モノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法
【課題】リパーゼ活性を損なうことなく高純度のモノアシルグリセロールを効率良く製造する方法を提供すること。
【解決手段】脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【解決手段】脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアシルグリセロール高含有油脂を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノアシルグリセロール（以下、「モノグリセリド」又は「モノグリセライド」と記載することもある）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用され、最近、モノアシルグリセロールの優れた生理活性に着目した食品が注目されている。このモノアシルグリセロールを得るため、脂肪酸又は脂肪酸メチルとグリセリンを反応させる方法、あるいは油脂とグリセリンを、高温下で金属触媒を添加して化学反応させる方法が用いられている。
【０００３】
脂肪酸を原料として用いるモノアシルグリセロールの製造法として、エステル化法、エステル交換法又はグリセロリシス法等が挙げられる。
例えば、部分グリセリドリパーゼの存在下、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセロールとを反応させるモノグリセライドとジグリセライドの混合物の製造方法（特許文献１）が知られている。
また、Penicillium camembertii モノ及びジグリセリドリパーゼの存在下、共役リノール酸に対してモル比で３倍以上の過剰量のグリセリンを使用し、５℃で反応させるモノグリセリドの製造方法（特許文献２）が知られている。
【０００４】
一方、炭酸カルシウムに固定化したPseudomonas sp.由来リパーゼの存在下、高度不飽和脂肪酸に対してモル比で３０倍以上のグリセリンを使用し、反応させるモノグリセリドの製造方法（特許文献３）が知られている。
【０００５】
そこで、脂肪酸とグリセリンを反応させてモノアシルグリセロール高含有油脂を効率よく製造する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−１８１３９０号公報
【特許文献２】特許第３９７０６６９号公報
【特許文献３】特許第３８６１９４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記従来技術のうち、金属触媒を用いる化学反応は２００℃以上の高温であるため、原料に不飽和脂肪酸を多く含む場合には劣化が生じ易い点、また、金属触媒の完全除去が困難である点等から、その適用が問題とされてきた。また、前記部分グリセリドリパーゼを用いる技術（特許文献１）では、反応の進行と共にモノアシルグリセロール濃度（モノアシルグリセロール／原料）は低下するので、モノアシルグリセロールの純度を上げるためにはエステル化反応の後に精留等の精製工程が必要となり、製造効率の点で課題がある。更に、前記モノ及びジグリセリドリパーゼを用いる技術（特許文献２）では、リパーゼの至適温度ではない低温で行われるため反応効率が良くない。また、炭酸カルシウムに固定化したリパーゼを用い脂肪酸に対してモル比で３０倍以上のグリセリンを使用する技術（特許文献３）では、モノグリセリド濃度は１６．７％に過ぎない。
【０００８】
本発明は、脂肪酸とグリセリンを原料とし、リパーゼ活性を損なうことなくモノアシルグリセロールを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを固定化酵素である固定化部分グリセリドリパーゼを用いて反応させる際、意外にも酵素固定化用担体（以下、固定化担体とも云う。）の量に対して部分グリセリドリパーゼの使用割合を多くして調製した固定化部分グリセリドリパーゼではモノアシルグリセロールの生産効率が低くなるのに対し、固定化担体の量に対して部分グリセリドリパーゼの使用割合を少なくするとモノアシルグリセロールの生産効率が高まることを見出した。更には、固定化担体の表面積がモノアシルグリセロールの生産効率に関与していることも見出し、固定化担体の単位面積あたりのエステル化活性が特定範囲となるように調製された固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させると、高い反応率で高純度のモノアシルグリセロールを製造できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法によれば、高純度のモノアシルグリセロールが効率良く得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本願発明で使用する固定化部分グリセリドリパーゼは、部分グリセリドリパーゼが固定化担体に固定化されたものである。本発明において、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性（以下「Ａ値」と記載する）は、平均粒径の分かっている担体にリパーゼを固定化してエステル化活性を測定し、当該測定に用いた固定化部分グリセリドリパーゼの質量、及び担体の平均粒径から求めた担体の単位質量あたりの比表面積から、次の式（１）に従って求める。
【００１３】
Ａ〔Ｕ／ｍ2〕＝固定化リパーゼのエステル化活性〔Ｕ〕／（固定化担体比表面積〔ｍ2／ｇ〕×固定化リパーゼ質量〔ｇ〕）・・・式（１）
【００１４】
本発明においては、式（１）中の固定化リパーゼのエステル化活性〔Ｕ〕は、脂肪酸とグリセリンを合計で１００ｇ、脂肪酸／グリセリンをモル比０．６で混合し、これに固定化リパーゼを乾燥質量基準で５ｇ加え、４０℃、４００Ｐａで６０分間攪拌後の脂肪酸濃度を測定し、１分間あたりに減少した脂肪酸のμモル数として定義する。ここで、固定化リパーゼ中、固定化担体の質量に対するリパーゼの質量は極めて小さいため、固定化担体の質量≒固定化リパーゼの質量とする。本発明においては、前記により測定したＡ値が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2の範囲のものである。このＡ値は、反応速度を向上させつつジアシルグリセロールを副生させず、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から好ましくは２００〜７００００Ｕ／ｍ2、更に５００〜３００００Ｕ／ｍ2、特に１５００〜１００００Ｕ／ｍ2が好ましい。
【００１５】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼのエステル化活性は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から５〜８０００Ｕ、更に１０〜４０００Ｕ、特に５０〜２０００Ｕ、殊更２００〜１２００Ｕが好ましい。
【００１６】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼに使用する固定化担体の比表面積は、固定化担体１ｇあたりの表面積であり、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から０．００２７〜０．５３６ｍ2／ｇ、更に０．００４５〜０．２６８ｍ2／ｇ、特に０．００７７〜０．１７９ｍ2／ｇ、殊更０．０１０７〜０．１３４ｍ2／ｇが好ましい。当該比表面積は、固定化担体を篩によって分級し平均粒子径を求め、担体の形状が球状、真比重を１．１２ｇ／ｃｍ3と仮定して算出することができる。
【００１７】
本発明で使用する部分グリセリドリパーゼは、モノアシルグリセロール及びジアシルグリセロールの部分グリセリドを加水分解するが、トリアシルグリセロールを加水分解し難いリパーゼである。
部分グリセリドリパーゼとしては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来のモノグリセリドリパーゼ又はジグリセリドリパーゼ；バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）Ｈ−２５７由来モノグリセリドリパーゼ（J. Biochem., 127, 419-425, 2000）、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）ＬＰ７３１５由来モノグリセリドリパーゼ（Journal of Bioscience and Bioengineering, 91(1), 27-32, 2001）、ペニシリウム・サイロピウム由来リパーゼ（J. Biochem, 87(1), 205-211, 1980）、ペニシリウム・カメンベルティ（Penicillium camembertii）Ｕ−１５０由来リパーゼ（J. Fermentation and Bioengineering, 72(3), 162-167, 1991）等が挙げられる。市販品としては、例えば「モノグリセライドリパーゼ（MGLPII）」（旭化成社）、「リパーゼＧ「アマノ」５０」（天野エンザイム社）等がある。
【００１８】
