リンホトキシン−β、リンホトキシン−β複合体、それらの薬学的な調製物および治療への使用
【課題】リンホトキシン−β、リンパ球膜タイプタンパク質を提供すること。また、リンホトキシン−βとリンホトキシン−αのような他のペプチドとの間で形成される複合体およびリンホトキシン−βの多数のサブユニットを包含する複合体を提供すること。これらのタンパク質および複合体を使用して、細胞内で形成されるＬＴ−αを細胞表面に保持し、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体が炎症調節剤、腫瘍増殖阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、Ｔ細胞活性化剤、自己免疫疾患調節剤、またはＨＩＶ阻害剤として作用させ得る。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の抗腫瘍活性を、ＬＴ−βの遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍湿潤リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞に送達し得る。
【解決手段】配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−β。
【解決手段】配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−β。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βに関する。リンホトキシン−β（ｐ３３と呼ばれる）は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株およびリンホカイン活性化キラー細胞の表面上で同定されている。
【０００２】
本発明はまた、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）およびリンホトキシン（ここでは「リンホトキシン−α（ＬＴ−α）」と称して、ＬＴ−βと区別している）のような他のリンホトキシンタイプペプチドとの間で形成される複合体ならびにＬＴ−βの多数のサブユニットを含有する複合体に関する。本発明のＬＴ−βポリペプチドは、細胞中で形成されたＬＴ−αを細胞表面上に保持する点で有益であると考えられ、該表面で、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体のいずれかが浸潤調節剤、腫瘍成長阻害剤、Ｔ細胞抑制剤、Ｔ細胞活性化剤、免疫モジュレ一ター剤、自己免疫疾患調節剤またはＨＩＶ調節剤として作用し得る。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の抗腫瘍活性は、ＬＴ−βの遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞へ送達され得る。
【０００３】
ここに記述した発明は、国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）許可番号ＣＡ３５６３８−０７−１０の下での一連の研究の中の一部でなされた。米国政府はこの発明に一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
免疫応答の開始は、細胞間シグナルの複雑な配列を含む。これらのシグナルは、代表的に多数の細胞−細胞接触依存シグナルでカップルした可溶性サイトカインを含有する。接触依存事象（Ｔ細胞レセプターの最も有名な活性化）は、応答に特異性を与えるが、他方可溶性メディエーターは、細胞分化および細胞増殖の維持に対して一般的に応答可能である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＬＴ−αは、一般的に免疫応答の開始に関与すると認識されている２つのポリペプチドである。
【０００５】
ＴＮＦおよびＬＴ−αは、元来腫瘍の成長を阻害する能力が知られている可溶性タンパク質である。［Ｌ．Ｏｌｄ、「腫瘍壊死因子」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、６３０（１９８５）］。さらなる研究により、両方のタンパク質は広範囲な活性を有することが示された。ＴＮＦは、造血細胞および非造血細胞の両方を含有する種々の細胞タイプによって、種々の炎症性の傷害に応答して合成されるが、対照的にＬＴ−αはリンパ球によって特異的に作られる。２つの公知のＴＮＦレセプターは、ＬＴ−αとＴＮＦとをはっきりと区別することができない。［Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、「ヒト腫瘍壊死因子のレセプターの分子クローニングおよび発現」、Ｃｅｌｌ、６１、３６１−３７０（１９９０）；Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、「腫瘍壊死因子のレセプターが、細胞のおよびウイルス性タンパク質の異常なファミリーを定義する」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）］。一般に、ＬＴ−αはしばしばほとんど強力ではないが、ＬＴ−αおよびＴＮＦは、インビトロ系で類似の活性スペクトルを示す。［Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、「いくつかのヒト腫瘍系統の成長に対する腫瘍壊死因子およびリンホトキシンの異なる影響の研究」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）］。
【０００６】
ＴＮＦは、内毒素ショックヘの応答、および造血細胞発達の調節において、代謝制御の特別な局面で主要な役割をつとめるようである。［Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒら、「カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）の由来、性質、および生物学的効果」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７、（１９８８）；Ｍ．Ａｋａｓｈｉら、「リンホトキシン：線維芽細胞中のコロニー促進因子の促進および調節」、Ｂｌｏｏｄ、７４、２３８３（１９８９）；Ｇ．Ｒｏｏｄｍａｎら、「腫瘍壊死因子−αおよび造血前駆体：赤血球前駆体ＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅならびに造血幹系統ｋ５６２、ＨＬ６０、およびＨＥＬ細胞の成長に対する腫瘍壊死因子の効果」、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５、９２８（１９８７）］。
【０００７】
ＩＬ−１およびＩＬ−６とともに、ＴＮＦもまた、炎症性応答の主要なメディエ一ターである。［Ｄ．Ｃａｖｅｎｄｅｒら、「腫瘍壊死因子およびリンホトキシンによって誘発される内皮細胞の活性化」、Ａｍｅｒ．Ｊｏｕｒ．Ｐａｔｈ．、１３４、５５１（１９８９）；Ｒ．Ｃｏｔｒａｎら、「炎症性および免疫反応における内皮細胞活性化の役割」、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＳｉｍｏｎｅｓｃｕおよびＳｉｍｏｎｅｓｃｕ編、１９８８）３３５］。ＴＮＦはまた、ある条件下でＴ細胞活性化に関与しているようである。［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、「混合リンパ球反応中のヒト腫瘍壊死因子−αおよび−βの関与」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１、４９９（１９８８）；Ｎ．Ｄａｍｌｅら、「ヒトＴ細胞活性化のＣＤ３依存およびＣＤ３非依存開始の間のＩＬ−４およびＴＮＦ−αの異なる調節効果」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、８、８５（１９８９）；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら、「ＩＬ−２依存性Ｔ細胞株の増殖シグナルとしての腫瘍壊死因子−α：活性の絶対種特異性」、Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２、１２０３（１９８９）；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら、「腫瘍壊死因子α／カケクチンは胸腺細胞の成長因子である」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７、１４７２（１９８８）；Ｐ．Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈら、「組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの免疫調節活性：ヒトＴ細胞のＴＮＦレセプターの誘発およびＴ細胞応答のＴＮＦ−α−仲介促進」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８、１７８６（１９８７）］。
【０００８】
ＴＮＦは、単球、線維芽細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む数種のタイプの細胞によって生産される。［Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、「腫瘍壊死因子：遺伝子構造および生物学的活性」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１、５９７（１９８６）；Ｄ．Ｓｐｒｉｇｇｓら、「ヒト上皮腫瘍細胞株での腫瘍壊死因子の発現」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１、４５５（１９８８）；Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒら、「自己免疫および正常個体からのヒトＴ細胞が腫瘍壊死因子を生産し得る」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７、１８０７（１９８７）］。研究者はまた、ネズミまたはヒト形態のＴＮＦを検出し、それらがトランスメンブランタンパク質またはレセプター結合分子のいずれかとして種々の細胞の表面に結合していることを示した。［Ｂ．Ｌｕｅｔｔｉｇら、「膜腫瘍壊死因子の２形態の存在についての証拠：内在性タンパク質およびそのレセプターに付着した分子」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、４０３４（１９８９）；Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、「新規形態のＴＮＦ／カケクチンは細胞表面細胞傷害性トランスメンブランタンパク質である：ＴＮＦの複合生理学についての分枝」、Ｃｅｌｌ、５３、４５−５３頁（１９８８）］；およびＭ．Ｋｉｎｋｈａｂｗａｌａら、「Ｔ細胞レパートリーヘの新規追加」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１、９４１−９４６頁（１９９０）］。
【０００９】
ＬＴ−αは、ＴＮＦの活性とは一般的に類似しているものの同一ではない多くの活性、例えば、腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘発、多形核白血球の活性化、内皮細胞上のクラスＩ主要組織適合性複合抗原の誘発、内皮細胞の接着分子の誘発および成長ホルモン刺激を含む。［Ｎ．ＲｕｄｄｌｅおよびＲ．Ｈｏｍｅｒ、「炎症におけるリンホトキシンの役割」、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、４０、１６２−１８２頁（１９８８）］。ＬＴ−αおよびＴＮＦの両方とも、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターファミリーのメンバーのリガンドである。［Ｓ−ＭａｌｌｅｔｔおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ、「神経成長因子レセプターに関連する細胞表面タンパク質の新しいスーパーファミリー」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１２、７、２２０−２２３（１９９１）］。
【００１０】
ＴＮＦとは対照的に、ＬＴ−αの分泌は、活性化されたＴ細胞およびある種のＢ−リンパ芽球腫瘍のみの特異的な性質のようである。［Ｎ．Ｐａｕｌら、「リンホトキシン」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、４０７（１９８８）］。ある研究者たちはまた、ＬＴ−αの膜結合形態は、ある環境下でリンパ球の表面上で発現され得ることを示した。［Ｊ．Ｈｉｓｅｒｏｄｔら、「インビトロでの異種の抗ＬＴ抗血清を使用するマイトジェン活性化ヒトリンパ球上の膜結合リンホトキシン（ＬＴ）の同定」、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４、３２６−３３９頁（１９７７）；Ｃ．ｗａｒｅら、「リンパ球仲介細胞障害性の機構」、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６、１９２７−１９３３頁（１９８１）；Ｕ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１２３、２３３（１９８９）；Ｙ．Ａｂｅら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、８２、２３（１９９１）；Ｙ．Ａｂｅら、「インビトロでのヒトリンホカイン活性化Ｔキラー細胞における膜結合および可溶性（分泌）リンホトキシンの研究」、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１、２、１１５−１２１（１９９２）］。
【００１１】
近年、ＴＮＦおよびＬＴ−αの両方の遺伝子が単離され、そしてクローン化されて、完全な特徴づけがなされ両方の組換え形態のタンパク質が入手可能となった。［Ｐ．Ｇｒａｙら、「ヒトリンホトキシンのｃＤＮＡのクローニングおよび発現、腫瘍壊死活性を有するリンホカイン」、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、１２１−１２４頁（１９８４）；Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａら、「ヒト腫瘍壊死因子：前駆体の構造、発現およびリンホトキシンとのホモロジー」、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、７２４（１９８４）］。
【００１２】
ＣＤ４０タンパク質を含有する他の「サイトカイン様」細胞表面タンパク質は、ＴＮＦおよびＬＴ−αとある種の類似性を共有していることが近年示された。ＴＮＦおよびＬＴ−αと同様に、ＣＤ４０タンパク質は、ＴＮＦ／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターファミリーのメンバーに対するリガンドである。［Ｓ．ＭａｌｌｅｔｔおよびＮ．Ｂａｒｃｌａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１２、２２０−２２３頁（１９９１）］。ＣＤ４０タンパク質は、Ｂ−リンパ球、上皮細胞、およびある種の癌腫細胞様の表面に発現する２７７アミノ酸のタンパク質である。［Ｒ．Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３５７、８０−８２頁（１９９２）；Ｔ．ＦａｒｒａｈおよびＣ．Ｓｍｉｔｈ、「サイトカインファミリーの発生」、Ｎａｔｕｒｅ、３５８、ｐ．２６（１９９２）］。
【００１３】
本発明者らは、新規な表面タンパク質、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）すなわちｐ３３を同定した。ＬＴ−βは、種々のタイプのリンパ球の表面で同定されたが、これらのリンパ球は、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を含む。ＬＴ−βは、細胞の中で生産され細胞膜に向かうＬＴ−αを標的としており、細胞膜では、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは複合体（本開示を通して「ＬＴ−α／ＬＴ−β」と表示する）のようにみえる。ＬＴ−α／ＬＴ−βは、活性化Ｔ細胞によるＬＴ−αの膜発現に対する新規機構であると考えられている。［Ａｎｄｒｏｌｅｗｉｃｚら、「リンホトキシンは、活性化ヒトＴ細胞ハイブリドーマの表面上で別の３３ｋＤａ糖タンパク質とヘテロマーな複合体として発現される」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７、２５４２−２５４７頁（１９９２）］。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、可溶性ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０タンパク質と類似の細胞溶解および細胞調節活性を示し得る。ＬＴ−αと複合した膜結合ＬＴ−βは、複合体としてＴ細胞が他の細胞と相互作用をする新規リガンドを表し得、そしてまた標的細胞の溶解に有用であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明の新規タンパク質はリンホトキシン−β（ＬＴ−β）と命名された。このタンパク質は、種々のタイプのリンパ球の表面で見い出されるが、これらのリンパ球はＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を含む。それはＬＴ−αとの新規複合体を形成し、そして他のＬＴ−βサブユニットとの複合体を形成する（例えば、（ＬＴ−β）２ＬＴ−α複合体）。
【００１５】
ＬＴ−βは、３１−３５ｋＤの分子量を有するが、これは免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された。ＬＴ−βは、Ｎ−結合グルコシル化を有する。リンホトキシン−βのアミノ酸配列を配列番号２で示し、そしていくつかの可溶性リンホトキシン−βペプチドのアミノ酸配列を配列番号４、配列番号６および配列番号８で示す。リンホトキシン−βをコードするＤＮＡ配列を配列番号１で示し、数種の可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードするＤＮＡ配列を、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示す。
【００１６】
細胞膜タンパク質としてのＬＴ−βは、合成中のＬＴ−αと結合する。従って、ＬＴ−αを細胞膜に「標的化」する。ＬＴ−βの非存在下で、ＬＴ−αは細胞外培地に分泌される。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、ＣＨＯ細胞中で発現された組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）に対して生じたポリクローナル抗血清により、または天然ＬＴ−αに対して生じたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）により認識される。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体および（ＬＴ−α）３を認識する抗血清は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）をブロックする。ＭＬＲは同種間刺激に対するＴリンパ球の予想される増殖応答であり、すなわち、他の個体からのＴリンパ球を導入した際に「レスポンダー」リンパ球により異物（非自己）として認識される標準免疫学的アッセイである。［例えばＭ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌ．、１４１、４９９（１９８８）を参照のこと］。
【００１７】
ＬＴ−βタンパク質をアフィニティクロマトグラフィにより精製し、部分配列を決定し、そして特異的オリゴヌクレオチドプローブを設計した。ＬＴ−αをコードするｃＤＮＡを、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞（ホルボールエステル活性化により大量の表面リンホトキシンを表すヒトＴ細胞ハイブリドーマ）からのｃＤＮＡライブラリーをプローブすることによって単離した。同定したアミノ酸配列は、２４０〜２４４アミノ酸配列（約２５１３０〜２５３９０ｋＤａの非修飾タンパク質の分子量）をコードする。配列番号２を参照のこと。アミノ酸配列およびトランスメンブラン領域位置はタイプＩＩ膜タンパク質の典型である。
【００１８】
この配列は、短い１４〜１８アミノ酸Ｎ−末端「細胞質」ドメインを含有する。この細胞質ドメインの後ろに、おそらく膜固定ドメインとして働く３０の疎水性アミノ酸の長い広がりがある。同一の配列は利用可能なデータベースには見られなかった。細胞外ドメインには１つのシステイン残基およびＣ−末端の最後の１７アミノ酸に２つのメチオニン残基がある。これは、このタンパク質が示す非常に制限された臭化シアン切断パターンと一致する。
【００１９】
ＬＴ−β配列とＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに結合することが知られている公知の他のタンパク質を比較すると、かなり構造の類似性がある。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに対する４つのリガンド（ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＬＴ−βおよびＣＤ４０リガンド）は、タイプＩＩ膜タンパク質に類似し、そして図１４に示されるような細胞外ドメイン中の保存配列の少なくとも４つの領域を共有している。ＬＴ−βと共有する、保存されたＴＮＦおよびＬＴ−αドメインは、サブユニット間相互作用およびβシート構造に関連しているようである。これらの保存領域は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βの間の結合を説明し得る。これらホモロジー領域の存在は、ポリペプチドを設計して、例えば、ＴＮＦまたはＣＤ４０リガンドと複合体を容易に形成させ得る。このような分子は、機能を混在し得、そして注文のデザインされた薬として使用され得る。［Ｊ．Ｆｕｈら、「ヒト成長ホルモンレセプターと拮抗するアンタゴニストの合理的なデザイン」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１６７７（１９９２）参照のこと］。
【００２０】
本発明のペプチド複合体はＴ細胞活性化の事象に重要であり、Ｔ細胞活性化あるいはＴ細胞抑制のための組成物および方法、ならびに炎症の治療剤として、あるいは腫瘍細胞または新生物の増殖阻害のような細胞障害活性を必要とする適用するための治療剤として有用であると考えられる。また、ポリペプチド複合体は細胞免疫療法に有用であり、腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）治療における腫瘍浸潤リンパ球の殺腫瘍能力を高めることが重要であると考えられる。ＴＩＬ免疫療法は、遺伝子組換え技術により改善され得る。例えば、遺伝子を、体の免疫系を誘導する目的で腫瘍細胞に加えて、効果的な腫瘍特異的免疫応答を仲介し得る。［例えば、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、「ヒト遺伝子療法」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、８０８−８１３（１９９２）参照のこと］。
【００２１】
また、「Ｆａｓ」として同定される分子とＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーとの間の類似性に基づいて、本発明のポリペプチド複合体は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスとして知られている細胞の内部プロセスに関与し得、それゆえ、自己免疫病の仲介に関与し得ると考えられる。［例えば、Ｎ．Ｉｔｏｈら、「ヒト細胞表面抗体ＦａｓのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドはアポトーシスを仲介し得る」、Ｃｅｌｌ、６６、２３３−２４３（１９９１）；Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、「アポトーシスを仲介するＦａｓ抗原の欠陥によって説明されるマウスにおけるリンパ増殖疾患」、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３４１（１９９２）参照のこと］。
【００２２】
ＬＴ−β、その関連ポリペプチド、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体または本発明の他のポリペプチド複合体に対する抗体はまた、特定のレセプターとの重要なＬＴ相互作用を破壊する。すなわち、既知のＴＮＦレセプター形態を介して仲介される事象以外の特異的に影響するＬＴ仲介事象を形成し得る。同様に、ＴＮＦ、ＬＴ−αまたはＬＴ−α／ＬＴ−β、またはこれらの誘導体（例えば、可溶性レセプターおよびＩｇＧ／レセプター融合タンパク質）に対するレセプターも、本発明のポリペプチドおよび複合体の阻害に使用し得る。
【００２３】
本発明は、以下を提供する：
（項目１） 配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−β。
【００２４】
（項目２） 上記ポリペプチドが細胞表面に結合しているポリペプチドである、項目１に記載のポリペプチド。
【００２５】
（項目３） 上記ポリペプチドが、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７に結合している、項目２に記載のポリペプチド。
【００２６】
（項目４） 可溶性リンホトキシン−βペプチドであって、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号６；および
（ｃ）以下の式で示されるアミノ酸配列：
Ｘ−配列番号６、
ここで、Ｘは配列番号８の３’末端から始まる１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含有する；
を包含するペプチド。
【００２７】
（項目５） 前記ペプチドが、さらに５’末端でのリーダー配列を含有する、項目４に記載のペプチド。
【００２８】
（項目６） ポリペプチドであって、以下からなる群からのＤＮＡ：
（ａ）配列番号１を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１によって定義されるＤＮＡにハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｃ）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ；
によってコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【００２９】
（項目７） ポリペプチドであって、以下からなる群からのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号３を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号５を含有するＤＮＡ配列；
（ｃ）以下の式で示されるＤＮＡ配列：
Ｘ−配列番号５、
ここで、Ｘは、配列番号７の３’末端から始まる１つまたはそれ以上のヌクレオシドトリプレットを含有する；
（ｄ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５および上記（ｃ）部のいずれか１つとハイブリダイズし、可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｅ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５および上記（ｃ）部の配列のいずれか１つによってコードされるポリペプチドをコードしている、縮重ヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ配列；
を含有するポリペプチド。
【００３０】
（項目８） 設計されたポリペプチドであって、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を包含し、ここで配列Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕが上記配列の５’末端から切断され、かつ１つのＭｅｔまたは１っのＬｅｕ残基によって置換される、ポリペプチド。
【００３１】
（項目９） 単離されたＤＮＡ配列であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号１で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；
（ｃ）リンホトキシン−βをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；から選択される、ＤＮＡ配列。
【００３２】
（項目１０） 単離されたＤＮＡ配列であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号３で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号５で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｃ）項目７（ｃ）のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｄ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５または項目７（ｃ）の配列のいずれか１つによって定義されるＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｅ）可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
から選択される、ＤＮＡ配列。
【００３３】
（項目１１） 設計されたＤＮＡ配列であって、配列番号１で定義されるヌクレオチド配列を含有し、ここでヌクレオチドＣＴＧＧＧＧＣＴＧが上記配列の５’末端から切断され、かつ１つの開始コドンによって置換される、ＤＮＡ配列。
【００３４】
（項目１２） 組換えＤＮＡ分子であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号１で定義されるＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号３で定義されるＤＮＡ配列；
（ｃ）配列番号５で定義されるＤＮＡ配列；
（ｄ）項目７（ｃ）に記載のＤＮＡ配列；
（ｅ）項目１１に記載のＤＮＡ配列；
（ｆ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５および項目７（ｃ）に記載の配列のいずれか１つによって定義されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；
（ｇ）縮重ヌクレオチド配列を含有し、リンホトキシン−βに対してコードするＤＮＡ配列；および
（ｈ）縮重ヌクレオチド配列を含有し、可溶性リンホトキシン−βペプチドに対してコードするＤＮＡ配列；
から選択されるＤＮＡ配列を含有する、組換えＤＮＡ分子。
【００３５】
（項目１３） 単細胞宿主、培養中の動物細胞および培養中のヒト細胞からなる群から選択される宿主であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、宿主。
【００３６】
（項目１４） 腫瘍浸潤リンパ球、リンホカイン活性化キラー細胞、キラー細胞および患者から取り出され、遺伝的に設計された腫瘍細胞からなる群から選択される項目１３に記載の宿主。
【００３７】
（項目１５） 項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記方法は項目１３に記載の形質転換宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【００３８】
（項目１６） ポリペプチド複合体であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、項目８のポリペプチド、および項目４（ｃ）の可溶性リンホトキシン−βペプチドからなる群から選択される第１のポリペプチド、および、リンホトキシン−α、天然ヒトまたは動物リンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌リンホトキシン、あるいはリンホトキシンまたは上記の任意のリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される第２のポリペプチドを含有する、ポリペプチド複合体。
【００３９】
（項目１７） 複数のリンホトキシン−βポリペプチドユニットを含有するポリペプチド複合体。
【００４０】
（項目１８） 項目１６に記載のポリペプチド複合体であって、上記複合体が細胞表面と結合している、ポリペプチド複合体。
【００４１】
（項目１９） 項目１８に記載のポリペプチド複合体であって、上記第１のポリペプチドがＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激非リンホトキシンヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７の表面と結合している、ポリペプチド複合体。
【００４２】
（項目２０） 細胞の表面上でリンホトキシンエピトープを生産する方法であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子で該細胞をトランスフェクトする工程、および該細胞中でＤＮＡを発現させる工程を包含する、方法。
【００４３】
（項目２１） 腫瘍浸潤リンパ球の標的殺腫瘍性活性を高める方法であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子で上記リンパ球をトランスフェクトする工程、および上記形質転換されたリンパ球を患者に導入する工程を包含する、方法。
【００４４】
（項目２２） 項目２１に記載の方法であって、上記形質転換されたリンパ球を項目１２に記載の組換えＤＮＡでトランスフェクトする前またはトランスフェクトした後に、リンホカインとともにインキュベートする、方法。
【００４５】
（項目２３） 項目２２に記載の方法であって、前記リンホカインがＩＬ−２である、方法。
【００４６】
（項目２４） ＨＩＶ感染、新生物形成、炎症または炎症性の病気、ならびに自己免疫疾患の進行、重篤、または影響を、抑制、処理または軽減するための組成物であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【００４７】
（項目２５） ＨＩＶ感染、新生物形成、炎症または炎症性の病気、ならびに自己免疫疾患の進行、重篤、または影響を、抑制、処理または軽減するための方法であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを投与することを含有する、方法。
【００４８】
（項目２６） 免疫系を抑制する組成物であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【００４９】
（項目２７） 免疫系を抑制する方法であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを投与することを包含する、方法。
【００５０】
（項目２８） リンホトキシン−βをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１により表される上記ヌクレオチド配列を含有し、さらに５’末端で設計されたヌクレオチド配列を含有し、上記設計されたヌクレオチド配列がＡＴＧまたはＣＴＧである機能的な開始コドンを含有し、上記設計されたヌクレオチド配列中で、ロイシンをコードする他のコドンがＣＴＧでない、ヌクレオチド配列。
【００５１】
（発明の詳細な説明）
ここに記載された本発明を完全に理解するために、以下に詳細に説明する。
【００５２】
本発明は、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βに関する。リンホトキシン−βのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５３】
ポリペプチド（またｐ３３という）は、３１〜３５ｋＤの分子量を有する。本発明のポリペプチドは、細胞表面に結合するか、またはそのような表面に結合しない。
【００５４】
本発明はまた、リンホトキシン−βの可溶形態に関する。可溶性リンホトキシン−βペプチドは、リンホトキシン−βのアミノ酸配列で定義され、ここで、配列は、トランスメンブラン領域の端（すなわち、アミノ酸番号４４付近）とアミノ酸番号９５付近の最初のホモロジー領域との間の任意の位置で切断される。２つの可溶性リンホトキシン−βペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４および６で定義されている。いくつかの付加的な可溶性リンホトキシン−βポリペプチドは、配列番号６によって定義されるアミノ酸配列の５’末端に付加的アミノ酸残基を有する配列を包含する。付加的な残基は、配列番号８によって定義される５２アミノ酸残基を包含し得る。可溶性リンホトキシンはまた、配列番号６で定義される配列に３’末端から始まる１〜５１のアミノ酸残基を含有する配列番号８の一部を加えたアミノ酸配列を包含する。このような可溶性ペプチドは、５’末端に周知のリーダー配列を任意の数包含し得る。このような配列により、真核系でペプチドが発現される。［例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許番号第５，０８２，７８３（１９９２）］。
【００５５】
本発明のポリペプチド複合体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号６プラス上述したような配列番号８の全部または一部分によって定義される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチドと、同一群から選択される第２のポリペプチド、および／またはリンホトキシン−α、天然ヒトまたは動物リンホトキシン−α、組換えリンホトキシン−α、可溶性リンホトキシン−α、分泌リンホトキシン−α、または上記の任意のリンホトキシン−α活性フラグメント等との第２のポリペプチドと複合した複合体に関する。
【００５６】
新規ＬＴ−βペプチドはＬＴ−αと複合体を形成し、そして他のＬＴ−βサブユニットと複合体を形成する（例えば、（ＬＴ−β）２ＬＴ−α複合体）。これらの複合体は、細胞と結合し得、または結合し得ず、そして上述のように共通ホモロジー領域を共有する他のタイプＩＩ膜タンパク質との複合体であり得る。
【００５７】
ポリペプチド複合体は、組換えＬＴ−αを認識する多特異性抗血清によって認識され、この複合体はＬＴ−αエピトープを示すことを示唆する。これらの抗血清は、市販の抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣中（ＣＨＯ）細胞で発現する組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）に対して生じる多特異性抗血清を包含する。これらの複合体を認識するポリクローナル抗血清はまた、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）をブロックするが、可溶性ＬＴ−αを認識するモノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体はＭＬＲをブロックしない。従って、本発明の複合体は、Ｔ細胞活性化における重要な役割を行うようである。また、これらの複合体が可溶性ＬＴ−αまたはＴＮＦの活性と同様にＴ細胞制御活性および細胞障害性を有することが予想される。
【００５８】
本発明はまた、上記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を本質的に含有するＤＮＡ、このＤＮＡによって特徴付けられる組換えＤＮＡ分子、本ＤＮＡでトランスフェクトされた培養物中の単細胞宿主または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主、ならびにこのＤＮＡおよびこれらの組換えＤＮＡ分子および宿主を使用しこれらによりコードされるポリペプチドを生産する組換え方法に関する。
【００５９】
さらに詳しくは、本発明は、配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列を含有する単離されたＤＮＡ配列に関する。
【００６０】
本発明はさらに、上記配列、リンホトキシン−βと実質的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ配列、およびリンホトキシン−βをコードするヌクレオチド配列を有する縮重ＤＮＡ配列に関する。
【００６１】
本発明はまた、可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号３および配列番号５で定義される。本発明はまた、配列番号５のＤＮＡの５’末端にいくつかの付加的なヌクレオチドトリプレットを有するＤＮＡでコードされる数種の付加的な可溶性リンホトキシン−βペプチドに関する。付加的なヌクレオチドトリプレットは、配列番号７によって定義される５２トリプレットを包含する。可溶性リンホトキシンペプチドはまた、配列番号５に３’末端から始まる１〜５１ヌクレオチドトリプレットを含有する配列番号７の一部分が付加された配列にコードされ得る。
【００６２】
本発明はまた、リンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドを発現するようにコードする上記同定された任意の配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。本発明はまた、リンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、および可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同なペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００６３】
リンホトキシン−βを同定し、単離しそして以下に記述する技術を使用して特徴付けた。
【００６４】
（フローサイトフルオロメトリー分析）
まず、フローサイトフルオロメトリー分析を使用してＴ細胞の表面上のＬＴ−αエピトープの発現を説明する。ＯＫＴ３モノクローナル抗体で活性化されたヒト末梢血単核球細胞が、抗ｒＬＴ−α抗血清と反応することによりＬＴ−αエピトープの発現を示すことが判明した。抗ｒＴＮＦ抗血清ではなく、抗ｒＬＴ−α抗血清のみが、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞に結合した。
【００６５】
また、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３．Ｄ７［Ｃ．Ｗａｒｅら、「細胞障害性リンホトキシンを生産するヒトＴ細胞ハイブリドーマ：リンホトキシン放出の誘導および抗ＣＤ３モノクローナル抗体またはレクチンおよびホルボールエステルによるキラー細胞活性」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、５、３１３（１９８６）］が、ＰＭＡ刺激によりＬＴ−αを分泌すること、さらにまたＰＭＡ刺激により表面ＬＴ−α関連エピトープを発現することが観察された。また、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞がウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清からＬＴ中和抗体を除去できたが、一方コントロールＵ９３７細胞（表面ＬＴ−α形態全てが欠如している）は除去できなかったことが示された。さらに、ウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清がウサギＬＴ−αと結合（複合体化）していた（生じた複合体が次にＩＩ−２３．Ｄ７細胞上の細胞性ＬＴ−α／ＴＮＦレセプターと結合する）という可能性を排除したが、それは、細胞性レセプターを過剰の可溶性ＴＮＦまたはＬＴ−αで飽和し、そしてこれが染色に関して影響を持たなかったことを観察したことによる。これらのアッセイの結果は、ハイブリドーマ上のＬＴ−α関連エピトープが本当にＬＴ−αと関係していることを示す。
【００６６】
また、過剰のｒＬＴ−αによる抗血清の前処理は、抗血清がＩＩ−２３．Ｄ７細胞を染色する能力を防ぐが、一方ｒＴＮＦでの前処理は効果を持たなかったということが観察された。このアッセイは、ＬＴ−α関連エピトープに対する抗血清の特異性を示す。
【００６７】
染色する前に刺激したＩＩ−２３．Ｄ７細胞をトリプシン処理することにより、シグナルを失わせるが、これは、抗血清によって認識されるエピトープはタンパク質であったことを示した。
