リン酸カルシウム材料、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む複合生体材料
【課題】ヒドロキシアパタイトよりも機械的に改良された靭性、並びにコラーゲンおよびコラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも改良された剛性を有する合成骨代用材料の提供。
【解決手段】１つ以上のリン酸カルシウム材料、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含む生体材料であって、前記コラーゲンと前記１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、前記リン酸カルシウム材料が前記マトリクス中に分散されており、前記リン酸カルシウム材料がブルシャイト、ブルシャイトを加水分解して得られたリン酸八カルシウムおよびブルシャイトを加水分解して得られたアパタイトから１つ以上が選択されることを特徴とする生体材料。
【解決手段】１つ以上のリン酸カルシウム材料、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含む生体材料であって、前記コラーゲンと前記１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、前記リン酸カルシウム材料が前記マトリクス中に分散されており、前記リン酸カルシウム材料がブルシャイト、ブルシャイトを加水分解して得られたリン酸八カルシウムおよびブルシャイトを加水分解して得られたアパタイトから１つ以上が選択されることを特徴とする生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医用用途のための合成骨、歯科材料および再生足場、特にコラーゲン、リン酸カルシウム材料および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む合成骨、歯科材料および再生足場およびそれらの前駆体に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然骨はコラーゲン、グリコサミノグリカンを含む非コラーゲン状有機相およびリン酸カルシウムとの生体複合体である。その複雑な階層構造によって、高剛性、強度および破壊靭性などの優れた機械的性質を有し、それによって骨は日々受ける生理学的な応力に耐える。この分野の研究者が直面する難題は、人体や動物体内の合成材料の中や周辺に自然骨が成長する組成および構造を有する合成材料を作ることである。
【０００３】
骨は、体環境の中で形成される骨類似アパタイト層によって（生体活性と称される性質）人体内のリン酸カルシウムに直接結合することが観察されている。一方、コラーゲンおよび、コラーゲンやグリコサミノグリカンのような他の生体有機物を含む共重合体は、人体の骨の生成および維持に欠かせないものを含む多数の細胞タイプの接合や増殖に最適な基材として知られている。
【０００４】
ヒドロキシアパタイトはリン酸カルシウムであり、骨の代用材料の成分として最も一般的に使用されている。しかしながら、ブルシャイト、リン酸三カルシウムおよびリン酸八カルシウムなどの他のリン酸カルシウム形と比べたとき、それは、比較的に不溶性である。人体中の材料吸収速度は特に遅いので、アパタイトの比較的低い溶解性が、生体材料を製造する場合、不利に働くことがあり得る。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウムは機械的に硬い材料である。しかしながら、それらは自然骨と比べると比較的脆い。コラーゲンは機械的に靭性のある材料であるが、自然骨と比べると比較的剛性が低い。コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体を含む材料はコラーゲン単体に比較して靭性と剛性があるが、しかし、自然骨と比べるとまだ比較的に剛性が低い。
【０００６】
従来技術で、ヒドロキシアパタイトよりも機械的に改良された靭性、並びにコラーゲンおよびコラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも改良された剛性を有する合成骨代用材料を製造するこれまでの試みには、コラーゲンとアパタイトを機械的に混合する方法がある。そのような機械的方法は欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４（特許文献１）に記載されている。
【０００７】
この技術のその後の開発には、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン‐４‐硫酸を含みこれらの成分を機械的に混合して骨代替材料の製造を含む。これは、欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０（特許文献２）に記載されている。この文献はさらに、コンドロイチン‐４‐硫酸をコラーゲンに脱水素熱的に架橋させることが記載されている。アパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン‐４‐硫酸を含む材料は良好な生体適合性を有することが見出されている。アパタイトをコラーゲン、任意選択的にコンドロイチン‐４‐硫酸と機械的に混合することで、コラーゲン／コンドロイチン‐４‐硫酸でコートされたアパタイト粒子が実質的に形成される。そのような材料は、生体適合性はあるものの、人体または動物体内では自然骨の成長に限界があり、合成材料のリン酸カルシウム相の改造にならないことが見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４
【特許文献２】欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０
【発明の概要】
【０００９】
本発明は従来技術に付随する少なくともいくつかの問題を解決しようとするものである。
【００１０】
第一の態様において、本発明はコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、カルシウム源、リン源および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を供給する工程、およびコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを一緒に前記水溶液から３種共沈殿物を形成するように沈殿する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
３種共沈殿物なる用語は３種類の化合物がその溶液／分散液から実質的に同時に沈殿した３種類の化合物の沈殿を包含する。それは、特に成分を個別に、例えば異なる溶液から沈殿させ、それらの成分を機械的に混合して形成した材料と区別される。共沈殿物の微細構造は成分を機械的に混合して形成した材料と本質的に異なる。
【００１２】
第一の態様において、溶液のｐＨは２．５から６．５、より好ましくは２．５から５．５である。さらに好ましくは溶液のｐＨが３．０から４．５である。さらにより好ましくは溶液のｐＨは３．８から４．２である。もっとも好ましくは溶液のｐＨが約４である。
【００１３】
カルシウム源は好ましくは、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、珪酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から１つ以上が選択される。ヘパリンのカルシウム塩は豚の腸粘膜から誘導することができる。適当なカルシウム塩はシグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich Inc)から市販されている。
【００１４】
リン源は好ましくは、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム２水和物（Ｎａ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ時折ＧＰＲセレンセ
ン塩と称される）およびリン酸トリメチル、リン酸のアルカリ金属塩（例、ＮａまたはＫ）およびリン酸のアルカリ土類塩（例、ＭｇまたはＣａ）から１つ以上が選択される。
【００１５】
グリコサミノグリカンはニ糖の繰り返し単位を含む長鎖の分岐のない多糖類を含む一群の高分子である。好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸から１つ以上が選択される。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン‐４‐硫酸またはコンドロイチン‐６‐硫酸でよいし、その両方ともシグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc）から入手できる。コンドロイチン‐６‐硫
酸は鮫の軟骨から誘導できる。ヒアルロン酸は人間の臍帯から誘導できる。ヘパリンは豚の腸粘膜から誘導できる。
【００１６】
３種共沈殿物の沈殿において溶液の温度は、好ましくは４．０から５０℃である。より好ましくは溶液の温度は１５から４０℃である。溶液は２０から３０℃の室温でもよく、２０から２７℃が好ましい。最も好ましくは約２５℃である。
【００１７】
水溶液のカルシウムイオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐3、好
ましくは０．００１から１ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法がさらにろ過および／または
低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐3（例、０．０８から０．２５ｍｏｌｄｍ‐3）、最も好ましくは
０．１から０．５ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法がさらに、凍結乾燥および任意選択的
に射出成形工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐3、最も好ましくは０．０５から０．１８ｍｏｌｄｍ‐3である。
【００１８】
好ましくは、溶液はリン酸塩イオンを含み、溶液中のリン酸塩イオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐3、好ましくは０．００１から１Ｍである。その方法
がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐3、さらにより好ましくは０．１から
０．５Ｍ、例えば０．１から０．０３５ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法はさらに、凍結
乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐3、さらにより好ましくは０．０５から０．
１８Ｍである。
【００１９】
好ましくは、沈殿前の溶液中のコラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１である。より好ましくは、コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が１０：１から１２：１、最も好ましくはその比率が１１：１から２３：２である。
【００２０】
好ましくは、３種共沈殿物中のコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００、より好ましくは５：１から１：２０、さらにより好ましくは３：２から１：１０、最も好ましくは３：２から１：４である。
【００２１】
沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度は典型的には、１から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１から１０ｇ／Ｌである。その方法がろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、溶液中のコラーゲン濃度がより好ましくは１から１０ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１．５から２．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．５から２．０ｇ／Ｌである。その方法が凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度が好ましくは５から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは５から１２ｇ／Ｌ、最も好ましくは９から１０．５ｇ／Ｌである。
【００２２】
沈殿前の溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカン全濃度は典型的には、０．０１から１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１から１ｇ／Ｌである。その方法がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度は好ましくは０．０３から１．２５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは０．１２５から０．２５ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．１３から０．１８２ｇ／Ｌである。その方法がさらに凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度はより好ましくは０．１５から１．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．４１から１．２ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．７８から０．９６ｇ／Ｌである。
【００２３】
好ましくはその溶液がカルシウムイオンを含み、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率が典型的には重量で１：４０から５００：１、その方法がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率は好ましくは１：４０から２５０：１、さらにより好ましくは１：１３から５：４であり、最も好ましくは１：１３から１：２である。その方法がさらに凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率はより好ましくは１：８から５００：１、さらにより好ましくは５：１２から３０：１、最も好ましくは５：５から５：１である。
【００２４】
沈殿は、コラーゲン、カルシウム源、リン源、１つ以上のグリコサミノグリカンを酸性水溶液中で組み合わせて、沈殿が生じるまで放置するか、溶液を攪拌、アンモニアのよう
な塩基性の滴定剤を用いて滴定、予め作成したブルシャイトのような核剤の添加、カルシウム源の添加速度の変化、およびこれらの技術の組み合わせによって達成される。
【００２５】
第二の態様において、本発明は、コラーゲン、リン酸八カルシウムおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を供給する工程、および前記複合材料中の少なくともブルシャイトの幾分かが加水分解によってリン酸八カルシウムに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
生体材料たる用語は人体または動物体と生体適合性がある材料を包含する。
【００２７】
第二の態様において、複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【００２８】
好ましくは、ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はリン酸八カルシウムがブルシャイトよりも熱力学的に安定するｐＨ以上である。好ましくは、この水溶液のｐＨは６から８である。より好ましくは、この水溶液のｐＨは６．３から７である。最も好ましくは、この水溶液のｐＨは約６．６５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物および／またはリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。好ましい水溶液はアンモニアを用いて所望のｐＨに滴定した酢酸を含む。
【００２９】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらにより好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００３０】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは１２から１４４時間、より好ましくは１８から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【００３１】