本発明で使用する固定化担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体；セルロースパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子の担体等が挙げられるが、特にイオン交換樹脂が、保水力の点で好ましい。固定化担体の形状としては、特に限定されないが、粒子状、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等が挙げられる。
【００１９】
担体の粒子径は１０〜２０００μｍ、更に２０〜１２００μｍ、特に３０〜７００μｍ、殊更４０〜５００μｍが好ましく、細孔径は１０〜１５０ｎｍ、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。
イオン交換樹脂としては、多孔性の陰イオン交換樹脂が好ましい。樹脂の材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられる。特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（商品名Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）がリパーゼ吸着性向上の点から好ましい。
【００２０】
本発明では、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素の固定化の前処理として、固定化担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。またこれらは単一で用いてもよいが、２種以上を組み合わせることで一層の効果が発揮される。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらをそのまま加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させた固定化担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の比率は、固定化担体１質量部（乾燥質量）に対し、脂溶性脂肪酸又はその誘導体０．０１〜１質量部、特に０．０５〜０．５質量部が好ましい。接触温度は、０〜８０℃、特に２０〜６０℃が好ましい。接触時間は、５分〜５時間程度でよい。本処理後濾過して固定化担体を回収するが、この時乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜８０℃が良く、減圧乾燥を行ってもよい。
【００２１】
この固定化担体の前処理に用いられる脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４の直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。好ましい脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の脂肪酸、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、イソステアリン酸等の分岐脂肪酸が挙げられる。脂溶性脂肪酸誘導体としては、炭素数８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエステルに更にエチレンオキサイドを付加した誘導体等が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステルとしては、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びそれらの誘導体、あるいはポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、いずれも常温で液状であることが工程上望ましい。また、これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００２２】
本発明の固定化部分グリセリドリパーゼは、一般的な固定化酵素の製造方法にて調製することができるが、例えば、固定化担体として、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ社製）を用いて、固定化担体に水酸化ナトリウム水溶液を加えて攪拌しながらアルカリ処理、緩衝液を加えて攪拌しながらｐＨ調整、エタノールで置換後、脂肪酸を加えて攪拌しながら脂溶性脂肪酸又はその誘導体による前処理を行った後、リパーゼを加えて攪拌しながら固定化、さらに大豆脂肪酸を加えて油置換することにより固定化酵素を得る方法や上記固定化担体に部分グリセリドリパーゼ溶液を加えて攪拌することにより該固定化担体に該部分グリセリドリパーゼを吸着固定し、次いで該部分グリセリドリパーゼ溶液から不溶性担体を濾過し、イオン交換水又は緩衝液を用いて洗浄する方法等が挙げられる。該酵素は、必要に応じて精製したり、予め水や緩衝溶液等の水性媒体に分散又は溶解して用いてもよい。
【００２３】
このとき用いる部分グリセリドリパーゼの量は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から固定化担体１００質量部に対して、部分グリセリドリパーゼとしてリパーゼＧ「アマノ」５０（５００００ｕ／ｇ以上）を用いた場合、０．１〜５００質量部、更に１〜２００質量部、特に５〜１００質量部、殊更１０〜８０質量部とすることが好ましい。なお、ここでいうｕ数は、ＬＶ乳化法によって、１分間に１μモルの脂肪酸の増加をもたらす酵素量を１単位[ｕ]とする。ＬＶ乳化法とは、ラウリン酸ビニルの乳化液にリパーゼを作用（ｐＨ５．６、４０℃にて３０分間）させ、エタノール／アセトン混合溶媒で反応を停止し、水酸化ナトリウムで生成脂肪酸を中和後、残存する水酸化ナトリウムを塩酸で滴定することで、生成脂肪酸を定量してｕ数を求める方法である。
【００２４】
なお、部分グリセリドリパーゼの固定化温度は、酵素の失活の起きない温度であればよく、０〜６０℃、特に５〜３０℃が好ましい。また固定化に用いる酵素水溶液のｐＨは、酵素の変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。特に至適ｐＨが酸性とされているリパーゼを用いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とするのがよい。また酵素水溶液に用いる緩衝液としては、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２５】
本発明のモノアシルグリセロールを製造するための原料として用いる脂肪酸としては、炭素数４〜２２の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、例えば酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ゾーマリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ガドレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を用いることができる。また上記脂肪酸とエステルを形成する低級アルコールとしては、炭素数１〜３の低級アルコール類が好ましい。炭素数１〜３の低級アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられる。これらの脂肪酸又はその低級アルキルエステル（以下、単に「脂肪酸等」と記載する）は、２種以上を併用することもできる。また、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００２６】
固定化部分グリセリドリパーゼの存在下での脂肪酸等とグリセリンのエステル化反応は、固定化部分グリセリドリパーゼと原料（脂肪酸等とグリセリン）を接触させればよく、接触手段としては、浸漬、攪拌、該固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液すること等が挙げられる。攪拌する場合には、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、３０〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更には１００〜７００ｒ／ｍｉｎが好ましい。
【００２７】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼは、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、固定化担体の粒径範囲に応じて次のようにエステル化活性〔Ｕ〕を設定することが好ましい。即ち、固定化担体の粒子径が２０〜１００μｍでは、エステル化活性は５０〜８０００Ｕ、更に２００〜４０００Ｕ、特に５００〜２０００Ｕであることが好ましく、固定化担体の粒子径が１００〜４００μｍでは、エステル化活性は１０〜４０００Ｕ、更に５０〜２０００Ｕ、特に２００〜１２００Ｕであることが好ましく、固定化担体の粒子径が４００〜１２００μｍでは、エステル化活性は５〜２０００Ｕ、更に１０〜１２００Ｕ、特に５０〜８００Ｕであることが好ましい。
