〜２％の可溶性でんぷん；０．０２〜２％、好ましくは０．０５〜０．５％のグルコース；０．０２〜２％、好ましくは０．２〜０．８％のＨＥＰＥＳ；０．０２〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、のＣａＢｒ2ｘＨ2Ｏ；０．０２〜１．５％、好ましくは０．０５〜０．７％、のＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０．００００１％〜０．００１％のシアノコバラミン及び１〜５％の吸着樹脂ＸＡＤ−１６を含有する培地において進行する。パーセントで示すデータは各場合において栄養溶液全体の質量に基づく。
【００４２】
微生物の培養を好気的に、すなわち震盪フラスコ若しくは発酵槽において震盪又は撹拌しながら液中（ｓｕｂｍｅｒｓｅ）形式で、又は固型培地で、場合により空気若しくは酸素を導入しながら行われる。これは約１８〜３５℃の温度範囲で、好ましくは約２０〜３２℃、特に２７〜３０℃で行われ得る。ｐＨ範囲は４〜１０の間、好ましくは６．５〜９の間であるべきである。微生物は一般的に、これらの条件下で３〜１８日の期間、好ましくは１４４〜２１６時間の間培養される。有利には、培養は多段階で行われ、すなわち最初に１つ又はそれ以上の前培養を液体栄養培地において準備し、次いでこれを実際の産生培地中に（主培養）、例えば体積比１：１０〜１：１００で播種する。前培養は、例えば株を栄養細胞又は子実体の形態の株を栄養溶液中に播種し、そしてそれを約３〜１３日間、好ましくは９６〜２４０時間増殖させる。栄養細胞及び／又は子実体は、例えば株を固形又は液体の栄養培地、例えばイースト寒天で約３〜１５日間、好ましくは７〜１０日間増殖させることにより得ることができる。
【００４３】
培地からの式（Ｉ）の物質の単離又は精製は、天然物質の化学的、物理的及び生物学的特性を考慮に入れて公知の方法にしたがって行われる。ＨＰＬＣを、培地中又は個々の単離段階でのそれぞれの誘導体の濃度を試験するために使用した。
【００４４】
単離のために、培養ブロスを遠心分離し、そして／又は吸引フィルターに通してろ過する。菌糸体をＸＡＤとともに凍結乾燥し、その後天然物質を凍結乾燥物から有機溶媒（例えばメタノール又は２−プロパノール）を使用して抽出する。有機溶媒相は本発明の天然物質を含有し；これを場合により真空濃縮し、そして液−液抽出により水及び有機溶媒（例えば（ジクロロメタン、酢酸エチル又はイソブチルメチルケトン）を使用してさらに精製する。
【００４５】
本発明の化合物の１つ又はそれ以上のさらなる精製を、適切な物質、好ましくは例えば、分子ふるい、シリカゲル、アルミナ、イオン交換体又は吸着樹脂又は逆相（ＲＰ）でのクロマトグラフィーにより行う。このクロマトグラフィーを用いて天然物質誘導体を分離する。本発明の化合物のクロマトグラフィーを、緩衝化水溶液又は水溶液と有機溶液との混合物を使用して行う。
【００４６】
水溶液と有機溶液との混合物は、０〜１００％の溶媒の濃度で水と混和性の全ての有機溶媒、好ましくはメタノール、２−プロパノール、またあるいは、有機溶媒と混和性の全ての緩衝化水溶液を意味すると理解される。使用される緩衝液は上で示されるものと同じである。
【００４７】
それらの異なる極性に基づく本発明の化合物の分離を、逆相クロマトグラフィーを用いて、例えばＭＣＩ(R)（吸着樹脂、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ、Ｊａｐａｎ）若しくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ(R)（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）、又は別の疎水性材料、例えば、ＲＰ−８若しくはＲＰ−１８相で行う。さらに、分離を順相クロマトグラフィーを用いて、例えばシリカゲル、アルミナなどで行うことができる。
【００４８】
天然物質誘導体のクロマトグラフィーを、当業者に公知の方法にしたがって、好ましくは緩衝化、塩基性若しくは酸性化された水溶液、又は水溶液とアルコール若しくはその他の水混和性有機溶媒との混合物を使用して行った。アセトニトリル及び／又はメタノールが好ましくは有機溶媒として使用される。
【００４９】
緩衝化、塩基性又は酸性化水溶液は、例えば、水、０．５Ｍまでの濃度の、リン酸緩衝剤、酢酸アンモニウム、ぎ酸アンモニウム、クエン酸緩衝剤、及び好ましくは１％までの濃度の、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、アンモニア、トリエチルアミン又は当業者に公知の全ての市販されている酸及び塩基を意味すると理解される。緩衝化水溶液の場合、０．１％酢酸アンモニウムが特に好ましい。
【００５０】
クロマトグラフィーを、例えば、水１００％で開始して溶媒１００％で終了するグラジエントを使用して行った；５〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントが好ましく作用した。
【００５１】
あるいは、ゲルクロマトグラフィー又は疎水相でのクロマトグラフィーもまた行うことができる。ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミド又は混合ポリマーゲル、例えば、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ ２(R)（Ｂｉｏｒａｄ）又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＨＷ
４０（Ｒ）Ｒ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われる。上述のクロマトグラフィーの順序は可逆的である。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物が立体異性体混合物として存在する場合、立体異性体を、公知の手段により、例えばキラルカラムを用いた分離により分離することができる。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物の３，５−ジクロロチロシンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ３がＨに相当する］のアシル基［Ｒ３がＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］への誘導体化及び／又は式（Ｉ）の化合物の３−ヒドロキシバリンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ４がＨに相当する］のアシル基［Ｒ４がＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］への誘導体化は、それ自体公知の方法（Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００７）に従って、例えば塩基の存在下での酸塩化物との反応又は酸無水物との反応により行われる。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物の３，５−ジクロロチロシンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ３がＨに相当する］の、アルキル基でのアルキル化［Ｒ３が（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］及び／又は式（Ｉ）の化合物の３−ヒドロキシバリンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ４がＨに相当する］のアルキル基でのアルキル化［Ｒ４が（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］は、当業者にそれ自体公知の方法（Ｊ． Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９２）により、例えば塩基の存在下での（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルブロミドとの反応により、又はメチル化の場合はヨウ化メチル若しくはＭｅ2ＳＯ4との反応により行われる。
【００５５】
フェノール性ＯＨ基（Ｒ３＝Ｈ）と脂肪族ＯＨ基（Ｒ４＝Ｈ）との選択的差別化を、それ自体当業者に公知の保護基導入方法により行う（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９９）。例えば、Ｐｅｔｔｕｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００、１２２、６１６０−６１６８）は、Ｋ2ＣＯ3の存在下でアセトン中（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルブロミドとの反応による、又は（ＣＦ3ＣＯ）2Ｏ及びＣｕＣｌ2水和物の存在下でＤＢＵ中（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル−ＯＨとの反応による、第三級脂肪族アルコールの存在下でのフェノール性ＯＨ基の選択的アルキル化を記載する。フェノール性ＯＨ基と脂肪族ＯＨ基とのさらなる差別化の可能性は、式（Ｉ）のビス−アルキル化［Ｒ３及びＲ４が等しく（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］又はビス−アシル化［Ｒ３及びＲ４が等しくＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］化合物の選択的脱保護のための、当業者にそれ自体公知の方法を用いて行われる（Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００６）。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００１、６６、３６８８−３６９５）は、−２０℃にてフッ化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）による、ＴＢＳ−保護第三級アルコールの存在下でのｔｅｒｔ−ブチルシリル（ＴＢＳ）−保護フェノールの選択的脱保護を記載する。フェノール性ＯＨ基（Ｒ３＝Ｈ）は、Ｃｌ−［（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル］−Ｃｌ又はＢｒ−［（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル］−Ｂｒの存在下でのＨ2Ｎ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルとの反応により、基−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルへとさらに誘導体化され得る。
【００５６】
式中Ｘ及びＹが基−Ｏ−を形成する式（Ｉ）の化合物の、式中Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである式（Ｉ）の化合物への誘導体化は、それ自体当業者に公知の方法を用いて（Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９２）、例えばエポキシド基と、（Ｃ1−Ｃ6）−アルコラート［ＹがＯ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合にＸはＯＨに相当し、又はＸがＯ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＹがＯＨに相当する］、ＮＨ3［ＹがＮＨ2に相当する場合はＸはＯＨに相当し、又はＸがＮＨ2に相当する場合はＹがＯＨに相当する］、又はＨ2Ｎ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル［ＹがＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＸはＯＨに相当するか、又はＸがＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＹがＯＨに相当する］との反応により行われる。
【００５７】
表１、２及び３に示されるように、式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍活性を、種々の腫瘍細胞株の細胞増殖の阻害を測定することにより決定した：
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
従って本発明は、式（Ｉ）
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
化合物又はその生理学的に許容しうる塩の、がん疾患の処置及び／又は予防のため、好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣（ｏｖｅｒｉａｌ）がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫を処置するための、使用に関する。
【００６２】
本発明はさらに、がん疾患の処置及び／又は予防のため、好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫を処置及び／又は予防するための、少なくとも１つの式（Ｉ）［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を含む医薬組成物に関する。
【００６３】
さらに、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を含む、
好ましくはがん疾患の処置及び／又は予防のため、
より好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫の処置及び／又は予防のための、医薬組成物に関する。
【００６４】
式（Ｉ）の化合物（単数又は複数）は、実質的にそれ自体で投与されても、好ましくは慣例の薬理学的に適切なビヒクル又は添加剤との混合物として投与されてもよい。
【００６５】
本発明の化合物は、固体状態及び２〜９の間のｐＨ範囲（特に５〜７）の溶液で
安定であり、従って慣例の生薬製剤中に組み込まれ得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口投与されても非経口投与されてもよいが、原理上は直腸投与も可能である。適切な固形又は液状の生薬剤形は、例えば顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤、ドロップ又はアンプル形態の注射液、及び活性物質が遅延放出される製剤であり、その製剤において、薬理学的に適切なビヒクル又は添加剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、流動促進剤又は滑沢剤、香味添加剤、甘味料又は可溶化剤が通常使用され、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン類、セルロース及びその誘導体、動物又は植物油、ポリエチレングリコール類並びに溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールである。
【００６７】
場合により、経口投与用の用量単位は、例えば、活性物質を適切なポリマー、ロウ中などで粒子形態にコーティング又は包埋することにより、放出を遅らせるか又はそれを長期にわたって延長するためにマイクロカプセル化され得る。
【００６８】
