リポタンパク質界面活性剤
試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーであって、（ａ）式（１）
の界面活性剤［式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ −ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない。］；及び、（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬、を含むセンサー。
の界面活性剤［式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ −ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない。］；及び、（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬、を含むセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、試料中のトリグリセリド又はコレステロール量の決定用センサー及び、このような決定の実施方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
トリグリセリド及びコレステロールは、血中に見出されるリポタンパク質の主要な構成成分である。トリグリセリドは主として、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）内に見出され、一方コレステロールは主として、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）内に見出される。コレステロール及びトリグリセリドは、血中の全てのリポタンパク質画分中に、ある程度存在する。
【０００３】
したがって、血液又は血漿試料について効果的な試験を実施するためには、リポタンパク質がまず分解され、トリグリセリド及びコレステロール（遊離コレステロール及びコレステロールエステルを含む）を遊離させなければならない。一般的にはこれは界面活性剤を使用して達成される。しかし、多くの界面活性剤は、異なるリポタンパク質画分に関して異なる速度で働く。したがって、トリグリセリド又はコレステロール試験が試料中に存在する全ての検体を検出することを保証するためには、全ての反応可能なトリグリセリド又はコレステロールを遊離させることを可能とするのに十分な時間、界面活性剤を試料と反応させることが必要である。
【０００４】
コレステロール及びトリグリセリド検査が家庭において、又は診療所の医師によって、実施されることを可能にする試験キットが入手可能になると、これらの試験における迅速な結果についての需要が著しく増加する。理想的には、試験キットが正確な結果をほんの数秒、又は数分で提供することだろう。この目的を達するためには、血中の全てのリポタンパク質画分を迅速に分解することのできる即効性の界面活性剤が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、コレステロール及びトリグリセリド試験を実施するために特に有用な界面活性剤群を見出した。これらの界面活性剤は、全てのリポタンパク質粒子中のコレステロール、コレステロールエステル及びトリグリセリドに対して、特に速い反応キネティクスを有する。したがってこれらの界面活性剤を包含するコレステロール又はトリグリセリドセンサーは、試料の総コレステロール又はトリグリセリド含量の短時間での信頼性のある測定を提供する。
【０００６】
したがって本発明は、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーであって、
（ａ）式（１）
【０００７】
【化１】
【０００８】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない］の界面活性剤；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含むセンサーを提供する。
【０００９】
また、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリドの量の決定方法であって、
− 上記で定義されるような界面活性剤と試料を接触させる工程；及び、
− 存在するコレステロール及び／又はトリグリセリドの量を決定する工程
を含む方法も提供する。
【００１０】
本発明のセンサーは、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロールの量の決定用である。誤解を避けるために、これは、センサーが試料中のトリグリセリドの総量及び／又はコレステロールの総量の決定用であることを意味する。総コレステロールは、試料中のＨＤＬ及びＬＤＬ画分の両方に存在するコレステロールを含み得る（当然、遊離コレステロール及び、試料中の任意の他の形態で存在するコレステロール、例えばコレステロールエステルなども、同様に含み得る）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１（ａ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｂ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｃ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｄ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｅ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｆ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明のセンサーは、リポタンパク質を含む任意の試料のコレステロール又はトリグリセリドレベルを測定するために使用され得る。典型的には、分析は、ヒト又は動物の任意の体液について実施され得、典型的には例えば、全血、血清又は血漿試料について実施され得る。本発明において用いられる好適な試料としては、血清及び血漿である。測定が全血について実施される場合、本方法は、赤血球を除去するために血液をろ過する追加の工程を含み得る。
【００１３】
界面活性剤はサッカリドであり、それはＤ−サッカリド又はＬ−サッカリドであり得、Ｄ−サッカリドが好ましい。α及びβアイソフォームの両方が使用され得る。一実施形態においては、βアイソフォームが好ましい。
【００１４】
界面活性剤は一般式（１）を有する：
【００１５】
【化２】
【００１６】
式１において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシではない。
【００１７】
好ましくは、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の１又は２（最も好ましくは１）は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＳＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＳＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、残りの基は−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシであり、好ましくは−ＯＨである。
【００１８】
一般式（１）の界面活性剤は一般式（Ｉ）を有することが好ましい：
【００１９】
【化３】
【００２０】
［式中：
ｉ）Ｒ１は、式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり；Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである；又は、
ｉｉ）Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である］。
【００２１】
本発明の第一の実施形態において、界面活性剤は一般式（Ｉ）を有し、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり、Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである。この実施形態において、ｍ’は好ましくは３から１０であり、例えば４から９である。特に好ましくは、ｍ’は６又は７であり、最も好ましくは６である。さらに、この実施形態において、Ｘは好ましくは−ＯＨ又はメトキシであり、最も好ましくはメトキシである。この実施形態中、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３を有することが好ましい。この実施形態における具体的な好ましい界面活性剤はメチル−６−Ｏ−（Ｎ−アルキルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドであり、ここで該アルキル基は５から１０の炭素原子を含む。これらの界面活性剤は、Ａｎａｔｒａｃｅから、Ａｎａｍｅｇ−５、Ａｎａｍｅｇ−６、Ａｎａｍｅｇ−７、Ａｎａｍｅｇ−８、Ａｎａｍｅｇ−９及びＡｎａｍｅｇ−１０として入手可能である（インデックスはアルキル鎖（すなわち、（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３基）の全長を示す）。特に好ましい界面活性剤はＯ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドであり、これはＡｎａｍｅｇ−７である。
【００２２】
本発明の第二の実施形態において、界面活性剤は一般式（Ｉ）を有し、Ｒ１は水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。この第二の実施形態において、Ｒ１は好ましくは水素又はメチルであり、最も好ましくは水素である。ｍは好ましくは５から９であり、例えば６から８である。さらに、ｍ”は好ましくは４から６である。なおさらに、ｎは好ましくは０から５であり、例えば０から３である。Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル基であり得、シクロペンチル及びシクロヘキシル、特にシクロヘキシルが好ましい。Ａ基は好ましくはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、最も好ましくはシクロヘキシルである。Ａがシクロアルキル基であるとき、ｎは好ましくは少なくとも１、例えば１から５である。Ａがフェニル基であるとき、ｎは好ましくは０から３である。
【００２３】
本発明の第二の実施形態において、界面活性剤の一つの好ましい群としては、Ｘが式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基である場合である。具体的な好ましい界面活性剤は、ｎ−アルキル−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、ここで該アルキル基は６から１０の炭素原子を含み、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰとして知られ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰとして知られ、同様にＡｎａｔｒａｃｅから入手可能）などである。他の具体的な好ましい界面活性剤は、ｎ−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−アルキル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−アルキル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びｎ−アルキル−β−Ｄ−マンノピラノシドであり、ここで該アルキル基は６から１０の炭素原子を含み：例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びｎ−オクチル−β−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００２４】
本発明の第二の実施形態における界面活性剤の別の好ましい群は、Ｘが式−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａの基である場合である。具体的な好ましい界面活性剤は、３−シクロヘキシル−１−メチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−１として知られる）、３−シクロヘキシル−１−エチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−２として知られる）及び特に３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３として知られる）であり、全てＡｎａｔｒａｃｅから入手可能である。Ａがフェニル基のとき、ｎは好ましくは０から８であり、例えば０から４である。さらに具体的な好ましい界面活性剤は、フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド、フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフェニルエチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。
【００２５】
本発明における特に好ましい界面活性剤は、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド及び３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである。
【００２６】
界面活性剤は、好ましくは式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）の界面活性剤である：
【００２７】
【化４】
【００２８】
したがって、式（Ｉａ）の界面活性剤は、好ましくはグルコピラノース（式（Ｉａ））、ガラクトピラノース（式（Ｉｂ））又はマンノピラノース（式（Ｉｃ））であり得る。
【００２９】
本発明の更なる実施形態において、界面活性剤は化学式（Ｉｘ）又は（ＩＩ）の界面活性剤である
【００３０】
【化５】
【００３１】
サッカリド−Ｏ（ＣＨ２）ＮＡ （ＩＩ）
【００３２】
［式中、Ｒ１’は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでＭは６から２０であり、Ｒ２は水素又はメチルであり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、Ｎは１から１０である］。
【００３３】
この更なる実施形態において、界面活性剤は、式（Ｉｘ）の６−Ｏ−カルバモイルサッカリドであり得る。好ましくは、式（Ｉｘ）の界面活性剤はグルコシドである。Ｍは典型的には６から１０であり、例えば６又は７である。好ましい界面活性剤としては、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｎａｍｅｇ−７、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）が挙げられる。
【００３４】
また、この更なる実施形態において、界面活性剤は式（ＩＩ）の界面活性剤であり得、したがって式Ａ−（ＣＨ２）Ｎ−ＯＨのアルコールとサッカリドの反応に由来し得る。したがって、式（ＩＩ）の化合物はサッカリド分子からなり、ここで少なくとも１の（例えば１の）−ＯＨ基は、−Ｏ（ＣＨ２）Ｎ−Ａ基で置換されている。サッカリドは、モノ、ジ又はトリサッカリドであり得、例えばグルコース、マルトース、マルトトリオース又はスクロースである。モノサッカリド（特にグルコース）が好ましい。界面活性剤は好ましくは１−グルコシドである。シクロアルキル基Ａは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル基であり得、シクロペンチル及びシクロヘキシル（特にシクロヘキシル）が好ましい。Ｎは好ましくは１から８であり、典型的には２から６である。好ましい界面活性剤としては、３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）が挙げられる。
【００３５】
また、この更なる実施形態において、本発明において使用される界面活性剤は、式（Ｉｘｘ）の界面活性剤であり得る：
【００３６】
【化６】
【００３７】
［式中、Ｒ１１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり且つＲ１２は水素若しくはメチルである；又はＲ１１は水素であり且つＲ１２は−（ＣＨ２）Ｎ−Ａである、のいずれかであり、ここでＡ、Ｎ及びＭは上記定義される通りである。］
【００３８】
本発明において、界面活性剤は特定のＨＬＢ値を有することが好ましい。ＨＬＢ値は、界面活性剤との関連で周知のパラメーターであり、界面活性剤の親水性を表すものである。特定の界面活性剤のＨＬＢ値は、Raboron et al., International Journal of Pharmaceutics, Vol 99, 1993, p23-36に記載されるような、ＮＭＲ法を使用して、容易に得られ得る。この参照文献は、ＨＬＢ値が、
【００３９】
【数１】
【００４０】
［式中、
【００４１】
【数２】
【００４２】
であり、ここでＡ親水性は親水基についての化学シフトのＮＭＲ積分値であり、Ａ全体は界面活性剤における全ての化学シフトのＮＭＲ積分値である］として計算され得ることを示す。
【００４３】
上記方法を使用して得られる本発明の特定の具体的な界面活性剤についてのＨＬＢ値は以下の通りである：
【００４４】
【表１】
【００４５】
本発明において、界面活性剤は、５から１６、例えば７から１４のＨＬＢ値を有することが好ましい。
【００４６】
本発明の界面活性剤は、商業的に入手可能な製品であり、又は当業者によって標準的な合成技術を使用して製造され得る。本発明において用いられ得る界面活性剤の更なる例、及びこれらの界面活性剤の合成に関する詳細は、ＵＳ ５，２２３，４１１及びＵＳ ５，７６３，５８６において見出され得る。
【００４７】
界面活性剤は、典型的には、試験されるべき試料と混合される場合、界面活性剤及び任意の他の使用される試薬と試料の混合物中の界面活性剤の濃度が、少なくとも１０ｍＭ、好ましくは少なくとも２０ｍＭ、例えば少なくとも２５ｍＭであるような量で提供される。
【００４８】
本明細書中に記載される界面活性剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。したがって、本発明のセンサーは、式（１）の一界面活性剤、例えば化学式（Ｉ）の界面活性剤を唯一の界面活性剤として、又は式（１）の界面活性剤を１以上の更なる界面活性剤と共に、含んでいてもよい。１以上の更なる界面活性剤も、一般式（１）に含まれ得る。一実施形態において、センサーは、２以上、例えば５までの界面活性剤を含み、それらは異なるが、それぞれ一般式（１）及び好ましくは一般式（Ｉ）を有する。例えば、センサーは、２つのこのような界面活性剤を含み得る。好ましい組み合わせは、
−Ａｎａｍｅｇ−７及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−Ｃｙｇｌｕ−３及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３
である。また、好ましくは、Ａｎａｍｅｇ−７、Ｃｙｇｌｕ−３及びＯＧＰのうち少なくとも２つを含む組み合わせである。
【００４９】
