リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の同定方法
本発明は、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体ユビキチンの同定方法に関する。さらに、本発明は、前記ヘテロ多量体ユビキチン群をコードするＤＮＡライブラリー、ならびに、前記ＤＮＡライブラリーの発現によって得られるタンパク質ライブラリー、前記ＤＮＡまたは前記タンパク質を含む細胞およびファージ、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらに、選択されたリガンドに高い親和性で特異的に結合可能な、ヘテロ多量体ユビキチンベースの新規な結合タンパク質を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体ユビキチンの同定方法に関する。さらに、本発明は、前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の群をコードするＤＮＡライブラリー、ならびに、前記ＤＮＡライブラリーの発現によって得られるタンパク質ライブラリー、前記ＤＮＡまたは前記タンパク質を含む細胞およびファージ、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらに、選択されたリガンドに高い親和性で特異的に結合可能な、ヘテロ多量体ユビキチンベースの新規な結合タンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子の需要が高まりつつある。現在に至るまで、抗体は、最もよく確立された結合分子に類別されるが、免疫グロブリン分子にはいくつかの主要な欠点があるため、高い親和性と特異性でリガンドをターゲットとするために、新しい結合分子が、なお求められている。免疫グロブリン分子は、非常に容易に製造でき、ほとんど全てのターゲットを対象とするが、極めて複雑な分子構造を有している。そのため、容易に取扱い可能な、より小さな分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これら代替結合剤は、例えば、疾病の診断、予防、および治療の医療分野において、有用である。
【０００３】
相対的に規定された三次元構造を有するタンパク質は、通常、足場タンパク質と呼ばれ、前記代替結合剤の設計の開始物質として用いられる。これら足場タンパク質は、一般的に、特異的またはランダムな配列のバリエーションを許容する、１以上の領域を含んでおり、そのような配列のランダム化は、しばしば、特異的結合分子を選択できる、タンパク質ライブラリーの製造のために行われる。抗体よりもサイズが小さく、かつ、ターゲット抗原への親和性が、抗体に匹敵するか、あるいはより高い分子は、薬物動態的な性質および免疫原性の点から、抗体よりも優れていると予想される。
【０００４】
従前の多くのアプローチは、結合タンパク質の開始物質として足場タンパク質を用いている。例えば、国際公開第９９／１６８７３号パンフレット（特許文献１）において、特定のリガンドに結合活性を示すリポカリンファミリー（いわゆるアンチカリン）の修飾タンパク質が開発された。リポカリンファミリーのペプチド構造は、遺伝子工学的方法を用いて、天然のリガンド結合ポケットにおけるアミノ酸置換によって修飾されている。免疫グロブリンのように、アンチカリンは、分子構造の同定または結合に使用できる。抗体と類似する方法で、可動性ループ構造が修飾され、これらの修飾により、天然のものとは異なるリガンドの認識が可能となる。
【０００５】
国際公開第０１／０４１４４号パンフレット（特許文献２）には、それ自体には結合部分がないβシート構造タンパク質のタンパク質表面における、結合ドメインの人工的な生成が記載されている。この手法によれば、高い親和性と特異性でリガンドと相互作用する、新規に生成された人工結合ドメイン（例えば、眼水晶体構造タンパク質であるγクリスタンのバリエーション）が得られる。アンチカリンに関して先に述べたような可動性ループ構造から形成される、すでに存在する結合部位の修飾とは対照的に、これらの結合ドメインは、βシートの表面に新規に生成される。しかし、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、新規結合特性を生じるための、相対的に大きなタンパク質の改変について記載されているのみである。国際公開第０１／０４１４４号パンフレットのタンパク質は、その大きさのため、ある程度の労力を必要とする方法でしか、遺伝子工学レベルで修飾できない。さらに、これまで公開されたタンパク質においては、タンパク質の全体構造を維持するために、全アミノ酸のうち、比較的小さいパーセンテージのみが修飾されていた。そのため、従前は存在しない結合特性の発生に利用できるのは、タンパク質表面の比較的小さい領域のみである。さらに、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、γ−クリスタンへの結合特性の生成のみが記載されている。
【０００６】
国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（特許文献３）には、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の生成が記載されている。ユビキチンは、小さい単量体の細胞質タンパク質であり、配列が高度に保存され、原虫から脊椎動物にいたるまでの全ての公知の真核細胞に存在する。生物において、ユビキチンは、細胞タンパク質のコントロールされた分解の制御において重要な役割を担う。この目的のために、分解予定のタンパク質は、酵素カスケードを通過する間に、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖と共有結合し、この標識により選択的に分解される。最近の研究結果によると、ユビキチンまたはユビキチンによるタンパク質の標識は、それぞれ、数種のタンパク質の移入または遺伝子制御等の他の細胞プロセスにおいても、重要な役割を担っている。
【０００７】
その生理的機能の明確化に加え、ユビキチンは、そもそもその構造およびタンパク質の化学特性のために、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれた７６アミノ酸からなる（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７（非特許文献１））。前記ポリペプチド鎖のほぼ８７％は、水素結合によって、二次構造エレメントの形成に関与する。顕著な二次構造は、３．５αヘリックスターン、ならびに４つの鎖からなる逆平行βシートである。これらの要素の特徴的な配置（逆平行βシートがタンパク質表面に露出し、その裏側にαヘリックスがパックされ、これが前記逆平行βシート上に垂直に延びている）は、一般的に、いわゆるユビキチン様フォールディングモチーフと考えられている。さらなる構造的な特徴は、αヘリックスとβシートとの間のタンパク質内側における、標識疎水性領域である。
【０００８】
ユビキチンの人工的な調製は、そのサイズが小さいため、化学合成によっても、生物学的手法によっても行うことができる。有利なフォールディング特性のため、ユビキチンは、大腸菌等の微生物を使用した遺伝子工学により、比較的大量に、そのサイトゾルまたは細胞膜周辺腔において製造できる。一般的に、後者のストラテジーは、周辺質において酸化状態が優勢であるため、分泌タンパク質の製造に使用される。簡易かつ効果的な細菌による調製のために、ユビキチンは、その製造に問題がある他の外来タンパク質に対する融合パートナーとして使用できる。ユビキチンとの融合によって、溶解度の改善およびそれによる製造収率の改善が、達成できる。
【０００９】
抗体または他の代替足場と比べ、ユビキチンタンパク質をベースとする人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）ともいう）は、小さいサイズ、高い安定性、高い親和性、高い特異性、費用対効果の高い微生物による製造、血清半減期の調整という利点を有している。しかしながら、免疫原性、迅速かつ予測的な前臨床開発の手順、および新しい治療方法の点から、それらのタンパク質をさらに開発する必要がある。国際公開第０５／０５７３０号パンフレット（特許文献４）には、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が、概略的に記載されているが、ハプテンおよび抗原等（例えば、タンパク質およびペプチド、ならびにこれらのエピトープ等）のリガンドへの、より高くより特異的な結合親和性を得るために、ユビキチンタンパク質を修飾する方法や、かかる修飾ユビキチンタンパク質を効率的に選択する方法については、記載されていない。
【００１０】
国際公開第０５／０５７３０号パンフレットに記載の方法は、修飾ユビキチンタンパク質の単量体または修飾ユビキチンの結合タンパク質（ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に関する。前記結合型は、１、２、またはそれ以上の修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングして選択し、その後、遺伝学的手法または化学的手法のいずれかにより、これらを組み合わせて結合型を得ることによって生成される。一つの結合ユビキチン分子によって、例えば、異なる種類のリガンドへの複数の特異的結合が可能となる。一例をあげると、単一の修飾ユビキチン分子と比べて結合親和性を増加させるため、二つの同一のユビキチンベースのタンパク質の部位特異的結合（ホモ二量体）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／１６８７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０５／０５７３０号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、リガンドへの高結合能を有する多量体ユビキチンタンパク質の同定方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、選択されたリガンドに高親和性で特異的に結合可能な、修飾ユビキチンベースの新規な結合タンパク質の同定方法を提供することである。
【００１４】
上述の課題は、提出した独立請求項の主題によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、ならびに下記の記載、実施例および図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、単量体４１Ｂ１０（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４１Ｂ１０ｔｈ）についての、Ｋｄ＝９．４μＭ＝９.４５×１０−６Ｍの結合親和性を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヘテロ二量体ユビキチンの結合親和性を示す。
【図２Ａ】図２は、サイトカインに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の高親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ＝５×１０−８Ｍ）。
【図２Ｃ】図２Ｂは、サイトカインＴＮＦαに融合することによって多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の親和性の向上を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ＝５．６×１０−９Ｍ）。
【図２Ｄ】図２Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。
【図２Ｅ】図２Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図３】図３は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。
【図４】図４は、配列アライメントを示す。
【図５】図５は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始する）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。
【図６】図６は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図７】図７は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図８】図８は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。
【図９】図９は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１０】図１０は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図１１】図１１は、ＥＤ−Ｂ結合変異体のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。
【図１２】図１２は、６種類のユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質の配列アライメントを示す。
【図１３】図１３は、結合決定領域ＢＤＲ１およびＢＤＲ２、ならびに、図１２に示すユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のリンカーのアライメントを示す。
【図１４】図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）への、図１２に示す結合変異体１１１１−Ｅ１０についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｂは、第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６、６８位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されていることを示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｃは、ヘテロ二量体ユビキチン変異体ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２の、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１５Ｆ】図１５Ｄは、ＴＮＦαに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの配列を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ｅは、前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈの配列を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ０.９μΜ=９×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかることを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈの配列を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ１８０ｎＭ＝１．８×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかることを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓの配列を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ３．８μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかることを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓの配列を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ４．１μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
より具体的には、本発明者らは、以下の工程を含む、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の同定方法を提供する。
ａ）単量体修飾ユビキチンタンパク質から生じるヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された、異なる修飾がなされた２つ以上のユビキチン単量体または１つ以上の修飾ユビキチン単量体を含むヘテロ多量体タンパク質を含み、
前記ヘテロ多量体タンパク質に含まれる前記単量体の少なくとも２つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位の少なくとも３個のアミノ酸における表面露出アミノ酸が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾のユビキチンタンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する、前記工程
ｂ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群に対する潜在的なリガンドを提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記リガンドと接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、ヘテロ多量体修飾タンパク質を同定する工程であり、
前記ヘテロ多量体修飾タンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程、および
任意に、
ｅ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【００１７】
本願で使用されている重要な用語の定義
「ユビキチンタンパク質」は、配列番号１のユビキチン、および、下記の定義によるその修飾物を包含する。ユビキチンは、真核生物において、高度に保存されている。例えば、今日まで研究されてきた全ての哺乳類において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、げっ歯類、ブタ、および霊長類由来のユビキチン分子が、特に好ましい。また、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母由来のユビキチンは、配列番号１と３つのアミノ酸が異なるのみである。前記「ユビキチンタンパク質」に包含される前記ユビキチンタンパク質は、通常、配列番号１に対し、７０％を超える、好ましくは７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、または９７％までの配列同一性を示す。
【００１８】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度の決定には、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ｖｏｌ． １２： ３３７− ３５７， １９９１）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２（２２）： ４６７３−４６８０， １９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【００１９】
本明細書において、「リガンド」、「ターゲット」および「結合パートナー」は、同意語として使用され、置き換え可能である。リガンドは、前述のヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に、ここで定義される親和性をもって結合可能な任意の分子である。
【００２０】
本発明の「ヘテロ多量体融合タンパク質」または「ヘテロ多量体タンパク質」は、１つ以上の異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と考えられる。よって、本発明の「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質の融合体であると考えられる。前記少なくとも２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質は、特定の結合パートナーに対する一価の結合特性を共同でもたらす、２つの相互作用結合ドメイン領域を有する。ヘテロ二量体またはヘテロ三量体が好ましい。
【００２１】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的手法を使用して、互いにヘッドトゥテイル融合で結合される。前記異なる修飾融合ユビキチン単量体は、一価で結合し、両方の「結合ドメイン領域」（ＢＤＲ）が共に作用する場合にのみ効果的である。前記ヘテロマータンパク質を形成する前記修飾および結合ユビキチン単量体は、一つの連続的な結合領域を介して同じエピトープに結合する。前記ヘテロマーのこの連続的な領域は、少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体により形成される前記少なくとも２つのモジュールの両結合決定領域により形成される。
【００２２】
「ヘッドトゥテイル融合」は、２つ以上のタンパク質が、前記多量体に含まれるユニット数に応じて、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ方向においてそれらを結合することにより、互いに融合することと解釈すべきである。このヘッドトゥテイル融合において、前記ユビキチン単量体は、リンカーを介すことなく、直接連結することもできる。または、前記ユビキチン単量体の融合は、リンカーを介して行うことができる。前記リンカーは、例えば、少なくともＧＩＧのアミノ酸配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するリンカー、または、任意の他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられる。２つのユビキチン単量体の遺伝学的融合用の他のリンカーも、当該技術分野では公知であり、使用できる。要約すると、修飾ユビキチン単量体の融合タンパク質を得るために、異なる修飾がなされた２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチンタンパク質を融合させることにより、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質が提供される。さらに別の実施形態では、前記ユビキチン単量体の少なくとも１つは修飾されず、残りのユビキチン分子のうちの少なくとも１つが修飾される。
【００２３】
「群」という用語は、異種核酸によってコードされる異種ポリペプチドの混合物であるライブラリーを指す。前記ライブラリーは、核酸配列によってコードされる単一のポリペプチドをメンバーとして構成される。ライブラリーメンバー間での配列の相違により、前記ライブラリー内における多様性が得られる。前記ライブラリーは、複数のポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態であってもよいし、あるいは、核酸ライブラリーを用いて形質転換された、生物または細胞、例えば、バクテリア、ウイルス、動物または植物の細胞等の形態でもよい。個々の生物または細胞が、前記ライブラリーのメンバーを１つだけを含むのが好ましい。前記核酸を発現ベクターに組み込み、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの産生を可能にすれば有利である。したがって、好ましい態様においては、ライブラリーは、宿主生物群の形態をとってもよく、各生物が、１以上の発現ベクターのコピーを含有し、前記発現ベクターが、発現によって対応するポリペプチドメンバーを産生できる、核酸の形態にある前記ライブラリーメンバーを１つ含むよう構成してもよい。このように、前記宿主生物群は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の多大なレパートリーをコードできる可能性がある。
【００２４】
前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質群は、例えば、異なる修飾がなされた単量体タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することによって提供される。あるいは、これに代わる手法として、前記単量体ユビキチンタンパク質の少なくとも１つを修飾し、前記ＤＮＡをヘテロ多量体融合タンパク質に翻訳し、前記タンパク質をディスプレイし、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された単量体ユビキチンタンパク質を含むヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の存在下、前記ディスプレイされたタンパク質をスクリーニングすることによって提供される。前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ １０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示す。ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を得るため、異なる修飾がなされた単量体タンパク質のそれぞれまたは少なくとも１つをコードする２つのＤＮＡライブラリーの融合、ヘテロ三量体ユビキチンタンパク質を得るため、異なる修飾がなされた単量体タンパク質のそれぞれまたは少なくとも１つをコードする３つのＤＮＡライブラリーの融合等を行う。また、さらに別の代替手法を用いて、スクリーニング用のライブラリーを提供してもよい。一例として、例えば、ソリッドステート技術により前記タンパク質を化学合成し、そのアミノ酸組成にバリエーションをもたらすことが挙げられる。当業者であれば、さらに別の選択肢に想到し、その有用性を見出す可能性がある。したがって、本発明は、本明細書に記載の例に限定されるものと解釈すべきではない。
【００２５】
よって、本発明は、リガンドへの結合能によって決定される機能性によりポリペプチドのレパートリーを提供し、選択の結果得られたポリペプチドのサブセットを採用して前記ターゲットリガンドへの結合能に基づくさらなる選択ラウンドを行い、前記リガンドに対する結合親和性の蓄積および増加を図る方法を開示している。
【００２６】
本発明によれば、当業者は、選択されたポリペプチドのレパートリーから、請求項に規定の親和性で前記ターゲットリガンドに結合できないポリペプチドを除去することができる。また、本発明によれば、当業者は、選択されたポリペプチドのレパートリーにおいて、機能的で、かつ前記親和性の要件を満たすポリペプチドの濃度を高めることができる。
【００２７】
本発明の最も重要なキーポイントの１つは、前記ターゲットに対して一価の結合親和性を有する前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の選択と、それに続いて行われる、前記結合親和性に関与する前記修飾アミノ酸の決定である。
【００２８】
多量体化、好ましくは二量化のさらなる利点は、新規な高親和性の結合特性を発生するために修飾され得るアミノ酸残基の総数の増加にある。前記利点は、多くのアミノ酸が修飾されても、ターゲットに対する前記新規に生成された結合タンパク質の足場全体の安定性が低下することがなく、タンパク質の化学的完全性（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されることである。一方、所定のターゲットに対する新規結合部位を発生させるために修飾され得る残基の総数は、前記修飾残基が２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチンタンパク質に割り当てられることで増加する。修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子数に応じて、２倍またはｘ倍にできる。要約すると、ユビキチンベースの結合タンパク質のモジュール構造は、２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチン分子に前記修飾アミノ酸が含まれると、前記修飾アミノ酸の総数を増加できる。本発明の方法は、一価の特異性（一つのシングルエピトープ）を有するヘテロ多量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００２９】
「一価」は、前記修飾二量体（任意に三量体、または通常は多量体）ユビキチンの前記第１および前記第２（任意に、さらに多くの）単量体ユニットにおいて生成された両結合領域が共に、ＥＤ−Ｂに相乗的に組み合わせられるように結合する機能、すなわち、両結合領域が、共同で一価の結合活性を形成する役割を果たす機能と理解されるべきである。前記二量体分子における前記第１および前記第２修飾ユビキチン両方の各結合領域を、別々に取り除いた場合、ＥＤ−Ｂへの結合は、前記二量体分子より明らかに効率および親和性が低下するだろう。前記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で使用するよりも、より効率的にＥＤ−Ｂに結合可能となるように、両結合領域は、アミノ酸の連続領域として前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面に形成されるユビキチン結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に、前記２つの単量体タンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。最も有力な結合ユビキチン分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した単量体ユビキチンユニット同士を連結することにより、これらの分子を得てもよい。二量体修飾ユビキチンタンパク質に関して本明細書に提示する例は全て、三量体または通常は多量体修飾ユビキチンタンパク質に関するものに変更できると解釈すべきである。
【００３０】
したがって、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ多量体、特にヘテロ二量体の使用は、これらの修飾残基の全量が、前記二量体または多量体を形成する前記２以上の単量体ユニットに割り振られるため、最終的な結合分子の前記タンパク質の化学的完全性に過度に影響を与えない修飾残基数を増加させる可能性を切り開く。前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００３１】
例えば、単量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つのＤＮＡライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたコドンに異なる修飾をすることにより確立された後、ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得るために、これらのライブラリーは、遺伝学的に融合される。本発明によれば、これらのライブラリーのＤＮＡがタンパク質に翻訳され、このようにして得られたヘテロ多量体タンパク質がターゲット分子に接触されて、結合親和性が存在する場合には、パートナーへの結合が可能となる。好ましい修飾ユビキチンは、ヘテロ二量体である。
【００３２】
接触工程およびスクリーニング工程が、ヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）修飾ユビキチンタンパク質について、既に行われていることが本発明の重要な態様である。この工程により、前記ターゲットへの一価の結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングが可能である。
【００３３】
本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングにより選択した後に、前記単量体修飾ユビキチンタンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ多量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。ただし、最も有力なヘテロ多量体ユビキチン結合分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンユニット同士を連結してヘテロ二量体結合タンパク質を形成することにより、これらの分子を得てもよい。
【００３４】
本発明における接触は、適切な提示方法および選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、または細菌表面ディスプレイ等の方法、好ましくは、リボソームディスプレイ法またはファージディスプレイ法により行われる。徹底した開示のために、下記の参考文献を参照できる；Ｈｏｅｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．． ３ （１９９３）， ５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２ （１９９２）， ５９７−６０４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。前述の方法は、当業者に公知であり、本発明における修飾に使用できる。
【００３５】
本発明によれば、前記修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して、定量化できる結合親和性を有するかどうかの決定は、１以上の下記の方法により行うことが好ましい。ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および超遠心分析法。当該技術分野において利用可能なその他の方法が、技術常識の範囲内において当業者に利用可能である。
【００３６】
本明細書において、「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なる単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質であると考えられる。本発明の「ヘテロ二量体」は、異なる修飾がなされた２つの単量体ユビキチンタンパク質の融合物であると考えられる。前記２つの単量体ユビキチンタンパク質は、いずれも、特異的結合パートナーに対して、共同で一価の結合特性を示す。本発明の修飾多量体（例えば、二量体）リガンド結合ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個々にスクリーニングし、その後、これら少なくとも２つを結合することによっては、得ることができず、前記リガンドへの共同での一価の結合活性を示す第１および第２単量体ユニットまたはさらなる単量体ユニットからなる多量体（任意に、二量体）タンパク質をスクリーニングすることにより、得ることができることを強調しておく。前記各サブユニットは、前記リガンドへの結合親和性がかなり制限され、結合した多量体または二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが、本明細書に記載の優れた結合特性を有することが期待される。
【００３７】
一実施形態においては、前記方法は、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質の同定に関するものであり、２つの単量体ユビキチンユニットが互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、前記二量体タンパク質の各単量体が、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置するアミノ酸（各アミノ酸は、表面が露出されている）の少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個の置換により、異なる修飾がなされており、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％、および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
リガンドに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記リガンドに対して一価の結合活性を示す。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、各単量体ユビキチンユニットにおいて、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、６、７、８、９個または全てのアミノ酸が、修飾される。本発明においては、各単量体ユニット、例えば、第１ユニットおよび第２ユニットにおいて、これらの変異は、それぞれ組み合わせることができると理解される。例えば、前記第１ユニットが、６つの修飾を含むことができ、一方、前記第２ユニットが、７つまたは８つの修飾を含み、前記第１ユニットが８つの修飾を、前記第２ユニットが７つの修飾を含んでもよい、等である。前述に列挙する各アミノ酸は、前記第１ユニット、前記第２ユニットから選択でき、その後、前記両ユニットは、組み合わせられる。好ましい置換は、以下に記載する。
【００３９】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質のディスプレイ方法
本願に適用されるファージディスプレイ法およびリボソームディスプレイ法は、下記および実施例に記載されている。これら方法は、本明細書に記載の潜在的なリガンドに対して結合特性を示すユビキチン変異体を検出するための、本発明における選択手法の例として挙げられている。同様に、例えば、細菌上に提示する方法（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１（９）：８２５−８３２）もしくは酵母細胞上に提示する方法（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ； Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１１）：１３０３−１０）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４（１０）：４９３７−４９４２； Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ２５（２４）：５１３２−５１３４）、ｃｉｓディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０１（９）：２８０６−２８１０）もしくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択システムを、適用できる。後者の場合、遺伝子型および表現型の一過性の物理的な結合が、リボソームを介して、適切なｍＲＮＡへのタンパク質変異体の連結により達成される。
【００４０】
本明細書に記載のファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換え変異体は、繊維状ファージ上に提示される。一方、この変異体のコードＤＮＡは、一本鎖の形状でファージエンベロープパッケージされ、同時に提示される。このため、親和性濃縮の枠組みにおいて、所定の特性を有する変異体を、ライブラリーから選択でき、その遺伝情報を、それぞれ、適切な細菌に感染させることにより増幅でき、また異なる濃縮サイクルに添加できる。ファージ表面での変異したユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくはＰｅｌＢシグナル配列、および、前記ファージのカプシドまたは表面タンパク質への遺伝子融合により達成され、カプシドタンパク ｐIIIまたはそのフラグメントのカルボキシ末端融合が好ましい。また、コードされた融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる検出および／または精製のためのアフィニティータグもしくは抗体エピトープ、または、前記親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的切断のためのプロテアーゼ認識配列等のさらなる機能性成分を含んでもよい。また、例えば、ユビキチン変異体の遺伝子およびファージカプシドタンパク質またはそのフラグメントのコード領域の間に、アンバー停止コドンを存在させてもよい。前記アンバー停止コドンは、１つのアミノ酸の導入により、部分的に、適切なサプレッサー株における翻訳の際に認識されない。
【００４１】
所定のターゲットへの結合特性を有するユビキチン変異体の単離に関する選択工程に適切であり、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入された細菌ベクターは、ファージミドという。中でも、繊維状ファージの遺伝子間領域（例えば、Ｍ１３もしくはｆ１）、または、その部分を含む。例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージによる前記ファージミドを輸送する細菌細胞の重複感染の際、ファージカプシド中に、ファージミドＤＮＡの共有結合的に閉鎖された鎖（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｓｔｒａｎｄ）がパッケージングされる。このようにして発生したファージ粒子は、細菌により分泌され、前記カプシドタンパク質 ｐIIIまたはそのフラグメントとの融合により、その表面にコードされた各ユビキチン変異体を、細菌表面に提示する。本来のｐIIIカプシドタンパク質は、適切な細菌株への再感染できるように、ファージ粒子に存在する。このため、対応するＤＮＡの増幅の可能性は、保持される。このため、前記ユビキチン変異体の表現型、すなわち、潜在的な結合特性とその遺伝子型との間の物理的な結合が、確保される。
【００４２】
得られたファージ粒子を、当業者に公知の手法により、ファージ上に提示されたユビキチン変異体の、任意のターゲット、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦ、ＩｇＧ、またはその他のターゲットへの結合により選択できる。このために、前記提示されたユビキチン変異体は、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化され、結合しない変異体を分離した後に、特異的に溶出し得る。前記溶出は、例えば、１００ｍＭ トリエチルアミン等の基本溶液により行うことが好ましい。また、前記溶出は、酸性条件下で、タンパク質分解または感染細菌の直接添加により行うことができる。このようにして、得られたファージ粒子は、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦ、ＩｇＧまたはその他のターゲットへの結合特性を有するユビキチン変異体の、連続的な選択サイクルおよび増幅サイクルにより、再度増幅され、濃縮され得る。
【００４３】
