メラノーマ癌の予後予測
本発明は、患者における癌、特にメラノーマ、の予後を決定するための予後マーカーおよび予後シグネチャー、および組成物および方法に関する。特に、本発明は、マーカーおよびマーカーのシグネチャーに基づいて、癌、例えばメラノーマの進行の危険を予測するための、遺伝子マーカーおよびタンパク質マーカーの使用に関する。種々の局面において、本発明は、癌の予後および処置を助けるための、予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく方法、組成物、キットおよび装置を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年５月２４日に出願されたニュージーランド仮特許出願第５５５３６３号の利益を主張し、それは全体において参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、患者における癌、特にメラノーマの進行を決定するための方法および組成物に関する。詳しくは、本発明は、予後シグネチャー(prognostic signatures)に基づいて、メラノーマなどの癌の予後を決定するための遺伝子マーカーおよびプロテオームマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
先進国では、メラノーマの発生率はこれまでの２５年間にわたり絶えず上昇しており、オーストラリアでの発生率が世界で最も高い１。認められた「メラノーマ流行」は、多分薄いメラノーマの増加した検出を表すけれども２、メラノーマは、主としてより若年のグループ冒して実りある人生の年月を損失させる。この年月は児童悪性疾患および精巣癌によってのみ超えられる３，４。メラノーマは細胞傷害性化学療法５、生物学的作用物質６，７および種々のワクチン接種ストラテジー８に殆ど応答しない。小さなサブグループの患者は、生物学的および/または細胞傷害性化学療法から利益を受けると思われるが、これらの患者を推測的に鑑別することは現在不可能であり、これは、低い利益の確率で実質的な毒性に多くの患者をさらすことを必要とする。
【０００４】
メラノーマが一旦局所的リンパ節に転移すると、患者の７０%は５年以内に死ぬであろう９。長い生存を有するサブグループの患者は独特のコホートを表す。現在のアジュバント治療は、全般的生存利益を与えず、そしていくらかの臨床医は、無病生存を改良するためにインターフェロンαを与えるが１０、多くの国際的な総合施設は、臨床試験の範囲外では活発なアジュパント処置を与えない。どの患者がアジュバント治療の使用にかかわらず良くなりそうかを予測することは、不必要な毒性を防止し、そしてより多く利益を得そうな患者をターゲティングする、より良好な治療ストラテジーの開発を可能とする。アジュバント臨床試験における患者のより良好な階層化は、第一種の過誤および第二種の過誤の両方を減少させるであろう。ＥＣＯＧ１６８４研究の後の１２年の更新および他の無作為化研究は、インターフェロンαが、ＴＴＰを改良するが、段階IIIメラノーマにおける全生存期間(overall survival)を改良しないことを証明した５，１０，１１。現在よく認識されているがコントロールされることができない患者母集団内の固有の不均一性は、初期のＥＣＯＧ１６８４研究１０および他のより少ない第ＩＩ相の研究において見られた生存に関する有望な効果を混乱させたかもしれない。再発の可能性のより高いこれらの患者を階層化することは、この不均一性をバランスさせそして処置がより正確に比較されることを可能とすることができる。
【０００５】
メラノーマの予後を予測するための更なるツールに対する要求がある。本発明は、癌の予後および処置を助けるための、予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく方法、組成物、キットおよび装置を提供する。
【０００６】
発明の要約
ある態様では、予後の良好なメラノーマおよび予後の悪い(poor)メラノーマにおいてディファレンシャルに発現されることが同定されたマーカー遺伝子のセットが提供される。この遺伝子のセットは、患者におけるメラノーマの進行速度を予測することができる２つ以上のマーカーを含む予後シグネチャーを発生させるのに使用することができる。
【０００７】
個々のマーカーは、腫瘍が速く進行するか速く進行しないかに依存して、ディファレンシャルに発現されうる。マーカーを組み合わせて、単一遺伝子アッセイよりもはるかに有効な個々の検定を提供することができる予後シグネチャーとすることにより、予測の正確度を高めることができる。予測モデルを発生させるために統計学、機械学習、人口知能およびデータマイニングなどの技術を予後シグネチャーにアプリケーションすることも提供される。他の態様では、次いで患者の腫瘍における特定の予後シグネチャーのマーカーの発現レベルを予測モデルにアプリケーションして予後を決定することができる。
【０００８】
ある態様では、マーカーの発現レベルは、マイクロアレイ法、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）またはイムノアッセイを使用して確立することができる。
【０００９】
特に、本発明は、患者におけるメラノーマの予後を決定するための方法であって、
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）の発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予測シグネチャー(predictive signature)の発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
（ｉｉｉ）予後を確立する
工程を含む方法を提供する。
【００１０】
あるいは、本発明は、薬物試験に対するメラノーマ患者の適性を決定するための方法であって、
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予測シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
（ｉｉｉ）試験に対する患者の適性を確立する、
工程を含む方法も提供する。
【００１１】
本方法に従うＭＰＭは、表１から選択されうる。予測方法は、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類および回帰木、アンサンブル学習法、判別分析(discriminant analysis)、最近傍法(nearest neighbor method)、ベイジアンネットワーク、独立成分分析からなる群より選ばれる。
【００１２】
ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定することは、例えばフォアードプライマーおよびリバースプライマーを使用するｑＰＣＲを使用して各遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより行うことができる。ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定することは、各遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを検出することにより、例えば各遺伝子のｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチドを使用することにより行うこともできる。更に、ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルは、各マーカーのタンパク質の発現レベルを検出することまたは各マーカーのペプチドの発現レベルを検出すること、例えば、各マーカーに対して向けられた抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清を使用することにより決定することができる。サンドイッチ型イムノアッセイ法またはＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。
【００１３】
本発明は、２つ以上のメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）を含むメラノーマの進行の危険を決定するための予後シグネチャーも提供する。予後シグネチャーのＭＰＭは表１から選ぶことができる。
【００１４】
他の局面では、本発明は、メラノーマの予後を決定するための装置であって、表面に１つ以上のロケーション有する基材を含み、各ロケーションはそこに２つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、各オリゴヌクレオチドは１つ以上のＭＰＭから選ばれる、装置を提供する。
【００１５】
２つ以上のオリゴヌクレオチドは表１から選ばれるＭＰＭであることができる。
【００１６】
本発明は、患者におけるメラノーマの予後を予測するためのキットの製造において、ＭＰＭの発現または２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現を検出するための試薬の使用も提供する。ＭＰＭは表１から選択されうる。
【００１７】
試薬は、ＭＰＭｍＲＮＡまたはＭＰＭｃＤＮＡの発現を検出することにより１つ以上のＭＰＭの発現のレベルを検出することができる。試薬は、ＭＰＭ ｍＲＮＡまたはＭＰＭ ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドであることができる。または、試薬は、ＭＰＭタンパク質またはペプチドの発現を検出することにより１つ以上のＭＰＭの発現のレベルを検出することができる。試薬は、抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清であることができる。
【００１８】
キットは、サンドイッチ型イムノアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイを引き受けるために適当であることができる。
本発明の具体的態様及び図に関して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】予測スコアを構築するのに使用された２２の遺伝子（「メラノーママーカー」）を示す。遺伝子はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して選ばれた。
【図２】図２は、ディファレンシャルに発現された遺伝子の遺伝子オントロジーグルーピングおよび関連した有意性を示す。最も有意なオントロジーは、カテゴリー間で重なる遺伝子の数、即ち、この多くの遺伝子が遺伝子リストおよびカテゴリーの両方にあることが偶然の一致(co-incidence)である尤度により決定される。
【図３】図３は、トレーニングセットおよびｑＰＳを使用するバリデーションセットＡおよびｑＰＳを使用するセットＢに適用された２つの独立したバリデーションセットを含む実験スキームである。トレーニングセットを使用して予測遺伝子を開発し、次いでこれをｑＰＳを使用するバリデーションセットＡおよびｑＰＳを使用するセットＢにアプリケーションした。
【図４】図４は、アレイ実験およびｑＰＣＲアッセイにおけるコンパレーターとしての両方に使用された参照ｃＤＮＡを創生するのに使用されたＲＮＡを示す。
【図５】Universal Probe Library Probesを使用するｑＰＣＲのために使用されたアッセイを示す。
【図６】検定セットおよびバリデーションセットＡについての患者の特徴を示す。
【図７】１５の遺伝子の悪い（空のボックス）予後グループから良好な（充填されたボックス）予後グループを分離する能力を証明する、すべての遺伝子（Ａ）およびディファレンシャルに発現された遺伝子（Ｂ）を使用する主成分分析を示す。これらの遺伝子は、アレイおよびｑＰＣＲベースの予測子を発生させるために使用された。
【図８】トレーニングセットにおけるａＰＳ（ａ−ｂ）およびｑＰＳ（ｃ−ｄ）の適用を示し、ＴＴＰおよび全生存期間とのその相関を証明する。ａＰＳは、アレイデータとｑＰＣＲデータ間で最も強い相関を有する１５の遺伝子のみを使用し、そしてｑＰＳは、２つのグループを分離する最も強い能力を有する５つの遺伝子を使用した。
【図９】図９は、トレーニングセットおよびバリデーションセットＡに適用されたｑＰＳロジスティック回帰アルゴリズムを示す。水平線は、平均値で引かれている。
【図１０】図１０は、第３の独立したセットの良好な予後グループと悪い予後グループからのｑＰＳスコアの分布を示す。
【００２０】
詳細な説明
定義
本発明の態様を詳細に説明する前に、本明細書で使用される用語のいくらかの定義を与えることは有用であろう。
【００２１】
「マーカー」という用語は、生物学的現象の存在と定量的または定性的に関連している分子を指す。「マーカー」の例は、現象の基礎をなす機構に直接または間接に関係していようがいまいが、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子もしくは遺伝子フラグメント、ＲＮＡもしくはＲＮＡフラグメント；ポリペプチド、例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質もしくはタンパク質フラグメントを含む遺伝子産物；または任意の関連した代謝物、副生物もしくは任意の他の同定分子、例えば抗体もしくは抗体フラグメントを含む。本発明のマーカーは、本明細書で開示されたヌクレオチド配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列）、特に、完全長配列、任意のコード配列、その任意のフラグメントもしくは任意の相補体よび上記したその任意の測定可能なマーカーを含む。
【００２２】
用語「ＭＰＭ」または「メラノーマ予後マーカー」または「ＭＰＭファミリーメンバー」は、特定の予後、例えば本明細書に記載された、より進んだ段階への癌進行の高い尤度もしくはより低い尤度と関連している変化した発現を伴うマーカーを指すが、メラノーマの予後と関連していることが先行技術で知られている分子を除外することができる。用語ＭＰＭは、マーカーがメラノーマに対してのみ特異的であることを必要としないと理解されるべきである。むしろ、ＭＰＭの発現は、悪性腫瘍を含む他のタイプの腫瘍においては変わることができる。
【００２３】
用語「予後シグネチャー」「シグネチャー」等は、セットとして一緒に分析されるとき、事象、例えばメラノーマの予後アウトカムの決定または予測を可能とする２つ以上のマーカー例えばＭＰＭのセットを指す。２つ以上のマーカーを含むシグネチャーの使用は、個々の変化の効果を減少させそしてより強い予測(robust prediction)を可能とする。ＭＰＭの非限定的例はＸＸで示される。本発明に関しては、任意の特定のセット（例えば任意のシグネチャー）に列挙されたマーカーの「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ等という表現は、列挙されたマーカーの任意の１つまたは任意のおよびすべての組み合わせを意味する。
【００２４】
用語「予測方法」は、予測モデルを特定するのに使用することができる統計学、機械学習、人口知能およびデータマイニングの分野からのより広い種類の方法を包含することが定義される。この用語は、アウトカムを予測するために適当な任意の方法も含み、そして、アウトカムを予測するために、多重マーカーの複雑な分析を使用するのみならず、コントロール組織の発現に対するまたは所定の閾値に対する単一マーカーもしくはシグネチャーの発現の直接の比較も使用する方法を含む。これらは、詳細な説明の節にさらに検討される。
【００２５】
用語「予測モデル」は、予測方法をデータのコレクションに適用することにより得られた特定の数学的モデルを指す。本明細書に詳述された実施例において、このようなデータセットは、各サンプルのクラス（良好または悪い）が知られている、良好なもしくは悪い予後を有するメラノーマ患者から採取された組織サンプルにおける遺伝子活性の測定値からなる。このようなモデルは、（１）未知の予後状態のサンプルを良好または悪いの１つであるとして分類するためまたは（２）未知のサンプルにおける特定された遺伝子のコレクションの、ｍＲＮＡ発現レベルまたは発現産物の測定値に基づいて、未知のサンプルが良好な予後を有する尤度を表す確率的予測をする（即ち、例えば確率と解釈されるべき割合または百分率を作り出す）ために使用されうる。いかにしてこれらの遺伝子特異的測定値が組み合わされて分類および確率的予測をするかの正確な詳細は、モデルを構築するのに使用される予測方法の特定の機序に依存している。この用語は、アウトカムを予測するのに適当な任意のモデルも含み、そしてアウトカムを予測するために、多重マーカーの複雑な分析を使用するモデルのみならず、単一マーカーまたはシグネチャーの発現をコントロール組織の発現または所定の閾値と直接比較することを伴うモデルも含む。
【００２６】
「感受性」、「特異性」（または「選択性」）、および「分類率」(classification rate)は、予測モデルの有効性を説明するのに適用されるとき、下記のことを意味する：
「感受性」は、ボジティブであることが（モデルにより）予測もされる真にポジティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、それは、良好であることがモデルにより予測された良好な予後を有する腫瘍の割合であろう。「特異性」または「選択性」は、ネガティブであることが（モデルによって）予測もされる真にネガティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、これは、モデルにより悪いことが予測される悪い予後を有するサンプルの割合に等しい。「分類率」は、予測モデルにより正確に分類されるすべてのサンプルの割合である（ポジティブまたはネガティブとしてのそれである）。
【００２７】
本明細書で使用された「抗体」および同様な用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する（と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、それらに限定されない。抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なるクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関する。これらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびその他などのサブクラスも含む。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であることができる。本明細書での抗体への言及は、すべてのクラス、サブクラスおよびタイプへの言及を含む。キメラ抗体、例えば、1つより多くのソース、例えばマウスまたはヒト配列に特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。更にラクダ抗体、サメ抗体またはナノボディも含まれる。
「００００」
用語「癌」および「癌性」（cancerous）は、典型的には異常なまたは調節されていない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌および癌病理学は、例えば、転移、隣接細胞の正常な機能を果たすことの妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症性または免疫学的応答の抑制または悪化、新形成、前悪性疾患、悪性疾患、周囲のまたは離れている組織または器官、たとえばリンパ節等の浸潤と関連していることができる。特にメラノーマが含まれる。
【００２８】
用語「メラノーマ」は、皮膚に見出されるが、口および肛門性器粘膜表面、食道、髄膜および眼などの他の部位にも見出されるメラノサイトから生じる腫瘍を指す。これらの腫瘍は任意の器官に転移することができる。
【００２９】
用語「ディファレンシャルに発現された」、「ディファレンシャルな発現」および同様なフレーズは、コントロール被検体（例えば参照サンプル）におけるその発現と比べて、状態(condition)、特に癌、例えばメラノーマを有する被検体（例えば、試験サンプル）においてより高いレベルまたはより低いレベルにその発現が活性化される遺伝子マーカーを指す。この用語は、同じ状態の異なる段階において；良好な予後または悪い予後を有する疾患において；またはより高いレベルもしくはより低いレベルの増殖を有する細胞において、より高いレベルまたはより低いレベルにその発現が活性化されるマーカーも含む。ディファレンシャルに発現されたマーカーは、ポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルで活性化または抑制され得るか、または選択的スプライシングを受けて異なるポリペプチド産物をもたらすことができる。このような差は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、ポリペプチドの表面発現、分泌または他の分配の変化により証明されうる。
【００３０】
「ディファレンシャルな発現」は、２つ以上のマーカー（例えば、遺伝子またはそれらの遺伝子産物）間の発現の比較；または２つ以上のマーカー（例えば、遺伝子またはそれらの遺伝子産物）間の発現の割合の比較；または同じマーカーの２つの異なってプロセシングされた産物（例えば転写物またはポリペプチド）の比較、を含むことができ、これらは、正常な被検体と疾患のある被検体間で異なるか、もしくは同じ疾患の種々の段階間で異なるか、もしくは良好な予後または悪い予後を有する疾患間で異なるか、もしくはより高いレベルの増殖とより低いレベルの増殖を有する細胞間で異なるか、もしくは正常な組織と罹病組織、例えば癌またはメラノーマとの間で異なる。ディファレンシャルな発現は、例えば正常細胞と罹病細胞間の、もしくは異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞間の、もしくは異なるレベルの増殖を有する細胞間の、遺伝子またはその発現産物における一過性または細胞性発現パターンの定量的差および定性的差の両方を含む。
【００３１】
用語「発現」は、遺伝子または遺伝子の一部からのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生、特にＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の産生を含み、そしてＲＮＡ、または遺伝子もしくは遺伝子の一部によりコードされたポリペプチドの産生、および発現と関連した検出可能な物質の出現を含む。例えば、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用、ポリペプチド−ヌクレオチド相互作用または同様なものからの、例えば複合体の形成は、用語「発現」の範囲内に含まれる。他の例は、遺伝子または他のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質フラグメントへの、ハイブリダイゼーションプローブもしくは抗体などの結合性リガンドの結合および結合性リガンドの可視化である。したがって、マイクロアレイ上のスポットの強度、ノーザンブロットなどのハイブリダイゼーションブロット上の強度、またはウエスタンブロットなどのイムノブロット上の強度、またはビーズアレイ上の強度またはＰＣＲ分析による強度は、基礎をなす生物学的分子の用語「発現」内に含まれる。
【００３２】
用語「発現閾値」および「規定された発現閾値」は、相互に交換可能に使用され、そして問題のマーカーのレベルであって、そのレベルの外側ではポリヌクレオチドまたはポリペプチドが患者生存の予測マーカーとして働く、マーカーのレベルを指す。閾値は、確立される予測モデルに依存するであろうし、下記の実施例に記載の臨床研究などの臨床研究から実験的に誘導される。使用される予測モデルに依存して、発現閾値は、最大感受性を達成するのに設定されることができ、または最大特異性のためまたは最小誤り(minimum error)(最大識別率（maximum classification rate））のために設定されうる。例えば、より高い閾値は、最小誤りを達成するために設定されうるが、これはより低い感受性をもたらすことがある。故に、任意の所与の予測モデルでは、臨床研究は、最小誤り率を有しながら最も高い感受性を一般に達成する発現閾値を設定するのに使用されるであろう。任意の状況についての発現閾値の決定は、十分当業者の知見の範囲内にある。
【００３３】
用語「長期生存」は、本明細書では、手術または他の処置の後、少なくとも５年間、更に好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存を指すのに使用される。
【００３４】
用語「マイクロアレイ」は、基材上の捕捉剤、好ましくはポリヌクレオチド（例えば、プローブ）またはポリペプチドの規則的配列または不規則的配列を指す。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing,2000; Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley ＆ Sons, 2004; およびProtein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004参照。
【００３５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、限定することなく、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡｓを含むポリヌクレオチド、典型的にはプローブまたはプライマーを指す。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば商業的に入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系、リコンビナント技術および細胞および生物における発現を含む種々の他の方法により合成される。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数または複数で使用されるとき、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであって、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであることができる、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。これは、限定することなく、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖もしくは更に典型的には二本鎖であることができるかまたは一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も含まれる。特にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびその任意のフラグメントが含まれる。この用語は、１つ以上の改変された塩基、例えばトリチウム化塩基または格別な塩基、例えばイノシンを含有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コード配列もしくは非コード配列またはセンス配列もしくはアンチセンス配列を包含することができる。本明細書で「ポリヌクレオチド」または同様な用語への各言及は、完全長配列およびその任意のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含むことは理解されるであろう。
【００３７】
本明細書で使用された「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチドもしくはタンパク質配列またはそのフラグメントを指し、そして天然に存在する分子、リコンビナント分子、合成分子もしくは半合成分子を指す。天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列に言及するために本明細書で「ポリペプチド」が詳述されるとき、「ポリペプチド」または同様な用語は、アミノ酸配列を、完全長分子のための完全な、ネイティブなアミノ酸配列に限定することを意味しない。本明細書で「ポリペプチド」または同様な用語への各言及は、完全長配列およびその任意のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含むことは理解されるであろう。
【００３８】
用語「予後」は、医学的アウトカム、例えば、悪いアウトカム（poor outcome）もしくは良好なアウトカム(good outcome)（例えば、長期間生存の尤度）の予測を指し；ネガティブな予後または悪いアウトカムは、再発、疾患の進行（例えば、腫瘍成長もしくは転移または薬物耐性）または死亡の予測を含み；ポジティブな予後または良好なアウトカムは、疾患の寛解（例えば無病状態）、改善（amelioration）（例えば腫瘍後退）または安定化を含む。
