マルチパラメトリック細胞同定・選別法および対応の装置
【課題】本発明は、特に細胞選別器で実行するための、生体粒子（４８，４９）を分析する方法、ならびに対応の分析装置に関する。
【解決手段】この分析方法は、以下の方法段階、すなわち、分析される粒子（４８，４９）を少なくとも１つの担体流に挿入すること、担体流と共に移動する粒子（４８，４９）の少なくとも第１の分析を実行すること、この第１の分析の結果に従って少なくとも１つの粒子（４８，４９）を選別すること、選別された粒子（４８，４９）を減速すること、および選別された粒子（４８，４９）の少なくとも第２の分析を、減速された状態で実行すること、を有する。
【解決手段】この分析方法は、以下の方法段階、すなわち、分析される粒子（４８，４９）を少なくとも１つの担体流に挿入すること、担体流と共に移動する粒子（４８，４９）の少なくとも第１の分析を実行すること、この第１の分析の結果に従って少なくとも１つの粒子（４８，４９）を選別すること、選別された粒子（４８，４９）を減速すること、および選別された粒子（４８，４９）の少なくとも第２の分析を、減速された状態で実行すること、を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載の、好ましくは生体粒子のための、特に、細胞選別器で生体細胞を分析するための分析方法ならびに請求項１４に記載の対応の分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ・ミュラー等『A 3-D microelrctrode system for handling and caging single cells and particles』、Biosensors and Bioelectrics 14 (1999)、247ないし256頁からは、生体細胞のための分析方法が公知である。この分析方法では、分析される細胞が、流体状のマイクロシステムの担体流中に懸濁されており、誘電泳動的に操作および選別される。担体流では、分析される細胞が、まず、漏斗状の、誘電泳動的な電極装置（英語では、「Funnel」）によって並べられ、続いて、誘電泳動的なかご（英語では、「Cage」）に抑えられる。その目的は、かごにある細胞を、静止状態で分析することができるためである。この目的のために、微視的な、分光学的なまたは蛍光学的な測定法を用いることができる。誘電泳動的なかごに捕捉された細胞の分析に従って、これらの細胞を続いて選別することができる。この目的のために、操作者は、担体流中で誘電泳動的なかごの下流方向後方に設けられた誘電泳動的な電極装置からなる選別手段を起動する。
【０００３】
前記分析方法の欠点は、サンプル中の分析される細胞がしばしば非常に異なっていることである。非常に不均一なサンプルから例えば所定の標的細胞を或る方法によって同定し、次にこれらの標的細胞を分離することが意図される。これらのサンプルの場合、標的細胞は、しばしば、サンプル全体の極僅かな割合に過ぎない。他の細胞は所望の特性を有しないか、最早生きておらず、従って既に死んでいる。更に、細胞が完全には個別化されておらず、幾つかの細胞が、２つまたはそれより多い細胞の凝集体として、システムを通過することがしばしば生じる。これは望ましくない結果である。しかし、場のかごの中の個々の細胞または凝集体の詳しい分析は、時間のかかるプロセスである。それ故に、場のかごの中の細胞サンプル全体の分析は非常に長く続行するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、前記の公知の分析方法を、重要でない生体細胞（例えば死んだ細胞）または細胞の屑の、誘電泳動的なかごの中での分析を防止することができるように、改善するという課題が、本発明の基礎になっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題は、明細書導入部に記載の公知の分析方法を前提として、請求項１の特徴によっておよび、対応の分析装置に関しては、請求項１４の特徴によって解決される。
【０００６】
本発明は、担体流に懸濁されている粒子の、誘電泳動的なかごの中での分析の前に、まず、担体流と共に移動する粒子の前分析を実行し、続いて、他の分析にとって重要な粒子を誘電泳動的なかごに捕捉しかつ分析することができるという、一般的な技術的教示を有する。
【０００７】
前分析は、例えば、蛍光の強度、細胞の生命力および／または個々の細胞または凝集体であるかの問題に該当することができる。更に、前分析の際に、細胞であるか、形状および大きさにおいて詳しい分析の主要細胞ではない物質、例えば不純物または他の細胞であるかが、これらの細胞が標的細胞と区別される限りで、検出されることができる。
【０００８】
本発明に係わる分析方法の場合、まず、担体流中に懸濁されている粒子の前分析および前分析の結果に応じた所定の粒子の選別がなされる。他方、実際の主分析は、予め選別された粒子のためにのみ実行される。このような粒子は、粒子の移動によって困難にされるだろう情報提供可能な主分析を可能にするために、減速される。
【０００９】
本発明の枠内では、前分析に従って選別された粒子が例えば誘電泳動的なかごの中で捕捉されるので、これらの粒子を主分析の前に完全に停止させることは必ずしも必要ではない。本発明の枠内では、むしろ、前分析に従って選別された粒子が、粒子の情報の多い分析が可能である限りのみ、担体流内で減速されることも可能である。
【００１０】
更に、本発明の枠内で用いられる、粒子の概念が一般的な意味を有するのであって、個々の生体粒子に限定されないことに言及することができる。むしろ、この概念は合成粒子または生体粒子を含む。特別な利点が生じるのは、粒子が、生体物質、従って例えば生体粒子、細胞群、細胞成分、または生物学的に重要な分子を、夫々、場合によっては他の生体粒子または合成担体粒子との組合せで有するときである。合成粒子は、個体粒子、液状粒子、懸濁媒体から分離されている粒子、また、担体流中の懸濁媒体に対し分相を形成する多相粒子を含んでもよい。
【００１１】
前分析に従って選別され、続いて主分析の枠内で詳細に分析された粒子を、主分析の結果に従って選別および／または処理することは好ましい。例えば、主分析の際に、種々の細胞型を区別し、続いて、それに対応して選別することができる。しかし、前分析の枠内で選別された粒子を、主分析の結果に応じて複数の誘電泳動的要素によって操作することも可能である。この場合、Ｔ・ミュラー等の、明細書導入部に記載された刊行物に記載された誘電泳動的要素を用いることができる。
【００１２】
前分析の枠内で、例えば、透過光測定、蛍光測定および／またはインピーダンス分光法を行なうことができる。しかし、本発明の好ましい実施の形態では、まず、透過光測定および続いて蛍光測定を行なう。透過光測定および蛍光測定を、空間的に分離された分析窓（英語では、「Religion of Interest」）で行なうことは好ましい。透過光測定は、例えば、生きている生体細胞と死んだ生体細胞との区別を可能にし、他方、蛍光測定は、担体流中に懸濁されている粒子が蛍光マーカーを有するか否かを分析するために、用いられることができる。
【００１３】
前分析の枠内で透過光測定および蛍光測定を、空間的に分離された分析窓で行なうとき、担体流中の透過光のための分析窓が、蛍光測定のための分析窓の上流方向手前に位置していることは好都合である。しかし、その代わりに、担体流中の透過光のための分析窓が、蛍光測定のための分析窓の下流方向後方に設けられていることも可能である。
【００１４】
担体流と共に移動する粒子の前分析の枠内で、光学画像が撮像されるのは好ましい。このことは、粒子を分類するためのディジタル式の画像評価を可能にする。この場合、例えば、個々の生体細胞を細胞塊と区別することができるために、粒子を形態的に分析することは好ましい。本明細書の枠内で用いられる、光学画像の概念は、一般的な意味を有し、従来の語義での２次元画像に限定されない。むしろ、本発明の意味する光学画像の概念は、担体流の、または、担体流中に懸濁されている粒子の、点状のまたは線状のスキャンをも含む。例えば、個々の粒子を検出しかつ分類するために、担体流に対し直角の線に沿って輝度を積分することができる。
【００１５】
前分析の枠内での、生きている細胞と死んだ細胞との区別は、透過光測定の際に、撮像された光学画像における強度分布の評価によってなされることができる。前記特性を有するこの透過光測定の特殊な原理は、例えば、位相差照明である。かくて、生きている生体細胞は、透過光測定で比較的明るい縁部と、より暗い中心点とを有する環状構造を有する。これに対し、死んだ生体細胞は、透過光測定の際に、ほぼ一様な輝度を有し、背景に比較して暗く見える。
【００１６】
粒子の主分析の際に、例えば、所定の分子を、１つの細胞内に局在化することができる。例えば、主分析の枠内で、蛍光染料で標識化されている分子を、１つの細胞内に局在化することができる。蛍光染料は、例えば、分子生物学的に生成された、「緑色蛍光タンパク質」の「標識」およびこれら標識の誘導体、他の自己蛍光性のタンパク質であってもよい。しかし、蛍光染料としては、細胞の分子に共有または非共有結合する蛍光染料も適切である。更に、蛍光染料としては、細胞の酵素から蛍光生成物に変換されるフッ素物質またはいわゆるＦＲＥＴ（Fluoreszenz Resonanz Energietransfer）対も用いることができる。用いられる蛍光染料の状態を、例えば、そのスペクトル特性に基づいてまたは生体発光によって区別することができる。
【００１７】
１つの細胞内での分子の局在化によって、分子の構造および機能を算出することもできる。この場合、例えば、原形質膜、細胞質ゾル、ミトコンドリア、ゴルジ装置、エンドソーム、リソゾーム、細胞核、紡錘装置、細胞骨格内での存否に基づき、アクチン、チューブリンとの共局在化を区別することができる。
【００１８】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞の形態を定めることができる。この場合、染料も用いることができる。
【００１９】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞集団の２つまたはそれより多い状態も区別することができる。
【００２０】
更に、主分析の枠内で、蛍光マーカーを有する分子のトランスロケーションに基づいて、細胞シグナルを、細胞の信号、例えば、受容体インターナリゼーションに従う受容体活性化、アレスチンの結合に従う受容体凝集、原形質膜から細胞質ゾルへの、細胞質ゾルから原形質膜への、細胞質ゾルから細胞核へのまたは細胞核から細胞質ゾルへの分子の転移を測定することが可能である。
【００２１】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、２つの分子の相互作用を測定する
ことができる。相互作用する分子のうちの少なくとも１が蛍光マーカーを有することは好ましく、例えば、２つの蛍光染料の共局在化による、ＦＲＥＴによる、または蛍光の寿命の変化による相互作用が示される。
【００２２】
しかし、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞周期内の或る細胞の状態を測定することができる。細胞の形態または細胞の染色質の染色が評価されることは好ましい。
【００２３】
主分析および／または前分析のための他の可能性は、或る細胞の膜電位を測定することにあり、膜電位に敏感な染料を用いることは好ましい。この場合、原形質膜電位および／またはミトコンドリアの膜電位に対し敏感である染料を用いることは好ましい。
【００２４】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞の生命力も算出することができる。この細胞の形態を評価しおよび／または生きている細胞と死んだ細胞を区別することができるフッ素物質を用いることは好ましい。
【００２５】
更に、主分析および／または前分析の際に、細胞毒性の効果を分析しおよび／または細胞のｐＨ値を測定することができる。
【００２６】
主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞内の１つまたは複数のイオンの濃度を測定することも可能である。
【００２７】
実際また、主分析および／または前分析の際に、細胞内の酵素の活性を算出することができる。フッ素物質または呈色物質、特にキナーゼ、ホスファターゼまたはプロテイナーゼを用いることができる。
【００２８】
更に、主分析および／または前分析の際に、生体物質、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物または脂肪を生産する細胞の、その増殖力を測定することができる。この場合、前記方法を用いることができる。
【００２９】
最後に、主分析の枠内で、細胞・ストレス経路、代謝経路、細胞成長経路、細胞分裂経路および他のシグナル導入経路を測定することができる。
【００３０】
更に、本発明は、前記分析方法を実施するための対応の分析装置を含む。
【００３１】
本発明に係わる分析装置が、粒子の画像を撮像するために、レンズを有することは好ましい。
【００３２】
本発明に係わる分析装置のレンズを、倍率、焦点および／または視野を調整するためにまたは所定の光学フィルタを選択するために、調整することができることは好ましい。レンズの調整は操作部（例えば電動機）によってなされることができる。
【００３３】
粒子の減速が、知られている誘電泳動的なかごによってなされることは既に前に記述した。しかし、本発明の実施の形態では、誘電泳動的なかごが、詳細な分析のための懸濁されている粒子を減速するためにのみ用いられるのではなくて、スイッチ（英語では「switch」）または転轍器の機能をも果たすのは、懸濁されている粒子を、詳細な分析に従って、かごにより、複数の排出管のうちの１に供給することによってである。この目的のために、誘電泳動的なかごの個々の電極を互いに別々に起動することができることは好ましい。更に、誘電泳動的なかごは、このために、排出管のうちの分岐点に設けられていることは好ましい。