ファージディスプレイのバリエーションの１つとして、Ｔａｔファージディスプレイ技術（Ｐａｓｃｈｋｅ、Ｍ． ａｎｄ Ｗ． Ｈｏｈｎｅ （２００５）．Ｇｅｎｅ ３５０（１）：７９−８８；欧州特許第１５６７６４３号明細書も併せて参照されたい）があげられる。この方法によれば、前記ファージミドにコードされた前記ユビキチン変異体が、細胞質内でネイティブ・コンフォメーションを既に獲得した折り畳みタンパク質を搬出する双アルギニン転座（Ｔａｔ）系を介して分泌される。（Ｂｒｕｓｅｒ ２００７ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６（１）：３５−４５）。分泌の必要条件は、前記ユビキチン変異体をＴａｔポアへと向かわせる特定のＮ末端シグナルペプチドとの融合である。細胞膜周辺腔への進入後、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによって除去される。前記細胞膜周辺腔において、前記ユビキチン変異体は、カプシドタンパク ｐIIIまたはそのＣ末端フラグメントに共有結合され、その他のファージタンパク質と共に、Ｓｅｃ経路を介して細胞質から分泌される。ユビキチンとｐIII間のこの結合は、前記ｐIIIタンパク質のＮ末端におけるＪｕｎロイシンジッパーと、前記ユビキチン変異体のＣ末端におけるＦｏｓロイシンジッパーとの高親和性相互作用によって実現される。前記各ロイシンジッパーのＮ末端およびＣ末端におけるさらなるシステインにより、両タンパク質間の共有結合が可能となり、その結果、ディスプレイされたユビキチンおよびコードされた遺伝子産物間の共有結合が、前記ファージ粒子内で可能となる。
【００４４】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、前記ユビキチン変異体が、まだファージミドの形態にあるとき、すなわち、ファージに融合され、または、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、可溶性のタンパク質の形態にあるときに行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。前記特性評価は、例えば、ＤＮＡ配列の決定、よって、単離された変異体の一次配列の決定を含んでもよい。また、単離された変異体の親和性および特異性は、例えば、標準的な生化学的方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、または超遠心分析法により検出できる。安定性分析については、例えば、化学的または物理的変性についての分光法が、当業者に公知である。その他の周知な方法としては、ＣＤスペクトル測定、タンパク質蛍光分光法、および核磁気共鳴分光法がある。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチン変異体のリボソームディスプレイ法を、無細胞転写／翻訳系の手法により準備し、対応するｍＲＮＡおよびリボソームが複合体として提示される。このために、前述のＤＮＡライブラリーは、基礎として使用され、変異体の遺伝子は、対応する発現およびタンパク質生合成の制御配列との融合の形態で提示される。前記遺伝子ライブラリー３’末端での前記停止コドンの欠失、および、前記新生タンパク質からなる三元複合体に適した実験条件（低温、高濃度のＭｇ２＋）により、前記ｍＲＮＡおよび前記リボソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳中において維持される。
【００４６】
各単量体ユビキチンユニットにおける選択されたアミノ酸の異なる修飾により、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが確立された後に、本発明によれば、前記修飾二量体タンパク質は、ターゲットに接触され、結合親和性を有する場合には、パートナー同士の結合を可能にする。これらのタンパク質ライブラリーは、前記修飾タンパク質と前記ターゲットタンパク質間の接触を可能とする方法で、前記修飾タンパク質を提示する任意の他の方法をディスプレイし、または使用する、ディスプレイ法ライブラリーの形態でもよい。前記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイ法である。
【００４７】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の潜在的なリガンドおよびターゲット
本発明は、下記の代表的な抗原、すなわち、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦおよびＩｇＧについて、十分に立証されている。これらの抗原は、あくまでも、当業者が本明細書中に提供される情報を取得した後、本明細書に記載の方法を、過度の負担を伴うことなく、十分実施可能である旨を示すために選択されたものと解釈されるべきである。本発明は、これらの特定の抗原に制限されることなく、当該技術分野において公知である全ての、もしくは少なくともほとんどのリガンドおよびターゲット分子について実施可能である。これらのターゲットは、当業者であれば、当該技術分野の技術常識の範囲内において選択可能である。リガンドおよびターゲット、ならびに抗原およびハプテンの一般的な定義を以下に示し、さらに別の潜在的なターゲット分子を選択して、例示としてあげる。
【００４８】
本発明において、抗原とは、抗体と同等の機能を有する本明細書記載の修飾ユビキチンに結合可能な物質を指す。本明細書中で用いられる代替用語は、「リガンド」、「結合パートナー」、または「ターゲット」である。本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、抗体と同様に作用しながら、抗体の欠点を回避する結合分子を提供する。抗原という用語は、ハプテン、ペプチド、タンパク質、糖、ＤＮＡ等を包含する。Ｒｏｃｈｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ Ｍｅｄｉｚｉｎ（第４版；Ｕｒｂａｎ ＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＧｍｂＨ）から、抗原およびハプテンについて次の定義を得ることができ、本明細書においても使用される。
【００４９】
抗原（ＡＧ）は、免疫系により異種（非自己）と認識される任意の物質を意味する。ほとんどの場合、免疫反応を引き起こし、免疫に至る（＝免疫原）。アレルギー（＝アレルゲン）およびアトピー（＝アトピゲン）の場合、それぞれ、この免疫反応が拡大する。ＡＧは、体液性（抗原抗体反応）および／または細胞性防御反応（免疫、下記参照）を誘導する。ＡＧが免疫系により許容される場合（免疫寛容）、「免疫寛容原」ともいう。抗原として有効なものは、主に、免疫反応に関与する化学的に特定できる機能性（決定因子）を有する複合体、またはより大きな分子量の物質（タンパク粒、多糖、ヌクレオチド、および多くの合成化合物）である。前記抗原は、１）完全ＡＧ：ほとんどの場合、より大きな分子量を有し、それ自身で免疫反応を誘導できるもの；２）低分子量ハプテン（＝半抗原）；より大きなキャリア分子と結合した後でのみ免疫原として作用するもの；に分類される。前記抗原は、例えば、異物−、非自己−または同種同系−、自家ＡＧ；自己−、ヘテロ−、移植−、抗腫瘍ウイルスＡＧ等ともいう。
【００５０】
ハプテンは、抗原（ＡＧ）の特異性に関与し、または、その構造（決定因子）に起因して抗体に特異的に結合できる、単純な低分子量化合物であるが、完全ＡＧとは対照的に、それ自身ではアレルギーを生じることはできない。キャリアと呼ばれるタンパク粒と結合した後に完全な抗原となる。
【００５１】
「リガンド」、「ターゲット」、または「結合パートナー」は、本明細書に記載の修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質によって認識される分子である。本発明の実施に際して採用できるリガンドは、特に制限されず、例えば、細胞膜受容体に対する作用物質および拮抗物質、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ポリペプチド、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、薬剤（例えば、オピエート、ステロイド等）、レクチン、糖、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体があげられる。
【００５２】
要約すると、本発明により提供される修飾タンパク質の結合パートナーとしては、生物学的・医学的な活性を有する、あらゆる関連分子を採用可能である。考えられる結合パートナーを、例を挙げて以下に述べる。ただし、このリストには、複数の他の考えられるリガンドも加えることができることに留意されたい。抗体と抗原の関係と同様に、潜在的な結合パートナーのリストは、さらなる潜在的なリガンドを加えることで完全なものとすることができる。
【００５３】
この発明においては、ヘテロ二量体ユビキチンの結合パートナーは、例えば、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）、サイトカイン（腫瘍壊死因子α）（ＴＮＦ−ａ）、ＭＩＡ−２、免疫グロブリンまたはその一部、例えば、全抗体（例えば、免疫グロブリンＧ）、および成長因子（例えば、ＮＧＦ、例えば、ヒト神経成長因子）があげられる。これらのリガンドについて、以下に簡潔に述べる。しかしながら、これらのリガンドは全て、長年にわたって当該技術分野において周知であり、各技術分野における当業者に公知であることを強調しておく。したがって、以下の記載は、アミノ酸配列も公知である、これらのタンパク質のいくつかの重要なパラメータの概要に過ぎない。
【００５４】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、プライマリーＲＮＡ転写物の代替スプライシングによってフィブロネクチン分子に挿入された、小さいドメインである。ＥＤ−Ｂは、癌および乾癬に関与することが知られている。驚くべきことに、高レベルのＥＤ−Ｂ発現は、胸、結腸直腸、非小細胞肺、膵臓、肝細胞、頭と首、およびヒトの肌、ならびに頭蓋内髄膜腫、グリオブラストーマを含むほとんど全てのヒトの固体癌のエンティティにおける一次病変、ならびに転移性部位において検出された（Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５）。さらに、ＥＤ−Ｂは、診断剤と結合でき、診断ツールとして有用である。一例として、例えば、動脈硬化プラークの分子の画像化や、例えば、癌患者の免疫シンチグラフィーによる、癌検出おける使用があげられる。さらに多くの診断用に使用できると考えられる。
【００５５】
フィブロネクチンのヒトエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）における９１個のアミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。前記タンパク質の発現のため、開始メチオニンを加えなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、げっ歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等において保存されている。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物は、例えば、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。
【００５６】
前記タンパク質ＭＩＡ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＣＤ−ＲＡＰ（軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質）ともいう）は、軟骨細胞において発現され、元来、そのｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗増殖特性によって単離されていた。元来、メラノーマ細胞の細胞培養上清から検出され、そこから単離されていた。前記タンパク質の精製および部分的な配列決定を行った後、ヒトＭＩＡのｃＤＮＡフラグメントを、ディジェネレートプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を利用して単離した。現在、ＭＩＡについては、ヒト、マウス、ウシ、ラット、およびゼブラフィッシュの配列が公知である。関連タンパク質であるＭＩＡ−２が、欧州特許第１４１０８０３号明細書および米国特許出願公開２０１０／０２１２０３７号明細書に記載されている。これらの文献は、引用により、本明細書に組み込まれる。
【００５７】
多面サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、主としてマクロファージによって生成されるが、その他の種類の細胞も、これを生成する。ＴＮＦαは、有益かつ病理学的な活性を示す。ＴＮＦαは、自己制御型であることに加え、増殖促進効果と増殖抑制特性との両方を有する。ＴＮＦαの有益な機能としては、身体のサーカディアンリズムを調節することによる恒常性の維持、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫感染に対する免疫応答の開始、線維芽細胞成長の刺激による損傷組織の交換または再構築、およびその名が示唆する通り、ある種の腫瘍の死滅があげられる。ＴＮＦαは、多岐にわたる疾患のメディエータとされてきた。
【００５８】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、感覚ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存と分化を促進する分子として、５０年以上前に発見された分泌タンパク質である。ＮＧＦは、ニューロトロフィンとして知られる神経栄養因子のファミリーメンバーである。ＮＧＦは、ＴｒｋＡとして知られるトロポミオシン受容体キナーゼに高親和性で結合する。また、ＮＧＦは、ｐ７５として知られる受容体にも結合可能である。ｐ７５は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、他のニューロトロフィンとも相互作用する。ＮＧＦのβ鎖は、ＮＧＦの神経成長刺激活性にのみ関与している。前記β鎖は、ホモ二量体化し、より大きなタンパク質複合体に取り込まれる。ＮＧＦの構造および機能は、例えば、Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ， Ｍ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２４：１２１７−１２８１；Ｗｅｉｓｍａｎｎ， Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．Ｍ． （２００１） Ｃｅｌｌ． ＭｏＩ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５８：７４８−７５９；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ， Ｍ． （１９９１） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：１−２６、において考察されている。
【００５９】
ＩｇＧ抗体は、４本のペプチド鎖からなる約１５０ｋＤａの大きな分子である。ＩｇＧ抗体は、約５０ｋＤａの同一の２本の重鎖と、約２５ｋＤａの同一の２本の軽鎖を含み、これにより、四量体四次構造を有する。前記２本の重鎖は、ジスルフィド結合により、互いに結合すると共に、軽鎖に結合している。この結果生じた四量体は、２つの同一の二等分部分（ｈａｌｖｅｓ）を有し、これらの部分は共同でＹ字形状を形成している。分岐の各端部は、同一の抗原結合部位を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ−糖化部位を有している。この部位に付着したＮ−グリカンは、大部分が、複合型のコアフコシル化二分岐構造を有する。さらに、これらＮ−グリカンの少量は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃおよびα−２，６結合シアル酸残基も有する。
【００６０】
ディスプレイされたタンパク質の選択、濃縮、および特性評価の方法
１０−７〜１０−１２Ｍの範囲のＫｄの特異的結合親和性による所定のターゲットへの結合活性に関して、ヘテロ多量体修飾ユビキチンの選択を、当業者に公知の方法により行うことができる。このために、例えば、リボソーム複合体で提示される前記ユビキチン変異体を、それぞれ、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化させ、または、溶液中で結合した後に磁性粒子に結合させ得る。非結合変異体の分離に続けて、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、リボソーム複合体の破壊により、ｍＲＮＡの形態で特異的に溶出できる。前記溶出は、ＥＤＴＡで行うのが好ましい。このようにして得られた前記ｍＲＮＡは、単離され、適切な方法を使用してＤＮＡに逆転写され（逆転写反応）、このようにして得られた前記ＤＮＡは、再度増幅され得る。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択、および増幅の連続サイクルにより、所定のハプテンまたは抗原への結合特性を有するユビキチン変異体を、濃縮できる。
【００６２】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、前述のように、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、前記文献に記載されている。
【００６３】
好ましくは、所定の結合パートナーに対する結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、前記検出されたタンパク質の単離工程および／または濃縮工程が続く。
【００６４】
前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体公知の方法によりさらに、精製および濃縮される。前記選択された方法は、例えば、使用する発現ベクター、宿主組織、意図する使用分野、タンパク質の大きさ、およびその他の要因等、それ自体当業者に公知の複数の要因により決定される。簡易に精製するために、本発明の修飾タンパク質は、分離材料への高い親和性を有する他のペプチド配列に融合させることができる。ユビキチンタンパク質の機能性に有害な効果を有さないか、または、特定のプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能な融合が、好ましく選択される。このような方法は、それ自体当業者に公知である。
【００６５】
突然変異誘発の開始点としての非修飾および修飾ユビキチンタンパク質
「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」は、さらに後述する結合領域を一つ含むユビキチンタンパク質を指す。結合領域は、少なくとも２つの結合決定領域（ＢＤＲ）を指すことができる。各単量体は、少なくとも１つ結合決定領域を有し、少なくとも２つの単量体が、１つの抗原に対する１つの結合領域を形成する少なくとも２つの結合決定領域を有する多量体を形成する。このようなユビキチンベースの結合タンパク質は、いずれも、例えば、多量体化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等の結合ドメインでない付加的なタンパク質ドメイン、および／または、非タンパク性のポリマー分子を含んでもよい。非タンパク性のポリマー分子は、例えば、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等である。
【００６６】
前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質のさらなる多量体化を、例えば、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、多量体化ドメインを有するエフェクター分子（例えば、ＴＮＦα）に、翻訳後に融合させることによって行うことも可能である。さらに別の実施形態においては、さらなる多量体化が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの使用により行われる。さらに別の実施形態においては、前記多量体化ドメインは、薬学的活性成分としても作用する。一例としては、多量体化ドメインおよび薬学的成分の両方として作用するＴＮＦαがあげられる。
【００６７】
修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質
「修飾ユビキチンタンパク質」は、アミノ酸の置換、挿入または欠失のいずれか一つ、または、それらの組み合わせによる、前記ユビキチンタンパク質の修飾を指す。ただし、上記修飾のいずれか一つによりなされる修飾で、最も好ましいのは置換である。前記修飾単量体ユビキチンユニットは、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つであるアミノ酸同一性を有するため、前記修飾数は厳密に限定されている。それゆえ、単量体ユニットにおける全修飾アミノ酸数、好ましくは、全置換数は、８０％のアミノ酸同一性に対応して、最大で１５個のアミノ酸に限定される。代替例として、修飾アミノ酸数が、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個であってもよい。前記二量体ユビキチン分子における全修飾アミノ酸数、好ましくは、全置換数は、前記二量体タンパク質に基づく、２０％のアミノ酸の修飾に対応して、３０個である。代替例として、前記二量体ユビキチン分子中の修飾アミノ酸数が、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個であってもよい。前記二量体修飾ユビキチンタンパク質の前記アミノ酸同一性は、配列番号１の基本単量体配列を有する二つの非修飾単量体ユビキチンタンパク質からなる二量体ユビキチンと比較して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つから選択される。
【００６８】
本発明の方法で得られる前記修飾ユビキチンタンパク質は、ターゲット分子、リガンド、または結合分子（これらの表現は、本明細書において相互に用いられる）に対する新規な結合親和性を有する組換え人工タンパク質である。
【００６９】
「置換」は、例えば、元のアミノ酸への化学基もしくは残基の置換または付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。βシート領域の少なくとも一つのβ鎖に位置するアミノ酸、または、前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸を含む前記タンパク質の少なくとも一つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が、重要である。
【００７０】
修飾は、当該技術分野において、十分に確立された公知の方法により行われる。「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」は、いくつかの部位が、ヌクレオチドまたはアミノ酸により挿入、欠失または置換され、特性が予測できないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。多くの場合、挿入された前記ランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列、または、ヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダム」であろう（例えば、ランダム化合成またはＰＣＲを介した突然変異の結果として）。ただし、前記ランダム配列は、共通の機能的特性（例えば、発現産物のリガンドへの反応性）を有する配列を含み得る。また、前記ランダム配列は、最終的な発現産物が、例えば、異なるアミノ酸が均等に分布した、完全にランダムな配列であるという意味で、ランダムでもよい。
【００７１】
ランダム化されたフラグメントをベクター中に適切に導入するために、本発明では、前記ランダムヌクレオチドは、部位特異的ＰＣＲを介した突然変異の方式により、発現ベクター中に導入されるのが好ましい。ただし、他の選択肢は、当業者に公知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーを同様にベクターに挿入可能である。
【００７２】
融合ＰＣＲにより変異体またはライブラリーを発生させるために、例えば、３回のＰＣＲ反応を行ってもよい。２回のＰＲＣ反応は、部分的に重なった中間体フラグメントを発生するように行われる。３回目のＰＣＲ反応は、前記中間体フラグメントを融合するように行われる。
【００７３】
ライブラリーまたは変異体株の構築方法は、所望の制限酵素認識部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）の第１セット、および、例えば、目的のコドンの上流および下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）の第２セットを構築する工程を含んでもよい。制限酵素認識部位プライマーは、フォワード制限酵素認識部位プライマーおよびリバース制限酵素認識部位プライマーを含む。変異原性プライマーは、フォワード変異原性プライマーおよびリバース変異原性プライマーを含む。一実施形態において、前記プライマーは、目的のコドンのすぐ上流およびすぐ下流について構築される。前記制限酵素認識部位プライマーおよび前記変異原性プライマーは、前記第１中間体フラグメントおよび前記第２中間体フラグメントの構築に使用される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直線状の中間体フラグメントが生成される。これらの各直線状の中間体フラグメントは、少なくとも一つの目的の変異コドン、フランキングヌクレオチド配列、および切断部位を含む。前記３回目のＰＣＲ反応では、前記２つの中間体フラグメント、ならびに前記フォワード制限酵素認識部位プライマーおよび前記リバース制限酵素認識部位プライマーが使用され、直線状の融合産物が生成される。一方、前記直線状の産物の結合していない末端は、制限酵素で切断され、前記直線状の産物に付着末端が作製される。前記直線状の産物の前記付着末端は、ＤＮＡリガーゼの使用により融合され、環状の産物、例えば、環状のポリヌクレオチド配列が生成される。
【００７４】
前記中間体フラグメントの構築のために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのセットについての設計および合成が行われる。前記２つのセットは、制限酵素切断部位およびそのフランキングヌクレオチド配列を含む第１セット、ならびに、目的の変異コドンを少なくとも一つ含む第２セット（変異原性プライマー）を含む。当業者は、前記変異の数が所望の変異アミノ酸修飾の数に対応することを認識するであろう。本願発明者は、他の制限酵素が前記工程に使用可能かを熟考した。この切断部位の正確な位置、ならびに、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの対応する配列は、適宜改変され得る。当該技術分野において利用可能な他の方法も、代替として使用し得る。
【００７５】
本発明において、足場に導入される発現産物のランダム化フラグメントを有することを除けば、前記ランダム化ヌクレオチド配列を、少なくとも一つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合させることにより、融合パートナーに前記ランダム配列を連結する必要がある。融合パートナーは、例えば、前記発現産物の発現および／または精製／単離および／または、さらに安定化を促進できる。
【００７６】
精製のため、前記融合パートナーは、Ｈｉｓ６タグ、ｍｙｃタグ、ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化ターゲット配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴ等の精製標識を含んでもよい。さらに、前記融合パートナーは、選別シグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）配列またはターゲティング配列を含んでいてもよい。
【００７７】
本発明によれば、前記ターゲット分子に特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、前記ターゲット分子に対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できるように、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はない。
【００７８】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくはランダム変異導入法による、好ましくは遺伝学的レベルでの突然変異、すなわち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【００７９】
置換は、特に、ユビキチンタンパク質のβシートの４つのβ鎖の表面露出アミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接する３つ目までの表面露出アミノ酸において行われる。各β鎖は、通常、５〜７個のアミノ酸からなる。配列番号１に関して、例えば、単量体ユビキチンの前記β鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、１２〜１６、４１〜４５および６５〜７１を包含する。付加的にかつ好ましく修飾され得る領域は、前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸（すなわち、１番目、２番目または３番目）の部位を含む。付加的にかつ好ましく修飾され得る前記好ましい領域は、特に、アミノ酸残基８〜１１、６２〜６４および７２〜７５を含む。前記好ましい領域は、２つのβ鎖が互いに結合したβターンを含む。好ましいβターンとしては、例えば、アミノ酸残基６２〜６４があげられる。前記β鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は、８位のアミノ酸である。また、アミノ酸置換のさらなる好ましい例は、３６、４４、７０、７１、および／または７３位である。例えば、付加的にかつ好ましく修飾され得る領域は、６２、６３および６４位のアミノ酸（３個のアミノ酸）、７２、７３位のアミノ酸（２個のアミノ酸）、または８位のアミノ酸（１個のアミノ酸）を含む。
【００８０】
付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上のアミノ酸に限定され、前記へテロ二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８個のアミノ酸に限定され、通常は、前記単量体タンパク質における修飾数のｘ倍である。通常、単量体分子においては、１〜１０個のアミノ酸が挿入され、および／または１〜７個のアミノ酸が欠失される。単量体分子当たり、６個以上１４個以下のアミノ酸が置換される。二量体分子においては、合計で１２個以上２８個以下のアミノ酸が置換され、および／または合計で１個以上２０個以下のアミノ酸が挿入され、および／または１個以上１４個以下のアミノ酸が欠失される。これらの数値の間に存在するあらゆる数字が使用可能であり、本発明の範囲内である。また、分子の全体的な構造的完全性が維持されるのであれば、欠失、挿入、置換数のあらゆる組み合わせが可能である。本発明の一実施形態では、βシート構造が維持される。
【００８１】
任意の実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個に限定され、それに応じて、前記二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個に限定される。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【００８２】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、請求項で特定され本明細書で説明された前記置換に加えて、１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を含む場合には、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられる前記アミノ酸部位を、対応するタンパク質同士で分配するために、前記修飾ユビキチンについてアライメントさせなければならない。融合タンパク質の場合（後述を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（およびアライメント）は、同様の方法によりなされる、すなわち、例えば、二量体のアライメントは、各サブユニットの１位のアミノ酸から開始される。
【００８３】
前記単量体ユビキチンタンパク質、好ましくは、例えば、ヒト等の哺乳類由来の単量体ユビキチンにおいて、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％が修飾されることができ、好ましくは置換される。β鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の好ましくは最大で約５０％、さらに好ましくは最大で約４０％または約３５％、約３０％以下、または約２５％以下が修飾され、好ましくは置換される。通常、一つのβ鎖において、１〜４個のアミノ酸が修飾される。一実施形態では、β鎖、好ましくは、第１β鎖および第４β鎖、例えば、２〜７位もしくは６５〜７１位のアミノ酸残基の領域において、６個のアミノ酸のうちの２個が修飾される。
【００８４】
ヘテロ多量体の構成要素として使用される本発明の修飾単量体ユビキチンは、合計で、２０％以下のアミノ酸が修飾される。これを考慮すると、配列番号１に対する前記修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は、少なくとも８０％である。本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、さらに、少なくとも９０％、少なくとも９２％、または少なくとも９５％である。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列の前記修飾ユビキチンタンパク質をも包含する。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、予め修飾されたユビキチン（配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位におけるアミノ酸の３、４、５、６、または７個が修飾されている）を、ターゲットへの結合特性を発生するためのさらなる修飾の開始点として使用し、配列番号１のユビキチンのアミノ酸が、合計で、９、１０、１１、１２、１３、１４、最大１５個までの修飾された、好ましくは置換されたユビキチンを得る。例えば、さらなる修飾は、７４および７５位のアミノ酸または４５位のアミノ酸における修飾を含むことができ、この修飾により、より良好な安定性またはタンパク質化学特性を発生する。一例によれば、ヘテロ多量体タンパク質の構成要素としての修飾単量体ユビキチンは、このような方法により、１４個の置換および１個の欠失を有するものが得られた。ユビキチンの総アミノ酸数に基づいて、これは、約２０％の割合に相当する。このことは、非常に驚くべきことであり、通常、もっと低い割合で、十分にタンパク質のフォールディングを阻害してしまうため、予測できなかったことである。
【００８６】
本発明の一実施形態において、これらのアミノ酸は、タンパク質表面上に連続的な領域を形成する、新規な結合特性を有する領域の発生のために修飾される。このようにして、前記標的リガンドへの結合特性を有する連続的な領域を発生させることができる。本発明において、「連続的な領域」は、以下の通りである。側鎖の電荷、空間的構造および疎水性／親水性により、それに対応して、アミノ酸は、その環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、通常は、水または、例えば、空間的に近いアミノ酸等の他の分子であり得る。タンパク質に関する構造情報および各種ソフトウェアの手段により、前記タンパク質表面の特徴を決定できる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との接触領域を、この接触領域がどのような構造であるか、溶媒に接触しやすい表面領域はどれか、または、前記表面において電荷がどのように分布しているか、についての情報を含むこの方法により可視化できる。連続的な領域は、例えば、適切なソフトウェアを使用したこの種の可視化により明らかにされ得る。このような方法は、当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体が、表面上の前記連続的な領域として使用され、新規な結合特性の発生のために修飾され得る。一実施形態において、この目的のための修飾は、αへリックス領域を含んでもよい。ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質において、結合決定領域は、１つの結合決定領域の２倍の長さを有する１つの連続的な領域を共同で形成する、２つの前記表面露出領域を含む。
【００８７】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位の少なくとも一方を含む、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の修飾が、重要である。前記「βシート構造」は、本質的にシート状で、ほぼ完全に伸長されている（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）ことにより定義される。一方、ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるαへリックスに対して、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造において離れて位置する領域同士が、近傍同士となることができる。β鎖は、概して、５〜１０個のアミノ酸長を有し（通常は、ユビキチンにおける５〜６残基）、ほぼ完全なストレッチ構造を有する。前記β鎖は、互いに近接し、一方の鎖のＣＯ基と他方の鎖のＮＨ基との間で水素結合が形成される。逆もまた同様である。βシートは、複数の鎖から形成され得、シート状構造を有し、Ｃα原子の部位が、シート状平面の上方または下方の間で交互に入れ替わる。アミノ酸側鎖は、このパターンに追随し、そして、上端もしくは下端に向く。前記β鎖の方向により、前記シートは、平行シートおよび逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも、変異可能であり、請求されたタンパク質の調製に使用可能である。
【００８８】
前記βシート構造の突然変異のために、表面に近いβ鎖領域または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位が、ユビキチンにおいて選択される。表面露出アミノ酸は、利用可能なＸ線結晶構造により同定できる。利用できる結晶構造がない場合、利用可能な一次構造に関して、表面露出βシート領域および個々のアミノ酸部位の接触性を予測するか、もしくは３次元タンパク質構造のモデリングを行い、これにより、潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を入手するという、コンピュータ解析手法による試みをなし得る。さらなる開示は、例えば、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７ Ａｐｒ ５； １９４（３）：５３１−４４． Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｂｕｇｇ Ｃ．Ｅ．， Ｃｏｏｋ Ｗ．Ｊから得ることができる。
【００８９】
前記βシートまたは前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位における修飾を行えるが、突然変異を生成させるアミノ酸部位の前選択は時間がかかるため、除外し得る。前記βシート構造または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境（ＤＮＡ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から単離し、ランダム突然変異に供し、その後、それらを予め除去したタンパク質をコードするＤＮＡに再度組み込む。続いて、所望の結合特性を有する変異体の選択工程を行う。
【００９０】
本発明の他の実施形態において、表面に近い、前記β鎖領域または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位は、前述のように選択され、これらの選択された領域内部の突然変異誘発された前記アミノ酸部位は、同定される。ついで、このようにして選択されたアミノ酸部位は、部位特異的突然変異によりＤＮＡレベルで、突然変異され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め選択された他の特定のアミノ酸をコードするコドンにより置換されるか、あるいは、この置換を、置換されるアミノ酸部位は規定されるが、新規な未定のアミノ酸をコードするコドンは規定されないランダム突然変異として行う。
【００９１】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性が、モデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性と比較して８％以上である場合、前記アミノ酸は、「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸部位は、それぞれ、本発明により選択される、潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位でもある。また、参考文献として、Ｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ７０９ − ７１３， ａｎｄ Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ， １９７３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７９（２）：３５１−３７１があげられ、開示の全てを、引用により本願に取り込む。
【００９２】
元のタンパク質および互いのタンパク質から新たに発生させた人工結合部位の領域における、アミノ酸置換によるユビキチンの変異体を、対象とされた各配列セグメントのターゲット突然変異により、発生できる。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性／親水性等の所定の特性を有するアミノ酸を、それぞれ、各特性を有するアミノ酸で交換または置換できる。置換の他に、「突然変異」、「修飾」および「交換」は、挿入および欠失も含む。タンパク質レベルにおいて、前記修飾を、当業者に公知の方法によるアミノ酸側鎖の化学的改変により行ってもよい。
【００９３】
ユビキチンの突然変異方法
各配列セグメントの突然変異の開始点として、例えば、当業者に公知の方法により、調製され、改変され、増幅されたユビキチンのｃＤＮＡを使用できる。一次配列の比較的狭い領域（例えば、１〜３個のアミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬および方法が利用可能である（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；「Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、Ｂｉｏｒａｄ）。大きい領域の部位特異的な突然変異には、具体的な態様として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当業者に利用可能である。この目的のために、所望の部位が変性された塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合は、例えば、変異の誘導に使用できる。これは、イノシン等のゲノムＤＮＡに自然には発生しない塩基対類似体の使用によってもなされ得る。
