レプリキンペプチドおよびその使用
本発明は、単離したインフルエンザペプチドおよび核酸配列、ならびに急速複製および毒性を予測する高度に保存されたレプリキンおよびレプリキン骨格配列においてアミノ酸または核酸の置換パターンを有する前記インフルエンザペプチドおよび核酸配列を識別する方法を提供する。置換の予測パターンを有するペプチドおよび核酸配列を識別するステップを含む、新生インフルエンザ株における毒性を予測する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、レプリキンとして知られる一群のペプチド、およびそのようなペプチドをコード化する核酸に関する。レプリキンは、アミノ酸配列およびそれらのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列内で定義された構造特性を共有する。レプリキンペプチドは、ウイルスおよび有機体の急速な複製と関連付けられている。レプリキン骨格は、一群のレプリキンペプチドのサブセットである。レプリキン骨格は、エピデミックと関連しているインフルエンザウイルスの株において高度に保存され、急速な複製、毒性および宿主細胞の死亡率と関連付けられている。本発明者は今回、インフルエンザウイルス株に高度に保存されたレプリキンおよびレプリキン骨格におけるアミノ酸の置換パターン、および対応するヌクレオチドを識別した。識別された置換パターンは毒性の変化と関連し、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックの予測として有用である。
【０００２】
本出願は、２００６年５月３０日提出の米国仮出願番号６０／８０８，９４４の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。以下の出願は、参照により本明細書に追加で組み込まれる。２００６年２月１６日提出の米国出願番号１１／３５５，１２０、２００５年２月１６日提出の米国仮出願番号６０／６５３，０８３、２００５年４月２８日提出の米国出願番号１１／１１６，２０３、２００４年４月２８日提出の米国仮出願番号６０／５６５，８４７、２００４年６月４日提出の米国出願番号１０／８６０，０５０、２００３年２月２３日提出の米国仮出願６０／５３１，６８６、２００３年９月２３日提出の６０／５０４，９５８、および２００３年６月６日提出の６０／４７６，１８６、２００２年７月８日提出の米国出願番号１０／１８９，４３７、２００２年３月２６日提出の米国出願番号１０／１０５，２３２、２００１年７月９日提出の米国仮出願６０／３０３，３９６および２００１年３月２７日提出の６０／２７８，７６１の優先権を主張する２００１年１０月２６日提出の米国出願番号０９／９８４，０５７。
【背景技術】
【０００３】
急速な複製は、特定の細菌、ウイルスおよび悪性腫瘍における毒性の特徴である。２００１年１０月２６日提出の米国特許出願番号０９／９８４，０５７は、レプリキンが一群の保存アミノ酸および核酸配列として、規定の配列構造を共有し、急速に複製する悪性腫瘍、細菌、ウイルス、その他有機体および複製関連タンパク質において広く検出され、急速な複製および毒性に関連する、と初めて説明した。レプリキンはアミノ酸配列またはアミノ酸配列をコード化する核酸配列であり、当該アミノ酸配列は、モチーフの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、およびモチーフの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基、第２リジン残基から６〜１０残基に位置する少なくとも１つのリジン残基、少なくとも１つのヒスチジン残基および少なくとも６％のリジン残基を含むモチーフを含む７〜約５０のアミノ酸を含む。
【０００４】
プロテオミクスの観点から、レプリキンモチーフは、脳グリア芽腫悪性腫瘍に存在するグリオーマペプチド配列に基づくアルゴリズムに由来する。健康なヒトゲノムと比較して、グリオーマに特有のペプチドにおいて認められるレプリキンアルゴリズムは、この場合の複製において、保存構造および特定の機能に関連する幅広いタンパク質群の発見をもたらした。次にインフルエンザ、ＨＩＶ、癌およびトマト縮葉ウイルスを含む異種疾患における、毒性の増加と、タンパク質内に存在するか、またはゲノムにコード化されるレプリキンペプチドの濃度の増加との関連が確立された。続いて、レプリキンの存在は、イースト、藻類、植物、マラリア、インフルエンザ、ジェミニ縮葉トマトウイルス、ＨＩＶおよび癌等の様々な有機体における急速な複製現象と関連付けられた。
【０００５】
急速に複製する有機体におけるレプリキンの存在の検出に加えて、１）レプリキン濃度（タンパク質１００アミノ酸あたりのレプリキン数またはゲノム内にコード化されるレプリキン数および、２）急速な複製に依存する特定の機能状態にあるレプリキン組成物が発見され、レプリキンは、それらが存在する有機体の複製率と量的および質的に関連するという発見の基礎を提供する。これらの機能を証明する例は、グリア芽腫細胞における急速な複製と毒性との間に見られる関係、インフルエンザウイルスにおけるレプリキンとインフルエンザパンデミックおよびエピデミックの予測との間に見られる関係、およびＨＩＶにおけるレプリキン濃度と急速な複製との関係を含む。
【０００６】
レプリキン配列、および特にレプリキン配列のモチーフを定義する要素は、急速に複製するウイルスおよび有機体、ならびに複製に関連するタンパク質において長期間保存されることが分かった。レプリキン配列は保存されるため、感染物質を検出するための一貫した標的を提供する。このレプリキンの保存は、レプリキン構造自体が、それが存在し保存されるウイルスおよび有機体の複製および生存において役割を有することも証明する。そのようにして、感染物質内で識別されたレプリキンは、感染物質に対する治療およびワクチンを開発するための良い標的である。
【０００７】
レプリキン骨格は、レプリキンのサブセットである。レプリキン骨格ペプチドは、感染物質において高度に保存されることが示されており、また急速な複製、毒性および宿主細胞の死亡率と関連付けられている。レプリキン骨格ペプチドは、約１６〜約３０のアミノ酸を含むレプリキンペプチド配列であり、さらに（１）任意に末端リジンに直接隣接する追加のリジンを含む末端リジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジンから６〜１０アミノ酸残基にあるリジンと、（４）少なくとも６％のリジンと、を含む。レプリキン骨格ペプチドは、時間、地理的空間、または疫学的発生を問わず、ウイルスまたは有機体の個別の分離株内で識別される、または遺伝子情報を共有する異なるウイルスまたは有機体において、例えば遺伝子再集合により識別される一連の保存されたレプリキンペプチドの一員である。
【０００８】
上述のように、最初に発見されたレプリキンは、グリオーマレプリキンであり、マリグニンと称される多形性脳グリア芽腫細胞（グリオーマ）細胞タンパク質において識別された。米国特許番号７，１８９，８００を参照のこと。グリオーマレプリキンが正常で健康なヒトゲノムに存在することは知られていなかった。グリオーマレプリキンの相同体を捜索するために考案されたアルゴリズムは、相同体が４，０００以上のタンパク質配列に共通でないことを明らかにした。しかし驚くことに、相同体はすべての腫瘍ウイルスおよび藻類、植物、真菌、ウイルスおよび細菌の複製タンパク質において認められた。２００２年７月８日提出の米国特許出願番号１０／１８９，４３７を参照のこと。そのようにして、広範なウイルスおよび有機体にわたるレプリキンの存在は、複製機能および急速な複製と関連付けられた。
【０００９】
急速に複製するウイルスおよび有機体ならびに複製関連タンパク質を広く検討した結果、ゲノム、タンパク質またはタンパク質フラグメントにおける１００アミノ酸あたりのレプリキン数は、急速な複製の機能的現象と関連しうることが発見された。米国特許出願番号１０／１８９，４３７を参照のこと。
【００１０】
レプリキン濃度と急速な複製との関連は、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質のアミノ酸配列と、過去１００年間のインフルエンザ流行に関する疫学的データとの比較においてさらに証明された。この比較により、１９０２年〜２００１年の４つの主要なインフルエンザ株のうちの各１つずつ生じたインフルエンザエピデミックにおける株特異性インフルエンザレプリキンの濃度が４〜１０倍増加したことが明らかになった。４つの主要なインフルエンザ株は、インフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２、および（Ａ）Ｈ３Ｎ２である。次に、濃度の増加は、少なくとも１つの特異的レプリキン組成物が消失してから１年〜最長６４年後に再出現すること、および新規の株特異性レプリキン組成物の出現によることが証明された。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１１】
レプリキンアミノ酸構造は、非レプリキンアミノ酸と同程度に変異または変化するわけではないことが認められた。レプリキン構造は、ウイルスおよび有機体において、またウイルスと有機体との間に時間を越えて保存される。この保存は、レプリキン構造が生存において重要性を有することを証明する。そのようにして、保存レプリキン構造は、生存に関連する新規の不変標的を提供し、それらは感染または悪性腫瘍の識別および治療に有用である。
【００１２】
レプリキンは、細菌、ウイルス、植物、および悪性腫瘍を含む一連のウイルスおよび有機体に保存されることが示された。特定の構造は生存機能と極めて密接に関連するため、細菌、ウイルス、植物およびその他の有機体にわたって保存されるレプリキン構造を絶えず変化させることは明らかに不可能であり、これはレプリキンが生存機能と密接に関与することを示唆する。
【００１３】
レプリキンが保存されるかどうか、または代わりに、広範な自然変異の影響を受けやすいかどうかの検討は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の様々な分離株のタンパク質配列を走査することにより行った。これらウイルスのタンパク質における変異は、何十年もの間、世界的に十分立証されている。全体レプリキンおよび特定のレプリキンにおいて認められた各構成要素レプリキンアミノ酸残基の両方が存在するかについて、ＦＭＤＶ分離株のタンパク質配列を視診した。隣接アミノ酸で生じるように、長期にわたって広範な置換の影響を受けるのではなく、レプリキン構造を含むアミノ酸は、ほとんど置換されないか、またはまったく置換されないことが認められた。つまり、非レプリキン配列と比較して、レプリキン構造は保存された。同様の配列保存は、麦ユビキチン活性酵素Ｅ等の植物、およびＨＩＶの分離株における転写活性剤（Ｔａｔ）タンパク質で認められた。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１４】
任意の構造の保存は、その構造が攻撃および破壊または刺激のために安定した不変標的を提供するかどうかについて極めて重要である。構造が何らかの方法で有機体の基本的な生存機序に関係している場合、その構造は保存される傾向がある。可変構造は不定標的を提供する。これは、以前の構造に対して特異的に生成された抗体等のアタッカーを回避するための良い手段であり、そのため修飾形態に対しては有効でない。インフルエンザウイルスはこの手段を使用するため、例えば、以前のワクチンが現行の毒性ウイルスに対してあまり効果的でなくなる可能性がある。
【００１５】
レプリキン構造の必須成分はヒスチジン（ｈ）であり、これは酸化還元酵素における金属基と頻繁に結合すること、および複製に必要なエネルギー源を提供するというその有望な機能が知られている。長期にわたるレプリキン配列の再検討により、レプリキンにおけるヒスチジン構造は常に一定であることが示唆される。そのようにして、レプリキン構造は、ウイルスまたは有機体の複製の破壊についての一層魅力的な標的を保持する。
【００１６】
レプリキン含有タンパク質も酸化還元機能、およびタンパク質の合成または延長、ならびに細胞の複製と関連付けられることが多い。金属ベースの酸化還元機能との関連、嫌気性複製中のレプリキン含有グリオーママリグニン濃度の増加、および低濃度（ピコグラム／細胞）の抗マリグニン抗体の細胞毒性は、すべてレプリキンが主要な呼吸性生存機能に関連することを示唆し、非レプリキンアミノ酸の変異特性の影響を受けにくい場合が多いことが発見された。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１７】
急速に複製するウイルスおよび有機体において、複製の速度とウイルスまたは有機体に存在するレプリキン配列の濃度との関連が確立された。１００アミノ酸中のレプリキン配列の濃度は、ウイルスまたは有機体のレプリキン数と称される。インフルエンザウイルスにおいて、レプリキン数の増加は、過去１００年間のインフルエンザ流行と関連付けられている。
【００１８】
例えば、血球凝集素タンパク質における株特異性レプリキン濃度と、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックとの量的関連が確立された（図６）。過去１００年の３つのインフルエンザパンデミック、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２のそれぞれにおいて、パンデミックをレプリキン数の増加によりレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測し、関連付けた。図６〜８および１０〜１１。４度のＨ５Ｎ１エピデミック、すなわち１９９７年、２００１年、および２００３〜２００４年（図１１）および２００６年のエピデミックのそれぞれにおいて、レプリキン数の増加は予測的であった。インフルエンザエピデミックと株特異性ウイルスタンパク質化学との関連については、これまで報告がなかった。
【００１９】
株特異性エピデミックが発生する１〜３年前にインフルエンザ群において特異性レプリキン数が増加するという発見に類似して、コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質におけるレプリキン数の増加も２００３年のＳＡＲＳパンデミックをレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測することが分かった。コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、以下のように増加した。１９９９年３．１（±１．８）、２０００年３．９（±１．２）、２００１年３．９（±１．３）、および２００２年５．１（±３．６）。このパンデミック前の増加は、レプリキンを豊富に含むコロナウイルスが２００３年のＳＡＲＳパンデミックに関与したという発見を支持する（図８を参照）。
【００２０】
ＨＩＶウイルスにおけるレプリキン数も急速な複製および毒性と関連付けられている。ＨＩＶ分離株において、ＨＩＶの増殖遅延型低タイター株（ＮＳＩ、「Ｂｒｕ」はＨＩＶ感染の初期によく見られる）は、１００アミノ酸につき１．１（＋／−１．６）のレプリキン濃度を有することが分かった。一方、ＨＩＶの急速に増殖する高タイター株（Ｓ１、「Ｌａｉ」はＨＩＶ感染の後期によく見られる）は、１００アミノ酸残基につき６．８（＋／−２．７）のレプリキン濃度を有する。さらに、中国および世界のその他多くの地域でトマトの収穫に打撃を与えたトマト縮葉ジェミニウイルスは、重複レプリキンのため高いレプリキン数を有することが示された。トマト葉巻ジェミニウイルスにおけるレプリキン数は、１００アミノ酸につき最高２０．７レプリキンまで達することが認められた。
【００２１】
レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの株において最初に識別された一群のレプリキンのサブセットである。レプリキン骨格は、インフルエンザの毒性株において高度に保存される。レプリキンおよびレプリキン骨格は、急速な複製および毒性と関連付けられているため、現在はインフルエンザウイルスの新生株におけるレプリキンの存在および濃度を使用して、到来するインフルエンザエピデミックを予測する。当該技術分野において、高い毒性および宿主細胞の死亡率をもたらすレプリキンまたはレプリキン骨格内のわずかな変化を識別する方法が必要とされる。また当該技術分野において、インフルエンザの毒性の高い株の治療を目的とする保存レプリキンおよびレプリキン骨格配列も必要とされる。さらに当該技術分野において、インフルエンザの新生株におけるワクチンの調整およびその他の治療に有用なレプリキンおよびレプリキン骨格アミノ酸配列の必要性がある。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに
（１）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、を含むインフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離したレプリキンペプチドを提供し、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン配列は、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列と比較して置換を含み、本置換はヒスチジンの置換ではなく、またインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
本置換は、インフルエンザウイルスの第３株に追加で存在し、インフルエンザウイルスの第３株における本置換の存在は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連し、インフルエンザウイルスの第３株は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含むレプリキン配列を含む。
【００２３】
好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン配列における異なるアミノ酸残基で置換されるインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する。
【００２４】
別の好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン配列における、ロイシン以外のアミノ酸残基で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は任意の疎水性アミノ酸、すなわちメチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンまたはバリンで置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸はメチオニンまたはイソロイシンで置換される。別の好適な実施形態において、単離したレプリキン配列は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスから単離される。
【００２５】
別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキン骨格ペプチドを含むワクチンを提供する。さらに別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキン骨格ペプチドに対する抗体を提供する。
【００２６】
本発明は、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキンペプチドをさらに提供する。インフルエンザウイルスの第１株は、インフルエンザウイルスの新生株であり、単離したレプリキンペプチドは、７〜約５０のアミノ酸を含み、
（１）単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基にある第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、を含むモチーフを識別するステップであって、インフルエンザウイルスの第２株における他は同一の配列と比較して、識別されたモチーフの末端残基間のレプリキンペプチド配列に位置するアミノ酸において置換が発生し、インフルエンザウイルスの第１株の識別されたモチーフの末端残基間における前記置換は、第２株と比較して、急速な複製および高い毒性に関連するステップと、識別されたモチーフを選択するステップと、識別されたモチーフを含むレプリキンペプチドを単離するステップと、により単離される。本発明は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離されたインフルエンザレプリキンペプチドをさらに提供する。
【００２７】
別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドを含むワクチンを提供する。さらに別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドに対する抗体を提供する。
【００２８】
本発明は、本発明の単離したレプリキンペプチドも提供する。レプリキンペプチドは、約２９のアミノ酸を含む。単離したレプリキンペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含んでもよく、［Ｓ］はロイシン以外の任意のアミノ酸であってもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は、ロイシン以外のアミノ酸であってもよい。別の好適な実施形態において、［Ｓ］は任意の疎水性アミノ酸であってもよく、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンまたはバリンを含む。別の好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。別の好適な実施形態において、単離したインフルエンザレプリキンペプチドは、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離される。
【００２９】
本発明は、上述の単離した配列のうちの任意の１つ以上、またはその抗原部分列、あるいは上述の単離した配列のいずれかに結合する抗体、乃至はその抗原部分列を含むワクチンも提供する。
【００３０】
本発明は、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を提供する。本方法は、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチド、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチド、およびインフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドを含むステップと、
（２）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換される第３レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸を識別するステップと、
（３）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株が高い複製、毒性、または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（４）第２レプリキン骨格と比較して、第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基も、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格ペプチドにおいて置換されることを判断するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数と、インフルエンザウイルスの第１株の初期分離株のレプリキン数とを比較するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いことを判断するステップと、
（７）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップと、を含む。
【００３１】
好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、第２レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基にある。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基である。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、ロイシン以外の疎水性アミノ酸である。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、メチオニンまたはイソロイシンである。別の好適な実施形態において，第１、第２および第３レプリキン骨格は、２９のアミノ酸を含む。さらに別の実施形態において、毒性の増加はパンデミックの兆候である。
【００３２】
本発明は、インフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法も提供する。本方法は、インフルエンザウイルスの第１新生株からレプリキンペプチドを識別するステップであって、インフルエンザレプリキンペプチドは、７〜約５０アミノの酸で構成され、
（１）単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基に位置する第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、を含むモチーフを含み、
インフルエンザウイルスの第２株における同一配列と比較して、モチーフの末端残基間のアミノ酸において置換が発生したステップと、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株における同一配列の置換と、インフルエンザウイルスの第３株における急速な複製および高い毒性とを関連付けるステップと、インフルエンザウイルスの第１株の毒性の増加を予測するステップと、を含む。
【００３３】
さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法は、コンピュータを使用して実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、様々な有機体におけるレプリキンの発生頻度を表す棒グラフを示す図である。
【００３５】
【図２】図２は、コンピュータを使用し、インフルエンザウイルスの少なくとも３つの株のレプリキン骨格を比較することにより、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を実施するという本発明の一側面を表すボックス図である。
【００３６】
【図３】図３は、レコグニン１６‐ｍｅｒへの曝露に応答して産生される抗マリグニン抗体の量を示す棒グラフを示す図である。
【００３７】
【図４Ａ−Ｅ】図４Ａは、通常の蛍光灯で撮影された血液塗抹標本の写真を示す図である。図４Ｂは、通常の蛍光灯で撮影された血液塗抹標本の写真を示す図であり、２つの白血病細胞の存在を示す。図４Ｃは、抗マリグニン抗体の存在下のグリオーマ細胞の緻密層の写真を示す図である。図４Ｄおよび図４Ｅは、抗マリグニン抗体の添加から３０分および４５分後に撮影された図４Ｃの細胞層の写真を示す図である。
【００３８】
【図４Ｆ】図４Ｆは、抗マリグニン抗体による生体外の小細胞肺癌細胞の成長抑制を示す棒グラフを示す図である。
【００３９】
【図５】図５は、良性または悪性乳房疾患患者の術前および術後の血清に存在する抗マリグニン抗体の量のプロットを示す図である。
【００４０】
【図６】図６は、インフルエンザＢおよびインフルエンザＡ株、Ｈ１Ｎ１の血球凝集素において認められたレプリキンの濃度を１９１８年から２００１年まで年毎に示すグラフを示す図である。
【００４１】
【図７】図７は、インフルエンザＡ株、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２、並びにその構成レプリキンにより定義される新生株、Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の血球凝集素において観察されたレプリキン濃度を１９５０年から２００１年まで年毎に示すグラフを示す図である。
【００４２】
【図８】図８は、１９１７年〜２００２年のコロナウイルスヌクレオキャプシドレプリキンを含む幾つかのウイルス株の１年あたりのレプリキン数を表すグラフを示す図である。
【００４３】
【図９Ａ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【図９Ｂ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【図９Ｃ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【００４４】
【図１０】図１０は、Ｈ５Ｎ１血球凝集素の１年あたりのレプリキン数を表すチャートを示す図である。
【００４５】