【００３４】
更に、複数の排出管のうちの１または複数には、漏斗状の電極装置（英語では「Funnel」）が設けられていてもよい。その目的は、懸濁されている粒子の、排出管における沈下を阻止するためである。このことは好都合である。何故ならば、担体流は、排出管で、以下の速度分布を有するからである。この速度分布は、壁付近で、遅い流速のみを示すので、排出管における粒子の沈下が、壁付近の沈殿をもたらすであろう。
【００３５】
更に、懸濁されている粒子が、共通の担体流用導管に合流する２つの分離された担体流用導管を通って、供給されるという可能性が存する。この場合、２つの担体流用導管の合流点の領域では、共通の担体流用導管に、隔壁が設けられていてもよい。この隔壁は、共通の担体流用導管においても、２つの分離される部分流を互いに分離する。２つの部分流を分析に晒すことができる。この分析の結果に従って、次に、２つの部分流に懸濁されている粒子を、集めることができる。次に、集められた粒子を、次に、前記の如く、誘電泳動的なかごに固定し、詳細な分析に晒すことができる。最後に、誘電泳動的なかごによって解放された細胞を、次に、詳細な分析の結果に従って、複数の排出管のうちの１に供給することができる。
【００３６】
細胞を、菌の少ない、無菌の条件下で分析し、それに応じて分離することができることは、本発明の特別な利点である。
【００３７】
本発明の他の好都合な改善は、従属請求項に特徴付けられている。以下、これらの改善を、本発明の好ましい実施の形態の記述と共に、図面を参照して詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
図１の略図は、微小流体状の選別チップ１によって生体細胞を誘電泳動で選別する、本発明に係わる細胞選別器を示している。
【００３９】
生体細胞に誘電泳動で影響を及ぼす技術は、例えば、Ｔ・ミュラー等『A 3-D microelectrode system for handing and caging single cells and particles』、Biosensors & Bioelectrics 14 (1999)、247ないし256頁に記載されている。それ故、以下に、選別チップ１における誘電泳動法の詳述を省略し、前記の刊行物を参照するよう指摘する。
【００４０】
選別チップ１は、流体の接触のために、複数の接続部２−６を有する。接続部２−６における流体の接触は、DE 102 13 272に記載されている。この公報の内容は本明細書に組み込まれる。
【００４１】
選別チップ１の接続部２は、選別される生体細胞を有する担体流を収容するために用いられる。これに対し、選別チップ１の接続部３は、選別チップ１上でこれ以上分析されない選別除外された生体細胞を搬出するために用いられる。選別除外された生体細胞は、吸引用シリンジ７によって捕らえられることができる。吸引用シリンジは、選別チップ１の接続部３に接続されることができる。これに対し、選別チップ１の出口５は、重要な生体細胞を搬出するために用いられる。これらの生体細胞は、続けて、更に加工または分析されることができる。
【００４２】
更に、選別チップ１の接続部４および６は、いわゆる被覆流（Huellstrom）の供給のために用いられる。被覆流は、選別された生体細胞を選別チップ１の接続部５に供給する課題を有する。被覆流の機能法に関して、ドイツ特許出願DE 100 05 735を参照されたい。それ故に、以下、被覆流の機能法の詳述を省略することができる。
【００４３】
選別チップの接続部４および６は、２つの被覆流用導管８，９、Ｙ継手１０および４方向弁１１を介して、圧力容器１２に接続されている。圧力容器には、被覆流のための培養媒体がある。
【００４４】
圧力容器１２は、圧縮空気用導管１３を介して、過剰圧力下に置かれる。それ故に、圧力容器１２に存する緩衝液（例えば、培養媒体）が、４方向弁１１の適切な位置で、Ｙ継手１０および被覆流用導管８，９を介して、選別チップ１の接続部４，６に流れる。
【００４５】
しかし、その代わりに、被覆流を、緩衝液の入った圧力容器１２とは異なる原理、例えば、シリンジ型ポンプまたは蠕動性のポンプによっても、実現化することができる。
【００４６】
これに対し、選別チップ１の接続部２は、担体流用導管１４を介して、粒子用インジェクタ１５に接続されている。
【００４７】
上流では、粒子用インジェクタ１５は、Ｔ継手１６を介して、担体流用シリンジ１７に接続されている。担体流用シリンジは機械式に駆動され、担体流の所定の液流を注入する。
【００４８】
更に、Ｔ継手１６は、上流で、他の４方向弁１８および被覆流用導管１９を介して、３方向弁２０に接続されている。３方向弁２０は、被覆流用導管８，９および担体用導管１４を、実際の作動前に洗浄をすることができる。
【００４９】
この目的のために、３方向弁２０は、上流で、蠕動性ポンプ２１を介して、３つの３方向弁２２．１ないし２２．３に接続されている。これらの３方向弁には、夫々シリンジ型リザーバ２３．１ないし２３．３が接続されている。この場合、シリンジ型リザーバ２３．１ないし２３．３は、実際の作動前に流体システム全体を洗浄するための充填剤流を供給するために用いられる。シリンジ型リザーバ２３．１は、例えば７０％のエタノールを有し、これに対し、シリンジ型リザーバ２３．２は、充填剤流用物質として、好ましくは蒸留水を有する。シリンジ型リザーバ２３．３は、充填剤流用物質として、例えば緩衝液を有する。
【００５０】
更に、細胞選別器は過剰な被覆流のための受器２７および過剰な充填剤流のための受け器２８を有する。
【００５１】
以下、まず、洗浄工程を記述する。この洗浄工程は、被覆流用導管８，９、担体流用導管１４および細胞選別器の残りの流体システムの気泡および不純物を取り除くために、細胞選別器の実際の作動前に実行される。
【００５２】
この目的のために、まず、３方向弁２２．１が開かれ、エタノールがシリンジ型リザーバ２３．１によって充填剤流として注入される。この場合、エタノールは蠕動性ポンプ２１によってまず３方向弁２０へ運ばれる。エタノールは、（無菌の分析・選択工程を調整するための）システム内の細菌の数を減らすためのみならず、空気を流体状のシステムから完全に除去するためにも用いられる。
【００５３】
洗浄工程中に、３方向弁２０は、蠕動性ポンプ２１によって運ばれる充填剤流の一部が、被覆流用導管１９を介して、更に導かれ、他方、蠕動性ポンプ２１によって運ばれる充填剤流の残り部分が４方向弁１１に達するように、調整されている。２つの４方向弁１１，１８は、同様に、充填剤流が、被覆流用導管８，９および担体流用導管１４を通って導かれるように、調整されている。更に、培養媒体は、これらの導管に短時間に媒体を注入するために、圧力容器１２から受け器２７へ流れる。
【００５４】
エタノールによる細胞選別器の前記洗浄の後に、同様に、蒸留水または緩衝液による洗浄もなされる。その時々に、３方向弁２２．２または２２．３が開かれる。
【００５５】
前記洗浄工程中に、過剰の充填剤流が、４方向弁１８から受け器２８へ導かれることができる。
【００５６】
洗浄工程後に、３方向弁２２．１ないし２２．３が閉じられ、蠕動性ポンプ２１が締め切られる。
【００５７】
選別駆動を起動するために、４方向弁１１は、圧力容器１２がＹ継手１０に接続されるので、圧力容器１２にある培養媒体が、圧力容器１２に支配的な過剰圧力の故に、被覆流用導管８，９へ押し入れられるように、調整されている。
【００５８】
更に、選別駆動中に、４方向弁１８は、流れの接続がＴ継手１６と４方向弁１８との間に存在しないように、調整されている。
【００５９】
担体流用シリンジ１７によって注入される担体流は、Ｔ継手１６を介して、粒子用インジェクタ１５に流れ、他の注入用シリンジ２９によって生体細胞が担体流に注入される。続いて、担体流は、注入された生体細胞と共に、粒子用インジェクタ１５から担体流用導管１４を通って選別チップの接続部２へと流れる。
【００６０】
更に、粒子用インジェクタ１５には、粒子用インジェクタ１５の温度Ｔを測定するために、温度センサ３０が取着されていることが述べられねばならない。
【００６１】
更に、粒子用インジェクタ１５のみならず選別チップ１のための収容部にも、ペルチエ素子の形の温度調素子３１がある。その目的は、粒子用インジェクタ１５および選別チップ１を加熱または冷却することができるためである。
【００６２】
この場合、加熱・冷却エネルギＱは、温度調節器３２によって事前設定される。この温度調節器は、入力側で、温度センサ３０に接続されており、粒子用インジェクタ１５の温度Ｔを、所定の目標値に調整する。
【００６３】
以下、図２を参照して、担体流路３３を説明する。この担体流路は、細胞選別器の選別チップ１に設けられており、２つの排出管３４，３５に分岐されている。排出管３４は選別チップ１の接続部５に接続されており、プラスに選択された粒子を更に導くために用いられ、他方、排出管３５は選別チップ１の接続部３に接続されており、選別除外された粒子の搬出のために用いられる。
【００６４】
担体流路３３では、選別チップ１の接続部２の下流方向後方に、漏斗状の、誘電泳動的な電極装置３６が設けられている。この電極装置は、担体流に懸濁されている粒子を担体流路３３内で連続的に並べるという課題を有する。電極装置３６の正確な技術的構成および機能方法は、ミュラー等の、明細書導入部に記載の刊行物に記載されている。この刊行物の内容は本明細書に組み込まれるので、以下、電極装置３６の詳述を省略することができる。
【００６５】
電極装置３６の下流後方には、担体流路３３で、誘電泳動的なかご（dielektrophoretischer Kaefig）３７が設けられている。このかごは、担体流３３に懸濁されている粒子を捕捉し、正確な分析のために分析窓ＵＦに固定することを可能にする。誘電泳動的なかご３７の構造および機能に関しては、同様に、ミュラー等の、明細書導入部に引用された刊行物を参照するよう指摘する。それ故に、このことに関しては、詳述を省略することができる。
【００６６】
誘電泳動的なかご３７の下流後方における、担体流路３３の分岐領域には、誘電泳動的な電極装置３８からなる選別手段がある。この選別手段は誘電泳動的な電極装置３８からなる。電極装置３８の構造および機能に関しては、同様に、ミュラー等の、明細書導入部に引用された刊行物を参照するよう指摘する。電極装置３８は、担体流に懸濁されている粒子を排出管３４または排出管３５に選別する。選択は、更に詳述するように、かご３７に固定された粒子で実行された主分析に従って、なされる。
【００６７】
更に、担体流用導管３３の分岐領域には、流れ誘導手段が設けられている。この流れ誘導手段は、同様に、誘電泳動的な電極装置３９からなり、排出管３５から排出管３４への粒子の逆流を防止するという課題を有する。この目的のために、電極装置３９はＶ字形に形成されており、２つの脚部を有する。電極装置３９の一方の脚部は排出管３４に突入し、電極装置３９の他方の脚部は排出管３５に突入している。
【００６８】
以下、図２および３を参照して、選別チップ１内の担体流に懸濁している粒子が如何に分析されるかを説明する。
【００６９】
粒子の前分析の枠内で、まず、分析窓ＲＯＩ１（region of interest 1）における透過光測定ならびに他の分析窓ＲＯＩ２（region of interest 2）における蛍光測定がなされる。分析窓ＲＯＩ１は、担体流路３３で、蛍光測定のための分析窓ＲＯＩ２の下流手前に設けられている。
【００７０】
この場合、透過光測定のみならず蛍光測定も、図３に略示された検出ユニットＤによってなされる。この検出ユニットは、画像検出のために、ＣＣＤカメラ４０を有する。このＣＣＤカメラは、選別チップ１の下方に設けられており、反射鏡４１へ整列されている。
【００７１】
選別チップ１の上方には、透過光測定のための光源として、発光ダイオード４２が設けられている。発光ダイオード４２と選別チップ１との間には、コンデンサ４３があり、このコンデンサは例えば位相差絞りを有してもよい。
【００７２】
選別チップ１の下方では、コンデンサ４３の光路に、対物レンズ４４が設けられている。
【００７３】
透過光測定の際には、ＣＣＤカメラ４０は、反射鏡４１および対物レンズ４４によって、分析窓ＲＯＩ１の画像を撮像する。
【００７４】
更に、検出ユニットＤは、複数の電動の操作部４５．１ないし４５．３を有する。これらの操作部は、対物レンズ４４の、フィルタブロック４７のおよび反射鏡４１の調整を可能にする。この場合、対物レンズ４４の調整は倍率のおよび焦点の変更を可能にする。これに対し、フィルタブロック４７を調整することができるのは、種々のフィルタを選択するためである。これに対し、反射鏡４１の調整は、担体流路３３での万が一の堆積を認識するために、視野を担体流路３３に沿って移動するという目的を有する。
【００７５】
蛍光測定の際に蛍光を励起するために、検出ユニットＤは光源４６（例えばレーザ）を有する。この光源は、フィルタブロック４７によって、担体流路３３に懸濁されている生体細胞の蛍光励起を可能にする。このとき、ＣＣＤカメラ４０は対応の蛍光画像を撮像する。
【００７６】
以下、図４を参照して、Ｘ線写真での生体細胞の種々の相を記述する。図４の例は、上方領域に、生きている細胞４８および死んだ細胞４９を示し、下方領域に、Ｘ線写真での強度曲線５０，５１を示す。このことから、生きている細胞４８が比較的暗い核を有し、これに対し、死んだ細胞４９の内部は、均等に照明されていることが認められる。このことは、これから詳述するように、生きている細胞４８と死んだ細胞４９との相違を可能にする。
【００７７】
以下、図５Ａないし５Ｅに示した流れ図を参照して、本発明に係わる分析法を説明する。
