マラリア・プラスモジウム抗原ポリペプチドＳＥ３６変異体、その精製方法、並びにこれより得られる抗原を用いるワクチン及び診断剤
【課題】量産化しうる、安全性、有効性の高いマラリアワクチン及び診断剤を提供する。
【解決手段】マラリア原虫由来の抗原ＳＥ３６の配列の一部を、アミノ酸置換、オリゴペプチド付加、又はオリゴペプチド決失させたＳＥ３６変異体遺伝子を合成し、ＳＥ３６変異体を大腸菌で量産し、高度精製する。ＳＥ３６変異体に特異的に結合するヒトＩｇＧ３抗体は、赤血球内での原虫の増殖を極めて有効に防止し、その結果、発熱の抑制、脳性マラリアの抑制をもたらし、致死の防止を行う。
【解決手段】マラリア原虫由来の抗原ＳＥ３６の配列の一部を、アミノ酸置換、オリゴペプチド付加、又はオリゴペプチド決失させたＳＥ３６変異体遺伝子を合成し、ＳＥ３６変異体を大腸菌で量産し、高度精製する。ＳＥ３６変異体に特異的に結合するヒトＩｇＧ３抗体は、赤血球内での原虫の増殖を極めて有効に防止し、その結果、発熱の抑制、脳性マラリアの抑制をもたらし、致死の防止を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、熱帯熱マラリア原虫、プスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の抗原ポリペプチドと、その精製方法、並びにこれより得られる精製抗原を有効成分として用いるマラリアワクチン及び診断剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、１種、又はそれ以上のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の感染により生じ、これには次の４種、熱帯熱マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、以下「Ｐｆ」と略記する）、三日熱マラリア（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）及び卵型マラリア（Ｐ．ｏｖａｌｅ）が知られている。上記原虫は、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の雌カの刺咬により、その唾液腺からｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの状態でヒト体内に侵入し感染する。尚、原虫の生活環の概要は次の通りである：
［カ］原虫の有性増殖によるｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの形成→＜刺咬＞→
［ヒト］ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ＜血中への侵入＞→＜肝細胞内への侵入＞
→［赤血球外期］肝細胞でのｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ→ｓｃｈｉｚｏｎｔ→
ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの形成・肝細胞破壊による血中への
放出→＜ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの赤血球内への侵入＞
→［赤血球内期］ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ→ｒｉｎｇ→ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ
→ｓｃｈｉｚｏｎｔの無性増殖→ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの
形成・赤血球破壊による血中への放出サイクルの反復→
＜発症＞； 又は
ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ→雌雄のｇａｍｅｔｏｃｙｔｅへの
分化→＜吸血＞→
［カ］雌雄ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ→雌雄ｇａｍｅｔｅ→有性生殖→
ｏｏｋｉｎｅｔｅへの分化→ｏｏｃｙｔｅへの分化・増殖→
ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの形成・唾液腺への移動。
また、この発明に係る上記マラリア原虫（Ｐｆ）の抗原に関し、以下に示す合計約４０に及ぶ多種多様な抗原の存在が報告されている：例えば、上記の生活環の赤血球内期（ｉｎｔｒａ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｓｔａｇｅ）ではＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ；別名、ＳＥＲＰ：ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＲＰ−２（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）等；メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）ではＭＳＰ−１（ｍｅｒｏｚｏｉｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＭＳＰ−２（ｍｅｒｏｚｏｉｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−２）、ＡＭＡ−１（ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）等；スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）−赤血球外期（ｅｘｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｓｔａｇｅ）ではＳＳＰ−２（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＬＳＡ−３（ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−３）等；更に、有性増殖期（ｓｅｘｕａｌ ｓｔａｇｅ）ではＰｆｓ２３０，Ｐｆｓ４５／４８等（“Ｔｏｐｌｅｙ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ´ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，第９版、ｖｏｌｕｍｅ ５−Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｐ．３８３，Ｌ．Ｃｏｌｌｉｅｒら著，Ａｒｎｏｌｄ社１９９８年発行）。また、これ等の抗原を単独、混合、あるいは遺伝子ＤＮＡのかたちで用いるワクチンの開発が精力的に試みられてはいるが、実用化されたワクチンは未だ知られていない（“Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａｎ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００”，ｐｐ．１４１−１４２，米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｅａｌｔｈ ２０００年発行）。
【０００３】
更に、この発明に係る前記ＳＥＲＡ（あるいはＳＥＲＰ）とその遺伝子を用いるマラリアワクチンの製造に関する従来技術として、例えば、欧州特許第２８３，８８２号（ＳＥＲＰの１４０ｋｄ抗原遺伝子の第１８８２−１９１７番塩基、第２４０３−２６０２番塩基、及び第２６０２−２６３１番塩基がコードする親水性エピトープ）、米国特許第５，３９５，６１４号（ＳＥＲＰエピトープとＨＲＰ−２との融合タンパク）、米国特許第６，０２４，９６６号（２種のプローブＡとＢで同定される遺伝子がコードするＳＥＲＡ抗原ポリペプチド）、また、ＳＥＲＡの４７ｋｄに由来のＳＥ４７´の発現系と、この系におけるＳＥ４７´抗原の生産に関する報告（Ｖａｃｃｉｎｅ，１４，ｐｐ．１０６９−１０７６，１９９６）等が知られてはいるが、これ等のワクチン抗原の免疫原性や純度等は不十分であり、また、精製工程が量産化には不向きである。更に、その安全性、有効性、又は均質性に係る保証が不明であり、これ等の解決には製造工程に格段の創意や進歩を要する。そのため、これ等の実用化は未だ達成されていない。
【０００４】
ところで、ＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ）は、赤血球内期のＰｆ遺伝子により発現される合計９８９アミノ酸からなる分子量が１１５ｋｄのタンパク抗原であり、その構造はＮ末端からＣ末端方向に順に、４７ｋｄ−５０ｋｄ−１８ｋｄの３つのドメインからなる。これ等のドメインの前駆体としてのＳＥＲＡは、合計５８６８塩基からなるＳＥＲＡ遺伝子ＤＮＡ上に分散する４つのエキソンによる発現後、赤血球内期でのメロゾイト放出の際にプロセッシングされ、上記３ドメインに開裂する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８６，ｐｐ．２４９−２５４，１９９７；及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８５，ｐｐ．１２１−１３４，１９９７）。尚、ＳＥＲＡ遺伝子ＤＮＡとこれがコードするアミノ酸配列の完全長データはＧｅｎＢａｎｋで公開され入手可能である（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０４０００；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。また、ＳＥＲＡのＮ末端領域（以下「４７ｋｄドメイン」と表記する）は、合計３８２アミノ酸からなり、その配列に係るＰｆ株間のホモロジー検索によれば、アミノ酸の欠失や付加の領域、約２０ヵ所におけるアミノ酸の変異（非同義置換）等の散在が見られ多様である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前；及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）。
【０００５】
マラリアは世界において、急性下気道感染症、エイズ、及び下痢症に次ぐ多発感染症であり、ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の推計によれば、１９９９年の罹患は約４，５００万例、そのうち約１１０万例が死亡している（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００，ｐ．１６４，及びｐ．１７０，ＷＨＯ２０００年発行）。かかる高い死亡率は、重篤な熱帯熱マラリア、いわゆる脳性マラリアによるものであり、その主な原因は、Ｐｆ増殖に伴う破壊赤血球の破片の脳血管内での滞積による脳血栓にあり、感覚鈍麻、うわごと、異常行動、痙攣等を経て死に至ると考えられており、かかる脳性マラリアの回避は最重要課題であるといっても過言ではない。
【０００６】
また、マラリア多発の理由として、ｑｕｉｎｉｎｅ、ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ−ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ、ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ、ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ等の抗マラリア剤に対する薬剤耐性あるいは多剤耐性マラリア原虫の出現と蔓延が提起されている。１９５０年代末、南米と東南アジアでのクロロキン耐性Ｐｆの出現が報告されて以来、かかる耐性原虫は現在、中米、カリブ海及び中近東の一部を除く熱帯〜亜熱帯のマラリア発生諸国のほぼ全域に広がり、非常手段としてＤＤＴ散布が余儀なく勧告されるほど、マラリア制圧は国交頻度が激化する今日の保健行政上のグローバル課題となっている（ＷＨＯ Ｅｘｐａｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍａｌａｒｉａ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．８９２、ｐｐ．１−７１、２０００、ＷＨＯ発行）。
【０００７】
更に、地球温暖化によるマラリア発生地域の拡大が将来課題として既に危惧されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７６３−１７６６、２０００）、今や、マラリア対策は全人類に逼迫した緊急の課題となっている。
【０００８】
特に、マラリアのワクチン開発に関し、これまで世界各国においてこのワクチン開発に多大の努力と精力が払われてきたにも拘らず、未だ有効なワクチン完成に至らない主な原因として、次の（ａ）〜（ｃ）の課題が上げられる：（ａ）マラリア抗原は、前述の通り多種多様であるため、かかる抗原からの感染防御抗原の特定が困難かつ曖昧である；（ｂ）マラリア抗原は遺伝子多型であり、Ｐｆ原虫株により互いに抗原性が異なる。従って、Ｐｆ由来の単一抗原、例えば、ＭＳＰ−１やＡＭＡ−１等の周知のワクチン候補抗原は、抗原性のスペクトルが狭く、どのようなＰｆ株に対しても感染予防に必ずしも有効ではない；及び（ｃ）上記のＭＳＰ−１やＡＭＡ−１等のワクチン候補抗原に知られるように、精製工程下で変性し、立体構造あるいはエピトープが破壊され、その抗原性が低下したり消失する。
【発明の開示】
【０００９】
この発明は、熱帯熱マラリア原虫ＰｆのＳＥＲＡ由来のタンパク抗原（ポリペプチドＳＥ３６）と、これをコードする合成ポリヌクレオチド、ポリペプチドＳＥ３６の精製方法、並びにこれより得られる精製抗原を有効成分として用いるマラリアワクチン及び診断剤を提供することにより、上記課題を解決する。
【００１０】
尚、特筆すべきは、この発明が、前述（ａ）〜（ｃ）の課題に対応した次の発見と知見に基づいていることである：（ａ）本発明に係るＳＥ３６抗原に対するＩｇＧ３抗体価が、マラリア流行地域住民のマラリアに対する獲得免疫とほぼ完全に相関するという驚くべき発見、及びかかる住民の血清中の上記ＩｇＧ３抗体は赤血球内でのＰｆ増殖を阻止するという知見（Ｐｆ増殖阻止により、マラリアによる発熱及び赤血球破壊の抑制、ひいては脳性マラリアによる死亡の防止が達成される）；（ｂ）このＳＥ３６抗原は、抗原性のスペクトルが広く、ＳＥＲＡ４７ｋｄドメインに見られる遺伝子多型の代表的なタイプであるＦＣＲ３、Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１、及びＫ１の３株（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）の共通抗原として機能し、前記ＩｇＧ３抗体は、中和反応により、これ等の全タイプのＰｆ原虫の増殖を阻害するという発見；及び（ｃ）量産下でのＳＥ３６抗原の抗原性あるいはエピトープが、破壊ないしは損なわれない精製方法の発見。
【００１１】
この発明は、前記のとおりの発見および知見に基づき、以下の（１）−（１０）の発明を提供する。
（１）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換：
第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ
の１または数個を有するポリペプチドＳＥ３６変異体。
（２）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１８番Ｇｌｙと第１９番Ｇｌｙとの間に、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（３）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に、配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（４）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（５）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失した請求項１のポリペプチドＳＥ３６変異体。
（６）前記（１）から（５）のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリアワクチン。
（７）前記（１）から（５）のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリア診断剤。
（８）前記（１）から（５）のいずれかのポリペプチドＳＥ３６変異体をコードする合成ＤＮＡ断片。
（９）前記（８）の合成ＤＮＡ断片によって形質転換した大腸菌の培養液から集菌の後、菌体破砕、塩析による分画、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、Octyl Sepharose疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析による沈殿、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、及び透析の順序で、これ等の各工程を行うことを特徴するポリペチドＳＥ３６変異体の精製方法。
（１０）ポリペプチドＳＥ３６変異体の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌになるように調整した後に透析を行う前記（１０）の精製方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ポリペプチドＳＥ３６分子の基本構造：
この発明に係るポリペプチドＳＥ３６（以下「ＳＥ３６」と略記する）は、前述した熱帯熱マラリア原虫ＰｆのＨｏｎｄｕｒａｓ−１株のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄ（以下「４７ｋｄ」と略記する）を基礎とするＳＥ４７´抗原（Ｖａｃｃｉｎｅ，１４，ｐｐ．１０６９−１０７６，１９９６；以下、「ＳＥ４７´」と略記する）に由来し、４７´ｋｄのセリン反復領域の全長又は一部分が切除された基本構造からなる。ＳＥ３６分子の基本構造と上記（Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株由来の）４７´ｋｄとの間のアミノ酸配列の相違を図１に、また、ＳＥ３６分子の基本構造の全長アミノ酸配列を図２に、それぞれ示す。尚、これ等の図では、アミノ酸配列がＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸１文字記号を用いて記載されている。また、図１では、前記Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株がＨｏｎｄ−１と略記され、この株と他のＰｆ株との間のホモロジー検索により検出される欠失領域は----で、同一のアミノ酸配列は……で、それぞれ表記されている。図１において、ＳＥ３６の基本構造は、Ｈｏｎｄ−１の４７ｋｄを構成する合計３８２アミノ酸のＮ末端のメチオニンを起点（第１番アミノ酸）としてＣ末端方向に順次、序数付けした第１６番アミノ酸（アスパラギン）のコドンを、開始コドン（メチオニン）に置換し、かつ、第３８２番アミノ酸（グルタミン酸）の後に翻訳停止コドンを隣接挿入し、更に、そのセリン反復領域を占める合計３３個の重合セリン残基（第１９３番から第２２５番セリンまで）を切除した合計３３４アミノ酸からなるポリペプチドである。
【００１３】
尚、上記の図１−２と対比される「配列表］において、［配列番号１］は、前記Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄ遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列と、それがコードする４７ｋｄ完全長アミノ酸配列を示す。
【００１４】
［配列番号２］は、配列番号１に記載の４７ｋｄの完全長アミノ酸配列を示す。この配列は、合計３８２アミノ酸からなり、その第１６〜３８２番アミノ酸までが、図１と後述する図３に記載の各Ｈｏｎｄ−１のそれと同じである。