【００９４】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位の１つ以上の突然変異の開始点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡでもよい。また、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は、合成的に調製されてもよい。
【００９５】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国特許第５，７８９，１６６号明細書、米国特許第４，８７３，１９２号明細書参照）があげられる。
【００９６】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略について、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０に考察されている。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【００９７】
突然変異に利用可能な公知の他の手法は、部位特異的突然変異の方法、ランダム突然変異の方法、ＰＣＲを使用する突然変異または類似の方法である。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異が生成される前記アミノ酸部位は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関して、請求項１の限定を満たすように行われる。いずれの場合にも、異なる変異のライブラリーは、通常、公知の方法によりスクリーニングされて確立される。修飾されたユビキチンタンパク質について、十分な構造情報が利用可能な場合には、通常、修飾されるアミノ酸の前選択が、特に簡易に行われ得る。
【００９９】
例えば、ＰＣＲ、化学的突然変異、または細菌の突然変異誘発株の使用による標的変異ならびに長い配列セグメントの突然変異のための方法もまた、従来技術に属しており、本発明においても使用可能である。
【０１００】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国特許第５，７８９，１６６号明細書、米国特許第４，８７３，１９２号明細書参照）があげられる。
【０１０１】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略について、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０に考察されている。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【０１０２】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換を、非常に簡易にＰＣＲの手段により行うことができる。前述の部位が、前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに位置しているためである。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端である。そこで、突然変異ＰＣＲ反応に使用される前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される２、４、６および／または８位のコドンから離れており、ユビキチンの配列におけるアミノ末端のコード鎖に対応する。したがって、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位から離れており、少なくとも部分的に、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖に対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を使用して行うことができる。
【０１０３】
また、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、他のポリメラーゼ連鎖反応に添加できる。本発明によれば、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための次の選択工程での使用に適したベクター系中に、得られた前記遺伝子カセットを導入するのが好ましい。
【０１０４】
本発明によれば、選択されたリガンドに特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、選択されたリガンドに対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はなく、よって任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できる。
【０１０５】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム変異導入法による遺伝学的レベルでの突然変異、すわなち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【０１０６】
本発明によれば、修飾ユビキチンタンパク質は、より好ましくは、化学的合成により調製することができる。好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。任意に、挿入または欠失されるアミノ酸数は、１〜１０、１〜５、２、３、または４個である。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【０１０７】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べる修飾されたアミノ酸配列のユビキチンが、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−１０Ｍ以下）で、そのターゲットと結合することを見出した。
【０１０８】
ユビキチンの修飾領域
修飾領域は、基本的に、選択された結合パートナーに接触可能かどうか、および、タンパク質の全体構造が、推測上修飾に耐性を示すかどうかで、選択され得る。
【０１０９】
表面露出β鎖における修飾の他に、前記タンパク質の他の表面露出領域も修飾でき、前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位において行われるのが好ましい。これらの修飾領域は、新規に発生させる、ターゲットに対する高い結合親和性に関与する。
【０１１０】
本発明の別の好ましい実施形態においては、ユビキチン、好ましくは哺乳類またはヒトのユビキチンにおける、少なくとも３、４または６個、任意に、少なくとも８、１０、１２個、最大で１５個の表面露出アミノ酸を、前記単量体ユビキチンにおいて修飾できる。前記修飾は、置換が好ましい。これは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の、ユビキチンの表面露出アミノ酸の修飾を含む。これらの３個以上１５個以下の表面露出修飾アミノ酸が、所定の結合パートナーへの結合親和性を有する領域を形成する。この領域を、本明細書中では「結合ドメイン領域（ＢＤＲ）」と定義する。この点において、少なくとも２個、任意に、少なくとも４個、さらに任意に、少なくとも６、８、１０、１２個、最大１５個の前記表面露出アミノ酸が、βシート領域、すなわちβシート鎖に存在すること、もしくは、複数のβ鎖に分布して存在すること、またはβシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位に存在することが特に好ましい。また、全て修飾、好ましくは、全て置換されている少なくとも３個のアミノ酸が、一次配列において、互いに直接隣接していることがさらに好ましい。
【０１１１】
本発明の他の任意の実施形態において、前記タンパク質における４つのβ鎖の１つもしくは２つにおけるアミノ酸、好ましくは２つにおけるアミノ酸、または、好ましくは前記４つのβ鎖の２つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、修飾され、新規の結合特性が発生する。前記４つのβ鎖の３つもしくは４つにおける修飾、または前記β鎖の３つもしくは４つに隣接する３つ目までのアミノ酸部位の修飾も、選択されたターゲットまたはリガンドへの結合発生のために、任意で行ってもよい。
【０１１２】
アミノ末端およびカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、または、アミノ末端およびカルボキシ末端鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、前記リガンドまたはターゲットへの新規の結合部位を発生させる。この点において、前記カルボキシ末端βシート鎖に隣接する４つ目までのアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、および、前記アミノ末端β鎖に隣接する１つ目のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される。
【０１１３】
本発明によれば、ユビキチンは、そのアミノ酸が修飾され、好ましくは、前記修飾は、哺乳類のユビキチン、好ましくはヒトのユビキチンにおける下記の部位、すなわち、２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位のアミノ酸の少なくとも３個の置換であるのが好ましい。前記アミノ酸グループの少なくとも３個のアミノ酸は、特定の結合パートナー、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＮＧＦ、ＩｇＧ、ＭＩＡ−２、またはその他のターゲットに対して、従来は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の発生に特に適していることが見出された、ユビキチンの表面に連続的な表面露出領域を形成する。これらのアミノ酸残基の少なくとも３個は、修飾されなければならない。任意に、前記アミノ酸残基の３、４、５、６、７、８、９、または１０個が修飾、好ましくは置換され、任意に付加的なアミノ酸残基を組み合わせることもできる。
【０１１４】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度を決定する目的で、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７，１９９１）（本願出願人および多重配列比較分析に関する本願出願人の研究所から、無料で入手可能）を採用でき、または、Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記誘導体の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【０１１５】
前記結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、例えば、下記の方法から選択できる：ＥＬＩＳＡ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、本発明のヘテロ多量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。例えば、米国特許第７,８３８,６２９号明細書を参照でき、当該文献の全内容が、引用により本明細書に組み込まれている。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質は、例えば、治療または診断に関連する放射線核種用の、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンドを含んでもよい。低分子の有機化合物または非アミノ酸化合物、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等を含んでもよい。本発明の好ましい一実施形態において、前記ユビキチンベースの結合分子は、ペプチド性の、アミノ酸ベースのリンカーもしくはリガンド、または治療または診断特性を有するタンパク質に結合される。
【０１１８】
結合特性（解離定数）
前記本発明の融合タンパク質の結合特異性は、Ｋｄで与えられる非融合タンパク質で前述のように定義したのと同様である。本発明によれば、特異的結合親和性を定義する「Ｋｄ」は、１０−７〜１０−１２Ｍの範囲である。１０−５Ｍ以下の値であれば、定量化可能な結合親和性であると考えられる。適用に応じて、Ｋｄの値は、例えば、クロマトグラフィーへの適用の場合には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍが好ましく、または、診断もしくは治療への適用の場合には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍが好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍであり、好ましくは、１０−１１Ｍである。
【０１１９】
ユビキチンの多量体化
本発明によれば、遺伝学的にヘッドトゥテイルで結合された少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、ターゲット分子、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＩｇＧ、ＭＩＡ２、ＮＧＦ、またはその他の標的分子の同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用することでのみ効果を示す。換言すれば、前記修飾ユビキチン単量体は、前記２分子の両結合領域が共に作用することによって形成される一つの連続的な結合領域を介して、同じエピトープに結合する。
【０１２０】
前記単量体は、直接またはリンカーを介して結合させることができる。好適な好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカー、少なくともＧＩＧ配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するリンカー、または任意のその他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧである。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。
【０１２１】
ライブラリー
さらなる態様において、本発明は、本発明のへテロ多量体ユビキチンタンパク質、好ましくは、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を形成する、前述の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様において、前述の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーが提供され、各ライブラリーは、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合される。前記ライブラリーは、所定のターゲットに対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする。前記相互結合は、当業者に公知のリンカーのいずれか１つ、または本明細書に記載のリンカーを使用することにより行われる。「異なる修飾がなされた」は、前記ヘテロ二量体タンパク質内に非修飾分子が１つ存在する場合も含む。
【０１２３】
複合ライブラリーの製造は、実施例１で概要を述べる。ただし、ライブラリーの品質に注意を払わなければならない。足場技術におけるライブラリーの品質は、そもそも、複雑性（個々の変異体の数）および機能性（得られた候補の構造的およびタンパク質の化学的完全性）に左右される。両方の特性が互いにネガティブな影響を与える場合もあり、前記足場における修飾部位の数の増加によるライブラリーの複雑性の増大が、変異体のタンパク質の化学的完全性の低下をまねくおそれもある。これにより、溶解度、凝集性が低下し、および／または収量が低下する場合もある。この理由は、エネルギー的に良好なタンパク質パッケージを有する本来の足場から大きく逸脱するためである。
【０１２４】
このため、適切な足場ライブラリーの構築とは、ターゲットへの結合性を最適化するために、本来の配列に可能な限り多くの変異を導入すること、および、ネガティブなタンパク質化学的効果を避けるために、可能なかぎり本来の一次配列を保存すること、という両極端な姿勢のバランスをとる作業となる。
【０１２５】
ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質における特定の修飾
Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍでリガンドに結合し、前記リガンドに対して一価の結合活性を示す、前記本発明のユビキチンのヘテロ二量体は、下記の２つの選択肢から選択される。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換、および、
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
【０１２６】
実施形態において、前記融合タンパク質は、第１ユビキチン単量体の６、８、６３〜６６位のアミノ酸の置換、ならびに、第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、および、任意に２位のアミノ酸の置換を有する、前記ユビキチン単量体が、遺伝学的に融合された二量体であり、好ましくは、
前記第１ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換、
８位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファンまたはフェニルアラニン（Ｗ、Ｆ）への置換、
６３位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換、
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への置換；
前記第２ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）への置換
６２位におけるグルタミン（Ｑ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換
６３位におけるリジン（Ｋ）のセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換
任意に、２位におけるグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｋ）への置換が好ましい。
【０１２７】
得られた修飾ユビキチンへテロ二量体が、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍで前記リガンドに対する特異的結合親和性を示し、前記リガンドに対して一価の結合活性を示し、かつ、ユビキチンタンパク質の構造的安定性が破壊されず、妨害されない限り、各単量体におけるこれらの置換の選択肢は、何ら制限されることなく、互いに組み合わせることができる。
【０１２８】
最も好ましい置換は、下記のとおりである。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、およびＴ６６Ｐの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、およびＴ６６Ｅの置換；任意にさらにＱ２Ｒの置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｌ、およびＴ６６Ｓの置換；および
前記第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位における修飾、さらに任意に、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｘ、Ｌ８Ｘ、Ｑ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｅ６４Ｘ、Ｓ６５Ｘ、およびＴ６６Ｘの置換；任意にさらにＱ２Ｘの置換、Ｘは、任意のアミノ酸。
【０１２９】
ＥＤ−Ｂへの結合タンパク質を発生させる前記第１ユビキチン単量体において、特に好ましい置換は、下記のとおりである。
２位：Ｑ→Ｔ、４位：Ｆ→Ｗ、６位：Ｋ→Ｈ、６２位：Ｑ→Ｎ、６３位：Ｋ→Ｆ、６４位：Ｅ→Ｋ、６５位：Ｓ→Ｌ、６６位：Ｔ→Ｓ
【０１３０】
２つの単量体のヘッドトゥテイルでの結合には、リンカーを使用しなくてもよいし、どのようなリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたは、ＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列もしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列のリンカーである。
【０１３１】
好ましい実施形態において、前記リガンドＥＤ−Ｂに結合するよう共に作用する２つの結合決定領域を有するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含む。薬学的活性成分としてＴＮＦαを含む、前記本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有する。別の実施形態において、前記リガンドＥＤ−Ｂに結合するよう共に作用する２つの結合決定領域を有するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号ＸＸに相当する、図１１に示すアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
さらに好ましいタンパク質は、ＸＸＸＸが任意のアミノ酸であってもよい下記配列（配列番号４７）により提供される。
【化１】
【０１３３】
これらの配列を有するタンパク質の例を、図１１に示す。リンカーとして、ここではＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧを使用した。ただし、その他の種類のリンカーまたはリンカーなしもまた、可能な代替例である。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチド、宿主細胞、ベクター
本発明のさらなる態様において、本発明は、前述のタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも包含する。また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明に包含される。
【０１３５】
本発明のさらなる態様において、前述のタンパク質もしくは融合タンパク質、および／または、前記本発明の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞は、包含される。
【０１３６】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチン分子の使用
高い親和性でリガンドに結合可能な本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する診断薬、および治療薬の調製に使用される。本発明のタンパク質は、例えば、直接的なエフェクター分子（修飾物質、拮抗物質、作用物質）または抗原認識ドメインとして使用できる。
【０１３７】
ヒトおよび獣医学の医薬療法および予防法の分野において、少なくとも一つの本発明のヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含む、薬学的に有効な医薬品を、それ自体公知な方法により調製できる。生薬製剤に応じて、これらの組成物を、注射、点滴、全身投与、直腸投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与または他の従来から使用されている投与方法により、非経口的に投与できる。医薬品の種類は、治療対象の疾患の種類、疾患の重症度、治療対象の患者、および医学分野の当業者に公知の他の要因によって決まる。
【０１３８】
選択する融合パートナーに応じて、本発明の医薬組成物は、ターゲットが大量に出現する疾患の治療に適用される。
【０１３９】
前記組成物は、治療上の有効量を含むように適応される。投与量は、治療対象の組織、疾患の種類、患者の年齢および体重、ならびにさらに公知の要因によって決まる。
【０１４０】
前記組成物は、薬学的または診断的に許容されるキャリアを含み、任意に、さらに、従来公知の助剤および添加剤を含み得る。これらは、特に制限されず、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝剤、着色剤等を含む。
【０１４１】
前記医薬組成物は、局所塗布用の液状製剤、クリーム、ローションの剤形；エアロゾル；粉末、細粒、錠剤、座剤、カプセル剤の剤形；エマルジョン、リポソーム製剤の剤形とし得る。前記組成物は、無菌、非発熱原性、等張性で、薬学的に従来公知で許容される添加剤を含むことが好ましい。また、Ｕ．Ｓ． ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規則を参照できる。
【０１４２】
本発明の「医薬組成物」は、組成物の形態で提供されてもよい。種々の活性成分および希釈剤および／または担体は、互いに混合され、混合製剤の形態でもよい。前記活性成分は、部分的にまたは全体的に別々の形態で存在する。このような混合または混合製剤の一例は、複数の部品からなるキットである。
【０１４３】
本発明の「組成物」は、少なくとも２つの薬学的に活性な化合物を含む。これらの化合物は、同時に投与してもよいし、１分〜数日の時間間隔で個々に投与してもよい。これらの化合物は、同じ経路で投与してもよいし、異なる経路、例えば、一方の活性化合物を経口投与し、他方の活性化合物を非経口投与することも可能である。また、前記活性化合物は、一つの医薬品、例えば、一つの点滴液に処方されてもよいし、個々に処方された両化合物を含むキットとして処方されてもよい。また、両方の化合物は、２以上の包装でも提供可能である。
【０１４４】
さらなる実施形態において、前記医薬組成物は、複数の部品からなるキットの形態でもよく、前記本発明の組換えユビキチンタンパク質／融合タンパク質、および１以上の化学療法剤が個々に提供される。
【０１４５】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、例えば、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、任意の従来公知の種々の技術により、または、市販の自動合成装置により調製できる。一方、従来の遺伝子組換え技術単独で、または、従来の合成技術との組み合わせにより、調製することもできる。
【０１４６】
任意に、前記修飾は、ＤＮＡレベルでの遺伝子工学、および、原核生物、真核生物またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける修飾タンパク質の発現により行われてもよい。
【０１４７】
さらなる実施形態において、前記修飾工程は、化学的合成工程を含む。
【０１４８】
本発明の一態様において、異なる修飾がなされたタンパク質群は、互いに異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質をコードする、２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することにより得られる。
【０１４９】
図面の簡単な説明
図１は、ヘテロ二量体を発生させる、ＢＤＲ１と称する結合決定領域を有する前方（第１）修飾ユビキチン単量体と、ＢＤＲ２と称する結合決定領域を有する異なる修飾がなされた後方（第２）ユビキチン単量体との遺伝子組み換えが、ＥＤ−Ｂに対する親和性の有意な向上、ならびに結合の特異性の向上をもたらすことを示す。細胞および組織切片に結合する前記修飾ユビキチン分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、蛍光偏光測定により分析した。ヒトＥＤ−Ｂへの複数のヘテロ二量体ユビキチン変異体の結合の濃度依存性ＥＬＩＳＡ（ｃｏｎｃ．−ＥＬＩＳＡ）を示す。
【０１５０】
図１Ａは、単量体４１Ｂ１０（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４１Ｂ１０ｔｈ）についての、Ｋｄ＝９．４μＭ＝９.４５×１０−６Ｍの結合親和性を示す。黒丸は、第１単量体４１Ｂ１０の、フィブロネクチンのエクストラドメインＢであるフラグメント６７Ｂ８９への結合を示す。コントロールであるフラグメント６７８９は、ＥＤ−Ｂを含まず、白丸で示される。
【０１５１】
図１Ｂは、ヘテロ二量体ユビキチンの結合親和性を示す。前記ヘテロ二量体は、４１Ｂ１０の第１単量体と異なる第２単量体とが結合され、変異体４６Ｈ９となっている（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４６Ｈ９ｔｈ）。４６Ｈ９の結合親和性は、両単量体のターゲットＥＤ−Ｂへの一価の結合により、図１Ａに示す単量体と比べて大幅に向上している（Ｋｄ＝１３１ｎＭ＝１．３×１０−７Ｍ；ここでは６７Ｂ８９とする、黒丸）。コントロールであるフラグメント６７８９は、ＥＤ−Ｂを含まず、白丸で示される。
【０１５２】
図２は、サイトカインに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【０１５３】
図２Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の高親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ＝５×１０−８Ｍ）。黒丸は、２４Ｈ１２のＥＤＢとの結合を示す。ネガティブコントロールとして、２４Ｈ１２のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との結合を用いた（白丸）。
【０１５４】
図２Ｂは、サイトカインＴＮＦαに融合することによって多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の親和性の向上を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ＝５．６×１０−９Ｍ）。
【０１５５】
図２Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。細胞基質のフィブロネクチン（ｃ−ＦＮ）をコントロールとして使用した場合と比較して、ターゲットＥＤ−Ｂに対して、Ｋｄ ＥＬＩＺＡ値が向上され、前記ターゲットへの特異的結合が確認された。
【０１５６】
図２Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の説明：０〜１５μＭ ９Ｅ１２）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析した。会合解離曲線の分析からは、Ｋｄを、決定できなかった。
【０１５７】
図２Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ４１Ｂ１０）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体４１Ｂ１０とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、６２３ｎＭ（６．２×１０−７Ｍ）であった。
【０１５８】
図３は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。前記異なる変異体は、小文字でマークされる共通の配列モジュールを共有する。前記変異体について、ＥＤ−Ｂ結合を分析した。図３は、修飾ユビキチンへテロ二量体が得られる、単量体の種々の組み合わせを示す。ヘテロ二量体変異体４６−Ａ５、５０−Ｇ１１および４６−Ｈ４は、すべて同一の、ＢＤＲ１を有する第１（前方）修飾単量体（同図において、「ａ」で示す）を有するが、第２（後方）ユビキチン単量体は、ＢＤＲ２における異なる部位が修飾されている。変異体５２−Ｄ１０および５２−Ｂ３は、ＢＤＲ１を有する４６−Ｈ９と比較して、異なる第１（前方）修飾単量体を有し、ＢＤＲ２を有する同一の第２（後方）ユビキチン単量体（同図において、「ｅ」で示す）を有している。
【０１５９】
前記修飾ユビキチンヘテロ二量体は、下記配列を有する。
４６−Ｈ４：配列番号２５、４５−Ｈ９：配列番号２６、４６−Ａ５：配列番号２７、５０−Ｇ１１：配列番号２８、５２−Ｂ３：配列番号２９、５２−Ｄ１０：配列番号３０
【０１６０】
実験過程において、配列ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）を有するＨｉｓタグの添加により、前述の配列を修飾した。
【０１６１】
図３に示すように、４６−Ｈ４は、ＥＤ−Ｂへの優れた結合親和性を有する（Ｋｄ＝１８９ｎＭ）。４６−Ａ５および５２−Ｄ１０は、結合活性を有さない。また、他の修飾ユビキチンタンパク質は、ＥＤ−Ｂへの結合活性が４６−Ｈ４と比較して低い。したがって、ヘテロ二量体変異体における両単量体が、ターゲットへの高い結合親和性のために必要とされ、両単量体がターゲットに対する一価の結合を示すと結論付けることができる。
【０１６２】
高いＥＤ−Ｂ結合活性を有する前記修飾ユビキチンヘテロ二量体４６−Ｈ９は、前記２つの単量体の両結合ドメイン領域における下記のアミノ酸置換により、野生型ユビキチン単量体と比較して同定される。
前記第１モジュール（ＢＤＲ１）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール（ＢＤＲ２）：（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５０Ｇ１１
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｃ）Ｋ６Ｍ、Ｌ８Ｒ、Ｑ６２Ｍ、Ｋ６３Ｎ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｌ
４６Ｈ４
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｄ）Ｋ６Ｇ、Ｌ８Ｗ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ｑ、Ｅ６４Ｑ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｒ
５２Ｂ３
前記第１モジュール：（ｇ）Ｑ２Ｒ、Ｆ４Ｐ、Ｋ６Ｙ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｒ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）：Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５２Ｄ１０（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール：Ｑ２Ｖ、Ｆ４Ｃ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｇ、Ｔ６６Ｄ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）：（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
４６Ａ５（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｂ）Ｋ６Ｌ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｌ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ
【０１６３】
図４は、配列アライメントを示す。１行目：野生型ユビキチンタンパク質の２つの単量体（１行目）は、７７位から８８位までの１２個のアミノ酸のリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧにより結合される。ＢＤＲ２を有する第２単量体は、８９位のメチオニンから始まる。この二量体野生型ユビキチンタンパク質は、第１単量体および第２単量体において異なる修飾がなされ、その結果２つのＢＤＲを有する、前記修飾へテロ二量体変異体４６−Ｈ９（２行目）と整列されている。ターゲットへの一価の結合のために、両ＢＤＲは、ターゲットとの結合において、共に作用する。
【０１６４】
図５は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始する）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されている。３行目は、二量体の野生型ユビキチンであり、リンカーアライメントを示さない（このため、７７位のメチオニンから第２単量体が開始する）、「Ｕｂｉ−Ｄｉｍｅｒ ｗｔ」を示す。４行目は、ヒトの野生型ユビキチンである「Ｕｂｉ−Ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ」を示す。
【０１６５】
図６は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ＝６．９×１０−９Ｍ）。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９−ｔ０という）への結合親和性を示すことを、黒丸で示し、この変異体が、ネガティブコントロール（６７８９−ｔ０という）には結合しないこと（白丸）と比較する。
【０１６６】
図７は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。１０４１−Ｄ１１は、可溶性６７Ｂ８９のＩＣ５０：１４０ｎＭで、固定化された６７Ｂ８９から解離し、１０４１−Ｄ１１の結合が、ｃｏｎｃ−ＥＬＩＳＡ設定で用いられた疎水性表面への固定化に起因するＥＤ−Ｂ構造の劣化によるものではないことを示している。
【０１６７】
図８は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。種々の濃度（図中の説明：０〜２００ｎＭ １０４１−Ｄ１１）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化された、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９という）への結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）であり、ｋｏｆｆ率は、７．７×１０−４ｓ−１であり、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体の半減期が長いことを示す。
【０１６８】
図９は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。マウス血清もしくはラット血清またはコントロールとしてのＰＢＳＴ中での、３７℃で１時間での前記変異体のプレインキュベーション等の、種々の条件を示す。Ｋｄ値は、すべて１０〜２０ｎＭである。したがって、ＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体１０４１−Ｄ１１の結合は、血清による顕著な影響を受けないと結論付けることができる。
【０１６９】
図１０は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【０１７０】
図１０Ａは、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体形成を示す。３回のＨＰＬＣのランを重ねている。ＳＥ−ＨＰＬＣ後の、保持時間２１．６５１分の青色のピークは、純粋な１０４１−Ｄ１１に由来し、保持時間２６．２８９分の黒色のピークは、フィブロネクチンフラグメント６７Ｂ８９を表し、保持時間２１．４０７分の赤色のピークは、１０４１−Ｄ１１と６７Ｂ８９との混合物の結果を示す。１０４１−Ｄ１１のピークの保持時間が短くなる側へのシフト、および、６７Ｂ８９のピークの消失は、１０４１−Ｄ１１と可溶性ＥＤ−Ｂとの複合体の形成を示す。
【０１７１】
図１０Ｂは、１０４１−Ｄ１１（青色、２１．９４４分）、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９（黒色、２６．２８９分）、および１０４１−Ｄ１１と６７８９との混合物（２１．９２９分および２６．２８９分にピークを有する赤色線）に関する３回のＳＥ−ＨＰＬＣのランを重ねて示す。前記１０４１−Ｄ１１のピークのシフトは、ほとんど観察されなかった。６７８９のピークが消失しなかったこととあわせて、この事実は、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９に、有意に結合しないことを示す。
【０１７２】
図１１は、ＥＤ−Ｂ結合変異体のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、１６種類の代表的なヘテロ二量体の配列を示す。前記コンセンサスアミノ酸部位は、前記第１単量体の結合決定領域である、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位である。一方、コンセンサスアミノ酸置換は、Ｑ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓである。
【０１７３】
図１２は、６種類のユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質の配列アライメントを示す。前記第２ユビキチン単量体は、８９位（１１１１−Ｂ４、１１１１−Ｃ９）または８０位（１１１１−Ｅ１０、１１１１−Ｆ６、１１１１−Ｈ１２、１１１１−Ｈ２）のメチオニンから開始される。
【０１７４】
図１３は、結合決定領域ＢＤＲ１およびＢＤＲ２、ならびに、図１２に示すユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のリンカーのアライメントを示す。さらに、ユビキチン配列における追加のアミノ酸交換を示す。
【０１７５】
図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）への、図１２に示す結合変異体１１１１−Ｅ１０についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。Ｋｄ＝２．６μＭ（黒丸）であり、コントロールはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とした（白丸）。
【０１７６】
図１５Ａ：第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価した。パートＡは、第１単量体修飾ユビキチンユニットの配列情報を、パートＢは、第２単量体修飾ユビキチンユニットの配列情報を示す。
【０１７７】
図１５Ｂ：第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６、６８位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１７８】
図１５Ｃ：ヘテロ二量体ユビキチン変異体ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２の、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２は、非常に高い親和性でＴＮＦαに結合する（Ｋｄ＝１２ｎＭ＝１．２×１０−８Ｍ）。図１５Ｃは、ヒトＴＮＦαに対する高親和性結合を示し（黒丸）、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１７９】
図１５Ｄ：ＴＮＦαに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８０】
図１５Ｅ：前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈは、非常に高い親和性でＴＮＦαに結合する（Ｋｄ＝１．７ｎＭ＝１．７×１０−９Ｍ）。図１５Ｅは、ヒトＴＮＦαに対する結合を示し（黒丸）、コントロールはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とした（白丸）。
【０１８１】
