マッサージ評価方法
【課題】皮膚を刺激するマッサージの効果をより的確に評価するために、マッサージの刺激を受けた皮膚の反応を検出する評価方法を開発する。
【解決手段】本発明は、物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含む、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法を提供する。本発明の評価方法において、前記物理的刺激処理はマッサージの場合がある。
【解決手段】本発明は、物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含む、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法を提供する。本発明の評価方法において、前記物理的刺激処理はマッサージの場合がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法、具体的には、オキシトシン放出量を指標とする皮膚へのマッサージの効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マッサージは、血液循環の改善や筋肉の緊張の緩和を通じて心身をリラックスさせて快適にするので、ストレスの激しい生活を送る現代人に人気がある。しかし、快不快の判断には主観が入るため、マッサージ効果の評価は困難である。より効果的で効率的なマッサージ方法を開発するためには、まず、客観的なマッサージ効果の評価方法を確立する必要がある。
【０００３】
従来のマッサージ効果の評価方法には、体幹及び／又は顔面の筋緊張度を施術の前後に計測し、該筋緊張度の緩和の度合いを指標とする評価方法（特許文献１）や、皮膚表面を冷却又は加温した場合の皮膚血流量の変化率を指標とする評価方法（特許文献２）がある。また、唾液中の免疫グロブリンを測定することを特徴とする、マッサージ方法の評価法（特許文献３）や、全身的な生化学的指標として、マッサージの前後に唾液中の副腎皮質ホルモン量を測定し、その変化の割合を指標とするマッサージの評価方法（特許文献４）も知られている。
【特許文献１】特開２００６−３３４１８６
【特許文献２】特開２００８−１１３８７６
【特許文献３】特開平８−１５２５７
【特許文献４】特開平１１−２３５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、これらの指標は、血管や筋肉及び唾液腺のように、マッサージ刺激の影響が間接的に及ぶ組織、器官の反応を検出しているにすぎないのであって、マッサージ刺激を直接受ける皮膚の反応を検出しているわけではない。また、マッサージ方法には筋肉の凝りをほぐすタイプもあるが、皮膚表面を刺激するタイプもある。そこで、皮膚を刺激するマッサージの効果をより的確に評価するためには、マッサージの刺激を受けた皮膚の反応を検出する評価方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含む、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法を提供する。
【０００６】
本発明の評価方法において、前記物理的刺激処理はマッサージの場合がある。
【０００７】
本明細書において「物理的刺激処理」とは、圧力、熱、電気その他の物理的刺激を与える処理をいう。圧力による刺激には、皮膚を押したり、さすったり、なでたり、叩いたり、ひねったりすることによる刺激が含まれる。前記圧力による刺激は、ヒトの手又は足か、マッサージ用器具かにより皮膚に直接圧力を加えるマッサージによる刺激の場合がある。
【０００８】
オキシトシンは、９個のアミノ酸残基からなるペプチドホルモンである。オキシトシンは、大脳の視床下部の室傍核や視索上核に存在する大細胞性神経細胞で合成され、脳下垂体後葉から血中に放出されることが知られる。その生物学的活性として子宮収縮作用、乳汁射出作用等が知られる。また、近年、オキシトシンの鼻腔内投与により他人への信頼が増大すること（Ｋｏｓｆｅｌｄ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）、４３５：６７３−６７６）、オキシトシンの経鼻投与により恐怖感が減少すること（Ｋｉｒｓｃｈ Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００５）２５：１１４８９−９３）等が報告された。また、動物及びヒトでの研究から、脳のオキシトシンは、社会的認識記憶の形成、養育行動を含む社会的行動を調節し、不安神経症を含むストレス応答を下向き調節することが明らかとなった（東田陽博、蛋白質 核酸 酵素（２００７）、５２：１８３２−１８３９、Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｉ．Ｄ．、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００７）、５：２３１−２３３）。このようにオキシトシンは、従来より知られている生物学的活性に加えて、人間関係の維持に必要な高次の心の働きに関与する機能も有する物質であり、情動の改善に有効であると考えられる。
【０００９】