【図１１】図１１は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行するインフルエンザのＨ５Ｎ１株の血球凝集素タンパク質におけるレプリキンパターンの濃度の急激な増加について説明するグラフを示す図である。図１１は、Ｈ５Ｎ１の血球凝集素タンパク質の増加するレプリキン濃度（「レプリキン数」）は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行したことを示す図である。Ｈ５Ｎ１インフルエンザにおいて、１９９５年〜１９９７年の株特異性レプリキン濃度（レプリキン数、平均値＋／−標準偏差）の増加は、１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１エピデミックに先行し（Ｅ１）、１９９９年〜２００１年の増加は、２００１年のエピデミックに先行し（Ｅ２）、および２００２年〜２００４年の増加は、２００４年のエピデミックに先行した（Ｅ３）。１９９９年の減少は、香港におけるＥ１エピデミックを受けて鶏を大量に処分したことに伴って生じた。
【００４６】
【図１２Ａ】図１２は、異なるタンパク質において実質的に固定したアミノ酸位置で発生するレプリキン骨格を説明する表を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２は、異なるタンパク質において実質的に固定したアミノ酸位置で発生するレプリキン骨格を説明する表を示す図である。
【００４７】
【図１３】図１３は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９４０年〜２００１年）におけるインフルエンザＢウイルスの血球凝集素に存在するレプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００４８】
【図１４Ａ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００４９】
【図１５】図１５は、１９５７年〜２０００年におけるインフルエンザＨ２Ｎ２ウイルスの血球凝集素に存在するレプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００５０】
【図１６】図１６は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９６８年〜２０００年）のインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２血球凝集素に存在するＨ３Ｎ２レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００５１】
【図１７Ａ】図１７は、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスおよびその他の急速に複製するウイルスならびに悪性腫瘍におけるレプリキン構造と、宿主細胞の死亡率の増加との関係を示す表を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７は、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスおよびその他の急速に複製するウイルスならびに悪性腫瘍におけるレプリキン構造と、宿主細胞の死亡率の増加との関係を示す表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本明細書で使用されるように、レプリキンペプチドまたはレプリキンタンパク質は、７〜約５０のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、（１）第２リジン残基から６〜１０アミノ酸残基に位置する少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％のリジン残基とを含む。同様に、レプリキン配列は、レプリキンペプチドをコード化する核酸配列である。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「レプリキン骨格」は、一連の保存レプリキンペプチドを意味し、各レプリキンペプチド配列は、約１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジン残基から６〜１０アミノ酸残基にあるリジン残基と、（４）少なくとも約６％のリジンとを含む。また「レプリキン骨格」は、一連の「レプリキン骨格」の個別部材または複数部材を意味する。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「初期発生」ウイルスまたは有機体は、ウイルスまたは有機体の別の標本が採取された日に先立って、自然源のウイルスまたは有機体から採取されたウイルスまたは有機体の標本である。「後期発生」ウイルスまたは有機体は、ウイルスまたは有機体の別の標本が採取された日の後に自然源のウイルスまたは有機体から採取されたウイルスまたは有機体の標本である。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「新生株」は、そのようなウイルスの株の早期発生分離株、またはそのようなウイルスのその他の株におけるレプリキン濃度と比較して、１つ以上のそのタンパク質配列において、高濃度または増加濃度のレプリキン配列を有するものとして識別されたウイルスの株を意味する。高濃度または増加濃度のレプリキンは、例えばインフルエンザウイルスにおいて、少なくとも約６ヶ月以上、また好ましくは少なくとも約１年以上、最も好ましくは少なくとも約３年以上の期間にわたって発生するが、はるかに短い期間であってもよい。
【００５６】
本明細書に記載のレプリキンの「官能基誘導体」は、レプリキンのフラグメント、変型、類似物、または化学的誘導体であり、レプリキンに特異的な抗体との免疫学的交差反応性を少なくとも一部保持する。レプリキンペプチドのフラグメントは、任意の分子のサブセットを意味する。変型ペプチドは、直接化学合成、例えば、当該技術分野においてよく知られる方法を使用することにより形成されてもよい。非天然タンパク質に対するレプリキンの類似物は、実質的に総タンパク質またはそのフラグメントのいずれかに類似する。レプリキンの化学的誘導体は、追加の化学部分を含む。
【００５７】
本明細書において使用されるように、所定のレプリキン内の総アミノ酸のパーセントとしての「相同性」は、レプリキン構造、例えばリジンおよびヒスチジンを「定義する」アミノ酸により維持される位置において定義するアミノ酸に重要であり、レプリキン構造内のその他のアミノ酸に対しては、以前の出願においてＨＩＶ ＴＡＴタンパク質に関して示されるように、あまり重要でないか、またはまったく重要でない。保存は、これらの比較的不変の「定義」アミノ酸に関して定義される。「定義」アミノ酸以外における特定の変型または置換は、本出願の対象である。これらはランダムではなく、例えば、ここに示されるようにパンデミックと関連があると思われる。またこれまで考えられていたよりも重要である。所定の機能を用いて反復することにより、それらは基本的なレプリキン骨格のサブセットを表す。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「変異」はアミノ酸の置換により生じる有機体の構造および特性の変化を意味する。反対に「保存」、「保存された」または関連する用語は、本明細書で使用されるように、置換の欠失による特定アミノ酸の保存を意味する。
【００５９】
本明細書で使用されるように、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、２つ以上のアミノ酸から成る化合物を意味する。ここで、１つのアミノ酸のカルボキシル基は別のアミノ酸のアミノ基と結合し、ペプチド結合を形成する。ペプチドという用語は、そのような化合物をコード化するアミノ酸配列の意味でも使用される。
【００６０】
本明細書で使用されるように、「単離した」または「合成した」ペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、精製後、実質的に細胞物質、またはペプチドが由来する細胞、あるいは組織源からのその他の夾雑タンパク質またはペプチドを含まないペプチド、あるいは任意の方法で化学的に合成された場合は、実質的に化学的前駆体、またはその他の化学物質を含まないペプチド、乃至は組み換え遺伝子技術により合成された場合に実質的に夾雑ペプチドを含まないペプチドを意味する。単離は、生体内、生体外、および現在ではプロテオミクスソフトウェア法を使用してコンピュータで（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）行ってもよい。
【００６１】
本明細書で使用されるように、「レプリキン数」または「レプリキン濃度」は、タンパク質または有機体における１００アミノ酸あたりのレプリキン数を意味する。レプリキン数の低いウイルスまたは有機体の第２株、早期発生株または後期発生株と比較して、ウイルスまたは有機体の第１株におけるレプリキンが高い程、第１ウイルスまたは有機体のさらに急速な複製と関連することが分かった。
【００６２】
Ｉ．インフルエンザエピデミックおよびパンデミックに関連する高いレプリキン数
過去１００年間のインフルエンザウイルスタンパク質配列およびインフルエンザ疫学に関するわれわれの研究は、インフルエンザにおける複製および毒性の増加を予測する方法を提供する。インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列から得た歴史的および現在のデータの再検討から、１９０２年〜２００１年のインフルエンザエピデミックに関連する株において、４つの主要なインフルエンザ株、すなわちインフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２，および（Ａ）Ｈ３Ｎ２のうちの１つにおける株特異性インフルエンザレプリキン濃度が４倍〜１０倍増加することが明らかになる。さらに、エピデミックに関連する血球凝集素タンパク質におけるレプリキン濃度の増加は、少なくとも１つの特異的レプリキン組成物が消失してから１年〜最長６４年後に再出現すること、および新規の株特異性レプリキン組成物の出現に起因することがわかる。
【００６３】
インフルエンザゲノムにおいてレプリキンが発見される前は、インフルエンザにおける血清学的血球凝集素および抗体分類のみが説明されていた。株特異性保存ペプチド配列については記載されていなかった。さらに、任意の株特異性ペプチド配列の濃度および組成物における変化が疫学的に立証されたエピデミックまたは急速な複製と関連するという記載はなかった。そのようにして、株特異性化学構造については、それを用いて、到来するインフルエンザシーズンに優勢となる株を予測することも、ワクチンの全体ウイルス株混合物を毎年考案することも知られていなかった。
【００６４】
高度のレプリキン構造の保存が認められたことにより、同一の構造は１００年間持続するか、または１年〜６４年欠失した後に再出現しうるが、これまでインフルエンザタンパク質におけるアミノ酸のランダム置換に起因すると考えられた変化は、組織化されたレプリキンの保存過程による変化である可能性が高いことが示された。
【００６５】
歴史的データの検討に照らして、インフルエンザにおけるレプリキン濃度の増加を監視することが、将来のエピデミックを予測するツールとして提供された。このツールは、多数の最近のインフルエンザ流行を有効に予測した。例えば、Ｈ３Ｎ２の歴史上最大となる、Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度における近年の急激な増加（１９９７年〜２０００年）および１９６８年の高死亡率Ｈ３Ｎ２パンデミック、および１９７５年と１９７７年の２度の高死亡率エピデミックにおいて最後に見られたが、２０年〜２５年間欠失した特異的レプリキン組成物の再出現を予測し、併せて２００２年のＨ３Ｎ２エピデミックを予測した。
【００６６】
インフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ３におけるパンデミック
特に注目すべきことに、試験したインフルエンザウイルスのほぼすべての個別株の血球凝集素タンパク質において、１００アミノあたり少なくとも１つのレプリキンが存在することを認めた。アミノ酸配列データが入手可能な各年（１９０２年〜２００１年）のインフルエンザウイルスの４つの一般的な株であるインフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１，Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２それぞれの分離株の血球凝集素タンパク質において発生することが認められたレプリキン配列を図１３、１４、１５、および１６に示す。
【００６７】
各インフルエンザＡ株は、それぞれ１９１８年、１９５７年、および１９６８年におけるパンデミックに関与している。図６および７のデータは、試験した４つの一般的なインフルエンザウイルスのすべての分離株の各インフルエンザ血球凝集素タンパク質において、１００アミノ酸あたり少なくとも１つのレプリキンが存在することを示し、複製の生存レベルの維持におけるレプリキンの機能を示唆する。１９９０年代において、Ｈ３Ｎ２株が減少する間、Ｈ３Ｎ２分離株の多くにはレプリキンが存在しなかったが、高濃度の新規レプリキンがＨ３Ｎ２分離株に出現した。これはＨ３Ｎ２（Ｒ）株の出現を定義する。図１６を参照のこと。
【００６８】
図６および図７に示されるレプリキン濃度の幾つかの特性は、４つのインフルエンザウイルス株すべてに共通すると思われる。第１に、濃度は長年にわたり循環し、上昇および下降の１サイクルは２〜３０年の期間で生じる。この上昇および下降は、血球凝集素およびノイラミニダーゼ分類による個別のインフルエンザウイルス株の優性に関して知られている増大および減少と一致する。
【００６９】
第２に、パンデミックに関与することが既に示されている各インフルエンザウイルス株のピークレプリキン濃度は、３つの年のパンデミックにそれぞれ特異的および個別に関連する。例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１の関与が示された１９１８年のパンデミックの場合に、Ｈ１Ｎ１におけるレプリキン濃度のピークが独立に生じた（Ｐ１）。Ｈ２Ｎ２の発現、関与が認められた１９５７年のパンデミックの場合に、Ｈ２Ｎ２におけるレプリキンのピーク濃度が生じた（Ｐ２）。またＨ３Ｎ２が発現し、パンデミックの原因であることが示された１９６８年のパンデミックの場合に、Ｈ３Ｎ２におけるレプリキンのピーク濃度が生じた（Ｐ３）。
【００７０】
第３に、上記３度のパンデミックそれぞれの直後の年に、特異的レプリキン濃度が顕著に減少した。これは、恐らくそれぞれのパンデミックで生成された免疫が広く分布したことを反映していると考えられる。したがって、このパンデミック後の減少は、それが関与したパンデミック（Ｐ１）直後のＨ１Ｎ１に特異的であり、その時点におけるすべての株の一般的な特性ではない。インフルエンザＢにおけるレプリキン濃度の増加は、Ｈ１Ｎ１におけるレプリキン濃度の減少と同時に発生した。例えば、１９５１年におけるＥＢ１および１９７６年におけるＥＢ２はどちらも死亡率が最も高いインフルエンザＢエピデミックに関連した（Ｓｔｕａｒｔ‐Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．（１９８５）。
【００７１】
第４に、濃度の一次ピーク増を越える二次ピーク濃度は、３度のパンデミックそれぞれから１５年後に発生した。この二次ピークは、Ｈ１Ｎ１「エピデミック」年における１９１８年のパンデミックから１５年後（Ｅ１）、Ｈ２Ｎ２「エピデミック」年における１９５７年のパンデミックから８年後（Ｅ２）、およびＨ３Ｎ２「エピデミック」年における１９６８年のパンデミックから７年後（Ｅ３）のエピデミックに伴う。これらの特定レプリキンの二次ピーク濃度は、株からの回復を反映する場合がある。
【００７２】
第５に、各株の特異的レプリキン濃度のピークは、１つまたはその他の両株のレプリキン濃度における減少に関連すると考えられる場合が多く、宿主細胞部位の株間の競合を示唆する。第６に、各株のレプリキン濃度は３５年（Ｈ２Ｎ２）から６０年（インフルエンザＢ）の期間をかけて減少するという明らかな全体的傾向がある。この減少は、インフルエンザワクチンが一般に使用される前の１９４０年〜１９６４年のインフルエンザＢの場合に明らかであったため、ワクチンの影響によるものではない。インフルエンザＢの場合において、レプリキンの減少後の回復が１９６５年以降に発生したことが分かるが、レプリキン濃度は１９９７年および２０００年に再度減少した（図６）。これは、最近の分離株におけるインフルエンザＢの発生が低いことと関連する。１９７８年〜１９７９年にピークを迎えたＨ１Ｎ１レプリキン濃度（図６）は、Ｈ１Ｎ１株の再出現および普及とともに、１９９６年に再度ピークに達し、Ｈ１Ｎ１エピデミックと一致した（図６）。１９９７年〜２０００年の間にＨ１Ｎ１レプリキン濃度も減少し、これらの年に得られた分離株におけるＨ１Ｎ１株の存在が減少した。Ｈ２Ｎ２レプリキンの場合、３５年の減少から回復しなかった（図７）。またこれは最近の分離株からＨ２Ｎ２が欠失していることに関連する。Ｈ３Ｎ２の場合、多くの分離株のレプリキン濃度は、１９９６年〜２０００年までの期間にゼロまで落ちたが、その他のＨ３Ｎ２分離株は、レプリキン濃度の著しく急激な増加を示した。これは、Ｈ３Ｎ２の亜株の出現を示す。本明細書ではＨ３Ｎ２（Ｒ）と指定する。
【００７３】
上述のように、図６および７は、レプリキン濃度がピークに達する前に１年〜３年の段階的な増加が認められることが多いことを示す。この段階的な増加は、レプリキンのピークと同時に起こるエピデミックの発生に先行する。したがって、特定の株の濃度における段階的な増加は、特定の株がエピデミックまたはパンデミックをもたらす最も有力な原因であることを示す。
【００７４】
インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２（Ｒ）におけるレプリキン濃度は、１９９７年〜２０００年に増加したことが認められた（図７）。結果として２００２年に生じたエピデミックは、エピデミックに先行するレプリキン濃度の増加の予測値を示した。Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度における３つの類似する以前のピークは、株が最初に発現した１９６８年のＨ３Ｎ２に基づくパンデミック（図７）、および１９７２年と１９７５年のＨ３Ｎ２に基づくエピデミックにおいて発生したことが見られた（図７）。これらのパンデミックおよびエピデミックは、それぞれ過度の死亡率と関連した（Ａｉｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１１３（１）：３０‐４３（１９８１）。
【００７５】
したがって、１９９７年〜２０００年におけるＨ３Ｎ２レプリキンのＨ３Ｎ２（Ｒ）亜種の濃度における急速な上昇は、統計的に、到来しつつある深刻なエピデミックまたはパンデミックの初期警告を表した。Ｈ３Ｎ２エピデミックが２０００年にロシアで発生したという記載（図７、Ｅ４）、および２００１年にＨ３Ｎ２が世界で最も頻繁に単離されたインフルエンザウイルス株であるという２００１年１２月のＣＤＣレポートにより、この予測が正しいことが示された（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ（ＭＭＷＲ），Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ；５０（４８）：１０８４‐６８（Ｄｅｃ．７，２００１）。
【００７６】
インフルエンザウイルスＢの株におけるレプリキンの組成物
インフルエンザウイルスＢ株において識別された合計２６のレプリキンのうち（図１３）、以下１０のレプリキンが、１９４０年〜２００１年に試験された各インフルエンザＢ分離株に存在する。重複するレプリキン配列は個別にリストされる。
ＫＳＨＦＡＮＬＫ（配列番号：＿）
ＫＳＨＦＡＮＬＫＧＴＫ（配列番号：＿）
ＫＳＨＦＡＮＬＫＧＴＫＴＲＧＫＬＣＰＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫＳＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫＳＫＰＹＹＴＧＥＨＡＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＶＫＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫＹＲＰＰＡＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫＹＲＰＰＡＫＬＬＫ（配列番号：＿）
【００７７】
図１３および１４は、Ｈ１Ｎ１レプリキンと比較して、インフルエンザＢ血球凝集素におけるレプリキン構造がはるかに優れた安定性を持つようであることを示す。インフルエンザＢは、任意のパンデミックに関与しておらず、動物または鳥類の保有宿主を有しないようである（Ｓｔｕａｒｔ‐Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８５））。
【００７８】
インフルエンザの株における遺伝子浮動
インフルエンザパンデミックまたはエピデミックそれぞれの場合において、新規レプリキンが出現する。所定の分離株における所定の血球凝集素において、２つの同一レプリキンは認められていない。新規レプリキンの出現が、別の動物または鳥類層からの転移に対してどの程度の変異を表すかは不明である。一部の場合において、毎年１つ以上の元のレプリキン構造が保存されるが、同時に新規のレプリキンが出現する。例えば、インフルエンザウイルスＢ血球凝集素において、１９１９年〜２００１年の間、常に５つのレプリキンが保存されたが、同一期間に２６のレプリキンが出現および消失した（一部は数年間の欠失後に再発した）。特定のレプリキン構造が消失し、何年か後に再出現することは、レプリキンが新たな変異を通じてではなく、別のウイルス宿主細胞層から回帰することを示唆する。
【００７９】
異なるインフルエンザ株の活性における変化は、順に、以下の２つのあまり知られていない過程のうちの１つにより達成される置換の生成物であるインフルエンザ血球凝集素における配列変化に関連すると考えられている。ｉ）血球凝集素分子における一連の点変異の累積に起因すると考えられる抗原浮動またはｉｉ）変化が著しいため遺伝子再集合は、ヒトおよび非ヒト宿主細胞のウイルス間で発生すると仮定される抗原浮動。第１に、本データは、異なるインフルエンザ株の活性における変化が、非特異的配列変化に関連するのではなく、株特異性レプリキンの高い濃度およびエピデミックに関連する複製の株特異的増加に基づく、または関連する。
【００８０】
さらに、どの配列変化が「浮動」または「転移」によるものか、また保存、保有宿主における保管、および再出現によるものかについて、考えられる識見に関するデータを評価した。データは、レプリキン濃度におけるエピデミック関連の増加は、血球凝集素あたりの既存のレプリキンの複製によるものではなく、少なくとも１つのレプリキン組成物が、消失してから１年〜最長５９年後に再出現することによること、加えてＡ株に限っては、新規の株特異性レプリキン組成物の出現によることを示唆する（図１３〜１６）。そのため、１９５１および１９７７のインフルエンザＢエピデミックにおけるレプリキン濃度の増加は、エピデミックの年における新規レプリキン組成物の出現に関連するのではなく、以前に発生したが消失していたレプリキン組成物の再出現に関連する（図１３）。
【００８１】
対照的に、Ａ株の場合は、以前に消失していたウイルスレプリキンの再出現に加え、新規の組成物が出現する（例えば、１９９６年エピデミックの年のＨ１Ｎ１において、６つの以前のレプリキンが再出現したことに加え、１０の新規組成物が出現した）。インフルエンザＢではなく、Ａ株のみがヒトでない動物および鳥類の保有宿主にアクセスできるため、完全に新規の組成物は、恐らく、レプリキンアルゴリズムの基本的要件である「３点認識」以外は新規組成物との類似点がないように思われる既存のヒトレプリキンの変異ではなく、ヒトでない保有宿主に由来すると考えられる（図１３〜１７）。Ｂと比較して多産性の高いＨ１Ｎ１、およびパンデミックはＢ株ではなく３つのＡ株のみによって産生されたという事実は、どちらも非ヒトウイルス保有宿主から新規のレプリキン組成物を受け取るヒトＡ株の能力機能であってもよい。
【００８２】
１年だけ出現した後に消失し、現在まで再出現していない幾つかのレプリキンがある（図１３〜１６）。また１年〜最長８１年間消失した後、同一のレプリキン配列が再出現した他のレプリキンもある。キーレプリキン「ｋ」および「ｈ」アミノ酸、およびそれらの間のスペースは、以下の株特異性レプリキン：１０のインフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１の単一レプリキン、およびＨ３Ｎ２の単一レプリキンに関して、および欠失後の同一レプリキンの再出現に関して図１３〜１６に示されるように、特定のレプリキンが一定に存在する間、長年にわたり保存される。
【００８３】
残りの血球凝集素配列のレプリキン構造内外におけるその他アミノ酸の置換または置換活性が顕著であるにもかかわらず、インフルエンザレプリキンヒスチジン（ｈ）はまったく置換されないようであり、リジン（ｋ）はほとんど置換されない。この保存の例は、以下において見られる。１９１８年〜２０００年の間一定であったＨ１Ｎ１レプリキン「ｈｐ（ｖ／ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ（ｒ／ｋ）（ｓ／ｔ）（ｔ／ａ）ｋ」（配列番号：＿）、１９７５年〜１９９８年の間一定であったＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｃｄ（ｇ／ｑ）ｆ（ｑ，ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ／ｉ）ｅｒ（ｓ／ｔ）ｋ」（配列番号：＿）、および１９７５年に最初に出現し、２５年間消失した後、２０００年に再出現したＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｑｎ（ｓ／ｅ）（ｅ／ｑ）ｇ（ｔ／ｓ）ｇ（ｑ／ｙ）ａａｄ（ｌ／ｑ）ｋｓｔｑ（ａ／ｎ）ａ（ｉ／ｌ）ｄ（ｑ／ｇ）Ｉ（ｎ／ｔ）（ｇ／ｎ）ｋ，（ｌ／ｖ）ｎ（ｒ／ｓ）ｖｉ（ｅ／ｃ）ｋ」（配列番号：＿）。多くのアミノ酸が置換されたが、最大約５０アミノ酸において、２つのリジン、離れた６〜１０の残基、１つのヒスチジン、最小６％のリジンから成る基本的レプリキン構造は保存された。
【００８４】
完全にランダムな置換では、これらＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２レプリキンが持続することも、１９０２〜２００１年までインフルエンザＢにおいて１０のレプリキン構造が持続することも、１９１９年の１８‐ｍｅｒレプリキンが７４年間欠失した後１９９３年に再出現することも不可能であったと考えられる。ランダムな種の置換ではなく、その不変性は、秩序的に制御された過程、または少なくともキーレプリキン残基が何らかの方法で固定または結合されるような保護、例えば、リジンは恐らく核酸と結合され、ヒスチジンは恐らく呼吸性の酸化還元酵素と結合されること示唆する。この保存を制御する機序は現時点で不明である。
【００８５】
ＩＩ．保存および遺伝子浮動はワクチン開発のための初期警告機序を提供する
Ｈ１Ｎ１レプリキンの場合において、１９１８年パンデミックに関連するＰ１ピークに存在する２つのレプリキンは、１２の新規レプリキンを含む１９３３年の回復Ｅ１ピークには存在しなかった。したがって、一定して保存されるレプリキンは、単独または併用のいずれもワクチンに対する最適な選択である。しかし、１年の濃度増加を伴う最近出現したレプリキンであっても、さらに１年以上持続および増加することが多く、濃度のピークおよびエピデミックに達するため、合成レプリキンを用いたワクチン接種の初期警告および時期を提供する（例えば、図６の１９９０年初頭のＨ１Ｎ１を参照のこと。例えば、図１０および図１１のＨ５Ｎ１ １９９５年〜２００２年も参照）。
【００８６】
図７、８、１０および１１におけるデータは、インフルエンザタンパク質配列におけるレプリキンの存在および濃度と、インフルエンザのパンデミックおよびエピデミックの発生との直接的な関係を示す。したがって、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列に関して、レプリキンの存在および濃度を分析することにより、インフルエンザパンデミックおよび／またはエピデミックの予測、およびインフルエンザワクチン製剤の標的を提供する。このデータを再度参照して、これまで株特異性化学構造を用いて、到来するインフルエンザのシーズンに優勢となる株を予測することも、ワクチンの全体ウイルス株の混合物を毎年考案することも知られていなかったことは注目に値する。
【００８７】