【００７８】
方法の始めに、まず、担体流用導管１４および被覆流用導管８，９を、７０％のエタノール溶液で、続いて蒸留水で、最後に緩衝液で洗浄する。その目的は、細胞選別器の流体システムを清浄し、特に気泡および不純物を除去するためである。
【００７９】
続いて、次に、担体流を担体流用シリンジ１７から担体流用導管１４に注入する。被覆流の供給後に、後述のように、分析される生体細胞を、粒子用インジェクタ１５に設けられた注入用シリンジ２９によって担体流に注入する。
【００８０】
更に、被覆流のための、圧力容器１２にある培養媒体を、圧縮空気用導管１３を通って供給される圧縮空気によって、圧力容器１２から被覆流用導管８，９に押し入れる。被覆流用導管は、選別チップ１の接続部４または６に通じており、選別チップ１において選別される粒子を、選別チップ１の接続部５を通って、送ることを支援する。
【００８１】
選別チップ１の担体流路３３では、破線矢印で略示されているように、懸濁されている粒子を、まず、電極装置３６によって、流れ方向に連続的に並べる。
【００８２】
続いて、分析窓ＲＯＩ１では、時間的に連続的に，複数の位相差画像Ｂ１，．．，Ｂｎを撮像する。その目的は、以下に詳述するように、懸濁されている粒子の運動速度を算出し、生きている細胞を死んだ細胞から区別するためである。
【００８３】
懸濁されている粒子の運動速度を測定するために、位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎの各々に対し、各々の強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎを算出するのは、位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎにおける画像強度を、カラムごとに、すなわち、流れ方向に直角に積分することによってである。個々の強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎは、夫々、生体細胞の位置で、信号のピークを有する。信号のピークは、複数の細胞の運動速度に対応する強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎと、これらの強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎの時間間隔との間で移動する。
【００８４】
続いて、時間的に連続する強度信号Ｉｉ，Ｉｉ＋１に関して、相互相関関数φ１を計算する。相互相関関数φ１の計算は、選別チップ１の担体流路３３での細胞の運動速度を測定するために用いられる。その目的は、所定の細胞を捕捉すべく、誘電泳動的なかご３７を正しい時点で起動させることができるためである。
【００８５】
続いて、担体流路３３の長手方向における移動ｘに従う個々の相互相関関数φｉ（ｘ）に関して、最大値を計算する。
【００８６】
このことから、担体流路３３での細胞の運動速度は、相互相関関数の最大値の平均値と、連続する位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎの間の時間間隔とのからなる商として生じる。
【００８７】
細胞の運動速度ｖを、フィードバックの枠内で、ポンプ制御のために、すなわち、計算されたポンピング速度と実際のポンピング速度が一致するか否かおよび場合によっては実際のポンピング速度が如何に再調整されねばならないかを制御するために、用いることができる。特に、細胞が余りに緩慢に流れる（詰まり）か、止まっているか、逆流さえする元になる故障が、システムにあるか否かを、運動速度ｖに基づいて、認識することができる。これらの妨害はかくして認識され、例えばシステムの洗浄によって除去されることができる。
【００８８】
しかし、その代わりに、細胞の運動速度ｖの前記測定を、分析窓ＲＯＩ１，ＲＯＩ２の外側で行なうことができる。原理的には、細胞の運動の追跡（英語では、「Cell Tracking」）は、担体流路３３全体または担体流路３３の任意な領域内でも可能である。
【００８９】
更に、強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎの信号形状が、粒子の寸法および凝集体の万が一の形成に関する情報を提供する。引っ括れば、強度信号の評価は、すべてのユニットの、すなわち、ポンプの、誘電泳動的な電極要素（例えば何時「ケージング」がなされ、何時「スイッチング」がなされるか）の、かご３７内の詳細な撮像およびサンプルの堆積の、制御および自動化にとって重要である。
【００９０】
第２段階では、次に、捕捉時点ｔＦを計算する。この捕捉時点で、かご３７を起動しなければならない。その目的は、続きの主分析のための分析された粒子を、分析窓ＵＦに捕捉するためである。この場合、捕捉時点ｔＦは、１つの粒子の運動速度ｖと、かご３７からの間隔とから生じる。
【００９１】
更に、他の段階では、複数の隣り合った粒子の間の粒子間隔ｄＰを算出する。このことは、これから詳述するように、個々の細胞と細胞凝集体との間の区別にとって重要となる。
【００９２】
以下、死んだ細胞と生きている細胞との区別がなされる、図５Ｃに記した方法段階を説明する。この目的のためには、その都度、位相差画像における強度が所定の境界値をＩＴＨを越えてなる細胞周辺定点ｘ１，ｘｒを算出する。
【００９３】
続いて、細胞周辺定点ｘ１とｘｒとの間に強度最大値があるか否かを検査する。このことが当て嵌まり、最小強度が存する場合には、図４から明らかなように、細胞は生きている細胞である。これに対し、異なる場合には、細胞を、死んだものと分類する。その目的は、これから詳述するように、以下に、適切な選別を行なうためである。
【００９４】
死んだ細胞と生きている細胞との間の前記区別の後に、図５Ｄの方法段階で、個々の細胞の輝度Ｌを算出するのは、１つの細胞の強度Ｉを、細胞周辺定点ｘ１とｘｒとの間に積分することによってである。
【００９５】
続いて、細胞の、かように算出された輝度Ｌを、最小値Ｌｍｉｎおよび最大値Ｌｍａｘと比較する。
【００９６】
細胞の算出された輝度がこの窓内部にある場合には、透過照明をオフにし、光源４６により蛍光の励起をオンにする。続いて、次に、蛍光画像を分析窓ＲＯＩ２において撮像し、細胞の蛍光ＩＦを測定する。
【００９７】
しかし、蛍光の励起が永続的に起動されていることも可能である。但し、細胞の算出された輝度が前記窓の内側にあるとき、透過照明はオフにされる。
【００９８】
細胞の測定された蛍光ＩＦが所定の境界値Ｉｍｉｎを越えるとき、このことは、当該の細胞が蛍光マーカーを有することを示す。
【００９９】
これに対し、測定された蛍光ＩＦが所定の境界値Ｉｍｉｎを下回るとき、当該の細胞が蛍光マーカーを有しないことを前提とすることができる。
【０１００】
図５Ｅに示した方法段階で、次に、所定の細胞を選別する。生きている細胞と死んだ細胞との区別および蛍光マーカーの有無の検査を考慮する。例えば、生きておりかつ蛍光マーカーを有する細胞を選別することができる。これに対し、他の細胞を選別除外する。
【０１０１】
他の段階で、次に、一方では個々の細胞と、他方では細胞凝集体との区別を、予め算出された粒子間隔ｄＰを所定の最小値ｄＭＩＮと比較することによって、行なう。最小値ｄＭＩＮを下回るときは、粒子が細胞凝集体であるので、工程が終了されることを前提とする。これに対し、粒子間隔ｄＰが所定の最小値ｄＭＩＮを上回るときは、粒子が個々の細胞であり、工程が、以下に記述する段階によって続行されることを前提とする。
【０１０２】
かように選別された細胞を、次に、所定の捕捉時点ｔＦで、誘電泳動的なかご３７に捕捉し、このことによって固定する。それ故に、続いて、解像度が高まりかつ照射時間が長くなるに連れて、捕捉された細胞の主分析が可能である。
【０１０３】
選別された細胞、すなわち、通常は、生きておりかつ蛍光マーカーを有する細胞を、次に、電極装置３８によって排出管３４へ送り込み、これに対し、選別除外された細胞（例えば、死んだ細胞）を排出管３５に運ぶ。
【０１０４】
分析窓ＵＦでの主分析は、蛍光励起を有する画像である。１つまたは複数の励起波長は同時にまたは時間的にずれて用いられる。この目的のために、フィルタブロック４７に、適切なダイクロイック・ミラーが用いられる。この場合、１つまたは複数の波長の蛍光が、同時に、１つまたは複数のカメラへ導かれる。この目的のために、フィルタブロック４７に、適切な発光フィルタ要素または適切な発光分割器が用いられる。かくて、複数の蛍光色の場合に、選別された細胞の複数の画像を同時にまたは順番に形成することが可能である。更に、白光の位相差照明の場合に、選別された細胞の１つの画像を形成することも可能である。このことは、蛍光マーカーを有する細胞に、なお１つのまたは複数の蛍光マーカーを有しない細胞が付着しているか否かを確認するために必要である。付着は、蛍光マーカーを有するこの細胞の、通常は望ましくない汚染をもたらす。
【０１０５】
図６に示した実施の形態は、図２に示した実施の形態とかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のために単にダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１０６】
この実施の形態の特殊性は、担体流路３３´で入口側に設けられており、かつ担体流に懸濁されている粒子を担体流路３３´に連続的に並べる誘電泳動的な電極装置３６´の、より単純な構造にある。
【０１０７】
この実施の形態の他の特殊性は、担体流路３３´で、電極装置３６´の下流方向後方には、鉤状の電極装置５２´が設けられていることにある。この電極装置は、その形状に応じて、「フック」とも呼ばれ、粒子を捕まえておき、いわば止めておくという課題を有する。電極装置５２´の正確な構造および機能方法は、例えば、Bioworld 2-2002に所収のＴ・ミュラー等『Life Cells in Cellprocessors』に記載されている。それ故に、ここでは、電極装置５２´の詳述を省略することができ、前記刊行物の内容を、本明細書に全面的に組み込むことができる。
【０１０８】
担体流路３３´では、電極装置５２´と誘電泳動的なかご３７´との間に、分析窓５３´が設けられている。その目的は、分析窓ＲＯＩ１およびＲＯＩ２に関して前記した予備分析を実行するためである。
【０１０９】
この場合、他の分析窓５４´は、誘電泳動的なかご３７´にある。それ故に、誘電泳動的なかご３７´で、減速された粒子の分析を実行することができる。
【０１１０】
この実施の形態の他の特殊性は、プラスに選択された粒子のための排出管３４´には、電極装置３６´に対応する機能を有する漏斗状の電極装置５５´が設けられていることにある。この電極装置は、粒子を排出管３４´に位置決めする課題を有する。このことは好都合である。何故ならば、排出管３４´内の粒子は、沈下の傾向を有し、従って、流速が低い壁付近に、堆積することがあるからである。電極装置５５´は、粒子のこのような沈下を防止し、このことによって、粒子を、排出管３４´の中央に保つ。そこでは、流速が最大である。
【０１１１】
更に、電極装置３６´，５２´並びに誘電泳動的なかご３７´が担体流路３３´に偏心的に設けられていることに言及しなければならない。このことは、結果として、電極装置３８´が起動されないとき、担体流路３３´に含まれている粒子が、誘電泳動的なかご３７´による解放後に、マイナスに選別された粒子のための排出管３５´に自動的に達することを伴う。このことは、プラスに選別されるべき粒子が担体流に極僅か含まれているときにのみ、電極装置３８´が起動されればよいという利点をもたらす。
【０１１２】
図７に示した代替の実施の形態は、図６に示した前記の実施の形態にかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のためにツーダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１１３】
この実施の形態の特殊性は、誘電泳動的なかご３７´´が、担体流路３３´´が２つの排出管３４´´，３５´´に分岐している位置に、設けられていることにある。更に、この場合、誘電泳動的なかご３７´´の個々の電極が、別々に起動されることができる。それ故に、誘電泳動的なかご３７´´は、２つの機能、すなわち、一方では、かご（英語では「Cage」）の機能と、他方では、スイッチ（英語では「Switch」または転轍器の機能を果たすことができる。誘電泳動的なかご３７´´は、一方では分析窓５４´´での分析のために、粒子を、担体流に固定し、他方では、粒子を２つの排出管３４´´，３５´´の一方に供給することができる。
【０１１４】
分岐点に関する、本明細書の枠内で用いられる概念は、一般的な意味を有し、排出管の幾何学的交点に限定されない。むしろ、かご３７´´または転轍器がこれらの排出管の上流方向手前に設けられていることも可能である。例えば、分岐点の概念は、いわゆる「セパラトリックス」を含む。このセパラトリックスは、担体流路における層流の分割線である。
【０１１５】
更に、電極装置３６´´，５２´´、かご３７´´および測定点（Messstationen）５３´´，５４´´は、ここではおよび以下の実施の形態で、担体流路３３´´で中央に設けられている。
【０１１６】
図８に示した実施の形態は、図７に示した前記の実施の形態にかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のためにスリーダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１１７】
この実施の形態の特殊性は、誘電泳動的なかご３７´´´の構造的形態にある。このかごはここでは６つの空間的に設けられた電極からなる。個々の電極は別々に起動されることができる。その目的は、かご３７´´´がスイッチまたは転轍器としてあるいはかごとして選択的に機能することができるためである。