【００２８】
この反応において、脂肪酸等とグリセリンの反応モル比Ｒ〔Ｒ＝脂肪酸等（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕は、０．２〜１．５が好ましく、更には０．３〜１．３５、特に０．４〜１．２であるのが好ましい。また、脂肪酸等とグリセリンを合計した原料１００質量部に対し、前記固定化部分グリセリドリパーゼを０．１〜５０質量部添加することが好ましく、更に０．５〜４０質量部、特に２．５〜３０質量部、殊更５〜２５質量部とすることが、反応速度を向上させ、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から好ましい。
【００２９】
上記エステル化反応の反応温度は、反応速度を向上する点、酵素の失活を抑制する点から０〜１００℃、更に１０〜８０℃、特に２０〜７０℃が反応性の点で好ましい。また反応時間は工業的な生産性の観点から、１〜２００時間が好ましく、更には２〜１５０時間が好ましい。また、適宜圧力の調整を行なってもよく、該圧力条件は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、１０〜１００００Ｐａが好ましく、更には１００〜１０００Ｐａが好ましい。
【００３０】
また、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、反応生成水を反応系外に除去しながら行われることが好ましい。例えば、リパーゼ製剤に含まれる水分を除き、実質的に無水条件下で行われ、エステル化反応により生成した反応生成水は、減圧；ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用；反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法により、系外に除去される。
【００３１】
本発明方法によれば、グリセリンと脂肪酸等を原料として、トリアシルグリセロールをほとんど生成せず、かつジアシルグリセロールの生成を抑制しつつ、できるだけ高い反応率でモノアシルグリセロール高含有油脂を製造することができる。得られたモノアシルグリセロール高含有油脂は、少なくともモノアシルグリセロール濃度４０質量％以上であることが好ましく、より好ましくは５０質量％以上、更に６０質量％以上、特に７０質量％以上、殊更７５質量％以上であることが好ましい。なお、該モノアシルグリセロール濃度は、モノアシルグリセロール／（モノアシルグリセロール＋ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール）×１００（質量％）で求めることができる。また、エステル化反応後のモノアシルグリセロール含有油脂の歩留は、エステル化反応を進行させて、脂肪酸濃度を低く、モノアシルグリセロールの含有量を高くする点から３０質量％以上であることが好ましく、更に４０質量％以上、特に５０質量％以上、殊更６０質量％以上であることが好ましい。ここで、モノアシルグリセロール含有油脂の歩留は、エステル化反応油中のモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールの質量％の合計で求めることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００３３】
〔分析方法〕
（ｉ）酸価の測定
日本油化学協会編「基準油脂分析試験法」２００３年版中の「酸価（２．３．１−１９９６）」に従って、試料１ｇ中に含まれている遊離脂肪酸を中和するのに要する水酸化カリウムのｍｇ数を求めた値いう。
【００３４】
（ii）脂肪酸組成の測定
日本油化学協会編「基準油脂分析試験法」中の「脂肪酸メチルエステルの調製法（２．４．１．２−１９９６）」に従って脂肪酸メチルエステルを調製し、得られたサンプルを、American Oil Chemists. Society Official Method Ce 1f-96（GLC法）に従って測定した。
【００３５】
（iii）脂肪酸濃度の測定
前記方法により測定した酸価及び脂肪酸組成を用い、油脂製品の知識（株式会社 幸書房）に従って、次式（１）により求めた。
脂肪酸濃度（質量％）＝ｘ×ｙ／５６.１／１０ （１）
（ｘ＝酸価[ｍｇＫＯＨ／ｇ]、ｙ＝脂肪酸組成から求めた平均分子量）
【００３６】
（iv）グリセリド組成の測定
遠心分離が可能な試験管に反応終了油のサンプルを約３ｇ採取し、３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離を行い、沈降したグリセリンを除去した。次いで、ガラス製サンプル瓶に、上層を約１０ｍｇとトリメチルシリル化剤（「シリル化剤ＴＨ」、関東化学製）０．５ｍＬを加え、密栓し、７０℃で１５分間加熱した。これに水１．５ｍＬとヘキサン１．５ｍＬを加え、振とうした。静置後、上層をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、グリセリド組成の分析を行った。
【００３７】
（ｖ）固定化酵素の乾燥重量比率の測定
油分及び水分の付着した固定化酵素ａ質量部に対し１０質量倍のヘキサン及びアセトンで交互に各３回ずつ洗浄後、７０℃で１５時間放置することにより脱溶剤し、固定化酵素のみの質量を秤量し（ｂ質量部）、下記式より固定化担体１００質量部に対する質量比として求めた。
固定化酵素の乾燥重量比率＝ｂ／ａ×１００（％）
（ａ：油分及び水分の付着した固定化酵素質量、ｂ：固定化酵素質量）
【００３８】
〔固定化リパーゼ１の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ社製、平均粒径４８０μｍ、以下同じ）５０ｇを０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５００ｍＬ中で、１時間攪拌した。その後、５００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで、２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後、濾過を行い、担体を回収した後、エタノール２５０ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、大豆脂肪酸を５０ｇ含むエタノール２５０ｍＬを加え３０分間、大豆脂肪酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後、部分グリセリドリパーゼであるリパーゼＧ「アマノ」５０（天野エンザイム(株)、以下同じ）５０ｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）４００ｍＬに溶解したリパーゼ溶液と２時間接触させ、固定化を行った。さらに、濾過し固定化リパーゼを回収して、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで洗浄を行い、固定化していないリパーゼや蛋白を除去した。以上の操作はいずれも温度２０℃で行った。その後、大豆脂肪酸５００ｇを加え、温度４０℃で攪拌しながら、圧力４００Ｐａに達するまで減圧して脱水し、固定化リパーゼ１を得た。
【００３９】
〔固定化リパーゼ２〜４の調製〕
リパーゼＧ「アマノ」５０の使用量を５、２５、１００ｇとした以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ２〜４を得た。
【００４０】
〔固定化リパーゼ５の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ５００ｇをすり潰し、６３μｍ及び３８μｍの篩で分級して得た平均粒径５１μｍの固定化担体を用いた以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ５を得た。
【００４１】
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ５００ｇをすり潰し、２５０μｍ及び１５０μｍの篩で分級して得た平均粒径２００μｍの固定化担体を用いた以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ６を得た。
【００４２】
〔固定化リパーゼ７〜１０の調製〕
リパーゼを１，３位選択性リパーゼであるリリパーゼＡ−１０ＦＧ（ナガセケムテックス(株)）とし、使用量を５、２５、５０、１００ｇとした以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ７〜１０を得た。
【００４３】