好ましくは、医薬組成物は用量単位で製剤化及び投与され、ここで各単位は活性構成要素として特定用量の本発明の天然物質の１つ又はそれ以上の化合物を含む。錠剤、カプセル剤及び坐剤のような固形用量単位の場合、この用量は、１日あたり、約５００ｍｇまでであり得るが、好ましくは約０．１〜２００ｍｇ、そしてアンプル形態の注射液の場合は約２００ｍｇまでであるが、好ましくは約０．５〜１００ｍｇである。
【００６９】
投与される日用量は、哺乳動物の体重、年齢、性別及び状態に依存する。しかし特定の状況下において、より高いかより低い日用量も適切であり得る。日用量の投与は、個別の用量単位の形態での単回投与により、あるいは多数のより小さな用量単位で、及び特定の間隔で細分された用量の複数回投与の両方により行われ得る。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、場合により式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上を慣例のビヒクル又は添加剤と混合し、そして適切な投与形態にすることにより製造される。
【００７１】
以下の実施例は、より詳細な本発明の説明に役立つことを意図され、本発明の範囲をいかなるようにも制限することはない。
【００７２】
パーセントは質量に対するものである。他の特定の記載がなければ、液体の場合の混合比は体積に対するものである。
【実施例】
【００７３】
実施例１：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の−１３５℃での保存
寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；０．１％ ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして約７〜１０日間３０℃でインキュベートした。この表面培養の細胞を寒天表面から滅菌スパチュラを使用して削り取り、クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中でカシトン（Ｃａｓｉｔｏｎｅ）培地１ｍｌ（１％カシトン（Ｄｉｆｃｏ）；０．１５％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；２５％グリセリン；ｐＨ７．０）に懸濁し、そして−１３５℃で保存した。
【００７４】
実施例２：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の−１９６℃での保存
寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして約７〜１０日間３０℃でインキュベートした。この表面培養の細胞を寒天表面から滅菌スパチュラを使用して削り取り、クリオチューブ中でカシトン培地１ｍｌ（１％カシトン（Ｄｉｆｃｏ）；０．１５％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；２５％グリセリン；ｐＨ７．０）に懸濁し、そして−１９６℃で保存した。
【００７５】
実施例３：エーレンマイヤーフラスコでのＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の前培養物の製造
滅菌した３００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中の栄養溶液１００ｍｌ（１％新鮮なパン酵母；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして６〜８日間３０℃及び回転式振盪機にて１８０ｒｐｍでインキュベートした。続いてこの前培養物の５０ｍｌを各５００ｍｌの主培養物の調製のために使用した（１０％接種材料）。
【００７６】
実施例４：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の液状主培養物の製造
以下の栄養溶液（０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６、ｐＨ７，２）５００ｍｌを含有する滅菌した２ｌエーレンマイヤーフラスコに、前培養物５０ｍｌ（１０％）（実施例３を参照のこと）又は新鮮な寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）で増殖させた培養物を接種し、そして振盪機で１８０ｒｐｍにて３０℃でインキュベートした。１４４〜２１６時間後に本発明の物質の最大産生に達した。
【００７７】
実施例５：発酵槽における物質（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の製造
１０ｌ及び５０ｌの発酵槽を以下の条件下で操作した：
種菌：２０％の前培養物（実施例３を参照のこと）
栄養培地：０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン、２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６
インキュベーション温度：３０℃
撹拌速度：２００ｒｐｍ
給気：０．５ｖｖｍ
ｐＨ調節：無し、滅菌前にＫＯＨを用いてｐＨ７．６±０．３
ｐＯ2調節：無し
消泡剤添加物：０．０５％Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ（Ｂａｙｅｒ）
実行時間：１４４〜２１６時間
ｐＨ調節を、１０％ＫＯＨ又は１０％Ｈ2ＳＯ4を使用して行った。
【００７８】
実施例６：臭化カルシウムを用いた、ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の液状主培養物の製造
以下の栄養溶液５００ｍｌ（０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＢｒ2・ｘＨ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６、ｐＨ７，２）を含む滅菌した２ｌエーレンマイヤーフラスコに、前培養物（実施例３を参照のこと）又は新鮮な寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）で増殖された培養物５０ｍｌ（１０％）を接種し、そして振盪機で１８０ｒｐｍ及び３０℃にてインキュベートした。１４４〜２１６時間後に本発明の物質の最大産生に達した。
【００７９】
実施例７：発酵槽における物質（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の製造
１０ｌ及び５０ｌの発酵槽を以下の条件下で操作した：
種菌：２０％前培養物（実施例３を参照のこと）
栄養培地：０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＢｒ2・ｘＨ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン、２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６
インキュベーション温度：３０℃
撹拌速度：２００ｒｐｍ
給気：０．５ｖｖｍ
ｐＨ調節：無し、滅菌前にＫＯＨを用いてｐＨ７．６±０．３
ｐＯ2調節：無し
消泡剤添加物：０．０５％Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ（Ｂａｙｅｒ）
実行時間：１４４〜２１６時間
ｐＨ調節を、１０％ＫＯＨ又は１０％Ｈ2ＳＯ4を用いて行った。
【００８０】
実施例８：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の液−液抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例４からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含有するバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール抽出物を真空で１ｌまで減らした。水１Ｌを加え、次いで水／メタノール層をジクロロメタン１Ｌで４回抽出した。その後、ジクロロメタン層を完全に乾固させて褐色油状物を得た。
【００８１】
実施例９：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の予備分離（Ｐｒｅ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）
実施例８からのジクロロメタン抽出物全部を引き続いて５００ｍｇステップ（ｓｔｅｐｓ）で精製した。例えば：ジクロロメタン抽出物５００ｍｇをメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（３ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R)１０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分間にわたって流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、酢酸でｐＨ４．６に調整）を流量１．２ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション２３及び２４は化合物（Ｖ）及び（ＩＩ）を含んでいた。これらを合わせて凍結乾燥した。フラクション２２も凍結乾燥し、これは化合物（ＩＩＩ）を含んでいた。
【００８２】
実施例１０：化合物（ＩＩ）及び（Ｖ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる最終精製
実施例９からのフラクション２３及び２４をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水を用いてｐＨ９に調整）を１．２ｍｌ／分の流量でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めてフラクション３２及び３３を合わせて、凍結乾燥後に純粋な（ＩＩ）を得た。フラクション２８及び２９も合わせて凍結乾燥後に純粋な（Ｖ）を得た。
【００８３】
実施例１１：化合物（ＩＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる最終精製
実施例９からのフラクション２２をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノール（１ ｍｌ、２０：７０：１０）の混合物に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R)１０μＣ１８（２）カラム（寸法：３０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を、水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に７０ｍｌ／分の流量で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を０．７ｍｌ／分の流量でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション１３を凍結乾燥して化合物（ＩＩＩ）を得た。
【００８４】
実施例１２：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の固相抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例４からの培養ブロス（培養ブロス約８０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール層を体積４Ｌまで真空濃縮し、続いて約３．０リットルのＣＨＰ−２０Ｐ材料（ＭＣＩ(R)ゲル、７５−１５０μ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を充填して準備したカラムにアプライした。１０％から９５％のメタノールグラジエントを使用して溶出を行った。カラムフロー（１２０ｍｌ／分）をフラクションで集めた（１ｌのフラクション）。化合物（ＩＩＩ）、（Ｖ）及び（ＩＩ）を含むフラクションを合わせて溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｒで除去し、続いてフラクションプールを凍結乾燥した。そのフラクションを実施例９〜１１に記載される手順を使用してさらに精製することができた。
【００８５】
実施例１３：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の液−液抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例６からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール抽出物を真空で１Ｌまで減らした。水１Ｌを加え、次いで水／メタノール層を４回ジクロロメタンで１Ｌ抽出した。その後ジクロロメタン層を完全に乾固させて褐色油状物を得た。
【００８６】
実施例１４：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる予備分離
実施例１３からのジクロロメタン抽出物全部を引き続いて５ｇステップで精製した。例えば：ジクロロメタン抽出物５ｇを５０ｍｌメタノールに溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ２５０ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで４０分の期間にわたって流量１５０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、酢酸でｐＨ４．６に調整）を流量１．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションを時間によって集めた（フラクションあたり１分）。フラクション２９は化合物（ＶＩＩ）及び（ＶＩ）を含んでおり、そしてフラクション３１は化合物（ＶＩＩＩ）を含んでいた。両方のフラクションを凍結乾燥した。
【００８７】
実施例１５：化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる予備分離
実施例１４からのフラクション２９をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R)Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：３０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分の期間にわたって流量６０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を流量０．６ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション７４を凍結乾燥し、これは化合物（ＶＩＩ）及び（ＶＩ）を含んでいた。
【００８８】
実施例１６：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩＩＩ）の予備分離
実施例１４からのフラクション３１をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分の期間にわたって流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を１．２ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション４８−５０を合わせて凍結乾燥し、これは化合物（ＶＩＩＩ）を含んでいた。