【０１１８】
図９は、最後に、選別チップの可能な配列の他の実施の形態を示す。ここでは、２つの担体流用導管５６，５７は共通の担体流用導管５８に通じている。２つの担体流用導管５６，５７を通って、夫々、懸濁されている粒子が供給される。
【０１１９】
２つの担体流用導管５６，５７には、夫々、漏斗状の電極装置５９，６０が設けられている。その目的は、２つの担体流用導管５６，５７の担体流に含まれている粒子を位置決めするためである。
【０１２０】
共通の担体流路５８では、２つの担体流用導管５６，５７の上流方向合流点に、隔壁６１がある。それ故に、２つの担体流用導管５６，５７の担体流に懸濁されている粒子が、担体流路５８内で、まず相並んで平行におよび互いに分離して送られる。
【０１２１】
隔壁６１の領域では、担体流路５８内に、２つの分析窓６２，６３がある。その目的は、懸濁されている粒子を、傍らを流れる間に、前分析に晒すためである。前分析は、例えば、図２に関し前述のように、なされることができる。
【０１２２】
２つの分析窓６２，６３の下流方向後方には、担体流用導管５８に、漏斗状の電極装置６４が設けられている。この電極装置は、２つの部分流で隔壁６１の両側に懸濁されている粒子を位置決めし、それを誘電泳動的なかご６５に供給する。このかごは、分析のための粒子を、他の分析窓６６に固定することができる。
【０１２３】
誘電泳動的なかご６５の下流方向後方に、他の電極装置６７がある。この電極装置は、担体流に懸濁されている粒子を、かご６５による解放後に、分析窓６６での分析の結果に応じて、３つの排出管６８，６９，７０のうちの１に供給する。この場合、排出管６８，７０は、マイナスに選別された粒子を運び出すために用いられる。これに対し、排出管６９はプラスに選別された粒子を更に導くために用いられる。従って、マイナスに選別された粒子のための排出管６８，７０に粒子を搬送することが意図されるとき、電極装置６７はアクティブに起動される必要がある。これに対し、プラスに選別された粒子のために起動はなされない。従って、この電極装置は、特に、極僅かの粒子がマイナスに選別される分析の場合に、適切である。
【０１２４】
本発明は前記の好ましい実施の形態に限定されない。むしろ、同様に本発明の思想を用いるので、保護範囲に含まれる多数の変更の実施の形態が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】選別チップを有する、本発明に係わる細胞選別器の、その流れ図を示す。
【図２】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの担体流路を示す。
【図３】図１の細胞選別器の分析用レンズの略図を示す。
【図４】死んだ生体細胞と生きている生体細胞の区別を明示するためのグラフを示す。
【図５Ａ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、実施の形態を示す。
【図５Ｂ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｃ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｄ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｅ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図６】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の代替の実施の形態を示す。
【図７】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【図８】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【図９】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載の、好ましくは生体粒子のための、特に、細胞選別器で生体細胞を分析するための分析方法ならびに請求項１４に記載の対応の分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ・ミュラー等『A 3-D microelrctrode system for handling and caging single cells and particles』、Biosensors and Bioelectrics 14 (1999)、247ないし256頁からは、生体細胞のための分析方法が公知である。この分析方法では、分析される細胞が、流体状のマイクロシステムの担体流中に懸濁されており、誘電泳動的に操作および選別される。担体流では、分析される細胞が、まず、漏斗状の、誘電泳動的な電極装置（英語では、「Funnel」）によって並べられ、続いて、誘電泳動的なかご（英語では、「Cage」）に抑えられる。その目的は、かごにある細胞を、静止状態で分析することができるためである。この目的のために、微視的な、分光学的なまたは蛍光学的な測定法を用いることができる。誘電泳動的なかごに捕捉された細胞の分析に従って、これらの細胞を続いて選別することができる。この目的のために、操作者は、担体流中で誘電泳動的なかごの下流方向後方に設けられた誘電泳動的な電極装置からなる選別手段を起動する。
【０００３】
前記分析方法の欠点は、サンプル中の分析される細胞がしばしば非常に異なっていることである。非常に不均一なサンプルから例えば所定の標的細胞を或る方法によって同定し、次にこれらの標的細胞を分離することが意図される。これらのサンプルの場合、標的細胞は、しばしば、サンプル全体の極僅かな割合に過ぎない。他の細胞は所望の特性を有しないか、最早生きておらず、従って既に死んでいる。更に、細胞が完全には個別化されておらず、幾つかの細胞が、２つまたはそれより多い細胞の凝集体として、システムを通過することがしばしば生じる。これは望ましくない結果である。しかし、場のかごの中の個々の細胞または凝集体の詳しい分析は、時間のかかるプロセスである。それ故に、場のかごの中の細胞サンプル全体の分析は非常に長く続行するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、前記の公知の分析方法を、重要でない生体細胞（例えば死んだ細胞）または細胞の屑の、誘電泳動的なかごの中での分析を防止することができるように、改善するという課題が、本発明の基礎になっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題は、明細書導入部に記載の公知の分析方法を前提として、請求項１の特徴によっておよび、対応の分析装置に関しては、請求項１４の特徴によって解決される。
【０００６】
本発明は、担体流に懸濁されている粒子の、誘電泳動的なかごの中での分析の前に、まず、担体流と共に移動する粒子の前分析を実行し、続いて、他の分析にとって重要な粒子を誘電泳動的なかごに捕捉しかつ分析することができるという、一般的な技術的教示を有する。
【０００７】
前分析は、例えば、蛍光の強度、細胞の生命力および／または個々の細胞または凝集体であるかの問題に該当することができる。更に、前分析の際に、細胞であるか、形状および大きさにおいて詳しい分析の主要細胞ではない物質、例えば不純物または他の細胞であるかが、これらの細胞が標的細胞と区別される限りで、検出されることができる。
【０００８】
本発明に係わる分析方法の場合、まず、担体流中に懸濁されている粒子の前分析および前分析の結果に応じた所定の粒子の選別がなされる。他方、実際の主分析は、予め選別された粒子のためにのみ実行される。このような粒子は、粒子の移動によって困難にされるだろう情報提供可能な主分析を可能にするために、減速される。
【０００９】
本発明の枠内では、前分析に従って選別された粒子が例えば誘電泳動的なかごの中で捕捉されるので、これらの粒子を主分析の前に完全に停止させることは必ずしも必要ではない。本発明の枠内では、むしろ、前分析に従って選別された粒子が、粒子の情報の多い分析が可能である限りのみ、担体流内で減速されることも可能である。
【００１０】
更に、本発明の枠内で用いられる、粒子の概念が一般的な意味を有するのであって、個々の生体粒子に限定されないことに言及することができる。むしろ、この概念は合成粒子または生体粒子を含む。特別な利点が生じるのは、粒子が、生体物質、従って例えば生体粒子、細胞群、細胞成分、または生物学的に重要な分子を、夫々、場合によっては他の生体粒子または合成担体粒子との組合せで有するときである。合成粒子は、個体粒子、液状粒子、懸濁媒体から分離されている粒子、また、担体流中の懸濁媒体に対し分相を形成する多相粒子を含んでもよい。
【００１１】
前分析に従って選別され、続いて主分析の枠内で詳細に分析された粒子を、主分析の結果に従って選別および／または処理することは好ましい。例えば、主分析の際に、種々の細胞型を区別し、続いて、それに対応して選別することができる。しかし、前分析の枠内で選別された粒子を、主分析の結果に応じて複数の誘電泳動的要素によって操作することも可能である。この場合、Ｔ・ミュラー等の、明細書導入部に記載された刊行物に記載された誘電泳動的要素を用いることができる。
【００１２】
前分析の枠内で、例えば、透過光測定、蛍光測定および／またはインピーダンス分光法を行なうことができる。しかし、本発明の好ましい実施の形態では、まず、透過光測定および続いて蛍光測定を行なう。透過光測定および蛍光測定を、空間的に分離された分析窓（英語では、「Religion of Interest」）で行なうことは好ましい。透過光測定は、例えば、生きている生体細胞と死んだ生体細胞との区別を可能にし、他方、蛍光測定は、担体流中に懸濁されている粒子が蛍光マーカーを有するか否かを分析するために、用いられることができる。
【００１３】
前分析の枠内で透過光測定および蛍光測定を、空間的に分離された分析窓で行なうとき、担体流中の透過光のための分析窓が、蛍光測定のための分析窓の上流方向手前に位置していることは好都合である。しかし、その代わりに、担体流中の透過光のための分析窓が、蛍光測定のための分析窓の下流方向後方に設けられていることも可能である。
【００１４】
担体流と共に移動する粒子の前分析の枠内で、光学画像が撮像されるのは好ましい。このことは、粒子を分類するためのディジタル式の画像評価を可能にする。この場合、例えば、個々の生体細胞を細胞塊と区別することができるために、粒子を形態的に分析することは好ましい。本明細書の枠内で用いられる、光学画像の概念は、一般的な意味を有し、従来の語義での２次元画像に限定されない。むしろ、本発明の意味する光学画像の概念は、担体流の、または、担体流中に懸濁されている粒子の、点状のまたは線状のスキャンをも含む。例えば、個々の粒子を検出しかつ分類するために、担体流に対し直角の線に沿って輝度を積分することができる。
【００１５】
前分析の枠内での、生きている細胞と死んだ細胞との区別は、透過光測定の際に、撮像された光学画像における強度分布の評価によってなされることができる。前記特性を有するこの透過光測定の特殊な原理は、例えば、位相差照明である。かくて、生きている生体細胞は、透過光測定で比較的明るい縁部と、より暗い中心点とを有する環状構造を有する。これに対し、死んだ生体細胞は、透過光測定の際に、ほぼ一様な輝度を有し、背景に比較して暗く見える。
【００１６】
粒子の主分析の際に、例えば、所定の分子を、１つの細胞内に局在化することができる。例えば、主分析の枠内で、蛍光染料で標識化されている分子を、１つの細胞内に局在化することができる。蛍光染料は、例えば、分子生物学的に生成された、「緑色蛍光タンパク質」の「標識」およびこれら標識の誘導体、他の自己蛍光性のタンパク質であってもよい。しかし、蛍光染料としては、細胞の分子に共有または非共有結合する蛍光染料も適切である。更に、蛍光染料としては、細胞の酵素から蛍光生成物に変換されるフッ素物質またはいわゆるＦＲＥＴ（Fluoreszenz Resonanz Energietransfer）対も用いることができる。用いられる蛍光染料の状態を、例えば、そのスペクトル特性に基づいてまたは生体発光によって区別することができる。
【００１７】
１つの細胞内での分子の局在化によって、分子の構造および機能を算出することもできる。この場合、例えば、原形質膜、細胞質ゾル、ミトコンドリア、ゴルジ装置、エンドソーム、リソゾーム、細胞核、紡錘装置、細胞骨格内での存否に基づき、アクチン、チューブリンとの共局在化を区別することができる。
【００１８】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞の形態を定めることができる。この場合、染料も用いることができる。
【００１９】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞集団の２つまたはそれより多い状態も区別することができる。
【００２０】
更に、主分析の枠内で、蛍光マーカーを有する分子のトランスロケーションに基づいて、細胞シグナルを、細胞の信号、例えば、受容体インターナリゼーションに従う受容体活性化、アレスチンの結合に従う受容体凝集、原形質膜から細胞質ゾルへの、細胞質ゾルから原形質膜への、細胞質ゾルから細胞核へのまたは細胞核から細胞質ゾルへの分子の転移を測定することが可能である。
【００２１】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、２つの分子の相互作用を測定する
ことができる。相互作用する分子のうちの少なくとも１が蛍光マーカーを有することは好ましく、例えば、２つの蛍光染料の共局在化による、ＦＲＥＴによる、または蛍光の寿命の変化による相互作用が示される。