【００３９】
用語「増殖」は、増加した細胞サイズまたは細胞数をもたらすプロセスを指し、そして腫瘍もしくは細胞成長、新脈管形成(angiogenesis)、神経支配(innervations)および転移の１つ以上を含むことができる。
【００４０】
用語「ｑＰＣＲ」または「ＱＰＣＲ」は、例えば、PCR Technique:Quantitative PCR, J.W.Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997,およびA-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004 に記載の定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
【００４１】
用語「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、すべての新形成細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌性細胞および組織を指す。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定することができ、そして一般に、プローブ長さ、洗浄温度および塩濃度に依存す経験的計算である。一般に、より長いプローブは適合性なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性されたＤＮＡが、相補性鎖がそれらの溶融温度以下で環境中に存在するとき、再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との所望の相同性の程度が高ければ高い程、使用することができる相対的温度はより高い。結果として、より高い相対的な温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度は、反応条件をより少なくストリンジェントにする傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更なる詳細および説明は、例えば、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)に見出される。
【００４３】
本明細書で使用された「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、典型的には、（1）洗浄ための低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション期間中変性剤、例えばホルムアミド、50％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを伴うｐＨ６．５の５０mMリン酸ナトリウムバッファーとともに４２℃で使用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５XSSC（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート(Dewnhardt)の溶液、音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ml）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を４２℃で使用し、更に０．２X SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃でおよび５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄し、続いて５５℃でEDTAを含有する０．１X SSCを含む高いストリンジェンシー洗浄を行う。
【００４４】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Mannual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, により記載されたとおりに同定され得、そして上記した洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件よりも少なくストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハートの溶液、１０％デキストラン硫酸および２０mg／mlの変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡ（denatured sheared salmon sperm DNA）を含む溶液中３７℃で一夜のインキュベーション、続いて約３７〜５０℃で１Ｘ SSC中でフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブ長さおよび同様なものなどのファクターに適応するのに必要に応じて温度、イオン強度等をいかに調節するかを認識するであろう。
【００４５】
本発明の実施は、特記しない限り、当技術分野のスキル内にある、分子生物学（リコンビナント技術を含む）、微生物学、差細胞生物学および生化学の慣用の技術を使用するであろう。このような技術は、文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2ed edition. Sambrook et al., 1989, Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.L. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D. M. Weir ＆ CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller ＆ M. P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 1987; およびPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds, 1994において完全に説明されている。
【００４６】
発明の態様の説明
【００４７】
本発明は、メラノーマにおける特定の予後マーカーおよびシグネチャーの特定の予後の役割を同定および決定するためのマイクロアレイの使用を開示する。本明細書で示されたマイクロアレイをベースとする研究は、メラノーマを有する患者について良好な予後または悪い予後を予測するのに使用されうるマーカーを確立する。特に、本明細書で示されたマイクロアレイをベースとする研究およびｑＰＣＲ分析は、特定のディファレンシャルに発現された遺伝子が、特定の予後と関連している予後シグネチャーとして使用されうることを示す。したがって、本発明は、攻撃的な疾患(aggressive disease)を有していそうな患者を同定するのに使用されうる。
【００４８】
本発明は、疾患予後の決定のためのマーカーを提供する。本発明の方法を使用して、マーカーがメラノーマ予後と関連しておりそしてアウトカムを予測するのに使用されうることが見出された。種々の段階のメラノーマを有する患者から採取したサンプルのマイクロアレイ分析は、マーカー発現の特定のパターンが癌の予後と関連しているという驚くべき発見に導いた。したがって、本発明は、良好なアウトカムまたは悪いアウトカムを有するメラノーマにおいてディファレンシャルに発現される、表１に略述された遺伝子のセットを提供する。表１に略述された遺伝子は、メラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）のセットを与える。
【００４９】
例えば、あるメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）の減少は、特定の予後を示すことができる。反対に、他のＭＰＭの増加は、特定の予後を示す。特定の予後は、消化進行の速度を含むことができる。発現の減少または増加は、例えば、試験サンプル、例えば患者の腫瘍サンプルを参照サンプル、例えば既知の予後と関連したサンプルと比較することにより決定されうる。特に、良好な予後を有する患者（１つまたは複数）からの１つ以上のサンプルを参照サンプルとして使用することができる。
【００５０】
例えば、予後を得るために、患者のサンプル（例えば、腫瘍サンプル）中の発現レベルを、既知のアウトカムを有する患者からのサンプルと比較することができる。患者のサンプルが、悪いアウトカム（急速な疾患進行）を有するサンプルに匹敵する１つ以上のＭＰＭの増加した発現もしくは減少した発現を示すならば、悪い予後が関係付けられる。患者のサンプルが、良好なアウトカム（遅い疾患進行）を有するサンプルに匹敵しうる１つ以上のＭＰＭの発現を示すならば、ポジティブな予後または良好な予後が関係付けられる。
【００５１】
更なる例として、予後を得るために、患者のサンプル（例えば、腫瘍サンプル）からの２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを、良好な予後または悪い予後を有することが知られている癌のサンプルと比較することができる。患者のサンプルが、良好な予後を有するサンプルとの比較によりＭＰＭの増加した発現または減少した発現を示すならば、および／または悪い予後のサンプルに匹敵しうる発現を示すならば、ネガティブな予後が関係付けられる。患者のサンプルが、良好な予後のサンプルに匹敵しうるＭＰＭの発現を示すならば、および／または、悪い予後を有するサンプルよりも低い発現もしくは高い発現を示すならば、ポジティブなまたは良好な予後が関係付けられる。
【００５２】
１つのアプローチとして、予測モデルを発生させるために、予測方法をマーカーのパネル、例えば表１に略述されたＭＰＭのパネルに適用することができる。これは、２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発生を伴う。
【００５３】
したがって、開示された表１のＭＰＭは、癌の予後を決定しそしてその腫瘍に特異的な処置法(treatment regime)または処置様式(treatment modality)を確立するための予後シグネチャーを発生させるための有用なマーカーのセットを提供する。特に、ポジテイブな予後は、特定の処置選択を推し進めることを決定するために患者により使用されうる。ネガティブな予後は、処置を終わらせることまたは高度に積極果敢な(aggressive)処置もしくは実験的な処置を推し進めることを決定するために患者により使用されうる。更に、患者は、予後マーカー（例えばＭＰｍｓ）の発現から予測されるそれらの予後に基づいて処置を選ぶことができる。
【００５４】
ＭＰＭのレベルは、腫瘍組織、腫瘍に近接した組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプルまたは糞便サンプルにおいて、任意の適当な方法を使用して検出することができ、そしてオリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲまたはマーカーに対して生じた抗体を含むことができるが、それらに限定されない。予測シグネチャーの形態にある複数のＭＰＭの存在および発現の量を分析し、そして予後シグネチャーを構築することにより、予後の感受性および正確度は増加するであろうことは認識されるであろう。したがって、本発明に従う多重マーカーは、癌の予後を決定するのに使用されうる。
【００５５】
本発明は、セットにおけるマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋された生検物質の使用を含み、したがって、最も広く入手可能なタイプの生検物質と適合性である。本発明は、例えばコア生検または細針吸引による腫瘍組織採取のいくつかの異なる方法とも適合性である。ある局面では、ＲＮＡは、固定され、ワックス包埋された患者の癌組織標本から単離される。単離は、例えばコア生検組織または細針吸引細胞から、当技術分野で知られている任意の技術により行われうる。
【００５６】
１つの局面では、本発明は、予後、例えば、処置後の癌患者の長期間の生存の尤度を予測する方法であって、患者から得られたサンプル中の他のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の発現レベルまたはＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化された、患者から得られたサンプル中の１つ以上の予後マーカーまたはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む方法に関する。
【００５７】
特定の局面では、予後マーカーは、表１に列挙された１つ以上のマーカーであり、または表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーの１つ以上として含まれる。
【００５８】
更なる局面では、予後マーカーまたはそれらの発現産物の発現レベルは、例えば、表１に列挙されたマーカーについておよび表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて決定される。他の局面では、本方法は、例えば表１に列挙されたマーカーについてまたは表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて、予後マーカーまたはそれらの発現産物のフルセットの発現レベルの決定を含む。
【００５９】
更なる局面では、本発明は、例えば、表１に列挙されたマーカーについて、または表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて、２つ以上のマーカーにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含むアレイ（例えば、マイクロアレイ）に関する。特定の局面では、アレイは、表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含む。他の特定の局面では、例えば、表１に列挙されたマーカーについて、マーカーのフルセットにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
これらのアレイでは、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡｓまたはオリゴヌクレオチドであることができ、そしてそれらがディスプレーされる固体表面は例えばガラスであることができる。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されたマーカーの１つ以上に、例えば完全長配列、任意のコード配列、その任意のフラグメント、またはその任意の相補体にハイブリダイゼーションすることができる。特定の局面では、１つ以上のＭＰＭの発現レベルの増加または減少は、例えば癌再発による、長期間の生存の減少した尤度を示すが、１つ以上のＭＰＭの発現レベルの増加または減少の欠如は、癌再発のない長期間の生存の増加した尤度を示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
予後マーカー検出への一般的アプローチ
下記のアプローチは、ＭＰＭファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するのに使用することができる非限定的方法である：ＭＰＭについて選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するマイクロアレイアプローチ；ＭＰＭ特異的プライマーおよびプローブを使用する腫瘍サンプルに関するリアルタイムｑＰＣＲ；ＭＰＭ特異的プライマーおよびプローブを使用するリンパ節、血液、血清、糞便または尿サンプルに関するリアルタイムｑＰＣＲ；酵素結合免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；抗マーカー抗体を使用する免疫組織化学；およびコンピュータを使用するアレイまたはｑＰＣＲデータの分析。
【００６３】
他の有用な方法は、ノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283(1999)）; RNase保護アッセイ(Hod, BioTechniques 13: 852-854(1992)); 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR; Weis et al., Trends in genetics 8: 263-264(1992)）; 遺伝子発現のシリアル分析(SAGE; Velculescu et al., Science 270: 484-487(1995); and Velculsecu et al., Cell 88: 243-51(1997)), MassARRAY技術(MassARRAY technology)(Sequenom, San Diego,CA),および大規模平行シグネチャーシーケンシング(massively parallel signature sequencing)(MPSS; Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634(2000))による遺伝子発現分析を含む。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−ポリペプチド二本鎖を含む特定の複合体を認識することができる抗体を使用することができる。
【００６４】
一次データを集めることができ、そして、例えば、腫瘍組織および非腫瘍組織におけるマーカー発現レベルの比較により；マーカー発現レベル対再発している腫瘍および非再発腫瘍において決定されたレベルの比較により；マーカー発現レベル対転移を有する腫瘍または転移なしの腫瘍において決定されたレベルの比較により；マーカー発現レベル対異なる段階の腫瘍において決定されたレベルの比較により；またはマーカー発現レベル対異なるレベルの増殖を有する細胞において決定されたレベルの比較により、倍率変化分析(fold change analysis)を行うことができる。ネガティブな予後またはポジティブな予後は、この分析に基づいて決定される。腫瘍マーカー発現の更なる分析は、増加した発現または減少した発現を示すこれらのマーカーを既知のメラノーマ腫瘍の発現プロフィルとマッチさせて予後を与えることを含む。
【００６５】
発現が増加されることを結論するための閾値は、特定のマーカーおよびアプリケーションされるべき特定の予測モデルにも依存するであろう。閾値は、一般に、最も低い誤り率で最も高い感受性および選択性を達成するように設定されるが、特定の臨床状況については変更が望ましいことがある。所望の閾値は、任意の予測モデルの統計的変動性を考慮して十分なサイズの母集団を分析することにより決定されそして予測モデルを作成するのに使用されるサンプルのサイズから計算される。発現が減少していることを結論するための閾値の決定について同じことがあてはまる。増加した発現または減少した発現が起こったことを結論するための、他の閾値、または閾値を確立するための方法が、本発明の範囲から逸脱することなく選択されうることは認識されうる。
【００６６】
予測モデルは、そのアウトプットとして数値、例えばスコア、尤度値または確率を作り出すことも可能である。これらの場合に、閾値を予測モデルにより作られた結果にアプリケーシヨンすることが可能であり、そしてこれらの場合に、同様な原理が発現値のための閾値を設定するのに使用される原理として成り立つ。
【００６７】
一旦、腫瘍サンプルにおける予後シグネチャーの発現レベルまたは予測モデルのアウトプットが得られると、次いで癌再発の尤度を決定することができる。
【００６８】
同定されたマーカーから、１つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーを使用して、１つ以上のマーカーの発現レベルを開示された予後シグネチャーと比較することにより癌の予後を決定することができる。腫瘍サンプル中の１つ以上のＭＰＭの発現を開示された予後シグネチャーと比較することにより、癌再発の尤度を決定することができる。予後を確立するための予後シグネチャーの発現レベルの比較は、先に述べた予測モデルをアプリケーションすることによりなされうる。
【００６９】
癌再発の尤度を決定することは、医師にとって大きな価値がある。腫瘍が処置に応答しない高い尤度は、より長いもしくはより高い用量処置が考慮されるべきであるか、または、処置が全く与えられていないかもしれないことを意味する。正確な予後は患者にとっても利益である。それは、患者が彼らの配偶者、家族、および友人とともに処置に関する決定を下すことも可能とし、ならびに患者の将来および生活様式の変化に関する決定も可能とする。したがって、本発明は、腫瘍サンプルにおけるマーカーの発現をディファレンシャルな発現シグネチャーとマッチさせることにより確立された予後に基づく特定の癌に対する処置法を確立する方法も提供する。
【００７０】
マーカー選択または予後シグネチャーの構築は、本明細書の表１に開示されたＭＰＭに制限される必要はないが、開示されたシグネチャーからの１つ以上のＭＰＭの使用を含むことができ、または開示されたマーカーリストから選ばれたＭＰＭを使用して新規なシグネチャーが確立されうることは認識されるであろう。任意のシグネチャーの要件は、それが、医師が処置法を確立するのを助けるのに十分な正確度で、急速な疾患進行の尤度を予測するということである。
【００７１】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記した技術のなかで、最も感受性のそして最も柔軟性の定量的方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これは、薬物処理してもしくは薬物処理しないで、正常な組織および腫瘍組織における異なるサンプル母集団においてＲＮＡレベルを比較し、発現のパターンを特徴付け、密接に関連したＲＮＡｓ間で識別しそしてＲＮＡ構造を分析するのに使用されうる。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲでは、最初の工程は、ターゲットサンプルからのＲＮＡの単離である。出発物質は、典型的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系およびそれぞれ、対応する正常な組織または細胞系から単離されたトータルＲＮＡである。ＲＮＡは、種々のサンプルから、例えば、胸、肺、結腸（例えば大腸もしくは小腸）、皮膚、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、睾丸、卵巣、子宮等、組織、からの腫瘍サンプルから単離されることができ、原発性腫瘍もしくは腫瘍細胞系から、および健康なドナーからのプールされたサンプルから単離されうる。ＲＮＡのソースが腫瘍であるならば、ＲＮＡは、例えば、凍結されたもしくは保管された(archived)パラフィン包埋された組織サンプル、および固定された（例えばホルマリン固定された）組織サンプルから抽出されうる。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１工程は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写、次いでＰＣＲ反応でのその幾何級数的な増幅である。２つの最もよく使用される逆転写酵素は、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、典型的には、発現プロファイリングの状況および目標に依存して、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、抽出されたＲＮＡを、Gene Amp RNA PCRキット(Perkin Elmer, CA, USA)を使用して、製造者の指示に従って逆転写させることができる。次いで誘導されたｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用することができる。
【００７４】
ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるけれども、典型的には，５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼが使用される。かくして、ＴａｑＭａｎ（ｑ）ＰＣＲは、典型的にはＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼを利用して、そのターゲットアンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。
【００７５】
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ反応の典型的なアンプリコンを発生させる。第３オリゴヌクレオチドまたはプローブが、２つのＰＣＲプライマー間に位置したヌクレオチド配列を検出するようにデザインされる。このプローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によりエクステンション可能ではなく(non-extendible)、そしてレポーター蛍光染料およびクエンチャー蛍光染料で標識される。レポーター染料からの任意のレーザー誘導発光は、２つの染料がプローブ上にあるままで２つの染料が相互に近接して位置するとき、クエンチング染料によりクエンチングされる。増幅反応期間中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存性方式でプローブを開裂する。得られるプローブフラグメントは溶液中で解離し、そして放出されたレポーター染料からのシグナルは、第２フルオロフォアのクエンチング効果から免れる。レポーター染料の１つの分子が、合成された各新しい分子に対して遊離され、そしてクエンチングされなかったレポーター染料の検出は、データの定量的解明のための基礎を与える。
【００７６】
ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City,CA, USA)またはLightcycler(Roche Molecular Biotechnicals, Manheim, Germany)などの市販の装置を使用して行うことができる。好ましい態様では、５’ヌクレアーゼ処理は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemなどのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラー上で９６ウエルフォーマットにおいてサンプルを増幅する。増幅期間中、レーザーで誘導された蛍光シグナルを、すべての９６ウエルについて光学繊維ケーブルを通してリアルタイムで収集し、そしてＣＣＤで検出する。システムは装置を動かすためおよびデータを分析するためのソフトウエアを含む。
【００７７】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔまたは閾値サイクルとして表現される。上記したとおり、蛍光値は、すべてのサイクル期間中記録されそして増幅反応においてその点に増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されるときの点は閾値サイクルである。
【００７８】
誤りおよびサンプル間の変動の効果を最小にするために、ＲＴ−ＰＣＲは通常内部標準を使用して行われる。理想的な内部標準は異なる組織間で一定のレベルで発現されそして実験処置により影響されない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡｓは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および−アクチンのためのｍＲＮＡｓである。
【００７９】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変化は、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識された蛍光発生プローブ(fluorigenic probe)（即ち、ＴａｑＭａｎプローブ）によるＰＣＲ産物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは定量的競合ＰＣＲおよび定量的比較ＰＣＲの両方と適合性である。前者は正規化のために各ターゲット配列のための内部競合体を使用し、後者は、サンプル内に含有される正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。更なる詳細は、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994(1996)により与えられる。
【００８０】