本発明の界面活性剤により遊離されるトリグリセリド又はコレステロールは酵素試薬と反応し、試料中に存在するトリグリセリド又はコレステロール量の定量測定を提供する。使用される酵素試薬は特に限定されず、トリグリセリド又はコレステロール試験の実施に適した任意の酵素が使用され得る。例えば、コレステロールの場合、酵素試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ又はコレステロールオキシダーゼを含み得る。トリグリセリド試験においては、使用され得る酵素試薬の例は、グリセロールリン酸オキシダーゼと組み合わせた、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びグリセロールキナーゼである。
【００５０】
任意の商業的に入手可能な形態のコレステロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼが利用され得る。例としては、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えば、ノカルジア属（Nocardia species）由来であり、グリセロールデヒドロゲナーゼは、例えば、セルロモナス属（Cellulomonas species）由来である。デヒドロゲナーゼは、０．１から１００ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から４５ｍｇ／ｍｌの試料の量で使用され得る。
【００５１】
リポタンパク質の界面活性剤との反応は、典型的には、遊離の形態及びコレステロールエステルの形態の両方で、コレステロールを遊離させる。したがってコレステロール試験においては、酵素試薬は、典型的には、エステルを遊離コレステロールへと分解するために、コレステロールエステル加水分解試薬を含む。コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステルをコレステロールに加水分解することのできる任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応及び、アッセイにおけるその後の任意の工程を妨げない試薬でなければならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は、酵素、例えばコレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。適切なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）属又はクロモバクテリウム ビスコサム（Chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。コレステロールエステル加水分解試薬は、０．１から２５ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から２０ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から２５ｍｇ／ｍｌ（例えば０．５から１５ｍｇ／ｍｌなど）の試料の量で使用され得る。
【００５２】
トリグリセリド試験においては、トリグリセリド含量を決定するために、典型的にはグリセロール酵素が使用される。したがってリポタンパク質から遊離されるトリグリセリドは、グリセロールデヒドロゲナーゼとの反応の前に、まずグリセロールへと分解されなければならない。典型的にはこれは、酵素試薬中にトリグリセリド加水分解試薬を含めることにより達成される。デヒドロゲナーゼ酵素の活性を阻害しない限り、トリグリセリドをグリセロールへと加水分解する任意の試薬が使用され得る。リパーゼ及びエステラーゼは、トリグリセリド加水分解試薬の適切な例である。コレステロールエステル加水分解試薬として上記したリパーゼは、トリグリセリドの加水分解における使用にも適している。トリグリセリド加水分解試薬は、０．１から１００ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から７０ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から２５ｍｇ／ｍｌ（例えば０．５から１５ｍｇ／ｍｌなど）の試料の量で使用され得る。一実施形態において、トリグリセリド加水分解試薬は、０．１から２５ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から２０ｍｇ／ｍｌの試料の量で使用される。
【００５３】
各酵素は、安定剤又は保存剤などの添加剤を含み得る。さらに、各酵素は化学的に修飾され得る。
【００５４】
酵素試薬と反応するコレステロール又はトリグリセリドの量の決定を実施するために、必要に応じて、更なる試薬が本発明のセンサー中に存在し得る。安定剤、緩衝剤及び賦形剤などの添加剤も使用され得る。酵素を活性化するための試薬も添加され得る。例えば塩化アンモニウムが、グリセロールデヒドロゲナーゼを活性化するために使用され得る。
【００５５】
界面活性剤は、他の試薬の添加の前に、又は他の試薬の添加と同時に、試料へと添加され得る。好ましい実施形態において、酵素試薬及び界面活性剤は、単一の試薬混合物（単一工程において試料と合わせられる）中に存在する。特に好ましい実施形態において、本方法は、試料を試薬と接触させる単一工程を含み、それゆえ単一の試薬混合物のみが提供される必要がある。
【００５６】
本発明のセンサーは、試料のコレステロール又はトリグリセリド含量を、任意の適切な技術により決定し得る。例えば、ペルオキシダーゼ及び発色剤（colour forming agent）が使用され得、検体のオキシダーゼ酵素との反応により生成される過酸化水素を決定し得る。当業者はこのような方法に精通しているであろう。オキシダーゼシステムを利用するトリグリセリド検出用センサーにおいて、例えば以下の試薬が使用され得る：リパーゼ又はコレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びメディエーター。オキシダーゼシステムを利用するコレステロール検出用センサーにおいて、例えば以下の試薬が使用され得る：リパーゼ又はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びメディエーター。このようなセンサーにおける使用に適したこれらの試薬の特定の例が、以下、より詳細に説明される。
【００５７】
好ましい実施形態においては電気化学分析が使用され、この実施形態は以下にさらに詳細に記載される。しかし当然のことながら、本発明が電気化学分析に限定されることを意図するものではない。
【００５８】
電気化学分析において、酵素試薬と反応したコレステロール又はトリグリセリド量は、電極において起こる電気化学応答を測定することにより決定される。この実施形態において、試料は、典型的には、界面活性剤、酵素試薬、酵素試薬と相互作用することのできる補酵素、及び酸化還元剤（酸化又は還元されることができ、電極において電気化学的に検出され得る生成物を形成する）と反応する。試料及び試薬の混合物は、引き起こされる酸化還元反応が検出され得るように、電気化学セルの作用電極と接触させられる。電位がセルに印加され、結果として起こる電気化学応答（典型的には電流）が測定される。
【００５９】
この好ましい実施形態において、コレステロール量は以下のアッセイに従って測定される：
【００６０】
【化７】
【００６１】
ここでＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである。
【００６２】
同様に、トリグリセリドセンサーについて、存在するトリグリセリド量は以下のアッセイに従って決定され得る：
【００６３】
【化８】
【００６４】
ここでＧｌｙＤはグリセロールデヒドロゲナーゼである。いずれのアッセイにおいても、アッセイによって生成された還元型酸化還元剤の量は、電気化学的に検出される。適切な場合、追加の試薬もこのアッセイに含まれ得る。
【００６５】
典型的には、試料は全ての試薬と単一の工程において接触する。したがって、センサーは典型的には、全ての必要な試薬を含み、且つアッセイを実施するために試料と容易に接触させられ得る、試薬混合物を含む。該試薬混合物は典型的には、界面活性剤を１０から５００ｍＭ、好ましくは２５から２００ｍＭ、特に、少なくとも５０ｍＭ、又は少なくとも７５ｍＭの濃度で含む。加水分解試薬は典型的には、０．１から２５ｍｇ、好ましくは約０．５から２０ｍｇ／ｍｌの試料の量で存在し、デヒドロゲナーゼは、０．１から１００ｍｇ、好ましくは０．５から４５ｍｇ／ｍｌの試料の量で存在する。
【００６６】
各試薬の量は、試薬混合物中の濃度の表現で、又は質量／ｍｌ試薬混合物の表現で、本明細書中に明記される。しかし試薬混合物が溶液の形態で提供されることは必須ではない。あるいはそれは乾燥された形態で提供され得、例えばそれは凍結乾燥され得る。これらの実施形態において、本明細書中に記載される試薬の量とは、乾燥前の試薬混合物の溶液又は懸濁液中の濃度又は質量をいう。
【００６７】
典型的には補酵素は、ＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通の構造特性を有する化合物であり、同様にコレステロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼについての補酵素として働く。
【００６８】
ＮＡＤ＋アナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオ−ＮＡＤ）;ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は典型的には、試薬混合物中に、１から２０ｍＭ、例えば３から１５ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭの量で存在する。
【００６９】
典型的には、酸化還元剤は、上記に示されるアッセイに従って還元され得るものであるべきである。この場合、酸化還元剤は、補酵素からの（又は下記のようにレダクターゼからの）電子を受容でき、且つ電子を電極に移動できるものであるべきである。酸化還元剤は分子又はイオン結合型錯体であり得る。それは、タンパク質などの天然に存在する電子受容体であり得、又は合成分子であり得る。酸化還元剤は典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有する。
【００７０】
好ましくは、酸化還元剤は、無機錯体である。この剤は金属イオンを含み得、好ましくは少なくとも二価を有する。特に、この剤は遷移金属イオンを含み得、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムが挙げられる。酸化還元剤は荷電していてもよく、例えばそれは陽イオン性又はあるいは陰イオン性であり得る。適切な陽イオン性剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋などのルテニウム錯体である。適切な陰イオン性剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−などのフェリシアン化物錯体である。
【００７１】
使用され得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）（本明細書中、以後ＲｕＡｃａｃと言う）及びそのキレート性アミン配位子誘導体（例えばエチレンジアミンなど）、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及びその誘導体であって、１以上の−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及び−ＣＯ２Ｈなどの基が、２つのシクロペンタジエニル環のうちの一方又は両方へと置換されているものが挙げられる。好ましくは、無機錯体は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００７２】
酸化還元剤は典型的には、試薬混合物中に、１０から２００ｍＭ、例えば２０から１５０ｍＭ、好ましくは３０から１００ｍＭ、又は８０ｍＭまでの量で存在する。
【００７３】
好ましい実施形態において、電気化学アッセイにおいて使用される試薬混合物は、さらにレダクターゼを含む。該レダクターゼは典型的には、還元型ＮＡＤ又はそのアナログから２電子を移動させ、２電子を酸化還元剤へと移動させる。したがってレダクターゼの使用は、速い電子の移動を提供する。
【００７４】
使用され得るレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ及びチトクロムＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロムＰ４５０ｃａｍ酵素システムのプチダレドキシン（putidaredoxin）レダクターゼ、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレン草フェロドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、チトクロムｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸レダクターゼ、テルプレドキシン（terpredoxin）レダクターゼ並びに酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明における使用のための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００７５】
レダクターゼは、精製又は単離されている組換えタンパク質又は天然に存在するタンパク質であり得る。レダクターゼは、それが電子移動を行なう速度を最適化するためなどのその性能、又はその基質特異性を向上させるために、変異導入されていてもよい。
【００７６】
レダクターゼは典型的には、試薬混合物中に、０．５から１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１から５０ｍｇ／ｍｌ、１から３０ｍｇ／ｍｌ又は２から２０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、コレステロールアッセイの一般的なスキームは以下の通りであり：
【００７８】
【化９】
【００７９】
そして、トリグリセリドアッセイの一般的なスキームは以下の通りであり：
【００８０】
【化１０】
【００８１】
ここで
ＰｄＲ − はプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａ − はジアホラーゼであり、
ＣｈＤ − はコレステロールデヒドロゲナーゼであり、
ＧｌｙＤ − はグリセロールデヒドロゲナーゼである。
【００８２】
デヒドロゲナーゼがオキシダーゼにより置換され得、結果としてカスケードへの変化を生じ、電気化学を介した過酸化物又は酵素の測定を可能にし得ることは、当業者に周知であろう。
【００８３】
試薬混合物は、１以上の追加の構成成分（例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤及び／又は安定剤）を随意に含む。該賦形剤は試薬混合物中に含まれることが好ましく、それにより、当分野で周知のように、混合物を安定化することができ、及び随意に、試薬混合物が本発明の装置上で乾燥される場合には、乾燥混合物に多孔性を提供することができる。適切な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトースなどの糖、グリシン及びＰＥＧが挙げられる。該緩衝剤も、最適な酵素活性のために必要なｐＨを提供するために含まれ得る。例えば、トリス緩衝剤（ｐＨ９）が使用され得る。該安定剤は、例えば酵素の安定性を高めるために添加され得る。適切な安定剤の例としては、アミノ酸（例えばグリシン）及びエクトイン（ectoine）である。
【００８４】
本発明のセンサーは典型的には、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール又はトリグリセリドの量の測定用検出装置を含む。好ましい実施形態において、センサーはコレステロール又はトリグリセリド含量の電気化学的測定用である。この実施形態において、センサーとしては少なくとも２つの電極を有する電気化学セルが挙げられる。該セルは、作用電極及び、擬似基準電極としても働く対電極を有する二電極システムであり得る。あるいは、セルは、作用電極、基準電極及び対電極を有する三電極システムであり得る。好ましい実施形態において、セルの作用電極は、微小電極、例えば、５０μｍ以下の幅を有するマイクロバンド（microband）電極である。典型的には、電極は、水溶性セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）又は非置換（non-substituted）水溶性サッカリド（例えば、グルコース、フルクトース、トレハロース、スクロース、ラクトース又はマルトース）を含む被覆層を備えていない。
【００８５】
センサーは典型的には、測定ユニット（セルに電位を供給するための電力供給装置及び結果として生じる電気化学応答（典型的にはセルを横切る電流）の測定のための測定器を含む）も含む。
【００８６】
典型的には、界面活性剤及び酵素試薬、及び必要な任意の更なる試薬は、適切な液体（例えば水又は緩衝液）中に懸濁／溶解され、センサーへ供給される単一の試薬混合物として、一緒に混合される。次いで試薬混合物は、典型的には、適切な位置において乾燥される。センサー内／上で物質を乾燥するこの工程は、所望の位置に物質を保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）により、好ましくは凍結乾燥により実施され得る。試薬混合物は典型的には、電極の近くに配置され、それゆえ試料が試薬混合物に接触するとき、電極との接触も起こる。
【００８７】
センサーは、試験されるべき試料が試薬混合物との接触前に通過する膜を随意に含み得る。該膜は、例えば、赤血球（red blood cells）、赤血球（erythrocytes）及び／又はリンパ球などの構成成分をろ過して除くために使用され得る。適切なろ過膜（血液ろ過膜を含む）は当分野において公知である。血液ろ過膜の例は、Ｐａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘである。ガラス繊維（Fibreglass）フィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は、全血から血漿を分離することができ、全血検体が装置に供給され、試験されるべき試料が血漿である場合の使用に適している。
【００８８】
別の又は追加の膜も使用され得、使用前に親水性又は疎水性処理が施されたものが含まれる。膜の他の表面特性も、所望の場合には改変され得る。例えば、水中での膜の接触角度を変更するための処理は、膜を通過する所望の試料の流れを促進するために使用され得る。膜は１、２又はそれ以上の物質の層を含み得、それぞれは同じでも異なってもよい。例えば、異なる膜物質の２層を含む常套的な二重層膜が使用され得る。
【００８９】
本発明における使用のための適切な装置としては、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載されているものが挙げられる。
【００９０】
上記実施形態において、本発明のセンサーはトリグリセリド又はコレステロール検出用である。しかし、当業者は、単一のセンサーが試料のトリグリセリド及びコレステロール含量の両方の測定を提供するために使用され得ることを理解するであろう。一実施形態において、これは、センサー内に２つの電気化学セル（試料のコレステロール含量の測定のために採用されるもの、及び試料のトリグリセリド含量の測定のために採用されるもの）を含めることにより達成される。ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載されるセンサーにおいて、これは、レセプタクルの形態で１つの電気化学セルにコレステロール試験用の適切な試薬を提供し、レセプタクルの形態で第二の電気化学セルにトリグリセリド試験用の適切な試薬を提供することにより、達成され得る。次いでセンサーは、試薬混合物が適切な電気化学セル内の適切な位置で乾燥されるように、凍結乾燥工程に供され得る。この実施形態において、２つの試薬混合物は、２つのアッセイが互いを妨げることなく同時に実施され得るように、限定的な位置に固定される。