【００１５】
［配列番号３］は、ＳＥ３６遺伝子の大腸菌コドンへの変換後の合成ＤＮＡの完全長塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列を示す。その第１番アミノ酸Ｍｅｔは、前記４７ｋｄの第１６番アミノ酸Ａｓｎが開始コドンＭｅｔに置換された形になっている。また、塩基配列は、ほとんど全てのＰｆコドンから大腸菌コドンに変換されている。かかる大腸菌コドンへの変換に関しては後述される。
【００１６】
［配列番号４］は、配列番号３に記載のＳＥ３６分子の基本構造としての完全長アミノ酸配列を示す。この配列は、図１に記載のＳＥ３６、及び図２に記載の各アミノ酸配列と同じである。
ＳＥ３６の誘導体・変異体：
ＳＥ３６の変異に関し、図３に例示する。この図は、図１に記載のＨｏｎｄｕｒａｓ−１株（Ｈｏｎｄ−１）のアミノ酸配列を基準に用い、図１と同じ約束でアミノ酸番号を付し、欠失は----、また、同一配列は……の表記により、他のＰｆ株（ＨＢ３、Ｔ９／９６、３Ｄ７、Ｋ１、Ｔ９／１０２、ＰＡ／７、及びＣａｍｐ）の各アミノ酸配列を併記し、これ等の株間のアミノ酸配列の相違を示す。尚、図３では上記基準（Ｈｏｎｄ−１）と他の株との間のアミノ酸配列の変異又は相違の個所がアミノ酸１文字記号で示されている。
【００１７】
以下、上記の図３に記載のアミノ酸変異の位置と領域、並びにこれ等のアミノ酸番号、及び配列表の配列番号４に記載のＳＥ３６基本構造のアミノ酸配列に基づき、図３と配列番号４の両記載を対応させ、ＳＥ３６の誘導体あるいは変異体の構成と態様につき説明する。
【００１８】
ＳＥ３６分子の基本構造は、図２（配列番号４）に示す通り、合計３３４アミノ酸からなるポリペプチドであるが、この構造の加工、変形、修飾等により、その誘導体あるいは派生体、修飾体、変異体等を得ることができる。これ等は、図３の記載に基づくアミノ酸の非同義置換、オリゴペプチドの付加あるいは欠失、及びセリン反復（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ）領域を占める重合セリン残基数の制限、また、４７ｋｄエピトープ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）の選択等の単独利用あるいは適宜、組合せて用いることにより調製することができる。即ち、この発明によれば、次の（１）−（４）が可能である。
（１）配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において次のアミノ酸置換(a)〜(v)から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換が可能である：
(a) 第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
(b) 第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
(c) 第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
(d) 第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
(e) 第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
(f) 第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
(g) 第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
(h) 第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
(i) 第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
(j) 第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
(k) 第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
(l) 第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
(m) 第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
(n) 第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
(o) 第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
(p) 第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
(q) 第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
(r) 第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
(s) 第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
(t) 第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
(u) 第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
(v) 第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ。
（２）図３に記載のＰｆ株間相互のアミノ酸配列の付加あるいは欠失を考慮し、配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において、次のオリゴペプチドの付加、あるいは欠失の組合せ加工(i)〜(vi)が可能である：
(i)第１８番Ｇｌｙと第１９Ｇｌｙとの間に配列番号５のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(ii)第１８番Ｇｌｙと第１９Ｇｌｙとの間に配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(iii)第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に配列番号７のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(iv)第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(v)第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの欠失；
(vi)第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの欠失。
（３）配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において第１７５番Ａｓｐと第１７８番Ｇｌｕとの間でペプチド結合により重合するセリン残基数が０〜３０、好ましくは０〜２０、更に好ましくは１０を超えない範囲、即ち、０から１０の範囲内が望ましい。かかるセリン残基数の制限は、３５個の重合セリン残基を有する前述ＳＥ４７´は精製が困難であり、その実用化に至らなかったという本発明者の経験（Ｖａｃｃｉｎｅ、前出）、及びセリン反復領域の重合セリン残基数とＳＥ３６の物性との間の関係「重合セリン残基数の減少に伴い、ＳＥ３６の水溶性あるいは可溶化性、更に、その抗原性あるいは免疫原性がいずれも高まる」という驚くべき発見に基づいている。この現象は、重合セリンの切除が、ＳＥ３６分子の立体構造に変化をもたらし、そのエピトープを含む親水性領域が露出されることを示唆する。従って、この発明によれば、ＳＥ３６を可溶化しその精製を容易にすると共に、その抗原としての機能と品質を高めるには、セリン反復領域の重合セリン残基数の制限は、必須条件である。
（４）上述のセリン残基数の制限と４７ｋｄエピトープの選択利用との組み合せにより、ＳＥ３６との間で交差する抗原性を有し、かつ、アミノ酸のホモロジー検索により検出されるセリン反復領域の重合セリン残基数が、例えば、０から１０の範囲内にあるポリペプチドを調製することができる。尚、この発明では、上記抗原性の交差は抗原抗体反応により検出し、セリン反復領域はＳＥ３６（配列番号４）の第１５７番Ｇｌｙから第１８３番Ａｓｎまでのアミノ酸配列を比較基準として用いるアミノ酸のホモロジー検索により検出することができる。
【００１９】
以上につき換言すれば、配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列は、ＳＥ３６本来の抗原性・免疫原性、及びこれ等のスペクトルが損なわれない限り、その分子構造を多様に修飾、変形あるいは加工することができる。即ち、この発明に係るポリペプチドＳＥ３６は、配列番号４に記載のＳＥ３６基本構造のみならず、上記（１）−（４）に記載のアミノ酸又はオリゴペプチドの付加、切除あるいは置換等による上記構造の誘導体あるいは派生体、変異体、修飾体等をも包括する、これ等すべての総称である。また、これ等のＳＥ３６は、ワクチン及び診断剤の有効成分として、個別に単独使用できるだけではなく、抗原性や免疫原性のスペクトルを広げるため、これ等の少なくとも２種を混合することにより用いることができる。
【００２０】
更に、特筆すべきは、ＳＥ３６の生産において、ＳＥ３６をコードする自然界の４７ｋｄ遺伝子ＤＮＡ断片そのものを全く使用しないことである。この発明によれば、ＳＥ３６の量産は、そのアミノ酸配列をコードする自然界のＰｆコドンを全て大腸菌コドンに変換したかたちで、全長ＳＥ３６をコードするＤＮＡ断片（以下、ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡと記載することがある）を合成かつクローニングした後、その合成遺伝子クローンの発現ベクターを構築し、次いで、これを宿主大腸菌に移入し、作成される形質転換体を培養することにより行う。尚、上記のＤＮＡ合成による大腸菌コドンへの変換は、本来のＰｆコドンのＳＥ３６遺伝子ＤＮＡは大腸菌での発現効率が低いので、ＳＥ３６の量産を目的とした産業上利用の観点からこれを高めるために行う。以下、これにつき更に詳しく説明する。
ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡの合成とクローニング：
Ｐｆの机上のＳＥ３６遺伝子ＤＮＡ塩基配列とそれがコードするアミノ酸配列は、衆知の遺伝子データベース公開機関、例えば、ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等からインターネットにより入手可能である。
【００２１】
Ｐｆコドンから大腸菌コドンへの机上の変換は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＣｏｄｅｎ Ｕｓａｇｅデータベースや発明者の既報（前述のＶａｃｃｉｎｅ；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、６３、２６５−２７３、１９９４）等を参考に用いることにより行うことができる。大腸菌コドンへの変換においては、Ｎ末端アミノ酸を開始コドンのＭｅｔに置換する以外は、自然界におけるＰｆ本来のアミノ酸配列を十分に重視し、その抗原性がアミノ酸の非同義置換により損なわれないよう留意する。
【００２２】
ＤＮＡ合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍｅｄｅｌ ３９２：ＰＥ社（米国）製］、ＡＳＭ−１０２Ｕ ＤＮＡ合成機［ＢＩＯＳＳＥＴ社（米国）製］等を用いることができる。かかる合成機により、約１００ないし約２００ヌクレオチドが重合のセンス（＋）とアンチセンス（−）の両鎖ＤＮＡ断片を別途に合成の後、各合成ＤＮＡ断片は、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動により精製する。次いで、精製された単鎖ＤＮＡ断片の相補鎖（対）のアニーリングにより合成２本鎖ＤＮＡ断片を調製する。
【００２３】
合成２本鎖ＤＮＡ断片のクローニングには、既知又は市販の、宿主が大腸菌のクローニング用ベクター（“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｉ−１〜Ｉ−Ｄ−ｉ−８、Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓら著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ１９８８発行に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋と大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅとの組合せ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製］を用いることができる。かかるクローニングでは、例えば、上記ＤＮＡ断片の制限酵素断片を、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係し構築したベクターを宿主に移入することにより、形質転換体としてのクローンが得られる。次いで、２本鎖ＤＮＡ断片の各クローンは、上記形質転換体の培養により増幅の後、これ等の各塩基配列をチェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ法）やマクサム・ギルバート法により決定する。尚、これには、市販のＤＮＡシーケンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００［ＰＥ社（米国）製］を用いることができる、その結果に基づき、ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡの全長をカバーする２本鎖ＤＮＡ断片を約５〜１０クローンを選択する。
【００２４】
全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡのクローニングは、前記２本鎖ＤＮＡ断片クローンの連結により行う。例えば、前記において８クローン（８対）が選択された場合には、これ等の２本鎖ＤＮＡ断片を順次、連結することにより全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡを得ることができる。次いで、この全長ＤＮＡを、前述と同様にしてクローニングする。尚、上記連結の際には、２本鎖ＤＮＡの各断片の両末端に連結用の制限酵素ｃｏｈｅｓｉｖｅサイトの導入が望まれる。但し、かかる導入には、Ｐｆ本来のアミノ酸配列が変化しないよう、コドンとしての塩基配列を整合させる必要がある。
ＳＥ３６遺伝子の発現系の構築：
ＳＥ３６遺伝子の発現ベクターの作成には、既知又は市販の、宿主が大腸菌の発現用ベクター（“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、同前に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドｐＥＴ−３ａと、大腸菌ＢＬ２１（ＤＬ３）ｐＬｙｓＳ、又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＬ３）ｐＬｙｓＥとの組合せ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製］を用いることができる。かかる作成は、例えば、前記クローニングベクターから全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡを含む制限酵素断片を切出した後、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係することにより行う。また、ｐＥＴ−ＳＥ４７´（Ｖａｃｃｉｎｅ、同前）からも作成することができる。この場合には、例えば、ｐＥＴ−ＳＥ４７´又はこれが保有のＳＥ４７´合成遺伝子からセリン反復領域をコードする全領域ないしは一部領域を制限酵素で切除することにより、上記と同様にして作成することができる。次いで、作成した発現ベクターを宿主に移入することにより形質転換体が得られる。かかる形質転換体から、ポリペプチドＳＥ３６の量産を指標として、ＳＥ３６遺伝子の発現系として産業上利用の観点から適確なものを選別することができる。
ポリペプチドＳＥ３６の生産：
ＳＥ３６の量産は、上記の大腸菌形質転換体の培養により行う。尚、かかる培養系は、ＳＥ３６の生産収率を高める観点から、インデューサー、例えば、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の使用、カタボライト・リプレッションの回避、培地組成、培養の温度と時間、宿主細胞内プロテアーゼの除去等につき改良あるいは改善することが可能であり、これ等は、発現ベクターの改造、更に、プロモーターや宿主菌株の変更等により行うことができる。
ポリペプチドＳＥ３６の精製：
ＳＥ３６が細胞外へ分泌される場合には、上記の形質転換体の培養物の除菌培養液を上記ＳＥ３６抽出の出発材料として用いる。細胞内に蓄積される場合は、例えば、培養物から遠心、濾過等により集菌し採取した菌体から上記ＳＥ３６を抽出する。先ず、抽出第一段階としての菌体の破砕には、酵素による消化、浸透圧による破壊、急激な加圧減圧、超音波、種々のホモジナイザー等々を用いることができる。次いで、菌体破砕物を分別するための手段として、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、吸脱着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳動、カラムクロマトグラフィー、支持体、透析、塩析等を、それぞれ組合せて用いることができる。また、これ等の手段の適用においては、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度等の物理化学的条件を適宜、設定できる。
【００２５】
この発明では、上記の多種多様な手段と条件のうち、超音波処理、硫安塩析、遠心、カラムクロマトグラフィー、濾過、膜濃縮等を組合せて用い、これ等を次に記載の精製工程（１）−（１０）の順序で行うことにより、ＳＥ３６ポリペプチドを精製する：
（１）培養菌体ペーストの超音波による破砕と遠心による細胞破片の除去；
（２）４℃の水に対する硫酸アンモニウム（以下「硫安」と略記する）の飽和度 が、下限２０％と上限５０％、望ましくは下限３０％と上限３５％になるよう硫安を添加混合する塩析による分画；
（３）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、０．２％（Ｗ／Ｗ）から５％（Ｗ／Ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０、望ましくは１％（Ｗ／Ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０、更に、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液によるＳＥ３６ポリペプチドの可溶化；
（４）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液による、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（５）Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性カラムクロマトグラフィーによる分画と透析；
（６）３５−６５％飽和硫安、好ましくは４５−５５％飽和硫安による塩析；
（７）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液によるＳＥ３６ポリペプチドの可溶化；