第三の態様において、本発明は、コラーゲン、アパタイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を供給する工程、および前記複合材料中のブルシャイトの少なくとも幾分かが加水分解によってアパタイトに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３２】
アパタイトはカルシウムとリン酸塩を含む一群の鉱物であり、一般式Ｃａ5（ＰＯ4）3
（Ｘ）で表され、式中、Ｘは典型的にはＯＨ‐、Ｆ‐、Ｃｌ‐のイオン、当業者に公知の他のイオンでもよい。アパタイトはシリコン置換アパタイトのような置換されたアパタイトも含む。アパタイトはヒドロキシアパタイトを含み、それはアパタイトの特定例である。ヒドロキシアパタイトはシリコンで置換されてもよい。
【００３３】
第三の態様において、好ましくは複合材料が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は、発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【００３４】
好ましくは、ブルシャイトのアパタイトへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はアパタイトがブルシャイトよりも熱力学的に安定す
るｐＨ以上である。好ましくはブルシャイトのアパタイトへの変換は、水溶液のｐＨが６．６５から９であり、より好ましくは７から８．５であり、さらにより好ましくは７．２から８．５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物および／またはリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。
【００３５】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらに好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００３６】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは１２から２８８時間、より好ましくは１８時間から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【００３７】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換速度を増加させる方法は、（ｉ）温度を上げること、（ｉｉ）溶液中のブルシャイトの濃度および／または（ｉｉｉ）攪拌速度である。
【００３８】
本発明に従って、アパタイトとリン酸八カルシウムの両方を含む生体材料を製造することが望ましいであろう。本発明の第二および第三の態様の方法は、リン酸八カルシウムとアパタイトの両方を含む生体材料を製造するために組合すことができる。まず、３種共沈殿物中のブルシャイトをリン酸八カルシウムに変換し、それからリン酸八カルシウムを部分的にアパタイトに変換することができる。全体として、またはほぼ全体として（例、少なくとも９８％）、ブルシャイトまたはリン酸八カルシウムのアパタイトへの変換は典型的にｐＨが８．０以上、約１２時間で生じる。したがって、前記材料中のブルシャイトおよび／またはアパタイトの部分的変換は１２時間以内で加水分解によって達成することができる。
【００３９】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくはｐＨが６．６５から１０、より好ましくは７．２から１０、さらにより好ましくは８から９である。
【００４０】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらに好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００４１】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２から１４４時間、より好ましくは１２から９６時間、最も好ましくは２４から７２時間で実施される。
【００４２】
本発明の第二および第三の態様において、ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換が、好ましくは３０から４０℃の温度で実施される。より好ましくはその変換は３６から３８℃の温度で実施される。最も好ましくは、その変換は約３７℃で実施される。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法が、３種共沈殿物中の１つ以上のグリコサミノグリカンとコラーゲンとの架橋工程を含む。３種共沈殿物によって、これはコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物およびその誘導体を含む。誘導体は、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換された共沈殿物および、成形または鋳造された、またはいかなる化学的または機械的な加工にかけられた共沈殿物を含む。架橋はいかなる従来技術を用いても達成される。
【００４４】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換され、ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換前にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。この架橋は、３種共沈殿物を１つ以上のガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理、ブドウ糖、マンノース、リボースまたは蔗糖のような単純な糖によって非酵素的な糖化、３種共沈殿物をグルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよび／またはノルジヒドログアヤレト酸の１つ以上に接触およびこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。これらの方法は従来技術である。
【００４５】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換される場合、ブルシャイがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換後にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。ブルシャイトがアパタイト／リン酸八カルシウムへ変換後の架橋が上記に記載の１つ以上の方法、または脱水素熱的処理、またはこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。脱水素熱的処理は基材を昇温下、低圧で処理する。脱水素熱的処理の温度は９５℃から１３５℃でよい。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に１８から３６時間で完了が所望される場合、好ましくは１００℃から１１０℃、最も好ましくは１０５℃から１１０℃である。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に４から８時間で完了が所望される場合、好ましくは１２０℃から１３５℃、最も好ましくは１２５℃から１３５℃である。
【００４６】
好ましくは、コラーゲンとグリコサミノグリカンとが、ブルシャイトがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換される前と後両方で架橋される。
【００４７】
本発明の方法は、複合生体材料を骨または歯の代用として用いるため適当な構造に成形する工程を含む。そのような工程は３種共沈殿物の形成の後で、しかし、ブルシャイトのいかなる変換または生ずるかもしれないコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋の前に起こるかもしれない。
【００４８】
別の方法として、生体材料の成形工程はブルシャイトのアパタイトおよび／またはリン酸八カルシウムの変換後、またはコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋後で起こるかもしれない。
【００４９】
好ましくは、複合材料は、（ｉ）ろ過および／または低温乾燥、（ｉｉ）凍結乾燥、（ｉｉｉ）射出成形および（ｉｖ）常温圧縮から選択される技術で成形される。ろ過および／または低温乾燥は、その温度が１５℃から４０℃、最も好ましくは３５℃から４０℃であり、典型的に材料の密度の高い粒状形になる。凍結乾燥は典型的には、開放多孔形状になる。射出成形は用いる金型の形に依存して材料の広範囲な形状／形態になる。常温圧縮は典型的には密度の高いペレット形状になる。
【００５０】
さらに本発明は、前駆体材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を合成生体材料に変化させるのに適する前駆体材料を提供する。好ましくは、その複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様の方法によって製造することができる。
【００５１】
本発明はまた、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本明細書で記述される本発明の方法によって得ることができる。
【００５２】
本発明はまた、コラーゲン、リン酸八カルシウムおよび１つ以上のグリコサミノグリカ
ンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第二の態様に従う方法によって得ることができる。
【００５３】
本発明はまた、コラーゲン、アパタイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第三の態様に従う方法によって得ることができる。
【００５４】
本発明はまた、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびブルシャイトの３種共沈殿物を含む複合生体材料を提供する。
【００５５】
本発明はまた、一つ以上のリン酸カルシウム材料の粒子、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカン含む複合生体材料を提供し、コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、リン酸カルシウム材料の粒子がマトリクス中に分散し、およびそのリン酸カルシウム材料がブルシャイト、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトの１つ以上から選択される。
【００５６】
以下の説明は、他に特に指定がない限り、本発明に従って複合生体材料のすべての態様に関する。
【００５７】
コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンは好ましくは架橋されている。
【００５８】
コラーゲンは好ましくは材料中に５から９０（乾燥）重量％、より好ましくは１５から６０（乾燥）重量％、より好ましくは２０から４０（乾燥）重量％の量で存在する。
【００５９】
材料中に１つ以上のグリコサミノグリカンは、好ましくは０．０１から１２（乾燥）重量％、より好ましくは１から５．５（乾燥）重量％、最も好ましくは１．８から２．３（乾燥）重量％の量で存在する。
【００６０】
材料がブルシャイトを含む場合、好ましくはコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）５：１から１：２０、最も好ましくは重量（乾燥）で３：２から１：１０、例えば、重量（乾燥）で３：２から１：４である。
【００６１】
材料がリン酸八カルシウムを含む場合、コラーゲンとリン酸八カルシウムとの比率は、好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）で５：１から１：２０、最も好ましくは３：２から１：１０重量（乾燥）である。
【００６２】
コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が好ましくは重量（乾燥）で８：１から３０：１であり、より好ましくは、重量（乾燥）で１０：１から３０：１、さらにより好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１２：１、最も好ましくは重量（乾燥）で１１：１から２３：２である。
【００６３】
本発明による複合生体材料は代用骨または歯科材料として使用することができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明の複合生体材料を含む合成骨材料、骨移植物、骨接ぎ片、骨代用品、骨足場、充填剤、コーティングまたは接着剤を提供する。コーティングなる用語は本発明の生体材料または前駆体を含むいかなるコーティングを含む。コーティングは補綴部材、骨または、人体または動物の体に使用する目的のいかなる基材の外面または内面に適用できるが、それは粒子状材料を含む。本発明の組成は、限定されないが骨および歯科材料を含む無機物化された生体材料で生体内および生体外修復用に用いることができる。本
発明の生体材料は同種移植および自家移植の成長に用いることができる。
【００６５】
リン酸八カルシウムを含む本発明による生体材料は、前駆体ブルシャイト相が無い、または実質的に無くてよい。この生体材料は、ブルシャイトが生体材料中のリン酸カルシウムの全量に対して重量で２％以下でよい。
【００６６】
リン酸カルシウム材料は、相が純粋なリン酸八カルシウムまたはアパタイトを含むまたは実質的に構成される。相が純粋とは、所望の相（Ｘ線解析で測定）が少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％を意味する。別の方法として、生体材料は、生体材料の所望の性質に依存するが、リン酸八カルシウムとアパタイトの混合物でもよい。
【００６７】
ブルシャイトを含む本発明の材料は、生体材料を作成する前駆体材料として使用するかまたはそれ自体で生体材料として使用するのが適しているであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】共沈殿後の複合体のＸＲＤパターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図２】３種共沈殿物のＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図３】３種共沈殿物のＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図４】１０５℃、５０ミリトール、４８時間の脱水素熱的処理後の複合体のＸＲＤパターンの図であり、ブルシャイト相が脱水素化された形のモネタイトに変換されたことを示す。
【図５】ｐＨ４．０に保つための、イオン濃度と、硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比との組み合わせ群を示すグラフである。
【図６】リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との質量比１：１を含む３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．０合成のための条件を求めるためのグラフである。
【図７】非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図８】ＣａＰ：コラーゲン＋ＧＡＧ＝１：１の３種共沈殿物表面の二次（ＳＥ）および後方散乱電子（ＢＳＥ）画像を示す写真である。
【図９】ＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１０】コラーゲン／ＧＡＧ／ＯＣＰ生体材料を形成するために、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）に３７℃、ｐＨ６．６７で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１１】ｐＨ４．５に保つための、イオン濃度と、硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比との組み合わせ群を示すグラフである。
【図１２】リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との３：１質量比を含む３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．５合成のための条件を求めるためのグラフである。