【００９１】
本発明の方法において、試験されるべき試料は、コレステロール又はトリグリセリド含量が測定されることを可能にするために、本明細書に記載の界面活性剤と接触させられ、さらに１以上の他の試薬と接触させられる。典型的には、試料は、本明細書に記載の試薬混合物と接触させられ、コレステロール又はトリグリセリド含量は電気化学的に測定される。
【００９２】
測定する前に、試薬混合物が試料と混合し、反応が起こるのに十分な時間（「ウェットアップ（wet-up）」期間）が許容されなければならない。凍結乾燥試薬を含むセンサーと血漿試料が使用される場合、界面活性剤及び酵素試薬との試料の接触と試験の開始の間に、およそ２０から３０秒の時間が経過する。このウェットアップ期間は、２０秒の短さであり得、又は１５秒でさえあり得るが、４５秒又は２分まででもよい。この短いウェットアップ期間は、本発明の界面活性剤に、試料中に存在する全ての種類のリポタンパク質産物を分解させ、遊離したコレステロール又はトリグリセリドが酵素試薬と反応することを可能にするのに十分である。全血が使用される場合、血球の除去を許容するために追加の時間が必要とされ得る。例えば、全血試料はセンサーに提供され得、血球の除去及び取り込み／試薬混合物との反応のために、４又は５分の期間が提供され得る。
【００９３】
電気化学的決定において、試薬混合物は典型的には、試料添加の前に電気化学セル内に存在する。セルへの試料の添加により上記ウェットアップ期間が開始され、ウェットアップ期間が経過した後に電位の印加が起こる。別の実施形態においては、試料は電極から離れて試薬と混合され、セルに添加されると直ぐに電位が印加される。
【００９４】
電気化学応答は、試料の添加後１０秒から５分の期間内に測定される。典型的には、電気化学応答は、試料の添加後少なくとも０．５分、例えば少なくとも１分で決定される。好ましい実施形態において、電気化学応答は、試料の添加後少なくとも１．５分、好ましくは少なくとも２分で決定される。
【００９５】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極において検出されるべき生成物である場合、セルに印加される電位は０．１Ｖから０．３Ｖである。好ましい印加電位は０．１５Ｖである。（本明細書中で言及される全ての電圧は、０．１Ｍ塩化物で、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して示される。）好ましい実施形態において、電位はまず、約１から４秒間、０．１５Ｖの正印加電位にされ、次いで、還元電流の測定が望まれる場合には、負印加電位にされる。異なる酸化還元剤が使用される場合、印加電位は、酸化／還元ピークが生じる電位に従って変更され得る。電位が印加される時間の長さも変わり得る。
【００９６】
したがって本発明の電気化学試験は、コレステロール及び／又はトリグリセリドの測定が非常に短い時間、典型的には装置への試料の添加から約５分以内に又は４分以内になされることを可能にする。
【００９７】
本発明は、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリドの総量を決定するために、試料中の全てのリポタンパク質画分を分解するための式（１）の界面活性剤（好ましくは式（Ｉ）の界面活性剤）の使用も提供する。
【００９８】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーを提供し、該センサーは、
（ａ）式（Ｉｘ）又は（ＩＩ）の界面活性剤
【００９９】
【化１１】
【０１００】
サッカリド−Ｏ（ＣＨ２）ＮＡ （ＩＩ）
［式中、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでＭは６から２０であり、Ｒ２は水素又はメチルであり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、Ｎは１から１０である］；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含む。
この実施形態において、界面活性剤は好ましくは式（Ｉｘｘ）の界面活性剤である：
【０１０１】
【化１２】
【０１０２】
［式中、Ｒ１１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり且つＲ１２は水素若しくはメチルである；又はＲ１１は水素であり且つＲ１２は−（ＣＨ２）Ｎ−Ａである、のいずれかである。Ｍは６から１０であり、Ｎは２から６であり、Ａはシクロヘキシルであることが好ましい。］。具体的な好ましい界面活性剤は、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド又は３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである。この実施形態において、センサーはさらに、少なくとも２つの電極を有する電気化学セル；補酵素及び、酸化され又は還元されて生成物を形成することのできる酸化還元剤；及び随意にさらにレダクターゼを含み得る。典型的には、界面活性剤、酵素試薬及び、使用する場合には補酵素、酸化還元剤及び／又はレダクターゼは、単一の試薬混合物として存在する。コレステロール測定用酵素試薬は、例えば、（ｉ）コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ及び（ｉｉ）コレステロールデヒドロゲナーゼを含み得る。トリグリセリド測定用酵素試薬は、例えば、（ｉ）コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ及び（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼを含み得る。例えば、トリグリセリド測定用酵素試薬は、リパーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼを含み得る。
【０１０３】
この具体的な実施形態において、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定方法も提供され、本方法は、
−試料をこの実施形態の界面活性剤と接触させる工程；及び、
−存在するコレステロール及び／又はトリグリセリド量を決定する工程
を含む。
この方法において、コレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定は、典型的には電気化学的決定である。例えば、本方法は、電気化学セル内において試料を界面活性剤、酵素試薬、補酵素、酸化還元剤及び随意にレダクターゼと接触させること、電気化学セルに電位を印加すること、及びセルの電気化学応答を決定することを含み得る。好ましくは、セルの電気化学応答は、試料を界面活性剤と接触させた後、少なくとも１．５分で決定される。好ましくは、試料と接触させられる界面活性剤の量は、試料と界面活性剤とを組み合わせたものの中で、少なくとも２０ｍＭの界面活性剤濃度を提供するのに十分な量である。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３
本実験の目的は、血漿ＨＤＬ又はＬＤＬの測定における新規界面活性剤の効果について、その界面活性剤で調製したコレステロールセンサーを調べることであった。
【０１０５】
方法
３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液
トリス緩衝液、ＫＯＨ、β−ラクトース及びＲｕ（Ａｃａｃ）を混合することにより、Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液を調製し、１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖβ−ラクトース及び３０ｍＭＲｕ（Ａｃａｃ）を含む溶液を得た。この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサー（acoustic mixer）を使用して混合した。Ｒｕ(Ａｃａｃ)＝Ｒｕ(ａｃａｃ)２(Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ)（Ｐｙ−３−ＣＯ２）
【０１０６】
Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３溶液
関連する界面活性剤をＲｕ（Ａｃａｃ）溶液に添加することにより、二倍濃度のＡｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３溶液を作製し、以下の終濃度とした：
Ａｎａｍｅｇ−７（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ａ３４０）
２００ｍＭ（１３１μｌＲｕ（Ａｃａｃ）溶液中０．００８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ原液３７．５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液３７．５μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ原液２５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液７５μｌ）
Ｃｙｇｌｕ−３（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ｃ３２３Ｇ）
２００ｍＭ（１２５μｌＲｕ（Ａｃａｃ）溶液中０．００７７ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ原液３７．５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液３７．５μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ原液２５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液７５μｌ）
【０１０７】
酵素混合物
酵素及び補酵素をＲｕ（Ａｃａｃ）溶液に添加することにより、二倍濃度で酵素混合物を作製し、以下の終濃度とした：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社（Oriental Yeast Co））
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）
６．７ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム（Genzyme））
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチン無添加（天野（Amano）、ＣＨＤＨ−６）
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを使用して混合した。
【０１０８】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液について、等容量（およそ５０ｕｌ）の二倍濃度の酵素溶液及びＡｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３溶液を１：１で混合し、最終酵素／界面活性剤混合物を得た。０．４μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１０９】
血漿試料
血漿試料は、５分間２９００ＲＣＦにて遠心する前に、３０分間解凍した。脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も試料として使用した。試料は、総コレステロール、トリグリセリド（ＴＧ）、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロール濃度について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０１１０】
試験プロトコール１
電気化学セル当たり、１５μｌの血漿試料を使用した。１５μｌの血漿の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始した。酸化電流を１３時点（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）において０．１５Ｖで測定し、還元電流を最終時点（４１６秒）において−０．４５Ｖで測定した。電流は、明記した各時点において４秒間測定した。各試料は二連で試験した。
【０１１１】
試験プロトコール２
電気化学セル当たり、１５μｌの血漿試料を使用した。１５μｌの血漿の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始した。酸化電流を１３時点（０、３４、６８、１０２、１３６、１７０、２０４、２３８、２７２、３０６、３４０、３７４及び４０８秒）において０．１５Ｖで測定し、還元電流を最終時点（４４２秒）において−０．４５Ｖで測定した。電流は、明記した各時点において４秒間測定した。各試料は二連で試験した。
【０１１２】
分析
集めた電流測定値を、ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール濃度に対してプロットした。各時点の勾配を使用して、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定間で得られる％ディファレンシエーション（% differentiation）を計算した。各時点におけるＨＤＬ及びＬＤＬへの較正プロットについての傾き及び切片を表１Ａに示し、これらの界面活性剤が、特に３２秒を超える時間において、ＨＤＬ及びＬＤＬの両方に働くことを示す。
【０１１３】
ＨＤＬ及びＬＤＬの間のディファレンシエーションは、方程式（ｉ）：
【０１１４】
【数３】
【０１１５】
に従ってＨＤＬについて決定し得、ここでＧｘは測定したＸへの応答の勾配である（例えば、Ｘの既知の濃度に対して測定した電流）。測定した応答は、リポタンパク質濃度に関する（又は対応する）、例えば、リポタンパク質濃度に比例する、任意の測定値であり得る。
【０１１６】
Ａｎａｍｅｇ−７で調製したセンサーについて、応答のＨＤＬ勾配は低く、界面活性剤濃度の上昇に伴い低下する。応答のＬＤＬ勾配は界面活性剤濃度に伴い増加し、比較的高い。これは、ＨＤＬが界面活性剤と急速に反応し、その後ＬＤＬへ強く応答したことを示し得る。Ｃｙｇｌｕ−３で調製したセンサーで、同様の効果が見られる。
【０１１７】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総コレステロール濃度に対してもプロットした。各時点における総コレステロールに対する較正プロットについての傾き及び切片を表１Ｂに示す。長時間における総コレステロールへの応答の勾配は、１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３について高く、切片は低いことから、センサーはＨＤＬ又はＬＤＬコレステロールよりはむしろ総コレステロールに応答することを示す。
【０１１８】
総コレステロールへの応答についての較正プロットを図１に示す。図１（ａ）から（ｃ）は、界面活性剤としてＡｎａｍｅｇ−７（（ａ）２５ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７；（ｂ）５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７；（ｃ）１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７）を使用して２８８秒において取得した電流測定値に関し、図１（ｄ）から（ｆ）は、界面活性剤としてＣｙｇｌｕ−３（（ｄ）２５ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３；（ｅ）５０ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３；（ｆ）１００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３）を使用して３２０秒において取得した電流測定値に関する。
【０１１９】
図１は、１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３を含むセンサーが優れた直線性及び総コレステロールへの高い応答の勾配を与えることを示す。
【０１２０】
実施例２から１４
一般的な製剤及び／又は試験手順における小さな変更を伴いながら、同じ基本の酵素混合物を使用して、いくつかの実験を実施した。これらの各実施例において記載する改変は、以下に説明する一般的なディテールについて行なう変更に関するものである。
【０１２１】
酵素混合物
一般的な酵素混合物には、以下の構成成分を含めた：
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）
４０ｍＭ ＫＯＨ
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）
１０％ラクトース
１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７
５００ｍＭ ＮａＣｌ
８．９ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４．２ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３．３ｍｇ／ｍｌリパーゼ
２２ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチン無添加（ＣｈＤＨ）。
【０１２２】
分注及び凍結乾燥
０．４μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１２３】
血漿試料
血漿又は脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）でセンサーを試験した。試料は、総コレステロール及びトリグリセリド濃度の両方について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０１２４】
試験プロトコール
各電気化学セルに、１２μｌの血漿試料を添加した。試料の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始し、実施例１のプロトコール１におけるのと同じ一連の電流測定値を得た。
【０１２５】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総コレステロール濃度に対してプロットした。次いで、選択した時点における総コレステロールに対する較正プロットについての傾き及び切片を計算した。
【０１２６】
実施例２：異なるアルキル鎖長
製剤及び試験手順は上記説明した通りであり、以下の改変を伴った：
４０ｍＭ ＫＯＨではなく、３０ｍＭ ＫＯＨを使用し、
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）ではなく、３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を使用し、
混合物中にＮａＣｌは含めなかった。
【０１２７】
Ａｎａｍｅｇ−７界面活性剤を以下の界面活性剤により置き換え、０、２５、５０及び１００ｍＭの濃度で使用した：
−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｘＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）。
【０１２８】
結果を表２に示す。
【０１２９】
実施例３：異なるイオン強度
製剤及び試験手順は上記説明した通りであり、以下の改変を伴った：
【０１３０】
塩を、一般的な酵素混合物から以下のように添加又は排除した：