発現レベルは、ＲＮＡソースとして固定され、パラフィン包埋された組織を使用して決定することができる。本発明の１つの局面に従えば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子に存在するイントロン配列に基づいてデザインされる。この態様においては、プライマー／プローブデザインにおける最初の工程は、遺伝子内のイントロン配列の脱線状化である。これは、Kent, W. J., Genome Res. 12(4): 656-64(2002)により開発されたＤＮＡ BLASTソフトウエアなどの公に入手可能なソフトウエアにより、またはそのバリエーションを含むBLASTソフトウエアにより行うことができる。次の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブデザインの十分に確立された方法に従う。
【００８１】
非特異的シグナルを回避するために、プライマーとプローブをデザインするとき、イントロン内の反復配列をマスクすることは有用である。これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングしそして反復エレメントがマスクされている問い合わせ配列(query sequence)に戻す、Bayer College of Medicineを通じてオンラインで入手可能なRepeat maskerプログラムを使用することにより容易に達成されうる。次いでマスクされた配列を使用して任意の市販のまたはそうでなければ公に入手可能なプライマー／プローブデザインパッケージ、例えば、Primer Express(Applied Biosystems); MGB assay-by-design(AppliedbBiosystems); Primer3(Steve Rozen and Helen J. Skaletsky(2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers in: Krawetz S, Misener S(eds) Bioinfomatics Methods and Protocols: Methods in Milecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)、を使用してプライマーおよびプローブ配列をデザインするのに使用することができる。
【００８２】
ＰＣＲプライマーデザインにおいて考慮される最も重要な因子が、プライマー長、溶融温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含有率、特異性、相補性プライマー配列および３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般的に長さは１７〜３０塩基であり、そして約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基、例えば約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含有する。５０〜８０℃、例えば約５０〜７０℃の溶融温度が典型的に好ましい。ＰＣＲプライマーおよびプローブデザインについての更なるガイドラインは、例えば、Diefenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1 995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, Optomization of PCTs in: PCR Products, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; and Plasterer, T. N. primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527(1997)を見られたい。その全体の開示は参照により明白に組み込まれる。
【００８３】
マイクロアレイ分析
ディファレンシャルな発現は、マイクロアレイ技術によって同定または確認することもできる。したがって、ＭＰＭの発現プロフィルは、マイクロアレイ技術を使用して新しい腫瘍組織またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定することができる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡｓおよびオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基材上にプレートまたはアレイする。次いでアレイされた配列（即ち捕捉プローブ）を関心のある細胞または組織からの特異的ポリヌクレオチド（即ち、ターゲット）とハイブリダイゼーションさせる。丁度ＲＴ−ＰＣＲ法におけると同じく、ＲＮＡのソースは、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞系および対応する正常な組織もしくは細胞系から単離されたトータルＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。ＲＮＡのソースが原発性腫瘍であるならば、ＲＮＡは、例えば、毎日の臨床実施においてルーチンに調製されそして保存されている、凍結されまたは保管された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織サンプルおよび固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルから抽出されうる。
【００８４】
マイクロアレイ技術の特定の態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートを基剤に適用する、基材は、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または７５までのヌクレオチド配列を含むことができる。他の局面では、基材は、少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列を含むことができる。マイクロチップ上に固定化されたマイクロアレイされた配列は、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションのために適当である。他の態様として、マイクロアレイのためのターゲットは、長さが少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００または２０００塩基、または長さが５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００もしくは５００〜５０００塩基であることができる。更なる態様として、マイクロアレイのための捕捉プローブは、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０または１００塩基、または長さが１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０、または２０〜８０塩基であることができる。
【００８５】
蛍光的に標識されたｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されたRNAの逆転写により蛍光性ヌクレオチドの組み込みにより発生させることができる。チップに適用された標識されたcDNAプローブは、アレイ上のDNAの各スポットに特異性をもってハイブリダイゼーションする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後に、共焦点レーザー顕微鏡によりまたはＣＣＤカメラなどの他の検出方法によりスキャンされる。各アレイされたエレメントのハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡ量(abundance)の評価を可能とする。二色蛍光により、２つのＲＮＡのソースから発生させた別々に標識されたｃＤＮＡプローブをペアー方式でアレイにハイブリダイゼーションさせる。かくして、各特定された遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対的量を同時に決定する。
【００８６】
ハイブリダイゼーションのミニチュア化されたスケールは、多数の遺伝子の発現パターンの便利で迅速な評価を与える。このような方法は、細胞当たり少数のコピーで発現される希少転写物を検出するのに必要な感受性および発現レベルにおいて少なくとも約２倍の差を再現可能に検出するのに必要な感受性を有することが示された(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149(1996))。マイクロアレイ分析は、市販の装置、例えば、Affimetrix GenChip技術、イルミナマイクロアレイ技術またはIncyteのマイクロアレイ技術により、製造者のプロトコールに従って、行うことができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、種々の腫瘍タイプにおける癌分類およびアウトカム予測の分子マーカーを系統的に研究することを可能とする。
【００８７】
ＲＮＡ単離、精製よび増幅
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は、当技術分野で周知でありそしてAusubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997)を含む分子生物学の標準方法に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987)およびDe Sanders et al., BioTechniques 18: 42044(1995)に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、Quiagenなどの商業的製造者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを使用して、製造者のインストラクションに従って行うことができる。例えば、培養物中の細胞からのトータルＲＮＡは、Quiage RNeasyミニカラムを使用して単離されうる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit(EPICENTRE(D, Madison, WI)およびParaffin Block RNA Isolation Kit(Ambion, Inc)を含む。組織サンプルからのトータルＲＮＡは、RNA Stat-60(Tel-Test)を使用して単離されうる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心により単離されうる。
【００８８】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマーエクステンションおよび増幅を含む、ＲＮＡソースとして固定された、パラフィン包埋された組織を使用する遺伝子発現をプロファィリングするための代表的プロトコールの工程は、種々の公表された雑誌文献（例えば、T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001)）に記載されている。簡単にいえば、代表的方法は、パラフィン包埋された腫瘍組織サンプルの１０μm厚さの切片を切断することで出発する。次いでRNAを抽出し、そしてタンパク質およびDNAを除去する。RNA濃度の分析の後に、RNA修復および／または増幅工程を必要に応じて含ませることができ、そしてRNAを遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写し、次いでＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析して、検査された腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的遺伝子発現パターンに基づいて患者に利用可能な最善の処置選択（１つまたは複数）を同定する。
【００８９】
免疫組織化学およびプロテオミクス
免疫組織化学法は、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのにも適当である。したがって、各マーカーに対して特異的な抗体もしくは抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が発現を検出するのに使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチンまたは酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼによる、抗体自体の直接標識化により検出されうる。あるいは、標識されていない第一抗体を、第１抗体に対して特異的な、抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識された第二抗体と共に使用する。免疫組織化学プロトコールおよびキットは、当技術分野で周知でありそして市販されている。
【００９０】
プロテオミクスを使用して、ある時点でのサンプル（例えば、組織、器官、または細胞培養物）中に存在するポリペプチドを分析することができる。特に、プロテオーム技術を使用して、サンプル中のポリペプチド発現の全体的変化を評価することができる（発現プロテオミクスとも呼ばれる）。プロテオーム分析は、典型的には、（１）二次元ゲル電気泳動(2-D PAGE)によるサンプル中の個々のポリペプチドの分離；（２）例えば、質量分析法またはＮ末端配列決定による、ゲルから回収された個々のポリペプチドの同定および（３）バイオインフォマティクスを使用するデータの分析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロフアイリングの他の方法に対する価値ある補足であり、そして単独でまたは他の方法と組み合わせて、本発明の増殖マーカーの産物を検出するのに使用することができる。
【００９１】
一旦腫瘍サンプル中の１つ以上の予後マーカーの発現レベルが評価されると、処置に応答する癌の尤度が決定されうる。本発明者等は、患者データセットにおいて、処置に応答しない（悪い予後）メラノーマに比べて処置に応答する（良好な予後）メラノーマにおいてディファレンシャルに発現される多数のマーカーを同定した。マーカーは表１に示されそして下記の実施例に示される。
【００９２】
ディファレンシャルに発現された遺伝子の選択
有意と思われる遺伝子の選択への早期のアプローチは、関心のある２つのグループ間での所与の遺伝子の「倍率変化」(fold change)を単に調べることを含んでいた。このアプローチは、最も劇的に変化すると思われる遺伝子に関して効果があるが、基本的統計学の考察は、分散（またはノイズレベル）が極めて高い（しばしばマイクロアレイ実験でみられるとおり）ならば、みかけは大きい倍率変化がただ偶然によるだけでしばしば起こりうることを認識させる。
【００９３】
マイクロアレイ実験、例えば本明細書で説明されたそれらは、典型的には、数千の遺伝子の同時測定を伴う。２つのグループ（例えば良好な予後の腫瘍と悪い予後マーカーの腫瘍）間での特定の遺伝子の発現レベルを比較している場合に、有意についての典型的な
検定（ｔ検定などの）は十分ではない。何故ならば、これは、数千の実験（この状況では、各遺伝子は「実験」を構成する）の群において、少なくとも１つの実験が偶然によるだけで通常の判断基準を通過する確率は本質的に一つ(unity)であるからである。有意についての検定において、典型的には、「帰無仮説」が正しいという確率を計算する。２つのグループを比較する場合に、帰無仮説は、２つのグループ間に差はないということである。統計的な検定がある閾値（通常０．０５または０．０１）以下で帰無仮説について確率を生じるならば、我々は帰無仮説を拒絶することができそして２つのグループは有意に異なるという仮説を受け入れることができるといわれる。明らかに、このような検定では、偶然のみによる帰無仮説の拒絶が２０回に１回（または100回に１回）期待されうる。有意についてのｔ検定のまたは他の同様な統計的検定の使用は、マイクロアレイに関しては、あまりにも多くの偽陽性（または第１種の過誤）を生じることになる。
【００９４】
このタイプの状況においては、同時に多数の仮説を検定する場合には、Bonferroni Method12などの典型的な多重比較法が適用される。しかしながら、このような検定は、大抵のマイクロアレイ実験のためにはあまりにも保守的であり、あまりにも多くの偽陰性（第二種の）誤りをもたらす。
【００９５】
より最近のアプローチは、所与の検定が有意であるための確率を適用する試みを捨て、そして予期される割合の第一種の過誤（または偽発見率(false discovery rate)13）がコントロールされるような実験のサブセットを選ぶための手段を確立することである。種々の実現(implementations)により；即ち、BRB Array Tools14およびBioconductorのlimma15,16 package（統計的環境Ｒ(R statistical environment)を使用する;17,18）を備えた方法によりこの研究で使用されたのはこのアプローチである。
【００９６】
データマイニングのための一般的方法：予後シグネチャーの発生
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すれば（通常）大容量のデータ（データセット）からの「ノーハウ」または予測能力を説明するために使用される用語である。これは、予後シグネチャーを発生させるのにこの研究で使用されたアプローチである。この研究の場合に、「ノーハウ」は、遺伝子発現測定またはシグネチャー（この節で一般的に述べられそして実施例の節で更に詳細に述べられた）の所与のセットから予後を正確に予測する能力である。
【００９７】
この研究で使用される方法のために使用される特定の詳細は、実施例１７−２０に記載されている。しかしながら、データマイニング法（実施例に記載の方法およびここで記載の方法の両方）のいずれの適用もこの一般的プロトコールに従うことができる。
【００９８】
データマイニング１９および関連した話題の機械学習２０は、１つ以上の適切なコンピュータソフトウエアパッケージ（下記参照）の使用を含む複雑な反復的な数学的タスクである。ソフトウエの使用は、一方では、正しい方法に忠実であるとの条件下に、データマイニング技術を成功的に使用するために各技術の背景の理論の複雑さに完全に習熟する必要はないという点で有利である。欠点は、データマイニングの適用がしばしば「ブラックボックス」：人がデータを挿入しそして答えを受け取る、と考えられうるということである。これがいかにして達成されるかは、しばしばエンドユーザーからマスクされており（これは説明した技術の多くについてそうである）そしてしばしばデータマイニングのために選ばれる統計的方法に影響を与えることがありうる。例えば、ニューラルネットワークおよびサポートベクターマシンは、エンドユーザーが決定をするのに使用される「ルール」を引き出すことを非常に困難にする特に複雑な実装を有する。他方、ｋ最近傍(k-nearest neighbours)および線形判別分析(linear discriminant analysis)は、ユーザーから隠されていない、決定をするための非常に透明なプロセスを有する。
【００９９】
データマイニングで使用される２つのタイプのアプローチがある：教師ありアプローチ(supervised approach)および教師なしアプローチ(unsupervised approach)。教師ありアプローチでは、カテゴリーデータ（例えば良好な予後対悪い予後）などのデータに連結されている情報は知られている。必要とされるのは、インプット変数に観測された応答（例えば、良好な予後対悪い予後）を連結する能力である。教師なしアプローチでは、データセット内のクラスは、前以て知られておらず、そしてデータマイニング技術は、データセット内のクラスまたは構造を発見することを試みるために使用される。
【０１００】
本実施例では、教師ありアプローチが使用され、そしてここで詳細に論議されるが、他の技術のいずれかを使用することも認識されるであろう。
【０１０１】
全体のプロトコールは、下記の工程を含む。
●データ表示
これは、選ばれたーデータマイニング技術で最も成功的に働きそうな形態にデータを変換することを含む。調査されるべきデータが遺伝子発現の相対的レベルを表すこの研究におけるように、データが数値である場合には、これは非常に簡単である。データが大きなダイナミックレンジを含むならば（即ち、多くの桁の大きさ）、しばしばデータの対数が採用される。別々の研究者による、別々の日の別々のサンプルの多くの測定値を含むならば、系統誤差が最小になることを確実にするよう、特に注意しなければならない。系統誤差（即ち、プロトコール差、機械差、オペレーター差および他の定量可能な因子から生じる誤差）の最小化は、ここでは「正規化」と呼ばれるプロセスである。
【０１０２】
●特徴選択
典型的には、データセットは、日々の基準で測定するのに実際的であるよりも多くのデータエレメントを含有し、そして更に予測モデルを作成するのに必要な情報を与えない多くのエレメントを含有する。予測モデルのデータセットを説明する実際の能力は、データセットの全次元(full dimensionality)のいくらかのサブセットから誘導される。これらの次元はデータセットの最も重要な成分（または特徴）である。マイクロアレイデータに関しては、データセットの次元は個々の遺伝子であることに留意されたい。ここで述べた文脈において、特徴選択は、最も「ディファレンシャルに発現される」これらの遺伝子を発見することを含む。より一般的な意味においては、それは、有意についてのいくらかの統計的検定に通るこれらのグループを含む、即ち、調査されているグループの一方もしくは他方において一貫してより高いかまたはより低い特定の変数のレベルである。時には、特徴は、最も大きい分散を示すこれらの変数（または次元）である。
【０１０３】
特徴選択の適用は、予測モデルを作り出すのに使用される方法とは完全に独立であり、そして所望の結果を達成するための多量の実験を含む。本発明内では、有意な遺伝子の選択は、特徴選択を伴う。更に、データ縮小(data reduction)の方法（主成分分析などの）をデータセットにアプリケーションすることができる。
【０１０４】
●トレーニング
一旦クラス例えば、良好な予後／悪い予後）および選択の特徴が確立されそしてデータがデータマイニングのためのインプットとして受け入れ可能な形態で表示されると、縮小したデータセット（特徴で述べられたとおりの）を選択された予測モデルにアプリケーションする。このモデルのためのインプットは、関連したアウトプット（クラス標識または応答）とともに、通常多次元数値インプット（ベクトルとして知られた）の形態にある。トレーニングプロセスにおいては、選択されたデータは、順次に（ニューラルネットワークなどの技術において）またはまとめて（線形モデル、線形判別分析、サポートベクターマシンなどのいくつかの回帰を適用する技術において）予測モデルにインプットされる。ある場合には（例えばｋ最近傍）、データセット（または特徴選択の後に得られたデータセットのサブセット）は、それ自体モデルである。論議されたとおり、有効なモデルは、成功的結果を最ももたらしそうであるとエキスパートアナリストによりモデルのパラメーターが 予め決定されている種々のソフトウエアパッケージの使用により、詳細な数学の最小の理解で確立されうる。
【０１０５】
バリデーション
これは、データマイニングプロトコールのキー成分であり、そしてこれの誤ったアプリケーションは、しばしば誤りに導く。データセットの一部は、予測モデルの成功を検定するために、特徴選択およびトレーニングとは別に、取っておくべきである。更に、パリデーションの結果がモデルの特徴選択およびトレーニングを行うのに使用されるならば、モデルが実生活の状況にアプリケーションされる前に、モデルを検定するための更なるバリデーションセットが得られる。このプロセスが厳密にモデルに忠実でない(not adhered)ならば、モデルは、実世界の状況において失敗する可能性が高い。バリデーションの方法は以下に更に詳細に述べられる。
【０１０６】
●アブリケーション
モデルが構築されそしてバリデーションされると、それはエンドユーザーに受け入れられうるような方法でパッケージされなければならない。これは、しばしば、モデルが埋め込まれているスプレッドシートアプリケーションのある形態の実装、統計的ソフトウエアパッケージのスクリプティング、または情報技術スタッフによるハードコーデッドアプリケーション(hard-corded application)へのモデルのリファクタリングを含む。
【０１０７】
しばしば使用されるソフトウエアパッケージの例は、
多数のベンダーから得られるスプレッドシートプラグイン(spreadsheat plugins)、
統計的環境Ｒ（R statistical environment）、
市販のパッケージMatlab、 S-Plus、 SAS、 SPSS、 STATA、
フリーオープンソースソフトウエア(free open-source software)、例えばＯｃｔａｖｅ（MatLabクローン）
市販のクローズドソースセッティング(closed-source setting)における予測モデルを実装するのに使用されうる多くのおよび多様なＣ＋＋ライブラリー。
【０１０８】
データマイニング法の例
本発明の方法は、最初にデータマイニング（上記）の工程を引き受け、次いで適切な既知のソフトウエアパッケージをアプリケーションすることにより行うことができる。データマイニングのプロセスの更なる説明は多くの極めてよく書かれているテキストに詳細に記載されている１９。
【０１０９】
●線形モデル１９，２１
データは、線形回帰モデルのインプットとして処理され、そのクラス標識または応答変数はアウトプットである。クラス標識または他のカテゴリーデータは、数値（通常整数）に変換されなければならない。一般化された線形モデルにおいては、クラス標識または応答変数は、それ自体はインプットデータに線形で関係していないが、「連結関数」の使用により変換される。ロジスティック回帰は、一般化された線形モデルの最も普通の形態である。
【０１１０】
●線形判別分析(linear discriminant analysis)19. 22. 23
データが線形に分離可能である（即ち、データのグループまたはクラスが、閾値のｎ次元拡張である超平面により分離されうる）との条件下で、この技術は適用されうる。変数の組み合わせは、グループ間分散が最大化されそしてグループ内分散が最小になるように、クラスを分離するのに使用される。この副産物は、分類ルールの形成である。未知のクラスのサンプルへのこのルールの適用は、クラス所属関係の予測または分類がそのサンプルについてなされることを可能とする。マイクロアレイ分析のために普通に使用されるニアレストシュランケンセントロイド（nearest shrunken centroids）などの線形判別分析の変形もある。
【０１１１】
●サポートベクターマシン２４
変数のコレクションを重量のコレクションとともに使用してこれらの重り付き変数によってクラス間の分離を最大化するモデルを決定する。次いでこのモデルのサンプルへの適用は、そのサンプルの分類またはクラス所属関係の予測を生じさせる。
【０１１２】
●ニューラルネットワーク23
データは、ノードのネットワークへのインプットとして処理され、ノードのネットワークは、表面的には生物学的ニューロンに似ており、インプットをすべてのノードからそれらが連結されているノードにアプリケーションし、そしてインプットをアウトプットに変換する。普通は、ニューラルネットワークは、「乗算および和算アルゴリズム」(multiply and sum algorithm)を使用して、多数の接続されたインプットノードからのインプットをシングルアウトプットに変換する。ノードは、そのノードへのインプットがある閾値を超えないならば、必ずしもアウトプットを生成しなくてもよい。各ノードは、そのインプットとしていくつかの他のノードからのアウトプットを有し、最終アウトプットノードは通常カテゴリー変数に連結されている。ノードの数およびノードのトポロジーは、殆ど無限に変わることができ、他の方法では分類することができないことがある非常にノイズのあるデータを分類する能力を与える。ニューラルネットワークの最も普通の実装は、多層パーセプトロンである。
【０１１３】
●分類および回帰木２５
これらにおいては、変数は、段階的方式でたどられる(followed)ことができるルールの階層制(hierarchy of rules)を規定して、サンプルのクラスを決定するのに使用される。典型的なプロセスは、特定のクラスアウトプットまたは識別できないことの特定の説明をもたらすルールのセットを創り出す。例としての分類木は、下記のようなアルゴリズムの実装である。
if gene A> x and gene Y> x and gene Z=z
