リボヌクレオチド標識核酸検出
【課題】標的核酸配列の検出のために有用な配列セグメントを有する5’末端を含んで成るポリヌクレオチド、及び標的核酸の検出へのそれらの使用方法を提供する。
【解決手段】ポリヌクレオチドは、１又は複数のリボヌクレオチドの存在下での標的核酸の配列を増幅するために使用される。リボヌクレオチドは、5’末端配列セグメントに対して相補的な、規則的間隔での増幅生成物に組込まれる。組込まれたリボヌクレオチドのすぐ3’側の結合での増幅生成物の分解は、標的核酸の存在又は不在を示す、検出的に明確なフラグメントを生成する。
【解決手段】ポリヌクレオチドは、１又は複数のリボヌクレオチドの存在下での標的核酸の配列を増幅するために使用される。リボヌクレオチドは、5’末端配列セグメントに対して相補的な、規則的間隔での増幅生成物に組込まれる。組込まれたリボヌクレオチドのすぐ3’側の結合での増幅生成物の分解は、標的核酸の存在又は不在を示す、検出的に明確なフラグメントを生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出の分野に関する。特に、本発明は、個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じである、複数連続配列セグメントを有するポリヌクレオチド、及び標的核酸の検出へのそれらの使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出のための多くの方法（例えば、SNP遺伝子型決定）は知られている。SNP遺伝子型決定のための現在入手できる均質アッセイは、TAQMAN（商標）, AMPLIFLUOR（商標）, 色素結合、対立遺伝子選択の動的PCR、及びSCORPION（商標）プライマーアッセイを包含する。それらのアッセイは、反応ウェル当たり１個又は最大２個（４種の異なった蛍光色素を用いる場合）のSNPを提供する（例えば、色素−結合動的PCRは１つのSNPのために２個のウェルを必要とする）。SNP遺伝子型決定のための利用できる方法は、反応ウェルにおける単一のSNPの遺伝子型決定を可能にする方法から単一ウェルにおける数千のSNPの遺伝子型決定を可能にする方法（例えば、GOLDEN GATE（商標）−Assay, Illumina）まで及ぶ。
【０００３】
現在の遺伝子型決定アッセイ方法は、個々の分類された対立遺伝子についての異なった色素について必要条件のために容易に多重化できず、そして従って、改良のためのその可能性において制限される。GOLDEN GATE（商標）アッセイは、複雑な分折装置、例えばファイバーオプチックアレイリーダーを必要とする。SNP遺伝子型決定の読み取りのための分析器は、プレートリーダー（任意には、包含されるPCR機械と共に）から、シーケンサー（例えば、毛細管シーケンサー）、アレイリーダー及び質量分光計まで及ぶ。さらに、質量分光計が遺伝子型決定のために使用されて来た程度には、現在利用できる方法は、真の多重化を可能にしない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、１又は複数の標的核酸の効果的で且つ高い感度の同時検出のためのポリヌクレオチドを提供する。配列セグメント又はその補体の質量が標的核酸又は標的核酸内の標的ヌクレオチドを同定するよう、１，２又はそれ以上の連続配列セグメントを含んで成る5’部分を有するポリヌクレオチドが企画される。いくつかの態様においては、配列セグメントは等質量のものである。等質量の配列セグメントは、同じ配列を有することができるが、但し必ずしも有する必要はない。配列セグメントは、ポリヌクレオチドの補体から分解され、そしてそれらの質量は標的核酸の存在、不在又は存在のレベルを同定するために測定されるか、又は検出される。
【０００５】
従って、第１の観点においては、本発明は、１，２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成るポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、ここで
ａ）5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして
ｂ）3’部分が少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは約75、50又は25個以下の長さのヌクレオチドである。
【０００６】
好ましい態様においては、個々の配列セグメントは、同じヌクレオチド配列を有する。
他の好ましい態様においては、5’部分は、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個の連続配列セグメントを含んで成る。いくつかの好ましい態様においては、個々の配列セグメントは、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個のヌクレオチドを含んで成る。
また好ましい態様においては、3’末端は、ポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるために除去できるブロッキング成分を含んで成る。特に好ましい態様においては、3’末端は2’ターミネーター成分を含んで成る。
【０００７】
さらなる観点においては、本発明は、標的核酸の検出方法を提供する。いくつかの態様においては、前記方法は：
（ａ）標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
（i）前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
（ii）前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；そして
（iii）前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り；
（ｂ）前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメント（すなわち、3’部分）を含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）であり；
（ｃ）個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し；そして
（ｄ）前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出すること、を含んで成る。
【０００８】
好ましい態様におては、5’部分の配列セグメントは、等質量のものである。
他の好ましい態様においては、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の少なくとも80％が、リボヌクレオチド（rNTP）の形で存在する。
さらなる好ましい態様においては、分解は、アンプリコンをアルカリ溶液にゆだねることにより実施される。
【０００９】
好ましい態様においては、アルカリ溶液は少なくとも１つの次のものを含んで成る：NaOH、KOH、RbOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2又はNH4OH。より好ましい態様においては、アルカリ溶液は少なくとも次のものを含んで成る：NaOH, KOH又はNH4OH。
また好ましい態様においては、さらに本発明の方法は、標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る。
【００１０】
さらに好ましい態様においては、前記方法はさらに、標的核酸と、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が前記標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す。
【００１１】
さらに好ましい態様においては、前記方法はさらに、標的核酸と、少なくとも２種の異なったポリヌクレオチドとを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの3’部分が3’末端ヌクレオチド塩基でのみ異なり、ここで個々のポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチド塩基がユニーク質量の配列セグメントに対応し、そして前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補対からの配列セグメントフラグメントの検出が標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す。
【００１２】
さらに好ましい態様においては、多くの異なった標的核酸配列が多くの異なったポリヌクレオチドと接触され、前記異なったポリヌクレオチドの個々はユニーク質量の配列セグメントを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの配列セグメントは前記多くの異なった標的核酸配列の１つの識別体であり、それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が多くの異なった標的核酸配列の少なくとも１つの存在し示す。
【００１３】
他の好ましい態様においては、ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成る単一触媒ドメインを含んで成る。ヌクレオチド組込み生触媒成分が第１及び第２触媒ドメインを含んで成ることが、本発明によれば、さらに好ましく、ここで前記第１触媒ドメインはデオキシリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り、そして第２触媒ドメインはリボヌクレオチド組込み活性を含んで成る。
【００１４】
好ましい態様においては、前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるブロッキング成分を含んで成り、そして前記方法がさらに、増幅の前、ポリヌクレオチドからのブロッキング成分を除去する段階を含んで成る。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、例えば上記本発明の検出方法を実施するための反応混合物を提供する。好ましい態様においては、反応混合物は、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
【００１６】
好ましい態様においては、反応混合物はさらに、少なくとも１つの標的核酸配列を含んで成る。
【００１７】
関連する観点においては、本発明はキットを提供する。好ましい態様においては、キットは、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
【００１８】
反応混合物及びキットの態様は、ポリヌクレオチド及び方法に関して上記に記載される通りである。本発明の好ましいキットは、例えば個々の5’部分配列セグメントが等質量のものであり、そしてポリヌクレオチドの5’部分配列セグメントが少なくとも３個の配列セグメント、より好ましくは少なくとも４個のヌクレオチド塩基、及び最も好ましくは、少なくとも７個のヌクレオチド塩基を含んで成る。キットの他の好ましい態様においては、3’末端は、ポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げる除去できるブロッキング成分を含んで成り、より好ましくは、ポリヌクレオチドの3’末端は2’−ターミネーター成分を含んで成る。
【００１９】
さらなる観点においては、本発明はアンプリコンを供給する。いくつかの態様においては、アンプリコンは、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成り；及び
ｂ）前記第１鎖に対して相補的であり、そして１又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第２鎖（ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである）を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成る。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明はシステムを供給する。いくつかの態様においては、システムは、
ａ本発明のアンプリコンを含んで成る組成物；
ｂ）容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも１つの熱モジュレーター；
ｃ）前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも１つの試薬移行成分；及び
ｄ）前記容器において又は支持体上に生成される１又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも１つの検出器を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体を含んで成る。
好ましい態様においては、検出器は、気相イオン分光計を含んで成る。
【００２１】
好ましい態様においては、システムは、
−容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも１つの制御器を含んで成る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のポリヌクレオチド及び方法の略図を示す。この典型的な態様においては、ポリヌクレオチドは、3個の同一の配列セグメント（すなわち、“反復体”）を有する5’部分又は5’末端（5’-NTAATAATAAT-3’；配列番号１）を含む。ポリヌクレオチドは、標的核酸における多形ヌクレオチドを検出するために使用される。ヌクレオチド組は、個々の配列セグメントの5’末端位置に存在するヌクレオチドに対して相補的であるリボヌクレオチドの約50％〜100％（例えば、rATP＝Å）を含むことができる。リボヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに対して相補的であるアンプリコン鎖中に組込まれる。アンプリコンは、配列セグメントを開放するフラグメント化を受けやすい。次に、開放される配列セグメントの質量が検出される。リボヌクレオチドもまた、標的核酸
【００２３】
【化１】
【００２４】
の相補的鎖中に組込まれるであろう。従って、リボヌクレオチドが組込まれている、標的核酸の増幅された鎖もまた、分解を受けやすいであろう。
【００２５】
【図２】図２は、本明細書及び例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでC対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“GTCTTA”は、問題のプライマーにおける反復ヘキサマーの逆補体を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【図３】図３は、本明細書及び例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでT対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“GCTCTA”は、問題のプライマーにおける反復ヘキサマーの逆補体を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２６】
【図４】図４は、下記例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでC及びT対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【図５】図５は、80％又は90％のリボヌクレオチド（ここで、rATP）及びデオキシリボヌクレオチドdU及びdCを用いてのHIV転写体の好結果をもたらす同定を示す。例２を参照のこと。“CCUA”は、上流のプライマーにおける反復テトラマーの逆補体核酸配列（４×CCUA＝配列番号６）を言及する。“GUGA”は、下流のプライマーにおける反復テトラマーの逆補体核酸配列（４×GUGA＝配列番号７）を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２７】
【図６】図６は、80％又は90％のリボヌクレオチド（ここで、rATP）及びデオキシリボヌクレオチドdU及び5-Me-dC(4 x CmeCmeUA =配列番号8; 4 x GUGA =配列番号7)を用いてのHIV転写体の好結果をもたらす同定を示す。シグナルは、鋳型なしではサンプルから得られなかった。例２を参照のこと。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２８】
【図７】図７は、図５及び６に示される試験サンプルからの結果を要約する（4 x CmeCmeUA =配列番号8; 4 x CCUA =配列番号6）。
【図８】図８は、NOS1_361のSNP RのATPリボ−PCRの７−マー領域の質量スペクトルを示す。A. ホモ接合体Aに対応する３種のフラグメントGTTTCTA (3 x GTTTCTA =配列番号9)。B. ヘテロ接合体AGに対応する３種のフラグメントGTTTCTA及びGTTTTTA (3 x GTTTTTA =配列番号10)。C. ホモ接合体Gに対応する3種のフラグメントGTTTTTA。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義：
用語“核酸”又は“ポリヌクレオチド”とは、リボース核酸（RNA）又はデオキシリボース核酸（DNA）ポリマーに対応され得るポリマー、又はその類似体に交換可能的に適用される。これは、ヌクレオチド、例えばRNA及びDNAのポリマー及びそれらの修飾された形、ペプチド核酸（PNA）、固定された核酸（LNATM）及び同様のものを包含する。ある態様においては、核酸は、複数のモノマータイプ、例えばRNA及びDNAサブユニットを含むポリマーであり得る。
【００３０】
核酸は、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のDNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、等であり得るか、又はそれらを包含することができる。核酸は、例えば一本鎖、二本鎖、三本鎖、等であり得、そしていずれかの特定の長さに制限されない。特にことわらない限り、特定の核酸配列は任意には、明確に示されるいずれかの配列の他に、相補的配列を含んで成るか、又はコードする。
【００３１】
核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列又は構造体、天然に存在する主鎖、及び/又は天然に存在するヌクレオチド関連鎖を有する分子に制限されない。例えば、１又は複数の炭素環式糖を含む核酸はまた、この定義内に含まれる（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp169-176）。さらに例証すると、核酸は一般的にホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合、他の主鎖を有する核酸類似体が包含される。
【００３２】
それらは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ホスホラミド（Beaucage など. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925) 及びそこにおける引例; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800; Sprinzl など. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger など. (1986)Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai など. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; 及び Pauwels など. (1986) ChemicaScripta 26: 1419）、ホスホロチオエート（Mag など. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1437; 及びアメリカ特許第5,644, 048号）、ホスホロジチオエート（Briu など. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 2321）、O−メチルホスホロアミジット連鎖（Eckstein,Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford University Press (1992)）、及びペプチド核酸主鎖及び連鎖（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Meier など. (1992) Chem. Int. Ed.Engl. 31: 1008 ; Nielsen (1993) Nature 365: 566; Carlsson など. (1996) Nature 380: 207）。
【００３３】
他の核酸類似体は、正に荷電された主鎖（Denpcy など. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性主鎖（アメリカ特許第5,386, 023号, 第5,637,684号, 第5,602, 240号,第5, 216,141号 及び第4,469, 863号; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger など. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook; Mesmaeker など. (1994)Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffsなど. (1994) J.Biomolecular NMR 34: 17; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)）、及び非−リボース主鎖を有するそれら、例えば引用により本明細書に組込まれる、アメリカ特許第5,235, 033号 及び第 5,034, 506号,及び Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cookに記載されるそれらを包含する。
【００３４】
いくつかの核酸類似体はまた、Rawls, C＆E News Jun.2, 1997, page35に記載される。リボース−リン酸主鎖のそれらの修飾は、追加の成分、例えばラベリング成分の付加を促進するために、又は生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を変更するために行われ得る。
【００３５】
核酸に典型的に見出されるそれらの天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）の他に、核酸類似体はまた、天然に存在しない複素環式又は他の修飾された塩基を有するそれらも包含する。さらに例証するために、溶融温度（Tm）調節体として作用するヌクレオチドに使用される一定の塩基が任意には包含される。例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ[３，４−d]ピリミジン、プロピニル−dN（例えば、プロピニル−dU、プロピニル−dC, 等）、及び同様のものを包含する。例えば、アメリカ特許第5,990,303号を参照のこと。
【００３６】
他の代表的な複素環式塩基は、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル及び同様のものを包含する。
【００３７】
多くの天然に存在しない塩基は又、例えばSeela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, and Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640にも記載される。修飾された塩基及びヌクレオチドの典型的な例はまた、例えばアメリカ特許第5,484,908号; 第5,645,985号; 第5,830,653号; 第6,639,059号; 第6,303,315号;及びアメリカ特許出願番号2003/0092905号にも記載される。
【００３８】
