マツノマダラカミキリ由来の新規キチナーゼ
【課題】
本発明は、病害虫に対して有効で、かつ植物体の外部から与えることが可能な殺生物剤の成分として、新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにキチナーゼの生産方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
上記課題の解決のため、本発明は、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）に由来する新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにキチナーゼの生産方法を提供する。
本発明は、病害虫に対して有効で、かつ植物体の外部から与えることが可能な殺生物剤の成分として、新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにキチナーゼの生産方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
上記課題の解決のため、本発明は、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）に由来する新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質、並びにキチナーゼの生産方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病害虫駆除用に用いられる殺生物剤の新規成分として有用なキチナーゼに関するものであり、詳しくは、松食い虫の媒介昆虫として知られるマツノマダラカミキリに由来する新規なキチナーゼ遺伝子及び該遺伝子がコードするキチナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンを構成単位とする多糖類の一種キチンの加水分解反応を触媒する酵素である。キチンは甲殻類の殻や真菌類の細胞壁を構成する成分であり、その分解産物であるアセチルグルコサミンや脱アセチル化で得られるキトサン等がいわゆる健康食品の素材として高い利用価値を持つことから、これを加水分解するキチナーゼ生産微生物の利用法や、種々の生物から単離されたキチナーゼ遺伝子などが提示されている（特許文献１−５）。
【０００３】
一方で、キチンが作物の病害虫や病原性微生物の構成成分であり、植物の生体防御機構がこのキチナーゼを含むことから、キチナーゼを組み込んだ「トランスジェニック植物」の形での利用方法も提示されている（特許文献６−９）。これらの試みは、種々の生物、例えば真菌類や耐病性のある植物からキチナーゼ遺伝子を単離して植物細胞に組み込み、遺伝子組み換え植物体内でキチナーゼを発現させることで、植物に耐病性や耐害虫性を持たせようとするものであった。しかしながら、遺伝子組み換え植物に対しては依然として社会的な抵抗感が根強くあり、また全ての植物に遺伝子組み換え技術を適用するのは困難であることから、対象となる生物自体への遺伝子の組み込みなど細胞の形質転換を伴わず、しかもヒトをはじめとする哺乳動物に無害であり、かつ効果の高い殺生物剤（殺菌・殺虫剤等）の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００６−０２５７０１ 高活性耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子
【特許文献２】特開２００４−０４１０３５ Ｎ‐アセチルグルコサミンの製造方法
【特許文献３】特開２００４−２９８１２７ キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、プラスミド、それを含む微生物及びそれを用いたキチナーゼの製造方法
【特許文献４】特開２００２−２７２４５２ バークホルデリア・セパシア、キチナーゼ、キチナーゼの製法及びキチンオリゴ糖の製法
【特許文献５】特開平９−２９９０９１ キチナーゼをコードするＤＮＡ及びキチナーゼの製造方法
【特許文献６】特開２００６−０７５１２５ キチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体
【特許文献７】特開２００３−２５０３７０ 病害抵抗性イネ科植物
【特許文献８】特開２０００−９３０２８ ブドウ類の菌類病抵抗性を増強する方法
【特許文献９】特開平５−８４０８７ アズキのエチレンで誘導される酸性キチナーゼ
【特許文献１０】ＷＯ２００３／０７２６０９ ダニのキチナーゼ
【非特許文献１】Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０（１）：２１９−２２９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明者らは、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）をモデル生物とし、いわゆる農薬や抗真菌剤などとして外部から与えることが可能な殺生物剤の検討を行った。その中でカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来のキチナーゼ遺伝子から合成したキチナーゼをマツノマダラカミキリに投与して良好な結果を得ている（非特許文献１）。しかし本発明者らが過去において昆虫から見いだしたキチナーゼ（キチナーゼＡ，Ｂ）は、その構造中にキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）を持っておらず、そのために殺虫効果が不十分なケースも観察された。そこで、更に効果の高い殺生物剤の開発のためにはＣＢＤを持ったキチナーゼが不可欠であるとの推測から、ＣＢＤを含んだ昆虫のキチナーゼに着目した。本発明者らは種々の昆虫からキチナーゼ遺伝子を探索し、その結果マツノマダラカミキリ自身からＣＢＤを含んだ形のキチナーゼ遺伝子を単離する事に初めて成功し、これが殺生物剤として極めて有効であることを見いだして、本発明を完成した。
【０００５】