【００８９】
実施例１７：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）の最終精製
実施例１５のフラクション７４をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R)Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：２１ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に流量４５ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（水中１０％ギ酸、ｐＨ２）を流量０．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション２４を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩＩ）を得、そしてフラクション２７を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩ）を得た。
【００９０】
実施例１８：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩＩＩ）の最終精製
実施例１６からのフラクション４８−５０をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：２１ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分以内に流量４５ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（水中１０％ギ酸、ｐＨ２）を流量０．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション１７を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩＩＩ）を得た。
【００９１】
実施例１９：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の固相抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵の完了後、実施例６からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール層を体積４Ｌまで真空濃縮し、続いてＣＨＰ−２０Ｐ材料約３．０リットル（ＭＣＩ(R)ゲル、７５−１５０μ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を充填して準備したカラムにアプライした。１０％から９５％のメタノールグラジエントを使用して溶出を行った。カラムフロー（１２０ｍｌ／分）を１ｌのフラクションで集めた。化合物（ＶＩＩ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩＩ）を含むフラクションを合わせて、溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｒで除去し、続いてフラクションプールを凍結乾燥した。そのフラクションは実施例１４〜１８に記載される手順にしたがってさらに精製することができた。
【００９２】
実施例２０：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）及び（Ｘ）のダイオードアレイ及び質量分析検出を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳ）による特徴付け
マクロラクトン（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）及び（Ｘ）を、サンプルマネージャー、バイナリ溶媒マネージャー及びＰＤＡ（検出器）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで分析した。ＵＰＬＣカラムとしてＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μ；２．１ｘ１００ｍｍ）を使用し、そして流量０．６ｍｌ／分で水：アセトニトリル（９：１）の１５分以内で１００％アセトニトリルまでのグラジエントを用いて溶出し、全ての溶媒は６．５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いてｐＨ４．６に緩衝化されていた。ＵＶスペクトルをＰＤＡ検出器により２００〜５００ｎｍの間の波長で記録した。質量スペクトルをＢｒｕｋｅｒ μＴＯＦ ＬＣ−ＭＳで直交型エレクトロスプレーイオン化、０．５Ｈｚのサンプリングレート及び１５０−１５００ｍｕの検出限界を使用して記録した。
【００９３】
実施例２１：化合物（ＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＩ）は９．２２分（ＴＩＣ）で溶出された。ＵＶスペクトルはλmax ２０４、２３２及び２８６ｎｍが特徴であった。
【００９４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１４．３、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；８１５．３（４７）；８１６．３（７３）；８１７．３（３０）；８１８．３（１６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１６．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（１７）；８１７．３（１０）；８１８．３（１４）；８１９．３（６）；８３３．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８３４．３（４４）；８３５．３（７４）；８３６．３（２９）；８３７．３（１６）に観測した。
【００９５】
【表４】
【００９６】
実施例２２：化合物（ＩＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＩＩ）は８．９５分（ＴＩＣ）で溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２０７及び２３２ｎｍが特徴的であった。
【００９７】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７８０．４、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；７８１．４（４８．１）；７８２．４（４４．６）；７８３．４（１０．５）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７８２．４、Ｍ＋Ｈ（＋）、（２５）；７８３．４（１５）；７８４．４（１１）；７９９．４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８００．４（４７．４）；８０１．４（４３．６）；８０２．４（１６）；８０３．４（３．３）に観測した。
【００９８】
【表５】
【００９９】
【表６】
【０１００】
実施例２３：化合物（ＩＶ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＶ）は８．２８分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax
２３１ｎｍが特徴的であった。
【０１０１】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７４６．４、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；７４７．４（３７．６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７４８．４、Ｍ＋Ｈ（＋）、（３５．２）；７４９．４（１４．９）；７５０．４（３．４）；７６５．４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；７６６．５（４２．３）；７６７．５（９．３）に観測した。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
実施例２４：化合物（Ｖ）の特徴付け
マクロラクトン（Ｖ）は９．００分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２０４、２３０及び２８６ｎｍが特徴的であった。
【０１０４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８００．３、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；８０１．３（４０）；８０２．３（７０．２）；８０３．３（２４）、８０４．３（１１．５）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８０２．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（１８）；８０４．３（１２）；８１９．３４９４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８２０．３５１８（４２．９）；８２１．３４７９（７４．５）；８２２．３（２３．７）；８２３（１４）に観測した。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】
実施例２５：化合物（ＶＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩ）は９．５０分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax
２０７及び２３２ｎｍが特徴的であった。
【０１０９】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８５８．３、Ｍ−Ｈ（−）、（６７．７）；８５９．３（３０．５）；８６０．３（１００）；８６１．３（４０．９）；８６２．３（３０．２）；８６３．３（１０．４）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８７７．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（７０）；８７８．３（３１．１）；８７９．３（１００）；８８０．３（４２．４）；８８１．３（３０．８）；８８２．３（１１）に観測した。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
【表１２】
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
実施例２６：化合物（ＶＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩＩ）は９．０５分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３２ｎｍが特徴的であった。
【０１１４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８２４．３、Ｍ−Ｈ（−）、（８９．５）；８２５．３（３９．２）；８２６．３（１００）；８２７．３（３９．７）；８２８．３（９．６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８２６．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（８９．９）；８２７．３（３９．５）；８２８．３（１００）；８２９．３（３９．８）；８３０．３（９．４）に観測した。
【０１１５】
【表１４】
【０１１６】
【表１５】
【０１１７】
【表１６】
【０１１８】
実施例２７：化合物（ＶＩＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩＩＩ）は９．５５分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３０及び２８４ｎｍが特徴的であった。
【０１１９】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８０８．３、Ｍ−Ｈ（−）、（８７．２）；８０９．３（３３）；８１０．３（１００）；８１１．３（３２）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１０．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（８９．６）；８１１．３（３４．５）；８１２．３（１００）；８１３．３（３３）に観測した。
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
【表１８】
【０１２２】
【表１９】
【０１２３】
実施例２８：化合物（Ｘ）の特徴付け
マクロラクトン（Ｘ）は９．４３分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３１及び２７９ｎｍが特徴的であった。
【０１２４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：９０２．２、Ｍ−Ｈ（−）、（４５．６）；９０３．２（２５．０）；９０４．２（１００）；９０５．２（４５．４）；９０６．２（５４．０）；９０７．２（２２．４）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：９２１．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（４９．０）；９２２．３（２０．６）；９２３．３（１００）；９２４．３（４０．１）；９２５．３（７１．３）；９２６．３（３０．４）；９２７．３（９．１）に観測した。
【０１２５】
【表２０】
【０１２６】
実施例２９：化合物（ＩＩ）〜（ＩＸ）についての細胞増殖のインビトロでの評価
式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍活性を、以下に記載される方法による種々の腫瘍細胞株の細胞増殖の阻害を測定することにより決定した。
【０１２７】
１４Ｃ−チミジン取り込みアッセイの実験条件：
１）細胞を、９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒマイクロプレートにおいて培地（１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ）１８０μｌ中に接種した。接種密度はＨＣＴ１１６について２５００細胞／ウェル、ＨＴ２９及びＰＣ３について５０００細胞／ウェル、そしてＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−Ａ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０について１００００細胞／ウェルであった。
２）マイクロプレートを４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
３）試験化合物１０μｌを加えた。
４）マイクロプレートを７２時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
５）１４Ｃ−チミジンを１０μＣｉ／ｍｌで１０μｌ加えた。