then
class A
else if gene A=q
then
class B
【０１１４】
最近傍法(nearest neighbor methods)２２，２３
予測または分類は、サンプル（未知のクラスの）をその周囲のサンプル（既知のクラスの）と比較することによりなされ、近さ（closeness）は距離関数により定義される。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。普通に使用される距離関数は、ユークリッド距離（三角測量におけるようにピタゴラスの距離のｎ次元への拡張、種々の形態の相関（ピアソン相関係数を含む）である。普通は意味のある距離メトリック(meaningful distance metric)により相互連結されないデータ点を、ユークリッド距離が適用されうるように、ユークリッド空間に変換する変換関数もある（例えばマハラノビス距離）。距離メトリックは極めて複雑でありうるけれども、ｋ最近傍の基本的前提は極めて単純であり、本質的に未知のインプットに最も類似したｋデータベクトルを「発見することの」言い換えであり、それらがどのクラスに対応するかを発見し、そして未知のインプットがどのクラスであるかに関して票決する(vote)。
【０１１５】
●他の方法
ベイジアンネットワーク
有向非環式グラフ(directed cyclic graph)を使用して変数のコレクションをそれらの同時確率分布(joint probability distribution)と共に表示し、次いでこれを使用してサンプルのクラス所属関係の確率を決定する。
独立したシグナル（例えばクラス所属関係）が変数のコレクシヨンから分離される（成分に）独立成分分析。次いでこれらの成分を使用して、サンプルのクラス所属関係の分類または予測を作成することができる。
予測方法のコレクションを組み合わせてサンプルのクラス所属関係の同時分類または予測(joint classification or prediction) を作成するアンサンブル学習法。
【０１１６】
探索されうるこれらの方法の多くの変法があり１９、そして多くの新しい方法が絶えず定義されそして開発されている。許容しうる結果を得るために、これらの方法のいずれかを適用することができることは当然である。過学習(overfitting)を回避するために、包括的バリデーションスキーム(comprehensive validation scheme)によりすべての結果を検定することを確実にすることによって、特別な注意を払わなければならない。
【０１１７】
バリデーション
説明した予測方法のいずれかのアプリケーションは、この方法を新しいデータセット（例えば臨床試験からのデータ）にアプリケーションすることができる前に、トレーニングとクロスバリデーション１２，２６の両方を伴う。トレーニングは、関心のあるデータセット（この場合にメラノーマからの遺伝子発現測定値）のサブセットを、それが検定されるべきクラス（この場合に急速な進行の良好な尤度または悪い尤度を有する腫瘍）を横切って階層化されるように、採用することを含む。このトレーニングセットを使用して予測モデル（上記した）を発生させ、これはデータの残り検定セット）に関して検定される。
【０１１８】
検定セットのより良好な性能を得るように予測モデルのパラメーターを変えることが可能であるが、これは過学習として知られた状況をもたらすことがあり、過学習においては、予測モデルはトレーニングデータセットには働くが、任意の外部のデータセットには働かない。これを回避するために、バリデーションのプロセスが続く。典型的に適用される２つの主要なタイプのバリデーションがあり、第1（ホールドアウトバリデーション）は、データセットを、３つのグループ：検定、トレーニングおよびバリデーションに分配することを含む。バリデーションセットは、なんであれ、トレーニングプロセスへのインプットを持たず、それにより検定セット（しかしバリデーションセットではない）へのアプリケーション期間中、パラメーターの任意の調節または他のリファインメントを行わなければならない。第２の主要なタイプは、クロスバリデーションであり、これは下記したいくつかの異なる方法でアプリケーションされうる。
【０１１９】
２つの主要なタイプのクロスバリデーションがある：Ｋ分割クロスバリデーション（K-fold cross-validation)およびリーブワンアウトクロスバリデーション(leave-one-out cross-validation)。
【０１２０】
Ｋ−分割クロスバリデーション：データセットをＫ個のサブサンプルに分割し、各サブサンプルはオリジナルとほぼ同じ割合のクラスグループを含有する。
【０１２１】
バリデーションの各ラウンドにおいて、Ｋ個のサブサンプルの１つを取って置き、データセットの残りを使用してトレーニングを達成する。そのラウンドのトレーニングの有効性は、残して置いたグループの分類がいかに正確であるかにより判定される。この手順をＫ回繰り返し、そして全体の有効性は、既知のクラスとの予測されたレベルの比較により確認される。
【０１２２】
リーブワンアウトクロスバリデーションは、：Ｋ＝ｎ（ここでｎはサンプルの数である）である、Ｋ分割クロスバリデーションのよく使用される変法。
【０１２３】
ＭＰＭＳの組み合わせ，例えば表１に上記したＭＰＭＳの組み合わせを使用して予後のための予測モデルを構築することができる。
【０１２４】
予後シグネチャー
これらのマーカーの１つ以上を含む予後シグネチャーを使用して、シグネチャー由来の１つ以上の予測モデルのアプリケーシヨンにより患者のアウトカムを決定することができる。特に、臨床医または研究者は、シグネチャーにおける１つ以上のマーカーのディファレンシャルな発現（例えば、増加した発現または減少した発現）を決定し、予測モデルをアプリケーションし、それによりネガティブな予後、例えば患者の疾患再発の尤度、またはポジティブな予後（連続した寛解）の尤度を決定することができる。
【０１２５】
予後シグネチャーを開発した。下記実施例で述べられるとおり、２２の遺伝子を含む予後シグネチャーをメラノーマを有する患者のセットから確立した（表１）。患者サンプル（例えば腫瘍サンプル）を得、そしてサンプルにおける１つ以上のマーカーの発現レベルをディファレンシャルナ発現プロフィルにマッチングさせることにより、癌進行の尤度を迅速に決定することができる。
【０１２６】
薬物試験
本発明は、特定の薬物試験のための個体を選択するのに使用することもできる。メラノーマを有する個体の予後を確立することにより、患者が応答しそうな慣用の処置を受けるべきかどうか、または患者が特定の薬物試験に参加するべきかどうか、即ち、特定の腫瘍タイプもしくは腫瘍段階を目標とするべきかどうかに関してより良い決定をすることができる。
【０１２７】
疾患進行への短い予測時間を有する患者の選択は、薬物試験の期間を短縮することも可能とし、そして記録されるべきより少数の患者が統計的に有意な薬物応答データを達成することを可能とする。
【０１２８】
実施例
ここに述べられた実施例は、本発明の態様を説明する目的のためである。他の態様、方法および分析のタイプは、分子診断技術分野における当業者の範囲内にあり、ここで詳細に述べる必要はない。当技術分野の範囲内の他の態様は、本発明の一部であると考えられる。
【０１２９】
段階ＩＩＩメラノーマにおける臨床アウトカムに影響を与えることがある腫瘍内の生物学的メカニズムを調査するために、段階ＩＩＩＢおよびＩＩＩＣメラノーマのリンパ節切除後の様々な臨床的アウトカムを有する患者からの２９のメラノーマ標本の最初の検定セットに関して遺伝子発現プロフィル化を行った。次いでこれを使用して、１０人の患者および１４人の患者を含む2つの独立したバリデーションセットにおける分子プロフィルに基づいて、臨床的アウトカムを将来的に予測した。この分子情報を使用して、2つの患者グループ間でディファレンシャルにレギュレーションされることができるそして治療介入のための可能なターゲットである、細胞経路およびネットワークも同定された。
【０１３０】
物質および方法
マイクロアレイ分析のための標本採集および選択
行われた実験の全体的なスキームを図３に示す。Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈで１９９７〜２００４年の間に臨床的に触診可能な節の外科リンパ節切除を受けた２９人の患者からのｅｘ ｖｉｖｏメラノーマ組織をマイクロアレイ分析のために選択した。すべての標本は、Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈヒト調査倫理委員会により認可された組織入手プロトコールの下にそして各患者の書面のインフォームドコンセントを伴って採集された。急に凍結した標本を最適切削温度化合物（ＯＣＴ）中に包埋しそしてＬｕｄｗｉｇ／Ａｕｓｔｉｎ組織バンク貯蔵室内に−８０℃で組織ブロックとして貯蔵した。すべての場合に診断は病理学者により確認された。
【０１３１】
患者サンプルは、段階ＩＩＩから段階ＩＶ疾患への腫瘍進行に要した時間（ＴＴＰ）に基づいてマイクロアレイ分析のために選択され、そして１6人の「悪い」（平均ＴＴＰ４か月）予後の患者および１３人の「良好な」（平均ＴＴＰ４２か月）予後の患者を含んでいた。専用のメラノーマユニットにおける手術後の検査を、リンパ節切除後の最初の１２カ月間毎月行い、次いで臨床的必要に従ってその後３か月および６カ月検査を４年まで行い、その後年に１回の検査を行った。段階調査は、臨床的疑いに応じてまたはルーチンに3〜６か月ごとに行った。
【０１３２】
組織は、最小の壊死が存在しそして腫瘍細胞が全細胞集団の少なくとも６０％を含むならばこの研究のために許容されうると考えられた。ＲＮＡ抽出時に、２つの５μm切片を切断しそしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、抽出された組織のインテグリティーを確実にした。
【０１３３】
RNA抽出およびcDNA合成
cDNA合成および共通の参照デザインとのハイブリダイゼーションを２９人の選択された患者について二重に(in duplication)行った。トータルRNAを、OCT包埋した組織から、組織切片をＴｒｉ試薬（Molecular Research Ｃenter, Cincinnati, OH）中に浸漬および均質化することにより抽出し、クロロホルム１．５ｍＬを均質化物に加え、サンプルを遠心しそして上部層を取り出し、そして１００％エタノールと混合した。ＲＮｅａｓｙカラムを使用する精製を、製造者のインストラクション（Quiagen, Valencia, CA）に従って行った。ＲＮＡ品質を２６０：２８０吸光度の比に基づいて確認し、そしてインテグリティーをｒＲＮＡ標準マーカーに対してホルムアルデヒド−アガロースゲル上で検査した。オリゴ（ｄＴ）およびアミノアリルデオキシヌクレオチドの存在下にＲＮＡ２０μｇからｃＤＮＡを合成した。Ｃｙ染料（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）を腫瘍ｃＤＮＡおよび並行して産生された参照ｃＤＮＡにカップリングさせた。参照ｃＤＮＡをメラノーマを含む種々の腫瘍および細胞系からのプールされたＲＮＡおよび正常な組織からのプールされたＲＮＡから合成した（図４）。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドアレイおよびデータ分析
個々の遺伝子および内部コントロールを表す３０，８８８のオリゴヌクレオチドプローブを、ＭＷＧ Biotech(Erbesberg, Germany)から入手し、そしてＯｍｎｉｇｒｉｄロボット(Gene Machines, San Carlos, CA)を使用して高密度アレイとしてスポットした。標識された腫瘍／参照ｃＤＮＡを共ハイブリダイゼーションし、そしてＧｅｎｅｐｉｘ ４０００Ａマイクロアレイスキャナー(Axon Insruments, Union City, CA)を使用してスキャニングした。マトリックスオーバーレイをスキャニングされたイメージにアラインさせ、そして特徴抽出を、Gene Pix v.6.0ソフトウエア(Axon Insruments, Foster City, CA) を使用して行った。生のデータをGeneSpring v7.2(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を使用して分析した。データをプリントチップグループ(print-tip group)に対して正規化し、次いでメディアン正規化した(median normalized)。簡単にいえば、ｌｏwｅｓｓ曲線を対数密度プロット対対数比プロットに適合させた。データの２０％を使用して各点におけるｌｏｗｅｓｓ適合を計算した。この曲線を使用して各測定値についてコントロール値を調節した。次いで各遺伝子をすべてのサンプルにおけるその測定値のメデイアンにより除した。
【０１３５】
ＥＯＲＴＣメラノーマ研究２７からの独立したバリデーションセットについてのデータは、Array Express公的データ貯蔵所:http//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/を通じて入手可能となった。データをGenespring v7.2にアップロードし、そしてスポットにつき、チップにつきおよび遺伝子につき正規化した。簡単に言えば、各遺伝子の測定された強度を、各サンプルにおいけるそのコントロールチャネル値により割り、次いでそのサンプルにおけるすべての測定値の第５０百分位数(５０th percentile)により除した。最後に各遺伝子を、すべてのサンプルにおけるその測定値のメディアンで除した。ディファレンシャルに発現された遺伝子についての発現値を使用して、下記したとおりの予測スコアを計算した。
【０１３６】
統計的方法
遺伝子発現データを、最初に、すべてのサンプルにおいて存在しなかったプローブを排除するフィルターに供した。考慮された最初の３０，８８８のプローブの内、１８，８０７はこのフィルターに通しそして分散分析、階層的クラスタリング(hierarchical clustering)および主成分分析のために使用された。ディファレンシャルに発現された遺伝子は、０．０５のｐ値カットオフに基づく多重検定補正(multiple testing correction)のために補正するのに使用されるBenjamini and Hochbergの偽発見率制御方法(false discovery rate controlling method)２８と共に、ウイルコクソン−マン−ホイットニー検定(Wilcoxon-Man-Whitney test)を行うことにより発見された。サンプルの階層的クラスタリングは、距離関数としてスピアマン相関(Spearman correlation) および平均リンケージ(average link)を使用して行われた。
【０１３７】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
アレイ結果を確かめるためにディファレンシャルに発現された遺伝子に関してｑＰＣＲを行い、次いでバリデーションセットＡを使用して予測子をバリデーションするのに行った。第１鎖ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマープライマー(Promega, Madison, WI)を使用して、アレイ実験のために抽出されたトータルＲＮＡ２μｇから合成した。逆転写を省くことによりネガティブコントロールを得た。Universal Probe Library アッセイデザインセンターhttps://www.roche-applied-science.com（Roche, Mannheim, Germany) を使用して、イントロンスパニングマルチプレックスアッセイをｑＰＣＲのためにデサインした（アッセイデザインについては図５参照）。すべての反応は、ＡＢＩ ７７００配列検出器(Applied Biosystems, Foster City,CA)を使用して二重に行った。サーマルサイクラー条件は、下記のとおりであった：５０℃２分間、９５℃１０分間、続いて４０サイクルの９４℃で２０秒および６０℃で４５秒。すべての結果を１８Ｓ増幅に対して正規化した(Applied Biosystems, Foster City, CA)。本発明者らは、本発明者らのコンパレーターとして参照のためのターゲット閾値（ＣＴ）の値を使用して相対的発現を計算した２９。
【０１３８】
次いで個々の遺伝子についての相対的発現値を、正規化されたｌｏｇ２比アレイ値および計算された相関係数を一緒にプロットした。
【０１３９】
結果
検定セットおよびバリデーションセットＡに含まれた患者の臨床的特徴および病理学的特徴を列挙する（図６）。全ての患者は、最初の診断時の年齢、性およびポジティブなリンパ節転移の数および位置に関する情報を有していた。すべてではない患者が本発明者らの病院で初期診断をされ、それ故いくらかの症例では原発性メラノーマにおいて潰瘍化が存在していたかどうかを確かめることはできなかった。原発性メラノーマにおける潰瘍化は、もし存在するならば疾患をＩＩＩＢからＩＩＩＣに段階を上げる独立した予後因子である３０。
【０１４０】
「良好な」予後グループの平均ＴＴＰは、「悪い」グループの４カ月に比べて４０カ月であった。「良好な」グループはより若く見えそしてより多くの女性を含んでいたけれども、グループ間でメデイアン年齢および性における統計的に有意な差はなかった。サンプルサイズの限界はあったけれども、ＡＪＣＣ病期分類、アジュバントインターフェロンの使用および腫瘍浸潤リンパ球の存在を含む他の既知の予後特徴において統計的に有意な差はなかった。
【０１４１】
１人の患者は、切除された脾臓に限られた孤立した段階ＩＶ疾患を有していたが、彼らが無病であることを考えて、このサンプルは含められた。このサンプルの排除は遺伝子発現プロフィルを変えなかった。
【０１４２】
ディファレンシャルに発現された遺伝子は、２つの予後グループを分離する。
教師なしの階層的クラスタリングは、予後とも他の臨床的情報とも相関しないメラノーマのサブグループを示さなかった。これはサンプル間の類似性を考えると予期されたことであった。予後グループを有効に分離することができた遺伝子を調査するために、ディファレンシャルな遺伝子発現を調べた。２，１４０の遺伝子が２つのグループ間でディファレンシャルに発現されたが、しかしながら、多重検定補正の厳格な適用は、これを高度に有意なディファレンシャルな発現を有する２２の遺伝子に減少させた（図１）。２２の遺伝子を、ｑＰＣＲを使用してトレーニングセットにおいて更にバリデーションし、そして２つのプラットフォーム間で最も高い相関係数を有する遺伝子（ｒ＞０．５、ｐ＜０．０５）が更なる分析のために選ばれた（データは示されていない）。最初の２２の内、１５の遺伝子は高いクロスプラットホーム相関(cross-platform correlation)を示し、そしてこれらは予測スコアの開発のために使用された。主成分分析は、１５の遺伝子の予後グループを分離する能力を証明した（図７）。
【０１４３】
予測スコアの開発
最初の検定セットを使用して２つの独立したバリデーションセットに関して検定された予測子を開発した。２つの予測アルゴリズムは、アレイデータおよびｑＰＣＲデータに基づいて開発された。
【０１４４】
１．アレイデータ（ａＰＳ）についての予測スコアを計算するために、アレイとｑＰＣＲとの間の最も有意な相関を有する１５の遺伝子を使用した。正規化されたｌｏｇ２発現比は、その値を２乗することにより変換された。「良好な」予後グループにおいてダウンレギュレーションされた遺伝子はネガティブな値に帰された。次いですべての１５の遺伝子についての値の和により最終スコアを計算した。ポジティブなスコアは改善されたアウトカムと関連していた。
【０１４５】
２．ｑＰＣＲデータ（ｑＰＳ）について、１５の最も相関した遺伝子についてのΔΔＣＴ値をAkaike Information Criterionnを利用するロジスティック回帰アルゴリズムにアプリケーションしてクラス識別に寄与する遺伝子のみを選択した。これは５つの有意な遺伝子を選択し、これらは次いで下記式において使用された：
qPS=[1328.15-187.42(IDH)+137.10(MFG8)+73.61(PILRA)+211.22(HLA-E)+143.94(TXNDC5)]×-1
ａＰＳに関すると同じく、ポジティブスコアは、この方法を使用して改善されたアウトカムと関連していた。
【０１４６】
予測スコアはＴＴＰおよび全生存期間と相関する
予期されたとおり、検定セットにアプリケーションされたａＰＳおよびｑＰＳの両方が、２つの予後グループを識別することができた。個々のスコアの大きさ（ａＰＳによる高いスコアおよびｑＰＳでのネガテイブスコア）がｑＰＳおよびａＰＳの両方について改善されたアウトカムと相関するような（図８、スピアマン順位相関、ｒ＝０．７９０８、ｐ＜０．０００１）、個々のスコアとＴＴＰおよび全生存期間との強い相関は明白であった。これは、これらのディファレンシャルに発現された遺伝子の発現レベルが、臨床的アウトカムに直接影響を与える基礎をなす生物学的機序に関係することを示唆しており、それらの予後の妥当性を強調している。
【０１４７】
３つの独立したセットへの予測スコアのアプリケーション
次いで結果を、独立に発生させたデータにアプリケーションした。我々自身に類似した患者のサブグループに関する１つの公表されたデータセットが同定された。この研究２７においてプロフィル化された８３人の患者の内、１４人は長期追跡により段階ＩＩＩ疾患を有していた。このサブグループでは、我々の検定セットにおいて適用された同様な基準を使用して、１０人の患者は「悪い」として分類され（平均ＴＴＰ１０カ月）、そして４人は「良好」として分類された（平均ＴＴＰ６２カ月）。ａＰＳアルゴリズムをこれらのサンプルにアプリケーションすると、すべての１０人の「悪い」患者および４人の「良好な」患者の内２人は正しく予測され、８５％の総合的な正しい分類率(overall correct classification rate)を生じる。
【０１４８】
次いで、我々は、Ｌｕｄｗｉｇ／Ａｕｓｔｉｎ組織バンクからの１０の腫瘍の独立したセットにｑＰＳアルゴリズムをアプリケーションし、これらに対するｑＰＣＲアッセイを５つの最も強力な予測性の遺伝子を使用して行った。予測子は「良好な」予後の腫瘍の５つのすべてを正しく分類したが、５つの「悪い」サンプルの１つを間違って分類した（図９）。間違って分類された「悪い」サンプルは、ＴＴＰは短いが転移疾患を伴って６年という長期の全生存期間を有した患者を表した。
【０１４９】
５つの遺伝子ｑＰＳも、段階３メラノーマサンプルの第３の独立したセットにアプリケーシヨンした。これらのサンプルは、段階３疾患の診断の後１８か月以下の生存期間を有する１９人の患者および段階３診断から４年より長く生存した更なる１８人の患者からなっていた。これらの良好な予後グループからのｑＰＳスコアの分布と悪い予後グループからのｑＰＳスコアの分布は、有意に異なっており（ｐ＝０．０２）そして図１０に示される。
【０１５０】
検討
この実施例は、マイクロアレイ遺伝子発現データおよびｑＰＣＲから誘導された発現プロフィルを使用して段階ＩＩＩメラノーマ患者の他の方法では識別できないグループにおける臨床的アウトカムの成功した予測を示す。２つの独立したセットにおいて、１５のディファレンシャルに発現された遺伝子に基づく２つの開発された予測スコアアルゴリズムを、マイクロアレイおよびｑＰＣＲデータにアプリケーションして、段階ＩＩＩＢ／Ｃメラノーマを有する患者における臨床的アウトカムを将来的に予測することができることが確立された。
【０１５１】
これらの患者は、同様な段階の疾患について選ばれ、そしていくつかの研究は、同様な段階の疾患を有する患者間よりも異なる段階で採取された自己由来のサンプル間の遺伝子発現のより高い類似性を証明した２７、３１、３２。９２％以下の正確度でアウトカムを将来的に予測するのに使用されうるグループ間でディファレンシャルに発現された遺伝子があるという観察は、それらの重要性を強調する。更に、ＴＴＰおよび全生存期間の両方との予測子の相関は、スコアの差の大きさが臨床的アウトカムと直接相関するような予測子の有用性も強調する。
【０１５２】
説明において、既知の均等物を有する整数または成分に関して言及された際、このような均等物は、あたかも個々に説明されたかのように、本明細書に組み込まれる。本発明は、実施例としておよびその可能な態様に関して説明されているけれども、本発明の範囲から逸脱することなく改善および／または改変がなされうることは認識されるべきである。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
工業的用途
予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく本発明の方法、成分、キットおよび装置は、癌、特にメラノーマの予後および処置のために有用である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年５月２４日に出願されたニュージーランド仮特許出願第５５５３６３号の利益を主張し、それは全体において参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、患者における癌、特にメラノーマの進行を決定するための方法および組成物に関する。詳しくは、本発明は、予後シグネチャー(prognostic signatures)に基づいて、メラノーマなどの癌の予後を決定するための遺伝子マーカーおよびプロテオームマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
先進国では、メラノーマの発生率はこれまでの２５年間にわたり絶えず上昇しており、オーストラリアでの発生率が世界で最も高い１。認められた「メラノーマ流行」は、多分薄いメラノーマの増加した検出を表すけれども２、メラノーマは、主としてより若年のグループ冒して実りある人生の年月を損失させる。この年月は児童悪性疾患および精巣癌によってのみ超えられる３，４。メラノーマは細胞傷害性化学療法５、生物学的作用物質６，７および種々のワクチン接種ストラテジー８に殆ど応答しない。小さなサブグループの患者は、生物学的および/または細胞傷害性化学療法から利益を受けると思われるが、これらの患者を推測的に鑑別することは現在不可能であり、これは、低い利益の確率で実質的な毒性に多くの患者をさらすことを必要とする。
【０００４】
メラノーマが一旦局所的リンパ節に転移すると、患者の７０%は５年以内に死ぬであろう９。長い生存を有するサブグループの患者は独特のコホートを表す。現在のアジュバント治療は、全般的生存利益を与えず、そしていくらかの臨床医は、無病生存を改良するためにインターフェロンαを与えるが１０、多くの国際的な総合施設は、臨床試験の範囲外では活発なアジュパント処置を与えない。どの患者がアジュバント治療の使用にかかわらず良くなりそうかを予測することは、不必要な毒性を防止し、そしてより多く利益を得そうな患者をターゲティングする、より良好な治療ストラテジーの開発を可能とする。アジュバント臨床試験における患者のより良好な階層化は、第一種の過誤および第二種の過誤の両方を減少させるであろう。ＥＣＯＧ１６８４研究の後の１２年の更新および他の無作為化研究は、インターフェロンαが、ＴＴＰを改良するが、段階IIIメラノーマにおける全生存期間(overall survival)を改良しないことを証明した５，１０，１１。現在よく認識されているがコントロールされることができない患者母集団内の固有の不均一性は、初期のＥＣＯＧ１６８４研究１０および他のより少ない第ＩＩ相の研究において見られた生存に関する有望な効果を混乱させたかもしれない。再発の可能性のより高いこれらの患者を階層化することは、この不均一性をバランスさせそして処置がより正確に比較されることを可能とすることができる。
【０００５】
メラノーマの予後を予測するための更なるツールに対する要求がある。本発明は、癌の予後および処置を助けるための、予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく方法、組成物、キットおよび装置を提供する。
【０００６】
発明の要約
ある態様では、予後の良好なメラノーマおよび予後の悪い(poor)メラノーマにおいてディファレンシャルに発現されることが同定されたマーカー遺伝子のセットが提供される。この遺伝子のセットは、患者におけるメラノーマの進行速度を予測することができる２つ以上のマーカーを含む予後シグネチャーを発生させるのに使用することができる。
【０００７】
個々のマーカーは、腫瘍が速く進行するか速く進行しないかに依存して、ディファレンシャルに発現されうる。マーカーを組み合わせて、単一遺伝子アッセイよりもはるかに有効な個々の検定を提供することができる予後シグネチャーとすることにより、予測の正確度を高めることができる。予測モデルを発生させるために統計学、機械学習、人口知能およびデータマイニングなどの技術を予後シグネチャーにアプリケーションすることも提供される。他の態様では、次いで患者の腫瘍における特定の予後シグネチャーのマーカーの発現レベルを予測モデルにアプリケーションして予後を決定することができる。
【０００８】