“ヌクレオチド”とは、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを言及する。例証すると、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖成分(例えば、5'位置、3’位置、2'位置、等)に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を含むことができる。
【００３９】
“ヌクレオチド組込み生触媒”とは、核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する触媒を言及する。ヌクレオチド組込み生触媒は典型的には酵素である。“酵素”は、他の化合物又は“基質”を含む化学反応の活性化エネルギーを低めるよう作用するタンパク質−及び/又は核酸−基材の触媒である。“ヌクレオチド組込み酵素“とは核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する酵素を言及する。典型的なヌクレオチド組込み酵素は例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、及び同様のものを包含する。他の生触媒はDNAに基づく(“DNAzymes”) 又はRNAに基づく(“リボザイム”) であり得る。
【００４０】
“熱安定性酵素”とは、熱に対して安定し、耐熱性であり、そして高温に選択された時間ゆだねられる場合、十分な触媒活性を保持する酵素を言及する。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる場合、プライマー延長反応をもたらすのに十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業者に良く知られており、そして1987年７月28日に発行された、“Process for amplifying nucleic acid sequences”と称するアメリカ特許第4,683,202号（Mullis）及び1987年７月28日に発行された、“Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences”と称するアメリカ特許第4,683,195号（Mullisなど）に例示されている。
【００４１】
本明細書において使用される場合、“熱安定性ポリメラーゼ”とは、温度周期反応、例えばPCR又は５‘-nヌクレアーゼ反応への使用のために適切である酸素を言及する。熱安定性ポリメラーゼに関しては、酵素活性は、鋳型核酸に対して相補的であるプライマー延長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチドの組合せの触媒を言及する。
【００４２】
典型的なヌクレオチド組込み生触媒は、次のものを包含する：例えば、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZO5R ポリメラーゼ、E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus ）ポリメラーゼ、TMA-25 ポリメラーゼ、E678G TMA-25 ポリメラーゼ、 TMA-30 ポリメラーゼ、E678G TMA-30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種SPS-17 ポリメラーゼ、E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZO5R ポリメラーゼ、T7 DNA ポリメラーゼ、コーンバーグ（Kornberg ）DNA ポリメラーゼ I、クレノウ DNA ポリメラーゼ、Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス（Micrococcal ）DNA ポリメラーゼ、αDNA ポリメラーゼ、逆転写酵素、AMV逆転写酵素、M-MuLV逆転写酵素、DNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼ、E.コリRNA ポリメラーゼ、SP6 RNA ポリメラーゼ、T3 RNA ポリメラーゼ、T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼ II、末端トランスフェラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボヌクレオチド類似体-組込みDNA ポリメラーゼ、リボヌクレオチド組込みDNA ポリメラーゼ、及び同様のもの。
【００４３】
用語“配列セグメント”とは、本発明のポリヌクレオチドの5’部分（すなわち、5’末端）のポリヌクレオチド副配列を言及する。5’部分は、１、２又はそれ以上の配列セグメントを含み、個々の配列セグメントは、１つのポリヌクレオチドの5’末端におけるすべての配列セグメントについて同じである、5’末端で位置するユニーク塩基を有する。配列セグメントは、約３〜10個又はそれ以上の長さの塩基、例えば約３〜８、３〜６、４〜６、４〜８又は７〜８個の長さの塩基を有することができ、そして5’部分は、２〜約10個又はそれ以上の配列セグメントを含むことができる。配列セグメントは、等質量のものであり得るが、但し必ずしも必要ではない。等質量の配列セグメントは、同一の配列を有することができるが、但し必ずしも必要ではない。同一の核酸配列を共有する5’末端における配列セグメントは、反復体である。
【００４４】
用語“5’末端”及び“3’末端”とは、5’−又は3’−末端（すなわち、5’−又は3’−末端塩基）で存在するポリヌクレオチド上のヌクレオチド位置、又は核酸又はその副配列の末端からの１又は２個のヌクレオチド塩基位置（すなわち、5’−又は3’−末端からの（−１）又は（−２）位置での）を、交換可能的に言及する。
【００４５】
用語“ブロッキング成分”又は“ブロッキング基”とは、例えば少なくとも１つのヌクレオチド組込み生触媒により、核酸の延長を妨げるポリヌクレオチドの3’末端に結合される化学基又は成分を言及する。例示されるブロッキング成分は、3’末端ヌクレオチド塩基の2’位置での置換基、すなわち2’−ターミネーターヌクレオチドを包含する。
【００４６】
“2’−ターミネーターヌクレオチド”とは、ヌクレオチドの糖成分の2’位置でブロッキング基（BG）を含んで成るヌクレオチド類似体を言及する。2’−ターミネーターヌクレオチドは、１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により非延長性であり得る。すなわち、2’−ターミネーターヌクレオチドが核酸（例えば、核酸の3’−末端で）中に組込まれると、ブロッキング基はさらに、少なくとも１つのヌクレオチド組込み生触媒による核酸のさらなる延長を妨げる。典型的なブロッキング基は、リン酸基である。典型的な2’−ターミネーターヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシド及び2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−二リン酸ヌクレオシドを包含する。2’−ターミネーターヌクレオチドは、例えばアメリカ特許公開番号2007/0219361号及び20070154914号に、詳細に記載されている。
【００４７】
用語“標的核酸”とは、検出されるべき副配列を含んで成るいずれかの核酸を言及する。標的核酸は、DNA又はRNAであり得る。標的核酸は、いずれかの源、例えばゲノムDNA、mRNA、cDNAからであり得る。標的核酸は、天然に存在する合成物（例えば、アンプリコン、ベクター、等）であり得る。標的核酸は、精製され得るか又は単離され得るが、但し必ずしも必要ではない。検出アッセイの性質に依存して、標的核酸は、植物又は動物組織からであり得るか、又は反応混合物から採取される。標的核酸は、本発明の方法による検出又は同定を受ける前、制限エンドヌクレアーゼに暴露され得るが、標的核酸の長さに対する制限は存在しない。本発明の方法のためには、標的核酸は、当業界において知られている方法を用いて調製される。
【００４８】
用語“増幅条件”とは、標的ヌクレオチドによる延長可能ポリヌクレオチド（例えば、プライマー）のハイブリダイゼーション、及び延長可能ポリヌクレオチドの鋳型依存性延長を可能にする増幅反応（例えば、PCR増幅、RT-PCR増幅）における条件を言及する。本明細書において使用される場合、“増幅条件”又は標的核酸を増幅するのに十分な条件は、当業界において良く知られている。例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, by Dieffenbach and Dveksler, eds., 2003, Cold Spring Harbor Press; and PCR Protocols, Bartlett and Stirling, eds., 2003, Humana Pressを参照のこと。
【００４９】
特定の記載：
１. 序言：
本発明は、最小数の反応段階を要し、そして便利で且つ真の多重化を可能にする多重検出のための方法を提供する。前記方法は、リボヌクレオチド塩基を組み込む反応（例えば、４種のヌクレオチド（A, C, G, T）の少なくとも１つがリボ塩基（rNTP）として、完全に又は一部、含まれる増幅反応）を使用する。標的核酸に対して特異的なプライマーが使用される。１つの又は両プライマーは、約３〜10個、又はそれ以上の塩基の１、２又はそれ以上の配列セグメント、及び個々の配列セグメントの5’末端で位置するリボ塩基に対して相補的な塩基を有する5’末端を有する。前記配列セグメントは、等質量のものであり得るが、但し必ずしも必要ではない。
【００５０】
増幅は、その5’部分を包含するプライマー配列のアンプリコン（例えば、増幅生成物）中への封入をもたらす。アンプリコンはまた、組込まれたリボ塩基を含むであろう。質量分光学による分析のために、増幅生成物は、例えばアルカリへの暴露により、断片化（フラグメント化）にゆだねられる。塩基が、前記組込まれたリボ塩基のすぐ3’側のDNA主鎖を選択的に分解する。従って、増幅生成物におけるプライマー配列及び配列セグメントの組込みは、配列セグメントの明白な質量を検出することにより、生成物の存在の検出を可能にする。プライマーの用法は、コピーされ、そして増幅された配列セグメントの質量の生成物の存在を翻訳する。
【００５１】
多重化に関しては、多重標的核酸（例えば、異なった対立遺伝子）のためのプライマーは、分解の後、明確な質量の生成物を生成する異なった5’部分配列セグメントを端に有する。すべての新規合成DNAは、組込まれたリボ塩基を含み、そして従って、アルカリにゆだねられる場合、フラグメントをもたらす。解釈を促進するためには、完全なシステムは、プライマー及び他の核酸のハイブリダイズする部分から一般的に発生する質量シグナルが5’末端配列セグメント又はその補体の質量とは異なるよう、計算され得る。シグナル末端における配列セグメントは、等質量のものであり得、そして同一の配列（すなわち、反復体）であり得る。反復体配列セグメントの反復は、標的核酸にアニーリングするかまたはそれをコピーするプライマーの部分の配列に由来するシグナルよりも明瞭なシグナルをもたらす。従って、個々の5’部分配列セグメントが等質量のものである、請求項１記載の方法は、本発明の好ましい態様である。
【００５２】
前記方法は、最少数の反応段階を用いての、単一のウェルにおいて10又はそれ以上のサンプルについての効果的な多重遺伝子型決定を可能にする。前記段階は一般的に、DNA鋳型及びマスター配合物の混合を必要とする。熱循環の後、アルカリ溶液が添加され、そしてフラグメント化された配列セグメントの質量が例えば、質量分光法により測定される。質量測定のためのいずれかの既知方法が使用され得る。質量分光法を用いる場合、いずれかの種類の質量分光計が分析のために適切である。
【００５３】
プライマーは、同じ熱安定性DNAポリメラーゼの“ホットスタート”をもたらし、それにより、特異性を改良し、そして高い程度の多重化を可能にする除去できる3’末端ブロッキング剤（すなわち、“ホットスタート”）を任意には含むことができる。
【００５４】
本発明の方法の実施のための１つの例においては、リボPCRが、個々の標的核酸（例えば、個々のSNP、個々の対立遺伝子）のためのDNAサンプル、２種の前方向プライマー及び１つの逆方向プライマーを用いて実施され得る。前方向プライマーは、標的核酸上の同定塩基に対して特異的に相補的な、3’末端塩基又は3’側の５個の3’末端塩基を伴って、１つの標的核酸（例えば、１つのSNP、１つの対立遺伝子）に対して特異的であるよう企画される。個々の前方向プライマーは、同一質量の１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成る特異的5’末端を有し、ここで個々の配列セグメントの5’末端塩基は、PCR増幅混合物におけるリボヌクレオチド（NTP）に対して相補的である。配列セグメントの質量は、異なった対立遺伝子、SNP、及び他の検出できる標的核酸間で異なり、そして区別できるよう企画される。
【００５５】
区別できる質量の配列セグメントを生成するためには、プライマーの5’末端は、例えば約３〜10個の長さの塩基である約２〜10個の配列セグメント；約４〜６個の長さの塩基の約４〜７個の配列セグメント；又は約７〜８個の長さの塩基の約２〜３個の配列セグメントを含む。
【００５６】
リボ−PCR又はリボ−増幅は、デオキシヌクレオチド及び少なくとも１つのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はrNTP）の混合物によるPCR又は増幅反応である。この例は、dGTP、リボヌクレオチドrTTP（すなわち、５−メチル−UTP）、dCTP及びdATP、及び適切な緩衝液においてリボヌクレオチドを効果的に組込み、そして延長するDNAポリメラーゼを含んで成るPCR混合物である。反応は、いずれかの延長反応、例えば熱循環反応により実施され得る。熱循環の後、反応混合物はアルカリにより処理され得る。アルカリは強塩基、例えばNaOH又はKOHであり得る。
【００５７】
アルカリは、組込まれたリボ塩基のすぐ3’側のDNA主鎖を分解し、そしてフラグメントの生成をもたらす。標的核酸の存在は、標的核酸に対して特異的な前方向プライマーの使用及び従って、増幅された5’末端配列の存在をもたらす。末端のコピーされ、そして分解された補体はユニーク質量を有する。この質量は、試験されるサンプルにおける標的核酸の存在を決定するために使用される。分解された相補的末端配列に対応する質量のシグナルの存在は、試験されるサンプルにおける標的核酸の存在を同定するために使用される。多重化のためには、多くの異なった末端配列が使用され、個々は、分解の後、DNAの特定質量をもたらす塩基組成を有する。
【００５８】
２．ポリヌクレオチド：
本発明のポリヌクレオチドは、１、２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及びヌクレオチドの鋳型に基づく延長を可能にするために標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る。
【００５９】
ａ．5’部分：
5’部分又は5’末端は、１、２又はそれ以上のタンデム（すなわち、連続）配列セグメントを含んで成り、個々の配列セグメントは、その個々の配列セグメントの5’末端で位置するユニークヌクレオチド塩基（すなわち、セグメントにおいてわずか１度、使用される）を含む。好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における個々の配列セグメントは、等質量のものである。
【００６０】
他の好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における個々の配列セグメントは、同一であり、これは、同じヌクレオチド配列を意味する。同一のヌクレオチド配列を有するタンデム配列セグメントは、反復体として言及される。ユニークヌクレオチド塩基に続いて、最後（２、３又は４番目、等）のタンデム配列セグメントが存在する。例えば、それぞれ４個の長さのヌクレオチドの同一質量の３個の配列セグメントを有する5’部分又は5’末端の配列は、5′-TAGCTAGCTAGCT-3′（配列番号３）であり得、ここでヌクレオチド塩基“T”は反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。
【００６１】
上記に例示されるように、いくつかの態様においては、5’部分又は5’末端の3’末端ヌクレオチド塩基は、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。アルカリ溶液は、5’部分の3’末端を包含する、組込まれたリボ塩基のすぐ3’側の結合を分解するので、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、すべての配列セグメントの開放を可能にする。分解されたアンプリコンの3’末端で残存するものは、2’又は3’リン酸を有する組込まれたリボ塩基である。図１を参照のこと。
【００６２】
5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、その5’部分が１つの配列セグメントのみを含む場合、必要とされる。5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基はまた、複数の配列セグメントが質量において異なる場合、必要とされる。しかしながら、5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、標的物−相補的部分の末端5’ヌクレオチドがまた、同じ“ユニーク”ヌクレオチド塩基である場合、又は5’部分が等質量の複数の配列セグメントを含む場合、任意である。
【００６３】
好ましい態様においては、追加のヌクレオチド塩基は、5’部分の4’末端で含まれる。追加の5’末端ヌクレオチド塩基は、いずれの塩基でも良い。追加の5’末端ヌクレオチド塩基を有する例示される5’部分は、5′-NTAGCTAGCTAGCT-3′（配列番号４）であり得る。追加の5’末端ヌクレオチド塩基の包含は、開放されるフラグメントの質量の均一性及び精度を高める。これは、アルカリ溶液が組込まれたリボ塩基のすぐ3’側の結合を分解する場合、2’又は3’リン酸成分がリボ塩基に結合したまま存続するためである。図１を参照のこと。5’部分の5’末端で包含される追加のヌクレオチド塩基が、鋳型無関係延長を行わないヌクレオチオ組込み生触媒を用いる場合、使用される。
【００６４】
他の好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における配列セグメントは、同一の質量を有するが、しかし異なった配列を有する。例えば、それぞれ４個の長さのヌクレオチドを有する、同一質量の３個の配列セグメントを有する、5’部分又は5’末端の配列は、5′-TAGCTCAGTGCAT-3′（配列番号５）であり、ここでヌクレオチド塩基“T”は、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。
【００６５】
さらに好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における配列セグメントは、異なった長さ（例えば、３、４及び/又は５個のヌクレオチド塩基）及び異なった質量のものであり得るが、しかし5’部分又は5’末端の全体は、アンプリコンが分解を受けやすい場合、例えば質量分光法により同定され得る、区別できる“模様”パターンを生成する。
【００６６】
前記5’部分又は5’末端は、２〜約10個の配列セグメント、又は所望には、それ以上、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、10又はそれ以上のタンデム配列セグメントを含むことができる。個々の配列セグメントは、約３〜約10個の長さのヌクレオチド塩基、又はより長い、例えば約３、４、５、６、７、８、９、10又はそれ以上の長さのヌクレオチド塩基であり得る。一般的に、配列セグメントが長いほど、より短い配列セグメントが5’末端に含まれる必要がある。逆にいえば、配列セグメントが短いほど、より長い配列セグメントが5’末端に含まれるであろう。例えば、5’末端は、約７〜８個の長さのヌクレオチド塩基である約２〜４個の配列セグメント、又は約４〜６個の長さのヌクレオチド塩基である約４〜６個の配列セグメント、又は約３〜５個の長さのヌクレオチド塩基である約５〜８個の配列セグメント、又は約３〜５個の長さのヌクレオチド塩基である約５〜８個のセグメントを含んで成る。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、標的核酸延長及び増幅反応においてプライマーとして有用である。個々の5’末端配列セグメントの5’末端に位置するユニークヌクレオチド塩基は、本発明のポリヌクレオチドによりハイブリダイズされる標的核酸の延長又は増幅のための反応混合物に含まれるリボヌクレオチド塩基に対して相補的である。
【００６８】
ｂ．3’部分：
ポリヌクレオチドの3’部分は、標的核酸配列にハイブリダイズし、そして延長されるために十分に相補的な核酸配列を有するよう企画される。3’部分は少なくとも５個の長さのヌクレオチド塩基であり、そして所望には、より長く、例えば約10、15、20、25、30、35、40、45 又は50個の長さのヌクレオチド塩基である。3’末端、又は3’部分の3’末端ヌクレオチド側の（−１）又は（−２）が、当業界において知られている方法に従って、標的核酸における特異的対立遺伝子又はSNP間を区別するために使用され得る。例えばプライマー延長又は熱循環のための典型的な反応条件は、約50 mM のトリシン-KOH, pH 7.5、00 mM のKOAc、3.0 mMのMg(OAc)2及び200 μMの個々のdNTPを包含し；アニーリング又はハイブリダイゼーション温度は、約50〜70℃、例えば約60〜65℃であり得る。
【００６９】
好ましい態様においては、3’部分の3’末端は任意には、ブロッキング基、又はポリヌクレオチドの延長を可逆的に妨げるブロッキング成分を有する。典型的な可逆的ブロッキング成分は、3’末端ヌクレオチド（すなわち、2’−ターミネーター）の2’位置に結合される置換基を含む。特に好ましい態様においては、2’−ターミネーター成分は、リン酸又はリン酸類似体、例えばメチルアミノリン酸である。
【００７０】
一般的に、糖成分の2’位置で使用されるブロッキング基（BG）はまた、種々の態様を包含する。好ましくは、例えばBGは、負に荷電された基及び/又はバルキング基である。さらに例証すると、BGは任意には、例えばCN、NO2、N3、ハロ基、エーテル基、アルデヒド基、カルボン酸基、エステル基、アミノ基、OCH3、OCH2COOH、O−シリルエーテル基、ケト基、O−ラクトン基、O−アルキル基、O−環状アルキル基、O−アルケニル基、O−アルキニル基、カルバメート基、イミド基、アミド基、及びそれらの組合せからから選択される。より特定には、BGは任意には、下記式（I）：
【００７１】
【化２】
【００７２】
を含んで成る。
【００７３】
他の好ましい態様においては、BGは、下記式（II）：
【化３】
【００７４】
［式中、Qは、O、 S又はNHであり；Xは、H、OH、CH3、BH3、F又はSeHであり；そして
Zは、O、S又はSeである］を含んで成る。さらに例証すると、BGは任意には、下記式（III）：
【００７５】
【化４】
【００７６】
［式中、Qは、O、S又はNHであり；Xは、O、S又はNHであり；Zは、O、S又はSeであり；そしてRは、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である］を含んで成る。もう１つの典型的な好ましい態様においては、BGは、下記式（IV）：
【００７７】
【化５】
【００７８】
［式中、Qは、O、S又はNHであり；Xは、O、S又はNHであり；Zは、O、S又はSeであり；Lは、L is -CONH(CH2)nNH-、-CO(CH2)nNH-又は-CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-であり；nは、0以上の整数であり；そしてRは、NH2、SH、COOH、消光剤成分、レポーター成分、ビオチン又は親和性成分である］を含んで成る。
【００７９】