−混合物中に塩を含めない
−混合物中に２５０ｍＭ ＫＣｌ又はＮａＣｌを含める
−混合物中に５００ｍＭ ＫＣｌを含める。
【０１３１】
結果を表３に示す。
【０１３２】
実施例４：ラクトースのＢＳＡへの置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、ラクトースを１％、２％及び３％の濃度のＢＳＡにより置き換えた。
【０１３３】
結果を表４に示す。
【０１３４】
実施例５：コレステロールデヒドロゲナーゼ濃度のバリエーション
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、コレステロールデヒドロゲナーゼ濃度を、２２、４４、及び６６ｍｇ／ｍｌで試験した。
試験を、実施例１のプロトコール２に従って完了した。
【０１３５】
結果を表５に示す。
【０１３６】
実施例６：トリス緩衝液のジエタノールアミン緩衝液への置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、緩衝液をトリスから０．１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ８．６）へと変更した。
以下の追加の改変も行なった：
１０％ラクトースを、１％ｗ／ｖミオイノシトール及び１％ｗ／ｖエクトインの組み合わせにより置き換えた。
５００ｍＭ ＮａＣｌを４００ｍＭ ＫＣｌにより置き換え、
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を８０ｍＭルテニウムヘキサミン（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）に置き換えた。
【０１３７】
さらに、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７を以下の界面活性剤に置き換えた：
−２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−１００又は２００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１００又は２００ｍＭ オクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）
−１００又は２００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ：５％ｗ／ｖ ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰＳ（参考例）。
【０１３８】
この実施例において、試験プロトコールを、以下のようにわずかに改変した。１９６秒の間、１５の連続する時間間隔で、＋０．１５Ｖで１．０秒間酸化電流を測定し、その後−０．４５Ｖで１．０秒間還元電流を測定した。酸化電流はおよそ０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４、１６８、１８２、１９６秒において、還元電流は２１０秒において−０．４５Ｖで測定した。
【０１３９】
結果を表６に示す。
【０１４０】
実施例７：広い範囲にわたる様々な界面活性剤濃度
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、使用した界面活性剤及びその濃度は以下のように変化させた（一般的な混合物中の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７の代わりに）：
−界面活性剤なし
−１０、２５、５０、２００又は３００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−１０、２５、５０、１００、２００又は３００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１０、２５、５０、１００、２００又は３００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１４１】
試験プロトコールは、実施例１のプロトコール２におけるものと同様であった。
【０１４２】
結果を表７Ａ及び７Ｂに示す。
【０１４３】
実施例８：コール酸塩を含まないコレステロールデヒドロゲナーゼ
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、標準コレステロールデヒドロゲナーゼを、コール酸を含まないデヒドロゲナーゼに置き換えた。
【０１４４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１４５】
結果を表８に示す。
【０１４６】
実施例９：二重界面活性剤システム
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇを、以下の界面活性剤の組み合わせに置き換えた：
−５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７及び５０ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−５０ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３及び５０ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１４７】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１４８】
結果を表９に示す。
【０１４９】
実施例１０：異なる、新規の、メディエーターの使用
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物中に存在する４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を、異なるルテニウムメディエーターに置き換えた。
【０１５０】
実験は、一般的な酵素混合物中に存在する１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７界面活性剤構成成分を使用して実施した。次いで、以下の別の界面活性剤を使用して、更なる実験を行なった：
−界面活性剤なし
−１００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１５１】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５２】
結果を表１０に示す。
【０１５３】
実施例１１：異なる糖界面活性剤
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７を以下のように置き換えた：
−界面活性剤なし
−５０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
−５０ｍＭ ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド
−５０ｍＭ Ｎ−オクタノイルβ−Ｄ−グルコシルアミン（ＮＯＧＡ）
−５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−５０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）
−５０ｍＭ ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐｔＧＰ）
−１００ｍＭ ＮＯＧＡ
−５０、１００又は２００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）
−５０又は１００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭＰ）
−２００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭＰ）
−５０、１００又は２００ｍＭ ｎ−オクタノイルＤ−グルコピラノシド（ＯＹＧＰ）。
【０１５４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５５】
結果を表１１に示す。
【０１５６】
実施例１２：Ａｎａｍｅｇ界面活性剤の範囲
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、Ａｎａｍｅｇ界面活性剤の範囲は以下のように設定した：
−界面活性剤なし
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−５
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−６
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−８
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−９。
【０１５７】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５８】
結果を表１２に示す。
【０１５９】
実施例１３：Ｃｙｇｌｕ界面活性剤の範囲
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、Ｃｙｇｌｕ界面活性剤の範囲は、Ａｎａｍｅｇ−７を以下のように置き換えた：
−界面活性剤なし
−０、５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−１
−５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−２
−５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−３
−５０、１００又は２００ｍＭ α−ｃｙｇｌｕ−３。
【０１６０】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１６１】
結果を表１３に示す。
【０１６２】
実施例１４：酵素の同等のものへの置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、異なるＮＡＤＨオキシダーゼ又は異なるエステル切断酵素のいずれかを以下のように使用した：
−４．２ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼを、４．２ｍｇ／ｍＬジアホラーゼにより置き換え、
−３．３ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）を、３．３ｍｇ／ｍＬ東洋紡ＣｈＥにより置き換えた。
【０１６３】
また、１０％ラクトースを２％ｗ／ｖ ＢＳＡに置き換えた。
【０１６４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１６５】
結果を表１４に示す。
【０１６６】
実施例１５：凍結乾燥トリグリセリドセンサー
この実施例において、トリグリセリドセンサー用最終酵素混合物は以下を含んだ：
０．１Ｍ ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）
１０％ｗ／ｖラクトース
１７．６ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
６．７ｍｇ／ｍｌジアホラーゼ
５ｍｇ／ｍｌ東洋紡ＣｈＥ
４５ｍｇ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ。
【０１６７】
界面活性剤なしで、及び以下の界面活性剤を以下の濃度で含んで、の両方で、この製剤を使用した：
−１％及び５％ｗ／ｖ Ａｎａｍｅｇ−７
−１％及び５％ｗ／ｖ ｃｙｇｌｕ−３
−１％及び５％ｗ／ｖ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１６８】
分注及び凍結乾燥
０．３μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１６９】
血漿試料
血漿又は脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）でセンサーを試験した。試料は、総コレステロール及びトリグリセリド濃度の両方について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０１７０】
試験プロトコール
各電気化学セルに、１２μｌの血漿試料を添加し、残りの試験プロトコールは実施例７において説明したものと同様であった。
【０１７１】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総トリグリセリド濃度に対してプロットした。次いで、選択した時点におけるトリグリセリドに対する較正プロットについての傾き及び切片を計算した。
【０１７２】
結果を表１５に示す。
【０１７３】
【表２−１】
【０１７４】
【表２−２】
【０１７５】
【表３−１】
【０１７６】
【表３−２】
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
【表５】
【０１７９】
【表６】
【０１８０】
【表７】
【０１８１】
【表８−１】
【０１８２】
【表８−２】
【０１８３】
【表９】
【０１８４】
【表１０】
【０１８５】
【表１１】
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
【表１３−１】
【０１８９】
【表１３−２】
【０１９０】
【表１４】
【０１９１】
【表１５−１】
【０１９２】
【表１５−２】
【０１９３】
【表１６】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、試料中のトリグリセリド又はコレステロール量の決定用センサー及び、このような決定の実施方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
トリグリセリド及びコレステロールは、血中に見出されるリポタンパク質の主要な構成成分である。トリグリセリドは主として、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）内に見出され、一方コレステロールは主として、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）内に見出される。コレステロール及びトリグリセリドは、血中の全てのリポタンパク質画分中に、ある程度存在する。
【０００３】
したがって、血液又は血漿試料について効果的な試験を実施するためには、リポタンパク質がまず分解され、トリグリセリド及びコレステロール（遊離コレステロール及びコレステロールエステルを含む）を遊離させなければならない。一般的にはこれは界面活性剤を使用して達成される。しかし、多くの界面活性剤は、異なるリポタンパク質画分に関して異なる速度で働く。したがって、トリグリセリド又はコレステロール試験が試料中に存在する全ての検体を検出することを保証するためには、全ての反応可能なトリグリセリド又はコレステロールを遊離させることを可能とするのに十分な時間、界面活性剤を試料と反応させることが必要である。
【０００４】
コレステロール及びトリグリセリド検査が家庭において、又は診療所の医師によって、実施されることを可能にする試験キットが入手可能になると、これらの試験における迅速な結果についての需要が著しく増加する。理想的には、試験キットが正確な結果をほんの数秒、又は数分で提供することだろう。この目的を達するためには、血中の全てのリポタンパク質画分を迅速に分解することのできる即効性の界面活性剤が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、コレステロール及びトリグリセリド試験を実施するために特に有用な界面活性剤群を見出した。これらの界面活性剤は、全てのリポタンパク質粒子中のコレステロール、コレステロールエステル及びトリグリセリドに対して、特に速い反応キネティクスを有する。したがってこれらの界面活性剤を包含するコレステロール又はトリグリセリドセンサーは、試料の総コレステロール又はトリグリセリド含量の短時間での信頼性のある測定を提供する。
【０００６】
したがって本発明は、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーであって、
（ａ）式（１）
【０００７】
【化１】
【０００８】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない］の界面活性剤；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含むセンサーを提供する。
【０００９】
また、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリドの量の決定方法であって、
− 上記で定義されるような界面活性剤と試料を接触させる工程；及び、
− 存在するコレステロール及び／又はトリグリセリドの量を決定する工程
を含む方法も提供する。
【００１０】
本発明のセンサーは、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロールの量の決定用である。誤解を避けるために、これは、センサーが試料中のトリグリセリドの総量及び／又はコレステロールの総量の決定用であることを意味する。総コレステロールは、試料中のＨＤＬ及びＬＤＬ画分の両方に存在するコレステロールを含み得る（当然、遊離コレステロール及び、試料中の任意の他の形態で存在するコレステロール、例えばコレステロールエステルなども、同様に含み得る）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１（ａ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｂ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｃ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｄ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｅ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【図１（ｆ）】図１（ａ）から（ｆ）は、本発明の種々のセンサーを使用して、多数の血漿試料について、総コレステロール濃度（［ＴＣ］（ｍＭ））に対して、センサー出力（測定される電流、Ｉｏｘ（ｎＡ））をプロットしたグラフである。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明のセンサーは、リポタンパク質を含む任意の試料のコレステロール又はトリグリセリドレベルを測定するために使用され得る。典型的には、分析は、ヒト又は動物の任意の体液について実施され得、典型的には例えば、全血、血清又は血漿試料について実施され得る。本発明において用いられる好適な試料としては、血清及び血漿である。測定が全血について実施される場合、本方法は、赤血球を除去するために血液をろ過する追加の工程を含み得る。
【００１３】
界面活性剤はサッカリドであり、それはＤ−サッカリド又はＬ−サッカリドであり得、Ｄ−サッカリドが好ましい。α及びβアイソフォームの両方が使用され得る。一実施形態においては、βアイソフォームが好ましい。
【００１４】
界面活性剤は一般式（１）を有する：
【００１５】
【化２】
【００１６】
式１において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシではない。
【００１７】