６）マイクロプレートを２４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
７）細胞中に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ放射能シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１２８】
ＡＴＰバイアビリティーアッセイの実験条件：
１）細胞を、９６ウェルマイクロプレートにおいて培地１３５μｌ中に接種した。
使用した培地は、ＨＬ６０及びＣＥＭ細胞株については１０％ウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ、そして正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）については１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭであった。接種密度は、ＨＬ６０及びＣＥＭについては２５０００細胞／ウェル、そしてＮＨＤＦについては７５００細胞／ウェルであった。
２）マイクロプレートを４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
３）試験化合物１５μｌを加えた。
４）マイクロプレートを９６時間インキュベートした。
５）溶解試薬及びルシフェラーゼ／ルシフェリンの混合物１００μｌを加えた（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。発光をＭｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１２９】
【表２１】
【０１３０】
細胞増殖試験の結果を表１、２及び３に示す。
【０１３１】
【背景技術】
【０００１】
がんは、大部分が致死的であり、そして内在細胞の制御不能な増殖により引き起こされる、ヒト及び動物の疾患である。がんは、悪性腫瘍（マリグノーマ（ｍａｌｉｇｎｏｍａｓ））及び新生物（腫瘍又はがん腫）の形成、又は白血球の悪性変性及び成熟障害（白血病、血液のがん）についての用語である。がん細胞又は腫瘍細胞は、内在細胞の形質転換の結果として生じる。がん細胞の悪性度は、細胞が無抑制の様式でかつ器官の構造に適合することなく増殖する能力、また浸潤する様式で増殖し、それにより組織を破壊する能力における、その増殖の自律性で表される。腫瘍細胞が血液又はリンパにより広がった後の腫瘍から距離を置いた播種（転移）の形成は、悪性の確実な徴候である。がんは、ヒトにおける最も頻繁な死因の１つであり、従って悪性変性を治癒又は処置するための方法及び手段に対する大きな必要性が存在する。
【０００２】
可能であれば根治的な、腫瘍の外科的除去に加えて、悪性腫瘍を処置する可能性には、Ｘ線、α線、β線及びγ線を使用する放射線学的治療、免疫療法並びに化学療法が含まれる。現在、免疫療法は限られた程度しか使用することができない。腫瘍の化学療法は、通常は局所的な外科的処置又は照射後に残存している腫瘍及び腫瘍細胞を処置するための細胞毒（細胞分裂阻害剤）の投与を意味すると理解される。これらの物質は細胞分裂の特定のプロセスに特異的に干渉し、これは、急速に増殖する腫瘍細胞のような高比率の分裂細胞を含む組織がより鋭敏に反応するということを意味する。使用される細胞分裂阻害剤は、アルキル化化合物（例えばシクロホスファミド）、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート）、アルカロイド（例えばビンクリスチン）及び抗生物質（例えばダウノマイシン又はアドリアマイシン）である。しかし、全てのこれらの薬剤は、大量の副作用に起因する深刻な不利益という欠点を有するので、罹患した患者の死亡が遅らされるだけで回避されない。さらに、変性した（がん）細胞は、使用される薬剤に対する耐性を発生させ；その時点で使用されている薬剤はその後細胞分裂阻害作用をもはや持たなくなるが、それらは副作用の結果として依然として毒性なままである。さらに、細胞分裂阻害剤を組み合わせて又は順々に使用することにより達成される有効性は、単一の細胞分裂阻害剤を使用すること（単剤療法）により達成される効率よりも高く、結果として、実質的な副作用は多剤化学療法に関連して付加的ではないということが見出されている。全てのこれらの理由から、新規な化学療法剤が緊急に必要とされており、従って世界中で探求されている。
【０００３】
特許文献１は、式
【化１】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ又はＣｌであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はエチルである］
のマクロサイクル（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ）又は上記化合物の生理学的許容しうる塩を記載する。
【０００４】
特許文献１に記載される化合物は、微生物株ナノシスティス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．） ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵及び任意のさらなる誘導体化により入手可能であり、そしてこれは真菌性疾患の処置及び／又は予防に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４９７１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式（Ｉ）
【化２】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の、
がん疾患の処置及び／又は予防のための使用に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、がん疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のための、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０００８】
Ｘ及びＹは、一緒になって好ましくは、それらが結合しているＣ原子間に結合を形成し、結果として上記Ｃ原子間の二重結合をさらに生じるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成し、結果として対応する好ましい化合物におけるＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子と一緒になってエポキシド基を形成する。より好ましくは、Ｘ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成する。
【０００９】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはＣｌ又はＢｒである。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌである。
【００１０】
Ｒ３は好ましくはＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである。より好ましくは、Ｒ３はＨ又はメチルである。
【００１１】
Ｒ４は好ましくはＨである。
【００１２】
Ｒ５は好ましくはエチルである。
【００１３】
特に好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、Ｒ３及びＲ４は互いに独立してＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１４】
より好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、Ｒ４はＨであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１５】
最も好ましくは、本発明は、式中、Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹはそれらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌであり、Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、好ましくはＨ又はメチルであり、Ｒ４はＨであり、そしてＲ５はメチル又はエチルである、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１６】
（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基であり、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル又はｎ−ヘキシルである。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の例は以下のとおりである：
【化３】
【００１８】
【化４】
【００１９】
本発明はさらに、式（Ｉ）
【化５】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩に関する。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物の例は、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の化合物（上記参照）である。
【００２１】
式（Ｉ）の化合物中にキラル中心が存在していてもよく、別の指示がなければＲ又はＳ配置である。本発明は、光学的に純粋な化合物と、鏡像異性体混合物及びジアステレオマー混合物のような立体異性体混合物の両方に関する。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、１４１８頁（１９８５））に記載されるような、それらの有機塩及び無機塩の両方を意味すると理解される。物理的及び化学的な安定性及び溶解性の理由で、とりわけナトリウム、カリウム、カルシウム及びアンモニウム塩が酸性基に好ましく；とりわけ塩酸、硫酸、リン酸又はカルボン酸若しくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸及びｐ−トルエンスルホン酸の塩が、塩基性基には好ましい。
【００２３】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の全ての明らかな化学的等価物、及び式（Ｉ）の化合物の明らかな化学的等価物の使用に関する。この種の等価物は、わずかな化学的差異を示し、それ故同じ作用を有するか、又は本発明の化合物に穏やかな条件下で変換される化合物である。上述の等価物には、例えば式（Ｉ）の化合物の塩、還元生成物、酸化生成物、エステル、エーテル、アセタール、又はアミド、及び当業者が標準的な方法を使用して製造することができる等価物も含まれる。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物は、一般的には特許文献１に記載されるように製造することができる。
【００２５】
本発明はさらに、式（Ｉ）
【化６】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を製造するための方法に関し、該方法は、
１． 株ナノシスティス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．） ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）又はその変異株（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び／若しくは突然変異株（ｍｕｔａｎｔｓ）の１つを、適切な条件下で、Ｃｌ源及び／又はＢｒ源を含む培地中で、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中に蓄積するまで発酵させること、並びに
２． 培地から式（Ｉ）の化合物を単離すること、並びに
３． 場合により、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、そして／又はそれを生理学的に許容しうる塩に変換すること
を含む。
【００２６】
好ましくは、少なくとも１つのＢｒ源が培地中に存在する。
【００２７】
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６の分離菌をＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに、ブダペスト条約（０９．１１．２００３）の規則にしたがって以下の番号で寄託した。以下の番号が寄託番号として割り当てられた：ＤＳＭ１８８７０。
【００２８】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の栄養細胞は特徴的な杆状形態を有する。固形栄養素培地において、ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は橙黄色の子実体を形成し、これは丸い粘菌胞子を含む。従って株ＳＴ２０１１９６の分類はミクソバクテリア属（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）と記載され得る。
【００２９】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の代わりに、本発明の化合物の１つ又はそれ以上を合成するその突然変異株及び／又は変異株を使用することも可能である。
【００３０】
突然変異株は、ゲノムの１つ又はそれ以上の遺伝子が改変されている微生物であり、ここで本発明の化合物を産生する生物の能力の原因である遺伝子（単数又は複数）は機能的でかつ遺伝可能なままである。
【００３１】
この型の突然変異体は、それ自体公知のやり方で、物理的手段、例えば紫外線若しくはＸ線ビームを用いるような照射、又は化学変異原、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）若しくはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、若しくはＢｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、３０４−３１５頁（１９８４）に記載されるようなものを用いて製造され得る。
【００３２】
変異株は微生物の表現型である。微生物はそれらの環境に適合する能力を有し、従って顕著な生理学的柔軟性を示す。表現型適合の場合、微生物の全ての細胞が関与し、この場合改変の性質は遺伝的に条件づけられず、改変された条件下では可逆的である（Ｈ． Ｓｔｏｌｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ：ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ｈａｂｉｔａｔｓ、ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＧＢ、ｐａｇｅ １８０、１９８８）。
【００３３】
本発明の化合物の１つ又はそれ以上を合成する突然変異株及び／又は変異株についてのスクリーニングは、以下のスキームにしたがって行われる：
− 発酵培地の凍結乾燥
− 凍結乾燥物の有機溶媒での抽出
− 固相を使用した培養物ろ液からの化合物の抽出
− ＨＰＬＣ、ＴＬＣ又は生物学的活性の試験による分析
【００３４】
記載される発酵条件はナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ １８８７０）並びにその突然変異株及び／又は変異株に適用される。
