リゾチームの変異体及びそれをコードするポリヌクレオチド
本発明は、変異体リゾチームに関する。本発明はまた、変異体リゾチームをコードするポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された親リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１１３、１１９、３５、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を含み、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有し、且つ抗微生物活性を有する、変異体。
【請求項２】
前記変異体リゾチームが、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド、又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体が、位置番号９５、１８６、６５、１２２、１３９、１４１、及び１７６からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を更に含む、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び／又は２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較してアルカリｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ；Ｙ１３４Ｖ；Ｇ１０２Ｐ；Ｔ１０８Ｗ；Ｔ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｐ；Ｙ５６Ｗ；Ｎ１９Ｄ；Ｈ１２０Ｑ；Ｈ１９８Ｎ；Ｈ１９８Ｆ；Ｈ２０Ｗ；Ｈ２０Ｙ；及び／又はＨ１３５Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ＋Ｙ１３４Ｖ及び／又はＹ１９６Ｇ＋Ｋ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、及び／又は２０６からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して酸性ｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｆ１６１Ｙ；Ｈ１２８Ｒ；Ｖ１３１Ｃ；Ｄ９５Ｇ；Ｄ２０３Ｎ；Ｒ９８Ｇ；Ｇ１１２Ｓ；Ｈ５５Ｎ；Ｄ３２Ｓ；Ｎ８９Ｔ；Ｎ２０６Ａ；及び／又はＮ２０６Ｓに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）Ｄ２０３Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４、７、及び８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号５６、１１３及び／又は１６１からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、胃のプロテアーゼの存在下の酸性ｐＨ条件において向上した安定性を有する、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、１又は２以上の以下の改変（番号付けに配列番号３を用いて）：Ｙ５６Ｗ、Ｖ１３１Ｃ及び／又はＦ１６１Ｃに対応する改変を含む、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５及び／又は１９３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｙ４７Ｆ；Ｙ１１１Ｆ；Ｙ１０８Ｆ；Ｔ４５Ｇ；Ｋ２２Ｇ；Ｐ１１０Ｇ；Ｈ１２０Ａ；Ｔ１４７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｄ４９Ａ；Ｈ５５Ａ；及び／又はＳ１９３Ａに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７及び／又は１９７からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された熱安定性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｓ１２１Ａ；Ｈ１２０Ｐ；Ｔ１８６Ｔ；Ａ１１３Ｐ；Ｋ１８５Ｐ；Ｐ１７６Ｖ；Ｑ１２２Ａ；Ｓ１１９Ｎ；Ｑ３５Ｒ；Ｌ６５Ｉ；Ｓ１３９Ｇ；Ｗ１４１Ｙ；Ｒ１５３Ｔ；Ａ１５８Ｓ；Ａ１７１Ｒ；Ｋ１９５Ｓ；Ｋ７６Ｓ；Ｋ１６４Ｔ；Ｋ３０Ｙ；Ｆ８５Ｙ；Ｋ１７８Ｃ；Ｄ１８３Ｇ；Ｙ１８６Ｙ；Ｇ１１２Ｓ；Ｓ１７４Ｔ；Ｗ１８７Ｙ及び／又はＫ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体中の改変の総数が、２個、好ましくは３個、より一層好ましくは４個、より一層好ましくは５個、より一層好ましくは６個、より一層好ましくは７個、より一層好ましくは８個、より一層好ましくは９個、最も好ましくは１０個である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列に対応する親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで前記細胞は、親リゾチームの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記変異体は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸位置で改変されており、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１の親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６５％の同一性を有する親ポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、及び
ｂ）培養培地からリゾチーム変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２１】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養すること、及び
ｂ）培養培地から変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム、及び界面活性剤を含む、洗剤組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム及び飼料成分を含む、飼料組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームを用いて、微生物汚染された表面を処理することを含む、微生物汚染を減少させるための方法。
【請求項２５】
抗微生物剤としての、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームの使用。
【請求項１】
単離された親リゾチームの変異体であって、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１１３、１１９、３５、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を含み、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有し、且つ抗微生物活性を有する、変異体。
【請求項２】