株特異性エピデミックが発生する１年〜３年前のインフルエンザ群における株特異性レプリキン数の発見と同様に、コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数の増加も識別されている。コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、以下のように増加した：１９９９年３．１（±１．８）、２０００年３．９（±１．２）、２００１年３．９（±１．３）、および２００２年５．１（±３．６）。このパンデミック前の増加は、コロナウイルスが２００３年のＳＡＲＳパンデミックに関与したという発見を支持する（図８および表３を参照）。
【００８８】
したがって、レプリキン構造およびレプリキン数を監視することにより、１９１７年〜１９１８年のガチョウレプリキンおよびインフルエンザおよびコロナウイルス株の両方に見られるようなその修飾型および付随レプリキンに対する合成株特異性ワクチン予防接種および抗体治療を開発する手段が提供される。
【００８９】
図９は、１９６２年〜２００３年に収集された分離株上でそのタンパク質配列を入手できるヌクレオキャプシドコロナウイルスタンパク質の自動レプリキン分析を表す。個別のタンパク質はそれぞれ受入番号で表し、レプリキンの存在について分析する。自動レプリキン分析の一部として、レプリキン数（１００アミノ酸あたりのレプリキン数）を自動的に計算する。各年の総レプリキン数について、１年あたりの平均（±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））レプリキン数を自動的に計算する。エピデミック前に、特定ウイルス株（コロナウイルス）における特定タンパク質（ヌクレオキャプシドタンパク質）の複製が増加していることを早期に警告するこの例は、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックに先行するインフルエンザウイルスの株において見られる増加と比較できる（図６、７、１０および１１）。１９９９年〜２００２年のレプリキン数の上昇は、２００２年末に出現し、２００３年へと続いたＳＡＲＳコロナウイルスのパンデミックに一致するとみられる場合がある。図８は、１９１７年〜２００２年のコロナウイルスヌクレオチドキャプシドレプリキンを含む幾つかのウイルス株のレプリキン数を示すグラフである。
【００９０】
ＩＩＩ．インフルエンザにおけるレプリキン
株が最初に出現し、その年にパンデミックをもたらした１９１８年から２０００年までの配列が入手可能な各Ｈ１Ｎ１分離株において、レプリキン「ｈｐ（ｖ／ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ‐（ｒ／ｋ）（ｓ／ｔ）（ｔ／ａ）ｋ」が１つのみ存在する。（図１４）（「（ｖ／ｉ）」は、アミノ酸ｖまたはｉが異なる年において同一位置に存在することを示す。）Ｈ１Ｎ１は持続性レプリキンを１つのみ含むが、Ｈ１Ｎ１は、インフルエンザＢより多産性であると思われる。Ｈ１Ｎ１に関して、８２年間に９５の異なるレプリキン構造が存在するのに対し、インフルエンザＢ分離株に関しては、６２年間に存在する異なるレプリキンは３１に留まる（図１３および１４）。多くの新規レプリキン構造における増加は、エピデミックの年に発生し（図１３〜１６）、総レプリキン濃度の増加に関連する（図６、７、１０および１１）。
【００９１】
インフルエンザＨ２Ｎ２レプリキン：インフルエンザＨ２Ｎ２は、１９５７年のヒトパンデミックに関与した。１９５７年の株において識別された２０レプリキンのうち３つは、Ｈ２Ｎ２分離株のそれぞれに保存され、１９９５年までＰｕｂＭｅｄでの試験用に入手可能であった（図１５）。
ｈａ（ｋ／ｑ／ｍ）（ｄ／ｎ）ｉｌｅｋｔｈｎｇｋ（配列番号：＿）
ｈａ（ｋ／ｑ／ｍ）（ｄ／ｎ）ｉｌｅｋｔｈｎｇｋｌｃ（ｋ／ｒ）（配列番号：＿）
ｋｇｓｎｙｐ（ｖ／ｉ）ａｋ（ｇ／ｒ）ｓｙｎｎｔｓｇｅｑｍｌｉｉｗｑ（ｖ／ｉ）ｈ（配列番号：＿）
【００９２】
しかしＨ１Ｎ１とは反対に、１９６１年に始まったＨ２Ｎ２では、１３の追加レプリキンが発見されたにすぎなかった。このような少数の新規レプリキン発現は、Ｈ２Ｎ２レプリキンの濃度および分離株におけるＨ２Ｎ２の発現が長年にわたって減少したことに関連する（図７）。
【００９３】
インフルエンザＨ３Ｎ２は、１９６８年のヒトパンデミックに関与した。１９６８年に出現した５つのレプリキンは１９７７年以降消失したが、１９９０年代に再度出現した（図１６）。２２年間持続したレプリキン構造はｈｃｄ（ｇ／ｑ）ｆ（ｑ／ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ／ｉ）ｅｒ（ｓ／ｔ）ｋのみであり、これは１９７７年に初めて出現し、１９９８年まで持続した。１９９０年代半ばの１２の新規Ｈ３Ｎ２レプリキンの出現は（図１６）、同時期のレプリキン濃度の増加、および最近の分離株におけるＨ３Ｎ２株の流行に関連し、それら分離株の一部から全レプリキンの同時消失を伴う（図７）。これは、新規の亜株Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の出現を示唆する。２００３年１１月および１２月におけるＨ３Ｎ２新規株（Ｆｕｊｉａｎ）のエピデミックは、最初に２００１年７月９日提出の米国仮出願番号６０／３０３，３９６において行われた予測を裏付けた。
【００９４】
図６、７、１０および１１は、インフルエンザエピデミックおよびパンデミックが、インフルエンザウイルスにおけるレプリキン濃度の増加と関連し、これは少なくとも１つのレプリキンが、消失してから１年〜５９年後に再発するためであることを示す。またＡ株に限って、新規の株特異性レプリキン組成物の発生が見られる（図１４〜１６、図６および７におけるＨ５Ｎ１のエピデミック前の新規レプリキン数の増加も参照）。単一のタンパク質内で個別のレプリキンが反復することによるレプリキン濃度の増加は、インフルエンザウイルスでは発生しないようであるが、その他の有機体において見られる。
【００９５】
ＩＶ．ガチョウレプリキン骨格
１９１７年にガチョウから単離されたインフルエンザウイルスの血球凝集素におけるレプリキン（ガチョウレプリキンと命名）は、翌年の１９１８年パンデミックに関与したインフルエンザのＨ１Ｎ１株において出現し、以下のようにたった２つの置換を持つことを発見した：ｋｋｇ（ｔ／ｓ）ｓｙｐｋｌｓｋｓｙ（ｔ／ｖ）ｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈ。表１は、複数のマイナー置換およびその他のインフルエンザ株への明らかな転移があったにもかかわらず、インフルエンザ１９１７年ガチョウレプリキン（ＧＲ）がその後８５年間、実質的に保存されたことを示す。われわれは、１９１７年インフルエンザＧＲが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年のパンデミック）、Ｈ２Ｎ２（１９５７〜５８年のパンデミック）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年のパンデミック、２０００年の中国およびロシアにおけるエピデミック、２００３年のＦｕｊｉａｎ株エピデミック）およびＨ５Ｎ１（１９９７年中国でのエピデミック）において表れるいくつかのインフルエンザ株の間で明らかな移動性を示すことを発見した。１９９７年に、その構造はＨ１Ｎ２において、その１９１８年構造ＫＫＧＳＳＹＰＫＬＳＫＳＹＶＮＮＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨに正確に回復された。
【００９６】
高い毒性および宿主細胞の死亡率に関連しうるレプリキン配列は、インフルエンザウイルスの新生株を予測、識別および治療するための標的を提供する。表１は、ガチョウレプリキンを示す。ガチョウレプリキンおよびその相同体は、以下の９０年間のインフルエンザ株に関するデータにおいて、インフルエンザウイルスの新生株における毒性の予測に有用であることが示された。ガチョウレプリキンおよびその相同体をひとまとめにして考えると、それらはレプリキン骨格のアルゴリズムに適合し、一連の保存レプリキンペプチドを必要とする。各レプリキンペプチド配列は、約１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジン残基から６〜約１０アミノ酸残基にあるリジン残基と、（４）少なくとも約６％のリジンと、を含む。
【００９７】
Ｖ．インフルエンザにおける高い毒性と関連するレプリキン骨格配列
高い毒性または宿主細胞の死亡率を示したインフルエンザ分離株から得た１つ以上のレプリキン骨格配列における置換に同一のアミノ酸に置換を有するインフルエンザ分離株におけるレプリキン骨格配列は、インフルエンザウイルスの新生株における標的および治療として有用である。したがって、本発明は、１６〜約３０のアミノ酸を含み、
（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、をさらに含む、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン骨格ペプチドを提供し、
インフルエンザウイルスの第１株の単離したレプリキン骨格配列は、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン骨格配列と比較して、アミノ酸置換を含み、アミノ酸置換はヒスチジン置換ではなく、またインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン骨格配列は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
インフルエンザウイルスの第３株のレプリキン骨格配列には追加で置換が存在し、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
インフルエンザウイルスの第３株における置換の存在は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、複製、毒性、または宿主細胞の増加に関連する。
【００９８】
好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン配列における異なるアミノ酸残基で置換されるインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する。
【００９９】
別の好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、インフルエンザウイルスの第１株の単離したレプリキン配列におけるロイシン以外のアミノ酸で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は、メチオニンまたはイソロイシンで置換される。別の好適な実施形態において、単離したレプリキン配列は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスから単離される。
【０１００】
本発明者は、１００年間の疫学的データを使用し、インフルエンザウイルスにおけるレプリキン濃度がウイルスの毒性と関連することを立証した。また同一の疫学的データを使用し、特定の高度に保存されたレプリキン配列の構造と、毒性およびエピデミックとを関連付けた。同一の１００年間の疫学的データにおいて、長期にわたって高度に保存されたレプリキン配列における個別の配列変化を再検討した結果、レトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）およびプロスペクティブ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）な予測能力が示された。
【０１０１】
ガチョウレプリキン骨格におけるレプリキン骨格も同様に、ガチョウレプリキン相同体を含むインフルエンザウイルスの新生株を治療するための標的を提供することが示された。例えば、ベトナムにおける病原性の高いＨ５Ｎ１の２００４年株（表１において「２００４年 Ｈ５Ｎ１ ベトナム、高い病原性」と標識）の２９アミノ酸レプリキン骨格ペプチドは、ＵＴＯＰＥとして知られる短い合成レプリキン配列およびキーホールリンペットヘモシアニンアジュバントで相補され、ウサギおよび鶏に皮下注射した場合に、強い免疫反応を提供した。例７を参照のこと。
【０１０２】
表１は、２００６年までのガチョウレプリキンおよびその相同体を提供する。表１における構造は、アミノ末端における一定長の一定リジン、およびカルボキシル末端における一定ヒスチジン残基は、異なる株において固定骨格で数十年にわたり保存されることを示す。ガチョウレプリキンの相同体は、１９１７年〜２００６年における１９１８年、１９５７年、および１９６８年の３度のパンデミックにそれぞれ関与する株のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２に出現し、さらにＨ１Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ１間の置換を含む。ガチョウレプリキンにおいて発生した特定の置換も、ランダムではなく選択的であり、長年にわたり保持される傾向がある。そのため、一般にアミノ酸置換はランダムに生じると仮定されるが、実際は、インフルエンザにおけるすべての置換がランダムとは限らないようである。数十年にわたるこのレプリキン保存により、合成インフルエンザワクチンの産生が可能になり、急速かつ安価に事前調整することができ、また１年以上有効である。
【０１０３】
そのため、合成インフルエンザワクチンの標的は、インフルエンザウイルスにおける保存レプリキン骨格である。レプリキン骨格は、約１６〜約３０のアミノ酸配列を含む一連の保存ペプチドを含み、
（１）末端リジンおよび末端リジンに直接隣接する残基部分にある任意のリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接する残基部分にある別のヒスチジンと、
（３）少なくとも１つの別のリジンから約６〜約１０アミノ酸残基内にある少なくとも１つのリジンと、
（４）１６〜約３０のアミノ酸ペプチド内にある少なくとも約６％のリジンと、をさらに含む。またレプリキン骨格ペプチドは、一連のレプリキン骨格の個別部材または複数部材を意味する。
【０１０４】
合成インフルエンザワクチンの非限定的かつ好適な標的は、約２９アミノ酸および末端リジンに直接隣接するリジンを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格である。別の好適な標的において、レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基にあるロイシンは、別のアミノ酸で置換される。別の好適な標的において、ロイシンの置換は、疎水性アミノ酸を用いて行われる。別の好適な標的において、ロイシンの置換は、メチオニンまたはイソロイシンを用いて行われる。
【０１０５】
合成インフルエンザワクチンのあまり好適でない標的は、約２９アミノ酸の第１ペプチド、および
（１）末端リジンおよび末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、を含み、
（３）任意のその他のリジンから６〜１０アミノ酸残基内のリジンを含まないインフルエンザウイルスの第１株における外骨格であってもよい。第１株の早期発生標本またはウイルスの別株は、約２９のアミノ酸を含む。
【０１０６】
表１において、ガチョウレプリキンおよびその相同体の経歴は、１９１７年から現在の鳥類Ｈ５Ｎ１ウイルスの流行まで追跡される。表１は、インフルエンザのウイルス株におけるガチョウレプリキンの「骨格」相同性の保存を示す。
【０１０７】
表１は、その他のインフルエンザレプリキンにおけるガチョウレプリキンおよびその相同体のタンパク質構造の存在の経歴を、１年毎またはそれより短期間毎に示す。表１は、それら相同体におけるアミノ酸置換の経歴およびレプリキンの定義およびレプリキンにより供給される急速な複製機能に不可欠なレプリキン構造の特定アミノ酸の保存をさらに示す。
【表１】
【０１０８】
表１の検討は、アミノ酸のランダム置換が１９１７年から現在までのインフルエンザ悪性株において発生した場合、ガチョウレプリキンの特定フレームワークアミノ酸は、エピデミックが発生した株において毎年保存されないことを示す。しかし、ランダム置換の結果とは反対に、インフルエンザの毒性株は、毎年一貫して、レプリキンを定義する位置に保存アミノ酸を含む。つまり、レプリキンを定義するアミノ酸の１つ、例えばリジンまたはヒスチジンにおいて置換が発生する場合、レプリキンの定義は喪失する。それにもかかわらず、レプリキン配列は８５年間以上にわたって保存される。したがって、特定アミノ酸が長年にわたって保存されることから、置換は完全にランダムであるとは言えない。レプリキンの定義に重要でないアミノ酸（例えばリジンまたはヒスチジン以外のアミノ酸）において置換が発生するという事実は、株の病原性におけるレプリキンの重要性を示す。
【０１０９】
さらに表１から、置換が発生する場合、レプリキン骨格の特定の明らかに好適な位置において発生することが分かることに注目する。表１は、１位、３〜２４位および２６〜２７位における置換の再発を示す。さらに、置換はこれらの位置全体で発生するが、リジンは第２リジン（これらの毒性株で置換されていない）から６〜１０アミノ酸の位置に存在し続ける。
【０１１０】
２９のアミノ酸ストレッチ内のリジン位置に置換がある場合であっても、１９５７年に見られるように、１１位のＫが１０位に移動すると、その新規位置は２００５年まで維持された。ＹＰ，ＡＹ、Ｎ（１５位）およびＬＶＬＷＧを有し、ほぼ例外なくレプリキン骨格の相同構造を保存する。
【０１１１】
中国（安徽省）におけるＨ５Ｎ１の２００６年株のレプリキン骨格において追加のＫが出現したことに注目することが重要である。この追加のＫの存在は、レプリキン骨格におけるレプリキン数の増加を知らせる。２００６年中国（安徽省）株は、（以下で説明されるように）６．６のレプリキン数を有する。レプリキン数６．６は、Ｈ５Ｎ１株に関してこれまで認められた中で最高値であり、インフルエンザの全体Ａ株において、１９１８年のパンデミックをもたらしたインフルエンザ株のレプリキン数にのみ匹敵する。この最初の２００６年報告が反復および維持される場合、２００４年および２００５年のカウント４．５および４．０がそれぞれ実質的に増加することを示し、Ｈ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」のエピデミックの継続または増加を予測する。
【０１１２】
レプリキン骨格配列を含むインフルエンザウイルスの初期毒性株を再検討し、レプリキン骨格が非レプリキン配列に分解されたが、レプリキン骨格の骨格構造に対する識別可能な相同性を維持する場合の複製速度および毒性に対する影響を判断した。レプリキン骨格における内部ＫおよびＨが欠失することにより（末端におけるそれらとは異なり）、例えば、２９のアミノ酸における２または３未満の含有レプリキンを表さないか、またはもはや完全にレプリキンでないが、例えば、非限定的に骨格の２９アミノ酸ＫＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＨ等の外部「シェル」を保存することは、分離株のウイルス配列に見られることが多く、高いレプリキン数および毒性は、典型的にエピデミックまたは流行の終端時に失われる。このレプリキン骨格の「破壊」（または不完全な合成）は、レプリキン数における減少に関する場合と同様に、流行またはエピデミックの衰弱を示す別の指標として有用であり、内部ＫおよびＨを伴う完全に代表的な骨格の出現のように、より多くのレプリキン、すなわち高いレプリキン数を産生し、その出現は通常レプリキン数が３を越える場合、またそれに近づく場合に発生する。これは、流行またはエピデミックの来たる出現の指標として有用である。この実際の使用に加えて、このシェル現象は、以前に認識されなかったレプリキン骨格は、ウイルスの重要な構造的要素であり、流行およびエピデミックにおけるウイルスの「成功」と密接に関連する機能を有することを証明する別の「原理の証拠」である。
【０１１３】
例えば、レプリキン骨格を有する特定インフルエンザ種の早期発生標本は、後に以下のように変化する。
１）２９アミノ酸長が保存される。
２）最初２つのアミノ酸位置（１および２）が保存される。例えば、ＫＫ。
３）最後２つのアミノ酸位置（２８および２９）が保存される。例えば、ＨＨ。
４）しかし、ＫＫから６〜１０アミノ酸にＫはもはや存在しない（レプリキンの定義を必要とする）。
そのようにして、骨格はもはやレプリキン骨格ではなく、骨格エクソスケルトンとなる。レプリキン骨格は、高いレプリキン数およびエピデミックの発生に関連するが、骨格エクソスケルトンはウイルスの休眠およびエピデミックの減少または終了に関連する。したがって、骨格エクソスケルトンは、レプリキン骨格および特定のウイルス流行が減少している場合に残基として残る変性構造であるため、この目的において有用な診断構造であると思われる。これは、１）抗体または小さい阻害性ＲＮＡ等の抗急速複製の標的、および２）抗ウイルスワクチンのベースとしてのレプリキン骨格の実態および使用を確認する。
【０１１４】
レプリキン骨格の完全性および保存は、好ましくは２つのリジンで開始し、２つのヒスチジンで終端する固定２９アミノ酸配列が存在するという事実により理解されてもよい。次に好ましくは、骨格は１６〜約３０アミノ酸長である。
【０１１５】
アミノ酸置換
骨格構造を破壊しないレプリキン骨格における置換は、特定のアミノ酸に限定されないようである。しかし、特定のアミノ酸はペプチドの構造および機能に対して類似の影響を及ぼす共通の化学特性を共有するため、同様のアミノ酸を持つレプリキン配列に対して同様の構造的影響を共有する１つのアミノ酸の置換は、異なる基からの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換より可能性が高いと想定される。
【０１１６】
アミノ酸は、酸性、塩基性、親水性、および疎水性４つのカテゴリに分類されてもよい。特定の基におけるアミノ酸は、異なる基のアミノ酸と比較して、その基内のアミノ酸と置換される可能性が高いと想定される。酸性側鎖を有する酸基は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。塩基性側鎖を有する塩基は、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンを含む。極性中立側鎖を有する中性の親水性基は、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トレオニン、セリンおよびシステインを含む。非極性中立側鎖を有する疎水性基は、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、プロリン、バリンおよびロイシンを含む。そのようにして、レプリキン骨格配列における特定アミノ酸の好適な置換は、本発明において想定されるように、同一のアミノ酸基内の置換、つまり置換アミノ酸である。例えば、ロイシンは、グルタミン酸よりもメチオニンにより置換される可能性が高く、メチオニンの置換は、ペプチドの特定部分の一部機能を破壊する可能性が低いと想定される。
【０１１７】
レプリキン骨格のＨ５Ｎ１インフルエンザ保存
幾つかの国における現行の高死亡率Ｈ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」の流行は、延滞インフルエンザパンデミックの第１段階を表すかもしれないというという懸念がある。１つの報告（Ｕｎｇｃｈｕｓａｋ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ２００５ Ｊａｎ ２７；３５２（４）：３２３‐５）は、推定されるＨ５Ｎ１の最初のヒトからヒトへの転移において、「ウイルス遺伝子のシーケンシングは、血球凝集素のレセプタ結合部位における変化またはウイルスのその他のキー特性を識別しなかった。８つのウイルス遺伝子セグメントの配列は、すべてタイにおける最近の鳥類分離株から得られたその他のＨ５Ｎ１配列と密接にクラスタ化したことを示唆する」。系統発生解析は、「ヒトインフルエンザウイルスとの再集合」の証拠がないため、Ｈ５Ｎ１は新規の変型ではないことを示唆した。しかし、われわれはここで、過去２度のＨ５Ｎ１エピデミックにおいて変化せず、実際に１９５９年以降保存されていた特定のＨ５Ｎ１タンパク質配列の部位における最近の３つの変化を報告する。これまで、ウイルスエピデミックおよび休眠に関連するタンパク質化学は存在しなかった。われわれは、過去１００年の３度のインフルエンザパンデミック、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２のそれぞれが、リジンおよびヒスチジンを豊富に含み、急速複製に関連するウイルスにおける特定ペプチド類、つまりレプリキンの濃度の増加により、およびそれに関連してレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測されたことを発見した。１９９７年、２００１年、および２００３年〜２００４年の３度のＨ５Ｎ１エピデミックそれぞれにおいて、レプリキンが予測的であることを発見した（図１１）。それらが分離株に出現する各年において、図１１に示されるように１００アミノ酸あたりのレプリキンを数えることができ、また表１に示されるようにそれらの配列を分析および比較することができる。レプリキンの分析は、入手可能な配列情報におけるレプリキン濃度を測定する目的で、手動または本発明の好適な側面においてソフトウエアを使用して自動に行われてもよい。
【０１１８】
図１１は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックの流行に先立つインフルエンザのＨ５Ｎ１株の血球凝集素タンパク質におけるレプリキンパターンの濃度の急速増加を示すグラフである。図１１を検討すると、Ｈ５Ｎ１の血球凝集素タンパク質において増加するレプリキン濃度（「レプリキン数」）が、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行したことが分かる。例えば、１９９５年〜１９９７年のレプリキン数（標準＋／−ＳＤ）における増加は、１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１エピデミックに先行した（Ｅ１）。１９９９年〜２００１年のレプリキン数の増加は、２００１年のエピデミックに先行した（Ｅ２）。および２００２年〜２００４年のレプリキン数の増加は、２００４年のエピデミックに先行した（Ｅ３）。１９９９年の減少は、香港におけるＥ１エピデミックを受けて鶏を大量に処理したことで発生した。
【０１１９】
ウイルスタンパク質におけるレプリキンの総数に加えて、長年にわたる各レプリキンの構造は有益な情報であり、抗体および小ＲＮＡ等のワクチンおよびその他治療に対する標的を提供する。上述のように、表１は、１９１７年にインフルエンザに感染したガチョウにおいて最初に認められたレプリキン（ガチョウレプリキン）を示す。アミノ末端における一定長の不変リジン、およびカルボキシ末端におけるヒスチジン残基は、数十年にわたって固定骨格の異なる株に保存された。ガチョウレプリキンの相同体は、１９１７年〜２００６年の株（１９１８年、１９５７年、１９６８年の３度のパンデミックに関与した株であるＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２を含む）において出現し、Ｈ１Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ１間のさらなる置換を伴う。ガチョウレプリキンにおいて発生した特定の置換でさえも、ランダムではなく選択的であり、長年にわたり保持される傾向がある。そのため、一般にアミノ酸置換はランダムに発生すると仮定されるが、インフルエンザでは、すべての置換が実際にランダムであるとは限らないと思われる。数十年にわたるこのレプリキン保存により、合成インフルエンザワクチンを急速かつ安価に事前調整でき、それらは１年以上有効である。
【０１２０】
１９９７年のＨ５Ｎ１香港エピデミックにおいて、ヒト死亡率は約２７％であった。２００４において、アジアでＨ５Ｎ１に感染したことが報告された５２人のうち、約７０％が死亡した。最近では、ベトナムにおける１１症例のうち９例が、２００４年１２月２８日〜２００５年１月２７日までに死亡した。ウイルスの毒性は増加したと考えられるが、ヒトからヒトへのさらなる感染の拡大に必要であると考えられる任意の変化は、まだ発生していないと考えられている。しかし、われわれは、２００４年ベトナム、タイおよび中国で分離株から得られたガチョウレプリキン骨格の３つのＨ５Ｎ１レプリキンアミノ酸残基の１８位、２４位、および２８位において最近の置換を認めた（表１を参照）。２４位における置換は、１９５９年Ｈ５Ｎ１の出現以降発生していないが、その他の株、１９５７年のＨ２Ｎ２および１９６８年のＨ３Ｎ２により発生し、合わせて２００万人を越える死者をもたらした過去２度のインフルエンザパンデミック、およびＨ７Ｎ７により生じた最近の毒性エピデミックに存在した（表１を参照）。これらは考えられる危険の兆候にすぎないが、図１１に示される上昇レプリキン数と併せて、置換に関するこれらのデータおよびそのようなレプリキンデータとパンデミックとの過去の関連は、ウイルスがヒトからヒトに広まる可能性は低いという系統発生解析から得られるような安心感を与えない。
【０１２１】
表１は、インフルエンザのウイルス株におけるレプリキン骨格の完全性を示す。上述のように、レプリキン骨格がエクソスケルトン骨格に分解されると、病原性が減少すると考えられる。したがって、一般的に２つのリジンで開始し、２つのヒスチジンで終端する固定２９アミノ酸配列が存在するという事実から、レプリキン骨格の完全性および保存が見られる。