【００３５】
培地は栄養溶液、又は少なくとも１つの炭素源及び窒素源、並びに慣例の無機塩を含有する固形培地である。
【００３６】
使用されるＣｌ源は、例えばＮａＣｌ又はＣａＣｌ2であり得る。この場合、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は好ましくは、Ｒ１及びＲ２の両方のラジカルがＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物、又はＲ１がＣｌに相当しＲ２がＨに相当する式（Ｉ）の化合物を産生する。好ましくは、本発明はＲ１及びＲ２がＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物を製造する方法に関する。さらに、本発明は好ましくは、Ｒ１がＨに相当し、Ｒ２がＣｌに相当する式（Ｉ）の化合物の製造方法に関する。
【００３７】
株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）にＣａＢｒ2を供給することにより、３つの新規なブロモ含有マクロラクトンが得られる。使用されるＢｒ源はアルカリ無機塩（ａｌｋａｌｉ）又はアルカリ金属（ａｌｋａｌｉｎｅ）臭化物、例えばＮａＢｒ又はＣａＢｒ2であり得る。この場合、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）は好ましくは、Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ、Ｃｌ若しくはＢｒである式（Ｉ）の化合物、Ｒ１若しくはＲ２の少なくとも１つがＢｒである式（Ｉ）の化合物、好ましくはＲ１がＣｌでありそしてＲ２がＢｒである式（Ｉ）の化合物、又はＲ１がＢｒでありそしてＲ２がＨである式（Ｉ）の化合物を産生する。
【００３８】
本発明の方法は、研究室規模（ミリリットルからリットルの規模）及び産業規模（立方メートル規模）の発酵に使用され得る。
【００３９】
発酵に適した炭素源は、同化炭化水素及び糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、又はＤ−マンニトール及び炭化水素含有天然物、例えば麦芽エキス又は酵母エキスである。適切な窒素含有栄養物は：アミノ酸；合成又は生合成ペプチド及びタンパク質、並びにそれらの分解産物、例えばＰｒｏｂｉｏｎ Ｆ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８４、１９（１）、２３−２８）、カゼイン、ペプトン又はトリプトン；肉エキス；酵母エキス；グルテン；例えばトウモロコシ、小麦、豆類、ダイズ又は綿の木の粉末種子；アルコール製品からの蒸留残滓；肉粉；酵母エキス；アンモニウム塩；硝酸塩（ｎｉｔｒａｔｅｓ）である。無機塩は、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガンの塩化物塩、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩である。微量元素は例えばコバルト及びマンガンである。
【００４０】
本発明に従うＣｌ含有物質の形成に適した条件は以下のとおりである：本発明の従う物質の形成は、好ましくは、０．０５〜５％、好ましくは０．１〜２．５％、の大豆ミール；０．０５〜５％、好ましくは０．２〜２％の可溶性でんぷん；０．０２〜２％、好ましくは０．０５〜０．５％のグルコース；０．０２〜２％、好ましくは０．２〜０．８％のＨＥＰＥＳ；０．０２〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、のＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．０２〜１．５％、好ましくは０．０５〜０．７％、のＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０．００００１％〜０．００１％のシアノコバラミン及び１〜５％の吸着樹脂（ａｄｓｏｒｂｅｒ ｒｅｓｉｎ）ＸＡＤ−１６を含有する培地において進行する。パーセントで示すデータは各場合において栄養溶液全体の質量に基づく。
【００４１】
本発明に従うＢｒ含有物質の形成に適した条件は以下のとおりである：本発明に従う物質の形成は、好ましくは、０．０５〜５％、好ましくは０．１〜２．５％、の大豆ミール；０．０５〜５％、好ましくは０．２〜２％の可溶性でんぷん；０．０２〜２％、好ましくは０．０５〜０．５％のグルコース；０．０２〜２％、好ましくは０．２〜０．８％のＨＥＰＥＳ；０．０２〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、のＣａＢｒ2ｘＨ2Ｏ；０．０２〜１．５％、好ましくは０．０５〜０．７％、のＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０．００００１％〜０．００１％のシアノコバラミン及び１〜５％の吸着樹脂ＸＡＤ−１６を含有する培地において進行する。パーセントで示すデータは各場合において栄養溶液全体の質量に基づく。
【００４２】
微生物の培養を好気的に、すなわち震盪フラスコ若しくは発酵槽において震盪又は撹拌しながら液中（ｓｕｂｍｅｒｓｅ）形式で、又は固型培地で、場合により空気若しくは酸素を導入しながら行われる。これは約１８〜３５℃の温度範囲で、好ましくは約２０〜３２℃、特に２７〜３０℃で行われ得る。ｐＨ範囲は４〜１０の間、好ましくは６．５〜９の間であるべきである。微生物は一般的に、これらの条件下で３〜１８日の期間、好ましくは１４４〜２１６時間の間培養される。有利には、培養は多段階で行われ、すなわち最初に１つ又はそれ以上の前培養を液体栄養培地において準備し、次いでこれを実際の産生培地中に（主培養）、例えば体積比１：１０〜１：１００で播種する。前培養は、例えば株を栄養細胞又は子実体の形態の株を栄養溶液中に播種し、そしてそれを約３〜１３日間、好ましくは９６〜２４０時間増殖させる。栄養細胞及び／又は子実体は、例えば株を固形又は液体の栄養培地、例えばイースト寒天で約３〜１５日間、好ましくは７〜１０日間増殖させることにより得ることができる。
【００４３】
培地からの式（Ｉ）の物質の単離又は精製は、天然物質の化学的、物理的及び生物学的特性を考慮に入れて公知の方法にしたがって行われる。ＨＰＬＣを、培地中又は個々の単離段階でのそれぞれの誘導体の濃度を試験するために使用した。
【００４４】
単離のために、培養ブロスを遠心分離し、そして／又は吸引フィルターに通してろ過する。菌糸体をＸＡＤとともに凍結乾燥し、その後天然物質を凍結乾燥物から有機溶媒（例えばメタノール又は２−プロパノール）を使用して抽出する。有機溶媒相は本発明の天然物質を含有し；これを場合により真空濃縮し、そして液−液抽出により水及び有機溶媒（例えば（ジクロロメタン、酢酸エチル又はイソブチルメチルケトン）を使用してさらに精製する。
【００４５】
本発明の化合物の１つ又はそれ以上のさらなる精製を、適切な物質、好ましくは例えば、分子ふるい、シリカゲル、アルミナ、イオン交換体又は吸着樹脂又は逆相（ＲＰ）でのクロマトグラフィーにより行う。このクロマトグラフィーを用いて天然物質誘導体を分離する。本発明の化合物のクロマトグラフィーを、緩衝化水溶液又は水溶液と有機溶液との混合物を使用して行う。
【００４６】
水溶液と有機溶液との混合物は、０〜１００％の溶媒の濃度で水と混和性の全ての有機溶媒、好ましくはメタノール、２−プロパノール、またあるいは、有機溶媒と混和性の全ての緩衝化水溶液を意味すると理解される。使用される緩衝液は上で示されるものと同じである。
【００４７】
それらの異なる極性に基づく本発明の化合物の分離を、逆相クロマトグラフィーを用いて、例えばＭＣＩ(R)（吸着樹脂、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ、Ｊａｐａｎ）若しくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ(R)（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）、又は別の疎水性材料、例えば、ＲＰ−８若しくはＲＰ−１８相で行う。さらに、分離を順相クロマトグラフィーを用いて、例えばシリカゲル、アルミナなどで行うことができる。
【００４８】
天然物質誘導体のクロマトグラフィーを、当業者に公知の方法にしたがって、好ましくは緩衝化、塩基性若しくは酸性化された水溶液、又は水溶液とアルコール若しくはその他の水混和性有機溶媒との混合物を使用して行った。アセトニトリル及び／又はメタノールが好ましくは有機溶媒として使用される。
【００４９】
緩衝化、塩基性又は酸性化水溶液は、例えば、水、０．５Ｍまでの濃度の、リン酸緩衝剤、酢酸アンモニウム、ぎ酸アンモニウム、クエン酸緩衝剤、及び好ましくは１％までの濃度の、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、アンモニア、トリエチルアミン又は当業者に公知の全ての市販されている酸及び塩基を意味すると理解される。緩衝化水溶液の場合、０．１％酢酸アンモニウムが特に好ましい。
【００５０】
クロマトグラフィーを、例えば、水１００％で開始して溶媒１００％で終了するグラジエントを使用して行った；５〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントが好ましく作用した。
【００５１】
あるいは、ゲルクロマトグラフィー又は疎水相でのクロマトグラフィーもまた行うことができる。ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミド又は混合ポリマーゲル、例えば、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ ２(R)（Ｂｉｏｒａｄ）又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＨＷ
４０（Ｒ）Ｒ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われる。上述のクロマトグラフィーの順序は可逆的である。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物が立体異性体混合物として存在する場合、立体異性体を、公知の手段により、例えばキラルカラムを用いた分離により分離することができる。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物の３，５−ジクロロチロシンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ３がＨに相当する］のアシル基［Ｒ３がＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］への誘導体化及び／又は式（Ｉ）の化合物の３−ヒドロキシバリンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ４がＨに相当する］のアシル基［Ｒ４がＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］への誘導体化は、それ自体公知の方法（Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００７）に従って、例えば塩基の存在下での酸塩化物との反応又は酸無水物との反応により行われる。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物の３，５−ジクロロチロシンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ３がＨに相当する］の、アルキル基でのアルキル化［Ｒ３が（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］及び／又は式（Ｉ）の化合物の３−ヒドロキシバリンアミノ酸上のＯＨ基［Ｒ４がＨに相当する］のアルキル基でのアルキル化［Ｒ４が（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］は、当業者にそれ自体公知の方法（Ｊ． Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９２）により、例えば塩基の存在下での（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルブロミドとの反応により、又はメチル化の場合はヨウ化メチル若しくはＭｅ2ＳＯ4との反応により行われる。
【００５５】
フェノール性ＯＨ基（Ｒ３＝Ｈ）と脂肪族ＯＨ基（Ｒ４＝Ｈ）との選択的差別化を、それ自体当業者に公知の保護基導入方法により行う（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９９）。例えば、Ｐｅｔｔｕｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００、１２２、６１６０−６１６８）は、Ｋ2ＣＯ3の存在下でアセトン中（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルブロミドとの反応による、又は（ＣＦ3ＣＯ）2Ｏ及びＣｕＣｌ2水和物の存在下でＤＢＵ中（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル−ＯＨとの反応による、第三級脂肪族アルコールの存在下でのフェノール性ＯＨ基の選択的アルキル化を記載する。フェノール性ＯＨ基と脂肪族ＯＨ基とのさらなる差別化の可能性は、式（Ｉ）のビス−アルキル化［Ｒ３及びＲ４が等しく（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する］又はビス−アシル化［Ｒ３及びＲ４が等しくＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル）に相当する］化合物の選択的脱保護のための、当業者にそれ自体公知の方法を用いて行われる（Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００６）。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００１、６６、３６８８−３６９５）は、−２０℃にてフッ化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）による、ＴＢＳ−保護第三級アルコールの存在下でのｔｅｒｔ−ブチルシリル（ＴＢＳ）−保護フェノールの選択的脱保護を記載する。フェノール性ＯＨ基（Ｒ３＝Ｈ）は、Ｃｌ−［（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル］−Ｃｌ又はＢｒ−［（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル］−Ｂｒの存在下でのＨ2Ｎ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルとの反応により、基−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルへとさらに誘導体化され得る。
【００５６】