使用される典型的な2’−ターミネーターヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシド及び2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−二リン酸ヌクレオシドを包含する。2’−ターミネーター可逆的ブロッキング成分は、例えばアメリカ特許公開番号2007/0219361号及び2007/0154914号に詳細に記載される。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは任意には、本明細書に記載のような、天然に存在しないヌクレオチド主鎖連鎖、ヌクレオチド塩基及びヌクレオチド塩基類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、それらの十分な長さにわたって一本鎖である。ポリヌクレオチドは、しばしば、いずれかのラベル、例えば結合された蛍光発色団、放射性同位体、酵素又は他の識別体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、単離され、合成された又は組換え体であり得る。5’及び3’部分を含むポリヌクレオチドは、いずれの長さでもあり得、そして一般的に約200個のヌクレオチド、又はそれよりも少ない、例えば約150、125、100、75、50又は25個、又はそれよりも少ない長さのヌクレオチドである。
【００８１】
３．検出方法：
ａ．標的核酸と本発明のポリヌクレオチドとの接触
検出方法を実施する最初の段階は、標的核酸と、本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド組、ヌクレオチド組込み生触媒成分との接触を包含する。
【００８２】
ｉ. ヌクレオチド組
本発明の方法に使用されるヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基（例えば、A, U, G又はC、又はもう１つのリボヌクレオチド、rNTP）の形で少なくとも１つの塩基を含む。いくつかの態様においては、ヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基の形で少なくとも２個の塩基を含む。リボヌクレオチド塩基として含まれる１又は複数の塩基は、ヌクレオチド組においてリボヌクレオチド塩基として、完全に（例えば、100％リボヌクレオチド）、又は一部（例えば、100％以下のリボヌクレオチド）、又は一部（例えば、100％以下のポリヌクレオチド、ここで塩基の残りはデオキシヌクレオチド又はdNTP）、含まれ得る。
【００８３】
好ましい態様においては、１又は複数のヌクレオチド塩基は、リボヌクレオチド（rNTP）として、大部分、すなわち50％以上、例えば60%、70%、80%、85%、90%、95%、及びデオキシリボヌクレオチド(rNTP)として、少数部分（すなわち、50％以下）、存在する。特に好ましい態様においては、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の少なくとも80％が、リボヌクレオチドの形で存在する。１又は複数のリボヌクレオチドが、完全なヌクレオチド組（A, T, C及びGヌクレオチドが存在する）を仕上げるためにデオキシリボヌクレオチドと共に包まれる。
【００８４】
ii. 生触媒成分
本発明に使用されるヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を含んで成る。好ましい態様においては、同じ触媒ドメインが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を触媒することができる。他の好ましい態様においては、生触媒成分は少なくとも２種の触媒ドメインを含んでなり、その１つはデオキシリボヌクレオチド組込み活性を有し、他の１つはリボヌクレオチド組込み活性を有する。
【００８５】
本発明の方法への使用のために適切な例示される生触媒成分は、修飾されたZ05, CS5, CS6又はTaqポリメラーゼであるポリメラーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。CS5及びCS6キメラポリメラーゼはさらに、例えばアメリカ特許出願公開番号2004/0005599号にも記載される。サーマス種Z05は、PCT国際特許公開番号WO92/06200号において公開されている。
【００８６】
典型的な修飾された酵素は、例えばG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A T606S D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、E615G Taq DNA ポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。それらの修飾された酵素は、リボヌクレオチドの組込みを増強し、そしてリボヌクレオチドの2’−修飾された類似体の組込みを増強し、そして/又は１又は複数のそれらの突然変異を欠いている酵素に関して、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を低めるか又は排除する突然変異を含んで成る。
【００８７】
有用なヌクレオチド組込み生触媒に関する追加の詳細は、アメリカ特許出願番号11/873,896号、及びアメリカ特許第5,939,292号; アメリカ特許第4,889,818号; アメリカ特許第5,374,553号;アメリカ特許第5,420,029号; アメリカ特許第5,455,170号; アメリカ特許第5,466,591号; アメリカ特許第5,618,711号; アメリカ特許第5,624,833号; アメリカ特許第5,674,738号; アメリカ特許第5,789,224号; アメリカ特許第5,795,762号; アメリカ特許第7,148,049号及びアメリカ特許第7,179,590号にも提供される。
【００８８】
リボヌクレオチド及び2’−ターミネーターヌクレオチド又は他の所望する性質を組込むための増強された効率を有する修飾された酵素の生成は、種々の方法、例えば特定の部位の突然変異誘発、化学的修飾、等により達成される。この技法は、所望する突然変異を表す制限されたミスマッチを除いて、突然変異誘発される一本鎖ファージDNAに対して相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ得る。
【００８９】
手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチドが、プラスミド又はファージに対して相補的な鎖の合成を方向づけるためのプライマーとして使用され、そして得られる二本鎖DNAにより、ファージ支持された宿主細菌が形質転換される。得られる細菌は例えば、所望する突然変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラークを同定するために、DNA配列分析又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイされ得る。さらに例証すると、核酸を修飾するためへの多くの他のアプローチ、例えば“組換えDCR”方法がまた、使用され得る。
【００９０】
本発明の観点の実施（例えば、修飾された酵素の生成、配列決定の実施、等）においては、分子生物学及び組換えDNAにおける多くの従来の技法が任意には使用される。それらの技法はよく知られており、そして例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 1997-2007 (F. M. Ausubel ed.), Wiley Interscience; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれWu and Grossman, and Wu, eds.,)において説明されている。
【００９１】
iii. ポリヌクレオチド：
前記方法に使用される5’−末端化されたポリヌクレオチドは、上記及び以下に記載されている。好ましい態様においては、標的核酸においては、多くの（例えば、複数の）5’−末端化されたポリヌクレオチドと接触される。他の好ましい態様においては、多数中の個々のポリヌクレオチドは、ユニーク質量の１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成る5’部分を有することにより別々に同定できる。この場合、個々の5’−末端化されたポリヌクレオチドのアンプリコン又は補体のフラグメント化が、異なった質量のシグナル又は特徴的質量プロフィールを生成する。さらなる好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、１又は複数のプライマー対として標的核酸に接触される。
【００９２】
プライマー対におけるポリヌクレオチドの１つ又は両者は、タンデム配列セグメントを含んで成る5’−末端を含むことができる。１又は複数のプライマー対として標的核酸と接触する多ポリヌクレオチドがまた供給され得、ここで対における個々のプライマーは、同一質量のタンデム配列セグメントを含んで成る5’部分を含んで成る。この場合、アンプリコンを生成するために使用される対における個々のプライマーの5’部分の補体のフラグメント化は、より高い（例えば、約２倍）強度の単一質量シグナル化を生成する。他方では、プライマー対における個々のプライマーは、１つの配列セグメントを含むことができ、ここで前記対中の個々のプライマーにおける配列セグメントは同一の質量のものである。
【００９３】
本発明の好ましい態様においては、5’末端化されたポリヌクレオチドは、検出できる分解生成物を生成するために明確な質量の１つの配列セグメントを含んで成ることができる。
【００９４】
iv. 標的核酸：
標的核酸は、いずれかの源、例えば動物又は植物からの組織サンプル、細菌又はウィルスからであり得るか、又は例えば反応混合物から合成され得る。標的核酸は例えば、ゲノムDNA、染色体又は染色セグメント、mRNA、cDNA、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸DNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、等であり得る。標的核酸は例えば一本鎖、二本鎖、等であり得、そしていずれかの特定の長さに制限されない。本発明の方法に使用される標的核酸は、１又は複数の単一ヌクレオチド多形現象（SNP）、挿入、欠失、置換又は他の区別する特徴を含むであろう。標的核酸は一般的に、サンプルで供給される。
【００９５】
好ましい態様においては、標的核酸は、１又は複数のSNPを識別するために接触される（すなわち、方法が行われる）。そのような用途においては、少なくとも２種の異なった対立遺伝子−識別の5’末端化されたポリヌクレオチドは、それらが特定の対立遺伝子に対して特異的にアニーリングするよう、それらの3’部分において異なり、そして１又は複数の配列セグメントが、3’部分により結合される対立遺伝子に対応し、そしてそれを特異的に同定する質量のものであるよう、それらの5’部分において異なるそれらのポリヌクレオチドが使用される。
【００９６】
他の好ましい態様においては、標的核酸は、標的核酸における１又は複数のまれな突然変異を検出するために接触される。そのような用途においては、標的核酸における特定の位置での突然変異に対して特異的にアニーリングする3’部分を有する１又は複数のポリヌクレオチドが存在する（同じ位置で野生型に対して特異的にアニーリングする3’部分を有するポリヌクレオチド）。
【００９７】
標的核酸配列における１つの突然変異が評価される場合、１，２又はそれ以上の異なった突然変異−識別の5’末端化されたポリヌクレオチドが野生型又は１又は複数の突然変異型を特異的にアニーリングするよう、それらの3’部分において異なり、そして１又は複数の配列セグメントが、その3’部分により結合される対立遺伝子に対応し、そしてそれを特異的に同定する質量のものであるよう、それらの5’部分においても異なるそれらのポリヌクレオチドが使用され得る。１つの標的核酸における複数の突然変異が評価される用途においては、標的核酸における第１位置での突然変異を特異的に検出する3’部分を有するポリヌクレオチドは、すべて第１質量の5’部分配列セグメントを有することができ；標的核酸における第２位置での突然変異を特異的に検出する3’部分を有するポリヌクレオチドは、すべて第２質量の5’部分配列セグメントを有することができる。他方では、ポリヌクレオチドの5’部分における配列セグメントの質量はそれぞれ異なり、独得の識別体として作用する。
【００９８】
さらなる好ましい態様、例えば多重増幅又は延長を包含するそれらの態様においては、ポリヌクレオチドは、複数のプライマー対として提供される。第１プライマー対においては、前記対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は、第１質量とは検出可能的に異なる、第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能的に異なる、第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対は、すべての先行する又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。プライマー対及び増幅又は延長反応の数は、反応混合物における遊離ヌクレオチド塩基の利用可能性により制限される。いくつかの好ましい態様においては、反応混合物は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、又はそれ以上のプライマー対を含むことができる。この方法は、複数の標的核酸、又は単一の標的核酸における複数の標的物の同時検出を可能にする。
【００９９】
ｂ．アンプリコンを生成するためへの標的核酸の増幅：
ｉ．増幅方法：
標的核酸は、当業界において知られているいずれかのポリヌクレオチド延長又は増幅方法を用いて、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドにより増幅され得る。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）、例えばRT-PCR、定量的PCR、多重化された及び同時PCRのいずれかの既知変法を用いての増幅が本発明の方法に使用され得る。
【０１００】
増幅はまた、当業界において知られている等温増幅方法及びポリヌクレオチド延長方法も包含する。PCRを実施するためのプロトコールは、当業界において良く知られており、そして例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., 2003, Cold Spring Harbor Laboratory Press; A-Z of Quantitative PCR, Bustin, ed., 2004, International University Line; Edwards, Real-Time PCR: An Essential Guide, 2004, Taylor & Francis; Real Time PCR, Dorak, ed., 2006, Taylor & Francis; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., eds., 1990, Academic Press, San Diego; PCR Strategies, Innis, et al., eds, 1995, Academic Press, San Diego; and PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Innis, et al., eds., 1999, Academic Press, San Diegoに記載されている。標的核酸は、検出できる量のアンプリコンを生成するために十分な時間、又は十分な数の循環、増幅されるか又は延長される。
【０１０１】
上記に論じられたように、１又は複数の標的核酸が増幅され得るか、又は単一核酸における１又は複数の標的位置が増幅され得る。識別できる質量の配列セグメントを有する異なった5’部分の数には実質的に制限は存在しないので、前記方法は特に、多重増幅アッセイに対して適合される。標的核酸、又は標的核酸内の特定の位置を増幅するために使用される１又は複数のポリヌクレオチドは、特異的に同定できる質量の配列セグメントを有する異なった5’部分を有することができる。プライマー対として使用されるポリヌクレオチド対は、同一質量の配列セグメントを有する5’部分を有することができる。特定の態様においては、配列セグメントは、同一配列を共有する。多重増幅アッセイは、所望には、少なくとも5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、又はそれ以上の異なった標的核酸、又は標的核酸内の位置の存在を同時に決定することができる。
【０１０２】
本発明の増幅及びポリヌクレオチド延長反応は、延長される（例えば“リボ−PCR”、又は“リボ−増幅”又は“リボ−延長”）、核酸鎖中へのリボヌクレオチドの組込みのための酵素活性を含んで成る生触媒単位（例えば、ポリメラーゼ）を使用する。リボヌクレオチド組込み活性を有する例示される生触媒単位は、Roche Molecular Systemsから入手でき、そして例えばMauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 35(8):e62 and Mauger, et al., Nucleic Acids Research (2006) 34(3):e18に記載される、G46E CS6R DNAポリメラーゼ及びKB17 DNAポリメラーゼを包含する。使用される追加の生触媒成分が上記に論じられる。また、アメリカ特許第5,934,292号も参照のこと。
【０１０３】
ii. 生成されるアンプリコン：
標的核酸配列の増幅は、二本鎖アンプリコンを生成し、ここでポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的なアンプリコンの鎖は、１又は複数の配列セグメントを含む3’部分を含んで成り、ここで前記配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基は組込まれたリボヌクレオチド一リン酸（rNMP）を含む。
【０１０４】
ｃ．アンプリコンの分解：
アンプリコンの配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、分解され得る。本発明の好ましい態様においては、アンプリコンは、アルカリ（すなわち、塩基性溶液）にアンプリコンをゆだねることにより、組込まれたNMPの3’側結合で分解される。アンプリコンは好ましくは、組込まれたNMPの3’側結合の分解をもたらすのに十分な時間及び温度で、分解のためのアルカリ溶液に暴露される。一般的に、温度が高いほど、アルカリ処理のために必要な時間は短い。
【０１０５】
例えば分解又はフラグメント化段階は、70℃で約1.5時間、又は約55℃で約８時間（すなわち、一晩）、実施され得る。アルカリ処理温度は、冷蔵温度ほど低く（例えば、4℃）、そしてほぼ沸点温度ほど高い（例えば、約95℃）。好ましい態様においては、アルカリ溶液は、約8.5以上のpH、例えば少なくとも9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0又はそれ以上のpHを有するいずれかの溶液であり得る。いくつかの態様においては、アルカリ溶液は、少なくとも約0.2M、0.3M、0.5M、0.8M、1.0M又はそれ以上の塩基性化合物を含むであろう。
【０１０６】
アルカリ溶液が一般的に含まれる場合、弱塩基が使用される。一般的に、アルカリ溶液は、約5.0又はそれ以下のpKb, 例えば約4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5又はそれ以下のpKbを有する、少なくとも１つの塩基性化合物を含むであろう。組込まれたNMPの3’側結合でのアンプリコンのフラグメント化に使用するための例示される塩基性化合物は例えば、NaOH、KOH、RbOH及びNH4OH、好ましくはNaOH、KOH又はNH4OHを包含する。他の塩基又は塩基性化合物がまた使用される。アルカリ処理の方法については、例えばMauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 35(8):e62 and Mauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 34(3):e18を参照のこと。
【０１０７】
ｄ．アンプリコンフラグメントの検出：
アンプリコンフラグメント、又は分離され、そして開放される配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて検出され得る。好ましい態様においては、分解されたフラグメントは、質量の同定により検出される。配列セグメントはまた、分解の前又は後、例えば蛍光発光団又は放射性同位体により、検出可能的にラベルされ得る。フラグメントは、5’又は3’末端で、又はいずれかのヌクレオチド塩基上で十分にラベルされ得る。例示される検出方法は、質量分光学、電気泳動分離、時間決定された蛍光検出、回転共鳴検出、及び固相（例えば、アレイ）へのハイブリダイゼーション、及び続く検出を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０８】
好ましい態様においては、アンプリコンから放される分解された配列セグメントは、質量分光法を用いて検出される。質量分光方法は当業界において知られている。いずれかの質量分光技法、例えばレーザー脱離−イオン化質量分光法（例えば、マトリックス助力のレーザー脱離−イオン化質量分光法（MALDI）及び表面増強されたレーザー脱離−イオン化質量分光法（SELDI））、気相イオン分光法、ガスクロマトグラフィー質量分光法、ダンデム質量分光法及び他の質量分光技法が使用されるであろう。質量分光法は、当業界において良く知られており、そして例えばGross, Mass Spectrometry: A Textbook, 2006, Springer Verlag; and Dass, Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry, 2007, Wiley Interscienceに記載されている。
【０１０９】
検出されるアンプリコンフラグメントは、ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的であるか、又は5’部分から増幅されるアンプリコンからの分解された配列セグメントであり得る。もちろん、好ましくは、分解できる配列セグメントは、アンプリコンの長さを通して創造され得る。アルカリ条件下で、リボヌクレオチドが組込まれたすぐ3’側の結合が分解を受けやすい。好ましい態様においては、アンプリコンフラグメントは、増幅された標的核酸から（例えば、ポリヌクレオチドの3’部分に対して相補的な配列セグメントから）、検出され得る。所望には、ポリヌクレオチドの5’部分及び/又は3’部分からの分解された配列セグメント又はその補体が検出され得る。検出されたアンプリコンフラグメントからのシグナルは、同定される標的核酸を示すピークの特徴を生成する。
【０１１０】
４．反応混合物：
本発明はまた、本発明の方法に包含される反応混合物も供給する。上記のいずれかの反応混合物が生成され得る。典型的な反応混合物は例えば、１，２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る１又は複数の本発明のポリヌクレオチド；dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも１つの塩基の大部分はポリヌクレオチドであり；及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を含んで成る。いくつかの態様においては、反応混合物は１又は複数の標的核酸配列を含んで成る。
【０１１１】
本発明の反応混合物はまた、本発明の方法により生成されたアンプリコンを含んで成り、前記アンプリコンは本発明のポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な配列セグメントを有する3’部分を含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオシド一リン酸（NMP）である。本発明の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドに同一の5’部分を含んで成るアンプリコンを含んで成る。反応混合物における多くのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド対で、例えばプライマー対として供給され、ここで個々のポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドは好ましくは、等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る。反応混合物における成分の態様は、上記及び本明細書に記載の通りである。