【００２２】
しかし、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞周期内の或る細胞の状態を測定することができる。細胞の形態または細胞の染色質の染色が評価されることは好ましい。
【００２３】
主分析および／または前分析のための他の可能性は、或る細胞の膜電位を測定することにあり、膜電位に敏感な染料を用いることは好ましい。この場合、原形質膜電位および／またはミトコンドリアの膜電位に対し敏感である染料を用いることは好ましい。
【００２４】
更に、主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞の生命力も算出することができる。この細胞の形態を評価しおよび／または生きている細胞と死んだ細胞を区別することができるフッ素物質を用いることは好ましい。
【００２５】
更に、主分析および／または前分析の際に、細胞毒性の効果を分析しおよび／または細胞のｐＨ値を測定することができる。
【００２６】
主分析および／または前分析の枠内で、或る細胞内の１つまたは複数のイオンの濃度を測定することも可能である。
【００２７】
実際また、主分析および／または前分析の際に、細胞内の酵素の活性を算出することができる。フッ素物質または呈色物質、特にキナーゼ、ホスファターゼまたはプロテイナーゼを用いることができる。
【００２８】
更に、主分析および／または前分析の際に、生体物質、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物または脂肪を生産する細胞の、その増殖力を測定することができる。この場合、前記方法を用いることができる。
【００２９】
最後に、主分析の枠内で、細胞・ストレス経路、代謝経路、細胞成長経路、細胞分裂経路および他のシグナル導入経路を測定することができる。
【００３０】
更に、本発明は、前記分析方法を実施するための対応の分析装置を含む。
【００３１】
本発明に係わる分析装置が、粒子の画像を撮像するために、レンズを有することは好ましい。
【００３２】
本発明に係わる分析装置のレンズを、倍率、焦点および／または視野を調整するためにまたは所定の光学フィルタを選択するために、調整することができることは好ましい。レンズの調整は操作部（例えば電動機）によってなされることができる。
【００３３】
粒子の減速が、知られている誘電泳動的なかごによってなされることは既に前に記述した。しかし、本発明の実施の形態では、誘電泳動的なかごが、詳細な分析のための懸濁されている粒子を減速するためにのみ用いられるのではなくて、スイッチ（英語では「switch」）または転轍器の機能をも果たすのは、懸濁されている粒子を、詳細な分析に従って、かごにより、複数の排出管のうちの１に供給することによってである。この目的のために、誘電泳動的なかごの個々の電極を互いに別々に起動することができることは好ましい。更に、誘電泳動的なかごは、このために、排出管のうちの分岐点に設けられていることは好ましい。
【００３４】
更に、複数の排出管のうちの１または複数には、漏斗状の電極装置（英語では「Funnel」）が設けられていてもよい。その目的は、懸濁されている粒子の、排出管における沈下を阻止するためである。このことは好都合である。何故ならば、担体流は、排出管で、以下の速度分布を有するからである。この速度分布は、壁付近で、遅い流速のみを示すので、排出管における粒子の沈下が、壁付近の沈殿をもたらすであろう。
【００３５】
更に、懸濁されている粒子が、共通の担体流用導管に合流する２つの分離された担体流用導管を通って、供給されるという可能性が存する。この場合、２つの担体流用導管の合流点の領域では、共通の担体流用導管に、隔壁が設けられていてもよい。この隔壁は、共通の担体流用導管においても、２つの分離される部分流を互いに分離する。２つの部分流を分析に晒すことができる。この分析の結果に従って、次に、２つの部分流に懸濁されている粒子を、集めることができる。次に、集められた粒子を、次に、前記の如く、誘電泳動的なかごに固定し、詳細な分析に晒すことができる。最後に、誘電泳動的なかごによって解放された細胞を、次に、詳細な分析の結果に従って、複数の排出管のうちの１に供給することができる。
【００３６】
細胞を、菌の少ない、無菌の条件下で分析し、それに応じて分離することができることは、本発明の特別な利点である。
【００３７】
本発明の他の好都合な改善は、従属請求項に特徴付けられている。以下、これらの改善を、本発明の好ましい実施の形態の記述と共に、図面を参照して詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
図１の略図は、微小流体状の選別チップ１によって生体細胞を誘電泳動で選別する、本発明に係わる細胞選別器を示している。
【００３９】
生体細胞に誘電泳動で影響を及ぼす技術は、例えば、Ｔ・ミュラー等『A 3-D microelectrode system for handing and caging single cells and particles』、Biosensors & Bioelectrics 14 (1999)、247ないし256頁に記載されている。それ故、以下に、選別チップ１における誘電泳動法の詳述を省略し、前記の刊行物を参照するよう指摘する。
【００４０】
選別チップ１は、流体の接触のために、複数の接続部２−６を有する。接続部２−６における流体の接触は、DE 102 13 272に記載されている。この公報の内容は本明細書に組み込まれる。
【００４１】
選別チップ１の接続部２は、選別される生体細胞を有する担体流を収容するために用いられる。これに対し、選別チップ１の接続部３は、選別チップ１上でこれ以上分析されない選別除外された生体細胞を搬出するために用いられる。選別除外された生体細胞は、吸引用シリンジ７によって捕らえられることができる。吸引用シリンジは、選別チップ１の接続部３に接続されることができる。これに対し、選別チップ１の出口５は、重要な生体細胞を搬出するために用いられる。これらの生体細胞は、続けて、更に加工または分析されることができる。
【００４２】
更に、選別チップ１の接続部４および６は、いわゆる被覆流（Huellstrom）の供給のために用いられる。被覆流は、選別された生体細胞を選別チップ１の接続部５に供給する課題を有する。被覆流の機能法に関して、ドイツ特許出願DE 100 05 735を参照されたい。それ故に、以下、被覆流の機能法の詳述を省略することができる。
【００４３】
選別チップの接続部４および６は、２つの被覆流用導管８，９、Ｙ継手１０および４方向弁１１を介して、圧力容器１２に接続されている。圧力容器には、被覆流のための培養媒体がある。
【００４４】
圧力容器１２は、圧縮空気用導管１３を介して、過剰圧力下に置かれる。それ故に、圧力容器１２に存する緩衝液（例えば、培養媒体）が、４方向弁１１の適切な位置で、Ｙ継手１０および被覆流用導管８，９を介して、選別チップ１の接続部４，６に流れる。
【００４５】
しかし、その代わりに、被覆流を、緩衝液の入った圧力容器１２とは異なる原理、例えば、シリンジ型ポンプまたは蠕動性のポンプによっても、実現化することができる。
【００４６】
これに対し、選別チップ１の接続部２は、担体流用導管１４を介して、粒子用インジェクタ１５に接続されている。
【００４７】
上流では、粒子用インジェクタ１５は、Ｔ継手１６を介して、担体流用シリンジ１７に接続されている。担体流用シリンジは機械式に駆動され、担体流の所定の液流を注入する。
【００４８】
更に、Ｔ継手１６は、上流で、他の４方向弁１８および被覆流用導管１９を介して、３方向弁２０に接続されている。３方向弁２０は、被覆流用導管８，９および担体用導管１４を、実際の作動前に洗浄をすることができる。
【００４９】
この目的のために、３方向弁２０は、上流で、蠕動性ポンプ２１を介して、３つの３方向弁２２．１ないし２２．３に接続されている。これらの３方向弁には、夫々シリンジ型リザーバ２３．１ないし２３．３が接続されている。この場合、シリンジ型リザーバ２３．１ないし２３．３は、実際の作動前に流体システム全体を洗浄するための充填剤流を供給するために用いられる。シリンジ型リザーバ２３．１は、例えば７０％のエタノールを有し、これに対し、シリンジ型リザーバ２３．２は、充填剤流用物質として、好ましくは蒸留水を有する。シリンジ型リザーバ２３．３は、充填剤流用物質として、例えば緩衝液を有する。
【００５０】
更に、細胞選別器は過剰な被覆流のための受器２７および過剰な充填剤流のための受け器２８を有する。
【００５１】
以下、まず、洗浄工程を記述する。この洗浄工程は、被覆流用導管８，９、担体流用導管１４および細胞選別器の残りの流体システムの気泡および不純物を取り除くために、細胞選別器の実際の作動前に実行される。
【００５２】
この目的のために、まず、３方向弁２２．１が開かれ、エタノールがシリンジ型リザーバ２３．１によって充填剤流として注入される。この場合、エタノールは蠕動性ポンプ２１によってまず３方向弁２０へ運ばれる。エタノールは、（無菌の分析・選択工程を調整するための）システム内の細菌の数を減らすためのみならず、空気を流体状のシステムから完全に除去するためにも用いられる。
【００５３】
洗浄工程中に、３方向弁２０は、蠕動性ポンプ２１によって運ばれる充填剤流の一部が、被覆流用導管１９を介して、更に導かれ、他方、蠕動性ポンプ２１によって運ばれる充填剤流の残り部分が４方向弁１１に達するように、調整されている。２つの４方向弁１１，１８は、同様に、充填剤流が、被覆流用導管８，９および担体流用導管１４を通って導かれるように、調整されている。更に、培養媒体は、これらの導管に短時間に媒体を注入するために、圧力容器１２から受け器２７へ流れる。
【００５４】
エタノールによる細胞選別器の前記洗浄の後に、同様に、蒸留水または緩衝液による洗浄もなされる。その時々に、３方向弁２２．２または２２．３が開かれる。
【００５５】
前記洗浄工程中に、過剰の充填剤流が、４方向弁１８から受け器２８へ導かれることができる。
【００５６】
洗浄工程後に、３方向弁２２．１ないし２２．３が閉じられ、蠕動性ポンプ２１が締め切られる。
【００５７】
選別駆動を起動するために、４方向弁１１は、圧力容器１２がＹ継手１０に接続されるので、圧力容器１２にある培養媒体が、圧力容器１２に支配的な過剰圧力の故に、被覆流用導管８，９へ押し入れられるように、調整されている。
【００５８】
更に、選別駆動中に、４方向弁１８は、流れの接続がＴ継手１６と４方向弁１８との間に存在しないように、調整されている。
【００５９】
担体流用シリンジ１７によって注入される担体流は、Ｔ継手１６を介して、粒子用インジェクタ１５に流れ、他の注入用シリンジ２９によって生体細胞が担体流に注入される。続いて、担体流は、注入された生体細胞と共に、粒子用インジェクタ１５から担体流用導管１４を通って選別チップの接続部２へと流れる。
【００６０】
更に、粒子用インジェクタ１５には、粒子用インジェクタ１５の温度Ｔを測定するために、温度センサ３０が取着されていることが述べられねばならない。
【００６１】
更に、粒子用インジェクタ１５のみならず選別チップ１のための収容部にも、ペルチエ素子の形の温度調素子３１がある。その目的は、粒子用インジェクタ１５および選別チップ１を加熱または冷却することができるためである。
【００６２】
この場合、加熱・冷却エネルギＱは、温度調節器３２によって事前設定される。この温度調節器は、入力側で、温度センサ３０に接続されており、粒子用インジェクタ１５の温度Ｔを、所定の目標値に調整する。
【００６３】
以下、図２を参照して、担体流路３３を説明する。この担体流路は、細胞選別器の選別チップ１に設けられており、２つの排出管３４，３５に分岐されている。排出管３４は選別チップ１の接続部５に接続されており、プラスに選択された粒子を更に導くために用いられ、他方、排出管３５は選別チップ１の接続部３に接続されており、選別除外された粒子の搬出のために用いられる。
【００６４】
担体流路３３では、選別チップ１の接続部２の下流方向後方に、漏斗状の、誘電泳動的な電極装置３６が設けられている。この電極装置は、担体流に懸濁されている粒子を担体流路３３内で連続的に並べるという課題を有する。電極装置３６の正確な技術的構成および機能方法は、ミュラー等の、明細書導入部に記載の刊行物に記載されている。この刊行物の内容は本明細書に組み込まれるので、以下、電極装置３６の詳述を省略することができる。
【００６５】
電極装置３６の下流後方には、担体流路３３で、誘電泳動的なかご（dielektrophoretischer Kaefig）３７が設けられている。このかごは、担体流３３に懸濁されている粒子を捕捉し、正確な分析のために分析窓ＵＦに固定することを可能にする。誘電泳動的なかご３７の構造および機能に関しては、同様に、ミュラー等の、明細書導入部に引用された刊行物を参照するよう指摘する。それ故に、このことに関しては、詳述を省略することができる。
【００６６】
誘電泳動的なかご３７の下流後方における、担体流路３３の分岐領域には、誘電泳動的な電極装置３８からなる選別手段がある。この選別手段は誘電泳動的な電極装置３８からなる。電極装置３８の構造および機能に関しては、同様に、ミュラー等の、明細書導入部に引用された刊行物を参照するよう指摘する。電極装置３８は、担体流に懸濁されている粒子を排出管３４または排出管３５に選別する。選択は、更に詳述するように、かご３７に固定された粒子で実行された主分析に従って、なされる。
【００６７】
更に、担体流用導管３３の分岐領域には、流れ誘導手段が設けられている。この流れ誘導手段は、同様に、誘電泳動的な電極装置３９からなり、排出管３５から排出管３４への粒子の逆流を防止するという課題を有する。この目的のために、電極装置３９はＶ字形に形成されており、２つの脚部を有する。電極装置３９の一方の脚部は排出管３４に突入し、電極装置３９の他方の脚部は排出管３５に突入している。