式中Ｘ及びＹが基−Ｏ−を形成する式（Ｉ）の化合物の、式中Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである式（Ｉ）の化合物への誘導体化は、それ自体当業者に公知の方法を用いて（Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９２）、例えばエポキシド基と、（Ｃ1−Ｃ6）−アルコラート［ＹがＯ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合にＸはＯＨに相当し、又はＸがＯ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＹがＯＨに相当する］、ＮＨ3［ＹがＮＨ2に相当する場合はＸはＯＨに相当し、又はＸがＮＨ2に相当する場合はＹがＯＨに相当する］、又はＨ2Ｎ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル［ＹがＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＸはＯＨに相当するか、又はＸがＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルに相当する場合はＹがＯＨに相当する］との反応により行われる。
【００５７】
表１、２及び３に示されるように、式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍活性を、種々の腫瘍細胞株の細胞増殖の阻害を測定することにより決定した：
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
従って本発明は、式（Ｉ）
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
化合物又はその生理学的に許容しうる塩の、がん疾患の処置及び／又は予防のため、好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣（ｏｖｅｒｉａｌ）がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫を処置するための、使用に関する。
【００６２】
本発明はさらに、がん疾患の処置及び／又は予防のため、好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫を処置及び／又は予防するための、少なくとも１つの式（Ｉ）［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり；
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり；そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を含む医薬組成物に関する。
【００６３】
さらに、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩を含む、
好ましくはがん疾患の処置及び／又は予防のため、
より好ましくは乳がん、腸がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、脳腫瘍、卵巣がん、食道がん、腎臓がん及び筋細胞がん、特に頭部及び頸部の筋肉のがん腫の処置及び／又は予防のための、医薬組成物に関する。
【００６４】
式（Ｉ）の化合物（単数又は複数）は、実質的にそれ自体で投与されても、好ましくは慣例の薬理学的に適切なビヒクル又は添加剤との混合物として投与されてもよい。
【００６５】
本発明の化合物は、固体状態及び２〜９の間のｐＨ範囲（特に５〜７）の溶液で
安定であり、従って慣例の生薬製剤中に組み込まれ得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口投与されても非経口投与されてもよいが、原理上は直腸投与も可能である。適切な固形又は液状の生薬剤形は、例えば顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤、ドロップ又はアンプル形態の注射液、及び活性物質が遅延放出される製剤であり、その製剤において、薬理学的に適切なビヒクル又は添加剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、流動促進剤又は滑沢剤、香味添加剤、甘味料又は可溶化剤が通常使用され、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン類、セルロース及びその誘導体、動物又は植物油、ポリエチレングリコール類並びに溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールである。
【００６７】
場合により、経口投与用の用量単位は、例えば、活性物質を適切なポリマー、ロウ中などで粒子形態にコーティング又は包埋することにより、放出を遅らせるか又はそれを長期にわたって延長するためにマイクロカプセル化され得る。
【００６８】
好ましくは、医薬組成物は用量単位で製剤化及び投与され、ここで各単位は活性構成要素として特定用量の本発明の天然物質の１つ又はそれ以上の化合物を含む。錠剤、カプセル剤及び坐剤のような固形用量単位の場合、この用量は、１日あたり、約５００ｍｇまでであり得るが、好ましくは約０．１〜２００ｍｇ、そしてアンプル形態の注射液の場合は約２００ｍｇまでであるが、好ましくは約０．５〜１００ｍｇである。
【００６９】
投与される日用量は、哺乳動物の体重、年齢、性別及び状態に依存する。しかし特定の状況下において、より高いかより低い日用量も適切であり得る。日用量の投与は、個別の用量単位の形態での単回投与により、あるいは多数のより小さな用量単位で、及び特定の間隔で細分された用量の複数回投与の両方により行われ得る。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、場合により式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上を慣例のビヒクル又は添加剤と混合し、そして適切な投与形態にすることにより製造される。
【００７１】
以下の実施例は、より詳細な本発明の説明に役立つことを意図され、本発明の範囲をいかなるようにも制限することはない。
【００７２】
パーセントは質量に対するものである。他の特定の記載がなければ、液体の場合の混合比は体積に対するものである。
【実施例】
【００７３】
実施例１：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の−１３５℃での保存
寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；０．１％ ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして約７〜１０日間３０℃でインキュベートした。この表面培養の細胞を寒天表面から滅菌スパチュラを使用して削り取り、クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中でカシトン（Ｃａｓｉｔｏｎｅ）培地１ｍｌ（１％カシトン（Ｄｉｆｃｏ）；０．１５％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；２５％グリセリン；ｐＨ７．０）に懸濁し、そして−１３５℃で保存した。
【００７４】
実施例２：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の−１９６℃での保存
寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして約７〜１０日間３０℃でインキュベートした。この表面培養の細胞を寒天表面から滅菌スパチュラを使用して削り取り、クリオチューブ中でカシトン培地１ｍｌ（１％カシトン（Ｄｉｆｃｏ）；０．１５％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；２５％グリセリン；ｐＨ７．０）に懸濁し、そして−１９６℃で保存した。
【００７５】
実施例３：エーレンマイヤーフラスコでのＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の前培養物の製造
滅菌した３００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中の栄養溶液１００ｍｌ（１％新鮮なパン酵母；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；ｐＨ７．２）に、株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）を接種し、そして６〜８日間３０℃及び回転式振盪機にて１８０ｒｐｍでインキュベートした。続いてこの前培養物の５０ｍｌを各５００ｍｌの主培養物の調製のために使用した（１０％接種材料）。
【００７６】
実施例４：ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の液状主培養物の製造
以下の栄養溶液（０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６、ｐＨ７，２）５００ｍｌを含有する滅菌した２ｌエーレンマイヤーフラスコに、前培養物５０ｍｌ（１０％）（実施例３を参照のこと）又は新鮮な寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）で増殖させた培養物を接種し、そして振盪機で１８０ｒｐｍにて３０℃でインキュベートした。１４４〜２１６時間後に本発明の物質の最大産生に達した。
【００７７】
実施例５：発酵槽における物質（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の製造
１０ｌ及び５０ｌの発酵槽を以下の条件下で操作した：
種菌：２０％の前培養物（実施例３を参照のこと）
栄養培地：０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン、２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６
インキュベーション温度：３０℃
撹拌速度：２００ｒｐｍ
給気：０．５ｖｖｍ
ｐＨ調節：無し、滅菌前にＫＯＨを用いてｐＨ７．６±０．３
ｐＯ2調節：無し
消泡剤添加物：０．０５％Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ（Ｂａｙｅｒ）
実行時間：１４４〜２１６時間
ｐＨ調節を、１０％ＫＯＨ又は１０％Ｈ2ＳＯ4を使用して行った。
【００７８】
実施例６：臭化カルシウムを用いた、ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の液状主培養物の製造
以下の栄養溶液５００ｍｌ（０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＢｒ2・ｘＨ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６、ｐＨ７，２）を含む滅菌した２ｌエーレンマイヤーフラスコに、前培養物（実施例３を参照のこと）又は新鮮な寒天プレート（０．５％新鮮なパン酵母；１％ＣａＣｌ2ｘ２Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン；１．８％寒天；ｐＨ７．２）で増殖された培養物５０ｍｌ（１０％）を接種し、そして振盪機で１８０ｒｐｍ及び３０℃にてインキュベートした。１４４〜２１６時間後に本発明の物質の最大産生に達した。
【００７９】
実施例７：発酵槽における物質（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の製造
１０ｌ及び５０ｌの発酵槽を以下の条件下で操作した：
種菌：２０％前培養物（実施例３を参照のこと）
栄養培地：０．５％大豆ミール；０．１％グルコース；１％可溶性でんぷん；０．１％ＣａＢｒ2・ｘＨ2Ｏ；０．１％ＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ；０．４７７％ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；０．００００５％シアノコバラミン、２％吸着樹脂ＸＡＤ−１６
インキュベーション温度：３０℃
撹拌速度：２００ｒｐｍ
給気：０．５ｖｖｍ
ｐＨ調節：無し、滅菌前にＫＯＨを用いてｐＨ７．６±０．３
ｐＯ2調節：無し
消泡剤添加物：０．０５％Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ（Ｂａｙｅｒ）
実行時間：１４４〜２１６時間
ｐＨ調節を、１０％ＫＯＨ又は１０％Ｈ2ＳＯ4を用いて行った。
【００８０】
実施例８：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の液−液抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例４からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含有するバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール抽出物を真空で１ｌまで減らした。水１Ｌを加え、次いで水／メタノール層をジクロロメタン１Ｌで４回抽出した。その後、ジクロロメタン層を完全に乾固させて褐色油状物を得た。
【００８１】
実施例９：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の予備分離（Ｐｒｅ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）
実施例８からのジクロロメタン抽出物全部を引き続いて５００ｍｇステップ（ｓｔｅｐｓ）で精製した。例えば：ジクロロメタン抽出物５００ｍｇをメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（３ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R)１０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分間にわたって流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、酢酸でｐＨ４．６に調整）を流量１．２ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション２３及び２４は化合物（Ｖ）及び（ＩＩ）を含んでいた。これらを合わせて凍結乾燥した。フラクション２２も凍結乾燥し、これは化合物（ＩＩＩ）を含んでいた。
【００８２】
実施例１０：化合物（ＩＩ）及び（Ｖ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる最終精製
実施例９からのフラクション２３及び２４をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水を用いてｐＨ９に調整）を１．２ｍｌ／分の流量でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めてフラクション３２及び３３を合わせて、凍結乾燥後に純粋な（ＩＩ）を得た。フラクション２８及び２９も合わせて凍結乾燥後に純粋な（Ｖ）を得た。
【００８３】
実施例１１：化合物（ＩＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる最終精製
実施例９からのフラクション２２をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノール（１ ｍｌ、２０：７０：１０）の混合物に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R)１０μＣ１８（２）カラム（寸法：３０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を、水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に７０ｍｌ／分の流量で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を０．７ｍｌ／分の流量でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション１３を凍結乾燥して化合物（ＩＩＩ）を得た。