【図１３】非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１４】ＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１５】コラーゲン／ＧＡＧ／アパタイト生体材料を形成するために、アパタイトに３７℃、ｐＨ８．５０で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１６】ガンマ線照射による二次架橋後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１７】三種共沈及び乾燥処理（工程IおよびII）直後における複合材料のＸ線回折パターンを示す図である。
【図１８】一次架橋（工程III）後の共沈殿物顆粒の構造を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図１９】リン酸八カルシウムへの加水分解の進行（工程IV）の情況を示すＸＲＤパターンの図である。
【図２０】複合体のＴＥＭ画像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明による方法は以下の一連の方法を用いて実施されるが、その方法とは、コラーゲン、１つ以上のグリコサノグリカンまたは１つ以上のリン酸カルシウム成分の生体材料を製造するために全体としてまたは部分的に適用される。以下の説明は実施例の方法で提供され、本発明によるいかなる態様の方法にも適用が可能である。
【００７０】
「I：コラーゲン、ＧＡＧおよびリン酸カルシウム・ブルシャイトの酸性ｐＨでの３種共
沈殿」
この工程は複合体の３種（またはそれ以上）の成分からなる溶液から沈殿を経て同時形成を開始し、３種（またはそれ以上）それぞれの相の比率をコントロールするために実施される。複合体の組成上の性質のコントロール（特に、コラーゲン：ＧＡＧ：ＣａＰ比率）は、ｐＨ、温度、熟成時間、カルシウムイオン濃度、リンイオン濃度、コラーゲン濃度およびＧＡＧ濃度の１つ以上を変化させることにより達成される。ｐＨは一定に保っても（例えば、緩衝剤、ｐＨスタット滴定または他の方法を用いて）または変化させてもよい。可能な２次（汚染物）相は、他の酸性リン酸カルシウム（例、モネタイト、リン酸水素カルシウム）および、滴定および反応剤付加の副産物を含む錯体（例、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム）を含む。架橋を助成する添加剤（例、グルコース、リボース）または生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）もこの工程で添加することができる。
【００７１】
「II：ネット・シェイプの形成」
この工程は最終複合体形状の所望の構造、特に気孔構造のコントロールに重点を置いて製造するために実施される。技術として、ろ過および低温乾燥（密度の高い粒状形となる）、凍結乾燥（開放気孔形状になる）、射出成形（金型のタイプに依存して広範囲な形状になる）および常温圧縮（密度の高いペレット形状になる）が挙げられる。
【００７２】
「III：一次架橋」
この工程は好ましくは、高いｐＨの溶液に置かれる場合、複合体のＧＡＧ含量が急速に流出せず、さらに、複合体の機械的および分解上の性質を高めるために実施される。技術として、低温物理的技術（例、ガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理）、化学的技術（例、単純な糖での非酵素的糖化、グルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ノルジヒドログアヤレト酸）または組み合わせ方法（例、同時に非酵素的糖化とガンマ線照射）が挙げられる。リン酸八カルシウム（即ち、工程IVとして）に変換が望ましい場合、一次架橋は３７℃未満で有利に実施され、ブルシャイト相がその脱水素化形であるモネタイト（容易にリン酸八カルシウムに加水分解されないリン酸カルシ
ウム）に変換されるのを防ぐ。
【００７３】
「IV：加水分解」
この工程は、ブルシャイト（生理的ｐＨにおいて高い溶解性の相）からのＣａＰ相が加水分解され、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイト（生理的ｐＨにおいて低い溶解性の相）になり、実質的に溶解性汚染物質（例、硝酸アンモニウム、リン酸水素カルシウム）を除去するために部分的にまたは全面的に実施される。ＯＣＰに加水分解の場合、選択したｐＨは約６．６５の一定値に有利に保持され（緩衝液、ｐＨスタットまたは他の方法を用いて）、約３７℃で約２４〜４８時間である。工程Iの場合のように、架橋を助
成する添加剤（例、グルコース、リボース）または生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）も加水分解工程（工程IV）の間に添加できる。
【００７４】
「V：二次架橋」
この工程は、複合材料の機械的および分解上の性質をさらに調整するために実施することができる。上記の工程IIIに挙げた架橋手順のある部分あるいはすべてを、二次架橋を
達成するために用いることができる。
【００７５】
以下の実施例および添付する図は、本発明を理解するのにさらに役立つように提供される。実施例および図は、本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。実施例および図で記載されたいかなる特徴は前記の説明のいかなる態様にも適用可能である。
【実施例１】
【００７６】
実施例１は、前記説明した合成方法の一例であり、工程IからIIIのみを適用して実施される。３種共沈殿は室温（２０〜２５℃）、約３．２のｐＨ（アンモニアで滴定して保持）で実施される。この実施例において、共沈殿物は３７℃で乾燥、脱水素熱的処理を経て架橋される。ＣａＰの加水分解的変換も二次架橋もこの実施例では実施されない。
【００７７】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；８５％タイプI、１５％タイプIII：日本ミートパッカー社（Japan Meat Packers，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma‐Aldrich Inc，St.Louis，MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）2シグマアルドリッチ社（Sigma
Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ3ＰＯ4；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ3；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
【００７８】
「手順」
〔工程I〕
溶液Ａ
Ｃａ（ＯＨ）2を０．４８ＭのＨ3ＰＯ4に室温で濃度０．１２Ｍになるように溶解し、
得られた溶液をアンモニアを用いてｐＨ３．２まで滴定する。
溶液Ｂ
コンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解する。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ、それからＣａ（ＯＨ
）2を、硝酸塩と水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カルシウム濃度２・
４Ｍの分散液を製造する。
０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合する。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加える。
６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視する。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成する。
【００７９】
〔工程II〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥する。
得られた３種共沈殿物のＸ線回折パターンを図１（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）およびＳＥＭ画像を図２に示す。
【００８０】
〔工程III〕
３種共沈殿物を、１０５℃、５０ミリトールの真空のもと、４８時間の脱水素熱的処理（ＤＨＴ）で架橋する。ＤＨＴ後の３種共沈殿物のＴＥＭ画像を図３に示す。図４はＤＨＴ後の３種共沈殿物のＸ線回折パターンを示しており、ブルシャイト相が脱水素された形のモネタイトに変換されていることを示唆している。
【実施例２】
【００８１】
実施例２は、前述の説明の合成方法の例であり、工程IからIVのみの適用を経て実施さ
れる。３種共沈殿は室温、ｐＨ４．０で実施される。この実施例において、ｐＨのコントロールは、水酸化カルシウムおよび硝酸カルシウム濃度の注意深いコントロール（３種共沈殿中のブルシャイトのコラーゲンとＧＡＧ合計との重量比のコントロールも可能な手法）によって達成される。得られた３種共沈殿物は、−２０℃に凍結され真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施される。得られる乾燥した３種共沈殿物はそれから、ｐＨ６．６７、温度約３７℃での加水分解によってリン酸八カルシウムに変換される。この実施例において、二次架橋は実施されない。
【００８２】
「材料」
・タイプI：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Integra
Life Science Plainsboro, NJ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
【００８３】
「手順」
〔工程I〕
ブルシャイトのコラーゲンとガリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の１：１に選択する。
２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を２１ｍｇ／ｍＬに設定する。
ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ2+］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで作成された）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］）および（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．０で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図５（ｐＨを４．０に保つためのイオン濃度およびの硝酸カルシウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。
この点の軌跡を同一軸でブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ、２１ｍｇ／ｍＬ曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（２１ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計（２１ｍｇ／ｍＬ）との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．０で（［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］＝０．１３８３Ｍ；Ｃａ（ＮＯ3）．４Ｈ2Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）2＝０．１３５６）で製造することができる一組の反応物濃度が与えられる。
図６（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．０合成のための条件の決定方法）参照。
３．８６４４ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１３８３ＭのＨ3ＰＯ4の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分以上攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いて非常に粘調なコラーゲン分散液を作り出す。
０．３４３６ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１３８３Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。
９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、非常に粘調なコラーゲン／ＧＡＧを得る。
９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）2および０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2
．４Ｈ2Ｏを極めて粘調なコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合
のもと３０分かけて加え、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、さらに１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ3ＰＯ4をそのスラリーに混合する。
３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．０である。
３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【００８４】
〔工程II〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。
凍結したスラリーはそれから冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。
非結合水除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図７に示し、共沈殿物の表面のＳＥＭ画像を図８（ＣａＰ：コラーゲン＋ＧＡＧ＝１：１の３種共沈殿物の表面の二次（ＳＥ）および後方散乱電子（ＢＳＥ）画像）に示す。
【００８５】
〔工程III〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥した３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。
０．０３５ＭのＥＤＡＣおよび０．０１４ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。
ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌して新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。
ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で２回１０分間隔で、成長させる。
それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図９にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【００８６】
〔工程IV〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを６．６７に調整する。
温度およびｐＨを４８時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。
ＯＣＰに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１０（コラーゲン／ＧＡＧ／ＯＣＰ生体材料を形成するために、ＯＣＰに３７℃、ｐＨ６．６７で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
【実施例３】
【００８７】
実施例３は、前述の説明の合成方法の例であり、工程IからVまでの適用を経て実施される。３種共沈殿は室温、ｐＨは約４．５で実施される。実施例２のように、ｐＨのコントロールは、滴定剤を用いず、水酸化カルシウムおよび硝酸カルシウム濃度を注意深くコントロールして達成する。得られた共沈殿物は、−２０℃に凍結され、真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施する。得られる乾燥した共沈殿物はそれから、ｐＨ８．５０、約３７℃でアパタイトに変換される。二次架橋はガンマ線照射を用いて実施する。
【００８８】
「材料」
・タイプI：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Integra
Life Science Plainsboro, NJ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
【００８９】
「手順」
〔工程I〕
ブルシャイトのコラーゲンとグリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の３：１に選択する。
２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を１０ｍｇ／ｍＬに設定する。
ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ2+］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］）および（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．５で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図１１（ｐＨを４．５に保つためのイオン濃度および、硝酸カル
シウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。
この点の軌跡をブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ（同一軸で）、３０ｍｇ／ｍＬ（コラーゲンとＧＡＧの合計濃度の３倍）曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（３０ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．５で（［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］＝０．１７６８Ｍ；Ｃａ（ＮＯ3）．４Ｈ2Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）2＝０．０４９）で製造す
ることができる一組の反応物濃度が与えられる。これが図１２（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．５合成のための条件の決定方法）に示される。
１．８３７ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１７６８ＭのＨ3ＰＯ4の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分間攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いてコラーゲン分散液を作り出す。
０．１６３ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１７６８Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。
９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、コラーゲン／ＧＡＧが得られる。
９０分の混合の後、２．４９８ｇのＣａ（ＯＨ）2および０．３８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏをコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合のもと３０分かけて加えて、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、さらに１４．３ｍＬの０．１７６８ＭのＨ3ＰＯ4をその混合しているスラリーに添加する。
３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．５である。
３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【００９０】
〔工程II〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。
凍結したスラリーは冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図１３に示す。
【００９１】
〔工程III〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。
０．０１８ＭのＥＤＡＣおよび０．００７ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。
ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌しながら新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。
ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で、２回１０分間隔で、成長させる。
それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図１４にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【００９２】
〔工程IV〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃でブルシャイトに関して予め飽和した５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを８．５０に調整する。
温度およびｐＨを７２時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。アパタイトに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１５（コラーゲン／ＧＡＧ／アパタイト生体材料を形成するために、アパタイトに３７℃、ｐＨ８．５０で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
【００９３】
〔工程V〕
乾燥したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物を線量３２．１ｋＧｙのガンマ線照射を施した。図１６にガンマ線照射後（ガンマ線照射による二次架橋後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）のＸ線か回折パターンを示す。
【実施例４】
【００９４】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；重量で８５％タイプI、重量で１５％タイプIII；日本ミートパッカー社（Japan Meat Packers，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma‐Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO,米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ３；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
【００９５】
「手順」
〔工程I〕
溶液ＡはＣａ（ＯＨ）2を０．４８ＭのＨ3ＰＯ4に室温で濃度０．１２Ｍになるように
溶解し、得られた溶液をｐＨ３．２まで滴定して準備した。
溶液Ｂはコンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解して準備した。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ、そ
れからＣａ（ＯＨ）2を、硝酸塩：水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カ
ルシウム濃度２・４Ｍの分散液を製造した。
０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合した。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加えた。６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視した。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成した。
【００９６】
〔工程II〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥した。
【００９７】
〔工程III〕
共沈殿物を希薄な酢酸（ｐＨ３．２）に入れ、線量３０ｋＧｙのガンマ線で照射した。それから架橋した沈殿物を溶液から分離し、リンスして空気中３７℃で乾燥した。
【００９８】
〔工程IV〕
架橋した共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用い
て溶液のｐＨを６．６５に調整した。温度およびｐＨを４８時間、一定に保ち、その後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥した。
【００９９】
〔工程V〕
架橋、加水分解した共沈殿物顆粒を室温で真空炉に置き、５０ミリトールの真空にして、それから温度を１０５℃まで上げた。２４時間後、温度を室温に戻し、真空を解除した。
【０１００】
図１７は、３種共沈殿物および乾燥（工程IとII）直後の複合体のＸ線回折パターンを
示す。このパターンで存在する主要な相はブルシャイトであることが確認される。
【０１０１】
図１８は、一次架橋（工程III）後の共沈殿物顆粒の構造のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
顆粒の微細構造的に均一な本質に言及することは価値がある。
【０１０２】
リン酸八カルシウムへの加水分解の進行（工程IV）は、図１９のＸＲＤパターンで説明される。進行する１２．５°のブルシャイトの強度の減少、４．５°の主要なリン酸八カルシウム（ＯＣＰ）の強度の増加によって４８時間に渡って無機相のＯＣＰへの変換が示唆される。
【０１０３】
複合体のＴＥＭ画像を図２０に示す。コラーゲン／ＧＡＧマトリクス中に分散した１０〜２０ｎｍの低アスペクト比のリン酸カルシウム結晶のランダム分布は明らかである。
【０１０４】
本発明の複合生体材料は生体吸収材料として使用することができる。移植の後、その材料から作製されたデバイスが完全に吸収され、後には健康な再生された組織だけが残り、移植それ自体の痕跡を残さないことが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医用用途のための合成骨、歯科材料および再生足場、特にコラーゲン、リン酸カルシウム材料および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む合成骨、歯科材料および再生足場およびそれらの前駆体に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然骨はコラーゲン、グリコサミノグリカンを含む非コラーゲン状有機相およびリン酸カルシウムとの生体複合体である。その複雑な階層構造によって、高剛性、強度および破壊靭性などの優れた機械的性質を有し、それによって骨は日々受ける生理学的な応力に耐える。この分野の研究者が直面する難題は、人体や動物体内の合成材料の中や周辺に自然骨が成長する組成および構造を有する合成材料を作ることである。
【０００３】
骨は、体環境の中で形成される骨類似アパタイト層によって（生体活性と称される性質）人体内のリン酸カルシウムに直接結合することが観察されている。一方、コラーゲンおよび、コラーゲンやグリコサミノグリカンのような他の生体有機物を含む共重合体は、人体の骨の生成および維持に欠かせないものを含む多数の細胞タイプの接合や増殖に最適な基材として知られている。
【０００４】
ヒドロキシアパタイトはリン酸カルシウムであり、骨の代用材料の成分として最も一般的に使用されている。しかしながら、ブルシャイト、リン酸三カルシウムおよびリン酸八カルシウムなどの他のリン酸カルシウム形と比べたとき、それは、比較的に不溶性である。人体中の材料吸収速度は特に遅いので、アパタイトの比較的低い溶解性が、生体材料を製造する場合、不利に働くことがあり得る。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウムは機械的に硬い材料である。しかしながら、それらは自然骨と比べると比較的脆い。コラーゲンは機械的に靭性のある材料であるが、自然骨と比べると比較的剛性が低い。コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体を含む材料はコラーゲン単体に比較して靭性と剛性があるが、しかし、自然骨と比べるとまだ比較的に剛性が低い。
【０００６】
従来技術で、ヒドロキシアパタイトよりも機械的に改良された靭性、並びにコラーゲンおよびコラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも改良された剛性を有する合成骨代用材料を製造するこれまでの試みには、コラーゲンとアパタイトを機械的に混合する方法がある。そのような機械的方法は欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４（特許文献１）に記載されている。
【０００７】
この技術のその後の開発には、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン‐４‐硫酸を含みこれらの成分を機械的に混合して骨代替材料の製造を含む。これは、欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０（特許文献２）に記載されている。この文献はさらに、コンドロイチン‐４‐硫酸をコラーゲンに脱水素熱的に架橋させることが記載されている。アパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン‐４‐硫酸を含む材料は良好な生体適合性を有することが見出されている。アパタイトをコラーゲン、任意選択的にコンドロイチン‐４‐硫酸と機械的に混合することで、コラーゲン／コンドロイチン‐４‐硫酸でコートされたアパタイト粒子が実質的に形成される。そのような材料は、生体適合性はあるものの、人体または動物体内では自然骨の成長に限界があり、合成材料のリン酸カルシウム相の改造にならないことが見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４
【特許文献２】欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０
【発明の概要】
【０００９】
本発明は従来技術に付随する少なくともいくつかの問題を解決しようとするものである。
【００１０】
第一の態様において、本発明はコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、カルシウム源、リン源および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を供給する工程、およびコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを一緒に前記水溶液から３種共沈殿物を形成するように沈殿する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
３種共沈殿物なる用語は３種類の化合物がその溶液／分散液から実質的に同時に沈殿した３種類の化合物の沈殿を包含する。それは、特に成分を個別に、例えば異なる溶液から沈殿させ、それらの成分を機械的に混合して形成した材料と区別される。共沈殿物の微細構造は成分を機械的に混合して形成した材料と本質的に異なる。
【００１２】
第一の態様において、溶液のｐＨは２．５から６．５、より好ましくは２．５から５．５である。さらに好ましくは溶液のｐＨが３．０から４．５である。さらにより好ましくは溶液のｐＨは３．８から４．２である。もっとも好ましくは溶液のｐＨが約４である。
【００１３】
カルシウム源は好ましくは、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、珪酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から１つ以上が選択される。ヘパリンのカルシウム塩は豚の腸粘膜から誘導することができる。適当なカルシウム塩はシグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich Inc)から市販されている。
【００１４】
リン源は好ましくは、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム２水和物（Ｎａ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ時折ＧＰＲセレンセ
ン塩と称される）およびリン酸トリメチル、リン酸のアルカリ金属塩（例、ＮａまたはＫ）およびリン酸のアルカリ土類塩（例、ＭｇまたはＣａ）から１つ以上が選択される。
【００１５】