ある態様では、マーカーの発現レベルは、マイクロアレイ法、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）またはイムノアッセイを使用して確立することができる。
【０００９】
特に、本発明は、患者におけるメラノーマの予後を決定するための方法であって、
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）の発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予測シグネチャー(predictive signature)の発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
（ｉｉｉ）予後を確立する
工程を含む方法を提供する。
【００１０】
あるいは、本発明は、薬物試験に対するメラノーマ患者の適性を決定するための方法であって、
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいてＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定し、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予測シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプリケーションすることにより確立された予測モデルをアプリケーションし、
（ｉｉｉ）試験に対する患者の適性を確立する、
工程を含む方法も提供する。
【００１１】
本方法に従うＭＰＭは、表１から選択されうる。予測方法は、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類および回帰木、アンサンブル学習法、判別分析(discriminant analysis)、最近傍法(nearest neighbor method)、ベイジアンネットワーク、独立成分分析からなる群より選ばれる。
【００１２】
ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定することは、例えばフォアードプライマーおよびリバースプライマーを使用するｑＰＣＲを使用して各遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより行うことができる。ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定することは、各遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを検出することにより、例えば各遺伝子のｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチドを使用することにより行うこともできる。更に、ＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルは、各マーカーのタンパク質の発現レベルを検出することまたは各マーカーのペプチドの発現レベルを検出すること、例えば、各マーカーに対して向けられた抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清を使用することにより決定することができる。サンドイッチ型イムノアッセイ法またはＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。
【００１３】
本発明は、２つ以上のメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）を含むメラノーマの進行の危険を決定するための予後シグネチャーも提供する。予後シグネチャーのＭＰＭは表１から選ぶことができる。
【００１４】
他の局面では、本発明は、メラノーマの予後を決定するための装置であって、表面に１つ以上のロケーション有する基材を含み、各ロケーションはそこに２つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、各オリゴヌクレオチドは１つ以上のＭＰＭから選ばれる、装置を提供する。
【００１５】
２つ以上のオリゴヌクレオチドは表１から選ばれるＭＰＭであることができる。
【００１６】
本発明は、患者におけるメラノーマの予後を予測するためのキットの製造において、ＭＰＭの発現または２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現を検出するための試薬の使用も提供する。ＭＰＭは表１から選択されうる。
【００１７】
試薬は、ＭＰＭｍＲＮＡまたはＭＰＭｃＤＮＡの発現を検出することにより１つ以上のＭＰＭの発現のレベルを検出することができる。試薬は、ＭＰＭ ｍＲＮＡまたはＭＰＭ ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドであることができる。または、試薬は、ＭＰＭタンパク質またはペプチドの発現を検出することにより１つ以上のＭＰＭの発現のレベルを検出することができる。試薬は、抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清であることができる。
【００１８】
キットは、サンドイッチ型イムノアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイを引き受けるために適当であることができる。
本発明の具体的態様及び図に関して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】予測スコアを構築するのに使用された２２の遺伝子（「メラノーママーカー」）を示す。遺伝子はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して選ばれた。
【図２】図２は、ディファレンシャルに発現された遺伝子の遺伝子オントロジーグルーピングおよび関連した有意性を示す。最も有意なオントロジーは、カテゴリー間で重なる遺伝子の数、即ち、この多くの遺伝子が遺伝子リストおよびカテゴリーの両方にあることが偶然の一致(co-incidence)である尤度により決定される。
【図３】図３は、トレーニングセットおよびｑＰＳを使用するバリデーションセットＡおよびｑＰＳを使用するセットＢに適用された２つの独立したバリデーションセットを含む実験スキームである。トレーニングセットを使用して予測遺伝子を開発し、次いでこれをｑＰＳを使用するバリデーションセットＡおよびｑＰＳを使用するセットＢにアプリケーションした。
【図４】図４は、アレイ実験およびｑＰＣＲアッセイにおけるコンパレーターとしての両方に使用された参照ｃＤＮＡを創生するのに使用されたＲＮＡを示す。
【図５】Universal Probe Library Probesを使用するｑＰＣＲのために使用されたアッセイを示す。
【図６】検定セットおよびバリデーションセットＡについての患者の特徴を示す。
【図７】１５の遺伝子の悪い（空のボックス）予後グループから良好な（充填されたボックス）予後グループを分離する能力を証明する、すべての遺伝子（Ａ）およびディファレンシャルに発現された遺伝子（Ｂ）を使用する主成分分析を示す。これらの遺伝子は、アレイおよびｑＰＣＲベースの予測子を発生させるために使用された。
【図８】トレーニングセットにおけるａＰＳ（ａ−ｂ）およびｑＰＳ（ｃ−ｄ）の適用を示し、ＴＴＰおよび全生存期間とのその相関を証明する。ａＰＳは、アレイデータとｑＰＣＲデータ間で最も強い相関を有する１５の遺伝子のみを使用し、そしてｑＰＳは、２つのグループを分離する最も強い能力を有する５つの遺伝子を使用した。
【図９】図９は、トレーニングセットおよびバリデーションセットＡに適用されたｑＰＳロジスティック回帰アルゴリズムを示す。水平線は、平均値で引かれている。
【図１０】図１０は、第３の独立したセットの良好な予後グループと悪い予後グループからのｑＰＳスコアの分布を示す。
【００２０】
詳細な説明
定義
本発明の態様を詳細に説明する前に、本明細書で使用される用語のいくらかの定義を与えることは有用であろう。
【００２１】
「マーカー」という用語は、生物学的現象の存在と定量的または定性的に関連している分子を指す。「マーカー」の例は、現象の基礎をなす機構に直接または間接に関係していようがいまいが、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子もしくは遺伝子フラグメント、ＲＮＡもしくはＲＮＡフラグメント；ポリペプチド、例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質もしくはタンパク質フラグメントを含む遺伝子産物；または任意の関連した代謝物、副生物もしくは任意の他の同定分子、例えば抗体もしくは抗体フラグメントを含む。本発明のマーカーは、本明細書で開示されたヌクレオチド配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列）、特に、完全長配列、任意のコード配列、その任意のフラグメントもしくは任意の相補体よび上記したその任意の測定可能なマーカーを含む。
【００２２】
用語「ＭＰＭ」または「メラノーマ予後マーカー」または「ＭＰＭファミリーメンバー」は、特定の予後、例えば本明細書に記載された、より進んだ段階への癌進行の高い尤度もしくはより低い尤度と関連している変化した発現を伴うマーカーを指すが、メラノーマの予後と関連していることが先行技術で知られている分子を除外することができる。用語ＭＰＭは、マーカーがメラノーマに対してのみ特異的であることを必要としないと理解されるべきである。むしろ、ＭＰＭの発現は、悪性腫瘍を含む他のタイプの腫瘍においては変わることができる。
【００２３】
用語「予後シグネチャー」「シグネチャー」等は、セットとして一緒に分析されるとき、事象、例えばメラノーマの予後アウトカムの決定または予測を可能とする２つ以上のマーカー例えばＭＰＭのセットを指す。２つ以上のマーカーを含むシグネチャーの使用は、個々の変化の効果を減少させそしてより強い予測(robust prediction)を可能とする。ＭＰＭの非限定的例はＸＸで示される。本発明に関しては、任意の特定のセット（例えば任意のシグネチャー）に列挙されたマーカーの「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ等という表現は、列挙されたマーカーの任意の１つまたは任意のおよびすべての組み合わせを意味する。
【００２４】
用語「予測方法」は、予測モデルを特定するのに使用することができる統計学、機械学習、人口知能およびデータマイニングの分野からのより広い種類の方法を包含することが定義される。この用語は、アウトカムを予測するために適当な任意の方法も含み、そして、アウトカムを予測するために、多重マーカーの複雑な分析を使用するのみならず、コントロール組織の発現に対するまたは所定の閾値に対する単一マーカーもしくはシグネチャーの発現の直接の比較も使用する方法を含む。これらは、詳細な説明の節にさらに検討される。
【００２５】
用語「予測モデル」は、予測方法をデータのコレクションに適用することにより得られた特定の数学的モデルを指す。本明細書に詳述された実施例において、このようなデータセットは、各サンプルのクラス（良好または悪い）が知られている、良好なもしくは悪い予後を有するメラノーマ患者から採取された組織サンプルにおける遺伝子活性の測定値からなる。このようなモデルは、（１）未知の予後状態のサンプルを良好または悪いの１つであるとして分類するためまたは（２）未知のサンプルにおける特定された遺伝子のコレクションの、ｍＲＮＡ発現レベルまたは発現産物の測定値に基づいて、未知のサンプルが良好な予後を有する尤度を表す確率的予測をする（即ち、例えば確率と解釈されるべき割合または百分率を作り出す）ために使用されうる。いかにしてこれらの遺伝子特異的測定値が組み合わされて分類および確率的予測をするかの正確な詳細は、モデルを構築するのに使用される予測方法の特定の機序に依存している。この用語は、アウトカムを予測するのに適当な任意のモデルも含み、そしてアウトカムを予測するために、多重マーカーの複雑な分析を使用するモデルのみならず、単一マーカーまたはシグネチャーの発現をコントロール組織の発現または所定の閾値と直接比較することを伴うモデルも含む。
【００２６】
「感受性」、「特異性」（または「選択性」）、および「分類率」(classification rate)は、予測モデルの有効性を説明するのに適用されるとき、下記のことを意味する：
「感受性」は、ボジティブであることが（モデルにより）予測もされる真にポジティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、それは、良好であることがモデルにより予測された良好な予後を有する腫瘍の割合であろう。「特異性」または「選択性」は、ネガティブであることが（モデルによって）予測もされる真にネガティブなサンプルの割合を意味する。メラノーマの予後の検定においては、これは、モデルにより悪いことが予測される悪い予後を有するサンプルの割合に等しい。「分類率」は、予測モデルにより正確に分類されるすべてのサンプルの割合である（ポジティブまたはネガティブとしてのそれである）。
【００２７】
本明細書で使用された「抗体」および同様な用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する（と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、それらに限定されない。抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なるクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関する。これらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびその他などのサブクラスも含む。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であることができる。本明細書での抗体への言及は、すべてのクラス、サブクラスおよびタイプへの言及を含む。キメラ抗体、例えば、1つより多くのソース、例えばマウスまたはヒト配列に特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。更にラクダ抗体、サメ抗体またはナノボディも含まれる。
「００００」
用語「癌」および「癌性」（cancerous）は、典型的には異常なまたは調節されていない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌および癌病理学は、例えば、転移、隣接細胞の正常な機能を果たすことの妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症性または免疫学的応答の抑制または悪化、新形成、前悪性疾患、悪性疾患、周囲のまたは離れている組織または器官、たとえばリンパ節等の浸潤と関連していることができる。特にメラノーマが含まれる。
【００２８】
用語「メラノーマ」は、皮膚に見出されるが、口および肛門性器粘膜表面、食道、髄膜および眼などの他の部位にも見出されるメラノサイトから生じる腫瘍を指す。これらの腫瘍は任意の器官に転移することができる。
【００２９】
用語「ディファレンシャルに発現された」、「ディファレンシャルな発現」および同様なフレーズは、コントロール被検体（例えば参照サンプル）におけるその発現と比べて、状態(condition)、特に癌、例えばメラノーマを有する被検体（例えば、試験サンプル）においてより高いレベルまたはより低いレベルにその発現が活性化される遺伝子マーカーを指す。この用語は、同じ状態の異なる段階において；良好な予後または悪い予後を有する疾患において；またはより高いレベルもしくはより低いレベルの増殖を有する細胞において、より高いレベルまたはより低いレベルにその発現が活性化されるマーカーも含む。ディファレンシャルに発現されたマーカーは、ポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルで活性化または抑制され得るか、または選択的スプライシングを受けて異なるポリペプチド産物をもたらすことができる。このような差は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、ポリペプチドの表面発現、分泌または他の分配の変化により証明されうる。
【００３０】
「ディファレンシャルな発現」は、２つ以上のマーカー（例えば、遺伝子またはそれらの遺伝子産物）間の発現の比較；または２つ以上のマーカー（例えば、遺伝子またはそれらの遺伝子産物）間の発現の割合の比較；または同じマーカーの２つの異なってプロセシングされた産物（例えば転写物またはポリペプチド）の比較、を含むことができ、これらは、正常な被検体と疾患のある被検体間で異なるか、もしくは同じ疾患の種々の段階間で異なるか、もしくは良好な予後または悪い予後を有する疾患間で異なるか、もしくはより高いレベルの増殖とより低いレベルの増殖を有する細胞間で異なるか、もしくは正常な組織と罹病組織、例えば癌またはメラノーマとの間で異なる。ディファレンシャルな発現は、例えば正常細胞と罹病細胞間の、もしくは異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞間の、もしくは異なるレベルの増殖を有する細胞間の、遺伝子またはその発現産物における一過性または細胞性発現パターンの定量的差および定性的差の両方を含む。
【００３１】
用語「発現」は、遺伝子または遺伝子の一部からのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生、特にＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の産生を含み、そしてＲＮＡ、または遺伝子もしくは遺伝子の一部によりコードされたポリペプチドの産生、および発現と関連した検出可能な物質の出現を含む。例えば、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用、ポリペプチド−ヌクレオチド相互作用または同様なものからの、例えば複合体の形成は、用語「発現」の範囲内に含まれる。他の例は、遺伝子または他のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質フラグメントへの、ハイブリダイゼーションプローブもしくは抗体などの結合性リガンドの結合および結合性リガンドの可視化である。したがって、マイクロアレイ上のスポットの強度、ノーザンブロットなどのハイブリダイゼーションブロット上の強度、またはウエスタンブロットなどのイムノブロット上の強度、またはビーズアレイ上の強度またはＰＣＲ分析による強度は、基礎をなす生物学的分子の用語「発現」内に含まれる。
【００３２】
用語「発現閾値」および「規定された発現閾値」は、相互に交換可能に使用され、そして問題のマーカーのレベルであって、そのレベルの外側ではポリヌクレオチドまたはポリペプチドが患者生存の予測マーカーとして働く、マーカーのレベルを指す。閾値は、確立される予測モデルに依存するであろうし、下記の実施例に記載の臨床研究などの臨床研究から実験的に誘導される。使用される予測モデルに依存して、発現閾値は、最大感受性を達成するのに設定されることができ、または最大特異性のためまたは最小誤り(minimum error)(最大識別率（maximum classification rate））のために設定されうる。例えば、より高い閾値は、最小誤りを達成するために設定されうるが、これはより低い感受性をもたらすことがある。故に、任意の所与の予測モデルでは、臨床研究は、最小誤り率を有しながら最も高い感受性を一般に達成する発現閾値を設定するのに使用されるであろう。任意の状況についての発現閾値の決定は、十分当業者の知見の範囲内にある。
【００３３】
用語「長期生存」は、本明細書では、手術または他の処置の後、少なくとも５年間、更に好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存を指すのに使用される。
【００３４】
用語「マイクロアレイ」は、基材上の捕捉剤、好ましくはポリヌクレオチド（例えば、プローブ）またはポリペプチドの規則的配列または不規則的配列を指す。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing,2000; Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley ＆ Sons, 2004; およびProtein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004参照。
【００３５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、限定することなく、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡｓを含むポリヌクレオチド、典型的にはプローブまたはプライマーを指す。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば商業的に入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系、リコンビナント技術および細胞および生物における発現を含む種々の他の方法により合成される。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数または複数で使用されるとき、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであって、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであることができる、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。これは、限定することなく、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖もしくは更に典型的には二本鎖であることができるかまたは一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も含まれる。特にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよびその任意のフラグメントが含まれる。この用語は、１つ以上の改変された塩基、例えばトリチウム化塩基または格別な塩基、例えばイノシンを含有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コード配列もしくは非コード配列またはセンス配列もしくはアンチセンス配列を包含することができる。本明細書で「ポリヌクレオチド」または同様な用語への各言及は、完全長配列およびその任意のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含むことは理解されるであろう。
【００３７】
本明細書で使用された「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチドもしくはタンパク質配列またはそのフラグメントを指し、そして天然に存在する分子、リコンビナント分子、合成分子もしくは半合成分子を指す。天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列に言及するために本明細書で「ポリペプチド」が詳述されるとき、「ポリペプチド」または同様な用語は、アミノ酸配列を、完全長分子のための完全な、ネイティブなアミノ酸配列に限定することを意味しない。本明細書で「ポリペプチド」または同様な用語への各言及は、完全長配列およびその任意のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含むことは理解されるであろう。
【００３８】
用語「予後」は、医学的アウトカム、例えば、悪いアウトカム（poor outcome）もしくは良好なアウトカム(good outcome)（例えば、長期間生存の尤度）の予測を指し；ネガティブな予後または悪いアウトカムは、再発、疾患の進行（例えば、腫瘍成長もしくは転移または薬物耐性）または死亡の予測を含み；ポジティブな予後または良好なアウトカムは、疾患の寛解（例えば無病状態）、改善（amelioration）（例えば腫瘍後退）または安定化を含む。
【００３９】
用語「増殖」は、増加した細胞サイズまたは細胞数をもたらすプロセスを指し、そして腫瘍もしくは細胞成長、新脈管形成(angiogenesis)、神経支配(innervations)および転移の１つ以上を含むことができる。
【００４０】
用語「ｑＰＣＲ」または「ＱＰＣＲ」は、例えば、PCR Technique:Quantitative PCR, J.W.Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997,およびA-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004 に記載の定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
【００４１】
用語「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、すべての新形成細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌性細胞および組織を指す。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定することができ、そして一般に、プローブ長さ、洗浄温度および塩濃度に依存す経験的計算である。一般に、より長いプローブは適合性なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性されたＤＮＡが、相補性鎖がそれらの溶融温度以下で環境中に存在するとき、再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との所望の相同性の程度が高ければ高い程、使用することができる相対的温度はより高い。結果として、より高い相対的な温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度は、反応条件をより少なくストリンジェントにする傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更なる詳細および説明は、例えば、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)に見出される。
【００４３】
本明細書で使用された「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、典型的には、（1）洗浄ための低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション期間中変性剤、例えばホルムアミド、50％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを伴うｐＨ６．５の５０mMリン酸ナトリウムバッファーとともに４２℃で使用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５XSSC（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート(Dewnhardt)の溶液、音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ml）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を４２℃で使用し、更に０．２X SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃でおよび５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄し、続いて５５℃でEDTAを含有する０．１X SSCを含む高いストリンジェンシー洗浄を行う。
【００４４】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Mannual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, により記載されたとおりに同定され得、そして上記した洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件よりも少なくストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハートの溶液、１０％デキストラン硫酸および２０mg／mlの変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡ（denatured sheared salmon sperm DNA）を含む溶液中３７℃で一夜のインキュベーション、続いて約３７〜５０℃で１Ｘ SSC中でフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブ長さおよび同様なものなどのファクターに適応するのに必要に応じて温度、イオン強度等をいかに調節するかを認識するであろう。