【０１２２】
本発明の側面は、ウイルスの病原性または複製速度、エピデミックまたはパンデミックを追跡するか、またはエピデミックあるいはパンデミックの発生を予測するレプリキン構造および機能の組み合わせである。この組み合わせの例は、１９１８年の株およびＨ５Ｎ１の現行Ｈ５Ｎ１株等のインフルエンザ株におけるレプリキン数の増加をカウントに使用される本発明のレプリキンアルゴリズムの能力である。１９１８年インフルエンザパンデミックおよび「鳥インフルエンザ」の現行の流行におけるレプリキン数は、本発明に従う、および本発明により可能となる典型的側面の予測能力を示す。
【０１２３】
インドネシアおよびベトナムにおいてヒトＨ５Ｎ１株から発見された単一置換は、以前のＨ５Ｎ１株には存在しないが、最近の１９５７年（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年（Ｈ３Ｎ２）における２度の致死的ヒトパンデミックに歴史的に存在する
上記表１を再検討したところ、１９５７年の高死亡率インフルエンザパンデミックに関与するインフルエンザウイルスのＨ２Ｎ２株、および１９６８年の高死亡率インフルエンザパンデミックに関与するインフルエンザのＨ３Ｎ２株は、ガチョウレプリキン骨格におけるアミノ酸番号２４に単一のアミノ酸置換を含むことが明らかになった。表１を参照のこと。本出願人は、インドネシアおよびベトナムでヒトにおいて発見されたＨ５Ｎ１ウイルスタンパク質における最近の単一アミノ酸置換もガチョウレプリキン骨格におけるアミノ酸番号２４に置換を有することを発見した。インドネシアおよびベトナムで最近ヒトにおいて単離されたＨ５Ｎ１ガチョウレプリキンペプチドは、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ（Ｍ／Ｉ）ＷＧＩＨＨであり、Ｈ５Ｎ１のインドネシア株は２４位にイソロイシンを含み、Ｈ５Ｎ１のベトナム株は２４位にメチオニンを含む。上述のように、本出願人は、アミノ酸２４における置換が高い毒性およびヒトパンデミックを予測することを教授する。
【０１２４】
ヒトにおいて最近単離されたＨ５Ｎ１のインドネシア株は、Ｈ５Ｎ１のガチョウレプリキンにおけるアミノ酸番号２４での置換（本明細書では「Ｓ」置換と指定する）が以前のどのＨ５Ｎ１株にも存在しないが、１９５７年（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年（Ｈ３Ｎ２）の過去２度の高死亡率インフルエンザパンデミックには存在したため重要である。１９５７年および１９６８年のパンデミックは、数百万人の死をもたらした。２４位におけるアミノ酸置換は、１人が死亡した最近のＨ７Ｎ７の流行（幸いなことに短期間）においても同様に存在した。表１を参照のこと。それにもかかわらず、Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおける２４位のアミノ酸置換は、１９５９年から現在（２００６年）までに分析および記録されたすべてのＨ５Ｎ１から欠失している。
【０１２５】
国立医学図書館（Ｐｕｂｍｅｄ）の１２００万を越えるエントリを見直した結果、アミノ酸配列におけるＳ置換を検出し、ＦｌｕＦｏｒｅｃａｓｔ（登録商標）ソフトウエアを使用して、Ｓが長年にわたって発生したことを追跡した（ｗｗｗ．Ｒｅｐｌｉｋｉｎｓ．ｃｏｍを参照）。
【０１２６】
Ｓ置換は、鶏からの最近のＨ５Ｎ１分離株では認められなかった。代わりに、高い死亡率を伴うヒト症例から得られたＨ５Ｎ１分離株において最近認められたにすぎない。Ｓ置換は、２００４年ベトナムおよび２００６年インドネシアにおいてヒトから得た分離株で観察された。表１を参照のこと。ベトナムおよびインドネシアのヒトにおける疫学的証拠は、Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおけるＳ置換が、対ヒト「クラスタ」と関連することを示唆する。ここで、鳥からヒトへの転移は確立されておらず、またヒト同士の転移は除外されている。Ｓ置換は、Ｈ５Ｎ１のヒト同士の転移が、これまでのところまれではあるが、既に発生している可能性があることを示唆する。
【０１２７】
世界保健機構（ＷＨＯ）および米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ）のスポークスパーソンは、最近、高い死亡率を持つＨ５Ｎ１のインドネシア人症例から得たＨ５Ｎ１分離株において「著しく」心配な配列変化は見られていないと発表した。著しい配列変化は、ヒトからヒトへの転移が生じる前に必要であると当業者は考える。そのため、「著しい」配列変化はヒトパンデミックの必要条件であると考えられる。Ｓ置換と対ヒト「クラスタ」との関連は、ＷＨＯおよびＣＤＣにより予測された「著しい」配列が、上述のようなガチョウレプリキン骨格内の単一アミノ酸変化において予期せず検出されうることを示唆する。
【０１２８】
ガチョウレプリキンウイルスペプチドは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、およびＨ５Ｎ１において、８８年間（１９１７年から現在まで）高度に保存されることが発見されたという事実にもかかわらず、驚くべき変異、つまりＳ変異がガチョウレプリキンにおいて特定の保存位置、２４位において識別された。上記で確立されたように、タンパク質におけるレプリキン濃度の増加は、急速複製およびエピデミックと関連している。例えば、図６、７、８、１０および１１を参照のこと。上昇する「レプリキン数」（１００アミノ酸あたりのレプリキン数）は、各主要なインフルエンザエピデミック、過去１００年における最近の３度のインフルエンザパンデミック、および１９９７年〜現在までの過去３度のＨ５Ｎ１エピデミックと量的に関連し、予測的であることが多いことが分かった。図６、７、８、１０および１１を参照のこと。
【０１２９】
Ｓ置換等の単一置換は、単独でパンデミックの唯一の原因とはならない。それにもかかわらず、Ｓ置換の発生は、１９５７年および１９６８年における過去２度の高死亡率パンデミックにおけるマーカである。さらに、鶏においては（現在まで）発生していないが、ヒトのみにおけるＨ５Ｎ１でのＳ置換の発生は、高い総レプリキン数および死亡率を伴い、Ｈ５Ｎ１が実際にヒトパンデミックに至る経路となりうることを示唆する。
【０１３０】
ヒトパンデミックが到来する可能性が高いことを示唆する証拠は、レプリキン数および高い死亡率と併せて、Ｓ置換を識別する前に行われた安心な評価とは顕著に異なる。そのため、Ｓ置換の詳細な機能は完全に知られてはいないが、この証拠は、Ｓ置換の疫学的機能が高いレプリキン数と併せて明らかであることを示唆する。
【０１３１】
Ｈ５Ｎ１から完全なパンデミックが実体化するかどうか、またそれがいつであるかを最終的に決定する要因は依然として不明である。次のパンデミックの因子となりうるＨ５Ｎ１の最終置換構造に関する情報がこれまで欠如していたため、適切なワクチンを産生する試みが遅れている。本明細書に開示されるレプリキンペプチド構造およびガチョウレプリキン骨格は、到来の可能性があるパンデミックに対するワクチンの産生について必要な指示を提供する。
【０１３２】
標的としてのＳ置換レプリキン骨格
インフルエンザウイルスの新生株におけるレプリキン骨格での予測的置換により提供される合成ワクチンのターゲットに関する非限定例は、表１の配列標示「１９５７ Ｈ２Ｎ２ヒトインフルエンザパンデミック」、「１９６８ Ｈ３Ｎ２ヒトインフルエンザパンデミック」、「１９７９〜２００３ Ｈ７Ｎ７インフルエンザ」、「２００４ Ｈ５Ｎ１（ベトナム、高い病原性）」および「２００６ Ｈ５Ｎ１インドネシア（高い病原性）」で提供される。上述のように、ガチョウレプリキンおよび表１に開示されるその他すべての配列と比較して、ロイシンを１９５７年および１９６８年パンデミック株におけるイソロイシンで置換すること、およびロイシンをＨ７Ｎ７の１９７９年〜２００３年株におけるイソロイシンで置換することは、ロイシンが２００４年ベトナムのＨ５Ｎ１新生株におけるメチオニン、および２００６年インドネシアのＨ５Ｎ１新生株におけるイソロイシンで最近置換されたことにより連続的な毒性の増加がもたらされるという予測的重要性を提供する。ベトナムおよびインドネシアにおける高い死亡率は、ヒトからヒトに転移した幾つかの証拠とともに、これらの置換株において毒性が実際に増加したことを示唆する。したがって、これらの株の置換レプリキン骨格ペプチドは、合成ワクチンの開発に役立つレプリキン骨格ペプチドの非限定的な好適実施形態である。本発明の別の非限定実施形態は、２００４年ベトナムから単離された置換Ｈ５Ｎ１および２００６年インドネシアから単離された置換Ｈ５Ｎ１のレプリキン骨格ペプチドであり、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基で置換された末端ヒスチジンから５番目の位置にある。より好適な実施形態において、レプリキン骨格ペプチドは、末端ヒスチジンから５番目の位置で、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸と置換される。
【０１３３】
本発明の別の実施形態において、１９５７年Ｈ２Ｎ２パンデミック株の骨格ペプチド、１９６８年Ｈ３Ｎ２パンデミック株、および１９７９年〜２００３年Ｈ７Ｎ７株は、これらの新生株に対する合成ワクチンの相同性標的も提供する。
【０１３４】
したがって、本発明は、本発明の単離したレプリキンペプチドも提供する。本レプリキンペプチドは、約２９のアミノ酸を含む。単離したレプリキンペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含んでもよく、［Ｓ］はインフルエンザウイルスの第２株と比較して、置換される任意のアミノ酸であるか、その他はほぼ同一のレプリキンペプチド配列を含んでもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は任意の疎水性アミノ酸であってもよい。さらに好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。さらに好適な実施形態において、上記で具体化された配列は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離される。
【０１３５】
ＶＩ．レプリキン骨格を使用したインフルエンザ毒性の増加を予測する方法
長期にわたるレプリキン骨格の歴史的データは、インフルエンザウイルスの新生株の毒性を予測するツールを提供する。インフルエンザウイルスの株において、レプリキン数が長期にわたって増加している場合、それはインフルエンザウイルスの新生株であり、毒性の増加を予想できる。インフルエンザウイルスの新生株が、歴史的に毒性が高いインフルエンザウイルスの株における毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連するレプリキン骨格ペプチドにアミノ酸置換を含む場合、新生株は毒性の増加を有すると予測してもよい。
【０１３６】
したがって本発明は、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を提供する。本方法は、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチドと、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチドと、インフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドと、を含むステップと、
（２）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換された第３レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸を識別するステップと、
（３）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株が、高い複製、毒性、または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（４）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸残基と同一の残基位置にあることを判断するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数と、インフルエンザウイルスの第１株の初期分離株のレプリキン数とを比較するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いことを判断するステップと、
（７）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップと、を含む。
【０１３７】
例えば、上述および表１に開示されるように、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２の１９５７年および１９６８年パンデミック株においてイソロイシンを持つ、ならびにＨ７Ｎ７の１９７９年〜２００３年株においてイソロイシンを持つ開示レプリキン骨格におけるガチョウレプリキンおよびその相同体におけるロイシンの置換は、２００４年ベトナムでのＨ５Ｎ１の新生株におけるメチオニンとのロイシンの最近の置換、および２００６年インドネシアでのＨ５Ｎ１の新生株におけるイソロイシンとの置換が継続的な毒性の増加をもたらすという予測重要性を提供する。高い死亡率およびヒト同士の感染が結合して起こることが証明されたことからも分かるように、ベトナムおよびインドネシア株において毒性は明らかに増加した。
【０１３８】
したがって、本発明の方法の非限定的な好適実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン骨格ペプチドは、任意のその他のアミノ酸の場合、ロイシンの置換を受けた。より好適な実施形態において、置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸で行われた。さらに好適な実施形態において、置換はメチオニンまたはイソロイシンで行われた。一層好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン骨格ペプチドにおける置換は、レプリキン骨格ペプチドの２４位、または代替として末端ヒスチジンから５番目の残基において行われた。
【０１３９】
本発明は、パンデミックを予測する方法も提供する。本方法は、ウイルスＤＮＡを単離およびシーケンシングするステップと、コード化されたアミノ酸配列に関して、結果として生じる配列を走査するステップと、アミノ酸配列に関して本明細書に記載される予測方法を行うステップと、を含む。核酸配列は、アミノ酸の配列をコード化する場合、アミノ酸配列と相同である。本発明の方法の好適な実施形態において、パンデミックを予測する方法は、結果として生じる核酸配列を走査するステップと、ガチョウレプリキンの２４位における変化を特定するステップと、Ｈ５Ｎ１のガチョウレプリキンにおけるＳ置換の存在に基づいて、将来のパンデミックを予測するステップとを含む。
【０１４０】
上述の非限定的方法は、発見された任意のレプリキン骨格または以下に開示される任意のレプリキン骨格を採用してもよい。
【０１４１】
ＶＩＩ．レプリキンを使用してインフルエンザ毒性の増加を予測する方法
本発明は、長期にわたるレプリキン配列の変化、地理、または疫学的事象を監視することにより、インフルエンザウイルスの株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する非限定的な方法も提供する。インフルエンザウイルスの株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法は、
（１）インフルエンザウイルスの第１株を識別するステップであって、インフルエンザウイルスの株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の早期発生分離株のレプリキン数より大きいステップと、
（２）インフルエンザウイルスの第１株の第１レプリキンペプチドを識別するステップと、
（３）第１レプリキンペプチドと相同であるが、アミノ酸の場合、アミノ酸置換はヒスチジン残基において行われない、インフルエンザウイルスの第２株における第２レプリキンペプチドを識別するステップと、
（４）第２レプリキンペプチドと相同であるが、アミノ酸置換は第１レプリキンペプチドにおけるアミノ酸置換と同位置で行われる、インフルエンザウイルスの第３株における第３レプリキンペプチドを識別するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第３株が、インフルエンザウイルスの第２株において高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株が、インフルエンザウイルスの第２株において高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すことを予測するステップと、を含む。
【０１４２】
本方法の好適な実施形態において、アミノ酸置換はリジン残基またはヒスチジン残基において行われない。レプリキンアルゴリズムは、第１、第２および第３レプリキンペプチドのそれぞれにおいて満たされる必要がある。
【０１４３】
本発明は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離したインフルエンザレプリキンペプチドをさらに提供する。
【０１４４】
ＶＩＩＩ．エビ白点ウイルスにおける相同性骨格配列
本発明者は、レプリキンについて現在までに調査されたすべてのその他ウイルスおよび有機体と比較して（マラリアを除く）、白点エビウイルスが異常に高いレプリキン数を有することをさらに発見した。レプリキンは、真菌、イースト、ウイルス、細菌、藻類において急速な複製を基本的に伴うことが示されているが、本発明者は、藻類以外の海洋有機体におけるレプリキンの存在を始めて示した。また藻類についても、レプリキンの存在が急速な蔓延に関連する。エビにおいて、最初は東洋諸国で、また現在では西半球の国々でも白点ウイルスがエビの捕獲量に何百万ドルもの損害を与えている。現時点で有効な予防または治療はない。レプリキン高死亡率海洋ウイルス性疾患のその他の例は、コイ等の魚、サケの出血性疾患において見られ、海洋生態系および疾患に広まる可能性がある。
【０１４５】
エビ白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）のヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキンの反復配列の存在は、異常に高いレプリキン数１０３．８の要因である。このウイルスレプリキン数は、例えば、通常１未満〜最大５または７の範囲であるインフルエンザウイルスのレプリキン数よりはるかに高く、熱帯熱マラリア原虫（マラリア）に見られる（今までのところ）記録的なレプリキン数１１１のみに匹敵する。興味深いことに、エビ白点症候群の有機体はウイルスであり、熱帯熱マラリア原虫の場合はトリパノソームであるが、エビ（白点ウイルス）またはヒト（マラリア）にかかわらず、どちらも赤血球、異常な宿主細胞におけるそれらの繁殖サイクルの重要部分を費やし、電撃性の急速に複製する疾患であって宿主細胞の高い死亡率を伴い、またどちらも高いレプリキン数をそのような記録的に高い値まで増加する同一の方法、つまりレプリキン反復およびレプリキン重複を使用すると考えられる。
【０１４６】
本発明者は、ウイルスのレプリキン骨格部分における毒性インフルエンザウイルスと白点ウイルスとの関係も確立した。これら２つのウイルスの関係はこれまで示唆されていない。広範な置換が存在するが、エビ白点症候群ウイルスの幾つかの短鎖レプリキンに関する本出願人の発見は、特に長さおよびキーリジン（ｋ）ならびにヒスチジン（ｈ）残基（固定骨格またはレプリキン骨格）に関して、インフルエンザウイルスレプリキン配列に対する著しい相同性を示し、両ウイルス群において、同様のレプリキン産生機序が使用されることを示唆する。
【表２】
【０１４７】
さらに、ブタおよび鳥類を含むがそれらに限定されない多くの種は、ヒトインフルエンザ感染の動物「保有宿主」を提供することが知られているため、現在、エビウイルス等の海洋形態を検査することができ、ブタインフルエンザおよび鳥インフルエンザ等の流行に対する初期警告診断的利点を有する。一部インフルエンザウイルスの類似性が種の間で認められており、これらウイルスの種間転移が知られているが、ウイルスの活性を図る定量方法はこれまでにない。これまで、異なる種に移動する可能性のある保有宿主の活性の増加を評価すること、よって事前の警告を出すことは不可能であった。現在、各種におけるレプリキンの活性について、ウイルス複製速度の増加およびその他の種に転移する可能性のある種におけるエピデミックの出現の証拠を常に監視することができる。
【０１４８】
このデータは、独自の歴史およびその宿主細胞の急速複製および疾患の共有機能を有する新種のペプチドとしてレプリキンをさらに指示する。そのエビ宿主細胞に対する高い死亡率を伴う白点症候群ウイルスは、現在そのレプリキンをウイルスレプリキンの初期形態、または類似形態学的分岐として評価した。いずれかの場合において、インフルエンザウイルスの場合のように、鳥および動物レプリキンの保有宿主として良好に作用する。エビにおけるこれらレプリキン発見を診断および予防に使用することは、インフルエンザおよびレプリキンを含むその他の有機体に対する診断および予防に使用する場合と同様に行う。
【０１４９】
ＩＸ．１９１８年パンデミックに遡るＳＡＲＳウイルスおよびＨ３Ｎ２‐ＦＵＪＩＡＮインフルエンザウイルスレプリキンにおける相同配列
特定のＳＡＲＳウイルスレプリキンペプチドは、ガチョウレプリキンと相同であるレプリキン骨格配列との相同体を含むインフルエンザウイルス分離株の幾つかの株におけるペプチドと相同体を共有する。相同体は、２，０００万人もの死をもたらした１９１８年インフルエンザパンデミックの株における配列に遡る２００６年毒性インフルエンザ株から拡大する。
【０１５０】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、２００２年〜２００３年インフルエンザシーズンにおいて最初に出現した。インフルエンザＧＲおよびコロナウイルスレプリキン（または一部の不明な共有前駆体）から得たＳＡＲＳレプリキンの２００２年における二重複製期限は、すべて２００２年に発生した以下の事象により示唆される。１）８５年間で初めての縮合は、ＧＲ‐Ｈ１Ｎ２レプリキン配列が２９から２８アミノ酸になったことに見られる（表３）（現行エピデミックにおける２９〜２７アミノ酸から得たＨ３Ｎ２Ｆｕｊｉａｎにおいて同様の縮合が見られた（表３））。２）ＧＲ‐Ｈ１Ｎ２のレプリキン数は、Ｈ１Ｎ２から移動するＧＲに一致して顕著な減少を示した。３）コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、顕著な増加を示した。４）以下のモチーフを含むレプリキンを持つＳＡＲＳコロナウイルスが２００２年〜２００３年に出現した。ＧＲ １９１８およびＧＲ‐Ｈ１Ｎ２ ２００１に既に見られる「ｋｋｇ」および「ｋ‐ｋ」；インフルエンザＧＲ‐Ｈ１Ｎ２ ２００１に見られる「ｋ‐ｋｋ、「ｋｋ」および「ｋｌ」；鳥類気管支炎コロナウイルスレプリキンに見られる「ｋｋ」；およびブタエピデミック下痢コロナウイルスのレプリキンに見られる「ｋｋ‐ｋｋ‐ｋ」、「ｋ‐ｋ」、「ｋｋ」、「ｋｌ」および「ｋｔ」（表３）。
【表３】
【０１５１】
１９１７年ガチョウレプリキンの存在を含む、近年の増加的に高いレプリキン数のピークは、現在Ｈ１Ｎ２（表３）において、１９１７年のレプリキン数に近づいており、来るべきパンデミックの警告となりうる。ＳＡＲＳウイルスおよびＨ３Ｎ２‐Ｆｕｊｉａｎウイルスは、高い死亡率に関連すると思われるガチョウレプリキン（図１７）の短いレプリキン派生物の現行キャリアであるため、既に始まっている可能性がある。
【０１５２】
ガチョウレプリキンは少なくとも８５年の歴史を持ち、インフルエンザおよびＳＡＲＳのＡ株の大部分またはすべてに関与するため、レプリキン自体およびその構成要素は、パナマ型保護に対する保存されたワクチン候補である。７〜２１アミノ酸長、ガチョウと比較してリジンおよびヒスチジン％の豊富な縮合型短鎖ＳＡＲＳレプリキンは、２９アミノ酸長のガチョウレプリキンの死亡率（２．５％）と比較して、ＳＡＲＳの高い死亡率（１０〜５５％）と関連して発生した。ＳＡＲＳにおける長鎖レプリキンとここで混合された短鎖レプリキンは、高い死亡率に関与する可能性がある。これは、エボラおよび天然痘ウイルスならびに炭疽菌等のその他の有機体のレプリキンの場合も同様である（表３）。これらの短鎖ＳＡＲＳレプリキンは、一層高い未治療死亡率に関連する天然痘、炭疽菌、およびエボラ等のその他有機体の短鎖レプリキンと驚くべき相同性を示した（表３）。インフルエンザレプリキンを用いたＳＡＲＳコロナウイルス相同体におけるレプリキンの検出により、ワクチンの小型ＳＡＲＳ抗原の合成を可能にした。
【０１５３】
短鎖合成ワクチンは、はるかに短期間で安価に産生することができ、一般に現行の全体ウイルスワクチンにおける数千の望ましくないタンパク質の複数のエピトープにより引き起こされる感染および免疫干渉に付随する副作用を回避するはずである。短鎖グリオーマレプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」は、合成物質のための良好なベースとなることが立証された。米国特許番号６，２４２，５７８を参照のこと。これは、癌細胞に対する細胞毒性を有する抗マリグニン抗体をピコグラム／細胞で産生し、癌患者の生存と量的に関連する。われわれは、ヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質において認められる５つのＳＡＲＳ短鎖レプリキンを合成した。例６を参照のこと。これらの合成短鎖ＳＡＲＳレプリキンをウサギに注射した場合、大量の特定抗体を産生した。例えば、２１アミノ酸ＳＡＲＳヌクレオキャプシドレプリキン抗体は、１：２０４，８００を越える希釈で結合する。様々な小ペプチドを用いて、天然痘ワクチンにおいて見られるように、総タンパク質または数千のタンパク質、あるいは核酸の使用により生じる望ましくない副作用のない強い免疫反応を得るための試みが以前に他者により行われたが、失敗に終わっているため、小型合成レプリキン抗原が強い免疫反応を実現する能力は、これらのＳＡＲＳワクチンの有効性にとって重要である。
【０１５４】
図１７に示されるような結果を用いて、インフルエンザおよびＳＡＲＳウイルスにおけるレプリキン構造と高い死亡率との関連を評価した。高い死亡率と短鎖または縮合レプリキン配列との関連は、図１７のセクションＢに示される高死亡率の有機体、インフルエンザおよびＳＡＲＳ以外のウイルス、および細菌、マラリアおよび癌において見られる。レプリキン構造の統一概念、および任意の細胞型または感染性有機体ではなく、レプリキンと急速複製との関連に関する統一概念の裏付けとして、流布および毒性に複製が重要となる広範囲のウイルス、細菌、マラリアおよび癌有機体における基本的レプリキン構造の普及に加えて、以下の相同配列が認められている。１位および２位における「ｋ」に注目する。取り込みまたは急速複製を刺激するためＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他のレセプタあるいはリガンドに提示する「ｋ」の配列に注目する。「二重ｋ」および「複数ｋ」の頻度に注目する。最も縮合短縮されたレプリキンの３位における「ｇ」の頻度および三重項「ｋｋｇ」、「ｈｅｋ」、「ｈｄｋ」、および「ｈｋｋ」の発生に注目する。このレプリキンは、天然痘ウイルス、炭疽菌ウイルス、ラウス肉腫、および多形性グリア芽腫（グリオーマ）、大腸癌および乳癌におけるｃ‐ｓｒｃ、メラノーマおよび大腸癌におけるｃ‐ｙｅｓを含む最高の死亡率を持つ有機体、癌細胞、および遺伝子に関連する。オーストラリアおよび東南アジアにおいて２つの近年出現した高死亡率ウイルスであるニパウイルスおよびヘンドラウイルスのほぼ同一レプリキン構造にも注目する。これら２つのウイルスは、それらに対して形成された類似または同一の抗体を有することが報告されているが、その構造的ベースについてはこれまで知られておらず、われわれがこの類似抗体に対する２つのほぼ同一レプリキンを発見した。
【０１５５】
また表３は、われわれが発見した２００３年の５つのＳＡＲＳレプリキンと、１９１７年インフルエンザガチョウレプリキンおよび２つのコロナウイルス（鳥類気管支炎コロナウイルスおよびブタエピデミック下痢ウイルス）との関連を示す。表３および図１７における最初の２００３年ヒトＳＡＲＳレプリキンは、２００２年におけるインフルエンザＨ１Ｎ２の中間構造による、１９１７年インフルエンザガチョウレプリキンおよびヒト１９１８年レプリキンに対する特定の配列相同性を示す（例えば、１位、１８位および１９位におけるレプリキン「ｋ」を参照）。１９１７年ガチョウレプリキン配列は、表３および図１７において、１９９９年におけるレプリキンの定義に重要ではないアミノ酸に多くの置換があるにもかかわらず、大部分が保存されていることを示す（置換はイタリック体で示される）。次に、元の２９アミノ酸１９１７年レプリキン配列は、２００１年Ｈ１Ｎ２レプリキンにおける１９１７年〜１９１８年のその構造にほぼ正確に回復されたことが分かった。しかし、２００２年Ｈ１Ｎ２インフルエンザレプリキンは、２９から２８アミノ酸に短縮され、アミノ酸ｋｅｖｌ（ｉ／ｖ）ｗｇ（ｖ／ｉ）ｈｈが「左にシフト」したことがはっきりと証明される。