グリコサミノグリカンはニ糖の繰り返し単位を含む長鎖の分岐のない多糖類を含む一群の高分子である。好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸から１つ以上が選択される。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン‐４‐硫酸またはコンドロイチン‐６‐硫酸でよいし、その両方ともシグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc）から入手できる。コンドロイチン‐６‐硫
酸は鮫の軟骨から誘導できる。ヒアルロン酸は人間の臍帯から誘導できる。ヘパリンは豚の腸粘膜から誘導できる。
【００１６】
３種共沈殿物の沈殿において溶液の温度は、好ましくは４．０から５０℃である。より好ましくは溶液の温度は１５から４０℃である。溶液は２０から３０℃の室温でもよく、２０から２７℃が好ましい。最も好ましくは約２５℃である。
【００１７】
水溶液のカルシウムイオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐3、好
ましくは０．００１から１ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法がさらにろ過および／または
低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐3（例、０．０８から０．２５ｍｏｌｄｍ‐3）、最も好ましくは
０．１から０．５ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法がさらに、凍結乾燥および任意選択的
に射出成形工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐3、最も好ましくは０．０５から０．１８ｍｏｌｄｍ‐3である。
【００１８】
好ましくは、溶液はリン酸塩イオンを含み、溶液中のリン酸塩イオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐3、好ましくは０．００１から１Ｍである。その方法
がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐3、さらにより好ましくは０．１から
０．５Ｍ、例えば０．１から０．０３５ｍｏｌｄｍ‐3である。その方法はさらに、凍結
乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐3、さらにより好ましくは０．０５から０．
１８Ｍである。
【００１９】
好ましくは、沈殿前の溶液中のコラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１である。より好ましくは、コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が１０：１から１２：１、最も好ましくはその比率が１１：１から２３：２である。
【００２０】
好ましくは、３種共沈殿物中のコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００、より好ましくは５：１から１：２０、さらにより好ましくは３：２から１：１０、最も好ましくは３：２から１：４である。
【００２１】
沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度は典型的には、１から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１から１０ｇ／Ｌである。その方法がろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、溶液中のコラーゲン濃度がより好ましくは１から１０ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１．５から２．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．５から２．０ｇ／Ｌである。その方法が凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度が好ましくは５から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは５から１２ｇ／Ｌ、最も好ましくは９から１０．５ｇ／Ｌである。
【００２２】
沈殿前の溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカン全濃度は典型的には、０．０１から１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１から１ｇ／Ｌである。その方法がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度は好ましくは０．０３から１．２５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは０．１２５から０．２５ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．１３から０．１８２ｇ／Ｌである。その方法がさらに凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度はより好ましくは０．１５から１．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．４１から１．２ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．７８から０．９６ｇ／Ｌである。
【００２３】
好ましくはその溶液がカルシウムイオンを含み、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率が典型的には重量で１：４０から５００：１、その方法がさらにろ過および／または低温乾燥の工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率は好ましくは１：４０から２５０：１、さらにより好ましくは１：１３から５：４であり、最も好ましくは１：１３から１：２である。その方法がさらに凍結乾燥および任意選択的に射出成形工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率はより好ましくは１：８から５００：１、さらにより好ましくは５：１２から３０：１、最も好ましくは５：５から５：１である。
【００２４】
沈殿は、コラーゲン、カルシウム源、リン源、１つ以上のグリコサミノグリカンを酸性水溶液中で組み合わせて、沈殿が生じるまで放置するか、溶液を攪拌、アンモニアのよう
な塩基性の滴定剤を用いて滴定、予め作成したブルシャイトのような核剤の添加、カルシウム源の添加速度の変化、およびこれらの技術の組み合わせによって達成される。
【００２５】
第二の態様において、本発明は、コラーゲン、リン酸八カルシウムおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を供給する工程、および前記複合材料中の少なくともブルシャイトの幾分かが加水分解によってリン酸八カルシウムに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
生体材料たる用語は人体または動物体と生体適合性がある材料を包含する。
【００２７】
第二の態様において、複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【００２８】
好ましくは、ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はリン酸八カルシウムがブルシャイトよりも熱力学的に安定するｐＨ以上である。好ましくは、この水溶液のｐＨは６から８である。より好ましくは、この水溶液のｐＨは６．３から７である。最も好ましくは、この水溶液のｐＨは約６．６５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物および／またはリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。好ましい水溶液はアンモニアを用いて所望のｐＨに滴定した酢酸を含む。
【００２９】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらにより好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００３０】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは１２から１４４時間、より好ましくは１８から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【００３１】
第三の態様において、本発明は、コラーゲン、アパタイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を供給する工程、および前記複合材料中のブルシャイトの少なくとも幾分かが加水分解によってアパタイトに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３２】
アパタイトはカルシウムとリン酸塩を含む一群の鉱物であり、一般式Ｃａ5（ＰＯ4）3
（Ｘ）で表され、式中、Ｘは典型的にはＯＨ‐、Ｆ‐、Ｃｌ‐のイオン、当業者に公知の他のイオンでもよい。アパタイトはシリコン置換アパタイトのような置換されたアパタイトも含む。アパタイトはヒドロキシアパタイトを含み、それはアパタイトの特定例である。ヒドロキシアパタイトはシリコンで置換されてもよい。
【００３３】
第三の態様において、好ましくは複合材料が、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は、発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【００３４】
好ましくは、ブルシャイトのアパタイトへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はアパタイトがブルシャイトよりも熱力学的に安定す
るｐＨ以上である。好ましくはブルシャイトのアパタイトへの変換は、水溶液のｐＨが６．６５から９であり、より好ましくは７から８．５であり、さらにより好ましくは７．２から８．５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物および／またはリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。
【００３５】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらに好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００３６】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは１２から２８８時間、より好ましくは１８時間から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【００３７】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換速度を増加させる方法は、（ｉ）温度を上げること、（ｉｉ）溶液中のブルシャイトの濃度および／または（ｉｉｉ）攪拌速度である。
【００３８】
本発明に従って、アパタイトとリン酸八カルシウムの両方を含む生体材料を製造することが望ましいであろう。本発明の第二および第三の態様の方法は、リン酸八カルシウムとアパタイトの両方を含む生体材料を製造するために組合すことができる。まず、３種共沈殿物中のブルシャイトをリン酸八カルシウムに変換し、それからリン酸八カルシウムを部分的にアパタイトに変換することができる。全体として、またはほぼ全体として（例、少なくとも９８％）、ブルシャイトまたはリン酸八カルシウムのアパタイトへの変換は典型的にｐＨが８．０以上、約１２時間で生じる。したがって、前記材料中のブルシャイトおよび／またはアパタイトの部分的変換は１２時間以内で加水分解によって達成することができる。
【００３９】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくはｐＨが６．６５から１０、より好ましくは７．２から１０、さらにより好ましくは８から９である。
【００４０】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、さらに好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【００４１】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２から１４４時間、より好ましくは１２から９６時間、最も好ましくは２４から７２時間で実施される。
【００４２】
本発明の第二および第三の態様において、ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換が、好ましくは３０から４０℃の温度で実施される。より好ましくはその変換は３６から３８℃の温度で実施される。最も好ましくは、その変換は約３７℃で実施される。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法が、３種共沈殿物中の１つ以上のグリコサミノグリカンとコラーゲンとの架橋工程を含む。３種共沈殿物によって、これはコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物およびその誘導体を含む。誘導体は、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換された共沈殿物および、成形または鋳造された、またはいかなる化学的または機械的な加工にかけられた共沈殿物を含む。架橋はいかなる従来技術を用いても達成される。
【００４４】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換され、ブルシャイトのリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換前にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。この架橋は、３種共沈殿物を１つ以上のガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理、ブドウ糖、マンノース、リボースまたは蔗糖のような単純な糖によって非酵素的な糖化、３種共沈殿物をグルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよび／またはノルジヒドログアヤレト酸の１つ以上に接触およびこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。これらの方法は従来技術である。
【００４５】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換される場合、ブルシャイがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換後にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。ブルシャイトがアパタイト／リン酸八カルシウムへ変換後の架橋が上記に記載の１つ以上の方法、または脱水素熱的処理、またはこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。脱水素熱的処理は基材を昇温下、低圧で処理する。脱水素熱的処理の温度は９５℃から１３５℃でよい。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に１８から３６時間で完了が所望される場合、好ましくは１００℃から１１０℃、最も好ましくは１０５℃から１１０℃である。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に４から８時間で完了が所望される場合、好ましくは１２０℃から１３５℃、最も好ましくは１２５℃から１３５℃である。
【００４６】
好ましくは、コラーゲンとグリコサミノグリカンとが、ブルシャイトがリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへ変換される前と後両方で架橋される。
【００４７】
本発明の方法は、複合生体材料を骨または歯の代用として用いるため適当な構造に成形する工程を含む。そのような工程は３種共沈殿物の形成の後で、しかし、ブルシャイトのいかなる変換または生ずるかもしれないコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋の前に起こるかもしれない。
【００４８】
別の方法として、生体材料の成形工程はブルシャイトのアパタイトおよび／またはリン酸八カルシウムの変換後、またはコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋後で起こるかもしれない。
【００４９】