【０１１２】
好ましい態様においては、反応混合物は複数のプライマー対を含んで成る。第１プライマー対においては、対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は第１質量とは検出可能的に異なる第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能的に異なる第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対はすべての前述の又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。特に好ましい態様においては、反応混合物は、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20又はそれ以上のプライマー対を含む。
【０１１３】
他の好ましい態様におては、反応混合物は、非従来の又は天然に存在しないヌクレオチド塩基又はラベルされたヌクレオチド塩基を含んで成るヌクレオチド組、及び蛍光発光団又は放射性同位体を含んで成る。反応混合物はまた、必要なら、緩衝成分及び塩を含む。さらなる好ましい態様においては、反応混合物は、上記のように、アルカリ成分、例えばNaOH又はKOHを含んで成る。本明細書に記載される方法によれば、高濃度（例えば、約0.1M−0.2M、又はそれよりも高い）のアルカリ成分を含む反応混合物は典型的には、増幅をすでに受けている。
【０１１４】
好ましくは、反応混合物は、本明細書に記載のように、本発明の方法により生成されるアンプリコン、及びアルカリ成分を含んで成る。
【０１１５】
５．キット：
本発明はまた、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。典型的には、キットは、容易な使用のために区画に分けられ、そして本発明を実施するための成分、例えば１，２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る本発明の１又は複数のポリヌクレオチド；dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも１つの塩基の大部分はリボヌクレオチドであり；及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を供給する容器を含む。
【０１１６】
好ましい態様においては、キットは、１又は複数の標的核酸配列、例えば制御核酸配列（正及び/又は負の制御のための）を含んで成る。キットは、別々の制御反応を実施するための試薬、例えば制御ポリヌクレオチド及び制御標的核酸配列を供給することができる。キットにおける多くのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド対で、例えばプライマー対として供給され得る。キットにおける成分の態様は、上記及び本明細書に記載される。
【０１１７】
好ましい態様においては、キットは複数のプライマー対を含んで成る。第１プライマー対においては、対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は第１質量とは検出可能に異なる第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能に異なる第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対は、すべての前述の又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。特に好ましい態様においては、キットは、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20又はそれ以上のプライマー対を含むことができる。
【０１１８】
追加の試薬を供給する１又は複数の追加の容器がまた包含され得る。そのような追加の容器は、上記方法に従ってのプライマー延長又は増幅方法への使用のために当業者により認識されるいずれかの試薬又は他の要素、例えば核酸増幅方法（例えば、PCR、RT−PCR）、DNA配列決定方法、又はDNAラベリング方法への使用のための試薬を含むことができる。他の非相互的に独占的な変法においては、キットは、遊離ヌクレオチド（従来の及び/又は非従来の）を供給する１又は複数の容器を含む。特定の態様においては、キットはα−ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP及び/又はラベルされたdNTP, 例えばフルオレセイン−又はシアニン−色素ファミリーdNTPを含む。さらに他の非相互的に独占的な態様においては、キットは、プライマー延長反応のために適切な緩衝液を供給する１又は複数の容器を含む。好ましい態様においては、キットは上記のようなアルカリ成分、例えばNaOH又はKOHを含んで成る。
【０１１９】
６．アンプリコン：
本発明はまた、本発明の方法により生成されるアンプリコンを供給する。PCRアンプリコンは通常、二本鎖であり、そして本発明のポリヌクレオチドに対して相補的である鎖を含んで成る。アンプリコンは、本発明のポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成り、ここでアンプリコンの3’配列セグメントは少なくとも１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成り、ここで配列セグメントの3’末端ヌクレオチドは、アンプリコンを生成するために使用されるヌクレオチド組においてNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）である。
【０１２０】
７．システム：
本発明はさらに、本発明の方法を自動化するためのシステムを供給する。システムは、ポリヌクレオチド又はアンプリコン又は本発明の反応混合物を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体；ポリヌクレオチド又はアンプリコンを含んで成る組成物と、１つの又はいくつかの温度で熱的に通じるよう形状化された熱モジュレーター（例えば、核酸熱循環機械；インキュベーター）；試薬を容器又は支持体に又はそれらから移行する少なくとも１つの試薬移行機会；及びフラグメント化された配列セグメントの質量を検出するために形状化された少なくとも１つの検出器（例えば、質量分光計、蛍光計）を含んで成る。好ましい態様においては、システムは、熱モジュレーター、試薬移行機械及び質量を検出するための形状化された検出器の少なくとも１つの操作可能的に通じる少なくとも制御器を含んで成る。
【実施例】
【０１２１】
次の例は、本発明を例示するために提供されるが、但し本発明を制限するものではない。
例１．高処理量SNP遺伝子型決定のためのフラッグ−標識：
ヒトH19遺伝子におけるSNPを含むアンプリコンを、分析のために調製した。標的配列は、gtgaggagtgtggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc（配列番号11）（小文字はプライマーにアニーリングする配列を示し、“ｙ”はSNP位置C又はTを示す）であった。PCRを、20μlの合計体積で実施し、そして2μlは10ng/mlに希釈されたゲノムDNAサンプルからであった。
【０１２２】
PCR増幅は次の成分を含んだ：50 mMのトリシン pH 7.5、100 mMの KOAc、 2.75 mMの Mg(OAc)2、及び1.6% 貯蔵緩衝液（50% v/v グリセロール、100 mMの KCl、0.1 mMの EDTA、20 mM のトリス pH 8.0、1 mM のDTT及び0.5% Tween 20を含む）。また、0.2 mMの個々の5-メチル-dCTP及びdGTP、0.4 mM のdUTP、0.18 mMの rATP、0.02 mMの dATP, 及び0.1 mM のピロリン酸もPCRに含まれた。ヌクレオチド塩基混合物は、90％rATP及び10％dATPを含んだ。PCR増幅に使用される酵素は、0.02 U/μlウラシル-DNAグリコシラーゼ (UNG) 及び20 nM のGLTDSE DNA ポリメラーゼであった。
【０１２３】
例えば、PCT公開番号WO 2008/046612号及びWO 2009/010251号を参照のこと。高濃度酵素ストック（それぞれ、8U/μl及び５μM）を用いて、グリセロール及びTweenのキャリーオーバーを最少にした。プライマーを添加し、それぞれ0.2μMにした。すべての反応に共通する１つのプライマーは、配列5′-GCTGATGTCGCCCTGTC-2’-PO4-U-3′（配列番号12）を有した。SNP−疑問プライマーは、H19C対立遺伝子（図２を参照のこと）を検出するための5′-CCTAAGACTAAGACTAAGACTCGTGAGGAGTGTGGAGTAGG-2’-PO4-C-3′（配列番号13）、又はH19T対立遺伝子（図３を参照のこと）を検出するための5′-CCTAGAGCTAGAGCTAGAGCTCGTGAGGAGTGTGGAGTAGG-2’-PO4-U-3′（配列番号14）、又は２種の50/50混合物のいずれかであった。
【０１２４】
標的配列に対応するプライマーの部分は下線が引かれている。それらのプライマーは、それらの5’末端で、H19C対立遺伝子を検出するためのプライマーにおいてT残基：（３×TAAGAC＝配列番号15）、又はH19T対立遺伝子（単一のヘキサマーはプライマー配列において太字で書かれている）を検出するためのプライマーにおいて（３×TAGAGC＝配列番号16）を端に有する異なった反復性ヘキサマーを含む。その反復性ヘキサマーは、ゲノム標的物に対して相補的ではないが、しかしアンプリコン中に組込まれる場合、塩基消化の後、ヘキサマー“フラッグ−標識の開放をもたらす。
【０１２５】
熱循環条件は次の通りであった：50℃で10分（UNG殺菌）；95℃で１分（UNG変性）；次に92℃で15秒（変性）〜60℃で２分（アニーリング/延長）の99サイクル。これに続いて、60℃で５分、維持された。熱循環は、ABI9800において行われた。
６種の異なったゲノムDNAサンプルを、すべての３種のプライマー対に対して、２重反復して試験した。さらに、４個の“鋳型なし”対象が個々のプライマー対のために試験された。
【０１２６】
熱循環に続いて、複製反応をプールした。塩基を添加し、そしてアンプリコンを熱処理した。サンプルを脱塩するために、キレート化剤を添加し、そしてその溶液を遠心分離した。上清液をマトリックスに適用し、そして質量分光計により分析した。データを分析し、フラッグ配列の出現を示すことにより、SNP位置での６個のサンプルの個々の遺伝子型を決定した。その結果は図２、３及び４に示されている。
【０１２７】
例２．感染剤についての高処理量スクリーニングのためのフラッグ標識：
感染剤スクリーニングへのフラッグ−標識技法の適用を、HIV由来の配列をコードするRNA転写体を用いて試験した。それらの実験についての転写体を、HIV株HXB２からのgag領域の発現ベクター中へのクローニングにより生成した。線状化の後、転写体を、T7 RNAポリメラーゼを用いて製造した。次に、転写体を、ポリ−dTカラム上で精製した。標的配列は、catgcagggcctattgcaccaGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGaagtgacatagcaggaactactagtacccttcagga（配列番号17）（プライマー配列は小文字下にある）であった。
【０１２８】
この転写体を用いてRT−PCRを、反応当たり50μlの合計体積を用いて、二重反復して実施した。反応を、反応当たり転写体の106個のコピーを用いて及びそれらを用いないで実施した。反応は、次の成分を含んだ：100 mM のトリシン pH 7.3、120 mMの KOAc、1 mM のMn(OAc)2、0.2 mMの dGTP、0.4 mMの dUTP、rATP 及びdATPの混合物（ その合計が80% 又は90% のrATPのいずれかと共に0.2 mMであるような）、0.2 mMの dCTP 又は0.2 mM の5-メチル-dCTPのいずれか、及び0.15 mMのピロリン酸。この反応に使用される酵素は、0.02 U/μl のUNG及び25 nM のGLDSE DNAポリメラーゼであった。PCT公開番号WO2008/046612号を参照のこと。高濃度酵素ストック（それぞれ、２U/μl及び2.5μM）を用いて、グリセロール及びTweenのキャリーオーバーを最少にした。プライマーを添加し、それぞれ0.1μMした。上流のプライマーは、配列5′-ATAGGTAGGTAGGTAGGTCATGCAGGGCCTATTGCACC-2’-PO4-A-3′（配列番号18）を有した。
【０１２９】
下流のプライマーは、配列5′-ATCACTCACTCACTCACTCCTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACT-2’-PO4-U-3′（配列番号19）を有した。標的配列にアニーリングするプライマーの部分は下線が引かれている。それらのプライマーは、それらの5’末端で、T残基：TCAC及びTACG（単一テトラマーは、プライマー配列において大文字で示されている）を端に有する異なった反復テトラマーを含む。その反復テトラマーは、転写体標的物に対して相補的ではないが、しかしアンプリコン中に組込まれる場合、塩基消化の後、テトラマー“フラッグ−標識の”の開放をもたらす。しかしながら、例１に示されるように、アンプリコンを検出するために両プライマーを標識する必要はない。５−メチル−dCTPの使用は、C及びU残基含有標識間に大きな質量差異を提供する。dCTP及びdUTPはわずか1amu異なるので、質量に基づいてそれらの間を区別することは困難である。対照的に、dUTP及び５−メチルdCTPは、質量の決定により容易に区別できる（すなわち、1amu以上、異なる）。
【０１３０】
熱循環条件は次の通りであった：50℃で２分（UNG殺菌）；60℃で60分（逆転写段階）；93℃で１分（UNG変性）；次に、92℃で15秒（変性）〜60℃で４分（アニーリング/延長）の60サイクル。熱循環は、ABI9700において行われた。
【０１３１】
アンプリコンを、80％又は90％のいずれかのrATP及びdCTP又は５−メチル−dCTPを含む反応から生成した。それらの４種の条件に関する負の鋳型反応をまた、実施した。すべての８種の条件について二重反復反応をプールし、そして分析のために調製した。塩基を添加し、そしてアンプリコンを加熱処理した。サンプルを脱塩するために、キレート化剤を添加し、そしてその溶液を遠心分離した。上清液をマトリックスに適用し、そして質量分光計により分析した。転写体を含むすべてのサンプルに関して、予測される標識配列を質量分光法により同定したが、しかし鋳型を含まない対照サンプルにおいて同定しなかった。その結果は、図５、６及び７に示される。
【０１３２】
例３．NOS1_361におけるSNP RのA/G対立遺伝子の検出：
対立遺伝子−特異的PCR：
1ng/μlのヒトゲノムDNA20μl、0.4 μMの個々のプライマー(表1)、0.15 mMのピロリン酸ナトリウム、100 mM のトリシン/KOH pH 7.3、100 mMの KCOO pH 7.5、3 mMの Mg(COO)2、0.2 mMの個々の ( rATP、dCTP、dGTP及びdTTP) 及び0.25 U/μl FP-1 DNAポリメラーゼ (すなわち、GLTDSE DNA ポリメラーゼ)におけるリボ−PCR増幅。PCRについての熱循環プロフィールは、92℃で４分、続いて92℃で15秒、63℃で４分（60サイクル）であった。これは常に4℃で行われた。5μlのPCRを、2％のアガロースゲノム中に配置し、PCRを調節した。
【０１３３】
表１は、この例に使用されるプライマーの配列を供給する。記号＊は、2’−PO4含有残基を示す。記号（C）は、2’OMeシチジン塩基を示す。下線の配列は、プライマーのフラッグ部分を現し、そして単一のヘプタマーは、プライマー配列において太字で示される。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
アルカリ分解：
アルカリ分解（表２）に関しては、5.0μlの1.2M水酸化ナトリウムを、残存する15μlの増反応に添加し、0.3Mの最終濃度にし、そして70℃で1.5時間インキュベートした。
表２は、NOS1_361のATPリボ-PCRの分解のフラグメントの予測される質量を示す。下線の配列は、プライマーのフラッグ部分を表わし、そして単一のヘプタマーは、プライマー配列において太字で示される。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
精製：
サンプルを、H+により荷電されカチオン交換樹脂の添加により脱塩した。6mgの樹脂を、MassArray（商標） Clean Resin Tool Kitと共に反応添加し、そして室温で20分間、撹拌下でインキュベートした。その後、サンプルを、134xgで２分間、遠心分離し、樹脂を沈殿した。
【０１３８】
MALDI−TOF MS：
トリヒドロキシアセトフェノン（THAP）をマトリックスとして使用した。調製のために、水中、50％アセトニトリル及び0.3Mのクエン酸アンモニウム溶液（6/3/2(v/v)）中、0.2Mの２，４，６−及び２，３，４−THAP 0.5μlを、MALDI標的物プレート（400 μmのスポットサイズを有するAnchorChipTM Target、Bruker Daltonik GmbH、Bremen、Germany）の固定位置上に沈着した。その後、0.5μlの上清液を添加し、そして室温で乾燥した。
【０１３９】
標的物を、分析のためにMALDI-TOF質量分光計 (Autoflex, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)中に導入した。質量分光法分析（図８）を、線状での100nsのパルスされたイオン抽出遅延を用いて、20kVの加速電圧、及び外部基準目盛を伴って、負のイオンモードで実施した。得られる個々のスペクトルは、合計200のレーザーショットであった。
【０１４０】
本明細書に記載される例及び態様は単なる例示目的のためであって、種々の修飾又は変更が当業者に示され、そして本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出の分野に関する。特に、本発明は、個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じである、複数連続配列セグメントを有するポリヌクレオチド、及び標的核酸の検出へのそれらの使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出のための多くの方法（例えば、SNP遺伝子型決定）は知られている。SNP遺伝子型決定のための現在入手できる均質アッセイは、TAQMAN（商標）, AMPLIFLUOR（商標）, 色素結合、対立遺伝子選択の動的PCR、及びSCORPION（商標）プライマーアッセイを包含する。それらのアッセイは、反応ウェル当たり１個又は最大２個（４種の異なった蛍光色素を用いる場合）のSNPを提供する（例えば、色素−結合動的PCRは１つのSNPのために２個のウェルを必要とする）。SNP遺伝子型決定のための利用できる方法は、反応ウェルにおける単一のSNPの遺伝子型決定を可能にする方法から単一ウェルにおける数千のSNPの遺伝子型決定を可能にする方法（例えば、GOLDEN GATE（商標）−Assay, Illumina）まで及ぶ。
【０００３】
現在の遺伝子型決定アッセイ方法は、個々の分類された対立遺伝子についての異なった色素について必要条件のために容易に多重化できず、そして従って、改良のためのその可能性において制限される。GOLDEN GATE（商標）アッセイは、複雑な分折装置、例えばファイバーオプチックアレイリーダーを必要とする。SNP遺伝子型決定の読み取りのための分析器は、プレートリーダー（任意には、包含されるPCR機械と共に）から、シーケンサー（例えば、毛細管シーケンサー）、アレイリーダー及び質量分光計まで及ぶ。さらに、質量分光計が遺伝子型決定のために使用されて来た程度には、現在利用できる方法は、真の多重化を可能にしない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、１又は複数の標的核酸の効果的で且つ高い感度の同時検出のためのポリヌクレオチドを提供する。配列セグメント又はその補体の質量が標的核酸又は標的核酸内の標的ヌクレオチドを同定するよう、１，２又はそれ以上の連続配列セグメントを含んで成る5’部分を有するポリヌクレオチドが企画される。いくつかの態様においては、配列セグメントは等質量のものである。等質量の配列セグメントは、同じ配列を有することができるが、但し必ずしも有する必要はない。配列セグメントは、ポリヌクレオチドの補体から分解され、そしてそれらの質量は標的核酸の存在、不在又は存在のレベルを同定するために測定されるか、又は検出される。
【０００５】
従って、第１の観点においては、本発明は、１，２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成るポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、ここで
ａ）5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして
ｂ）3’部分が少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは約75、50又は25個以下の長さのヌクレオチドである。
【０００６】
好ましい態様においては、個々の配列セグメントは、同じヌクレオチド配列を有する。
他の好ましい態様においては、5’部分は、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個の連続配列セグメントを含んで成る。いくつかの好ましい態様においては、個々の配列セグメントは、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個のヌクレオチドを含んで成る。
また好ましい態様においては、3’末端は、ポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるために除去できるブロッキング成分を含んで成る。特に好ましい態様においては、3’末端は2’ターミネーター成分を含んで成る。
【０００７】
さらなる観点においては、本発明は、標的核酸の検出方法を提供する。いくつかの態様においては、前記方法は：
（ａ）標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
（i）前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
（ii）前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；そして
（iii）前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り；
（ｂ）前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメント（すなわち、3’部分）を含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）であり；
（ｃ）個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し；そして
（ｄ）前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出すること、を含んで成る。
【０００８】
好ましい態様におては、5’部分の配列セグメントは、等質量のものである。
他の好ましい態様においては、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の少なくとも80％が、リボヌクレオチド（rNTP）の形で存在する。
さらなる好ましい態様においては、分解は、アンプリコンをアルカリ溶液にゆだねることにより実施される。
【０００９】
好ましい態様においては、アルカリ溶液は少なくとも１つの次のものを含んで成る：NaOH、KOH、RbOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2又はNH4OH。より好ましい態様においては、アルカリ溶液は少なくとも次のものを含んで成る：NaOH, KOH又はNH4OH。