好ましくは、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の１又は２（最も好ましくは１）は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＳＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＳＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、残りの基は−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシであり、好ましくは−ＯＨである。
【００１８】
一般式（１）の界面活性剤は一般式（Ｉ）を有することが好ましい：
【００１９】
【化３】
【００２０】
［式中：
ｉ）Ｒ１は、式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり；Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである；又は、
ｉｉ）Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である］。
【００２１】
本発明の第一の実施形態において、界面活性剤は一般式（Ｉ）を有し、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり、Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである。この実施形態において、ｍ’は好ましくは３から１０であり、例えば４から９である。特に好ましくは、ｍ’は６又は７であり、最も好ましくは６である。さらに、この実施形態において、Ｘは好ましくは−ＯＨ又はメトキシであり、最も好ましくはメトキシである。この実施形態中、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３を有することが好ましい。この実施形態における具体的な好ましい界面活性剤はメチル−６−Ｏ−（Ｎ−アルキルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドであり、ここで該アルキル基は５から１０の炭素原子を含む。これらの界面活性剤は、Ａｎａｔｒａｃｅから、Ａｎａｍｅｇ−５、Ａｎａｍｅｇ−６、Ａｎａｍｅｇ−７、Ａｎａｍｅｇ−８、Ａｎａｍｅｇ−９及びＡｎａｍｅｇ−１０として入手可能である（インデックスはアルキル鎖（すなわち、（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３基）の全長を示す）。特に好ましい界面活性剤はＯ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドであり、これはＡｎａｍｅｇ−７である。
【００２２】
本発明の第二の実施形態において、界面活性剤は一般式（Ｉ）を有し、Ｒ１は水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。この第二の実施形態において、Ｒ１は好ましくは水素又はメチルであり、最も好ましくは水素である。ｍは好ましくは５から９であり、例えば６から８である。さらに、ｍ”は好ましくは４から６である。なおさらに、ｎは好ましくは０から５であり、例えば０から３である。Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル基であり得、シクロペンチル及びシクロヘキシル、特にシクロヘキシルが好ましい。Ａ基は好ましくはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、最も好ましくはシクロヘキシルである。Ａがシクロアルキル基であるとき、ｎは好ましくは少なくとも１、例えば１から５である。Ａがフェニル基であるとき、ｎは好ましくは０から３である。
【００２３】
本発明の第二の実施形態において、界面活性剤の一つの好ましい群としては、Ｘが式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基である場合である。具体的な好ましい界面活性剤は、ｎ−アルキル−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、ここで該アルキル基は６から１０の炭素原子を含み、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰとして知られ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰとして知られ、同様にＡｎａｔｒａｃｅから入手可能）などである。他の具体的な好ましい界面活性剤は、ｎ−アルキル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−アルキル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−アルキル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びｎ−アルキル−β−Ｄ−マンノピラノシドであり、ここで該アルキル基は６から１０の炭素原子を含み：例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びｎ−オクチル−β−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００２４】
本発明の第二の実施形態における界面活性剤の別の好ましい群は、Ｘが式−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａの基である場合である。具体的な好ましい界面活性剤は、３−シクロヘキシル−１−メチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−１として知られる）、３−シクロヘキシル−１−エチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−２として知られる）及び特に３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３として知られる）であり、全てＡｎａｔｒａｃｅから入手可能である。Ａがフェニル基のとき、ｎは好ましくは０から８であり、例えば０から４である。さらに具体的な好ましい界面活性剤は、フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド、フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフェニルエチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドである。
【００２５】
本発明における特に好ましい界面活性剤は、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド及び３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである。
【００２６】
界面活性剤は、好ましくは式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）の界面活性剤である：
【００２７】
【化４】
【００２８】
したがって、式（Ｉａ）の界面活性剤は、好ましくはグルコピラノース（式（Ｉａ））、ガラクトピラノース（式（Ｉｂ））又はマンノピラノース（式（Ｉｃ））であり得る。
【００２９】
本発明の更なる実施形態において、界面活性剤は化学式（Ｉｘ）又は（ＩＩ）の界面活性剤である
【００３０】
【化５】
【００３１】
サッカリド−Ｏ（ＣＨ２）ＮＡ （ＩＩ）
【００３２】
［式中、Ｒ１’は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでＭは６から２０であり、Ｒ２は水素又はメチルであり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、Ｎは１から１０である］。
【００３３】
この更なる実施形態において、界面活性剤は、式（Ｉｘ）の６−Ｏ−カルバモイルサッカリドであり得る。好ましくは、式（Ｉｘ）の界面活性剤はグルコシドである。Ｍは典型的には６から１０であり、例えば６又は７である。好ましい界面活性剤としては、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ａｎａｍｅｇ−７、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）が挙げられる。
【００３４】
また、この更なる実施形態において、界面活性剤は式（ＩＩ）の界面活性剤であり得、したがって式Ａ−（ＣＨ２）Ｎ−ＯＨのアルコールとサッカリドの反応に由来し得る。したがって、式（ＩＩ）の化合物はサッカリド分子からなり、ここで少なくとも１の（例えば１の）−ＯＨ基は、−Ｏ（ＣＨ２）Ｎ−Ａ基で置換されている。サッカリドは、モノ、ジ又はトリサッカリドであり得、例えばグルコース、マルトース、マルトトリオース又はスクロースである。モノサッカリド（特にグルコース）が好ましい。界面活性剤は好ましくは１−グルコシドである。シクロアルキル基Ａは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル基であり得、シクロペンチル及びシクロヘキシル（特にシクロヘキシル）が好ましい。Ｎは好ましくは１から８であり、典型的には２から６である。好ましい界面活性剤としては、３−シクロヘキシル−１−プロピル−β−Ｄ−グルコシド（Ｃｙｇｌｕ−３、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）が挙げられる。
【００３５】
また、この更なる実施形態において、本発明において使用される界面活性剤は、式（Ｉｘｘ）の界面活性剤であり得る：
【００３６】
【化６】
【００３７】
［式中、Ｒ１１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり且つＲ１２は水素若しくはメチルである；又はＲ１１は水素であり且つＲ１２は−（ＣＨ２）Ｎ−Ａである、のいずれかであり、ここでＡ、Ｎ及びＭは上記定義される通りである。］
【００３８】
本発明において、界面活性剤は特定のＨＬＢ値を有することが好ましい。ＨＬＢ値は、界面活性剤との関連で周知のパラメーターであり、界面活性剤の親水性を表すものである。特定の界面活性剤のＨＬＢ値は、Raboron et al., International Journal of Pharmaceutics, Vol 99, 1993, p23-36に記載されるような、ＮＭＲ法を使用して、容易に得られ得る。この参照文献は、ＨＬＢ値が、
【００３９】
【数１】
【００４０】
［式中、
【００４１】
【数２】
【００４２】
であり、ここでＡ親水性は親水基についての化学シフトのＮＭＲ積分値であり、Ａ全体は界面活性剤における全ての化学シフトのＮＭＲ積分値である］として計算され得ることを示す。
【００４３】
上記方法を使用して得られる本発明の特定の具体的な界面活性剤についてのＨＬＢ値は以下の通りである：
【００４４】
【表１】
【００４５】
本発明において、界面活性剤は、５から１６、例えば７から１４のＨＬＢ値を有することが好ましい。
【００４６】
本発明の界面活性剤は、商業的に入手可能な製品であり、又は当業者によって標準的な合成技術を使用して製造され得る。本発明において用いられ得る界面活性剤の更なる例、及びこれらの界面活性剤の合成に関する詳細は、ＵＳ ５，２２３，４１１及びＵＳ ５，７６３，５８６において見出され得る。
【００４７】
界面活性剤は、典型的には、試験されるべき試料と混合される場合、界面活性剤及び任意の他の使用される試薬と試料の混合物中の界面活性剤の濃度が、少なくとも１０ｍＭ、好ましくは少なくとも２０ｍＭ、例えば少なくとも２５ｍＭであるような量で提供される。
【００４８】
本明細書中に記載される界面活性剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。したがって、本発明のセンサーは、式（１）の一界面活性剤、例えば化学式（Ｉ）の界面活性剤を唯一の界面活性剤として、又は式（１）の界面活性剤を１以上の更なる界面活性剤と共に、含んでいてもよい。１以上の更なる界面活性剤も、一般式（１）に含まれ得る。一実施形態において、センサーは、２以上、例えば５までの界面活性剤を含み、それらは異なるが、それぞれ一般式（１）及び好ましくは一般式（Ｉ）を有する。例えば、センサーは、２つのこのような界面活性剤を含み得る。好ましい組み合わせは、
−Ａｎａｍｅｇ−７及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−Ｃｙｇｌｕ−３及びｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３
である。また、好ましくは、Ａｎａｍｅｇ−７、Ｃｙｇｌｕ−３及びＯＧＰのうち少なくとも２つを含む組み合わせである。
【００４９】
本発明の界面活性剤により遊離されるトリグリセリド又はコレステロールは酵素試薬と反応し、試料中に存在するトリグリセリド又はコレステロール量の定量測定を提供する。使用される酵素試薬は特に限定されず、トリグリセリド又はコレステロール試験の実施に適した任意の酵素が使用され得る。例えば、コレステロールの場合、酵素試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ又はコレステロールオキシダーゼを含み得る。トリグリセリド試験においては、使用され得る酵素試薬の例は、グリセロールリン酸オキシダーゼと組み合わせた、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びグリセロールキナーゼである。
【００５０】
任意の商業的に入手可能な形態のコレステロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼが利用され得る。例としては、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えば、ノカルジア属（Nocardia species）由来であり、グリセロールデヒドロゲナーゼは、例えば、セルロモナス属（Cellulomonas species）由来である。デヒドロゲナーゼは、０．１から１００ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から４５ｍｇ／ｍｌの試料の量で使用され得る。
【００５１】
リポタンパク質の界面活性剤との反応は、典型的には、遊離の形態及びコレステロールエステルの形態の両方で、コレステロールを遊離させる。したがってコレステロール試験においては、酵素試薬は、典型的には、エステルを遊離コレステロールへと分解するために、コレステロールエステル加水分解試薬を含む。コレステロールエステル加水分解試薬は、コレステロールエステルをコレステロールに加水分解することのできる任意の試薬であり得る。試薬は、コレステロールのコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応及び、アッセイにおけるその後の任意の工程を妨げない試薬でなければならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は、酵素、例えばコレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。適切なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）属又はクロモバクテリウム ビスコサム（Chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。コレステロールエステル加水分解試薬は、０．１から２５ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から２０ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から２５ｍｇ／ｍｌ（例えば０．５から１５ｍｇ／ｍｌなど）の試料の量で使用され得る。
【００５２】
トリグリセリド試験においては、トリグリセリド含量を決定するために、典型的にはグリセロール酵素が使用される。したがってリポタンパク質から遊離されるトリグリセリドは、グリセロールデヒドロゲナーゼとの反応の前に、まずグリセロールへと分解されなければならない。典型的にはこれは、酵素試薬中にトリグリセリド加水分解試薬を含めることにより達成される。デヒドロゲナーゼ酵素の活性を阻害しない限り、トリグリセリドをグリセロールへと加水分解する任意の試薬が使用され得る。リパーゼ及びエステラーゼは、トリグリセリド加水分解試薬の適切な例である。コレステロールエステル加水分解試薬として上記したリパーゼは、トリグリセリドの加水分解における使用にも適している。トリグリセリド加水分解試薬は、０．１から１００ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から７０ｍｇ／ｍｌの試料、好ましくは０．５から２５ｍｇ／ｍｌ（例えば０．５から１５ｍｇ／ｍｌなど）の試料の量で使用され得る。一実施形態において、トリグリセリド加水分解試薬は、０．１から２５ｍｇ／ｍｌの試料、例えば０．１から２０ｍｇ／ｍｌの試料の量で使用される。
【００５３】
各酵素は、安定剤又は保存剤などの添加剤を含み得る。さらに、各酵素は化学的に修飾され得る。
【００５４】
酵素試薬と反応するコレステロール又はトリグリセリドの量の決定を実施するために、必要に応じて、更なる試薬が本発明のセンサー中に存在し得る。安定剤、緩衝剤及び賦形剤などの添加剤も使用され得る。酵素を活性化するための試薬も添加され得る。例えば塩化アンモニウムが、グリセロールデヒドロゲナーゼを活性化するために使用され得る。
【００５５】
界面活性剤は、他の試薬の添加の前に、又は他の試薬の添加と同時に、試料へと添加され得る。好ましい実施形態において、酵素試薬及び界面活性剤は、単一の試薬混合物（単一工程において試料と合わせられる）中に存在する。特に好ましい実施形態において、本方法は、試料を試薬と接触させる単一工程を含み、それゆえ単一の試薬混合物のみが提供される必要がある。
【００５６】
本発明のセンサーは、試料のコレステロール又はトリグリセリド含量を、任意の適切な技術により決定し得る。例えば、ペルオキシダーゼ及び発色剤（colour forming agent）が使用され得、検体のオキシダーゼ酵素との反応により生成される過酸化水素を決定し得る。当業者はこのような方法に精通しているであろう。オキシダーゼシステムを利用するトリグリセリド検出用センサーにおいて、例えば以下の試薬が使用され得る：リパーゼ又はコレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びメディエーター。オキシダーゼシステムを利用するコレステロール検出用センサーにおいて、例えば以下の試薬が使用され得る：リパーゼ又はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びメディエーター。このようなセンサーにおける使用に適したこれらの試薬の特定の例が、以下、より詳細に説明される。
【００５７】
好ましい実施形態においては電気化学分析が使用され、この実施形態は以下にさらに詳細に記載される。しかし当然のことながら、本発明が電気化学分析に限定されることを意図するものではない。
【００５８】
電気化学分析において、酵素試薬と反応したコレステロール又はトリグリセリド量は、電極において起こる電気化学応答を測定することにより決定される。この実施形態において、試料は、典型的には、界面活性剤、酵素試薬、酵素試薬と相互作用することのできる補酵素、及び酸化還元剤（酸化又は還元されることができ、電極において電気化学的に検出され得る生成物を形成する）と反応する。試料及び試薬の混合物は、引き起こされる酸化還元反応が検出され得るように、電気化学セルの作用電極と接触させられる。電位がセルに印加され、結果として起こる電気化学応答（典型的には電流）が測定される。
【００５９】
この好ましい実施形態において、コレステロール量は以下のアッセイに従って測定される：
【００６０】
【化７】
【００６１】
ここでＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである。