【００６８】
また、ＣＨＯ由来の混入物が活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上の誘導タンパク質の抗血清による認識に寄与しなかったことが示されたが、それは可溶性ＬＴ−αのみを生産するＬＴ−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が抗ＬＴ−α抗血清によって染色されなかったことによる。
【００６９】
（免疫沈降）
さらに、これら表面ＬＴ−α関連タンパク質を、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面のヨウ素化（１２５Ｉ−標識化）または代謝標識化（３５Ｓ−Ｍｅｔまたは３５Ｓ−Ｃｙｓ）のいずれかにより標識し、続いてデタージェントで原形質膜を可溶化し、標識ＬＴ−α関連タンパク質の免疫沈降により特徴付けた。
【００７０】
免疫沈降で結合した表面ヨウ素化によって、抗ＬＴ−α抗血清によって認識される２つのタンパク質：以降ＬＴ−αという２５〜２６ｋＤ形態、および以後、ＬＴ−βまたはｐ３３という３１〜３５ｋＤ形態が明らかとなった。同じウサギからの免疫前抗血清も抗ｒＴＮＦ−ウサギ血清のいずれもヨウ素化されたＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からのバンドを免疫沈降しなかったことを観察した。ヨウ素化し免疫沈降したバンドの一次元部分的ＣＮＢｒ処理ペプチドマップは、２５〜２６ｋＤ形態（ＬＴ−α）の切断によりヨウ素化した組換えＬＴ−αのものと同一のパターンを示した。このことは、表面ＬＴ−αと可溶性ＬＴ−αとの相互関係を補強する。ヨウ素化された３１〜３５ｋＤ形態（ＬＴ−β、すなわちｐ３３）はＣＮＢｒによって切断されず、公知のＬＴ−α遺伝子生成物とは別であることが示された。
【００７１】
さらに、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインで代謝標識し、ＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を特徴付けた。システインおよびメチオニンの分布は、ＴＮＦとＬＴ−αとの間、ならびに、シグナル配列を有する形態と有しない形態との間を区別するための方法が提供される。［Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、５３、４５（１９８８）］。分泌されたＴＮＦはシステインを含有するが、メチオニンはなく、一方、分泌されたＬＴ−αはメチオニンのみを含有し、システイン残基はない。しかし、ＬＴ−αはシグナル配列中に１つのシステイン残基を有するが、一方、ＴＮＦはシグナル配列中に２つのメチオニン残基を含有する。
【００７２】
３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインのいずれかでＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞をそれぞれ培養して標識し、そして培地および細胞からの免疫反応性タンパク質を沈降した。次に、３５Ｓ−メチオニンで標識した細胞の培地からの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、ＬＴ−αの２５ｋＤ形態が現れたが、一方３５Ｓ−システインで標識した細胞の培地からの免疫沈降物では現れず、分泌ＬＴ−αに対して予測されるパターンではなかった。洗浄した細胞の分析では、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態および３３ｋＤ ＬＴ−β形態の両方を示した。これらの結果は、表面ヨウ素化を用いて観察された膜結合形態と同じである。
【００７３】
２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αはシステインを欠如しており、これはリーディング配列のプロセッシングを示している。また、３３ｋＤ ＬＴ−βは３５Ｓ−メチオニンと３５Ｓ−システインとの両方を取り込み、それ自身が２５ｋＤ ＬＴ−α形態とは異なる形態であることが観察された。典型的に、そのレセプターと結合したＬＴ−αは、ＢＯＳＣＯＥＳ（すなわち、ビス［２−［スクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ］エチル］スルホン；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のような化学的架橋剤を用いてレセプターと架橋し得る。［Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｒｅｗｓら、「ヒトＴリンパ球上の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびリンホトキシン（ＬＴ）に対するレセプターの特徴付け」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４、２５８２（１９９０）］。表面ヨウ素化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を架橋剤で処理した時、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αまたは３３ｋＤ ＬＴ−β関連形態のいずれかが、他の付加的膜タンパク質と結合しなかったことが観察された。このアッセイは、レセプター結合はＬＴ−αおよびＬＴ−βが細胞膜と結合したままのメカニズムではないことを示した。ＬＴ−βの配列分析は、２つのＴＮＦレセプター形態のいずれとも関係ないことを示した。［Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９、（１９９０）；Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１（１９９０）］。
【００７４】
（アフィニティークロマトグラフィー）
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質のさらなる特徴付けを、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行った。ＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のＬＴ−α／ＬＴ−β複合体がレンチルレクチンと結合することが観察されたが、これは、それぞれの形態が糖タンパク質構造であることを示す。従って、精製工程としてレンチルレクチンクロマトグラフィー工程を、抗血清アフィニティークロマトグラフィーの前に使用した。デタージェントで可溶化したＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質をレンチルレクチンセファロースに結合し、そしてα−メチルマンノシドで溶出した。コントロールＩｇＧおよび抗ＬＴ−α−ＩｇＧアフィニティーカラムの両方を調製し、これらのタンパク質が抗ＬＴ−α抗血清によって特異的に認識されることを正確に評価した。次に、レンチルレクチンに結合したタンパク質をこれらのカラムに適用した。カラムを低ｐＨで溶出したときに抗ＬＴ−αアフィニティーカラムからＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質が放出されることを観察した。溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果は、表面ヨウ素化ＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からの免疫沈降タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果とかなり類似していた。この比較は、類似のタンパク質が２つの方法によって精製されたことを示した。
【００７５】
アフィニティー精製の間、約２５ｋＤ ＬＴ−α形態が切断されて１９〜２０ｋＤ形態、すなわち「デス（ｄｅｓ）２０」形態にとなるようであることを観察した。ＲＰＭＩ １７８８腫瘍細胞株からの天然ＬＴ−αの最初の単離［Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌら、「１７８８腫瘍細胞株由来のヒトリンホトキシンの一次構造」、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６０、２３３４−２３４４頁（１９８５）］もまた、Ｎ−末端的に切断された２０ｋＤ ＬＴ−α形態を与えていた。この「デス２０」天然型ＬＴ−α中の１つのメチオニンが失われており、無傷の分子と比べると異なるＣＮＢｒ切断パターンとなる。アフィニティー精製ＬＴ−αタンパク質の一次元ＣＮＢｒ切断は、短縮型の天然ＬＴ−α形態と一致する切断パターンを示し、そして、アフィニティー精製「デス２０」ＬＴ−α形態はおそらく天然ＬＴ−α「デス２０」で観測されたような類似の切断から生じたと結論した。
【００７６】
さらに、ＬＴ−βが部分的ＣＮＢｒ切断でダブレットを生じることを観察した。ＬＴ−βタンパク質による切断パターンは、メチオニン残基が存在すること、および少なくとも１つのメチオニンがＣ−またはＮ−末端いずれかから５〜２０残基の範囲内にある（このマッピング技術を使用して切断した時、いずれかの末端の１〜５残基の範囲内でメチオニン残基は検出されなかった）。このパターンは、ＬＴ−βは公知のＬＴ−α配列の全部を含有していないことを示唆した。
【００７７】
ＬＴ−βタンパク質はまた、抗原活性化一次細胞障害性Ｔリンパ球クローンによって発現されることが観察された。これらの細胞の代謝標識後の抗ｒＬＴ−αを用いる免疫沈降の結果は、少量のＬＴ−αと共にＬＴ−βが現れた。これらの結果は、ＬＴ−βは一次Ｔ細胞およびＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマによって作成され得ることを示した。
【００７８】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質の初期精製）
以下の一般的な工程を使用してＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を精製した。まずホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）をＩＩ−２３．Ｄ７細胞に添加した。２４時間後に、細胞を収集し、それらを無血清冷ＲＰＭＩ培地で洗浄した。冷たい細胞ペレットに、氷冷溶解緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＮＰ−４０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、およびアジ化ナトリウム）を加え、それにベンズアミジン、フェニルメチルスルホニルクロライド（ＰＭＳＦ）、ならびにＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ダイズトリプシンインヒビター、ペプスタチンおよびアプロチニンを新たに添加した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞を穏やかに均一化し、そして溶解液を遠心分離した。遠心分離し、そして上清を採取した。ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を添加した溶解緩衝液で予め平衡化したレンチルレクチンセファロースカラムに、上清をロードした。ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を有する溶解緩衝液でカラムを洗浄し、次にα−メチルマンノシドを含有する溶解緩衝液で溶出した。溶出画分をプールし、そしてウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフィニティーカラムの上にロードしたが、このカラムはウサギ抗ｒＬＴ−αセファロースアフィニティーカラムに直接連結していた。ＥＤＴＡを含有する同じ溶解緩衝液で、次にＮＰ−４０をＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で置換した溶解緩衝液で両方のカラムを洗浄した。洗浄したカラムをそれぞれ別個に５ｍＭ ＭＥＧＡ−８、５０ｍＭ グリシン、ＮａＣｌ、ベンズアミジン、およびＥＤＴＡ溶液で溶出したが、その方法は、Ｂｒｏｗｎｉｎｇらの「リンホトキシンおよび関連３３−ｋＤ糖タンパクは、活性化ヒトＴ細胞ハイブリドーマの表面上で発現される」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７、１２３０−１２３７頁（１９９１）に記載された方法に従った。ｐＨシフト後の第１回分をプールし、凍結乾燥し、ＳＤＳで水に再懸濁し、そしてＨＥＰＥＳおよびＳＤＳの溶液に対して透析した。ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで透析画分を乾燥し、そして水に再懸濁した。アリコートをＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液と混合し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。銀染色でタンパク質を視覚化した。
【００７９】
１つまたは複数のＬＴ−αエピトープがＰＭＡ処理で生じるような細胞活性化によってのみ、ＩＩ−２３．Ｄ７Ｔ細胞ハイブリドーマの表面に存在することが観察された。反対に、一次Ｔ細胞上で存在する時、ＰＭＡ処理により表面抗原が失われる。さらに、組換えＬＴ−α（ＣＨＯ細胞で生産される）あるいは天然ＬＴ−α（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）のいずれかに対するウサギポリクローナル抗血清が１つまたは複数のＬＴ−αエピトープを認識したことを見出した。
【００８０】
また、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体を認識するこの抗血清はＭＬＲをブロックするが、可溶性ＬＴ−αを認識する特定のモノクローナル抗体はブロックしないことを観察した［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１、４９９（１９８８）］。それゆえ、本発明のＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、Ｔ細胞の活性化のメディエーターであり得る。
【００８１】
細胞溶解物からの免疫沈降物中のＬＴ−βがＬＴ−αと共に存在することは、ＬＴ−βが免疫原性的にＬＴ−αと関連するかあるいはＬＴ−βがＬＴ−αと結合されるか、または両方を示唆している。この問題を解決するために、３５Ｓ−メチオニン標識細胞からの２５ｋＤおよび３３ｋＤバンドを、ウサギポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清で免疫沈降し、切り出したゲルスライスから溶出し、そして抗ｒＬＴ−αポリクローナル抗血清または抗ｒＬＴ−α ｍＡｂのいずれかで再免疫沈降した。ＬＴ−α（ＬＴ−βではなく）は、抗ｒＬＴ−α抗体のいずれかで免疫沈降し、ＬＴ−βが免疫原性的にＬＴ−αと関連しないことを示唆した。これらの観察は、ＬＴ−βが物理的にＬＴ−αと結合していることを示した。
【００８２】
表面ＬＴ−αおよびＬＴ−βが複合体を形成するという仮説をさらに検証するために、変性および未変性条件下で等電点フォーカシング法（ＩＥＦ）実験を行った。ＬＴ−αおよびＬＴ−βが物理的に結合されれば、これらは未変性条件下では複合体としてフォーカスするはずであるが、変性条件下では分離した形でフォーカスするという理論的根拠に基づく。ＬＴ−αおよびＬＴ−βに対する個々の等電点（ｐＩ）を、二次元ゲル分析（変性条件）によって決定した（図９Ａ）。ＬＴ−αは、６．５〜７．３のｐＩの範囲で５つの荷電化したアイソマーを有するが、ＬＴ−βは５．５〜６．０のｐＩの範囲で４つの荷電化したアイソマーを有する。しかし、フォーカシング法を未変性条件下で行った時、ＬＴ−αおよびＬＴ−βは共に６．３〜７．２のｐＩの範囲で広いバンド幅で集中した。それゆえ、ＬＴ−βの泳動は、未変性条件下で顕著に遅れた。
【００８３】
（ＬＴ−αおよびＬＴ−βのさらなる精製および同定）
ＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を以下の一般的な工程を使用して精製した。ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地でＩＩ−２３．Ｄ７細胞を培養し、そして細胞を５０ｌのＲＰＭＩから集め、そして培地に再懸濁し、そしてホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間の活性化の後、遠心分離によって細胞を収集し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄した。冷溶解緩衝液に最終細胞ペレットを懸濁し、そしてペレットをいったん窒素キャビテーターの中を通過させた。溶解した細胞を遠心分離し、そして上清を捨てた。一晩デタージェントと共に溶解緩衝液中でペレットを抽出し、次に再び遠心分離した。
【００８４】
デタージェントで可溶化した膜を含有する上清を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（１０）と結合したモノクローナル抗ＬＴ−αを含むアフィニティー樹脂に添加し、懸濁液を一晩振動した。樹脂を小さいカラム中に回収し、ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含むＨＥＰＥＳで、次に１％ ｗ／ｖ ＭＥＧＡ−８を含む同じ緩衝液でそれを洗浄し、ＭＥＧＡ−８を含むグリシン緩衝液で結合したタンパク質を溶出し、そしてその画分をトリス塩基で直ちに中和した。画分中にＬＴ−βおよびＬＴ−αの存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色法によって確認した。これらタンパク質を含有する画分をプールし、そしてＳＤＳを添加し、そしてこのプールを０．ｌ×ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に対して透析した（ＭＥＧＡ−８デタージェントを除去するため何度も取り替えた）。透析した溶液を乾燥状態まで、凍結乾燥して、元の１／１０量の水に再懸濁した。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にサンプルを流し、ＰｒｏＢｌｏｔメンプラン上にプロットし、そしてクーマシーブルー染料で染色した。ＬＴ−βおよびＬＴ−αバンドを切り出し、そしてタンパク質シーケンサーにロードした。エドマン分解によってＮ−末端配列を得た。膜に結合したＬＴ−αバンドの配列は、分泌性のＬＴ−αについて記載された配列と正確に一致することがわかった。すなわちＬｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（アミノ酸番号１〜９）［Ｐ．Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、１２１−１２４頁（１９８４）］と一致する。エドマン分解分析によって、結合ＬＴ−βタンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列が２つのアミノ酸配列：Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ＧｌｎまたはＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎを含む可能性があることを示した。引き続きより正確なｃＤＮＡ技術を使用するＤＮＡ分析で、正しい配列はＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎであったことを確認した。
【００８６】
ＬＴ−α形態が検出されたそれぞれの場合で、また、ＬＴ−βを検出し得た（すなわち、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞、活性化ＣＴＬクローン、およびＨｕｔ−７８細胞の表面ＬＴ−α形態を構成的に発現する）。ＬＴ−αは表面ＬＴ−αの非存在下でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から分泌され、そしてＬＴ−βの存在が表面結合ＬＴ−αと関連するので、ＬＴ−βはＬＴ−αと複合体を形成し細胞表面でそれを標的化すると結論付けた。生化学的には、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは非変性等電点フォーカシングゲル上で共に泳動するが、複合体が尿素で解離すると、２つのタンパク質が分離して流れる。［図９Ａ、１０Ａ参照のこと］。これらの観察は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βは細胞表面上で複合体として存在するという結論に導いた。
【００８７】
（リンホトキシン−βおよび可溶性リンホトシン−βペプチドに対してコードするＤＮＡ配列の同定）
リンホトキシン−βを、上述したように免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。直接Ｎ−末端配列決定およびインサイチュトリプシン分解に続いて、分解ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離を行った。［Ａｂｅｒｓｏｌｄら、「ニトロセルロース上のインサイチュプロテアーゼ分解後の一次元または二次元ゲル電気泳動法によって分離されるタンパク質の内部アミノ酸配列分析」、ＰＮＡＳ、８４、６９７０−６９７４（１９８７）参照のこと］。次に得られたＮ−末端および内部トリプシンフラグメントペプチドの配列を通常の方法を使用して決定した。Ｎ−末端およびＴ１０５、Ｔ８７／８８、Ｔ１１０およびＴ６７と命名した内部ペプチドの配列決定を図１３に示す。
【００８８】
２つのアンチセンス１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号９］およびＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号１０］（それぞれ１３６８および１３６９と命名した）を、ペプチドＴ−８７／Ｔ−８８の配列の一部分と一致するように合成し、そして３２Ｐで放射能標識した。ノーザン分析の結果、１３６８と命名されたプローブが、０．９〜１．１ｋｂ ｍＲＮＡバンドに強くハイブリダイズしたことを示した。このｍＲＮＡは、前述したようにホルボールエステルで前処理したＩＩ−２３．Ｄ７細胞中で強く誘導された。
【００８９】
ベクターｐＣＤＭ８中のｃＤＮＡライブラリーを、ＰＭＡで６時間誘導したＩＩ−２３．Ｄ７細胞から単離されたポリＡ＋ｍＲＮＡから構築した。ライブラリーを１３６８と命名された標識オリゴマーでスクリーニングし、そしてポジティブクローンを単離し、次に５０℃で３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。０．８〜０．９ｋＤ挿入物を有するいくつかの（＞１６）クローンを、ＤＮＡ配列分析にかけた。
【００９０】
クローンｐＣＤＭ８／ＬＴ−β−１２は、配列番号１に示されるリンホトキシン−βをコードする配列を含んでいた。他のクローンは、５’末端で種々の短縮形であることを除いて、同一であった。クローン１２ ｃＤＮＡは、機能的なリンホトキシン−βをコードする。標準プライマー伸長法を用いて、アミノ酸残基−−ＭＥＴ ＧＬＹ ＡＬＡ−−をコードする付加的なコドンを同定した。８６２〜８６７位の終止コドン ＡＡＴＡＡＡは、３’ポリＡ領域のちょうど前に、あり、これは全３’末端領域が同定されたことを示す。タンパク質コード配列は、２４０アミノ酸をコードし非修飾分子量で約２５，３９０ｋＤａと計算される。
【００９１】
クローン１２ ｃＤＮＡおよびプライマー伸長から同定されたＬＴ−β ＤＮＡ配列の５’末端、ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧ［配列番号１１］から、３つの開始コドン（下線）の可能性があることが明らかとなった。［例えば、Ｍ．Ｋｏｚａｋ、「脊椎動物ｍＲＮＡ配列の分析：翻訳調節の暗示」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１５、４、８８７−９０３（１９９１）］。設計されたＬＴ−βポリペプチドおよびＤＮＡ配列は、この５’配列の全てまたは一部分を切断することならびに１つの開始コドンを置換することで誘導し得る。
【００９２】
このアミノ酸配列プロフィルは、タイプＩＩ膜タンパク質に典型的である。短い（最大１７）アミノ酸配列Ｎ−末端「細胞質」ドメインに続いて、膜固定ドメインとしておそらく働く３０の疎水性アミノ酸が拡がる範囲がある。入手可能なデータベースでは同一の配列が発見されなかった。細胞外ドメイン中に１つのシステイン残基があり、そして最後のＣ−末端１７アミノ酸中に２つのメチオニンがある。これは、このタンパク質で示される非常に制限された臭化シアン切断パターンと一致する。
【００９３】
ＬＴ−βの配列を決定した後の比較では、ＬＴ−βは、タイプＩＩ膜タンパク質であり、ＴＮＦ、ＬＴ−αおよびＣＤ４０タンパク質に対して有意に相同性を有することが明らかになった。これらのポリペプチドは、細胞外ドメイン中に４つの配列保存領域を共有している。図１４参照のこと。このような保存領域は、これらのポリペプチドがお互いに複合体を形成するのを可能にするようである。［以下を参照のこと；例えば、Ｍ．ＥｃｋおよびＳ．Ｓｐｒａｎｇ、「２．６Å分解能での腫瘍壊死因子−αの構造、レセプター結合との関係」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６４、２９、１７５９５−１７６０５頁（１９８９）；Ｅ．Ｊｏｎｅｓら、「腫瘍壊死因子の構造」、Ｎａｔｕｒｅ、３３８、２２５−２２８頁（１９８９）；Ｍ．Ｅｃｋら、「１．９Å分解能でのヒトリンホトキシン（腫瘍壊死因子−β）の構造」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７、４、２１１９−２１１２頁（１９９２）；Ｊ．Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、「腫瘍壊死因子およびリンホトキシンの保存残基は、トリマー構造の骨組みを構成する」、Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．、２５７、２、（１９８９）］。
【００９４】
（クローン化ＬＴ−βの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２＊（＊プラスミドｐＣＤＭ／ＬＴ−βクローン１２を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２は、ＢＮ１２８９（ＭＣ１０６１／Ｐ３／Ｐ３３−クローン−１２）と命名され、１９９２年１１月１３日にＡＴＣＣに寄託された。）またはコントロールプラスミド、クローン４（非機能性ＬＴ−β ｃＤＮＡ挿入断片を有するｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによって、安定にヒトＬＴ−αでトランスフェクトしたＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞およびＣＨＯ細胞中に導入した。３日後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＣａ／Ｍｇを含まないＨａｎｋ溶液に取り出し、そして上述したような１０μｇ／ｍｌコントロールＩｇＧ１または抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のいずれかを使用したＦＡＣＳ分析のために染色し、その後、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリン標識ヤギ抗マウス調製物のいずれかで、結合免疫グロブリンを標識した。
【００９５】
他の実験において、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＤＭ８ベクター中でもまた等量のヒトＬＴ−αｃＤＮＡの存在または非存在下で、ｐＣＤＭ８中のクローン４またはクローン１２のＬＴ−βｃＤＮＡのいずれかでエレクトポレートし、そして上記のように３日後ＦＡＣＳ分析のために染色した。ＬＴ−αを発現するＣＨＯ細胞のみが、機能性ＬＴ−β ＤＮＡ（すなわち、クローン１２）でのトランスフェクションにおいて表面リンホトキシンを示した。
【００９６】
クローン１２は開始ＡＴＧコドンを欠損しているが、いくつかのＣＴＧ開始コドンを有しており、それゆえこの発現実験は１つまたはいくつかの５’ＣＴＧコドンが翻訳を開始しなければならないことを示す。ＣＴＧコドンは、いくつかの真核タンパク質の翻訳に対する開始部位となることは公知である。［Ｍ．Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１１５、４、８８７−９０３（１９９１）］。ＬＴ−αおよびＬＴ−β ＤＮＡの両方を受け入れるＣＯＳ細胞のみが、ＦＡＣＳ分析中の実質的な表面ＬＴ−αを示すような同様の結果を、ＣＯＳ細胞中の２つのトランスフェクション系を使用して観測した。
【００９７】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αならびにＬＴ−α／ＬＴ−βのポテンシャル使用）
上記のように、ＬＴ−β、ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドの間にかなりの構造的類似性がある。ＬＴ−β、ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドはタイプＩＩ膜タンパク質であり、そして細胞外ドメイン中に少なくとも４つの配列保存領域を共有している。
【００９８】
構造的類似性の観点において、ＬＴ−αが、分泌される分子と同一の形態で活性化リンパ球の表面で見られるが、ＬＴ−αを表面におそらく固定する他の不可欠な膜タンパク質と複合されるという問題がある。発明者らは、この独特の複合体（すでにＬＴ−α／ＬＴ−βであると決定された）が、ＬＴ−αのさらに関連している形態を示し、ＴＮＦと関連する特異性を与えると考えている。
【００９９】
リンホカインのヘテロメトリックの複合体の存在は、免疫系に独特であるが、他の領域中のシグナル分子を暗示する（例えば、ＰＤＧＦおよびインヒビン／アクチビンヘテロメトリック複合体）。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の記述は、ＬＴ−αホモトリマーによって模倣できない複合体独特の免疫調節活性の可能性を提供する。複合体は、高い親和性相互作用および生化学的に関連したシグナルを導く独特のレセプターまたはレセプター鎖組合せに結合し得る。独特のレセプター複合体とのＬＴα−／ＬＴ−β相互作用の仮説は、多くの系でのＴＮＦ（２つの公知ＴＮＦレセプターの研究によって説明できない観測）と比較してＬＴ−αホモトリマーの相対的に弱い活性を説明し得た。［Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１−３７０（１９９０）；Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）］。
【０１００】
ＬＴ−βとの複合体化を経て可溶性ＬＴ−αを細胞表面につなぐことは、ＬＴ−α／ＬＴ−βを介する細胞−細胞接触特異的シグナルが、免疫調節の重要な面であり得ることを示す。ＴＮＦおよび関連したＬＴ−α形態は分泌されるので、ＬＴ−βもまた分泌され得ると考えられる。これは、抗ＬＴ−βモノクローナル抗体を使用する研究で実証し得る。このような抗体はまた、ＬＴ−βホモ−オリゴマーが自然に生じるかどうか決定するために使用され得る。
【０１０１】
一般的に、ＬＴ一およびＴＮＦは、定性的に同じ活性スペクトルを示し、そしてＬＴ−αおよびＴＮＦは同じセットのレセプター（５５および８０ｋＤ ＴＮＦレセプターと呼ぶ）と相互作用すると考えられる。［Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）；Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１（１９９０）］。それでもなお、ＬＴ−αおよびＴＮＦによって示される生物学的能力の定量的パターンは劇的に異なり、ＬＴ−αはしばしばＴＮＦよりさらに能力が少ない［例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）を参照のこと］。これらの観測は、存在するレセプター結合データと一致させることが難しい。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、他の現在まで不確定のレセプターと相互作用するような、独特の特性をＬＴ−αに与える可能性がある。この場合、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体および本発明の他の複合体は、ＬＴ−αまたはＴＮＦのいずれかと区別する独特の生物学的特性を有する。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、例えばＬＴ−α／ＬＴ−βまたはＬＴ−β特異的レセプターを同定し、そしてクローニングするために使用され得る。さらに、さらなる複合体の使用は、新規な生物学的活性を明らかにし得る。
【０１０２】
また、多数のＴ細胞およびマクロファージ細胞株がＨＩＶウイルスによって感染可能であることは公知であるが、実際には、少数の細胞様が組織培養中のウイルスを増殖するのに有用である。例えば、Ｈ９株（Ｇａｌｌｏらによって最初に開発されたＨｕｔ−７８の誘導体［Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４、４９７−５００（１９８４）］）、および他のヒトリンパ球株（Ｃ８１６６）は、ＨＩＶ増殖に対して有用であった。［Ｍ．ＳｏｍａｓｕｎｄａｒａｎおよびＨ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、１５５４−１５５７（１９８８）］。表面ＬＴ−α発現または表面ＬＴ−αの発現の能力は、所定の細胞をＨＩＶ増殖に対して良い標識にし得る。
【０１０３】
ＨＩＶ増殖を高めることにおけるＴＮＦの役割が提案された［Ｌ．Ｏｓｂｏｒｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、２３３６（１９８９）；Ｚ．ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＡ．Ｆａｕｃｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１１、１７６（１９９０）；Ｃ．Ｌｏｃａｒｄｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４、５８７４（１９９０）；Ｇ．Ｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、７８２（１９９０）］。発明者らは、ＩＩ−２３．Ｄ７株がＨＩＶ株ＩＩＩＢで感染可能であるが、ＰＭＡ処理でこのウイルスによる感染が劇的に増加することを発見した。Ｈｕｔ−７８細胞株が、表面ＬＴ形態を構成的に発現することが見出され、そしてＣ８１６６株は、その後のＰＭＡ処理で明らかとなる表面ＬＴ中でＩＩ−２３．Ｄ７と似ている。［Ｗａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、印刷中（１９９２）］。
【０１０４】
これらのＨＩＶによるＩＩ−２３．Ｄ７の感染可能性の結果、および感染可能な細胞株と表面ＬＴ発現との関係を考慮すると、これらの株がＨＩＶ感染および複製に対し良い宿主であり得ることを提案する。なぜなら、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体、および本発明の他のポリペプチドおよび複合体が調節の役割を果たすからである。ＬＴ−α遺伝子がＨＩＶ転写活性化因子ＴＡＴの発現によって誘導されることが証明され［Ｋ．Ｓａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、２００９１（１９９０）］、そして、さらに、ＨＴＬＶ−１感染もまたＬＴ−α発現を誘導することが示された［Ｎ．Ｐａｕｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４、５４１２（１９９０）；Ｅ．Ｔｓｃｈａｃｈｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０）、Ｗ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ編、１０５頁］。従って、ＨＩＶ感染および続いて起こるＬＴ−α／ＬＴ−β複合体または他の複合体の発現によるＬＴ−αの誘導、またはこれらのタンパク質を作る能力がある細胞株でのＰＭＡ処理によるＬＴ−α／ＬＴ−βまたは他の複合体の発現の誘導は、ウイルス複製を高めるために用い得る。この理由のために、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体もしくは本発明の他のポリペプチド複合体、またはこれらの複合体の可溶性形態、またはＬＴ−βおよび本発明の他のポリペプチドに対する抗体または特異的結合タンパク質（例えば、可溶性レセプター）は、ＨＩＶ増殖を阻害し得、またはＨＩＶ誘導Ｔ細胞死をブロックし得る。
【０１０５】
ＬＴ−α／ＬＴ−βとＣＤ４０レセプターリガンドペアとの間の類似点が示され得、ここでＴ細胞表面ＣＤ４０リガンドからのシグナルは、ＣＤ４０レセプターを介してＢ細胞へ「ヘルプ」を与える。従って、表面ＬＴ−α／ＬＴ−βが、Ｔ細胞または他の造血系（ＬＡＫまたはＮＫ細胞およびＢ−細胞など）のＴ細胞調節の成分であり得ると仮定し得る。さらに、この相互作用は、いくつかの自己免疫疾患中の機能不全であり得る。［例えば、Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３１４−３１７頁（１９９２）を参照のこと］。
【０１０６】
さらに、Ｆａｓ抗原と呼ばれる細胞表面タンパク質は、ＴＮＦ、ＮＧＦ、およびＣＤ４０タンパク質を含む多数の細胞表面レセプターとかなりの構造的相同性を有することを示した。Ｆａｓ抗原は、アポトーシスを仲介することに関係しており、プロセスもまたプログラム細胞死として関連している［Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３１４−３１７頁（１９９２）；Ｎ．Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ、６６、２３３−２４３頁（１９９１）］。Ｆａｓ抗原の欠損を説明するマウスの株は、全身性エリテマトーデス様自己免疫疾患を発生する。これは、構造的に類似しているＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体もまた、全身性エリテマトーデスを仲介する役割を行い得、それゆえ、この経路中の介入は、種々の自己免疫疾患を治療することに臨床的に有用であり得る。あるいは、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、細胞−細胞接触依存機構を介するプログラム細胞死を誘導することに関連し得る。すでに大規模なＴＮＦ／ＮＧＦタイプレセプターのファミリーを補充するためのＴＮＦ関連リガンドのこのファミリーの出現は、免疫系中での重要な調節因子の追加配列の存在を示唆する。
【０１０７】
ＬＴ−βまたはＬＴ−β／ＬＴ−α複合体は、免疫系を抑制する役割を同様に行い得、そしてアレルギーを治療し、耐性を誘発することに潜在的に有用であり得る。
【０１０８】
ゲノムのＭＨＣ領域のＴＮＦ／ＬＴ遺伝子座の位置は、研究者らに種々の自己免疫疾患、特にインスリン依存性真性糖尿病に対する関連を調査させた。［例えば、Ｆ．Ｐｏｃｉｏｔら、「モノカイン分泌とインスリン依存性真性糖尿病との関係における腫瘍壊死因子β遺伝子多形性」、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３、３７−４９（１９９１）；Ｋ．Ｂａｄｅｎｈｏｏｐら、「（インスリン依存性）真性糖尿病タイプ１におけるＴＮＦ−α遺伝子多形性」、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３２、４４５−４４８（１９８９）を参照のこと］。発明者らは、ＬＴ−β遺伝子がＴＮＦ／ＬＴ遺伝子座の次に位置することを発見したので、ＬＴ−β遺伝子またはそのレセプターがこの自己免疫条件に関連する可能性がある。従って、ＬＴ−βまたはそのレセプターまたはＬＴ−βに対する抗体は、糖尿病のこの形態における置換療法を包含する。
【０１０９】
上述したように、ＬＴ−βポリペプチド、および本発明のポリペプチド複合体は、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化、またはＴ細胞抑制適用を含む多数の可能性のある使用、全身性エリテマトーデスの治療を含む適用、および抗炎症性の組成物での使用および方法を有することが期待される。次に、ＬＴ−βポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、同様なＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子、ならびに同様の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした培養物中の単細胞宿主および動物またはヒト細胞を用いて、組成物および上記の療法で使用するために、実質的に他のヒトタンパク質を含まない大量の本発明のポリペプチドを生成し得る。
【０１１０】
本発明のポリペプチド複合体の表面上で発現するリンパ球、および好ましくはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、腫瘍細胞を殺す能力を高め得たリンパ球のサブセットを示す。同様に、このサブセットは、ＬＡＫ（リンホトキシン活性化キラー）細胞またはＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）細胞療法に有用であり得る。［Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｓｉｋｏｒａ、「癌療法への生物学的アプローチ」、Ｊｏｕｒ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、１７、１９１（１９８９）］。ＴＩＬ免疫療法は、遺伝子転移技法によって改善され得る。ＬＴ−βについての組換え遺伝子およびそれに基づく関連のポリペプチドは、例えばＴＩＬ療法で、治療上有用であり、ここでＬＴ−β遺伝子は（ＬＴ−α遺伝子と共にまたはＬＴ−α遺伝子なしのいずれかで）、腫瘍から単離したＴ細胞に導入し、そして患者に導入され得る。さらに好ましくは、細胞を患者から取り出し、本発明のポリペプチドを発現するようにコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトし、トランスフェクションの前または後でリンホカイン、好ましくはＩＬ−２でインキュベートし、そして患者に戻す。トランスフェクトしたＴ細胞（すでにＬＴ−βを発現し、そしてまたその後ＬＴ−αと複合化している）は、取り出された腫瘍に戻り、そこでＬＴ−αの殺腫瘍性作用を直接腫瘍に伝える。同様に、ＬＡＫ細胞中に導入されるＬＴ−β遺伝子が細胞上の表面複合体の数を増加させ、そしてそれらの活性を高めることが考えられる。あるいは、患者腫瘍細胞中へのＬＴ−β遺伝子の導入は、ＬＴ−β改変腫瘍が、腫瘍自体に対する高められた免疫応答を誘発する腫瘍ワクチンを造り出すことに、有用であり得る。［例えば、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、８０８−８１３（１９９２）を参照のこと］。
【０１１１】
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体に対する抗体または抗体誘導体もまた、この細胞集団を富化するための通常の免疫学的方法（例えば、パンニングまたはフローサイトフルオロメトリー選別）に有用である。［Ｌ．Ｊ．ＷｙｓｏｃｋｉおよびＶ．Ｌ．Ｓａｔｏ、「リンパ球についてのパンニング：細胞選別の方法」、ＰＮＡＳ、７５、２８４４（１９７８）］。
【０１１２】
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体、またはフラグメントまたはその誘導体は、リンホトキシン−αおよび腫瘍壊死因子が使用されるのと同様に、細胞調節または治療の適用に有用である。
【０１１３】
本発明の組成物は、特定の臨床状態に対して治療するために、有効な用量で投与され得る。所定の適用についての特定の用量の決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の治療の程度および治療に対する患者の耐性を、当該技術分野では十分考慮に入れる。本発明の複合体およびポリペプチド、またはおそらくそれに由来するペプチド、またはそれからもしくはそれらのアミノ酸配列を使用して合成されるペプチド（ポリペプチドの単離および精製形態を包含する）、またはそれらの塩または薬学的に受容可能な誘導体の投与は、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞抑制または抗炎症活性を示す薬剤の任意の従来受容された態様を介するものであり得る。
【０１１４】