（８）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液による、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（９）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（10）ＳＥ３６タンパク質の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜３０μｇ／ｍｌになるように調整後、透析；
（11）膜濃縮。尚、ワクチン調製のための無菌化は、例えば、０．２２μＭ−フィルターによる濾過滅菌により行う。
ＳＥ３６分子とその抗原性の確認：
ＳＥ３６分子の検出とサイズの確認は、例えば、沈降係数の測定、分子ふるい、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動等により行うことができる。また、ＳＥ３６分子の抗原性は、ＳＥＲＡの４７ｋｄに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、ＥＬＩＳＡ、凝集反応，蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ等での抗原抗体反応により確認できる。更に、ＳＥ３６ポリペプチドの免疫原性、及び抗ＳＥ３６抗体のＰｆ原虫増殖阻害能は、熱帯熱マラリア患者の血清や、該ポリペプチドで免疫した実験小動物、例えば、ラットやマウス等の血清等を用いる上記抗原抗体反応、Ｐｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの赤血球内での増殖阻止試験（いわゆる中和反応）、ＳＥ３６抗体の保有者の血中Ｐｆ数の測定等により確認することができる。
ワクチンの調製：
先ず、前記の精製ポリペプチドＳＥ３６を抗原として、これを溶媒、例えば、等張のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に浮遊し、ワクチン原液を調製する。
【００２６】
尚、上記ワクチン抗原は常用の不活化剤で固定化することにより立体構造を安定化できる。不活化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β−プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に添加して用いることができる。ホルマリンを使用の場合、その添加量は約０．００５−０．１％（Ｖ／Ｖ）、不活化温度は約４−３８℃、不活化時間は、約５−１８０日である。但し、不活化により抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する、かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要なら、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。
【００２７】
また、ワクチンの経口や経鼻接種による粘膜免疫あるいは局所免疫の誘導を目的として、上記ＳＥ３６抗原を加工あるいは修飾できる。これには、例えば、リポソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェアー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等を用いるＤＤＳ（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）に係る技術を適用できる。以上により得られた調製物をワクチン原液として次の工程に供する。
【００２８】
上記ワクチン原液を、例えば、前記ＰＢＳで希釈し、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導し、免疫を奏するに必要な量になるよう調整する。その際、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合できる。例えば、安定化剤として、糖類やアミノ酸類、また、アジュバントとして、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等を利用できる。
【００２９】
次いで、適当な量、例えば、約１−２０ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封の後、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより。乾燥製剤として使用に供することができる。
ワクチンの検定：
ワクチンの工程管理及び品質管理に係る検定は、薬事法（昭和３５年法律第１４５号）第４２条第１項の規定に基づく日本国の規程「生物学的製剤基準」、ＷＨＯの勧告“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”［ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ（ＴＲＳ）、Ｎｏ．８８９、ｐｐ．１０５−１１１、１９９９］等に準拠して行われる。マラリアワクチンは、未だ実用化されておらず、その製剤基準が存在しないので、その検定は、これに類似のワクチンに係る基準、例えば、上記ＷＨＯの勧告“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖａｃｃｏｉｎｅｓ Ｍａｄｅ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（上記ＴＲＳ、Ｎｏ．７８６、１８９８、及びＮｏ．８８９、１９９９）、“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ”（上記ＴＲＳ、Ｎｏ．７７１、１９８８）等に記載の安全性と有効性に関する種々の規定に準拠し行うことができる。例えば、無菌、異常毒性否定、タンパク質含量、純度、水素イオン濃度、抗原確認、抗原ポリペプチド等、要求あるいは勧告される種々の試験規定に準拠して検定を行い、これ等の全ての検定試験に合格した製造ロットを適格なマラリアワクチン製剤として実用に供する。
ワクチンの用法：
ワクチン接種は、例えば、１ドーズ約０．２５−０．５ｍｌを皮下接種する。尚、かかる接種は、約２−４週間隔で１−３回、行う。但し、ワクチン用法は、上記の例にのみ限定されるものではない。
診断剤の調製：
ＳＥ３６ポリペプチドは、マラリアの診断用抗原、例えば、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等の抗原として提供できる。また、上記ポリペプチドを動物、例えば、ウサギ、モルモット、マウス等の腹腔内、皮下や筋肉内等に接種し、抗体産生させたこれ等の動物の血清から抗体を作成することができる。かかる抗体は，例えば，上記の各種診断法での抗原検出用として提供できる。尚、この発明に係る診断用の抗原や抗体は、これ等の診断剤中の含量が、抗原抗体反応を呈するに必要な量となるよう、溶媒、例えば、前記ＰＢＳで希釈調整し使用に供する。
【００３０】
以下、この発明の態様並びに構成と効果を、実施例及び参考例を示し、具体的に説明する。但し、本発明は、これ等に限定されるものではない。
実施例１：ＳＥ３６発現系の構築
Ｐｆコドンから大腸菌コドンに机上で変換した全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡ塩基配列を８分割し、各分割断片のセンス（＋）鎖とアンチセンス（−）鎖の単鎖ＤＮＡ断片を合計１６本（８対）合成すると共にアニーリングし、合計８対の２本鎖ＤＮＡを調製の後、これ等を相互に連結し、全長ＳＥ３６遺伝子を作成し、その発現ベクターを構築した。尚、合成ＤＮＡ断片のクローニングと連結の基本操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）により行った。
【００３１】
前記の単鎖ＤＮＡ断片はそれぞれ、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｍｏｄｅｌ ３９２”［ＰＥ社（米国）製］を用いて合成した。これ等の合成断片は、１０％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミド（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３，１ｍＭ ＥＤＴＡ，及び８Ｍ 尿素を含有）の電気泳動により精製した。次いで、２０p moles の精製断片ＤＮＡの各＋と−の相補鎖を混合の後、緩衝液（２０μl の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ2）中で８５℃、５分間、保温した。更に、上記両鎖の相補領域をアニーリングするため、ＺｙｍｏｒｅａｃｔｏｒII［ＡＴＴＯ社（日本）製］を用い、その温度を５℃／５分の割合で５５℃まで、次に、５℃／１０分の割合で２５℃まで下げた。アニーリング終了の後、等量の緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４種のｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＴＰ）の各１ｍＭ ＮＴＰ、及び３units のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ］を添加混合し、４℃で５分、２５℃で５分、更に、３７℃で１２０分、順次、保温した。これより得られた各２本鎖ＤＮＡ断片は、ＳＥ３６遺伝子の構築に用いるため、制限酵素ＫｐｎI及びＢａｍＨIで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋と大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅでクローニングかつ増幅し、各クローンの上記ＤＮＡ断片の塩基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法で決定すると共に、全長ＳＥ３６遺伝子をカバーする８クローンを選定した。これ等の８クローン（８対）の合成２本鎖ＤＮＡ断片を連結することにより全長ＳＥ３６遺伝子の２本鎖ＤＮＡを調製した。尚、その際、Ｐｆ本来のアミノ酸配列が変化しないよう配慮された塩基配列を利用して、連結用の制限酵素サイトが各対ＤＮＡの両末端に導入された。次いで、全長ＳＥ３６遺伝子は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋でクローニングの後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに移入し増幅すると共に、その塩基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法で決定した。その結果を配列表の配列番号３に示す。
【００３２】
次いで、上記クローンの制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＥＴ−３ａのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ両切断サイトに挿入連係し、ＳＥ３６発現ベクターｐＥＴ−ＳＥ３６を構築した。この発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに移入することにより形質転換体、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ−ＳＥ３７を作製し、これを大腸菌ＢＬ／ＳＥ３６と命名した。
実施例２：ＳＥ３６の発現と精製
実施例１で得た大腸菌ＢＬ／ＳＥ３６をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ培地［Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ １％（Ｗ／Ｖ）、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％（Ｗ／Ｖ）、及びＮａＣｌ １％（Ｗ／Ｖ）］で３７℃にて１８時間培養しシードを調製した。次いで、上述の新鮮ＬＢ培地５L に上記シード５0 ｍｌを接種した後、３７℃で培養した。菌数が１×１０８／mlに達した時点で、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を、最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう添加混合の後、更に、３７℃にて３時間培養した。培養終了後、遠心（５，０００ｒｐｍ、１０分）により集菌し、細胞ペースト３．２ｇを得た。このペーストを、９．６ｍｌの氷冷した溶菌（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁の後、以下（１）−（６）の操作を記載の順に、４℃で行った。
（１）超音波処理
超音波（１９．５ｋＨｚ、５０Ｗ）で２０秒間、６回処理により上記ペースト細胞を破砕の後、その遠心（１５，０００ｒｐｍ、３０分）上清を採取し、２０ｍｌ容のビーカーに移注した。
（２）硫安塩析Ｉ
上記ビーカー内液に、攪拌下で２．３７ｇの結晶（ＮＨ4）2ＳＯ4 を３５％（Ｗ／Ｗ）飽和になるよう添加混合し、更に、３０分間撹拌を続け塩析を行った。次いで、これを遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、その上清を捨て、沈渣に、３０％（Ｗ／Ｗ）硫安飽和になるよう９ｍｌの氷冷硫安溶液［１．１Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4を含有の前記ｌｙｓｉｓ緩衝液］を加え、懸濁した。この懸濁液を遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、その上清を捨てた後、８．８ｍｌの溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、９Ｍ 尿素、及び１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０］を添加し、沈渣を再懸濁し回収した。この再懸濁液の１／２量（４．４ｍｌ）を６０℃で１０分間保温し、再び氷冷の後、０．４５μｍ−フイルター［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国）製］で濾過した。
（３）カラム精製Ｉ
上記濾液を、ＧＦ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び８Ｍ 尿素］で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（２６／６０）カラムクロマトグラフィー（流速０．３ｍｌ／分、４℃）で分画（３．５ｍｌ／分画）した後、第２２−４３各分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その泳動像に基づき検出されるＳＥ３６タンパク質を多量に含む第３２−３７分画をプールした。残りの再懸濁液（４．４ｍｌ）も上記と同様に処理した後、前記の分画プールと併せて次（４）の操作に用いた。
（４）カラム精製II
上記の分画プールを室温に置き、攪拌下でこの分画プール１ｍｌ当たり０．０９３ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4 を添加混合し、硫安の最終濃度が０．７Ｍになるよう調整した。一方、容量１３ｍｌの水性カラムＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１０倍量のＨＩＣ緩衝液［０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有の前記ＧＦ緩衝液］で平衡化した。このカラムに上記の硫安濃度調整の分画プールを流速０．５ｍｌ／分にて流入した。更に、吸光度が下がるまでＨＩＣ緩衝液を流入の後、確認のため、（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有しないＧＦ緩衝液により吸着成分を溶出した。このカラムでの未吸着分画を透析バッグに入れ、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）を外液に用い４℃で１０時間、透析した。尚、この透析の間、外液を２回交換した。
（５）硫安塩析II
透析済みバッグを更に、０．３Ｌの５０％（Ｗ／Ｗ）飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有］を外液に用い４℃で１０時間、透析することにより、タンパク質を沈殿させた。この沈殿物は、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）により、沈渣として回収の後、２ｍｌのＧＦ緩衝液に懸濁した。
（６）カラム精製III
上記の懸濁液を６０℃で１０分間保温の後、４℃に戻した。これを前記０．４５μｍ−フィルターで濾過し、その濾液を流速０．３ｍｌ／分にて、ＧＦ緩衝液２［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び８Ｍ 尿素］で平衡化した前記Ｓ−３００カラム（２６／６０）にかけ分画した。前述（３）と同様にして、各分画のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、ＳＥ３６タンパク質の分画を選別の後、これ等をプールして該分画１２ｍｌを得た。この分画プールを希釈用緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２Ｍ尿素]に撹拌添加し、ＳＥ３６タンパク質の濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように希釈した。この希釈液を２ＬのＰＢＳ［９ｍＭ ＮａＨＰＯ4、３ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、及び１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］を外液に用い４℃で１０時間、透析した。尚、この透析の間、外液を２回交換した。次いで、透析終了後の内液を、Ｃｅｎｔｐｒｅｐ ３０で濃縮した後、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ０．２２μｍ−フィルター［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 （米国）製］で濾過滅菌し、ＳＥ３６タンパク質を１ｍｇ／ｍｌを含有の無菌標品１０ｍｌを得、これをＳＥ３６ワクチン原液として４℃に保存し、爾後の検定に供した。
【００３３】
上記標品の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では４０ｋｄのＳＥ３６タンパク質のメインバンドのほかに数本のバンドが可視検出された（図５）。これらのバンドは全てウエスタンブロットにおいて、抗ＳＥ３６モノクローナル抗体と反応することが確認され、上記標品の純度は９９％（Ｗ／Ｗ）を超えると推定された。
【００３４】
尚、タンパク質濃度は、１ｍｇ＝０．４９１（ＯＤ278 ）を以て算出した。この値は、ＳＥ３６分子にはＴｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅがそれぞれ１、１０及び９個存在し、これ等を合算した分子吸光係数、ε278 ＝１９１６０／モルに基づいた。
実施例３：アミノ酸配列決定
実施例２で得たＳＥ３６タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は、タンパク質シークエンサー Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ［ＰＥ社（米国）製］を用いるエドマン分解により決定した。その結果を図２及び配列表の配列番号４に示す。
実施例４：抗原性および免疫原性の検定
実施例２で得たＳＥ３６ワクチン原液中のＳＥ３６タンパク質の抗原性と免疫原性につき、次（１）−（３）の通り検定した。
（１）ワクチンの調製