【００８４】
実施例１２：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の固相抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例４からの培養ブロス（培養ブロス約８０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール層を体積４Ｌまで真空濃縮し、続いて約３．０リットルのＣＨＰ−２０Ｐ材料（ＭＣＩ(R)ゲル、７５−１５０μ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を充填して準備したカラムにアプライした。１０％から９５％のメタノールグラジエントを使用して溶出を行った。カラムフロー（１２０ｍｌ／分）をフラクションで集めた（１ｌのフラクション）。化合物（ＩＩＩ）、（Ｖ）及び（ＩＩ）を含むフラクションを合わせて溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｒで除去し、続いてフラクションプールを凍結乾燥した。そのフラクションを実施例９〜１１に記載される手順を使用してさらに精製することができた。
【００８５】
実施例１３：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の液−液抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵が完了した後、実施例６からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール抽出物を真空で１Ｌまで減らした。水１Ｌを加え、次いで水／メタノール層を４回ジクロロメタンで１Ｌ抽出した。その後ジクロロメタン層を完全に乾固させて褐色油状物を得た。
【００８６】
実施例１４：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる予備分離
実施例１３からのジクロロメタン抽出物全部を引き続いて５ｇステップで精製した。例えば：ジクロロメタン抽出物５ｇを５０ｍｌメタノールに溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ２５０ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで４０分の期間にわたって流量１５０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、酢酸でｐＨ４．６に調整）を流量１．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションを時間によって集めた（フラクションあたり１分）。フラクション２９は化合物（ＶＩＩ）及び（ＶＩ）を含んでおり、そしてフラクション３１は化合物（ＶＩＩＩ）を含んでいた。両方のフラクションを凍結乾燥した。
【００８７】
実施例１５：化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）のＲＰ−１８クロマトグラフィーによる予備分離
実施例１４からのフラクション２９をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R)Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：３０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分の期間にわたって流量６０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を流量０．６ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション７４を凍結乾燥し、これは化合物（ＶＩＩ）及び（ＶＩ）を含んでいた。
【００８８】
実施例１６：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩＩＩ）の予備分離
実施例１４からのフラクション３１をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：５０ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分の期間にわたって流量１２０ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（０．６５Ｍ酢酸アンモニウム、アンモニア水でｐＨ９に調整）を１．２ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション４８−５０を合わせて凍結乾燥し、これは化合物（ＶＩＩＩ）を含んでいた。
【００８９】
実施例１７：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）の最終精製
実施例１５のフラクション７４をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R)Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μＣ１８（２）カラム（寸法：２１ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から４０％のアセトニトリルのグラジエントで５分以内に、そして４０％から９５％で２７分以内に流量４５ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（水中１０％ギ酸、ｐＨ２）を流量０．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション２４を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩＩ）を得、そしてフラクション２７を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩ）を得た。
【００９０】
実施例１８：ＲＰ−１８クロマトグラフィーによる化合物（ＶＩＩＩ）の最終精製
実施例１６からのフラクション４８−５０をメタノール／ジメチルスルホキシド／２−プロパノールの混合物（１ｍｌ、２０：７０：１０）に溶解し、そしてＷａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ(R) Ｐｒｅｐ ＭＳ Ｃ１８ １０μプレカラム（寸法：１９ｘ１０ｍｍ）を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ(R) １０μ Ｃ１８（２）カラム（寸法：２１ｘ１００ｍｍ）にロードした。化合物を水中５％から９５％のアセトニトリルのグラジエントで２７分以内に流量４５ｍｌ／分で溶出した。緩衝液（水中１０％ギ酸、ｐＨ２）を流量０．５ｍｌ／分でシステムにポンプで注入した。フラクションをＵＶ（２２０ｎｍ）により集めた。フラクション１７を凍結乾燥して純粋な化合物（ＶＩＩＩ）を得た。
【００９１】
実施例１９：化合物（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の固相抽出
微生物株ナノシスティス・エスピー ＳＴ２０１１９６（ＤＳＭ１８８７０）の発酵の完了後、実施例６からの培養ブロス（培養ブロス約９０Ｌ）をろ過した。ＸＡＤを含むバイオマスを凍結乾燥し、続いてメタノールで抽出した（５ｘ１０Ｌ）。メタノール層を体積４Ｌまで真空濃縮し、続いてＣＨＰ−２０Ｐ材料約３．０リットル（ＭＣＩ(R)ゲル、７５−１５０μ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を充填して準備したカラムにアプライした。１０％から９５％のメタノールグラジエントを使用して溶出を行った。カラムフロー（１２０ｍｌ／分）を１ｌのフラクションで集めた。化合物（ＶＩＩ）、（ＶＩ）及び（ＶＩＩＩ）を含むフラクションを合わせて、溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｒで除去し、続いてフラクションプールを凍結乾燥した。そのフラクションは実施例１４〜１８に記載される手順にしたがってさらに精製することができた。
【００９２】
実施例２０：化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）及び（Ｘ）のダイオードアレイ及び質量分析検出を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳ）による特徴付け
マクロラクトン（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）及び（Ｘ）を、サンプルマネージャー、バイナリ溶媒マネージャー及びＰＤＡ（検出器）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで分析した。ＵＰＬＣカラムとしてＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μ；２．１ｘ１００ｍｍ）を使用し、そして流量０．６ｍｌ／分で水：アセトニトリル（９：１）の１５分以内で１００％アセトニトリルまでのグラジエントを用いて溶出し、全ての溶媒は６．５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いてｐＨ４．６に緩衝化されていた。ＵＶスペクトルをＰＤＡ検出器により２００〜５００ｎｍの間の波長で記録した。質量スペクトルをＢｒｕｋｅｒ μＴＯＦ ＬＣ−ＭＳで直交型エレクトロスプレーイオン化、０．５Ｈｚのサンプリングレート及び１５０−１５００ｍｕの検出限界を使用して記録した。
【００９３】
実施例２１：化合物（ＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＩ）は９．２２分（ＴＩＣ）で溶出された。ＵＶスペクトルはλmax ２０４、２３２及び２８６ｎｍが特徴であった。
【００９４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１４．３、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；８１５．３（４７）；８１６．３（７３）；８１７．３（３０）；８１８．３（１６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１６．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（１７）；８１７．３（１０）；８１８．３（１４）；８１９．３（６）；８３３．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８３４．３（４４）；８３５．３（７４）；８３６．３（２９）；８３７．３（１６）に観測した。
【００９５】
【表４】
【００９６】
実施例２２：化合物（ＩＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＩＩ）は８．９５分（ＴＩＣ）で溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２０７及び２３２ｎｍが特徴的であった。
【００９７】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７８０．４、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；７８１．４（４８．１）；７８２．４（４４．６）；７８３．４（１０．５）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７８２．４、Ｍ＋Ｈ（＋）、（２５）；７８３．４（１５）；７８４．４（１１）；７９９．４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８００．４（４７．４）；８０１．４（４３．６）；８０２．４（１６）；８０３．４（３．３）に観測した。
【００９８】
【表５】
【００９９】
【表６】
【０１００】
実施例２３：化合物（ＩＶ）の特徴付け
マクロラクトン（ＩＶ）は８．２８分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax
２３１ｎｍが特徴的であった。
【０１０１】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７４６．４、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；７４７．４（３７．６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：７４８．４、Ｍ＋Ｈ（＋）、（３５．２）；７４９．４（１４．９）；７５０．４（３．４）；７６５．４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；７６６．５（４２．３）；７６７．５（９．３）に観測した。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
実施例２４：化合物（Ｖ）の特徴付け
マクロラクトン（Ｖ）は９．００分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２０４、２３０及び２８６ｎｍが特徴的であった。
【０１０４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８００．３、Ｍ−Ｈ（−）、（１００）；８０１．３（４０）；８０２．３（７０．２）；８０３．３（２４）、８０４．３（１１．５）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８０２．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（１８）；８０４．３（１２）；８１９．３４９４、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（１００）；８２０．３５１８（４２．９）；８２１．３４７９（７４．５）；８２２．３（２３．７）；８２３（１４）に観測した。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】
実施例２５：化合物（ＶＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩ）は９．５０分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax
２０７及び２３２ｎｍが特徴的であった。
【０１０９】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８５８．３、Ｍ−Ｈ（−）、（６７．７）；８５９．３（３０．５）；８６０．３（１００）；８６１．３（４０．９）；８６２．３（３０．２）；８６３．３（１０．４）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８７７．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（７０）；８７８．３（３１．１）；８７９．３（１００）；８８０．３（４２．４）；８８１．３（３０．８）；８８２．３（１１）に観測した。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