従来、マツノマダラカミキリのＣＢＤを含んだキチナーゼ遺伝子は知られておらず、本発明者らによって初めて解明された新規な遺伝子である。また昆虫由来のキチナーゼとしても、本発明者が明らかにした以外ではダニのキチナーゼ（特許文献１０）などが提示されるにとどまっており、作物などに害を与える昆虫由来のキチナーゼの利用は知られていない。本発明は、マツノマダラカミキリに由来する新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質すなわちキチナーゼ、並びに該キチナーゼの生産方法を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち本発明の第１の態様は、マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来のキチナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、配列番号２で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、配列番号３で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、配列番号４で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の遺伝子を組み込んだベクターを提供する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載のベクターを含んだ形質転換細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、第６の態様に記載の形質転換細胞を提供する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、第１から第４のうちいずれか１つの態様に記載の遺伝子がコードする、マツノマダラカミキリのキチナーゼを提供する。
【００１４】
本発明の第９の態様は、配列番号５で示されるアミノ酸配列、または配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１５】
本発明の第１０の態様は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、または配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１６】
本発明の第１１の態様は、配列番号７で示されるアミノ酸配列、または配列番号７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１７】
本発明の第１２の態様は、配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１８】
本発明の第１３の態様は、第６または第７の態様に記載の形質転換細胞を用いた、キチナーゼの生産方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１４の態様は、第９から第１２の態様のうちいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分とする、殺生物剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の提供する新規キチナーゼ遺伝子、その遺伝子を含むベクターやベクターを導入した形質転換細胞、並びに新規キチナーゼ遺伝子がコードするタンパク質を用いることにより、病害虫に対する新規な殺生物剤として利用可能な新規加水分解酵素を製造することが可能となる。本発明が提供する遺伝子のコードするタンパク質は、昆虫類のキチン質を特異的に分解可能な酵素であり、ヒトを初めとする哺乳動物やマツなどの高等植物はキチンを体内に持っていないため、その効果は極めて特異的である事が期待される。すなわち本発明の提供する遺伝子及びタンパク質は、これまで用いられてきた化学農薬に替わりうる新たな殺生物剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明を利用するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、配列番号１で示される塩基配列、または配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来の新規キチナーゼ遺伝子を提供する。本発明は山口県において甚大な被害を出している松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリに着目し、この生物が持っている（脱皮などの際に働く）キチナーゼをコードする遺伝子をクローニングして利用可能としたものである。キチンは昆虫類など節足動物の体構造構成成分であり、加水分解によってこれを選択的に切断するキチナーゼは他種生物に害を与えることなく、標的とする病害虫、一般には甲虫類、好適にはマツノマダラカミキリを選択的に除去可能な新規殺生物剤の成分として利用可能な酵素である。塩基配列には個体差もあり、配列番号１で示した配列において１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されることも考えられるが、これらの場合にあってもコドンの読み枠をずらさない変異（置換）であって、更にアミノ酸配列の置換につながらない変異、あるいはアミノ酸配列が置換されても酵素活性に影響を与えない変異であれば、キチナーゼをコードする遺伝子としての利用には問題なく、またコドンの読み枠をずらす変異（欠失、付加）であってもそのコードするタンパク質が酵素活性を保持していれば上記同様問題なく利用することが可能である。おおよその目安として、配列番号１の塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子であれば、本発明の目的に利用可能である。
【００２２】
下記実施例に述べるとおり、本発明者らが明らかにしたマツノマダラカミキリキチナーゼ遺伝子（配列番号１、概要は図２に記載）は、３つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（Ｕｎｉｔ３，４，５）と１つのＣｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有するという極めて特徴的な構造を有していることが明らかとなった。すなわち配列番号１で示した遺伝子の一部、例えば配列番号２，３及び４（図２Ｂ，Ｃ，Ｄ）で示した、ＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎを少なくとも１つ有する部分配列もまた、キチナーゼ遺伝子として働く単位として捉える事が可能であり、これもまた本発明に含まれるべきものである。
【００２３】