これらの療法で使用される組成物もまた、種々の形態であり得る。これらは、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、注入可能または浸出可能な溶液のような、固体、半固体、および液体の投与形態、および遺伝子療法を包含し得る。好ましい形態は、投与の意図した形式および療法の適用に依存する。投与の態様は、経口、非経口、皮下、静脈内、病変内、または局所投与を包含し得る。組成物はまた、好ましくは、通常の薬学的に受容可能なキャリアを包含し、そして他の医薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤など、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物を包含し得る。好ましくは、組成物は１単位用量の形態であり、そして通常１日１回またはそれ以上を投与される。
【０１１５】
以下は、本発明のＬＴ−βおよびＬＴ−α／ＬＴ−β複合体、およびこれらを特徴付けるために使用される方法を説明する実施例である。これらの実施例は限定して解釈されるべきものではなく：実施例は例証の目的のために含まれ、そして本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１６】
実施例において以下の実験手順を使用した：
（抗血清）
組換えヒトＬＴ−α（ｒＬＴ−α）を、無血清条件培地中で安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって、発現しそして分泌した。無血清条件培地から、一連のセファロースＳ、レンズマメレクチンセファロースおよびＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィー工程によって、分泌ｒＬＴ−αを精製した。ＣＨＯ細胞由来のｒＬＴ−α調製物の特性は記載されている。［Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）］。リンパ腺手順［Ｍ．Ｓｉｇｅｌら、「リンパ腺中への接種による抗体の産生」、Ｍｅｔ．Ｅｎｚ．、９３、３（１９８３）］によって、完全フロイントアジュバンド中２５μｇの天然ｒＬＴ−αで２匹のウサギ（４および５）を免疫した。３番目のウサギ（６）を、完全フロイントァジュバンド中２５μｇの変性ｒＬＴ−αで同じ経路により免疫した。変性ｒＬＴ−αをＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて０．１％ＳＤＳ−カーボネート緩衝液中で電気溶出によって調製した。
【０１１７】
上記の方法を使用して、３つの抗ｒＬＴ−α抗血清を、２つを天然ｒＬＴ−αに対して、３番目をＳＤＳ変性ｒＬＴ−αに対して生成した。天然タンパク質（ウサギ４および５）での免疫によって生じた抗血清は、１：２０００〜５０００の希釈で５０ユニット／ｍｌ溶液を中和し得た。変性ｒＬＴ−α（ウサギ６）に対して生じた血清は、中和力価がないが、ウェスタンブロットではｒＬＴ−αと弱く反応した。抗血清は、ｒ−ヒトＴＮＦを中和し得ず、またウサギ６由来の抗血清中で非常に弱い力価であることを除いて、ＥＬＩＳＡプレートに結合したｒ−ヒトＴＮＦを認識し得なかった。ウサギ６由来の抗血清のみがウエスタン分析でｒＬＴを認識可能であった。
【０１１８】
組換えヒトＴＮＦで４番目のウサギを免疫した。完全フロイントアジュバント中で、続いて不完全フロイントアジュバント中のブーストにより、組換えヒトＴＮＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来［Ｄ．Ｗｅｉｒら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ｆｏｕｒ Ｖｏｌｕｍｅｓ、８章「実験動物の免疫」］）を使用する古典的免疫スキームを経て、ポリクローナル抗ｒＴＮＦウサギ血清を調製した。免疫によりｒＴＮＦに対して生じた血清は、良好な中和力価を有した。ＴＮＦに対する中和モノクローナル抗体が記述されている［Ｌｉａｎｇら、「組換えヒト腫瘍壊死因子／カケクチンに対するモノクローナル抗体の産生および特徴付け」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１３７、８４７（１９８６）］。予め免疫した血清を、コントロールとしての使用のために全ての動物から収集した。
【０１１９】
（細胞増殖およびＴ細胞活性化）
全ての細胞を、上述したＬＴ−αトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を除いて、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した［Ｂｒｏｗｎｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９−１８６７頁（１９８９）］。
【０１２０】
細胞を、１％グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ−ｄｅｆｉｎｅｄ）を補足したＲＰＭＩ １６４０（「完全ＲＰＭＩ」と呼ぶ）中で増殖した。ただし、上記のように補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中で増殖したトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は除く。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３は、活性化末梢リンパ球とヒトＣＥＭ腫瘍株との融合の結果であり、そしてさらにサブクローニングした（ＩＩ−２３．Ｄ７）［Ｃ．Ｗａｒｅら、「細胞障害性リンホカインを生産するヒトＴ細胞ハイブリドーマ：抗ＣＤ３モノクローナル抗体またはレクチンおよびホルボールエステルによるリンホトキシン放出およびキラー細胞活性の誘導」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、５、３１３（１９８６）］。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をヘパリン添加ガラスチューブ中に入れ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって単離し、洗浄し、そして完全ＲＰＭＩ培地で再懸濁した。１μｇ／ｍｌ インドメタシン存在下および、いくつかの実施例では１０ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ−２（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ＯＫＴ３条件培地の１：５００希釈（最終的に約２ｎｇ／ｍｌ）を用いて、２×１０６細胞／ｍｌで、ＰＢＬを処理した。ヒトＣＴＬ−クローンを、記述したように生成し［Ｌ．Ｇｒｅｅｎら、「クローン化ヒト細胞障害性Ｔリンパ球によって生産される細胞障害性リンホカイン」、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５、４０３４（１９８５）］、そして照射刺激細胞（抗原）またはＥ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚによって提供された抗ＣＤ２モノクローナル抗体（Ｔｌ１２＋Ｔｌ１３）の組合せのいずれかで活性化した。
【０１２１】
（フローサイトメトリー）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ アジ化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍｌ ヒトＩｇＧを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、０℃で、細胞を再懸濁した。ヒトＩｇＧでのプレインキュベーションに続いて、所望の抗血清を含有する追加培地を添加した。代表的には、細胞を１：２００の抗ｒＬＴ−αおよび抗ｒＴＮＦ血清の最終希釈で６０〜９０分間インキュベートした。Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、次に、上記の培地中でフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）の１：５００希釈で最低６０分間これらをインキュベートした。次に細胞を１回洗浄し、そして直接に分析するか、またはいくつかの場合では０．５％パラホルムアルデヒドを用いて０℃にて１０分間の固定後に分析するかのいずれかを行った。２番目の抗体段階でのフィコエリスリン標識ｌｅｕ−４、ｌｅｕ−２、ｌｅｕ−Ｍ３、またはｌｅｕ−１６もしくはｌｅｕ−１９（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を添加することを除いて、上記のように２つの色分析を行った。表面結合ＬＴ−αとＩＬ−２レセプターレベルとの比較を、フルオレセイン標識抗ＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａ．）を用いる分離単色分析で行った。分析を、ＦＡＣＳｔａｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。
【０１２２】
（活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞による中和抗ｒＬＴ−α抗体の吸着）
完全ＲＰＭＩ培地中で、１×１０６細胞／ｍｌで８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと共に、ＩＩ−２３．Ｄ７およびＵ９３前単球細胞を刺激した。３回培地で細胞（１×１０８個）を洗浄し、そして上清を吸引して、乾燥ペレットを得た。次に、細胞を、抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４由来）の１：１０００希釈を含有する１ｍｌの培地で再懸濁し、そして混合しながら１．５時間氷上でインキュベートした。細胞を遠心分離によって抗血清から取り除いた。吸着した抗血清（免疫前および免疫後の両方）を、１５Ｕ／ｍｌのｒＬＴ−αを含有する等量（５０μｌ）の培地と混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。この混合物を培地中に連続的に希釈し、そしてＬ９２９細胞（０．１ｍｌ中）に添加し、そしてさらに２４時間インキュベートした。記載されたようなＭＴＴアッセイ［Ｌ．Ｇｒｅｅｎら、「細胞生存度に対する迅速な比色アッセイ：細胞障害性および増殖阻害リンホカインの定量への適用」、Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、７０、２５７−２６８（１９８４）］によって、細胞生存度を評価した。
【０１２３】
（Ｔ細胞の３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインの代謝標識）
ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０％ ｖ／ｖ 透析ＦＢＳ、および２％ ｖ／ｖ 通常のＲＰＭＩ（冷キャリア添加）を補足したシステインを含まないまたはメチオニンを含まないＲＰＭＩ １６４０中に、細胞を移した。細胞濃度を２〜３×１０５細胞／ｍｌに調節し、そして３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを１００〜２００μＣｉ／ｍｌのレベルにした適切な培地に添加した。新たに活性化したＰＢＬの場合は、上清を穏やかに除去し、そして細胞を遠心分離し、標識培地中で再懸濁し、そして元の付着集団に戻して添加した。１２〜１８時間の標識期間の後、以下に記述するように細胞を洗浄し、そして溶解した。ＰＢＬを用いて、細胞をピペットにより除去し、そして付着集団をＰＢＳ中で５ｍＭＥＤＴＡで処理することで部分的に除去した。
【０１２４】
（免疫沈降）
標識した細胞溶解物の０．２〜０．５ｍｌに２〜４μｌのウサギ血清を添加した。サンプルを１〜２時間、４℃で放置した。次に、洗浄したプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）の６０〜７５％懸濁液の６０μｌアリコートを添加し、そして６〜１８時間４℃でサンプルを振とうした。プロテインＡセファロースペレットをカルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ中 １％ＮＰ−４０で３回洗浄し、それらを５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳローディング緩衝液に再懸濁した。代表的には、１つの溶解物のサンプルを、連続した免疫沈降（免疫前抗ｒＬＴ−α血清、抗ｒＴＮＦ抗血清、および最後に免疫後抗ｒＬＴ−α抗血清）を介して循環した。１つのセットの実験で、５ｍＭ ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を溶解物に添加し、そして洗浄したレンズマメレクチン−セファロースの７５％懸濁液の７５μｌと共に溶解物を一晩振とうした。このセファロースをＮＰ−４０／ＰＢＳで２回洗浄し、次に０．２５Ｍ α−メチルマンノシドを含む７５μｌの１％ ＮＰ−４０／ＰＢＳの３回の連続的な添加により溶出した。プールした洗浄液を、免疫沈降プロトコールに用いた。
【０１２５】
（ウサギ抗ｒＬＴアフィニティーカラム）
プロテインＡセファロースを用いて酸性ｐＨ溶出で抗ｒＬＴ血清（ウサギ４由来）から免疫グロブリン画分を精製した。溶出したＩｇＧ含有面分をＰＢＳで透析し、そしてアミコン濾過により濃縮した。抗ｒＬＴ−α−ＩｇＧ溶液（６ｍｇ／ｍｌを１５ｍｌ）を、使用説明書に従い８ｍｌのＡｆｆｉ−ｇｅｌ １０樹脂（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａ．）に結合した。非特異的ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）を用いて同一のアフィニティーカラムを調製した。両方のカラムを、ＰＢＳ、１％ ＮＰ４０を含む１Ｍ 酢酸 ｐＨ３．０、そして最後にプロテアーゼインヒビターを含まない溶解緩衝液で洗浄した。
【０１２６】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αの最初の精製）
ＩＩ−２Ｓ．Ｄ７細胞（１５Ｌ）を５×１０５細胞／ｍｌの濃度になるまで増殖し、ホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）を添加し、最終濃度２５ｎｇ／ｍｌにした。２４時間後、細胞を採取し、そしてそれを冷無血清ＲＰＭＩ培地中で洗浄した。７×１０９細胞を含む凍結した細胞ペレットに、１００ｍｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１％ ｖ／ｖ ＮＰ−４０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．１％ アジ化ナトリウム）を添加した。その溶解緩衝液には、５ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルクロライド（ＰＭＳＦ）、および０．２５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター、０．７μｇ／ｍｌ ペプスタチンおよび１０μｇ／ｍｌ アプロチニンが新たに添加されている。ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞を穏やかにホモジナイズし、そして細胞溶解物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を６０，０００×ｇで９０分間遠心分離し、そして上清を収集した。
【０１２７】
高速遠心分離からの上清に、５ｍＭ ＣａＣｌ２および５ｍＭ ＭｎＣｌ２を添加した。次に、この上清を、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を加えた溶解緩衝液で平衡化した２０ｍｌのレンズマメレクチンセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）にロードした。溶解緩衝液（ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含む）でカラムを洗浄し、そして次に０．２５Ｍ α−メチルマンノシドを含有する溶解緩衝液でカラムを溶出した。
【０１２８】
レンズマメレクチン溶出画分を５０ｍｌの体積までプールし、そしてそれを２ｍｌのウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフィニティーカラムに直接ロードした。このカラムを２ｍｌのウサギ抗ｒＬＴ−αセファロースアフィニティーカラムに直接連結した。両方のカラムをＥＤＴＡを含む同じ溶解緩衝液で洗浄し、次に１％ ＮＰ−４０が１％ Ｗ／Ｖ
ＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ一Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ．）に置換されている溶解緩衝液で洗浄した。
【０１２９】
洗浄したカラムを、各々、１％ ＭＥＧＡ−８、５０ｍＭ グリシンｐＨ２．５、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭベンズアミジン、および２ｍＭ ＥＤＴＡで溶出した。ｐＨが変わった後の最初の２０ｍｌをプールし、このプールを凍結乾燥し、０．０５％ ＳＤＳを含む水１ｍｌに再懸濁し、そして１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．０５％ ＳＤＳ、および０．１％ ＭＥＧＡ−８で透析した。透析した画分をスピード真空（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で乾燥し、そして０．１５ｍｌの水に再懸濁した。アリコートとＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液とを混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質を銀染色により視覚化した。
【０１３０】
（ＩＩ−２３．Ｄ７細胞表面のヨウ素化）
コントロールまたはＰＭＡ誘導ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のいずれかを、カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳで大量に洗浄し、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．２５ｍＭ ＮＥＭで処理し、そして次に２回洗浄した。５０μｇのヨードジェン（ｉｏｄｏｇｅｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ）でコートした１２×７５ｍｍガラスチューブに、０．３ｍｌの細胞（１×１０７全量）および１〜２ｍＣｉの１２５ヨウ化ナトリウムを添加した。細胞を２５分間、室温で定期的に撹拝しながら放置し、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳで３回洗浄し、そして上記の溶解緩衝液に再懸濁した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠沈管での２分間の遠心分離により核を除去した。次に、この上清をさらに１５分間遠心分離した。透明にした上清を免疫沈降のプロトコールに用いた。
【０１３１】
（一次元ＣＮＢｒペプチドマッピング）
サンプルを、１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉシステムゲル上にて短距離で電気泳動し、適切なゲル断片を切り出した。ゲルの薄片を、９０％ギ酸中に新鮮な７００ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒを１５μｌ含む１．０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ、０．２％ ２−メルカプトエタノールに１時間浸漬した。次にこの薄片を取り出し、そして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０で５分間、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０で５分間、そして最後に１×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で１０分間洗浄した。１２％ アクリルアミドスタッキングゲルを有する１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で薄片をロードした。ペプチドのバンドを銀染色または乾燥したゲルのオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【０１３２】
（再免疫沈降）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した抗原の再免疫沈降を、ゲルから標識したバンドを切り出し、ＴＢＳ、０．２％ ＳＤＳで１０分間再水和化し、そして次にゲルの薄片を小さな切片に刻むことにより行った。タンパク質を、１ｍｌ ＴＢＳ、０．２％ ＳＤＳ中で８時間、室温で回転しながらインキュベートすることにより溶出した。溶出後、ゲルの切片を遠心分離で取り除き、そしてＮＰ−４０を最終濃度が２％になるように上清に添加した。次に溶出されたタンパク質を上記の様に免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで再分析した。
【０１３３】
（等電点電気泳動（ＩＥＦ））
二次元ＩＥＦを、本質的にＰ．Ｈ．Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，４００７−４０２１（１９７５）］に記載されたように行った。１２５Ｉで標識した抗原を、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物から免疫沈降し、そして免疫沈降したタンパク質を、９．５Ｍ尿素を含む１００μｌのＯ’Ｆａｒｒｅｌｌサンプル緩衝液中で１００℃、５分間の加熱により溶出した。次に、溶出したタンパク質を、最終濃度２％アンホリン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ）（ｐＨ３〜１０領域、Ｓｉｇｍａ）を有する１４ｃｍ×３ｍｍのチューブゲル上で室温で１６時間定電圧（４００Ｖ）で泳動した（第一次元）。第二次元は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥであった。
【０１３４】
天然（未変性）条件下でのＩＥＦについて、１２５Ｉで標識した細胞抽出物を、尿素が存在することを除いて上記と同様にチューブゲルに直接電気泳動した。標識した抽出物（容積２００μｌ）をチューブゲルでロードする前に、１００，０００×ｇ（３０ｐｓｉ、ａｉｒｆｕｇｅ）で１０分間遠心分離した。電気泳動を上記と同じ条件下で４℃にて行った。次にチューブゲルを取り出し、そして１ｃｍの断片にスライスし、タンパク質を、１ｍｌのＴＢＳ、２％ ＮＰ−４０、２ｍＭ ＰＭＳＦ中で、８時間室温でそれぞれの薄片を回転させながらインキュベートすることにより溶出した。次に溶出したタンパク質を含む上清を免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。変性および未変性のチューブゲルの両方についてのｐＨ勾配を、並行で行ったゲルからの個々の薄片のｐＨの測定により決定した。
【０１３５】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
ＰＢＬを単離し、そして１０％ヒト自己血清、１μｇ／ｍｌ インドメタシン、および５０Ｕ／ｍｌポリミキシンＢを含むウシ胎児血清を除いた上記の完全ＲＰＭＩに再懸濁した。ＭＬＲ実験で、自己血清は応答動物の血清であった。異なるドナーからの刺激細胞を３０００ラドで照射した。ウサギ血清を５６℃で１時間前加熱し、そして増殖アッセイに用いる前に血清を希釈し、濾過滅菌した。丸底９６ウェルプレートの０．２ｍｌの細胞（全量１×１０５）を５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン、１〜２ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３または１．５〜２×１０５の照射した刺激細胞のどちらかで、種々の抗血清またはサイトカインの存在または非存在下で処理した。３日後（ＰＨＡまたはＯＫＴ３活性化）または５日後（ＭＬＲ）、細胞を３Ｈ−チミジンでパルスし、採取しそして計数した。
【０１３６】
（ＬＴ−αおよびＬＴ−βのさらなる精製）
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で培養し、５０ＬのＲＰＭＩ培地から細胞を採取し、４×１０６細胞／ｍｌの濃度になるよう培地に再懸濁し、そして５０ｎｇ／ｍｌ ホルボールミリストイルアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間の活性化の後、遠心分離により細胞を採取し、そしてＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。２００ｍｌの冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０；０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ベンズアミジン、各１０μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（アプロチニン、キモスタチン、ロイペプチン、アンチパイン）、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド）中に最終的に４×１０１０細胞の細胞ペレットを懸濁し、このペレットを一回窒素キャビテ一ターに通した。溶解した細胞を、５０．２ Ｔｉローターで４０，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、１％ ｗ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ４０デタージェントを含む１２０ｍｌの溶解緩衝液中で一晩抽出し、そして次に上記の様に遠心分離した。
【０１３７】
Ａｆｆｉ−ｇｅｌ １０（ＢｉｏＲａｄ）に結合しているモノクローナル抗リンホトキシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した抗腫瘍壊死因子−β）からなる２ｍｌのアフィニティー樹脂に、デタージェントで可溶化した膜タンパク質を含む上清を添加し、そしてこの懸濁液を一晩振とうした。樹脂を小さなカラムに集め、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、そして次に１％ ｗ／ｖ ＭＥＧＡ−８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む同じ緩衝液で洗浄した。５０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．５中の１％ＭＥＧＡ−８で、結合したタンパク質を溶出し、そして画分を直ぐにＴｒｉｓ塩基で中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色により、画分中のｐ３３およびＬＴの存在を決定した。これらのタンパク質を含む画分をプールし、そしてＳＤＳを最終濃度０．１％ ｗ／ｖになるまで添加し、そして０．１×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＭＥＧＡ−８デタージェントを除去するために様々に変化している）でこのプールを透析した。透析した溶液を凍結乾燥し、そして元の水の１／１０量に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にサンプルをロードし、ＰｒｏＢｌｏｔメンブラン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にブロットし、そしてクマシーブルー染料で染色した。
【０１３８】
このスキームは、 ブロット上のバンドでＬＴ−βを精製可能にする。当業者がイオン交換クロマトグラフィーによりアフィニティー樹脂から溶出したタンパク質を分離することは可能であるべきである。例えば、複合体を尿素で解離し得、そしてＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を、例えば１％非イオン性デタージェント（例えば、ＭＥＧＡ−８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および尿素を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液ｐＨ８．０中で、ＭＯＮＯ Ｑ ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陰イオン交換クロマトグラフィーにより、塩勾配溶出を用いて分離し得る。このクロマトグラフィーの技術は、タンパク質の異なった電荷に基づいて分離する。２種類のタンパク質は、等電点電気泳動実験（上記参照）で電荷の差異に基づいて分離され得、このとき尿素を使用し、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体を解離する。このようなアフィニティークロマトグラフィー、尿素／非イオン性デタージェントでの解離、およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せは、可溶性ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の精製を可能にする。
【０１３９】
（ペプチド配列決定アッセイ）
ＰｒｏｂｌｏｔからＬＴ−βおよびＬＴ−αバンドを切り出し、タンパク質シークエンサーにロードした。１２０Ａ ＰＴＨアミノ酸分析機と連結した、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシークエンサーモデル４７０Ａを用いて、Ｅｄｍａｎ分解によりＮ末端の配列の情報を得た。ＬＴ−βを上記の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてトリプシン断片の配列を得た。［Ａｂｅｒｓｏｌｄら、「インサイチュ後の一次元または二次元ゲル電気泳動により分離したタンパク質の内部アミノ酸配列分析、ニトロセルロース上でのプロテアーゼ切断」ＰＮＡＳ，８４，６９７０−６９７４（１９８７）を参照のこと］。すなわち、インサイチュでブロット上のタンパク質をトリプシンで切断し、切断したペプチドの逆相ＨＰＬＣ解析を行った。得られたＮ末端および内部のトリプシン断片ペプチドを、次にＥｄｍａｎ分解により配列決定した。Ｔ１０５、Ｔ８７／８８、Ｔ１００、およびＴ６７と呼ばれるＮ末端および内部のペプチドの配列決定を図１３に示す。
【０１４０】
（オリゴヌレオチドプローブの構築）
Ｔ８７／８８の配列から、以下のアンチセンスプローブを設計した：
１３６８ ＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号９］
１３６９ ＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号１０］
そして標準方法により合成した。［例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版．（１９８９）を参照のこと］。
【０１４１】
（誘導されたＩＩ−２３ ｃＤＮＡライブラリーの調製）
ｃＤＮＡサブライブラリーを以下のように調製した：
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を６時間、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで刺激し、ＬＴ−β ｍＲＮＡの存在を確認した。これらの細胞からｍＲＮＡを単離し、そして当該技術分野で周知の技術を用いてそれを逆転写しｃＤＮＡにした。［Ｂ．ＳｅｅｄおよびＡ．Ａｒｕｆｆｏ、「迅速免疫選択方法による、ＣＤ２抗原、Ｔ細胞赤血球レセプターの分子クローニング」ＰＮＡＳ、８４，３３６５−３３６９（１９８７）］。標準手法を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを以下の配列を有するＮｏｔＩ−ＢｓｔＸＩリンカー／アダプターに連結した：
【化１】
【０１４２】
次に４．２ｍｌの５〜２０％酢酸カリウム勾配、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド、Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）ＳＷローターで、５０，０００ｒｐｍ、２２℃にて３時間標準方法によりｃＤＮＡをサイズ選択した。５００塩基対より大きなｃＤＮＡ断片をプールした。次いで、ベクター、ｐＣＤＭ８（Ｂｒｉａｎ Ｓｅｅｄ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から供与された）を調製した。このプラスミドをＢｓｔＸＩで切断した。４００塩基対のスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを除去するために、この混合物を上記の様に酢酸カリウム勾配で遠心分離し、そしてより大きなフラグメントを単離した。このフラグメントをアガロースゲル電気泳動によりさらに精製し、そして次いでｃＤＮＡをベクターに連結した。この方法で、誘導したＩＩ−２３．Ｄ７細胞で発現したｍＲＮＡに対するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を作製した。これらのプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１ Ｐ３を形質転換した。ＰＭＡ誘導したＩＩ−２３．Ｄ７ ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを有する、１×１０６以上の組換えクローンのコレクションを得た。
【０１４３】
（スリーニングおよびクローンのＤＮＡ配列決定）
ｐＣＤＭ８ ＩＩ−２３．Ｄ７ライブラリーを３２Ｐ標識したオリゴマー１３６８でスクリーニングし、ポジティブなクローンを単離し、３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで５０℃にて洗浄した。［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）；Ｊａｃｏｂｓら、「テトラアルキルアンモニウム塩溶液中の配列非依存の二本鎖オリゴヌクレオチドの熱安定性：組換えＤＮＡクローンの同定への適用」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，１０，４６３７−４６４９（１９８８）］。０．９ｋｂの挿入物を含むいくつかのクローンをジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列分析に用いた［同上］。
【０１４４】
（ＬＴ−β ｃＤＮＡの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２またはコントロールプラスミドのクローン４（無関係なｃＤＮＡ挿入物を含むｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによりＣＨＯ ｄｈｆｒ−に導入し、ＣＨＯ細胞をヒトＬＴ−αで安定にトランスフェクトした。３日後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含みＣａ／Ｍｇを含まないＨａｎｋ溶液に取り出し、１０μｇ／ｍｌ コントロールＩｇＧ１または抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のどちらかを用いて上記の様にＦＡＣＳ分析のために染色し、次にＦＩＴＣまたはフィコエリスリンのどちらかで標識したヤギ抗マウス調製物と結合した免疫グロブリンを標識した。その他の実験では、これもまたｐＣＤＭ８ベクター中にある等量のヒトＬＴ−α ｃＤＮＡの存在または非存在下で、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＤＭ８中のクローン４またはクローン１２のいずれかのＬＴ−β ｃＤＮＡでエレクトロポレーションし、上記のように３日後ＦＡＣＳ分析のために染色した。
【０１４５】
（ＬＴ−βの発現のノーザン分析）
ポリＡ＋ ＲＮＡをＩＩ−２３．Ｄ７細胞または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）のどちらかでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供されたＦａｓｔ−ＴｒａｃｋＴＭシステムを用いて単離した。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）に本質的には記載されているように、２μｇ／レーンのＲＮＡおよびホルムアミドゲルでの電気泳動を用いてノーザンブロットを調製し、次にＧｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎナイロンメンブラン上へ転写し、そしてＵＶ架橋した。ブロットを、ゲル精製したＬＴ−β ｃＤＮＡのランダムプライムＢｓｔＥＩＩ／Ｘｍｎ−Ｉフラグメント、あるいはヒトＬＴ−αまたはアクチンのフラグメントでプローブした。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで時間を変えて誘導し、そしてＬＴ−αおよびＬＴ−βの両方の発現が誘導されたことを見出した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地のみまたは１０００ユニット／ｍｌのＩＬ−２の存在下、あるいはＴ細胞を活性化するＯＫＴ３とともに培養した。
【０１４６】
（ＬＴ−βの５’末端の決定）
ｍＲＮＡの５’の配列をプライマー伸長分析により決定した。［Ｂ．Ｗａｌｌｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０，７７−８１（１９８６）．］オリゴヌクレオチドプライマー（プローブ３６０−１２１ ５’ＧＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡ−３’）［配列番号１３］を用いたプライマー伸長により、約１２８〜１３０ｂｐの産物を得た。これは、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ方法論［Ａ．ＭａｘａｍおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，「塩基特異的化学開裂を用いる末端標識ＤＮＡの配列決定」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８８）］を用いた配列決定により、メチオニンＡＴＧの７〜９ｂｐ上流にある転写開始部位を示した。一時的な実験でクローン１２により示された発現は、１つまたは両方のＬｅｕ−４またはＬｅｕ−６の開始部位は機能的であることを示した。ｍＲＮＡの５’配列を証明するために、コスミドクローン、０３１Ａ［Ｓｐｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３，２１４（１９８９）］をいくつかの制限酵素で切断し、電気泳動し、ブロッティングし、そしてＬＴ−β ｃＤＮＡのＢＳＴ Ｅ２／Ｘｍｎ−１フラグメントでプローブした。コスミドは、６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント内にＬＴ−β遺伝子を含有した。ＥｃｏＲＩフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＮＮ１０９と呼ぶｐＵＣ誘導体にサブクローニングした。ジデオキシ核酸配列決定により完全なゲノム配列を得た。
【０１４７】
（実施例１：Ｔ細胞がその表面にＬＴ−関連エピトープを発現する）
上記の条件下で、ヒト末梢単核細胞（ＰＭＮ）を、ＯＫＴ３モノクローナル抗体で活性化し、培養の２日後に、フローサイトフルオロメトリー分析によって、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合関連形態の発現について分析した。１つの実験（結果は図１に示す）で、新鮮なＰＢＬをＯＫＴ３およびＩＬ２とともに３日間培養し、それらを、未変性ｒＬＴ−α（それぞれ、ウサギ４および５由来である、図１の「ＬＴ−４」および「ＬＴ−５」パネル）、変性ｒＬＴ−α（ウサギ６由来である、図１の「ＬＴ−６」パネル）、および未変性ｒＴＮＦ（ウサギ７由来である、図１の「ＴＮＦ」パネル）に対して１：２００希釈の抗血清で染色した。細胞を、各動物からの免疫後の血清（図１のパネルの実線）あるいは免疫前の血清（図１のパネルの破線）で染色した。図１は、ウサギ４および５由来の抗ｒＬＴ−α血清のみが、活性化末梢Ｔ細胞上のエピトープを認識したことを示す。
【０１４８】
図２に示す実験では、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を１５時間、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで処理するかあるいは処理せずに、それらを、図１に記載の実験のように、ウサギ４抗ｒＬＴ−α免疫後の血清（図２のパネルの実線）、あるいはウサギ４免疫前の血清（図２のパネルの破線）で染色した。図２に示すように、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激でＬＴ−αを合成するＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７が、ＰＭＡ活性化で表面ＬＴ−関連エピトープを発現することを認めた。
【０１４９】
Ｔ細胞上のＬＴ−α関連エピトープは、ＬＴに関連し、組み換えＬＴ−α調製物由来のＣＨＯ細胞中のなんらかの夾雑物に関連しないことを確認するために、ＰＭＡ活性化し洗浄したＩＩ−２３．Ｄ７あるいはＵ９３７細胞で、ウサギ４由来の抗血清の１：１０００希釈物を処理した。図３に示す実験では、抗ｒＬＴ−α血清（１：１０００抗ＬＴ−４）の試料１ｍｌを、細胞を含まない（−−）、１×１０８ Ｕ９３７細胞（−〇−）、１×１０８（−−）ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞、あるいは１×１０７（−−）ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のいずれかで処理した。吸収抗血清の希釈物を、Ｌ９２９細胞障害性アッセイで限定量のｒＬＴ−αに加えて、最初のウエルに１：４０００の最終希釈物が存在するようにした。このアッセイは、２４時間以内に、マウス繊維芽細胞株Ｌ９２９を殺すＬＴ−αの能力を測定する［Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒｅａｄｅ，Ｃ．Ｆ．Ｗａｒｅ，「細胞生存性についての迅速な比色アッセイ：細胞障害性および増殖阻害性リンホカインの定量への適用」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０，２５７（１９８４）］。２４時間後に、細胞生存率をＭＴＴ読み取りによって評価した。図３のプロットは、吸収抗血清の希釈に対する吸光度（細胞生存率に比例する）である。データは、２つのウエルの平均であり、２つは概して、符号で示されている範囲内に存在する。図３に示されているように、標準Ｌ９２９細胞障害性アッセイでの吸収抗血清中和力価の分析は、Ｕ９３７細胞は効果がないが、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞が、ＬＴ−α中和抗体を除去することを実証した。これらのデータは、膜表面の抗原構造が実質的にＬＴ−αに関連することを示す。
【０１５０】
ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を、Ｔ細胞表面のＬＴ−α関連エピトープの明確な存在についての多くの平凡な説明を確かめるために、さらなる多くの処置を行った。まず最初に、抗血清中のＬＴ−α：抗体複合体が、ハイブリドーマ上のＴＮＦ／ＬＴ−αレセプターに結合し得る可能性を除外した。ＴＮＦおよびＬＴ−αの両方は、複合体中の抗体結合エピトープの存在を考慮し得る三量体構造を有する。しかし、細胞ＴＮＦレセプターの可溶性ＴＮＦあるいはＬＴ−αでの前飽和は、表面染色には効果はなかった。このような飽和は、このような免疫複合体のこのようなレセプターヘの結合を妨害した。
【０１５１】
結合されたＴＮＦをそのレセプターから解離し得る、ｐＨ３の乳酸処理は、シグナルには影響しなかった。このことは、ＬＴ−αがレセプター結合されないことを示唆する。しかし、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞へ結合する１２５Ｉ−ＬＴ−αを使用する実験は、レセプター結合ＬＴ−αが、ＴＮＦよりも酸性ｐＨではそのレセプターから解離させるのはより困難であることを示した。
【０１５２】
染色前の細胞のおだやかなトリプシン処理は、シグナルの消失を導き、このことは、エピトープがタンパク質であることを示す。表面結合ＬＴ−αがフォスファチジルイノシトール結合されたかどうかを決定するために、細胞をフォスファチジルイノシトール特異性フォスホリパーゼＣで処理した。ＰＩ−結合抗原ＬＦＡ−３が解離され得る条件下［Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｔ細胞赤血球レセプター（ＣＤ２）のモノクローナル抗体およびリガンド結合部位」Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４２（１９８７）］で、ＬＴ−αエピトープには効果が認められなかった。