【００４５】
本発明の実施は、特記しない限り、当技術分野のスキル内にある、分子生物学（リコンビナント技術を含む）、微生物学、差細胞生物学および生化学の慣用の技術を使用するであろう。このような技術は、文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2ed edition. Sambrook et al., 1989, Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.L. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D. M. Weir ＆ CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller ＆ M. P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 1987; およびPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds, 1994において完全に説明されている。
【００４６】
発明の態様の説明
【００４７】
本発明は、メラノーマにおける特定の予後マーカーおよびシグネチャーの特定の予後の役割を同定および決定するためのマイクロアレイの使用を開示する。本明細書で示されたマイクロアレイをベースとする研究は、メラノーマを有する患者について良好な予後または悪い予後を予測するのに使用されうるマーカーを確立する。特に、本明細書で示されたマイクロアレイをベースとする研究およびｑＰＣＲ分析は、特定のディファレンシャルに発現された遺伝子が、特定の予後と関連している予後シグネチャーとして使用されうることを示す。したがって、本発明は、攻撃的な疾患(aggressive disease)を有していそうな患者を同定するのに使用されうる。
【００４８】
本発明は、疾患予後の決定のためのマーカーを提供する。本発明の方法を使用して、マーカーがメラノーマ予後と関連しておりそしてアウトカムを予測するのに使用されうることが見出された。種々の段階のメラノーマを有する患者から採取したサンプルのマイクロアレイ分析は、マーカー発現の特定のパターンが癌の予後と関連しているという驚くべき発見に導いた。したがって、本発明は、良好なアウトカムまたは悪いアウトカムを有するメラノーマにおいてディファレンシャルに発現される、表１に略述された遺伝子のセットを提供する。表１に略述された遺伝子は、メラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）のセットを与える。
【００４９】
例えば、あるメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）の減少は、特定の予後を示すことができる。反対に、他のＭＰＭの増加は、特定の予後を示す。特定の予後は、消化進行の速度を含むことができる。発現の減少または増加は、例えば、試験サンプル、例えば患者の腫瘍サンプルを参照サンプル、例えば既知の予後と関連したサンプルと比較することにより決定されうる。特に、良好な予後を有する患者（１つまたは複数）からの１つ以上のサンプルを参照サンプルとして使用することができる。
【００５０】
例えば、予後を得るために、患者のサンプル（例えば、腫瘍サンプル）中の発現レベルを、既知のアウトカムを有する患者からのサンプルと比較することができる。患者のサンプルが、悪いアウトカム（急速な疾患進行）を有するサンプルに匹敵する１つ以上のＭＰＭの増加した発現もしくは減少した発現を示すならば、悪い予後が関係付けられる。患者のサンプルが、良好なアウトカム（遅い疾患進行）を有するサンプルに匹敵しうる１つ以上のＭＰＭの発現を示すならば、ポジティブな予後または良好な予後が関係付けられる。
【００５１】
更なる例として、予後を得るために、患者のサンプル（例えば、腫瘍サンプル）からの２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを、良好な予後または悪い予後を有することが知られている癌のサンプルと比較することができる。患者のサンプルが、良好な予後を有するサンプルとの比較によりＭＰＭの増加した発現または減少した発現を示すならば、および／または悪い予後のサンプルに匹敵しうる発現を示すならば、ネガティブな予後が関係付けられる。患者のサンプルが、良好な予後のサンプルに匹敵しうるＭＰＭの発現を示すならば、および／または、悪い予後を有するサンプルよりも低い発現もしくは高い発現を示すならば、ポジティブなまたは良好な予後が関係付けられる。
【００５２】
１つのアプローチとして、予測モデルを発生させるために、予測方法をマーカーのパネル、例えば表１に略述されたＭＰＭのパネルに適用することができる。これは、２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発生を伴う。
【００５３】
したがって、開示された表１のＭＰＭは、癌の予後を決定しそしてその腫瘍に特異的な処置法(treatment regime)または処置様式(treatment modality)を確立するための予後シグネチャーを発生させるための有用なマーカーのセットを提供する。特に、ポジテイブな予後は、特定の処置選択を推し進めることを決定するために患者により使用されうる。ネガティブな予後は、処置を終わらせることまたは高度に積極果敢な(aggressive)処置もしくは実験的な処置を推し進めることを決定するために患者により使用されうる。更に、患者は、予後マーカー（例えばＭＰｍｓ）の発現から予測されるそれらの予後に基づいて処置を選ぶことができる。
【００５４】
ＭＰＭのレベルは、腫瘍組織、腫瘍に近接した組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプルまたは糞便サンプルにおいて、任意の適当な方法を使用して検出することができ、そしてオリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲまたはマーカーに対して生じた抗体を含むことができるが、それらに限定されない。予測シグネチャーの形態にある複数のＭＰＭの存在および発現の量を分析し、そして予後シグネチャーを構築することにより、予後の感受性および正確度は増加するであろうことは認識されるであろう。したがって、本発明に従う多重マーカーは、癌の予後を決定するのに使用されうる。
【００５５】
本発明は、セットにおけるマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋された生検物質の使用を含み、したがって、最も広く入手可能なタイプの生検物質と適合性である。本発明は、例えばコア生検または細針吸引による腫瘍組織採取のいくつかの異なる方法とも適合性である。ある局面では、ＲＮＡは、固定され、ワックス包埋された患者の癌組織標本から単離される。単離は、例えばコア生検組織または細針吸引細胞から、当技術分野で知られている任意の技術により行われうる。
【００５６】
１つの局面では、本発明は、予後、例えば、処置後の癌患者の長期間の生存の尤度を予測する方法であって、患者から得られたサンプル中の他のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の発現レベルまたはＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化された、患者から得られたサンプル中の１つ以上の予後マーカーまたはそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む方法に関する。
【００５７】
特定の局面では、予後マーカーは、表１に列挙された１つ以上のマーカーであり、または表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーの１つ以上として含まれる。
【００５８】
更なる局面では、予後マーカーまたはそれらの発現産物の発現レベルは、例えば、表１に列挙されたマーカーについておよび表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて決定される。他の局面では、本方法は、例えば表１に列挙されたマーカーについてまたは表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて、予後マーカーまたはそれらの発現産物のフルセットの発現レベルの決定を含む。
【００５９】
更なる局面では、本発明は、例えば、表１に列挙されたマーカーについて、または表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーについて、２つ以上のマーカーにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含むアレイ（例えば、マイクロアレイ）に関する。特定の局面では、アレイは、表１に列挙されたマーカーに由来する予後シグネチャーにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含む。他の特定の局面では、例えば、表１に列挙されたマーカーについて、マーカーのフルセットにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
これらのアレイでは、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡｓまたはオリゴヌクレオチドであることができ、そしてそれらがディスプレーされる固体表面は例えばガラスであることができる。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されたマーカーの１つ以上に、例えば完全長配列、任意のコード配列、その任意のフラグメント、またはその任意の相補体にハイブリダイゼーションすることができる。特定の局面では、１つ以上のＭＰＭの発現レベルの増加または減少は、例えば癌再発による、長期間の生存の減少した尤度を示すが、１つ以上のＭＰＭの発現レベルの増加または減少の欠如は、癌再発のない長期間の生存の増加した尤度を示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
予後マーカー検出への一般的アプローチ
下記のアプローチは、ＭＰＭファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するのに使用することができる非限定的方法である：ＭＰＭについて選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するマイクロアレイアプローチ；ＭＰＭ特異的プライマーおよびプローブを使用する腫瘍サンプルに関するリアルタイムｑＰＣＲ；ＭＰＭ特異的プライマーおよびプローブを使用するリンパ節、血液、血清、糞便または尿サンプルに関するリアルタイムｑＰＣＲ；酵素結合免疫学的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；抗マーカー抗体を使用する免疫組織化学；およびコンピュータを使用するアレイまたはｑＰＣＲデータの分析。
【００６３】
他の有用な方法は、ノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283(1999)）; RNase保護アッセイ(Hod, BioTechniques 13: 852-854(1992)); 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR; Weis et al., Trends in genetics 8: 263-264(1992)）; 遺伝子発現のシリアル分析(SAGE; Velculescu et al., Science 270: 484-487(1995); and Velculsecu et al., Cell 88: 243-51(1997)), MassARRAY技術(MassARRAY technology)(Sequenom, San Diego,CA),および大規模平行シグネチャーシーケンシング(massively parallel signature sequencing)(MPSS; Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634(2000))による遺伝子発現分析を含む。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−ポリペプチド二本鎖を含む特定の複合体を認識することができる抗体を使用することができる。
【００６４】
一次データを集めることができ、そして、例えば、腫瘍組織および非腫瘍組織におけるマーカー発現レベルの比較により；マーカー発現レベル対再発している腫瘍および非再発腫瘍において決定されたレベルの比較により；マーカー発現レベル対転移を有する腫瘍または転移なしの腫瘍において決定されたレベルの比較により；マーカー発現レベル対異なる段階の腫瘍において決定されたレベルの比較により；またはマーカー発現レベル対異なるレベルの増殖を有する細胞において決定されたレベルの比較により、倍率変化分析(fold change analysis)を行うことができる。ネガティブな予後またはポジティブな予後は、この分析に基づいて決定される。腫瘍マーカー発現の更なる分析は、増加した発現または減少した発現を示すこれらのマーカーを既知のメラノーマ腫瘍の発現プロフィルとマッチさせて予後を与えることを含む。
【００６５】
発現が増加されることを結論するための閾値は、特定のマーカーおよびアプリケーションされるべき特定の予測モデルにも依存するであろう。閾値は、一般に、最も低い誤り率で最も高い感受性および選択性を達成するように設定されるが、特定の臨床状況については変更が望ましいことがある。所望の閾値は、任意の予測モデルの統計的変動性を考慮して十分なサイズの母集団を分析することにより決定されそして予測モデルを作成するのに使用されるサンプルのサイズから計算される。発現が減少していることを結論するための閾値の決定について同じことがあてはまる。増加した発現または減少した発現が起こったことを結論するための、他の閾値、または閾値を確立するための方法が、本発明の範囲から逸脱することなく選択されうることは認識されうる。
【００６６】
予測モデルは、そのアウトプットとして数値、例えばスコア、尤度値または確率を作り出すことも可能である。これらの場合に、閾値を予測モデルにより作られた結果にアプリケーシヨンすることが可能であり、そしてこれらの場合に、同様な原理が発現値のための閾値を設定するのに使用される原理として成り立つ。
【００６７】
一旦、腫瘍サンプルにおける予後シグネチャーの発現レベルまたは予測モデルのアウトプットが得られると、次いで癌再発の尤度を決定することができる。
【００６８】
同定されたマーカーから、１つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーを使用して、１つ以上のマーカーの発現レベルを開示された予後シグネチャーと比較することにより癌の予後を決定することができる。腫瘍サンプル中の１つ以上のＭＰＭの発現を開示された予後シグネチャーと比較することにより、癌再発の尤度を決定することができる。予後を確立するための予後シグネチャーの発現レベルの比較は、先に述べた予測モデルをアプリケーションすることによりなされうる。
【００６９】
癌再発の尤度を決定することは、医師にとって大きな価値がある。腫瘍が処置に応答しない高い尤度は、より長いもしくはより高い用量処置が考慮されるべきであるか、または、処置が全く与えられていないかもしれないことを意味する。正確な予後は患者にとっても利益である。それは、患者が彼らの配偶者、家族、および友人とともに処置に関する決定を下すことも可能とし、ならびに患者の将来および生活様式の変化に関する決定も可能とする。したがって、本発明は、腫瘍サンプルにおけるマーカーの発現をディファレンシャルな発現シグネチャーとマッチさせることにより確立された予後に基づく特定の癌に対する処置法を確立する方法も提供する。
【００７０】
マーカー選択または予後シグネチャーの構築は、本明細書の表１に開示されたＭＰＭに制限される必要はないが、開示されたシグネチャーからの１つ以上のＭＰＭの使用を含むことができ、または開示されたマーカーリストから選ばれたＭＰＭを使用して新規なシグネチャーが確立されうることは認識されるであろう。任意のシグネチャーの要件は、それが、医師が処置法を確立するのを助けるのに十分な正確度で、急速な疾患進行の尤度を予測するということである。
【００７１】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記した技術のなかで、最も感受性のそして最も柔軟性の定量的方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これは、薬物処理してもしくは薬物処理しないで、正常な組織および腫瘍組織における異なるサンプル母集団においてＲＮＡレベルを比較し、発現のパターンを特徴付け、密接に関連したＲＮＡｓ間で識別しそしてＲＮＡ構造を分析するのに使用されうる。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲでは、最初の工程は、ターゲットサンプルからのＲＮＡの単離である。出発物質は、典型的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系およびそれぞれ、対応する正常な組織または細胞系から単離されたトータルＲＮＡである。ＲＮＡは、種々のサンプルから、例えば、胸、肺、結腸（例えば大腸もしくは小腸）、皮膚、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、睾丸、卵巣、子宮等、組織、からの腫瘍サンプルから単離されることができ、原発性腫瘍もしくは腫瘍細胞系から、および健康なドナーからのプールされたサンプルから単離されうる。ＲＮＡのソースが腫瘍であるならば、ＲＮＡは、例えば、凍結されたもしくは保管された(archived)パラフィン包埋された組織サンプル、および固定された（例えばホルマリン固定された）組織サンプルから抽出されうる。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１工程は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写、次いでＰＣＲ反応でのその幾何級数的な増幅である。２つの最もよく使用される逆転写酵素は、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、典型的には、発現プロファイリングの状況および目標に依存して、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、抽出されたＲＮＡを、Gene Amp RNA PCRキット(Perkin Elmer, CA, USA)を使用して、製造者の指示に従って逆転写させることができる。次いで誘導されたｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用することができる。
【００７４】
ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるけれども、典型的には，５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼが使用される。かくして、ＴａｑＭａｎ（ｑ）ＰＣＲは、典型的にはＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼを利用して、そのターゲットアンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。
【００７５】
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ反応の典型的なアンプリコンを発生させる。第３オリゴヌクレオチドまたはプローブが、２つのＰＣＲプライマー間に位置したヌクレオチド配列を検出するようにデザインされる。このプローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によりエクステンション可能ではなく(non-extendible)、そしてレポーター蛍光染料およびクエンチャー蛍光染料で標識される。レポーター染料からの任意のレーザー誘導発光は、２つの染料がプローブ上にあるままで２つの染料が相互に近接して位置するとき、クエンチング染料によりクエンチングされる。増幅反応期間中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存性方式でプローブを開裂する。得られるプローブフラグメントは溶液中で解離し、そして放出されたレポーター染料からのシグナルは、第２フルオロフォアのクエンチング効果から免れる。レポーター染料の１つの分子が、合成された各新しい分子に対して遊離され、そしてクエンチングされなかったレポーター染料の検出は、データの定量的解明のための基礎を与える。
【００７６】
ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City,CA, USA)またはLightcycler(Roche Molecular Biotechnicals, Manheim, Germany)などの市販の装置を使用して行うことができる。好ましい態様では、５’ヌクレアーゼ処理は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemなどのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラー上で９６ウエルフォーマットにおいてサンプルを増幅する。増幅期間中、レーザーで誘導された蛍光シグナルを、すべての９６ウエルについて光学繊維ケーブルを通してリアルタイムで収集し、そしてＣＣＤで検出する。システムは装置を動かすためおよびデータを分析するためのソフトウエアを含む。
【００７７】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔまたは閾値サイクルとして表現される。上記したとおり、蛍光値は、すべてのサイクル期間中記録されそして増幅反応においてその点に増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されるときの点は閾値サイクルである。
【００７８】
誤りおよびサンプル間の変動の効果を最小にするために、ＲＴ−ＰＣＲは通常内部標準を使用して行われる。理想的な内部標準は異なる組織間で一定のレベルで発現されそして実験処置により影響されない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡｓは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および−アクチンのためのｍＲＮＡｓである。
【００７９】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変化は、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識された蛍光発生プローブ(fluorigenic probe)（即ち、ＴａｑＭａｎプローブ）によるＰＣＲ産物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは定量的競合ＰＣＲおよび定量的比較ＰＣＲの両方と適合性である。前者は正規化のために各ターゲット配列のための内部競合体を使用し、後者は、サンプル内に含有される正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。更なる詳細は、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994(1996)により与えられる。
【００８０】
発現レベルは、ＲＮＡソースとして固定され、パラフィン包埋された組織を使用して決定することができる。本発明の１つの局面に従えば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子に存在するイントロン配列に基づいてデザインされる。この態様においては、プライマー／プローブデザインにおける最初の工程は、遺伝子内のイントロン配列の脱線状化である。これは、Kent, W. J., Genome Res. 12(4): 656-64(2002)により開発されたＤＮＡ BLASTソフトウエアなどの公に入手可能なソフトウエアにより、またはそのバリエーションを含むBLASTソフトウエアにより行うことができる。次の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブデザインの十分に確立された方法に従う。
【００８１】
非特異的シグナルを回避するために、プライマーとプローブをデザインするとき、イントロン内の反復配列をマスクすることは有用である。これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングしそして反復エレメントがマスクされている問い合わせ配列(query sequence)に戻す、Bayer College of Medicineを通じてオンラインで入手可能なRepeat maskerプログラムを使用することにより容易に達成されうる。次いでマスクされた配列を使用して任意の市販のまたはそうでなければ公に入手可能なプライマー／プローブデザインパッケージ、例えば、Primer Express(Applied Biosystems); MGB assay-by-design(AppliedbBiosystems); Primer3(Steve Rozen and Helen J. Skaletsky(2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers in: Krawetz S, Misener S(eds) Bioinfomatics Methods and Protocols: Methods in Milecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)、を使用してプライマーおよびプローブ配列をデザインするのに使用することができる。
【００８２】
ＰＣＲプライマーデザインにおいて考慮される最も重要な因子が、プライマー長、溶融温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含有率、特異性、相補性プライマー配列および３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般的に長さは１７〜３０塩基であり、そして約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基、例えば約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含有する。５０〜８０℃、例えば約５０〜７０℃の溶融温度が典型的に好ましい。ＰＣＲプライマーおよびプローブデザインについての更なるガイドラインは、例えば、Diefenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1 995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, Optomization of PCTs in: PCR Products, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; and Plasterer, T. N. primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527(1997)を見られたい。その全体の開示は参照により明白に組み込まれる。
【００８３】
マイクロアレイ分析