【００６８】
以下、図２および３を参照して、選別チップ１内の担体流に懸濁している粒子が如何に分析されるかを説明する。
【００６９】
粒子の前分析の枠内で、まず、分析窓ＲＯＩ１（region of interest 1）における透過光測定ならびに他の分析窓ＲＯＩ２（region of interest 2）における蛍光測定がなされる。分析窓ＲＯＩ１は、担体流路３３で、蛍光測定のための分析窓ＲＯＩ２の下流手前に設けられている。
【００７０】
この場合、透過光測定のみならず蛍光測定も、図３に略示された検出ユニットＤによってなされる。この検出ユニットは、画像検出のために、ＣＣＤカメラ４０を有する。このＣＣＤカメラは、選別チップ１の下方に設けられており、反射鏡４１へ整列されている。
【００７１】
選別チップ１の上方には、透過光測定のための光源として、発光ダイオード４２が設けられている。発光ダイオード４２と選別チップ１との間には、コンデンサ４３があり、このコンデンサは例えば位相差絞りを有してもよい。
【００７２】
選別チップ１の下方では、コンデンサ４３の光路に、対物レンズ４４が設けられている。
【００７３】
透過光測定の際には、ＣＣＤカメラ４０は、反射鏡４１および対物レンズ４４によって、分析窓ＲＯＩ１の画像を撮像する。
【００７４】
更に、検出ユニットＤは、複数の電動の操作部４５．１ないし４５．３を有する。これらの操作部は、対物レンズ４４の、フィルタブロック４７のおよび反射鏡４１の調整を可能にする。この場合、対物レンズ４４の調整は倍率のおよび焦点の変更を可能にする。これに対し、フィルタブロック４７を調整することができるのは、種々のフィルタを選択するためである。これに対し、反射鏡４１の調整は、担体流路３３での万が一の堆積を認識するために、視野を担体流路３３に沿って移動するという目的を有する。
【００７５】
蛍光測定の際に蛍光を励起するために、検出ユニットＤは光源４６（例えばレーザ）を有する。この光源は、フィルタブロック４７によって、担体流路３３に懸濁されている生体細胞の蛍光励起を可能にする。このとき、ＣＣＤカメラ４０は対応の蛍光画像を撮像する。
【００７６】
以下、図４を参照して、Ｘ線写真での生体細胞の種々の相を記述する。図４の例は、上方領域に、生きている細胞４８および死んだ細胞４９を示し、下方領域に、Ｘ線写真での強度曲線５０，５１を示す。このことから、生きている細胞４８が比較的暗い核を有し、これに対し、死んだ細胞４９の内部は、均等に照明されていることが認められる。このことは、これから詳述するように、生きている細胞４８と死んだ細胞４９との相違を可能にする。
【００７７】
以下、図５Ａないし５Ｅに示した流れ図を参照して、本発明に係わる分析法を説明する。
【００７８】
方法の始めに、まず、担体流用導管１４および被覆流用導管８，９を、７０％のエタノール溶液で、続いて蒸留水で、最後に緩衝液で洗浄する。その目的は、細胞選別器の流体システムを清浄し、特に気泡および不純物を除去するためである。
【００７９】
続いて、次に、担体流を担体流用シリンジ１７から担体流用導管１４に注入する。被覆流の供給後に、後述のように、分析される生体細胞を、粒子用インジェクタ１５に設けられた注入用シリンジ２９によって担体流に注入する。
【００８０】
更に、被覆流のための、圧力容器１２にある培養媒体を、圧縮空気用導管１３を通って供給される圧縮空気によって、圧力容器１２から被覆流用導管８，９に押し入れる。被覆流用導管は、選別チップ１の接続部４または６に通じており、選別チップ１において選別される粒子を、選別チップ１の接続部５を通って、送ることを支援する。
【００８１】
選別チップ１の担体流路３３では、破線矢印で略示されているように、懸濁されている粒子を、まず、電極装置３６によって、流れ方向に連続的に並べる。
【００８２】
続いて、分析窓ＲＯＩ１では、時間的に連続的に，複数の位相差画像Ｂ１，．．，Ｂｎを撮像する。その目的は、以下に詳述するように、懸濁されている粒子の運動速度を算出し、生きている細胞を死んだ細胞から区別するためである。
【００８３】
懸濁されている粒子の運動速度を測定するために、位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎの各々に対し、各々の強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎを算出するのは、位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎにおける画像強度を、カラムごとに、すなわち、流れ方向に直角に積分することによってである。個々の強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎは、夫々、生体細胞の位置で、信号のピークを有する。信号のピークは、複数の細胞の運動速度に対応する強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎと、これらの強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎの時間間隔との間で移動する。
【００８４】
続いて、時間的に連続する強度信号Ｉｉ，Ｉｉ＋１に関して、相互相関関数φ１を計算する。相互相関関数φ１の計算は、選別チップ１の担体流路３３での細胞の運動速度を測定するために用いられる。その目的は、所定の細胞を捕捉すべく、誘電泳動的なかご３７を正しい時点で起動させることができるためである。
【００８５】
続いて、担体流路３３の長手方向における移動ｘに従う個々の相互相関関数φｉ（ｘ）に関して、最大値を計算する。
【００８６】
このことから、担体流路３３での細胞の運動速度は、相互相関関数の最大値の平均値と、連続する位相差画像Ｂ１，．．．，Ｂｎの間の時間間隔とのからなる商として生じる。
【００８７】
細胞の運動速度ｖを、フィードバックの枠内で、ポンプ制御のために、すなわち、計算されたポンピング速度と実際のポンピング速度が一致するか否かおよび場合によっては実際のポンピング速度が如何に再調整されねばならないかを制御するために、用いることができる。特に、細胞が余りに緩慢に流れる（詰まり）か、止まっているか、逆流さえする元になる故障が、システムにあるか否かを、運動速度ｖに基づいて、認識することができる。これらの妨害はかくして認識され、例えばシステムの洗浄によって除去されることができる。
【００８８】
しかし、その代わりに、細胞の運動速度ｖの前記測定を、分析窓ＲＯＩ１，ＲＯＩ２の外側で行なうことができる。原理的には、細胞の運動の追跡（英語では、「Cell Tracking」）は、担体流路３３全体または担体流路３３の任意な領域内でも可能である。
【００８９】
更に、強度信号Ｉ１，．．．，Ｉｎの信号形状が、粒子の寸法および凝集体の万が一の形成に関する情報を提供する。引っ括れば、強度信号の評価は、すべてのユニットの、すなわち、ポンプの、誘電泳動的な電極要素（例えば何時「ケージング」がなされ、何時「スイッチング」がなされるか）の、かご３７内の詳細な撮像およびサンプルの堆積の、制御および自動化にとって重要である。
【００９０】
第２段階では、次に、捕捉時点ｔＦを計算する。この捕捉時点で、かご３７を起動しなければならない。その目的は、続きの主分析のための分析された粒子を、分析窓ＵＦに捕捉するためである。この場合、捕捉時点ｔＦは、１つの粒子の運動速度ｖと、かご３７からの間隔とから生じる。
【００９１】
更に、他の段階では、複数の隣り合った粒子の間の粒子間隔ｄＰを算出する。このことは、これから詳述するように、個々の細胞と細胞凝集体との間の区別にとって重要となる。
【００９２】
以下、死んだ細胞と生きている細胞との区別がなされる、図５Ｃに記した方法段階を説明する。この目的のためには、その都度、位相差画像における強度が所定の境界値をＩＴＨを越えてなる細胞周辺定点ｘ１，ｘｒを算出する。
【００９３】
続いて、細胞周辺定点ｘ１とｘｒとの間に強度最大値があるか否かを検査する。このことが当て嵌まり、最小強度が存する場合には、図４から明らかなように、細胞は生きている細胞である。これに対し、異なる場合には、細胞を、死んだものと分類する。その目的は、これから詳述するように、以下に、適切な選別を行なうためである。
【００９４】
死んだ細胞と生きている細胞との間の前記区別の後に、図５Ｄの方法段階で、個々の細胞の輝度Ｌを算出するのは、１つの細胞の強度Ｉを、細胞周辺定点ｘ１とｘｒとの間に積分することによってである。
【００９５】
続いて、細胞の、かように算出された輝度Ｌを、最小値Ｌｍｉｎおよび最大値Ｌｍａｘと比較する。
【００９６】
細胞の算出された輝度がこの窓内部にある場合には、透過照明をオフにし、光源４６により蛍光の励起をオンにする。続いて、次に、蛍光画像を分析窓ＲＯＩ２において撮像し、細胞の蛍光ＩＦを測定する。
【００９７】
しかし、蛍光の励起が永続的に起動されていることも可能である。但し、細胞の算出された輝度が前記窓の内側にあるとき、透過照明はオフにされる。
【００９８】
細胞の測定された蛍光ＩＦが所定の境界値Ｉｍｉｎを越えるとき、このことは、当該の細胞が蛍光マーカーを有することを示す。
【００９９】
これに対し、測定された蛍光ＩＦが所定の境界値Ｉｍｉｎを下回るとき、当該の細胞が蛍光マーカーを有しないことを前提とすることができる。
【０１００】
図５Ｅに示した方法段階で、次に、所定の細胞を選別する。生きている細胞と死んだ細胞との区別および蛍光マーカーの有無の検査を考慮する。例えば、生きておりかつ蛍光マーカーを有する細胞を選別することができる。これに対し、他の細胞を選別除外する。
【０１０１】
他の段階で、次に、一方では個々の細胞と、他方では細胞凝集体との区別を、予め算出された粒子間隔ｄＰを所定の最小値ｄＭＩＮと比較することによって、行なう。最小値ｄＭＩＮを下回るときは、粒子が細胞凝集体であるので、工程が終了されることを前提とする。これに対し、粒子間隔ｄＰが所定の最小値ｄＭＩＮを上回るときは、粒子が個々の細胞であり、工程が、以下に記述する段階によって続行されることを前提とする。
【０１０２】
かように選別された細胞を、次に、所定の捕捉時点ｔＦで、誘電泳動的なかご３７に捕捉し、このことによって固定する。それ故に、続いて、解像度が高まりかつ照射時間が長くなるに連れて、捕捉された細胞の主分析が可能である。
【０１０３】
選別された細胞、すなわち、通常は、生きておりかつ蛍光マーカーを有する細胞を、次に、電極装置３８によって排出管３４へ送り込み、これに対し、選別除外された細胞（例えば、死んだ細胞）を排出管３５に運ぶ。
【０１０４】
分析窓ＵＦでの主分析は、蛍光励起を有する画像である。１つまたは複数の励起波長は同時にまたは時間的にずれて用いられる。この目的のために、フィルタブロック４７に、適切なダイクロイック・ミラーが用いられる。この場合、１つまたは複数の波長の蛍光が、同時に、１つまたは複数のカメラへ導かれる。この目的のために、フィルタブロック４７に、適切な発光フィルタ要素または適切な発光分割器が用いられる。かくて、複数の蛍光色の場合に、選別された細胞の複数の画像を同時にまたは順番に形成することが可能である。更に、白光の位相差照明の場合に、選別された細胞の１つの画像を形成することも可能である。このことは、蛍光マーカーを有する細胞に、なお１つのまたは複数の蛍光マーカーを有しない細胞が付着しているか否かを確認するために必要である。付着は、蛍光マーカーを有するこの細胞の、通常は望ましくない汚染をもたらす。
【０１０５】
図６に示した実施の形態は、図２に示した実施の形態とかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のために単にダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１０６】
この実施の形態の特殊性は、担体流路３３´で入口側に設けられており、かつ担体流に懸濁されている粒子を担体流路３３´に連続的に並べる誘電泳動的な電極装置３６´の、より単純な構造にある。
【０１０７】
この実施の形態の他の特殊性は、担体流路３３´で、電極装置３６´の下流方向後方には、鉤状の電極装置５２´が設けられていることにある。この電極装置は、その形状に応じて、「フック」とも呼ばれ、粒子を捕まえておき、いわば止めておくという課題を有する。電極装置５２´の正確な構造および機能方法は、例えば、Bioworld 2-2002に所収のＴ・ミュラー等『Life Cells in Cellprocessors』に記載されている。それ故に、ここでは、電極装置５２´の詳述を省略することができ、前記刊行物の内容を、本明細書に全面的に組み込むことができる。
【０１０８】
担体流路３３´では、電極装置５２´と誘電泳動的なかご３７´との間に、分析窓５３´が設けられている。その目的は、分析窓ＲＯＩ１およびＲＯＩ２に関して前記した予備分析を実行するためである。
【０１０９】
この場合、他の分析窓５４´は、誘電泳動的なかご３７´にある。それ故に、誘電泳動的なかご３７´で、減速された粒子の分析を実行することができる。
【０１１０】
この実施の形態の他の特殊性は、プラスに選択された粒子のための排出管３４´には、電極装置３６´に対応する機能を有する漏斗状の電極装置５５´が設けられていることにある。この電極装置は、粒子を排出管３４´に位置決めする課題を有する。このことは好都合である。何故ならば、排出管３４´内の粒子は、沈下の傾向を有し、従って、流速が低い壁付近に、堆積することがあるからである。電極装置５５´は、粒子のこのような沈下を防止し、このことによって、粒子を、排出管３４´の中央に保つ。そこでは、流速が最大である。
【０１１１】