以下の実施例で詳しく説明するとおり、本発明は、オキシトシンと、オキシトシン前駆体をエンコードするｍＲＮＡとが皮膚に存在すること、皮膚に刺激を与えることにより皮膚からのオキシトシンの放出量が増大すること、皮膚からのオキシトシンの放出量は、刺激の与え方に依存して増大することの新規な発見に基づく。とくに、刺激の与え方に依存して皮膚からのオキシトシンの放出量が増大することから、オキシトシンはマッサージ効果の評価方法の指標として有望である。
【００１０】
また、オキシトシンは上述のように経鼻投与により信頼感の増大、恐怖感の減少等の効果を発揮する物質であるので、皮膚に刺激を与えることによって放出されたオキシトシンは、快適さというマッサージの効果に直接関与する可能性がある。
【００１１】
そこで、本発明の評価方法は、心身が快適になるというマッサージの最も重要な効果に関与する可能性がある物質を指標とするため、マッサージの効果をより正確に評価できることが期待される。
【００１２】
本発明は、以下の実施例で示すとおり、皮膚組織、特に、表皮上層から角層にかけての細胞にオキシトシンが存在するとの知見に基づく。したがって、本発明において物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片は、少なくとも表皮上層から角層にかけての細胞を含む。
【００１３】
本明細書において培養液中に放出された皮膚組織片由来のオキシトシンの量とは、皮膚への物理的刺激処理前に皮膚細胞内で生成され、該刺激処理後、培養下で細胞外に放出されたオキシトシンの量と、前記刺激処理後、培養下で皮膚細胞内で生成され、細胞外に放出されたオキシトシンの量との和から、培養液中で分解されたオキシトシンの量と、培養下で皮膚細胞に吸着または取り込まれたオキシトシンの量とを引いた差の量をいう。
【００１４】
本発明における「培養」は、刺激を与えた皮膚からオキシトシンが培養液中に放出されるのに十分な培養条件であれば、どのような培養条件で行なっても構わない。前記培養条件は、培養時間、培養温度等を含む。前記培養時間は、皮膚中のオキシトシンを培養液中に放出させるための十分な時間を確保することが好ましい。前記培養条件は、３７°Ｃで２４時間培養を行なう場合がある。
【００１５】
本発明における培養液は、本発明の皮膚から単離された皮膚組織片を浸漬し培養することができるものであって、皮膚組織片の細胞におけるオキシトシン生成及び細胞外への放出を妨げたり、培養中に皮膚組織片の細胞が死んで細胞内のタンパク質分解酵素が培養液中に放出されて培養液中のオキシトシンを分解することが起きないものであれば、どのような組成の培養液であってもかまわない。ただし、元来オキシトシンを含有する血清や脳下垂体抽出物を添加した培養液は、皮膚由来のオキシトシンの定量に影響するため用いない。好ましくは前記培養液は、Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（インビトロジェン）または Ｅｐｉｌｉｆｅ ＡＯＦ Ｋｉｔ （インビトロジェン）の場合がある。
【００１６】
本発明における培養液中に放出されたオキシトシンを定量するステップは、当業者に周知の方法により実行される場合がある。例えば前記測定は、前記培養液を逆相クロマトグラフィその他の方法によってオキシトシン分画を精製し、これを適当なバッファーに再溶解させることによって、濃縮と溶媒液の変更とを行った上で、ＥＬＩＳＡ法により定量する場合がある。前記ＥＬＩＳＡ法は、例えばＯｘｙｔｏｃｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施される場合がある。代替的には、前記濃縮と溶媒液の変更とを行った後、オキシトシンを蛍光物質で標識し、ＨＰＬＣ法により分析しオキシトシンの溶出ピークを定量する場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下の実施例により本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
１．オキシトシンの存在部位についての検討
１−１．方法
免疫組織化学的な実験には、ヒト（ボランティア提供者３名、年齢５５−６６才、女性）の皮膚、及びヘアレスマウスＨＲ−１（Ｈｒｈｒ／Ｈｒｈｒ、７週齢、雄）の背中の皮膚組織片を得て、凍結ブロックを作製し、６μｍ厚の組織切片を薄切した。切片はメタノールで固定後、抗オキシトシン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と蛍光標識２次抗体（インビトロジェン）を用いて染色し、その蛍光画像を取得した。
【００１９】
分子遺伝学的な実験には、ＲＴ−ＰＣＲ法によりオキシトシン前駆体ｍＲＮＡの検出を行った。ＰＣＲ反応の鋳型として、ヒト新生児由来の表皮ケラチノサイト（クラボウ）から作製したｃＤＮＡと、ヒト皮膚由来のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｃ．）を用いた。ＰＣＲ反応のポジティブコントロールとしてヒト脳由来のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。オキシトシンｃＤＮＡの増幅に用いたプライマーの配列を表１に示す。表１の配列ａ、ｂ、ｃ及びｄのヌクレオチド配列はそれぞれＰＣＲ反応は例えばＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて添付のプロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ産物は分子量マーカー（１００ｂｐラダー、東洋紡）とともにアガロースゲル電気泳動法で分離し、臭化エチジウムで染色したバンドの蛍光画像を取得した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