【００６２】
同様に、トリグリセリドセンサーについて、存在するトリグリセリド量は以下のアッセイに従って決定され得る：
【００６３】
【化８】
【００６４】
ここでＧｌｙＤはグリセロールデヒドロゲナーゼである。いずれのアッセイにおいても、アッセイによって生成された還元型酸化還元剤の量は、電気化学的に検出される。適切な場合、追加の試薬もこのアッセイに含まれ得る。
【００６５】
典型的には、試料は全ての試薬と単一の工程において接触する。したがって、センサーは典型的には、全ての必要な試薬を含み、且つアッセイを実施するために試料と容易に接触させられ得る、試薬混合物を含む。該試薬混合物は典型的には、界面活性剤を１０から５００ｍＭ、好ましくは２５から２００ｍＭ、特に、少なくとも５０ｍＭ、又は少なくとも７５ｍＭの濃度で含む。加水分解試薬は典型的には、０．１から２５ｍｇ、好ましくは約０．５から２０ｍｇ／ｍｌの試料の量で存在し、デヒドロゲナーゼは、０．１から１００ｍｇ、好ましくは０．５から４５ｍｇ／ｍｌの試料の量で存在する。
【００６６】
各試薬の量は、試薬混合物中の濃度の表現で、又は質量／ｍｌ試薬混合物の表現で、本明細書中に明記される。しかし試薬混合物が溶液の形態で提供されることは必須ではない。あるいはそれは乾燥された形態で提供され得、例えばそれは凍結乾燥され得る。これらの実施形態において、本明細書中に記載される試薬の量とは、乾燥前の試薬混合物の溶液又は懸濁液中の濃度又は質量をいう。
【００６７】
典型的には補酵素は、ＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通の構造特性を有する化合物であり、同様にコレステロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼについての補酵素として働く。
【００６８】
ＮＡＤ＋アナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオ−ＮＡＤ）;ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は典型的には、試薬混合物中に、１から２０ｍＭ、例えば３から１５ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭの量で存在する。
【００６９】
典型的には、酸化還元剤は、上記に示されるアッセイに従って還元され得るものであるべきである。この場合、酸化還元剤は、補酵素からの（又は下記のようにレダクターゼからの）電子を受容でき、且つ電子を電極に移動できるものであるべきである。酸化還元剤は分子又はイオン結合型錯体であり得る。それは、タンパク質などの天然に存在する電子受容体であり得、又は合成分子であり得る。酸化還元剤は典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有する。
【００７０】
好ましくは、酸化還元剤は、無機錯体である。この剤は金属イオンを含み得、好ましくは少なくとも二価を有する。特に、この剤は遷移金属イオンを含み得、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムが挙げられる。酸化還元剤は荷電していてもよく、例えばそれは陽イオン性又はあるいは陰イオン性であり得る。適切な陽イオン性剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋などのルテニウム錯体である。適切な陰イオン性剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−などのフェリシアン化物錯体である。
【００７１】
使用され得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）（本明細書中、以後ＲｕＡｃａｃと言う）及びそのキレート性アミン配位子誘導体（例えばエチレンジアミンなど）、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及びその誘導体であって、１以上の−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及び−ＣＯ２Ｈなどの基が、２つのシクロペンタジエニル環のうちの一方又は両方へと置換されているものが挙げられる。好ましくは、無機錯体は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００７２】
酸化還元剤は典型的には、試薬混合物中に、１０から２００ｍＭ、例えば２０から１５０ｍＭ、好ましくは３０から１００ｍＭ、又は８０ｍＭまでの量で存在する。
【００７３】
好ましい実施形態において、電気化学アッセイにおいて使用される試薬混合物は、さらにレダクターゼを含む。該レダクターゼは典型的には、還元型ＮＡＤ又はそのアナログから２電子を移動させ、２電子を酸化還元剤へと移動させる。したがってレダクターゼの使用は、速い電子の移動を提供する。
【００７４】
使用され得るレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ及びチトクロムＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来のチトクロムＰ４５０ｃａｍ酵素システムのプチダレドキシン（putidaredoxin）レダクターゼ、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレン草フェロドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、チトクロムｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸レダクターゼ、テルプレドキシン（terpredoxin）レダクターゼ並びに酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明における使用のための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００７５】
レダクターゼは、精製又は単離されている組換えタンパク質又は天然に存在するタンパク質であり得る。レダクターゼは、それが電子移動を行なう速度を最適化するためなどのその性能、又はその基質特異性を向上させるために、変異導入されていてもよい。
【００７６】
レダクターゼは典型的には、試薬混合物中に、０．５から１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１から５０ｍｇ／ｍｌ、１から３０ｍｇ／ｍｌ又は２から２０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、コレステロールアッセイの一般的なスキームは以下の通りであり：
【００７８】
【化９】
【００７９】
そして、トリグリセリドアッセイの一般的なスキームは以下の通りであり：
【００８０】
【化１０】
【００８１】
ここで
ＰｄＲ − はプチダレドキシンレダクターゼであり、
Ｄｉａ − はジアホラーゼであり、
ＣｈＤ − はコレステロールデヒドロゲナーゼであり、
ＧｌｙＤ − はグリセロールデヒドロゲナーゼである。
【００８２】
デヒドロゲナーゼがオキシダーゼにより置換され得、結果としてカスケードへの変化を生じ、電気化学を介した過酸化物又は酵素の測定を可能にし得ることは、当業者に周知であろう。
【００８３】
試薬混合物は、１以上の追加の構成成分（例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤及び／又は安定剤）を随意に含む。該賦形剤は試薬混合物中に含まれることが好ましく、それにより、当分野で周知のように、混合物を安定化することができ、及び随意に、試薬混合物が本発明の装置上で乾燥される場合には、乾燥混合物に多孔性を提供することができる。適切な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトースなどの糖、グリシン及びＰＥＧが挙げられる。該緩衝剤も、最適な酵素活性のために必要なｐＨを提供するために含まれ得る。例えば、トリス緩衝剤（ｐＨ９）が使用され得る。該安定剤は、例えば酵素の安定性を高めるために添加され得る。適切な安定剤の例としては、アミノ酸（例えばグリシン）及びエクトイン（ectoine）である。
【００８４】
本発明のセンサーは典型的には、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応するコレステロール又はトリグリセリドの量の測定用検出装置を含む。好ましい実施形態において、センサーはコレステロール又はトリグリセリド含量の電気化学的測定用である。この実施形態において、センサーとしては少なくとも２つの電極を有する電気化学セルが挙げられる。該セルは、作用電極及び、擬似基準電極としても働く対電極を有する二電極システムであり得る。あるいは、セルは、作用電極、基準電極及び対電極を有する三電極システムであり得る。好ましい実施形態において、セルの作用電極は、微小電極、例えば、５０μｍ以下の幅を有するマイクロバンド（microband）電極である。典型的には、電極は、水溶性セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）又は非置換（non-substituted）水溶性サッカリド（例えば、グルコース、フルクトース、トレハロース、スクロース、ラクトース又はマルトース）を含む被覆層を備えていない。
【００８５】
センサーは典型的には、測定ユニット（セルに電位を供給するための電力供給装置及び結果として生じる電気化学応答（典型的にはセルを横切る電流）の測定のための測定器を含む）も含む。
【００８６】
典型的には、界面活性剤及び酵素試薬、及び必要な任意の更なる試薬は、適切な液体（例えば水又は緩衝液）中に懸濁／溶解され、センサーへ供給される単一の試薬混合物として、一緒に混合される。次いで試薬混合物は、典型的には、適切な位置において乾燥される。センサー内／上で物質を乾燥するこの工程は、所望の位置に物質を保持するのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）により、好ましくは凍結乾燥により実施され得る。試薬混合物は典型的には、電極の近くに配置され、それゆえ試料が試薬混合物に接触するとき、電極との接触も起こる。
【００８７】
センサーは、試験されるべき試料が試薬混合物との接触前に通過する膜を随意に含み得る。該膜は、例えば、赤血球（red blood cells）、赤血球（erythrocytes）及び／又はリンパ球などの構成成分をろ過して除くために使用され得る。適切なろ過膜（血液ろ過膜を含む）は当分野において公知である。血液ろ過膜の例は、Ｐａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘである。ガラス繊維（Fibreglass）フィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は、全血から血漿を分離することができ、全血検体が装置に供給され、試験されるべき試料が血漿である場合の使用に適している。
【００８８】
別の又は追加の膜も使用され得、使用前に親水性又は疎水性処理が施されたものが含まれる。膜の他の表面特性も、所望の場合には改変され得る。例えば、水中での膜の接触角度を変更するための処理は、膜を通過する所望の試料の流れを促進するために使用され得る。膜は１、２又はそれ以上の物質の層を含み得、それぞれは同じでも異なってもよい。例えば、異なる膜物質の２層を含む常套的な二重層膜が使用され得る。
【００８９】
本発明における使用のための適切な装置としては、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載されているものが挙げられる。
【００９０】
上記実施形態において、本発明のセンサーはトリグリセリド又はコレステロール検出用である。しかし、当業者は、単一のセンサーが試料のトリグリセリド及びコレステロール含量の両方の測定を提供するために使用され得ることを理解するであろう。一実施形態において、これは、センサー内に２つの電気化学セル（試料のコレステロール含量の測定のために採用されるもの、及び試料のトリグリセリド含量の測定のために採用されるもの）を含めることにより達成される。ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載されるセンサーにおいて、これは、レセプタクルの形態で１つの電気化学セルにコレステロール試験用の適切な試薬を提供し、レセプタクルの形態で第二の電気化学セルにトリグリセリド試験用の適切な試薬を提供することにより、達成され得る。次いでセンサーは、試薬混合物が適切な電気化学セル内の適切な位置で乾燥されるように、凍結乾燥工程に供され得る。この実施形態において、２つの試薬混合物は、２つのアッセイが互いを妨げることなく同時に実施され得るように、限定的な位置に固定される。
【００９１】
本発明の方法において、試験されるべき試料は、コレステロール又はトリグリセリド含量が測定されることを可能にするために、本明細書に記載の界面活性剤と接触させられ、さらに１以上の他の試薬と接触させられる。典型的には、試料は、本明細書に記載の試薬混合物と接触させられ、コレステロール又はトリグリセリド含量は電気化学的に測定される。
【００９２】
測定する前に、試薬混合物が試料と混合し、反応が起こるのに十分な時間（「ウェットアップ（wet-up）」期間）が許容されなければならない。凍結乾燥試薬を含むセンサーと血漿試料が使用される場合、界面活性剤及び酵素試薬との試料の接触と試験の開始の間に、およそ２０から３０秒の時間が経過する。このウェットアップ期間は、２０秒の短さであり得、又は１５秒でさえあり得るが、４５秒又は２分まででもよい。この短いウェットアップ期間は、本発明の界面活性剤に、試料中に存在する全ての種類のリポタンパク質産物を分解させ、遊離したコレステロール又はトリグリセリドが酵素試薬と反応することを可能にするのに十分である。全血が使用される場合、血球の除去を許容するために追加の時間が必要とされ得る。例えば、全血試料はセンサーに提供され得、血球の除去及び取り込み／試薬混合物との反応のために、４又は５分の期間が提供され得る。
【００９３】
電気化学的決定において、試薬混合物は典型的には、試料添加の前に電気化学セル内に存在する。セルへの試料の添加により上記ウェットアップ期間が開始され、ウェットアップ期間が経過した後に電位の印加が起こる。別の実施形態においては、試料は電極から離れて試薬と混合され、セルに添加されると直ぐに電位が印加される。
【００９４】
電気化学応答は、試料の添加後１０秒から５分の期間内に測定される。典型的には、電気化学応答は、試料の添加後少なくとも０．５分、例えば少なくとも１分で決定される。好ましい実施形態において、電気化学応答は、試料の添加後少なくとも１．５分、好ましくは少なくとも２分で決定される。
【００９５】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極において検出されるべき生成物である場合、セルに印加される電位は０．１Ｖから０．３Ｖである。好ましい印加電位は０．１５Ｖである。（本明細書中で言及される全ての電圧は、０．１Ｍ塩化物で、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して示される。）好ましい実施形態において、電位はまず、約１から４秒間、０．１５Ｖの正印加電位にされ、次いで、還元電流の測定が望まれる場合には、負印加電位にされる。異なる酸化還元剤が使用される場合、印加電位は、酸化／還元ピークが生じる電位に従って変更され得る。電位が印加される時間の長さも変わり得る。
【００９６】
したがって本発明の電気化学試験は、コレステロール及び／又はトリグリセリドの測定が非常に短い時間、典型的には装置への試料の添加から約５分以内に又は４分以内になされることを可能にする。
【００９７】
本発明は、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリドの総量を決定するために、試料中の全てのリポタンパク質画分を分解するための式（１）の界面活性剤（好ましくは式（Ｉ）の界面活性剤）の使用も提供する。
【００９８】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーを提供し、該センサーは、
（ａ）式（Ｉｘ）又は（ＩＩ）の界面活性剤
【００９９】
【化１１】
【０１００】
サッカリド−Ｏ（ＣＨ２）ＮＡ （ＩＩ）
［式中、Ｒ１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでＭは６から２０であり、Ｒ２は水素又はメチルであり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基であり、Ｎは１から１０である］；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含む。
この実施形態において、界面活性剤は好ましくは式（Ｉｘｘ）の界面活性剤である：
【０１０１】
【化１２】
【０１０２】
［式中、Ｒ１１は式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｍ−ＣＨ３の基であり且つＲ１２は水素若しくはメチルである；又はＲ１１は水素であり且つＲ１２は−（ＣＨ２）Ｎ−Ａである、のいずれかである。Ｍは６から１０であり、Ｎは２から６であり、Ａはシクロヘキシルであることが好ましい。］。具体的な好ましい界面活性剤は、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド又は３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである。この実施形態において、センサーはさらに、少なくとも２つの電極を有する電気化学セル；補酵素及び、酸化され又は還元されて生成物を形成することのできる酸化還元剤；及び随意にさらにレダクターゼを含み得る。典型的には、界面活性剤、酵素試薬及び、使用する場合には補酵素、酸化還元剤及び／又はレダクターゼは、単一の試薬混合物として存在する。コレステロール測定用酵素試薬は、例えば、（ｉ）コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ及び（ｉｉ）コレステロールデヒドロゲナーゼを含み得る。トリグリセリド測定用酵素試薬は、例えば、（ｉ）コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ及び（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼを含み得る。例えば、トリグリセリド測定用酵素試薬は、リパーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼを含み得る。
【０１０３】
この具体的な実施形態において、試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定方法も提供され、本方法は、
−試料をこの実施形態の界面活性剤と接触させる工程；及び、
−存在するコレステロール及び／又はトリグリセリド量を決定する工程
を含む。
この方法において、コレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定は、典型的には電気化学的決定である。例えば、本方法は、電気化学セル内において試料を界面活性剤、酵素試薬、補酵素、酸化還元剤及び随意にレダクターゼと接触させること、電気化学セルに電位を印加すること、及びセルの電気化学応答を決定することを含み得る。好ましくは、セルの電気化学応答は、試料を界面活性剤と接触させた後、少なくとも１．５分で決定される。好ましくは、試料と接触させられる界面活性剤の量は、試料と界面活性剤とを組み合わせたものの中で、少なくとも２０ｍＭの界面活性剤濃度を提供するのに十分な量である。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３