更に、電極装置３６´，５２´並びに誘電泳動的なかご３７´が担体流路３３´に偏心的に設けられていることに言及しなければならない。このことは、結果として、電極装置３８´が起動されないとき、担体流路３３´に含まれている粒子が、誘電泳動的なかご３７´による解放後に、マイナスに選別された粒子のための排出管３５´に自動的に達することを伴う。このことは、プラスに選別されるべき粒子が担体流に極僅か含まれているときにのみ、電極装置３８´が起動されればよいという利点をもたらす。
【０１１２】
図７に示した代替の実施の形態は、図６に示した前記の実施の形態にかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のためにツーダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１１３】
この実施の形態の特殊性は、誘電泳動的なかご３７´´が、担体流路３３´´が２つの排出管３４´´，３５´´に分岐している位置に、設けられていることにある。更に、この場合、誘電泳動的なかご３７´´の個々の電極が、別々に起動されることができる。それ故に、誘電泳動的なかご３７´´は、２つの機能、すなわち、一方では、かご（英語では「Cage」）の機能と、他方では、スイッチ（英語では「Switch」または転轍器の機能を果たすことができる。誘電泳動的なかご３７´´は、一方では分析窓５４´´での分析のために、粒子を、担体流に固定し、他方では、粒子を２つの排出管３４´´，３５´´の一方に供給することができる。
【０１１４】
分岐点に関する、本明細書の枠内で用いられる概念は、一般的な意味を有し、排出管の幾何学的交点に限定されない。むしろ、かご３７´´または転轍器がこれらの排出管の上流方向手前に設けられていることも可能である。例えば、分岐点の概念は、いわゆる「セパラトリックス」を含む。このセパラトリックスは、担体流路における層流の分割線である。
【０１１５】
更に、電極装置３６´´，５２´´、かご３７´´および測定点（Messstationen）５３´´，５４´´は、ここではおよび以下の実施の形態で、担体流路３３´´で中央に設けられている。
【０１１６】
図８に示した実施の形態は、図７に示した前記の実施の形態にかなり一致している。それ故に、繰返しを避けるために、前記記述を参照するよう指摘する。以下、対応の構成部材に関しては、区別のためにスリーダッシュが付されている参照符号を用いる。
【０１１７】
この実施の形態の特殊性は、誘電泳動的なかご３７´´´の構造的形態にある。このかごはここでは６つの空間的に設けられた電極からなる。個々の電極は別々に起動されることができる。その目的は、かご３７´´´がスイッチまたは転轍器としてあるいはかごとして選択的に機能することができるためである。
【０１１８】
図９は、最後に、選別チップの可能な配列の他の実施の形態を示す。ここでは、２つの担体流用導管５６，５７は共通の担体流用導管５８に通じている。２つの担体流用導管５６，５７を通って、夫々、懸濁されている粒子が供給される。
【０１１９】
２つの担体流用導管５６，５７には、夫々、漏斗状の電極装置５９，６０が設けられている。その目的は、２つの担体流用導管５６，５７の担体流に含まれている粒子を位置決めするためである。
【０１２０】
共通の担体流路５８では、２つの担体流用導管５６，５７の上流方向合流点に、隔壁６１がある。それ故に、２つの担体流用導管５６，５７の担体流に懸濁されている粒子が、担体流路５８内で、まず相並んで平行におよび互いに分離して送られる。
【０１２１】
隔壁６１の領域では、担体流路５８内に、２つの分析窓６２，６３がある。その目的は、懸濁されている粒子を、傍らを流れる間に、前分析に晒すためである。前分析は、例えば、図２に関し前述のように、なされることができる。
【０１２２】
２つの分析窓６２，６３の下流方向後方には、担体流用導管５８に、漏斗状の電極装置６４が設けられている。この電極装置は、２つの部分流で隔壁６１の両側に懸濁されている粒子を位置決めし、それを誘電泳動的なかご６５に供給する。このかごは、分析のための粒子を、他の分析窓６６に固定することができる。
【０１２３】
誘電泳動的なかご６５の下流方向後方に、他の電極装置６７がある。この電極装置は、担体流に懸濁されている粒子を、かご６５による解放後に、分析窓６６での分析の結果に応じて、３つの排出管６８，６９，７０のうちの１に供給する。この場合、排出管６８，７０は、マイナスに選別された粒子を運び出すために用いられる。これに対し、排出管６９はプラスに選別された粒子を更に導くために用いられる。従って、マイナスに選別された粒子のための排出管６８，７０に粒子を搬送することが意図されるとき、電極装置６７はアクティブに起動される必要がある。これに対し、プラスに選別された粒子のために起動はなされない。従って、この電極装置は、特に、極僅かの粒子がマイナスに選別される分析の場合に、適切である。
【０１２４】
本発明は前記の好ましい実施の形態に限定されない。むしろ、同様に本発明の思想を用いるので、保護範囲に含まれる多数の変更の実施の形態が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】選別チップを有する、本発明に係わる細胞選別器の、その流れ図を示す。
【図２】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの担体流路を示す。
【図３】図１の細胞選別器の分析用レンズの略図を示す。
【図４】死んだ生体細胞と生きている生体細胞の区別を明示するためのグラフを示す。
【図５Ａ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、実施の形態を示す。
【図５Ｂ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｃ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｄ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図５Ｅ】流れ図の形の、本発明に係わる分析方法の、他の実施の形態を示す。
【図６】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の代替の実施の形態を示す。
【図７】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【図８】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【図９】複数の誘電泳動的な要素を有する選別チップの、その担体流路の他の代替の実施の形態を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子（４８，４９）のための、特に生体粒子（４８，４９）のための分析方法であって、
分析される前記粒子（４８，４９）を少なくとも１つの担体流に挿入する工程と、
前記担体流と共に移動する前記粒子（４８，４９）の少なくとも第１の分析を実行する工程と、
この第１の分析の結果に従って少なくとも１つの粒子（４８，４９）を選別する工程と、
前記選別された粒子（４８，４９）を減速する工程と、
前記選別された粒子（４８，４９）の少なくとも第２の分析を、減速された状態で実行する工程とを具備する分析方法。
【請求項２】
前記選別された粒子（４８，４９）を、前記第２の分析の結果に応じて選別および／または処理することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記第１の分析の枠内でおよび／または前記第２の分析の枠内で透過光測定および蛍光測定を行なうことを特徴とする請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記透過光測定は、第１の分析窓（ＲＯＩ１）で、前記蛍光測定は第２の分析窓（ＲＯＩ２）で実行され、前記２つの分析窓（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２）は空間的に互いに分離されていることを特徴とする請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記第１の分析の枠内で前記粒子（４８，４９）の少なくとも１つの光学画像を撮像することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記第１の分析の枠内で、電気的なおよび／または電磁的な分析を行なうことを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項７】
前記第１の分析の枠内で、インピーダンス分析を行なうことを特徴とする請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
前記粒子（４８，４９）を、前記第１の分析の際におよび／または前記第２の分析の際に、形態学的におよび／または大きさに関して分析することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項９】
前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、その都度、個々の生体細胞からなるか、複数の生体細胞からなるか否かが検査され、前記第２の分析のために、唯一の生体細胞からなる粒子（４８，４９）が選別されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、生きた細胞（４８）であるか、死んだ細胞（４９）であるか否かが検査されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記第１の分析の枠内で、前記粒子（４８，４９）の透過光測定がなされ、前記粒子（４８，４９）の光学画像が撮像され、前記粒子（４８，４９）の前記画像での強度分布（５０，５１）が評価されることを特徴とする請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
蛍光測定による前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、蛍光マーカーに関する所定の閾値を越えるか否かが、検査されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記第１の分析によって選別された前記粒子（４８，４９）は、減速のために、場のかご（３７，３７´，３７´´，３７´´´，６５）に固定されおよび／または前記担体流は減速されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１４】
粒子（４８，４９）、特に生体粒子（４８，４９）を分析するための分析装置であって、
懸濁されている前記粒子（４８，４９）を有する担体流を収容する担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）と、
前記担体流と共に移動する前記粒子（４８，４９）の第１の分析を実行するための第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´，６２，６３）と、
前記第１の分析の結果に応じて前記粒子を選別するための選別ユニット（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）と、
前記選別された粒子（４８，４９）の第２の分析を減速された状態で実行するための第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）とを具備し、
前記選別ユニット（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）は、前記選別された粒子（４８，４９）を減速するための減速手段（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）を有する。
【請求項１５】
前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）は、前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´）の下流方向後方に設けられていることを特徴とする請求項１４に記載の分析装置。
【請求項１６】
前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）の下流方向後方には、前記選別された粒子（４８，４９）を、前記第１のおよび／または第２の分析の結果に応じて処理および／または選別するために、処理手段および／または選別手段（３８，３８´，６７）が設けられていることを特徴とする請求項１４または１５に記載の分析装置。
【請求項１７】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）は、前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）の下流方向後方で、少なくとも２つの流路（３４，３４´，３４´´，３４´´´，３５，３５´，３５´´，３５´´´）に分岐されており、前記選別手段（３８，３８´，３７´´，３７´´´）は、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域に設けられていることを特徴とする請求項１６に記載の分析装置。
【請求項１８】
前記選別手段（３８）は、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域に設けられている誘電的な転轍器を有することを特徴とする請求項１７に記載の分析装置。