上記ワクチン原液をＰＢＳで５倍階段希釈し、抗原量（μｇ／０．０５ｍｌ）が２００、４０、及び８の各溶液をそれぞれ調製し、等量（Ｖ／Ｖ）のフロイントコンプリートアジュバント、及び、フロイントインコンプリートアジュバントと混合し、エマルジョンにし、前者を第一回免疫、後者を第２回および第３回免疫に用いた。
（２）マウス免疫血清の作製
７週齢、雌のBALB/cマウス［ＣＬＥＡ社（日本）製］を合計２０匹（５匹／群、合計4 群）用い、上記ワクチンを０．１ｍｌ／マウスずつ、初回免疫、初回から７日目及び２１日目の合計３回、皮下接種した。第１群マウスには抗原量２００μｇのワクチンを、また、第２群は４０μｇ、第３群は８μｇ、尚、第４群マウスにはＰＢＳをアジュバントと混合したものを０．１ｍｌ／マウス、皮下接種し比較対照として用いた。初回免疫から３０日目に各マウス毎に採血し、その血清は、マウス毎に個別に５６℃で３０分加熱により非働化した後、全て−２０℃に保存し、マウス抗血清、及び比較対照マウス血清としてそれぞれ爾後の検定に供した。尚、上記の第１−３群の免疫マウスは全て、ワクチン接種後の飼育の間、比較対照の第４群マウスと同様に健常であり、異常な体重減少・行動・排泄物・外観、及び死亡例はいずれも見られず、このワクチンの安全性が確認された。
（３）Ｐｆ増殖阻止試験
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＨｏｎｄｕｒａｓ−１株を用い、その培養と維持は、Ｔｒａｇｅｒ及びＪｅｎｓｅｎの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９３、６７３−６７５、１９７６）、及びＢａｎｙａｌ及びＩｎｓｅｒｂｅｒｇの方法（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｇｉｅｎｅ、３４、１０５５−１０６４、１９８５）により行った。先ず、培養下のＰｆ寄生赤血球の８０％がｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ及びｓｃｈｉｚｏｎｔが寄生の赤血球に達したとき、その維持培地を新鮮赤血球で希釈し、この寄生赤血球数を全血球数の０．５ ％に調整した。次いで、これを更に完全培地で希釈して赤血球濃度を2 ％（Ｖ／Ｖ）に調整することにより、Ｐｆ寄生赤血球培養液を調製した。この培養液を９６ウエルのマイクロプレートに１００μｌ／ウエルずつ滴下の後、１／２０量（５μｌ）の前記（２）のマウス抗血清と混合し、３７℃で７２時間培養した。比較対照には前述のＰＢＳ接種のマウス血清を用いた。培養終了後、これをスライド上に塗布してギムザ染色し、スライド上の５０００個の赤血球を検鏡し、Ｐｆ寄生赤血球数を計数した。Ｐｆ増殖阻止率（％）は、これより計数された同一希釈血清の存在下でのＰｆ寄生赤血球数を用いる次式、
１００×（１−マウス抗血清下でのＰｆ寄生赤血球数／
比較対照マウス血清下でのＰｆ寄生赤血球数）
により算出した。その結果、前記の第１群および第２群（各群５匹）の各マウス抗血清はいずれも上記阻止率が９０％、また、第３群の５匹マウスの平均値は７０％であった。尚、マウス抗血清及び比較対照マウス血清は、上記の阻止試験前にそれぞれ、次の前処理を行った：これ等の各々の０．５ｍｌに、２ｍｌの赤血球パックとを添加混合の後、３７℃で２時間保温し、次に、室温で遠心（１，５００ｒｐｍ、５分）し、その上清を採取した。この上清に更に０．５ｍｌの新鮮赤血球パックを添加混合の後、上記と同様にして保温及び遠心を行い、その上清を採取し、これを上述の阻止試験に供した。
（３）抗原解析
ＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析にはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット［Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製］を用いた。ＥＬＩＳＡには、抗原としてＳＥ３６タンパク質を、また、基質として２，２´−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを用いた。ＥＬＩＳＡ価は、５０５ｎｍのマイクロプレートリーダー“Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣＣ／３４０ ＫＭII”［Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ Ｓｃｉｅｎｆｉｃ社（米国）製］で読み取り、吸光度０．３で判定した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析には基質としてｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを用いた。
【００３５】
Ｐｆ寄生赤血球は、少なくともその８０％が成熟ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ及びｓｃｈｉｚｏｎｔが寄生の赤血球の培養物から調達した。この寄生赤血球を、０．０７５％（Ｗ／Ｖ）サポニン溶液中で３７℃で１０分間、静置して溶かした後、遠心（５，０００ｇ、５分）し、その沈渣を採取した。次いで、沈渣をＰＢＳに浮遊の後、この浮遊液をｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプル緩衝液と混合し、マラリア細胞破砕液としてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析に供した。
【００３６】
前記の第１群〜第３群（各群５匹マウス）のＥＬＩＳＡ価の平均値は、第１群が９０，０００、第２群が８８，０００、第３群が４２，０００、及び第４群の比較対照は１００未満であった。また、前記マラリア細胞リゼートのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析の結果、第１群〜第３群の各マウス抗血清と反応するタンパク質が１２０ｋｄの位置に検出され、他方、第４群の各マウス血清と反応するタンパク質は全く検出されなかった。尚、上記分析は、上記細胞破砕液を１２．５％（Ｗ／Ｖ）ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた泳動像をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｙｎｉｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）に移した後、前記の第１群〜第３群のマウス抗血清、及び比較対照マウス血清とそれぞれ反応させることにより行った。
実施例５：チンパンジーを用いた免疫試験
ＳＥ３６タンパク質を水酸化アルミニウムゲルに吸着させて調製した試作ワクチンをチンパンジーに接種し、各時点で採血した血液について血液学的及び血液生化学的検査を行うと共に、その血清について免疫応答を試験した。
（１）方法
３頭のチンパンジーに、試作ワクチンを１回当たりＳＥ３６タンパク質として４５０μｇ（雄、１１才）、５０μｇ（雌、１０才）、１０μｇ（雌、６才）ずつ背中に皮下接種した。試験スケジュールは、初回接種を０週とし、４週目に追加接種を行った。また、採血を各接種前に行うとともに、追加接種時及びその後経時的に行った。
【００３７】
なお、以上の試験は、三共化学研究所 熊本霊長類パークでの倫理委員会での承認を得た後、同施設にて行った。
（２）結果
試作ワクチンを接種したチンパンジーから採血した血液の血液学的および血液生化学的検査の結果から、ＳＥ３６タンパク質として４５０μｇ／回という非常に多量のタンパク質を接種した場合においても、異常は確認されなかった。この結果から、ＳＥ３６タンパク質を水酸化アルミニウムゲルに吸着させて作成したワクチンの安全性が確認された。
【００３８】
また、得られた血清のＳＥ３６タンパク質特異的抗体価をＩｇＧのサブクラス毎に測定した結果、４５０μｇ／回で接種したものでは、全てのサブクラスで高い抗体価の上昇が確認され、特に２回目接種後には約１００００倍に達した。この高い抗体価は、１０週目でも維持されていた（図６Ａ）。また、５０μｇ／回で接種したものでも、４５０μｇ／回で接種したものと同程度の免疫応答が得られた（図６Ｂ）。１０μｇ／回で接種したものでは、免疫応答が得られるのにやや時間を要するものの、４週目には全てのサブクラスで抗体価が上昇し、２回目接種後には約１０００倍に達した（図６Ｃ）。この結果から、本発明のワクチンが、ヒト用ワクチンとして現実的な接種量で免疫応答を可能とすることが確認された。
【００３９】
さらに、４５０μｇ／回で接種して得た免疫血清を用いてＩｇＧ依存的なＡＤＣＩ（Antibody-Dependent Cellular Inhibition of Parasite Growth）によるマラリア原虫の増殖阻害を試験した。すなわち、１００μｌのマラリア原虫の培養液に、免疫血清と２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの単球を加えて培養を続け、４８時間後の原虫数を測定した。チンパンジーの免疫血清について試験した系では０．３８ｍｇ／ｍｌの免疫前全ＩｇＧ分画を添加した場合の原虫数を、またマラリアに対する免疫を獲得したヒトの血清について測定した系では１０μｇ／ｍｌの非特異的ＩｇＧ３画分を添加した場合の原虫数を対照（１００％）とし、各測定系での原虫数を割合（％）で示した。
【００４０】
結果は図７に示したとおりである。チンパンジー免疫前および後の全ＩｇＧ分画を各々１．５ｍｇ／ｍｌ添加した場合の増殖は、免疫前の全ＩｇＧ分画を添加したものが対照の約７０％まで増殖するのに対し、免疫後の全ＩｇＧ分画を添加したものでは約４０％の増殖にとどまった。
【００４１】
上記の試験において、添加したチンパンジーの全ＩｇＧ分画濃度は、チンパンジーの血清中のＩｇＧ濃度の約１／１０の濃度であり、免疫前の全ＩｇＧ分画を添加した場合と比較して、免疫後の全ＩｇＧ分画を添加した方が約３０％良好な原虫増殖阻害が得られたことは、生体の血中においてはほぼ完全な阻害効果が期待される。また、ヒト血中の測定にはＳＥ３６タンパク質に特異的なＩｇＧ３を用いていることを考慮すれば、マラリア原虫に対し免疫を獲得したヒトの原虫増殖阻害効果に匹敵すると考えられる。以上の結果から、本発明のワクチンの有効性が確認された。
参考例１：疫学検査I
ウガンダのマラリア高度流行地域における１０歳以下（平均６歳）の児童の血清を用い、ＳＥ３６タンパク質に対する血中のＩｇＧ３抗体の保有状況を前述のＥＬＩＳＡにより検査した。その結果、発熱をしていない（体温３７．５℃未満の）健康な児童３１例のうち、８例がＩｇＧ３抗体陽性、他方、発熱を伴う（３７．５℃以上の）児童患者９例は全てＩｇＧ３抗体陰性であった。これにより抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体の産生あるいは保有者においてはマラリア発熱が全く見られず、同抗体はマラリア発症を抑制するという相関が示唆された。
参考例２：疫学検査II
さらに同地区において採取した１５歳以下の児童（８６例）の血中原虫（Ｐｆ）数とＥＬＩＳＡによる抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価との間の相関関係を検査した。その結果、上記ＩｇＧ３抗体価が高いほど血中のＰｆ数が低いという相関のあることが示唆された。
参考例３：疫学検査III
マラリア高度流行地域住民の年齢別（０−４０歳以上）の、ＳＥ３６タンパク質に対する血中抗体価の保有状況をＥＬＩＳＡにより検査した。その結果、抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価は、全年齢において他のＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の各抗体価が横ばいで低値であるのに比べ、０から８歳までは常にこれ等の２倍以上高く、しかも、８歳を超えると、加齢に伴い対数曲線的に上昇することが観察された。
参考例４：熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止試験
マラリア高度流行地域住民（成人）２５名の血清の、ＳＥ３６タンパク質に反応する血中抗体価の保有状況をＥＬＩＳＡにより検査し、同血清を用いて試験管内における熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止実験を行った。培養液量の５％に相当する量の各血清をＦＣＲ３株、Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株、及びＫ１株のそれぞれに加え、マラリア免疫のない日本人の血清を対照として２４時間後の原虫増殖の阻止能を調べた。その結果、いずれの株においても抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価と増殖阻止能は正の相関を示し、ＳＥ３６タンパク質が原虫増殖阻害的に作用するヒト抗体のエピトープを提供していることが示唆された。さらに、ＳＥＲＡの遺伝子多型はワクチン効果に影響のないことも示唆された（図８）。
参考例５：ＳＥ３６の中和能
実施例２で得たＳＥ３６無菌標品の共存下における、参考例４で用いたマラリア高度流行地域住民の抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価の高い代表的な血清によるＰｆ増殖阻止能の消長を、参考例４に記載の試験管内における熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止実験により測定した。ＳＥ３６との比較対照としてバキュロウイルスベクターにより生産した自然な立体構造を持つ全長ＳＥＲＡタンパク質、及び全長ＳＥＲＡタンパク質の中央部ドメインに由来するＳＥ５０Ａタンパク質（ワクチン効果なし）（Ｖａｃｃｉｎｅ，同前）をそれぞれ用いた。
【００４２】
その結果、マラリア高度流行地域住民の血清のＰｆ増殖阻止能は、ＳＥ３６共存濃度の上昇に伴い最も強く阻害（中和）され、ＳＥ５０Ａでは全く阻害されなかった。また、上記阻害の程度に基づくＳＥ３６の中和能は、全長ＳＥＲＡタンパクのそれに比べ優れていた（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
この発明により、発熱を伴うマラリア症状と死亡の原因となる脳性マラリアの根本原因である、赤血球内でのマラリア原虫（Ｐｆ）の増殖を阻止するＩｇＧ３抗体を誘導する、極めて有効なマラリア予防のワクチンが提供される。併せて、マラリア診断剤が提供される。その結果、上記のＰｆ増殖に伴う、死を招く脳性マラリアの原因とマラリアへの恐怖が一掃される。従って、本発明は、世界有数の多発感染症、マラリアを制圧するための優れて強力な手段として寄与すると共に、地球温暖化に伴うマラリア発生地域の拡大が懸念されている今日にあっては、人類の保健だけではなく、観光、経済、政治等に係るグローバルかつ健全な活動を確保する上で、待望かつ多大の効果と福音をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄの第１６〜３８２番アミノ酸（Ｎ〜Ｅ）配列とポリペプチドＳＥ３６全長アミノ酸配列、第１〜３３４番アミノ酸（Ｍ〜Ｅ）との間の相違を示す。ＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸の１文字記号により記載。Ｈｏｎｄ−１はＨｏｎｄｕｒａｓ−１株、……は同一配列、----は欠失、また、［数字］はＳＥ３６のアミノ酸番号をそれぞれ意味する。
【図２】ポリペプチドＳＥ３６分子の基本構造としての全長アミノ酸配列を示す。ＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸の１文字記号により記載。
【図３】図１に記載のＨｏｎｄｕｒａｓ−１株４７ｋｄアミノ酸配列を基準にし、他のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株のそれとの間の相違を示す。［数字］はＳＥ３６のアミノ酸番号を意味する。
【図４】カラム１は分子量マーカー、カラム２はＳＥ３６を発現していない大腸菌の全タンパク、カラム３はＳＥ３６をＩＰＴＧ添加により発現させた大腸菌の全タンパクの電気泳動像。
【図５】実施例２で調製したＳＥ３６無菌標品（ワクチン原液）のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動像。ＳＥ３６以外の夾雑物の存在が可視的に検出されないことを示す。
【図６】ＳＥ３６タンパク質での免疫によるチンパンジーの抗体価をＩｇＧのサブクラス毎に示したグラフである。
【図７】ＳＥ３６タンパク質で免疫したチンパンジー、およびマラリア免疫を獲得したヒトＩｇＧによるマラリア原虫の増殖阻害を示したグラフである。
【図８】マラリア高度流行地域住民の血清によるＰｆ原虫増殖阻止と、抗ＳＥ３６ＩｇＧ抗体価との間には正の相関のあることを示す。
【図９】マラリア高度流行地域住民の血清によるＰｆ原虫増殖阻止は、比較対照の共存に比べ、ＳＥ３６無菌標品（ワクチン原液）の共存により著しく阻害（中和）されることを示す。図中、○は自然な立体構造を持つ全長のＳＥ３６タンパク質、●はＳＥ３６タンパク質、■はワクチン効果のないＳＥ５０Ａタンパク質を示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、熱帯熱マラリア原虫、プスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の抗原ポリペプチドと、その精製方法、並びにこれより得られる精製抗原を有効成分として用いるマラリアワクチン及び診断剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、１種、又はそれ以上のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の感染により生じ、これには次の４種、熱帯熱マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、以下「Ｐｆ」と略記する）、三日熱マラリア（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）及び卵型マラリア（Ｐ．ｏｖａｌｅ）が知られている。上記原虫は、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の雌カの刺咬により、その唾液腺からｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの状態でヒト体内に侵入し感染する。尚、原虫の生活環の概要は次の通りである：
［カ］原虫の有性増殖によるｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの形成→＜刺咬＞→
［ヒト］ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ＜血中への侵入＞→＜肝細胞内への侵入＞
→［赤血球外期］肝細胞でのｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ→ｓｃｈｉｚｏｎｔ→
ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの形成・肝細胞破壊による血中への
放出→＜ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの赤血球内への侵入＞
→［赤血球内期］ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ→ｒｉｎｇ→ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ
→ｓｃｈｉｚｏｎｔの無性増殖→ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの
形成・赤血球破壊による血中への放出サイクルの反復→
＜発症＞； 又は
ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ→雌雄のｇａｍｅｔｏｃｙｔｅへの
分化→＜吸血＞→