〔固定化リパーゼ１１の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ２０ｇを０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬ中で、１時間攪拌した。その後、２００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬで、２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後、濾過を行い、担体を回収した後、エタノール１００ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、大豆脂肪酸を２０ｇ含むエタノール１００ｍＬを加え３０分間、大豆脂肪酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後、非選択性リパーゼであるリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ（天野エンザイム(株)）２０ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｍＬに溶解したリパーゼ溶液と４時間接触させ、固定化を行った。さらに、濾過し固定化リパーゼを回収して、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで洗浄を行い、固定化していないリパーゼや蛋白を除去した。以上の操作はいずれも温度２０℃で行った。その後、脱臭大豆油１００ｇを加え、温度４０℃、１０時間攪拌した後、濾過して脱臭大豆油と分離し、固定化リパーゼ１１を得た。
【００４４】
〔原料脂肪酸〕
反応原料として用いた脂肪酸は、油水向流式の高圧熱水型分解装置によって油脂を加水分解反応することにより得た。大豆油を高圧熱水型分解装置の下側から、水を装置の上側からそれぞれ連続的に送液した。送液量は、原料油脂１００質量部に対して水５０質量部とした。この時、分解塔内の平均滞留時間(ｈｒ)（塔容積(ｍ3)／（原料油の流量(ｍ3／ｈｒ)＋水の流量(ｍ3／ｈｒ)））は約４ｈｒであった。装置の中で原料油脂は高圧熱水（５．０ＭＰａ、２４０℃）により加熱された。油水向流式の高圧熱水型分解装置の途中にあるサンプリング口から反応液を採取し、窒素シールし、遮光状態で２５℃まで冷却した。その後、遠心分離（５，０００ｇ，３０分）し、水層を除去後、脂肪酸層を温度７０℃、真空度４００Ｐａで３０分間減圧脱水し、原料脂肪酸Ｘを得た。また、原料脂肪酸Ｘを、ワイプトフィルム蒸発装置（神鋼パンテック社 ２−０３型、内径５ｃｍ、伝熱面積０．０３ｍ2）を用い、加熱ヒーター温度２３０℃、圧力２Ｐａ、流量１５０ｍｌ／ｈｒの操作条件で蒸留し、原料脂肪酸Ｙを得た。それぞれのグリセリド組成を表１に示す。ここで、ＦＦＡは遊離脂肪酸、ＧＬＹはグリセリン、ＭＡＧはモノアシルグリセロール、ＤＡＧはジアシルグリセロール、ＴＡＧはトリアシルグリセロールである（以下同じ）。
【００４５】
【表１】
【００４６】
〔固定化リパーゼのエステル化活性〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表１に示した原料脂肪酸１００ｇ及びエステル化原料に対して固定化リパーゼを乾燥質量基準で５ｇ仕込み、温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで３０分間減圧脱水した。その後、原料脂肪酸で３回洗浄した。その後、原料脂肪酸を加え、次にグリセリンを加えて反応を開始し、真空ポンプで減圧にした。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで行った。原料脂肪酸とグリセリンの合計を１００ｇ、ＦＦＡ／ＧＬＹのモル比を０．６とした。６０分後の反応液をサンプリングし、脂肪酸濃度の値からエステル化活性を算出した。なお、各原料脂肪酸の脂肪酸組成から算出した平均分子量は、原料脂肪酸Ｘ及びＹのいずれも２７９であった。調製した固定化リパーゼの調製条件及び物性値を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
〔エステル化反応１〜１８〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表３に示したＸ又はＹのいずれかの原料脂肪酸１００ｇ及び固定化リパーゼを乾燥質量基準で表３に示す量仕込み、温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで３０分間減圧脱水した。その後、原料脂肪酸で３回洗浄した。その後、原料脂肪酸を加え、次に攪拌しながらグリセリンを加えて反応を開始し、真空ポンプで減圧にした。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで行い、原料脂肪酸とグリセリンの合計を１００ｇ、表３に示したＦＦＡ／ＧＬＹのモル比とした。表３に示す反応時間で反応液をサンプリングし、グリセリド組成を求めた。
【００４９】
〔エステル化反応１９〜２４〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表３に示した原料脂肪酸（Ｘ）、グリセリンを加えて攪拌を開始し、表４に示した量の粉末リパーゼＧを添加した。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、表４に示す圧力で行い、減圧の場合は真空ポンプを用いた。原料脂肪酸とグリセリンの合計は１００ｇ、表４に示したＦＦＡ／ＧＬＹのモル比とした。表４に示す反応時間で反応液をサンプリングし、グリセリド組成を求めた。
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
表３及び４より、本発明で規定するＡ値を有する固定化部分グリセリドリパーゼを使用したエステル化反応３〜５及び９〜１５は、いずれも高いＭＡＧ濃度となったが、リパーゼ種、Ａ値、固定化のいずれか１以上の要件を満たさないものにおいては、ＭＡＧ濃度を高くすることはできなかった。
【００５３】
（Ｉ）リパーゼ種の影響
エステル化反応１〜３及び１６〜１８の比較により、固定化リパーゼを用いたエステル化反応において、部分グリセリドリパーゼであるリパーゼＧを固定化したものは１，３位選択性リパーゼであるリリパーゼや非選択性リパーゼであるリパーゼＡＹを固定化したものと比べて、最もＭＡＧ濃度が高くなった。また、リリパーゼを用いたものは、Ａ値を本発明規定の範囲内としてもＭＡＧ濃度を高くすることはできなかった（エステル化反応１６〜１８）。
【００５４】
（II）Ａ値の影響
エステル化反応３〜１５の比較から、固定化部分グリセリドリパーゼを用い、本発明で規定するＡ値の範囲内の固定化部分グリセリドリパーゼを用いて行ったエステル化反応においては、いずれもＭＡＧ濃度が高くなったが、Ａ値が上限を超えるものを用いた場合にはＭＡＧ濃度を高くすることはできず、酵素濃度を低くしても同様であった（エステル化反応６〜８）。また、Ａ値が高いほど反応速度は速くなるが、同時にＤＡＧが副生してくる傾向であった（エステル化反応８、９及び１３）。更に、エステル化反応原料仕込比をＦＦＡ／ＧＬＹ＝０．２とすると、ＭＡＧ濃度はより高くなるが、反応系内にグリセリンが多くなるため歩留の点では不利であった（エステル化反応３〜５。なお、表３及び４に示した反応終了油のグリセリド組成は、前記「グリセリド組成の測定」に記載した通り、反応終了油をサンプリングして遠心分離し、沈降した未反応のグリセリンを除去した後に測定しているため、グリセリン量は反応終了油に溶解したもののみが測定されている。従って、反応終了油中にグリセリンと親和性の高いＭＡＧの量が多くなるほど、グリセリンは実際よりも多く測定されることとなる。実際に「反応系内にグリセリンが多く」なっているのはエステル化反応番号４であり、仕込み原料１００ｇ中のグリセリン６２％に対して、遠心分離で沈降し除去したグリセリンは５２％であった。）。
また、担体粒径をより小さくし、固定化担体の表面積を大きくすると、反応時間の短縮とＭＡＧの高濃度化を両立することができ、特に担体粒径を２００μｍ以下とした場合に効果が高かった（エステル化反応１０及び１１）。更に、Ａ値の低い固定化部分グリセリドリパーゼを高濃度で用いると、同様に反応時間の短縮とＭＡＧの高濃度化を両立することができた（エステル化反応１２及び１３）。この際、エステル化反応原料仕込比をＦＦＡ／ＧＬＹ＝１．０としても歩留まりの高さとＭＡＧ濃度の高さを両立でき（エステル化反応１４と１５の比較）、また原料脂肪酸の脂肪酸濃度が高いほどＭＡＧ濃度が高くなった（エステル化反応１２と１４の比較）。
【００５５】
（III）リパーゼ固定化の影響
固定化していない粉末の部分グリセリドリパーゼを用いて行ったエステル化反応１９〜２４においては、減圧条件、常圧条件のいずれにおいても、高ＭＡＧ濃度と高歩留の両立ができなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアシルグリセロール高含有油脂を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノアシルグリセロール（以下、「モノグリセリド」又は「モノグリセライド」と記載することもある）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用され、最近、モノアシルグリセロールの優れた生理活性に着目した食品が注目されている。このモノアシルグリセロールを得るため、脂肪酸又は脂肪酸メチルとグリセリンを反応させる方法、あるいは油脂とグリセリンを、高温下で金属触媒を添加して化学反応させる方法が用いられている。