本発明の実施の態様としては、上述の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、更にこのベクターを宿主となる細胞に導入して形質転換細胞を作成し、この形質転換細胞に遺伝子のコードするタンパク質を発現させて利用することが好ましい。この場合においてベクターとはプラスミドベクターやウィルスベクターなど、遺伝子導入のために分子生物学において用いられているものであれば特にその種類は問わず、何ら本発明を限定するものでは無いが、例えば複製起点と抗生物質耐性遺伝子とインサートチェック（Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のためのＬａｃＺ遺伝子と、インサート切り出しのための複数制限酵素サイトを有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどはその一例である。また形質転換に用いる細胞も、分子生物学で通常用いられているものであればどの様なものでも良く、特に本発明を限定するものでは無いが、例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）、昆虫細胞−バキュロウィルス系、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの系が利用可である。中でもメタノール資化性酵母の系は、異種タンパク質の分泌生産において、生産性の高さと制御の容易さから特に好ましく、本発明の実施においても非常に好適である。また本発明の遺伝子は、大量発現させて産物そのものを殺生物剤の有効成分として利用しようとするものであるが、勿論植物細胞に導入し、いわゆる遺伝子組み換えによって「病気に強い植物」を作出するためにも利用可能であり、その場合は宿主となる植物の細胞を培養してこれに分子生物学で通常用いられている手法により遺伝子を導入し、導入細胞から植物体を形成させれば良い。
【００２４】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質、好適には配列番号５で示したアミノ酸配列、または配列番号５で示したアミノ酸配列と９０％以上の相同性を持つタンパク質も、本発明に含まれるべきものである。遺伝子に変異がある場合と同様に、配列番号５に記載のアミノ酸配列に１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは挿入されたものも、本発明の範囲内である。実質的に酵素活性を保持しているならば、アミノ酸変異の数や場所は問わず、本発明を限定するものではない。
【００２５】
また上記の通り、本発明は複数のユニットからなるポリペプチドをコードしているのであるから、配列番号５で示したアミノ酸配列の一部、好適には配列番号５から８のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質（図２Ｂ〜Ｄ参照）もまた、キチナーゼとして作用する最小の単位としてＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎを少なくとも１つ有しており、本発明の範囲内に含まれるべきものである。
【００２６】
上述の形質転換細胞を大量培養し、全タンパク質中から本発明に係るキチナーゼを精製し、これを適切な緩衝液や展着剤などと混合することによって、病害虫に効果のある殺生物剤を製造することも可能となる。対象となる生物は特に限定は無いが、主に作物に害を与える昆虫のうち甲虫類が対象としては挙げられ、個々の酵素の反応特異性などを考慮すれば、マツノマダラカミキリが好適である。タンパク質の精製については、分子生物学で通常用いられている手法の中から適宜選択すれば良く、殺生物剤における緩衝液や展着剤などの補助成分についても目的に合わせて適宜組み合わせれば良く、どちらも本発明を限定するものではない。また、本発明のキチナーゼを殺生物剤として用いる方法も特に限定は無いが、一般に松などの被害を防止する目的で植物に噴霧する方法や、害虫が好む餌に混合して散布する方法、さらには、展着剤と混合して植物の幹などに塗布する方法などが考えられる。以下、本発明を実施例により更に詳しく述べるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
（材料及びＲＮＡの抽出） 本実施例においては、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）の前蛹をＲＮＡ抽出のために用いた。液体窒素で凍らせたマツノマダラカミキリ前蛹２０ｍｇを乳鉢ですり潰し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ｍＲＮＡを抽出した。
【００２８】
（３’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）マツノマダラカミキリが発現しているキチナーゼのｍＲＮＡの３’側配列を明らかにするため、３’−ＲＡＣＥ（３’ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を用いた解析を行った。前述のｍＲＮＡを鋳型とし、３’側のプライマーとしてはＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌに相補的なＯｌｉｇｏ ｄＴにアダプター配列を付加したもの（配列番号９）を用いて、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、最初のｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、５’側のプライマーとして、Ｆａｍｉｌｙ １８キチナーゼに共通のアミノ酸配列から作成したプライマー（配列番号１０）を、３’側のプライマーとして前記アダプター配列に相補的な配列（配列番号１１）を用い、ＰＣＲ（２．５Ｕ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１００ｐｍｏｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ）を行った。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＣＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングし、塩基配列を決定した。本実施例で用いたプライマーの一覧を表１に示す。
【表１】
【００２９】
（５’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）ｍＲＮＡの５’側の塩基配列を明らかにするために、前述の全ｍＲＮＡを鋳型とし、３’−ＲＡＣＥで明らかにした配列中からプライマー（配列番号１２）を設計して、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、５’側のｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、５’側のプライマーとしてはＣＢＤにおける保存領域から設計したプライマー（配列番号１３）、３’側のプライマーとしては配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は３’−ＲＡＣＥ同様サブクローニング後にシークエンスを行い、塩基配列を決定した。塩基配列と他種生物の遺伝子との比較から、この配列がＣＢＤである事が示された。
【００３０】