［カ］雌雄ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ→雌雄ｇａｍｅｔｅ→有性生殖→
ｏｏｋｉｎｅｔｅへの分化→ｏｏｃｙｔｅへの分化・増殖→
ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの形成・唾液腺への移動。
また、この発明に係る上記マラリア原虫（Ｐｆ）の抗原に関し、以下に示す合計約４０に及ぶ多種多様な抗原の存在が報告されている：例えば、上記の生活環の赤血球内期（ｉｎｔｒａ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｓｔａｇｅ）ではＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ；別名、ＳＥＲＰ：ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＲＰ−２（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）等；メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）ではＭＳＰ−１（ｍｅｒｏｚｏｉｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＭＳＰ−２（ｍｅｒｏｚｏｉｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−２）、ＡＭＡ−１（ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）等；スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）−赤血球外期（ｅｘｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｓｔａｇｅ）ではＳＳＰ−２（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＬＳＡ−３（ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−３）等；更に、有性増殖期（ｓｅｘｕａｌ ｓｔａｇｅ）ではＰｆｓ２３０，Ｐｆｓ４５／４８等（“Ｔｏｐｌｅｙ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ´ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，第９版、ｖｏｌｕｍｅ ５−Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｐ．３８３，Ｌ．Ｃｏｌｌｉｅｒら著，Ａｒｎｏｌｄ社１９９８年発行）。また、これ等の抗原を単独、混合、あるいは遺伝子ＤＮＡのかたちで用いるワクチンの開発が精力的に試みられてはいるが、実用化されたワクチンは未だ知られていない（“Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａｎ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００”，ｐｐ．１４１−１４２，米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｅａｌｔｈ ２０００年発行）。
【０００３】
更に、この発明に係る前記ＳＥＲＡ（あるいはＳＥＲＰ）とその遺伝子を用いるマラリアワクチンの製造に関する従来技術として、例えば、欧州特許第２８３，８８２号（ＳＥＲＰの１４０ｋｄ抗原遺伝子の第１８８２−１９１７番塩基、第２４０３−２６０２番塩基、及び第２６０２−２６３１番塩基がコードする親水性エピトープ）、米国特許第５，３９５，６１４号（ＳＥＲＰエピトープとＨＲＰ−２との融合タンパク）、米国特許第６，０２４，９６６号（２種のプローブＡとＢで同定される遺伝子がコードするＳＥＲＡ抗原ポリペプチド）、また、ＳＥＲＡの４７ｋｄに由来のＳＥ４７´の発現系と、この系におけるＳＥ４７´抗原の生産に関する報告（Ｖａｃｃｉｎｅ，１４，ｐｐ．１０６９−１０７６，１９９６）等が知られてはいるが、これ等のワクチン抗原の免疫原性や純度等は不十分であり、また、精製工程が量産化には不向きである。更に、その安全性、有効性、又は均質性に係る保証が不明であり、これ等の解決には製造工程に格段の創意や進歩を要する。そのため、これ等の実用化は未だ達成されていない。
【０００４】
ところで、ＳＥＲＡ（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ ａｎｔｉｇｅｎ）は、赤血球内期のＰｆ遺伝子により発現される合計９８９アミノ酸からなる分子量が１１５ｋｄのタンパク抗原であり、その構造はＮ末端からＣ末端方向に順に、４７ｋｄ−５０ｋｄ−１８ｋｄの３つのドメインからなる。これ等のドメインの前駆体としてのＳＥＲＡは、合計５８６８塩基からなるＳＥＲＡ遺伝子ＤＮＡ上に分散する４つのエキソンによる発現後、赤血球内期でのメロゾイト放出の際にプロセッシングされ、上記３ドメインに開裂する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８６，ｐｐ．２４９−２５４，１９９７；及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８５，ｐｐ．１２１−１３４，１９９７）。尚、ＳＥＲＡ遺伝子ＤＮＡとこれがコードするアミノ酸配列の完全長データはＧｅｎＢａｎｋで公開され入手可能である（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｊ０４０００；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。また、ＳＥＲＡのＮ末端領域（以下「４７ｋｄドメイン」と表記する）は、合計３８２アミノ酸からなり、その配列に係るＰｆ株間のホモロジー検索によれば、アミノ酸の欠失や付加の領域、約２０ヵ所におけるアミノ酸の変異（非同義置換）等の散在が見られ多様である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前；及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）。
【０００５】
マラリアは世界において、急性下気道感染症、エイズ、及び下痢症に次ぐ多発感染症であり、ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の推計によれば、１９９９年の罹患は約４，５００万例、そのうち約１１０万例が死亡している（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００，ｐ．１６４，及びｐ．１７０，ＷＨＯ２０００年発行）。かかる高い死亡率は、重篤な熱帯熱マラリア、いわゆる脳性マラリアによるものであり、その主な原因は、Ｐｆ増殖に伴う破壊赤血球の破片の脳血管内での滞積による脳血栓にあり、感覚鈍麻、うわごと、異常行動、痙攣等を経て死に至ると考えられており、かかる脳性マラリアの回避は最重要課題であるといっても過言ではない。
【０００６】
また、マラリア多発の理由として、ｑｕｉｎｉｎｅ、ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ−ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ、ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ、ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ等の抗マラリア剤に対する薬剤耐性あるいは多剤耐性マラリア原虫の出現と蔓延が提起されている。１９５０年代末、南米と東南アジアでのクロロキン耐性Ｐｆの出現が報告されて以来、かかる耐性原虫は現在、中米、カリブ海及び中近東の一部を除く熱帯〜亜熱帯のマラリア発生諸国のほぼ全域に広がり、非常手段としてＤＤＴ散布が余儀なく勧告されるほど、マラリア制圧は国交頻度が激化する今日の保健行政上のグローバル課題となっている（ＷＨＯ Ｅｘｐａｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍａｌａｒｉａ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．８９２、ｐｐ．１−７１、２０００、ＷＨＯ発行）。
【０００７】
更に、地球温暖化によるマラリア発生地域の拡大が将来課題として既に危惧されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７６３−１７６６、２０００）、今や、マラリア対策は全人類に逼迫した緊急の課題となっている。
【０００８】
特に、マラリアのワクチン開発に関し、これまで世界各国においてこのワクチン開発に多大の努力と精力が払われてきたにも拘らず、未だ有効なワクチン完成に至らない主な原因として、次の（ａ）〜（ｃ）の課題が上げられる：（ａ）マラリア抗原は、前述の通り多種多様であるため、かかる抗原からの感染防御抗原の特定が困難かつ曖昧である；（ｂ）マラリア抗原は遺伝子多型であり、Ｐｆ原虫株により互いに抗原性が異なる。従って、Ｐｆ由来の単一抗原、例えば、ＭＳＰ−１やＡＭＡ−１等の周知のワクチン候補抗原は、抗原性のスペクトルが狭く、どのようなＰｆ株に対しても感染予防に必ずしも有効ではない；及び（ｃ）上記のＭＳＰ−１やＡＭＡ−１等のワクチン候補抗原に知られるように、精製工程下で変性し、立体構造あるいはエピトープが破壊され、その抗原性が低下したり消失する。
【発明の開示】
【０００９】
この発明は、熱帯熱マラリア原虫ＰｆのＳＥＲＡ由来のタンパク抗原（ポリペプチドＳＥ３６）と、これをコードする合成ポリヌクレオチド、ポリペプチドＳＥ３６の精製方法、並びにこれより得られる精製抗原を有効成分として用いるマラリアワクチン及び診断剤を提供することにより、上記課題を解決する。
【００１０】
尚、特筆すべきは、この発明が、前述（ａ）〜（ｃ）の課題に対応した次の発見と知見に基づいていることである：（ａ）本発明に係るＳＥ３６抗原に対するＩｇＧ３抗体価が、マラリア流行地域住民のマラリアに対する獲得免疫とほぼ完全に相関するという驚くべき発見、及びかかる住民の血清中の上記ＩｇＧ３抗体は赤血球内でのＰｆ増殖を阻止するという知見（Ｐｆ増殖阻止により、マラリアによる発熱及び赤血球破壊の抑制、ひいては脳性マラリアによる死亡の防止が達成される）；（ｂ）このＳＥ３６抗原は、抗原性のスペクトルが広く、ＳＥＲＡ４７ｋｄドメインに見られる遺伝子多型の代表的なタイプであるＦＣＲ３、Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１、及びＫ１の３株（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）の共通抗原として機能し、前記ＩｇＧ３抗体は、中和反応により、これ等の全タイプのＰｆ原虫の増殖を阻害するという発見；及び（ｃ）量産下でのＳＥ３６抗原の抗原性あるいはエピトープが、破壊ないしは損なわれない精製方法の発見。
【００１１】
この発明は、前記のとおりの発見および知見に基づき、以下の（１）−（１０）の発明を提供する。
（１）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換：
第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ
の１または数個を有するポリペプチドＳＥ３６変異体。
（２）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１８番Ｇｌｙと第１９番Ｇｌｙとの間に、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（３）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に、配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（４）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失したポリペプチドＳＥ３６変異体。
（５）配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失した請求項１のポリペプチドＳＥ３６変異体。
（６）前記（１）から（５）のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリアワクチン。
（７）前記（１）から（５）のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリア診断剤。
（８）前記（１）から（５）のいずれかのポリペプチドＳＥ３６変異体をコードする合成ＤＮＡ断片。
（９）前記（８）の合成ＤＮＡ断片によって形質転換した大腸菌の培養液から集菌の後、菌体破砕、塩析による分画、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、Octyl Sepharose疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析による沈殿、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、及び透析の順序で、これ等の各工程を行うことを特徴するポリペチドＳＥ３６変異体の精製方法。
（１０）ポリペプチドＳＥ３６変異体の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌになるように調整した後に透析を行う前記（１０）の精製方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ポリペプチドＳＥ３６分子の基本構造：
この発明に係るポリペプチドＳＥ３６（以下「ＳＥ３６」と略記する）は、前述した熱帯熱マラリア原虫ＰｆのＨｏｎｄｕｒａｓ−１株のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄ（以下「４７ｋｄ」と略記する）を基礎とするＳＥ４７´抗原（Ｖａｃｃｉｎｅ，１４，ｐｐ．１０６９−１０７６，１９９６；以下、「ＳＥ４７´」と略記する）に由来し、４７´ｋｄのセリン反復領域の全長又は一部分が切除された基本構造からなる。ＳＥ３６分子の基本構造と上記（Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株由来の）４７´ｋｄとの間のアミノ酸配列の相違を図１に、また、ＳＥ３６分子の基本構造の全長アミノ酸配列を図２に、それぞれ示す。尚、これ等の図では、アミノ酸配列がＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸１文字記号を用いて記載されている。また、図１では、前記Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株がＨｏｎｄ−１と略記され、この株と他のＰｆ株との間のホモロジー検索により検出される欠失領域は----で、同一のアミノ酸配列は……で、それぞれ表記されている。図１において、ＳＥ３６の基本構造は、Ｈｏｎｄ−１の４７ｋｄを構成する合計３８２アミノ酸のＮ末端のメチオニンを起点（第１番アミノ酸）としてＣ末端方向に順次、序数付けした第１６番アミノ酸（アスパラギン）のコドンを、開始コドン（メチオニン）に置換し、かつ、第３８２番アミノ酸（グルタミン酸）の後に翻訳停止コドンを隣接挿入し、更に、そのセリン反復領域を占める合計３３個の重合セリン残基（第１９３番から第２２５番セリンまで）を切除した合計３３４アミノ酸からなるポリペプチドである。
【００１３】
尚、上記の図１−２と対比される「配列表］において、［配列番号１］は、前記Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄ遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列と、それがコードする４７ｋｄ完全長アミノ酸配列を示す。
【００１４】
［配列番号２］は、配列番号１に記載の４７ｋｄの完全長アミノ酸配列を示す。この配列は、合計３８２アミノ酸からなり、その第１６〜３８２番アミノ酸までが、図１と後述する図３に記載の各Ｈｏｎｄ−１のそれと同じである。
【００１５】
［配列番号３］は、ＳＥ３６遺伝子の大腸菌コドンへの変換後の合成ＤＮＡの完全長塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列を示す。その第１番アミノ酸Ｍｅｔは、前記４７ｋｄの第１６番アミノ酸Ａｓｎが開始コドンＭｅｔに置換された形になっている。また、塩基配列は、ほとんど全てのＰｆコドンから大腸菌コドンに変換されている。かかる大腸菌コドンへの変換に関しては後述される。
【００１６】
［配列番号４］は、配列番号３に記載のＳＥ３６分子の基本構造としての完全長アミノ酸配列を示す。この配列は、図１に記載のＳＥ３６、及び図２に記載の各アミノ酸配列と同じである。
ＳＥ３６の誘導体・変異体：
ＳＥ３６の変異に関し、図３に例示する。この図は、図１に記載のＨｏｎｄｕｒａｓ−１株（Ｈｏｎｄ−１）のアミノ酸配列を基準に用い、図１と同じ約束でアミノ酸番号を付し、欠失は----、また、同一配列は……の表記により、他のＰｆ株（ＨＢ３、Ｔ９／９６、３Ｄ７、Ｋ１、Ｔ９／１０２、ＰＡ／７、及びＣａｍｐ）の各アミノ酸配列を併記し、これ等の株間のアミノ酸配列の相違を示す。尚、図３では上記基準（Ｈｏｎｄ−１）と他の株との間のアミノ酸配列の変異又は相違の個所がアミノ酸１文字記号で示されている。
【００１７】
以下、上記の図３に記載のアミノ酸変異の位置と領域、並びにこれ等のアミノ酸番号、及び配列表の配列番号４に記載のＳＥ３６基本構造のアミノ酸配列に基づき、図３と配列番号４の両記載を対応させ、ＳＥ３６の誘導体あるいは変異体の構成と態様につき説明する。
【００１８】
ＳＥ３６分子の基本構造は、図２（配列番号４）に示す通り、合計３３４アミノ酸からなるポリペプチドであるが、この構造の加工、変形、修飾等により、その誘導体あるいは派生体、修飾体、変異体等を得ることができる。これ等は、図３の記載に基づくアミノ酸の非同義置換、オリゴペプチドの付加あるいは欠失、及びセリン反復（ｓｅｒｉｎｅ−ｒｅｐｅａｔ）領域を占める重合セリン残基数の制限、また、４７ｋｄエピトープ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，同前）の選択等の単独利用あるいは適宜、組合せて用いることにより調製することができる。即ち、この発明によれば、次の（１）−（４）が可能である。
（１）配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において次のアミノ酸置換(a)〜(v)から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換が可能である：
(a) 第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
(b) 第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
(c) 第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
(d) 第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
(e) 第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
(f) 第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
(g) 第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
(h) 第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
(i) 第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