１−２．結果
図１は、ヒトの顔面の皮膚組織切片（図１Ａ及びＢ）と、ヘアレスマウスＨＲ−１系統の皮膚組織切片（図１Ｃ及びＤ）とについての抗オキシトシン抗体による染色パターンを示す免疫組織化学的染色標本の顕微鏡写真（図１Ａ及びＣ）と、それぞれに隣接する組織切片のヘマトキシリン−エオジン染色標本の顕微鏡写真（図１Ｂ及びＤ）である。図１Ａ及びＣではオキシトシン抗体が反応した部位が黒色で示される。図１Ｂ及びＤでは組織構築状態が示される。これらの結果より、ヒト及びマウスの両方で、皮膚、特に表皮上層から角層にオキシトシンが存在することが明らかとなった。
【００２２】
図２は、ヒトの皮膚および培養ケラチノサイトについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２Ａはプライマーaとｂを使用したＰＣＲの結果で、予想される３９０ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。図２Ｂは図２ＡのＰＣＲで増幅されたＤＮＡの内部配列を確認するために行ったＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲの結果である。図２ＡのＰＣＲ反応液の一部をとって鋳型とし、プライマーｃとｄを使用したＰＣＲを行った結果、予想される２０１ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。用いたプライマーの組み合わせは、いずれもゲノム上のイントロンをはさむ位置にアニールするように設計されており、ここで検出されたバンドの長さが予想どおりであったことから、増幅されたｃＤＮＡはゲノム由来ではなく、ｍＲＮＡ由来であると推測される。すなわち、脳と同様にヒト皮膚および培養ケラチノサイトにおいて、オキシトシン前駆体のｍＲＮＡが発現していることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２３】
２．ケラチノサイトによるオキシトシンの産生の検討
２−１．方法
（ＡＴＰγｓ添加の影響の検討）
ケラチノサイトとして、継代数４までのヒト新生児由来表皮ケラチノサイト（クラボウ）を使用した。培養液はＤｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（インビトロジェン）を用いた。前記ケラチノサイトを、直径１０ｃｍのディッシュにコンフルエントになるまで、１日おきに培養液を交換しながら３７°Ｃで数日間培養した後、培養液中の塩化カルシウム濃度を１．８ｍＭに上げることにより分化を誘導した。その４５時間後に、各ディッシュ中の最終濃度が０、１０、３０、１００及び３００μＭとなるようにアデノシン ５’−（３−チオ）三リン酸四リチウム塩（Ｓｉｇｍａ、以下、「ＡＴＰγｓ」という。）を添加し、引き続き３７°Ｃで培養を継続した。ＡＴＰγｓの添加から１０分後に、培養液を回収し、オキシトシン量を以下のとおりＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ法によるオキシトシン定量
回収した培養液中のオキシトシンを逆相カラム（Ｃ１８ Ｓｅｐ―ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製及び濃縮し、溶出は６０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液で行った。具体的にはオキシトシンを含むカラム溶出液画分を凍結乾燥させた後、少量の緩衝液（ＥＩＡキットに含まれる）に再溶解し、培養液中オキシトシンを２０倍以上に濃縮した。その後、濃縮オキシトシン溶液中のオキシトシン濃度を、Ｏｘｙｔｏｃｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ）を使用する競合ＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の手順はキットに添付されたマニュアルの指示に従った。簡潔には、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルにはヤギ抗ウサギＩｇＧが不動化されており、これにウサギ抗オキシトシン抗体を結合させた。そして、オキシトシンを含むサンプルをアルカリフォスファターゼとコンジュゲートされたオキシトシンと混合してから抗オキシトシン抗体と結合させた。対照実験としてはサンプルのかわりに既知量のオキシトシンをアルカリフォスファターゼとコンジュゲートされたオキシトシンと混合した。アルカリフォスファターゼによる呈色反応の吸光度の測定を行って、既知量のオキシトシンによる競合阻害による吸光度の変化から片対数標準曲線を作成して、サンプルの吸光度に対応するオキシトシン量を決定した。
【００２５】
（ＥＧＴＡ添加の影響の検討）
０及び２ｍＭのエチレングリコール ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」という。和光純薬）を培地中にさらに添加した条件を設定した以外は、上述したのと同じ手順で同様の操作を行なった。ＥＧＴＡはＡＴＰγｓ添加の５分前から添加した。
【００２６】
２−２．結果