上記で明らかになった配列の更に５’上流の配列を明らかにするために、５’側のプライマーとして他種生物のキチナーゼで共通の５’側配列を用い（配列番号１０）、３’側のプライマーとして３’−ＲＡＣＥで明らかになった配列より設計したプライマー（配列番号１２）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには、長い遺伝子断片を高い信頼性で増幅させるためにＥｌｏｎｇａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ．）を用いた。以後のＰＣＲは全てこのＥｌｏｎｇａｓｅを用いて行っている。ＰＣＲの結果、通常予想される単一の産物では無く、分子量の異なる３つの産物が増幅された。アガロースゲル電気泳動により分離した写真を図１に示す。図中レーンＭは分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄφ×１７４ＨａｅＩＩＩ）を表し、レーン１がＰＣＲにより増幅したキチナーゼ遺伝子を泳動したものである。ＰＣＲ産物は４８００ｂｐ、２５００ｂｐ、１２００ｂｐの３つであり、特にバンドがはっきりと確認された２５００ｂｐと１２００ｂｐの２つについてサブクローニングを行い、シークエンスを行った。この情報に基づき、ｃＤＮＡを鋳型にして、以下プライマーの組み合わせとして（配列番号１０、配列番号１４）、（配列番号１５、配列番号１６）、（配列番号１７、配列番号１８）で各々ＰＣＲを行って解析を進めた結果、マツノマダラカミキリのキチナーゼｍＲＮＡは複数ユニットからなるアミノ酸配列をコードしており、図２に示す構造を持っている事が明らかとなった。
【００３１】
図２において、Ｕｎｉｔ３，４…は便宜上名付けた領域名であり、ＣＢＤはキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）を表す。ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）による相同性検索の結果、各ユニットはキチナーゼのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎであり、ＣＢＤを２つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（４，５）が挟み、更に上流にもう一つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（３）があるという極めて特徴的な構造を有している事が明らかとなった。この中で特に、ＣＢＤを挟んだＵｎｉｔ４とＵｎｉｔ５について解析を行った結果を表２に示す。表中Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ａ，Ｂはそれぞれ、本発明者らが過去に単離したマツノマダラカミキリキチナーゼＡ，Ｂ遺伝子（ＣＢＤを持たない）との比較結果を示すが、塩基配列レベルで相同性が５０％前後であることから、本発明におけるキチナーゼ遺伝子が全く新規な遺伝子である事が示された。Ｕｎｉｔ４と５の間の相同性は遺伝子で６６．５２％、アミノ酸で６９．０５％であった。またＣＢＤについては、塩基数１４４ｂｐ、推定される分子量は５．６ｋＤａと算定された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の提供する新規キチナーゼ遺伝子及びこの遺伝子がコードするタンパク質は、病害虫に対して特異的に作用する殺生物剤の製造を可能にするものであり、農業分野においてこれまでの化学農薬に替わる新たな農薬の有効成分として利用可能である。また本発明の遺伝子は、遺伝子組み換えによって植物に病害虫に対する抵抗性を付与するのにも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マツノマダラカミキリキチナーゼの５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲの結果を示す。図中レーンＭは分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄφ×１７４ＨａｅＩＩＩ）を表し、レーン１がＰＣＲ産物を泳動したものである。ＰＣＲにより、４８００ｂｐ、２４００ｂｐ、１２００ｂｐの３つの遺伝子断片が増幅された。
【図２】３’−ＲＡＣＥ，５’−ＲＡＣＥによって明らかとなった、本発明のマツノマダラカミキリキチナーゼの遺伝子（ｍＲＮＡ）の構造を模式的に表す。今回明らかになったマツノマダラカミキリキチナーゼのｍＲＮＡは、３つのＣａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ（Ｕｎｉｔ３，４，５と便宜上命名）と１つのキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）からなるタンパク質をコードしていることが明らかとなった（Ａ）。Ｂ，Ｃ，Ｄはそれぞれ、本発明の応用時において取り得る「キチナーゼとして機能するタンパク質をコードする遺伝子」の分子デザインを表す。最小の単位として、Ｃ，Ｄの様にＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎを１つ持っていれば、キチナーゼとしての機能は保持されると考えられる。また図中ＡＡ…ＡはＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病害虫駆除用に用いられる殺生物剤の新規成分として有用なキチナーゼに関するものであり、詳しくは、松食い虫の媒介昆虫として知られるマツノマダラカミキリに由来する新規なキチナーゼ遺伝子及び該遺伝子がコードするキチナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンを構成単位とする多糖類の一種キチンの加水分解反応を触媒する酵素である。キチンは甲殻類の殻や真菌類の細胞壁を構成する成分であり、その分解産物であるアセチルグルコサミンや脱アセチル化で得られるキトサン等がいわゆる健康食品の素材として高い利用価値を持つことから、これを加水分解するキチナーゼ生産微生物の利用法や、種々の生物から単離されたキチナーゼ遺伝子などが提示されている（特許文献１−５）。
【０００３】
一方で、キチンが作物の病害虫や病原性微生物の構成成分であり、植物の生体防御機構がこのキチナーゼを含むことから、キチナーゼを組み込んだ「トランスジェニック植物」の形での利用方法も提示されている（特許文献６−９）。これらの試みは、種々の生物、例えば真菌類や耐病性のある植物からキチナーゼ遺伝子を単離して植物細胞に組み込み、遺伝子組み換え植物体内でキチナーゼを発現させることで、植物に耐病性や耐害虫性を持たせようとするものであった。しかしながら、遺伝子組み換え植物に対しては依然として社会的な抵抗感が根強くあり、また全ての植物に遺伝子組み換え技術を適用するのは困難であることから、対象となる生物自体への遺伝子の組み込みなど細胞の形質転換を伴わず、しかもヒトをはじめとする哺乳動物に無害であり、かつ効果の高い殺生物剤（殺菌・殺虫剤等）の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開２００６−０２５７０１ 高活性耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子