【０１５６】
２００３年に１つのレプリキンが、最初にリストされる２００３年ヒトＳＡＲＳウイルスの２１アミノ酸レプリキンにさらに短縮（または小型化）された。２００３年ＳＡＲＳレプリキンにおけるｋの割合（％）は、ガチョウレプリキンおよび１９１８年ヒトパンデミックレプリキンの２０．７％と比較して、現在３８．１％（８／２１）である。インフルエンザ２９アミノ酸レプリキンと比較して、３つのＳＡＲＳレプリキンが、さらに１９、１１および９アミノ酸長配列にそれぞれ短縮（または小型化）されたことが認められた。図に示されるＳＡＲＳ９アミノ酸配列におけるｋの割合（％）は４４．４％（４／９）である。ＳＡＲＳレプリキンの短縮に関して、ヒトにおけるＳＡＲＳ死亡率は、１９１８年インフルエンザパンデミックにおける２．５％と比較して、若年層において１０％、老年層において５５．５％まで上昇した。
【０１５７】
アミノ酸配列を表３に示し、相同の程度およびインフルエンザレプリキンの８５年間（１９１７年〜２００２年）にわたる保存を強調表示する。１９１７年ガチョウレプリキンにおいてその証拠が最初に認められた。そのような保存は、これまで認められていない。また表３は、２００３年ヒトＳＡＲＳウイルスにおけるレプリキンが、最初に１９１７年ガチョウレプリキンとして、また１９１８年ヒトパンデミックインフルエンザレプリキンとして出現したインフルエンザレプリキンに対する相同性を有することに加え、コロナウイルス鳥類気管支炎ウイルスレプリキン（例えば、１位および２位が「ｋ」であり、「ｈ」で終端する）およびコロナウイルス急性下痢ウイルスレプリキン（例えば、レプリキンの１位および１１位が「ｋ」であり、末端が「ｈ」である）の両方に対して特定の配列相同性があることを示す。インフルエンザおよびコロナウイルスレプリキンの両方に関連するというこの証拠は、幾つかの最近のインフルエンザエピデミックおよび以前のパンデミックと同様に、ＳＡＲＳが香港で発生し、ＳＡＲＳウイルスが、ヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質を含むその構造に一部起因して新規コロナウイルスとして分類されていることからも興味深い。ＳＡＲＳがヒトにおいてエピデミック肺炎として最初に出現したことについては、特定の疫学的証拠も関連している。このエピデミック肺炎は、込み合った香港のアパートで勃発した。そこでは糞便汚水の激しい逆流があり、それが換気扇により空中に浮遊した。
【０１５８】
Ｘ．インフルエンザワクチン、治療および治療薬
本発明は、任意の１つ以上の上述の単離した配列、または任意の１つ以上の上述の単離した配列の任意の抗原部分列、あるいは上述の単離した配列またはそれらの部分列のいずれかに結合する抗体を含むワクチンも提供する。
【０１５９】
現在、インフルエンザ用ワクチン製剤は、ＷＨＯおよびＣＤＣの国際会議において毎年２回変更されている。ワクチン製剤は、世界の所定地域におけるインフルエンザウイルス株の最近の優勢に関する血清学的証拠に基づく。しかし、本発明に先立って、インフルエンザウイルス株に特異的なアミノ酸配列の変化と、インフルエンザエピデミックまたはパンデミックの発生との関連付けはなかった。
【０１６０】
インフルエンザウイルスタンパク質における特定レプリキンおよびその濃度を観察することにより、インフルエンザパンデミックおよびエピデミックに関する第１の特異的な量的初期化学的関連が提供され、特異的に調整されたインフルエンザワクチンを産生して適時投与することにより、世界の特定地域において流行しているインフルエンザウイルスの出現株または再出現株を治療することができる。インフルエンザウイルス株の分離株のタンパク質配列、例えば血球凝集素タンパク質配列について、レプリキンの存在、濃度および／または保存を分析することにより、インフルエンザウイルスパンデミックおよびエピデミックを予測できる。さらに、そのようなインフルエンザ流行の重大性は、最も豊富にあることが認められたレプリキン配列または所定の期間、例えば約１〜約３年にわたってウイルス分離株中で上昇傾向にあるレプリキン配列に基づいたインフルエンザペプチドワクチンを投与することにより、著しく低減できる。
【０１６１】
本発明のインフルエンザペプチドワクチンは、単一のレプリキンペプチド配列を含んでもよく、またはインフルエンザウイルス株において見られる複数のレプリキン配列を含んでもよい。好ましくは、ペプチドワクチンは、所定の期間にわたって濃度の増加が見られ、少なくともその期間は保存されるレプリキン配列に基づく。
【０１６２】
例えば、好適なワクチンは、レプリキン骨格の一部材であるレプリキン配列を含んでもよい。レプリキン骨格配列とインフルエンザウイルスの高い毒性株との関連性と併せて、レプリキン骨格の高い保存性により、レプリキン骨格配列は合成ワクチンに好適な配列となる。ガチョウレプリキン骨格の一部材は、ウサギおよび鶏に皮下投与された場合に強い免疫反応を提供するために有効であることが証明された。例７を参照のこと。
【０１６３】
本発明のワクチンは、新規のレプリキンペプチドと併せて保存レプリキンペプチドを含んでもよく、または新規のレプリキンペプチド配列に基づいてもよい。レプリキンペプチドは、化学合成または組み換え遺伝子技術を含む任意の方法で合成することができ、レプリキン配列のみを含むペプチドに基づくワクチンが好ましいが、非レプリキン配列を含んでもよい。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容しうるキャリアおよび／またはアジュバントを含んでもよい。
【０１６４】
本発明のインフルエンザワクチンは、単独で、またはガンシクロビル；インターフェロン；インターロイキン；アマンタジン、リマンタジン等のＭ２阻害剤；ザナミビルおよびオセルタミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤等の抗ウイルス薬と併用して、および抗ウイルス薬の組み合わせとともに投与することができる。
【０１６５】
本発明のインフルエンザワクチンは、免疫反応において抗体を産生できる任意の動物に投与してもよい。例えば、本発明のインフルエンザワクチンは、ウサギ、鶏、ブタ、またはヒトに投与されてもよい。本発明のインフルエンザワクチンは、一連のインフルエンザ株または特定のインフルエンザ株に配向されてもよい。
【０１６６】
本発明に従う非限定的側面において、インフルエンザワクチンは、インフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２、（Ａ）Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１を含むインフルエンザの動物またはヒト株、またはその後に生じる可能性のあるウイルスの任意のヒト変型、および現行の鳥類Ｈ５Ｎ１等の主に動物に見られるインフルエンザ株に対する免疫反応を対象としてもよい。インフルエンザワクチンは、インフルエンザタンパク質の任意の一部における特定のレプリキンアミノ酸配列をさらに対象としてもよい。ＵＴＯＰＥ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＨに共有結合したＨ５Ｎ１ウイルスのレプリキン骨格ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含むインフルエンザワクチンおよびよく知られたキーホールリンペットシアニンンアジュバントは、鶏およびウサギにおいて強い免疫反応を提供した。例７を参照のこと。
【０１６７】
本発明の非限定的実施形態は、レプリキン骨格配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含むインフルエンザワクチンを提供する。［Ｓ］は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して置換される以外はほぼ同一のレプリキンペプチド配列を含む任意のアミノ酸であってもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は疎水性アミノ酸であってもよい。さらに好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。一層好適な実施形態において、上記で具体化された配列は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離された配列である。
【０１６８】
さらに非限定的な側面において、インフルエンザワクチンは、ＫＫＫＫＨまたはＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨ等のＵＴＯＰＥを含んでもよい。さらなる代替例において、ワクチンは、本明細書で‐ＫＬＨと表示される、よく知られたキーホールリンペットヘモシアニン等のアジュバントの追加を含んでもよい。さらに好適な非限定的側面において、インフルエンザワクチンは、２つのＵＴＯＰＥ、およびＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＭＷＧＩＨＨ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨまたはＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＩＷＧＩＨＨ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ等のアジュバント配列をさらに含むインフルエンザＨ５Ｎ１のレプリキン骨格を含んでもよい。本発明の側面は、以前に単離され、表１において「２００４年 Ｈ５Ｎ１ベトナム、高い病原性」または「２００６年 インドネシア、高い病原性」と標識される鳥インフルエンザレプリキンの１つとして示されるレプリキン骨格配列を含んでもよい。
【０１６９】
１００μｇのペプチドから成るワクチンをウサギおよび鶏に皮下注射により投与することにより、１：５０未満のワクチン接種を受けていない希釈物からの抗体反応は、ワクチン接種後３〜４週間で、１：１２０，０００の希釈から１：２４０，０００を越えるピークに達することが予測される。
【０１７０】
グリオーマレプリキン（配列番号：＿）「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」またはＣ型肝炎レプリキン（配列番号：＿）「ｈｙｐｐｋｐｇｃｉｖｐａｋ」等のレプリキン、あるいは（配列番号：＿）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」または（配列番号：＿）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」等のＨＩＶレプリキンに基づく合成レプリキンワクチン、または好ましくは所定の期間にわたって保存される、および／または出現または再出現するレプリキンに基づくインフルエンザワクチンを使用し、抗体濃度を増加させて、ウイルス感染した細胞をそれぞれ溶解し、ウイルスを細胞外に放出して化学療法が有効になるようにしてもよい。
【０１７１】
レプリキンフラグメントを認識および結合することにより、細胞の破壊をもたらす抗体の誘導を目的とする場合は、特定のレプリキン構造のみを利用することが好ましい。大型タンパク質配列は、「複製関連機能」を有することが当業者に知られているが、大型タンパク質を使用するワクチンは失敗するか、または有効でないことが分かる場合が多い。
【０１７２】
本発明者は単一の理論に固執することを望まないが、本明細書における研究は、先行技術のワクチンが、大型タンパク質配列の使用に基づくため効果がないこと、つまり抗体の形態で適切な免疫反応および／または細胞性免疫を産生できず、保護能がないことを示唆する。大型タンパク質配列は、常に１つ以上のエピトープ（特定の抗体形成を誘導できる独立した抗原配列）を有し、レプリキン構造は、通常これらの可能なエピトープのうちの１つを含む。その他のエピトープが大型タンパク質に存在することは、免疫系に無関係の抗原刺激を「大量に送り込む」ことによって、レプリキン抗原を阻止する可能性があり、レプリキンに対する抗体の適切な形成が妨害される場合がある。このよく知られた抗原優位現象に関する議論については、例えば、Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９７（２）：１７７‐１８３（１９６６）、およびＷｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３４：４８‐５８，１９７６、Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４２１‐４２２（１９９８）を参照のこと。この抗原優位現象によって、免疫系により提示および認識される第１ペプチドエピトープがその後広まり、その他のペプチドエピトープが同時に提示されるが、それに対する抗体が形成される。これは、ワクチン形成において、有機体からのその他のエピトープを提示する前に、定常レプリキンペプチドを最初に免疫系に提示することによって、レプリキンが先取されず免疫記憶に残るようにすることが重要である別の理由である。
【０１７３】
レプリキンワクチンに対する初期反応の量的測定
数日または数週間におけるレプリキンワクチンに対する初期特定抗体反応を量的に測定する能力は、臨床反応が数ヶ月または数年後にしか測定できないその他のワクチンに優る主要な実践的利点である。
【０１７４】
アジュバント
様々なアジュバントを使用し、宿主細胞種に応じて、免疫学的反応を強化してもよい。例えば、フロインド（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーリンペットヘモシアニン、ジントロフェノール、およびＢＣＧ、ホルマリン死菌体（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。それらにおける合成ＵＴＯＰＥのワクチン使用に加えて、ＵＴＯＰＥをその他レプリキンワクチンおよび非レプリキンワクチンに対するアジュバントとして使用できる。
【０１７５】
ＵＴＯＰＥＳ
ｋの割合（％）が高いレプリキンは、ウサギに投与された場合に最も高い抗体反応を生成することが示された。本発明者が設計したこれらの合成ペプチドは、万能合成エピトープ、または「ＵＴＯＰＥ」と指定し、これらのＵＴＯＰＥに基づくワクチンは「ＵＶＡＸ」と称される。推定合成ワクチンであるＵＶＡＸは、単一ワクチン、またはより特異的なレプリキンワクチンまたはその他ワクチンと併用投与されるアジュバントとして使用してもよい。以下は、推定ＵＴＯＰＥおよびＵＶＡＸの例である。
考案した合成レプリキン 配列番号：
（ＵＴＯＰＥまたはＵＶＡＸ）
ＫＫＫＫＨＫ ＿＿＿
ＫＫＫＨＫＫ ＿＿＿
ＫＫＨＫＫＫ ＿＿＿
ＫＨＫＫＫＫ ＿＿＿
ＫＫＫＫＫＫＨ ＿＿＿
ＫＫＫＫＫＨＫ ＿＿＿
ＫＫＫＫＨＫＫ ＿＿＿
ＫＫＫＨＫＫＫ ＿＿＿
ＫＫＨＫＫＫＫ ＿＿＿
ＫＨＫＫＫＫＫ ＿＿＿
ＨＫＫＫＫＫＫ ＿＿＿
【０１７６】
レコグニンおよび／またはレプリキンペプチドを対象に投与し、対象の免疫系を誘導して抗レプリキン抗体を産生してもよい。一般的に０．５〜約２ｍｇ用量、好ましくは各ペプチドの１ｍｇ用量を対象に投与し、免疫反応を誘導する。必要に応じて、後次の用量を投与してもよい。
【０１７７】
置換の識別はワクチンの初期開発を提供する
以前の卵および細胞に基づくインフルエンザワクチンの生成方法は、望ましくない副作用を生じる可能性のある数千もの不要なタンパク質を含み、生成に６〜９ヶ月以上かかり、試験にさらなる時間を要した。ＦｌｕＦｏｒｅｃａｓｔ（登録商標）は、現在、エピデミックまたはパンデミックが到来しつつあるという株特異性警告を１〜３年先行して行うことが可能である。またキーレプリキンおよび置換アミノ酸「Ｓ」の発見により、より正確で潜在的に安全な合成ワクチンを短期間、つまり数日以内に調整して試験することができる。
【０１７８】
Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおけるＳ置換の識別は、Ｈ５Ｎ１におけるＳ置換から生じる将来のヒトパンデミックに対するワクチンの開発用の標的を熟練者に提供する。ワクチンは、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨの任意の一部を含んでもよく、２４位におけるＳ置換（末端ヒスチジンから５残基目）は、任意のアミノ酸置換を表す場合がある。好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外のアミノ酸を表す。より好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸を表す。さらに好適な実施形態において、置換はメチオニンまたはイソロイシンを表す。１つの非限定的ワクチン実施形態は、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸を含む。別の非限定的実施形態において、ワクチンは配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸を含む。代替として、本ワクチンはキーリンペットヘモシアニン等のアジュバントまたはその他のアジュバント、および／またはＫＫＫＫＨＫ等のＵＴＯＰＥあるいは任意のその他のＵＴＯＰＥを含んでもよい。別の非限定実施形態において、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸抗原部分列に対する抗体も考慮される。本発明のレプリキン骨格またはレプリキン配列の約７〜約２９アミノ酸を有する任意の抗原部分列は、ワクチンおよび抗体を産生するための免疫系の刺激を考慮する。
【０１７９】
配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨのすべてまたは任意の一部に対する抗体は、当業者により開発されてもよい。特に２４位を含むエピトープに配向された抗体も同様に、当業者により開発されてもよい。好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外のアミノ酸を表す。より好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸を表す。さらに好適な実施形態において、Ｓ置換はメチオニンまたはイソロイシンを表す。例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ（Ｍ／Ｉ）を含む配列のすべてまたは任意の一部に対する抗体は、当業者により開発されてもよい。
【０１８０】
Ｓ置換を有するガチョウレプリキンに対する抗体を使用し、配列に対する抗体を持つＨ５Ｎ１感染を治療するか、または鳥、動物、またはヒトにおけるＨ５Ｎ１の毒性感染を診断してもよい。
【０１８１】
現在までに試験されたすべてのレプリキン配列は、免疫原生特性を示している。マリグニンから得た１６‐ｍｅｒレプリキンをウサギに注射したところ、１６‐ｍｅｒレプリキンに特異的な抗体が産生された。米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例６および図９Ａおよび９Ｂ、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオキャプシド、スパイクおよびエンベロープタンパク質において認められたＳＡＲＳレプリキンを合成し、ウサギで試験した。免疫反応を定量した。例６を参照のこと。本発明者は、表１において「２００４ Ｈ５Ｎ１ ベトナム、高い病原性」と標示されるＨ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」レプリキンの２９アミノ酸レプリキン骨格から４１アミノ酸レプリキン配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ指定のワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を、２つのＵＴＯＰＥ単位（ＫＫＫＫＨＫ）をＨ５Ｎ１骨格のＣ末端に追加し、２つのＵＴＯＰＥ単位のＣ末端上で共役結合した追加のアジュバント（キーホールリンペットヘモシアニン（‐ＫＬＨと記す）を追加して設計した。１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギおよび鶏に皮下注射した。抗体反応をワクチン接種前および注射から１週間〜８週間後に測定した。抗体反応は１週間で認められ、ワクチン接種から３〜４週間後にピークに達した。ピーク抗体反応は、１：１２０，０００の希釈〜１：２４０，０００を越える希釈の範囲であった。当業者は、本明細書に記載のレプリキン配列およびレプリキン骨格配列それぞれに対する抗体を開発してもよい。
【０１８２】
レプリキンヌクレオチド配列
レプリキンＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス、細菌またはその他のレプリキンコード化物質の感染に起因する疾患を診断するための使用法を多数有する可能性がある。例えば、レプリキンヌクレオチド配列は、原位置で加水分解アッセイを含む、生検組織または血液の加水分解アッセイ、例えばサザンまたはノーザン分析において使用し、例えば、組織標本または環境標本における特定有機体の存在を診断してもよい。また本発明は、関心の特定病原体に存在する特定レプリキンに特異的な抗体を含む、または特定のレプリキン、および任意に診断に必要な様々なバッファおよび／または試薬に対して特異的に加水分解する核酸分子（センスまたはアンチセンス）を含むキットについて考慮する。
【０１８３】
また、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびレプリキン‐またはレコグニン含有ｍＲＮＡの翻訳を抑制するよう機能するリボザイムを含むオリゴリボヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子およびリボザイムはどちらも、当該技術分野において知られる任意の方法で調整されてもよい。アンチセンス分子は、多様なベクターに組み込んで対象に送達することができる。熟練した医師であれば、最適な送達経路を決定できるが、一般にｉ．ｖ．（静脈内）またはｉ．ｍ．（筋肉内）送達が通常である。用量も容易に解明できる。
【０１８４】
特に、好適なアンチセンス核酸分子は、例えば、インフルエンザウイルスポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに含まれるレプリキン配列に相補的である。本レプリキン配列は、７〜約５０のアミノ酸から成り、（１）第２リジン残基から６〜１０残基にある少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％のリジン残基と、を含む。より好ましくは、遺伝子のコード鎖に存在するレプリキン、またはインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質をコード化するｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子である。本アンチセンス核酸分子は、６ヶ月から１年以上の期間保存されることが示された、および／またはその他のインフルエンザウイルス株のレプリキン濃度と比較して、高いレプリキン濃度を有することが示されたインフルエンザウイルスの株に存在するレプリキンをコード化するヌクレオチド配列に相補的である。レプリキン濃度の増加は、好ましくは少なくとも６ヶ月、より好ましくは約１年、最も好ましくは約２〜３年以上かけて発生する。
【０１８５】
同様に、ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンス核酸分子は、（１）第２リジン残基から６〜１９残基にある少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％リジン残基と、を含む７〜約５０アミノ酸のレプリキン配列を含むレプリキンをコード化するｍＲＮＡに相補的である。より好ましくは、遺伝子のコード鎖、またはウイルスのタンパク質をコード化するｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンス核酸分子である。
【０１８６】
ＸＩ．コンピュータ
本発明は、コンピュータを使用してインフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法も提供する。レプリキンを含むインフルエンザ株の存在について、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むデータバンクをコンピュータにより走査することもできる。またインフルエンザウイルスの新生株を予測するための要件を満たすレプリキン骨格ペプチドは高い毒性を持つ。
【０１８７】
図２は、本発明の前述の実施形態と併用するために入手可能なコンピュータのブロック図である。コンピュータは、プロセッサ、入出力装置、および前述の実施形態の毒性予測方法を表す実装可能なプログラム指示を格納するメモリを含んでもよい。メモリはスタティックメモリ、揮発性メモリ、および／または非揮発性メモリを含んでもよい。スタティックメモリは、磁気的、または電気的あるいは光学的保存媒体で提供される従来の読み取り専用メモリ（「ＲＯＭ」）であってもよい。揮発性メモリは、従来のランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）であってもよく、またプロセッサ内にキャッシュとして集積されるか、または個別の集積回路としてプロセッサ外で提供されてもよい。非揮発性メモリは、電気的、磁気的または光学的保存媒体であってもよい。
【０１８８】
以下の例は本発明のみを説明することを意図し、本明細書で提供される本発明の全範囲を限定しない。当然のことながら、本発明の修正および変型は上述の教示により包含され、本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく添付の請求項の範囲に含まれる。
【０１８９】
実施例１
レプリキンの抽出、単離、および識別の過程、およびレプリキン含有有機体を標的、標識または破壊するためのレプリキンの使用
ａ）藻類
バミューダ水地から以下の藻類を収集し、同日に抽出するか、または−２０℃で凍結し、次の日に抽出した。中性バッファにおける１ｇアリコート、例えば１００ｃｃの０．００５Ｍリン酸バッファ溶液ｐＨ７（「リン酸バッファ」）中の藻類を冷室（０〜５℃）において１５分間、ワーリングブレンダで均質化し、３０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄みを蒸発により濃縮し、冷たいリン酸バッファに対して透析することにより約１５ｍｌ量を産生した。この抽出液の量を記録し、タンパク質分析用に得られたアリコートおよび残渣を分別して、１〜４のｐＫ範囲を有するタンパク質留分を得た。
【０１９０】
分別の好適な方法は、以下のクロマトグラフィである。抽出溶液を冷室（４℃）において、０．００５Ｍリン酸バッファで平衡されたＤＥＡＥセルロース（Ｃｅｌｌｅｘ‐Ｄ）カラム２．５ｘ１１．０ｃｍ上で分別する。溶離溶媒の段階的な変化は、以下の溶液を用いて行った。
溶液１‐４．０４ｇのＮａＨ２Ｐ０４および０．５ｇのＮａＨ２Ｐ０４を１５リットルの蒸留水（０．００５モル、ｐＨ７）に溶解する。
溶液２‐８．５７ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４８０ｍｌの蒸留水に溶解する。
溶液３‐１７．１ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４８０ｍｌの蒸留水に溶解する（０．０５モル、ｐＨ４．７）。
溶液４‐５９．６５ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４７０ｍｌの蒸留水に溶解する（０．１７５モル）。
溶液５‐１０１．６ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４５５ｍｌの蒸留水に溶解する（ｐＨ４．３）。
溶液６‐３４０．２ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４６５ｍｌの蒸留水に溶解する（１．０モル、ｐＸ‐ｉ４．１）。
溶液７‐２８３．６３ｇの８０％リン酸（Ｈ３Ｐ０４）を２，４６０ｍｌの蒸留水中で形成する（１．０モル、ｐＨ１．０）。
【０１９１】