また好ましい態様においては、さらに本発明の方法は、標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る。
【００１０】
さらに好ましい態様においては、前記方法はさらに、標的核酸と、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が前記標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す。
【００１１】
さらに好ましい態様においては、前記方法はさらに、標的核酸と、少なくとも２種の異なったポリヌクレオチドとを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの3’部分が3’末端ヌクレオチド塩基でのみ異なり、ここで個々のポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチド塩基がユニーク質量の配列セグメントに対応し、そして前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補対からの配列セグメントフラグメントの検出が標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す。
【００１２】
さらに好ましい態様においては、多くの異なった標的核酸配列が多くの異なったポリヌクレオチドと接触され、前記異なったポリヌクレオチドの個々はユニーク質量の配列セグメントを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの配列セグメントは前記多くの異なった標的核酸配列の１つの識別体であり、それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が多くの異なった標的核酸配列の少なくとも１つの存在し示す。
【００１３】
他の好ましい態様においては、ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成る単一触媒ドメインを含んで成る。ヌクレオチド組込み生触媒成分が第１及び第２触媒ドメインを含んで成ることが、本発明によれば、さらに好ましく、ここで前記第１触媒ドメインはデオキシリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り、そして第２触媒ドメインはリボヌクレオチド組込み活性を含んで成る。
【００１４】
好ましい態様においては、前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるブロッキング成分を含んで成り、そして前記方法がさらに、増幅の前、ポリヌクレオチドからのブロッキング成分を除去する段階を含んで成る。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、例えば上記本発明の検出方法を実施するための反応混合物を提供する。好ましい態様においては、反応混合物は、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
【００１６】
好ましい態様においては、反応混合物はさらに、少なくとも１つの標的核酸配列を含んで成る。
【００１７】
関連する観点においては、本発明はキットを提供する。好ましい態様においては、キットは、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
【００１８】
反応混合物及びキットの態様は、ポリヌクレオチド及び方法に関して上記に記載される通りである。本発明の好ましいキットは、例えば個々の5’部分配列セグメントが等質量のものであり、そしてポリヌクレオチドの5’部分配列セグメントが少なくとも３個の配列セグメント、より好ましくは少なくとも４個のヌクレオチド塩基、及び最も好ましくは、少なくとも７個のヌクレオチド塩基を含んで成る。キットの他の好ましい態様においては、3’末端は、ポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げる除去できるブロッキング成分を含んで成り、より好ましくは、ポリヌクレオチドの3’末端は2’−ターミネーター成分を含んで成る。
【００１９】
さらなる観点においては、本発明はアンプリコンを供給する。いくつかの態様においては、アンプリコンは、
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成り；及び
ｂ）前記第１鎖に対して相補的であり、そして１又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第２鎖（ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである）を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成る。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明はシステムを供給する。いくつかの態様においては、システムは、
ａ本発明のアンプリコンを含んで成る組成物；
ｂ）容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも１つの熱モジュレーター；
ｃ）前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも１つの試薬移行成分；及び
ｄ）前記容器において又は支持体上に生成される１又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも１つの検出器を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体を含んで成る。
好ましい態様においては、検出器は、気相イオン分光計を含んで成る。
【００２１】
好ましい態様においては、システムは、
−容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも１つの制御器を含んで成る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のポリヌクレオチド及び方法の略図を示す。この典型的な態様においては、ポリヌクレオチドは、3個の同一の配列セグメント（すなわち、“反復体”）を有する5’部分又は5’末端（5’-NTAATAATAAT-3’；配列番号１）を含む。ポリヌクレオチドは、標的核酸における多形ヌクレオチドを検出するために使用される。ヌクレオチド組は、個々の配列セグメントの5’末端位置に存在するヌクレオチドに対して相補的であるリボヌクレオチドの約50％〜100％（例えば、rATP＝Å）を含むことができる。リボヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに対して相補的であるアンプリコン鎖中に組込まれる。アンプリコンは、配列セグメントを開放するフラグメント化を受けやすい。次に、開放される配列セグメントの質量が検出される。リボヌクレオチドもまた、標的核酸
【００２３】
【化１】
【００２４】
の相補的鎖中に組込まれるであろう。従って、リボヌクレオチドが組込まれている、標的核酸の増幅された鎖もまた、分解を受けやすいであろう。
【００２５】
【図２】図２は、本明細書及び例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでC対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“GTCTTA”は、問題のプライマーにおける反復ヘキサマーの逆補体を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【図３】図３は、本明細書及び例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでT対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“GCTCTA”は、問題のプライマーにおける反復ヘキサマーの逆補体を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２６】
【図４】図４は、下記例１に記載される方法論を用いて、H19遺伝子内のSNPでC及びT対立遺伝子の好結果をもたらす遺伝子型決定を示す。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【図５】図５は、80％又は90％のリボヌクレオチド（ここで、rATP）及びデオキシリボヌクレオチドdU及びdCを用いてのHIV転写体の好結果をもたらす同定を示す。例２を参照のこと。“CCUA”は、上流のプライマーにおける反復テトラマーの逆補体核酸配列（４×CCUA＝配列番号６）を言及する。“GUGA”は、下流のプライマーにおける反復テトラマーの逆補体核酸配列（４×GUGA＝配列番号７）を言及する。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２７】
【図６】図６は、80％又は90％のリボヌクレオチド（ここで、rATP）及びデオキシリボヌクレオチドdU及び5-Me-dC(4 x CmeCmeUA =配列番号8; 4 x GUGA =配列番号7)を用いてのHIV転写体の好結果をもたらす同定を示す。シグナルは、鋳型なしではサンプルから得られなかった。例２を参照のこと。“ノイズ”とは、識別できるシグナルが検出されなかったことを示す。
【００２８】
【図７】図７は、図５及び６に示される試験サンプルからの結果を要約する（4 x CmeCmeUA =配列番号8; 4 x CCUA =配列番号6）。
【図８】図８は、NOS1_361のSNP RのATPリボ−PCRの７−マー領域の質量スペクトルを示す。A. ホモ接合体Aに対応する３種のフラグメントGTTTCTA (3 x GTTTCTA =配列番号9)。B. ヘテロ接合体AGに対応する３種のフラグメントGTTTCTA及びGTTTTTA (3 x GTTTTTA =配列番号10)。C. ホモ接合体Gに対応する3種のフラグメントGTTTTTA。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義：
用語“核酸”又は“ポリヌクレオチド”とは、リボース核酸（RNA）又はデオキシリボース核酸（DNA）ポリマーに対応され得るポリマー、又はその類似体に交換可能的に適用される。これは、ヌクレオチド、例えばRNA及びDNAのポリマー及びそれらの修飾された形、ペプチド核酸（PNA）、固定された核酸（LNATM）及び同様のものを包含する。ある態様においては、核酸は、複数のモノマータイプ、例えばRNA及びDNAサブユニットを含むポリマーであり得る。
【００３０】
核酸は、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のDNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、等であり得るか、又はそれらを包含することができる。核酸は、例えば一本鎖、二本鎖、三本鎖、等であり得、そしていずれかの特定の長さに制限されない。特にことわらない限り、特定の核酸配列は任意には、明確に示されるいずれかの配列の他に、相補的配列を含んで成るか、又はコードする。
【００３１】
核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列又は構造体、天然に存在する主鎖、及び/又は天然に存在するヌクレオチド関連鎖を有する分子に制限されない。例えば、１又は複数の炭素環式糖を含む核酸はまた、この定義内に含まれる（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp169-176）。さらに例証すると、核酸は一般的にホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合、他の主鎖を有する核酸類似体が包含される。
【００３２】
それらは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ホスホラミド（Beaucage など. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925) 及びそこにおける引例; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800; Sprinzl など. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger など. (1986)Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai など. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; 及び Pauwels など. (1986) ChemicaScripta 26: 1419）、ホスホロチオエート（Mag など. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1437; 及びアメリカ特許第5,644, 048号）、ホスホロジチオエート（Briu など. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 2321）、O−メチルホスホロアミジット連鎖（Eckstein,Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford University Press (1992)）、及びペプチド核酸主鎖及び連鎖（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Meier など. (1992) Chem. Int. Ed.Engl. 31: 1008 ; Nielsen (1993) Nature 365: 566; Carlsson など. (1996) Nature 380: 207）。
【００３３】
他の核酸類似体は、正に荷電された主鎖（Denpcy など. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性主鎖（アメリカ特許第5,386, 023号, 第5,637,684号, 第5,602, 240号,第5, 216,141号 及び第4,469, 863号; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger など. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook; Mesmaeker など. (1994)Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffsなど. (1994) J.Biomolecular NMR 34: 17; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)）、及び非−リボース主鎖を有するそれら、例えば引用により本明細書に組込まれる、アメリカ特許第5,235, 033号 及び第 5,034, 506号,及び Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cookに記載されるそれらを包含する。
【００３４】
いくつかの核酸類似体はまた、Rawls, C＆E News Jun.2, 1997, page35に記載される。リボース−リン酸主鎖のそれらの修飾は、追加の成分、例えばラベリング成分の付加を促進するために、又は生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を変更するために行われ得る。
【００３５】
核酸に典型的に見出されるそれらの天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）の他に、核酸類似体はまた、天然に存在しない複素環式又は他の修飾された塩基を有するそれらも包含する。さらに例証するために、溶融温度（Tm）調節体として作用するヌクレオチドに使用される一定の塩基が任意には包含される。例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ[３，４−d]ピリミジン、プロピニル−dN（例えば、プロピニル−dU、プロピニル−dC, 等）、及び同様のものを包含する。例えば、アメリカ特許第5,990,303号を参照のこと。
【００３６】
他の代表的な複素環式塩基は、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル及び同様のものを包含する。
【００３７】
多くの天然に存在しない塩基は又、例えばSeela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, and Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640にも記載される。修飾された塩基及びヌクレオチドの典型的な例はまた、例えばアメリカ特許第5,484,908号; 第5,645,985号; 第5,830,653号; 第6,639,059号; 第6,303,315号;及びアメリカ特許出願番号2003/0092905号にも記載される。
【００３８】
“ヌクレオチド”とは、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを言及する。例証すると、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖成分(例えば、5'位置、3’位置、2'位置、等)に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を含むことができる。
【００３９】
“ヌクレオチド組込み生触媒”とは、核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する触媒を言及する。ヌクレオチド組込み生触媒は典型的には酵素である。“酵素”は、他の化合物又は“基質”を含む化学反応の活性化エネルギーを低めるよう作用するタンパク質−及び/又は核酸−基材の触媒である。“ヌクレオチド組込み酵素“とは核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する酵素を言及する。典型的なヌクレオチド組込み酵素は例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、及び同様のものを包含する。他の生触媒はDNAに基づく(“DNAzymes”) 又はRNAに基づく(“リボザイム”) であり得る。
【００４０】
“熱安定性酵素”とは、熱に対して安定し、耐熱性であり、そして高温に選択された時間ゆだねられる場合、十分な触媒活性を保持する酵素を言及する。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる場合、プライマー延長反応をもたらすのに十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業者に良く知られており、そして1987年７月28日に発行された、“Process for amplifying nucleic acid sequences”と称するアメリカ特許第4,683,202号（Mullis）及び1987年７月28日に発行された、“Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences”と称するアメリカ特許第4,683,195号（Mullisなど）に例示されている。
【００４１】
本明細書において使用される場合、“熱安定性ポリメラーゼ”とは、温度周期反応、例えばPCR又は５‘-nヌクレアーゼ反応への使用のために適切である酸素を言及する。熱安定性ポリメラーゼに関しては、酵素活性は、鋳型核酸に対して相補的であるプライマー延長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチドの組合せの触媒を言及する。
【００４２】
典型的なヌクレオチド組込み生触媒は、次のものを包含する：例えば、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZO5R ポリメラーゼ、E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus ）ポリメラーゼ、TMA-25 ポリメラーゼ、E678G TMA-25 ポリメラーゼ、 TMA-30 ポリメラーゼ、E678G TMA-30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種SPS-17 ポリメラーゼ、E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZO5R ポリメラーゼ、T7 DNA ポリメラーゼ、コーンバーグ（Kornberg ）DNA ポリメラーゼ I、クレノウ DNA ポリメラーゼ、Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス（Micrococcal ）DNA ポリメラーゼ、αDNA ポリメラーゼ、逆転写酵素、AMV逆転写酵素、M-MuLV逆転写酵素、DNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼ、E.コリRNA ポリメラーゼ、SP6 RNA ポリメラーゼ、T3 RNA ポリメラーゼ、T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼ II、末端トランスフェラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボヌクレオチド類似体-組込みDNA ポリメラーゼ、リボヌクレオチド組込みDNA ポリメラーゼ、及び同様のもの。
【００４３】
用語“配列セグメント”とは、本発明のポリヌクレオチドの5’部分（すなわち、5’末端）のポリヌクレオチド副配列を言及する。5’部分は、１、２又はそれ以上の配列セグメントを含み、個々の配列セグメントは、１つのポリヌクレオチドの5’末端におけるすべての配列セグメントについて同じである、5’末端で位置するユニーク塩基を有する。配列セグメントは、約３〜10個又はそれ以上の長さの塩基、例えば約３〜８、３〜６、４〜６、４〜８又は７〜８個の長さの塩基を有することができ、そして5’部分は、２〜約10個又はそれ以上の配列セグメントを含むことができる。配列セグメントは、等質量のものであり得るが、但し必ずしも必要ではない。等質量の配列セグメントは、同一の配列を有することができるが、但し必ずしも必要ではない。同一の核酸配列を共有する5’末端における配列セグメントは、反復体である。
【００４４】
用語“5’末端”及び“3’末端”とは、5’−又は3’−末端（すなわち、5’−又は3’−末端塩基）で存在するポリヌクレオチド上のヌクレオチド位置、又は核酸又はその副配列の末端からの１又は２個のヌクレオチド塩基位置（すなわち、5’−又は3’−末端からの（−１）又は（−２）位置での）を、交換可能的に言及する。
【００４５】
用語“ブロッキング成分”又は“ブロッキング基”とは、例えば少なくとも１つのヌクレオチド組込み生触媒により、核酸の延長を妨げるポリヌクレオチドの3’末端に結合される化学基又は成分を言及する。例示されるブロッキング成分は、3’末端ヌクレオチド塩基の2’位置での置換基、すなわち2’−ターミネーターヌクレオチドを包含する。
【００４６】
“2’−ターミネーターヌクレオチド”とは、ヌクレオチドの糖成分の2’位置でブロッキング基（BG）を含んで成るヌクレオチド類似体を言及する。2’−ターミネーターヌクレオチドは、１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により非延長性であり得る。すなわち、2’−ターミネーターヌクレオチドが核酸（例えば、核酸の3’−末端で）中に組込まれると、ブロッキング基はさらに、少なくとも１つのヌクレオチド組込み生触媒による核酸のさらなる延長を妨げる。典型的なブロッキング基は、リン酸基である。典型的な2’−ターミネーターヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシド及び2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−二リン酸ヌクレオシドを包含する。2’−ターミネーターヌクレオチドは、例えばアメリカ特許公開番号2007/0219361号及び20070154914号に、詳細に記載されている。
【００４７】