図１６は、修飾ユビキチンベースのヘテロ二量体のＮＧＦへの結合を示す。
【０１８２】
図１６Ａ：ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位、および５１位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８３】
図１６Ｂ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ０.９μΜ=９×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかる。図１６Ｂは、組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ；黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１８４】
図１６Ｃ：ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２、６４〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８５】
図１６Ｄ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ１８０ｎＭ＝１．８×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかる。図１６Ｄは、組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ；黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１８６】
図１７：ヘテロ二量体ＩｇＧ結合タンパク質を示す。
【０１８７】
図１７Ａ：ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓの配列を示す。第１ユビキチン単量体の６、６２、６３、６５、６６位と、第２単量体の６、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８８】
図１７Ｂ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ３．８μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。図１７Ｂは、ＩｇＧ（黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡ−１、ＢＳＡ−２、およびＥｎｂｒｅｌ（赤丸、緑丸、および青丸、適合線なし）とした。Ｅｎｂｒｅｌは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。Ｅｎｂｒｅｌへの弱い結合は、ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓのＩｇＧのＦａｂ部分への結合を示唆している。
【０１８９】
図１７Ｃ：ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓの配列を示す。第１ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１９０】
図１７Ｄ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ４．１μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。図１７Ｄは、ＩｇＧ（黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡ（白丸）およびエタネルセプト（商品名：エンブレル）（赤丸、適合線なし）とした。エンブレルは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。エンブレルへの弱い結合は、ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓのＩｇＧのＦａｂ部分への結合を示唆している。
【実施例】
【０１９１】
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものである。本発明は、特に、ユビキチンの修飾を例にあげて実証されている。ただし、本発明は、これに限定されず、下記実施例は、単に、前述の記載に基づいた本発明の実施可能性を示しているにすぎない。本発明の完全な開示のため、本願および付属書類に引用されている文献についても言及しているが、これらの引用文献は全て、引用により、その開示全体が本願に取り込まれている。
【０１９２】
［実施例１］
修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の同定
【０１９３】
ライブラリーの構築とクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。
【０１９４】
合計１５の選択されたアミノ酸部位における協調した変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、第１ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸、および第２ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。両ユビキチン単量体は、少なくともＧＩＧ配列、または少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するグリシン／セリンリンカーによって遺伝的に結合（ヘッドトゥテイル配置）しており、リンカー配列の例としては、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号３２）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられるが、その他のリンカーでもよい。
【０１９５】
ＴＡＴファージディスプレイ選択
ヘテロ二量体ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを使用し、ターゲットに対して濃縮した。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットは、タンパク質結合表面上に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して、非特異的に固定化され得る。ビオチンを介するストレプトアビジンビーズまたはニュートラアビジンストリップ上への固定化が好ましい。ターゲット結合ファージは、溶液中または固定化ターゲット上のいずれかにおいて選択される。例えば、ビオチン化され固定化されたターゲットとファージとを、インキュベートし、続いて、マトリックスに結合したファージの洗浄およびマトリックス結合ファージの溶出を行う。ターゲットのインキュベーションに続く各サイクルにおいて、前記ビーズを磁力により溶液から分離し、数回洗浄した。１〜３回目の選択サイクルにおいて、ターゲットを担持した磁気ビーズに固定化された三元複合体を洗浄した。４回目の選択サイクルにおいて、洗浄を数回行った。最初の選択サイクルにおいて、ビオチン化ターゲットを、ニュートラアビジンストリップに固定化し、一方、２回目から４回目のサイクルにおいて、溶液における選択を行い、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に、ターゲットとファージとの複合体を固定化した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のファージを、酸性溶液での溶出により遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のファージ溶出を行った。溶出したファージを再増幅した。バインダーの特異性を誘導するため、選択に際し、ターゲットに類似するタンパク質を含めてもよい。
【０１９６】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてリボソームディスプレイを使用して、ターゲットに対して濃縮した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットを、標準的な方法によってビオチン化し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。リボソーム、ｍＲＮＡおよび新生ユビキチンポリペプチドを含む三元複合体を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて構築した。選択の一次ラウンドを２回行い、三元複合体をインキュベートし、続いて、類似する選択のラウンドを２回行った。ターゲットインキュベーションに続く各サイクルにおいて、ビーズを磁力により溶液から分離し、ストリンジェンシーを増加させながら、リボソームディスプレイバッファーで洗浄した。１〜３回目の選択サイクルにおいて、ターゲットを担持した磁気ビーズに固定化された三元複合体を洗浄した。４回目の選択サイクルにおいて、洗浄を数回行った。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のｍＲＮＡの溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００４）。各サイクルの後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、アメリカ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）を用いて、ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成を行った。
【０１９７】
濃縮プールのクローニング
４回目の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡを、当該技術分野において公知の方法であるＰＣＲで増幅し、適切な制限ヌクレアーゼで切断し、適合性付着端を介して発現ベクターｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）に連結した。
【０１９８】
単一コロニーのヒット解析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）への形質転換の後、アンピシリン耐性単一コロニーを培養した。自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ、２００５）を用いた、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ社製、イギリス）での培養により、ターゲットに結合する修飾ユビキチンを発現させた。細胞を回収し、その後、溶解した。遠心分離した後、得られた上清を、ターゲット、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とのユビキチン特異的ＦａｂフラグメントコンジュゲートでコートしたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社製、ドイツ）を用いた。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍと６２０ｎｍを測定した。
【０１９９】
数サイクルの選択ディスプレイを、ターゲットに対して行った。最後の２サイクルの選択において、結合分子を、過剰量の遊離ターゲットを用いて溶出した。
【０２００】
例えば、４６Ｈ９（配列番号６）、９Ｅ１２（配列番号７）、２２Ｄ１（配列番号８）、１０４１−Ｄ１１（図５）（配列番号３３）、１０４５−Ｄ１０（配列番号３４）等の、前記ターゲットＥＤ−Ｂに対するヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質を同定した。また、例えば、その他のターゲットに対するヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質、例えば、ターゲットＭＩＡ−２結合タンパク質１１１１−Ｅ１０（図１２）（配列番号５３）、ターゲットＴＮＦα結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２（図１５Ｂ）（配列番号５７）およびＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４（図１５Ｄ）（配列番号９０）、ターゲットＮＧＦ結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈ（図１６Ａ）（配列番号９１）およびＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈ（図１６Ｃ）（配列番号９２）、ならびにターゲットＩｇＧ結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓ（図１７Ａ）（配列番号９３）およびＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓ（図１７Ｃ）（配列番号９４）を同定した。
【０２０１】
野生型ユビキチン単量体（Ｕｂｉ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ）と、野生型ユビキチン二量体（ｕｂｉ ｄｉｍｅｒ ｗｔ）、野生型ユビキチンタンパク質（図５におけるＵｂ２−ＴｓＸ９、各単量体の４５位の置換およびＣ末端に２つの置換を有する）、および修飾ユビキチンヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１との配列アライメントを、図５に示す。デユビキチナーゼは、ユビキチンのＧＧの後ろを切断し、ＡＡの後ろを切断しないため、Ｕｂ２−ＴｓＸにおいて、前記単量体のＣ末端の置換（ＧＧからＡＡ）は、血清における安定性を増加させる。野生型ユビキチンの二次構造は、前記Ｃ末端における置換を有するユビキチンと比較して、ほぼ同一である。
【０２０２】
１０４１−Ｄ１１（図Ｘ、配列番号３６）または１０４５−Ｄ１０と呼ばれる、優れたＥＤ−Ｂ結合親和性を有する修飾ユビキチンは、野生型と比較して、後述のアミノ酸置換によって同定される。
第１モジュール
Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ
第２モジュール
Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ
任意に、Ｑ２Ｒ（当該置換は、変異体１０４１−Ｄ１１に存在し、変異体１０４５−Ｄ１０には存在しない）
融合タンパク質に適した好ましいリンカーは、少なくともＧＩＧ配列を有するリンカーまたは少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するリンカー、あるいは、例えばＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列、またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ配列を有するその他のリンカーが挙げられる。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。第１単量体結合決定領域においてコンセンサス配列を有する、さらに別のＥＤＢバインダーを、図１１に示す。
【０２０３】
優れたＭＩＡ−２結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１２〜１４に示す。
【０２０４】
優れたＮＧＦ結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１６に示す。
【０２０５】
優れたＴＮＦα結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１５に示す。
【０２０６】
優れたＩｇＧ結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１７に示す。
【０２０７】
［実施例２］
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体のヒトターゲットに対する結合分析
【０２０８】
実施例２Ａ：濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースの結合変異体の結合分析
ユビキチンベースの変異体のヒトターゲットに対する結合を、濃度依存ＥＬＩＳＡによって分析した。精製タンパク質を、ヒトターゲット、ＢＳＡまたはＨＳＡ、および考えられるその他のコントロール（ターゲットとしてＥＤ−Ｂを用いた場合には、細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）等）でコーティングされた複数のＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに、量を増加させてアプライした。ウェルあたり５０μｌのタンパク質溶液（１０μｇ／ｍｌ）での抗原コーティングを、４℃で一晩行った。前記プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４；ＰＢＳＴ）で洗浄した後、前記ウェルを、室温で２時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；３％ ＢＳＡ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングした。前記ウェルを、ＰＢＳＴでさらに３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。コーティングされたウェルを、異なる濃度のターゲット結合タンパク質で、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで前記ウェルを洗浄した後、抗ユビキチンｆａｂフラグメント（ＡｂｙＤ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴに適切に希釈して、アプライした。前記プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。前記ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて読み取った。参照波長を６２０ｎｍとして、４５０ｎｍで吸光光度測定を行った。図６は、変異体１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ）。このことは、図１４、１５、１６、１７に示す結果により、他のターゲット分子であるＭＩＡ−２、ＴＮＦα、ＮＧＦ、およびＩｇＧについてもそれぞれ確認されている。このように、野生型ユビキチンにおけるわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）により、所定のターゲットに対する、低いマイクロモーラー（Ｍ）の範囲の親和性がもたらされる。
【０２０９】
実施例２Ｂ：競合的濃度依存ＥＬＩＳＡによる、修飾ユビキチンベースの結合変異体の結合分析
本実施例では、ターゲットＥＤ−Ｂに関する結合分析について述べるが、この結合分析は、これ以外の任意のターゲットについても、さらに実験を行うことなく使用できる。競合的濃度依存ＥＬＩＳＡにより、量が増加する遊離のターゲットの存在下、フィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９）を含む固定化ＥＤ−Ｂに対するユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を分析した。ＥＬＩＳＡの条件は、１０４１−Ｄ１１タンパク質を、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）（０μＭ〜１０μＭ）、またはネガティブコントロール６７８９（０μＭ〜１０μＭ）で、１時間プレインキュベートし、その後、その混合物を、Ｍｅｄｉｓｏｒｐ−ｐｌａｔｅ上に配置したターゲット６７Ｂ８９に添加した以外は、実施例２Ａで述べたとおりである。これに続き、前記変異体を、対応する抗体によって検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ；希釈度１：６５００）。
【０２１０】
図７は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合親和性を有することを示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。図６に示した結果が裏付けられている。すなわち、野生型ユビキチンにおけるわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）のみにより、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２１１】
実施例２Ｃ：結合活性の血清安定性を同時に分析する、濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当該技術分野における公知の方法により、前述（実施例２Ａおよび２Ｂ）と同様に、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９ともいう）を、マイクロタイタープレートにコーティングし、前記変異体を、ＥＤ−Ｂに結合させ、特異的ユビキチン抗体（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ）により検出した。この分析において、前記変異体は、異なる方法で処理した。すなわち、前記変異体を、３７℃で１時間、マウス血清中でインキュベートする処理（図９参照、青丸）、前記変異体を、３７℃で１時間、ラット血清中でインキュベートする処理（図９、赤丸）、または、前記変異体を、３７℃で１時間、ＰＢＳでインキュベートする処理（図９、黒丸）である。図９、変異体１０４１−Ｄ１１の全てのＫｄが、１０．３ｎＭ（ＰＢＳ）から２０．７４ｎＭ（マウス血清）の間にあることを示す。
【０２１２】
実施例２Ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化したフィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９という）を含むＥＤ−Ｂに対する結合について、前記変異体を異なる濃度で分析した（例えば、０〜２００ｎＭの変異体、好ましくは１０４１−Ｄ１１）。得られたデータは、ＢＩＡ評価ソフトウェアおよび１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。図８に示すように、変異体１０４１−Ｄ１１のＫＤは、１．０ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝７．６×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝７．７×１０−４ｓ−１であった。融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαのＫＤは、１．１３ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝４．５×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝５．０×１０−４ｓ−１であった。
【０２１３】
実施例２Ｅ：ＳＥ−ＨＰＬＣによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の複合体構造の分析
複合体構造の分析のために、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（Ｖ＝３ｍｌ）を使用し、５０μｌのタンパク質をアプライした。さらなる条件は、バッファー：１×ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、流速：０．３ｍｌ／分、ラン：４５分（サンプルの注入：１５分後）とした。条件：０．７２ｎｍｏｌ １０４１−Ｄ１１タンパク質＋０．７２ｎｍｏｌ ＥＤ−Ｂ（以下、６７Ｂ８９という）またはネガティブコントロールのフィブロネクチン（以下、６７８９という）を、室温で１時間インキュベートし、複合体構造を分析するために、カラムにアプライした。図１０は、前記変異体のみを黒で示し、ターゲットＥＤ−Ｂのみを青で示し、ＥＤ−Ｂとの複合体を構成する変異体結合をピンクで示す。図１０Ａは、前記変異体とＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチン（６７Ｂ８９）とを示す。図１０Ｂは、前記変異体とＥＤ−Ｂフリーのフィブロネクチンとを示す。図１０は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）と複合体を構築するが、フィブロネクチン（６７８９）とは複合体を構築しないことを示し、特異性を裏付けている。
【０２１４】
［実施例３］
ＴＮＦαへの結合性が向上したユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質
【０２１５】
ＴＮＦαに対して特異的なユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質を、本発明の方法により選択した。すなわち、ＴＮＦαに対する結合性能に基づいてスクリーニングされたヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質群を含むファージライブラリーを確立した。下記の修飾を行った。
【０２１６】
第１単量体：２、４、６、６２〜６６位、任意に追加で６８、７０、７２〜７４位のうちの１以上、任意にさらに別の位置の１以上のアミノ酸の修飾
【０２１７】
第２単量体:６、８、６２〜６６位のうちの１以上のアミノ酸の修飾
【０２１８】
１１４４−Ｄ１１（配列番号７９）および１１４４−Ｅ９（配列番号８０）を除き、ほとんどの場合、リンカーとしてＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧを使用した。１１４４−Ｄ１１および１１４４−Ｅ９に関しては、第１および第２ユビキチン単量体間にリンカーを使用しなかった。７５および７６位は、ＡＡまたはＧＧである。前記リンカーを、図１５のパートＡに示す。結合親和性を、図１５Ｂ〜１５Ｅに示す。
【０２１９】
［実施例４］
ＭＩＡ２への結合性が向上した、ユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質の生成
【０２２０】
ＭＩＡ２は、特に、肝硬変、線維症、および肝臓癌に関する診断および治療用のマーカーである。このマーカーに関する詳しい情報は、米国特許第２００４０７６９６５号明細書中に見出せる。
【０２２１】
本発明の修飾ユビキチン結合タンパク質のターゲットタンパク質は、ＭＩＡのコア領域である安定した１０１個のアミノ酸からなり、ここではＳＰＲ３０−３という。ＳＰＲ３０−３は、ＭＩＡ−２の構造化された部分である。ＳＰＲ３０−３は、シグナルペプチドを除く、ＭＩＡ（ＣＤ−ＲＡＰ）、ＯＴＯＲ、ＴＡＮＧＯと相同的である。その分子量は、１１５６９.１９８Ｄａである。
【０２２２】
前記ＭＩＡ−２のコア領域のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９５）。
MLESTKLLADLKKCGDLECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL
【０２２３】
ＭＩＡ２に特異的なユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質を、本発明の方法により選択した。ＭＩＡ２に対する結合性能に基づいてスクリーニングされたヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質群を含むファージライブラリーを確立した。下記の修飾を行った。結果を以下に示す。
【０２２４】
図１３は、ユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のアライメントを示す。
【０２２５】
変異体１１１１−Ｅ１０は、マイクロモーラーの範囲でのビオチン化ターゲットへの親和性と、サイズ排除クロマトグラフィーにおける複合体形成とを示す。最も強力なバインダーは、第１単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ１）の６、８、６２、６３、６４、６５、６６位におけるアミノ酸が置換され、第２単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ２）の６、８、６２、６３、６４、６５、６６位において異なる置換がなされた１１１１−Ｅｌ０である。
【０２２６】
第１単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ１）における置換は、１１１１−Ｈ２および１１１１−Ｈ１２では同様である。したがって、変異体１１１１−Ｈ２および１１１１−Ｈ１２は、１つのアミノ酸の置換のみが相違するＢＤＲ１とＢＤＲ２との組み合わせと考えられる。
【０２２７】
下記のさらなる強力な結合分子、１１１１−Ｃ９、１１１１−Ｂ４および１１１１−Ｆ６を評価した。これらのバインダーは、不溶性であるか、あるいは、ＥＬＩＳＡおよびＳＥＣにおいて、ＭＩＡ２のＳＰＲ３０−３に対して結合を示さなかった。変異体１１１１−Ｅ１０および１１１１−Ｃ９のそれぞれと、１１１１−Ｂ４とを濃縮した（１１１１−Ｂ４において、さらなる置換Ｔ９Ａが数回発生した）。１１１１−Ｆ６は濃縮しなかったが、Ｈｉｔ−ＥＬＩＳＡにおいて高いシグナルを示すことから、興味深い候補であると考えられた。しかしながら、このバインダーは、不溶性のようであった。
【０２２８】
図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）に対する結合変異体１１１１−Ｅ１０についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。Ｋｄ＝２．６μＭであり（黒丸）、コントロールはＨＳＡ（白丸）である。この変異体１１１１−Ｅ１０は、ＭＩＡ２に対する最良の結合分子であることが証明された。その配列は、下記の通りである。
MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA（配列番号５３）
【０２２９】
使用したリンカーを、添付の配列表において、以下のように示す。
１１１１−Ｂ４＿２１２３１ sggggsggggig （配列番号９６）
１１１１−Ｃ９＿２１２６５ sggggsggggig （配列番号９６）
１１１１−Ｅ１０＿２１３１５ gig
１１１１−Ｆ６＿２１３３１ gig
１１１１−Ｈ１２＿２１３９１ eig
１１１１−Ｈ２＿２１３７１ gig
【０２３０】
刊行物
１． Ｂｉｒｃｈｌｅｒ， Ｍ．， Ｆ． Ｖｉｔｉ， Ｌ． Ｚａｒｄｉ， Ｂ． Ｓｐｉｅｓｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． １９９９． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９８４−８．
２． Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ， Ｊ．， Ｍ． Ｌａｎｇ， Ｍ． Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｓ． Ｎ． Ｌｅｅｂ， Ｗ． Ｆａｌｋ， Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｍ． Ｇｏｋｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒｏｇｌｅｒ． ２００７． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ ＥＤ−Ａ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＤ） ｍｕｃｏｓａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２２：６１１−２３．
３． Ｄｕｂｉｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｈ． Ｐｅｔｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｂｒｏｗｎ， Ｂ． Ｌｏｇａｎ， Ｋ． Ｃ． Ｋｅｎｔ， Ｂ． Ｂｅｒｓｅ， Ｓ． Ｂｅｒｖｅｎ， Ｂ． Ｃｅｒｃｅｋ， Ｂ． Ｇ． Ｓｈａｒｉｆｉ， Ｒ． Ｅ． Ｐｒａｔｔ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂａｌｌｏｏｎ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５：１９５８−６７．
４． Ｇｏｏｄｓｅｌｌ， Ｄ． Ｓ． ２００１． ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ： Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ６：５４７−５４８．
５． Ｋａｃｚｍａｒｅｋ， Ｊ．， Ｐ． Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ｇ． Ｎｉｃｏｌｏ， Ｂ． Ｓｐｉｎａ， Ｇ． Ａｌｌｅｍａｎｎｉ， ａｎｄ Ｌ． Ｚａｒｄｉ． １９９４． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ， ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５９：１１−６．
６． Ｍｅｎｒａｄ， Ａ．， ａｎｄ Ｈ． Ｄ． Ｍｅｎｓｓｅｎ． ２００５． ＥＤ−Ｂ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ９：４９１−５００．
７． Ｐｕｊｕｇｕｅｔ， Ｐ．， Ａ． Ｈａｍｍａｎｎ， Ｍ． Ｍｏｕｔｅｔ， Ｊ． Ｌ． Ｓａｍｕｅｌ， Ｆ． Ｍａｒｔｉｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９６． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＥＤ−Ａ＋ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ＋ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４８：５７９−９２．
８． Ｔｒａｃｈｓｅｌ， Ｅ．， Ｍ． Ｋａｓｐａｒ， Ｆ． Ｂｏｏｔｚ， Ｍ． Ｄｅｔｍａｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． ２００７． Ａ ｈｕｍａｎ ｍＡｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７：８８１−６．
９． Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ， Ａ．， Ｈ． Ｊ． Ｂａｅｌｄｅ， Ｌ． Ｊ． Ｖｌｅｍｉｎｇ， Ｅ． ｄｅ Ｈｅｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ａ． Ｂｒｕｉｊｎ． ２００１． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９３：２５６−６２．
１０． Ｌｉｐｏｖｓｅｋ， Ｄ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００４）． Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０，５１−６７．
１１． Ｏｈａｓｈｉ， Ｈ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， Ｙｉｎｇ， Ｂ．Ｗ．， ａｎｄ Ｕｅｄａ， Ｔ． （２００７）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３５２，２７０−２７６．
１２． Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ． （２００５）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４１，２０７−２３４．
１３． Ｚａｈｎｄ， Ｃ．， Ａｍｓｔｕｔｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００７）． Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ２６９−２７９．
１４． Ｐａｓｃｈｋｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｗ． Ｈｏｈｎｅ （２００５）． Ｇｅｎｅ ３５０（１）：７９−８８
１５． Ｂｒｕｓｅｒ ２００７ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６（１）：３５−４５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体ユビキチンの同定方法に関する。さらに、本発明は、前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の群をコードするＤＮＡライブラリー、ならびに、前記ＤＮＡライブラリーの発現によって得られるタンパク質ライブラリー、前記ＤＮＡまたは前記タンパク質を含む細胞およびファージ、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらに、選択されたリガンドに高い親和性で特異的に結合可能な、ヘテロ多量体ユビキチンベースの新規な結合タンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子の需要が高まりつつある。現在に至るまで、抗体は、最もよく確立された結合分子に類別されるが、免疫グロブリン分子にはいくつかの主要な欠点があるため、高い親和性と特異性でリガンドをターゲットとするために、新しい結合分子が、なお求められている。免疫グロブリン分子は、非常に容易に製造でき、ほとんど全てのターゲットを対象とするが、極めて複雑な分子構造を有している。そのため、容易に取扱い可能な、より小さな分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これら代替結合剤は、例えば、疾病の診断、予防、および治療の医療分野において、有用である。
【０００３】
相対的に規定された三次元構造を有するタンパク質は、通常、足場タンパク質と呼ばれ、前記代替結合剤の設計の開始物質として用いられる。これら足場タンパク質は、一般的に、特異的またはランダムな配列のバリエーションを許容する、１以上の領域を含んでおり、そのような配列のランダム化は、しばしば、特異的結合分子を選択できる、タンパク質ライブラリーの製造のために行われる。抗体よりもサイズが小さく、かつ、ターゲット抗原への親和性が、抗体に匹敵するか、あるいはより高い分子は、薬物動態的な性質および免疫原性の点から、抗体よりも優れていると予想される。
【０００４】
従前の多くのアプローチは、結合タンパク質の開始物質として足場タンパク質を用いている。例えば、国際公開第９９／１６８７３号パンフレット（特許文献１）において、特定のリガンドに結合活性を示すリポカリンファミリー（いわゆるアンチカリン）の修飾タンパク質が開発された。リポカリンファミリーのペプチド構造は、遺伝子工学的方法を用いて、天然のリガンド結合ポケットにおけるアミノ酸置換によって修飾されている。免疫グロブリンのように、アンチカリンは、分子構造の同定または結合に使用できる。抗体と類似する方法で、可動性ループ構造が修飾され、これらの修飾により、天然のものとは異なるリガンドの認識が可能となる。
【０００５】
国際公開第０１／０４１４４号パンフレット（特許文献２）には、それ自体には結合部分がないβシート構造タンパク質のタンパク質表面における、結合ドメインの人工的な生成が記載されている。この手法によれば、高い親和性と特異性でリガンドと相互作用する、新規に生成された人工結合ドメイン（例えば、眼水晶体構造タンパク質であるγクリスタンのバリエーション）が得られる。アンチカリンに関して先に述べたような可動性ループ構造から形成される、すでに存在する結合部位の修飾とは対照的に、これらの結合ドメインは、βシートの表面に新規に生成される。しかし、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、新規結合特性を生じるための、相対的に大きなタンパク質の改変について記載されているのみである。国際公開第０１／０４１４４号パンフレットのタンパク質は、その大きさのため、ある程度の労力を必要とする方法でしか、遺伝子工学レベルで修飾できない。さらに、これまで公開されたタンパク質においては、タンパク質の全体構造を維持するために、全アミノ酸のうち、比較的小さいパーセンテージのみが修飾されていた。そのため、従前は存在しない結合特性の発生に利用できるのは、タンパク質表面の比較的小さい領域のみである。さらに、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、γ−クリスタンへの結合特性の生成のみが記載されている。
【０００６】
国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（特許文献３）には、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の生成が記載されている。ユビキチンは、小さい単量体の細胞質タンパク質であり、配列が高度に保存され、原虫から脊椎動物にいたるまでの全ての公知の真核細胞に存在する。生物において、ユビキチンは、細胞タンパク質のコントロールされた分解の制御において重要な役割を担う。この目的のために、分解予定のタンパク質は、酵素カスケードを通過する間に、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖と共有結合し、この標識により選択的に分解される。最近の研究結果によると、ユビキチンまたはユビキチンによるタンパク質の標識は、それぞれ、数種のタンパク質の移入または遺伝子制御等の他の細胞プロセスにおいても、重要な役割を担っている。
【０００７】
その生理的機能の明確化に加え、ユビキチンは、そもそもその構造およびタンパク質の化学特性のために、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれた７６アミノ酸からなる（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７（非特許文献１））。前記ポリペプチド鎖のほぼ８７％は、水素結合によって、二次構造エレメントの形成に関与する。顕著な二次構造は、３．５αヘリックスターン、ならびに４つの鎖からなる逆平行βシートである。これらの要素の特徴的な配置（逆平行βシートがタンパク質表面に露出し、その裏側にαヘリックスがパックされ、これが前記逆平行βシート上に垂直に延びている）は、一般的に、いわゆるユビキチン様フォールディングモチーフと考えられている。さらなる構造的な特徴は、αヘリックスとβシートとの間のタンパク質内側における、標識疎水性領域である。
【０００８】
ユビキチンの人工的な調製は、そのサイズが小さいため、化学合成によっても、生物学的手法によっても行うことができる。有利なフォールディング特性のため、ユビキチンは、大腸菌等の微生物を使用した遺伝子工学により、比較的大量に、そのサイトゾルまたは細胞膜周辺腔において製造できる。一般的に、後者のストラテジーは、周辺質において酸化状態が優勢であるため、分泌タンパク質の製造に使用される。簡易かつ効果的な細菌による調製のために、ユビキチンは、その製造に問題がある他の外来タンパク質に対する融合パートナーとして使用できる。ユビキチンとの融合によって、溶解度の改善およびそれによる製造収率の改善が、達成できる。
【０００９】