【請求項１９】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域には、前記２つの流路（３４，３５）の一方から他方の流路（３４，３５）への前記担体流および／または前記粒子（４８，４９）の逆流を阻止するために、流れ案内手段（３９）が設けられていることを特徴とする請求項１７または１８に記載の分析装置。
【請求項２０】
前記流れ案内手段（３９）は電極を有することを特徴とする請求項１９に記載の分析装置。
【請求項２１】
前記流れ案内手段（３９）の電極は実質的にＶ字形に形成されており、２つの脚部を有し、これらの脚部は、実質的に、前記２つの分岐する流路（３４，３５）の方向に延びていることを特徴とする請求項２０に記載の分析装置。
【請求項２２】
前記減速手段（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）は誘電的なかごを有することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２３】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）では、前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２）の上流方向手前に、複数の集束電極（３６）が設けられていることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２４】
前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´，６２，６３）および／または前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´）は、画像を撮像するために、レンズ（４４）を有することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２５】
前記レンズ（４４）は、前記画像を、少なくとも、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）に沿って、移動させるために、可動であることを特徴とする請求項２４に記載の分析装置。
【請求項２６】
前記レンズ（４４）は、画像の移動のために、電気機械式の操作部（４５）に接続されていることを特徴とする請求項２５に記載の分析装置。
【請求項２７】
請求項１４ないし２６のいずれか１に記載の分析装置の、医学的および／または薬学的研究でのおよび／または診断でのおよび／または法医学での使用。
【請求項２８】
請求項１４ないし２６のいずれか１に記載の分析装置の、種々の細胞型、特に消滅状態のおよび壊死性の細胞、異なった発現パターンを有する細胞および／または親細胞を分離するための使用。
【請求項１】
粒子（４８，４９）のための、特に生体粒子（４８，４９）のための分析方法であって、
分析される前記粒子（４８，４９）を少なくとも１つの担体流に挿入する工程と、
前記担体流と共に移動する前記粒子（４８，４９）の少なくとも第１の分析を実行する工程と、
この第１の分析の結果に従って少なくとも１つの粒子（４８，４９）を選別する工程と、
前記選別された粒子（４８，４９）を減速する工程と、
前記選別された粒子（４８，４９）の少なくとも第２の分析を、減速された状態で実行する工程とを具備する分析方法。
【請求項２】
前記選別された粒子（４８，４９）を、前記第２の分析の結果に応じて選別および／または処理することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記第１の分析の枠内でおよび／または前記第２の分析の枠内で透過光測定および蛍光測定を行なうことを特徴とする請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記透過光測定は、第１の分析窓（ＲＯＩ１）で、前記蛍光測定は第２の分析窓（ＲＯＩ２）で実行され、前記２つの分析窓（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２）は空間的に互いに分離されていることを特徴とする請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記第１の分析の枠内で前記粒子（４８，４９）の少なくとも１つの光学画像を撮像することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記第１の分析の枠内で、電気的なおよび／または電磁的な分析を行なうことを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項７】
前記第１の分析の枠内で、インピーダンス分析を行なうことを特徴とする請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
前記粒子（４８，４９）を、前記第１の分析の際におよび／または前記第２の分析の際に、形態学的におよび／または大きさに関して分析することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項９】
前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、その都度、個々の生体細胞からなるか、複数の生体細胞からなるか否かが検査され、前記第２の分析のために、唯一の生体細胞からなる粒子（４８，４９）が選別されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、生きた細胞（４８）であるか、死んだ細胞（４９）であるか否かが検査されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記第１の分析の枠内で、前記粒子（４８，４９）の透過光測定がなされ、前記粒子（４８，４９）の光学画像が撮像され、前記粒子（４８，４９）の前記画像での強度分布（５０，５１）が評価されることを特徴とする請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
蛍光測定による前記第１の分析の際に、前記担体流中の前記粒子（４８，４９）が、蛍光マーカーに関する所定の閾値を越えるか否かが、検査されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記第１の分析によって選別された前記粒子（４８，４９）は、減速のために、場のかご（３７，３７´，３７´´，３７´´´，６５）に固定されおよび／または前記担体流は減速されることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析方法。
【請求項１４】
粒子（４８，４９）、特に生体粒子（４８，４９）を分析するための分析装置であって、
懸濁されている前記粒子（４８，４９）を有する担体流を収容する担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）と、
前記担体流と共に移動する前記粒子（４８，４９）の第１の分析を実行するための第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´，６２，６３）と、
前記第１の分析の結果に応じて前記粒子を選別するための選別ユニット（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）と、
前記選別された粒子（４８，４９）の第２の分析を減速された状態で実行するための第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）とを具備し、
前記選別ユニット（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）は、前記選別された粒子（４８，４９）を減速するための減速手段（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）を有する。
【請求項１５】
前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）は、前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´）の下流方向後方に設けられていることを特徴とする請求項１４に記載の分析装置。
【請求項１６】
前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）の下流方向後方には、前記選別された粒子（４８，４９）を、前記第１のおよび／または第２の分析の結果に応じて処理および／または選別するために、処理手段および／または選別手段（３８，３８´，６７）が設けられていることを特徴とする請求項１４または１５に記載の分析装置。
【請求項１７】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）は、前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´，６６）の下流方向後方で、少なくとも２つの流路（３４，３４´，３４´´，３４´´´，３５，３５´，３５´´，３５´´´）に分岐されており、前記選別手段（３８，３８´，３７´´，３７´´´）は、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域に設けられていることを特徴とする請求項１６に記載の分析装置。
【請求項１８】
前記選別手段（３８）は、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域に設けられている誘電的な転轍器を有することを特徴とする請求項１７に記載の分析装置。
【請求項１９】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）の分岐領域には、前記２つの流路（３４，３５）の一方から他方の流路（３４，３５）への前記担体流および／または前記粒子（４８，４９）の逆流を阻止するために、流れ案内手段（３９）が設けられていることを特徴とする請求項１７または１８に記載の分析装置。
【請求項２０】
前記流れ案内手段（３９）は電極を有することを特徴とする請求項１９に記載の分析装置。
【請求項２１】
前記流れ案内手段（３９）の電極は実質的にＶ字形に形成されており、２つの脚部を有し、これらの脚部は、実質的に、前記２つの分岐する流路（３４，３５）の方向に延びていることを特徴とする請求項２０に記載の分析装置。
【請求項２２】
前記減速手段（３７，３７´，３７´´．３７´´´，６５）は誘電的なかごを有することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２３】
前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）では、前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２）の上流方向手前に、複数の集束電極（３６）が設けられていることを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２４】
前記第１の測定点（ＲＯＩ１，ＲＯＩ２，５３´，５３´´，５３´´´，６２，６３）および／または前記第２の測定点（ＵＦ，５４´，５４´´，５４´´´）は、画像を撮像するために、レンズ（４４）を有することを特徴とする前記すべての請求項のいずれか１に記載の分析装置。
【請求項２５】
前記レンズ（４４）は、前記画像を、少なくとも、前記担体流路（３３，３３´，３３´´，３３´´´，５８）に沿って、移動させるために、可動であることを特徴とする請求項２４に記載の分析装置。
【請求項２６】
前記レンズ（４４）は、画像の移動のために、電気機械式の操作部（４５）に接続されていることを特徴とする請求項２５に記載の分析装置。
【請求項２７】
請求項１４ないし２６のいずれか１に記載の分析装置の、医学的および／または薬学的研究でのおよび／または診断でのおよび／または法医学での使用。
【請求項２８】
請求項１４ないし２６のいずれか１に記載の分析装置の、種々の細胞型、特に消滅状態のおよび壊死性の細胞、異なった発現パターンを有する細胞および／または親細胞を分離するための使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５１７２９２（Ｐ２００６−５１７２９２Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０１７３５（Ｐ２００６−５０１７３５）
【出願日】平成１６年２月４日（２００４．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１０３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７０３６２
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５０５２９６７５１）エボテック・テヒノロギーズ・ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月４日（２００４．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１０３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７０３６２
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５０５２９６７５１）エボテック・テヒノロギーズ・ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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