好ましくは、複合材料は、（ｉ）ろ過および／または低温乾燥、（ｉｉ）凍結乾燥、（ｉｉｉ）射出成形および（ｉｖ）常温圧縮から選択される技術で成形される。ろ過および／または低温乾燥は、その温度が１５℃から４０℃、最も好ましくは３５℃から４０℃であり、典型的に材料の密度の高い粒状形になる。凍結乾燥は典型的には、開放多孔形状になる。射出成形は用いる金型の形に依存して材料の広範囲な形状／形態になる。常温圧縮は典型的には密度の高いペレット形状になる。
【００５０】
さらに本発明は、前駆体材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料を合成生体材料に変化させるのに適する前駆体材料を提供する。好ましくは、その複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含むまたは実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様の方法によって製造することができる。
【００５１】
本発明はまた、コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本明細書で記述される本発明の方法によって得ることができる。
【００５２】
本発明はまた、コラーゲン、リン酸八カルシウムおよび１つ以上のグリコサミノグリカ
ンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第二の態様に従う方法によって得ることができる。
【００５３】
本発明はまた、コラーゲン、アパタイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第三の態様に従う方法によって得ることができる。
【００５４】
本発明はまた、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびブルシャイトの３種共沈殿物を含む複合生体材料を提供する。
【００５５】
本発明はまた、一つ以上のリン酸カルシウム材料の粒子、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカン含む複合生体材料を提供し、コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、リン酸カルシウム材料の粒子がマトリクス中に分散し、およびそのリン酸カルシウム材料がブルシャイト、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトの１つ以上から選択される。
【００５６】
以下の説明は、他に特に指定がない限り、本発明に従って複合生体材料のすべての態様に関する。
【００５７】
コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンは好ましくは架橋されている。
【００５８】
コラーゲンは好ましくは材料中に５から９０（乾燥）重量％、より好ましくは１５から６０（乾燥）重量％、より好ましくは２０から４０（乾燥）重量％の量で存在する。
【００５９】
材料中に１つ以上のグリコサミノグリカンは、好ましくは０．０１から１２（乾燥）重量％、より好ましくは１から５．５（乾燥）重量％、最も好ましくは１．８から２．３（乾燥）重量％の量で存在する。
【００６０】
材料がブルシャイトを含む場合、好ましくはコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）５：１から１：２０、最も好ましくは重量（乾燥）で３：２から１：１０、例えば、重量（乾燥）で３：２から１：４である。
【００６１】
材料がリン酸八カルシウムを含む場合、コラーゲンとリン酸八カルシウムとの比率は、好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）で５：１から１：２０、最も好ましくは３：２から１：１０重量（乾燥）である。
【００６２】
コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が好ましくは重量（乾燥）で８：１から３０：１であり、より好ましくは、重量（乾燥）で１０：１から３０：１、さらにより好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１２：１、最も好ましくは重量（乾燥）で１１：１から２３：２である。
【００６３】
本発明による複合生体材料は代用骨または歯科材料として使用することができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明の複合生体材料を含む合成骨材料、骨移植物、骨接ぎ片、骨代用品、骨足場、充填剤、コーティングまたは接着剤を提供する。コーティングなる用語は本発明の生体材料または前駆体を含むいかなるコーティングを含む。コーティングは補綴部材、骨または、人体または動物の体に使用する目的のいかなる基材の外面または内面に適用できるが、それは粒子状材料を含む。本発明の組成は、限定されないが骨および歯科材料を含む無機物化された生体材料で生体内および生体外修復用に用いることができる。本
発明の生体材料は同種移植および自家移植の成長に用いることができる。
【００６５】
リン酸八カルシウムを含む本発明による生体材料は、前駆体ブルシャイト相が無い、または実質的に無くてよい。この生体材料は、ブルシャイトが生体材料中のリン酸カルシウムの全量に対して重量で２％以下でよい。
【００６６】
リン酸カルシウム材料は、相が純粋なリン酸八カルシウムまたはアパタイトを含むまたは実質的に構成される。相が純粋とは、所望の相（Ｘ線解析で測定）が少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％を意味する。別の方法として、生体材料は、生体材料の所望の性質に依存するが、リン酸八カルシウムとアパタイトの混合物でもよい。
【００６７】
ブルシャイトを含む本発明の材料は、生体材料を作成する前駆体材料として使用するかまたはそれ自体で生体材料として使用するのが適しているであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】共沈殿後の複合体のＸＲＤパターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図２】３種共沈殿物のＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図３】３種共沈殿物のＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図４】１０５℃、５０ミリトール、４８時間の脱水素熱的処理後の複合体のＸＲＤパターンの図であり、ブルシャイト相が脱水素化された形のモネタイトに変換されたことを示す。
【図５】ｐＨ４．０に保つための、イオン濃度と、硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比との組み合わせ群を示すグラフである。
【図６】リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との質量比１：１を含む３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．０合成のための条件を求めるためのグラフである。
【図７】非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図８】ＣａＰ：コラーゲン＋ＧＡＧ＝１：１の３種共沈殿物表面の二次（ＳＥ）および後方散乱電子（ＢＳＥ）画像を示す写真である。
【図９】ＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１０】コラーゲン／ＧＡＧ／ＯＣＰ生体材料を形成するために、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）に３７℃、ｐＨ６．６７で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１１】ｐＨ４．５に保つための、イオン濃度と、硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比との組み合わせ群を示すグラフである。
【図１２】リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との３：１質量比を含む３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．５合成のための条件を求めるためのグラフである。
【図１３】非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１４】ＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイト３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１５】コラーゲン／ＧＡＧ／アパタイト生体材料を形成するために、アパタイトに３７℃、ｐＨ８．５０で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１６】ガンマ線照射による二次架橋後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋα照射）を示す図である。
【図１７】三種共沈及び乾燥処理（工程IおよびII）直後における複合材料のＸ線回折パターンを示す図である。
【図１８】一次架橋（工程III）後の共沈殿物顆粒の構造を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図１９】リン酸八カルシウムへの加水分解の進行（工程IV）の情況を示すＸＲＤパターンの図である。
【図２０】複合体のＴＥＭ画像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明による方法は以下の一連の方法を用いて実施されるが、その方法とは、コラーゲン、１つ以上のグリコサノグリカンまたは１つ以上のリン酸カルシウム成分の生体材料を製造するために全体としてまたは部分的に適用される。以下の説明は実施例の方法で提供され、本発明によるいかなる態様の方法にも適用が可能である。
【００７０】
「I：コラーゲン、ＧＡＧおよびリン酸カルシウム・ブルシャイトの酸性ｐＨでの３種共
沈殿」
この工程は複合体の３種（またはそれ以上）の成分からなる溶液から沈殿を経て同時形成を開始し、３種（またはそれ以上）それぞれの相の比率をコントロールするために実施される。複合体の組成上の性質のコントロール（特に、コラーゲン：ＧＡＧ：ＣａＰ比率）は、ｐＨ、温度、熟成時間、カルシウムイオン濃度、リンイオン濃度、コラーゲン濃度およびＧＡＧ濃度の１つ以上を変化させることにより達成される。ｐＨは一定に保っても（例えば、緩衝剤、ｐＨスタット滴定または他の方法を用いて）または変化させてもよい。可能な２次（汚染物）相は、他の酸性リン酸カルシウム（例、モネタイト、リン酸水素カルシウム）および、滴定および反応剤付加の副産物を含む錯体（例、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム）を含む。架橋を助成する添加剤（例、グルコース、リボース）または生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）もこの工程で添加することができる。
【００７１】
「II：ネット・シェイプの形成」
この工程は最終複合体形状の所望の構造、特に気孔構造のコントロールに重点を置いて製造するために実施される。技術として、ろ過および低温乾燥（密度の高い粒状形となる）、凍結乾燥（開放気孔形状になる）、射出成形（金型のタイプに依存して広範囲な形状になる）および常温圧縮（密度の高いペレット形状になる）が挙げられる。
【００７２】
「III：一次架橋」
この工程は好ましくは、高いｐＨの溶液に置かれる場合、複合体のＧＡＧ含量が急速に流出せず、さらに、複合体の機械的および分解上の性質を高めるために実施される。技術として、低温物理的技術（例、ガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理）、化学的技術（例、単純な糖での非酵素的糖化、グルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ノルジヒドログアヤレト酸）または組み合わせ方法（例、同時に非酵素的糖化とガンマ線照射）が挙げられる。リン酸八カルシウム（即ち、工程IVとして）に変換が望ましい場合、一次架橋は３７℃未満で有利に実施され、ブルシャイト相がその脱水素化形であるモネタイト（容易にリン酸八カルシウムに加水分解されないリン酸カルシ
ウム）に変換されるのを防ぐ。
【００７３】
「IV：加水分解」
この工程は、ブルシャイト（生理的ｐＨにおいて高い溶解性の相）からのＣａＰ相が加水分解され、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイト（生理的ｐＨにおいて低い溶解性の相）になり、実質的に溶解性汚染物質（例、硝酸アンモニウム、リン酸水素カルシウム）を除去するために部分的にまたは全面的に実施される。ＯＣＰに加水分解の場合、選択したｐＨは約６．６５の一定値に有利に保持され（緩衝液、ｐＨスタットまたは他の方法を用いて）、約３７℃で約２４〜４８時間である。工程Iの場合のように、架橋を助
成する添加剤（例、グルコース、リボース）または生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）も加水分解工程（工程IV）の間に添加できる。
【００７４】
「V：二次架橋」
この工程は、複合材料の機械的および分解上の性質をさらに調整するために実施することができる。上記の工程IIIに挙げた架橋手順のある部分あるいはすべてを、二次架橋を
達成するために用いることができる。
【００７５】
以下の実施例および添付する図は、本発明を理解するのにさらに役立つように提供される。実施例および図は、本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。実施例および図で記載されたいかなる特徴は前記の説明のいかなる態様にも適用可能である。
【実施例１】
【００７６】
実施例１は、前記説明した合成方法の一例であり、工程IからIIIのみを適用して実施される。３種共沈殿は室温（２０〜２５℃）、約３．２のｐＨ（アンモニアで滴定して保持）で実施される。この実施例において、共沈殿物は３７℃で乾燥、脱水素熱的処理を経て架橋される。ＣａＰの加水分解的変換も二次架橋もこの実施例では実施されない。
【００７７】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；８５％タイプI、１５％タイプIII：日本ミートパッカー社（Japan Meat Packers，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma‐Aldrich Inc，St.Louis，MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）2シグマアルドリッチ社（Sigma
Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ3ＰＯ4；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ3；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
【００７８】
「手順」
〔工程I〕
溶液Ａ
Ｃａ（ＯＨ）2を０．４８ＭのＨ3ＰＯ4に室温で濃度０．１２Ｍになるように溶解し、
得られた溶液をアンモニアを用いてｐＨ３．２まで滴定する。
溶液Ｂ
コンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解する。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ、それからＣａ（ＯＨ
）2を、硝酸塩と水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カルシウム濃度２・
４Ｍの分散液を製造する。
０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合する。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加える。
６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視する。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成する。
【００７９】
〔工程II〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥する。
得られた３種共沈殿物のＸ線回折パターンを図１（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）およびＳＥＭ画像を図２に示す。
【００８０】
〔工程III〕