抗体または他の代替足場と比べ、ユビキチンタンパク質をベースとする人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）ともいう）は、小さいサイズ、高い安定性、高い親和性、高い特異性、費用対効果の高い微生物による製造、血清半減期の調整という利点を有している。しかしながら、免疫原性、迅速かつ予測的な前臨床開発の手順、および新しい治療方法の点から、それらのタンパク質をさらに開発する必要がある。国際公開第０５／０５７３０号パンフレット（特許文献４）には、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が、概略的に記載されているが、ハプテンおよび抗原等（例えば、タンパク質およびペプチド、ならびにこれらのエピトープ等）のリガンドへの、より高くより特異的な結合親和性を得るために、ユビキチンタンパク質を修飾する方法や、かかる修飾ユビキチンタンパク質を効率的に選択する方法については、記載されていない。
【００１０】
国際公開第０５／０５７３０号パンフレットに記載の方法は、修飾ユビキチンタンパク質の単量体または修飾ユビキチンの結合タンパク質（ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に関する。前記結合型は、１、２、またはそれ以上の修飾ユビキチンタンパク質をスクリーニングして選択し、その後、遺伝学的手法または化学的手法のいずれかにより、これらを組み合わせて結合型を得ることによって生成される。一つの結合ユビキチン分子によって、例えば、異なる種類のリガンドへの複数の特異的結合が可能となる。一例をあげると、単一の修飾ユビキチン分子と比べて結合親和性を増加させるため、二つの同一のユビキチンベースのタンパク質の部位特異的結合（ホモ二量体）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／１６８７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０５／０５７３０号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、リガンドへの高結合能を有する多量体ユビキチンタンパク質の同定方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、選択されたリガンドに高親和性で特異的に結合可能な、修飾ユビキチンベースの新規な結合タンパク質の同定方法を提供することである。
【００１４】
上述の課題は、提出した独立請求項の主題によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、ならびに下記の記載、実施例および図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、単量体４１Ｂ１０（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４１Ｂ１０ｔｈ）についての、Ｋｄ＝９．４μＭ＝９.４５×１０−６Ｍの結合親和性を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヘテロ二量体ユビキチンの結合親和性を示す。
【図２Ａ】図２は、サイトカインに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の高親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ＝５×１０−８Ｍ）。
【図２Ｃ】図２Ｂは、サイトカインＴＮＦαに融合することによって多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の親和性の向上を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ＝５．６×１０−９Ｍ）。
【図２Ｄ】図２Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。
【図２Ｅ】図２Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図３】図３は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。
【図４】図４は、配列アライメントを示す。
【図５】図５は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始する）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。
【図６】図６は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図７】図７は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図８】図８は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。
【図９】図９は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１０】図１０は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図１１】図１１は、ＥＤ−Ｂ結合変異体のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。
【図１２】図１２は、６種類のユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質の配列アライメントを示す。
【図１３】図１３は、結合決定領域ＢＤＲ１およびＢＤＲ２、ならびに、図１２に示すユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のリンカーのアライメントを示す。
【図１４】図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）への、図１２に示す結合変異体１１１１−Ｅ１０についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａは、第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価したことを示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｂは、第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６、６８位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されていることを示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｃは、ヘテロ二量体ユビキチン変異体ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２の、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１５Ｆ】図１５Ｄは、ＴＮＦαに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの配列を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ｅは、前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈの配列を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ０.９μΜ=９×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかることを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈの配列を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ１８０ｎＭ＝１．８×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかることを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓの配列を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ３．８μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかることを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓの配列を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ４．１μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
より具体的には、本発明者らは、以下の工程を含む、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の同定方法を提供する。
ａ）単量体修飾ユビキチンタンパク質から生じるヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された、異なる修飾がなされた２つ以上のユビキチン単量体または１つ以上の修飾ユビキチン単量体を含むヘテロ多量体タンパク質を含み、
前記ヘテロ多量体タンパク質に含まれる前記単量体の少なくとも２つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位の少なくとも３個のアミノ酸における表面露出アミノ酸が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾のユビキチンタンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する、前記工程
ｂ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群に対する潜在的なリガンドを提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記リガンドと接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、ヘテロ多量体修飾タンパク質を同定する工程であり、
前記ヘテロ多量体修飾タンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程、および
任意に、
ｅ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【００１７】
本願で使用されている重要な用語の定義
「ユビキチンタンパク質」は、配列番号１のユビキチン、および、下記の定義によるその修飾物を包含する。ユビキチンは、真核生物において、高度に保存されている。例えば、今日まで研究されてきた全ての哺乳類において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、げっ歯類、ブタ、および霊長類由来のユビキチン分子が、特に好ましい。また、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母由来のユビキチンは、配列番号１と３つのアミノ酸が異なるのみである。前記「ユビキチンタンパク質」に包含される前記ユビキチンタンパク質は、通常、配列番号１に対し、７０％を超える、好ましくは７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、または９７％までの配列同一性を示す。
【００１８】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度の決定には、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ｖｏｌ． １２： ３３７− ３５７， １９９１）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２（２２）： ４６７３−４６８０， １９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【００１９】
本明細書において、「リガンド」、「ターゲット」および「結合パートナー」は、同意語として使用され、置き換え可能である。リガンドは、前述のヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に、ここで定義される親和性をもって結合可能な任意の分子である。
【００２０】
本発明の「ヘテロ多量体融合タンパク質」または「ヘテロ多量体タンパク質」は、１つ以上の異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と考えられる。よって、本発明の「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質の融合体であると考えられる。前記少なくとも２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質は、特定の結合パートナーに対する一価の結合特性を共同でもたらす、２つの相互作用結合ドメイン領域を有する。ヘテロ二量体またはヘテロ三量体が好ましい。
【００２１】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的手法を使用して、互いにヘッドトゥテイル融合で結合される。前記異なる修飾融合ユビキチン単量体は、一価で結合し、両方の「結合ドメイン領域」（ＢＤＲ）が共に作用する場合にのみ効果的である。前記ヘテロマータンパク質を形成する前記修飾および結合ユビキチン単量体は、一つの連続的な結合領域を介して同じエピトープに結合する。前記ヘテロマーのこの連続的な領域は、少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体により形成される前記少なくとも２つのモジュールの両結合決定領域により形成される。
【００２２】
「ヘッドトゥテイル融合」は、２つ以上のタンパク質が、前記多量体に含まれるユニット数に応じて、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ方向においてそれらを結合することにより、互いに融合することと解釈すべきである。このヘッドトゥテイル融合において、前記ユビキチン単量体は、リンカーを介すことなく、直接連結することもできる。または、前記ユビキチン単量体の融合は、リンカーを介して行うことができる。前記リンカーは、例えば、少なくともＧＩＧのアミノ酸配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するリンカー、または、任意の他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられる。２つのユビキチン単量体の遺伝学的融合用の他のリンカーも、当該技術分野では公知であり、使用できる。要約すると、修飾ユビキチン単量体の融合タンパク質を得るために、異なる修飾がなされた２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチンタンパク質を融合させることにより、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質が提供される。さらに別の実施形態では、前記ユビキチン単量体の少なくとも１つは修飾されず、残りのユビキチン分子のうちの少なくとも１つが修飾される。
【００２３】
「群」という用語は、異種核酸によってコードされる異種ポリペプチドの混合物であるライブラリーを指す。前記ライブラリーは、核酸配列によってコードされる単一のポリペプチドをメンバーとして構成される。ライブラリーメンバー間での配列の相違により、前記ライブラリー内における多様性が得られる。前記ライブラリーは、複数のポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態であってもよいし、あるいは、核酸ライブラリーを用いて形質転換された、生物または細胞、例えば、バクテリア、ウイルス、動物または植物の細胞等の形態でもよい。個々の生物または細胞が、前記ライブラリーのメンバーを１つだけを含むのが好ましい。前記核酸を発現ベクターに組み込み、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの産生を可能にすれば有利である。したがって、好ましい態様においては、ライブラリーは、宿主生物群の形態をとってもよく、各生物が、１以上の発現ベクターのコピーを含有し、前記発現ベクターが、発現によって対応するポリペプチドメンバーを産生できる、核酸の形態にある前記ライブラリーメンバーを１つ含むよう構成してもよい。このように、前記宿主生物群は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の多大なレパートリーをコードできる可能性がある。
【００２４】
前記ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質群は、例えば、異なる修飾がなされた単量体タンパク質をそれぞれコードするＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することによって提供される。あるいは、これに代わる手法として、前記単量体ユビキチンタンパク質の少なくとも１つを修飾し、前記ＤＮＡをヘテロ多量体融合タンパク質に翻訳し、前記タンパク質をディスプレイし、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された単量体ユビキチンタンパク質を含むヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の存在下、前記ディスプレイされたタンパク質をスクリーニングすることによって提供される。前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ １０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示す。ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を得るため、異なる修飾がなされた単量体タンパク質のそれぞれまたは少なくとも１つをコードする２つのＤＮＡライブラリーの融合、ヘテロ三量体ユビキチンタンパク質を得るため、異なる修飾がなされた単量体タンパク質のそれぞれまたは少なくとも１つをコードする３つのＤＮＡライブラリーの融合等を行う。また、さらに別の代替手法を用いて、スクリーニング用のライブラリーを提供してもよい。一例として、例えば、ソリッドステート技術により前記タンパク質を化学合成し、そのアミノ酸組成にバリエーションをもたらすことが挙げられる。当業者であれば、さらに別の選択肢に想到し、その有用性を見出す可能性がある。したがって、本発明は、本明細書に記載の例に限定されるものと解釈すべきではない。
【００２５】
よって、本発明は、リガンドへの結合能によって決定される機能性によりポリペプチドのレパートリーを提供し、選択の結果得られたポリペプチドのサブセットを採用して前記ターゲットリガンドへの結合能に基づくさらなる選択ラウンドを行い、前記リガンドに対する結合親和性の蓄積および増加を図る方法を開示している。
【００２６】
本発明によれば、当業者は、選択されたポリペプチドのレパートリーから、請求項に規定の親和性で前記ターゲットリガンドに結合できないポリペプチドを除去することができる。また、本発明によれば、当業者は、選択されたポリペプチドのレパートリーにおいて、機能的で、かつ前記親和性の要件を満たすポリペプチドの濃度を高めることができる。
【００２７】
本発明の最も重要なキーポイントの１つは、前記ターゲットに対して一価の結合親和性を有する前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の選択と、それに続いて行われる、前記結合親和性に関与する前記修飾アミノ酸の決定である。
【００２８】
多量体化、好ましくは二量化のさらなる利点は、新規な高親和性の結合特性を発生するために修飾され得るアミノ酸残基の総数の増加にある。前記利点は、多くのアミノ酸が修飾されても、ターゲットに対する前記新規に生成された結合タンパク質の足場全体の安定性が低下することがなく、タンパク質の化学的完全性（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されることである。一方、所定のターゲットに対する新規結合部位を発生させるために修飾され得る残基の総数は、前記修飾残基が２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチンタンパク質に割り当てられることで増加する。修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子数に応じて、２倍またはｘ倍にできる。要約すると、ユビキチンベースの結合タンパク質のモジュール構造は、２つ、３つ、またはそれ以上の単量体ユビキチン分子に前記修飾アミノ酸が含まれると、前記修飾アミノ酸の総数を増加できる。本発明の方法は、一価の特異性（一つのシングルエピトープ）を有するヘテロ多量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００２９】
「一価」は、前記修飾二量体（任意に三量体、または通常は多量体）ユビキチンの前記第１および前記第２（任意に、さらに多くの）単量体ユニットにおいて生成された両結合領域が共に、ＥＤ−Ｂに相乗的に組み合わせられるように結合する機能、すなわち、両結合領域が、共同で一価の結合活性を形成する役割を果たす機能と理解されるべきである。前記二量体分子における前記第１および前記第２修飾ユビキチン両方の各結合領域を、別々に取り除いた場合、ＥＤ−Ｂへの結合は、前記二量体分子より明らかに効率および親和性が低下するだろう。前記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で使用するよりも、より効率的にＥＤ−Ｂに結合可能となるように、両結合領域は、アミノ酸の連続領域として前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面に形成されるユビキチン結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に、前記２つの単量体タンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。最も有力な結合ユビキチン分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した単量体ユビキチンユニット同士を連結することにより、これらの分子を得てもよい。二量体修飾ユビキチンタンパク質に関して本明細書に提示する例は全て、三量体または通常は多量体修飾ユビキチンタンパク質に関するものに変更できると解釈すべきである。
【００３０】
したがって、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ多量体、特にヘテロ二量体の使用は、これらの修飾残基の全量が、前記二量体または多量体を形成する前記２以上の単量体ユニットに割り振られるため、最終的な結合分子の前記タンパク質の化学的完全性に過度に影響を与えない修飾残基数を増加させる可能性を切り開く。前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００３１】
例えば、単量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つのＤＮＡライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたコドンに異なる修飾をすることにより確立された後、ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得るために、これらのライブラリーは、遺伝学的に融合される。本発明によれば、これらのライブラリーのＤＮＡがタンパク質に翻訳され、このようにして得られたヘテロ多量体タンパク質がターゲット分子に接触されて、結合親和性が存在する場合には、パートナーへの結合が可能となる。好ましい修飾ユビキチンは、ヘテロ二量体である。
【００３２】
接触工程およびスクリーニング工程が、ヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）修飾ユビキチンタンパク質について、既に行われていることが本発明の重要な態様である。この工程により、前記ターゲットへの一価の結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングが可能である。
【００３３】
本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングにより選択した後に、前記単量体修飾ユビキチンタンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ多量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。ただし、最も有力なヘテロ多量体ユビキチン結合分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンユニット同士を連結してヘテロ二量体結合タンパク質を形成することにより、これらの分子を得てもよい。
【００３４】
本発明における接触は、適切な提示方法および選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、または細菌表面ディスプレイ等の方法、好ましくは、リボソームディスプレイ法またはファージディスプレイ法により行われる。徹底した開示のために、下記の参考文献を参照できる；Ｈｏｅｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．． ３ （１９９３）， ５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２ （１９９２）， ５９７−６０４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。前述の方法は、当業者に公知であり、本発明における修飾に使用できる。
【００３５】
本発明によれば、前記修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して、定量化できる結合親和性を有するかどうかの決定は、１以上の下記の方法により行うことが好ましい。ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および超遠心分析法。当該技術分野において利用可能なその他の方法が、技術常識の範囲内において当業者に利用可能である。
【００３６】
本明細書において、「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なる単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質であると考えられる。本発明の「ヘテロ二量体」は、異なる修飾がなされた２つの単量体ユビキチンタンパク質の融合物であると考えられる。前記２つの単量体ユビキチンタンパク質は、いずれも、特異的結合パートナーに対して、共同で一価の結合特性を示す。本発明の修飾多量体（例えば、二量体）リガンド結合ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個々にスクリーニングし、その後、これら少なくとも２つを結合することによっては、得ることができず、前記リガンドへの共同での一価の結合活性を示す第１および第２単量体ユニットまたはさらなる単量体ユニットからなる多量体（任意に、二量体）タンパク質をスクリーニングすることにより、得ることができることを強調しておく。前記各サブユニットは、前記リガンドへの結合親和性がかなり制限され、結合した多量体または二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが、本明細書に記載の優れた結合特性を有することが期待される。
【００３７】
一実施形態においては、前記方法は、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質の同定に関するものであり、２つの単量体ユビキチンユニットが互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、前記二量体タンパク質の各単量体が、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置するアミノ酸（各アミノ酸は、表面が露出されている）の少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個の置換により、異なる修飾がなされており、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％、および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
リガンドに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記リガンドに対して一価の結合活性を示す。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、各単量体ユビキチンユニットにおいて、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位における、６、７、８、９個または全てのアミノ酸が、修飾される。本発明においては、各単量体ユニット、例えば、第１ユニットおよび第２ユニットにおいて、これらの変異は、それぞれ組み合わせることができると理解される。例えば、前記第１ユニットが、６つの修飾を含むことができ、一方、前記第２ユニットが、７つまたは８つの修飾を含み、前記第１ユニットが８つの修飾を、前記第２ユニットが７つの修飾を含んでもよい、等である。前述に列挙する各アミノ酸は、前記第１ユニット、前記第２ユニットから選択でき、その後、前記両ユニットは、組み合わせられる。好ましい置換は、以下に記載する。
【００３９】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質のディスプレイ方法
本願に適用されるファージディスプレイ法およびリボソームディスプレイ法は、下記および実施例に記載されている。これら方法は、本明細書に記載の潜在的なリガンドに対して結合特性を示すユビキチン変異体を検出するための、本発明における選択手法の例として挙げられている。同様に、例えば、細菌上に提示する方法（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１（９）：８２５−８３２）もしくは酵母細胞上に提示する方法（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ； Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１１）：１３０３−１０）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４（１０）：４９３７−４９４２； Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ２５（２４）：５１３２−５１３４）、ｃｉｓディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０１（９）：２８０６−２８１０）もしくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択システムを、適用できる。後者の場合、遺伝子型および表現型の一過性の物理的な結合が、リボソームを介して、適切なｍＲＮＡへのタンパク質変異体の連結により達成される。
【００４０】
本明細書に記載のファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換え変異体は、繊維状ファージ上に提示される。一方、この変異体のコードＤＮＡは、一本鎖の形状でファージエンベロープパッケージされ、同時に提示される。このため、親和性濃縮の枠組みにおいて、所定の特性を有する変異体を、ライブラリーから選択でき、その遺伝情報を、それぞれ、適切な細菌に感染させることにより増幅でき、また異なる濃縮サイクルに添加できる。ファージ表面での変異したユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくはＰｅｌＢシグナル配列、および、前記ファージのカプシドまたは表面タンパク質への遺伝子融合により達成され、カプシドタンパク ｐIIIまたはそのフラグメントのカルボキシ末端融合が好ましい。また、コードされた融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる検出および／または精製のためのアフィニティータグもしくは抗体エピトープ、または、前記親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的切断のためのプロテアーゼ認識配列等のさらなる機能性成分を含んでもよい。また、例えば、ユビキチン変異体の遺伝子およびファージカプシドタンパク質またはそのフラグメントのコード領域の間に、アンバー停止コドンを存在させてもよい。前記アンバー停止コドンは、１つのアミノ酸の導入により、部分的に、適切なサプレッサー株における翻訳の際に認識されない。
【００４１】
所定のターゲットへの結合特性を有するユビキチン変異体の単離に関する選択工程に適切であり、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入された細菌ベクターは、ファージミドという。中でも、繊維状ファージの遺伝子間領域（例えば、Ｍ１３もしくはｆ１）、または、その部分を含む。例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージによる前記ファージミドを輸送する細菌細胞の重複感染の際、ファージカプシド中に、ファージミドＤＮＡの共有結合的に閉鎖された鎖（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｓｔｒａｎｄ）がパッケージングされる。このようにして発生したファージ粒子は、細菌により分泌され、前記カプシドタンパク質 ｐIIIまたはそのフラグメントとの融合により、その表面にコードされた各ユビキチン変異体を、細菌表面に提示する。本来のｐIIIカプシドタンパク質は、適切な細菌株への再感染できるように、ファージ粒子に存在する。このため、対応するＤＮＡの増幅の可能性は、保持される。このため、前記ユビキチン変異体の表現型、すなわち、潜在的な結合特性とその遺伝子型との間の物理的な結合が、確保される。
【００４２】
得られたファージ粒子を、当業者に公知の手法により、ファージ上に提示されたユビキチン変異体の、任意のターゲット、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦ、ＩｇＧ、またはその他のターゲットへの結合により選択できる。このために、前記提示されたユビキチン変異体は、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化され、結合しない変異体を分離した後に、特異的に溶出し得る。前記溶出は、例えば、１００ｍＭ トリエチルアミン等の基本溶液により行うことが好ましい。また、前記溶出は、酸性条件下で、タンパク質分解または感染細菌の直接添加により行うことができる。このようにして、得られたファージ粒子は、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦ、ＩｇＧまたはその他のターゲットへの結合特性を有するユビキチン変異体の、連続的な選択サイクルおよび増幅サイクルにより、再度増幅され、濃縮され得る。
【００４３】
ファージディスプレイのバリエーションの１つとして、Ｔａｔファージディスプレイ技術（Ｐａｓｃｈｋｅ、Ｍ． ａｎｄ Ｗ． Ｈｏｈｎｅ （２００５）．Ｇｅｎｅ ３５０（１）：７９−８８；欧州特許第１５６７６４３号明細書も併せて参照されたい）があげられる。この方法によれば、前記ファージミドにコードされた前記ユビキチン変異体が、細胞質内でネイティブ・コンフォメーションを既に獲得した折り畳みタンパク質を搬出する双アルギニン転座（Ｔａｔ）系を介して分泌される。（Ｂｒｕｓｅｒ ２００７ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６（１）：３５−４５）。分泌の必要条件は、前記ユビキチン変異体をＴａｔポアへと向かわせる特定のＮ末端シグナルペプチドとの融合である。細胞膜周辺腔への進入後、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによって除去される。前記細胞膜周辺腔において、前記ユビキチン変異体は、カプシドタンパク ｐIIIまたはそのＣ末端フラグメントに共有結合され、その他のファージタンパク質と共に、Ｓｅｃ経路を介して細胞質から分泌される。ユビキチンとｐIII間のこの結合は、前記ｐIIIタンパク質のＮ末端におけるＪｕｎロイシンジッパーと、前記ユビキチン変異体のＣ末端におけるＦｏｓロイシンジッパーとの高親和性相互作用によって実現される。前記各ロイシンジッパーのＮ末端およびＣ末端におけるさらなるシステインにより、両タンパク質間の共有結合が可能となり、その結果、ディスプレイされたユビキチンおよびコードされた遺伝子産物間の共有結合が、前記ファージ粒子内で可能となる。
【００４４】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、前記ユビキチン変異体が、まだファージミドの形態にあるとき、すなわち、ファージに融合され、または、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、可溶性のタンパク質の形態にあるときに行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。前記特性評価は、例えば、ＤＮＡ配列の決定、よって、単離された変異体の一次配列の決定を含んでもよい。また、単離された変異体の親和性および特異性は、例えば、標準的な生化学的方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、または超遠心分析法により検出できる。安定性分析については、例えば、化学的または物理的変性についての分光法が、当業者に公知である。その他の周知な方法としては、ＣＤスペクトル測定、タンパク質蛍光分光法、および核磁気共鳴分光法がある。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチン変異体のリボソームディスプレイ法を、無細胞転写／翻訳系の手法により準備し、対応するｍＲＮＡおよびリボソームが複合体として提示される。このために、前述のＤＮＡライブラリーは、基礎として使用され、変異体の遺伝子は、対応する発現およびタンパク質生合成の制御配列との融合の形態で提示される。前記遺伝子ライブラリー３’末端での前記停止コドンの欠失、および、前記新生タンパク質からなる三元複合体に適した実験条件（低温、高濃度のＭｇ２＋）により、前記ｍＲＮＡおよび前記リボソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳中において維持される。
【００４６】
各単量体ユビキチンユニットにおける選択されたアミノ酸の異なる修飾により、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが確立された後に、本発明によれば、前記修飾二量体タンパク質は、ターゲットに接触され、結合親和性を有する場合には、パートナー同士の結合を可能にする。これらのタンパク質ライブラリーは、前記修飾タンパク質と前記ターゲットタンパク質間の接触を可能とする方法で、前記修飾タンパク質を提示する任意の他の方法をディスプレイし、または使用する、ディスプレイ法ライブラリーの形態でもよい。前記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイ法である。
【００４７】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質の潜在的なリガンドおよびターゲット
本発明は、下記の代表的な抗原、すなわち、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＭＩＡ−２、ＮＧＦおよびＩｇＧについて、十分に立証されている。これらの抗原は、あくまでも、当業者が本明細書中に提供される情報を取得した後、本明細書に記載の方法を、過度の負担を伴うことなく、十分実施可能である旨を示すために選択されたものと解釈されるべきである。本発明は、これらの特定の抗原に制限されることなく、当該技術分野において公知である全ての、もしくは少なくともほとんどのリガンドおよびターゲット分子について実施可能である。これらのターゲットは、当業者であれば、当該技術分野の技術常識の範囲内において選択可能である。リガンドおよびターゲット、ならびに抗原およびハプテンの一般的な定義を以下に示し、さらに別の潜在的なターゲット分子を選択して、例示としてあげる。
【００４８】
本発明において、抗原とは、抗体と同等の機能を有する本明細書記載の修飾ユビキチンに結合可能な物質を指す。本明細書中で用いられる代替用語は、「リガンド」、「結合パートナー」、または「ターゲット」である。本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、抗体と同様に作用しながら、抗体の欠点を回避する結合分子を提供する。抗原という用語は、ハプテン、ペプチド、タンパク質、糖、ＤＮＡ等を包含する。Ｒｏｃｈｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ Ｍｅｄｉｚｉｎ（第４版；Ｕｒｂａｎ ＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＧｍｂＨ）から、抗原およびハプテンについて次の定義を得ることができ、本明細書においても使用される。
【００４９】
抗原（ＡＧ）は、免疫系により異種（非自己）と認識される任意の物質を意味する。ほとんどの場合、免疫反応を引き起こし、免疫に至る（＝免疫原）。アレルギー（＝アレルゲン）およびアトピー（＝アトピゲン）の場合、それぞれ、この免疫反応が拡大する。ＡＧは、体液性（抗原抗体反応）および／または細胞性防御反応（免疫、下記参照）を誘導する。ＡＧが免疫系により許容される場合（免疫寛容）、「免疫寛容原」ともいう。抗原として有効なものは、主に、免疫反応に関与する化学的に特定できる機能性（決定因子）を有する複合体、またはより大きな分子量の物質（タンパク粒、多糖、ヌクレオチド、および多くの合成化合物）である。前記抗原は、１）完全ＡＧ：ほとんどの場合、より大きな分子量を有し、それ自身で免疫反応を誘導できるもの；２）低分子量ハプテン（＝半抗原）；より大きなキャリア分子と結合した後でのみ免疫原として作用するもの；に分類される。前記抗原は、例えば、異物−、非自己−または同種同系−、自家ＡＧ；自己−、ヘテロ−、移植−、抗腫瘍ウイルスＡＧ等ともいう。
【００５０】
ハプテンは、抗原（ＡＧ）の特異性に関与し、または、その構造（決定因子）に起因して抗体に特異的に結合できる、単純な低分子量化合物であるが、完全ＡＧとは対照的に、それ自身ではアレルギーを生じることはできない。キャリアと呼ばれるタンパク粒と結合した後に完全な抗原となる。
【００５１】
「リガンド」、「ターゲット」、または「結合パートナー」は、本明細書に記載の修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質によって認識される分子である。本発明の実施に際して採用できるリガンドは、特に制限されず、例えば、細胞膜受容体に対する作用物質および拮抗物質、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ポリペプチド、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、薬剤（例えば、オピエート、ステロイド等）、レクチン、糖、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体があげられる。