用語“標的核酸”とは、検出されるべき副配列を含んで成るいずれかの核酸を言及する。標的核酸は、DNA又はRNAであり得る。標的核酸は、いずれかの源、例えばゲノムDNA、mRNA、cDNAからであり得る。標的核酸は、天然に存在する合成物（例えば、アンプリコン、ベクター、等）であり得る。標的核酸は、精製され得るか又は単離され得るが、但し必ずしも必要ではない。検出アッセイの性質に依存して、標的核酸は、植物又は動物組織からであり得るか、又は反応混合物から採取される。標的核酸は、本発明の方法による検出又は同定を受ける前、制限エンドヌクレアーゼに暴露され得るが、標的核酸の長さに対する制限は存在しない。本発明の方法のためには、標的核酸は、当業界において知られている方法を用いて調製される。
【００４８】
用語“増幅条件”とは、標的ヌクレオチドによる延長可能ポリヌクレオチド（例えば、プライマー）のハイブリダイゼーション、及び延長可能ポリヌクレオチドの鋳型依存性延長を可能にする増幅反応（例えば、PCR増幅、RT-PCR増幅）における条件を言及する。本明細書において使用される場合、“増幅条件”又は標的核酸を増幅するのに十分な条件は、当業界において良く知られている。例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, by Dieffenbach and Dveksler, eds., 2003, Cold Spring Harbor Press; and PCR Protocols, Bartlett and Stirling, eds., 2003, Humana Pressを参照のこと。
【００４９】
特定の記載：
１. 序言：
本発明は、最小数の反応段階を要し、そして便利で且つ真の多重化を可能にする多重検出のための方法を提供する。前記方法は、リボヌクレオチド塩基を組み込む反応（例えば、４種のヌクレオチド（A, C, G, T）の少なくとも１つがリボ塩基（rNTP）として、完全に又は一部、含まれる増幅反応）を使用する。標的核酸に対して特異的なプライマーが使用される。１つの又は両プライマーは、約３〜10個、又はそれ以上の塩基の１、２又はそれ以上の配列セグメント、及び個々の配列セグメントの5’末端で位置するリボ塩基に対して相補的な塩基を有する5’末端を有する。前記配列セグメントは、等質量のものであり得るが、但し必ずしも必要ではない。
【００５０】
増幅は、その5’部分を包含するプライマー配列のアンプリコン（例えば、増幅生成物）中への封入をもたらす。アンプリコンはまた、組込まれたリボ塩基を含むであろう。質量分光学による分析のために、増幅生成物は、例えばアルカリへの暴露により、断片化（フラグメント化）にゆだねられる。塩基が、前記組込まれたリボ塩基のすぐ3’側のDNA主鎖を選択的に分解する。従って、増幅生成物におけるプライマー配列及び配列セグメントの組込みは、配列セグメントの明白な質量を検出することにより、生成物の存在の検出を可能にする。プライマーの用法は、コピーされ、そして増幅された配列セグメントの質量の生成物の存在を翻訳する。
【００５１】
多重化に関しては、多重標的核酸（例えば、異なった対立遺伝子）のためのプライマーは、分解の後、明確な質量の生成物を生成する異なった5’部分配列セグメントを端に有する。すべての新規合成DNAは、組込まれたリボ塩基を含み、そして従って、アルカリにゆだねられる場合、フラグメントをもたらす。解釈を促進するためには、完全なシステムは、プライマー及び他の核酸のハイブリダイズする部分から一般的に発生する質量シグナルが5’末端配列セグメント又はその補体の質量とは異なるよう、計算され得る。シグナル末端における配列セグメントは、等質量のものであり得、そして同一の配列（すなわち、反復体）であり得る。反復体配列セグメントの反復は、標的核酸にアニーリングするかまたはそれをコピーするプライマーの部分の配列に由来するシグナルよりも明瞭なシグナルをもたらす。従って、個々の5’部分配列セグメントが等質量のものである、請求項１記載の方法は、本発明の好ましい態様である。
【００５２】
前記方法は、最少数の反応段階を用いての、単一のウェルにおいて10又はそれ以上のサンプルについての効果的な多重遺伝子型決定を可能にする。前記段階は一般的に、DNA鋳型及びマスター配合物の混合を必要とする。熱循環の後、アルカリ溶液が添加され、そしてフラグメント化された配列セグメントの質量が例えば、質量分光法により測定される。質量測定のためのいずれかの既知方法が使用され得る。質量分光法を用いる場合、いずれかの種類の質量分光計が分析のために適切である。
【００５３】
プライマーは、同じ熱安定性DNAポリメラーゼの“ホットスタート”をもたらし、それにより、特異性を改良し、そして高い程度の多重化を可能にする除去できる3’末端ブロッキング剤（すなわち、“ホットスタート”）を任意には含むことができる。
【００５４】
本発明の方法の実施のための１つの例においては、リボPCRが、個々の標的核酸（例えば、個々のSNP、個々の対立遺伝子）のためのDNAサンプル、２種の前方向プライマー及び１つの逆方向プライマーを用いて実施され得る。前方向プライマーは、標的核酸上の同定塩基に対して特異的に相補的な、3’末端塩基又は3’側の５個の3’末端塩基を伴って、１つの標的核酸（例えば、１つのSNP、１つの対立遺伝子）に対して特異的であるよう企画される。個々の前方向プライマーは、同一質量の１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成る特異的5’末端を有し、ここで個々の配列セグメントの5’末端塩基は、PCR増幅混合物におけるリボヌクレオチド（NTP）に対して相補的である。配列セグメントの質量は、異なった対立遺伝子、SNP、及び他の検出できる標的核酸間で異なり、そして区別できるよう企画される。
【００５５】
区別できる質量の配列セグメントを生成するためには、プライマーの5’末端は、例えば約３〜10個の長さの塩基である約２〜10個の配列セグメント；約４〜６個の長さの塩基の約４〜７個の配列セグメント；又は約７〜８個の長さの塩基の約２〜３個の配列セグメントを含む。
【００５６】
リボ−PCR又はリボ−増幅は、デオキシヌクレオチド及び少なくとも１つのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はrNTP）の混合物によるPCR又は増幅反応である。この例は、dGTP、リボヌクレオチドrTTP（すなわち、５−メチル−UTP）、dCTP及びdATP、及び適切な緩衝液においてリボヌクレオチドを効果的に組込み、そして延長するDNAポリメラーゼを含んで成るPCR混合物である。反応は、いずれかの延長反応、例えば熱循環反応により実施され得る。熱循環の後、反応混合物はアルカリにより処理され得る。アルカリは強塩基、例えばNaOH又はKOHであり得る。
【００５７】
アルカリは、組込まれたリボ塩基のすぐ3’側のDNA主鎖を分解し、そしてフラグメントの生成をもたらす。標的核酸の存在は、標的核酸に対して特異的な前方向プライマーの使用及び従って、増幅された5’末端配列の存在をもたらす。末端のコピーされ、そして分解された補体はユニーク質量を有する。この質量は、試験されるサンプルにおける標的核酸の存在を決定するために使用される。分解された相補的末端配列に対応する質量のシグナルの存在は、試験されるサンプルにおける標的核酸の存在を同定するために使用される。多重化のためには、多くの異なった末端配列が使用され、個々は、分解の後、DNAの特定質量をもたらす塩基組成を有する。
【００５８】
２．ポリヌクレオチド：
本発明のポリヌクレオチドは、１、２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及びヌクレオチドの鋳型に基づく延長を可能にするために標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る。
【００５９】
ａ．5’部分：
5’部分又は5’末端は、１、２又はそれ以上のタンデム（すなわち、連続）配列セグメントを含んで成り、個々の配列セグメントは、その個々の配列セグメントの5’末端で位置するユニークヌクレオチド塩基（すなわち、セグメントにおいてわずか１度、使用される）を含む。好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における個々の配列セグメントは、等質量のものである。
【００６０】
他の好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における個々の配列セグメントは、同一であり、これは、同じヌクレオチド配列を意味する。同一のヌクレオチド配列を有するタンデム配列セグメントは、反復体として言及される。ユニークヌクレオチド塩基に続いて、最後（２、３又は４番目、等）のタンデム配列セグメントが存在する。例えば、それぞれ４個の長さのヌクレオチドの同一質量の３個の配列セグメントを有する5’部分又は5’末端の配列は、5′-TAGCTAGCTAGCT-3′（配列番号３）であり得、ここでヌクレオチド塩基“T”は反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。
【００６１】
上記に例示されるように、いくつかの態様においては、5’部分又は5’末端の3’末端ヌクレオチド塩基は、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。アルカリ溶液は、5’部分の3’末端を包含する、組込まれたリボ塩基のすぐ3’側の結合を分解するので、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、すべての配列セグメントの開放を可能にする。分解されたアンプリコンの3’末端で残存するものは、2’又は3’リン酸を有する組込まれたリボ塩基である。図１を参照のこと。
【００６２】
5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、その5’部分が１つの配列セグメントのみを含む場合、必要とされる。5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基はまた、複数の配列セグメントが質量において異なる場合、必要とされる。しかしながら、5’部分の3’末端で位置する、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的であるヌクレオチド塩基は、標的物−相補的部分の末端5’ヌクレオチドがまた、同じ“ユニーク”ヌクレオチド塩基である場合、又は5’部分が等質量の複数の配列セグメントを含む場合、任意である。
【００６３】
好ましい態様においては、追加のヌクレオチド塩基は、5’部分の4’末端で含まれる。追加の5’末端ヌクレオチド塩基は、いずれの塩基でも良い。追加の5’末端ヌクレオチド塩基を有する例示される5’部分は、5′-NTAGCTAGCTAGCT-3′（配列番号４）であり得る。追加の5’末端ヌクレオチド塩基の包含は、開放されるフラグメントの質量の均一性及び精度を高める。これは、アルカリ溶液が組込まれたリボ塩基のすぐ3’側の結合を分解する場合、2’又は3’リン酸成分がリボ塩基に結合したまま存続するためである。図１を参照のこと。5’部分の5’末端で包含される追加のヌクレオチド塩基が、鋳型無関係延長を行わないヌクレオチオ組込み生触媒を用いる場合、使用される。
【００６４】
他の好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における配列セグメントは、同一の質量を有するが、しかし異なった配列を有する。例えば、それぞれ４個の長さのヌクレオチドを有する、同一質量の３個の配列セグメントを有する、5’部分又は5’末端の配列は、5′-TAGCTCAGTGCAT-3′（配列番号５）であり、ここでヌクレオチド塩基“T”は、反応混合物におけるリボ塩基に対して相補的である。
【００６５】
さらに好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における配列セグメントは、異なった長さ（例えば、３、４及び/又は５個のヌクレオチド塩基）及び異なった質量のものであり得るが、しかし5’部分又は5’末端の全体は、アンプリコンが分解を受けやすい場合、例えば質量分光法により同定され得る、区別できる“模様”パターンを生成する。
【００６６】
前記5’部分又は5’末端は、２〜約10個の配列セグメント、又は所望には、それ以上、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、10又はそれ以上のタンデム配列セグメントを含むことができる。個々の配列セグメントは、約３〜約10個の長さのヌクレオチド塩基、又はより長い、例えば約３、４、５、６、７、８、９、10又はそれ以上の長さのヌクレオチド塩基であり得る。一般的に、配列セグメントが長いほど、より短い配列セグメントが5’末端に含まれる必要がある。逆にいえば、配列セグメントが短いほど、より長い配列セグメントが5’末端に含まれるであろう。例えば、5’末端は、約７〜８個の長さのヌクレオチド塩基である約２〜４個の配列セグメント、又は約４〜６個の長さのヌクレオチド塩基である約４〜６個の配列セグメント、又は約３〜５個の長さのヌクレオチド塩基である約５〜８個の配列セグメント、又は約３〜５個の長さのヌクレオチド塩基である約５〜８個のセグメントを含んで成る。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、標的核酸延長及び増幅反応においてプライマーとして有用である。個々の5’末端配列セグメントの5’末端に位置するユニークヌクレオチド塩基は、本発明のポリヌクレオチドによりハイブリダイズされる標的核酸の延長又は増幅のための反応混合物に含まれるリボヌクレオチド塩基に対して相補的である。
【００６８】
ｂ．3’部分：
ポリヌクレオチドの3’部分は、標的核酸配列にハイブリダイズし、そして延長されるために十分に相補的な核酸配列を有するよう企画される。3’部分は少なくとも５個の長さのヌクレオチド塩基であり、そして所望には、より長く、例えば約10、15、20、25、30、35、40、45 又は50個の長さのヌクレオチド塩基である。3’末端、又は3’部分の3’末端ヌクレオチド側の（−１）又は（−２）が、当業界において知られている方法に従って、標的核酸における特異的対立遺伝子又はSNP間を区別するために使用され得る。例えばプライマー延長又は熱循環のための典型的な反応条件は、約50 mM のトリシン-KOH, pH 7.5、00 mM のKOAc、3.0 mMのMg(OAc)2及び200 μMの個々のdNTPを包含し；アニーリング又はハイブリダイゼーション温度は、約50〜70℃、例えば約60〜65℃であり得る。
【００６９】
好ましい態様においては、3’部分の3’末端は任意には、ブロッキング基、又はポリヌクレオチドの延長を可逆的に妨げるブロッキング成分を有する。典型的な可逆的ブロッキング成分は、3’末端ヌクレオチド（すなわち、2’−ターミネーター）の2’位置に結合される置換基を含む。特に好ましい態様においては、2’−ターミネーター成分は、リン酸又はリン酸類似体、例えばメチルアミノリン酸である。
【００７０】
一般的に、糖成分の2’位置で使用されるブロッキング基（BG）はまた、種々の態様を包含する。好ましくは、例えばBGは、負に荷電された基及び/又はバルキング基である。さらに例証すると、BGは任意には、例えばCN、NO2、N3、ハロ基、エーテル基、アルデヒド基、カルボン酸基、エステル基、アミノ基、OCH3、OCH2COOH、O−シリルエーテル基、ケト基、O−ラクトン基、O−アルキル基、O−環状アルキル基、O−アルケニル基、O−アルキニル基、カルバメート基、イミド基、アミド基、及びそれらの組合せからから選択される。より特定には、BGは任意には、下記式（I）：
【００７１】
【化２】
【００７２】
を含んで成る。
【００７３】
他の好ましい態様においては、BGは、下記式（II）：
【化３】
【００７４】
［式中、Qは、O、 S又はNHであり；Xは、H、OH、CH3、BH3、F又はSeHであり；そして
Zは、O、S又はSeである］を含んで成る。さらに例証すると、BGは任意には、下記式（III）：
【００７５】
【化４】
【００７６】
［式中、Qは、O、S又はNHであり；Xは、O、S又はNHであり；Zは、O、S又はSeであり；そしてRは、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である］を含んで成る。もう１つの典型的な好ましい態様においては、BGは、下記式（IV）：
【００７７】
【化５】
【００７８】
［式中、Qは、O、S又はNHであり；Xは、O、S又はNHであり；Zは、O、S又はSeであり；Lは、L is -CONH(CH2)nNH-、-CO(CH2)nNH-又は-CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-であり；nは、0以上の整数であり；そしてRは、NH2、SH、COOH、消光剤成分、レポーター成分、ビオチン又は親和性成分である］を含んで成る。
【００７９】
使用される典型的な2’−ターミネーターヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシド及び2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−二リン酸ヌクレオシドを包含する。2’−ターミネーター可逆的ブロッキング成分は、例えばアメリカ特許公開番号2007/0219361号及び2007/0154914号に詳細に記載される。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは任意には、本明細書に記載のような、天然に存在しないヌクレオチド主鎖連鎖、ヌクレオチド塩基及びヌクレオチド塩基類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、それらの十分な長さにわたって一本鎖である。ポリヌクレオチドは、しばしば、いずれかのラベル、例えば結合された蛍光発色団、放射性同位体、酵素又は他の識別体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、単離され、合成された又は組換え体であり得る。5’及び3’部分を含むポリヌクレオチドは、いずれの長さでもあり得、そして一般的に約200個のヌクレオチド、又はそれよりも少ない、例えば約150、125、100、75、50又は25個、又はそれよりも少ない長さのヌクレオチドである。
【００８１】
３．検出方法：
ａ．標的核酸と本発明のポリヌクレオチドとの接触
検出方法を実施する最初の段階は、標的核酸と、本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド組、ヌクレオチド組込み生触媒成分との接触を包含する。
【００８２】
ｉ. ヌクレオチド組
本発明の方法に使用されるヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基（例えば、A, U, G又はC、又はもう１つのリボヌクレオチド、rNTP）の形で少なくとも１つの塩基を含む。いくつかの態様においては、ヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基の形で少なくとも２個の塩基を含む。リボヌクレオチド塩基として含まれる１又は複数の塩基は、ヌクレオチド組においてリボヌクレオチド塩基として、完全に（例えば、100％リボヌクレオチド）、又は一部（例えば、100％以下のリボヌクレオチド）、又は一部（例えば、100％以下のポリヌクレオチド、ここで塩基の残りはデオキシヌクレオチド又はdNTP）、含まれ得る。
【００８３】
好ましい態様においては、１又は複数のヌクレオチド塩基は、リボヌクレオチド（rNTP）として、大部分、すなわち50％以上、例えば60%、70%、80%、85%、90%、95%、及びデオキシリボヌクレオチド(rNTP)として、少数部分（すなわち、50％以下）、存在する。特に好ましい態様においては、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の少なくとも80％が、リボヌクレオチドの形で存在する。１又は複数のリボヌクレオチドが、完全なヌクレオチド組（A, T, C及びGヌクレオチドが存在する）を仕上げるためにデオキシリボヌクレオチドと共に包まれる。
【００８４】
ii. 生触媒成分
本発明に使用されるヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を含んで成る。好ましい態様においては、同じ触媒ドメインが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を触媒することができる。他の好ましい態様においては、生触媒成分は少なくとも２種の触媒ドメインを含んでなり、その１つはデオキシリボヌクレオチド組込み活性を有し、他の１つはリボヌクレオチド組込み活性を有する。
【００８５】
本発明の方法への使用のために適切な例示される生触媒成分は、修飾されたZ05, CS5, CS6又はTaqポリメラーゼであるポリメラーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。CS5及びCS6キメラポリメラーゼはさらに、例えばアメリカ特許出願公開番号2004/0005599号にも記載される。サーマス種Z05は、PCT国際特許公開番号WO92/06200号において公開されている。
【００８６】
典型的な修飾された酵素は、例えばG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A T606S D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、E615G Taq DNA ポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。それらの修飾された酵素は、リボヌクレオチドの組込みを増強し、そしてリボヌクレオチドの2’−修飾された類似体の組込みを増強し、そして/又は１又は複数のそれらの突然変異を欠いている酵素に関して、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を低めるか又は排除する突然変異を含んで成る。
【００８７】
有用なヌクレオチド組込み生触媒に関する追加の詳細は、アメリカ特許出願番号11/873,896号、及びアメリカ特許第5,939,292号; アメリカ特許第4,889,818号; アメリカ特許第5,374,553号;アメリカ特許第5,420,029号; アメリカ特許第5,455,170号; アメリカ特許第5,466,591号; アメリカ特許第5,618,711号; アメリカ特許第5,624,833号; アメリカ特許第5,674,738号; アメリカ特許第5,789,224号; アメリカ特許第5,795,762号; アメリカ特許第7,148,049号及びアメリカ特許第7,179,590号にも提供される。
【００８８】
リボヌクレオチド及び2’−ターミネーターヌクレオチド又は他の所望する性質を組込むための増強された効率を有する修飾された酵素の生成は、種々の方法、例えば特定の部位の突然変異誘発、化学的修飾、等により達成される。この技法は、所望する突然変異を表す制限されたミスマッチを除いて、突然変異誘発される一本鎖ファージDNAに対して相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ得る。
【００８９】
手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチドが、プラスミド又はファージに対して相補的な鎖の合成を方向づけるためのプライマーとして使用され、そして得られる二本鎖DNAにより、ファージ支持された宿主細菌が形質転換される。得られる細菌は例えば、所望する突然変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラークを同定するために、DNA配列分析又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイされ得る。さらに例証すると、核酸を修飾するためへの多くの他のアプローチ、例えば“組換えDCR”方法がまた、使用され得る。
【００９０】
本発明の観点の実施（例えば、修飾された酵素の生成、配列決定の実施、等）においては、分子生物学及び組換えDNAにおける多くの従来の技法が任意には使用される。それらの技法はよく知られており、そして例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 1997-2007 (F. M. Ausubel ed.), Wiley Interscience; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれWu and Grossman, and Wu, eds.,)において説明されている。