３種共沈殿物を、１０５℃、５０ミリトールの真空のもと、４８時間の脱水素熱的処理（ＤＨＴ）で架橋する。ＤＨＴ後の３種共沈殿物のＴＥＭ画像を図３に示す。図４はＤＨＴ後の３種共沈殿物のＸ線回折パターンを示しており、ブルシャイト相が脱水素された形のモネタイトに変換されていることを示唆している。
【実施例２】
【００８１】
実施例２は、前述の説明の合成方法の例であり、工程IからIVのみの適用を経て実施さ
れる。３種共沈殿は室温、ｐＨ４．０で実施される。この実施例において、ｐＨのコントロールは、水酸化カルシウムおよび硝酸カルシウム濃度の注意深いコントロール（３種共沈殿中のブルシャイトのコラーゲンとＧＡＧ合計との重量比のコントロールも可能な手法）によって達成される。得られた３種共沈殿物は、−２０℃に凍結され真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施される。得られる乾燥した３種共沈殿物はそれから、ｐＨ６．６７、温度約３７℃での加水分解によってリン酸八カルシウムに変換される。この実施例において、二次架橋は実施されない。
【００８２】
「材料」
・タイプI：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Integra
Life Science Plainsboro, NJ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
【００８３】
「手順」
〔工程I〕
ブルシャイトのコラーゲンとガリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の１：１に選択する。
２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を２１ｍｇ／ｍＬに設定する。
ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ2+］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで作成された）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］）および（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．０で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図５（ｐＨを４．０に保つためのイオン濃度およびの硝酸カルシウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。
この点の軌跡を同一軸でブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ、２１ｍｇ／ｍＬ曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（２１ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計（２１ｍｇ／ｍＬ）との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．０で（［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］＝０．１３８３Ｍ；Ｃａ（ＮＯ3）．４Ｈ2Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）2＝０．１３５６）で製造することができる一組の反応物濃度が与えられる。
図６（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．０合成のための条件の決定方法）参照。
３．８６４４ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１３８３ＭのＨ3ＰＯ4の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分以上攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いて非常に粘調なコラーゲン分散液を作り出す。
０．３４３６ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１３８３Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。
９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、非常に粘調なコラーゲン／ＧＡＧを得る。
９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）2および０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2
．４Ｈ2Ｏを極めて粘調なコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合
のもと３０分かけて加え、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、さらに１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ3ＰＯ4をそのスラリーに混合する。
３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．０である。
３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【００８４】
〔工程II〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。
凍結したスラリーはそれから冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。
非結合水除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図７に示し、共沈殿物の表面のＳＥＭ画像を図８（ＣａＰ：コラーゲン＋ＧＡＧ＝１：１の３種共沈殿物の表面の二次（ＳＥ）および後方散乱電子（ＢＳＥ）画像）に示す。
【００８５】
〔工程III〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥した３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。
０．０３５ＭのＥＤＡＣおよび０．０１４ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。
ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌して新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。
ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で２回１０分間隔で、成長させる。
それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図９にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【００８６】
〔工程IV〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを６．６７に調整する。
温度およびｐＨを４８時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。
ＯＣＰに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１０（コラーゲン／ＧＡＧ／ＯＣＰ生体材料を形成するために、ＯＣＰに３７℃、ｐＨ６．６７で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
【実施例３】
【００８７】
実施例３は、前述の説明の合成方法の例であり、工程IからVまでの適用を経て実施される。３種共沈殿は室温、ｐＨは約４．５で実施される。実施例２のように、ｐＨのコントロールは、滴定剤を用いず、水酸化カルシウムおよび硝酸カルシウム濃度を注意深くコントロールして達成する。得られた共沈殿物は、−２０℃に凍結され、真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施する。得られる乾燥した共沈殿物はそれから、ｐＨ８．５０、約３７℃でアパタイトに変換される。二次架橋はガンマ線照射を用いて実施する。
【００８８】
「材料」
・タイプI：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Integra
Life Science Plainsboro, NJ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
【００８９】
「手順」
〔工程I〕
ブルシャイトのコラーゲンとグリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の３：１に選択する。
２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を１０ｍｇ／ｍＬに設定する。
ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ2+］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］）および（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．５で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図１１（ｐＨを４．５に保つためのイオン濃度および、硝酸カル
シウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。
この点の軌跡をブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ（同一軸で）、３０ｍｇ／ｍＬ（コラーゲンとＧＡＧの合計濃度の３倍）曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（３０ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．５で（［Ｃａ2+］＝［Ｈ3ＰＯ4］＝０．１７６８Ｍ；Ｃａ（ＮＯ3）．４Ｈ2Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）2＝０．０４９）で製造す
ることができる一組の反応物濃度が与えられる。これが図１２（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．５合成のための条件の決定方法）に示される。
１．８３７ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１７６８ＭのＨ3ＰＯ4の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分間攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いてコラーゲン分散液を作り出す。
０．１６３ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１７６８Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。
９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、コラーゲン／ＧＡＧが得られる。
９０分の混合の後、２．４９８ｇのＣａ（ＯＨ）2および０．３８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏをコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合のもと３０分かけて加えて、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、さらに１４．３ｍＬの０．１７６８ＭのＨ3ＰＯ4をその混合しているスラリーに添加する。
３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．５である。
３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【００９０】
〔工程II〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。
凍結したスラリーは冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図１３に示す。
【００９１】
〔工程III〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。
０．０１８ＭのＥＤＡＣおよび０．００７ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。
ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌しながら新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。
ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で、２回１０分間隔で、成長させる。
それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図１４にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【００９２】
〔工程IV〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃でブルシャイトに関して予め飽和した５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを８．５０に調整する。
温度およびｐＨを７２時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。アパタイトに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１５（コラーゲン／ＧＡＧ／アパタイト生体材料を形成するために、アパタイトに３７℃、ｐＨ８．５０で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
【００９３】
〔工程V〕
乾燥したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物を線量３２．１ｋＧｙのガンマ線照射を施した。図１６にガンマ線照射後（ガンマ線照射による二次架橋後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）のＸ線か回折パターンを示す。
【実施例４】
【００９４】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；重量で８５％タイプI、重量で１５％タイプIII；日本ミートパッカー社（Japan Meat Packers，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Sigma‐Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Inc，St.Louis,MO,米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ３；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（BDH Laboratory supplies, Poole，英国）
【００９５】
「手順」
〔工程I〕
溶液ＡはＣａ（ＯＨ）2を０．４８ＭのＨ3ＰＯ4に室温で濃度０．１２Ｍになるように
溶解し、得られた溶液をｐＨ３．２まで滴定して準備した。
溶液Ｂはコンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解して準備した。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ3）2．４Ｈ2Ｏ、そ
れからＣａ（ＯＨ）2を、硝酸塩：水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カ
ルシウム濃度２・４Ｍの分散液を製造した。
０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合した。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加えた。６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視した。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成した。
【００９６】