【特許文献２】特開２００４−０４１０３５ Ｎ‐アセチルグルコサミンの製造方法
【特許文献３】特開２００４−２９８１２７ キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、プラスミド、それを含む微生物及びそれを用いたキチナーゼの製造方法
【特許文献４】特開２００２−２７２４５２ バークホルデリア・セパシア、キチナーゼ、キチナーゼの製法及びキチンオリゴ糖の製法
【特許文献５】特開平９−２９９０９１ キチナーゼをコードするＤＮＡ及びキチナーゼの製造方法
【特許文献６】特開２００６−０７５１２５ キチナーゼ遺伝子が導入されたシクラメン属植物の形質転換体
【特許文献７】特開２００３−２５０３７０ 病害抵抗性イネ科植物
【特許文献８】特開２０００−９３０２８ ブドウ類の菌類病抵抗性を増強する方法
【特許文献９】特開平５−８４０８７ アズキのエチレンで誘導される酸性キチナーゼ
【特許文献１０】ＷＯ２００３／０７２６０９ ダニのキチナーゼ
【非特許文献１】Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０（１）：２１９−２２９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明者らは、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）をモデル生物とし、いわゆる農薬や抗真菌剤などとして外部から与えることが可能な殺生物剤の検討を行った。その中でカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来のキチナーゼ遺伝子から合成したキチナーゼをマツノマダラカミキリに投与して良好な結果を得ている（非特許文献１）。しかし本発明者らが過去において昆虫から見いだしたキチナーゼ（キチナーゼＡ，Ｂ）は、その構造中にキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）を持っておらず、そのために殺虫効果が不十分なケースも観察された。そこで、更に効果の高い殺生物剤の開発のためにはＣＢＤを持ったキチナーゼが不可欠であるとの推測から、ＣＢＤを含んだ昆虫のキチナーゼに着目した。本発明者らは種々の昆虫からキチナーゼ遺伝子を探索し、その結果マツノマダラカミキリ自身からＣＢＤを含んだ形のキチナーゼ遺伝子を単離する事に初めて成功し、これが殺生物剤として極めて有効であることを見いだして、本発明を完成した。
【０００５】
従来、マツノマダラカミキリのＣＢＤを含んだキチナーゼ遺伝子は知られておらず、本発明者らによって初めて解明された新規な遺伝子である。また昆虫由来のキチナーゼとしても、本発明者が明らかにした以外ではダニのキチナーゼ（特許文献１０）などが提示されるにとどまっており、作物などに害を与える昆虫由来のキチナーゼの利用は知られていない。本発明は、マツノマダラカミキリに由来する新規なキチナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質すなわちキチナーゼ、並びに該キチナーゼの生産方法を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち本発明の第１の態様は、マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来のキチナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、配列番号２で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００８】
本発明の第３の態様は、配列番号３で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、配列番号４で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子を提供する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、第１から第４の態様のうちいずれか１つに記載の遺伝子を組み込んだベクターを提供する。
【００１１】
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載のベクターを含んだ形質転換細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第７の態様は、宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、第６の態様に記載の形質転換細胞を提供する。
【００１３】
本発明の第８の態様は、第１から第４のうちいずれか１つの態様に記載の遺伝子がコードする、マツノマダラカミキリのキチナーゼを提供する。
【００１４】
本発明の第９の態様は、配列番号５で示されるアミノ酸配列、または配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１５】
本発明の第１０の態様は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、または配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１６】
本発明の第１１の態様は、配列番号７で示されるアミノ酸配列、または配列番号７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１７】
本発明の第１２の態様は、配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【００１８】