図３は、それぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示す棒グラフである。ＡＴＰγｓを添加しない条件ではオキシトシン濃度は１ｐｇ／ｍＬ程度であったが、ＡＴＰγｓの添加量の増加に伴いオキシトシン量も増大し、添加量３００μＭでは７ｐｇ／ｍＬを超える濃度となった。
【００２７】
図４は、２ｍＭのＥＧＴＡを含む培地中にそれぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示す棒グラフである。ＥＧＴＡを含む条件では、ＡＴＰγｓの添加量の増加に伴うオキシトシン量の増大が抑制された。
【００２８】
ＡＴＰγｓは、ＡＴＰの難分解性誘導体である。ＡＴＰは、そのケラチノサイトへの添加により濃度依存的にケラチノサイト内のＣａ２＋濃度の上昇を引き起こすことが知られている（Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２） ９０，４２−５１；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００４）３８０，３２９−３３８）。ＥＧＴＡは、Ｃａ２＋に高い親和性を有するキレート剤であり、本実施例ではＥＧＴＡを培地中に添加することにより培地中のＣａ２＋はＥＧＴＡに捕捉され、培地中のＣａ２＋濃度は極めて低いと考えられる。図３及び４の結果、ケラチノサイトへのＡＴＰγｓの添加は、Ｐ２Ｘ受容体等のような細胞膜のイオンチャネルを介して培地中のＣａ２＋をケラチノサイトの細胞質内に流入させることにより細胞内Ｃａ２＋濃度を増大させ、オキシトシン放出を促すと考えられる。以上より、ケラチノサイトは、細胞内Ｃａ２＋の増大を介してオキシトシンを放出すると考えられる。
【実施例３】
【００２９】
３．マッサージした皮膚によるオキシトシンの産生及び放出の検討
３−１．方法
実験にはヘアレスマウスＨＲ−１（Ｈｒｈｒ／Ｈｒｈｒ、１４週齢、雄）を用いた。マッサージ処置を施す場合は、背部の皮膚を採取し１．５ｃｍ×２．５ｃｍの大きさに切った後、テフロンメッシュ上に載せ、培養液ＭＣＤＢ１５３（Ｓｉｇｍａ）を入れた培養皿に浮かせた。３７℃インキュベーターで３時間培養後、皮膚組織片の角層上にウレタンゴムシートを敷き、その上から、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、重さ５３ｇ）をのせ、機械刺激をした。おもりの曲面がウレタンゴムシートに接するように置き培養皿ごとシーソー型振とう機（１分間に２３．５往復）にのせ、１時間おもりを転がし続けたものをマッサージ処置（Ｒｏｌｌｉｎｇ）とした。また、おもりの底面が接するように置き、１時間静置したものを荷重処置（Ｐｒｅｓｓ）とした。また無処置対照として、ウレタンゴムシートの上には何も載せずに同じ時間静置した。刺激後、ウレタンゴムシートを除去し、それぞれの皮膚を１．２５ｍＬの新しい培地に浮かべ、３７°Ｃで２４時間培養した。その後培養液を回収し、オキシトシン量を実施例２と同様にＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３０】
３−２．結果
図５は、マッサージ処置、荷重処置及び対照の無処置のそれぞれの群の皮膚の培養液から回収されたオキシトシンの測定結果を示す棒グラフである。それぞれの棒グラフは、それぞれの群における３個の皮膚組織片が放出したオキシトシン量の平均値を示す。それぞれの誤差棒は、３個の分析結果の標準偏差を示す。対照群のオキシトシン濃度の平均値は２０ｐｇ／ｍＬ未満であり、荷重処理群では対照群と同程度であったのに対して、マッサージ群では４０ｐｇ／ｍＬ程度であり対照群の約２倍の濃度であった。対照群のオキシトシン濃度の測定値とマッサージ群のオキシトシン濃度の測定値との間でスチューデントのｔ検定を実施したところ、危険率はｐ＜０．０１（Ｃｏｎｔ ｖｓ Ｒｏｌｌｉｎｇ：ｐ＝０．００５０； Ｃｏｎｔ ｖｓ Ｐｒｅｓｓ：ｐ＝０．７１８６； Ｐｒｅｓｓ ｖｓ Ｒｏｌｌｉｎｇ：ｐ＝０．００４４）と算出され、マッサージ群におけるオキシトシン濃度の増大の程度は、対照群と比較して統計学的に有意であった。この結果から、皮膚におけるオキシトシンの放出量がマッサージのような物理的刺激処理により増大することが明らかとなるとともに、皮膚におけるオキシトシンの産生量がマッサージにより増大する可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトの顔面の皮膚と、マウスＨＲ−１の皮膚との組織染色結果を示す顕微鏡写真。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによるオキシトシンｍＲＮＡの検出結果を示す、アガロースゲル電気泳動結果の写真。
【図３】それぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示すグラフ。
【図４】２ｍＭのＥＧＴＡを含む又は含まない培地中にそれぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示すグラフ。
【図５】対照群、荷重処置（Ｐｒｅｓｓ）群、マッサージ処置（Ｒｏｌｌｉｎｇ）群の皮膚の培養液から回収されたオキシトシンの分析結果を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法、具体的には、オキシトシン放出量を指標とする皮膚へのマッサージの効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マッサージは、血液循環の改善や筋肉の緊張の緩和を通じて心身をリラックスさせて快適にするので、ストレスの激しい生活を送る現代人に人気がある。しかし、快不快の判断には主観が入るため、マッサージ効果の評価は困難である。より効果的で効率的なマッサージ方法を開発するためには、まず、客観的なマッサージ効果の評価方法を確立する必要がある。