本実験の目的は、血漿ＨＤＬ又はＬＤＬの測定における新規界面活性剤の効果について、その界面活性剤で調製したコレステロールセンサーを調べることであった。
【０１０５】
方法
３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液
トリス緩衝液、ＫＯＨ、β−ラクトース及びＲｕ（Ａｃａｃ）を混合することにより、Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液を調製し、１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ、１０％ｗ／ｖβ−ラクトース及び３０ｍＭＲｕ（Ａｃａｃ）を含む溶液を得た。この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサー（acoustic mixer）を使用して混合した。Ｒｕ(Ａｃａｃ)＝Ｒｕ(ａｃａｃ)２(Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ)（Ｐｙ−３−ＣＯ２）
【０１０６】
Ａｎａｍｅｇ−７及びＣｙｇｌｕ−３溶液
関連する界面活性剤をＲｕ（Ａｃａｃ）溶液に添加することにより、二倍濃度のＡｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３溶液を作製し、以下の終濃度とした：
Ａｎａｍｅｇ−７（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ａ３４０）
２００ｍＭ（１３１μｌＲｕ（Ａｃａｃ）溶液中０．００８８ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ原液３７．５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液３７．５μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ原液２５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液７５μｌ）
Ｃｙｇｌｕ−３（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ｃ３２３Ｇ）
２００ｍＭ（１２５μｌＲｕ（Ａｃａｃ）溶液中０．００７７ｇ）
１００ｍＭ（２００ｍＭ原液３７．５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液３７．５μｌ）
５０ｍＭ（２００ｍＭ原液２５μｌ＋Ｒｕ（Ａｃａｃ）溶液７５μｌ）
【０１０７】
酵素混合物
酵素及び補酵素をＲｕ（Ａｃａｃ）溶液に添加することにより、二倍濃度で酵素混合物を作製し、以下の終濃度とした：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社（Oriental Yeast Co））
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）
６．７ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム（Genzyme））
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチン無添加（天野（Amano）、ＣＨＤＨ−６）
この溶液を、Ｃｏｖａｒｉｓアコースティックミキサーを使用して混合した。
【０１０８】
分注及び凍結乾燥
各酵素溶液について、等容量（およそ５０ｕｌ）の二倍濃度の酵素溶液及びＡｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３溶液を１：１で混合し、最終酵素／界面活性剤混合物を得た。０．４μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１０９】
血漿試料
血漿試料は、５分間２９００ＲＣＦにて遠心する前に、３０分間解凍した。脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も試料として使用した。試料は、総コレステロール、トリグリセリド（ＴＧ）、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロール濃度について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０１１０】
試験プロトコール１
電気化学セル当たり、１５μｌの血漿試料を使用した。１５μｌの血漿の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始した。酸化電流を１３時点（０、３２、６４、９６、１２８、１６０、１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）において０．１５Ｖで測定し、還元電流を最終時点（４１６秒）において−０．４５Ｖで測定した。電流は、明記した各時点において４秒間測定した。各試料は二連で試験した。
【０１１１】
試験プロトコール２
電気化学セル当たり、１５μｌの血漿試料を使用した。１５μｌの血漿の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始した。酸化電流を１３時点（０、３４、６８、１０２、１３６、１７０、２０４、２３８、２７２、３０６、３４０、３７４及び４０８秒）において０．１５Ｖで測定し、還元電流を最終時点（４４２秒）において−０．４５Ｖで測定した。電流は、明記した各時点において４秒間測定した。各試料は二連で試験した。
【０１１２】
分析
集めた電流測定値を、ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した血漿試料のＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール濃度に対してプロットした。各時点の勾配を使用して、ＬＤＬ及びＨＤＬの測定間で得られる％ディファレンシエーション（% differentiation）を計算した。各時点におけるＨＤＬ及びＬＤＬへの較正プロットについての傾き及び切片を表１Ａに示し、これらの界面活性剤が、特に３２秒を超える時間において、ＨＤＬ及びＬＤＬの両方に働くことを示す。
【０１１３】
ＨＤＬ及びＬＤＬの間のディファレンシエーションは、方程式（ｉ）：
【０１１４】
【数３】
【０１１５】
に従ってＨＤＬについて決定し得、ここでＧｘは測定したＸへの応答の勾配である（例えば、Ｘの既知の濃度に対して測定した電流）。測定した応答は、リポタンパク質濃度に関する（又は対応する）、例えば、リポタンパク質濃度に比例する、任意の測定値であり得る。
【０１１６】
Ａｎａｍｅｇ−７で調製したセンサーについて、応答のＨＤＬ勾配は低く、界面活性剤濃度の上昇に伴い低下する。応答のＬＤＬ勾配は界面活性剤濃度に伴い増加し、比較的高い。これは、ＨＤＬが界面活性剤と急速に反応し、その後ＬＤＬへ強く応答したことを示し得る。Ｃｙｇｌｕ−３で調製したセンサーで、同様の効果が見られる。
【０１１７】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総コレステロール濃度に対してもプロットした。各時点における総コレステロールに対する較正プロットについての傾き及び切片を表１Ｂに示す。長時間における総コレステロールへの応答の勾配は、１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３について高く、切片は低いことから、センサーはＨＤＬ又はＬＤＬコレステロールよりはむしろ総コレステロールに応答することを示す。
【０１１８】
総コレステロールへの応答についての較正プロットを図１に示す。図１（ａ）から（ｃ）は、界面活性剤としてＡｎａｍｅｇ−７（（ａ）２５ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７；（ｂ）５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７；（ｃ）１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７）を使用して２８８秒において取得した電流測定値に関し、図１（ｄ）から（ｆ）は、界面活性剤としてＣｙｇｌｕ−３（（ｄ）２５ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３；（ｅ）５０ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３；（ｆ）１００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３）を使用して３２０秒において取得した電流測定値に関する。
【０１１９】
図１は、１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７又はＣｙｇｌｕ−３を含むセンサーが優れた直線性及び総コレステロールへの高い応答の勾配を与えることを示す。
【０１２０】
実施例２から１４
一般的な製剤及び／又は試験手順における小さな変更を伴いながら、同じ基本の酵素混合物を使用して、いくつかの実験を実施した。これらの各実施例において記載する改変は、以下に説明する一般的なディテールについて行なう変更に関するものである。
【０１２１】
酵素混合物
一般的な酵素混合物には、以下の構成成分を含めた：
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）
４０ｍＭ ＫＯＨ
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）
１０％ラクトース
１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７
５００ｍＭ ＮａＣｌ
８．９ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
４．２ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）
３．３ｍｇ／ｍｌリパーゼ
２２ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチン無添加（ＣｈＤＨ）。
【０１２２】
分注及び凍結乾燥
０．４μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１２３】
血漿試料
血漿又は脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）でセンサーを試験した。試料は、総コレステロール及びトリグリセリド濃度の両方について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０１２４】
試験プロトコール
各電気化学セルに、１２μｌの血漿試料を添加した。試料の添加と同時に、クロノアンペロメトリー試験を開始し、実施例１のプロトコール１におけるのと同じ一連の電流測定値を得た。
【０１２５】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総コレステロール濃度に対してプロットした。次いで、選択した時点における総コレステロールに対する較正プロットについての傾き及び切片を計算した。
【０１２６】
実施例２：異なるアルキル鎖長
製剤及び試験手順は上記説明した通りであり、以下の改変を伴った：
４０ｍＭ ＫＯＨではなく、３０ｍＭ ＫＯＨを使用し、
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）ではなく、３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を使用し、
混合物中にＮａＣｌは含めなかった。
【０１２７】
Ａｎａｍｅｇ−７界面活性剤を以下の界面活性剤により置き換え、０、２５、５０及び１００ｍＭの濃度で使用した：
−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｘＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）
−ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ、Ａｎａｔｒａｃｅから入手可能）。
【０１２８】
結果を表２に示す。
【０１２９】
実施例３：異なるイオン強度
製剤及び試験手順は上記説明した通りであり、以下の改変を伴った：
【０１３０】
塩を、一般的な酵素混合物から以下のように添加又は排除した：
−混合物中に塩を含めない
−混合物中に２５０ｍＭ ＫＣｌ又はＮａＣｌを含める
−混合物中に５００ｍＭ ＫＣｌを含める。
【０１３１】
結果を表３に示す。
【０１３２】
実施例４：ラクトースのＢＳＡへの置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、ラクトースを１％、２％及び３％の濃度のＢＳＡにより置き換えた。
【０１３３】
結果を表４に示す。
【０１３４】
実施例５：コレステロールデヒドロゲナーゼ濃度のバリエーション
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、コレステロールデヒドロゲナーゼ濃度を、２２、４４、及び６６ｍｇ／ｍｌで試験した。
試験を、実施例１のプロトコール２に従って完了した。
【０１３５】
結果を表５に示す。
【０１３６】
実施例６：トリス緩衝液のジエタノールアミン緩衝液への置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、緩衝液をトリスから０．１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ８．６）へと変更した。
以下の追加の改変も行なった：
１０％ラクトースを、１％ｗ／ｖミオイノシトール及び１％ｗ／ｖエクトインの組み合わせにより置き換えた。
５００ｍＭ ＮａＣｌを４００ｍＭ ＫＣｌにより置き換え、
４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を８０ｍＭルテニウムヘキサミン（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）に置き換えた。
【０１３７】
さらに、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７を以下の界面活性剤に置き換えた：
−２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−１００又は２００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１００又は２００ｍＭ オクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）
−１００又は２００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ：５％ｗ／ｖ ＤｅｏｘｙＢｉｇＣＨＡＰＳ（参考例）。
【０１３８】
この実施例において、試験プロトコールを、以下のようにわずかに改変した。１９６秒の間、１５の連続する時間間隔で、＋０．１５Ｖで１．０秒間酸化電流を測定し、その後−０．４５Ｖで１．０秒間還元電流を測定した。酸化電流はおよそ０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４、１６８、１８２、１９６秒において、還元電流は２１０秒において−０．４５Ｖで測定した。
【０１３９】
結果を表６に示す。
【０１４０】
実施例７：広い範囲にわたる様々な界面活性剤濃度
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、使用した界面活性剤及びその濃度は以下のように変化させた（一般的な混合物中の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ ７の代わりに）：
−界面活性剤なし
−１０、２５、５０、２００又は３００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−１０、２５、５０、１００、２００又は３００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１０、２５、５０、１００、２００又は３００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１４１】
試験プロトコールは、実施例１のプロトコール２におけるものと同様であった。
【０１４２】
結果を表７Ａ及び７Ｂに示す。
【０１４３】
実施例８：コール酸塩を含まないコレステロールデヒドロゲナーゼ
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、標準コレステロールデヒドロゲナーゼを、コール酸を含まないデヒドロゲナーゼに置き換えた。
【０１４４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１４５】
結果を表８に示す。
【０１４６】
実施例９：二重界面活性剤システム
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇを、以下の界面活性剤の組み合わせに置き換えた：
−５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７及び５０ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）
−５０ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３及び５０ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１４７】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１４８】
結果を表９に示す。
【０１４９】
実施例１０：異なる、新規の、メディエーターの使用
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物中に存在する４０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）を、異なるルテニウムメディエーターに置き換えた。
【０１５０】
実験は、一般的な酵素混合物中に存在する１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７界面活性剤構成成分を使用して実施した。次いで、以下の別の界面活性剤を使用して、更なる実験を行なった：
−界面活性剤なし
−１００ｍＭ Ｃｙｇｌｕ−３
−１００ｍＭ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１５１】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５２】
結果を表１０に示す。
【０１５３】
実施例１１：異なる糖界面活性剤
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、一般的な酵素混合物の１００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７を以下のように置き換えた：
−界面活性剤なし
−５０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
−５０ｍＭ ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド
−５０ｍＭ Ｎ−オクタノイルβ−Ｄ−グルコシルアミン（ＮＯＧＡ）
−５０ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−５０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）