【０００３】
脂肪酸を原料として用いるモノアシルグリセロールの製造法として、エステル化法、エステル交換法又はグリセロリシス法等が挙げられる。
例えば、部分グリセリドリパーゼの存在下、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセロールとを反応させるモノグリセライドとジグリセライドの混合物の製造方法（特許文献１）が知られている。
また、Penicillium camembertii モノ及びジグリセリドリパーゼの存在下、共役リノール酸に対してモル比で３倍以上の過剰量のグリセリンを使用し、５℃で反応させるモノグリセリドの製造方法（特許文献２）が知られている。
【０００４】
一方、炭酸カルシウムに固定化したPseudomonas sp.由来リパーゼの存在下、高度不飽和脂肪酸に対してモル比で３０倍以上のグリセリンを使用し、反応させるモノグリセリドの製造方法（特許文献３）が知られている。
【０００５】
そこで、脂肪酸とグリセリンを反応させてモノアシルグリセロール高含有油脂を効率よく製造する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−１８１３９０号公報
【特許文献２】特許第３９７０６６９号公報
【特許文献３】特許第３８６１９４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記従来技術のうち、金属触媒を用いる化学反応は２００℃以上の高温であるため、原料に不飽和脂肪酸を多く含む場合には劣化が生じ易い点、また、金属触媒の完全除去が困難である点等から、その適用が問題とされてきた。また、前記部分グリセリドリパーゼを用いる技術（特許文献１）では、反応の進行と共にモノアシルグリセロール濃度（モノアシルグリセロール／原料）は低下するので、モノアシルグリセロールの純度を上げるためにはエステル化反応の後に精留等の精製工程が必要となり、製造効率の点で課題がある。更に、前記モノ及びジグリセリドリパーゼを用いる技術（特許文献２）では、リパーゼの至適温度ではない低温で行われるため反応効率が良くない。また、炭酸カルシウムに固定化したリパーゼを用い脂肪酸に対してモル比で３０倍以上のグリセリンを使用する技術（特許文献３）では、モノグリセリド濃度は１６．７％に過ぎない。
【０００８】
本発明は、脂肪酸とグリセリンを原料とし、リパーゼ活性を損なうことなくモノアシルグリセロールを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを固定化酵素である固定化部分グリセリドリパーゼを用いて反応させる際、意外にも酵素固定化用担体（以下、固定化担体とも云う。）の量に対して部分グリセリドリパーゼの使用割合を多くして調製した固定化部分グリセリドリパーゼではモノアシルグリセロールの生産効率が低くなるのに対し、固定化担体の量に対して部分グリセリドリパーゼの使用割合を少なくするとモノアシルグリセロールの生産効率が高まることを見出した。更には、固定化担体の表面積がモノアシルグリセロールの生産効率に関与していることも見出し、固定化担体の単位面積あたりのエステル化活性が特定範囲となるように調製された固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させると、高い反応率で高純度のモノアシルグリセロールを製造できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法によれば、高純度のモノアシルグリセロールが効率良く得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本願発明で使用する固定化部分グリセリドリパーゼは、部分グリセリドリパーゼが固定化担体に固定化されたものである。本発明において、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性（以下「Ａ値」と記載する）は、平均粒径の分かっている担体にリパーゼを固定化してエステル化活性を測定し、当該測定に用いた固定化部分グリセリドリパーゼの質量、及び担体の平均粒径から求めた担体の単位質量あたりの比表面積から、次の式（１）に従って求める。
【００１３】
Ａ〔Ｕ／ｍ2〕＝固定化リパーゼのエステル化活性〔Ｕ〕／（固定化担体比表面積〔ｍ2／ｇ〕×固定化リパーゼ質量〔ｇ〕）・・・式（１）
【００１４】
本発明においては、式（１）中の固定化リパーゼのエステル化活性〔Ｕ〕は、脂肪酸とグリセリンを合計で１００ｇ、脂肪酸／グリセリンをモル比０．６で混合し、これに固定化リパーゼを乾燥質量基準で５ｇ加え、４０℃、４００Ｐａで６０分間攪拌後の脂肪酸濃度を測定し、１分間あたりに減少した脂肪酸のμモル数として定義する。ここで、固定化リパーゼ中、固定化担体の質量に対するリパーゼの質量は極めて小さいため、固定化担体の質量≒固定化リパーゼの質量とする。本発明においては、前記により測定したＡ値が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2の範囲のものである。このＡ値は、反応速度を向上させつつジアシルグリセロールを副生させず、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から好ましくは２００〜７００００Ｕ／ｍ2、更に５００〜３００００Ｕ／ｍ2、特に１５００〜１００００Ｕ／ｍ2が好ましい。
【００１５】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼのエステル化活性は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から５〜８０００Ｕ、更に１０〜４０００Ｕ、特に５０〜２０００Ｕ、殊更２００〜１２００Ｕが好ましい。
【００１６】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼに使用する固定化担体の比表面積は、固定化担体１ｇあたりの表面積であり、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から０．００２７〜０．５３６ｍ2／ｇ、更に０．００４５〜０．２６８ｍ2／ｇ、特に０．００７７〜０．１７９ｍ2／ｇ、殊更０．０１０７〜０．１３４ｍ2／ｇが好ましい。当該比表面積は、固定化担体を篩によって分級し平均粒子径を求め、担体の形状が球状、真比重を１．１２ｇ／ｃｍ3と仮定して算出することができる。
【００１７】
本発明で使用する部分グリセリドリパーゼは、モノアシルグリセロール及びジアシルグリセロールの部分グリセリドを加水分解するが、トリアシルグリセロールを加水分解し難いリパーゼである。
部分グリセリドリパーゼとしては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来のモノグリセリドリパーゼ又はジグリセリドリパーゼ；バチルス・スピーシーズ（Bacillus sp.）Ｈ−２５７由来モノグリセリドリパーゼ（J. Biochem., 127, 419-425, 2000）、シュードモナス・スピーシーズ（Pseudomonas sp.）ＬＰ７３１５由来モノグリセリドリパーゼ（Journal of Bioscience and Bioengineering, 91(1), 27-32, 2001）、ペニシリウム・サイロピウム由来リパーゼ（J. Biochem, 87(1), 205-211, 1980）、ペニシリウム・カメンベルティ（Penicillium camembertii）Ｕ−１５０由来リパーゼ（J. Fermentation and Bioengineering, 72(3), 162-167, 1991）等が挙げられる。市販品としては、例えば「モノグリセライドリパーゼ（MGLPII）」（旭化成社）、「リパーゼＧ「アマノ」５０」（天野エンザイム社）等がある。
【００１８】
本発明で使用する固定化担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体；セルロースパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子の担体等が挙げられるが、特にイオン交換樹脂が、保水力の点で好ましい。固定化担体の形状としては、特に限定されないが、粒子状、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状等が挙げられる。
【００１９】
担体の粒子径は１０〜２０００μｍ、更に２０〜１２００μｍ、特に３０〜７００μｍ、殊更４０〜５００μｍが好ましく、細孔径は１０〜１５０ｎｍ、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。
イオン交換樹脂としては、多孔性の陰イオン交換樹脂が好ましい。樹脂の材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられる。特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（商品名Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）がリパーゼ吸着性向上の点から好ましい。