【００５２】
要約すると、本発明により提供される修飾タンパク質の結合パートナーとしては、生物学的・医学的な活性を有する、あらゆる関連分子を採用可能である。考えられる結合パートナーを、例を挙げて以下に述べる。ただし、このリストには、複数の他の考えられるリガンドも加えることができることに留意されたい。抗体と抗原の関係と同様に、潜在的な結合パートナーのリストは、さらなる潜在的なリガンドを加えることで完全なものとすることができる。
【００５３】
この発明においては、ヘテロ二量体ユビキチンの結合パートナーは、例えば、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）、サイトカイン（腫瘍壊死因子α）（ＴＮＦ−ａ）、ＭＩＡ−２、免疫グロブリンまたはその一部、例えば、全抗体（例えば、免疫グロブリンＧ）、および成長因子（例えば、ＮＧＦ、例えば、ヒト神経成長因子）があげられる。これらのリガンドについて、以下に簡潔に述べる。しかしながら、これらのリガンドは全て、長年にわたって当該技術分野において周知であり、各技術分野における当業者に公知であることを強調しておく。したがって、以下の記載は、アミノ酸配列も公知である、これらのタンパク質のいくつかの重要なパラメータの概要に過ぎない。
【００５４】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、プライマリーＲＮＡ転写物の代替スプライシングによってフィブロネクチン分子に挿入された、小さいドメインである。ＥＤ−Ｂは、癌および乾癬に関与することが知られている。驚くべきことに、高レベルのＥＤ−Ｂ発現は、胸、結腸直腸、非小細胞肺、膵臓、肝細胞、頭と首、およびヒトの肌、ならびに頭蓋内髄膜腫、グリオブラストーマを含むほとんど全てのヒトの固体癌のエンティティにおける一次病変、ならびに転移性部位において検出された（Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５）。さらに、ＥＤ−Ｂは、診断剤と結合でき、診断ツールとして有用である。一例として、例えば、動脈硬化プラークの分子の画像化や、例えば、癌患者の免疫シンチグラフィーによる、癌検出おける使用があげられる。さらに多くの診断用に使用できると考えられる。
【００５５】
フィブロネクチンのヒトエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）における９１個のアミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。前記タンパク質の発現のため、開始メチオニンを加えなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、げっ歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等において保存されている。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物は、例えば、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。
【００５６】
前記タンパク質ＭＩＡ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＣＤ−ＲＡＰ（軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質）ともいう）は、軟骨細胞において発現され、元来、そのｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗増殖特性によって単離されていた。元来、メラノーマ細胞の細胞培養上清から検出され、そこから単離されていた。前記タンパク質の精製および部分的な配列決定を行った後、ヒトＭＩＡのｃＤＮＡフラグメントを、ディジェネレートプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を利用して単離した。現在、ＭＩＡについては、ヒト、マウス、ウシ、ラット、およびゼブラフィッシュの配列が公知である。関連タンパク質であるＭＩＡ−２が、欧州特許第１４１０８０３号明細書および米国特許出願公開２０１０／０２１２０３７号明細書に記載されている。これらの文献は、引用により、本明細書に組み込まれる。
【００５７】
多面サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、主としてマクロファージによって生成されるが、その他の種類の細胞も、これを生成する。ＴＮＦαは、有益かつ病理学的な活性を示す。ＴＮＦαは、自己制御型であることに加え、増殖促進効果と増殖抑制特性との両方を有する。ＴＮＦαの有益な機能としては、身体のサーカディアンリズムを調節することによる恒常性の維持、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫感染に対する免疫応答の開始、線維芽細胞成長の刺激による損傷組織の交換または再構築、およびその名が示唆する通り、ある種の腫瘍の死滅があげられる。ＴＮＦαは、多岐にわたる疾患のメディエータとされてきた。
【００５８】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、感覚ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存と分化を促進する分子として、５０年以上前に発見された分泌タンパク質である。ＮＧＦは、ニューロトロフィンとして知られる神経栄養因子のファミリーメンバーである。ＮＧＦは、ＴｒｋＡとして知られるトロポミオシン受容体キナーゼに高親和性で結合する。また、ＮＧＦは、ｐ７５として知られる受容体にも結合可能である。ｐ７５は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、他のニューロトロフィンとも相互作用する。ＮＧＦのβ鎖は、ＮＧＦの神経成長刺激活性にのみ関与している。前記β鎖は、ホモ二量体化し、より大きなタンパク質複合体に取り込まれる。ＮＧＦの構造および機能は、例えば、Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ， Ｍ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２４：１２１７−１２８１；Ｗｅｉｓｍａｎｎ， Ｃ． ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．Ｍ． （２００１） Ｃｅｌｌ． ＭｏＩ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５８：７４８−７５９；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ， Ｍ． （１９９１） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：１−２６、において考察されている。
【００５９】
ＩｇＧ抗体は、４本のペプチド鎖からなる約１５０ｋＤａの大きな分子である。ＩｇＧ抗体は、約５０ｋＤａの同一の２本の重鎖と、約２５ｋＤａの同一の２本の軽鎖を含み、これにより、四量体四次構造を有する。前記２本の重鎖は、ジスルフィド結合により、互いに結合すると共に、軽鎖に結合している。この結果生じた四量体は、２つの同一の二等分部分（ｈａｌｖｅｓ）を有し、これらの部分は共同でＹ字形状を形成している。分岐の各端部は、同一の抗原結合部位を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ−糖化部位を有している。この部位に付着したＮ−グリカンは、大部分が、複合型のコアフコシル化二分岐構造を有する。さらに、これらＮ−グリカンの少量は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃおよびα−２，６結合シアル酸残基も有する。
【００６０】
ディスプレイされたタンパク質の選択、濃縮、および特性評価の方法
１０−７〜１０−１２Ｍの範囲のＫｄの特異的結合親和性による所定のターゲットへの結合活性に関して、ヘテロ多量体修飾ユビキチンの選択を、当業者に公知の方法により行うことができる。このために、例えば、リボソーム複合体で提示される前記ユビキチン変異体を、それぞれ、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化させ、または、溶液中で結合した後に磁性粒子に結合させ得る。非結合変異体の分離に続けて、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、リボソーム複合体の破壊により、ｍＲＮＡの形態で特異的に溶出できる。前記溶出は、ＥＤＴＡで行うのが好ましい。このようにして得られた前記ｍＲＮＡは、単離され、適切な方法を使用してＤＮＡに逆転写され（逆転写反応）、このようにして得られた前記ＤＮＡは、再度増幅され得る。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択、および増幅の連続サイクルにより、所定のハプテンまたは抗原への結合特性を有するユビキチン変異体を、濃縮できる。
【００６２】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、前述のように、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、前記文献に記載されている。
【００６３】
好ましくは、所定の結合パートナーに対する結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、前記検出されたタンパク質の単離工程および／または濃縮工程が続く。
【００６４】
前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体公知の方法によりさらに、精製および濃縮される。前記選択された方法は、例えば、使用する発現ベクター、宿主組織、意図する使用分野、タンパク質の大きさ、およびその他の要因等、それ自体当業者に公知の複数の要因により決定される。簡易に精製するために、本発明の修飾タンパク質は、分離材料への高い親和性を有する他のペプチド配列に融合させることができる。ユビキチンタンパク質の機能性に有害な効果を有さないか、または、特定のプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能な融合が、好ましく選択される。このような方法は、それ自体当業者に公知である。
【００６５】
突然変異誘発の開始点としての非修飾および修飾ユビキチンタンパク質
「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」は、さらに後述する結合領域を一つ含むユビキチンタンパク質を指す。結合領域は、少なくとも２つの結合決定領域（ＢＤＲ）を指すことができる。各単量体は、少なくとも１つ結合決定領域を有し、少なくとも２つの単量体が、１つの抗原に対する１つの結合領域を形成する少なくとも２つの結合決定領域を有する多量体を形成する。このようなユビキチンベースの結合タンパク質は、いずれも、例えば、多量体化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等の結合ドメインでない付加的なタンパク質ドメイン、および／または、非タンパク性のポリマー分子を含んでもよい。非タンパク性のポリマー分子は、例えば、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等である。
【００６６】
前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質のさらなる多量体化を、例えば、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質を、多量体化ドメインを有するエフェクター分子（例えば、ＴＮＦα）に、翻訳後に融合させることによって行うことも可能である。さらに別の実施形態においては、さらなる多量体化が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの使用により行われる。さらに別の実施形態においては、前記多量体化ドメインは、薬学的活性成分としても作用する。一例としては、多量体化ドメインおよび薬学的成分の両方として作用するＴＮＦαがあげられる。
【００６７】
修飾ヘテロ多量体ユビキチンタンパク質
「修飾ユビキチンタンパク質」は、アミノ酸の置換、挿入または欠失のいずれか一つ、または、それらの組み合わせによる、前記ユビキチンタンパク質の修飾を指す。ただし、上記修飾のいずれか一つによりなされる修飾で、最も好ましいのは置換である。前記修飾単量体ユビキチンユニットは、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つであるアミノ酸同一性を有するため、前記修飾数は厳密に限定されている。それゆえ、単量体ユニットにおける全修飾アミノ酸数、好ましくは、全置換数は、８０％のアミノ酸同一性に対応して、最大で１５個のアミノ酸に限定される。代替例として、修飾アミノ酸数が、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個であってもよい。前記二量体ユビキチン分子における全修飾アミノ酸数、好ましくは、全置換数は、前記二量体タンパク質に基づく、２０％のアミノ酸の修飾に対応して、３０個である。代替例として、前記二量体ユビキチン分子中の修飾アミノ酸数が、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個であってもよい。前記二量体修飾ユビキチンタンパク質の前記アミノ酸同一性は、配列番号１の基本単量体配列を有する二つの非修飾単量体ユビキチンタンパク質からなる二量体ユビキチンと比較して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つから選択される。
【００６８】
本発明の方法で得られる前記修飾ユビキチンタンパク質は、ターゲット分子、リガンド、または結合分子（これらの表現は、本明細書において相互に用いられる）に対する新規な結合親和性を有する組換え人工タンパク質である。
【００６９】
「置換」は、例えば、元のアミノ酸への化学基もしくは残基の置換または付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。βシート領域の少なくとも一つのβ鎖に位置するアミノ酸、または、前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸を含む前記タンパク質の少なくとも一つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が、重要である。
【００７０】
修飾は、当該技術分野において、十分に確立された公知の方法により行われる。「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」は、いくつかの部位が、ヌクレオチドまたはアミノ酸により挿入、欠失または置換され、特性が予測できないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。多くの場合、挿入された前記ランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列、または、ヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダム」であろう（例えば、ランダム化合成またはＰＣＲを介した突然変異の結果として）。ただし、前記ランダム配列は、共通の機能的特性（例えば、発現産物のリガンドへの反応性）を有する配列を含み得る。また、前記ランダム配列は、最終的な発現産物が、例えば、異なるアミノ酸が均等に分布した、完全にランダムな配列であるという意味で、ランダムでもよい。
【００７１】
ランダム化されたフラグメントをベクター中に適切に導入するために、本発明では、前記ランダムヌクレオチドは、部位特異的ＰＣＲを介した突然変異の方式により、発現ベクター中に導入されるのが好ましい。ただし、他の選択肢は、当業者に公知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーを同様にベクターに挿入可能である。
【００７２】
融合ＰＣＲにより変異体またはライブラリーを発生させるために、例えば、３回のＰＣＲ反応を行ってもよい。２回のＰＲＣ反応は、部分的に重なった中間体フラグメントを発生するように行われる。３回目のＰＣＲ反応は、前記中間体フラグメントを融合するように行われる。
【００７３】
ライブラリーまたは変異体株の構築方法は、所望の制限酵素認識部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）の第１セット、および、例えば、目的のコドンの上流および下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）の第２セットを構築する工程を含んでもよい。制限酵素認識部位プライマーは、フォワード制限酵素認識部位プライマーおよびリバース制限酵素認識部位プライマーを含む。変異原性プライマーは、フォワード変異原性プライマーおよびリバース変異原性プライマーを含む。一実施形態において、前記プライマーは、目的のコドンのすぐ上流およびすぐ下流について構築される。前記制限酵素認識部位プライマーおよび前記変異原性プライマーは、前記第１中間体フラグメントおよび前記第２中間体フラグメントの構築に使用される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直線状の中間体フラグメントが生成される。これらの各直線状の中間体フラグメントは、少なくとも一つの目的の変異コドン、フランキングヌクレオチド配列、および切断部位を含む。前記３回目のＰＣＲ反応では、前記２つの中間体フラグメント、ならびに前記フォワード制限酵素認識部位プライマーおよび前記リバース制限酵素認識部位プライマーが使用され、直線状の融合産物が生成される。一方、前記直線状の産物の結合していない末端は、制限酵素で切断され、前記直線状の産物に付着末端が作製される。前記直線状の産物の前記付着末端は、ＤＮＡリガーゼの使用により融合され、環状の産物、例えば、環状のポリヌクレオチド配列が生成される。
【００７４】
前記中間体フラグメントの構築のために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのセットについての設計および合成が行われる。前記２つのセットは、制限酵素切断部位およびそのフランキングヌクレオチド配列を含む第１セット、ならびに、目的の変異コドンを少なくとも一つ含む第２セット（変異原性プライマー）を含む。当業者は、前記変異の数が所望の変異アミノ酸修飾の数に対応することを認識するであろう。本願発明者は、他の制限酵素が前記工程に使用可能かを熟考した。この切断部位の正確な位置、ならびに、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの対応する配列は、適宜改変され得る。当該技術分野において利用可能な他の方法も、代替として使用し得る。
【００７５】
本発明において、足場に導入される発現産物のランダム化フラグメントを有することを除けば、前記ランダム化ヌクレオチド配列を、少なくとも一つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合させることにより、融合パートナーに前記ランダム配列を連結する必要がある。融合パートナーは、例えば、前記発現産物の発現および／または精製／単離および／または、さらに安定化を促進できる。
【００７６】
精製のため、前記融合パートナーは、Ｈｉｓ６タグ、ｍｙｃタグ、ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化ターゲット配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴ等の精製標識を含んでもよい。さらに、前記融合パートナーは、選別シグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）配列またはターゲティング配列を含んでいてもよい。
【００７７】
本発明によれば、前記ターゲット分子に特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、前記ターゲット分子に対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できるように、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はない。
【００７８】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくはランダム変異導入法による、好ましくは遺伝学的レベルでの突然変異、すなわち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【００７９】
置換は、特に、ユビキチンタンパク質のβシートの４つのβ鎖の表面露出アミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接する３つ目までの表面露出アミノ酸において行われる。各β鎖は、通常、５〜７個のアミノ酸からなる。配列番号１に関して、例えば、単量体ユビキチンの前記β鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、１２〜１６、４１〜４５および６５〜７１を包含する。付加的にかつ好ましく修飾され得る領域は、前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸（すなわち、１番目、２番目または３番目）の部位を含む。付加的にかつ好ましく修飾され得る前記好ましい領域は、特に、アミノ酸残基８〜１１、６２〜６４および７２〜７５を含む。前記好ましい領域は、２つのβ鎖が互いに結合したβターンを含む。好ましいβターンとしては、例えば、アミノ酸残基６２〜６４があげられる。前記β鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は、８位のアミノ酸である。また、アミノ酸置換のさらなる好ましい例は、３６、４４、７０、７１、および／または７３位である。例えば、付加的にかつ好ましく修飾され得る領域は、６２、６３および６４位のアミノ酸（３個のアミノ酸）、７２、７３位のアミノ酸（２個のアミノ酸）、または８位のアミノ酸（１個のアミノ酸）を含む。
【００８０】
付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上のアミノ酸に限定され、前記へテロ二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８個のアミノ酸に限定され、通常は、前記単量体タンパク質における修飾数のｘ倍である。通常、単量体分子においては、１〜１０個のアミノ酸が挿入され、および／または１〜７個のアミノ酸が欠失される。単量体分子当たり、６個以上１４個以下のアミノ酸が置換される。二量体分子においては、合計で１２個以上２８個以下のアミノ酸が置換され、および／または合計で１個以上２０個以下のアミノ酸が挿入され、および／または１個以上１４個以下のアミノ酸が欠失される。これらの数値の間に存在するあらゆる数字が使用可能であり、本発明の範囲内である。また、分子の全体的な構造的完全性が維持されるのであれば、欠失、挿入、置換数のあらゆる組み合わせが可能である。本発明の一実施形態では、βシート構造が維持される。
【００８１】
任意の実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個に限定され、それに応じて、前記二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個に限定される。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【００８２】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、請求項で特定され本明細書で説明された前記置換に加えて、１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を含む場合には、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられる前記アミノ酸部位を、対応するタンパク質同士で分配するために、前記修飾ユビキチンについてアライメントさせなければならない。融合タンパク質の場合（後述を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（およびアライメント）は、同様の方法によりなされる、すなわち、例えば、二量体のアライメントは、各サブユニットの１位のアミノ酸から開始される。
【００８３】
前記単量体ユビキチンタンパク質、好ましくは、例えば、ヒト等の哺乳類由来の単量体ユビキチンにおいて、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％が修飾されることができ、好ましくは置換される。β鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の好ましくは最大で約５０％、さらに好ましくは最大で約４０％または約３５％、約３０％以下、または約２５％以下が修飾され、好ましくは置換される。通常、一つのβ鎖において、１〜４個のアミノ酸が修飾される。一実施形態では、β鎖、好ましくは、第１β鎖および第４β鎖、例えば、２〜７位もしくは６５〜７１位のアミノ酸残基の領域において、６個のアミノ酸のうちの２個が修飾される。
【００８４】
ヘテロ多量体の構成要素として使用される本発明の修飾単量体ユビキチンは、合計で、２０％以下のアミノ酸が修飾される。これを考慮すると、配列番号１に対する前記修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は、少なくとも８０％である。本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、さらに、少なくとも９０％、少なくとも９２％、または少なくとも９５％である。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列の前記修飾ユビキチンタンパク質をも包含する。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、予め修飾されたユビキチン（配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位におけるアミノ酸の３、４、５、６、または７個が修飾されている）を、ターゲットへの結合特性を発生するためのさらなる修飾の開始点として使用し、配列番号１のユビキチンのアミノ酸が、合計で、９、１０、１１、１２、１３、１４、最大１５個までの修飾された、好ましくは置換されたユビキチンを得る。例えば、さらなる修飾は、７４および７５位のアミノ酸または４５位のアミノ酸における修飾を含むことができ、この修飾により、より良好な安定性またはタンパク質化学特性を発生する。一例によれば、ヘテロ多量体タンパク質の構成要素としての修飾単量体ユビキチンは、このような方法により、１４個の置換および１個の欠失を有するものが得られた。ユビキチンの総アミノ酸数に基づいて、これは、約２０％の割合に相当する。このことは、非常に驚くべきことであり、通常、もっと低い割合で、十分にタンパク質のフォールディングを阻害してしまうため、予測できなかったことである。
【００８６】
本発明の一実施形態において、これらのアミノ酸は、タンパク質表面上に連続的な領域を形成する、新規な結合特性を有する領域の発生のために修飾される。このようにして、前記標的リガンドへの結合特性を有する連続的な領域を発生させることができる。本発明において、「連続的な領域」は、以下の通りである。側鎖の電荷、空間的構造および疎水性／親水性により、それに対応して、アミノ酸は、その環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、通常は、水または、例えば、空間的に近いアミノ酸等の他の分子であり得る。タンパク質に関する構造情報および各種ソフトウェアの手段により、前記タンパク質表面の特徴を決定できる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との接触領域を、この接触領域がどのような構造であるか、溶媒に接触しやすい表面領域はどれか、または、前記表面において電荷がどのように分布しているか、についての情報を含むこの方法により可視化できる。連続的な領域は、例えば、適切なソフトウェアを使用したこの種の可視化により明らかにされ得る。このような方法は、当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体が、表面上の前記連続的な領域として使用され、新規な結合特性の発生のために修飾され得る。一実施形態において、この目的のための修飾は、αへリックス領域を含んでもよい。ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質において、結合決定領域は、１つの結合決定領域の２倍の長さを有する１つの連続的な領域を共同で形成する、２つの前記表面露出領域を含む。
【００８７】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位の少なくとも一方を含む、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の修飾が、重要である。前記「βシート構造」は、本質的にシート状で、ほぼ完全に伸長されている（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）ことにより定義される。一方、ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるαへリックスに対して、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造において離れて位置する領域同士が、近傍同士となることができる。β鎖は、概して、５〜１０個のアミノ酸長を有し（通常は、ユビキチンにおける５〜６残基）、ほぼ完全なストレッチ構造を有する。前記β鎖は、互いに近接し、一方の鎖のＣＯ基と他方の鎖のＮＨ基との間で水素結合が形成される。逆もまた同様である。βシートは、複数の鎖から形成され得、シート状構造を有し、Ｃα原子の部位が、シート状平面の上方または下方の間で交互に入れ替わる。アミノ酸側鎖は、このパターンに追随し、そして、上端もしくは下端に向く。前記β鎖の方向により、前記シートは、平行シートおよび逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも、変異可能であり、請求されたタンパク質の調製に使用可能である。
【００８８】
前記βシート構造の突然変異のために、表面に近いβ鎖領域または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位が、ユビキチンにおいて選択される。表面露出アミノ酸は、利用可能なＸ線結晶構造により同定できる。利用できる結晶構造がない場合、利用可能な一次構造に関して、表面露出βシート領域および個々のアミノ酸部位の接触性を予測するか、もしくは３次元タンパク質構造のモデリングを行い、これにより、潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を入手するという、コンピュータ解析手法による試みをなし得る。さらなる開示は、例えば、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７ Ａｐｒ ５； １９４（３）：５３１−４４． Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｂｕｇｇ Ｃ．Ｅ．， Ｃｏｏｋ Ｗ．Ｊから得ることができる。
【００８９】
前記βシートまたは前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位における修飾を行えるが、突然変異を生成させるアミノ酸部位の前選択は時間がかかるため、除外し得る。前記βシート構造または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境（ＤＮＡ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から単離し、ランダム突然変異に供し、その後、それらを予め除去したタンパク質をコードするＤＮＡに再度組み込む。続いて、所望の結合特性を有する変異体の選択工程を行う。
【００９０】
本発明の他の実施形態において、表面に近い、前記β鎖領域または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位は、前述のように選択され、これらの選択された領域内部の突然変異誘発された前記アミノ酸部位は、同定される。ついで、このようにして選択されたアミノ酸部位は、部位特異的突然変異によりＤＮＡレベルで、突然変異され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め選択された他の特定のアミノ酸をコードするコドンにより置換されるか、あるいは、この置換を、置換されるアミノ酸部位は規定されるが、新規な未定のアミノ酸をコードするコドンは規定されないランダム突然変異として行う。
【００９１】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性が、モデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性と比較して８％以上である場合、前記アミノ酸は、「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸部位は、それぞれ、本発明により選択される、潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位でもある。また、参考文献として、Ｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ７０９ − ７１３， ａｎｄ Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ， １９７３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７９（２）：３５１−３７１があげられ、開示の全てを、引用により本願に取り込む。
【００９２】
元のタンパク質および互いのタンパク質から新たに発生させた人工結合部位の領域における、アミノ酸置換によるユビキチンの変異体を、対象とされた各配列セグメントのターゲット突然変異により、発生できる。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性／親水性等の所定の特性を有するアミノ酸を、それぞれ、各特性を有するアミノ酸で交換または置換できる。置換の他に、「突然変異」、「修飾」および「交換」は、挿入および欠失も含む。タンパク質レベルにおいて、前記修飾を、当業者に公知の方法によるアミノ酸側鎖の化学的改変により行ってもよい。
【００９３】
ユビキチンの突然変異方法
各配列セグメントの突然変異の開始点として、例えば、当業者に公知の方法により、調製され、改変され、増幅されたユビキチンのｃＤＮＡを使用できる。一次配列の比較的狭い領域（例えば、１〜３個のアミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬および方法が利用可能である（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；「Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、Ｂｉｏｒａｄ）。大きい領域の部位特異的な突然変異には、具体的な態様として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当業者に利用可能である。この目的のために、所望の部位が変性された塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合は、例えば、変異の誘導に使用できる。これは、イノシン等のゲノムＤＮＡに自然には発生しない塩基対類似体の使用によってもなされ得る。
【００９４】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位の１つ以上の突然変異の開始点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡでもよい。また、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は、合成的に調製されてもよい。
【００９５】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国特許第５，７８９，１６６号明細書、米国特許第４，８７３，１９２号明細書参照）があげられる。
【００９６】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略について、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０に考察されている。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【００９７】
突然変異に利用可能な公知の他の手法は、部位特異的突然変異の方法、ランダム突然変異の方法、ＰＣＲを使用する突然変異または類似の方法である。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異が生成される前記アミノ酸部位は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関して、請求項１の限定を満たすように行われる。いずれの場合にも、異なる変異のライブラリーは、通常、公知の方法によりスクリーニングされて確立される。修飾されたユビキチンタンパク質について、十分な構造情報が利用可能な場合には、通常、修飾されるアミノ酸の前選択が、特に簡易に行われ得る。
【００９９】
例えば、ＰＣＲ、化学的突然変異、または細菌の突然変異誘発株の使用による標的変異ならびに長い配列セグメントの突然変異のための方法もまた、従来技術に属しており、本発明においても使用可能である。
【０１００】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（米国特許第５，７８９，１６６号明細書、米国特許第４，８７３，１９２号明細書参照）があげられる。
【０１０１】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略について、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０に考察されている。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【０１０２】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換を、非常に簡易にＰＣＲの手段により行うことができる。前述の部位が、前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに位置しているためである。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端である。そこで、突然変異ＰＣＲ反応に使用される前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される２、４、６および／または８位のコドンから離れており、ユビキチンの配列におけるアミノ末端のコード鎖に対応する。したがって、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位から離れており、少なくとも部分的に、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖に対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を使用して行うことができる。
【０１０３】
また、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、他のポリメラーゼ連鎖反応に添加できる。本発明によれば、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための次の選択工程での使用に適したベクター系中に、得られた前記遺伝子カセットを導入するのが好ましい。
【０１０４】
本発明によれば、選択されたリガンドに特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、選択されたリガンドに対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はなく、よって任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できる。
【０１０５】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム変異導入法による遺伝学的レベルでの突然変異、すわなち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【０１０６】
本発明によれば、修飾ユビキチンタンパク質は、より好ましくは、化学的合成により調製することができる。好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。任意に、挿入または欠失されるアミノ酸数は、１〜１０、１〜５、２、３、または４個である。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【０１０７】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べる修飾されたアミノ酸配列のユビキチンが、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−１０Ｍ以下）で、そのターゲットと結合することを見出した。
【０１０８】
ユビキチンの修飾領域
修飾領域は、基本的に、選択された結合パートナーに接触可能かどうか、および、タンパク質の全体構造が、推測上修飾に耐性を示すかどうかで、選択され得る。
【０１０９】
表面露出β鎖における修飾の他に、前記タンパク質の他の表面露出領域も修飾でき、前記β鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位において行われるのが好ましい。これらの修飾領域は、新規に発生させる、ターゲットに対する高い結合親和性に関与する。
【０１１０】
本発明の別の好ましい実施形態においては、ユビキチン、好ましくは哺乳類またはヒトのユビキチンにおける、少なくとも３、４または６個、任意に、少なくとも８、１０、１２個、最大で１５個の表面露出アミノ酸を、前記単量体ユビキチンにおいて修飾できる。前記修飾は、置換が好ましい。これは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の、ユビキチンの表面露出アミノ酸の修飾を含む。これらの３個以上１５個以下の表面露出修飾アミノ酸が、所定の結合パートナーへの結合親和性を有する領域を形成する。この領域を、本明細書中では「結合ドメイン領域（ＢＤＲ）」と定義する。この点において、少なくとも２個、任意に、少なくとも４個、さらに任意に、少なくとも６、８、１０、１２個、最大１５個の前記表面露出アミノ酸が、βシート領域、すなわちβシート鎖に存在すること、もしくは、複数のβ鎖に分布して存在すること、またはβシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位に存在することが特に好ましい。また、全て修飾、好ましくは、全て置換されている少なくとも３個のアミノ酸が、一次配列において、互いに直接隣接していることがさらに好ましい。
【０１１１】