【００９１】
iii. ポリヌクレオチド：
前記方法に使用される5’−末端化されたポリヌクレオチドは、上記及び以下に記載されている。好ましい態様においては、標的核酸においては、多くの（例えば、複数の）5’−末端化されたポリヌクレオチドと接触される。他の好ましい態様においては、多数中の個々のポリヌクレオチドは、ユニーク質量の１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成る5’部分を有することにより別々に同定できる。この場合、個々の5’−末端化されたポリヌクレオチドのアンプリコン又は補体のフラグメント化が、異なった質量のシグナル又は特徴的質量プロフィールを生成する。さらなる好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、１又は複数のプライマー対として標的核酸に接触される。
【００９２】
プライマー対におけるポリヌクレオチドの１つ又は両者は、タンデム配列セグメントを含んで成る5’−末端を含むことができる。１又は複数のプライマー対として標的核酸と接触する多ポリヌクレオチドがまた供給され得、ここで対における個々のプライマーは、同一質量のタンデム配列セグメントを含んで成る5’部分を含んで成る。この場合、アンプリコンを生成するために使用される対における個々のプライマーの5’部分の補体のフラグメント化は、より高い（例えば、約２倍）強度の単一質量シグナル化を生成する。他方では、プライマー対における個々のプライマーは、１つの配列セグメントを含むことができ、ここで前記対中の個々のプライマーにおける配列セグメントは同一の質量のものである。
【００９３】
本発明の好ましい態様においては、5’末端化されたポリヌクレオチドは、検出できる分解生成物を生成するために明確な質量の１つの配列セグメントを含んで成ることができる。
【００９４】
iv. 標的核酸：
標的核酸は、いずれかの源、例えば動物又は植物からの組織サンプル、細菌又はウィルスからであり得るか、又は例えば反応混合物から合成され得る。標的核酸は例えば、ゲノムDNA、染色体又は染色セグメント、mRNA、cDNA、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸DNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、等であり得る。標的核酸は例えば一本鎖、二本鎖、等であり得、そしていずれかの特定の長さに制限されない。本発明の方法に使用される標的核酸は、１又は複数の単一ヌクレオチド多形現象（SNP）、挿入、欠失、置換又は他の区別する特徴を含むであろう。標的核酸は一般的に、サンプルで供給される。
【００９５】
好ましい態様においては、標的核酸は、１又は複数のSNPを識別するために接触される（すなわち、方法が行われる）。そのような用途においては、少なくとも２種の異なった対立遺伝子−識別の5’末端化されたポリヌクレオチドは、それらが特定の対立遺伝子に対して特異的にアニーリングするよう、それらの3’部分において異なり、そして１又は複数の配列セグメントが、3’部分により結合される対立遺伝子に対応し、そしてそれを特異的に同定する質量のものであるよう、それらの5’部分において異なるそれらのポリヌクレオチドが使用される。
【００９６】
他の好ましい態様においては、標的核酸は、標的核酸における１又は複数のまれな突然変異を検出するために接触される。そのような用途においては、標的核酸における特定の位置での突然変異に対して特異的にアニーリングする3’部分を有する１又は複数のポリヌクレオチドが存在する（同じ位置で野生型に対して特異的にアニーリングする3’部分を有するポリヌクレオチド）。
【００９７】
標的核酸配列における１つの突然変異が評価される場合、１，２又はそれ以上の異なった突然変異−識別の5’末端化されたポリヌクレオチドが野生型又は１又は複数の突然変異型を特異的にアニーリングするよう、それらの3’部分において異なり、そして１又は複数の配列セグメントが、その3’部分により結合される対立遺伝子に対応し、そしてそれを特異的に同定する質量のものであるよう、それらの5’部分においても異なるそれらのポリヌクレオチドが使用され得る。１つの標的核酸における複数の突然変異が評価される用途においては、標的核酸における第１位置での突然変異を特異的に検出する3’部分を有するポリヌクレオチドは、すべて第１質量の5’部分配列セグメントを有することができ；標的核酸における第２位置での突然変異を特異的に検出する3’部分を有するポリヌクレオチドは、すべて第２質量の5’部分配列セグメントを有することができる。他方では、ポリヌクレオチドの5’部分における配列セグメントの質量はそれぞれ異なり、独得の識別体として作用する。
【００９８】
さらなる好ましい態様、例えば多重増幅又は延長を包含するそれらの態様においては、ポリヌクレオチドは、複数のプライマー対として提供される。第１プライマー対においては、前記対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は、第１質量とは検出可能的に異なる、第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能的に異なる、第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対は、すべての先行する又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。プライマー対及び増幅又は延長反応の数は、反応混合物における遊離ヌクレオチド塩基の利用可能性により制限される。いくつかの好ましい態様においては、反応混合物は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、又はそれ以上のプライマー対を含むことができる。この方法は、複数の標的核酸、又は単一の標的核酸における複数の標的物の同時検出を可能にする。
【００９９】
ｂ．アンプリコンを生成するためへの標的核酸の増幅：
ｉ．増幅方法：
標的核酸は、当業界において知られているいずれかのポリヌクレオチド延長又は増幅方法を用いて、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドにより増幅され得る。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）、例えばRT-PCR、定量的PCR、多重化された及び同時PCRのいずれかの既知変法を用いての増幅が本発明の方法に使用され得る。
【０１００】
増幅はまた、当業界において知られている等温増幅方法及びポリヌクレオチド延長方法も包含する。PCRを実施するためのプロトコールは、当業界において良く知られており、そして例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., 2003, Cold Spring Harbor Laboratory Press; A-Z of Quantitative PCR, Bustin, ed., 2004, International University Line; Edwards, Real-Time PCR: An Essential Guide, 2004, Taylor & Francis; Real Time PCR, Dorak, ed., 2006, Taylor & Francis; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., eds., 1990, Academic Press, San Diego; PCR Strategies, Innis, et al., eds, 1995, Academic Press, San Diego; and PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Innis, et al., eds., 1999, Academic Press, San Diegoに記載されている。標的核酸は、検出できる量のアンプリコンを生成するために十分な時間、又は十分な数の循環、増幅されるか又は延長される。
【０１０１】
上記に論じられたように、１又は複数の標的核酸が増幅され得るか、又は単一核酸における１又は複数の標的位置が増幅され得る。識別できる質量の配列セグメントを有する異なった5’部分の数には実質的に制限は存在しないので、前記方法は特に、多重増幅アッセイに対して適合される。標的核酸、又は標的核酸内の特定の位置を増幅するために使用される１又は複数のポリヌクレオチドは、特異的に同定できる質量の配列セグメントを有する異なった5’部分を有することができる。プライマー対として使用されるポリヌクレオチド対は、同一質量の配列セグメントを有する5’部分を有することができる。特定の態様においては、配列セグメントは、同一配列を共有する。多重増幅アッセイは、所望には、少なくとも5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、又はそれ以上の異なった標的核酸、又は標的核酸内の位置の存在を同時に決定することができる。
【０１０２】
本発明の増幅及びポリヌクレオチド延長反応は、延長される（例えば“リボ−PCR”、又は“リボ−増幅”又は“リボ−延長”）、核酸鎖中へのリボヌクレオチドの組込みのための酵素活性を含んで成る生触媒単位（例えば、ポリメラーゼ）を使用する。リボヌクレオチド組込み活性を有する例示される生触媒単位は、Roche Molecular Systemsから入手でき、そして例えばMauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 35(8):e62 and Mauger, et al., Nucleic Acids Research (2006) 34(3):e18に記載される、G46E CS6R DNAポリメラーゼ及びKB17 DNAポリメラーゼを包含する。使用される追加の生触媒成分が上記に論じられる。また、アメリカ特許第5,934,292号も参照のこと。
【０１０３】
ii. 生成されるアンプリコン：
標的核酸配列の増幅は、二本鎖アンプリコンを生成し、ここでポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的なアンプリコンの鎖は、１又は複数の配列セグメントを含む3’部分を含んで成り、ここで前記配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基は組込まれたリボヌクレオチド一リン酸（rNMP）を含む。
【０１０４】
ｃ．アンプリコンの分解：
アンプリコンの配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、分解され得る。本発明の好ましい態様においては、アンプリコンは、アルカリ（すなわち、塩基性溶液）にアンプリコンをゆだねることにより、組込まれたNMPの3’側結合で分解される。アンプリコンは好ましくは、組込まれたNMPの3’側結合の分解をもたらすのに十分な時間及び温度で、分解のためのアルカリ溶液に暴露される。一般的に、温度が高いほど、アルカリ処理のために必要な時間は短い。
【０１０５】
例えば分解又はフラグメント化段階は、70℃で約1.5時間、又は約55℃で約８時間（すなわち、一晩）、実施され得る。アルカリ処理温度は、冷蔵温度ほど低く（例えば、4℃）、そしてほぼ沸点温度ほど高い（例えば、約95℃）。好ましい態様においては、アルカリ溶液は、約8.5以上のpH、例えば少なくとも9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0又はそれ以上のpHを有するいずれかの溶液であり得る。いくつかの態様においては、アルカリ溶液は、少なくとも約0.2M、0.3M、0.5M、0.8M、1.0M又はそれ以上の塩基性化合物を含むであろう。
【０１０６】
アルカリ溶液が一般的に含まれる場合、弱塩基が使用される。一般的に、アルカリ溶液は、約5.0又はそれ以下のpKb, 例えば約4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5又はそれ以下のpKbを有する、少なくとも１つの塩基性化合物を含むであろう。組込まれたNMPの3’側結合でのアンプリコンのフラグメント化に使用するための例示される塩基性化合物は例えば、NaOH、KOH、RbOH及びNH4OH、好ましくはNaOH、KOH又はNH4OHを包含する。他の塩基又は塩基性化合物がまた使用される。アルカリ処理の方法については、例えばMauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 35(8):e62 and Mauger, et al., Nucleic Acids Research (2007) 34(3):e18を参照のこと。
【０１０７】
ｄ．アンプリコンフラグメントの検出：
アンプリコンフラグメント、又は分離され、そして開放される配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて検出され得る。好ましい態様においては、分解されたフラグメントは、質量の同定により検出される。配列セグメントはまた、分解の前又は後、例えば蛍光発光団又は放射性同位体により、検出可能的にラベルされ得る。フラグメントは、5’又は3’末端で、又はいずれかのヌクレオチド塩基上で十分にラベルされ得る。例示される検出方法は、質量分光学、電気泳動分離、時間決定された蛍光検出、回転共鳴検出、及び固相（例えば、アレイ）へのハイブリダイゼーション、及び続く検出を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０８】
好ましい態様においては、アンプリコンから放される分解された配列セグメントは、質量分光法を用いて検出される。質量分光方法は当業界において知られている。いずれかの質量分光技法、例えばレーザー脱離−イオン化質量分光法（例えば、マトリックス助力のレーザー脱離−イオン化質量分光法（MALDI）及び表面増強されたレーザー脱離−イオン化質量分光法（SELDI））、気相イオン分光法、ガスクロマトグラフィー質量分光法、ダンデム質量分光法及び他の質量分光技法が使用されるであろう。質量分光法は、当業界において良く知られており、そして例えばGross, Mass Spectrometry: A Textbook, 2006, Springer Verlag; and Dass, Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry, 2007, Wiley Interscienceに記載されている。
【０１０９】
検出されるアンプリコンフラグメントは、ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的であるか、又は5’部分から増幅されるアンプリコンからの分解された配列セグメントであり得る。もちろん、好ましくは、分解できる配列セグメントは、アンプリコンの長さを通して創造され得る。アルカリ条件下で、リボヌクレオチドが組込まれたすぐ3’側の結合が分解を受けやすい。好ましい態様においては、アンプリコンフラグメントは、増幅された標的核酸から（例えば、ポリヌクレオチドの3’部分に対して相補的な配列セグメントから）、検出され得る。所望には、ポリヌクレオチドの5’部分及び/又は3’部分からの分解された配列セグメント又はその補体が検出され得る。検出されたアンプリコンフラグメントからのシグナルは、同定される標的核酸を示すピークの特徴を生成する。
【０１１０】
４．反応混合物：
本発明はまた、本発明の方法に包含される反応混合物も供給する。上記のいずれかの反応混合物が生成され得る。典型的な反応混合物は例えば、１，２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る１又は複数の本発明のポリヌクレオチド；dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも１つの塩基の大部分はポリヌクレオチドであり；及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を含んで成る。いくつかの態様においては、反応混合物は１又は複数の標的核酸配列を含んで成る。
【０１１１】
本発明の反応混合物はまた、本発明の方法により生成されたアンプリコンを含んで成り、前記アンプリコンは本発明のポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な配列セグメントを有する3’部分を含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオシド一リン酸（NMP）である。本発明の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドに同一の5’部分を含んで成るアンプリコンを含んで成る。反応混合物における多くのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド対で、例えばプライマー対として供給され、ここで個々のポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドは好ましくは、等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る。反応混合物における成分の態様は、上記及び本明細書に記載の通りである。
【０１１２】
好ましい態様においては、反応混合物は複数のプライマー対を含んで成る。第１プライマー対においては、対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は第１質量とは検出可能的に異なる第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能的に異なる第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対はすべての前述の又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。特に好ましい態様においては、反応混合物は、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20又はそれ以上のプライマー対を含む。
【０１１３】
他の好ましい態様におては、反応混合物は、非従来の又は天然に存在しないヌクレオチド塩基又はラベルされたヌクレオチド塩基を含んで成るヌクレオチド組、及び蛍光発光団又は放射性同位体を含んで成る。反応混合物はまた、必要なら、緩衝成分及び塩を含む。さらなる好ましい態様においては、反応混合物は、上記のように、アルカリ成分、例えばNaOH又はKOHを含んで成る。本明細書に記載される方法によれば、高濃度（例えば、約0.1M−0.2M、又はそれよりも高い）のアルカリ成分を含む反応混合物は典型的には、増幅をすでに受けている。
【０１１４】
好ましくは、反応混合物は、本明細書に記載のように、本発明の方法により生成されるアンプリコン、及びアルカリ成分を含んで成る。
【０１１５】
５．キット：
本発明はまた、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。典型的には、キットは、容易な使用のために区画に分けられ、そして本発明を実施するための成分、例えば１，２又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る本発明の１又は複数のポリヌクレオチド；dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも１つの塩基の大部分はリボヌクレオチドであり；及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を供給する容器を含む。
【０１１６】
好ましい態様においては、キットは、１又は複数の標的核酸配列、例えば制御核酸配列（正及び/又は負の制御のための）を含んで成る。キットは、別々の制御反応を実施するための試薬、例えば制御ポリヌクレオチド及び制御標的核酸配列を供給することができる。キットにおける多くのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド対で、例えばプライマー対として供給され得る。キットにおける成分の態様は、上記及び本明細書に記載される。
【０１１７】
好ましい態様においては、キットは複数のプライマー対を含んで成る。第１プライマー対においては、対における個々のプライマーの5’部分は、第１質量の配列セグメントを含み；第２プライマー対は第１質量とは検出可能に異なる第２質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；第３プライマー対は、第１及び第２配列セグメントの質量とは検出可能に異なる第３質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有し；続くプライマー対は、すべての前述の又は他のプライマー対とは検出可能的に異なる質量の配列セグメントを含む対における個々のプライマーの5’部分を有する。特に好ましい態様においては、キットは、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20又はそれ以上のプライマー対を含むことができる。
【０１１８】
追加の試薬を供給する１又は複数の追加の容器がまた包含され得る。そのような追加の容器は、上記方法に従ってのプライマー延長又は増幅方法への使用のために当業者により認識されるいずれかの試薬又は他の要素、例えば核酸増幅方法（例えば、PCR、RT−PCR）、DNA配列決定方法、又はDNAラベリング方法への使用のための試薬を含むことができる。他の非相互的に独占的な変法においては、キットは、遊離ヌクレオチド（従来の及び/又は非従来の）を供給する１又は複数の容器を含む。特定の態様においては、キットはα−ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP及び/又はラベルされたdNTP, 例えばフルオレセイン−又はシアニン−色素ファミリーdNTPを含む。さらに他の非相互的に独占的な態様においては、キットは、プライマー延長反応のために適切な緩衝液を供給する１又は複数の容器を含む。好ましい態様においては、キットは上記のようなアルカリ成分、例えばNaOH又はKOHを含んで成る。
【０１１９】
６．アンプリコン：
本発明はまた、本発明の方法により生成されるアンプリコンを供給する。PCRアンプリコンは通常、二本鎖であり、そして本発明のポリヌクレオチドに対して相補的である鎖を含んで成る。アンプリコンは、本発明のポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成り、ここでアンプリコンの3’配列セグメントは少なくとも１、２又はそれ以上の配列セグメントを含んで成り、ここで配列セグメントの3’末端ヌクレオチドは、アンプリコンを生成するために使用されるヌクレオチド組においてNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）である。
【０１２０】
７．システム：
本発明はさらに、本発明の方法を自動化するためのシステムを供給する。システムは、ポリヌクレオチド又はアンプリコン又は本発明の反応混合物を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体；ポリヌクレオチド又はアンプリコンを含んで成る組成物と、１つの又はいくつかの温度で熱的に通じるよう形状化された熱モジュレーター（例えば、核酸熱循環機械；インキュベーター）；試薬を容器又は支持体に又はそれらから移行する少なくとも１つの試薬移行機会；及びフラグメント化された配列セグメントの質量を検出するために形状化された少なくとも１つの検出器（例えば、質量分光計、蛍光計）を含んで成る。好ましい態様においては、システムは、熱モジュレーター、試薬移行機械及び質量を検出するための形状化された検出器の少なくとも１つの操作可能的に通じる少なくとも制御器を含んで成る。
【実施例】
【０１２１】
次の例は、本発明を例示するために提供されるが、但し本発明を制限するものではない。
例１．高処理量SNP遺伝子型決定のためのフラッグ−標識：
ヒトH19遺伝子におけるSNPを含むアンプリコンを、分析のために調製した。標的配列は、gtgaggagtgtggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc（配列番号11）（小文字はプライマーにアニーリングする配列を示し、“ｙ”はSNP位置C又はTを示す）であった。PCRを、20μlの合計体積で実施し、そして2μlは10ng/mlに希釈されたゲノムDNAサンプルからであった。