【００２０】
本発明では、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素の固定化の前処理として、固定化担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。またこれらは単一で用いてもよいが、２種以上を組み合わせることで一層の効果が発揮される。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらをそのまま加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させた固定化担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の比率は、固定化担体１質量部（乾燥質量）に対し、脂溶性脂肪酸又はその誘導体０．０１〜１質量部、特に０．０５〜０．５質量部が好ましい。接触温度は、０〜８０℃、特に２０〜６０℃が好ましい。接触時間は、５分〜５時間程度でよい。本処理後濾過して固定化担体を回収するが、この時乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜８０℃が良く、減圧乾燥を行ってもよい。
【００２１】
この固定化担体の前処理に用いられる脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４の直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。好ましい脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の脂肪酸、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、イソステアリン酸等の分岐脂肪酸が挙げられる。脂溶性脂肪酸誘導体としては、炭素数８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエステルに更にエチレンオキサイドを付加した誘導体等が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステルとしては、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びそれらの誘導体、あるいはポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、いずれも常温で液状であることが工程上望ましい。また、これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００２２】
本発明の固定化部分グリセリドリパーゼは、一般的な固定化酵素の製造方法にて調製することができるが、例えば、固定化担体として、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ社製）を用いて、固定化担体に水酸化ナトリウム水溶液を加えて攪拌しながらアルカリ処理、緩衝液を加えて攪拌しながらｐＨ調整、エタノールで置換後、脂肪酸を加えて攪拌しながら脂溶性脂肪酸又はその誘導体による前処理を行った後、リパーゼを加えて攪拌しながら固定化、さらに大豆脂肪酸を加えて油置換することにより固定化酵素を得る方法や上記固定化担体に部分グリセリドリパーゼ溶液を加えて攪拌することにより該固定化担体に該部分グリセリドリパーゼを吸着固定し、次いで該部分グリセリドリパーゼ溶液から不溶性担体を濾過し、イオン交換水又は緩衝液を用いて洗浄する方法等が挙げられる。該酵素は、必要に応じて精製したり、予め水や緩衝溶液等の水性媒体に分散又は溶解して用いてもよい。
【００２３】
このとき用いる部分グリセリドリパーゼの量は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から固定化担体１００質量部に対して、部分グリセリドリパーゼとしてリパーゼＧ「アマノ」５０（５００００ｕ／ｇ以上）を用いた場合、０．１〜５００質量部、更に１〜２００質量部、特に５〜１００質量部、殊更１０〜８０質量部とすることが好ましい。なお、ここでいうｕ数は、ＬＶ乳化法によって、１分間に１μモルの脂肪酸の増加をもたらす酵素量を１単位[ｕ]とする。ＬＶ乳化法とは、ラウリン酸ビニルの乳化液にリパーゼを作用（ｐＨ５．６、４０℃にて３０分間）させ、エタノール／アセトン混合溶媒で反応を停止し、水酸化ナトリウムで生成脂肪酸を中和後、残存する水酸化ナトリウムを塩酸で滴定することで、生成脂肪酸を定量してｕ数を求める方法である。
【００２４】
なお、部分グリセリドリパーゼの固定化温度は、酵素の失活の起きない温度であればよく、０〜６０℃、特に５〜３０℃が好ましい。また固定化に用いる酵素水溶液のｐＨは、酵素の変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。特に至適ｐＨが酸性とされているリパーゼを用いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とするのがよい。また酵素水溶液に用いる緩衝液としては、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２５】
本発明のモノアシルグリセロールを製造するための原料として用いる脂肪酸としては、炭素数４〜２２の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、例えば酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ゾーマリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ガドレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を用いることができる。また上記脂肪酸とエステルを形成する低級アルコールとしては、炭素数１〜３の低級アルコール類が好ましい。炭素数１〜３の低級アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられる。これらの脂肪酸又はその低級アルキルエステル（以下、単に「脂肪酸等」と記載する）は、２種以上を併用することもできる。また、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００２６】
固定化部分グリセリドリパーゼの存在下での脂肪酸等とグリセリンのエステル化反応は、固定化部分グリセリドリパーゼと原料（脂肪酸等とグリセリン）を接触させればよく、接触手段としては、浸漬、攪拌、該固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液すること等が挙げられる。攪拌する場合には、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、３０〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更には１００〜７００ｒ／ｍｉｎが好ましい。
【００２７】
本発明において用いる固定化部分グリセリドリパーゼは、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、固定化担体の粒径範囲に応じて次のようにエステル化活性〔Ｕ〕を設定することが好ましい。即ち、固定化担体の粒子径が２０〜１００μｍでは、エステル化活性は５０〜８０００Ｕ、更に２００〜４０００Ｕ、特に５００〜２０００Ｕであることが好ましく、固定化担体の粒子径が１００〜４００μｍでは、エステル化活性は１０〜４０００Ｕ、更に５０〜２０００Ｕ、特に２００〜１２００Ｕであることが好ましく、固定化担体の粒子径が４００〜１２００μｍでは、エステル化活性は５〜２０００Ｕ、更に１０〜１２００Ｕ、特に５０〜８００Ｕであることが好ましい。
【００２８】
この反応において、脂肪酸等とグリセリンの反応モル比Ｒ〔Ｒ＝脂肪酸等（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕は、０．２〜１．５が好ましく、更には０．３〜１．３５、特に０．４〜１．２であるのが好ましい。また、脂肪酸等とグリセリンを合計した原料１００質量部に対し、前記固定化部分グリセリドリパーゼを０．１〜５０質量部添加することが好ましく、更に０．５〜４０質量部、特に２．５〜３０質量部、殊更５〜２５質量部とすることが、反応速度を向上させ、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から好ましい。
【００２９】
上記エステル化反応の反応温度は、反応速度を向上する点、酵素の失活を抑制する点から０〜１００℃、更に１０〜８０℃、特に２０〜７０℃が反応性の点で好ましい。また反応時間は工業的な生産性の観点から、１〜２００時間が好ましく、更には２〜１５０時間が好ましい。また、適宜圧力の調整を行なってもよく、該圧力条件は、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、１０〜１００００Ｐａが好ましく、更には１００〜１０００Ｐａが好ましい。