【０００３】
従来のマッサージ効果の評価方法には、体幹及び／又は顔面の筋緊張度を施術の前後に計測し、該筋緊張度の緩和の度合いを指標とする評価方法（特許文献１）や、皮膚表面を冷却又は加温した場合の皮膚血流量の変化率を指標とする評価方法（特許文献２）がある。また、唾液中の免疫グロブリンを測定することを特徴とする、マッサージ方法の評価法（特許文献３）や、全身的な生化学的指標として、マッサージの前後に唾液中の副腎皮質ホルモン量を測定し、その変化の割合を指標とするマッサージの評価方法（特許文献４）も知られている。
【特許文献１】特開２００６−３３４１８６
【特許文献２】特開２００８−１１３８７６
【特許文献３】特開平８−１５２５７
【特許文献４】特開平１１−２３５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、これらの指標は、血管や筋肉及び唾液腺のように、マッサージ刺激の影響が間接的に及ぶ組織、器官の反応を検出しているにすぎないのであって、マッサージ刺激を直接受ける皮膚の反応を検出しているわけではない。また、マッサージ方法には筋肉の凝りをほぐすタイプもあるが、皮膚表面を刺激するタイプもある。そこで、皮膚を刺激するマッサージの効果をより的確に評価するためには、マッサージの刺激を受けた皮膚の反応を検出する評価方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含む、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法を提供する。
【０００６】
本発明の評価方法において、前記物理的刺激処理はマッサージの場合がある。
【０００７】
本明細書において「物理的刺激処理」とは、圧力、熱、電気その他の物理的刺激を与える処理をいう。圧力による刺激には、皮膚を押したり、さすったり、なでたり、叩いたり、ひねったりすることによる刺激が含まれる。前記圧力による刺激は、ヒトの手又は足か、マッサージ用器具かにより皮膚に直接圧力を加えるマッサージによる刺激の場合がある。
【０００８】
オキシトシンは、９個のアミノ酸残基からなるペプチドホルモンである。オキシトシンは、大脳の視床下部の室傍核や視索上核に存在する大細胞性神経細胞で合成され、脳下垂体後葉から血中に放出されることが知られる。その生物学的活性として子宮収縮作用、乳汁射出作用等が知られる。また、近年、オキシトシンの鼻腔内投与により他人への信頼が増大すること（Ｋｏｓｆｅｌｄ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）、４３５：６７３−６７６）、オキシトシンの経鼻投与により恐怖感が減少すること（Ｋｉｒｓｃｈ Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００５）２５：１１４８９−９３）等が報告された。また、動物及びヒトでの研究から、脳のオキシトシンは、社会的認識記憶の形成、養育行動を含む社会的行動を調節し、不安神経症を含むストレス応答を下向き調節することが明らかとなった（東田陽博、蛋白質 核酸 酵素（２００７）、５２：１８３２−１８３９、Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｉ．Ｄ．、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００７）、５：２３１−２３３）。このようにオキシトシンは、従来より知られている生物学的活性に加えて、人間関係の維持に必要な高次の心の働きに関与する機能も有する物質であり、情動の改善に有効であると考えられる。
【０００９】
以下の実施例で詳しく説明するとおり、本発明は、オキシトシンと、オキシトシン前駆体をエンコードするｍＲＮＡとが皮膚に存在すること、皮膚に刺激を与えることにより皮膚からのオキシトシンの放出量が増大すること、皮膚からのオキシトシンの放出量は、刺激の与え方に依存して増大することの新規な発見に基づく。とくに、刺激の与え方に依存して皮膚からのオキシトシンの放出量が増大することから、オキシトシンはマッサージ効果の評価方法の指標として有望である。
【００１０】
また、オキシトシンは上述のように経鼻投与により信頼感の増大、恐怖感の減少等の効果を発揮する物質であるので、皮膚に刺激を与えることによって放出されたオキシトシンは、快適さというマッサージの効果に直接関与する可能性がある。
【００１１】
そこで、本発明の評価方法は、心身が快適になるというマッサージの最も重要な効果に関与する可能性がある物質を指標とするため、マッサージの効果をより正確に評価できることが期待される。
【００１２】
本発明は、以下の実施例で示すとおり、皮膚組織、特に、表皮上層から角層にかけての細胞にオキシトシンが存在するとの知見に基づく。したがって、本発明において物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片は、少なくとも表皮上層から角層にかけての細胞を含む。
【００１３】