【０１２２】
PCR増幅は次の成分を含んだ：50 mMのトリシン pH 7.5、100 mMの KOAc、 2.75 mMの Mg(OAc)2、及び1.6% 貯蔵緩衝液（50% v/v グリセロール、100 mMの KCl、0.1 mMの EDTA、20 mM のトリス pH 8.0、1 mM のDTT及び0.5% Tween 20を含む）。また、0.2 mMの個々の5-メチル-dCTP及びdGTP、0.4 mM のdUTP、0.18 mMの rATP、0.02 mMの dATP, 及び0.1 mM のピロリン酸もPCRに含まれた。ヌクレオチド塩基混合物は、90％rATP及び10％dATPを含んだ。PCR増幅に使用される酵素は、0.02 U/μlウラシル-DNAグリコシラーゼ (UNG) 及び20 nM のGLTDSE DNA ポリメラーゼであった。
【０１２３】
例えば、PCT公開番号WO 2008/046612号及びWO 2009/010251号を参照のこと。高濃度酵素ストック（それぞれ、8U/μl及び５μM）を用いて、グリセロール及びTweenのキャリーオーバーを最少にした。プライマーを添加し、それぞれ0.2μMにした。すべての反応に共通する１つのプライマーは、配列5′-GCTGATGTCGCCCTGTC-2’-PO4-U-3′（配列番号12）を有した。SNP−疑問プライマーは、H19C対立遺伝子（図２を参照のこと）を検出するための5′-CCTAAGACTAAGACTAAGACTCGTGAGGAGTGTGGAGTAGG-2’-PO4-C-3′（配列番号13）、又はH19T対立遺伝子（図３を参照のこと）を検出するための5′-CCTAGAGCTAGAGCTAGAGCTCGTGAGGAGTGTGGAGTAGG-2’-PO4-U-3′（配列番号14）、又は２種の50/50混合物のいずれかであった。
【０１２４】
標的配列に対応するプライマーの部分は下線が引かれている。それらのプライマーは、それらの5’末端で、H19C対立遺伝子を検出するためのプライマーにおいてT残基：（３×TAAGAC＝配列番号15）、又はH19T対立遺伝子（単一のヘキサマーはプライマー配列において太字で書かれている）を検出するためのプライマーにおいて（３×TAGAGC＝配列番号16）を端に有する異なった反復性ヘキサマーを含む。その反復性ヘキサマーは、ゲノム標的物に対して相補的ではないが、しかしアンプリコン中に組込まれる場合、塩基消化の後、ヘキサマー“フラッグ−標識の開放をもたらす。
【０１２５】
熱循環条件は次の通りであった：50℃で10分（UNG殺菌）；95℃で１分（UNG変性）；次に92℃で15秒（変性）〜60℃で２分（アニーリング/延長）の99サイクル。これに続いて、60℃で５分、維持された。熱循環は、ABI9800において行われた。
６種の異なったゲノムDNAサンプルを、すべての３種のプライマー対に対して、２重反復して試験した。さらに、４個の“鋳型なし”対象が個々のプライマー対のために試験された。
【０１２６】
熱循環に続いて、複製反応をプールした。塩基を添加し、そしてアンプリコンを熱処理した。サンプルを脱塩するために、キレート化剤を添加し、そしてその溶液を遠心分離した。上清液をマトリックスに適用し、そして質量分光計により分析した。データを分析し、フラッグ配列の出現を示すことにより、SNP位置での６個のサンプルの個々の遺伝子型を決定した。その結果は図２、３及び４に示されている。
【０１２７】
例２．感染剤についての高処理量スクリーニングのためのフラッグ標識：
感染剤スクリーニングへのフラッグ−標識技法の適用を、HIV由来の配列をコードするRNA転写体を用いて試験した。それらの実験についての転写体を、HIV株HXB２からのgag領域の発現ベクター中へのクローニングにより生成した。線状化の後、転写体を、T7 RNAポリメラーゼを用いて製造した。次に、転写体を、ポリ−dTカラム上で精製した。標的配列は、catgcagggcctattgcaccaGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGaagtgacatagcaggaactactagtacccttcagga（配列番号17）（プライマー配列は小文字下にある）であった。
【０１２８】
この転写体を用いてRT−PCRを、反応当たり50μlの合計体積を用いて、二重反復して実施した。反応を、反応当たり転写体の106個のコピーを用いて及びそれらを用いないで実施した。反応は、次の成分を含んだ：100 mM のトリシン pH 7.3、120 mMの KOAc、1 mM のMn(OAc)2、0.2 mMの dGTP、0.4 mMの dUTP、rATP 及びdATPの混合物（ その合計が80% 又は90% のrATPのいずれかと共に0.2 mMであるような）、0.2 mMの dCTP 又は0.2 mM の5-メチル-dCTPのいずれか、及び0.15 mMのピロリン酸。この反応に使用される酵素は、0.02 U/μl のUNG及び25 nM のGLDSE DNAポリメラーゼであった。PCT公開番号WO2008/046612号を参照のこと。高濃度酵素ストック（それぞれ、２U/μl及び2.5μM）を用いて、グリセロール及びTweenのキャリーオーバーを最少にした。プライマーを添加し、それぞれ0.1μMした。上流のプライマーは、配列5′-ATAGGTAGGTAGGTAGGTCATGCAGGGCCTATTGCACC-2’-PO4-A-3′（配列番号18）を有した。
【０１２９】
下流のプライマーは、配列5′-ATCACTCACTCACTCACTCCTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACT-2’-PO4-U-3′（配列番号19）を有した。標的配列にアニーリングするプライマーの部分は下線が引かれている。それらのプライマーは、それらの5’末端で、T残基：TCAC及びTACG（単一テトラマーは、プライマー配列において大文字で示されている）を端に有する異なった反復テトラマーを含む。その反復テトラマーは、転写体標的物に対して相補的ではないが、しかしアンプリコン中に組込まれる場合、塩基消化の後、テトラマー“フラッグ−標識の”の開放をもたらす。しかしながら、例１に示されるように、アンプリコンを検出するために両プライマーを標識する必要はない。５−メチル−dCTPの使用は、C及びU残基含有標識間に大きな質量差異を提供する。dCTP及びdUTPはわずか1amu異なるので、質量に基づいてそれらの間を区別することは困難である。対照的に、dUTP及び５−メチルdCTPは、質量の決定により容易に区別できる（すなわち、1amu以上、異なる）。
【０１３０】
熱循環条件は次の通りであった：50℃で２分（UNG殺菌）；60℃で60分（逆転写段階）；93℃で１分（UNG変性）；次に、92℃で15秒（変性）〜60℃で４分（アニーリング/延長）の60サイクル。熱循環は、ABI9700において行われた。
【０１３１】
アンプリコンを、80％又は90％のいずれかのrATP及びdCTP又は５−メチル−dCTPを含む反応から生成した。それらの４種の条件に関する負の鋳型反応をまた、実施した。すべての８種の条件について二重反復反応をプールし、そして分析のために調製した。塩基を添加し、そしてアンプリコンを加熱処理した。サンプルを脱塩するために、キレート化剤を添加し、そしてその溶液を遠心分離した。上清液をマトリックスに適用し、そして質量分光計により分析した。転写体を含むすべてのサンプルに関して、予測される標識配列を質量分光法により同定したが、しかし鋳型を含まない対照サンプルにおいて同定しなかった。その結果は、図５、６及び７に示される。
【０１３２】
例３．NOS1_361におけるSNP RのA/G対立遺伝子の検出：
対立遺伝子−特異的PCR：
1ng/μlのヒトゲノムDNA20μl、0.4 μMの個々のプライマー(表1)、0.15 mMのピロリン酸ナトリウム、100 mM のトリシン/KOH pH 7.3、100 mMの KCOO pH 7.5、3 mMの Mg(COO)2、0.2 mMの個々の ( rATP、dCTP、dGTP及びdTTP) 及び0.25 U/μl FP-1 DNAポリメラーゼ (すなわち、GLTDSE DNA ポリメラーゼ)におけるリボ−PCR増幅。PCRについての熱循環プロフィールは、92℃で４分、続いて92℃で15秒、63℃で４分（60サイクル）であった。これは常に4℃で行われた。5μlのPCRを、2％のアガロースゲノム中に配置し、PCRを調節した。
【０１３３】
表１は、この例に使用されるプライマーの配列を供給する。記号＊は、2’−PO4含有残基を示す。記号（C）は、2’OMeシチジン塩基を示す。下線の配列は、プライマーのフラッグ部分を現し、そして単一のヘプタマーは、プライマー配列において太字で示される。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
アルカリ分解：
アルカリ分解（表２）に関しては、5.0μlの1.2M水酸化ナトリウムを、残存する15μlの増反応に添加し、0.3Mの最終濃度にし、そして70℃で1.5時間インキュベートした。
表２は、NOS1_361のATPリボ-PCRの分解のフラグメントの予測される質量を示す。下線の配列は、プライマーのフラッグ部分を表わし、そして単一のヘプタマーは、プライマー配列において太字で示される。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
精製：
サンプルを、H+により荷電されカチオン交換樹脂の添加により脱塩した。6mgの樹脂を、MassArray（商標） Clean Resin Tool Kitと共に反応添加し、そして室温で20分間、撹拌下でインキュベートした。その後、サンプルを、134xgで２分間、遠心分離し、樹脂を沈殿した。
【０１３８】
MALDI−TOF MS：
トリヒドロキシアセトフェノン（THAP）をマトリックスとして使用した。調製のために、水中、50％アセトニトリル及び0.3Mのクエン酸アンモニウム溶液（6/3/2(v/v)）中、0.2Mの２，４，６−及び２，３，４−THAP 0.5μlを、MALDI標的物プレート（400 μmのスポットサイズを有するAnchorChipTM Target、Bruker Daltonik GmbH、Bremen、Germany）の固定位置上に沈着した。その後、0.5μlの上清液を添加し、そして室温で乾燥した。
【０１３９】
標的物を、分析のためにMALDI-TOF質量分光計 (Autoflex, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)中に導入した。質量分光法分析（図８）を、線状での100nsのパルスされたイオン抽出遅延を用いて、20kVの加速電圧、及び外部基準目盛を伴って、負のイオンモードで実施した。得られる個々のスペクトルは、合計200のレーザーショットであった。
【０１４０】
本明細書に記載される例及び態様は単なる例示目的のためであって、種々の修飾又は変更が当業者に示され、そして本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の検出方法であって、
（ａ）標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
（i）前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
（ii）前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；そして
（iii）前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り；
（ｂ）前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）であり；
（ｃ）個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し；そして
（ｄ）前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触し、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸と、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が前記標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸と、少なくとも２種の異なったポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの3’部分が3’末端ヌクレオチド塩基でのみ異なり、ここで個々のポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチド塩基がユニーク質量の配列セグメントに対応し、そして前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補対からの配列セグメントフラグメントの検出が標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項５】
多くの異なった標的核酸配列が多くの異なったポリヌクレオチドと接触され、前記異なったポリヌクレオチドの個々はユニーク質量の配列セグメントを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの配列セグメントは前記多くの異なった標的核酸配列の１つの識別体であり、それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が多くの異なった標的核酸配列の少なくとも１つの存在し示す請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるブロッキング成分を含んで成り、そして前記方法がさらに、増幅の前、ポリヌクレオチドからのブロッキング成分を除去する段階を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項７】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る反応混合物。
【請求項８】
ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第２ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項７記載の反応混合物。
【請求項９】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成るキット。
【請求項１０】
陽性対照標的核酸配列をさらに含んで成る請求項９記載のキット。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第２ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項９記載のキット。
【請求項１２】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成り；及び
ｂ）前記第１鎖に対して相補的であり、そして１又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第２鎖（ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである）を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成るアンプリコン。
【請求項１３】
ａ）請求項12記載のアンプリコンを含んで成る組成物；
ｂ）容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも１つの熱モジュレーター；
ｃ）前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも１つの試薬移行成分；及び
ｄ）前記容器において又は支持体上に生成される１又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも１つの検出器を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体を含んで成るシステム。
【請求項１４】
−容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも１つの制御器をさらに含んで成る請求項13記載のシステム。
【請求項１５】
ａ）5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして
ｂ）3’部分が少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る、100個以下の長さの塩基であるポリヌクレオチド。
【請求項１】
標的核酸の検出方法であって、
（ａ）標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
（i）前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
（ii）前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；そして
（iii）前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り；
（ｂ）前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸（NMP）であり；
（ｃ）個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し；そして
（ｄ）前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触し、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸と、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が前記標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸と、少なくとも２種の異なったポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの3’部分が3’末端ヌクレオチド塩基でのみ異なり、ここで個々のポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチド塩基がユニーク質量の配列セグメントに対応し、そして前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補対からの配列セグメントフラグメントの検出が標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項５】
多くの異なった標的核酸配列が多くの異なったポリヌクレオチドと接触され、前記異なったポリヌクレオチドの個々はユニーク質量の配列セグメントを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの配列セグメントは前記多くの異なった標的核酸配列の１つの識別体であり、それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が多くの異なった標的核酸配列の少なくとも１つの存在し示す請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるブロッキング成分を含んで成り、そして前記方法がさらに、増幅の前、ポリヌクレオチドからのブロッキング成分を除去する段階を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項７】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る反応混合物。
【請求項８】
ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第２ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項７記載の反応混合物。
【請求項９】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は１又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り；
ｂ）デオキシリボヌクレオチド（dNTP）の形での少なくとも２つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド（rNTP）の形での少なくとも１つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり；及び
ｃ）デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成るキット。
【請求項１０】
陽性対照標的核酸配列をさらに含んで成る請求項９記載のキット。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第２ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項９記載のキット。
【請求項１２】
ａ）5’部分及び3’部分を含んで成る第１鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして前記3’部分は、少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成り；及び
ｂ）前記第１鎖に対して相補的であり、そして１又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第２鎖（ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである）を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成るアンプリコン。
【請求項１３】
ａ）請求項12記載のアンプリコンを含んで成る組成物；
ｂ）容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも１つの熱モジュレーター；
ｃ）前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも１つの試薬移行成分；及び
ｄ）前記容器において又は支持体上に生成される１又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも１つの検出器を含んで成る少なくとも１つの容器又は支持体を含んで成るシステム。
【請求項１４】
−容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも１つの制御器をさらに含んで成る請求項13記載のシステム。
【請求項１５】
ａ）5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも３個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が１つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり；そして
ｂ）3’部分が少なくとも５個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る、100個以下の長さの塩基であるポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２６１３９２（Ｐ２００９−２６１３９２Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１０１９５３（Ｐ２００９−１０１９５３）
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【出願人】（５０９１１２９０３）サントル ナシオナル ドゥ ジェノティパージュ (1)
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０１９５３（Ｐ２００９−１０１９５３）
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【出願人】（５０９１１２９０３）サントル ナシオナル ドゥ ジェノティパージュ (1)
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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