６〜１０ｍｌ量の抽出液をカラムに移し、溶液１と重ねた。また３００ｍｌの溶液１の容器を取り付け、重力によりカラム上に滴下させた。３ｍｌアリコートの溶離剤を収集し、溶液１で除去されるすべてのタンパク質がカラムから除去されるまで、ＯＤ２８０におけるタンパク質含有量について分析した。次に溶液２をカラムに適用し、各溶液で除去可能なタンパク質がすべてカラムから除去されるまで、溶液３、４、５、６および７を連続して適用する。溶液７からの溶離剤を複合し、リン酸バッファに対して透析し、透析液および透析物に関するタンパク質含有量を特定し、両者をゲル電気永動により分析した。３，０００〜２５，０００ダルトン分子量のペプチドまたはタンパク質の１つまたは２つのバンドを溶液７において取得する。例えば、溶液７においてにおいて示された藻類のＣａｕｌｅｒｐａ ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌａｕｒｅｎｃｉａ ｏｂｔｕｒａ、Ｃｌａｄｏｐｈｅｘａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｎａｔａｎｓ、Ｃａｕｌｅｒｐａ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ、Ｈａｌｉｍｅｄａ ｔｕｎａ、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｏｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓはすべて、上述のような抽出および治療後に、感染のないこのモル重量領域において明らかなペプチドバンドを溶離する。これらの溶液７タンパク質またはそれらの溶離されたバンドを加水分解し、アミノ酸組成物を特定する。そのようにして得られたペプチドは、６％以上のリジン組成物を含むレプリキン前駆体である。次に、アミノ酸配列に対するこれらのレプリキンペプチド前駆体を特定し、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１において詳述される加水分解および質量分析によりレプリキンを特定する。「３点認識」法により定義される基準を満たすものをレプリキンとして識別する。この手順は、イースト、細菌および任意の植物レプリキンにも適用できる。
【０１９２】
ｂ）ウイルス
ａ）藻類の場合において上述のように、同一の抽出物およびカラムクロマトグラフィ分離法を使用し、ウイルス感染細胞におけるレプリキンを単離および識別した。
【０１９３】
ｃ）腫瘍細胞の生体内および生体外組織培養
ａ）藻類の場合において上述されるような同一の抽出物およびカラムクロマトグラフィ分離法を使用し、腫瘍細胞におけるレプリキンを単離および識別する。例えば、悪性脳腫瘍から単離されたアストロシチン、組織培養中のグリオブラストーマ腫瘍細胞から単離されたマリグニン（Ａｇｌｙｃｏ ｌＯＢ）、組織培養中のＭＣＦ７哺乳類癌細胞、および組織培養中のＰ３Ｊリンフォーマ細胞のレプリキン前駆体であり、それぞれａ）リジン含有率９．１％、６．７％、６．７％および６．５％で産生されたレプリキン前駆体において上述のように治療される。米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例１０に記載のＡｇｌｙｃｏ ｌＯＢの加水分解および質量分解により、アミノ酸配列ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｉｄｅ、１６‐ｍｅｒレプリキンが産生された。
【０１９４】
実施例２
レプリキンの診断的使用の例として、Ａｇｌｙｃｏ ｌＯＢまたは１６‐ｍｅｒレプリキンを抗原として使用し、診断的目的で血清中に存在するその対応する抗体の量を獲得および定量してもよいことは、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図２、３、４および７に示される。
【０１９５】
標識、栄養または破壊の目的でレプリキンに結合する物質の産生に関する例として、ウサギに１６‐ｍｅｒレプリキンを注射し、１６‐ｍｅｒレプリキンに特異的な抗体を産生することは、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例６および図９Ａおよび９Ｂに示される。
【０１９６】
１６‐ｍｅｒレプリキンに対する抗体を使用し、このレプリキンを含む特定細胞を標識するというレプリキンを標識する物質の使用例は、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図８および例６に示される。
【０１９７】
１６‐ｍｅｒレプリキンに対する抗体を使用し、このレプリキンを含む特定細胞を抑制または破壊するというレプリキンを破壊する物質の使用例は、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図９に示される。
【０１９８】
実施例３
インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質の分離株またはノイラミニダーゼタンパク質の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。インフルエンザウイルスの分離株を取得し、インフルエンザ血球凝集素および／またはノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列を任意の当該技術分野で知られる方法、例えば血球凝集素またはノイラミニダーゼ遺伝子のシーケンシングおよびそこからタンパク質配列を派生させることにより取得する。新規レプリキンの存在、長期にわたるレプリキンの保存、および各分離株中のレプリキン濃度について、配列を走査する。レプリキン配列および濃度と、以前（約６ヶ月〜約３年前）に分離株から得られたアミノ酸配列との比較により、到来するインフルエンザシーズンにおいてインフルエンザの原因として最も可能性の高い株、および季節性インフルエンザペプチドワクチンまたは核酸ベースワクチンに対するベースを形成する株の出現の予測に使用するデータを提供する。濃度の増加の観察、特に約６ヶ月〜約３年以上にわたるインフルエンザウイルスの所定株におけるレプリキン濃度の段階的な増加は、将来のインフルエンザエピデミックまたはパンデミックの考えられる原因として、株の出現を予測する。
【０１９９】
新生株において認められたレプリキンに基づくペプチドワクチンまたは核酸ベースワクチンを生成する。長期にわたって血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ配列内のレプリキン配列の濃度が最も高く増加したインフルエンザウイルスの株として新生株を識別する。好ましくは、ペプチドまたは核酸ワクチンは、新生株に保存されることが観察された任意のレプリキン配列に基づくか、またはそれらを含む。保存レプリキンは、好ましくは血球凝集素またはノイラミニダーゼに約２年間および好ましくはそれ以上存在するレプリキン配列である。ワクチンは、新生株において識別されたレプリキン配列の任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２００】
ワクチン産生の場合、効果的なワクチンに有用であると識別されたレプリキンペプチドまたはペプチドは、任意の方法で合成される。化学合成および分子生物学技術、クローンニング、宿主細胞における発現、およびその後の精製を含む。ペプチドは、好ましくは、それに対する治療的抗体反応を誘導するために決定された量で薬学的に許容しうるキャリアと混合されてもよい。一般に、用量は約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【０２０１】
インフルエンザワクチンは、好ましくは「インフルエンザシーズン」の開始に先立って、それを必要とする患者に投与される。インフルエンザのシーズンは、一般に１０月後半に始まり、４月後半まで続く。しかし、ワクチンは、１年の任意の時期に投与してもよい。インフルエンザワクチンは毎年１回投与されることが好ましく、現在までに観察されたレプリキン配列に基づき、および好ましくはインフルエンザウイルスの新生株において保存される。インフルエンザワクチンに含めるべき別の好適なレプリキンは、１年以上欠失した後、インフルエンザの株において再出現したことが示されたレプリキンである。
【０２０２】
実施例４
コロナウイルスヌクレオキャプシドの分離株、またはスパイク、あるいはエンベロープ、乃至はその他のタンパク質の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。
【０２０３】
実施例５
熱帯熱マラリア原虫抗原の分離株の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。
【０２０４】
実施例６
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質において認められた５つの短いＳＡＲＳレプリキンのアミノ酸配列を合成し、ウサギで試験してＳＡＲＳコロナウイルスにおけるレプリキン配列に対する免疫反応を試験した。以下のレプリキン配列を試験した：（１）２００３年ヒトＳＡＲＳヌクレオキャプシド（配列番号：＿）；（２）２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）；（３）２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）、２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）；（４）２００３年ＳＡＲＳエンベロープタンパク質（配列番号：＿）；および（５）２００３年ヒトＳＡＲＳヌクレオキャプシドタンパク質（配列番号：＿）。各合成ペプチドをウサギに皮下注射した。試験したウサギは、１：１００，０００を越える希釈で結合された５つの配列それぞれに対して測定可能な特異的抗体を産生した。２１アミノ酸ＳＡＲＳヌクレオキャプシドレプリキン抗体（配列番号：＿）は、１：２０４，８００を越える希釈で結合することが示された。様々な小型ペプチドを用いて、総タンパク質または天然痘ワクチンに見られるような数千のタンパク質または核酸により生じる望ましくない副作用を伴うことなく、強い免疫反応を得るという試みが他者により行われたが、失敗に終わったため、小型の合成レプリキン抗原が強い免疫反応を獲得する能力は、ＳＡＲＳワクチンの有効性にとって重要であることが示された。
【０２０５】
実施例７
４１アミノ酸レプリキン配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ指定ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２は、本発明者により、表１において「２００４年Ｈ５Ｎ１ベトナム、高い病原性」と標示されるＨ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」レプリキンの２９アミノ酸レプリキン骨格から、Ｈ５Ｎ１骨格のＣ末端上の２つのＵＴＯＰＥ単位（ＫＫＫＫＨＫ）および２つのＵＴＯＰＥ単位のＣ末端上で共有結合される追加のアジュバント（キーホールリンペットヘモシアニン（‐ＫＬＨと標示）を追加して設計された。１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギおよび鶏に皮下注射した。ワクチン接種前および注射後１週間から８週間の抗体反応を測定した。抗体反応は１週間目に認められ、ワクチン接種から３〜４週間後にピークに達した。ピーク抗体反応は、１：１２０，０００の希釈から１：２４０，０００を越える希釈の範囲であった。高結合９６ウェルプレート上で固体相（０．１μｇ／１００μｌ／ウェル）に結合されたペプチド‐ＧＧＧ（ヤギγグロブリン）を用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体タイターを特定した。まず血清を５０倍に希釈した後、さらに２倍連続希釈法で希釈した。ＥＬＩＳＡタイターの結果は、４０５ｎｍの０．２において光学密度から得られる、および連続希釈曲線の非線形回帰分析から生じた推定希釈要素から判断した。西洋ワサビペルオキシダーゼ複合２次抗体およびＡＢＴＳ置換基を使用して検出を行った（ＡＢＴＳは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ．ＧｍｂＨの登録商標である）。表４は、２羽の鶏および２匹のウサギから得られた結果を示す。ウサギＤ４５００に関する試験から得られた個別のウェル結果を表５に示す。例６に報告された結果と併せて、合計６回のウサギまたは鶏における抗体反応に関するレプリキン配列の試験において、６つの配列すべてが測定可能な抗体反応を生じ、抗原を証明した。
【０２０６】
【表４】
【０２０７】
【表５】
【０２０８】
実施例８
インフルエンザの新生毒性株は、以下の方法を使用して予測してもよい。インフルエンザウイルスの毒性株におけるレプリキン骨格の存在について、インフルエンザウイルスの分離株の配列および疫学的データを、疫学的データと合わせて、または本明細書に記載のレプリキン骨格アルゴリズムに基づくコンピュータプログラムを使用して、視覚的走査シーケンスにより分析する。
【０２０９】
単離したインフルエンザウイルスペプチドは、単離したペプチドが１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに、
（１）末端リジン、および任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジン、および末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから約６〜約１０アミノ酸内にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、を含む場合、レプリキン骨格ペプチドであると見なされてもよい。
【０２１０】
レプリキン骨格配列を含む単離した配列を、レプリキン骨格系のその他の部材と共有および置換された配列について調べ、疫学的毒性のレベルにより比較する。疫学的毒性は、発生の程度および／または宿主死亡率％、または当業者に知られる任意の方法で決定されてもよい。
【０２１１】
次に、個別のレプリキン骨格ペプチド内の個別の置換を、個別のレプリキン骨格ペプチドが単離した特定の分離株に関連する高い毒性の発生との関連について調べる。６ヶ月〜３年をかけて増加するレプリキン数に基づいて新生株であること、および代表的なレプリキン骨格ペプチドを含むことが示されたインフルエンザウイルスの現行株を調べ、初期新生株における高い毒性に関連する置換が、インフルエンザの新生株に存在するかどうかを判断する。高い毒性に関連する個別の置換が存在する場合、インフルエンザウイルスの新生株も高い毒性を有すると予測してもよい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、レプリキンとして知られる一群のペプチド、およびそのようなペプチドをコード化する核酸に関する。レプリキンは、アミノ酸配列およびそれらのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列内で定義された構造特性を共有する。レプリキンペプチドは、ウイルスおよび有機体の急速な複製と関連付けられている。レプリキン骨格は、一群のレプリキンペプチドのサブセットである。レプリキン骨格は、エピデミックと関連しているインフルエンザウイルスの株において高度に保存され、急速な複製、毒性および宿主細胞の死亡率と関連付けられている。本発明者は今回、インフルエンザウイルス株に高度に保存されたレプリキンおよびレプリキン骨格におけるアミノ酸の置換パターン、および対応するヌクレオチドを識別した。識別された置換パターンは毒性の変化と関連し、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックの予測として有用である。
【０００２】
本出願は、２００６年５月３０日提出の米国仮出願番号６０／８０８，９４４の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。以下の出願は、参照により本明細書に追加で組み込まれる。２００６年２月１６日提出の米国出願番号１１／３５５，１２０、２００５年２月１６日提出の米国仮出願番号６０／６５３，０８３、２００５年４月２８日提出の米国出願番号１１／１１６，２０３、２００４年４月２８日提出の米国仮出願番号６０／５６５，８４７、２００４年６月４日提出の米国出願番号１０／８６０，０５０、２００３年２月２３日提出の米国仮出願６０／５３１，６８６、２００３年９月２３日提出の６０／５０４，９５８、および２００３年６月６日提出の６０／４７６，１８６、２００２年７月８日提出の米国出願番号１０／１８９，４３７、２００２年３月２６日提出の米国出願番号１０／１０５，２３２、２００１年７月９日提出の米国仮出願６０／３０３，３９６および２００１年３月２７日提出の６０／２７８，７６１の優先権を主張する２００１年１０月２６日提出の米国出願番号０９／９８４，０５７。
【背景技術】
【０００３】
急速な複製は、特定の細菌、ウイルスおよび悪性腫瘍における毒性の特徴である。２００１年１０月２６日提出の米国特許出願番号０９／９８４，０５７は、レプリキンが一群の保存アミノ酸および核酸配列として、規定の配列構造を共有し、急速に複製する悪性腫瘍、細菌、ウイルス、その他有機体および複製関連タンパク質において広く検出され、急速な複製および毒性に関連する、と初めて説明した。レプリキンはアミノ酸配列またはアミノ酸配列をコード化する核酸配列であり、当該アミノ酸配列は、モチーフの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、およびモチーフの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基、第２リジン残基から６〜１０残基に位置する少なくとも１つのリジン残基、少なくとも１つのヒスチジン残基および少なくとも６％のリジン残基を含むモチーフを含む７〜約５０のアミノ酸を含む。
【０００４】
プロテオミクスの観点から、レプリキンモチーフは、脳グリア芽腫悪性腫瘍に存在するグリオーマペプチド配列に基づくアルゴリズムに由来する。健康なヒトゲノムと比較して、グリオーマに特有のペプチドにおいて認められるレプリキンアルゴリズムは、この場合の複製において、保存構造および特定の機能に関連する幅広いタンパク質群の発見をもたらした。次にインフルエンザ、ＨＩＶ、癌およびトマト縮葉ウイルスを含む異種疾患における、毒性の増加と、タンパク質内に存在するか、またはゲノムにコード化されるレプリキンペプチドの濃度の増加との関連が確立された。続いて、レプリキンの存在は、イースト、藻類、植物、マラリア、インフルエンザ、ジェミニ縮葉トマトウイルス、ＨＩＶおよび癌等の様々な有機体における急速な複製現象と関連付けられた。
【０００５】
急速に複製する有機体におけるレプリキンの存在の検出に加えて、１）レプリキン濃度（タンパク質１００アミノ酸あたりのレプリキン数またはゲノム内にコード化されるレプリキン数および、２）急速な複製に依存する特定の機能状態にあるレプリキン組成物が発見され、レプリキンは、それらが存在する有機体の複製率と量的および質的に関連するという発見の基礎を提供する。これらの機能を証明する例は、グリア芽腫細胞における急速な複製と毒性との間に見られる関係、インフルエンザウイルスにおけるレプリキンとインフルエンザパンデミックおよびエピデミックの予測との間に見られる関係、およびＨＩＶにおけるレプリキン濃度と急速な複製との関係を含む。
【０００６】
レプリキン配列、および特にレプリキン配列のモチーフを定義する要素は、急速に複製するウイルスおよび有機体、ならびに複製に関連するタンパク質において長期間保存されることが分かった。レプリキン配列は保存されるため、感染物質を検出するための一貫した標的を提供する。このレプリキンの保存は、レプリキン構造自体が、それが存在し保存されるウイルスおよび有機体の複製および生存において役割を有することも証明する。そのようにして、感染物質内で識別されたレプリキンは、感染物質に対する治療およびワクチンを開発するための良い標的である。
【０００７】
レプリキン骨格は、レプリキンのサブセットである。レプリキン骨格ペプチドは、感染物質において高度に保存されることが示されており、また急速な複製、毒性および宿主細胞の死亡率と関連付けられている。レプリキン骨格ペプチドは、約１６〜約３０のアミノ酸を含むレプリキンペプチド配列であり、さらに（１）任意に末端リジンに直接隣接する追加のリジンを含む末端リジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジンから６〜１０アミノ酸残基にあるリジンと、（４）少なくとも６％のリジンと、を含む。レプリキン骨格ペプチドは、時間、地理的空間、または疫学的発生を問わず、ウイルスまたは有機体の個別の分離株内で識別される、または遺伝子情報を共有する異なるウイルスまたは有機体において、例えば遺伝子再集合により識別される一連の保存されたレプリキンペプチドの一員である。
【０００８】
上述のように、最初に発見されたレプリキンは、グリオーマレプリキンであり、マリグニンと称される多形性脳グリア芽腫細胞（グリオーマ）細胞タンパク質において識別された。米国特許番号７，１８９，８００を参照のこと。グリオーマレプリキンが正常で健康なヒトゲノムに存在することは知られていなかった。グリオーマレプリキンの相同体を捜索するために考案されたアルゴリズムは、相同体が４，０００以上のタンパク質配列に共通でないことを明らかにした。しかし驚くことに、相同体はすべての腫瘍ウイルスおよび藻類、植物、真菌、ウイルスおよび細菌の複製タンパク質において認められた。２００２年７月８日提出の米国特許出願番号１０／１８９，４３７を参照のこと。そのようにして、広範なウイルスおよび有機体にわたるレプリキンの存在は、複製機能および急速な複製と関連付けられた。
【０００９】
急速に複製するウイルスおよび有機体ならびに複製関連タンパク質を広く検討した結果、ゲノム、タンパク質またはタンパク質フラグメントにおける１００アミノ酸あたりのレプリキン数は、急速な複製の機能的現象と関連しうることが発見された。米国特許出願番号１０／１８９，４３７を参照のこと。
【００１０】
レプリキン濃度と急速な複製との関連は、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質のアミノ酸配列と、過去１００年間のインフルエンザ流行に関する疫学的データとの比較においてさらに証明された。この比較により、１９０２年〜２００１年の４つの主要なインフルエンザ株のうちの各１つずつ生じたインフルエンザエピデミックにおける株特異性インフルエンザレプリキンの濃度が４〜１０倍増加したことが明らかになった。４つの主要なインフルエンザ株は、インフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２、および（Ａ）Ｈ３Ｎ２である。次に、濃度の増加は、少なくとも１つの特異的レプリキン組成物が消失してから１年〜最長６４年後に再出現すること、および新規の株特異性レプリキン組成物の出現によることが証明された。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１１】
レプリキンアミノ酸構造は、非レプリキンアミノ酸と同程度に変異または変化するわけではないことが認められた。レプリキン構造は、ウイルスおよび有機体において、またウイルスと有機体との間に時間を越えて保存される。この保存は、レプリキン構造が生存において重要性を有することを証明する。そのようにして、保存レプリキン構造は、生存に関連する新規の不変標的を提供し、それらは感染または悪性腫瘍の識別および治療に有用である。
【００１２】
レプリキンは、細菌、ウイルス、植物、および悪性腫瘍を含む一連のウイルスおよび有機体に保存されることが示された。特定の構造は生存機能と極めて密接に関連するため、細菌、ウイルス、植物およびその他の有機体にわたって保存されるレプリキン構造を絶えず変化させることは明らかに不可能であり、これはレプリキンが生存機能と密接に関与することを示唆する。
【００１３】
レプリキンが保存されるかどうか、または代わりに、広範な自然変異の影響を受けやすいかどうかの検討は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の様々な分離株のタンパク質配列を走査することにより行った。これらウイルスのタンパク質における変異は、何十年もの間、世界的に十分立証されている。全体レプリキンおよび特定のレプリキンにおいて認められた各構成要素レプリキンアミノ酸残基の両方が存在するかについて、ＦＭＤＶ分離株のタンパク質配列を視診した。隣接アミノ酸で生じるように、長期にわたって広範な置換の影響を受けるのではなく、レプリキン構造を含むアミノ酸は、ほとんど置換されないか、またはまったく置換されないことが認められた。つまり、非レプリキン配列と比較して、レプリキン構造は保存された。同様の配列保存は、麦ユビキチン活性酵素Ｅ等の植物、およびＨＩＶの分離株における転写活性剤（Ｔａｔ）タンパク質で認められた。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１４】
任意の構造の保存は、その構造が攻撃および破壊または刺激のために安定した不変標的を提供するかどうかについて極めて重要である。構造が何らかの方法で有機体の基本的な生存機序に関係している場合、その構造は保存される傾向がある。可変構造は不定標的を提供する。これは、以前の構造に対して特異的に生成された抗体等のアタッカーを回避するための良い手段であり、そのため修飾形態に対しては有効でない。インフルエンザウイルスはこの手段を使用するため、例えば、以前のワクチンが現行の毒性ウイルスに対してあまり効果的でなくなる可能性がある。
【００１５】
レプリキン構造の必須成分はヒスチジン（ｈ）であり、これは酸化還元酵素における金属基と頻繁に結合すること、および複製に必要なエネルギー源を提供するというその有望な機能が知られている。長期にわたるレプリキン配列の再検討により、レプリキンにおけるヒスチジン構造は常に一定であることが示唆される。そのようにして、レプリキン構造は、ウイルスまたは有機体の複製の破壊についての一層魅力的な標的を保持する。
【００１６】
レプリキン含有タンパク質も酸化還元機能、およびタンパク質の合成または延長、ならびに細胞の複製と関連付けられることが多い。金属ベースの酸化還元機能との関連、嫌気性複製中のレプリキン含有グリオーママリグニン濃度の増加、および低濃度（ピコグラム／細胞）の抗マリグニン抗体の細胞毒性は、すべてレプリキンが主要な呼吸性生存機能に関連することを示唆し、非レプリキンアミノ酸の変異特性の影響を受けにくい場合が多いことが発見された。米国特許出願番号１０／８６０，０５０を参照のこと。
【００１７】
急速に複製するウイルスおよび有機体において、複製の速度とウイルスまたは有機体に存在するレプリキン配列の濃度との関連が確立された。１００アミノ酸中のレプリキン配列の濃度は、ウイルスまたは有機体のレプリキン数と称される。インフルエンザウイルスにおいて、レプリキン数の増加は、過去１００年間のインフルエンザ流行と関連付けられている。
【００１８】
例えば、血球凝集素タンパク質における株特異性レプリキン濃度と、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックとの量的関連が確立された（図６）。過去１００年の３つのインフルエンザパンデミック、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２のそれぞれにおいて、パンデミックをレプリキン数の増加によりレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測し、関連付けた。図６〜８および１０〜１１。４度のＨ５Ｎ１エピデミック、すなわち１９９７年、２００１年、および２００３〜２００４年（図１１）および２００６年のエピデミックのそれぞれにおいて、レプリキン数の増加は予測的であった。インフルエンザエピデミックと株特異性ウイルスタンパク質化学との関連については、これまで報告がなかった。
【００１９】
株特異性エピデミックが発生する１〜３年前にインフルエンザ群において特異性レプリキン数が増加するという発見に類似して、コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質におけるレプリキン数の増加も２００３年のＳＡＲＳパンデミックをレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測することが分かった。コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、以下のように増加した。１９９９年３．１（±１．８）、２０００年３．９（±１．２）、２００１年３．９（±１．３）、および２００２年５．１（±３．６）。このパンデミック前の増加は、レプリキンを豊富に含むコロナウイルスが２００３年のＳＡＲＳパンデミックに関与したという発見を支持する（図８を参照）。
【００２０】
ＨＩＶウイルスにおけるレプリキン数も急速な複製および毒性と関連付けられている。ＨＩＶ分離株において、ＨＩＶの増殖遅延型低タイター株（ＮＳＩ、「Ｂｒｕ」はＨＩＶ感染の初期によく見られる）は、１００アミノ酸につき１．１（＋／−１．６）のレプリキン濃度を有することが分かった。一方、ＨＩＶの急速に増殖する高タイター株（Ｓ１、「Ｌａｉ」はＨＩＶ感染の後期によく見られる）は、１００アミノ酸残基につき６．８（＋／−２．７）のレプリキン濃度を有する。さらに、中国および世界のその他多くの地域でトマトの収穫に打撃を与えたトマト縮葉ジェミニウイルスは、重複レプリキンのため高いレプリキン数を有することが示された。トマト葉巻ジェミニウイルスにおけるレプリキン数は、１００アミノ酸につき最高２０．７レプリキンまで達することが認められた。
【００２１】
レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの株において最初に識別された一群のレプリキンのサブセットである。レプリキン骨格は、インフルエンザの毒性株において高度に保存される。レプリキンおよびレプリキン骨格は、急速な複製および毒性と関連付けられているため、現在はインフルエンザウイルスの新生株におけるレプリキンの存在および濃度を使用して、到来するインフルエンザエピデミックを予測する。当該技術分野において、高い毒性および宿主細胞の死亡率をもたらすレプリキンまたはレプリキン骨格内のわずかな変化を識別する方法が必要とされる。また当該技術分野において、インフルエンザの毒性の高い株の治療を目的とする保存レプリキンおよびレプリキン骨格配列も必要とされる。さらに当該技術分野において、インフルエンザの新生株におけるワクチンの調整およびその他の治療に有用なレプリキンおよびレプリキン骨格アミノ酸配列の必要性がある。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに
（１）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、を含むインフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離したレプリキンペプチドを提供し、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン配列は、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列と比較して置換を含み、本置換はヒスチジンの置換ではなく、またインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
本置換は、インフルエンザウイルスの第３株に追加で存在し、インフルエンザウイルスの第３株における本置換の存在は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連し、インフルエンザウイルスの第３株は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に本末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび本末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含むレプリキン配列を含む。
【００２３】
好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン配列における異なるアミノ酸残基で置換されるインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する。
【００２４】
別の好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン配列における、ロイシン以外のアミノ酸残基で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は任意の疎水性アミノ酸、すなわちメチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンまたはバリンで置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸はメチオニンまたはイソロイシンで置換される。別の好適な実施形態において、単離したレプリキン配列は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスから単離される。
【００２５】
別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキン骨格ペプチドを含むワクチンを提供する。さらに別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキン骨格ペプチドに対する抗体を提供する。
【００２６】
本発明は、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキンペプチドをさらに提供する。インフルエンザウイルスの第１株は、インフルエンザウイルスの新生株であり、単離したレプリキンペプチドは、７〜約５０のアミノ酸を含み、
（１）単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基にある第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、を含むモチーフを識別するステップであって、インフルエンザウイルスの第２株における他は同一の配列と比較して、識別されたモチーフの末端残基間のレプリキンペプチド配列に位置するアミノ酸において置換が発生し、インフルエンザウイルスの第１株の識別されたモチーフの末端残基間における前記置換は、第２株と比較して、急速な複製および高い毒性に関連するステップと、識別されたモチーフを選択するステップと、識別されたモチーフを含むレプリキンペプチドを単離するステップと、により単離される。本発明は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離されたインフルエンザレプリキンペプチドをさらに提供する。
【００２７】
別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドを含むワクチンを提供する。さらに別の側面において、本発明は、本発明の単離したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドに対する抗体を提供する。
【００２８】
本発明は、本発明の単離したレプリキンペプチドも提供する。レプリキンペプチドは、約２９のアミノ酸を含む。単離したレプリキンペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含んでもよく、［Ｓ］はロイシン以外の任意のアミノ酸であってもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は、ロイシン以外のアミノ酸であってもよい。別の好適な実施形態において、［Ｓ］は任意の疎水性アミノ酸であってもよく、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンまたはバリンを含む。別の好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。別の好適な実施形態において、単離したインフルエンザレプリキンペプチドは、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離される。
【００２９】
本発明は、上述の単離した配列のうちの任意の１つ以上、またはその抗原部分列、あるいは上述の単離した配列のいずれかに結合する抗体、乃至はその抗原部分列を含むワクチンも提供する。
【００３０】
本発明は、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を提供する。本方法は、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチド、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチド、およびインフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドを含むステップと、
（２）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換される第３レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸を識別するステップと、
（３）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株が高い複製、毒性、または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（４）第２レプリキン骨格と比較して、第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基も、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格ペプチドにおいて置換されることを判断するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数と、インフルエンザウイルスの第１株の初期分離株のレプリキン数とを比較するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いことを判断するステップと、
（７）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップと、を含む。
【００３１】
好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、第２レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基にある。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基である。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、ロイシン以外の疎水性アミノ酸である。別の好適な実施形態において、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、メチオニンまたはイソロイシンである。別の好適な実施形態において，第１、第２および第３レプリキン骨格は、２９のアミノ酸を含む。さらに別の実施形態において、毒性の増加はパンデミックの兆候である。
【００３２】
本発明は、インフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法も提供する。本方法は、インフルエンザウイルスの第１新生株からレプリキンペプチドを識別するステップであって、インフルエンザレプリキンペプチドは、７〜約５０アミノの酸で構成され、
（１）単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのリジン残基または少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基に位置する第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、を含むモチーフを含み、
インフルエンザウイルスの第２株における同一配列と比較して、モチーフの末端残基間のアミノ酸において置換が発生したステップと、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株における同一配列の置換と、インフルエンザウイルスの第３株における急速な複製および高い毒性とを関連付けるステップと、インフルエンザウイルスの第１株の毒性の増加を予測するステップと、を含む。
【００３３】
さらなる実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法は、コンピュータを使用して実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、様々な有機体におけるレプリキンの発生頻度を表す棒グラフを示す図である。
【００３５】
【図２】図２は、コンピュータを使用し、インフルエンザウイルスの少なくとも３つの株のレプリキン骨格を比較することにより、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を実施するという本発明の一側面を表すボックス図である。
【００３６】
【図３】図３は、レコグニン１６‐ｍｅｒへの曝露に応答して産生される抗マリグニン抗体の量を示す棒グラフを示す図である。
【００３７】
【図４Ａ−Ｅ】図４Ａは、通常の蛍光灯で撮影された血液塗抹標本の写真を示す図である。図４Ｂは、通常の蛍光灯で撮影された血液塗抹標本の写真を示す図であり、２つの白血病細胞の存在を示す。図４Ｃは、抗マリグニン抗体の存在下のグリオーマ細胞の緻密層の写真を示す図である。図４Ｄおよび図４Ｅは、抗マリグニン抗体の添加から３０分および４５分後に撮影された図４Ｃの細胞層の写真を示す図である。
【００３８】
【図４Ｆ】図４Ｆは、抗マリグニン抗体による生体外の小細胞肺癌細胞の成長抑制を示す棒グラフを示す図である。
【００３９】
【図５】図５は、良性または悪性乳房疾患患者の術前および術後の血清に存在する抗マリグニン抗体の量のプロットを示す図である。
【００４０】
【図６】図６は、インフルエンザＢおよびインフルエンザＡ株、Ｈ１Ｎ１の血球凝集素において認められたレプリキンの濃度を１９１８年から２００１年まで年毎に示すグラフを示す図である。
【００４１】
【図７】図７は、インフルエンザＡ株、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２、並びにその構成レプリキンにより定義される新生株、Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の血球凝集素において観察されたレプリキン濃度を１９５０年から２００１年まで年毎に示すグラフを示す図である。
【００４２】
【図８】図８は、１９１７年〜２００２年のコロナウイルスヌクレオキャプシドレプリキンを含む幾つかのウイルス株の１年あたりのレプリキン数を表すグラフを示す図である。
【００４３】
【図９Ａ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【図９Ｂ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【図９Ｃ】図９は、コロナウイルス分離株のヌクレオキャプシドについての１年あたりの平均レプリキン数を表すチャートを示す図である。
【００４４】
【図１０】図１０は、Ｈ５Ｎ１血球凝集素の１年あたりのレプリキン数を表すチャートを示す図である。
【００４５】
【図１１】図１１は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行するインフルエンザのＨ５Ｎ１株の血球凝集素タンパク質におけるレプリキンパターンの濃度の急激な増加について説明するグラフを示す図である。図１１は、Ｈ５Ｎ１の血球凝集素タンパク質の増加するレプリキン濃度（「レプリキン数」）は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行したことを示す図である。Ｈ５Ｎ１インフルエンザにおいて、１９９５年〜１９９７年の株特異性レプリキン濃度（レプリキン数、平均値＋／−標準偏差）の増加は、１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１エピデミックに先行し（Ｅ１）、１９９９年〜２００１年の増加は、２００１年のエピデミックに先行し（Ｅ２）、および２００２年〜２００４年の増加は、２００４年のエピデミックに先行した（Ｅ３）。１９９９年の減少は、香港におけるＥ１エピデミックを受けて鶏を大量に処分したことに伴って生じた。
【００４６】
【図１２Ａ】図１２は、異なるタンパク質において実質的に固定したアミノ酸位置で発生するレプリキン骨格を説明する表を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２は、異なるタンパク質において実質的に固定したアミノ酸位置で発生するレプリキン骨格を説明する表を示す図である。
【００４７】
【図１３】図１３は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９４０年〜２００１年）におけるインフルエンザＢウイルスの血球凝集素に存在するレプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００４８】
【図１４Ａ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９１８年〜２０００年）におけるインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１血球凝集素に存在するＨ１Ｎ１レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００４９】
【図１５】図１５は、１９５７年〜２０００年におけるインフルエンザＨ２Ｎ２ウイルスの血球凝集素に存在するレプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００５０】
【図１６】図１６は、そのアミノ酸配列が入手可能な各年（１９６８年〜２０００年）のインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２血球凝集素に存在するＨ３Ｎ２レプリキン配列を提供する表を示す図である。
【００５１】
【図１７Ａ】図１７は、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスおよびその他の急速に複製するウイルスならびに悪性腫瘍におけるレプリキン構造と、宿主細胞の死亡率の増加との関係を示す表を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７は、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスおよびその他の急速に複製するウイルスならびに悪性腫瘍におけるレプリキン構造と、宿主細胞の死亡率の増加との関係を示す表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本明細書で使用されるように、レプリキンペプチドまたはレプリキンタンパク質は、７〜約５０のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、（１）第２リジン残基から６〜１０アミノ酸残基に位置する少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％のリジン残基とを含む。同様に、レプリキン配列は、レプリキンペプチドをコード化する核酸配列である。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「レプリキン骨格」は、一連の保存レプリキンペプチドを意味し、各レプリキンペプチド配列は、約１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジン残基から６〜１０アミノ酸残基にあるリジン残基と、（４）少なくとも約６％のリジンとを含む。また「レプリキン骨格」は、一連の「レプリキン骨格」の個別部材または複数部材を意味する。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「初期発生」ウイルスまたは有機体は、ウイルスまたは有機体の別の標本が採取された日に先立って、自然源のウイルスまたは有機体から採取されたウイルスまたは有機体の標本である。「後期発生」ウイルスまたは有機体は、ウイルスまたは有機体の別の標本が採取された日の後に自然源のウイルスまたは有機体から採取されたウイルスまたは有機体の標本である。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「新生株」は、そのようなウイルスの株の早期発生分離株、またはそのようなウイルスのその他の株におけるレプリキン濃度と比較して、１つ以上のそのタンパク質配列において、高濃度または増加濃度のレプリキン配列を有するものとして識別されたウイルスの株を意味する。高濃度または増加濃度のレプリキンは、例えばインフルエンザウイルスにおいて、少なくとも約６ヶ月以上、また好ましくは少なくとも約１年以上、最も好ましくは少なくとも約３年以上の期間にわたって発生するが、はるかに短い期間であってもよい。
【００５６】
本明細書に記載のレプリキンの「官能基誘導体」は、レプリキンのフラグメント、変型、類似物、または化学的誘導体であり、レプリキンに特異的な抗体との免疫学的交差反応性を少なくとも一部保持する。レプリキンペプチドのフラグメントは、任意の分子のサブセットを意味する。変型ペプチドは、直接化学合成、例えば、当該技術分野においてよく知られる方法を使用することにより形成されてもよい。非天然タンパク質に対するレプリキンの類似物は、実質的に総タンパク質またはそのフラグメントのいずれかに類似する。レプリキンの化学的誘導体は、追加の化学部分を含む。
【００５７】
本明細書において使用されるように、所定のレプリキン内の総アミノ酸のパーセントとしての「相同性」は、レプリキン構造、例えばリジンおよびヒスチジンを「定義する」アミノ酸により維持される位置において定義するアミノ酸に重要であり、レプリキン構造内のその他のアミノ酸に対しては、以前の出願においてＨＩＶ ＴＡＴタンパク質に関して示されるように、あまり重要でないか、またはまったく重要でない。保存は、これらの比較的不変の「定義」アミノ酸に関して定義される。「定義」アミノ酸以外における特定の変型または置換は、本出願の対象である。これらはランダムではなく、例えば、ここに示されるようにパンデミックと関連があると思われる。またこれまで考えられていたよりも重要である。所定の機能を用いて反復することにより、それらは基本的なレプリキン骨格のサブセットを表す。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「変異」はアミノ酸の置換により生じる有機体の構造および特性の変化を意味する。反対に「保存」、「保存された」または関連する用語は、本明細書で使用されるように、置換の欠失による特定アミノ酸の保存を意味する。
【００５９】
本明細書で使用されるように、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、２つ以上のアミノ酸から成る化合物を意味する。ここで、１つのアミノ酸のカルボキシル基は別のアミノ酸のアミノ基と結合し、ペプチド結合を形成する。ペプチドという用語は、そのような化合物をコード化するアミノ酸配列の意味でも使用される。
【００６０】
本明細書で使用されるように、「単離した」または「合成した」ペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、精製後、実質的に細胞物質、またはペプチドが由来する細胞、あるいは組織源からのその他の夾雑タンパク質またはペプチドを含まないペプチド、あるいは任意の方法で化学的に合成された場合は、実質的に化学的前駆体、またはその他の化学物質を含まないペプチド、乃至は組み換え遺伝子技術により合成された場合に実質的に夾雑ペプチドを含まないペプチドを意味する。単離は、生体内、生体外、および現在ではプロテオミクスソフトウェア法を使用してコンピュータで（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）行ってもよい。
【００６１】
本明細書で使用されるように、「レプリキン数」または「レプリキン濃度」は、タンパク質または有機体における１００アミノ酸あたりのレプリキン数を意味する。レプリキン数の低いウイルスまたは有機体の第２株、早期発生株または後期発生株と比較して、ウイルスまたは有機体の第１株におけるレプリキンが高い程、第１ウイルスまたは有機体のさらに急速な複製と関連することが分かった。
【００６２】
Ｉ．インフルエンザエピデミックおよびパンデミックに関連する高いレプリキン数
過去１００年間のインフルエンザウイルスタンパク質配列およびインフルエンザ疫学に関するわれわれの研究は、インフルエンザにおける複製および毒性の増加を予測する方法を提供する。インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列から得た歴史的および現在のデータの再検討から、１９０２年〜２００１年のインフルエンザエピデミックに関連する株において、４つの主要なインフルエンザ株、すなわちインフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２，および（Ａ）Ｈ３Ｎ２のうちの１つにおける株特異性インフルエンザレプリキン濃度が４倍〜１０倍増加することが明らかになる。さらに、エピデミックに関連する血球凝集素タンパク質におけるレプリキン濃度の増加は、少なくとも１つの特異的レプリキン組成物が消失してから１年〜最長６４年後に再出現すること、および新規の株特異性レプリキン組成物の出現に起因することがわかる。
【００６３】
インフルエンザゲノムにおいてレプリキンが発見される前は、インフルエンザにおける血清学的血球凝集素および抗体分類のみが説明されていた。株特異性保存ペプチド配列については記載されていなかった。さらに、任意の株特異性ペプチド配列の濃度および組成物における変化が疫学的に立証されたエピデミックまたは急速な複製と関連するという記載はなかった。そのようにして、株特異性化学構造については、それを用いて、到来するインフルエンザシーズンに優勢となる株を予測することも、ワクチンの全体ウイルス株混合物を毎年考案することも知られていなかった。
【００６４】
高度のレプリキン構造の保存が認められたことにより、同一の構造は１００年間持続するか、または１年〜６４年欠失した後に再出現しうるが、これまでインフルエンザタンパク質におけるアミノ酸のランダム置換に起因すると考えられた変化は、組織化されたレプリキンの保存過程による変化である可能性が高いことが示された。
【００６５】
歴史的データの検討に照らして、インフルエンザにおけるレプリキン濃度の増加を監視することが、将来のエピデミックを予測するツールとして提供された。このツールは、多数の最近のインフルエンザ流行を有効に予測した。例えば、Ｈ３Ｎ２の歴史上最大となる、Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度における近年の急激な増加（１９９７年〜２０００年）および１９６８年の高死亡率Ｈ３Ｎ２パンデミック、および１９７５年と１９７７年の２度の高死亡率エピデミックにおいて最後に見られたが、２０年〜２５年間欠失した特異的レプリキン組成物の再出現を予測し、併せて２００２年のＨ３Ｎ２エピデミックを予測した。
【００６６】
インフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ３におけるパンデミック
特に注目すべきことに、試験したインフルエンザウイルスのほぼすべての個別株の血球凝集素タンパク質において、１００アミノあたり少なくとも１つのレプリキンが存在することを認めた。アミノ酸配列データが入手可能な各年（１９０２年〜２００１年）のインフルエンザウイルスの４つの一般的な株であるインフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１，Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２それぞれの分離株の血球凝集素タンパク質において発生することが認められたレプリキン配列を図１３、１４、１５、および１６に示す。
【００６７】
各インフルエンザＡ株は、それぞれ１９１８年、１９５７年、および１９６８年におけるパンデミックに関与している。図６および７のデータは、試験した４つの一般的なインフルエンザウイルスのすべての分離株の各インフルエンザ血球凝集素タンパク質において、１００アミノ酸あたり少なくとも１つのレプリキンが存在することを示し、複製の生存レベルの維持におけるレプリキンの機能を示唆する。１９９０年代において、Ｈ３Ｎ２株が減少する間、Ｈ３Ｎ２分離株の多くにはレプリキンが存在しなかったが、高濃度の新規レプリキンがＨ３Ｎ２分離株に出現した。これはＨ３Ｎ２（Ｒ）株の出現を定義する。図１６を参照のこと。
【００６８】
図６および図７に示されるレプリキン濃度の幾つかの特性は、４つのインフルエンザウイルス株すべてに共通すると思われる。第１に、濃度は長年にわたり循環し、上昇および下降の１サイクルは２〜３０年の期間で生じる。この上昇および下降は、血球凝集素およびノイラミニダーゼ分類による個別のインフルエンザウイルス株の優性に関して知られている増大および減少と一致する。
【００６９】
第２に、パンデミックに関与することが既に示されている各インフルエンザウイルス株のピークレプリキン濃度は、３つの年のパンデミックにそれぞれ特異的および個別に関連する。例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１の関与が示された１９１８年のパンデミックの場合に、Ｈ１Ｎ１におけるレプリキン濃度のピークが独立に生じた（Ｐ１）。Ｈ２Ｎ２の発現、関与が認められた１９５７年のパンデミックの場合に、Ｈ２Ｎ２におけるレプリキンのピーク濃度が生じた（Ｐ２）。またＨ３Ｎ２が発現し、パンデミックの原因であることが示された１９６８年のパンデミックの場合に、Ｈ３Ｎ２におけるレプリキンのピーク濃度が生じた（Ｐ３）。
【００７０】
第３に、上記３度のパンデミックそれぞれの直後の年に、特異的レプリキン濃度が顕著に減少した。これは、恐らくそれぞれのパンデミックで生成された免疫が広く分布したことを反映していると考えられる。したがって、このパンデミック後の減少は、それが関与したパンデミック（Ｐ１）直後のＨ１Ｎ１に特異的であり、その時点におけるすべての株の一般的な特性ではない。インフルエンザＢにおけるレプリキン濃度の増加は、Ｈ１Ｎ１におけるレプリキン濃度の減少と同時に発生した。例えば、１９５１年におけるＥＢ１および１９７６年におけるＥＢ２はどちらも死亡率が最も高いインフルエンザＢエピデミックに関連した（Ｓｔｕａｒｔ‐Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．（１９８５）。