【表１２】
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
実施例２６：化合物（ＶＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩＩ）は９．０５分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３２ｎｍが特徴的であった。
【０１１４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８２４．３、Ｍ−Ｈ（−）、（８９．５）；８２５．３（３９．２）；８２６．３（１００）；８２７．３（３９．７）；８２８．３（９．６）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８２６．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（８９．９）；８２７．３（３９．５）；８２８．３（１００）；８２９．３（３９．８）；８３０．３（９．４）に観測した。
【０１１５】
【表１４】
【０１１６】
【表１５】
【０１１７】
【表１６】
【０１１８】
実施例２７：化合物（ＶＩＩＩ）の特徴付け
マクロラクトン（ＶＩＩＩ）は９．５５分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３０及び２８４ｎｍが特徴的であった。
【０１１９】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８０８．３、Ｍ−Ｈ（−）、（８７．２）；８０９．３（３３）；８１０．３（１００）；８１１．３（３２）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：８１０．３、Ｍ＋Ｈ（＋）、（８９．６）；８１１．３（３４．５）；８１２．３（１００）；８１３．３（３３）に観測した。
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
【表１８】
【０１２２】
【表１９】
【０１２３】
実施例２８：化合物（Ｘ）の特徴付け
マクロラクトン（Ｘ）は９．４３分（ＴＩＣ）に溶出した。ＵＶスペクトルはλmax ２３１及び２７９ｎｍが特徴的であった。
【０１２４】
分子イオンをネガティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：９０２．２、Ｍ−Ｈ（−）、（４５．６）；９０３．２（２５．０）；９０４．２（１００）；９０５．２（４５．４）；９０６．２（５４．０）；９０７．２（２２．４）に観測した。分子イオンをポジティブモードでｍ／ｚ（Ｉ）：９２１．３、Ｍ＋ＮＨ４（＋）、（４９．０）；９２２．３（２０．６）；９２３．３（１００）；９２４．３（４０．１）；９２５．３（７１．３）；９２６．３（３０．４）；９２７．３（９．１）に観測した。
【０１２５】
【表２０】
【０１２６】
実施例２９：化合物（ＩＩ）〜（ＩＸ）についての細胞増殖のインビトロでの評価
式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍活性を、以下に記載される方法による種々の腫瘍細胞株の細胞増殖の阻害を測定することにより決定した。
【０１２７】
１４Ｃ−チミジン取り込みアッセイの実験条件：
１）細胞を、９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒマイクロプレートにおいて培地（１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ）１８０μｌ中に接種した。接種密度はＨＣＴ１１６について２５００細胞／ウェル、ＨＴ２９及びＰＣ３について５０００細胞／ウェル、そしてＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−Ａ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０について１００００細胞／ウェルであった。
２）マイクロプレートを４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
３）試験化合物１０μｌを加えた。
４）マイクロプレートを７２時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
５）１４Ｃ−チミジンを１０μＣｉ／ｍｌで１０μｌ加えた。
６）マイクロプレートを２４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
７）細胞中に取り込まれた放射能をＭｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ放射能シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１２８】
ＡＴＰバイアビリティーアッセイの実験条件：
１）細胞を、９６ウェルマイクロプレートにおいて培地１３５μｌ中に接種した。
使用した培地は、ＨＬ６０及びＣＥＭ細胞株については１０％ウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ、そして正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）については１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭであった。接種密度は、ＨＬ６０及びＣＥＭについては２５０００細胞／ウェル、そしてＮＨＤＦについては７５００細胞／ウェルであった。
２）マイクロプレートを４時間３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
３）試験化合物１５μｌを加えた。
４）マイクロプレートを９６時間インキュベートした。
５）溶解試薬及びルシフェラーゼ／ルシフェリンの混合物１００μｌを加えた（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。発光をＭｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１２９】
【表２１】
【０１３０】
細胞増殖試験の結果を表１、２及び３に示す。
【０１３１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん疾患の処置及び／又は予防のための、式（Ｉ）
【化１】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の使用。
【請求項２】
Ｘ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成する、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つがＣｌ又はＢｒである、請求項１又は２に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項４】
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項５】
Ｒ４はＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項６】
Ｒ５はエチルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３及びＲ４は互いに独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項８】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌであり、
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む、がん疾患の処置及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）
【化２】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物、又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩。
【請求項１２】
請求項１１に記載の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容しうる塩の製造方法であって、
１． 株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ １８８７０）、又はその変異株及び／若しくは突然変異株の１つを、適した条件下で、Ｃｌ源及び／又はＢｒ源を含有する培地中で、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中に蓄積するまで発酵させること、
２． 培地から式（Ｉ）の化合物を単離すること、並びに
３． 場合により、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、そして／又はそれを生理学的に許容しうる塩に変換すること
を含む、上記方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＢｒ源が培地中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む医薬組成物。
【請求項１】
がん疾患の処置及び／又は予防のための、式（Ｉ）
【化１】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立してＨ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである］
の化合物又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩の使用。
【請求項２】
Ｘ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成する、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つがＣｌ又はＢｒである、請求項１又は２に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項４】
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項５】
Ｒ４はＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項６】
Ｒ５はエチルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３及びＲ４は互いに独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項８】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９】
Ｘ及びＹは、一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは、それらが結合しているＣ原子間の二重結合をさらに形成し、
Ｒ１及びＲ２は両方ともＣｌであり、
Ｒ３はＨ又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルである、
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む、がん疾患の処置及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）
【化２】
［式中、
Ｘ及びＹは、互いに独立して、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹは一緒になって基−Ｏ−を形成するか、又はＸ及びＹは一緒になってそれらが結合しているＣ原子間にさらなる結合を形成し、
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、Ｈ、Ｃｌ又はＢｒであり、
Ｒ３はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ５はメチル又はエチルであり、
ただし、
Ｘ及びＹが互いに独立してＯＨ、Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、ＮＨ2若しくはＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであるか、又はＸ及びＹが一緒になって基−Ｏ−を形成し、
Ｒ１及びＲ２が互いに独立してＨ又はＣｌであり、
Ｒ３がＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ6）−アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルであり、そして
Ｒ４はＨ、（Ｃ1−Ｃ6）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）−アルキルである場合、
Ｒ５はエチルであることはない］
の化合物、又は式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容しうる塩。
【請求項１２】
請求項１１に記載の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容しうる塩の製造方法であって、
１． 株ナノシスティス・エスピー ＳＴ ２０１１９６（ＤＳＭ １８８７０）、又はその変異株及び／若しくは突然変異株の１つを、適した条件下で、Ｃｌ源及び／又はＢｒ源を含有する培地中で、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中に蓄積するまで発酵させること、
２． 培地から式（Ｉ）の化合物を単離すること、並びに
３． 場合により、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、そして／又はそれを生理学的に許容しうる塩に変換すること
を含む、上記方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＢｒ源が培地中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む医薬組成物。
【公表番号】特表２０１２−５１２２２４（Ｐ２０１２−５１２２２４Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１３４２（Ｐ２０１１−５４１３４２）
【出願日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６８０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６９８５０
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６８０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６９８５０
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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