(j) 第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
(k) 第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
(l) 第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
(m) 第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
(n) 第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
(o) 第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
(p) 第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
(q) 第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
(r) 第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
(s) 第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
(t) 第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
(u) 第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
(v) 第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ。
（２）図３に記載のＰｆ株間相互のアミノ酸配列の付加あるいは欠失を考慮し、配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において、次のオリゴペプチドの付加、あるいは欠失の組合せ加工(i)〜(vi)が可能である：
(i)第１８番Ｇｌｙと第１９Ｇｌｙとの間に配列番号５のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(ii)第１８番Ｇｌｙと第１９Ｇｌｙとの間に配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(iii)第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に配列番号７のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(iv)第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの付加；
(v)第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの欠失；
(vi)第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの欠失。
（３）配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列において第１７５番Ａｓｐと第１７８番Ｇｌｕとの間でペプチド結合により重合するセリン残基数が０〜３０、好ましくは０〜２０、更に好ましくは１０を超えない範囲、即ち、０から１０の範囲内が望ましい。かかるセリン残基数の制限は、３５個の重合セリン残基を有する前述ＳＥ４７´は精製が困難であり、その実用化に至らなかったという本発明者の経験（Ｖａｃｃｉｎｅ、前出）、及びセリン反復領域の重合セリン残基数とＳＥ３６の物性との間の関係「重合セリン残基数の減少に伴い、ＳＥ３６の水溶性あるいは可溶化性、更に、その抗原性あるいは免疫原性がいずれも高まる」という驚くべき発見に基づいている。この現象は、重合セリンの切除が、ＳＥ３６分子の立体構造に変化をもたらし、そのエピトープを含む親水性領域が露出されることを示唆する。従って、この発明によれば、ＳＥ３６を可溶化しその精製を容易にすると共に、その抗原としての機能と品質を高めるには、セリン反復領域の重合セリン残基数の制限は、必須条件である。
（４）上述のセリン残基数の制限と４７ｋｄエピトープの選択利用との組み合せにより、ＳＥ３６との間で交差する抗原性を有し、かつ、アミノ酸のホモロジー検索により検出されるセリン反復領域の重合セリン残基数が、例えば、０から１０の範囲内にあるポリペプチドを調製することができる。尚、この発明では、上記抗原性の交差は抗原抗体反応により検出し、セリン反復領域はＳＥ３６（配列番号４）の第１５７番Ｇｌｙから第１８３番Ａｓｎまでのアミノ酸配列を比較基準として用いるアミノ酸のホモロジー検索により検出することができる。
【００１９】
以上につき換言すれば、配列番号４に記載のＳＥ３６のアミノ酸配列は、ＳＥ３６本来の抗原性・免疫原性、及びこれ等のスペクトルが損なわれない限り、その分子構造を多様に修飾、変形あるいは加工することができる。即ち、この発明に係るポリペプチドＳＥ３６は、配列番号４に記載のＳＥ３６基本構造のみならず、上記（１）−（４）に記載のアミノ酸又はオリゴペプチドの付加、切除あるいは置換等による上記構造の誘導体あるいは派生体、変異体、修飾体等をも包括する、これ等すべての総称である。また、これ等のＳＥ３６は、ワクチン及び診断剤の有効成分として、個別に単独使用できるだけではなく、抗原性や免疫原性のスペクトルを広げるため、これ等の少なくとも２種を混合することにより用いることができる。
【００２０】
更に、特筆すべきは、ＳＥ３６の生産において、ＳＥ３６をコードする自然界の４７ｋｄ遺伝子ＤＮＡ断片そのものを全く使用しないことである。この発明によれば、ＳＥ３６の量産は、そのアミノ酸配列をコードする自然界のＰｆコドンを全て大腸菌コドンに変換したかたちで、全長ＳＥ３６をコードするＤＮＡ断片（以下、ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡと記載することがある）を合成かつクローニングした後、その合成遺伝子クローンの発現ベクターを構築し、次いで、これを宿主大腸菌に移入し、作成される形質転換体を培養することにより行う。尚、上記のＤＮＡ合成による大腸菌コドンへの変換は、本来のＰｆコドンのＳＥ３６遺伝子ＤＮＡは大腸菌での発現効率が低いので、ＳＥ３６の量産を目的とした産業上利用の観点からこれを高めるために行う。以下、これにつき更に詳しく説明する。
ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡの合成とクローニング：
Ｐｆの机上のＳＥ３６遺伝子ＤＮＡ塩基配列とそれがコードするアミノ酸配列は、衆知の遺伝子データベース公開機関、例えば、ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等からインターネットにより入手可能である。
【００２１】
Ｐｆコドンから大腸菌コドンへの机上の変換は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＣｏｄｅｎ Ｕｓａｇｅデータベースや発明者の既報（前述のＶａｃｃｉｎｅ；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、６３、２６５−２７３、１９９４）等を参考に用いることにより行うことができる。大腸菌コドンへの変換においては、Ｎ末端アミノ酸を開始コドンのＭｅｔに置換する以外は、自然界におけるＰｆ本来のアミノ酸配列を十分に重視し、その抗原性がアミノ酸の非同義置換により損なわれないよう留意する。
【００２２】
ＤＮＡ合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍｅｄｅｌ ３９２：ＰＥ社（米国）製］、ＡＳＭ−１０２Ｕ ＤＮＡ合成機［ＢＩＯＳＳＥＴ社（米国）製］等を用いることができる。かかる合成機により、約１００ないし約２００ヌクレオチドが重合のセンス（＋）とアンチセンス（−）の両鎖ＤＮＡ断片を別途に合成の後、各合成ＤＮＡ断片は、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動により精製する。次いで、精製された単鎖ＤＮＡ断片の相補鎖（対）のアニーリングにより合成２本鎖ＤＮＡ断片を調製する。
【００２３】
合成２本鎖ＤＮＡ断片のクローニングには、既知又は市販の、宿主が大腸菌のクローニング用ベクター（“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｉ−１〜Ｉ−Ｄ−ｉ−８、Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓら著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ１９８８発行に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋と大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅとの組合せ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製］を用いることができる。かかるクローニングでは、例えば、上記ＤＮＡ断片の制限酵素断片を、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係し構築したベクターを宿主に移入することにより、形質転換体としてのクローンが得られる。次いで、２本鎖ＤＮＡ断片の各クローンは、上記形質転換体の培養により増幅の後、これ等の各塩基配列をチェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ法）やマクサム・ギルバート法により決定する。尚、これには、市販のＤＮＡシーケンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００［ＰＥ社（米国）製］を用いることができる、その結果に基づき、ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡの全長をカバーする２本鎖ＤＮＡ断片を約５〜１０クローンを選択する。
【００２４】
全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡのクローニングは、前記２本鎖ＤＮＡ断片クローンの連結により行う。例えば、前記において８クローン（８対）が選択された場合には、これ等の２本鎖ＤＮＡ断片を順次、連結することにより全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡを得ることができる。次いで、この全長ＤＮＡを、前述と同様にしてクローニングする。尚、上記連結の際には、２本鎖ＤＮＡの各断片の両末端に連結用の制限酵素ｃｏｈｅｓｉｖｅサイトの導入が望まれる。但し、かかる導入には、Ｐｆ本来のアミノ酸配列が変化しないよう、コドンとしての塩基配列を整合させる必要がある。
ＳＥ３６遺伝子の発現系の構築：
ＳＥ３６遺伝子の発現ベクターの作成には、既知又は市販の、宿主が大腸菌の発現用ベクター（“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、同前に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドｐＥＴ−３ａと、大腸菌ＢＬ２１（ＤＬ３）ｐＬｙｓＳ、又は大腸菌ＢＬ２１（ＤＬ３）ｐＬｙｓＥとの組合せ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）製］を用いることができる。かかる作成は、例えば、前記クローニングベクターから全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡを含む制限酵素断片を切出した後、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係することにより行う。また、ｐＥＴ−ＳＥ４７´（Ｖａｃｃｉｎｅ、同前）からも作成することができる。この場合には、例えば、ｐＥＴ−ＳＥ４７´又はこれが保有のＳＥ４７´合成遺伝子からセリン反復領域をコードする全領域ないしは一部領域を制限酵素で切除することにより、上記と同様にして作成することができる。次いで、作成した発現ベクターを宿主に移入することにより形質転換体が得られる。かかる形質転換体から、ポリペプチドＳＥ３６の量産を指標として、ＳＥ３６遺伝子の発現系として産業上利用の観点から適確なものを選別することができる。
ポリペプチドＳＥ３６の生産：
ＳＥ３６の量産は、上記の大腸菌形質転換体の培養により行う。尚、かかる培養系は、ＳＥ３６の生産収率を高める観点から、インデューサー、例えば、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の使用、カタボライト・リプレッションの回避、培地組成、培養の温度と時間、宿主細胞内プロテアーゼの除去等につき改良あるいは改善することが可能であり、これ等は、発現ベクターの改造、更に、プロモーターや宿主菌株の変更等により行うことができる。
ポリペプチドＳＥ３６の精製：
ＳＥ３６が細胞外へ分泌される場合には、上記の形質転換体の培養物の除菌培養液を上記ＳＥ３６抽出の出発材料として用いる。細胞内に蓄積される場合は、例えば、培養物から遠心、濾過等により集菌し採取した菌体から上記ＳＥ３６を抽出する。先ず、抽出第一段階としての菌体の破砕には、酵素による消化、浸透圧による破壊、急激な加圧減圧、超音波、種々のホモジナイザー等々を用いることができる。次いで、菌体破砕物を分別するための手段として、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、吸脱着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳動、カラムクロマトグラフィー、支持体、透析、塩析等を、それぞれ組合せて用いることができる。また、これ等の手段の適用においては、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度等の物理化学的条件を適宜、設定できる。
【００２５】
この発明では、上記の多種多様な手段と条件のうち、超音波処理、硫安塩析、遠心、カラムクロマトグラフィー、濾過、膜濃縮等を組合せて用い、これ等を次に記載の精製工程（１）−（１０）の順序で行うことにより、ＳＥ３６ポリペプチドを精製する：
（１）培養菌体ペーストの超音波による破砕と遠心による細胞破片の除去；
（２）４℃の水に対する硫酸アンモニウム（以下「硫安」と略記する）の飽和度 が、下限２０％と上限５０％、望ましくは下限３０％と上限３５％になるよう硫安を添加混合する塩析による分画；
（３）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、０．２％（Ｗ／Ｗ）から５％（Ｗ／Ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０、望ましくは１％（Ｗ／Ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０、更に、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液によるＳＥ３６ポリペプチドの可溶化；
（４）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液による、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（５）Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性カラムクロマトグラフィーによる分画と透析；
（６）３５−６５％飽和硫安、好ましくは４５−５５％飽和硫安による塩析；
（７）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液によるＳＥ３６ポリペプチドの可溶化；
（８）６Ｍから完全飽和までの尿素、望ましくは９Ｍ尿素と、ジスルフィド結合を還元するに十分な濃度の２−メルカプトエタノール、若しくはジチオスレイトール、あるいは他の還元剤を含有する緩衝液による、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（９）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００又はＳ−２００、あるいはこれに相応する分子ふるいのカラムクロマトグラフィーを用いる分子量による分画；
（10）ＳＥ３６タンパク質の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜３０μｇ／ｍｌになるように調整後、透析；
（11）膜濃縮。尚、ワクチン調製のための無菌化は、例えば、０．２２μＭ−フィルターによる濾過滅菌により行う。
ＳＥ３６分子とその抗原性の確認：
ＳＥ３６分子の検出とサイズの確認は、例えば、沈降係数の測定、分子ふるい、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動等により行うことができる。また、ＳＥ３６分子の抗原性は、ＳＥＲＡの４７ｋｄに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、ＥＬＩＳＡ、凝集反応，蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ等での抗原抗体反応により確認できる。更に、ＳＥ３６ポリペプチドの免疫原性、及び抗ＳＥ３６抗体のＰｆ原虫増殖阻害能は、熱帯熱マラリア患者の血清や、該ポリペプチドで免疫した実験小動物、例えば、ラットやマウス等の血清等を用いる上記抗原抗体反応、Ｐｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅの赤血球内での増殖阻止試験（いわゆる中和反応）、ＳＥ３６抗体の保有者の血中Ｐｆ数の測定等により確認することができる。
ワクチンの調製：
先ず、前記の精製ポリペプチドＳＥ３６を抗原として、これを溶媒、例えば、等張のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に浮遊し、ワクチン原液を調製する。
【００２６】
尚、上記ワクチン抗原は常用の不活化剤で固定化することにより立体構造を安定化できる。不活化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β−プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に添加して用いることができる。ホルマリンを使用の場合、その添加量は約０．００５−０．１％（Ｖ／Ｖ）、不活化温度は約４−３８℃、不活化時間は、約５−１８０日である。但し、不活化により抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する、かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要なら、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。
【００２７】
また、ワクチンの経口や経鼻接種による粘膜免疫あるいは局所免疫の誘導を目的として、上記ＳＥ３６抗原を加工あるいは修飾できる。これには、例えば、リポソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェアー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等を用いるＤＤＳ（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）に係る技術を適用できる。以上により得られた調製物をワクチン原液として次の工程に供する。
【００２８】
上記ワクチン原液を、例えば、前記ＰＢＳで希釈し、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導し、免疫を奏するに必要な量になるよう調整する。その際、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合できる。例えば、安定化剤として、糖類やアミノ酸類、また、アジュバントとして、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等を利用できる。