本明細書において培養液中に放出された皮膚組織片由来のオキシトシンの量とは、皮膚への物理的刺激処理前に皮膚細胞内で生成され、該刺激処理後、培養下で細胞外に放出されたオキシトシンの量と、前記刺激処理後、培養下で皮膚細胞内で生成され、細胞外に放出されたオキシトシンの量との和から、培養液中で分解されたオキシトシンの量と、培養下で皮膚細胞に吸着または取り込まれたオキシトシンの量とを引いた差の量をいう。
【００１４】
本発明における「培養」は、刺激を与えた皮膚からオキシトシンが培養液中に放出されるのに十分な培養条件であれば、どのような培養条件で行なっても構わない。前記培養条件は、培養時間、培養温度等を含む。前記培養時間は、皮膚中のオキシトシンを培養液中に放出させるための十分な時間を確保することが好ましい。前記培養条件は、３７°Ｃで２４時間培養を行なう場合がある。
【００１５】
本発明における培養液は、本発明の皮膚から単離された皮膚組織片を浸漬し培養することができるものであって、皮膚組織片の細胞におけるオキシトシン生成及び細胞外への放出を妨げたり、培養中に皮膚組織片の細胞が死んで細胞内のタンパク質分解酵素が培養液中に放出されて培養液中のオキシトシンを分解することが起きないものであれば、どのような組成の培養液であってもかまわない。ただし、元来オキシトシンを含有する血清や脳下垂体抽出物を添加した培養液は、皮膚由来のオキシトシンの定量に影響するため用いない。好ましくは前記培養液は、Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（インビトロジェン）または Ｅｐｉｌｉｆｅ ＡＯＦ Ｋｉｔ （インビトロジェン）の場合がある。
【００１６】
本発明における培養液中に放出されたオキシトシンを定量するステップは、当業者に周知の方法により実行される場合がある。例えば前記測定は、前記培養液を逆相クロマトグラフィその他の方法によってオキシトシン分画を精製し、これを適当なバッファーに再溶解させることによって、濃縮と溶媒液の変更とを行った上で、ＥＬＩＳＡ法により定量する場合がある。前記ＥＬＩＳＡ法は、例えばＯｘｙｔｏｃｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施される場合がある。代替的には、前記濃縮と溶媒液の変更とを行った後、オキシトシンを蛍光物質で標識し、ＨＰＬＣ法により分析しオキシトシンの溶出ピークを定量する場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下の実施例により本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
１．オキシトシンの存在部位についての検討
１−１．方法
免疫組織化学的な実験には、ヒト（ボランティア提供者３名、年齢５５−６６才、女性）の皮膚、及びヘアレスマウスＨＲ−１（Ｈｒｈｒ／Ｈｒｈｒ、７週齢、雄）の背中の皮膚組織片を得て、凍結ブロックを作製し、６μｍ厚の組織切片を薄切した。切片はメタノールで固定後、抗オキシトシン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と蛍光標識２次抗体（インビトロジェン）を用いて染色し、その蛍光画像を取得した。
【００１９】
分子遺伝学的な実験には、ＲＴ−ＰＣＲ法によりオキシトシン前駆体ｍＲＮＡの検出を行った。ＰＣＲ反応の鋳型として、ヒト新生児由来の表皮ケラチノサイト（クラボウ）から作製したｃＤＮＡと、ヒト皮膚由来のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｃ．）を用いた。ＰＣＲ反応のポジティブコントロールとしてヒト脳由来のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。オキシトシンｃＤＮＡの増幅に用いたプライマーの配列を表１に示す。表１の配列ａ、ｂ、ｃ及びｄのヌクレオチド配列はそれぞれＰＣＲ反応は例えばＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて添付のプロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ産物は分子量マーカー（１００ｂｐラダー、東洋紡）とともにアガロースゲル電気泳動法で分離し、臭化エチジウムで染色したバンドの蛍光画像を取得した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
１−２．結果
図１は、ヒトの顔面の皮膚組織切片（図１Ａ及びＢ）と、ヘアレスマウスＨＲ−１系統の皮膚組織切片（図１Ｃ及びＤ）とについての抗オキシトシン抗体による染色パターンを示す免疫組織化学的染色標本の顕微鏡写真（図１Ａ及びＣ）と、それぞれに隣接する組織切片のヘマトキシリン−エオジン染色標本の顕微鏡写真（図１Ｂ及びＤ）である。図１Ａ及びＣではオキシトシン抗体が反応した部位が黒色で示される。図１Ｂ及びＤでは組織構築状態が示される。これらの結果より、ヒト及びマウスの両方で、皮膚、特に表皮上層から角層にオキシトシンが存在することが明らかとなった。
【００２２】