ディファレンシャルな発現は、マイクロアレイ技術によって同定または確認することもできる。したがって、ＭＰＭの発現プロフィルは、マイクロアレイ技術を使用して新しい腫瘍組織またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定することができる。この方法では、関心のあるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡｓおよびオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基材上にプレートまたはアレイする。次いでアレイされた配列（即ち捕捉プローブ）を関心のある細胞または組織からの特異的ポリヌクレオチド（即ち、ターゲット）とハイブリダイゼーションさせる。丁度ＲＴ−ＰＣＲ法におけると同じく、ＲＮＡのソースは、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞系および対応する正常な組織もしくは細胞系から単離されたトータルＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。ＲＮＡのソースが原発性腫瘍であるならば、ＲＮＡは、例えば、毎日の臨床実施においてルーチンに調製されそして保存されている、凍結されまたは保管された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織サンプルおよび固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルから抽出されうる。
【００８４】
マイクロアレイ技術の特定の態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートを基剤に適用する、基材は、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または７５までのヌクレオチド配列を含むことができる。他の局面では、基材は、少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列を含むことができる。マイクロチップ上に固定化されたマイクロアレイされた配列は、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションのために適当である。他の態様として、マイクロアレイのためのターゲットは、長さが少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００または２０００塩基、または長さが５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００もしくは５００〜５０００塩基であることができる。更なる態様として、マイクロアレイのための捕捉プローブは、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０または１００塩基、または長さが１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０、または２０〜８０塩基であることができる。
【００８５】
蛍光的に標識されたｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されたRNAの逆転写により蛍光性ヌクレオチドの組み込みにより発生させることができる。チップに適用された標識されたcDNAプローブは、アレイ上のDNAの各スポットに特異性をもってハイブリダイゼーションする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後に、共焦点レーザー顕微鏡によりまたはＣＣＤカメラなどの他の検出方法によりスキャンされる。各アレイされたエレメントのハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡ量(abundance)の評価を可能とする。二色蛍光により、２つのＲＮＡのソースから発生させた別々に標識されたｃＤＮＡプローブをペアー方式でアレイにハイブリダイゼーションさせる。かくして、各特定された遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対的量を同時に決定する。
【００８６】
ハイブリダイゼーションのミニチュア化されたスケールは、多数の遺伝子の発現パターンの便利で迅速な評価を与える。このような方法は、細胞当たり少数のコピーで発現される希少転写物を検出するのに必要な感受性および発現レベルにおいて少なくとも約２倍の差を再現可能に検出するのに必要な感受性を有することが示された(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149(1996))。マイクロアレイ分析は、市販の装置、例えば、Affimetrix GenChip技術、イルミナマイクロアレイ技術またはIncyteのマイクロアレイ技術により、製造者のプロトコールに従って、行うことができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、種々の腫瘍タイプにおける癌分類およびアウトカム予測の分子マーカーを系統的に研究することを可能とする。
【００８７】
ＲＮＡ単離、精製よび増幅
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は、当技術分野で周知でありそしてAusubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997)を含む分子生物学の標準方法に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987)およびDe Sanders et al., BioTechniques 18: 42044(1995)に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、Quiagenなどの商業的製造者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを使用して、製造者のインストラクションに従って行うことができる。例えば、培養物中の細胞からのトータルＲＮＡは、Quiage RNeasyミニカラムを使用して単離されうる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit(EPICENTRE(D, Madison, WI)およびParaffin Block RNA Isolation Kit(Ambion, Inc)を含む。組織サンプルからのトータルＲＮＡは、RNA Stat-60(Tel-Test)を使用して単離されうる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心により単離されうる。
【００８８】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマーエクステンションおよび増幅を含む、ＲＮＡソースとして固定された、パラフィン包埋された組織を使用する遺伝子発現をプロファィリングするための代表的プロトコールの工程は、種々の公表された雑誌文献（例えば、T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001)）に記載されている。簡単にいえば、代表的方法は、パラフィン包埋された腫瘍組織サンプルの１０μm厚さの切片を切断することで出発する。次いでRNAを抽出し、そしてタンパク質およびDNAを除去する。RNA濃度の分析の後に、RNA修復および／または増幅工程を必要に応じて含ませることができ、そしてRNAを遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写し、次いでＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析して、検査された腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的遺伝子発現パターンに基づいて患者に利用可能な最善の処置選択（１つまたは複数）を同定する。
【００８９】
免疫組織化学およびプロテオミクス
免疫組織化学法は、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのにも適当である。したがって、各マーカーに対して特異的な抗体もしくは抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が発現を検出するのに使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチンまたは酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼによる、抗体自体の直接標識化により検出されうる。あるいは、標識されていない第一抗体を、第１抗体に対して特異的な、抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識された第二抗体と共に使用する。免疫組織化学プロトコールおよびキットは、当技術分野で周知でありそして市販されている。
【００９０】
プロテオミクスを使用して、ある時点でのサンプル（例えば、組織、器官、または細胞培養物）中に存在するポリペプチドを分析することができる。特に、プロテオーム技術を使用して、サンプル中のポリペプチド発現の全体的変化を評価することができる（発現プロテオミクスとも呼ばれる）。プロテオーム分析は、典型的には、（１）二次元ゲル電気泳動(2-D PAGE)によるサンプル中の個々のポリペプチドの分離；（２）例えば、質量分析法またはＮ末端配列決定による、ゲルから回収された個々のポリペプチドの同定および（３）バイオインフォマティクスを使用するデータの分析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロフアイリングの他の方法に対する価値ある補足であり、そして単独でまたは他の方法と組み合わせて、本発明の増殖マーカーの産物を検出するのに使用することができる。
【００９１】
一旦腫瘍サンプル中の１つ以上の予後マーカーの発現レベルが評価されると、処置に応答する癌の尤度が決定されうる。本発明者等は、患者データセットにおいて、処置に応答しない（悪い予後）メラノーマに比べて処置に応答する（良好な予後）メラノーマにおいてディファレンシャルに発現される多数のマーカーを同定した。マーカーは表１に示されそして下記の実施例に示される。
【００９２】
ディファレンシャルに発現された遺伝子の選択
有意と思われる遺伝子の選択への早期のアプローチは、関心のある２つのグループ間での所与の遺伝子の「倍率変化」(fold change)を単に調べることを含んでいた。このアプローチは、最も劇的に変化すると思われる遺伝子に関して効果があるが、基本的統計学の考察は、分散（またはノイズレベル）が極めて高い（しばしばマイクロアレイ実験でみられるとおり）ならば、みかけは大きい倍率変化がただ偶然によるだけでしばしば起こりうることを認識させる。
【００９３】
マイクロアレイ実験、例えば本明細書で説明されたそれらは、典型的には、数千の遺伝子の同時測定を伴う。２つのグループ（例えば良好な予後の腫瘍と悪い予後マーカーの腫瘍）間での特定の遺伝子の発現レベルを比較している場合に、有意についての典型的な
検定（ｔ検定などの）は十分ではない。何故ならば、これは、数千の実験（この状況では、各遺伝子は「実験」を構成する）の群において、少なくとも１つの実験が偶然によるだけで通常の判断基準を通過する確率は本質的に一つ(unity)であるからである。有意についての検定において、典型的には、「帰無仮説」が正しいという確率を計算する。２つのグループを比較する場合に、帰無仮説は、２つのグループ間に差はないということである。統計的な検定がある閾値（通常０．０５または０．０１）以下で帰無仮説について確率を生じるならば、我々は帰無仮説を拒絶することができそして２つのグループは有意に異なるという仮説を受け入れることができるといわれる。明らかに、このような検定では、偶然のみによる帰無仮説の拒絶が２０回に１回（または100回に１回）期待されうる。有意についてのｔ検定のまたは他の同様な統計的検定の使用は、マイクロアレイに関しては、あまりにも多くの偽陽性（または第１種の過誤）を生じることになる。
【００９４】
このタイプの状況においては、同時に多数の仮説を検定する場合には、Bonferroni Method12などの典型的な多重比較法が適用される。しかしながら、このような検定は、大抵のマイクロアレイ実験のためにはあまりにも保守的であり、あまりにも多くの偽陰性（第二種の）誤りをもたらす。
【００９５】
より最近のアプローチは、所与の検定が有意であるための確率を適用する試みを捨て、そして予期される割合の第一種の過誤（または偽発見率(false discovery rate)13）がコントロールされるような実験のサブセットを選ぶための手段を確立することである。種々の実現(implementations)により；即ち、BRB Array Tools14およびBioconductorのlimma15,16 package（統計的環境Ｒ(R statistical environment)を使用する;17,18）を備えた方法によりこの研究で使用されたのはこのアプローチである。
【００９６】
データマイニングのための一般的方法：予後シグネチャーの発生
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すれば（通常）大容量のデータ（データセット）からの「ノーハウ」または予測能力を説明するために使用される用語である。これは、予後シグネチャーを発生させるのにこの研究で使用されたアプローチである。この研究の場合に、「ノーハウ」は、遺伝子発現測定またはシグネチャー（この節で一般的に述べられそして実施例の節で更に詳細に述べられた）の所与のセットから予後を正確に予測する能力である。
【００９７】
この研究で使用される方法のために使用される特定の詳細は、実施例１７−２０に記載されている。しかしながら、データマイニング法（実施例に記載の方法およびここで記載の方法の両方）のいずれの適用もこの一般的プロトコールに従うことができる。
【００９８】
データマイニング１９および関連した話題の機械学習２０は、１つ以上の適切なコンピュータソフトウエアパッケージ（下記参照）の使用を含む複雑な反復的な数学的タスクである。ソフトウエの使用は、一方では、正しい方法に忠実であるとの条件下に、データマイニング技術を成功的に使用するために各技術の背景の理論の複雑さに完全に習熟する必要はないという点で有利である。欠点は、データマイニングの適用がしばしば「ブラックボックス」：人がデータを挿入しそして答えを受け取る、と考えられうるということである。これがいかにして達成されるかは、しばしばエンドユーザーからマスクされており（これは説明した技術の多くについてそうである）そしてしばしばデータマイニングのために選ばれる統計的方法に影響を与えることがありうる。例えば、ニューラルネットワークおよびサポートベクターマシンは、エンドユーザーが決定をするのに使用される「ルール」を引き出すことを非常に困難にする特に複雑な実装を有する。他方、ｋ最近傍(k-nearest neighbours)および線形判別分析(linear discriminant analysis)は、ユーザーから隠されていない、決定をするための非常に透明なプロセスを有する。
【００９９】
データマイニングで使用される２つのタイプのアプローチがある：教師ありアプローチ(supervised approach)および教師なしアプローチ(unsupervised approach)。教師ありアプローチでは、カテゴリーデータ（例えば良好な予後対悪い予後）などのデータに連結されている情報は知られている。必要とされるのは、インプット変数に観測された応答（例えば、良好な予後対悪い予後）を連結する能力である。教師なしアプローチでは、データセット内のクラスは、前以て知られておらず、そしてデータマイニング技術は、データセット内のクラスまたは構造を発見することを試みるために使用される。
【０１００】
本実施例では、教師ありアプローチが使用され、そしてここで詳細に論議されるが、他の技術のいずれかを使用することも認識されるであろう。
【０１０１】
全体のプロトコールは、下記の工程を含む。
●データ表示
これは、選ばれたーデータマイニング技術で最も成功的に働きそうな形態にデータを変換することを含む。調査されるべきデータが遺伝子発現の相対的レベルを表すこの研究におけるように、データが数値である場合には、これは非常に簡単である。データが大きなダイナミックレンジを含むならば（即ち、多くの桁の大きさ）、しばしばデータの対数が採用される。別々の研究者による、別々の日の別々のサンプルの多くの測定値を含むならば、系統誤差が最小になることを確実にするよう、特に注意しなければならない。系統誤差（即ち、プロトコール差、機械差、オペレーター差および他の定量可能な因子から生じる誤差）の最小化は、ここでは「正規化」と呼ばれるプロセスである。
【０１０２】
●特徴選択
典型的には、データセットは、日々の基準で測定するのに実際的であるよりも多くのデータエレメントを含有し、そして更に予測モデルを作成するのに必要な情報を与えない多くのエレメントを含有する。予測モデルのデータセットを説明する実際の能力は、データセットの全次元(full dimensionality)のいくらかのサブセットから誘導される。これらの次元はデータセットの最も重要な成分（または特徴）である。マイクロアレイデータに関しては、データセットの次元は個々の遺伝子であることに留意されたい。ここで述べた文脈において、特徴選択は、最も「ディファレンシャルに発現される」これらの遺伝子を発見することを含む。より一般的な意味においては、それは、有意についてのいくらかの統計的検定に通るこれらのグループを含む、即ち、調査されているグループの一方もしくは他方において一貫してより高いかまたはより低い特定の変数のレベルである。時には、特徴は、最も大きい分散を示すこれらの変数（または次元）である。
【０１０３】
特徴選択の適用は、予測モデルを作り出すのに使用される方法とは完全に独立であり、そして所望の結果を達成するための多量の実験を含む。本発明内では、有意な遺伝子の選択は、特徴選択を伴う。更に、データ縮小(data reduction)の方法（主成分分析などの）をデータセットにアプリケーションすることができる。
【０１０４】
●トレーニング
一旦クラス例えば、良好な予後／悪い予後）および選択の特徴が確立されそしてデータがデータマイニングのためのインプットとして受け入れ可能な形態で表示されると、縮小したデータセット（特徴で述べられたとおりの）を選択された予測モデルにアプリケーションする。このモデルのためのインプットは、関連したアウトプット（クラス標識または応答）とともに、通常多次元数値インプット（ベクトルとして知られた）の形態にある。トレーニングプロセスにおいては、選択されたデータは、順次に（ニューラルネットワークなどの技術において）またはまとめて（線形モデル、線形判別分析、サポートベクターマシンなどのいくつかの回帰を適用する技術において）予測モデルにインプットされる。ある場合には（例えばｋ最近傍）、データセット（または特徴選択の後に得られたデータセットのサブセット）は、それ自体モデルである。論議されたとおり、有効なモデルは、成功的結果を最ももたらしそうであるとエキスパートアナリストによりモデルのパラメーターが 予め決定されている種々のソフトウエアパッケージの使用により、詳細な数学の最小の理解で確立されうる。
【０１０５】
バリデーション
これは、データマイニングプロトコールのキー成分であり、そしてこれの誤ったアプリケーションは、しばしば誤りに導く。データセットの一部は、予測モデルの成功を検定するために、特徴選択およびトレーニングとは別に、取っておくべきである。更に、パリデーションの結果がモデルの特徴選択およびトレーニングを行うのに使用されるならば、モデルが実生活の状況にアプリケーションされる前に、モデルを検定するための更なるバリデーションセットが得られる。このプロセスが厳密にモデルに忠実でない(not adhered)ならば、モデルは、実世界の状況において失敗する可能性が高い。バリデーションの方法は以下に更に詳細に述べられる。
【０１０６】
●アブリケーション
モデルが構築されそしてバリデーションされると、それはエンドユーザーに受け入れられうるような方法でパッケージされなければならない。これは、しばしば、モデルが埋め込まれているスプレッドシートアプリケーションのある形態の実装、統計的ソフトウエアパッケージのスクリプティング、または情報技術スタッフによるハードコーデッドアプリケーション(hard-corded application)へのモデルのリファクタリングを含む。
【０１０７】
しばしば使用されるソフトウエアパッケージの例は、
多数のベンダーから得られるスプレッドシートプラグイン(spreadsheat plugins)、
統計的環境Ｒ（R statistical environment）、
市販のパッケージMatlab、 S-Plus、 SAS、 SPSS、 STATA、
フリーオープンソースソフトウエア(free open-source software)、例えばＯｃｔａｖｅ（MatLabクローン）
市販のクローズドソースセッティング(closed-source setting)における予測モデルを実装するのに使用されうる多くのおよび多様なＣ＋＋ライブラリー。
【０１０８】
データマイニング法の例
本発明の方法は、最初にデータマイニング（上記）の工程を引き受け、次いで適切な既知のソフトウエアパッケージをアプリケーションすることにより行うことができる。データマイニングのプロセスの更なる説明は多くの極めてよく書かれているテキストに詳細に記載されている１９。
【０１０９】
●線形モデル１９，２１
データは、線形回帰モデルのインプットとして処理され、そのクラス標識または応答変数はアウトプットである。クラス標識または他のカテゴリーデータは、数値（通常整数）に変換されなければならない。一般化された線形モデルにおいては、クラス標識または応答変数は、それ自体はインプットデータに線形で関係していないが、「連結関数」の使用により変換される。ロジスティック回帰は、一般化された線形モデルの最も普通の形態である。
【０１１０】
●線形判別分析(linear discriminant analysis)19. 22. 23
データが線形に分離可能である（即ち、データのグループまたはクラスが、閾値のｎ次元拡張である超平面により分離されうる）との条件下で、この技術は適用されうる。変数の組み合わせは、グループ間分散が最大化されそしてグループ内分散が最小になるように、クラスを分離するのに使用される。この副産物は、分類ルールの形成である。未知のクラスのサンプルへのこのルールの適用は、クラス所属関係の予測または分類がそのサンプルについてなされることを可能とする。マイクロアレイ分析のために普通に使用されるニアレストシュランケンセントロイド（nearest shrunken centroids）などの線形判別分析の変形もある。
【０１１１】
●サポートベクターマシン２４
変数のコレクションを重量のコレクションとともに使用してこれらの重り付き変数によってクラス間の分離を最大化するモデルを決定する。次いでこのモデルのサンプルへの適用は、そのサンプルの分類またはクラス所属関係の予測を生じさせる。
【０１１２】
●ニューラルネットワーク23
データは、ノードのネットワークへのインプットとして処理され、ノードのネットワークは、表面的には生物学的ニューロンに似ており、インプットをすべてのノードからそれらが連結されているノードにアプリケーションし、そしてインプットをアウトプットに変換する。普通は、ニューラルネットワークは、「乗算および和算アルゴリズム」(multiply and sum algorithm)を使用して、多数の接続されたインプットノードからのインプットをシングルアウトプットに変換する。ノードは、そのノードへのインプットがある閾値を超えないならば、必ずしもアウトプットを生成しなくてもよい。各ノードは、そのインプットとしていくつかの他のノードからのアウトプットを有し、最終アウトプットノードは通常カテゴリー変数に連結されている。ノードの数およびノードのトポロジーは、殆ど無限に変わることができ、他の方法では分類することができないことがある非常にノイズのあるデータを分類する能力を与える。ニューラルネットワークの最も普通の実装は、多層パーセプトロンである。
【０１１３】
●分類および回帰木２５
これらにおいては、変数は、段階的方式でたどられる(followed)ことができるルールの階層制(hierarchy of rules)を規定して、サンプルのクラスを決定するのに使用される。典型的なプロセスは、特定のクラスアウトプットまたは識別できないことの特定の説明をもたらすルールのセットを創り出す。例としての分類木は、下記のようなアルゴリズムの実装である。
if gene A> x and gene Y> x and gene Z=z
then
class A
else if gene A=q
then
class B
【０１１４】
最近傍法(nearest neighbor methods)２２，２３
予測または分類は、サンプル（未知のクラスの）をその周囲のサンプル（既知のクラスの）と比較することによりなされ、近さ（closeness）は距離関数により定義される。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。普通に使用される距離関数は、ユークリッド距離（三角測量におけるようにピタゴラスの距離のｎ次元への拡張、種々の形態の相関（ピアソン相関係数を含む）である。普通は意味のある距離メトリック(meaningful distance metric)により相互連結されないデータ点を、ユークリッド距離が適用されうるように、ユークリッド空間に変換する変換関数もある（例えばマハラノビス距離）。距離メトリックは極めて複雑でありうるけれども、ｋ最近傍の基本的前提は極めて単純であり、本質的に未知のインプットに最も類似したｋデータベクトルを「発見することの」言い換えであり、それらがどのクラスに対応するかを発見し、そして未知のインプットがどのクラスであるかに関して票決する(vote)。
【０１１５】
●他の方法
ベイジアンネットワーク
有向非環式グラフ(directed cyclic graph)を使用して変数のコレクションをそれらの同時確率分布(joint probability distribution)と共に表示し、次いでこれを使用してサンプルのクラス所属関係の確率を決定する。
独立したシグナル（例えばクラス所属関係）が変数のコレクシヨンから分離される（成分に）独立成分分析。次いでこれらの成分を使用して、サンプルのクラス所属関係の分類または予測を作成することができる。
予測方法のコレクションを組み合わせてサンプルのクラス所属関係の同時分類または予測(joint classification or prediction) を作成するアンサンブル学習法。
【０１１６】
探索されうるこれらの方法の多くの変法があり１９、そして多くの新しい方法が絶えず定義されそして開発されている。許容しうる結果を得るために、これらの方法のいずれかを適用することができることは当然である。過学習(overfitting)を回避するために、包括的バリデーションスキーム(comprehensive validation scheme)によりすべての結果を検定することを確実にすることによって、特別な注意を払わなければならない。
【０１１７】
バリデーション
説明した予測方法のいずれかのアプリケーションは、この方法を新しいデータセット（例えば臨床試験からのデータ）にアプリケーションすることができる前に、トレーニングとクロスバリデーション１２，２６の両方を伴う。トレーニングは、関心のあるデータセット（この場合にメラノーマからの遺伝子発現測定値）のサブセットを、それが検定されるべきクラス（この場合に急速な進行の良好な尤度または悪い尤度を有する腫瘍）を横切って階層化されるように、採用することを含む。このトレーニングセットを使用して予測モデル（上記した）を発生させ、これはデータの残り検定セット）に関して検定される。
【０１１８】
検定セットのより良好な性能を得るように予測モデルのパラメーターを変えることが可能であるが、これは過学習として知られた状況をもたらすことがあり、過学習においては、予測モデルはトレーニングデータセットには働くが、任意の外部のデータセットには働かない。これを回避するために、バリデーションのプロセスが続く。典型的に適用される２つの主要なタイプのバリデーションがあり、第1（ホールドアウトバリデーション）は、データセットを、３つのグループ：検定、トレーニングおよびバリデーションに分配することを含む。バリデーションセットは、なんであれ、トレーニングプロセスへのインプットを持たず、それにより検定セット（しかしバリデーションセットではない）へのアプリケーション期間中、パラメーターの任意の調節または他のリファインメントを行わなければならない。第２の主要なタイプは、クロスバリデーションであり、これは下記したいくつかの異なる方法でアプリケーションされうる。
【０１１９】
２つの主要なタイプのクロスバリデーションがある：Ｋ分割クロスバリデーション（K-fold cross-validation)およびリーブワンアウトクロスバリデーション(leave-one-out cross-validation)。
【０１２０】
Ｋ−分割クロスバリデーション：データセットをＫ個のサブサンプルに分割し、各サブサンプルはオリジナルとほぼ同じ割合のクラスグループを含有する。