【０１５３】
ＬＴ−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、（前ＰＭＡ活性を伴うか、あるいは伴わない）染色し得なかった。このことは、ウサギを免疫するのに使用された、もともとのｒＬＴ−α中のＣＨＯ由来の夾雑物に対する抗体が、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の染色に寄与するのに十分な量が存在しなかったことを示す。同様に、任意のウシ胎児血清タンパク質を夾雑するＬＴ−α調製物に対して誘起された抗体は、染色が１０％ウシ胎児血清中で実施されたので、Ｔ細胞染色には影響しなかった。
【０１５４】
抗ｒＬＴ−α血清のｒＬＴ−αでの前処理は、ｒＴＮＦでの前処理では阻止しなかったが、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞上のＬＴ−α形態の染色を阻止した。
【０１５５】
（実施例２：Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７上のＬＴ−α関連タンパクの免疫沈降）
ＰＭＡで活性化したＩＩ−２３．Ｄ７細胞を表面ヨウ素化し、溶解してデタージェントで可溶化した。標識膜タンパク質の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２つのタンパク質が抗ｒＴＮＦ−α抗血清により認識されることを示した。図４Ａは、免疫前（ＰＲＥ）あるいは免疫後（ＰＯＳＴ）抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４由来）のいずれかで免疫沈降されたヨウ素化表面タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【０１５６】
図４Ａに示されているように、ＬＴ−αの推定の大きさと相関する２５〜２６ｋＤ分子量形態（「ＬＴ−α」）を認め、そして、約３３ｋＤの別の形態（「ＬＴ−βあるいはｐ３３」）を認めた。同じウサギ由来の免疫前血清（図４ＡのＰＲＥの欄）および抗ｒＴＮＦウサギ血清のどちらもが、ヨウ素化ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来のどのバンドも免疫沈降させ得なかった。
【０１５７】
ヨウ素化バンドの１−Ｄ部分ＣＮＢｒペプチドマッピングは、２５〜２６ｋＤ形態が、ヨウ素化ｒＬＴ−αと同じパターンで切断されることを示した。従って、このバンドをＬＴ−αと同定した。図４Ｂに示す実験で、パネルＡ由来の２５〜２６ｋＤおよび３３ｋＤのバンドを切り出し、制限ＣＮＢｒ切断およびＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムでの電気泳動にかけた。比較のために、並行して行ったｒＴＮＦおよびｒＬＴ−αの両切断を図４Ｂに示す。ゲルをオートラジオグラフィーによって可視化した。レーン１はｒＴＮＦを示し、レーン２はｒＬＴを示し、レーン３はＬＴを示し、そして、レーン４は、ＬＴ−βを示す。ＣＮＢｒフラグメントの増大された大きさは、天然ＬＴ−βの炭水化物量の増加を反映する。ヨウ素化３３ｋＤ形態はＣＮＢｒで切断されず（レーン４）、このことは、既知ＬＴ−α遺伝子生成物とは異なることを示す。ｒＴＮＦは、このタンパク質中にメチオンが存在しないので、ＣＮＢｒでは切断されなかった（レーン１）。
【０１５８】
免疫沈降と組み合わせて、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインでの代謝標識を行って、これらのＬＴ−α関連表面形態のさらなる特徴付けを行った。ＴＮＦ／ＬＴ−αペアの場合には、システインおよびメチオニン分布は、ＴＮＦとＬＴ−αとの間、および、シグナル配列を伴う形態と伴わない形態との間の両方の区別を可能にし、これは、膜ＴＮＦ形態の研究で活用された［Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，５３，４５〜５３頁（１９８８）］。完全にプロセシングされたサイトカイン、すなわち、分泌形態の場合には、ＴＮＦはシステインを含有し、メチオニンを含有しないが、ＬＴ−αはメチオニンのみを含有し、システインを含有しない。しかし、ＬＴ−αは、シグナル配列ドメイン中に２つのシステイン残基を含有し、ＴＮＦは、Ｎ末端領域に１つのメチオニン残基を含有する。ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞の分離培養物を、３５Ｓ−メチオニンあるいは３５Ｓ−システインのいずれかで標識し、免疫反応タンパク質を沈降させた。実験では（結果は図５に示す）、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで活性化し、次に、８時間、３５Ｓ−メチオニンあるいは３５Ｓ−システインで標識した。培地および溶解細胞の両方を、免疫前（ウサギ４）（Ｐ）、抗ｒＴＮＦ（Ｔ）、および抗ｒＬＴ−α（ウサギ４）（Ｌ）血清の順で、連続して免疫沈降を行った。図５は、分泌タンパク質を含有する上清あるいは洗浄細胞の、免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー分析を示す。”ｓ−ＴＮＦ”は、３５Ｓ−メチオニン標識の細胞由来の抗ｒＴＮＦ免疫沈降されたバンドを示し、ＴＮＦのプロセシングされていない２６ｋＤ形態と推定される。”Ｍｅｔ”および”Ｃｙｓ”は、使用した３５Ｓ−標識アミノ酸のことである。３５Ｓ−システイン含有のそれらのレーンを、３５Ｓ−メチオニン含有レーンより長時間露光した。これらの細胞からの上清では（「分泌された」と記されたレーン）、２５ｋＤ形態のＬＴ（「ＬＴ−α」）は、ＰＭＡ処理後に、３５Ｓ−メチオニン標識された細胞により放出されるが、３５Ｓ−システイン標識細胞によっては放出されない。このパターンは、完全にプロセシングされ、分泌されたＬＴ−αと予測される。より長時間の露光は、上清に極少量のＴＮＦを示し、標識の取り込みは、完全にプロセシングされた分泌ＴＮＦに対して予測された通りであった。ｍＲＮＡレベルでもまた、低いＴＮＦレベルでの優先的なＬＴ−α発現を認めた（ＳｈａｍａｎｓｋｙおよびＷａｒｅ、未公開情報）。洗浄細胞の分析（「細胞の」と記されたレーン）は、３３ ｋＤ ＬＴ−βを伴って、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αの両方が存在することを示した。２５〜２６ｋＤおよび３３ｋＤ形態の相対的な量は、表面ヨウ素化により認められたものに相当した。２５〜２６ｋＤ表面ＬＴ−α形態はシステインを含まず、このことは、リーダー配列のプロセシングを示す。３３ｋＤ形態は、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインの両方を取り込んだ。図５に示したフィルムのより長時間の露光（示されていない）は、約２６〜２７ｋＤで細胞からの抗ＴＮＦ免疫沈降されたバンドの存在を示した。バンドは、標識システインおよび標識メチオニンの両方の取り込みを示した。標識はシステインによって、より強かった。２６ｋＤ−ＴＮＦ形態ではｃｙｓ：ｍｅｔ比率は４：１であるので、この標識パターンは、このバンドの同一性を確実にする。
【０１５９】
細胞溶解物からの免疫沈降物中のＬＴ−αを伴ったＬＴ−βの存在は、ＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αに関連すること、あるいはＬＴ−βがＬＴ−αに結合されることのいずれかあるいは両方を示唆した。この論点に的を絞るために、３５Ｓ−メチオニン標識細胞由来の２５ｋＤおよび３３ｋＤのバンドを、ウサギポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清で免疫沈降させ、切り出したゲル切断片から溶出して、抗ｒＬＴ−αポリクローナル血清あるいはｍＡｂで再度免疫沈降させた。ＬＴ−βではなくＬＴ−αが、抗ｒＬＴ−α抗体で免疫沈降され得、このことはＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αに関連しないことを示唆する。これらの観察は、ＬＴ−βがＬＴαと物理的に結合することを示した。３３ｋＤのタンパク質は、抗原的にＬＴ−α関連せず、単にＬＴ−αと共に沈降されることを示した。
【０１６０】
表面ヨウ素化あるいは代謝標識のいずれかでは、ＬＴ−αあるいはＴＮＦに結合した、既知の５５あるいは８０ｋＤ ＴＮＦ／ＬＴ−αレセプター形態のいずれも検出され得なかった。おそらく、これは、レセプターが、Ｔ細胞の活性化の間に急速に費やされるからである。［Ｃ．Ｗａｒｅら、「腫瘍壊死因子によるＣＴＬ溶解経路の調節」Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｔ．ＬｏｔｚｅおよびＯ．Ｊ．Ｆｉｎｎ編 第１３５巻，１２１〜１２８頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９９０］。
【０１６１】
（実施例３：ＩＩ−２３．Ｄ７細胞上の表面ＬＴ−形態の生化学的特徴付け）
ＰＭＡ処理したＩｌ−２３．Ｄ７細胞表面のＬＴ−関連形態を、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。免疫沈降法によって、ＬＴ−βおよびＬＴ−αがレンズマメレクチンセファロースに結合すること（このことは糖タンパク質構造を示す）に注目した。デタージェントで可溶化し、ＰＭＡ処理したＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質を、レンズマメレクチンセファロースに結合し、アフィニティー精製の前にα−メチルマンノシドで溶出した。抗ｒＬＴ−α血清によって特異的に認識されるこれらのタンパク質を、さらに正確に評価するために、コントロールＩｇＧおよび抗ＩｇＧカラムの両方を調製した。カラムを低ｐＨで溶出することにより、抗ｒＬＴ−αカラムから約１００〜２００ｎｇの２種のＬＴ形態が放出された。
【０１６２】
図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）あるいは免疫後（ＰＯＳＴ）ウサギ血清から調製された抗ｒＬＴ−αアフィニティーカラムから溶出されたタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。図６Ｂでは、パネルＡ中のゲルから３３ｋＤおよび２０ｋＤのバンドを切り出し、制限ＣＮＢｒ切断およびＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムでの電気泳動にかけた。比較のために、図６Ｂは、並行して行ったｒＴＮＦおよびｒＬＴ−α（ＣＨＯ由来）のＣＮＢｒ切断を示す。銀染色によってゲルを可視化した。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、免疫沈降された表面ヨウ素化ＰＭＡ処理のＩＩ−２３．Ｄ７細胞のゲルによく類似し、このことは類似のタンパク質が精製されたことを示す。
【０１６３】
アフィニティー精製の間に、２５ｋＤのＬＴ−α形態は、１９〜２０ｋＤ形態に切断されるようである。すなわち、それは、未処理の組み換えＣＨＯ細胞由来のＬＴ−αとともに移動した。ＲＰＭＩ １７８８腫瘍株由来の天然ＬＴ−αの最初の単離もまた、Ｎ−末端切断された「ｄｅｓ−２０」ＬＴ−α形態を生じた。アフィニティー精製したタンパク質の一次元ＣＮＢｒ分解物は、切断された２０ｋＤのＬＴ−α形態が、おそらくこのＬＴ−α形態の切断型特性を反映するＣＮＢｒ切断パターンを有することを示した。メチオニンの１つが、「ｄｅｓ−２０」ＬＴ−α形態では消失し、ゆえに、切断パターンは未処理のＬＴ−α形態とは異なる。３３ｋＤのタンパク質（ＬＴ−β）は、ＣＮＢｒ切断で２つになるので、このことから、１つのメチオニンはＣあるいはＮ末端から５〜２０残基以内に存在しなければならないことが推定された。この切断パターンは、３３ｋＤのタンパク質が既知のＬＴ形態と著しく異なることを示す。表面ヨウ素化３３ｋＤタンパク質のＣＮＢｒ切断分析は、恐らく類似の結果を与えたが、しかし、ヨウ素化で達成され得る解像は、その２つを十分に現らわさなかった。ヨウ素化ｒＬＴ−α、ｒＴＮＦ、およびＩＩ−２３．Ｄ７ ＬＴ形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＶ８分解は、分解に対して耐性であるべきｒＬＴ−αおよび２５〜２６ｋＤＫ ＩＩ−２３．Ｄ７ ＬＴ−α形態を示した。このことは、このタンパク質がＬＴ−αであることを確実にした。３３ｋＤのタンパク質を、ｒＴＮＦによく類似するパターンを有する、数個の小さなフラグメントに切断した。
【０１６４】
図７では、免疫沈降された表面ヨウ素化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分離し、表面結合２５〜２６ｋＤのタンパク質（「ｓＬＴ−α」）および３３ｋＤのタンパク質（「ＬＴ−β」）のバンドを切り出した。切断片を、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−Ｇｌｙ）、ノイラミニダーゼとＯ−グリカナーゼ（Ｏ−Ｇｌｙ）との混合物、あるいは３つ全ての酵素で分解した。分解した切断片を、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、乾燥ゲルのオートラジオグラムを示す。図７に示したように、ヨウ素化表面ＬＴ形態の免疫沈降、その後の、Ｎ−グリカナーゼあるいはＯ−グリカナーゼのいずれか、またはその両方での分解で、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態が、Ｎ−連結オリゴ糖を含有することを示した。２５−２６ｋＤ ＬＴ−α形態は、Ｎ−グリカナーゼ分解での大きさの変化に関連する１つのＮ−連結部位のみを有する。同様に、３３ｋＤ形態（ＬＴ−β）は、Ｎ−グリカナーゼ処理で約３ｋＤの大きさを消失した。このことは、１つのＮ−連結オリゴ糖の存在を示唆する。２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態に対して、Ｏ−グリカナーゼ処理は、ＬＴ−βの分子量に影響を与えなかった。しかし、グリカナーゼによる切断がないことは、炭水化物の存在を欠く明白な証拠ではない。
【０１６５】
（実施例４：ＬＴ−αの再免疫沈降）
ＬＴ−βのＬＴ−αとの共沈降は、これらのタンパク質が抗原的に関連するか、あるいは物理的に結合されることを示唆した。この確認のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離されたＬＴ−α（ｐ２５）およびＬＴ−βタンパク質が免疫沈降され得るかどうかを試験した。１２５Ｉあるいは３５Ｓ−Ｍｅｔで標識されたＬＴ−αおよびＬＴ−βを、免疫沈降によって部分精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。標識されたバンドを切り出し、緩衝液中で再度水和し、タンパク質を溶出した。次に、溶出タンパク質を、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体を用いて、第二回目の免疫沈降を行った（図１０）。ウサギ抗ｒＬＴ−αは、ＬＴ−α（「ｐ２５」、レーン２）を再免疫沈降させたが、ＬＴ−βはさせなかった（レーン３）。抗ｒＬＴ−α ｍＡｂは、ＬＴ−α（レーン５）および２１ｋＤのタンパク質（「ｐ２１」、レーン４）を沈降させた。これは、下記に示すように、ＬＴ−αの前駆体であるが、しかし、ＬＴ−βを沈降させなかった（レーン６）。結果は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された後に、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ｒＬＴ−α両抗体が、ＬＴ−αと反応し得るがＬＴ−βとは反応し得ないことを示す。このデータは、ＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αと関連しない証拠を提供する。しかし、ＬＴ−αエピトープは完全なまま残存するが、推定のＬＴ−β交差反応エピトープが、変性後に消失される可能性は除外され得ない。
【０１６６】
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出された、１２５Ｉ標識および３５Ｓ−Ｍｅｔ標識のｐ２５およびｐ３３タンパク質の再免疫沈降の結果を示す。１２５Ｉ標識ＩＩ−２３．Ｄ７細胞（レーン２、３）および３５Ｓ標識細胞（レーン４、５、６）由来のＬＴ−αおよびＬＴ−β種を、上記のようにゲル切断片から溶出した。溶出物を、抗ｒＬＴ−α血清（レーン２、３）あるいは抗ｒＬＴ−α ｍＡｂ（レーン４、５、６）のいずれかで免疫沈降し、再沈降されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで分析した。レーン１は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βの同定のためのコントロールレーンである。
【０１６７】
（実施例５：ＬＴ−αおよびＬＴ−βの等電点電気泳動）
図９および１０（各々は、オートラジオグラフ（９Ａ、１０Ａ）、および移動距離対ｐＨをグラフにした検量線を含む（９Ｂ、１０Ｂ））は、変性（図９）および未変性（図１０）条件下での等電点電気泳動分析を示す。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物から免疫沈降された、１２５Ｉ標識ＬＴ−αおよびＬＴ−βについて、上記のように、二次元ゲル分析を行った。２−Ｄゲル分析を、尿素が存在する変性条件下で実施した（図９Ａ）。これに対し、未変性ＩＥＦを、尿素を含まない１％ ＮＰ−４０中で行った。１２５Ｉ標識ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物を、４℃でチューブゲルで泳動させた。泳動後に、チューブゲルを１ｃｍ切断片に切断し、泳動されたタンパク質をこれらの切断片から溶出し、免疫沈降して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０Ａ）。ゲルレーン１〜１２から免疫沈降された物質は、チューブゲル切断片の２〜１３に対応する。１ｃｍゲル増大量に基づいて変性および未変性チューブゲルに対してｐＨ勾配を実施した。これらもまた、それぞれに９Ｂおよび１０Ｂとして下にオートラジオグラムを示す。生化学的に、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは、非変性等電点電気泳動ゲル上で共に移動するが、複合体が尿素により解離されると、２つのタンパク質は別々に移動する。［図９Ａ、１０Ａを参照］これらの観察は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βが細胞表面に複合体として存在するという結果を導く。
【０１６８】
（実施例６：ＬＴ−α発現の制御）
以下に示す表Ｉは、ＬＴ−αの表面形態発現についての、種々の細胞タイプのフローサイトフルオロメトリー分析による調査結果のまとめである。
【０１６９】
【表Ｉ】
これらの研究の際だった観察は、ＴおよびＢ細胞に対する表面ＬＴ−α発現の制限であった。ｌｅｕ−Ｍ３、単球マーカーおよびｌｅｕ−４（ＣＤ３）抗体を、各細胞群を別々に観察するために、二色フローサイトフルオロメトリー分析に使用した。この分析で、表面ＴＮＦと表面ＬＴ−αと間に際だった相違が存在した。ここで、Ｔ細胞は表面ＬＴ−αのみを示したが、単球は表面ＴＮＦのみを発現した。この結果を図１１に示す。
【０１７０】
図１１に示されている実験では、ＰＢＬを、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、インターフェロン−γ（２００Ｕ／ｍｌ）、およびＯＫＴ３（１ｎｇ／ｍｌ）の混合物で８時間処理し、次に、ＬＴ−α（ウサギ５由来の抗ｒＬＴ−α血清）あるいはＴＮＦ（ウサギ７由来の抗ｒＴＮＦ血清）に対して染色し、その後、ＦＩＴＣ抗ウサギ標識を行った。細胞を、フィコエリスリン−ｌｅｕ−４、ｐａｎ Ｔ細胞マーカー、あるいはフィコエリスリン−ｌｅｕ−Ｍ３、単球マーカーで逆染色した。「Ｔ細胞パネル」をｌｅｕ−４＋に対してゲートし、一方、「単球」パネルをｌｅｕ−Ｍ３＋細胞に対してゲートした。細胞を、免疫前（破線）あるいは免疫後（実線）の血清で染色した。単球腫瘍株ＨＬ−６０およびＵ９３７はＬＴ−αを染色しなかった。二色フローサイトフルオロメトリー分析によって、活性化ＰＢＬのＴ４およびＴ８サブクラスが、同レベルの表面結合ＬＴ−αを示すことが認められた。一般的に、ＬＴ−αを発現し得る一次Ｔ細胞もまた表面ＬＴ−α形態を示し得るようである。
【０１７１】
３人の異なるヒトドナーの実験は、表面ＬＴ−α形態が用時単離された末梢Ｔ休止細胞に存在することを示した。ＰＢＬの場合には、細胞のＯＫＴ３活性化あるいは単なるＩＬ−２処理が、発現の増大を導いた。蛍光チャネル数により、ＯＫＴ３活性化の間の表面ＬＴ−αおよびＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）発現の両方の定量を試みた。ＯＫＴ３による表面ＬＴ−αの最大誘導が、大量培養でＩＬ−２レセプターのピーク発現（ＴＡＣ発現）に先行するようであり、従って、表面結合ＬＴ形態（ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体）は、初期Ｔ細胞活性化抗原のようである。抗Ｔ１１および同種異系抗原の両方が、クローン化細胞障害性Ｔ細胞表面にＬＴ−αを生じ得ることが見い出された。同様に、ＰＭＡ刺激は、ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ表面でのＬＴ−α出現の誘導に必要であった。Ｔ細胞活性化が表面ＬＴ−α形態を増加させるようである。ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマに比較して、末梢リンパ球は、ＰＭＡ処理後に急速に表面ＬＴ−α形態を下降制御する。同様に、ＯＫＴ３活性化ＰＢＬ群の二色分析では、活性化の前進段階でＴ細胞を含むはずであるＤｒ＋細胞は、表面ＬＴ−α形態を欠いた。
【０１７２】
新鮮なＰＢＬの高レベルＩＬ−２での活性化は、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）を生じた。図１２に示されているように、抗ｒＬＴ−αおよびｌｅｕ−１９、ＮＫ／ＬＡＫ細胞マーカーを用いた二色フローサイトフルオロメトリー分析は、表面ＬＴ−α形態のＬＡＫ細胞発現が、Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７に類似することを示した。図１２に示されている実験では、ＰＢＬを、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２とともに５日間培養し、次に二色分析のために、上記のように、フィコエリスリン標識ｌｅｕ−１９および抗ｒＬＴ（ウサギ５）で染色した。図１２は、免疫前（破線）あるいは免疫後（実線）血清で染色した、ｌｅｕ−１９＋細胞上の表面ＬＴ−αレベルを示す。従って、ＬＡＫ細胞は、あらゆる一次細胞形態中で最も高い表面ＬＴ−αレベルを有するようである。
【０１７３】
（実施例７：全ＴＮＦあるいはＬＴ−αのＴ細胞活性化との機能関連性）
ＴＮＦおよびＬＴ−αのＴ細胞活性化プロセスとの機能関連性を調べるために、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）およびＯＫＴ３活性化アッセイに、ウサギ抗ｒＬＴ−αおよび抗ｒＴＮＦ血清を包含させた。ＭＬＲは、個人のＴ細胞が、他人のＴ細胞を外来物として認識し、増殖によるその存在に応答する能力を試験する、標準的な免疫学的アッセイである。以下の表ＩＩは、種々の応答細胞／刺激細胞の組合せを使用した、ＭＬＲ実験のデータを示す。
【表ＩＩ】
【０１７４】
表ＩＩに示したように、中和抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４および５）は、５日目に評価されるように、増殖応答を阻害したが、免疫前血清あるいは非中和抗ｒＬＴ−α（ウサギ６）血清は軽い刺激効果を有した。以前に報告されたように［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，４９９（１９８８）］、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＴＮＦ調製物もまた阻害性であった。これらのアッセイを、過剰刺激細胞条件で行った。従って、阻害は最適化され得ない。表ＩＩ中で使用した血清レベルは、その他の実験（データは示していない）よりかなり高く、１：１０００までの抗体希釈物はまだ阻害性であった。ＰＨＡあるいはＯＫＴ３刺激Ｔ細胞増殖もまた、より低い程度で阻害された（データは示さない）。これらのデータは、Ｔ細胞表面のＬＴあるいはＬＴ−関連エピトープが、Ｔ細胞活性化に関連し得ることを示した。
【０１７５】
ＭＬＲアッセイおよび中和モノクローナル抗体を用いた以前の研究は、Ｔ細胞活性化および次のこの系での増殖において、ＬＴ−αではなくＴＮＦに関係した。［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，４９９（１９８８）］。その研究では、モノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体は、ＭＬＲアッセイに効果がなかった。中和ポリクローナル抗ＣＨＯ細胞誘導ｒＬＴ−α血清が、部分的にＭＬＲを阻害し得ることが、われわれの研究で示され、そのことは、この系におけるなんらかのＬＴ形態に対する役割を示唆する。これらの抗体調製物の性質に相違が存在し得るが、この矛盾に対する理由は明確ではない。モノクローナル抗体を、グルタルアルデヒドに架橋結合された天然のＬＴ−α（ＲＰＭＩ １７８８分泌の）に対して産生し、一方、ポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清は、未変性ｒ−ＬＴ−α（組み換えＣＨＯ細胞由来の）を、フロイントアジュバントともに直接リンパ節に注射して調製した。後者の系の成果に対する貯蔵効果は、免疫化マウスにおいて報告された問題を考慮するとおそらく重要であった［Ｔ．Ｂｒｉｎｇｍａｎら、「ヒト腫瘍壊死因子αおよびβに対するモノクローナル抗体：アフィニティー精製、イムノアッセイヘの適用、および構造プローブとしての適用」Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，４８９（１９８７）］。これらのデータは、本発明のポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清のＭＬＲにおけるブロック効果が、従来の可溶性ＬＴ−α形態の認識ではなく、血清による表面ＬＴ形態の認識の結果であることを示唆する。
【０１７６】
（実施例８：ＬＴ−αおよびＬＴ−βの精製およびの最初の配列決定）
上記のように、エドマン分解によって、ＬＴ−αおよびＬＴ−βのＮ末端配列情報を得た。膜結合ＬＴ−αバンドの配列を以下のように認めた：Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ。この配列は、分泌ＬＴ−αの既知配列に一致する。エドマン分解分析は、結合ＬＴ−βタンパク質のＮ末端部分が、２つの可能なアミノ酸配列を含むことを解明した：Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ＧｌｎあるいはＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ。次のＤＮＡ分析は、７サイクル目でグリシンがグルタミンとして誤って同定されたこと以外は、前者の配列を確認した。
【０１７７】
（実施例９：ＬＴ−β配列決定およびクローニング）
上記のように、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの方法によって、数個のペプチド配列の配列を得た。２つのアンチセンス１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号：９］およびＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号：１０］を、これらのペプチド、Ｔ−８７／Ｔ−８８の１つの配列部分と一致するように合成した。これらのプローブを、３２Ｐで放射性標識した。ノーザン分析（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９））は、プローブ１３６８（ＧＴＹＴＣＮＧＧＴＣＹＴＣＹＴＣ）［配列番号：１０］が、先に記載のように、ホルボールエステルで前処理されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞中で強く誘導される、０．９〜１．１ｋｂ ｍＲＮＡバンドに強くハイブリダイズしたことを示した。ベクターｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）のｃＤＮＡライブラリーを、ＰＭＡで６時間誘導されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞から単離されたポリＡ＋ ｍＲＮＡから構築した［Ｂ．ＳｅｅｄおよびＡ．Ａｒｕｆｆｏ，ＰＮＡＳ，８４，３３６５〜３３６９（１９８７）を参照のこと］。ライブラリーを標識オリゴマー１３６８でスクリーニングし、ポジティブクローンを単離し、その後５０℃の３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。［Ｊａｃｏｂｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，１０，４６３７〜４６４９（１９８８）を参照のこと］。０．９ｋｂの挿入物を含有するいくつかのクローンを、ＤＮＡ配列分析にかけた。クローンｐＣＤＭ８／ＬＴ−β−１２（クローン１２）が、コーディング配列を含むことが認められた。その他のクローンは、１〜３０ｂｐの種々の５’末端切断型以外は同定された。１つの可能なクローン（クローン４）はフレームシフトを含み、トランスフェクション実験のコントロールとして使用された。８６２位の終止配列ＡＡＴＡＡＡが、ポリＡ区域の直前に見いだされ、このことは、全３’末端が同定されたことを示す。同定されたタンパク質配列は、計算上の分子量２５，３９０を有する少なくとも２４０アミノ酸、およびタイプＩＩ膜タンパク質の代表的なドメイン構造をコードする。このデータは、開始ＣＴＧが、ｇｌｙ ５（ｍｅｔ＝１）で始まるプロセシングされたＮ末端を導く、すなわち、ＣＴＧにコードされるロイシンが翻訳されないか、あるいは、ロイシン−４基がさらにプロセシングされて、アミノ酸配列決定で得られた成熟Ｎ末端を得ることを示唆する。
【０１７８】
ＬＴ−βの３３ｋＤａの大きさは、先に定義したようにＮ−結合グリコシル化に起因し、この結果は、ＣＤ４０リガンドに認められる同様の部位に一致する位置の、アミノ酸配列中の１つの可能なＮ−結合炭水化物部位の存在により、裏付けられる。代表的なＮ−結合糖残基は、約３〜４ｋＤａ ＭＷを付加し得、それゆえに、最終分子量は観察された３０〜３３ｋＤａに近い。
【０１７９】
同定されていない配列が、データベースで認められた。細胞外ドメインに１つのシステイン残基、および最後のＣ末端１７アミノ酸内に２つのメチオニンが存在し、このタンパク質で示される、非常に限定された臭化シアン切断パターンに一致する。
【０１８０】
（実施例１０：ＬＴ−βの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２またはコントロールプラスミド、クローン４（非機能性ｃＤＮＡ挿入物を有するｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによって、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−およびヒトＬＴ−αで安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に導入した。３日後、細胞を、Ｃａ／Ｍｇを含まない、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有のハンクス液で取り出し、上記のように、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ１、あるいは抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用するＦＡＣＳ分析のために染色し、その後、ＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン標識ヤギ抗マウス調製物を用いる結合免疫グロブリンで標識した。
【０１８１】
別の実験で、ＣＯＳ細胞に、ｐＣＤＭ８中のクローン４あるいはクローン１２ ＬＴ−β ｃＤＮＡを、これもまたｐＣＤＭ８ベクター中の等量のヒトＬＴ−α ｃＤＮＡの存在下あるいは非存在下で、エレクトロポレーションし、上記のように３日後に、ＦＡＣＳ分析用に染色した。ＬＴ−αを発現するＣＯＳ細胞のみが、機能性ＬＴ−β ＤＮＡ、すなわちクローン１２でのトランスフェクションで、表面リンホトキシンを示した。
【０１８２】
クローン１２は、開始ＡＴＧコドンを欠くが、いくつかのＣＴＧ開始コドンを有し、それゆえに、この発現実験は、１つあるいはいくつかの５’ＣＴＧコドンが翻訳を開始し得ることを示す。ＣＴＧコドンは、数種の真核タンパク質での翻訳開始部位として作用することが知られている。［Ｍ．Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１５，４（１９９１）］。同様の結果が、ＬＴ−αおよびＬＴ−β ＤＮＡの両方を有するＣＯＳ細胞のみが、ＦＡＣＳ分析で実質的な表面ＬＴ−αを示すような二元トランスフェクション系を使用して観察された。
【０１８３】
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のノーザン分析は、ＬＴ−β ｃＤＮＡの０．９〜１．０ｋｂ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを示し、このことは、クローニングしたｃＤＮＡが転写される全遺伝子を本質的に表すことを示す。図１５を参照のこと。ＬＴ−β遺伝子は、非処理ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞において低レベルで発現されるが、しかし、ホルボールエステルによる細胞の活性化で、ｍＲＮＡレベルが劇的に増大した。図１６を参照のこと。
【０１８４】
（実施例１１：ＬＴ−βとリンホカインのＴＮＦフミリーのその他のメンバーとの間の相同性）
ＬＴ−βをコードするｃＤＮＡのクローニングは、ＬＴ−βが、ＴＮＦ、ＬＴ−α、およびＣＤ４０レセプターのリガンドに著しい相同性を有するタイプＩＩ膜タンパク質であることを解明した。これらのタンパク質は、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに結合することが知られている。ＬＴ−β、ＴＮＦ、ＬＴ−αおよびＣＤ−４０レセプターのリガンドは、細胞外ドメインに４つの配列保存領域を共有する。図１３を参照のこと。これらのドメインは、ＴＮＦおよびＬＴ−α結晶構造の表面に存在し、サブユニット間相互作用に関連するようである。
【０１８５】
（実施例１２：数個の可能な開始部位を明らかにするＬＴ−βの５’末端の決定）
５’ｍＲＮＡ配列を、プライマー伸長分析によって決定した。プライマー伸長分析は、ＬＴ−βタンパク質の転写開始部位が、メチオニンＡＴＧの上流約７〜９塩基対であることを解明した。従って、ｍＲＮＡは、少なくとも３つの可能な転写開始部位、Ｍｅｔ−１，Ｌｅｕ−４、およびＬｅｕ−６コドンを有する。クローン１２を用いる一時的な実験は、Ｌｅｕ−４あるいはＬｅｕ−６開始部位の１つあるいは両方が機能することを示した。５’ｍＲＮＡ配列は、上記のコスミドクローン０３１Ａを使用したＬＴ−βゲノム配列の決定、およびジデオキシ核酸配列決定によって明らかにされた。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、リンホトキシン−β、リンパ球膜タイプタンパク質に関する。このタンパク質は、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７細胞を含む多数の細胞の表面で見られる。本発明はまた、リンホトキシン−βとリンホトキシン−αのような他のペプチドとの間で形成される複合体およびリンホトキシン−βの多数のサブユニットを包含する複合体に関する。これらのタンパク質および複合体は、細胞内で形成されるＬＴ−αを細胞表面に保持するのに有用であり、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体が炎症調節剤、腫瘍増殖阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、Ｔ細胞活性化剤、自己免疫疾患調節剤、またはＨＩＶ阻害剤として作用し得る。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の抗腫瘍活性を、ＬＴ−βの遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍湿潤リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞に送達し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ＯＫＴ３−刺激、ＩＬ−２拡張末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のフローサイトフルオロメトリー分析を示し、３つの、異なるウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清との反応を示し、そして本質的にウサギ抗ｒＴＮＦ抗血清との反応がなかったことを示す。
【図２】図２は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３．Ｄ７のフローサイトフルオロメトリー分析を示し、細胞表面上の（ＰＭＡ処理後の）ＬＴ−α関連エピトープの存在を示す。
【図３】図３は、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の抗ｒＬＴ−α抗体と結合する能力を示す。抗ＬＴ−α抗血清のサンプルと、ＰＭＡ処理Ｕ９３７（非ＬＴ生成）細胞、（−〇−）、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞（１０８、−−；１０７、−・−）、および細胞なし（コントロール、−−）とをインキュベートした。インキュベーション後、無細胞抗血清の連続希釈をｒＬＴ−αに添加し、そしてＬ９２９（ＬＴ−αセンシティブ）細胞に対する細胞障害性アッセイに使用した。プロットは、ｒＬＴ−α中和抗体が抗血清から活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞によって除去されたことを示す。
【図４】図４は、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からの１２５Ｉ−標識表面タンパク質の免疫沈降を示す２つのオートラジオグラフ（ＡおよびＢ）を示す。図４Ａは、免疫前ウサギ血清ではなくて免疫後ウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清によって、約２５ｋＤ表面タンパク質（ＬＴ−α）および約３３ｋＤ表面タンパク質（ｐ３３、すなわちＬＴ−β）の免疫沈降を示す。図４Ｂは、図４Ａからの２５ｋＤおよび３３ｋＤバンドの一次元ＣＮＢｒ切断マップを示し、Ｅ．ｃｏｌｉで生産した組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）、およびＣＨＯ細胞で生産される組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）［Ｊ．Ｂｒｏｗｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３、１８５９（１９８９）］と、ＣＮＢｒ切断の有り（＋）およびなし（−）の両方で比較した。
【図５】図５は、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインで代謝的に標識したＰＭＡ刺激ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からのＴＮＦ−およびＬＴ−α−関連タンパク質の免疫沈降を示すオートラジオグラフである。この図は、約２５ｋＤメチオニン含有表面タンパク質（ＬＴ−α）および約３３ｋＤメチオニンおよびシステイン含有表面タンパク質（ｐ３３、すなわちＬＴ−β）が、免疫前（Ｐ）または抗ｒＴＮＦ抗血清（Ｔ）ではない抗ｒＬＴ−α抗血清（Ｌ）によって認識されることを示している。オートラジオグラフもまた、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞がまた２６ｋＤ形態のＴＮＦを生産し、そして可溶性リンホトキシン−αを分泌することを示す。
【図６】図６は、抗ｒＬＴ−α血清によって認識されるＰＭＡ活性化ＩＩ−２Ｓ．Ｄ７細胞からのこれらのタンパク質のアフィニティ精製１−Ｄ ＣＮＢｒペプチドマッピングを示す。図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）または免疫後（ＰＯＳＴ）ウサギ血清のいずれかから調製した抗ＬＴ−αアフィニティーカラムから溶出されるタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を表す。図６Ａは、約３３ｋＤおよび約２０ｋＤタンパク質バンドは免疫前血清（ＰＲＥ）を使用して調製したアフィニティーカラムに結合しないが、抗ｒＬＴ−α抗血清（ＰＯＳＴ）を使用して調製したアフィニティーカラムに結合することを示す。図６Ｂは、ＰＯＳＴカラムから溶出される約３３ｋＤおよび約２０ｋＤタンパク質の部分的なＣＮＢｒ切断を示し、並行して泳動したｒＴＮＦおよびｒＬＴ−αとの比較を示す。ゲルを、銀染色法で視覚化した。
【図７】図７は、約２５ｋＤおよび約３３ｋＤ１２５Ｉ−標識タンパク質（それぞれＬＴ−αおよびＬＴ−βと命名した）のオートラジオグラフを示すが、これらは、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙ）、ノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼ（Ｏ−ｇｌｙ）の混合物で、または３つの酵素すべてで処理された活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞から免疫沈降されたものである。
【図８】図８は、共沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の再免疫沈降の結果を示し、さらにこれらが免疫学的に関連しているかどうか調査する。
【図９】図９（９Ａおよび９Ｂ部分を含む）は、免疫沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の変性条件下での等電点フォーカシングの結果を示す。
【図１０】図１０（１０Ａおよび１０Ｂ部分を含む）は、免疫沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の未変性条件下での等電点フォーカシングの結果を示す。図９および図１０は共に、ＬＴ−βおよびＬＴ−αが変性可能な複合体を形成することを示す。
【図１１】図１１は、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γおよびＯＫＴ３の混合物で刺激した後、Ｔ細胞および単球上で分化的に発現した表面タンパク質をフローサイトフルオロメトリーを示す。刺激したＰＢＬプールから分離したＴ細胞は、抗ｒＬＴ−α抗血清（ＬＴ）によって認識される表面タンパク質を発現することが認められ、他方分離した単球は抗ｒＴＮＦ抗血清（ＴＮＦ）によって認識される表面タンパク質を発現した。
【図１２】図１２は、ＩＬ−２で処理されたｌｅｕ−１９−およびｌｅｕ−１９＋（すなわち天然キラー）細胞上の表面ＬＴ形態のフローサイトフローメトリー分析を示す。ＩＬ−２で処理したＰＢＬを標識ｌｅｕ−１９および抗ｒＬＴ−αの両方で分析した結果、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が表面ＬＴ形態を発現するのを確認した。
【図１３】図１３は、ＬＴ−βフラグメントのアミノ酸配列を示すが、これは、直接Ｎ−末端配列決定およびインサイチュトリプシン切断に続いて、切断されたペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離によって得られた。
【図１４】図１４は、ＴＮＦ／ＮＧＦ−レセプターファミリーのメンバーと結合するリガンドのファミリーの４つのメンバーのアミノ酸配列比較を示す。ホモロジー領域を、太いタイプフェイスで、同一配列をドットで示し、そして保存配列を星印で示す。推定Ｎ−結合グルコシル化部位を四角で囲んでいる。
【図１５】図１５は、これはＬＴ−αおよびＬＴ−β発現のノーザン分析を示す。Ａ）いくつかの細胞株のノーザンブロットでＨｕｔ−７８およびＩＩ−２３．Ｄ７細胞中のみで両方のＬＴ遺伝子を特異的に発現することを示す。Ｂ）ＩＩ−２３．Ｄ７細胞中のＬＴ−αおよびＬＴ−β ｍＲＮＡのＰＭＡ誘導の時間経過 Ｃ）抗ＣＤ３またはＩＬ−２単独のいずれかで活性化されたヒト末梢血リンパ球の同様の分析を示す。