【００３０】
また、効率的にモノアシルグリセロール高含有油脂を得る点から、反応生成水を反応系外に除去しながら行われることが好ましい。例えば、リパーゼ製剤に含まれる水分を除き、実質的に無水条件下で行われ、エステル化反応により生成した反応生成水は、減圧；ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用；反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法により、系外に除去される。
【００３１】
本発明方法によれば、グリセリンと脂肪酸等を原料として、トリアシルグリセロールをほとんど生成せず、かつジアシルグリセロールの生成を抑制しつつ、できるだけ高い反応率でモノアシルグリセロール高含有油脂を製造することができる。得られたモノアシルグリセロール高含有油脂は、少なくともモノアシルグリセロール濃度４０質量％以上であることが好ましく、より好ましくは５０質量％以上、更に６０質量％以上、特に７０質量％以上、殊更７５質量％以上であることが好ましい。なお、該モノアシルグリセロール濃度は、モノアシルグリセロール／（モノアシルグリセロール＋ジアシルグリセロール＋トリアシルグリセロール）×１００（質量％）で求めることができる。また、エステル化反応後のモノアシルグリセロール含有油脂の歩留は、エステル化反応を進行させて、脂肪酸濃度を低く、モノアシルグリセロールの含有量を高くする点から３０質量％以上であることが好ましく、更に４０質量％以上、特に５０質量％以上、殊更６０質量％以上であることが好ましい。ここで、モノアシルグリセロール含有油脂の歩留は、エステル化反応油中のモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールの質量％の合計で求めることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００３３】
〔分析方法〕
（ｉ）酸価の測定
日本油化学協会編「基準油脂分析試験法」２００３年版中の「酸価（２．３．１−１９９６）」に従って、試料１ｇ中に含まれている遊離脂肪酸を中和するのに要する水酸化カリウムのｍｇ数を求めた値いう。
【００３４】
（ii）脂肪酸組成の測定
日本油化学協会編「基準油脂分析試験法」中の「脂肪酸メチルエステルの調製法（２．４．１．２−１９９６）」に従って脂肪酸メチルエステルを調製し、得られたサンプルを、American Oil Chemists. Society Official Method Ce 1f-96（GLC法）に従って測定した。
【００３５】
（iii）脂肪酸濃度の測定
前記方法により測定した酸価及び脂肪酸組成を用い、油脂製品の知識（株式会社 幸書房）に従って、次式（１）により求めた。
脂肪酸濃度（質量％）＝ｘ×ｙ／５６.１／１０ （１）
（ｘ＝酸価[ｍｇＫＯＨ／ｇ]、ｙ＝脂肪酸組成から求めた平均分子量）
【００３６】
（iv）グリセリド組成の測定
遠心分離が可能な試験管に反応終了油のサンプルを約３ｇ採取し、３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離を行い、沈降したグリセリンを除去した。次いで、ガラス製サンプル瓶に、上層を約１０ｍｇとトリメチルシリル化剤（「シリル化剤ＴＨ」、関東化学製）０．５ｍＬを加え、密栓し、７０℃で１５分間加熱した。これに水１．５ｍＬとヘキサン１．５ｍＬを加え、振とうした。静置後、上層をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、グリセリド組成の分析を行った。
【００３７】
（ｖ）固定化酵素の乾燥重量比率の測定
油分及び水分の付着した固定化酵素ａ質量部に対し１０質量倍のヘキサン及びアセトンで交互に各３回ずつ洗浄後、７０℃で１５時間放置することにより脱溶剤し、固定化酵素のみの質量を秤量し（ｂ質量部）、下記式より固定化担体１００質量部に対する質量比として求めた。
固定化酵素の乾燥重量比率＝ｂ／ａ×１００（％）
（ａ：油分及び水分の付着した固定化酵素質量、ｂ：固定化酵素質量）
【００３８】
〔固定化リパーゼ１の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａｓｓ社製、平均粒径４８０μｍ、以下同じ）５０ｇを０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５００ｍＬ中で、１時間攪拌した。その後、５００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで、２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後、濾過を行い、担体を回収した後、エタノール２５０ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、大豆脂肪酸を５０ｇ含むエタノール２５０ｍＬを加え３０分間、大豆脂肪酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後、部分グリセリドリパーゼであるリパーゼＧ「アマノ」５０（天野エンザイム(株)、以下同じ）５０ｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）４００ｍＬに溶解したリパーゼ溶液と２時間接触させ、固定化を行った。さらに、濾過し固定化リパーゼを回収して、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５００ｍＬで洗浄を行い、固定化していないリパーゼや蛋白を除去した。以上の操作はいずれも温度２０℃で行った。その後、大豆脂肪酸５００ｇを加え、温度４０℃で攪拌しながら、圧力４００Ｐａに達するまで減圧して脱水し、固定化リパーゼ１を得た。
【００３９】
〔固定化リパーゼ２〜４の調製〕
リパーゼＧ「アマノ」５０の使用量を５、２５、１００ｇとした以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ２〜４を得た。
【００４０】
〔固定化リパーゼ５の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ５００ｇをすり潰し、６３μｍ及び３８μｍの篩で分級して得た平均粒径５１μｍの固定化担体を用いた以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ５を得た。
【００４１】
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ５００ｇをすり潰し、２５０μｍ及び１５０μｍの篩で分級して得た平均粒径２００μｍの固定化担体を用いた以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ６を得た。
【００４２】
〔固定化リパーゼ７〜１０の調製〕
リパーゼを１，３位選択性リパーゼであるリリパーゼＡ−１０ＦＧ（ナガセケムテックス(株)）とし、使用量を５、２５、５０、１００ｇとした以外は固定化リパーゼ１と同様の方法により処理し、固定化リパーゼ７〜１０を得た。
【００４３】
〔固定化リパーゼ１１の調製〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８ ２０ｇを０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬ中で、１時間攪拌した。その後、２００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬで、２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後、濾過を行い、担体を回収した後、エタノール１００ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、大豆脂肪酸を２０ｇ含むエタノール１００ｍＬを加え３０分間、大豆脂肪酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後、非選択性リパーゼであるリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ（天野エンザイム(株)）２０ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｍＬに溶解したリパーゼ溶液と４時間接触させ、固定化を行った。さらに、濾過し固定化リパーゼを回収して、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで洗浄を行い、固定化していないリパーゼや蛋白を除去した。以上の操作はいずれも温度２０℃で行った。その後、脱臭大豆油１００ｇを加え、温度４０℃、１０時間攪拌した後、濾過して脱臭大豆油と分離し、固定化リパーゼ１１を得た。
【００４４】
〔原料脂肪酸〕