本発明の他の任意の実施形態において、前記タンパク質における４つのβ鎖の１つもしくは２つにおけるアミノ酸、好ましくは２つにおけるアミノ酸、または、好ましくは前記４つのβ鎖の２つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、修飾され、新規の結合特性が発生する。前記４つのβ鎖の３つもしくは４つにおける修飾、または前記β鎖の３つもしくは４つに隣接する３つ目までのアミノ酸部位の修飾も、選択されたターゲットまたはリガンドへの結合発生のために、任意で行ってもよい。
【０１１２】
アミノ末端およびカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、または、アミノ末端およびカルボキシ末端鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸部位が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、前記リガンドまたはターゲットへの新規の結合部位を発生させる。この点において、前記カルボキシ末端βシート鎖に隣接する４つ目までのアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、および、前記アミノ末端β鎖に隣接する１つ目のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される。
【０１１３】
本発明によれば、ユビキチンは、そのアミノ酸が修飾され、好ましくは、前記修飾は、哺乳類のユビキチン、好ましくはヒトのユビキチンにおける下記の部位、すなわち、２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位のアミノ酸の少なくとも３個の置換であるのが好ましい。前記アミノ酸グループの少なくとも３個のアミノ酸は、特定の結合パートナー、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＮＧＦ、ＩｇＧ、ＭＩＡ−２、またはその他のターゲットに対して、従来は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の発生に特に適していることが見出された、ユビキチンの表面に連続的な表面露出領域を形成する。これらのアミノ酸残基の少なくとも３個は、修飾されなければならない。任意に、前記アミノ酸残基の３、４、５、６、７、８、９、または１０個が修飾、好ましくは置換され、任意に付加的なアミノ酸残基を組み合わせることもできる。
【０１１４】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度を決定する目的で、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７，１９９１）（本願出願人および多重配列比較分析に関する本願出願人の研究所から、無料で入手可能）を採用でき、または、Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記誘導体の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【０１１５】
前記結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、例えば、下記の方法から選択できる：ＥＬＩＳＡ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光偏光測定、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、本発明のヘテロ多量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。例えば、米国特許第７,８３８,６２９号明細書を参照でき、当該文献の全内容が、引用により本明細書に組み込まれている。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質は、例えば、治療または診断に関連する放射線核種用の、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンドを含んでもよい。低分子の有機化合物または非アミノ酸化合物、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等を含んでもよい。本発明の好ましい一実施形態において、前記ユビキチンベースの結合分子は、ペプチド性の、アミノ酸ベースのリンカーもしくはリガンド、または治療または診断特性を有するタンパク質に結合される。
【０１１８】
結合特性（解離定数）
前記本発明の融合タンパク質の結合特異性は、Ｋｄで与えられる非融合タンパク質で前述のように定義したのと同様である。本発明によれば、特異的結合親和性を定義する「Ｋｄ」は、１０−７〜１０−１２Ｍの範囲である。１０−５Ｍ以下の値であれば、定量化可能な結合親和性であると考えられる。適用に応じて、Ｋｄの値は、例えば、クロマトグラフィーへの適用の場合には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍが好ましく、または、診断もしくは治療への適用の場合には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍが好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍであり、好ましくは、１０−１１Ｍである。
【０１１９】
ユビキチンの多量体化
本発明によれば、遺伝学的にヘッドトゥテイルで結合された少なくとも２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、ターゲット分子、例えば、ＥＤ−Ｂ、ＴＮＦα、ＩｇＧ、ＭＩＡ２、ＮＧＦ、またはその他の標的分子の同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用することでのみ効果を示す。換言すれば、前記修飾ユビキチン単量体は、前記２分子の両結合領域が共に作用することによって形成される一つの連続的な結合領域を介して、同じエピトープに結合する。
【０１２０】
前記単量体は、直接またはリンカーを介して結合させることができる。好適な好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカー、少なくともＧＩＧ配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するリンカー、または任意のその他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧである。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。
【０１２１】
ライブラリー
さらなる態様において、本発明は、本発明のへテロ多量体ユビキチンタンパク質、好ましくは、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を形成する、前述の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様において、前述の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーが提供され、各ライブラリーは、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合される。前記ライブラリーは、所定のターゲットに対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする。前記相互結合は、当業者に公知のリンカーのいずれか１つ、または本明細書に記載のリンカーを使用することにより行われる。「異なる修飾がなされた」は、前記ヘテロ二量体タンパク質内に非修飾分子が１つ存在する場合も含む。
【０１２３】
複合ライブラリーの製造は、実施例１で概要を述べる。ただし、ライブラリーの品質に注意を払わなければならない。足場技術におけるライブラリーの品質は、そもそも、複雑性（個々の変異体の数）および機能性（得られた候補の構造的およびタンパク質の化学的完全性）に左右される。両方の特性が互いにネガティブな影響を与える場合もあり、前記足場における修飾部位の数の増加によるライブラリーの複雑性の増大が、変異体のタンパク質の化学的完全性の低下をまねくおそれもある。これにより、溶解度、凝集性が低下し、および／または収量が低下する場合もある。この理由は、エネルギー的に良好なタンパク質パッケージを有する本来の足場から大きく逸脱するためである。
【０１２４】
このため、適切な足場ライブラリーの構築とは、ターゲットへの結合性を最適化するために、本来の配列に可能な限り多くの変異を導入すること、および、ネガティブなタンパク質化学的効果を避けるために、可能なかぎり本来の一次配列を保存すること、という両極端な姿勢のバランスをとる作業となる。
【０１２５】
ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質における特定の修飾
Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍでリガンドに結合し、前記リガンドに対して一価の結合活性を示す、前記本発明のユビキチンのヘテロ二量体は、下記の２つの選択肢から選択される。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換、および、
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
【０１２６】
実施形態において、前記融合タンパク質は、第１ユビキチン単量体の６、８、６３〜６６位のアミノ酸の置換、ならびに、第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、および、任意に２位のアミノ酸の置換を有する、前記ユビキチン単量体が、遺伝学的に融合された二量体であり、好ましくは、
前記第１ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換、
８位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファンまたはフェニルアラニン（Ｗ、Ｆ）への置換、
６３位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換、
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への置換；
前記第２ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）への置換
６２位におけるグルタミン（Ｑ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換
６３位におけるリジン（Ｋ）のセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換
任意に、２位におけるグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｋ）への置換が好ましい。
【０１２７】
得られた修飾ユビキチンへテロ二量体が、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍで前記リガンドに対する特異的結合親和性を示し、前記リガンドに対して一価の結合活性を示し、かつ、ユビキチンタンパク質の構造的安定性が破壊されず、妨害されない限り、各単量体におけるこれらの置換の選択肢は、何ら制限されることなく、互いに組み合わせることができる。
【０１２８】
最も好ましい置換は、下記のとおりである。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、およびＴ６６Ｐの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、およびＴ６６Ｅの置換；任意にさらにＱ２Ｒの置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｌ、およびＴ６６Ｓの置換；および
前記第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、および６６位における修飾、さらに任意に、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｘ、Ｌ８Ｘ、Ｑ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｅ６４Ｘ、Ｓ６５Ｘ、およびＴ６６Ｘの置換；任意にさらにＱ２Ｘの置換、Ｘは、任意のアミノ酸。
【０１２９】
ＥＤ−Ｂへの結合タンパク質を発生させる前記第１ユビキチン単量体において、特に好ましい置換は、下記のとおりである。
２位：Ｑ→Ｔ、４位：Ｆ→Ｗ、６位：Ｋ→Ｈ、６２位：Ｑ→Ｎ、６３位：Ｋ→Ｆ、６４位：Ｅ→Ｋ、６５位：Ｓ→Ｌ、６６位：Ｔ→Ｓ
【０１３０】
２つの単量体のヘッドトゥテイルでの結合には、リンカーを使用しなくてもよいし、どのようなリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたは、ＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列もしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列のリンカーである。
【０１３１】
好ましい実施形態において、前記リガンドＥＤ−Ｂに結合するよう共に作用する２つの結合決定領域を有するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含む。薬学的活性成分としてＴＮＦαを含む、前記本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有する。別の実施形態において、前記リガンドＥＤ−Ｂに結合するよう共に作用する２つの結合決定領域を有するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号ＸＸに相当する、図１１に示すアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
さらに好ましいタンパク質は、ＸＸＸＸが任意のアミノ酸であってもよい下記配列（配列番号４７）により提供される。
【化１】
【０１３３】
これらの配列を有するタンパク質の例を、図１１に示す。リンカーとして、ここではＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧを使用した。ただし、その他の種類のリンカーまたはリンカーなしもまた、可能な代替例である。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチド、宿主細胞、ベクター
本発明のさらなる態様において、本発明は、前述のタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも包含する。また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明に包含される。
【０１３５】
本発明のさらなる態様において、前述のタンパク質もしくは融合タンパク質、および／または、前記本発明の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞は、包含される。
【０１３６】
前記修飾ヘテロ多量体ユビキチン分子の使用
高い親和性でリガンドに結合可能な本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する診断薬、および治療薬の調製に使用される。本発明のタンパク質は、例えば、直接的なエフェクター分子（修飾物質、拮抗物質、作用物質）または抗原認識ドメインとして使用できる。
【０１３７】
ヒトおよび獣医学の医薬療法および予防法の分野において、少なくとも一つの本発明のヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含む、薬学的に有効な医薬品を、それ自体公知な方法により調製できる。生薬製剤に応じて、これらの組成物を、注射、点滴、全身投与、直腸投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与または他の従来から使用されている投与方法により、非経口的に投与できる。医薬品の種類は、治療対象の疾患の種類、疾患の重症度、治療対象の患者、および医学分野の当業者に公知の他の要因によって決まる。
【０１３８】
選択する融合パートナーに応じて、本発明の医薬組成物は、ターゲットが大量に出現する疾患の治療に適用される。
【０１３９】
前記組成物は、治療上の有効量を含むように適応される。投与量は、治療対象の組織、疾患の種類、患者の年齢および体重、ならびにさらに公知の要因によって決まる。
【０１４０】
前記組成物は、薬学的または診断的に許容されるキャリアを含み、任意に、さらに、従来公知の助剤および添加剤を含み得る。これらは、特に制限されず、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝剤、着色剤等を含む。
【０１４１】
前記医薬組成物は、局所塗布用の液状製剤、クリーム、ローションの剤形；エアロゾル；粉末、細粒、錠剤、座剤、カプセル剤の剤形；エマルジョン、リポソーム製剤の剤形とし得る。前記組成物は、無菌、非発熱原性、等張性で、薬学的に従来公知で許容される添加剤を含むことが好ましい。また、Ｕ．Ｓ． ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規則を参照できる。
【０１４２】
本発明の「医薬組成物」は、組成物の形態で提供されてもよい。種々の活性成分および希釈剤および／または担体は、互いに混合され、混合製剤の形態でもよい。前記活性成分は、部分的にまたは全体的に別々の形態で存在する。このような混合または混合製剤の一例は、複数の部品からなるキットである。
【０１４３】
本発明の「組成物」は、少なくとも２つの薬学的に活性な化合物を含む。これらの化合物は、同時に投与してもよいし、１分〜数日の時間間隔で個々に投与してもよい。これらの化合物は、同じ経路で投与してもよいし、異なる経路、例えば、一方の活性化合物を経口投与し、他方の活性化合物を非経口投与することも可能である。また、前記活性化合物は、一つの医薬品、例えば、一つの点滴液に処方されてもよいし、個々に処方された両化合物を含むキットとして処方されてもよい。また、両方の化合物は、２以上の包装でも提供可能である。
【０１４４】
さらなる実施形態において、前記医薬組成物は、複数の部品からなるキットの形態でもよく、前記本発明の組換えユビキチンタンパク質／融合タンパク質、および１以上の化学療法剤が個々に提供される。
【０１４５】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、例えば、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、任意の従来公知の種々の技術により、または、市販の自動合成装置により調製できる。一方、従来の遺伝子組換え技術単独で、または、従来の合成技術との組み合わせにより、調製することもできる。
【０１４６】
任意に、前記修飾は、ＤＮＡレベルでの遺伝子工学、および、原核生物、真核生物またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける修飾タンパク質の発現により行われてもよい。
【０１４７】
さらなる実施形態において、前記修飾工程は、化学的合成工程を含む。
【０１４８】
本発明の一態様において、異なる修飾がなされたタンパク質群は、互いに異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質をコードする、２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することにより得られる。
【０１４９】
図面の簡単な説明
図１は、ヘテロ二量体を発生させる、ＢＤＲ１と称する結合決定領域を有する前方（第１）修飾ユビキチン単量体と、ＢＤＲ２と称する結合決定領域を有する異なる修飾がなされた後方（第２）ユビキチン単量体との遺伝子組み換えが、ＥＤ−Ｂに対する親和性の有意な向上、ならびに結合の特異性の向上をもたらすことを示す。細胞および組織切片に結合する前記修飾ユビキチン分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、蛍光偏光測定により分析した。ヒトＥＤ−Ｂへの複数のヘテロ二量体ユビキチン変異体の結合の濃度依存性ＥＬＩＳＡ（ｃｏｎｃ．−ＥＬＩＳＡ）を示す。
【０１５０】
図１Ａは、単量体４１Ｂ１０（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４１Ｂ１０ｔｈ）についての、Ｋｄ＝９．４μＭ＝９.４５×１０−６Ｍの結合親和性を示す。黒丸は、第１単量体４１Ｂ１０の、フィブロネクチンのエクストラドメインＢであるフラグメント６７Ｂ８９への結合を示す。コントロールであるフラグメント６７８９は、ＥＤ−Ｂを含まず、白丸で示される。
【０１５１】
図１Ｂは、ヘテロ二量体ユビキチンの結合親和性を示す。前記ヘテロ二量体は、４１Ｂ１０の第１単量体と異なる第２単量体とが結合され、変異体４６Ｈ９となっている（ここでは、ＳＰＷＦ２８−４６Ｈ９ｔｈ）。４６Ｈ９の結合親和性は、両単量体のターゲットＥＤ−Ｂへの一価の結合により、図１Ａに示す単量体と比べて大幅に向上している（Ｋｄ＝１３１ｎＭ＝１．３×１０−７Ｍ；ここでは６７Ｂ８９とする、黒丸）。コントロールであるフラグメント６７８９は、ＥＤ−Ｂを含まず、白丸で示される。
【０１５２】
図２は、サイトカインに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【０１５３】
図２Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の高親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ＝５×１０−８Ｍ）。黒丸は、２４Ｈ１２のＥＤＢとの結合を示す。ネガティブコントロールとして、２４Ｈ１２のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との結合を用いた（白丸）。
【０１５４】
図２Ｂは、サイトカインＴＮＦαに融合することによって多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体２４Ｈ１２の親和性の向上を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ＝５．６×１０−９Ｍ）。
【０１５５】
図２Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。細胞基質のフィブロネクチン（ｃ−ＦＮ）をコントロールとして使用した場合と比較して、ターゲットＥＤ−Ｂに対して、Ｋｄ ＥＬＩＺＡ値が向上され、前記ターゲットへの特異的結合が確認された。
【０１５６】
図２Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の説明：０〜１５μＭ ９Ｅ１２）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析した。会合解離曲線の分析からは、Ｋｄを、決定できなかった。
【０１５７】
図２Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記ヘテロ二量体修飾ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ４１Ｂ１０）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析し、前記ヘテロ二量体変異体４１Ｂ１０とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、６２３ｎＭ（６．２×１０−７Ｍ）であった。
【０１５８】
図３は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。前記異なる変異体は、小文字でマークされる共通の配列モジュールを共有する。前記変異体について、ＥＤ−Ｂ結合を分析した。図３は、修飾ユビキチンへテロ二量体が得られる、単量体の種々の組み合わせを示す。ヘテロ二量体変異体４６−Ａ５、５０−Ｇ１１および４６−Ｈ４は、すべて同一の、ＢＤＲ１を有する第１（前方）修飾単量体（同図において、「ａ」で示す）を有するが、第２（後方）ユビキチン単量体は、ＢＤＲ２における異なる部位が修飾されている。変異体５２−Ｄ１０および５２−Ｂ３は、ＢＤＲ１を有する４６−Ｈ９と比較して、異なる第１（前方）修飾単量体を有し、ＢＤＲ２を有する同一の第２（後方）ユビキチン単量体（同図において、「ｅ」で示す）を有している。
【０１５９】
前記修飾ユビキチンヘテロ二量体は、下記配列を有する。
４６−Ｈ４：配列番号２５、４５−Ｈ９：配列番号２６、４６−Ａ５：配列番号２７、５０−Ｇ１１：配列番号２８、５２−Ｂ３：配列番号２９、５２−Ｄ１０：配列番号３０
【０１６０】
実験過程において、配列ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）を有するＨｉｓタグの添加により、前述の配列を修飾した。
【０１６１】
図３に示すように、４６−Ｈ４は、ＥＤ−Ｂへの優れた結合親和性を有する（Ｋｄ＝１８９ｎＭ）。４６−Ａ５および５２−Ｄ１０は、結合活性を有さない。また、他の修飾ユビキチンタンパク質は、ＥＤ−Ｂへの結合活性が４６−Ｈ４と比較して低い。したがって、ヘテロ二量体変異体における両単量体が、ターゲットへの高い結合親和性のために必要とされ、両単量体がターゲットに対する一価の結合を示すと結論付けることができる。
【０１６２】
高いＥＤ−Ｂ結合活性を有する前記修飾ユビキチンヘテロ二量体４６−Ｈ９は、前記２つの単量体の両結合ドメイン領域における下記のアミノ酸置換により、野生型ユビキチン単量体と比較して同定される。
前記第１モジュール（ＢＤＲ１）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール（ＢＤＲ２）：（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５０Ｇ１１
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｃ）Ｋ６Ｍ、Ｌ８Ｒ、Ｑ６２Ｍ、Ｋ６３Ｎ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｌ
４６Ｈ４
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｄ）Ｋ６Ｇ、Ｌ８Ｗ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ｑ、Ｅ６４Ｑ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｒ
５２Ｂ３
前記第１モジュール：（ｇ）Ｑ２Ｒ、Ｆ４Ｐ、Ｋ６Ｙ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｒ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）：Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５２Ｄ１０（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール：Ｑ２Ｖ、Ｆ４Ｃ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｇ、Ｔ６６Ｄ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）：（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
４６Ａ５（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール（４６Ｈ９）：（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール：（ｂ）Ｋ６Ｌ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｌ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ
【０１６３】
図４は、配列アライメントを示す。１行目：野生型ユビキチンタンパク質の２つの単量体（１行目）は、７７位から８８位までの１２個のアミノ酸のリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧにより結合される。ＢＤＲ２を有する第２単量体は、８９位のメチオニンから始まる。この二量体野生型ユビキチンタンパク質は、第１単量体および第２単量体において異なる修飾がなされ、その結果２つのＢＤＲを有する、前記修飾へテロ二量体変異体４６−Ｈ９（２行目）と整列されている。ターゲットへの一価の結合のために、両ＢＤＲは、ターゲットとの結合において、共に作用する。
【０１６４】
図５は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始する）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されている。３行目は、二量体の野生型ユビキチンであり、リンカーアライメントを示さない（このため、７７位のメチオニンから第２単量体が開始する）、「Ｕｂｉ−Ｄｉｍｅｒ ｗｔ」を示す。４行目は、ヒトの野生型ユビキチンである「Ｕｂｉ−Ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ」を示す。
【０１６５】
図６は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ＝６．９×１０−９Ｍ）。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９−ｔ０という）への結合親和性を示すことを、黒丸で示し、この変異体が、ネガティブコントロール（６７８９−ｔ０という）には結合しないこと（白丸）と比較する。
【０１６６】
図７は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。１０４１−Ｄ１１は、可溶性６７Ｂ８９のＩＣ５０：１４０ｎＭで、固定化された６７Ｂ８９から解離し、１０４１−Ｄ１１の結合が、ｃｏｎｃ−ＥＬＩＳＡ設定で用いられた疎水性表面への固定化に起因するＥＤ−Ｂ構造の劣化によるものではないことを示している。
【０１６７】
図８は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。種々の濃度（図中の説明：０〜２００ｎＭ １０４１−Ｄ１１）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化された、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９という）への結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）であり、ｋｏｆｆ率は、７．７×１０−４ｓ−１であり、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体の半減期が長いことを示す。
【０１６８】
図９は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。マウス血清もしくはラット血清またはコントロールとしてのＰＢＳＴ中での、３７℃で１時間での前記変異体のプレインキュベーション等の、種々の条件を示す。Ｋｄ値は、すべて１０〜２０ｎＭである。したがって、ＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体１０４１−Ｄ１１の結合は、血清による顕著な影響を受けないと結論付けることができる。
【０１６９】
図１０は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【０１７０】
図１０Ａは、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体形成を示す。３回のＨＰＬＣのランを重ねている。ＳＥ−ＨＰＬＣ後の、保持時間２１．６５１分の青色のピークは、純粋な１０４１−Ｄ１１に由来し、保持時間２６．２８９分の黒色のピークは、フィブロネクチンフラグメント６７Ｂ８９を表し、保持時間２１．４０７分の赤色のピークは、１０４１−Ｄ１１と６７Ｂ８９との混合物の結果を示す。１０４１−Ｄ１１のピークの保持時間が短くなる側へのシフト、および、６７Ｂ８９のピークの消失は、１０４１−Ｄ１１と可溶性ＥＤ−Ｂとの複合体の形成を示す。
【０１７１】
図１０Ｂは、１０４１−Ｄ１１（青色、２１．９４４分）、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９（黒色、２６．２８９分）、および１０４１−Ｄ１１と６７８９との混合物（２１．９２９分および２６．２８９分にピークを有する赤色線）に関する３回のＳＥ−ＨＰＬＣのランを重ねて示す。前記１０４１−Ｄ１１のピークのシフトは、ほとんど観察されなかった。６７８９のピークが消失しなかったこととあわせて、この事実は、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９に、有意に結合しないことを示す。
【０１７２】
図１１は、ＥＤ−Ｂ結合変異体のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、１６種類の代表的なヘテロ二量体の配列を示す。前記コンセンサスアミノ酸部位は、前記第１単量体の結合決定領域である、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位である。一方、コンセンサスアミノ酸置換は、Ｑ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓである。
【０１７３】
図１２は、６種類のユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質の配列アライメントを示す。前記第２ユビキチン単量体は、８９位（１１１１−Ｂ４、１１１１−Ｃ９）または８０位（１１１１−Ｅ１０、１１１１−Ｆ６、１１１１−Ｈ１２、１１１１−Ｈ２）のメチオニンから開始される。
【０１７４】
図１３は、結合決定領域ＢＤＲ１およびＢＤＲ２、ならびに、図１２に示すユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のリンカーのアライメントを示す。さらに、ユビキチン配列における追加のアミノ酸交換を示す。
【０１７５】
図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）への、図１２に示す結合変異体１１１１−Ｅ１０についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。Ｋｄ＝２．６μＭ（黒丸）であり、コントロールはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とした（白丸）。
【０１７６】
図１５Ａ：第１および第２単量体ユビキチンユニットの連続する分子におけるアミノ酸残基を修飾し、配列アライメントを行って、最も強力な結合部位を評価した。パートＡは、第１単量体修飾ユビキチンユニットの配列情報を、パートＢは、第２単量体修飾ユビキチンユニットの配列情報を示す。
【０１７７】
図１５Ｂ：第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６、６８位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１７８】
図１５Ｃ：ヘテロ二量体ユビキチン変異体ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２の、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２は、非常に高い親和性でＴＮＦαに結合する（Ｋｄ＝１２ｎＭ＝１．２×１０−８Ｍ）。図１５Ｃは、ヒトＴＮＦαに対する高親和性結合を示し（黒丸）、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１７９】
図１５Ｄ：ＴＮＦαに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８０】
図１５Ｅ：前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈの、ヒトＴＮＦαへの結合についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４＿Ｔｈは、非常に高い親和性でＴＮＦαに結合する（Ｋｄ＝１．７ｎＭ＝１．７×１０−９Ｍ）。図１５Ｅは、ヒトＴＮＦαに対する結合を示し（黒丸）、コントロールはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とした（白丸）。
【０１８１】
図１６は、修飾ユビキチンベースのヘテロ二量体のＮＧＦへの結合を示す。
【０１８２】
図１６Ａ：ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位、および５１位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８３】
図１６Ｂ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ０.９μΜ=９×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかる。図１６Ｂは、組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ；黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１８４】
図１６Ｃ：ＮＧＦに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈの配列を示す。第１ユビキチン単量体の２、４、６、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２、６４〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８５】
図１６Ｄ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ１８０ｎＭ＝１．８×１０−７Ｍの高親和性でＮＧＦへ結合することがわかる。図１６Ｄは、組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ；黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡとした（白丸）。
【０１８６】
図１７：ヘテロ二量体ＩｇＧ結合タンパク質を示す。
【０１８７】
図１７Ａ：ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓの配列を示す。第１ユビキチン単量体の６、６２、６３、６５、６６位と、第２単量体の６、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１８８】
図１７Ｂ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ３．８μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。図１７Ｂは、ＩｇＧ（黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡ−１、ＢＳＡ−２、およびＥｎｂｒｅｌ（赤丸、緑丸、および青丸、適合線なし）とした。Ｅｎｂｒｅｌは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。Ｅｎｂｒｅｌへの弱い結合は、ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓのＩｇＧのＦａｂ部分への結合を示唆している。
【０１８９】
図１７Ｃ：ＩｇＧに対して特異性を有する、ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓの配列を示す。第１ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位と、第２単量体の６、８、６２〜６６位が修飾されている。前記２つのユビキチン単量体間のリンカーは「ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ」である。
【０１９０】
図１７Ｄ：濃度依存性ＥＬＩＳＡにより、Ｋｄ４．１μＭの親和性でＩｇＧへ結合することがわかる。図１７Ｄは、ＩｇＧ（黒丸）に対する結合を示し、コントロールはＢＳＡ（白丸）およびエタネルセプト（商品名：エンブレル）（赤丸、適合線なし）とした。エンブレルは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。エンブレルへの弱い結合は、ＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓのＩｇＧのＦａｂ部分への結合を示唆している。
【実施例】
【０１９１】
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものである。本発明は、特に、ユビキチンの修飾を例にあげて実証されている。ただし、本発明は、これに限定されず、下記実施例は、単に、前述の記載に基づいた本発明の実施可能性を示しているにすぎない。本発明の完全な開示のため、本願および付属書類に引用されている文献についても言及しているが、これらの引用文献は全て、引用により、その開示全体が本願に取り込まれている。
【０１９２】
［実施例１］
修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の同定
【０１９３】
ライブラリーの構築とクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。
【０１９４】
合計１５の選択されたアミノ酸部位における協調した変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、第１ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸、および第２ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。両ユビキチン単量体は、少なくともＧＩＧ配列、または少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するグリシン／セリンリンカーによって遺伝的に結合（ヘッドトゥテイル配置）しており、リンカー配列の例としては、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号３２）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられるが、その他のリンカーでもよい。
【０１９５】
ＴＡＴファージディスプレイ選択