【図１６】図１６は、ＣＨＯ細胞中のＬＴ−αおよびＬＴ−βの発現を示す。Ａ）ＬＴ−β ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析。親ｄＨＦＲ−ＣＨＯ株またはＬＴ−αを発現するＣＨＯ細胞のいずれかを、無関係の挿入物（クローン４）を含有するｐＣＤＭ８またはｐＣＤＭ８／ＬＴ−βプラスミドのいずれかでエレクトロポレートし、そしてコントロールＩｇＧ（−−−）または抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（＿＿＿）で染色した。Ｂ）パネルＢは、ＣＯＳ細胞中でＬＴ−αおよびＬＴ−βの発現を示す。細胞を、ｐＣＤＭ８／ＬＴαと共に、または用いないで、コントロールＤＮＡまたはｐＣＤＭ８／ＬＴβプラスミドでトランスフェクトし、そしてパネルＡと同様に染色した。
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βに関する。リンホトキシン−β（ｐ３３と呼ばれる）は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株およびリンホカイン活性化キラー細胞の表面上で同定されている。
【０００２】
本発明はまた、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）およびリンホトキシン（ここでは「リンホトキシン−α（ＬＴ−α）」と称して、ＬＴ−βと区別している）のような他のリンホトキシンタイプペプチドとの間で形成される複合体ならびにＬＴ−βの多数のサブユニットを含有する複合体に関する。本発明のＬＴ−βポリペプチドは、細胞中で形成されたＬＴ−αを細胞表面上に保持する点で有益であると考えられ、該表面で、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体のいずれかが浸潤調節剤、腫瘍成長阻害剤、Ｔ細胞抑制剤、Ｔ細胞活性化剤、免疫モジュレ一ター剤、自己免疫疾患調節剤またはＨＩＶ調節剤として作用し得る。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の抗腫瘍活性は、ＬＴ−βの遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞へ送達され得る。
【０００３】
ここに記述した発明は、国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）許可番号ＣＡ３５６３８−０７−１０の下での一連の研究の中の一部でなされた。米国政府はこの発明に一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
免疫応答の開始は、細胞間シグナルの複雑な配列を含む。これらのシグナルは、代表的に多数の細胞−細胞接触依存シグナルでカップルした可溶性サイトカインを含有する。接触依存事象（Ｔ細胞レセプターの最も有名な活性化）は、応答に特異性を与えるが、他方可溶性メディエーターは、細胞分化および細胞増殖の維持に対して一般的に応答可能である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＬＴ−αは、一般的に免疫応答の開始に関与すると認識されている２つのポリペプチドである。
【０００５】
ＴＮＦおよびＬＴ−αは、元来腫瘍の成長を阻害する能力が知られている可溶性タンパク質である。［Ｌ．Ｏｌｄ、「腫瘍壊死因子」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、６３０（１９８５）］。さらなる研究により、両方のタンパク質は広範囲な活性を有することが示された。ＴＮＦは、造血細胞および非造血細胞の両方を含有する種々の細胞タイプによって、種々の炎症性の傷害に応答して合成されるが、対照的にＬＴ−αはリンパ球によって特異的に作られる。２つの公知のＴＮＦレセプターは、ＬＴ−αとＴＮＦとをはっきりと区別することができない。［Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、「ヒト腫瘍壊死因子のレセプターの分子クローニングおよび発現」、Ｃｅｌｌ、６１、３６１−３７０（１９９０）；Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、「腫瘍壊死因子のレセプターが、細胞のおよびウイルス性タンパク質の異常なファミリーを定義する」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）］。一般に、ＬＴ−αはしばしばほとんど強力ではないが、ＬＴ−αおよびＴＮＦは、インビトロ系で類似の活性スペクトルを示す。［Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、「いくつかのヒト腫瘍系統の成長に対する腫瘍壊死因子およびリンホトキシンの異なる影響の研究」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）］。
【０００６】
ＴＮＦは、内毒素ショックヘの応答、および造血細胞発達の調節において、代謝制御の特別な局面で主要な役割をつとめるようである。［Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒら、「カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）の由来、性質、および生物学的効果」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７、（１９８８）；Ｍ．Ａｋａｓｈｉら、「リンホトキシン：線維芽細胞中のコロニー促進因子の促進および調節」、Ｂｌｏｏｄ、７４、２３８３（１９８９）；Ｇ．Ｒｏｏｄｍａｎら、「腫瘍壊死因子−αおよび造血前駆体：赤血球前駆体ＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅならびに造血幹系統ｋ５６２、ＨＬ６０、およびＨＥＬ細胞の成長に対する腫瘍壊死因子の効果」、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５、９２８（１９８７）］。
【０００７】
ＩＬ−１およびＩＬ−６とともに、ＴＮＦもまた、炎症性応答の主要なメディエ一ターである。［Ｄ．Ｃａｖｅｎｄｅｒら、「腫瘍壊死因子およびリンホトキシンによって誘発される内皮細胞の活性化」、Ａｍｅｒ．Ｊｏｕｒ．Ｐａｔｈ．、１３４、５５１（１９８９）；Ｒ．Ｃｏｔｒａｎら、「炎症性および免疫反応における内皮細胞活性化の役割」、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＳｉｍｏｎｅｓｃｕおよびＳｉｍｏｎｅｓｃｕ編、１９８８）３３５］。ＴＮＦはまた、ある条件下でＴ細胞活性化に関与しているようである。［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、「混合リンパ球反応中のヒト腫瘍壊死因子−αおよび−βの関与」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１、４９９（１９８８）；Ｎ．Ｄａｍｌｅら、「ヒトＴ細胞活性化のＣＤ３依存およびＣＤ３非依存開始の間のＩＬ−４およびＴＮＦ−αの異なる調節効果」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、８、８５（１９８９）；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら、「ＩＬ−２依存性Ｔ細胞株の増殖シグナルとしての腫瘍壊死因子−α：活性の絶対種特異性」、Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２、１２０３（１９８９）；Ｇ．Ｒａｎｇｅｓら、「腫瘍壊死因子α／カケクチンは胸腺細胞の成長因子である」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７、１４７２（１９８８）；Ｐ．Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈら、「組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの免疫調節活性：ヒトＴ細胞のＴＮＦレセプターの誘発およびＴ細胞応答のＴＮＦ−α−仲介促進」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８、１７８６（１９８７）］。
【０００８】
ＴＮＦは、単球、線維芽細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む数種のタイプの細胞によって生産される。［Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、「腫瘍壊死因子：遺伝子構造および生物学的活性」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１、５９７（１９８６）；Ｄ．Ｓｐｒｉｇｇｓら、「ヒト上皮腫瘍細胞株での腫瘍壊死因子の発現」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１、４５５（１９８８）；Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒら、「自己免疫および正常個体からのヒトＴ細胞が腫瘍壊死因子を生産し得る」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７、１８０７（１９８７）］。研究者はまた、ネズミまたはヒト形態のＴＮＦを検出し、それらがトランスメンブランタンパク質またはレセプター結合分子のいずれかとして種々の細胞の表面に結合していることを示した。［Ｂ．Ｌｕｅｔｔｉｇら、「膜腫瘍壊死因子の２形態の存在についての証拠：内在性タンパク質およびそのレセプターに付着した分子」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、４０３４（１９８９）；Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、「新規形態のＴＮＦ／カケクチンは細胞表面細胞傷害性トランスメンブランタンパク質である：ＴＮＦの複合生理学についての分枝」、Ｃｅｌｌ、５３、４５−５３頁（１９８８）］；およびＭ．Ｋｉｎｋｈａｂｗａｌａら、「Ｔ細胞レパートリーヘの新規追加」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１、９４１−９４６頁（１９９０）］。
【０００９】
ＬＴ−αは、ＴＮＦの活性とは一般的に類似しているものの同一ではない多くの活性、例えば、腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘発、多形核白血球の活性化、内皮細胞上のクラスＩ主要組織適合性複合抗原の誘発、内皮細胞の接着分子の誘発および成長ホルモン刺激を含む。［Ｎ．ＲｕｄｄｌｅおよびＲ．Ｈｏｍｅｒ、「炎症におけるリンホトキシンの役割」、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、４０、１６２−１８２頁（１９８８）］。ＬＴ−αおよびＴＮＦの両方とも、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターファミリーのメンバーのリガンドである。［Ｓ−ＭａｌｌｅｔｔおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ、「神経成長因子レセプターに関連する細胞表面タンパク質の新しいスーパーファミリー」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１２、７、２２０−２２３（１９９１）］。
【００１０】
ＴＮＦとは対照的に、ＬＴ−αの分泌は、活性化されたＴ細胞およびある種のＢ−リンパ芽球腫瘍のみの特異的な性質のようである。［Ｎ．Ｐａｕｌら、「リンホトキシン」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、４０７（１９８８）］。ある研究者たちはまた、ＬＴ−αの膜結合形態は、ある環境下でリンパ球の表面上で発現され得ることを示した。［Ｊ．Ｈｉｓｅｒｏｄｔら、「インビトロでの異種の抗ＬＴ抗血清を使用するマイトジェン活性化ヒトリンパ球上の膜結合リンホトキシン（ＬＴ）の同定」、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４、３２６−３３９頁（１９７７）；Ｃ．ｗａｒｅら、「リンパ球仲介細胞障害性の機構」、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６、１９２７−１９３３頁（１９８１）；Ｕ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１２３、２３３（１９８９）；Ｙ．Ａｂｅら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、８２、２３（１９９１）；Ｙ．Ａｂｅら、「インビトロでのヒトリンホカイン活性化Ｔキラー細胞における膜結合および可溶性（分泌）リンホトキシンの研究」、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１、２、１１５−１２１（１９９２）］。
【００１１】
近年、ＴＮＦおよびＬＴ−αの両方の遺伝子が単離され、そしてクローン化されて、完全な特徴づけがなされ両方の組換え形態のタンパク質が入手可能となった。［Ｐ．Ｇｒａｙら、「ヒトリンホトキシンのｃＤＮＡのクローニングおよび発現、腫瘍壊死活性を有するリンホカイン」、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、１２１−１２４頁（１９８４）；Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａら、「ヒト腫瘍壊死因子：前駆体の構造、発現およびリンホトキシンとのホモロジー」、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、７２４（１９８４）］。
【００１２】
ＣＤ４０タンパク質を含有する他の「サイトカイン様」細胞表面タンパク質は、ＴＮＦおよびＬＴ−αとある種の類似性を共有していることが近年示された。ＴＮＦおよびＬＴ−αと同様に、ＣＤ４０タンパク質は、ＴＮＦ／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプターファミリーのメンバーに対するリガンドである。［Ｓ．ＭａｌｌｅｔｔおよびＮ．Ｂａｒｃｌａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１２、２２０−２２３頁（１９９１）］。ＣＤ４０タンパク質は、Ｂ−リンパ球、上皮細胞、およびある種の癌腫細胞様の表面に発現する２７７アミノ酸のタンパク質である。［Ｒ．Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３５７、８０−８２頁（１９９２）；Ｔ．ＦａｒｒａｈおよびＣ．Ｓｍｉｔｈ、「サイトカインファミリーの発生」、Ｎａｔｕｒｅ、３５８、ｐ．２６（１９９２）］。
【００１３】
本発明者らは、新規な表面タンパク質、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）すなわちｐ３３を同定した。ＬＴ−βは、種々のタイプのリンパ球の表面で同定されたが、これらのリンパ球は、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を含む。ＬＴ−βは、細胞の中で生産され細胞膜に向かうＬＴ−αを標的としており、細胞膜では、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは複合体（本開示を通して「ＬＴ−α／ＬＴ−β」と表示する）のようにみえる。ＬＴ−α／ＬＴ−βは、活性化Ｔ細胞によるＬＴ−αの膜発現に対する新規機構であると考えられている。［Ａｎｄｒｏｌｅｗｉｃｚら、「リンホトキシンは、活性化ヒトＴ細胞ハイブリドーマの表面上で別の３３ｋＤａ糖タンパク質とヘテロマーな複合体として発現される」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７、２５４２−２５４７頁（１９９２）］。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、可溶性ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０タンパク質と類似の細胞溶解および細胞調節活性を示し得る。ＬＴ−αと複合した膜結合ＬＴ−βは、複合体としてＴ細胞が他の細胞と相互作用をする新規リガンドを表し得、そしてまた標的細胞の溶解に有用であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明の新規タンパク質はリンホトキシン−β（ＬＴ−β）と命名された。このタンパク質は、種々のタイプのリンパ球の表面で見い出されるが、これらのリンパ球はＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を含む。それはＬＴ−αとの新規複合体を形成し、そして他のＬＴ−βサブユニットとの複合体を形成する（例えば、（ＬＴ−β）２ＬＴ−α複合体）。
【００１５】
ＬＴ−βは、３１−３５ｋＤの分子量を有するが、これは免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された。ＬＴ−βは、Ｎ−結合グルコシル化を有する。リンホトキシン−βのアミノ酸配列を配列番号２で示し、そしていくつかの可溶性リンホトキシン−βペプチドのアミノ酸配列を配列番号４、配列番号６および配列番号８で示す。リンホトキシン−βをコードするＤＮＡ配列を配列番号１で示し、数種の可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードするＤＮＡ配列を、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示す。
【００１６】
細胞膜タンパク質としてのＬＴ−βは、合成中のＬＴ−αと結合する。従って、ＬＴ−αを細胞膜に「標的化」する。ＬＴ−βの非存在下で、ＬＴ−αは細胞外培地に分泌される。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、ＣＨＯ細胞中で発現された組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）に対して生じたポリクローナル抗血清により、または天然ＬＴ−αに対して生じたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）により認識される。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体および（ＬＴ−α）３を認識する抗血清は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）をブロックする。ＭＬＲは同種間刺激に対するＴリンパ球の予想される増殖応答であり、すなわち、他の個体からのＴリンパ球を導入した際に「レスポンダー」リンパ球により異物（非自己）として認識される標準免疫学的アッセイである。［例えばＭ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌ．、１４１、４９９（１９８８）を参照のこと］。
【００１７】
ＬＴ−βタンパク質をアフィニティクロマトグラフィにより精製し、部分配列を決定し、そして特異的オリゴヌクレオチドプローブを設計した。ＬＴ−αをコードするｃＤＮＡを、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞（ホルボールエステル活性化により大量の表面リンホトキシンを表すヒトＴ細胞ハイブリドーマ）からのｃＤＮＡライブラリーをプローブすることによって単離した。同定したアミノ酸配列は、２４０〜２４４アミノ酸配列（約２５１３０〜２５３９０ｋＤａの非修飾タンパク質の分子量）をコードする。配列番号２を参照のこと。アミノ酸配列およびトランスメンブラン領域位置はタイプＩＩ膜タンパク質の典型である。
【００１８】
この配列は、短い１４〜１８アミノ酸Ｎ−末端「細胞質」ドメインを含有する。この細胞質ドメインの後ろに、おそらく膜固定ドメインとして働く３０の疎水性アミノ酸の長い広がりがある。同一の配列は利用可能なデータベースには見られなかった。細胞外ドメインには１つのシステイン残基およびＣ−末端の最後の１７アミノ酸に２つのメチオニン残基がある。これは、このタンパク質が示す非常に制限された臭化シアン切断パターンと一致する。
【００１９】
ＬＴ−β配列とＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに結合することが知られている公知の他のタンパク質を比較すると、かなり構造の類似性がある。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに対する４つのリガンド（ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＬＴ−βおよびＣＤ４０リガンド）は、タイプＩＩ膜タンパク質に類似し、そして図１４に示されるような細胞外ドメイン中の保存配列の少なくとも４つの領域を共有している。ＬＴ−βと共有する、保存されたＴＮＦおよびＬＴ−αドメインは、サブユニット間相互作用およびβシート構造に関連しているようである。これらの保存領域は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βの間の結合を説明し得る。これらホモロジー領域の存在は、ポリペプチドを設計して、例えば、ＴＮＦまたはＣＤ４０リガンドと複合体を容易に形成させ得る。このような分子は、機能を混在し得、そして注文のデザインされた薬として使用され得る。［Ｊ．Ｆｕｈら、「ヒト成長ホルモンレセプターと拮抗するアンタゴニストの合理的なデザイン」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１６７７（１９９２）参照のこと］。
【００２０】
本発明のペプチド複合体はＴ細胞活性化の事象に重要であり、Ｔ細胞活性化あるいはＴ細胞抑制のための組成物および方法、ならびに炎症の治療剤として、あるいは腫瘍細胞または新生物の増殖阻害のような細胞障害活性を必要とする適用するための治療剤として有用であると考えられる。また、ポリペプチド複合体は細胞免疫療法に有用であり、腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）治療における腫瘍浸潤リンパ球の殺腫瘍能力を高めることが重要であると考えられる。ＴＩＬ免疫療法は、遺伝子組換え技術により改善され得る。例えば、遺伝子を、体の免疫系を誘導する目的で腫瘍細胞に加えて、効果的な腫瘍特異的免疫応答を仲介し得る。［例えば、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、「ヒト遺伝子療法」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、８０８−８１３（１９９２）参照のこと］。
【００２１】
また、「Ｆａｓ」として同定される分子とＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーとの間の類似性に基づいて、本発明のポリペプチド複合体は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスとして知られている細胞の内部プロセスに関与し得、それゆえ、自己免疫病の仲介に関与し得ると考えられる。［例えば、Ｎ．Ｉｔｏｈら、「ヒト細胞表面抗体ＦａｓのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドはアポトーシスを仲介し得る」、Ｃｅｌｌ、６６、２３３−２４３（１９９１）；Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、「アポトーシスを仲介するＦａｓ抗原の欠陥によって説明されるマウスにおけるリンパ増殖疾患」、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３４１（１９９２）参照のこと］。
【００２２】
ＬＴ−β、その関連ポリペプチド、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体または本発明の他のポリペプチド複合体に対する抗体はまた、特定のレセプターとの重要なＬＴ相互作用を破壊する。すなわち、既知のＴＮＦレセプター形態を介して仲介される事象以外の特異的に影響するＬＴ仲介事象を形成し得る。同様に、ＴＮＦ、ＬＴ−αまたはＬＴ−α／ＬＴ−β、またはこれらの誘導体（例えば、可溶性レセプターおよびＩｇＧ／レセプター融合タンパク質）に対するレセプターも、本発明のポリペプチドおよび複合体の阻害に使用し得る。
【００２３】
本発明は、以下を提供する：
（項目１） 配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−β。
【００２４】
（項目２） 上記ポリペプチドが細胞表面に結合しているポリペプチドである、項目１に記載のポリペプチド。
【００２５】
（項目３） 上記ポリペプチドが、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激ヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７に結合している、項目２に記載のポリペプチド。
【００２６】
（項目４） 可溶性リンホトキシン−βペプチドであって、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号６；および
（ｃ）以下の式で示されるアミノ酸配列：
Ｘ−配列番号６、
ここで、Ｘは配列番号８の３’末端から始まる１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含有する；
を包含するペプチド。
【００２７】
（項目５） 前記ペプチドが、さらに５’末端でのリーダー配列を含有する、項目４に記載のペプチド。
【００２８】
（項目６） ポリペプチドであって、以下からなる群からのＤＮＡ：
（ａ）配列番号１を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１によって定義されるＤＮＡにハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｃ）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ；
によってコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【００２９】
（項目７） ポリペプチドであって、以下からなる群からのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号３を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号５を含有するＤＮＡ配列；
（ｃ）以下の式で示されるＤＮＡ配列：
Ｘ−配列番号５、
ここで、Ｘは、配列番号７の３’末端から始まる１つまたはそれ以上のヌクレオシドトリプレットを含有する；
（ｄ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５および上記（ｃ）部のいずれか１つとハイブリダイズし、可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｅ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５および上記（ｃ）部の配列のいずれか１つによってコードされるポリペプチドをコードしている、縮重ヌクレオチド配列を含有する、ＤＮＡ配列；
を含有するポリペプチド。
【００３０】
（項目８） 設計されたポリペプチドであって、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を包含し、ここで配列Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕが上記配列の５’末端から切断され、かつ１つのＭｅｔまたは１っのＬｅｕ残基によって置換される、ポリペプチド。
【００３１】
（項目９） 単離されたＤＮＡ配列であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号１で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；
（ｃ）リンホトキシン−βをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；から選択される、ＤＮＡ配列。
【００３２】
（項目１０） 単離されたＤＮＡ配列であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号３で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号５で定義されるヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｃ）項目７（ｃ）のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
（ｄ）ＤＮＡ配列であって、配列番号３、配列番号５または項目７（ｃ）の配列のいずれか１つによって定義されるＤＮＡ配列にハイブリダイズし、かつ可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同であるポリペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；および
（ｅ）可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列；
から選択される、ＤＮＡ配列。
【００３３】
（項目１１） 設計されたＤＮＡ配列であって、配列番号１で定義されるヌクレオチド配列を含有し、ここでヌクレオチドＣＴＧＧＧＧＣＴＧが上記配列の５’末端から切断され、かつ１つの開始コドンによって置換される、ＤＮＡ配列。
【００３４】
（項目１２） 組換えＤＮＡ分子であって、以下からなる群：
（ａ）配列番号１で定義されるＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号３で定義されるＤＮＡ配列；
（ｃ）配列番号５で定義されるＤＮＡ配列；
（ｄ）項目７（ｃ）に記載のＤＮＡ配列；
（ｅ）項目１１に記載のＤＮＡ配列；
（ｆ）ＤＮＡ配列であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５および項目７（ｃ）に記載の配列のいずれか１つによって定義されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつリンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドを発現するようにコードする、ＤＮＡ配列；
（ｇ）縮重ヌクレオチド配列を含有し、リンホトキシン−βに対してコードするＤＮＡ配列；および
（ｈ）縮重ヌクレオチド配列を含有し、可溶性リンホトキシン−βペプチドに対してコードするＤＮＡ配列；
から選択されるＤＮＡ配列を含有する、組換えＤＮＡ分子。
【００３５】
（項目１３） 単細胞宿主、培養中の動物細胞および培養中のヒト細胞からなる群から選択される宿主であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、宿主。
【００３６】
（項目１４） 腫瘍浸潤リンパ球、リンホカイン活性化キラー細胞、キラー細胞および患者から取り出され、遺伝的に設計された腫瘍細胞からなる群から選択される項目１３に記載の宿主。
【００３７】
（項目１５） 項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記方法は項目１３に記載の形質転換宿主を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【００３８】
（項目１６） ポリペプチド複合体であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、項目８のポリペプチド、および項目４（ｃ）の可溶性リンホトキシン−βペプチドからなる群から選択される第１のポリペプチド、および、リンホトキシン−α、天然ヒトまたは動物リンホトキシン、組換えリンホトキシン、可溶性リンホトキシン、分泌リンホトキシン、あるいはリンホトキシンまたは上記の任意のリンホトキシン活性フラグメントからなる群から選択される第２のポリペプチドを含有する、ポリペプチド複合体。
【００３９】
（項目１７） 複数のリンホトキシン−βポリペプチドユニットを含有するポリペプチド複合体。
【００４０】
（項目１８） 項目１６に記載のポリペプチド複合体であって、上記複合体が細胞表面と結合している、ポリペプチド複合体。
【００４１】
（項目１９） 項目１８に記載のポリペプチド複合体であって、上記第１のポリペプチドがＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞、抗原特異的ＩＬ−２依存性ＣＴＬクローン、およびＰＭＡ刺激非リンホトキシンヒトＴ細胞ハイブリドーマであるＩＩ−２３．Ｄ７の表面と結合している、ポリペプチド複合体。
【００４２】
（項目２０） 細胞の表面上でリンホトキシンエピトープを生産する方法であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子で該細胞をトランスフェクトする工程、および該細胞中でＤＮＡを発現させる工程を包含する、方法。
【００４３】
（項目２１） 腫瘍浸潤リンパ球の標的殺腫瘍性活性を高める方法であって、項目１２に記載の組換えＤＮＡ分子で上記リンパ球をトランスフェクトする工程、および上記形質転換されたリンパ球を患者に導入する工程を包含する、方法。
【００４４】
（項目２２） 項目２１に記載の方法であって、上記形質転換されたリンパ球を項目１２に記載の組換えＤＮＡでトランスフェクトする前またはトランスフェクトした後に、リンホカインとともにインキュベートする、方法。
【００４５】
（項目２３） 項目２２に記載の方法であって、前記リンホカインがＩＬ−２である、方法。
【００４６】
（項目２４） ＨＩＶ感染、新生物形成、炎症または炎症性の病気、ならびに自己免疫疾患の進行、重篤、または影響を、抑制、処理または軽減するための組成物であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【００４７】
（項目２５） ＨＩＶ感染、新生物形成、炎症または炎症性の病気、ならびに自己免疫疾患の進行、重篤、または影響を、抑制、処理または軽減するための方法であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを投与することを含有する、方法。
【００４８】
（項目２６） 免疫系を抑制する組成物であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【００４９】
（項目２７） 免疫系を抑制する方法であって、項目１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド複合体、上記のいずれかに対する抗体、または上記のいずれかの組合せからなる群から選択される有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを投与することを包含する、方法。
【００５０】
（項目２８） リンホトキシン−βをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１により表される上記ヌクレオチド配列を含有し、さらに５’末端で設計されたヌクレオチド配列を含有し、上記設計されたヌクレオチド配列がＡＴＧまたはＣＴＧである機能的な開始コドンを含有し、上記設計されたヌクレオチド配列中で、ロイシンをコードする他のコドンがＣＴＧでない、ヌクレオチド配列。
【００５１】
（発明の詳細な説明）
ここに記載された本発明を完全に理解するために、以下に詳細に説明する。
【００５２】
本発明は、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βに関する。リンホトキシン−βのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５３】
ポリペプチド（またｐ３３という）は、３１〜３５ｋＤの分子量を有する。本発明のポリペプチドは、細胞表面に結合するか、またはそのような表面に結合しない。
【００５４】
本発明はまた、リンホトキシン−βの可溶形態に関する。可溶性リンホトキシン−βペプチドは、リンホトキシン−βのアミノ酸配列で定義され、ここで、配列は、トランスメンブラン領域の端（すなわち、アミノ酸番号４４付近）とアミノ酸番号９５付近の最初のホモロジー領域との間の任意の位置で切断される。２つの可溶性リンホトキシン−βペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４および６で定義されている。いくつかの付加的な可溶性リンホトキシン−βポリペプチドは、配列番号６によって定義されるアミノ酸配列の５’末端に付加的アミノ酸残基を有する配列を包含する。付加的な残基は、配列番号８によって定義される５２アミノ酸残基を包含し得る。可溶性リンホトキシンはまた、配列番号６で定義される配列に３’末端から始まる１〜５１のアミノ酸残基を含有する配列番号８の一部を加えたアミノ酸配列を包含する。このような可溶性ペプチドは、５’末端に周知のリーダー配列を任意の数包含し得る。このような配列により、真核系でペプチドが発現される。［例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許番号第５，０８２，７８３（１９９２）］。
【００５５】
本発明のポリペプチド複合体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号６プラス上述したような配列番号８の全部または一部分によって定義される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチドと、同一群から選択される第２のポリペプチド、および／またはリンホトキシン−α、天然ヒトまたは動物リンホトキシン−α、組換えリンホトキシン−α、可溶性リンホトキシン−α、分泌リンホトキシン−α、または上記の任意のリンホトキシン−α活性フラグメント等との第２のポリペプチドと複合した複合体に関する。
【００５６】
新規ＬＴ−βペプチドはＬＴ−αと複合体を形成し、そして他のＬＴ−βサブユニットと複合体を形成する（例えば、（ＬＴ−β）２ＬＴ−α複合体）。これらの複合体は、細胞と結合し得、または結合し得ず、そして上述のように共通ホモロジー領域を共有する他のタイプＩＩ膜タンパク質との複合体であり得る。
【００５７】
ポリペプチド複合体は、組換えＬＴ−αを認識する多特異性抗血清によって認識され、この複合体はＬＴ−αエピトープを示すことを示唆する。これらの抗血清は、市販の抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣中（ＣＨＯ）細胞で発現する組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）に対して生じる多特異性抗血清を包含する。これらの複合体を認識するポリクローナル抗血清はまた、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）をブロックするが、可溶性ＬＴ−αを認識するモノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体はＭＬＲをブロックしない。従って、本発明の複合体は、Ｔ細胞活性化における重要な役割を行うようである。また、これらの複合体が可溶性ＬＴ−αまたはＴＮＦの活性と同様にＴ細胞制御活性および細胞障害性を有することが予想される。
【００５８】
本発明はまた、上記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を本質的に含有するＤＮＡ、このＤＮＡによって特徴付けられる組換えＤＮＡ分子、本ＤＮＡでトランスフェクトされた培養物中の単細胞宿主または動物およびヒト細胞の群から選択される宿主、ならびにこのＤＮＡおよびこれらの組換えＤＮＡ分子および宿主を使用しこれらによりコードされるポリペプチドを生産する組換え方法に関する。
【００５９】
さらに詳しくは、本発明は、配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列を含有する単離されたＤＮＡ配列に関する。
【００６０】
本発明はさらに、上記配列、リンホトキシン−βと実質的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ配列、およびリンホトキシン−βをコードするヌクレオチド配列を有する縮重ＤＮＡ配列に関する。
【００６１】
本発明はまた、可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号３および配列番号５で定義される。本発明はまた、配列番号５のＤＮＡの５’末端にいくつかの付加的なヌクレオチドトリプレットを有するＤＮＡでコードされる数種の付加的な可溶性リンホトキシン−βペプチドに関する。付加的なヌクレオチドトリプレットは、配列番号７によって定義される５２トリプレットを包含する。可溶性リンホトキシンペプチドはまた、配列番号５に３’末端から始まる１〜５１ヌクレオチドトリプレットを含有する配列番号７の一部分が付加された配列にコードされ得る。
【００６２】
本発明はまた、リンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドを発現するようにコードする上記同定された任意の配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。本発明はまた、リンホトキシン−βまたは可溶性リンホトキシン−βペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、および可溶性リンホトキシン−βペプチドと実質的に相同なペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００６３】
リンホトキシン−βを同定し、単離しそして以下に記述する技術を使用して特徴付けた。
【００６４】
（フローサイトフルオロメトリー分析）
まず、フローサイトフルオロメトリー分析を使用してＴ細胞の表面上のＬＴ−αエピトープの発現を説明する。ＯＫＴ３モノクローナル抗体で活性化されたヒト末梢血単核球細胞が、抗ｒＬＴ−α抗血清と反応することによりＬＴ−αエピトープの発現を示すことが判明した。抗ｒＴＮＦ抗血清ではなく、抗ｒＬＴ−α抗血清のみが、ＯＫＴ３刺激一次Ｔ細胞に結合した。
【００６５】
また、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３．Ｄ７［Ｃ．Ｗａｒｅら、「細胞障害性リンホトキシンを生産するヒトＴ細胞ハイブリドーマ：リンホトキシン放出の誘導および抗ＣＤ３モノクローナル抗体またはレクチンおよびホルボールエステルによるキラー細胞活性」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、５、３１３（１９８６）］が、ＰＭＡ刺激によりＬＴ−αを分泌すること、さらにまたＰＭＡ刺激により表面ＬＴ−α関連エピトープを発現することが観察された。また、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞がウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清からＬＴ中和抗体を除去できたが、一方コントロールＵ９３７細胞（表面ＬＴ−α形態全てが欠如している）は除去できなかったことが示された。さらに、ウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清がウサギＬＴ−αと結合（複合体化）していた（生じた複合体が次にＩＩ−２３．Ｄ７細胞上の細胞性ＬＴ−α／ＴＮＦレセプターと結合する）という可能性を排除したが、それは、細胞性レセプターを過剰の可溶性ＴＮＦまたはＬＴ−αで飽和し、そしてこれが染色に関して影響を持たなかったことを観察したことによる。これらのアッセイの結果は、ハイブリドーマ上のＬＴ−α関連エピトープが本当にＬＴ−αと関係していることを示す。
【００６６】
また、過剰のｒＬＴ−αによる抗血清の前処理は、抗血清がＩＩ−２３．Ｄ７細胞を染色する能力を防ぐが、一方ｒＴＮＦでの前処理は効果を持たなかったということが観察された。このアッセイは、ＬＴ−α関連エピトープに対する抗血清の特異性を示す。
【００６７】
染色する前に刺激したＩＩ−２３．Ｄ７細胞をトリプシン処理することにより、シグナルを失わせるが、これは、抗血清によって認識されるエピトープはタンパク質であったことを示した。
【００６８】
また、ＣＨＯ由来の混入物が活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上の誘導タンパク質の抗血清による認識に寄与しなかったことが示されたが、それは可溶性ＬＴ−αのみを生産するＬＴ−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が抗ＬＴ−α抗血清によって染色されなかったことによる。
【００６９】
（免疫沈降）