【００２９】
次いで、適当な量、例えば、約１−２０ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封の後、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより。乾燥製剤として使用に供することができる。
ワクチンの検定：
ワクチンの工程管理及び品質管理に係る検定は、薬事法（昭和３５年法律第１４５号）第４２条第１項の規定に基づく日本国の規程「生物学的製剤基準」、ＷＨＯの勧告“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”［ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ（ＴＲＳ）、Ｎｏ．８８９、ｐｐ．１０５−１１１、１９９９］等に準拠して行われる。マラリアワクチンは、未だ実用化されておらず、その製剤基準が存在しないので、その検定は、これに類似のワクチンに係る基準、例えば、上記ＷＨＯの勧告“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖａｃｃｏｉｎｅｓ Ｍａｄｅ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（上記ＴＲＳ、Ｎｏ．７８６、１８９８、及びＮｏ．８８９、１９９９）、“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ”（上記ＴＲＳ、Ｎｏ．７７１、１９８８）等に記載の安全性と有効性に関する種々の規定に準拠し行うことができる。例えば、無菌、異常毒性否定、タンパク質含量、純度、水素イオン濃度、抗原確認、抗原ポリペプチド等、要求あるいは勧告される種々の試験規定に準拠して検定を行い、これ等の全ての検定試験に合格した製造ロットを適格なマラリアワクチン製剤として実用に供する。
ワクチンの用法：
ワクチン接種は、例えば、１ドーズ約０．２５−０．５ｍｌを皮下接種する。尚、かかる接種は、約２−４週間隔で１−３回、行う。但し、ワクチン用法は、上記の例にのみ限定されるものではない。
診断剤の調製：
ＳＥ３６ポリペプチドは、マラリアの診断用抗原、例えば、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等の抗原として提供できる。また、上記ポリペプチドを動物、例えば、ウサギ、モルモット、マウス等の腹腔内、皮下や筋肉内等に接種し、抗体産生させたこれ等の動物の血清から抗体を作成することができる。かかる抗体は，例えば，上記の各種診断法での抗原検出用として提供できる。尚、この発明に係る診断用の抗原や抗体は、これ等の診断剤中の含量が、抗原抗体反応を呈するに必要な量となるよう、溶媒、例えば、前記ＰＢＳで希釈調整し使用に供する。
【００３０】
以下、この発明の態様並びに構成と効果を、実施例及び参考例を示し、具体的に説明する。但し、本発明は、これ等に限定されるものではない。
実施例１：ＳＥ３６発現系の構築
Ｐｆコドンから大腸菌コドンに机上で変換した全長ＳＥ３６遺伝子ＤＮＡ塩基配列を８分割し、各分割断片のセンス（＋）鎖とアンチセンス（−）鎖の単鎖ＤＮＡ断片を合計１６本（８対）合成すると共にアニーリングし、合計８対の２本鎖ＤＮＡを調製の後、これ等を相互に連結し、全長ＳＥ３６遺伝子を作成し、その発現ベクターを構築した。尚、合成ＤＮＡ断片のクローニングと連結の基本操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）により行った。
【００３１】
前記の単鎖ＤＮＡ断片はそれぞれ、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｍｏｄｅｌ ３９２”［ＰＥ社（米国）製］を用いて合成した。これ等の合成断片は、１０％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミド（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３，１ｍＭ ＥＤＴＡ，及び８Ｍ 尿素を含有）の電気泳動により精製した。次いで、２０p moles の精製断片ＤＮＡの各＋と−の相補鎖を混合の後、緩衝液（２０μl の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ2）中で８５℃、５分間、保温した。更に、上記両鎖の相補領域をアニーリングするため、ＺｙｍｏｒｅａｃｔｏｒII［ＡＴＴＯ社（日本）製］を用い、その温度を５℃／５分の割合で５５℃まで、次に、５℃／１０分の割合で２５℃まで下げた。アニーリング終了の後、等量の緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４種のｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＴＰ）の各１ｍＭ ＮＴＰ、及び３units のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ］を添加混合し、４℃で５分、２５℃で５分、更に、３７℃で１２０分、順次、保温した。これより得られた各２本鎖ＤＮＡ断片は、ＳＥ３６遺伝子の構築に用いるため、制限酵素ＫｐｎI及びＢａｍＨIで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋と大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅでクローニングかつ増幅し、各クローンの上記ＤＮＡ断片の塩基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法で決定すると共に、全長ＳＥ３６遺伝子をカバーする８クローンを選定した。これ等の８クローン（８対）の合成２本鎖ＤＮＡ断片を連結することにより全長ＳＥ３６遺伝子の２本鎖ＤＮＡを調製した。尚、その際、Ｐｆ本来のアミノ酸配列が変化しないよう配慮された塩基配列を利用して、連結用の制限酵素サイトが各対ＤＮＡの両末端に導入された。次いで、全長ＳＥ３６遺伝子は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋でクローニングの後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに移入し増幅すると共に、その塩基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法で決定した。その結果を配列表の配列番号３に示す。
【００３２】
次いで、上記クローンの制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＥＴ−３ａのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ両切断サイトに挿入連係し、ＳＥ３６発現ベクターｐＥＴ−ＳＥ３６を構築した。この発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに移入することにより形質転換体、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ−ＳＥ３７を作製し、これを大腸菌ＢＬ／ＳＥ３６と命名した。
実施例２：ＳＥ３６の発現と精製
実施例１で得た大腸菌ＢＬ／ＳＥ３６をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ培地［Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ １％（Ｗ／Ｖ）、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％（Ｗ／Ｖ）、及びＮａＣｌ １％（Ｗ／Ｖ）］で３７℃にて１８時間培養しシードを調製した。次いで、上述の新鮮ＬＢ培地５L に上記シード５0 ｍｌを接種した後、３７℃で培養した。菌数が１×１０８／mlに達した時点で、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を、最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう添加混合の後、更に、３７℃にて３時間培養した。培養終了後、遠心（５，０００ｒｐｍ、１０分）により集菌し、細胞ペースト３．２ｇを得た。このペーストを、９．６ｍｌの氷冷した溶菌（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁の後、以下（１）−（６）の操作を記載の順に、４℃で行った。
（１）超音波処理
超音波（１９．５ｋＨｚ、５０Ｗ）で２０秒間、６回処理により上記ペースト細胞を破砕の後、その遠心（１５，０００ｒｐｍ、３０分）上清を採取し、２０ｍｌ容のビーカーに移注した。
（２）硫安塩析Ｉ
上記ビーカー内液に、攪拌下で２．３７ｇの結晶（ＮＨ4）2ＳＯ4 を３５％（Ｗ／Ｗ）飽和になるよう添加混合し、更に、３０分間撹拌を続け塩析を行った。次いで、これを遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、その上清を捨て、沈渣に、３０％（Ｗ／Ｗ）硫安飽和になるよう９ｍｌの氷冷硫安溶液［１．１Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4を含有の前記ｌｙｓｉｓ緩衝液］を加え、懸濁した。この懸濁液を遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、その上清を捨てた後、８．８ｍｌの溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、９Ｍ 尿素、及び１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０］を添加し、沈渣を再懸濁し回収した。この再懸濁液の１／２量（４．４ｍｌ）を６０℃で１０分間保温し、再び氷冷の後、０．４５μｍ−フイルター［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国）製］で濾過した。
（３）カラム精製Ｉ
上記濾液を、ＧＦ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び８Ｍ 尿素］で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（２６／６０）カラムクロマトグラフィー（流速０．３ｍｌ／分、４℃）で分画（３．５ｍｌ／分画）した後、第２２−４３各分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その泳動像に基づき検出されるＳＥ３６タンパク質を多量に含む第３２−３７分画をプールした。残りの再懸濁液（４．４ｍｌ）も上記と同様に処理した後、前記の分画プールと併せて次（４）の操作に用いた。
（４）カラム精製II
上記の分画プールを室温に置き、攪拌下でこの分画プール１ｍｌ当たり０．０９３ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4 を添加混合し、硫安の最終濃度が０．７Ｍになるよう調整した。一方、容量１３ｍｌの水性カラムＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１０倍量のＨＩＣ緩衝液［０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有の前記ＧＦ緩衝液］で平衡化した。このカラムに上記の硫安濃度調整の分画プールを流速０．５ｍｌ／分にて流入した。更に、吸光度が下がるまでＨＩＣ緩衝液を流入の後、確認のため、（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有しないＧＦ緩衝液により吸着成分を溶出した。このカラムでの未吸着分画を透析バッグに入れ、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）を外液に用い４℃で１０時間、透析した。尚、この透析の間、外液を２回交換した。
（５）硫安塩析II
透析済みバッグを更に、０．３Ｌの５０％（Ｗ／Ｗ）飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有］を外液に用い４℃で１０時間、透析することにより、タンパク質を沈殿させた。この沈殿物は、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）により、沈渣として回収の後、２ｍｌのＧＦ緩衝液に懸濁した。
（６）カラム精製III
上記の懸濁液を６０℃で１０分間保温の後、４℃に戻した。これを前記０．４５μｍ−フィルターで濾過し、その濾液を流速０．３ｍｌ／分にて、ＧＦ緩衝液２［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び８Ｍ 尿素］で平衡化した前記Ｓ−３００カラム（２６／６０）にかけ分画した。前述（３）と同様にして、各分画のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、ＳＥ３６タンパク質の分画を選別の後、これ等をプールして該分画１２ｍｌを得た。この分画プールを希釈用緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２Ｍ尿素]に撹拌添加し、ＳＥ３６タンパク質の濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように希釈した。この希釈液を２ＬのＰＢＳ［９ｍＭ ＮａＨＰＯ4、３ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、及び１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］を外液に用い４℃で１０時間、透析した。尚、この透析の間、外液を２回交換した。次いで、透析終了後の内液を、Ｃｅｎｔｐｒｅｐ ３０で濃縮した後、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ０．２２μｍ−フィルター［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 （米国）製］で濾過滅菌し、ＳＥ３６タンパク質を１ｍｇ／ｍｌを含有の無菌標品１０ｍｌを得、これをＳＥ３６ワクチン原液として４℃に保存し、爾後の検定に供した。
【００３３】
上記標品の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では４０ｋｄのＳＥ３６タンパク質のメインバンドのほかに数本のバンドが可視検出された（図５）。これらのバンドは全てウエスタンブロットにおいて、抗ＳＥ３６モノクローナル抗体と反応することが確認され、上記標品の純度は９９％（Ｗ／Ｗ）を超えると推定された。
【００３４】
尚、タンパク質濃度は、１ｍｇ＝０．４９１（ＯＤ278 ）を以て算出した。この値は、ＳＥ３６分子にはＴｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅがそれぞれ１、１０及び９個存在し、これ等を合算した分子吸光係数、ε278 ＝１９１６０／モルに基づいた。
実施例３：アミノ酸配列決定
実施例２で得たＳＥ３６タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は、タンパク質シークエンサー Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ［ＰＥ社（米国）製］を用いるエドマン分解により決定した。その結果を図２及び配列表の配列番号４に示す。
実施例４：抗原性および免疫原性の検定
実施例２で得たＳＥ３６ワクチン原液中のＳＥ３６タンパク質の抗原性と免疫原性につき、次（１）−（３）の通り検定した。
（１）ワクチンの調製
上記ワクチン原液をＰＢＳで５倍階段希釈し、抗原量（μｇ／０．０５ｍｌ）が２００、４０、及び８の各溶液をそれぞれ調製し、等量（Ｖ／Ｖ）のフロイントコンプリートアジュバント、及び、フロイントインコンプリートアジュバントと混合し、エマルジョンにし、前者を第一回免疫、後者を第２回および第３回免疫に用いた。
（２）マウス免疫血清の作製
７週齢、雌のBALB/cマウス［ＣＬＥＡ社（日本）製］を合計２０匹（５匹／群、合計4 群）用い、上記ワクチンを０．１ｍｌ／マウスずつ、初回免疫、初回から７日目及び２１日目の合計３回、皮下接種した。第１群マウスには抗原量２００μｇのワクチンを、また、第２群は４０μｇ、第３群は８μｇ、尚、第４群マウスにはＰＢＳをアジュバントと混合したものを０．１ｍｌ／マウス、皮下接種し比較対照として用いた。初回免疫から３０日目に各マウス毎に採血し、その血清は、マウス毎に個別に５６℃で３０分加熱により非働化した後、全て−２０℃に保存し、マウス抗血清、及び比較対照マウス血清としてそれぞれ爾後の検定に供した。尚、上記の第１−３群の免疫マウスは全て、ワクチン接種後の飼育の間、比較対照の第４群マウスと同様に健常であり、異常な体重減少・行動・排泄物・外観、及び死亡例はいずれも見られず、このワクチンの安全性が確認された。
（３）Ｐｆ増殖阻止試験
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＨｏｎｄｕｒａｓ−１株を用い、その培養と維持は、Ｔｒａｇｅｒ及びＪｅｎｓｅｎの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９３、６７３−６７５、１９７６）、及びＢａｎｙａｌ及びＩｎｓｅｒｂｅｒｇの方法（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｇｉｅｎｅ、３４、１０５５−１０６４、１９８５）により行った。先ず、培養下のＰｆ寄生赤血球の８０％がｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ及びｓｃｈｉｚｏｎｔが寄生の赤血球に達したとき、その維持培地を新鮮赤血球で希釈し、この寄生赤血球数を全血球数の０．５ ％に調整した。次いで、これを更に完全培地で希釈して赤血球濃度を2 ％（Ｖ／Ｖ）に調整することにより、Ｐｆ寄生赤血球培養液を調製した。この培養液を９６ウエルのマイクロプレートに１００μｌ／ウエルずつ滴下の後、１／２０量（５μｌ）の前記（２）のマウス抗血清と混合し、３７℃で７２時間培養した。比較対照には前述のＰＢＳ接種のマウス血清を用いた。培養終了後、これをスライド上に塗布してギムザ染色し、スライド上の５０００個の赤血球を検鏡し、Ｐｆ寄生赤血球数を計数した。Ｐｆ増殖阻止率（％）は、これより計数された同一希釈血清の存在下でのＰｆ寄生赤血球数を用いる次式、
１００×（１−マウス抗血清下でのＰｆ寄生赤血球数／
比較対照マウス血清下でのＰｆ寄生赤血球数）
により算出した。その結果、前記の第１群および第２群（各群５匹）の各マウス抗血清はいずれも上記阻止率が９０％、また、第３群の５匹マウスの平均値は７０％であった。尚、マウス抗血清及び比較対照マウス血清は、上記の阻止試験前にそれぞれ、次の前処理を行った：これ等の各々の０．５ｍｌに、２ｍｌの赤血球パックとを添加混合の後、３７℃で２時間保温し、次に、室温で遠心（１，５００ｒｐｍ、５分）し、その上清を採取した。この上清に更に０．５ｍｌの新鮮赤血球パックを添加混合の後、上記と同様にして保温及び遠心を行い、その上清を採取し、これを上述の阻止試験に供した。
（３）抗原解析
ＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析にはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット［Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製］を用いた。ＥＬＩＳＡには、抗原としてＳＥ３６タンパク質を、また、基質として２，２´−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄを用いた。ＥＬＩＳＡ価は、５０５ｎｍのマイクロプレートリーダー“Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣＣ／３４０ ＫＭII”［Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ Ｓｃｉｅｎｆｉｃ社（米国）製］で読み取り、吸光度０．３で判定した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析には基質としてｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを用いた。
【００３５】
Ｐｆ寄生赤血球は、少なくともその８０％が成熟ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ及びｓｃｈｉｚｏｎｔが寄生の赤血球の培養物から調達した。この寄生赤血球を、０．０７５％（Ｗ／Ｖ）サポニン溶液中で３７℃で１０分間、静置して溶かした後、遠心（５，０００ｇ、５分）し、その沈渣を採取した。次いで、沈渣をＰＢＳに浮遊の後、この浮遊液をｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプル緩衝液と混合し、マラリア細胞破砕液としてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析に供した。
【００３６】
前記の第１群〜第３群（各群５匹マウス）のＥＬＩＳＡ価の平均値は、第１群が９０，０００、第２群が８８，０００、第３群が４２，０００、及び第４群の比較対照は１００未満であった。また、前記マラリア細胞リゼートのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析の結果、第１群〜第３群の各マウス抗血清と反応するタンパク質が１２０ｋｄの位置に検出され、他方、第４群の各マウス血清と反応するタンパク質は全く検出されなかった。尚、上記分析は、上記細胞破砕液を１２．５％（Ｗ／Ｖ）ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた泳動像をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｙｎｉｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）に移した後、前記の第１群〜第３群のマウス抗血清、及び比較対照マウス血清とそれぞれ反応させることにより行った。
実施例５：チンパンジーを用いた免疫試験
ＳＥ３６タンパク質を水酸化アルミニウムゲルに吸着させて調製した試作ワクチンをチンパンジーに接種し、各時点で採血した血液について血液学的及び血液生化学的検査を行うと共に、その血清について免疫応答を試験した。
（１）方法
３頭のチンパンジーに、試作ワクチンを１回当たりＳＥ３６タンパク質として４５０μｇ（雄、１１才）、５０μｇ（雌、１０才）、１０μｇ（雌、６才）ずつ背中に皮下接種した。試験スケジュールは、初回接種を０週とし、４週目に追加接種を行った。また、採血を各接種前に行うとともに、追加接種時及びその後経時的に行った。
【００３７】
なお、以上の試験は、三共化学研究所 熊本霊長類パークでの倫理委員会での承認を得た後、同施設にて行った。
（２）結果
試作ワクチンを接種したチンパンジーから採血した血液の血液学的および血液生化学的検査の結果から、ＳＥ３６タンパク質として４５０μｇ／回という非常に多量のタンパク質を接種した場合においても、異常は確認されなかった。この結果から、ＳＥ３６タンパク質を水酸化アルミニウムゲルに吸着させて作成したワクチンの安全性が確認された。
【００３８】
また、得られた血清のＳＥ３６タンパク質特異的抗体価をＩｇＧのサブクラス毎に測定した結果、４５０μｇ／回で接種したものでは、全てのサブクラスで高い抗体価の上昇が確認され、特に２回目接種後には約１００００倍に達した。この高い抗体価は、１０週目でも維持されていた（図６Ａ）。また、５０μｇ／回で接種したものでも、４５０μｇ／回で接種したものと同程度の免疫応答が得られた（図６Ｂ）。１０μｇ／回で接種したものでは、免疫応答が得られるのにやや時間を要するものの、４週目には全てのサブクラスで抗体価が上昇し、２回目接種後には約１０００倍に達した（図６Ｃ）。この結果から、本発明のワクチンが、ヒト用ワクチンとして現実的な接種量で免疫応答を可能とすることが確認された。
【００３９】
さらに、４５０μｇ／回で接種して得た免疫血清を用いてＩｇＧ依存的なＡＤＣＩ（Antibody-Dependent Cellular Inhibition of Parasite Growth）によるマラリア原虫の増殖阻害を試験した。すなわち、１００μｌのマラリア原虫の培養液に、免疫血清と２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの単球を加えて培養を続け、４８時間後の原虫数を測定した。チンパンジーの免疫血清について試験した系では０．３８ｍｇ／ｍｌの免疫前全ＩｇＧ分画を添加した場合の原虫数を、またマラリアに対する免疫を獲得したヒトの血清について測定した系では１０μｇ／ｍｌの非特異的ＩｇＧ３画分を添加した場合の原虫数を対照（１００％）とし、各測定系での原虫数を割合（％）で示した。
【００４０】
結果は図７に示したとおりである。チンパンジー免疫前および後の全ＩｇＧ分画を各々１．５ｍｇ／ｍｌ添加した場合の増殖は、免疫前の全ＩｇＧ分画を添加したものが対照の約７０％まで増殖するのに対し、免疫後の全ＩｇＧ分画を添加したものでは約４０％の増殖にとどまった。
【００４１】
上記の試験において、添加したチンパンジーの全ＩｇＧ分画濃度は、チンパンジーの血清中のＩｇＧ濃度の約１／１０の濃度であり、免疫前の全ＩｇＧ分画を添加した場合と比較して、免疫後の全ＩｇＧ分画を添加した方が約３０％良好な原虫増殖阻害が得られたことは、生体の血中においてはほぼ完全な阻害効果が期待される。また、ヒト血中の測定にはＳＥ３６タンパク質に特異的なＩｇＧ３を用いていることを考慮すれば、マラリア原虫に対し免疫を獲得したヒトの原虫増殖阻害効果に匹敵すると考えられる。以上の結果から、本発明のワクチンの有効性が確認された。
参考例１：疫学検査I
ウガンダのマラリア高度流行地域における１０歳以下（平均６歳）の児童の血清を用い、ＳＥ３６タンパク質に対する血中のＩｇＧ３抗体の保有状況を前述のＥＬＩＳＡにより検査した。その結果、発熱をしていない（体温３７．５℃未満の）健康な児童３１例のうち、８例がＩｇＧ３抗体陽性、他方、発熱を伴う（３７．５℃以上の）児童患者９例は全てＩｇＧ３抗体陰性であった。これにより抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体の産生あるいは保有者においてはマラリア発熱が全く見られず、同抗体はマラリア発症を抑制するという相関が示唆された。
参考例２：疫学検査II
さらに同地区において採取した１５歳以下の児童（８６例）の血中原虫（Ｐｆ）数とＥＬＩＳＡによる抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価との間の相関関係を検査した。その結果、上記ＩｇＧ３抗体価が高いほど血中のＰｆ数が低いという相関のあることが示唆された。
参考例３：疫学検査III
マラリア高度流行地域住民の年齢別（０−４０歳以上）の、ＳＥ３６タンパク質に対する血中抗体価の保有状況をＥＬＩＳＡにより検査した。その結果、抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価は、全年齢において他のＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の各抗体価が横ばいで低値であるのに比べ、０から８歳までは常にこれ等の２倍以上高く、しかも、８歳を超えると、加齢に伴い対数曲線的に上昇することが観察された。
参考例４：熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止試験
マラリア高度流行地域住民（成人）２５名の血清の、ＳＥ３６タンパク質に反応する血中抗体価の保有状況をＥＬＩＳＡにより検査し、同血清を用いて試験管内における熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止実験を行った。培養液量の５％に相当する量の各血清をＦＣＲ３株、Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株、及びＫ１株のそれぞれに加え、マラリア免疫のない日本人の血清を対照として２４時間後の原虫増殖の阻止能を調べた。その結果、いずれの株においても抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価と増殖阻止能は正の相関を示し、ＳＥ３６タンパク質が原虫増殖阻害的に作用するヒト抗体のエピトープを提供していることが示唆された。さらに、ＳＥＲＡの遺伝子多型はワクチン効果に影響のないことも示唆された（図８）。
参考例５：ＳＥ３６の中和能
実施例２で得たＳＥ３６無菌標品の共存下における、参考例４で用いたマラリア高度流行地域住民の抗ＳＥ３６ＩｇＧ３抗体価の高い代表的な血清によるＰｆ増殖阻止能の消長を、参考例４に記載の試験管内における熱帯熱マラリア原虫の増殖阻止実験により測定した。ＳＥ３６との比較対照としてバキュロウイルスベクターにより生産した自然な立体構造を持つ全長ＳＥＲＡタンパク質、及び全長ＳＥＲＡタンパク質の中央部ドメインに由来するＳＥ５０Ａタンパク質（ワクチン効果なし）（Ｖａｃｃｉｎｅ，同前）をそれぞれ用いた。
【００４２】
その結果、マラリア高度流行地域住民の血清のＰｆ増殖阻止能は、ＳＥ３６共存濃度の上昇に伴い最も強く阻害（中和）され、ＳＥ５０Ａでは全く阻害されなかった。また、上記阻害の程度に基づくＳＥ３６の中和能は、全長ＳＥＲＡタンパクのそれに比べ優れていた（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
この発明により、発熱を伴うマラリア症状と死亡の原因となる脳性マラリアの根本原因である、赤血球内でのマラリア原虫（Ｐｆ）の増殖を阻止するＩｇＧ３抗体を誘導する、極めて有効なマラリア予防のワクチンが提供される。併せて、マラリア診断剤が提供される。その結果、上記のＰｆ増殖に伴う、死を招く脳性マラリアの原因とマラリアへの恐怖が一掃される。従って、本発明は、世界有数の多発感染症、マラリアを制圧するための優れて強力な手段として寄与すると共に、地球温暖化に伴うマラリア発生地域の拡大が懸念されている今日にあっては、人類の保健だけではなく、観光、経済、政治等に係るグローバルかつ健全な活動を確保する上で、待望かつ多大の効果と福音をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｈｏｎｄｕｒａｓ−１株のＳＥＲＡドメイン４７ｋｄの第１６〜３８２番アミノ酸（Ｎ〜Ｅ）配列とポリペプチドＳＥ３６全長アミノ酸配列、第１〜３３４番アミノ酸（Ｍ〜Ｅ）との間の相違を示す。ＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸の１文字記号により記載。Ｈｏｎｄ−１はＨｏｎｄｕｒａｓ−１株、……は同一配列、----は欠失、また、［数字］はＳＥ３６のアミノ酸番号をそれぞれ意味する。
【図２】ポリペプチドＳＥ３６分子の基本構造としての全長アミノ酸配列を示す。ＮからＣ末端方向に左から右へ、アミノ酸の１文字記号により記載。
【図３】図１に記載のＨｏｎｄｕｒａｓ−１株４７ｋｄアミノ酸配列を基準にし、他のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株のそれとの間の相違を示す。［数字］はＳＥ３６のアミノ酸番号を意味する。
【図４】カラム１は分子量マーカー、カラム２はＳＥ３６を発現していない大腸菌の全タンパク、カラム３はＳＥ３６をＩＰＴＧ添加により発現させた大腸菌の全タンパクの電気泳動像。
【図５】実施例２で調製したＳＥ３６無菌標品（ワクチン原液）のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動像。ＳＥ３６以外の夾雑物の存在が可視的に検出されないことを示す。
【図６】ＳＥ３６タンパク質での免疫によるチンパンジーの抗体価をＩｇＧのサブクラス毎に示したグラフである。
【図７】ＳＥ３６タンパク質で免疫したチンパンジー、およびマラリア免疫を獲得したヒトＩｇＧによるマラリア原虫の増殖阻害を示したグラフである。
【図８】マラリア高度流行地域住民の血清によるＰｆ原虫増殖阻止と、抗ＳＥ３６ＩｇＧ抗体価との間には正の相関のあることを示す。
【図９】マラリア高度流行地域住民の血清によるＰｆ原虫増殖阻止は、比較対照の共存に比べ、ＳＥ３６無菌標品（ワクチン原液）の共存により著しく阻害（中和）されることを示す。図中、○は自然な立体構造を持つ全長のＳＥ３６タンパク質、●はＳＥ３６タンパク質、■はワクチン効果のないＳＥ５０Ａタンパク質を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換：
第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ
の１または数個を有するポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１８番Ｇｌｙと第１９番Ｇｌｙとの間に、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に、配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失した請求項１のポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項６】
請求項１から５のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリアワクチン。
【請求項７】
請求項１から５のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリア診断剤。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかのポリペプチドＳＥ３６変異体をコードする合成ＤＮＡ断片。
【請求項９】
請求項８の合成ＤＮＡ断片によって形質転換した大腸菌の培養液から集菌の後、菌体破砕、塩析による分画、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、Octyl Sepharose疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析による沈殿、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、及び透析の順序で、これ等の各工程を行うことを特徴するポリペチドＳＥ３６変異体の精製方法。
【請求項１０】
ポリペプチドＳＥ３６変異体の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌになるように調整した後に透析を行う請求項１０の精製方法。
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換：
第１９番のＧｌｙがＶａｌ；
第１２８番ＧｌｕがＬｙｓ；
第１５７番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１６０番ＧｌｙがＳｅｒ；
第１７２番ＰｒｏがＳｅｒ；
第１７８番ＧｌｕがＶａｌ；
第１７９番ＳｅｒがＡｓｎ；
第１８０番ＬｅｕがＰｒｏ；
第１８５番ＰｒｏがＡｌａ；
第１８６番ＡｓｐがＧｌｙ；
第１８８番ＰｒｏがＴｈｒ；
第１８９番ＴｈｒがＰｒｏ；
第１９０番ＶａｌがＡｓｐ；
第１９１番ＬｙｓがＡｌａ；
第１９２番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９３番ＰｒｏがＬｙｓ；
第１９４番ＡｒｇがＬｙｓ；
第２１９番ＩｌｅがＬｅｕ；
第２５２番ＳｅｒがＡｓｎ；
第２７３番ＡｌａがＳｅｒ；
第２７４番ＬｅｕがＩｌｅ；および
第３２７番ＡｓｎがＬｙｓ
の１または数個を有するポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１８番Ｇｌｙと第１９番Ｇｌｙとの間に、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第４２番Ａｌａと第４３番Ｓｅｒとの間に、配列番号８のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが付加したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１９番Ｇｌｙから第２６番Ｇｌｙまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失したポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドＳＥ３６の変異体であって、配列番号４のアミノ酸配列における第１６３番Ｔｈｒから第１７５番Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが欠失した請求項１のポリペプチドＳＥ３６変異体。
【請求項６】
請求項１から５のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリアワクチン。
【請求項７】
請求項１から５のポリペプチドＳＥ３６変異体より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするマラリア診断剤。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかのポリペプチドＳＥ３６変異体をコードする合成ＤＮＡ断片。
【請求項９】
請求項８の合成ＤＮＡ断片によって形質転換した大腸菌の培養液から集菌の後、菌体破砕、塩析による分画、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、Octyl Sepharose疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析による沈殿、膜濾過、Sephacryl S-300またはS-200カラムクロマトグラフィー、及び透析の順序で、これ等の各工程を行うことを特徴するポリペチドＳＥ３６変異体の精製方法。
【請求項１０】
ポリペプチドＳＥ３６変異体の濃度が１０〜１００μｇ／ｍｌになるように調整した後に透析を行う請求項１０の精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２７１９５８（Ｐ２００８−２７１９５８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８７８１８（Ｐ２００８−８７８１８）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【分割の表示】特願２００２−５５９８０４（Ｐ２００２−５５９８０４）の分割
【原出願日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２４）
【特許番号】特許第４１４５３４８号（Ｐ４１４５３４８）
【特許公報発行日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【出願人】（５０１０８５６３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【分割の表示】特願２００２−５５９８０４（Ｐ２００２−５５９８０４）の分割
【原出願日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２４）
【特許番号】特許第４１４５３４８号（Ｐ４１４５３４８）
【特許公報発行日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【出願人】（５０１０８５６３６）
【Ｆターム（参考）】
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