図２は、ヒトの皮膚および培養ケラチノサイトについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２Ａはプライマーaとｂを使用したＰＣＲの結果で、予想される３９０ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。図２Ｂは図２ＡのＰＣＲで増幅されたＤＮＡの内部配列を確認するために行ったＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲの結果である。図２ＡのＰＣＲ反応液の一部をとって鋳型とし、プライマーｃとｄを使用したＰＣＲを行った結果、予想される２０１ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。用いたプライマーの組み合わせは、いずれもゲノム上のイントロンをはさむ位置にアニールするように設計されており、ここで検出されたバンドの長さが予想どおりであったことから、増幅されたｃＤＮＡはゲノム由来ではなく、ｍＲＮＡ由来であると推測される。すなわち、脳と同様にヒト皮膚および培養ケラチノサイトにおいて、オキシトシン前駆体のｍＲＮＡが発現していることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２３】
２．ケラチノサイトによるオキシトシンの産生の検討
２−１．方法
（ＡＴＰγｓ添加の影響の検討）
ケラチノサイトとして、継代数４までのヒト新生児由来表皮ケラチノサイト（クラボウ）を使用した。培養液はＤｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（インビトロジェン）を用いた。前記ケラチノサイトを、直径１０ｃｍのディッシュにコンフルエントになるまで、１日おきに培養液を交換しながら３７°Ｃで数日間培養した後、培養液中の塩化カルシウム濃度を１．８ｍＭに上げることにより分化を誘導した。その４５時間後に、各ディッシュ中の最終濃度が０、１０、３０、１００及び３００μＭとなるようにアデノシン ５’−（３−チオ）三リン酸四リチウム塩（Ｓｉｇｍａ、以下、「ＡＴＰγｓ」という。）を添加し、引き続き３７°Ｃで培養を継続した。ＡＴＰγｓの添加から１０分後に、培養液を回収し、オキシトシン量を以下のとおりＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ法によるオキシトシン定量
回収した培養液中のオキシトシンを逆相カラム（Ｃ１８ Ｓｅｐ―ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製及び濃縮し、溶出は６０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液で行った。具体的にはオキシトシンを含むカラム溶出液画分を凍結乾燥させた後、少量の緩衝液（ＥＩＡキットに含まれる）に再溶解し、培養液中オキシトシンを２０倍以上に濃縮した。その後、濃縮オキシトシン溶液中のオキシトシン濃度を、Ｏｘｙｔｏｃｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ）を使用する競合ＥＬＩＳＡ法により測定した。測定の手順はキットに添付されたマニュアルの指示に従った。簡潔には、９６穴マルチウェルプレートの各ウェルにはヤギ抗ウサギＩｇＧが不動化されており、これにウサギ抗オキシトシン抗体を結合させた。そして、オキシトシンを含むサンプルをアルカリフォスファターゼとコンジュゲートされたオキシトシンと混合してから抗オキシトシン抗体と結合させた。対照実験としてはサンプルのかわりに既知量のオキシトシンをアルカリフォスファターゼとコンジュゲートされたオキシトシンと混合した。アルカリフォスファターゼによる呈色反応の吸光度の測定を行って、既知量のオキシトシンによる競合阻害による吸光度の変化から片対数標準曲線を作成して、サンプルの吸光度に対応するオキシトシン量を決定した。
【００２５】
（ＥＧＴＡ添加の影響の検討）
０及び２ｍＭのエチレングリコール ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」という。和光純薬）を培地中にさらに添加した条件を設定した以外は、上述したのと同じ手順で同様の操作を行なった。ＥＧＴＡはＡＴＰγｓ添加の５分前から添加した。
【００２６】
２−２．結果
図３は、それぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示す棒グラフである。ＡＴＰγｓを添加しない条件ではオキシトシン濃度は１ｐｇ／ｍＬ程度であったが、ＡＴＰγｓの添加量の増加に伴いオキシトシン量も増大し、添加量３００μＭでは７ｐｇ／ｍＬを超える濃度となった。
【００２７】
図４は、２ｍＭのＥＧＴＡを含む培地中にそれぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示す棒グラフである。ＥＧＴＡを含む条件では、ＡＴＰγｓの添加量の増加に伴うオキシトシン量の増大が抑制された。
【００２８】
ＡＴＰγｓは、ＡＴＰの難分解性誘導体である。ＡＴＰは、そのケラチノサイトへの添加により濃度依存的にケラチノサイト内のＣａ２＋濃度の上昇を引き起こすことが知られている（Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２） ９０，４２−５１；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００４）３８０，３２９−３３８）。ＥＧＴＡは、Ｃａ２＋に高い親和性を有するキレート剤であり、本実施例ではＥＧＴＡを培地中に添加することにより培地中のＣａ２＋はＥＧＴＡに捕捉され、培地中のＣａ２＋濃度は極めて低いと考えられる。図３及び４の結果、ケラチノサイトへのＡＴＰγｓの添加は、Ｐ２Ｘ受容体等のような細胞膜のイオンチャネルを介して培地中のＣａ２＋をケラチノサイトの細胞質内に流入させることにより細胞内Ｃａ２＋濃度を増大させ、オキシトシン放出を促すと考えられる。以上より、ケラチノサイトは、細胞内Ｃａ２＋の増大を介してオキシトシンを放出すると考えられる。