前記変異体リゾチームが、配列番号２の成熟ポリペプチドに対応するポリペプチド、又は配列番号３に示されるポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体が、位置番号９５、１８６、６５、１２２、１３９、１４１、及び１７６からなる群から選択される１又は２以上の位置にアミノ酸改変を更に含む、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び／又は２０３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較してアルカリｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ；Ｙ１３４Ｖ；Ｇ１０２Ｐ；Ｔ１０８Ｗ；Ｔ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｋ１９７Ｐ；Ｙ５６Ｗ；Ｎ１９Ｄ；Ｈ１２０Ｑ；Ｈ１９８Ｎ；Ｈ１９８Ｆ；Ｈ２０Ｗ；Ｈ２０Ｙ；及び／又はＨ１３５Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｇ１０２Ｐ＋Ｙ１３４Ｖ及び／又はＹ１９６Ｇ＋Ｋ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、及び／又は２０６からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して酸性ｐＨにおいて向上した安定性及び／又は活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｆ１６１Ｙ；Ｈ１２８Ｒ；Ｖ１３１Ｃ；Ｄ９５Ｇ；Ｄ２０３Ｎ；Ｒ９８Ｇ；Ｇ１１２Ｓ；Ｈ５５Ｎ；Ｄ３２Ｓ；Ｎ８９Ｔ；Ｎ２０６Ａ；及び／又はＮ２０６Ｓに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）Ｄ２０３Ｎに対応する改変を含む、請求項１〜４、７、及び８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号５６、１１３及び／又は１６１からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、胃のプロテアーゼの存在下の酸性ｐＨ条件において向上した安定性を有する、請求項１〜３、及び７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、１又は２以上の以下の改変（番号付けに配列番号３を用いて）：Ｙ５６Ｗ、Ｖ１３１Ｃ及び／又はＦ１６１Ｃに対応する改変を含む、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５及び／又は１９３からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｙ４７Ｆ；Ｙ１１１Ｆ；Ｙ１０８Ｆ；Ｔ４５Ｇ；Ｋ２２Ｇ；Ｐ１１０Ｇ；Ｈ１２０Ａ；Ｔ１４７Ｇ；Ｙ１９６Ｇ；Ｄ４９Ａ；Ｈ５５Ａ；及び／又はＳ１９３Ａに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）位置番号１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７及び／又は１９７からなる群から選択される１又は２以上の位置に改変を含み、前記変異体が、親リゾチームと比較して低温において改良された熱安定性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体が、（番号付けに配列番号３を用いて）１又は２以上の以下の改変：Ｓ１２１Ａ；Ｈ１２０Ｐ；Ｔ１８６Ｔ；Ａ１１３Ｐ；Ｋ１８５Ｐ；Ｐ１７６Ｖ；Ｑ１２２Ａ；Ｓ１１９Ｎ；Ｑ３５Ｒ；Ｌ６５Ｉ；Ｓ１３９Ｇ；Ｗ１４１Ｙ；Ｒ１５３Ｔ；Ａ１５８Ｓ；Ａ１７１Ｒ；Ｋ１９５Ｓ；Ｋ７６Ｓ；Ｋ１６４Ｔ；Ｋ３０Ｙ；Ｆ８５Ｙ；Ｋ１７８Ｃ；Ｄ１８３Ｇ；Ｙ１８６Ｙ；Ｇ１１２Ｓ；Ｓ１７４Ｔ；Ｗ１８７Ｙ及び／又はＫ１９７Ｐに対応する改変を含む、請求項１〜３、及び１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体中の改変の総数が、２個、好ましくは３個、より一層好ましくは４個、より一層好ましくは５個、より一層好ましくは６個、より一層好ましくは７個、より一層好ましくは８個、より一層好ましくは９個、最も好ましくは１０個である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列に対応する親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで前記細胞は、親リゾチームの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記変異体は、位置番号４７、１１１、１０８、４５、２２、１１０、１２０、１４７、１９６、４９、５５、１９３、１６１、１２８、１３１、９５、２０３、９８、１１２、５５、３２、８９、２０６、１２１、１２０、１８５、１８６、１７６、１１３、１２２、１１９、３５、６５、１３９、１４１、１５３、１５８、１７１、１９５、７６、１６４、３０、８５、１７８、１８３、１８６、１１２、１７４、１８７、１９７、１０２、１３４、１０８、１９６、１９７、１９８、５６、１９、１２０、２０、１３５、及び２０３からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸位置で改変されており、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１の親ポリヌクレオチド、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６５％の同一性を有する親ポリヌクレオチドの変異誘発により調製される、及び
ｂ）培養培地からリゾチーム変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２１】
親リゾチームの変異体を生産する方法であって、前記変異体が抗微生物活性を有し、前記方法が、以下：
ａ）変異体の発現に好適な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養すること、及び
ｂ）培養培地から変異体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム、及び界面活性剤を含む、洗剤組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチーム及び飼料成分を含む、飼料組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームを用いて、微生物汚染された表面を処理することを含む、微生物汚染を減少させるための方法。
【請求項２５】
抗微生物剤としての、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のリゾチームの使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図２−９】
【図２−１０】
【図２−１１】
【図２−１２】
【図２−１３】
【図２−１４】
【図２−１５】
【図２−１６】
【図２−１７】
【図２−１８】
【図２−１９】
【図２−２０】
【図２−２１】
【図２−２２】
【図２−２３】
【図２−２４】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図２−９】
【図２−１０】
【図２−１１】
【図２−１２】
【図２−１３】
【図２−１４】
【図２−１５】
【図２−１６】
【図２−１７】
【図２−１８】
【図２−１９】
【図２−２０】
【図２−２１】
【図２−２２】
【図２−２３】
【図２−２４】
【公表番号】特表２０１３−５２０１８９（Ｐ２０１３−５２０１８９Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４３４９（Ｐ２０１２−５５４３４９）
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５２８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４３３９
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５２８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４３３９
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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