ヘテロ二量体ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを使用し、ターゲットに対して濃縮した。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットは、タンパク質結合表面上に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して、非特異的に固定化され得る。ビオチンを介するストレプトアビジンビーズまたはニュートラアビジンストリップ上への固定化が好ましい。ターゲット結合ファージは、溶液中または固定化ターゲット上のいずれかにおいて選択される。例えば、ビオチン化され固定化されたターゲットとファージとを、インキュベートし、続いて、マトリックスに結合したファージの洗浄およびマトリックス結合ファージの溶出を行う。ターゲットのインキュベーションに続く各サイクルにおいて、前記ビーズを磁力により溶液から分離し、数回洗浄した。１〜３回目の選択サイクルにおいて、ターゲットを担持した磁気ビーズに固定化された三元複合体を洗浄した。４回目の選択サイクルにおいて、洗浄を数回行った。最初の選択サイクルにおいて、ビオチン化ターゲットを、ニュートラアビジンストリップに固定化し、一方、２回目から４回目のサイクルにおいて、溶液における選択を行い、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に、ターゲットとファージとの複合体を固定化した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のファージを、酸性溶液での溶出により遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のファージ溶出を行った。溶出したファージを再増幅した。バインダーの特異性を誘導するため、選択に際し、ターゲットに類似するタンパク質を含めてもよい。
【０１９６】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてリボソームディスプレイを使用して、ターゲットに対して濃縮した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットを、標準的な方法によってビオチン化し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。リボソーム、ｍＲＮＡおよび新生ユビキチンポリペプチドを含む三元複合体を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて構築した。選択の一次ラウンドを２回行い、三元複合体をインキュベートし、続いて、類似する選択のラウンドを２回行った。ターゲットインキュベーションに続く各サイクルにおいて、ビーズを磁力により溶液から分離し、ストリンジェンシーを増加させながら、リボソームディスプレイバッファーで洗浄した。１〜３回目の選択サイクルにおいて、ターゲットを担持した磁気ビーズに固定化された三元複合体を洗浄した。４回目の選択サイクルにおいて、洗浄を数回行った。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のｍＲＮＡの溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００４）。各サイクルの後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、アメリカ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）を用いて、ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成を行った。
【０１９７】
濃縮プールのクローニング
４回目の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡを、当該技術分野において公知の方法であるＰＣＲで増幅し、適切な制限ヌクレアーゼで切断し、適合性付着端を介して発現ベクターｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）に連結した。
【０１９８】
単一コロニーのヒット解析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）への形質転換の後、アンピシリン耐性単一コロニーを培養した。自己誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ、２００５）を用いた、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ社製、イギリス）での培養により、ターゲットに結合する修飾ユビキチンを発現させた。細胞を回収し、その後、溶解した。遠心分離した後、得られた上清を、ターゲット、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とのユビキチン特異的ＦａｂフラグメントコンジュゲートでコートしたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社製、ドイツ）を用いた。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍと６２０ｎｍを測定した。
【０１９９】
数サイクルの選択ディスプレイを、ターゲットに対して行った。最後の２サイクルの選択において、結合分子を、過剰量の遊離ターゲットを用いて溶出した。
【０２００】
例えば、４６Ｈ９（配列番号６）、９Ｅ１２（配列番号７）、２２Ｄ１（配列番号８）、１０４１−Ｄ１１（図５）（配列番号３３）、１０４５−Ｄ１０（配列番号３４）等の、前記ターゲットＥＤ−Ｂに対するヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質を同定した。また、例えば、その他のターゲットに対するヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質、例えば、ターゲットＭＩＡ−２結合タンパク質１１１１−Ｅ１０（図１２）（配列番号５３）、ターゲットＴＮＦα結合タンパク質ＳＰＷＦ−１５＿６−Ａ１２（図１５Ｂ）（配列番号５７）およびＳＰＷＦ−１５＿１６−Ｄ４（図１５Ｄ）（配列番号９０）、ターゲットＮＧＦ結合タンパク質ＳＰＷＦ９−１Ｂ７−ｔｈ（図１６Ａ）（配列番号９１）およびＳＰＷＦ９−６Ａ２−ｔｈ（図１６Ｃ）（配列番号９２）、ならびにターゲットＩｇＧ結合タンパク質ＳＰＶＦ４−１６Ｂ２−ｔｓ（図１７Ａ）（配列番号９３）およびＳＰＶＦ４−９Ｃ６−ｔｓ（図１７Ｃ）（配列番号９４）を同定した。
【０２０１】
野生型ユビキチン単量体（Ｕｂｉ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ）と、野生型ユビキチン二量体（ｕｂｉ ｄｉｍｅｒ ｗｔ）、野生型ユビキチンタンパク質（図５におけるＵｂ２−ＴｓＸ９、各単量体の４５位の置換およびＣ末端に２つの置換を有する）、および修飾ユビキチンヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１との配列アライメントを、図５に示す。デユビキチナーゼは、ユビキチンのＧＧの後ろを切断し、ＡＡの後ろを切断しないため、Ｕｂ２−ＴｓＸにおいて、前記単量体のＣ末端の置換（ＧＧからＡＡ）は、血清における安定性を増加させる。野生型ユビキチンの二次構造は、前記Ｃ末端における置換を有するユビキチンと比較して、ほぼ同一である。
【０２０２】
１０４１−Ｄ１１（図Ｘ、配列番号３６）または１０４５−Ｄ１０と呼ばれる、優れたＥＤ−Ｂ結合親和性を有する修飾ユビキチンは、野生型と比較して、後述のアミノ酸置換によって同定される。
第１モジュール
Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ
第２モジュール
Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ
任意に、Ｑ２Ｒ（当該置換は、変異体１０４１−Ｄ１１に存在し、変異体１０４５−Ｄ１０には存在しない）
融合タンパク質に適した好ましいリンカーは、少なくともＧＩＧ配列を有するリンカーまたは少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するリンカー、あるいは、例えばＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列、またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ配列を有するその他のリンカーが挙げられる。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。第１単量体結合決定領域においてコンセンサス配列を有する、さらに別のＥＤＢバインダーを、図１１に示す。
【０２０３】
優れたＭＩＡ−２結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１２〜１４に示す。
【０２０４】
優れたＮＧＦ結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１６に示す。
【０２０５】
優れたＴＮＦα結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１５に示す。
【０２０６】
優れたＩｇＧ結合活性を有する修飾ユビキチンを、図１７に示す。
【０２０７】
［実施例２］
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体のヒトターゲットに対する結合分析
【０２０８】
実施例２Ａ：濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースの結合変異体の結合分析
ユビキチンベースの変異体のヒトターゲットに対する結合を、濃度依存ＥＬＩＳＡによって分析した。精製タンパク質を、ヒトターゲット、ＢＳＡまたはＨＳＡ、および考えられるその他のコントロール（ターゲットとしてＥＤ−Ｂを用いた場合には、細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）等）でコーティングされた複数のＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに、量を増加させてアプライした。ウェルあたり５０μｌのタンパク質溶液（１０μｇ／ｍｌ）での抗原コーティングを、４℃で一晩行った。前記プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４；ＰＢＳＴ）で洗浄した後、前記ウェルを、室温で２時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；３％ ＢＳＡ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングした。前記ウェルを、ＰＢＳＴでさらに３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。コーティングされたウェルを、異なる濃度のターゲット結合タンパク質で、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで前記ウェルを洗浄した後、抗ユビキチンｆａｂフラグメント（ＡｂｙＤ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴに適切に希釈して、アプライした。前記プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。前記ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて読み取った。参照波長を６２０ｎｍとして、４５０ｎｍで吸光光度測定を行った。図６は、変異体１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ）。このことは、図１４、１５、１６、１７に示す結果により、他のターゲット分子であるＭＩＡ−２、ＴＮＦα、ＮＧＦ、およびＩｇＧについてもそれぞれ確認されている。このように、野生型ユビキチンにおけるわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）により、所定のターゲットに対する、低いマイクロモーラー（Ｍ）の範囲の親和性がもたらされる。
【０２０９】
実施例２Ｂ：競合的濃度依存ＥＬＩＳＡによる、修飾ユビキチンベースの結合変異体の結合分析
本実施例では、ターゲットＥＤ−Ｂに関する結合分析について述べるが、この結合分析は、これ以外の任意のターゲットについても、さらに実験を行うことなく使用できる。競合的濃度依存ＥＬＩＳＡにより、量が増加する遊離のターゲットの存在下、フィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９）を含む固定化ＥＤ−Ｂに対するユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を分析した。ＥＬＩＳＡの条件は、１０４１−Ｄ１１タンパク質を、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）（０μＭ〜１０μＭ）、またはネガティブコントロール６７８９（０μＭ〜１０μＭ）で、１時間プレインキュベートし、その後、その混合物を、Ｍｅｄｉｓｏｒｐ−ｐｌａｔｅ上に配置したターゲット６７Ｂ８９に添加した以外は、実施例２Ａで述べたとおりである。これに続き、前記変異体を、対応する抗体によって検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ；希釈度１：６５００）。
【０２１０】
図７は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合親和性を有することを示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。図６に示した結果が裏付けられている。すなわち、野生型ユビキチンにおけるわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）のみにより、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２１１】
実施例２Ｃ：結合活性の血清安定性を同時に分析する、濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当該技術分野における公知の方法により、前述（実施例２Ａおよび２Ｂ）と同様に、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９ともいう）を、マイクロタイタープレートにコーティングし、前記変異体を、ＥＤ−Ｂに結合させ、特異的ユビキチン抗体（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ）により検出した。この分析において、前記変異体は、異なる方法で処理した。すなわち、前記変異体を、３７℃で１時間、マウス血清中でインキュベートする処理（図９参照、青丸）、前記変異体を、３７℃で１時間、ラット血清中でインキュベートする処理（図９、赤丸）、または、前記変異体を、３７℃で１時間、ＰＢＳでインキュベートする処理（図９、黒丸）である。図９、変異体１０４１−Ｄ１１の全てのＫｄが、１０．３ｎＭ（ＰＢＳ）から２０．７４ｎＭ（マウス血清）の間にあることを示す。
【０２１２】
実施例２Ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化したフィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９という）を含むＥＤ−Ｂに対する結合について、前記変異体を異なる濃度で分析した（例えば、０〜２００ｎＭの変異体、好ましくは１０４１−Ｄ１１）。得られたデータは、ＢＩＡ評価ソフトウェアおよび１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。図８に示すように、変異体１０４１−Ｄ１１のＫＤは、１．０ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝７．６×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝７．７×１０−４ｓ−１であった。融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαのＫＤは、１．１３ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝４．５×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝５．０×１０−４ｓ−１であった。
【０２１３】
実施例２Ｅ：ＳＥ−ＨＰＬＣによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の複合体構造の分析
複合体構造の分析のために、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（Ｖ＝３ｍｌ）を使用し、５０μｌのタンパク質をアプライした。さらなる条件は、バッファー：１×ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、流速：０．３ｍｌ／分、ラン：４５分（サンプルの注入：１５分後）とした。条件：０．７２ｎｍｏｌ １０４１−Ｄ１１タンパク質＋０．７２ｎｍｏｌ ＥＤ−Ｂ（以下、６７Ｂ８９という）またはネガティブコントロールのフィブロネクチン（以下、６７８９という）を、室温で１時間インキュベートし、複合体構造を分析するために、カラムにアプライした。図１０は、前記変異体のみを黒で示し、ターゲットＥＤ−Ｂのみを青で示し、ＥＤ−Ｂとの複合体を構成する変異体結合をピンクで示す。図１０Ａは、前記変異体とＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチン（６７Ｂ８９）とを示す。図１０Ｂは、前記変異体とＥＤ−Ｂフリーのフィブロネクチンとを示す。図１０は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）と複合体を構築するが、フィブロネクチン（６７８９）とは複合体を構築しないことを示し、特異性を裏付けている。
【０２１４】
［実施例３］
ＴＮＦαへの結合性が向上したユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質
【０２１５】
ＴＮＦαに対して特異的なユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質を、本発明の方法により選択した。すなわち、ＴＮＦαに対する結合性能に基づいてスクリーニングされたヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質群を含むファージライブラリーを確立した。下記の修飾を行った。
【０２１６】
第１単量体：２、４、６、６２〜６６位、任意に追加で６８、７０、７２〜７４位のうちの１以上、任意にさらに別の位置の１以上のアミノ酸の修飾
【０２１７】
第２単量体:６、８、６２〜６６位のうちの１以上のアミノ酸の修飾
【０２１８】
１１４４−Ｄ１１（配列番号７９）および１１４４−Ｅ９（配列番号８０）を除き、ほとんどの場合、リンカーとしてＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧを使用した。１１４４−Ｄ１１および１１４４−Ｅ９に関しては、第１および第２ユビキチン単量体間にリンカーを使用しなかった。７５および７６位は、ＡＡまたはＧＧである。前記リンカーを、図１５のパートＡに示す。結合親和性を、図１５Ｂ〜１５Ｅに示す。
【０２１９】
［実施例４］
ＭＩＡ２への結合性が向上した、ユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質の生成
【０２２０】
ＭＩＡ２は、特に、肝硬変、線維症、および肝臓癌に関する診断および治療用のマーカーである。このマーカーに関する詳しい情報は、米国特許第２００４０７６９６５号明細書中に見出せる。
【０２２１】
本発明の修飾ユビキチン結合タンパク質のターゲットタンパク質は、ＭＩＡのコア領域である安定した１０１個のアミノ酸からなり、ここではＳＰＲ３０−３という。ＳＰＲ３０−３は、ＭＩＡ−２の構造化された部分である。ＳＰＲ３０−３は、シグナルペプチドを除く、ＭＩＡ（ＣＤ−ＲＡＰ）、ＯＴＯＲ、ＴＡＮＧＯと相同的である。その分子量は、１１５６９.１９８Ｄａである。
【０２２２】
前記ＭＩＡ−２のコア領域のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９５）。
MLESTKLLADLKKCGDLECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL
【０２２３】
ＭＩＡ２に特異的なユビキチンベースのヘテロ二量体結合タンパク質を、本発明の方法により選択した。ＭＩＡ２に対する結合性能に基づいてスクリーニングされたヘテロ二量体修飾ユビキチン結合タンパク質群を含むファージライブラリーを確立した。下記の修飾を行った。結果を以下に示す。
【０２２４】
図１３は、ユビキチンベースのヘテロ二量体ＭＩＡ２結合タンパク質のアライメントを示す。
【０２２５】
変異体１１１１−Ｅ１０は、マイクロモーラーの範囲でのビオチン化ターゲットへの親和性と、サイズ排除クロマトグラフィーにおける複合体形成とを示す。最も強力なバインダーは、第１単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ１）の６、８、６２、６３、６４、６５、６６位におけるアミノ酸が置換され、第２単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ２）の６、８、６２、６３、６４、６５、６６位において異なる置換がなされた１１１１−Ｅｌ０である。
【０２２６】
第１単量体ユビキチンユニット（ＢＤＲ１）における置換は、１１１１−Ｈ２および１１１１−Ｈ１２では同様である。したがって、変異体１１１１−Ｈ２および１１１１−Ｈ１２は、１つのアミノ酸の置換のみが相違するＢＤＲ１とＢＤＲ２との組み合わせと考えられる。
【０２２７】
下記のさらなる強力な結合分子、１１１１−Ｃ９、１１１１−Ｂ４および１１１１−Ｆ６を評価した。これらのバインダーは、不溶性であるか、あるいは、ＥＬＩＳＡおよびＳＥＣにおいて、ＭＩＡ２のＳＰＲ３０−３に対して結合を示さなかった。変異体１１１１−Ｅ１０および１１１１−Ｃ９のそれぞれと、１１１１−Ｂ４とを濃縮した（１１１１−Ｂ４において、さらなる置換Ｔ９Ａが数回発生した）。１１１１−Ｆ６は濃縮しなかったが、Ｈｉｔ−ＥＬＩＳＡにおいて高いシグナルを示すことから、興味深い候補であると考えられた。しかしながら、このバインダーは、不溶性のようであった。
【０２２８】
図１４は、ビオチン化ＭＩＡ−２（ｂｉｏｔ．ＭＩＡ２）に対する結合変異体１１１１−Ｅ１０についての濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。Ｋｄ＝２．６μＭであり（黒丸）、コントロールはＨＳＡ（白丸）である。この変異体１１１１−Ｅ１０は、ＭＩＡ２に対する最良の結合分子であることが証明された。その配列は、下記の通りである。
MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA（配列番号５３）
【０２２９】
使用したリンカーを、添付の配列表において、以下のように示す。
１１１１−Ｂ４＿２１２３１ sggggsggggig （配列番号９６）
１１１１−Ｃ９＿２１２６５ sggggsggggig （配列番号９６）
１１１１−Ｅ１０＿２１３１５ gig
１１１１−Ｆ６＿２１３３１ gig
１１１１−Ｈ１２＿２１３９１ eig
１１１１−Ｈ２＿２１３７１ gig
【０２３０】
刊行物
１． Ｂｉｒｃｈｌｅｒ， Ｍ．， Ｆ． Ｖｉｔｉ， Ｌ． Ｚａｒｄｉ， Ｂ． Ｓｐｉｅｓｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． １９９９． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９８４−８．
２． Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ， Ｊ．， Ｍ． Ｌａｎｇ， Ｍ． Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｓ． Ｎ． Ｌｅｅｂ， Ｗ． Ｆａｌｋ， Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｍ． Ｇｏｋｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒｏｇｌｅｒ． ２００７． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ ＥＤ−Ａ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＤ） ｍｕｃｏｓａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２２：６１１−２３．
３． Ｄｕｂｉｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｈ． Ｐｅｔｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｂｒｏｗｎ， Ｂ． Ｌｏｇａｎ， Ｋ． Ｃ． Ｋｅｎｔ， Ｂ． Ｂｅｒｓｅ， Ｓ． Ｂｅｒｖｅｎ， Ｂ． Ｃｅｒｃｅｋ， Ｂ． Ｇ． Ｓｈａｒｉｆｉ， Ｒ． Ｅ． Ｐｒａｔｔ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂａｌｌｏｏｎ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５：１９５８−６７．
４． Ｇｏｏｄｓｅｌｌ， Ｄ． Ｓ． ２００１． ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ： Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ６：５４７−５４８．
５． Ｋａｃｚｍａｒｅｋ， Ｊ．， Ｐ． Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ｇ． Ｎｉｃｏｌｏ， Ｂ． Ｓｐｉｎａ， Ｇ． Ａｌｌｅｍａｎｎｉ， ａｎｄ Ｌ． Ｚａｒｄｉ． １９９４． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ， ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５９：１１−６．
６． Ｍｅｎｒａｄ， Ａ．， ａｎｄ Ｈ． Ｄ． Ｍｅｎｓｓｅｎ． ２００５． ＥＤ−Ｂ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ９：４９１−５００．
７． Ｐｕｊｕｇｕｅｔ， Ｐ．， Ａ． Ｈａｍｍａｎｎ， Ｍ． Ｍｏｕｔｅｔ， Ｊ． Ｌ． Ｓａｍｕｅｌ， Ｆ． Ｍａｒｔｉｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９６． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＥＤ−Ａ＋ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ＋ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４８：５７９−９２．
８． Ｔｒａｃｈｓｅｌ， Ｅ．， Ｍ． Ｋａｓｐａｒ， Ｆ． Ｂｏｏｔｚ， Ｍ． Ｄｅｔｍａｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． ２００７． Ａ ｈｕｍａｎ ｍＡｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７：８８１−６．
９． Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ， Ａ．， Ｈ． Ｊ． Ｂａｅｌｄｅ， Ｌ． Ｊ． Ｖｌｅｍｉｎｇ， Ｅ． ｄｅ Ｈｅｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ａ． Ｂｒｕｉｊｎ． ２００１． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９３：２５６−６２．
１０． Ｌｉｐｏｖｓｅｋ， Ｄ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００４）． Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０，５１−６７．
１１． Ｏｈａｓｈｉ， Ｈ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， Ｙｉｎｇ， Ｂ．Ｗ．， ａｎｄ Ｕｅｄａ， Ｔ． （２００７）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３５２，２７０−２７６．
１２． Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ． （２００５）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４１，２０７−２３４．
１３． Ｚａｈｎｄ， Ｃ．， Ａｍｓｔｕｔｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００７）． Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ２６９−２７９．
１４． Ｐａｓｃｈｋｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｗ． Ｈｏｈｎｅ （２００５）． Ｇｅｎｅ ３５０（１）：７９−８８
１５． Ｂｒｕｓｅｒ ２００７ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６（１）：３５−４５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の同定方法。
ａ）単量体修飾ユビキチンタンパク質から生じるヘテロ多量体修飾ユビキチン群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つ以上のユビキチン単量体を含むヘテロ多量体タンパク質を含み、
前記ヘテロ多量体タンパク質に含まれる前記単量体の少なくとも１つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置する表面露出アミノ酸の少なくとも３個が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾のユビキチンタンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、前記工程
ｂ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群に対する潜在的なリガンドを提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記リガンドと接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、ヘテロ多量体修飾タンパク質を同定する工程であり、
前記ヘテロ多量体修飾タンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程、および
任意に、
ｅ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンを、前記結合親和性で単離する工程
【請求項２】
前記ヘテロ多量体タンパク質が、ヘテロ二量体タンパク質またはヘテロ三量体タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記修飾単量体タンパク質は、１以上のアミノ酸が挿入され、挿入アミノ酸数が合計で１〜１０個であり、および／または、１以上のアミノ酸が欠失され、欠失アミノ酸数が合計で１〜７個であり、さらに任意に、前記修飾単量体ユビキチンタンパク質は、６個以上１４個以下のアミノ酸が置換され、
前記修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、合計で１２個以上２８個以下のアミノ酸が置換され、および／または、合計で１個以上２０個以下のアミノ酸が挿入され、および／または合計で１個以上１４個以下のアミノ酸が欠失されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記修飾単量体ユビキチンタンパク質が、ユビキチンをコードするＤＮＡを遺伝子工学的に設計し、前記タンパク質を原核生物もしくは真核生物内またはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多量体タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法によって提供され、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法が、好ましくはディスプレイ法であり、任意に、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ＴＡＴファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、細菌ディスプレイ法、細胞表面ディスプレイ法またはｍＲＮＡディスプレイ法である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、抗原またはハプテンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単量体ユビキチンタンパク質の少なくとも１つにおいて、さらに追加で１〜７個のアミノ酸が置換され、
これらのアミノ酸は、任意に、配列番号１の３６、４４、７０、および７１位の１以上のアミノ酸から選択され、
さらに、任意に、配列番号１の６２、６３および６４位、７２および７３位、または８位を追加した１以上のアミノ酸から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ユビキチンのヘテロ多量体融合タンパク質群は、異なる修飾がなされた単量体タンパク質をそれぞれコードする２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合し、前記ＤＮＡをヘテロ多量体融合タンパク質に翻訳し、前記タンパク質をディスプレイし、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された単量体ユビキチンタンパク質を含むヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の存在下、前記ディスプレイされたタンパク質をスクリーニングすることによって提供され、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質であるか、あるいは
前記ユビキチンのヘテロ多量体融合タンパク質群が、前記タンパク質の化学合成によって提供される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
単量体ユビキチンから生じるヘテロ多量体ユビキチン融合タンパク質群をコードするＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーであり、
各多量体タンパク質が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つ以上の修飾ユビキチン単量体を含み、
前記多量体タンパク質の各単量体の少なくとも２つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置する表面露出アミノ酸の少なくとも３個が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾タンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、ＤＮＡライブラリー。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡライブラリーの発現によって得られるタンパク質ライブラリー。
【請求項１１】
請求項９記載のＤＮＡライブラリー、または請求項１０記載のタンパク質ライブラリーを含む、原核細胞もしくは真核細胞、またはファージ群。
【請求項１２】
請求項１０記載のタンパク質ライブラリーにおける融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１】
以下の工程を含む、リガンドへの結合能を有するヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の同定方法。
ａ）単量体修飾ユビキチンタンパク質から生じるヘテロ多量体修飾ユビキチン群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つ以上のユビキチン単量体を含むヘテロ多量体タンパク質を含み、
前記ヘテロ多量体タンパク質に含まれる前記単量体の少なくとも１つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置する表面露出アミノ酸の少なくとも３個が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾のユビキチンタンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、前記工程
ｂ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群に対する潜在的なリガンドを提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記リガンドと接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、ヘテロ多量体修飾タンパク質を同定する工程であり、
前記ヘテロ多量体修飾タンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程、および
任意に、
ｅ）前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンを、前記結合親和性で単離する工程
【請求項２】
前記ヘテロ多量体タンパク質が、ヘテロ二量体タンパク質またはヘテロ三量体タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記修飾単量体タンパク質は、１以上のアミノ酸が挿入され、挿入アミノ酸数が合計で１〜１０個であり、および／または、１以上のアミノ酸が欠失され、欠失アミノ酸数が合計で１〜７個であり、さらに任意に、前記修飾単量体ユビキチンタンパク質は、６個以上１４個以下のアミノ酸が置換され、
前記修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、合計で１２個以上２８個以下のアミノ酸が置換され、および／または、合計で１個以上２０個以下のアミノ酸が挿入され、および／または合計で１個以上１４個以下のアミノ酸が欠失されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記修飾単量体ユビキチンタンパク質が、ユビキチンをコードするＤＮＡを遺伝子工学的に設計し、前記タンパク質を原核生物もしくは真核生物内またはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多量体タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法によって提供され、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法が、好ましくはディスプレイ法であり、任意に、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ＴＡＴファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、細菌ディスプレイ法、細胞表面ディスプレイ法またはｍＲＮＡディスプレイ法である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、抗原またはハプテンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単量体ユビキチンタンパク質の少なくとも１つにおいて、さらに追加で１〜７個のアミノ酸が置換され、
これらのアミノ酸は、任意に、配列番号１の３６、４４、７０、および７１位の１以上のアミノ酸から選択され、
さらに、任意に、配列番号１の６２、６３および６４位、７２および７３位、または８位を追加した１以上のアミノ酸から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ユビキチンのヘテロ多量体融合タンパク質群は、異なる修飾がなされた単量体タンパク質をそれぞれコードする２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合し、前記ＤＮＡをヘテロ多量体融合タンパク質に翻訳し、前記タンパク質をディスプレイし、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された単量体ユビキチンタンパク質を含むヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質の存在下、前記ディスプレイされたタンパク質をスクリーニングすることによって提供され、前記ヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質は、前記リガンドと、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記リガンドに対して、一価の結合活性を示すタンパク質であるか、あるいは
前記ユビキチンのヘテロ多量体融合タンパク質群が、前記タンパク質の化学合成によって提供される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
単量体ユビキチンから生じるヘテロ多量体ユビキチン融合タンパク質群をコードするＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーであり、
各多量体タンパク質が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つ以上の修飾ユビキチン単量体を含み、
前記多量体タンパク質の各単量体の少なくとも２つは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、および６８位に位置する表面露出アミノ酸の少なくとも３個が、少なくとも置換により異なる修飾がなされ、
前記修飾単量体タンパク質が、非修飾タンパク質に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する配列を有する、ＤＮＡライブラリー。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡライブラリーの発現によって得られるタンパク質ライブラリー。
【請求項１１】
請求項９記載のＤＮＡライブラリー、または請求項１０記載のタンパク質ライブラリーを含む、原核細胞もしくは真核細胞、またはファージ群。
【請求項１２】
請求項１０記載のタンパク質ライブラリーにおける融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｄ】
【図１４】
【図２Ｃ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｄ】
【図１４】
【図２Ｃ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【公表番号】特表２０１３−５１３３７６（Ｐ２０１３−５１３３７６Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４２５８３（Ｐ２０１２−５４２５８３）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３２１４
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３２１４
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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