本発明の第１３の態様は、第６または第７の態様に記載の形質転換細胞を用いた、キチナーゼの生産方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１４の態様は、第９から第１２の態様のうちいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分とする、殺生物剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の提供する新規キチナーゼ遺伝子、その遺伝子を含むベクターやベクターを導入した形質転換細胞、並びに新規キチナーゼ遺伝子がコードするタンパク質を用いることにより、病害虫に対する新規な殺生物剤として利用可能な新規加水分解酵素を製造することが可能となる。本発明が提供する遺伝子のコードするタンパク質は、昆虫類のキチン質を特異的に分解可能な酵素であり、ヒトを初めとする哺乳動物やマツなどの高等植物はキチンを体内に持っていないため、その効果は極めて特異的である事が期待される。すなわち本発明の提供する遺伝子及びタンパク質は、これまで用いられてきた化学農薬に替わりうる新たな殺生物剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明を利用するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、配列番号１で示される塩基配列、または配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来の新規キチナーゼ遺伝子を提供する。本発明は山口県において甚大な被害を出している松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリに着目し、この生物が持っている（脱皮などの際に働く）キチナーゼをコードする遺伝子をクローニングして利用可能としたものである。キチンは昆虫類など節足動物の体構造構成成分であり、加水分解によってこれを選択的に切断するキチナーゼは他種生物に害を与えることなく、標的とする病害虫、一般には甲虫類、好適にはマツノマダラカミキリを選択的に除去可能な新規殺生物剤の成分として利用可能な酵素である。塩基配列には個体差もあり、配列番号１で示した配列において１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されることも考えられるが、これらの場合にあってもコドンの読み枠をずらさない変異（置換）であって、更にアミノ酸配列の置換につながらない変異、あるいはアミノ酸配列が置換されても酵素活性に影響を与えない変異であれば、キチナーゼをコードする遺伝子としての利用には問題なく、またコドンの読み枠をずらす変異（欠失、付加）であってもそのコードするタンパク質が酵素活性を保持していれば上記同様問題なく利用することが可能である。おおよその目安として、配列番号１の塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子であれば、本発明の目的に利用可能である。
【００２２】
下記実施例に述べるとおり、本発明者らが明らかにしたマツノマダラカミキリキチナーゼ遺伝子（配列番号１、概要は図２に記載）は、３つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（Ｕｎｉｔ３，４，５）と１つのＣｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎを有するという極めて特徴的な構造を有していることが明らかとなった。すなわち配列番号１で示した遺伝子の一部、例えば配列番号２，３及び４（図２Ｂ，Ｃ，Ｄ）で示した、ＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎを少なくとも１つ有する部分配列もまた、キチナーゼ遺伝子として働く単位として捉える事が可能であり、これもまた本発明に含まれるべきものである。
【００２３】
本発明の実施の態様としては、上述の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、更にこのベクターを宿主となる細胞に導入して形質転換細胞を作成し、この形質転換細胞に遺伝子のコードするタンパク質を発現させて利用することが好ましい。この場合においてベクターとはプラスミドベクターやウィルスベクターなど、遺伝子導入のために分子生物学において用いられているものであれば特にその種類は問わず、何ら本発明を限定するものでは無いが、例えば複製起点と抗生物質耐性遺伝子とインサートチェック（Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のためのＬａｃＺ遺伝子と、インサート切り出しのための複数制限酵素サイトを有したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどはその一例である。また形質転換に用いる細胞も、分子生物学で通常用いられているものであればどの様なものでも良く、特に本発明を限定するものでは無いが、例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）、昆虫細胞−バキュロウィルス系、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの系が利用可である。中でもメタノール資化性酵母の系は、異種タンパク質の分泌生産において、生産性の高さと制御の容易さから特に好ましく、本発明の実施においても非常に好適である。また本発明の遺伝子は、大量発現させて産物そのものを殺生物剤の有効成分として利用しようとするものであるが、勿論植物細胞に導入し、いわゆる遺伝子組み換えによって「病気に強い植物」を作出するためにも利用可能であり、その場合は宿主となる植物の細胞を培養してこれに分子生物学で通常用いられている手法により遺伝子を導入し、導入細胞から植物体を形成させれば良い。
【００２４】
本発明の遺伝子がコードするタンパク質、好適には配列番号５で示したアミノ酸配列、または配列番号５で示したアミノ酸配列と９０％以上の相同性を持つタンパク質も、本発明に含まれるべきものである。遺伝子に変異がある場合と同様に、配列番号５に記載のアミノ酸配列に１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは挿入されたものも、本発明の範囲内である。実質的に酵素活性を保持しているならば、アミノ酸変異の数や場所は問わず、本発明を限定するものではない。
【００２５】
また上記の通り、本発明は複数のユニットからなるポリペプチドをコードしているのであるから、配列番号５で示したアミノ酸配列の一部、好適には配列番号５から８のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質（図２Ｂ〜Ｄ参照）もまた、キチナーゼとして作用する最小の単位としてＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎを少なくとも１つ有しており、本発明の範囲内に含まれるべきものである。
【００２６】