〔工程II〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥した。
【００９７】
〔工程III〕
共沈殿物を希薄な酢酸（ｐＨ３．２）に入れ、線量３０ｋＧｙのガンマ線で照射した。それから架橋した沈殿物を溶液から分離し、リンスして空気中３７℃で乾燥した。
【００９８】
〔工程IV〕
架橋した共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用い
て溶液のｐＨを６．６５に調整した。温度およびｐＨを４８時間、一定に保ち、その後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥した。
【００９９】
〔工程V〕
架橋、加水分解した共沈殿物顆粒を室温で真空炉に置き、５０ミリトールの真空にして、それから温度を１０５℃まで上げた。２４時間後、温度を室温に戻し、真空を解除した。
【０１００】
図１７は、３種共沈殿物および乾燥（工程IとII）直後の複合体のＸ線回折パターンを
示す。このパターンで存在する主要な相はブルシャイトであることが確認される。
【０１０１】
図１８は、一次架橋（工程III）後の共沈殿物顆粒の構造のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
顆粒の微細構造的に均一な本質に言及することは価値がある。
【０１０２】
リン酸八カルシウムへの加水分解の進行（工程IV）は、図１９のＸＲＤパターンで説明される。進行する１２．５°のブルシャイトの強度の減少、４．５°の主要なリン酸八カルシウム（ＯＣＰ）の強度の増加によって４８時間に渡って無機相のＯＣＰへの変換が示唆される。
【０１０３】
複合体のＴＥＭ画像を図２０に示す。コラーゲン／ＧＡＧマトリクス中に分散した１０〜２０ｎｍの低アスペクト比のリン酸カルシウム結晶のランダム分布は明らかである。
【０１０４】
本発明の複合生体材料は生体吸収材料として使用することができる。移植の後、その材料から作製されたデバイスが完全に吸収され、後には健康な再生された組織だけが残り、移植それ自体の痕跡を残さないことが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料の製造方法であって、コラーゲン、カルシウム源、リン源および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を供給する工程と、前記コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを一緒に前記水溶液から３種共沈殿物を形成するように沈殿する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記水溶液のｐＨが２．５から６．５である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液のｐＨが３から４．５である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液のｐＨが３．８から４．２である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カルシウム源が硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、珪酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から１つ以上が選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リン源がリン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム２水和物およびリン酸トリメチルから１つ以上が選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のグリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸から１つ以上が選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液の温度が４から５０℃である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液の温度が１５から４０℃である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液中のコラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液がカルシウムイオンを含み、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率が重量で１：４０から５００：１である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記共沈殿物中のコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶液がカルシウムイオンを含み、水溶液中のカルシウムイオン濃度が０．０００２５から１Ｍである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液がリン酸塩を含み、水溶液中のリン酸塩濃度が０．０００２５から１Ｍである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液中のコラーゲン濃度が１．０から２０ｇ／Ｌである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカン全濃度が、０．０１から１．５ｇ／Ｌである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むことを特徴とする複合材料。
【請求項１８】
前記複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物で実質的に構成される請求項１７に記載の複合材料。
【請求項１９】
前記３種共沈殿物が請求項１〜１６のいずれか一項で定義される方法に従って製造される請求項１７または１８に記載の複合材料。
【請求項２０】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の複合材料に含まれる３種共沈殿物におけるブルシャイトの少なくとも幾分かを加水分解することによって得られたリン酸八カルシウムと、コラーゲンと、１つ以上のグリコサミノグリカンとを含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の複合材料に含まれる３種共沈殿物におけるブルシャイトの少なくとも幾分かを加水分解することによって得られたアパタイトと、コラーゲンと、１つ以上のグリコサミノグリカンとを含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２３】
代用骨または歯科材料として使用するための請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項２４】
コラーゲンが５から９０重量％で存在することを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２５】
１つ以上のグリコサミノグリカンが０．０１から１２重量％で存在することを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２６】
コラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２７】
コラーゲンとリン酸八カルシウムとの比率が重量で１０：１から１：１００であることを特徴とする請求項２１に記載の材料。
【請求項２８】
コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１であることを特徴とする請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２９】
１つ以上のリン酸カルシウム材料、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含む生体材料であって、前記コラーゲンと前記１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、前記リン酸カルシウム材料が前記マトリクス中に分散されており、前記リン酸カルシウム材料がブルシャイト、ブルシャイトを加水分解して得られたリン酸八カルシウムおよびブルシャイトを加水分解して得られたアパタイトから１つ以上が選択されることを特徴とする生体材料。
【請求項１】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合材料の製造方法であって、コラーゲン、カルシウム源、リン源および１つ以上のグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を供給する工程と、前記コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンを一緒に前記水溶液から３種共沈殿物を形成するように沈殿する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記水溶液のｐＨが２．５から６．５である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液のｐＨが３から４．５である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液のｐＨが３．８から４．２である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カルシウム源が硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、珪酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から１つ以上が選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リン源がリン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム２水和物およびリン酸トリメチルから１つ以上が選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のグリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸から１つ以上が選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液の温度が４から５０℃である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液の温度が１５から４０℃である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液中のコラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液がカルシウムイオンを含み、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率が重量で１：４０から５００：１である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記共沈殿物中のコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶液がカルシウムイオンを含み、水溶液中のカルシウムイオン濃度が０．０００２５から１Ｍである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液がリン酸塩を含み、水溶液中のリン酸塩濃度が０．０００２５から１Ｍである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液中のコラーゲン濃度が１．０から２０ｇ／Ｌである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶液中の１つ以上のグリコサミノグリカン全濃度が、０．０１から１．５ｇ／Ｌである請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むことを特徴とする複合材料。
【請求項１８】
前記複合材料がコラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物で実質的に構成される請求項１７に記載の複合材料。
【請求項１９】
前記３種共沈殿物が請求項１〜１６のいずれか一項で定義される方法に従って製造される請求項１７または１８に記載の複合材料。
【請求項２０】
コラーゲン、ブルシャイトおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の複合材料に含まれる３種共沈殿物におけるブルシャイトの少なくとも幾分かを加水分解することによって得られたリン酸八カルシウムと、コラーゲンと、１つ以上のグリコサミノグリカンとを含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の複合材料に含まれる３種共沈殿物におけるブルシャイトの少なくとも幾分かを加水分解することによって得られたアパタイトと、コラーゲンと、１つ以上のグリコサミノグリカンとを含むことを特徴とする複合生体材料。
【請求項２３】
代用骨または歯科材料として使用するための請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項２４】
コラーゲンが５から９０重量％で存在することを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２５】
１つ以上のグリコサミノグリカンが０．０１から１２重量％で存在することを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２６】
コラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２７】
コラーゲンとリン酸八カルシウムとの比率が重量で１０：１から１：１００であることを特徴とする請求項２１に記載の材料。
【請求項２８】
コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１であることを特徴とする請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項２９】
１つ以上のリン酸カルシウム材料、コラーゲンおよび１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含む生体材料であって、前記コラーゲンと前記１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、前記リン酸カルシウム材料が前記マトリクス中に分散されており、前記リン酸カルシウム材料がブルシャイト、ブルシャイトを加水分解して得られたリン酸八カルシウムおよびブルシャイトを加水分解して得られたアパタイトから１つ以上が選択されることを特徴とする生体材料。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図８】
【図１８】
【図２０】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図８】
【図１８】
【図２０】
【公開番号】特開２０１２−１１０７３９（Ｐ２０１２−１１０７３９Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２０９７０（Ｐ２０１２−２０９７０）
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００６−５３７４１２（Ｐ２００６−５３７４１２）の分割
【原出願日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０１４８４８５１）ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド (40)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＥＮＴＥＲＰＲＩＳＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００６−５３７４１２（Ｐ２００６−５３７４１２）の分割
【原出願日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０１４８４８５１）ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド (40)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＥＮＴＥＲＰＲＩＳＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]