−５０ｍＭ ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＨｅｐｔＧＰ）
−１００ｍＭ ＮＯＧＡ
−５０、１００又は２００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）
−５０又は１００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭＰ）
−２００ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−マンノピラノシド（ＯＭＰ）
−５０、１００又は２００ｍＭ ｎ−オクタノイルＤ−グルコピラノシド（ＯＹＧＰ）。
【０１５４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５５】
結果を表１１に示す。
【０１５６】
実施例１２：Ａｎａｍｅｇ界面活性剤の範囲
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、Ａｎａｍｅｇ界面活性剤の範囲は以下のように設定した：
−界面活性剤なし
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−５
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−６
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−７
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−８
−５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭ Ａｎａｍｅｇ−９。
【０１５７】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１５８】
結果を表１２に示す。
【０１５９】
実施例１３：Ｃｙｇｌｕ界面活性剤の範囲
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、Ｃｙｇｌｕ界面活性剤の範囲は、Ａｎａｍｅｇ−７を以下のように置き換えた：
−界面活性剤なし
−０、５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−１
−５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−２
−５０、１００又は２００ｍＭ β−ｃｙｇｌｕ−３
−５０、１００又は２００ｍＭ α−ｃｙｇｌｕ−３。
【０１６０】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１６１】
結果を表１３に示す。
【０１６２】
実施例１４：酵素の同等のものへの置き換え
製剤及び試験手順は上記説明した通りであったが、異なるＮＡＤＨオキシダーゼ又は異なるエステル切断酵素のいずれかを以下のように使用した：
−４．２ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼを、４．２ｍｇ／ｍＬジアホラーゼにより置き換え、
−３．３ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）を、３．３ｍｇ／ｍＬ東洋紡ＣｈＥにより置き換えた。
【０１６３】
また、１０％ラクトースを２％ｗ／ｖ ＢＳＡに置き換えた。
【０１６４】
試験プロトコールは、実施例７において説明したものと同様であった。
【０１６５】
結果を表１４に示す。
【０１６６】
実施例１５：凍結乾燥トリグリセリドセンサー
この実施例において、トリグリセリドセンサー用最終酵素混合物は以下を含んだ：
０．１Ｍ ＨＥＰＢＳ（ｐＨ９．０）
３０ｍＭ ＫＯＨ
３０ｍＭ Ｒｕ（Ａｃａｃ）
１０％ｗ／ｖラクトース
１７．６ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＴＮＡＤ）
６．７ｍｇ／ｍｌジアホラーゼ
５ｍｇ／ｍｌ東洋紡ＣｈＥ
４５ｍｇ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ。
【０１６７】
界面活性剤なしで、及び以下の界面活性剤を以下の濃度で含んで、の両方で、この製剤を使用した：
−１％及び５％ｗ／ｖ Ａｎａｍｅｇ−７
−１％及び５％ｗ／ｖ ｃｙｇｌｕ−３
−１％及び５％ｗ／ｖ ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧＰ）。
【０１６８】
分注及び凍結乾燥
０．３μｌ／ウェルの各溶液を、電動ピペットを使用して、ＷＯ２００６／０００８２８に記載されるように、センサー上に分注した。次いで、分注されたセンサーシートを凍結乾燥した。
【０１６９】
血漿試料
血漿又は脱脂した血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）でセンサーを試験した。試料は、総コレステロール及びトリグリセリド濃度の両方について、Ｓｐａｃｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０１７０】
試験プロトコール
各電気化学セルに、１２μｌの血漿試料を添加し、残りの試験プロトコールは実施例７において説明したものと同様であった。
【０１７１】
センサー応答を、Ｓｐａｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒにより測定した総トリグリセリド濃度に対してプロットした。次いで、選択した時点におけるトリグリセリドに対する較正プロットについての傾き及び切片を計算した。
【０１７２】
結果を表１５に示す。
【０１７３】
【表２−１】
【０１７４】
【表２−２】
【０１７５】
【表３−１】
【０１７６】
【表３−２】
【０１７７】
【表４】
【０１７８】
【表５】
【０１７９】
【表６】
【０１８０】
【表７】
【０１８１】
【表８−１】
【０１８２】
【表８−２】
【０１８３】
【表９】
【０１８４】
【表１０】
【０１８５】
【表１１】
【０１８６】
【表１２−１】
【０１８７】
【表１２−２】
【０１８８】
【表１３−１】
【０１８９】
【表１３−２】
【０１９０】
【表１４】
【０１９１】
【表１５−１】
【０１９２】
【表１５−２】
【０１９３】
【表１６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーであって、
（ａ）式（１）の界面活性剤
【化１】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない。］；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含むセンサー。
【請求項２】
前記界面活性剤が、式（Ｉ）
【化２】
［式中：
ｉ）Ｒ１は、式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり；Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである；又は、
ｉｉ）Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である］の界面活性剤である、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
ｍ’が３から１０である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項４】
ｍが５から９である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項５】
ｍ”が４から６である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項６】
ｎが０から５である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項７】
ＡがＣ３−Ｃ８シクロアルキル基である、請求項２又は６に記載のセンサー。
【請求項８】
Ａがシクロヘキシルである、請求項２、６又は７に記載のセンサー。
【請求項９】
Ｒ１が式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、且つＸが−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである、請求項２又は３に記載のセンサー。
【請求項１０】
Ｒ１が水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、且つＸが式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基である、請求項２、４又は５に記載のセンサー。
【請求項１１】
Ｒ１が水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、且つＸが式−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａの基である、請求項２、６、７又は８に記載のセンサー。
【請求項１２】
界面活性剤がメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド又は３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである、請求項１に記載のセンサー。
【請求項１３】
界面活性剤が式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）：
【化３】
［式中、Ｒ１及びＸは前記請求項のいずれか１項と同義である］の界面活性剤である、請求項２から１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
前記請求項のいずれか１項に記載のセンサーであって、さらに、少なくとも２つの電極を有する電気化学セル；補酵素、酸化され又は還元されて生成物を形成することのできる酸化還元剤及び随意にレダクターゼを含むセンサー。
【請求項１５】
界面活性剤、酵素試薬及び、使用する場合には補酵素、酸化還元剤及び／又はレダクターゼが、単一の試薬混合物として存在する、前記請求項のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１６】
コレステロール測定用酵素試薬が（ｉ）コレステロールエステラーゼ若しくはリパーゼ；及び（ｉｉ）コレステロールデヒドロゲナーゼを含み；及び／又はトリグリセリド測定用酵素試薬が（ｉ）コレステロールエステラーゼ若しくはリパーゼ；及び（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１７】
試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定方法であって、
−試料を請求項１から１３のいずれか１項において定義される界面活性剤と接触させる工程；及び、
−存在するコレステロール及び／又はトリグリセリド量を決定する工程
を含む方法。
【請求項１８】
コレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定が電気化学的決定であり、且つ方法が随意に、電気化学セル内において試料を界面活性剤、酵素試薬、補酵素、酸化還元剤及び随意にレダクターゼと接触させる工程、電気化学セルに電位を印加する工程、及びセルの電気化学応答を決定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
セルの電気化学応答が、試料を界面活性剤と接触させた後、少なくとも１．５分で決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試料と接触させられる界面活性剤の量が、試料と界面活性剤とを組み合わせたものの中で、少なくとも２０ｍＭの界面活性剤濃度を提供するのに十分な量である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
試料中のトリグリセリド及び／又はコレステロール量の決定用センサーであって、
（ａ）式（１）の界面活性剤
【化１】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅのそれぞれは独立に、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ又は、式−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３若しくは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ’は４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である。但し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ基の少なくとも１つは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシでない。］；及び、
（ｂ）トリグリセリド測定用酵素試薬及び／又はコレステロール測定用酵素試薬
を含むセンサー。
【請求項２】
前記界面活性剤が、式（Ｉ）
【化２】
［式中：
ｉ）Ｒ１は、式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、ここでｍ’は４から２０であり；Ｘは−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである；又は、
ｉｉ）Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｘは式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基であり、ここでｍは４から２０であり、ｍ”は４から６又は８から２０であり、ｎは０から１０であり、ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル基又はフェニル基である］の界面活性剤である、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
ｍ’が３から１０である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項４】
ｍが５から９である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項５】
ｍ”が４から６である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項６】
ｎが０から５である、請求項２に記載のセンサー。
【請求項７】
ＡがＣ３−Ｃ８シクロアルキル基である、請求項２又は６に記載のセンサー。
【請求項８】
Ａがシクロヘキシルである、請求項２、６又は７に記載のセンサー。
【請求項９】
Ｒ１が式−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３又は−ＣＯ（ＣＨ２）ｍ’−ＣＨ３の基であり、且つＸが−ＯＨ又はＣ１−Ｃ４アルコキシである、請求項２又は３に記載のセンサー。
【請求項１０】
Ｒ１が水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、且つＸが式−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）ｍ”−ＣＨ３、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３又は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３の基である、請求項２、４又は５に記載のセンサー。
【請求項１１】
Ｒ１が水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、且つＸが式−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ａ、又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−Ａの基である、請求項２、６、７又は８に記載のセンサー。
【請求項１２】
界面活性剤がメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−Ｄ−グルコピラノシド又は３−シクロヘキシル−１−プロピル−Ｄ−グルコシドである、請求項１に記載のセンサー。
【請求項１３】
界面活性剤が式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）：
【化３】
［式中、Ｒ１及びＸは前記請求項のいずれか１項と同義である］の界面活性剤である、請求項２から１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
前記請求項のいずれか１項に記載のセンサーであって、さらに、少なくとも２つの電極を有する電気化学セル；補酵素、酸化され又は還元されて生成物を形成することのできる酸化還元剤及び随意にレダクターゼを含むセンサー。
【請求項１５】
界面活性剤、酵素試薬及び、使用する場合には補酵素、酸化還元剤及び／又はレダクターゼが、単一の試薬混合物として存在する、前記請求項のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１６】
コレステロール測定用酵素試薬が（ｉ）コレステロールエステラーゼ若しくはリパーゼ；及び（ｉｉ）コレステロールデヒドロゲナーゼを含み；及び／又はトリグリセリド測定用酵素試薬が（ｉ）コレステロールエステラーゼ若しくはリパーゼ；及び（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１７】
試料中のコレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定方法であって、
−試料を請求項１から１３のいずれか１項において定義される界面活性剤と接触させる工程；及び、
−存在するコレステロール及び／又はトリグリセリド量を決定する工程
を含む方法。
【請求項１８】
コレステロール及び／又はトリグリセリド量の決定が電気化学的決定であり、且つ方法が随意に、電気化学セル内において試料を界面活性剤、酵素試薬、補酵素、酸化還元剤及び随意にレダクターゼと接触させる工程、電気化学セルに電位を印加する工程、及びセルの電気化学応答を決定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
セルの電気化学応答が、試料を界面活性剤と接触させた後、少なくとも１．５分で決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試料と接触させられる界面活性剤の量が、試料と界面活性剤とを組み合わせたものの中で、少なくとも２０ｍＭの界面活性剤濃度を提供するのに十分な量である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【図１（ｄ）】
【図１（ｅ）】
【図１（ｆ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【図１（ｄ）】
【図１（ｅ）】
【図１（ｆ）】
【公表番号】特表２０１０−５２９４７３（Ｐ２０１０−５２９４７３Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１７１７（Ｐ２０１０−５１１７１７）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３８０
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３８０
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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