上述の形質転換細胞を大量培養し、全タンパク質中から本発明に係るキチナーゼを精製し、これを適切な緩衝液や展着剤などと混合することによって、病害虫に効果のある殺生物剤を製造することも可能となる。対象となる生物は特に限定は無いが、主に作物に害を与える昆虫のうち甲虫類が対象としては挙げられ、個々の酵素の反応特異性などを考慮すれば、マツノマダラカミキリが好適である。タンパク質の精製については、分子生物学で通常用いられている手法の中から適宜選択すれば良く、殺生物剤における緩衝液や展着剤などの補助成分についても目的に合わせて適宜組み合わせれば良く、どちらも本発明を限定するものではない。また、本発明のキチナーゼを殺生物剤として用いる方法も特に限定は無いが、一般に松などの被害を防止する目的で植物に噴霧する方法や、害虫が好む餌に混合して散布する方法、さらには、展着剤と混合して植物の幹などに塗布する方法などが考えられる。以下、本発明を実施例により更に詳しく述べるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
（材料及びＲＮＡの抽出） 本実施例においては、松食い虫の媒介昆虫であるマツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）の前蛹をＲＮＡ抽出のために用いた。液体窒素で凍らせたマツノマダラカミキリ前蛹２０ｍｇを乳鉢ですり潰し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ｍＲＮＡを抽出した。
【００２８】
（３’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）マツノマダラカミキリが発現しているキチナーゼのｍＲＮＡの３’側配列を明らかにするため、３’−ＲＡＣＥ（３’ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法を用いた解析を行った。前述のｍＲＮＡを鋳型とし、３’側のプライマーとしてはＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌに相補的なＯｌｉｇｏ ｄＴにアダプター配列を付加したもの（配列番号９）を用いて、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、最初のｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、５’側のプライマーとして、Ｆａｍｉｌｙ １８キチナーゼに共通のアミノ酸配列から作成したプライマー（配列番号１０）を、３’側のプライマーとして前記アダプター配列に相補的な配列（配列番号１１）を用い、ＰＣＲ（２．５Ｕ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１００ｐｍｏｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ）を行った。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＣＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングし、塩基配列を決定した。本実施例で用いたプライマーの一覧を表１に示す。
【表１】
【００２９】
（５’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）ｍＲＮＡの５’側の塩基配列を明らかにするために、前述の全ｍＲＮＡを鋳型とし、３’−ＲＡＣＥで明らかにした配列中からプライマー（配列番号１２）を設計して、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、５’側のｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、５’側のプライマーとしてはＣＢＤにおける保存領域から設計したプライマー（配列番号１３）、３’側のプライマーとしては配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は３’−ＲＡＣＥ同様サブクローニング後にシークエンスを行い、塩基配列を決定した。塩基配列と他種生物の遺伝子との比較から、この配列がＣＢＤである事が示された。
【００３０】
上記で明らかになった配列の更に５’上流の配列を明らかにするために、５’側のプライマーとして他種生物のキチナーゼで共通の５’側配列を用い（配列番号１０）、３’側のプライマーとして３’−ＲＡＣＥで明らかになった配列より設計したプライマー（配列番号１２）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには、長い遺伝子断片を高い信頼性で増幅させるためにＥｌｏｎｇａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ．）を用いた。以後のＰＣＲは全てこのＥｌｏｎｇａｓｅを用いて行っている。ＰＣＲの結果、通常予想される単一の産物では無く、分子量の異なる３つの産物が増幅された。アガロースゲル電気泳動により分離した写真を図１に示す。図中レーンＭは分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄφ×１７４ＨａｅＩＩＩ）を表し、レーン１がＰＣＲにより増幅したキチナーゼ遺伝子を泳動したものである。ＰＣＲ産物は４８００ｂｐ、２５００ｂｐ、１２００ｂｐの３つであり、特にバンドがはっきりと確認された２５００ｂｐと１２００ｂｐの２つについてサブクローニングを行い、シークエンスを行った。この情報に基づき、ｃＤＮＡを鋳型にして、以下プライマーの組み合わせとして（配列番号１０、配列番号１４）、（配列番号１５、配列番号１６）、（配列番号１７、配列番号１８）で各々ＰＣＲを行って解析を進めた結果、マツノマダラカミキリのキチナーゼｍＲＮＡは複数ユニットからなるアミノ酸配列をコードしており、図２に示す構造を持っている事が明らかとなった。
【００３１】
図２において、Ｕｎｉｔ３，４…は便宜上名付けた領域名であり、ＣＢＤはキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）を表す。ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）による相同性検索の結果、各ユニットはキチナーゼのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎであり、ＣＢＤを２つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（４，５）が挟み、更に上流にもう一つのＣａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ（３）があるという極めて特徴的な構造を有している事が明らかとなった。この中で特に、ＣＢＤを挟んだＵｎｉｔ４とＵｎｉｔ５について解析を行った結果を表２に示す。表中Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ａ，Ｂはそれぞれ、本発明者らが過去に単離したマツノマダラカミキリキチナーゼＡ，Ｂ遺伝子（ＣＢＤを持たない）との比較結果を示すが、塩基配列レベルで相同性が５０％前後であることから、本発明におけるキチナーゼ遺伝子が全く新規な遺伝子である事が示された。