【実施例３】
【００２９】
３．マッサージした皮膚によるオキシトシンの産生及び放出の検討
３−１．方法
実験にはヘアレスマウスＨＲ−１（Ｈｒｈｒ／Ｈｒｈｒ、１４週齢、雄）を用いた。マッサージ処置を施す場合は、背部の皮膚を採取し１．５ｃｍ×２．５ｃｍの大きさに切った後、テフロンメッシュ上に載せ、培養液ＭＣＤＢ１５３（Ｓｉｇｍａ）を入れた培養皿に浮かせた。３７℃インキュベーターで３時間培養後、皮膚組織片の角層上にウレタンゴムシートを敷き、その上から、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、重さ５３ｇ）をのせ、機械刺激をした。おもりの曲面がウレタンゴムシートに接するように置き培養皿ごとシーソー型振とう機（１分間に２３．５往復）にのせ、１時間おもりを転がし続けたものをマッサージ処置（Ｒｏｌｌｉｎｇ）とした。また、おもりの底面が接するように置き、１時間静置したものを荷重処置（Ｐｒｅｓｓ）とした。また無処置対照として、ウレタンゴムシートの上には何も載せずに同じ時間静置した。刺激後、ウレタンゴムシートを除去し、それぞれの皮膚を１．２５ｍＬの新しい培地に浮かべ、３７°Ｃで２４時間培養した。その後培養液を回収し、オキシトシン量を実施例２と同様にＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００３０】
３−２．結果
図５は、マッサージ処置、荷重処置及び対照の無処置のそれぞれの群の皮膚の培養液から回収されたオキシトシンの測定結果を示す棒グラフである。それぞれの棒グラフは、それぞれの群における３個の皮膚組織片が放出したオキシトシン量の平均値を示す。それぞれの誤差棒は、３個の分析結果の標準偏差を示す。対照群のオキシトシン濃度の平均値は２０ｐｇ／ｍＬ未満であり、荷重処理群では対照群と同程度であったのに対して、マッサージ群では４０ｐｇ／ｍＬ程度であり対照群の約２倍の濃度であった。対照群のオキシトシン濃度の測定値とマッサージ群のオキシトシン濃度の測定値との間でスチューデントのｔ検定を実施したところ、危険率はｐ＜０．０１（Ｃｏｎｔ ｖｓ Ｒｏｌｌｉｎｇ：ｐ＝０．００５０； Ｃｏｎｔ ｖｓ Ｐｒｅｓｓ：ｐ＝０．７１８６； Ｐｒｅｓｓ ｖｓ Ｒｏｌｌｉｎｇ：ｐ＝０．００４４）と算出され、マッサージ群におけるオキシトシン濃度の増大の程度は、対照群と比較して統計学的に有意であった。この結果から、皮膚におけるオキシトシンの放出量がマッサージのような物理的刺激処理により増大することが明らかとなるとともに、皮膚におけるオキシトシンの産生量がマッサージにより増大する可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトの顔面の皮膚と、マウスＨＲ−１の皮膚との組織染色結果を示す顕微鏡写真。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによるオキシトシンｍＲＮＡの検出結果を示す、アガロースゲル電気泳動結果の写真。
【図３】それぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示すグラフ。
【図４】２ｍＭのＥＧＴＡを含む又は含まない培地中にそれぞれの濃度のＡＴＰγｓを添加し培養した後の培養液中のオキシトシン濃度の分析結果を示すグラフ。
【図５】対照群、荷重処置（Ｐｒｅｓｓ）群、マッサージ処置（Ｒｏｌｌｉｎｇ）群の皮膚の培養液から回収されたオキシトシンの分析結果を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含むことを特徴とする、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法。
【請求項２】
前記物理的刺激処理はマッサージであることを特徴とする、請求項１に記載の評価方法。
【請求項１】
物理的刺激処理を施された皮膚から単離された皮膚組織片を培養液中で培養するステップか、物理的刺激処理を施さない皮膚から単離された皮膚組織片に物理的刺激処理を施してから培養するステップかのいずれかと、前記培養液中に放出された前記皮膚組織片由来のオキシトシンを定量するステップとを含むことを特徴とする、皮膚への物理的刺激処理の効果の評価方法。
【請求項２】
前記物理的刺激処理はマッサージであることを特徴とする、請求項１に記載の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１１７２３２（Ｐ２０１０−１１７２３２Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９０４０８（Ｐ２００８−２９０４０８）
【出願日】平成２０年１１月１２日（２００８．１１．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１２日（２００８．１１．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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