【０１２１】
バリデーションの各ラウンドにおいて、Ｋ個のサブサンプルの１つを取って置き、データセットの残りを使用してトレーニングを達成する。そのラウンドのトレーニングの有効性は、残して置いたグループの分類がいかに正確であるかにより判定される。この手順をＫ回繰り返し、そして全体の有効性は、既知のクラスとの予測されたレベルの比較により確認される。
【０１２２】
リーブワンアウトクロスバリデーションは、：Ｋ＝ｎ（ここでｎはサンプルの数である）である、Ｋ分割クロスバリデーションのよく使用される変法。
【０１２３】
ＭＰＭＳの組み合わせ，例えば表１に上記したＭＰＭＳの組み合わせを使用して予後のための予測モデルを構築することができる。
【０１２４】
予後シグネチャー
これらのマーカーの１つ以上を含む予後シグネチャーを使用して、シグネチャー由来の１つ以上の予測モデルのアプリケーシヨンにより患者のアウトカムを決定することができる。特に、臨床医または研究者は、シグネチャーにおける１つ以上のマーカーのディファレンシャルな発現（例えば、増加した発現または減少した発現）を決定し、予測モデルをアプリケーションし、それによりネガティブな予後、例えば患者の疾患再発の尤度、またはポジティブな予後（連続した寛解）の尤度を決定することができる。
【０１２５】
予後シグネチャーを開発した。下記実施例で述べられるとおり、２２の遺伝子を含む予後シグネチャーをメラノーマを有する患者のセットから確立した（表１）。患者サンプル（例えば腫瘍サンプル）を得、そしてサンプルにおける１つ以上のマーカーの発現レベルをディファレンシャルナ発現プロフィルにマッチングさせることにより、癌進行の尤度を迅速に決定することができる。
【０１２６】
薬物試験
本発明は、特定の薬物試験のための個体を選択するのに使用することもできる。メラノーマを有する個体の予後を確立することにより、患者が応答しそうな慣用の処置を受けるべきかどうか、または患者が特定の薬物試験に参加するべきかどうか、即ち、特定の腫瘍タイプもしくは腫瘍段階を目標とするべきかどうかに関してより良い決定をすることができる。
【０１２７】
疾患進行への短い予測時間を有する患者の選択は、薬物試験の期間を短縮することも可能とし、そして記録されるべきより少数の患者が統計的に有意な薬物応答データを達成することを可能とする。
【０１２８】
実施例
ここに述べられた実施例は、本発明の態様を説明する目的のためである。他の態様、方法および分析のタイプは、分子診断技術分野における当業者の範囲内にあり、ここで詳細に述べる必要はない。当技術分野の範囲内の他の態様は、本発明の一部であると考えられる。
【０１２９】
段階ＩＩＩメラノーマにおける臨床アウトカムに影響を与えることがある腫瘍内の生物学的メカニズムを調査するために、段階ＩＩＩＢおよびＩＩＩＣメラノーマのリンパ節切除後の様々な臨床的アウトカムを有する患者からの２９のメラノーマ標本の最初の検定セットに関して遺伝子発現プロフィル化を行った。次いでこれを使用して、１０人の患者および１４人の患者を含む2つの独立したバリデーションセットにおける分子プロフィルに基づいて、臨床的アウトカムを将来的に予測した。この分子情報を使用して、2つの患者グループ間でディファレンシャルにレギュレーションされることができるそして治療介入のための可能なターゲットである、細胞経路およびネットワークも同定された。
【０１３０】
物質および方法
マイクロアレイ分析のための標本採集および選択
行われた実験の全体的なスキームを図３に示す。Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈで１９９７〜２００４年の間に臨床的に触診可能な節の外科リンパ節切除を受けた２９人の患者からのｅｘ ｖｉｖｏメラノーマ組織をマイクロアレイ分析のために選択した。すべての標本は、Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈヒト調査倫理委員会により認可された組織入手プロトコールの下にそして各患者の書面のインフォームドコンセントを伴って採集された。急に凍結した標本を最適切削温度化合物（ＯＣＴ）中に包埋しそしてＬｕｄｗｉｇ／Ａｕｓｔｉｎ組織バンク貯蔵室内に−８０℃で組織ブロックとして貯蔵した。すべての場合に診断は病理学者により確認された。
【０１３１】
患者サンプルは、段階ＩＩＩから段階ＩＶ疾患への腫瘍進行に要した時間（ＴＴＰ）に基づいてマイクロアレイ分析のために選択され、そして１6人の「悪い」（平均ＴＴＰ４か月）予後の患者および１３人の「良好な」（平均ＴＴＰ４２か月）予後の患者を含んでいた。専用のメラノーマユニットにおける手術後の検査を、リンパ節切除後の最初の１２カ月間毎月行い、次いで臨床的必要に従ってその後３か月および６カ月検査を４年まで行い、その後年に１回の検査を行った。段階調査は、臨床的疑いに応じてまたはルーチンに3〜６か月ごとに行った。
【０１３２】
組織は、最小の壊死が存在しそして腫瘍細胞が全細胞集団の少なくとも６０％を含むならばこの研究のために許容されうると考えられた。ＲＮＡ抽出時に、２つの５μm切片を切断しそしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、抽出された組織のインテグリティーを確実にした。
【０１３３】
RNA抽出およびcDNA合成
cDNA合成および共通の参照デザインとのハイブリダイゼーションを２９人の選択された患者について二重に(in duplication)行った。トータルRNAを、OCT包埋した組織から、組織切片をＴｒｉ試薬（Molecular Research Ｃenter, Cincinnati, OH）中に浸漬および均質化することにより抽出し、クロロホルム１．５ｍＬを均質化物に加え、サンプルを遠心しそして上部層を取り出し、そして１００％エタノールと混合した。ＲＮｅａｓｙカラムを使用する精製を、製造者のインストラクション（Quiagen, Valencia, CA）に従って行った。ＲＮＡ品質を２６０：２８０吸光度の比に基づいて確認し、そしてインテグリティーをｒＲＮＡ標準マーカーに対してホルムアルデヒド−アガロースゲル上で検査した。オリゴ（ｄＴ）およびアミノアリルデオキシヌクレオチドの存在下にＲＮＡ２０μｇからｃＤＮＡを合成した。Ｃｙ染料（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）を腫瘍ｃＤＮＡおよび並行して産生された参照ｃＤＮＡにカップリングさせた。参照ｃＤＮＡをメラノーマを含む種々の腫瘍および細胞系からのプールされたＲＮＡおよび正常な組織からのプールされたＲＮＡから合成した（図４）。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドアレイおよびデータ分析
個々の遺伝子および内部コントロールを表す３０，８８８のオリゴヌクレオチドプローブを、ＭＷＧ Biotech(Erbesberg, Germany)から入手し、そしてＯｍｎｉｇｒｉｄロボット(Gene Machines, San Carlos, CA)を使用して高密度アレイとしてスポットした。標識された腫瘍／参照ｃＤＮＡを共ハイブリダイゼーションし、そしてＧｅｎｅｐｉｘ ４０００Ａマイクロアレイスキャナー(Axon Insruments, Union City, CA)を使用してスキャニングした。マトリックスオーバーレイをスキャニングされたイメージにアラインさせ、そして特徴抽出を、Gene Pix v.6.0ソフトウエア(Axon Insruments, Foster City, CA) を使用して行った。生のデータをGeneSpring v7.2(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を使用して分析した。データをプリントチップグループ(print-tip group)に対して正規化し、次いでメディアン正規化した(median normalized)。簡単にいえば、ｌｏwｅｓｓ曲線を対数密度プロット対対数比プロットに適合させた。データの２０％を使用して各点におけるｌｏｗｅｓｓ適合を計算した。この曲線を使用して各測定値についてコントロール値を調節した。次いで各遺伝子をすべてのサンプルにおけるその測定値のメデイアンにより除した。
【０１３５】
ＥＯＲＴＣメラノーマ研究２７からの独立したバリデーションセットについてのデータは、Array Express公的データ貯蔵所:http//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/を通じて入手可能となった。データをGenespring v7.2にアップロードし、そしてスポットにつき、チップにつきおよび遺伝子につき正規化した。簡単に言えば、各遺伝子の測定された強度を、各サンプルにおいけるそのコントロールチャネル値により割り、次いでそのサンプルにおけるすべての測定値の第５０百分位数(５０th percentile)により除した。最後に各遺伝子を、すべてのサンプルにおけるその測定値のメディアンで除した。ディファレンシャルに発現された遺伝子についての発現値を使用して、下記したとおりの予測スコアを計算した。
【０１３６】
統計的方法
遺伝子発現データを、最初に、すべてのサンプルにおいて存在しなかったプローブを排除するフィルターに供した。考慮された最初の３０，８８８のプローブの内、１８，８０７はこのフィルターに通しそして分散分析、階層的クラスタリング(hierarchical clustering)および主成分分析のために使用された。ディファレンシャルに発現された遺伝子は、０．０５のｐ値カットオフに基づく多重検定補正(multiple testing correction)のために補正するのに使用されるBenjamini and Hochbergの偽発見率制御方法(false discovery rate controlling method)２８と共に、ウイルコクソン−マン−ホイットニー検定(Wilcoxon-Man-Whitney test)を行うことにより発見された。サンプルの階層的クラスタリングは、距離関数としてスピアマン相関(Spearman correlation) および平均リンケージ(average link)を使用して行われた。
【０１３７】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
アレイ結果を確かめるためにディファレンシャルに発現された遺伝子に関してｑＰＣＲを行い、次いでバリデーションセットＡを使用して予測子をバリデーションするのに行った。第１鎖ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマープライマー(Promega, Madison, WI)を使用して、アレイ実験のために抽出されたトータルＲＮＡ２μｇから合成した。逆転写を省くことによりネガティブコントロールを得た。Universal Probe Library アッセイデザインセンターhttps://www.roche-applied-science.com（Roche, Mannheim, Germany) を使用して、イントロンスパニングマルチプレックスアッセイをｑＰＣＲのためにデサインした（アッセイデザインについては図５参照）。すべての反応は、ＡＢＩ ７７００配列検出器(Applied Biosystems, Foster City,CA)を使用して二重に行った。サーマルサイクラー条件は、下記のとおりであった：５０℃２分間、９５℃１０分間、続いて４０サイクルの９４℃で２０秒および６０℃で４５秒。すべての結果を１８Ｓ増幅に対して正規化した(Applied Biosystems, Foster City, CA)。本発明者らは、本発明者らのコンパレーターとして参照のためのターゲット閾値（ＣＴ）の値を使用して相対的発現を計算した２９。
【０１３８】
次いで個々の遺伝子についての相対的発現値を、正規化されたｌｏｇ２比アレイ値および計算された相関係数を一緒にプロットした。
【０１３９】
結果
検定セットおよびバリデーションセットＡに含まれた患者の臨床的特徴および病理学的特徴を列挙する（図６）。全ての患者は、最初の診断時の年齢、性およびポジティブなリンパ節転移の数および位置に関する情報を有していた。すべてではない患者が本発明者らの病院で初期診断をされ、それ故いくらかの症例では原発性メラノーマにおいて潰瘍化が存在していたかどうかを確かめることはできなかった。原発性メラノーマにおける潰瘍化は、もし存在するならば疾患をＩＩＩＢからＩＩＩＣに段階を上げる独立した予後因子である３０。
【０１４０】
「良好な」予後グループの平均ＴＴＰは、「悪い」グループの４カ月に比べて４０カ月であった。「良好な」グループはより若く見えそしてより多くの女性を含んでいたけれども、グループ間でメデイアン年齢および性における統計的に有意な差はなかった。サンプルサイズの限界はあったけれども、ＡＪＣＣ病期分類、アジュバントインターフェロンの使用および腫瘍浸潤リンパ球の存在を含む他の既知の予後特徴において統計的に有意な差はなかった。
【０１４１】
１人の患者は、切除された脾臓に限られた孤立した段階ＩＶ疾患を有していたが、彼らが無病であることを考えて、このサンプルは含められた。このサンプルの排除は遺伝子発現プロフィルを変えなかった。
【０１４２】
ディファレンシャルに発現された遺伝子は、２つの予後グループを分離する。
教師なしの階層的クラスタリングは、予後とも他の臨床的情報とも相関しないメラノーマのサブグループを示さなかった。これはサンプル間の類似性を考えると予期されたことであった。予後グループを有効に分離することができた遺伝子を調査するために、ディファレンシャルな遺伝子発現を調べた。２，１４０の遺伝子が２つのグループ間でディファレンシャルに発現されたが、しかしながら、多重検定補正の厳格な適用は、これを高度に有意なディファレンシャルな発現を有する２２の遺伝子に減少させた（図１）。２２の遺伝子を、ｑＰＣＲを使用してトレーニングセットにおいて更にバリデーションし、そして２つのプラットフォーム間で最も高い相関係数を有する遺伝子（ｒ＞０．５、ｐ＜０．０５）が更なる分析のために選ばれた（データは示されていない）。最初の２２の内、１５の遺伝子は高いクロスプラットホーム相関(cross-platform correlation)を示し、そしてこれらは予測スコアの開発のために使用された。主成分分析は、１５の遺伝子の予後グループを分離する能力を証明した（図７）。
【０１４３】
予測スコアの開発
最初の検定セットを使用して２つの独立したバリデーションセットに関して検定された予測子を開発した。２つの予測アルゴリズムは、アレイデータおよびｑＰＣＲデータに基づいて開発された。
【０１４４】
１．アレイデータ（ａＰＳ）についての予測スコアを計算するために、アレイとｑＰＣＲとの間の最も有意な相関を有する１５の遺伝子を使用した。正規化されたｌｏｇ２発現比は、その値を２乗することにより変換された。「良好な」予後グループにおいてダウンレギュレーションされた遺伝子はネガティブな値に帰された。次いですべての１５の遺伝子についての値の和により最終スコアを計算した。ポジティブなスコアは改善されたアウトカムと関連していた。
【０１４５】
２．ｑＰＣＲデータ（ｑＰＳ）について、１５の最も相関した遺伝子についてのΔΔＣＴ値をAkaike Information Criterionnを利用するロジスティック回帰アルゴリズムにアプリケーションしてクラス識別に寄与する遺伝子のみを選択した。これは５つの有意な遺伝子を選択し、これらは次いで下記式において使用された：
qPS=[1328.15-187.42(IDH)+137.10(MFG8)+73.61(PILRA)+211.22(HLA-E)+143.94(TXNDC5)]×-1
ａＰＳに関すると同じく、ポジティブスコアは、この方法を使用して改善されたアウトカムと関連していた。
【０１４６】
予測スコアはＴＴＰおよび全生存期間と相関する
予期されたとおり、検定セットにアプリケーションされたａＰＳおよびｑＰＳの両方が、２つの予後グループを識別することができた。個々のスコアの大きさ（ａＰＳによる高いスコアおよびｑＰＳでのネガテイブスコア）がｑＰＳおよびａＰＳの両方について改善されたアウトカムと相関するような（図８、スピアマン順位相関、ｒ＝０．７９０８、ｐ＜０．０００１）、個々のスコアとＴＴＰおよび全生存期間との強い相関は明白であった。これは、これらのディファレンシャルに発現された遺伝子の発現レベルが、臨床的アウトカムに直接影響を与える基礎をなす生物学的機序に関係することを示唆しており、それらの予後の妥当性を強調している。
【０１４７】
３つの独立したセットへの予測スコアのアプリケーション
次いで結果を、独立に発生させたデータにアプリケーションした。我々自身に類似した患者のサブグループに関する１つの公表されたデータセットが同定された。この研究２７においてプロフィル化された８３人の患者の内、１４人は長期追跡により段階ＩＩＩ疾患を有していた。このサブグループでは、我々の検定セットにおいて適用された同様な基準を使用して、１０人の患者は「悪い」として分類され（平均ＴＴＰ１０カ月）、そして４人は「良好」として分類された（平均ＴＴＰ６２カ月）。ａＰＳアルゴリズムをこれらのサンプルにアプリケーションすると、すべての１０人の「悪い」患者および４人の「良好な」患者の内２人は正しく予測され、８５％の総合的な正しい分類率(overall correct classification rate)を生じる。
【０１４８】
次いで、我々は、Ｌｕｄｗｉｇ／Ａｕｓｔｉｎ組織バンクからの１０の腫瘍の独立したセットにｑＰＳアルゴリズムをアプリケーションし、これらに対するｑＰＣＲアッセイを５つの最も強力な予測性の遺伝子を使用して行った。予測子は「良好な」予後の腫瘍の５つのすべてを正しく分類したが、５つの「悪い」サンプルの１つを間違って分類した（図９）。間違って分類された「悪い」サンプルは、ＴＴＰは短いが転移疾患を伴って６年という長期の全生存期間を有した患者を表した。
【０１４９】
５つの遺伝子ｑＰＳも、段階３メラノーマサンプルの第３の独立したセットにアプリケーシヨンした。これらのサンプルは、段階３疾患の診断の後１８か月以下の生存期間を有する１９人の患者および段階３診断から４年より長く生存した更なる１８人の患者からなっていた。これらの良好な予後グループからのｑＰＳスコアの分布と悪い予後グループからのｑＰＳスコアの分布は、有意に異なっており（ｐ＝０．０２）そして図１０に示される。
【０１５０】
検討
この実施例は、マイクロアレイ遺伝子発現データおよびｑＰＣＲから誘導された発現プロフィルを使用して段階ＩＩＩメラノーマ患者の他の方法では識別できないグループにおける臨床的アウトカムの成功した予測を示す。２つの独立したセットにおいて、１５のディファレンシャルに発現された遺伝子に基づく２つの開発された予測スコアアルゴリズムを、マイクロアレイおよびｑＰＣＲデータにアプリケーションして、段階ＩＩＩＢ／Ｃメラノーマを有する患者における臨床的アウトカムを将来的に予測することができることが確立された。
【０１５１】
これらの患者は、同様な段階の疾患について選ばれ、そしていくつかの研究は、同様な段階の疾患を有する患者間よりも異なる段階で採取された自己由来のサンプル間の遺伝子発現のより高い類似性を証明した２７、３１、３２。９２％以下の正確度でアウトカムを将来的に予測するのに使用されうるグループ間でディファレンシャルに発現された遺伝子があるという観察は、それらの重要性を強調する。更に、ＴＴＰおよび全生存期間の両方との予測子の相関は、スコアの差の大きさが臨床的アウトカムと直接相関するような予測子の有用性も強調する。
【０１５２】
説明において、既知の均等物を有する整数または成分に関して言及された際、このような均等物は、あたかも個々に説明されたかのように、本明細書に組み込まれる。本発明は、実施例としておよびその可能な態様に関して説明されているけれども、本発明の範囲から逸脱することなく改善および／または改変がなされうることは認識されるべきである。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
工業的用途
予後癌マーカー、特にメラノーマ予後マーカーに基づく本発明の方法、成分、キットおよび装置は、癌、特にメラノーマの予後および処置のために有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）を含む、メラノーマの進行の危険を決定するための予後シグネチャー。
【請求項２】
ＭＰＭが表１から選ばれる、請求項１に記載のシグネチャー。
【請求項３】
表面に１つ以上のロケーションを有する基材を含み、各ロケーションはそこに２つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、各オリゴヌクレオチドは１つ以上のＭＰＭから選ばれる、メラノーマの予後を決定するための装置。
【請求項４】
前記２つ以上のオリゴヌクレオチドが表１から選ばれるＭＰＭである、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
患者におけるメラノーマの予後を決定するための方法であって、下記工程：
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいて、ＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプライすることにより確立された予測モデルをアプライする工程、
（ｉｉｉ）予後を確立する工程、
を含む方法。
【請求項６】
薬物試験に対するメラノーマ患者の適性を決定するための方法であって、下記工程：
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいて、ＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプライすることにより確立された予測モデルをアプライする工程、
（ｉｉｉ）試験に対する患者の適合性を確立する工程、
を含む方法。
【請求項７】
ＭＰＭが表１から選ばれる、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記予測方法が、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類および回帰木、アンサンブル学習方法、判別分析、最近傍法、ベイジアンネットワーク、独立成分分析からなる群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、前記ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチドを使用して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、フォアードプライマーおよびリバースプライマーを使用するｑＰＣＲ法を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、請求項３または請求項４に記載の装置を使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのタンパク質の発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのペプチドの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記検出する工程が、各マーカーに向けられた抗体を使用して行われる、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出する工程がサンドイッチ型イムノアッセイ法を使用して行われる、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がポリクローナル抗血清である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
２つ以上のメラノーマ予後マーカー（ＭＰＭ）を含む、メラノーマの進行の危険を決定するための予後シグネチャー。
【請求項２】
ＭＰＭが表１から選ばれる、請求項１に記載のシグネチャー。
【請求項３】
表面に１つ以上のロケーションを有する基材を含み、各ロケーションはそこに２つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、各オリゴヌクレオチドは１つ以上のＭＰＭから選ばれる、メラノーマの予後を決定するための装置。
【請求項４】
前記２つ以上のオリゴヌクレオチドが表１から選ばれるＭＰＭである、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
患者におけるメラノーマの予後を決定するための方法であって、下記工程：
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいて、ＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプライすることにより確立された予測モデルをアプライする工程、
（ｉｉｉ）予後を確立する工程、
を含む方法。
【請求項６】
薬物試験に対するメラノーマ患者の適性を決定するための方法であって、下記工程：
（ｉ）患者からのメラノーマ腫瘍サンプルにおいて、ＭＰＭの発現レベルまたは２つ以上のＭＰＭを含む予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程、
（ｉｉ）予後が良好な腫瘍サンプルおよび予後が悪い腫瘍サンプルにおけるＭＰＭの発現レベルまたは予後シグネチャーの発現レベルに予測方法をアプライすることにより確立された予測モデルをアプライする工程、
（ｉｉｉ）試験に対する患者の適合性を確立する工程、
を含む方法。
【請求項７】
ＭＰＭが表１から選ばれる、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記予測方法が、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類および回帰木、アンサンブル学習方法、判別分析、最近傍法、ベイジアンネットワーク、独立成分分析からなる群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、前記ｃＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチドを使用して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、フォアードプライマーおよびリバースプライマーを使用するｑＰＣＲ法を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、請求項３または請求項４に記載の装置を使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのタンパク質の発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＭＰＭまたは予後シグネチャーの発現レベルを決定する工程が、各マーカーのペプチドの発現レベルを検出することにより行われる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記検出する工程が、各マーカーに向けられた抗体を使用して行われる、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出する工程がサンドイッチ型イムノアッセイ法を使用して行われる、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がポリクローナル抗血清である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５２７６０４（Ｐ２０１０−５２７６０４Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９２９３（Ｐ２０１０−５０９２９３）
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００８／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３５３３
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【出願人】（５０３４１２３７７）ルートヴィヒ・インスティチュート・フォー・キャンサー・リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００８／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３５３３
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【出願人】（５０３４１２３７７）ルートヴィヒ・インスティチュート・フォー・キャンサー・リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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