さらに、これら表面ＬＴ−α関連タンパク質を、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面のヨウ素化（１２５Ｉ−標識化）または代謝標識化（３５Ｓ−Ｍｅｔまたは３５Ｓ−Ｃｙｓ）のいずれかにより標識し、続いてデタージェントで原形質膜を可溶化し、標識ＬＴ−α関連タンパク質の免疫沈降により特徴付けた。
【００７０】
免疫沈降で結合した表面ヨウ素化によって、抗ＬＴ−α抗血清によって認識される２つのタンパク質：以降ＬＴ−αという２５〜２６ｋＤ形態、および以後、ＬＴ−βまたはｐ３３という３１〜３５ｋＤ形態が明らかとなった。同じウサギからの免疫前抗血清も抗ｒＴＮＦ−ウサギ血清のいずれもヨウ素化されたＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からのバンドを免疫沈降しなかったことを観察した。ヨウ素化し免疫沈降したバンドの一次元部分的ＣＮＢｒ処理ペプチドマップは、２５〜２６ｋＤ形態（ＬＴ−α）の切断によりヨウ素化した組換えＬＴ−αのものと同一のパターンを示した。このことは、表面ＬＴ−αと可溶性ＬＴ−αとの相互関係を補強する。ヨウ素化された３１〜３５ｋＤ形態（ＬＴ−β、すなわちｐ３３）はＣＮＢｒによって切断されず、公知のＬＴ−α遺伝子生成物とは別であることが示された。
【００７１】
さらに、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインで代謝標識し、ＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を特徴付けた。システインおよびメチオニンの分布は、ＴＮＦとＬＴ−αとの間、ならびに、シグナル配列を有する形態と有しない形態との間を区別するための方法が提供される。［Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、５３、４５（１９８８）］。分泌されたＴＮＦはシステインを含有するが、メチオニンはなく、一方、分泌されたＬＴ−αはメチオニンのみを含有し、システイン残基はない。しかし、ＬＴ−αはシグナル配列中に１つのシステイン残基を有するが、一方、ＴＮＦはシグナル配列中に２つのメチオニン残基を含有する。
【００７２】
３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインのいずれかでＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞をそれぞれ培養して標識し、そして培地および細胞からの免疫反応性タンパク質を沈降した。次に、３５Ｓ−メチオニンで標識した細胞の培地からの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、ＬＴ−αの２５ｋＤ形態が現れたが、一方３５Ｓ−システインで標識した細胞の培地からの免疫沈降物では現れず、分泌ＬＴ−αに対して予測されるパターンではなかった。洗浄した細胞の分析では、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態および３３ｋＤ ＬＴ−β形態の両方を示した。これらの結果は、表面ヨウ素化を用いて観察された膜結合形態と同じである。
【００７３】
２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αはシステインを欠如しており、これはリーディング配列のプロセッシングを示している。また、３３ｋＤ ＬＴ−βは３５Ｓ−メチオニンと３５Ｓ−システインとの両方を取り込み、それ自身が２５ｋＤ ＬＴ−α形態とは異なる形態であることが観察された。典型的に、そのレセプターと結合したＬＴ−αは、ＢＯＳＣＯＥＳ（すなわち、ビス［２−［スクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ］エチル］スルホン；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のような化学的架橋剤を用いてレセプターと架橋し得る。［Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｒｅｗｓら、「ヒトＴリンパ球上の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびリンホトキシン（ＬＴ）に対するレセプターの特徴付け」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４、２５８２（１９９０）］。表面ヨウ素化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を架橋剤で処理した時、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αまたは３３ｋＤ ＬＴ−β関連形態のいずれかが、他の付加的膜タンパク質と結合しなかったことが観察された。このアッセイは、レセプター結合はＬＴ−αおよびＬＴ−βが細胞膜と結合したままのメカニズムではないことを示した。ＬＴ−βの配列分析は、２つのＴＮＦレセプター形態のいずれとも関係ないことを示した。［Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９、（１９９０）；Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１（１９９０）］。
【００７４】
（アフィニティークロマトグラフィー）
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質のさらなる特徴付けを、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行った。ＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の表面上のＬＴ−α／ＬＴ−β複合体がレンチルレクチンと結合することが観察されたが、これは、それぞれの形態が糖タンパク質構造であることを示す。従って、精製工程としてレンチルレクチンクロマトグラフィー工程を、抗血清アフィニティークロマトグラフィーの前に使用した。デタージェントで可溶化したＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質をレンチルレクチンセファロースに結合し、そしてα−メチルマンノシドで溶出した。コントロールＩｇＧおよび抗ＬＴ−α−ＩｇＧアフィニティーカラムの両方を調製し、これらのタンパク質が抗ＬＴ−α抗血清によって特異的に認識されることを正確に評価した。次に、レンチルレクチンに結合したタンパク質をこれらのカラムに適用した。カラムを低ｐＨで溶出したときに抗ＬＴ−αアフィニティーカラムからＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質が放出されることを観察した。溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果は、表面ヨウ素化ＰＭＡ処理ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からの免疫沈降タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果とかなり類似していた。この比較は、類似のタンパク質が２つの方法によって精製されたことを示した。
【００７５】
アフィニティー精製の間、約２５ｋＤ ＬＴ−α形態が切断されて１９〜２０ｋＤ形態、すなわち「デス（ｄｅｓ）２０」形態にとなるようであることを観察した。ＲＰＭＩ １７８８腫瘍細胞株からの天然ＬＴ−αの最初の単離［Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌら、「１７８８腫瘍細胞株由来のヒトリンホトキシンの一次構造」、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６０、２３３４−２３４４頁（１９８５）］もまた、Ｎ−末端的に切断された２０ｋＤ ＬＴ−α形態を与えていた。この「デス２０」天然型ＬＴ−α中の１つのメチオニンが失われており、無傷の分子と比べると異なるＣＮＢｒ切断パターンとなる。アフィニティー精製ＬＴ−αタンパク質の一次元ＣＮＢｒ切断は、短縮型の天然ＬＴ−α形態と一致する切断パターンを示し、そして、アフィニティー精製「デス２０」ＬＴ−α形態はおそらく天然ＬＴ−α「デス２０」で観測されたような類似の切断から生じたと結論した。
【００７６】
さらに、ＬＴ−βが部分的ＣＮＢｒ切断でダブレットを生じることを観察した。ＬＴ−βタンパク質による切断パターンは、メチオニン残基が存在すること、および少なくとも１つのメチオニンがＣ−またはＮ−末端いずれかから５〜２０残基の範囲内にある（このマッピング技術を使用して切断した時、いずれかの末端の１〜５残基の範囲内でメチオニン残基は検出されなかった）。このパターンは、ＬＴ−βは公知のＬＴ−α配列の全部を含有していないことを示唆した。
【００７７】
ＬＴ−βタンパク質はまた、抗原活性化一次細胞障害性Ｔリンパ球クローンによって発現されることが観察された。これらの細胞の代謝標識後の抗ｒＬＴ−αを用いる免疫沈降の結果は、少量のＬＴ−αと共にＬＴ−βが現れた。これらの結果は、ＬＴ−βは一次Ｔ細胞およびＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマによって作成され得ることを示した。
【００７８】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質の初期精製）
以下の一般的な工程を使用してＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を精製した。まずホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）をＩＩ−２３．Ｄ７細胞に添加した。２４時間後に、細胞を収集し、それらを無血清冷ＲＰＭＩ培地で洗浄した。冷たい細胞ペレットに、氷冷溶解緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＮＰ−４０、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、およびアジ化ナトリウム）を加え、それにベンズアミジン、フェニルメチルスルホニルクロライド（ＰＭＳＦ）、ならびにＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ダイズトリプシンインヒビター、ペプスタチンおよびアプロチニンを新たに添加した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞を穏やかに均一化し、そして溶解液を遠心分離した。遠心分離し、そして上清を採取した。ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を添加した溶解緩衝液で予め平衡化したレンチルレクチンセファロースカラムに、上清をロードした。ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を有する溶解緩衝液でカラムを洗浄し、次にα−メチルマンノシドを含有する溶解緩衝液で溶出した。溶出画分をプールし、そしてウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフィニティーカラムの上にロードしたが、このカラムはウサギ抗ｒＬＴ−αセファロースアフィニティーカラムに直接連結していた。ＥＤＴＡを含有する同じ溶解緩衝液で、次にＮＰ−４０をＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で置換した溶解緩衝液で両方のカラムを洗浄した。洗浄したカラムをそれぞれ別個に５ｍＭ ＭＥＧＡ−８、５０ｍＭ グリシン、ＮａＣｌ、ベンズアミジン、およびＥＤＴＡ溶液で溶出したが、その方法は、Ｂｒｏｗｎｉｎｇらの「リンホトキシンおよび関連３３−ｋＤ糖タンパクは、活性化ヒトＴ細胞ハイブリドーマの表面上で発現される」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７、１２３０−１２３７頁（１９９１）に記載された方法に従った。ｐＨシフト後の第１回分をプールし、凍結乾燥し、ＳＤＳで水に再懸濁し、そしてＨＥＰＥＳおよびＳＤＳの溶液に対して透析した。ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで透析画分を乾燥し、そして水に再懸濁した。アリコートをＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液と混合し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。銀染色でタンパク質を視覚化した。
【００７９】
１つまたは複数のＬＴ−αエピトープがＰＭＡ処理で生じるような細胞活性化によってのみ、ＩＩ−２３．Ｄ７Ｔ細胞ハイブリドーマの表面に存在することが観察された。反対に、一次Ｔ細胞上で存在する時、ＰＭＡ処理により表面抗原が失われる。さらに、組換えＬＴ−α（ＣＨＯ細胞で生産される）あるいは天然ＬＴ−α（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）のいずれかに対するウサギポリクローナル抗血清が１つまたは複数のＬＴ−αエピトープを認識したことを見出した。
【００８０】
また、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体を認識するこの抗血清はＭＬＲをブロックするが、可溶性ＬＴ−αを認識する特定のモノクローナル抗体はブロックしないことを観察した［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１、４９９（１９８８）］。それゆえ、本発明のＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、Ｔ細胞の活性化のメディエーターであり得る。
【００８１】
細胞溶解物からの免疫沈降物中のＬＴ−βがＬＴ−αと共に存在することは、ＬＴ−βが免疫原性的にＬＴ−αと関連するかあるいはＬＴ−βがＬＴ−αと結合されるか、または両方を示唆している。この問題を解決するために、３５Ｓ−メチオニン標識細胞からの２５ｋＤおよび３３ｋＤバンドを、ウサギポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清で免疫沈降し、切り出したゲルスライスから溶出し、そして抗ｒＬＴ−αポリクローナル抗血清または抗ｒＬＴ−α ｍＡｂのいずれかで再免疫沈降した。ＬＴ−α（ＬＴ−βではなく）は、抗ｒＬＴ−α抗体のいずれかで免疫沈降し、ＬＴ−βが免疫原性的にＬＴ−αと関連しないことを示唆した。これらの観察は、ＬＴ−βが物理的にＬＴ−αと結合していることを示した。
【００８２】
表面ＬＴ−αおよびＬＴ−βが複合体を形成するという仮説をさらに検証するために、変性および未変性条件下で等電点フォーカシング法（ＩＥＦ）実験を行った。ＬＴ−αおよびＬＴ−βが物理的に結合されれば、これらは未変性条件下では複合体としてフォーカスするはずであるが、変性条件下では分離した形でフォーカスするという理論的根拠に基づく。ＬＴ−αおよびＬＴ−βに対する個々の等電点（ｐＩ）を、二次元ゲル分析（変性条件）によって決定した（図９Ａ）。ＬＴ−αは、６．５〜７．３のｐＩの範囲で５つの荷電化したアイソマーを有するが、ＬＴ−βは５．５〜６．０のｐＩの範囲で４つの荷電化したアイソマーを有する。しかし、フォーカシング法を未変性条件下で行った時、ＬＴ−αおよびＬＴ−βは共に６．３〜７．２のｐＩの範囲で広いバンド幅で集中した。それゆえ、ＬＴ−βの泳動は、未変性条件下で顕著に遅れた。
【００８３】
（ＬＴ−αおよびＬＴ−βのさらなる精製および同定）
ＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を以下の一般的な工程を使用して精製した。ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地でＩＩ−２３．Ｄ７細胞を培養し、そして細胞を５０ｌのＲＰＭＩから集め、そして培地に再懸濁し、そしてホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間の活性化の後、遠心分離によって細胞を収集し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄した。冷溶解緩衝液に最終細胞ペレットを懸濁し、そしてペレットをいったん窒素キャビテーターの中を通過させた。溶解した細胞を遠心分離し、そして上清を捨てた。一晩デタージェントと共に溶解緩衝液中でペレットを抽出し、次に再び遠心分離した。
【００８４】
デタージェントで可溶化した膜を含有する上清を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（１０）と結合したモノクローナル抗ＬＴ−αを含むアフィニティー樹脂に添加し、懸濁液を一晩振動した。樹脂を小さいカラム中に回収し、ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含むＨＥＰＥＳで、次に１％ ｗ／ｖ ＭＥＧＡ−８を含む同じ緩衝液でそれを洗浄し、ＭＥＧＡ−８を含むグリシン緩衝液で結合したタンパク質を溶出し、そしてその画分をトリス塩基で直ちに中和した。画分中にＬＴ−βおよびＬＴ−αの存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色法によって確認した。これらタンパク質を含有する画分をプールし、そしてＳＤＳを添加し、そしてこのプールを０．ｌ×ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に対して透析した（ＭＥＧＡ−８デタージェントを除去するため何度も取り替えた）。透析した溶液を乾燥状態まで、凍結乾燥して、元の１／１０量の水に再懸濁した。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にサンプルを流し、ＰｒｏＢｌｏｔメンプラン上にプロットし、そしてクーマシーブルー染料で染色した。ＬＴ−βおよびＬＴ−αバンドを切り出し、そしてタンパク質シーケンサーにロードした。エドマン分解によってＮ−末端配列を得た。膜に結合したＬＴ−αバンドの配列は、分泌性のＬＴ−αについて記載された配列と正確に一致することがわかった。すなわちＬｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（アミノ酸番号１〜９）［Ｐ．Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、１２１−１２４頁（１９８４）］と一致する。エドマン分解分析によって、結合ＬＴ−βタンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸配列が２つのアミノ酸配列：Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ＧｌｎまたはＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎを含む可能性があることを示した。引き続きより正確なｃＤＮＡ技術を使用するＤＮＡ分析で、正しい配列はＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎであったことを確認した。
【００８６】
ＬＴ−α形態が検出されたそれぞれの場合で、また、ＬＴ−βを検出し得た（すなわち、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞、活性化ＣＴＬクローン、およびＨｕｔ−７８細胞の表面ＬＴ−α形態を構成的に発現する）。ＬＴ−αは表面ＬＴ−αの非存在下でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から分泌され、そしてＬＴ−βの存在が表面結合ＬＴ−αと関連するので、ＬＴ−βはＬＴ−αと複合体を形成し細胞表面でそれを標的化すると結論付けた。生化学的には、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは非変性等電点フォーカシングゲル上で共に泳動するが、複合体が尿素で解離すると、２つのタンパク質が分離して流れる。［図９Ａ、１０Ａ参照のこと］。これらの観察は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βは細胞表面上で複合体として存在するという結論に導いた。
【００８７】
（リンホトキシン−βおよび可溶性リンホトシン−βペプチドに対してコードするＤＮＡ配列の同定）
リンホトキシン−βを、上述したように免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。直接Ｎ−末端配列決定およびインサイチュトリプシン分解に続いて、分解ペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離を行った。［Ａｂｅｒｓｏｌｄら、「ニトロセルロース上のインサイチュプロテアーゼ分解後の一次元または二次元ゲル電気泳動法によって分離されるタンパク質の内部アミノ酸配列分析」、ＰＮＡＳ、８４、６９７０−６９７４（１９８７）参照のこと］。次に得られたＮ−末端および内部トリプシンフラグメントペプチドの配列を通常の方法を使用して決定した。Ｎ−末端およびＴ１０５、Ｔ８７／８８、Ｔ１１０およびＴ６７と命名した内部ペプチドの配列決定を図１３に示す。
【００８８】
２つのアンチセンス１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号９］およびＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号１０］（それぞれ１３６８および１３６９と命名した）を、ペプチドＴ−８７／Ｔ−８８の配列の一部分と一致するように合成し、そして３２Ｐで放射能標識した。ノーザン分析の結果、１３６８と命名されたプローブが、０．９〜１．１ｋｂ ｍＲＮＡバンドに強くハイブリダイズしたことを示した。このｍＲＮＡは、前述したようにホルボールエステルで前処理したＩＩ−２３．Ｄ７細胞中で強く誘導された。
【００８９】
ベクターｐＣＤＭ８中のｃＤＮＡライブラリーを、ＰＭＡで６時間誘導したＩＩ−２３．Ｄ７細胞から単離されたポリＡ＋ｍＲＮＡから構築した。ライブラリーを１３６８と命名された標識オリゴマーでスクリーニングし、そしてポジティブクローンを単離し、次に５０℃で３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。０．８〜０．９ｋＤ挿入物を有するいくつかの（＞１６）クローンを、ＤＮＡ配列分析にかけた。
【００９０】
クローンｐＣＤＭ８／ＬＴ−β−１２は、配列番号１に示されるリンホトキシン−βをコードする配列を含んでいた。他のクローンは、５’末端で種々の短縮形であることを除いて、同一であった。クローン１２ ｃＤＮＡは、機能的なリンホトキシン−βをコードする。標準プライマー伸長法を用いて、アミノ酸残基−−ＭＥＴ ＧＬＹ ＡＬＡ−−をコードする付加的なコドンを同定した。８６２〜８６７位の終止コドン ＡＡＴＡＡＡは、３’ポリＡ領域のちょうど前に、あり、これは全３’末端領域が同定されたことを示す。タンパク質コード配列は、２４０アミノ酸をコードし非修飾分子量で約２５，３９０ｋＤａと計算される。
【００９１】
クローン１２ ｃＤＮＡおよびプライマー伸長から同定されたＬＴ−β ＤＮＡ配列の５’末端、ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧ［配列番号１１］から、３つの開始コドン（下線）の可能性があることが明らかとなった。［例えば、Ｍ．Ｋｏｚａｋ、「脊椎動物ｍＲＮＡ配列の分析：翻訳調節の暗示」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１５、４、８８７−９０３（１９９１）］。設計されたＬＴ−βポリペプチドおよびＤＮＡ配列は、この５’配列の全てまたは一部分を切断することならびに１つの開始コドンを置換することで誘導し得る。
【００９２】
このアミノ酸配列プロフィルは、タイプＩＩ膜タンパク質に典型的である。短い（最大１７）アミノ酸配列Ｎ−末端「細胞質」ドメインに続いて、膜固定ドメインとしておそらく働く３０の疎水性アミノ酸が拡がる範囲がある。入手可能なデータベースでは同一の配列が発見されなかった。細胞外ドメイン中に１つのシステイン残基があり、そして最後のＣ−末端１７アミノ酸中に２つのメチオニンがある。これは、このタンパク質で示される非常に制限された臭化シアン切断パターンと一致する。
【００９３】
ＬＴ−βの配列を決定した後の比較では、ＬＴ−βは、タイプＩＩ膜タンパク質であり、ＴＮＦ、ＬＴ−αおよびＣＤ４０タンパク質に対して有意に相同性を有することが明らかになった。これらのポリペプチドは、細胞外ドメイン中に４つの配列保存領域を共有している。図１４参照のこと。このような保存領域は、これらのポリペプチドがお互いに複合体を形成するのを可能にするようである。［以下を参照のこと；例えば、Ｍ．ＥｃｋおよびＳ．Ｓｐｒａｎｇ、「２．６Å分解能での腫瘍壊死因子−αの構造、レセプター結合との関係」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６４、２９、１７５９５−１７６０５頁（１９８９）；Ｅ．Ｊｏｎｅｓら、「腫瘍壊死因子の構造」、Ｎａｔｕｒｅ、３３８、２２５−２２８頁（１９８９）；Ｍ．Ｅｃｋら、「１．９Å分解能でのヒトリンホトキシン（腫瘍壊死因子−β）の構造」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６７、４、２１１９−２１１２頁（１９９２）；Ｊ．Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、「腫瘍壊死因子およびリンホトキシンの保存残基は、トリマー構造の骨組みを構成する」、Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．、２５７、２、（１９８９）］。
【００９４】
（クローン化ＬＴ−βの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２＊（＊プラスミドｐＣＤＭ／ＬＴ−βクローン１２を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２は、ＢＮ１２８９（ＭＣ１０６１／Ｐ３／Ｐ３３−クローン−１２）と命名され、１９９２年１１月１３日にＡＴＣＣに寄託された。）またはコントロールプラスミド、クローン４（非機能性ＬＴ−β ｃＤＮＡ挿入断片を有するｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによって、安定にヒトＬＴ−αでトランスフェクトしたＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞およびＣＨＯ細胞中に導入した。３日後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＣａ／Ｍｇを含まないＨａｎｋ溶液に取り出し、そして上述したような１０μｇ／ｍｌコントロールＩｇＧ１または抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のいずれかを使用したＦＡＣＳ分析のために染色し、その後、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリン標識ヤギ抗マウス調製物のいずれかで、結合免疫グロブリンを標識した。
【００９５】
他の実験において、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＤＭ８ベクター中でもまた等量のヒトＬＴ−αｃＤＮＡの存在または非存在下で、ｐＣＤＭ８中のクローン４またはクローン１２のＬＴ−βｃＤＮＡのいずれかでエレクトポレートし、そして上記のように３日後ＦＡＣＳ分析のために染色した。ＬＴ−αを発現するＣＨＯ細胞のみが、機能性ＬＴ−β ＤＮＡ（すなわち、クローン１２）でのトランスフェクションにおいて表面リンホトキシンを示した。
【００９６】
クローン１２は開始ＡＴＧコドンを欠損しているが、いくつかのＣＴＧ開始コドンを有しており、それゆえこの発現実験は１つまたはいくつかの５’ＣＴＧコドンが翻訳を開始しなければならないことを示す。ＣＴＧコドンは、いくつかの真核タンパク質の翻訳に対する開始部位となることは公知である。［Ｍ．Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１１５、４、８８７−９０３（１９９１）］。ＬＴ−αおよびＬＴ−β ＤＮＡの両方を受け入れるＣＯＳ細胞のみが、ＦＡＣＳ分析中の実質的な表面ＬＴ−αを示すような同様の結果を、ＣＯＳ細胞中の２つのトランスフェクション系を使用して観測した。
【００９７】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αならびにＬＴ−α／ＬＴ−βのポテンシャル使用）
上記のように、ＬＴ−β、ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドの間にかなりの構造的類似性がある。ＬＴ−β、ＬＴ−α、ＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドはタイプＩＩ膜タンパク質であり、そして細胞外ドメイン中に少なくとも４つの配列保存領域を共有している。
【００９８】
構造的類似性の観点において、ＬＴ−αが、分泌される分子と同一の形態で活性化リンパ球の表面で見られるが、ＬＴ−αを表面におそらく固定する他の不可欠な膜タンパク質と複合されるという問題がある。発明者らは、この独特の複合体（すでにＬＴ−α／ＬＴ−βであると決定された）が、ＬＴ−αのさらに関連している形態を示し、ＴＮＦと関連する特異性を与えると考えている。
【００９９】
リンホカインのヘテロメトリックの複合体の存在は、免疫系に独特であるが、他の領域中のシグナル分子を暗示する（例えば、ＰＤＧＦおよびインヒビン／アクチビンヘテロメトリック複合体）。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の記述は、ＬＴ−αホモトリマーによって模倣できない複合体独特の免疫調節活性の可能性を提供する。複合体は、高い親和性相互作用および生化学的に関連したシグナルを導く独特のレセプターまたはレセプター鎖組合せに結合し得る。独特のレセプター複合体とのＬＴα−／ＬＴ−β相互作用の仮説は、多くの系でのＴＮＦ（２つの公知ＴＮＦレセプターの研究によって説明できない観測）と比較してＬＴ−αホモトリマーの相対的に弱い活性を説明し得た。［Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１−３７０（１９９０）；Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）］。
【０１００】
ＬＴ−βとの複合体化を経て可溶性ＬＴ−αを細胞表面につなぐことは、ＬＴ−α／ＬＴ−βを介する細胞−細胞接触特異的シグナルが、免疫調節の重要な面であり得ることを示す。ＴＮＦおよび関連したＬＴ−α形態は分泌されるので、ＬＴ−βもまた分泌され得ると考えられる。これは、抗ＬＴ−βモノクローナル抗体を使用する研究で実証し得る。このような抗体はまた、ＬＴ−βホモ−オリゴマーが自然に生じるかどうか決定するために使用され得る。
【０１０１】
一般的に、ＬＴ一およびＴＮＦは、定性的に同じ活性スペクトルを示し、そしてＬＴ−αおよびＴＮＦは同じセットのレセプター（５５および８０ｋＤ ＴＮＦレセプターと呼ぶ）と相互作用すると考えられる。［Ｃ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９（１９９０）；Ｔ．Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１、３６１（１９９０）］。それでもなお、ＬＴ−αおよびＴＮＦによって示される生物学的能力の定量的パターンは劇的に異なり、ＬＴ−αはしばしばＴＮＦよりさらに能力が少ない［例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）を参照のこと］。これらの観測は、存在するレセプター結合データと一致させることが難しい。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、他の現在まで不確定のレセプターと相互作用するような、独特の特性をＬＴ−αに与える可能性がある。この場合、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体および本発明の他の複合体は、ＬＴ−αまたはＴＮＦのいずれかと区別する独特の生物学的特性を有する。ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、例えばＬＴ−α／ＬＴ−βまたはＬＴ−β特異的レセプターを同定し、そしてクローニングするために使用され得る。さらに、さらなる複合体の使用は、新規な生物学的活性を明らかにし得る。
【０１０２】
また、多数のＴ細胞およびマクロファージ細胞株がＨＩＶウイルスによって感染可能であることは公知であるが、実際には、少数の細胞様が組織培養中のウイルスを増殖するのに有用である。例えば、Ｈ９株（Ｇａｌｌｏらによって最初に開発されたＨｕｔ−７８の誘導体［Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４、４９７−５００（１９８４）］）、および他のヒトリンパ球株（Ｃ８１６６）は、ＨＩＶ増殖に対して有用であった。［Ｍ．ＳｏｍａｓｕｎｄａｒａｎおよびＨ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、１５５４−１５５７（１９８８）］。表面ＬＴ−α発現または表面ＬＴ−αの発現の能力は、所定の細胞をＨＩＶ増殖に対して良い標識にし得る。
【０１０３】
ＨＩＶ増殖を高めることにおけるＴＮＦの役割が提案された［Ｌ．Ｏｓｂｏｒｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、２３３６（１９８９）；Ｚ．ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＡ．Ｆａｕｃｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１１、１７６（１９９０）；Ｃ．Ｌｏｃａｒｄｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４、５８７４（１９９０）；Ｇ．Ｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、７８２（１９９０）］。発明者らは、ＩＩ−２３．Ｄ７株がＨＩＶ株ＩＩＩＢで感染可能であるが、ＰＭＡ処理でこのウイルスによる感染が劇的に増加することを発見した。Ｈｕｔ−７８細胞株が、表面ＬＴ形態を構成的に発現することが見出され、そしてＣ８１６６株は、その後のＰＭＡ処理で明らかとなる表面ＬＴ中でＩＩ−２３．Ｄ７と似ている。［Ｗａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、印刷中（１９９２）］。
【０１０４】
これらのＨＩＶによるＩＩ−２３．Ｄ７の感染可能性の結果、および感染可能な細胞株と表面ＬＴ発現との関係を考慮すると、これらの株がＨＩＶ感染および複製に対し良い宿主であり得ることを提案する。なぜなら、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体、および本発明の他のポリペプチドおよび複合体が調節の役割を果たすからである。ＬＴ−α遺伝子がＨＩＶ転写活性化因子ＴＡＴの発現によって誘導されることが証明され［Ｋ．Ｓａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、２００９１（１９９０）］、そして、さらに、ＨＴＬＶ−１感染もまたＬＴ−α発現を誘導することが示された［Ｎ．Ｐａｕｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４、５４１２（１９９０）；Ｅ．Ｔｓｃｈａｃｈｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０）、Ｗ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ編、１０５頁］。従って、ＨＩＶ感染および続いて起こるＬＴ−α／ＬＴ−β複合体または他の複合体の発現によるＬＴ−αの誘導、またはこれらのタンパク質を作る能力がある細胞株でのＰＭＡ処理によるＬＴ−α／ＬＴ−βまたは他の複合体の発現の誘導は、ウイルス複製を高めるために用い得る。この理由のために、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体もしくは本発明の他のポリペプチド複合体、またはこれらの複合体の可溶性形態、またはＬＴ−βおよび本発明の他のポリペプチドに対する抗体または特異的結合タンパク質（例えば、可溶性レセプター）は、ＨＩＶ増殖を阻害し得、またはＨＩＶ誘導Ｔ細胞死をブロックし得る。
【０１０５】
ＬＴ−α／ＬＴ−βとＣＤ４０レセプターリガンドペアとの間の類似点が示され得、ここでＴ細胞表面ＣＤ４０リガンドからのシグナルは、ＣＤ４０レセプターを介してＢ細胞へ「ヘルプ」を与える。従って、表面ＬＴ−α／ＬＴ−βが、Ｔ細胞または他の造血系（ＬＡＫまたはＮＫ細胞およびＢ−細胞など）のＴ細胞調節の成分であり得ると仮定し得る。さらに、この相互作用は、いくつかの自己免疫疾患中の機能不全であり得る。［例えば、Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３１４−３１７頁（１９９２）を参照のこと］。
【０１０６】
さらに、Ｆａｓ抗原と呼ばれる細胞表面タンパク質は、ＴＮＦ、ＮＧＦ、およびＣＤ４０タンパク質を含む多数の細胞表面レセプターとかなりの構造的相同性を有することを示した。Ｆａｓ抗原は、アポトーシスを仲介することに関係しており、プロセスもまたプログラム細胞死として関連している［Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３１４−３１７頁（１９９２）；Ｎ．Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ、６６、２３３−２４３頁（１９９１）］。Ｆａｓ抗原の欠損を説明するマウスの株は、全身性エリテマトーデス様自己免疫疾患を発生する。これは、構造的に類似しているＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体もまた、全身性エリテマトーデスを仲介する役割を行い得、それゆえ、この経路中の介入は、種々の自己免疫疾患を治療することに臨床的に有用であり得る。あるいは、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、細胞−細胞接触依存機構を介するプログラム細胞死を誘導することに関連し得る。すでに大規模なＴＮＦ／ＮＧＦタイプレセプターのファミリーを補充するためのＴＮＦ関連リガンドのこのファミリーの出現は、免疫系中での重要な調節因子の追加配列の存在を示唆する。
【０１０７】
ＬＴ−βまたはＬＴ−β／ＬＴ−α複合体は、免疫系を抑制する役割を同様に行い得、そしてアレルギーを治療し、耐性を誘発することに潜在的に有用であり得る。
【０１０８】
ゲノムのＭＨＣ領域のＴＮＦ／ＬＴ遺伝子座の位置は、研究者らに種々の自己免疫疾患、特にインスリン依存性真性糖尿病に対する関連を調査させた。［例えば、Ｆ．Ｐｏｃｉｏｔら、「モノカイン分泌とインスリン依存性真性糖尿病との関係における腫瘍壊死因子β遺伝子多形性」、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３、３７−４９（１９９１）；Ｋ．Ｂａｄｅｎｈｏｏｐら、「（インスリン依存性）真性糖尿病タイプ１におけるＴＮＦ−α遺伝子多形性」、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３２、４４５−４４８（１９８９）を参照のこと］。発明者らは、ＬＴ−β遺伝子がＴＮＦ／ＬＴ遺伝子座の次に位置することを発見したので、ＬＴ−β遺伝子またはそのレセプターがこの自己免疫条件に関連する可能性がある。従って、ＬＴ−βまたはそのレセプターまたはＬＴ−βに対する抗体は、糖尿病のこの形態における置換療法を包含する。
【０１０９】
上述したように、ＬＴ−βポリペプチド、および本発明のポリペプチド複合体は、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化、またはＴ細胞抑制適用を含む多数の可能性のある使用、全身性エリテマトーデスの治療を含む適用、および抗炎症性の組成物での使用および方法を有することが期待される。次に、ＬＴ−βポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、同様なＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子、ならびに同様の組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした培養物中の単細胞宿主および動物またはヒト細胞を用いて、組成物および上記の療法で使用するために、実質的に他のヒトタンパク質を含まない大量の本発明のポリペプチドを生成し得る。
【０１１０】
本発明のポリペプチド複合体の表面上で発現するリンパ球、および好ましくはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体は、腫瘍細胞を殺す能力を高め得たリンパ球のサブセットを示す。同様に、このサブセットは、ＬＡＫ（リンホトキシン活性化キラー）細胞またはＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）細胞療法に有用であり得る。［Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｓｉｋｏｒａ、「癌療法への生物学的アプローチ」、Ｊｏｕｒ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、１７、１９１（１９８９）］。ＴＩＬ免疫療法は、遺伝子転移技法によって改善され得る。ＬＴ−βについての組換え遺伝子およびそれに基づく関連のポリペプチドは、例えばＴＩＬ療法で、治療上有用であり、ここでＬＴ−β遺伝子は（ＬＴ−α遺伝子と共にまたはＬＴ−α遺伝子なしのいずれかで）、腫瘍から単離したＴ細胞に導入し、そして患者に導入され得る。さらに好ましくは、細胞を患者から取り出し、本発明のポリペプチドを発現するようにコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトし、トランスフェクションの前または後でリンホカイン、好ましくはＩＬ−２でインキュベートし、そして患者に戻す。トランスフェクトしたＴ細胞（すでにＬＴ−βを発現し、そしてまたその後ＬＴ−αと複合化している）は、取り出された腫瘍に戻り、そこでＬＴ−αの殺腫瘍性作用を直接腫瘍に伝える。同様に、ＬＡＫ細胞中に導入されるＬＴ−β遺伝子が細胞上の表面複合体の数を増加させ、そしてそれらの活性を高めることが考えられる。あるいは、患者腫瘍細胞中へのＬＴ−β遺伝子の導入は、ＬＴ−β改変腫瘍が、腫瘍自体に対する高められた免疫応答を誘発する腫瘍ワクチンを造り出すことに、有用であり得る。［例えば、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、８０８−８１３（１９９２）を参照のこと］。
【０１１１】
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体に対する抗体または抗体誘導体もまた、この細胞集団を富化するための通常の免疫学的方法（例えば、パンニングまたはフローサイトフルオロメトリー選別）に有用である。［Ｌ．Ｊ．ＷｙｓｏｃｋｉおよびＶ．Ｌ．Ｓａｔｏ、「リンパ球についてのパンニング：細胞選別の方法」、ＰＮＡＳ、７５、２８４４（１９７８）］。
【０１１２】
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体、またはフラグメントまたはその誘導体は、リンホトキシン−αおよび腫瘍壊死因子が使用されるのと同様に、細胞調節または治療の適用に有用である。
【０１１３】
本発明の組成物は、特定の臨床状態に対して治療するために、有効な用量で投与され得る。所定の適用についての特定の用量の決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の治療の程度および治療に対する患者の耐性を、当該技術分野では十分考慮に入れる。本発明の複合体およびポリペプチド、またはおそらくそれに由来するペプチド、またはそれからもしくはそれらのアミノ酸配列を使用して合成されるペプチド（ポリペプチドの単離および精製形態を包含する）、またはそれらの塩または薬学的に受容可能な誘導体の投与は、抗腫瘍、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞抑制または抗炎症活性を示す薬剤の任意の従来受容された態様を介するものであり得る。
【０１１４】
これらの療法で使用される組成物もまた、種々の形態であり得る。これらは、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、注入可能または浸出可能な溶液のような、固体、半固体、および液体の投与形態、および遺伝子療法を包含し得る。好ましい形態は、投与の意図した形式および療法の適用に依存する。投与の態様は、経口、非経口、皮下、静脈内、病変内、または局所投与を包含し得る。組成物はまた、好ましくは、通常の薬学的に受容可能なキャリアを包含し、そして他の医薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤など、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物を包含し得る。好ましくは、組成物は１単位用量の形態であり、そして通常１日１回またはそれ以上を投与される。