反応原料として用いた脂肪酸は、油水向流式の高圧熱水型分解装置によって油脂を加水分解反応することにより得た。大豆油を高圧熱水型分解装置の下側から、水を装置の上側からそれぞれ連続的に送液した。送液量は、原料油脂１００質量部に対して水５０質量部とした。この時、分解塔内の平均滞留時間(ｈｒ)（塔容積(ｍ3)／（原料油の流量(ｍ3／ｈｒ)＋水の流量(ｍ3／ｈｒ)））は約４ｈｒであった。装置の中で原料油脂は高圧熱水（５．０ＭＰａ、２４０℃）により加熱された。油水向流式の高圧熱水型分解装置の途中にあるサンプリング口から反応液を採取し、窒素シールし、遮光状態で２５℃まで冷却した。その後、遠心分離（５，０００ｇ，３０分）し、水層を除去後、脂肪酸層を温度７０℃、真空度４００Ｐａで３０分間減圧脱水し、原料脂肪酸Ｘを得た。また、原料脂肪酸Ｘを、ワイプトフィルム蒸発装置（神鋼パンテック社 ２−０３型、内径５ｃｍ、伝熱面積０．０３ｍ2）を用い、加熱ヒーター温度２３０℃、圧力２Ｐａ、流量１５０ｍｌ／ｈｒの操作条件で蒸留し、原料脂肪酸Ｙを得た。それぞれのグリセリド組成を表１に示す。ここで、ＦＦＡは遊離脂肪酸、ＧＬＹはグリセリン、ＭＡＧはモノアシルグリセロール、ＤＡＧはジアシルグリセロール、ＴＡＧはトリアシルグリセロールである（以下同じ）。
【００４５】
【表１】
【００４６】
〔固定化リパーゼのエステル化活性〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表１に示した原料脂肪酸１００ｇ及びエステル化原料に対して固定化リパーゼを乾燥質量基準で５ｇ仕込み、温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで３０分間減圧脱水した。その後、原料脂肪酸で３回洗浄した。その後、原料脂肪酸を加え、次にグリセリンを加えて反応を開始し、真空ポンプで減圧にした。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで行った。原料脂肪酸とグリセリンの合計を１００ｇ、ＦＦＡ／ＧＬＹのモル比を０．６とした。６０分後の反応液をサンプリングし、脂肪酸濃度の値からエステル化活性を算出した。なお、各原料脂肪酸の脂肪酸組成から算出した平均分子量は、原料脂肪酸Ｘ及びＹのいずれも２７９であった。調製した固定化リパーゼの調製条件及び物性値を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
〔エステル化反応１〜１８〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表３に示したＸ又はＹのいずれかの原料脂肪酸１００ｇ及び固定化リパーゼを乾燥質量基準で表３に示す量仕込み、温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで３０分間減圧脱水した。その後、原料脂肪酸で３回洗浄した。その後、原料脂肪酸を加え、次に攪拌しながらグリセリンを加えて反応を開始し、真空ポンプで減圧にした。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、圧力４００Ｐａで行い、原料脂肪酸とグリセリンの合計を１００ｇ、表３に示したＦＦＡ／ＧＬＹのモル比とした。表３に示す反応時間で反応液をサンプリングし、グリセリド組成を求めた。
【００４９】
〔エステル化反応１９〜２４〕
三日月羽根をセットした３００ｍｌの４ツ口フラスコに、表３に示した原料脂肪酸（Ｘ）、グリセリンを加えて攪拌を開始し、表４に示した量の粉末リパーゼＧを添加した。エステル化反応は温度４０℃、攪拌４００ｒｐｍ、表４に示す圧力で行い、減圧の場合は真空ポンプを用いた。原料脂肪酸とグリセリンの合計は１００ｇ、表４に示したＦＦＡ／ＧＬＹのモル比とした。表４に示す反応時間で反応液をサンプリングし、グリセリド組成を求めた。
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
表３及び４より、本発明で規定するＡ値を有する固定化部分グリセリドリパーゼを使用したエステル化反応３〜５及び９〜１５は、いずれも高いＭＡＧ濃度となったが、リパーゼ種、Ａ値、固定化のいずれか１以上の要件を満たさないものにおいては、ＭＡＧ濃度を高くすることはできなかった。
【００５３】
（Ｉ）リパーゼ種の影響
エステル化反応１〜３及び１６〜１８の比較により、固定化リパーゼを用いたエステル化反応において、部分グリセリドリパーゼであるリパーゼＧを固定化したものは１，３位選択性リパーゼであるリリパーゼや非選択性リパーゼであるリパーゼＡＹを固定化したものと比べて、最もＭＡＧ濃度が高くなった。また、リリパーゼを用いたものは、Ａ値を本発明規定の範囲内としてもＭＡＧ濃度を高くすることはできなかった（エステル化反応１６〜１８）。
【００５４】
（II）Ａ値の影響
エステル化反応３〜１５の比較から、固定化部分グリセリドリパーゼを用い、本発明で規定するＡ値の範囲内の固定化部分グリセリドリパーゼを用いて行ったエステル化反応においては、いずれもＭＡＧ濃度が高くなったが、Ａ値が上限を超えるものを用いた場合にはＭＡＧ濃度を高くすることはできず、酵素濃度を低くしても同様であった（エステル化反応６〜８）。また、Ａ値が高いほど反応速度は速くなるが、同時にＤＡＧが副生してくる傾向であった（エステル化反応８、９及び１３）。更に、エステル化反応原料仕込比をＦＦＡ／ＧＬＹ＝０．２とすると、ＭＡＧ濃度はより高くなるが、反応系内にグリセリンが多くなるため歩留の点では不利であった（エステル化反応３〜５。なお、表３及び４に示した反応終了油のグリセリド組成は、前記「グリセリド組成の測定」に記載した通り、反応終了油をサンプリングして遠心分離し、沈降した未反応のグリセリンを除去した後に測定しているため、グリセリン量は反応終了油に溶解したもののみが測定されている。従って、反応終了油中にグリセリンと親和性の高いＭＡＧの量が多くなるほど、グリセリンは実際よりも多く測定されることとなる。実際に「反応系内にグリセリンが多く」なっているのはエステル化反応番号４であり、仕込み原料１００ｇ中のグリセリン６２％に対して、遠心分離で沈降し除去したグリセリンは５２％であった。）。
また、担体粒径をより小さくし、固定化担体の表面積を大きくすると、反応時間の短縮とＭＡＧの高濃度化を両立することができ、特に担体粒径を２００μｍ以下とした場合に効果が高かった（エステル化反応１０及び１１）。更に、Ａ値の低い固定化部分グリセリドリパーゼを高濃度で用いると、同様に反応時間の短縮とＭＡＧの高濃度化を両立することができた（エステル化反応１２及び１３）。この際、エステル化反応原料仕込比をＦＦＡ／ＧＬＹ＝１．０としても歩留まりの高さとＭＡＧ濃度の高さを両立でき（エステル化反応１４と１５の比較）、また原料脂肪酸の脂肪酸濃度が高いほどＭＡＧ濃度が高くなった（エステル化反応１２と１４の比較）。
【００５５】
（III）リパーゼ固定化の影響
固定化していない粉末の部分グリセリドリパーゼを用いて行ったエステル化反応１９〜２４においては、減圧条件、常圧条件のいずれにおいても、高ＭＡＧ濃度と高歩留の両立ができなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【請求項２】
脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとの反応モル比Ｒ〔Ｒ＝脂肪酸又はその低級アルキルエステル（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕が、０．２〜１．５である請求項１に記載のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【請求項３】
固定化担体がイオン交換樹脂である請求項１又は２に記載のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【請求項１】
脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを、固定化担体の単位表面積あたりのエステル化活性が１００〜１４００００Ｕ／ｍ2である固定化部分グリセリドリパーゼの存在下で反応させるモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【請求項２】
脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとの反応モル比Ｒ〔Ｒ＝脂肪酸又はその低級アルキルエステル（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕が、０．２〜１．５である請求項１に記載のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【請求項３】
固定化担体がイオン交換樹脂である請求項１又は２に記載のモノアシルグリセロール高含有油脂の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１８３８７３（Ｐ２０１０−１８３８７３Ａ）
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３００８９（Ｐ２００９−３００８９）
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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