Ｕｎｉｔ４と５の間の相同性は遺伝子で６６．５２％、アミノ酸で６９．０５％であった。またＣＢＤについては、塩基数１４４ｂｐ、推定される分子量は５．６ｋＤａと算定された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の提供する新規キチナーゼ遺伝子及びこの遺伝子がコードするタンパク質は、病害虫に対して特異的に作用する殺生物剤の製造を可能にするものであり、農業分野においてこれまでの化学農薬に替わる新たな農薬の有効成分として利用可能である。また本発明の遺伝子は、遺伝子組み換えによって植物に病害虫に対する抵抗性を付与するのにも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マツノマダラカミキリキチナーゼの５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲの結果を示す。図中レーンＭは分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄφ×１７４ＨａｅＩＩＩ）を表し、レーン１がＰＣＲ産物を泳動したものである。ＰＣＲにより、４８００ｂｐ、２４００ｂｐ、１２００ｂｐの３つの遺伝子断片が増幅された。
【図２】３’−ＲＡＣＥ，５’−ＲＡＣＥによって明らかとなった、本発明のマツノマダラカミキリキチナーゼの遺伝子（ｍＲＮＡ）の構造を模式的に表す。今回明らかになったマツノマダラカミキリキチナーゼのｍＲＮＡは、３つのＣａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ（Ｕｎｉｔ３，４，５と便宜上命名）と１つのキチン結合領域（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）からなるタンパク質をコードしていることが明らかとなった（Ａ）。Ｂ，Ｃ，Ｄはそれぞれ、本発明の応用時において取り得る「キチナーゼとして機能するタンパク質をコードする遺伝子」の分子デザインを表す。最小の単位として、Ｃ，Ｄの様にＣＢＤとＣａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎを１つ持っていれば、キチナーゼとしての機能は保持されると考えられる。また図中ＡＡ…ＡはＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来のキチナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項３】
配列番号３で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項４】
配列番号４で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の遺伝子を組み込んだベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含んだ形質転換細胞。
【請求項７】
宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の遺伝子がコードする、マツノマダラカミキリのキチナーゼ。
【請求項９】
配列番号５で示されるアミノ酸配列、または配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号６で示されるアミノ酸配列、または配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号７で示されるアミノ酸配列、または配列番号７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
請求項６または請求項７に記載の形質転換細胞を用いた、キチナーゼの生産方法。
【請求項１４】
請求項９から請求項１２のうちいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分とする、殺生物剤。
【請求項１】
マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）由来のキチナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項３】
配列番号３で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項４】
配列番号４で示される塩基配列、または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなることを特徴とする、キチナーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の遺伝子を組み込んだベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含んだ形質転換細胞。
【請求項７】
宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の遺伝子がコードする、マツノマダラカミキリのキチナーゼ。
【請求項９】
配列番号５で示されるアミノ酸配列、または配列番号５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号６で示されるアミノ酸配列、または配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号７で示されるアミノ酸配列、または配列番号７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、キチン結合能を有しかつキチナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
請求項６または請求項７に記載の形質転換細胞を用いた、キチナーゼの生産方法。
【請求項１４】
請求項９から請求項１２のうちいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分とする、殺生物剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２２７３８（Ｐ２００８−２２７３８Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９７０２０（Ｐ２００６−１９７０２０）
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（３９１０１６０８２）山口県 (54)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（３９１０１６０８２）山口県 (54)
【Ｆターム（参考）】
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