【０１１５】
以下は、本発明のＬＴ−βおよびＬＴ−α／ＬＴ−β複合体、およびこれらを特徴付けるために使用される方法を説明する実施例である。これらの実施例は限定して解釈されるべきものではなく：実施例は例証の目的のために含まれ、そして本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１６】
実施例において以下の実験手順を使用した：
（抗血清）
組換えヒトＬＴ−α（ｒＬＴ−α）を、無血清条件培地中で安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株によって、発現しそして分泌した。無血清条件培地から、一連のセファロースＳ、レンズマメレクチンセファロースおよびＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィー工程によって、分泌ｒＬＴ−αを精製した。ＣＨＯ細胞由来のｒＬＴ−α調製物の特性は記載されている。［Ｊ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９（１９８９）］。リンパ腺手順［Ｍ．Ｓｉｇｅｌら、「リンパ腺中への接種による抗体の産生」、Ｍｅｔ．Ｅｎｚ．、９３、３（１９８３）］によって、完全フロイントアジュバンド中２５μｇの天然ｒＬＴ−αで２匹のウサギ（４および５）を免疫した。３番目のウサギ（６）を、完全フロイントァジュバンド中２５μｇの変性ｒＬＴ−αで同じ経路により免疫した。変性ｒＬＴ−αをＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて０．１％ＳＤＳ−カーボネート緩衝液中で電気溶出によって調製した。
【０１１７】
上記の方法を使用して、３つの抗ｒＬＴ−α抗血清を、２つを天然ｒＬＴ−αに対して、３番目をＳＤＳ変性ｒＬＴ−αに対して生成した。天然タンパク質（ウサギ４および５）での免疫によって生じた抗血清は、１：２０００〜５０００の希釈で５０ユニット／ｍｌ溶液を中和し得た。変性ｒＬＴ−α（ウサギ６）に対して生じた血清は、中和力価がないが、ウェスタンブロットではｒＬＴ−αと弱く反応した。抗血清は、ｒ−ヒトＴＮＦを中和し得ず、またウサギ６由来の抗血清中で非常に弱い力価であることを除いて、ＥＬＩＳＡプレートに結合したｒ−ヒトＴＮＦを認識し得なかった。ウサギ６由来の抗血清のみがウエスタン分析でｒＬＴを認識可能であった。
【０１１８】
組換えヒトＴＮＦで４番目のウサギを免疫した。完全フロイントアジュバント中で、続いて不完全フロイントアジュバント中のブーストにより、組換えヒトＴＮＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来［Ｄ．Ｗｅｉｒら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ｆｏｕｒ Ｖｏｌｕｍｅｓ、８章「実験動物の免疫」］）を使用する古典的免疫スキームを経て、ポリクローナル抗ｒＴＮＦウサギ血清を調製した。免疫によりｒＴＮＦに対して生じた血清は、良好な中和力価を有した。ＴＮＦに対する中和モノクローナル抗体が記述されている［Ｌｉａｎｇら、「組換えヒト腫瘍壊死因子／カケクチンに対するモノクローナル抗体の産生および特徴付け」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１３７、８４７（１９８６）］。予め免疫した血清を、コントロールとしての使用のために全ての動物から収集した。
【０１１９】
（細胞増殖およびＴ細胞活性化）
全ての細胞を、上述したＬＴ−αトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を除いて、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した［Ｂｒｏｗｎｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、１８５９−１８６７頁（１９８９）］。
【０１２０】
細胞を、１％グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ−ｄｅｆｉｎｅｄ）を補足したＲＰＭＩ １６４０（「完全ＲＰＭＩ」と呼ぶ）中で増殖した。ただし、上記のように補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中で増殖したトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は除く。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３は、活性化末梢リンパ球とヒトＣＥＭ腫瘍株との融合の結果であり、そしてさらにサブクローニングした（ＩＩ−２３．Ｄ７）［Ｃ．Ｗａｒｅら、「細胞障害性リンホカインを生産するヒトＴ細胞ハイブリドーマ：抗ＣＤ３モノクローナル抗体またはレクチンおよびホルボールエステルによるリンホトキシン放出およびキラー細胞活性の誘導」、Ｌｙｍｐｈ．Ｒｅｓ．、５、３１３（１９８６）］。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をヘパリン添加ガラスチューブ中に入れ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって単離し、洗浄し、そして完全ＲＰＭＩ培地で再懸濁した。１μｇ／ｍｌ インドメタシン存在下および、いくつかの実施例では１０ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ−２（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ＯＫＴ３条件培地の１：５００希釈（最終的に約２ｎｇ／ｍｌ）を用いて、２×１０６細胞／ｍｌで、ＰＢＬを処理した。ヒトＣＴＬ−クローンを、記述したように生成し［Ｌ．Ｇｒｅｅｎら、「クローン化ヒト細胞障害性Ｔリンパ球によって生産される細胞障害性リンホカイン」、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５、４０３４（１９８５）］、そして照射刺激細胞（抗原）またはＥ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚによって提供された抗ＣＤ２モノクローナル抗体（Ｔｌ１２＋Ｔｌ１３）の組合せのいずれかで活性化した。
【０１２１】
（フローサイトメトリー）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ アジ化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍｌ ヒトＩｇＧを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で、０℃で、細胞を再懸濁した。ヒトＩｇＧでのプレインキュベーションに続いて、所望の抗血清を含有する追加培地を添加した。代表的には、細胞を１：２００の抗ｒＬＴ−αおよび抗ｒＴＮＦ血清の最終希釈で６０〜９０分間インキュベートした。Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、次に、上記の培地中でフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）の１：５００希釈で最低６０分間これらをインキュベートした。次に細胞を１回洗浄し、そして直接に分析するか、またはいくつかの場合では０．５％パラホルムアルデヒドを用いて０℃にて１０分間の固定後に分析するかのいずれかを行った。２番目の抗体段階でのフィコエリスリン標識ｌｅｕ−４、ｌｅｕ−２、ｌｅｕ−Ｍ３、またはｌｅｕ−１６もしくはｌｅｕ−１９（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を添加することを除いて、上記のように２つの色分析を行った。表面結合ＬＴ−αとＩＬ−２レセプターレベルとの比較を、フルオレセイン標識抗ＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａ．）を用いる分離単色分析で行った。分析を、ＦＡＣＳｔａｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。
【０１２２】
（活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞による中和抗ｒＬＴ−α抗体の吸着）
完全ＲＰＭＩ培地中で、１×１０６細胞／ｍｌで８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと共に、ＩＩ−２３．Ｄ７およびＵ９３前単球細胞を刺激した。３回培地で細胞（１×１０８個）を洗浄し、そして上清を吸引して、乾燥ペレットを得た。次に、細胞を、抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４由来）の１：１０００希釈を含有する１ｍｌの培地で再懸濁し、そして混合しながら１．５時間氷上でインキュベートした。細胞を遠心分離によって抗血清から取り除いた。吸着した抗血清（免疫前および免疫後の両方）を、１５Ｕ／ｍｌのｒＬＴ−αを含有する等量（５０μｌ）の培地と混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。この混合物を培地中に連続的に希釈し、そしてＬ９２９細胞（０．１ｍｌ中）に添加し、そしてさらに２４時間インキュベートした。記載されたようなＭＴＴアッセイ［Ｌ．Ｇｒｅｅｎら、「細胞生存度に対する迅速な比色アッセイ：細胞障害性および増殖阻害リンホカインの定量への適用」、Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、７０、２５７−２６８（１９８４）］によって、細胞生存度を評価した。
【０１２３】
（Ｔ細胞の３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインの代謝標識）
ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０％ ｖ／ｖ 透析ＦＢＳ、および２％ ｖ／ｖ 通常のＲＰＭＩ（冷キャリア添加）を補足したシステインを含まないまたはメチオニンを含まないＲＰＭＩ １６４０中に、細胞を移した。細胞濃度を２〜３×１０５細胞／ｍｌに調節し、そして３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを１００〜２００μＣｉ／ｍｌのレベルにした適切な培地に添加した。新たに活性化したＰＢＬの場合は、上清を穏やかに除去し、そして細胞を遠心分離し、標識培地中で再懸濁し、そして元の付着集団に戻して添加した。１２〜１８時間の標識期間の後、以下に記述するように細胞を洗浄し、そして溶解した。ＰＢＬを用いて、細胞をピペットにより除去し、そして付着集団をＰＢＳ中で５ｍＭＥＤＴＡで処理することで部分的に除去した。
【０１２４】
（免疫沈降）
標識した細胞溶解物の０．２〜０．５ｍｌに２〜４μｌのウサギ血清を添加した。サンプルを１〜２時間、４℃で放置した。次に、洗浄したプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）の６０〜７５％懸濁液の６０μｌアリコートを添加し、そして６〜１８時間４℃でサンプルを振とうした。プロテインＡセファロースペレットをカルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ中 １％ＮＰ−４０で３回洗浄し、それらを５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳローディング緩衝液に再懸濁した。代表的には、１つの溶解物のサンプルを、連続した免疫沈降（免疫前抗ｒＬＴ−α血清、抗ｒＴＮＦ抗血清、および最後に免疫後抗ｒＬＴ−α抗血清）を介して循環した。１つのセットの実験で、５ｍＭ ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を溶解物に添加し、そして洗浄したレンズマメレクチン−セファロースの７５％懸濁液の７５μｌと共に溶解物を一晩振とうした。このセファロースをＮＰ−４０／ＰＢＳで２回洗浄し、次に０．２５Ｍ α−メチルマンノシドを含む７５μｌの１％ ＮＰ−４０／ＰＢＳの３回の連続的な添加により溶出した。プールした洗浄液を、免疫沈降プロトコールに用いた。
【０１２５】
（ウサギ抗ｒＬＴアフィニティーカラム）
プロテインＡセファロースを用いて酸性ｐＨ溶出で抗ｒＬＴ血清（ウサギ４由来）から免疫グロブリン画分を精製した。溶出したＩｇＧ含有面分をＰＢＳで透析し、そしてアミコン濾過により濃縮した。抗ｒＬＴ−α−ＩｇＧ溶液（６ｍｇ／ｍｌを１５ｍｌ）を、使用説明書に従い８ｍｌのＡｆｆｉ−ｇｅｌ １０樹脂（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａ．）に結合した。非特異的ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）を用いて同一のアフィニティーカラムを調製した。両方のカラムを、ＰＢＳ、１％ ＮＰ４０を含む１Ｍ 酢酸 ｐＨ３．０、そして最後にプロテアーゼインヒビターを含まない溶解緩衝液で洗浄した。
【０１２６】
（ＬＴ−βおよびＬＴ−αの最初の精製）
ＩＩ−２Ｓ．Ｄ７細胞（１５Ｌ）を５×１０５細胞／ｍｌの濃度になるまで増殖し、ホルボールミリスチンアセテート（ＰＭＡ）を添加し、最終濃度２５ｎｇ／ｍｌにした。２４時間後、細胞を採取し、そしてそれを冷無血清ＲＰＭＩ培地中で洗浄した。７×１０９細胞を含む凍結した細胞ペレットに、１００ｍｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１％ ｖ／ｖ ＮＰ−４０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．１％ アジ化ナトリウム）を添加した。その溶解緩衝液には、５ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルクロライド（ＰＭＳＦ）、および０．２５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター、０．７μｇ／ｍｌ ペプスタチンおよび１０μｇ／ｍｌ アプロチニンが新たに添加されている。ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞を穏やかにホモジナイズし、そして細胞溶解物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を６０，０００×ｇで９０分間遠心分離し、そして上清を収集した。
【０１２７】
高速遠心分離からの上清に、５ｍＭ ＣａＣｌ２および５ｍＭ ＭｎＣｌ２を添加した。次に、この上清を、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を加えた溶解緩衝液で平衡化した２０ｍｌのレンズマメレクチンセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）にロードした。溶解緩衝液（ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含む）でカラムを洗浄し、そして次に０．２５Ｍ α−メチルマンノシドを含有する溶解緩衝液でカラムを溶出した。
【０１２８】
レンズマメレクチン溶出画分を５０ｍｌの体積までプールし、そしてそれを２ｍｌのウサギ非特異的ＩｇＧセファロースアフィニティーカラムに直接ロードした。このカラムを２ｍｌのウサギ抗ｒＬＴ−αセファロースアフィニティーカラムに直接連結した。両方のカラムをＥＤＴＡを含む同じ溶解緩衝液で洗浄し、次に１％ ＮＰ−４０が１％ Ｗ／Ｖ
ＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ一Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ．）に置換されている溶解緩衝液で洗浄した。
【０１２９】
洗浄したカラムを、各々、１％ ＭＥＧＡ−８、５０ｍＭ グリシンｐＨ２．５、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭベンズアミジン、および２ｍＭ ＥＤＴＡで溶出した。ｐＨが変わった後の最初の２０ｍｌをプールし、このプールを凍結乾燥し、０．０５％ ＳＤＳを含む水１ｍｌに再懸濁し、そして１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．０５％ ＳＤＳ、および０．１％ ＭＥＧＡ−８で透析した。透析した画分をスピード真空（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で乾燥し、そして０．１５ｍｌの水に再懸濁した。アリコートとＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液とを混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＬＴ−βおよびＬＴ−αタンパク質を銀染色により視覚化した。
【０１３０】
（ＩＩ−２３．Ｄ７細胞表面のヨウ素化）
コントロールまたはＰＭＡ誘導ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のいずれかを、カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳで大量に洗浄し、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．２５ｍＭ ＮＥＭで処理し、そして次に２回洗浄した。５０μｇのヨードジェン（ｉｏｄｏｇｅｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ）でコートした１２×７５ｍｍガラスチューブに、０．３ｍｌの細胞（１×１０７全量）および１〜２ｍＣｉの１２５ヨウ化ナトリウムを添加した。細胞を２５分間、室温で定期的に撹拝しながら放置し、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳで３回洗浄し、そして上記の溶解緩衝液に再懸濁した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠沈管での２分間の遠心分離により核を除去した。次に、この上清をさらに１５分間遠心分離した。透明にした上清を免疫沈降のプロトコールに用いた。
【０１３１】
（一次元ＣＮＢｒペプチドマッピング）
サンプルを、１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉシステムゲル上にて短距離で電気泳動し、適切なゲル断片を切り出した。ゲルの薄片を、９０％ギ酸中に新鮮な７００ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒを１５μｌ含む１．０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ、０．２％ ２−メルカプトエタノールに１時間浸漬した。次にこの薄片を取り出し、そして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０で５分間、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０で５分間、そして最後に１×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で１０分間洗浄した。１２％ アクリルアミドスタッキングゲルを有する１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で薄片をロードした。ペプチドのバンドを銀染色または乾燥したゲルのオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【０１３２】
（再免疫沈降）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した抗原の再免疫沈降を、ゲルから標識したバンドを切り出し、ＴＢＳ、０．２％ ＳＤＳで１０分間再水和化し、そして次にゲルの薄片を小さな切片に刻むことにより行った。タンパク質を、１ｍｌ ＴＢＳ、０．２％ ＳＤＳ中で８時間、室温で回転しながらインキュベートすることにより溶出した。溶出後、ゲルの切片を遠心分離で取り除き、そしてＮＰ−４０を最終濃度が２％になるように上清に添加した。次に溶出されたタンパク質を上記の様に免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで再分析した。
【０１３３】
（等電点電気泳動（ＩＥＦ））
二次元ＩＥＦを、本質的にＰ．Ｈ．Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，４００７−４０２１（１９７５）］に記載されたように行った。１２５Ｉで標識した抗原を、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物から免疫沈降し、そして免疫沈降したタンパク質を、９．５Ｍ尿素を含む１００μｌのＯ’Ｆａｒｒｅｌｌサンプル緩衝液中で１００℃、５分間の加熱により溶出した。次に、溶出したタンパク質を、最終濃度２％アンホリン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ）（ｐＨ３〜１０領域、Ｓｉｇｍａ）を有する１４ｃｍ×３ｍｍのチューブゲル上で室温で１６時間定電圧（４００Ｖ）で泳動した（第一次元）。第二次元は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥであった。
【０１３４】
天然（未変性）条件下でのＩＥＦについて、１２５Ｉで標識した細胞抽出物を、尿素が存在することを除いて上記と同様にチューブゲルに直接電気泳動した。標識した抽出物（容積２００μｌ）をチューブゲルでロードする前に、１００，０００×ｇ（３０ｐｓｉ、ａｉｒｆｕｇｅ）で１０分間遠心分離した。電気泳動を上記と同じ条件下で４℃にて行った。次にチューブゲルを取り出し、そして１ｃｍの断片にスライスし、タンパク質を、１ｍｌのＴＢＳ、２％ ＮＰ−４０、２ｍＭ ＰＭＳＦ中で、８時間室温でそれぞれの薄片を回転させながらインキュベートすることにより溶出した。次に溶出したタンパク質を含む上清を免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。変性および未変性のチューブゲルの両方についてのｐＨ勾配を、並行で行ったゲルからの個々の薄片のｐＨの測定により決定した。
【０１３５】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
ＰＢＬを単離し、そして１０％ヒト自己血清、１μｇ／ｍｌ インドメタシン、および５０Ｕ／ｍｌポリミキシンＢを含むウシ胎児血清を除いた上記の完全ＲＰＭＩに再懸濁した。ＭＬＲ実験で、自己血清は応答動物の血清であった。異なるドナーからの刺激細胞を３０００ラドで照射した。ウサギ血清を５６℃で１時間前加熱し、そして増殖アッセイに用いる前に血清を希釈し、濾過滅菌した。丸底９６ウェルプレートの０．２ｍｌの細胞（全量１×１０５）を５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン、１〜２ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３または１．５〜２×１０５の照射した刺激細胞のどちらかで、種々の抗血清またはサイトカインの存在または非存在下で処理した。３日後（ＰＨＡまたはＯＫＴ３活性化）または５日後（ＭＬＲ）、細胞を３Ｈ−チミジンでパルスし、採取しそして計数した。
【０１３６】
（ＬＴ−αおよびＬＴ−βのさらなる精製）
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で培養し、５０ＬのＲＰＭＩ培地から細胞を採取し、４×１０６細胞／ｍｌの濃度になるよう培地に再懸濁し、そして５０ｎｇ／ｍｌ ホルボールミリストイルアセテート（ＰＭＡ）を添加した。６時間の活性化の後、遠心分離により細胞を採取し、そしてＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。２００ｍｌの冷溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０；０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ベンズアミジン、各１０μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（アプロチニン、キモスタチン、ロイペプチン、アンチパイン）、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド）中に最終的に４×１０１０細胞の細胞ペレットを懸濁し、このペレットを一回窒素キャビテ一ターに通した。溶解した細胞を、５０．２ Ｔｉローターで４０，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、１％ ｗ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ４０デタージェントを含む１２０ｍｌの溶解緩衝液中で一晩抽出し、そして次に上記の様に遠心分離した。
【０１３７】
Ａｆｆｉ−ｇｅｌ １０（ＢｉｏＲａｄ）に結合しているモノクローナル抗リンホトキシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した抗腫瘍壊死因子−β）からなる２ｍｌのアフィニティー樹脂に、デタージェントで可溶化した膜タンパク質を含む上清を添加し、そしてこの懸濁液を一晩振とうした。樹脂を小さなカラムに集め、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、そして次に１％ ｗ／ｖ ＭＥＧＡ−８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む同じ緩衝液で洗浄した。５０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．５中の１％ＭＥＧＡ−８で、結合したタンパク質を溶出し、そして画分を直ぐにＴｒｉｓ塩基で中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色により、画分中のｐ３３およびＬＴの存在を決定した。これらのタンパク質を含む画分をプールし、そしてＳＤＳを最終濃度０．１％ ｗ／ｖになるまで添加し、そして０．１×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＭＥＧＡ−８デタージェントを除去するために様々に変化している）でこのプールを透析した。透析した溶液を凍結乾燥し、そして元の水の１／１０量に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にサンプルをロードし、ＰｒｏＢｌｏｔメンブラン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にブロットし、そしてクマシーブルー染料で染色した。
【０１３８】
このスキームは、 ブロット上のバンドでＬＴ−βを精製可能にする。当業者がイオン交換クロマトグラフィーによりアフィニティー樹脂から溶出したタンパク質を分離することは可能であるべきである。例えば、複合体を尿素で解離し得、そしてＬＴ−αおよびＬＴ−βタンパク質を、例えば１％非イオン性デタージェント（例えば、ＭＥＧＡ−８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および尿素を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液ｐＨ８．０中で、ＭＯＮＯ Ｑ ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陰イオン交換クロマトグラフィーにより、塩勾配溶出を用いて分離し得る。このクロマトグラフィーの技術は、タンパク質の異なった電荷に基づいて分離する。２種類のタンパク質は、等電点電気泳動実験（上記参照）で電荷の差異に基づいて分離され得、このとき尿素を使用し、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体を解離する。このようなアフィニティークロマトグラフィー、尿素／非イオン性デタージェントでの解離、およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せは、可溶性ＬＴ−βまたはＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の精製を可能にする。
【０１３９】
（ペプチド配列決定アッセイ）
ＰｒｏｂｌｏｔからＬＴ−βおよびＬＴ−αバンドを切り出し、タンパク質シークエンサーにロードした。１２０Ａ ＰＴＨアミノ酸分析機と連結した、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシークエンサーモデル４７０Ａを用いて、Ｅｄｍａｎ分解によりＮ末端の配列の情報を得た。ＬＴ−βを上記の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてトリプシン断片の配列を得た。［Ａｂｅｒｓｏｌｄら、「インサイチュ後の一次元または二次元ゲル電気泳動により分離したタンパク質の内部アミノ酸配列分析、ニトロセルロース上でのプロテアーゼ切断」ＰＮＡＳ，８４，６９７０−６９７４（１９８７）を参照のこと］。すなわち、インサイチュでブロット上のタンパク質をトリプシンで切断し、切断したペプチドの逆相ＨＰＬＣ解析を行った。得られたＮ末端および内部のトリプシン断片ペプチドを、次にＥｄｍａｎ分解により配列決定した。Ｔ１０５、Ｔ８７／８８、Ｔ１００、およびＴ６７と呼ばれるＮ末端および内部のペプチドの配列決定を図１３に示す。
【０１４０】
（オリゴヌレオチドプローブの構築）
Ｔ８７／８８の配列から、以下のアンチセンスプローブを設計した：
１３６８ ＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号９］
１３６９ ＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号１０］
そして標準方法により合成した。［例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版．（１９８９）を参照のこと］。
【０１４１】
（誘導されたＩＩ−２３ ｃＤＮＡライブラリーの調製）
ｃＤＮＡサブライブラリーを以下のように調製した：
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を６時間、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで刺激し、ＬＴ−β ｍＲＮＡの存在を確認した。これらの細胞からｍＲＮＡを単離し、そして当該技術分野で周知の技術を用いてそれを逆転写しｃＤＮＡにした。［Ｂ．ＳｅｅｄおよびＡ．Ａｒｕｆｆｏ、「迅速免疫選択方法による、ＣＤ２抗原、Ｔ細胞赤血球レセプターの分子クローニング」ＰＮＡＳ、８４，３３６５−３３６９（１９８７）］。標準手法を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを以下の配列を有するＮｏｔＩ−ＢｓｔＸＩリンカー／アダプターに連結した：
【化１】
【０１４２】
次に４．２ｍｌの５〜２０％酢酸カリウム勾配、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド、Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）ＳＷローターで、５０，０００ｒｐｍ、２２℃にて３時間標準方法によりｃＤＮＡをサイズ選択した。５００塩基対より大きなｃＤＮＡ断片をプールした。次いで、ベクター、ｐＣＤＭ８（Ｂｒｉａｎ Ｓｅｅｄ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から供与された）を調製した。このプラスミドをＢｓｔＸＩで切断した。４００塩基対のスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを除去するために、この混合物を上記の様に酢酸カリウム勾配で遠心分離し、そしてより大きなフラグメントを単離した。このフラグメントをアガロースゲル電気泳動によりさらに精製し、そして次いでｃＤＮＡをベクターに連結した。この方法で、誘導したＩＩ−２３．Ｄ７細胞で発現したｍＲＮＡに対するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を作製した。これらのプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１ Ｐ３を形質転換した。ＰＭＡ誘導したＩＩ−２３．Ｄ７ ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを有する、１×１０６以上の組換えクローンのコレクションを得た。
【０１４３】
（スリーニングおよびクローンのＤＮＡ配列決定）
ｐＣＤＭ８ ＩＩ−２３．Ｄ７ライブラリーを３２Ｐ標識したオリゴマー１３６８でスクリーニングし、ポジティブなクローンを単離し、３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで５０℃にて洗浄した。［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）；Ｊａｃｏｂｓら、「テトラアルキルアンモニウム塩溶液中の配列非依存の二本鎖オリゴヌクレオチドの熱安定性：組換えＤＮＡクローンの同定への適用」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，１０，４６３７−４６４９（１９８８）］。０．９ｋｂの挿入物を含むいくつかのクローンをジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列分析に用いた［同上］。
【０１４４】
（ＬＴ−β ｃＤＮＡの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２またはコントロールプラスミドのクローン４（無関係なｃＤＮＡ挿入物を含むｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによりＣＨＯ ｄｈｆｒ−に導入し、ＣＨＯ細胞をヒトＬＴ−αで安定にトランスフェクトした。３日後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含みＣａ／Ｍｇを含まないＨａｎｋ溶液に取り出し、１０μｇ／ｍｌ コントロールＩｇＧ１または抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のどちらかを用いて上記の様にＦＡＣＳ分析のために染色し、次にＦＩＴＣまたはフィコエリスリンのどちらかで標識したヤギ抗マウス調製物と結合した免疫グロブリンを標識した。その他の実験では、これもまたｐＣＤＭ８ベクター中にある等量のヒトＬＴ−α ｃＤＮＡの存在または非存在下で、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＤＭ８中のクローン４またはクローン１２のいずれかのＬＴ−β ｃＤＮＡでエレクトロポレーションし、上記のように３日後ＦＡＣＳ分析のために染色した。
【０１４５】
（ＬＴ−βの発現のノーザン分析）
ポリＡ＋ ＲＮＡをＩＩ−２３．Ｄ７細胞または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）のどちらかでＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供されたＦａｓｔ−ＴｒａｃｋＴＭシステムを用いて単離した。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）に本質的には記載されているように、２μｇ／レーンのＲＮＡおよびホルムアミドゲルでの電気泳動を用いてノーザンブロットを調製し、次にＧｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎナイロンメンブラン上へ転写し、そしてＵＶ架橋した。ブロットを、ゲル精製したＬＴ−β ｃＤＮＡのランダムプライムＢｓｔＥＩＩ／Ｘｍｎ−Ｉフラグメント、あるいはヒトＬＴ−αまたはアクチンのフラグメントでプローブした。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで時間を変えて誘導し、そしてＬＴ−αおよびＬＴ−βの両方の発現が誘導されたことを見出した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地のみまたは１０００ユニット／ｍｌのＩＬ−２の存在下、あるいはＴ細胞を活性化するＯＫＴ３とともに培養した。
【０１４６】
（ＬＴ−βの５’末端の決定）
ｍＲＮＡの５’の配列をプライマー伸長分析により決定した。［Ｂ．Ｗａｌｌｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０，７７−８１（１９８６）．］オリゴヌクレオチドプライマー（プローブ３６０−１２１ ５’ＧＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡ−３’）［配列番号１３］を用いたプライマー伸長により、約１２８〜１３０ｂｐの産物を得た。これは、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ方法論［Ａ．ＭａｘａｍおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，「塩基特異的化学開裂を用いる末端標識ＤＮＡの配列決定」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８８）］を用いた配列決定により、メチオニンＡＴＧの７〜９ｂｐ上流にある転写開始部位を示した。一時的な実験でクローン１２により示された発現は、１つまたは両方のＬｅｕ−４またはＬｅｕ−６の開始部位は機能的であることを示した。ｍＲＮＡの５’配列を証明するために、コスミドクローン、０３１Ａ［Ｓｐｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３，２１４（１９８９）］をいくつかの制限酵素で切断し、電気泳動し、ブロッティングし、そしてＬＴ−β ｃＤＮＡのＢＳＴ Ｅ２／Ｘｍｎ−１フラグメントでプローブした。コスミドは、６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント内にＬＴ−β遺伝子を含有した。ＥｃｏＲＩフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＮＮ１０９と呼ぶｐＵＣ誘導体にサブクローニングした。ジデオキシ核酸配列決定により完全なゲノム配列を得た。
【０１４７】
（実施例１：Ｔ細胞がその表面にＬＴ−関連エピトープを発現する）
上記の条件下で、ヒト末梢単核細胞（ＰＭＮ）を、ＯＫＴ３モノクローナル抗体で活性化し、培養の２日後に、フローサイトフルオロメトリー分析によって、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合関連形態の発現について分析した。１つの実験（結果は図１に示す）で、新鮮なＰＢＬをＯＫＴ３およびＩＬ２とともに３日間培養し、それらを、未変性ｒＬＴ−α（それぞれ、ウサギ４および５由来である、図１の「ＬＴ−４」および「ＬＴ−５」パネル）、変性ｒＬＴ−α（ウサギ６由来である、図１の「ＬＴ−６」パネル）、および未変性ｒＴＮＦ（ウサギ７由来である、図１の「ＴＮＦ」パネル）に対して１：２００希釈の抗血清で染色した。細胞を、各動物からの免疫後の血清（図１のパネルの実線）あるいは免疫前の血清（図１のパネルの破線）で染色した。図１は、ウサギ４および５由来の抗ｒＬＴ−α血清のみが、活性化末梢Ｔ細胞上のエピトープを認識したことを示す。
【０１４８】
図２に示す実験では、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を１５時間、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで処理するかあるいは処理せずに、それらを、図１に記載の実験のように、ウサギ４抗ｒＬＴ−α免疫後の血清（図２のパネルの実線）、あるいはウサギ４免疫前の血清（図２のパネルの破線）で染色した。図２に示すように、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激でＬＴ−αを合成するＴ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７が、ＰＭＡ活性化で表面ＬＴ−関連エピトープを発現することを認めた。
【０１４９】
Ｔ細胞上のＬＴ−α関連エピトープは、ＬＴに関連し、組み換えＬＴ−α調製物由来のＣＨＯ細胞中のなんらかの夾雑物に関連しないことを確認するために、ＰＭＡ活性化し洗浄したＩＩ−２３．Ｄ７あるいはＵ９３７細胞で、ウサギ４由来の抗血清の１：１０００希釈物を処理した。図３に示す実験では、抗ｒＬＴ−α血清（１：１０００抗ＬＴ−４）の試料１ｍｌを、細胞を含まない（−−）、１×１０８ Ｕ９３７細胞（−〇−）、１×１０８（−−）ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞、あるいは１×１０７（−−）ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のいずれかで処理した。吸収抗血清の希釈物を、Ｌ９２９細胞障害性アッセイで限定量のｒＬＴ−αに加えて、最初のウエルに１：４０００の最終希釈物が存在するようにした。このアッセイは、２４時間以内に、マウス繊維芽細胞株Ｌ９２９を殺すＬＴ−αの能力を測定する［Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒｅａｄｅ，Ｃ．Ｆ．Ｗａｒｅ，「細胞生存性についての迅速な比色アッセイ：細胞障害性および増殖阻害性リンホカインの定量への適用」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０，２５７（１９８４）］。２４時間後に、細胞生存率をＭＴＴ読み取りによって評価した。図３のプロットは、吸収抗血清の希釈に対する吸光度（細胞生存率に比例する）である。データは、２つのウエルの平均であり、２つは概して、符号で示されている範囲内に存在する。図３に示されているように、標準Ｌ９２９細胞障害性アッセイでの吸収抗血清中和力価の分析は、Ｕ９３７細胞は効果がないが、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞が、ＬＴ−α中和抗体を除去することを実証した。これらのデータは、膜表面の抗原構造が実質的にＬＴ−αに関連することを示す。
【０１５０】
ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７を、Ｔ細胞表面のＬＴ−α関連エピトープの明確な存在についての多くの平凡な説明を確かめるために、さらなる多くの処置を行った。まず最初に、抗血清中のＬＴ−α：抗体複合体が、ハイブリドーマ上のＴＮＦ／ＬＴ−αレセプターに結合し得る可能性を除外した。ＴＮＦおよびＬＴ−αの両方は、複合体中の抗体結合エピトープの存在を考慮し得る三量体構造を有する。しかし、細胞ＴＮＦレセプターの可溶性ＴＮＦあるいはＬＴ−αでの前飽和は、表面染色には効果はなかった。このような飽和は、このような免疫複合体のこのようなレセプターヘの結合を妨害した。
【０１５１】
結合されたＴＮＦをそのレセプターから解離し得る、ｐＨ３の乳酸処理は、シグナルには影響しなかった。このことは、ＬＴ−αがレセプター結合されないことを示唆する。しかし、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞へ結合する１２５Ｉ−ＬＴ−αを使用する実験は、レセプター結合ＬＴ−αが、ＴＮＦよりも酸性ｐＨではそのレセプターから解離させるのはより困難であることを示した。
【０１５２】
染色前の細胞のおだやかなトリプシン処理は、シグナルの消失を導き、このことは、エピトープがタンパク質であることを示す。表面結合ＬＴ−αがフォスファチジルイノシトール結合されたかどうかを決定するために、細胞をフォスファチジルイノシトール特異性フォスホリパーゼＣで処理した。ＰＩ−結合抗原ＬＦＡ−３が解離され得る条件下［Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｔ細胞赤血球レセプター（ＣＤ２）のモノクローナル抗体およびリガンド結合部位」Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４２（１９８７）］で、ＬＴ−αエピトープには効果が認められなかった。
【０１５３】
ＬＴ−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、（前ＰＭＡ活性を伴うか、あるいは伴わない）染色し得なかった。このことは、ウサギを免疫するのに使用された、もともとのｒＬＴ−α中のＣＨＯ由来の夾雑物に対する抗体が、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の染色に寄与するのに十分な量が存在しなかったことを示す。同様に、任意のウシ胎児血清タンパク質を夾雑するＬＴ−α調製物に対して誘起された抗体は、染色が１０％ウシ胎児血清中で実施されたので、Ｔ細胞染色には影響しなかった。
【０１５４】
抗ｒＬＴ−α血清のｒＬＴ−αでの前処理は、ｒＴＮＦでの前処理では阻止しなかったが、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞上のＬＴ−α形態の染色を阻止した。
【０１５５】
（実施例２：Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７上のＬＴ−α関連タンパクの免疫沈降）
ＰＭＡで活性化したＩＩ−２３．Ｄ７細胞を表面ヨウ素化し、溶解してデタージェントで可溶化した。標識膜タンパク質の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２つのタンパク質が抗ｒＴＮＦ−α抗血清により認識されることを示した。図４Ａは、免疫前（ＰＲＥ）あるいは免疫後（ＰＯＳＴ）抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４由来）のいずれかで免疫沈降されたヨウ素化表面タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【０１５６】
図４Ａに示されているように、ＬＴ−αの推定の大きさと相関する２５〜２６ｋＤ分子量形態（「ＬＴ−α」）を認め、そして、約３３ｋＤの別の形態（「ＬＴ−βあるいはｐ３３」）を認めた。同じウサギ由来の免疫前血清（図４ＡのＰＲＥの欄）および抗ｒＴＮＦウサギ血清のどちらもが、ヨウ素化ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞由来のどのバンドも免疫沈降させ得なかった。
【０１５７】
ヨウ素化バンドの１−Ｄ部分ＣＮＢｒペプチドマッピングは、２５〜２６ｋＤ形態が、ヨウ素化ｒＬＴ−αと同じパターンで切断されることを示した。従って、このバンドをＬＴ−αと同定した。図４Ｂに示す実験で、パネルＡ由来の２５〜２６ｋＤおよび３３ｋＤのバンドを切り出し、制限ＣＮＢｒ切断およびＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムでの電気泳動にかけた。比較のために、並行して行ったｒＴＮＦおよびｒＬＴ−αの両切断を図４Ｂに示す。ゲルをオートラジオグラフィーによって可視化した。レーン１はｒＴＮＦを示し、レーン２はｒＬＴを示し、レーン３はＬＴを示し、そして、レーン４は、ＬＴ−βを示す。ＣＮＢｒフラグメントの増大された大きさは、天然ＬＴ−βの炭水化物量の増加を反映する。ヨウ素化３３ｋＤ形態はＣＮＢｒで切断されず（レーン４）、このことは、既知ＬＴ−α遺伝子生成物とは異なることを示す。ｒＴＮＦは、このタンパク質中にメチオンが存在しないので、ＣＮＢｒでは切断されなかった（レーン１）。
【０１５８】
免疫沈降と組み合わせて、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインでの代謝標識を行って、これらのＬＴ−α関連表面形態のさらなる特徴付けを行った。ＴＮＦ／ＬＴ−αペアの場合には、システインおよびメチオニン分布は、ＴＮＦとＬＴ−αとの間、および、シグナル配列を伴う形態と伴わない形態との間の両方の区別を可能にし、これは、膜ＴＮＦ形態の研究で活用された［Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，５３，４５〜５３頁（１９８８）］。完全にプロセシングされたサイトカイン、すなわち、分泌形態の場合には、ＴＮＦはシステインを含有し、メチオニンを含有しないが、ＬＴ−αはメチオニンのみを含有し、システインを含有しない。しかし、ＬＴ−αは、シグナル配列ドメイン中に２つのシステイン残基を含有し、ＴＮＦは、Ｎ末端領域に１つのメチオニン残基を含有する。ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞の分離培養物を、３５Ｓ−メチオニンあるいは３５Ｓ−システインのいずれかで標識し、免疫反応タンパク質を沈降させた。実験では（結果は図５に示す）、ＩＩ−２３．Ｄ７細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで活性化し、次に、８時間、３５Ｓ−メチオニンあるいは３５Ｓ−システインで標識した。培地および溶解細胞の両方を、免疫前（ウサギ４）（Ｐ）、抗ｒＴＮＦ（Ｔ）、および抗ｒＬＴ−α（ウサギ４）（Ｌ）血清の順で、連続して免疫沈降を行った。図５は、分泌タンパク質を含有する上清あるいは洗浄細胞の、免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー分析を示す。”ｓ−ＴＮＦ”は、３５Ｓ−メチオニン標識の細胞由来の抗ｒＴＮＦ免疫沈降されたバンドを示し、ＴＮＦのプロセシングされていない２６ｋＤ形態と推定される。”Ｍｅｔ”および”Ｃｙｓ”は、使用した３５Ｓ−標識アミノ酸のことである。３５Ｓ−システイン含有のそれらのレーンを、３５Ｓ−メチオニン含有レーンより長時間露光した。これらの細胞からの上清では（「分泌された」と記されたレーン）、２５ｋＤ形態のＬＴ（「ＬＴ−α」）は、ＰＭＡ処理後に、３５Ｓ−メチオニン標識された細胞により放出されるが、３５Ｓ−システイン標識細胞によっては放出されない。このパターンは、完全にプロセシングされ、分泌されたＬＴ−αと予測される。より長時間の露光は、上清に極少量のＴＮＦを示し、標識の取り込みは、完全にプロセシングされた分泌ＴＮＦに対して予測された通りであった。ｍＲＮＡレベルでもまた、低いＴＮＦレベルでの優先的なＬＴ−α発現を認めた（ＳｈａｍａｎｓｋｙおよびＷａｒｅ、未公開情報）。洗浄細胞の分析（「細胞の」と記されたレーン）は、３３ ｋＤ ＬＴ−βを伴って、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−αの両方が存在することを示した。２５〜２６ｋＤおよび３３ｋＤ形態の相対的な量は、表面ヨウ素化により認められたものに相当した。２５〜２６ｋＤ表面ＬＴ−α形態はシステインを含まず、このことは、リーダー配列のプロセシングを示す。３３ｋＤ形態は、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインの両方を取り込んだ。図５に示したフィルムのより長時間の露光（示されていない）は、約２６〜２７ｋＤで細胞からの抗ＴＮＦ免疫沈降されたバンドの存在を示した。バンドは、標識システインおよび標識メチオニンの両方の取り込みを示した。標識はシステインによって、より強かった。２６ｋＤ−ＴＮＦ形態ではｃｙｓ：ｍｅｔ比率は４：１であるので、この標識パターンは、このバンドの同一性を確実にする。
【０１５９】
細胞溶解物からの免疫沈降物中のＬＴ−αを伴ったＬＴ−βの存在は、ＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αに関連すること、あるいはＬＴ−βがＬＴ−αに結合されることのいずれかあるいは両方を示唆した。この論点に的を絞るために、３５Ｓ−メチオニン標識細胞由来の２５ｋＤおよび３３ｋＤのバンドを、ウサギポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清で免疫沈降させ、切り出したゲル切断片から溶出して、抗ｒＬＴ−αポリクローナル血清あるいはｍＡｂで再度免疫沈降させた。ＬＴ−βではなくＬＴ−αが、抗ｒＬＴ−α抗体で免疫沈降され得、このことはＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αに関連しないことを示唆する。これらの観察は、ＬＴ−βがＬＴαと物理的に結合することを示した。３３ｋＤのタンパク質は、抗原的にＬＴ−α関連せず、単にＬＴ−αと共に沈降されることを示した。
【０１６０】
表面ヨウ素化あるいは代謝標識のいずれかでは、ＬＴ−αあるいはＴＮＦに結合した、既知の５５あるいは８０ｋＤ ＴＮＦ／ＬＴ−αレセプター形態のいずれも検出され得なかった。おそらく、これは、レセプターが、Ｔ細胞の活性化の間に急速に費やされるからである。［Ｃ．Ｗａｒｅら、「腫瘍壊死因子によるＣＴＬ溶解経路の調節」Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｔ．ＬｏｔｚｅおよびＯ．Ｊ．Ｆｉｎｎ編 第１３５巻，１２１〜１２８頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１９９０］。
【０１６１】
（実施例３：ＩＩ−２３．Ｄ７細胞上の表面ＬＴ−形態の生化学的特徴付け）
ＰＭＡ処理したＩｌ−２３．Ｄ７細胞表面のＬＴ−関連形態を、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。免疫沈降法によって、ＬＴ−βおよびＬＴ−αがレンズマメレクチンセファロースに結合すること（このことは糖タンパク質構造を示す）に注目した。デタージェントで可溶化し、ＰＭＡ処理したＩＩ−２３．Ｄ７タンパク質を、レンズマメレクチンセファロースに結合し、アフィニティー精製の前にα−メチルマンノシドで溶出した。抗ｒＬＴ−α血清によって特異的に認識されるこれらのタンパク質を、さらに正確に評価するために、コントロールＩｇＧおよび抗ＩｇＧカラムの両方を調製した。カラムを低ｐＨで溶出することにより、抗ｒＬＴ−αカラムから約１００〜２００ｎｇの２種のＬＴ形態が放出された。
【０１６２】
図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）あるいは免疫後（ＰＯＳＴ）ウサギ血清から調製された抗ｒＬＴ−αアフィニティーカラムから溶出されたタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。図６Ｂでは、パネルＡ中のゲルから３３ｋＤおよび２０ｋＤのバンドを切り出し、制限ＣＮＢｒ切断およびＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムでの電気泳動にかけた。比較のために、図６Ｂは、並行して行ったｒＴＮＦおよびｒＬＴ−α（ＣＨＯ由来）のＣＮＢｒ切断を示す。銀染色によってゲルを可視化した。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、免疫沈降された表面ヨウ素化ＰＭＡ処理のＩＩ−２３．Ｄ７細胞のゲルによく類似し、このことは類似のタンパク質が精製されたことを示す。
【０１６３】
アフィニティー精製の間に、２５ｋＤのＬＴ−α形態は、１９〜２０ｋＤ形態に切断されるようである。すなわち、それは、未処理の組み換えＣＨＯ細胞由来のＬＴ−αとともに移動した。ＲＰＭＩ １７８８腫瘍株由来の天然ＬＴ−αの最初の単離もまた、Ｎ−末端切断された「ｄｅｓ−２０」ＬＴ−α形態を生じた。アフィニティー精製したタンパク質の一次元ＣＮＢｒ分解物は、切断された２０ｋＤのＬＴ−α形態が、おそらくこのＬＴ−α形態の切断型特性を反映するＣＮＢｒ切断パターンを有することを示した。メチオニンの１つが、「ｄｅｓ−２０」ＬＴ−α形態では消失し、ゆえに、切断パターンは未処理のＬＴ−α形態とは異なる。３３ｋＤのタンパク質（ＬＴ−β）は、ＣＮＢｒ切断で２つになるので、このことから、１つのメチオニンはＣあるいはＮ末端から５〜２０残基以内に存在しなければならないことが推定された。この切断パターンは、３３ｋＤのタンパク質が既知のＬＴ形態と著しく異なることを示す。表面ヨウ素化３３ｋＤタンパク質のＣＮＢｒ切断分析は、恐らく類似の結果を与えたが、しかし、ヨウ素化で達成され得る解像は、その２つを十分に現らわさなかった。ヨウ素化ｒＬＴ−α、ｒＴＮＦ、およびＩＩ−２３．Ｄ７ ＬＴ形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＶ８分解は、分解に対して耐性であるべきｒＬＴ−αおよび２５〜２６ｋＤＫ ＩＩ−２３．Ｄ７ ＬＴ−α形態を示した。このことは、このタンパク質がＬＴ−αであることを確実にした。３３ｋＤのタンパク質を、ｒＴＮＦによく類似するパターンを有する、数個の小さなフラグメントに切断した。
【０１６４】
図７では、免疫沈降された表面ヨウ素化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分離し、表面結合２５〜２６ｋＤのタンパク質（「ｓＬＴ−α」）および３３ｋＤのタンパク質（「ＬＴ−β」）のバンドを切り出した。切断片を、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−Ｇｌｙ）、ノイラミニダーゼとＯ−グリカナーゼ（Ｏ−Ｇｌｙ）との混合物、あるいは３つ全ての酵素で分解した。分解した切断片を、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、乾燥ゲルのオートラジオグラムを示す。図７に示したように、ヨウ素化表面ＬＴ形態の免疫沈降、その後の、Ｎ−グリカナーゼあるいはＯ−グリカナーゼのいずれか、またはその両方での分解で、２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態が、Ｎ−連結オリゴ糖を含有することを示した。２５−２６ｋＤ ＬＴ−α形態は、Ｎ−グリカナーゼ分解での大きさの変化に関連する１つのＮ−連結部位のみを有する。同様に、３３ｋＤ形態（ＬＴ−β）は、Ｎ−グリカナーゼ処理で約３ｋＤの大きさを消失した。このことは、１つのＮ−連結オリゴ糖の存在を示唆する。２５〜２６ｋＤ ＬＴ−α形態に対して、Ｏ−グリカナーゼ処理は、ＬＴ−βの分子量に影響を与えなかった。しかし、グリカナーゼによる切断がないことは、炭水化物の存在を欠く明白な証拠ではない。
【０１６５】
（実施例４：ＬＴ−αの再免疫沈降）
ＬＴ−βのＬＴ−αとの共沈降は、これらのタンパク質が抗原的に関連するか、あるいは物理的に結合されることを示唆した。この確認のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離されたＬＴ−α（ｐ２５）およびＬＴ−βタンパク質が免疫沈降され得るかどうかを試験した。１２５Ｉあるいは３５Ｓ−Ｍｅｔで標識されたＬＴ−αおよびＬＴ−βを、免疫沈降によって部分精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。標識されたバンドを切り出し、緩衝液中で再度水和し、タンパク質を溶出した。次に、溶出タンパク質を、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体を用いて、第二回目の免疫沈降を行った（図１０）。ウサギ抗ｒＬＴ−αは、ＬＴ−α（「ｐ２５」、レーン２）を再免疫沈降させたが、ＬＴ−βはさせなかった（レーン３）。抗ｒＬＴ−α ｍＡｂは、ＬＴ−α（レーン５）および２１ｋＤのタンパク質（「ｐ２１」、レーン４）を沈降させた。これは、下記に示すように、ＬＴ−αの前駆体であるが、しかし、ＬＴ−βを沈降させなかった（レーン６）。結果は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された後に、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ｒＬＴ−α両抗体が、ＬＴ−αと反応し得るがＬＴ−βとは反応し得ないことを示す。このデータは、ＬＴ−βが抗原的にＬＴ−αと関連しない証拠を提供する。しかし、ＬＴ−αエピトープは完全なまま残存するが、推定のＬＴ−β交差反応エピトープが、変性後に消失される可能性は除外され得ない。
【０１６６】
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出された、１２５Ｉ標識および３５Ｓ−Ｍｅｔ標識のｐ２５およびｐ３３タンパク質の再免疫沈降の結果を示す。１２５Ｉ標識ＩＩ−２３．Ｄ７細胞（レーン２、３）および３５Ｓ標識細胞（レーン４、５、６）由来のＬＴ−αおよびＬＴ−β種を、上記のようにゲル切断片から溶出した。溶出物を、抗ｒＬＴ−α血清（レーン２、３）あるいは抗ｒＬＴ−α ｍＡｂ（レーン４、５、６）のいずれかで免疫沈降し、再沈降されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで分析した。レーン１は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βの同定のためのコントロールレーンである。
【０１６７】
（実施例５：ＬＴ−αおよびＬＴ−βの等電点電気泳動）
図９および１０（各々は、オートラジオグラフ（９Ａ、１０Ａ）、および移動距離対ｐＨをグラフにした検量線を含む（９Ｂ、１０Ｂ））は、変性（図９）および未変性（図１０）条件下での等電点電気泳動分析を示す。ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物から免疫沈降された、１２５Ｉ標識ＬＴ−αおよびＬＴ−βについて、上記のように、二次元ゲル分析を行った。２−Ｄゲル分析を、尿素が存在する変性条件下で実施した（図９Ａ）。これに対し、未変性ＩＥＦを、尿素を含まない１％ ＮＰ−４０中で行った。１２５Ｉ標識ＩＩ−２３．Ｄ７細胞抽出物を、４℃でチューブゲルで泳動させた。泳動後に、チューブゲルを１ｃｍ切断片に切断し、泳動されたタンパク質をこれらの切断片から溶出し、免疫沈降して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０Ａ）。ゲルレーン１〜１２から免疫沈降された物質は、チューブゲル切断片の２〜１３に対応する。１ｃｍゲル増大量に基づいて変性および未変性チューブゲルに対してｐＨ勾配を実施した。これらもまた、それぞれに９Ｂおよび１０Ｂとして下にオートラジオグラムを示す。生化学的に、ＬＴ−βおよびＬＴ−αは、非変性等電点電気泳動ゲル上で共に移動するが、複合体が尿素により解離されると、２つのタンパク質は別々に移動する。［図９Ａ、１０Ａを参照］これらの観察は、ＬＴ−αおよびＬＴ−βが細胞表面に複合体として存在するという結果を導く。
【０１６８】
（実施例６：ＬＴ−α発現の制御）
以下に示す表Ｉは、ＬＴ−αの表面形態発現についての、種々の細胞タイプのフローサイトフルオロメトリー分析による調査結果のまとめである。
【０１６９】
【表Ｉ】
これらの研究の際だった観察は、ＴおよびＢ細胞に対する表面ＬＴ−α発現の制限であった。ｌｅｕ−Ｍ３、単球マーカーおよびｌｅｕ−４（ＣＤ３）抗体を、各細胞群を別々に観察するために、二色フローサイトフルオロメトリー分析に使用した。この分析で、表面ＴＮＦと表面ＬＴ−αと間に際だった相違が存在した。ここで、Ｔ細胞は表面ＬＴ−αのみを示したが、単球は表面ＴＮＦのみを発現した。この結果を図１１に示す。
【０１７０】
図１１に示されている実験では、ＰＢＬを、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、インターフェロン−γ（２００Ｕ／ｍｌ）、およびＯＫＴ３（１ｎｇ／ｍｌ）の混合物で８時間処理し、次に、ＬＴ−α（ウサギ５由来の抗ｒＬＴ−α血清）あるいはＴＮＦ（ウサギ７由来の抗ｒＴＮＦ血清）に対して染色し、その後、ＦＩＴＣ抗ウサギ標識を行った。細胞を、フィコエリスリン−ｌｅｕ−４、ｐａｎ Ｔ細胞マーカー、あるいはフィコエリスリン−ｌｅｕ−Ｍ３、単球マーカーで逆染色した。「Ｔ細胞パネル」をｌｅｕ−４＋に対してゲートし、一方、「単球」パネルをｌｅｕ−Ｍ３＋細胞に対してゲートした。細胞を、免疫前（破線）あるいは免疫後（実線）の血清で染色した。単球腫瘍株ＨＬ−６０およびＵ９３７はＬＴ−αを染色しなかった。二色フローサイトフルオロメトリー分析によって、活性化ＰＢＬのＴ４およびＴ８サブクラスが、同レベルの表面結合ＬＴ−αを示すことが認められた。一般的に、ＬＴ−αを発現し得る一次Ｔ細胞もまた表面ＬＴ−α形態を示し得るようである。
【０１７１】
３人の異なるヒトドナーの実験は、表面ＬＴ−α形態が用時単離された末梢Ｔ休止細胞に存在することを示した。ＰＢＬの場合には、細胞のＯＫＴ３活性化あるいは単なるＩＬ−２処理が、発現の増大を導いた。蛍光チャネル数により、ＯＫＴ３活性化の間の表面ＬＴ−αおよびＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）発現の両方の定量を試みた。ＯＫＴ３による表面ＬＴ−αの最大誘導が、大量培養でＩＬ−２レセプターのピーク発現（ＴＡＣ発現）に先行するようであり、従って、表面結合ＬＴ形態（ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体）は、初期Ｔ細胞活性化抗原のようである。抗Ｔ１１および同種異系抗原の両方が、クローン化細胞障害性Ｔ細胞表面にＬＴ−αを生じ得ることが見い出された。同様に、ＰＭＡ刺激は、ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ表面でのＬＴ−α出現の誘導に必要であった。Ｔ細胞活性化が表面ＬＴ−α形態を増加させるようである。ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマに比較して、末梢リンパ球は、ＰＭＡ処理後に急速に表面ＬＴ−α形態を下降制御する。同様に、ＯＫＴ３活性化ＰＢＬ群の二色分析では、活性化の前進段階でＴ細胞を含むはずであるＤｒ＋細胞は、表面ＬＴ−α形態を欠いた。
【０１７２】
新鮮なＰＢＬの高レベルＩＬ−２での活性化は、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）を生じた。図１２に示されているように、抗ｒＬＴ−αおよびｌｅｕ−１９、ＮＫ／ＬＡＫ細胞マーカーを用いた二色フローサイトフルオロメトリー分析は、表面ＬＴ−α形態のＬＡＫ細胞発現が、Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７に類似することを示した。図１２に示されている実験では、ＰＢＬを、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２とともに５日間培養し、次に二色分析のために、上記のように、フィコエリスリン標識ｌｅｕ−１９および抗ｒＬＴ（ウサギ５）で染色した。図１２は、免疫前（破線）あるいは免疫後（実線）血清で染色した、ｌｅｕ−１９＋細胞上の表面ＬＴ−αレベルを示す。従って、ＬＡＫ細胞は、あらゆる一次細胞形態中で最も高い表面ＬＴ−αレベルを有するようである。
【０１７３】
（実施例７：全ＴＮＦあるいはＬＴ−αのＴ細胞活性化との機能関連性）
ＴＮＦおよびＬＴ−αのＴ細胞活性化プロセスとの機能関連性を調べるために、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）およびＯＫＴ３活性化アッセイに、ウサギ抗ｒＬＴ−αおよび抗ｒＴＮＦ血清を包含させた。ＭＬＲは、個人のＴ細胞が、他人のＴ細胞を外来物として認識し、増殖によるその存在に応答する能力を試験する、標準的な免疫学的アッセイである。以下の表ＩＩは、種々の応答細胞／刺激細胞の組合せを使用した、ＭＬＲ実験のデータを示す。
【表ＩＩ】
【０１７４】
表ＩＩに示したように、中和抗ｒＬＴ−α血清（ウサギ４および５）は、５日目に評価されるように、増殖応答を阻害したが、免疫前血清あるいは非中和抗ｒＬＴ−α（ウサギ６）血清は軽い刺激効果を有した。以前に報告されたように［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，４９９（１９８８）］、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＴＮＦ調製物もまた阻害性であった。これらのアッセイを、過剰刺激細胞条件で行った。従って、阻害は最適化され得ない。表ＩＩ中で使用した血清レベルは、その他の実験（データは示していない）よりかなり高く、１：１０００までの抗体希釈物はまだ阻害性であった。ＰＨＡあるいはＯＫＴ３刺激Ｔ細胞増殖もまた、より低い程度で阻害された（データは示さない）。これらのデータは、Ｔ細胞表面のＬＴあるいはＬＴ−関連エピトープが、Ｔ細胞活性化に関連し得ることを示した。
【０１７５】
ＭＬＲアッセイおよび中和モノクローナル抗体を用いた以前の研究は、Ｔ細胞活性化および次のこの系での増殖において、ＬＴ−αではなくＴＮＦに関係した。［Ｍ．Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，４９９（１９８８）］。その研究では、モノクローナル抗ｒＬＴ−α抗体は、ＭＬＲアッセイに効果がなかった。中和ポリクローナル抗ＣＨＯ細胞誘導ｒＬＴ−α血清が、部分的にＭＬＲを阻害し得ることが、われわれの研究で示され、そのことは、この系におけるなんらかのＬＴ形態に対する役割を示唆する。これらの抗体調製物の性質に相違が存在し得るが、この矛盾に対する理由は明確ではない。モノクローナル抗体を、グルタルアルデヒドに架橋結合された天然のＬＴ−α（ＲＰＭＩ １７８８分泌の）に対して産生し、一方、ポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清は、未変性ｒ−ＬＴ−α（組み換えＣＨＯ細胞由来の）を、フロイントアジュバントともに直接リンパ節に注射して調製した。後者の系の成果に対する貯蔵効果は、免疫化マウスにおいて報告された問題を考慮するとおそらく重要であった［Ｔ．Ｂｒｉｎｇｍａｎら、「ヒト腫瘍壊死因子αおよびβに対するモノクローナル抗体：アフィニティー精製、イムノアッセイヘの適用、および構造プローブとしての適用」Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，４８９（１９８７）］。これらのデータは、本発明のポリクローナル抗ｒＬＴ−α血清のＭＬＲにおけるブロック効果が、従来の可溶性ＬＴ−α形態の認識ではなく、血清による表面ＬＴ形態の認識の結果であることを示唆する。
【０１７６】
（実施例８：ＬＴ−αおよびＬＴ−βの精製およびの最初の配列決定）
上記のように、エドマン分解によって、ＬＴ−αおよびＬＴ−βのＮ末端配列情報を得た。膜結合ＬＴ−αバンドの配列を以下のように認めた：Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ。この配列は、分泌ＬＴ−αの既知配列に一致する。エドマン分解分析は、結合ＬＴ−βタンパク質のＮ末端部分が、２つの可能なアミノ酸配列を含むことを解明した：Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ＧｌｎあるいはＧｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ。次のＤＮＡ分析は、７サイクル目でグリシンがグルタミンとして誤って同定されたこと以外は、前者の配列を確認した。
【０１７７】
（実施例９：ＬＴ−β配列決定およびクローニング）
上記のように、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの方法によって、数個のペプチド配列の配列を得た。２つのアンチセンス１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブＧＴＹＴＣＮＧＧＣＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号：９］およびＧＴＹＴＣＮＧＧＴＴＣＹＴＣＹＴＣ［配列番号：１０］を、これらのペプチド、Ｔ−８７／Ｔ−８８の１つの配列部分と一致するように合成した。これらのプローブを、３２Ｐで放射性標識した。ノーザン分析（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９））は、プローブ１３６８（ＧＴＹＴＣＮＧＧＴＣＹＴＣＹＴＣ）［配列番号：１０］が、先に記載のように、ホルボールエステルで前処理されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞中で強く誘導される、０．９〜１．１ｋｂ ｍＲＮＡバンドに強くハイブリダイズしたことを示した。ベクターｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）のｃＤＮＡライブラリーを、ＰＭＡで６時間誘導されたＩＩ−２３．Ｄ７細胞から単離されたポリＡ＋ ｍＲＮＡから構築した［Ｂ．ＳｅｅｄおよびＡ．Ａｒｕｆｆｏ，ＰＮＡＳ，８４，３３６５〜３３６９（１９８７）を参照のこと］。ライブラリーを標識オリゴマー１３６８でスクリーニングし、ポジティブクローンを単離し、その後５０℃の３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。［Ｊａｃｏｂｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，１０，４６３７〜４６４９（１９８８）を参照のこと］。０．９ｋｂの挿入物を含有するいくつかのクローンを、ＤＮＡ配列分析にかけた。クローンｐＣＤＭ８／ＬＴ−β−１２（クローン１２）が、コーディング配列を含むことが認められた。その他のクローンは、１〜３０ｂｐの種々の５’末端切断型以外は同定された。１つの可能なクローン（クローン４）はフレームシフトを含み、トランスフェクション実験のコントロールとして使用された。８６２位の終止配列ＡＡＴＡＡＡが、ポリＡ区域の直前に見いだされ、このことは、全３’末端が同定されたことを示す。同定されたタンパク質配列は、計算上の分子量２５，３９０を有する少なくとも２４０アミノ酸、およびタイプＩＩ膜タンパク質の代表的なドメイン構造をコードする。このデータは、開始ＣＴＧが、ｇｌｙ ５（ｍｅｔ＝１）で始まるプロセシングされたＮ末端を導く、すなわち、ＣＴＧにコードされるロイシンが翻訳されないか、あるいは、ロイシン−４基がさらにプロセシングされて、アミノ酸配列決定で得られた成熟Ｎ末端を得ることを示唆する。
【０１７８】
ＬＴ−βの３３ｋＤａの大きさは、先に定義したようにＮ−結合グリコシル化に起因し、この結果は、ＣＤ４０リガンドに認められる同様の部位に一致する位置の、アミノ酸配列中の１つの可能なＮ−結合炭水化物部位の存在により、裏付けられる。代表的なＮ−結合糖残基は、約３〜４ｋＤａ ＭＷを付加し得、それゆえに、最終分子量は観察された３０〜３３ｋＤａに近い。
【０１７９】
同定されていない配列が、データベースで認められた。細胞外ドメインに１つのシステイン残基、および最後のＣ末端１７アミノ酸内に２つのメチオニンが存在し、このタンパク質で示される、非常に限定された臭化シアン切断パターンに一致する。
【０１８０】
（実施例１０：ＬＴ−βの発現）
ｐＣＤＭ８／ＬＴ−βクローン１２またはコントロールプラスミド、クローン４（非機能性ｃＤＮＡ挿入物を有するｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーションによって、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−およびヒトＬＴ−αで安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に導入した。３日後、細胞を、Ｃａ／Ｍｇを含まない、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有のハンクス液で取り出し、上記のように、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ１、あるいは抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用するＦＡＣＳ分析のために染色し、その後、ＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン標識ヤギ抗マウス調製物を用いる結合免疫グロブリンで標識した。
【０１８１】
別の実験で、ＣＯＳ細胞に、ｐＣＤＭ８中のクローン４あるいはクローン１２ ＬＴ−β ｃＤＮＡを、これもまたｐＣＤＭ８ベクター中の等量のヒトＬＴ−α ｃＤＮＡの存在下あるいは非存在下で、エレクトロポレーションし、上記のように３日後に、ＦＡＣＳ分析用に染色した。ＬＴ−αを発現するＣＯＳ細胞のみが、機能性ＬＴ−β ＤＮＡ、すなわちクローン１２でのトランスフェクションで、表面リンホトキシンを示した。
【０１８２】
クローン１２は、開始ＡＴＧコドンを欠くが、いくつかのＣＴＧ開始コドンを有し、それゆえに、この発現実験は、１つあるいはいくつかの５’ＣＴＧコドンが翻訳を開始し得ることを示す。ＣＴＧコドンは、数種の真核タンパク質での翻訳開始部位として作用することが知られている。［Ｍ．Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１５，４（１９９１）］。同様の結果が、ＬＴ−αおよびＬＴ−β ＤＮＡの両方を有するＣＯＳ細胞のみが、ＦＡＣＳ分析で実質的な表面ＬＴ−αを示すような二元トランスフェクション系を使用して観察された。
【０１８３】
ＩＩ−２３．Ｄ７細胞のノーザン分析は、ＬＴ−β ｃＤＮＡの０．９〜１．０ｋｂ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを示し、このことは、クローニングしたｃＤＮＡが転写される全遺伝子を本質的に表すことを示す。図１５を参照のこと。ＬＴ−β遺伝子は、非処理ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞において低レベルで発現されるが、しかし、ホルボールエステルによる細胞の活性化で、ｍＲＮＡレベルが劇的に増大した。図１６を参照のこと。
【０１８４】
（実施例１１：ＬＴ−βとリンホカインのＴＮＦフミリーのその他のメンバーとの間の相同性）
ＬＴ−βをコードするｃＤＮＡのクローニングは、ＬＴ−βが、ＴＮＦ、ＬＴ−α、およびＣＤ４０レセプターのリガンドに著しい相同性を有するタイプＩＩ膜タンパク質であることを解明した。これらのタンパク質は、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーに結合することが知られている。ＬＴ−β、ＴＮＦ、ＬＴ−αおよびＣＤ−４０レセプターのリガンドは、細胞外ドメインに４つの配列保存領域を共有する。図１３を参照のこと。これらのドメインは、ＴＮＦおよびＬＴ−α結晶構造の表面に存在し、サブユニット間相互作用に関連するようである。
【０１８５】
（実施例１２：数個の可能な開始部位を明らかにするＬＴ−βの５’末端の決定）
５’ｍＲＮＡ配列を、プライマー伸長分析によって決定した。プライマー伸長分析は、ＬＴ−βタンパク質の転写開始部位が、メチオニンＡＴＧの上流約７〜９塩基対であることを解明した。従って、ｍＲＮＡは、少なくとも３つの可能な転写開始部位、Ｍｅｔ−１，Ｌｅｕ−４、およびＬｅｕ−６コドンを有する。クローン１２を用いる一時的な実験は、Ｌｅｕ−４あるいはＬｅｕ−６開始部位の１つあるいは両方が機能することを示した。５’ｍＲＮＡ配列は、上記のコスミドクローン０３１Ａを使用したＬＴ−βゲノム配列の決定、およびジデオキシ核酸配列決定によって明らかにされた。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、リンホトキシン−β、リンパ球膜タイプタンパク質に関する。このタンパク質は、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激Ｔ細胞ハイブリドーマＩＩ−２３．Ｄ７細胞を含む多数の細胞の表面で見られる。本発明はまた、リンホトキシン−βとリンホトキシン−αのような他のペプチドとの間で形成される複合体およびリンホトキシン−βの多数のサブユニットを包含する複合体に関する。これらのタンパク質および複合体は、細胞内で形成されるＬＴ−αを細胞表面に保持するのに有用であり、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体が炎症調節剤、腫瘍増殖阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、Ｔ細胞活性化剤、自己免疫疾患調節剤、またはＨＩＶ阻害剤として作用し得る。さらに、ＬＴ−α／ＬＴ−β複合体の抗腫瘍活性を、ＬＴ−βの遺伝子でトランスフェクトされた腫瘍湿潤リンパ球（ＴＩＬ）によって腫瘍細胞に送達し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ＯＫＴ３−刺激、ＩＬ−２拡張末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のフローサイトフルオロメトリー分析を示し、３つの、異なるウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清との反応を示し、そして本質的にウサギ抗ｒＴＮＦ抗血清との反応がなかったことを示す。
【図２】図２は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ、ＩＩ−２３．Ｄ７のフローサイトフルオロメトリー分析を示し、細胞表面上の（ＰＭＡ処理後の）ＬＴ−α関連エピトープの存在を示す。
【図３】図３は、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞の抗ｒＬＴ−α抗体と結合する能力を示す。抗ＬＴ−α抗血清のサンプルと、ＰＭＡ処理Ｕ９３７（非ＬＴ生成）細胞、（−〇−）、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７ハイブリドーマ細胞（１０８、−−；１０７、−・−）、および細胞なし（コントロール、−−）とをインキュベートした。インキュベーション後、無細胞抗血清の連続希釈をｒＬＴ−αに添加し、そしてＬ９２９（ＬＴ−αセンシティブ）細胞に対する細胞障害性アッセイに使用した。プロットは、ｒＬＴ−α中和抗体が抗血清から活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞によって除去されたことを示す。
【図４】図４は、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からの１２５Ｉ−標識表面タンパク質の免疫沈降を示す２つのオートラジオグラフ（ＡおよびＢ）を示す。図４Ａは、免疫前ウサギ血清ではなくて免疫後ウサギ抗ｒＬＴ−α抗血清によって、約２５ｋＤ表面タンパク質（ＬＴ−α）および約３３ｋＤ表面タンパク質（ｐ３３、すなわちＬＴ−β）の免疫沈降を示す。図４Ｂは、図４Ａからの２５ｋＤおよび３３ｋＤバンドの一次元ＣＮＢｒ切断マップを示し、Ｅ．ｃｏｌｉで生産した組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）、およびＣＨＯ細胞で生産される組換えリンホトキシン−α（ｒＬＴ−α）［Ｊ．Ｂｒｏｗｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３、１８５９（１９８９）］と、ＣＮＢｒ切断の有り（＋）およびなし（−）の両方で比較した。
【図５】図５は、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインで代謝的に標識したＰＭＡ刺激ＩＩ−２３．Ｄ７細胞からのＴＮＦ−およびＬＴ−α−関連タンパク質の免疫沈降を示すオートラジオグラフである。この図は、約２５ｋＤメチオニン含有表面タンパク質（ＬＴ−α）および約３３ｋＤメチオニンおよびシステイン含有表面タンパク質（ｐ３３、すなわちＬＴ−β）が、免疫前（Ｐ）または抗ｒＴＮＦ抗血清（Ｔ）ではない抗ｒＬＴ−α抗血清（Ｌ）によって認識されることを示している。オートラジオグラフもまた、活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞がまた２６ｋＤ形態のＴＮＦを生産し、そして可溶性リンホトキシン−αを分泌することを示す。
【図６】図６は、抗ｒＬＴ−α血清によって認識されるＰＭＡ活性化ＩＩ−２Ｓ．Ｄ７細胞からのこれらのタンパク質のアフィニティ精製１−Ｄ ＣＮＢｒペプチドマッピングを示す。図６Ａは、免疫前（ＰＲＥ）または免疫後（ＰＯＳＴ）ウサギ血清のいずれかから調製した抗ＬＴ−αアフィニティーカラムから溶出されるタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を表す。図６Ａは、約３３ｋＤおよび約２０ｋＤタンパク質バンドは免疫前血清（ＰＲＥ）を使用して調製したアフィニティーカラムに結合しないが、抗ｒＬＴ−α抗血清（ＰＯＳＴ）を使用して調製したアフィニティーカラムに結合することを示す。図６Ｂは、ＰＯＳＴカラムから溶出される約３３ｋＤおよび約２０ｋＤタンパク質の部分的なＣＮＢｒ切断を示し、並行して泳動したｒＴＮＦおよびｒＬＴ−αとの比較を示す。ゲルを、銀染色法で視覚化した。
【図７】図７は、約２５ｋＤおよび約３３ｋＤ１２５Ｉ−標識タンパク質（それぞれＬＴ−αおよびＬＴ−βと命名した）のオートラジオグラフを示すが、これらは、Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙ）、ノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼ（Ｏ−ｇｌｙ）の混合物で、または３つの酵素すべてで処理された活性化ＩＩ−２３．Ｄ７細胞から免疫沈降されたものである。
【図８】図８は、共沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の再免疫沈降の結果を示し、さらにこれらが免疫学的に関連しているかどうか調査する。
【図９】図９（９Ａおよび９Ｂ部分を含む）は、免疫沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の変性条件下での等電点フォーカシングの結果を示す。
【図１０】図１０（１０Ａおよび１０Ｂ部分を含む）は、免疫沈降したｐ３３（ＬＴ−β）およびｐ２５（ＬＴ−α）タンパク質の未変性条件下での等電点フォーカシングの結果を示す。図９および図１０は共に、ＬＴ−βおよびＬＴ−αが変性可能な複合体を形成することを示す。
【図１１】図１１は、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γおよびＯＫＴ３の混合物で刺激した後、Ｔ細胞および単球上で分化的に発現した表面タンパク質をフローサイトフルオロメトリーを示す。刺激したＰＢＬプールから分離したＴ細胞は、抗ｒＬＴ−α抗血清（ＬＴ）によって認識される表面タンパク質を発現することが認められ、他方分離した単球は抗ｒＴＮＦ抗血清（ＴＮＦ）によって認識される表面タンパク質を発現した。
【図１２】図１２は、ＩＬ−２で処理されたｌｅｕ−１９−およびｌｅｕ−１９＋（すなわち天然キラー）細胞上の表面ＬＴ形態のフローサイトフローメトリー分析を示す。ＩＬ−２で処理したＰＢＬを標識ｌｅｕ−１９および抗ｒＬＴ−αの両方で分析した結果、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が表面ＬＴ形態を発現するのを確認した。
【図１３】図１３は、ＬＴ−βフラグメントのアミノ酸配列を示すが、これは、直接Ｎ−末端配列決定およびインサイチュトリプシン切断に続いて、切断されたペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離によって得られた。
【図１４】図１４は、ＴＮＦ／ＮＧＦ−レセプターファミリーのメンバーと結合するリガンドのファミリーの４つのメンバーのアミノ酸配列比較を示す。ホモロジー領域を、太いタイプフェイスで、同一配列をドットで示し、そして保存配列を星印で示す。推定Ｎ−結合グルコシル化部位を四角で囲んでいる。
【図１５】図１５は、これはＬＴ−αおよびＬＴ−β発現のノーザン分析を示す。Ａ）いくつかの細胞株のノーザンブロットでＨｕｔ−７８およびＩＩ−２３．Ｄ７細胞中のみで両方のＬＴ遺伝子を特異的に発現することを示す。Ｂ）ＩＩ−２３．Ｄ７細胞中のＬＴ−αおよびＬＴ−β ｍＲＮＡのＰＭＡ誘導の時間経過 Ｃ）抗ＣＤ３またはＩＬ−２単独のいずれかで活性化されたヒト末梢血リンパ球の同様の分析を示す。
【図１６】図１６は、ＣＨＯ細胞中のＬＴ−αおよびＬＴ−βの発現を示す。Ａ）ＬＴ−β ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析。親ｄＨＦＲ−ＣＨＯ株またはＬＴ−αを発現するＣＨＯ細胞のいずれかを、無関係の挿入物（クローン４）を含有するｐＣＤＭ８またはｐＣＤＭ８／ＬＴ−βプラスミドのいずれかでエレクトロポレートし、そしてコントロールＩｇＧ（−−−）または抗ＬＴ−αモノクローナル抗体（＿＿＿）で染色した。Ｂ）パネルＢは、ＣＯＳ細胞中でＬＴ−αおよびＬＴ−βの発現を示す。細胞を、ｐＣＤＭ８／ＬＴαと共に、または用いないで、コントロールＤＮＡまたはｐＣＤＭ８／ＬＴβプラスミドでトランスフェクトし、そしてパネルＡと同様に染色した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βを使用する工程を包含する、新生物形成の進行を軽減するための方法。
【請求項１】
配列番号２の配列を含有する、リンパ球膜タイプポリペプチドであるリンホトキシン−βを使用する工程を包含する、新生物形成の進行を軽減するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００７−３９４６４（Ｐ２００７−３９４６４Ａ）
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５３５４１（Ｐ２００６−２５３５４１）
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【分割の表示】特願２００３−３８３０９９（Ｐ２００３−３８３０９９）の分割
【原出願日】平成５年１２月２日（１９９３．１２．２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【出願人】（５０００２５５０３）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【分割の表示】特願２００３−３８３０９９（Ｐ２００３−３８３０９９）の分割
【原出願日】平成５年１２月２日（１９９３．１２．２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【出願人】（５０００２５５０３）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
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