【００７１】
第４に、濃度の一次ピーク増を越える二次ピーク濃度は、３度のパンデミックそれぞれから１５年後に発生した。この二次ピークは、Ｈ１Ｎ１「エピデミック」年における１９１８年のパンデミックから１５年後（Ｅ１）、Ｈ２Ｎ２「エピデミック」年における１９５７年のパンデミックから８年後（Ｅ２）、およびＨ３Ｎ２「エピデミック」年における１９６８年のパンデミックから７年後（Ｅ３）のエピデミックに伴う。これらの特定レプリキンの二次ピーク濃度は、株からの回復を反映する場合がある。
【００７２】
第５に、各株の特異的レプリキン濃度のピークは、１つまたはその他の両株のレプリキン濃度における減少に関連すると考えられる場合が多く、宿主細胞部位の株間の競合を示唆する。第６に、各株のレプリキン濃度は３５年（Ｈ２Ｎ２）から６０年（インフルエンザＢ）の期間をかけて減少するという明らかな全体的傾向がある。この減少は、インフルエンザワクチンが一般に使用される前の１９４０年〜１９６４年のインフルエンザＢの場合に明らかであったため、ワクチンの影響によるものではない。インフルエンザＢの場合において、レプリキンの減少後の回復が１９６５年以降に発生したことが分かるが、レプリキン濃度は１９９７年および２０００年に再度減少した（図６）。これは、最近の分離株におけるインフルエンザＢの発生が低いことと関連する。１９７８年〜１９７９年にピークを迎えたＨ１Ｎ１レプリキン濃度（図６）は、Ｈ１Ｎ１株の再出現および普及とともに、１９９６年に再度ピークに達し、Ｈ１Ｎ１エピデミックと一致した（図６）。１９９７年〜２０００年の間にＨ１Ｎ１レプリキン濃度も減少し、これらの年に得られた分離株におけるＨ１Ｎ１株の存在が減少した。Ｈ２Ｎ２レプリキンの場合、３５年の減少から回復しなかった（図７）。またこれは最近の分離株からＨ２Ｎ２が欠失していることに関連する。Ｈ３Ｎ２の場合、多くの分離株のレプリキン濃度は、１９９６年〜２０００年までの期間にゼロまで落ちたが、その他のＨ３Ｎ２分離株は、レプリキン濃度の著しく急激な増加を示した。これは、Ｈ３Ｎ２の亜株の出現を示す。本明細書ではＨ３Ｎ２（Ｒ）と指定する。
【００７３】
上述のように、図６および７は、レプリキン濃度がピークに達する前に１年〜３年の段階的な増加が認められることが多いことを示す。この段階的な増加は、レプリキンのピークと同時に起こるエピデミックの発生に先行する。したがって、特定の株の濃度における段階的な増加は、特定の株がエピデミックまたはパンデミックをもたらす最も有力な原因であることを示す。
【００７４】
インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２（Ｒ）におけるレプリキン濃度は、１９９７年〜２０００年に増加したことが認められた（図７）。結果として２００２年に生じたエピデミックは、エピデミックに先行するレプリキン濃度の増加の予測値を示した。Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度における３つの類似する以前のピークは、株が最初に発現した１９６８年のＨ３Ｎ２に基づくパンデミック（図７）、および１９７２年と１９７５年のＨ３Ｎ２に基づくエピデミックにおいて発生したことが見られた（図７）。これらのパンデミックおよびエピデミックは、それぞれ過度の死亡率と関連した（Ａｉｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１１３（１）：３０‐４３（１９８１）。
【００７５】
したがって、１９９７年〜２０００年におけるＨ３Ｎ２レプリキンのＨ３Ｎ２（Ｒ）亜種の濃度における急速な上昇は、統計的に、到来しつつある深刻なエピデミックまたはパンデミックの初期警告を表した。Ｈ３Ｎ２エピデミックが２０００年にロシアで発生したという記載（図７、Ｅ４）、および２００１年にＨ３Ｎ２が世界で最も頻繁に単離されたインフルエンザウイルス株であるという２００１年１２月のＣＤＣレポートにより、この予測が正しいことが示された（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ（ＭＭＷＲ），Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ；５０（４８）：１０８４‐６８（Ｄｅｃ．７，２００１）。
【００７６】
インフルエンザウイルスＢの株におけるレプリキンの組成物
インフルエンザウイルスＢ株において識別された合計２６のレプリキンのうち（図１３）、以下１０のレプリキンが、１９４０年〜２００１年に試験された各インフルエンザＢ分離株に存在する。重複するレプリキン配列は個別にリストされる。
ＫＳＨＦＡＮＬＫ（配列番号：＿）
ＫＳＨＦＡＮＬＫＧＴＫ（配列番号：＿）
ＫＳＨＦＡＮＬＫＧＴＫＴＲＧＫＬＣＰＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫＳＫ（配列番号：＿）
ＨＥＫＹＧＧＬＮＫＳＫＰＹＹＴＧＥＨＡＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＶＫＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫＹＲＰＰＡＫ（配列番号：＿）
ＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫＹＲＰＰＡＫＬＬＫ（配列番号：＿）
【００７７】
図１３および１４は、Ｈ１Ｎ１レプリキンと比較して、インフルエンザＢ血球凝集素におけるレプリキン構造がはるかに優れた安定性を持つようであることを示す。インフルエンザＢは、任意のパンデミックに関与しておらず、動物または鳥類の保有宿主を有しないようである（Ｓｔｕａｒｔ‐Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８５））。
【００７８】
インフルエンザの株における遺伝子浮動
インフルエンザパンデミックまたはエピデミックそれぞれの場合において、新規レプリキンが出現する。所定の分離株における所定の血球凝集素において、２つの同一レプリキンは認められていない。新規レプリキンの出現が、別の動物または鳥類層からの転移に対してどの程度の変異を表すかは不明である。一部の場合において、毎年１つ以上の元のレプリキン構造が保存されるが、同時に新規のレプリキンが出現する。例えば、インフルエンザウイルスＢ血球凝集素において、１９１９年〜２００１年の間、常に５つのレプリキンが保存されたが、同一期間に２６のレプリキンが出現および消失した（一部は数年間の欠失後に再発した）。特定のレプリキン構造が消失し、何年か後に再出現することは、レプリキンが新たな変異を通じてではなく、別のウイルス宿主細胞層から回帰することを示唆する。
【００７９】
異なるインフルエンザ株の活性における変化は、順に、以下の２つのあまり知られていない過程のうちの１つにより達成される置換の生成物であるインフルエンザ血球凝集素における配列変化に関連すると考えられている。ｉ）血球凝集素分子における一連の点変異の累積に起因すると考えられる抗原浮動またはｉｉ）変化が著しいため遺伝子再集合は、ヒトおよび非ヒト宿主細胞のウイルス間で発生すると仮定される抗原浮動。第１に、本データは、異なるインフルエンザ株の活性における変化が、非特異的配列変化に関連するのではなく、株特異性レプリキンの高い濃度およびエピデミックに関連する複製の株特異的増加に基づく、または関連する。
【００８０】
さらに、どの配列変化が「浮動」または「転移」によるものか、また保存、保有宿主における保管、および再出現によるものかについて、考えられる識見に関するデータを評価した。データは、レプリキン濃度におけるエピデミック関連の増加は、血球凝集素あたりの既存のレプリキンの複製によるものではなく、少なくとも１つのレプリキン組成物が、消失してから１年〜最長５９年後に再出現することによること、加えてＡ株に限っては、新規の株特異性レプリキン組成物の出現によることを示唆する（図１３〜１６）。そのため、１９５１および１９７７のインフルエンザＢエピデミックにおけるレプリキン濃度の増加は、エピデミックの年における新規レプリキン組成物の出現に関連するのではなく、以前に発生したが消失していたレプリキン組成物の再出現に関連する（図１３）。
【００８１】
対照的に、Ａ株の場合は、以前に消失していたウイルスレプリキンの再出現に加え、新規の組成物が出現する（例えば、１９９６年エピデミックの年のＨ１Ｎ１において、６つの以前のレプリキンが再出現したことに加え、１０の新規組成物が出現した）。インフルエンザＢではなく、Ａ株のみがヒトでない動物および鳥類の保有宿主にアクセスできるため、完全に新規の組成物は、恐らく、レプリキンアルゴリズムの基本的要件である「３点認識」以外は新規組成物との類似点がないように思われる既存のヒトレプリキンの変異ではなく、ヒトでない保有宿主に由来すると考えられる（図１３〜１７）。Ｂと比較して多産性の高いＨ１Ｎ１、およびパンデミックはＢ株ではなく３つのＡ株のみによって産生されたという事実は、どちらも非ヒトウイルス保有宿主から新規のレプリキン組成物を受け取るヒトＡ株の能力機能であってもよい。
【００８２】
１年だけ出現した後に消失し、現在まで再出現していない幾つかのレプリキンがある（図１３〜１６）。また１年〜最長８１年間消失した後、同一のレプリキン配列が再出現した他のレプリキンもある。キーレプリキン「ｋ」および「ｈ」アミノ酸、およびそれらの間のスペースは、以下の株特異性レプリキン：１０のインフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１の単一レプリキン、およびＨ３Ｎ２の単一レプリキンに関して、および欠失後の同一レプリキンの再出現に関して図１３〜１６に示されるように、特定のレプリキンが一定に存在する間、長年にわたり保存される。
【００８３】
残りの血球凝集素配列のレプリキン構造内外におけるその他アミノ酸の置換または置換活性が顕著であるにもかかわらず、インフルエンザレプリキンヒスチジン（ｈ）はまったく置換されないようであり、リジン（ｋ）はほとんど置換されない。この保存の例は、以下において見られる。１９１８年〜２０００年の間一定であったＨ１Ｎ１レプリキン「ｈｐ（ｖ／ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ（ｒ／ｋ）（ｓ／ｔ）（ｔ／ａ）ｋ」（配列番号：＿）、１９７５年〜１９９８年の間一定であったＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｃｄ（ｇ／ｑ）ｆ（ｑ，ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ／ｉ）ｅｒ（ｓ／ｔ）ｋ」（配列番号：＿）、および１９７５年に最初に出現し、２５年間消失した後、２０００年に再出現したＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｑｎ（ｓ／ｅ）（ｅ／ｑ）ｇ（ｔ／ｓ）ｇ（ｑ／ｙ）ａａｄ（ｌ／ｑ）ｋｓｔｑ（ａ／ｎ）ａ（ｉ／ｌ）ｄ（ｑ／ｇ）Ｉ（ｎ／ｔ）（ｇ／ｎ）ｋ，（ｌ／ｖ）ｎ（ｒ／ｓ）ｖｉ（ｅ／ｃ）ｋ」（配列番号：＿）。多くのアミノ酸が置換されたが、最大約５０アミノ酸において、２つのリジン、離れた６〜１０の残基、１つのヒスチジン、最小６％のリジンから成る基本的レプリキン構造は保存された。
【００８４】
完全にランダムな置換では、これらＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２レプリキンが持続することも、１９０２〜２００１年までインフルエンザＢにおいて１０のレプリキン構造が持続することも、１９１９年の１８‐ｍｅｒレプリキンが７４年間欠失した後１９９３年に再出現することも不可能であったと考えられる。ランダムな種の置換ではなく、その不変性は、秩序的に制御された過程、または少なくともキーレプリキン残基が何らかの方法で固定または結合されるような保護、例えば、リジンは恐らく核酸と結合され、ヒスチジンは恐らく呼吸性の酸化還元酵素と結合されること示唆する。この保存を制御する機序は現時点で不明である。
【００８５】
ＩＩ．保存および遺伝子浮動はワクチン開発のための初期警告機序を提供する
Ｈ１Ｎ１レプリキンの場合において、１９１８年パンデミックに関連するＰ１ピークに存在する２つのレプリキンは、１２の新規レプリキンを含む１９３３年の回復Ｅ１ピークには存在しなかった。したがって、一定して保存されるレプリキンは、単独または併用のいずれもワクチンに対する最適な選択である。しかし、１年の濃度増加を伴う最近出現したレプリキンであっても、さらに１年以上持続および増加することが多く、濃度のピークおよびエピデミックに達するため、合成レプリキンを用いたワクチン接種の初期警告および時期を提供する（例えば、図６の１９９０年初頭のＨ１Ｎ１を参照のこと。例えば、図１０および図１１のＨ５Ｎ１ １９９５年〜２００２年も参照）。
【００８６】
図７、８、１０および１１におけるデータは、インフルエンザタンパク質配列におけるレプリキンの存在および濃度と、インフルエンザのパンデミックおよびエピデミックの発生との直接的な関係を示す。したがって、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列に関して、レプリキンの存在および濃度を分析することにより、インフルエンザパンデミックおよび／またはエピデミックの予測、およびインフルエンザワクチン製剤の標的を提供する。このデータを再度参照して、これまで株特異性化学構造を用いて、到来するインフルエンザのシーズンに優勢となる株を予測することも、ワクチンの全体ウイルス株の混合物を毎年考案することも知られていなかったことは注目に値する。
【００８７】
株特異性エピデミックが発生する１年〜３年前のインフルエンザ群における株特異性レプリキン数の発見と同様に、コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数の増加も識別されている。コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、以下のように増加した：１９９９年３．１（±１．８）、２０００年３．９（±１．２）、２００１年３．９（±１．３）、および２００２年５．１（±３．６）。このパンデミック前の増加は、コロナウイルスが２００３年のＳＡＲＳパンデミックに関与したという発見を支持する（図８および表３を参照）。
【００８８】
したがって、レプリキン構造およびレプリキン数を監視することにより、１９１７年〜１９１８年のガチョウレプリキンおよびインフルエンザおよびコロナウイルス株の両方に見られるようなその修飾型および付随レプリキンに対する合成株特異性ワクチン予防接種および抗体治療を開発する手段が提供される。
【００８９】
図９は、１９６２年〜２００３年に収集された分離株上でそのタンパク質配列を入手できるヌクレオキャプシドコロナウイルスタンパク質の自動レプリキン分析を表す。個別のタンパク質はそれぞれ受入番号で表し、レプリキンの存在について分析する。自動レプリキン分析の一部として、レプリキン数（１００アミノ酸あたりのレプリキン数）を自動的に計算する。各年の総レプリキン数について、１年あたりの平均（±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））レプリキン数を自動的に計算する。エピデミック前に、特定ウイルス株（コロナウイルス）における特定タンパク質（ヌクレオキャプシドタンパク質）の複製が増加していることを早期に警告するこの例は、インフルエンザのエピデミックおよびパンデミックに先行するインフルエンザウイルスの株において見られる増加と比較できる（図６、７、１０および１１）。１９９９年〜２００２年のレプリキン数の上昇は、２００２年末に出現し、２００３年へと続いたＳＡＲＳコロナウイルスのパンデミックに一致するとみられる場合がある。図８は、１９１７年〜２００２年のコロナウイルスヌクレオチドキャプシドレプリキンを含む幾つかのウイルス株のレプリキン数を示すグラフである。
【００９０】
ＩＩＩ．インフルエンザにおけるレプリキン
株が最初に出現し、その年にパンデミックをもたらした１９１８年から２０００年までの配列が入手可能な各Ｈ１Ｎ１分離株において、レプリキン「ｈｐ（ｖ／ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ‐（ｒ／ｋ）（ｓ／ｔ）（ｔ／ａ）ｋ」が１つのみ存在する。（図１４）（「（ｖ／ｉ）」は、アミノ酸ｖまたはｉが異なる年において同一位置に存在することを示す。）Ｈ１Ｎ１は持続性レプリキンを１つのみ含むが、Ｈ１Ｎ１は、インフルエンザＢより多産性であると思われる。Ｈ１Ｎ１に関して、８２年間に９５の異なるレプリキン構造が存在するのに対し、インフルエンザＢ分離株に関しては、６２年間に存在する異なるレプリキンは３１に留まる（図１３および１４）。多くの新規レプリキン構造における増加は、エピデミックの年に発生し（図１３〜１６）、総レプリキン濃度の増加に関連する（図６、７、１０および１１）。
【００９１】
インフルエンザＨ２Ｎ２レプリキン：インフルエンザＨ２Ｎ２は、１９５７年のヒトパンデミックに関与した。１９５７年の株において識別された２０レプリキンのうち３つは、Ｈ２Ｎ２分離株のそれぞれに保存され、１９９５年までＰｕｂＭｅｄでの試験用に入手可能であった（図１５）。
ｈａ（ｋ／ｑ／ｍ）（ｄ／ｎ）ｉｌｅｋｔｈｎｇｋ（配列番号：＿）
ｈａ（ｋ／ｑ／ｍ）（ｄ／ｎ）ｉｌｅｋｔｈｎｇｋｌｃ（ｋ／ｒ）（配列番号：＿）
ｋｇｓｎｙｐ（ｖ／ｉ）ａｋ（ｇ／ｒ）ｓｙｎｎｔｓｇｅｑｍｌｉｉｗｑ（ｖ／ｉ）ｈ（配列番号：＿）
【００９２】
しかしＨ１Ｎ１とは反対に、１９６１年に始まったＨ２Ｎ２では、１３の追加レプリキンが発見されたにすぎなかった。このような少数の新規レプリキン発現は、Ｈ２Ｎ２レプリキンの濃度および分離株におけるＨ２Ｎ２の発現が長年にわたって減少したことに関連する（図７）。
【００９３】
インフルエンザＨ３Ｎ２は、１９６８年のヒトパンデミックに関与した。１９６８年に出現した５つのレプリキンは１９７７年以降消失したが、１９９０年代に再度出現した（図１６）。２２年間持続したレプリキン構造はｈｃｄ（ｇ／ｑ）ｆ（ｑ／ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ／ｉ）ｅｒ（ｓ／ｔ）ｋのみであり、これは１９７７年に初めて出現し、１９９８年まで持続した。１９９０年代半ばの１２の新規Ｈ３Ｎ２レプリキンの出現は（図１６）、同時期のレプリキン濃度の増加、および最近の分離株におけるＨ３Ｎ２株の流行に関連し、それら分離株の一部から全レプリキンの同時消失を伴う（図７）。これは、新規の亜株Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の出現を示唆する。２００３年１１月および１２月におけるＨ３Ｎ２新規株（Ｆｕｊｉａｎ）のエピデミックは、最初に２００１年７月９日提出の米国仮出願番号６０／３０３，３９６において行われた予測を裏付けた。
【００９４】
図６、７、１０および１１は、インフルエンザエピデミックおよびパンデミックが、インフルエンザウイルスにおけるレプリキン濃度の増加と関連し、これは少なくとも１つのレプリキンが、消失してから１年〜５９年後に再発するためであることを示す。またＡ株に限って、新規の株特異性レプリキン組成物の発生が見られる（図１４〜１６、図６および７におけるＨ５Ｎ１のエピデミック前の新規レプリキン数の増加も参照）。単一のタンパク質内で個別のレプリキンが反復することによるレプリキン濃度の増加は、インフルエンザウイルスでは発生しないようであるが、その他の有機体において見られる。
【００９５】
ＩＶ．ガチョウレプリキン骨格
１９１７年にガチョウから単離されたインフルエンザウイルスの血球凝集素におけるレプリキン（ガチョウレプリキンと命名）は、翌年の１９１８年パンデミックに関与したインフルエンザのＨ１Ｎ１株において出現し、以下のようにたった２つの置換を持つことを発見した：ｋｋｇ（ｔ／ｓ）ｓｙｐｋｌｓｋｓｙ（ｔ／ｖ）ｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈ。表１は、複数のマイナー置換およびその他のインフルエンザ株への明らかな転移があったにもかかわらず、インフルエンザ１９１７年ガチョウレプリキン（ＧＲ）がその後８５年間、実質的に保存されたことを示す。われわれは、１９１７年インフルエンザＧＲが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年のパンデミック）、Ｈ２Ｎ２（１９５７〜５８年のパンデミック）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年のパンデミック、２０００年の中国およびロシアにおけるエピデミック、２００３年のＦｕｊｉａｎ株エピデミック）およびＨ５Ｎ１（１９９７年中国でのエピデミック）において表れるいくつかのインフルエンザ株の間で明らかな移動性を示すことを発見した。１９９７年に、その構造はＨ１Ｎ２において、その１９１８年構造ＫＫＧＳＳＹＰＫＬＳＫＳＹＶＮＮＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨに正確に回復された。
【００９６】
高い毒性および宿主細胞の死亡率に関連しうるレプリキン配列は、インフルエンザウイルスの新生株を予測、識別および治療するための標的を提供する。表１は、ガチョウレプリキンを示す。ガチョウレプリキンおよびその相同体は、以下の９０年間のインフルエンザ株に関するデータにおいて、インフルエンザウイルスの新生株における毒性の予測に有用であることが示された。ガチョウレプリキンおよびその相同体をひとまとめにして考えると、それらはレプリキン骨格のアルゴリズムに適合し、一連の保存レプリキンペプチドを必要とする。各レプリキンペプチド配列は、約１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、（３）別のリジン残基から６〜約１０アミノ酸残基にあるリジン残基と、（４）少なくとも約６％のリジンと、を含む。
【００９７】
Ｖ．インフルエンザにおける高い毒性と関連するレプリキン骨格配列
高い毒性または宿主細胞の死亡率を示したインフルエンザ分離株から得た１つ以上のレプリキン骨格配列における置換に同一のアミノ酸に置換を有するインフルエンザ分離株におけるレプリキン骨格配列は、インフルエンザウイルスの新生株における標的および治療として有用である。したがって、本発明は、１６〜約３０のアミノ酸を含み、
（１）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、をさらに含む、インフルエンザウイルスの第１株から単離したレプリキン骨格ペプチドを提供し、
インフルエンザウイルスの第１株の単離したレプリキン骨格配列は、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン骨格配列と比較して、アミノ酸置換を含み、アミノ酸置換はヒスチジン置換ではなく、またインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン骨格配列は、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
インフルエンザウイルスの第３株のレプリキン骨格配列には追加で置換が存在し、
（１）１６〜約３０のアミノ酸と、
（２）末端リジンおよび任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（３）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（４）別のリジンから６〜約１０アミノ酸にあるリジンと、
（５）少なくとも６％のリジンと、を含み、
インフルエンザウイルスの第３株における置換の存在は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して、複製、毒性、または宿主細胞の増加に関連する。
【００９８】
好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン配列における異なるアミノ酸残基で置換されるインフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する。
【００９９】
別の好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列におけるアミノ酸残基は、インフルエンザウイルスの第１株の単離したレプリキン配列におけるロイシン以外のアミノ酸で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸で置換される。別の好適な実施形態において、アミノ酸は、メチオニンまたはイソロイシンで置換される。別の好適な実施形態において、単離したレプリキン配列は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスから単離される。
【０１００】
本発明者は、１００年間の疫学的データを使用し、インフルエンザウイルスにおけるレプリキン濃度がウイルスの毒性と関連することを立証した。また同一の疫学的データを使用し、特定の高度に保存されたレプリキン配列の構造と、毒性およびエピデミックとを関連付けた。同一の１００年間の疫学的データにおいて、長期にわたって高度に保存されたレプリキン配列における個別の配列変化を再検討した結果、レトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）およびプロスペクティブ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）な予測能力が示された。
【０１０１】
ガチョウレプリキン骨格におけるレプリキン骨格も同様に、ガチョウレプリキン相同体を含むインフルエンザウイルスの新生株を治療するための標的を提供することが示された。例えば、ベトナムにおける病原性の高いＨ５Ｎ１の２００４年株（表１において「２００４年 Ｈ５Ｎ１ ベトナム、高い病原性」と標識）の２９アミノ酸レプリキン骨格ペプチドは、ＵＴＯＰＥとして知られる短い合成レプリキン配列およびキーホールリンペットヘモシアニンアジュバントで相補され、ウサギおよび鶏に皮下注射した場合に、強い免疫反応を提供した。例７を参照のこと。
【０１０２】
表１は、２００６年までのガチョウレプリキンおよびその相同体を提供する。表１における構造は、アミノ末端における一定長の一定リジン、およびカルボキシル末端における一定ヒスチジン残基は、異なる株において固定骨格で数十年にわたり保存されることを示す。ガチョウレプリキンの相同体は、１９１７年〜２００６年における１９１８年、１９５７年、および１９６８年の３度のパンデミックにそれぞれ関与する株のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２に出現し、さらにＨ１Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ１間の置換を含む。ガチョウレプリキンにおいて発生した特定の置換も、ランダムではなく選択的であり、長年にわたり保持される傾向がある。そのため、一般にアミノ酸置換はランダムに生じると仮定されるが、実際は、インフルエンザにおけるすべての置換がランダムとは限らないようである。数十年にわたるこのレプリキン保存により、合成インフルエンザワクチンの産生が可能になり、急速かつ安価に事前調整することができ、また１年以上有効である。
【０１０３】
そのため、合成インフルエンザワクチンの標的は、インフルエンザウイルスにおける保存レプリキン骨格である。レプリキン骨格は、約１６〜約３０のアミノ酸配列を含む一連の保存ペプチドを含み、
（１）末端リジンおよび末端リジンに直接隣接する残基部分にある任意のリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接する残基部分にある別のヒスチジンと、
（３）少なくとも１つの別のリジンから約６〜約１０アミノ酸残基内にある少なくとも１つのリジンと、
（４）１６〜約３０のアミノ酸ペプチド内にある少なくとも約６％のリジンと、をさらに含む。またレプリキン骨格ペプチドは、一連のレプリキン骨格の個別部材または複数部材を意味する。
【０１０４】
合成インフルエンザワクチンの非限定的かつ好適な標的は、約２９アミノ酸および末端リジンに直接隣接するリジンを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格である。別の好適な標的において、レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基にあるロイシンは、別のアミノ酸で置換される。別の好適な標的において、ロイシンの置換は、疎水性アミノ酸を用いて行われる。別の好適な標的において、ロイシンの置換は、メチオニンまたはイソロイシンを用いて行われる。
【０１０５】
合成インフルエンザワクチンのあまり好適でない標的は、約２９アミノ酸の第１ペプチド、および
（１）末端リジンおよび末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジンおよび末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、を含み、
（３）任意のその他のリジンから６〜１０アミノ酸残基内のリジンを含まないインフルエンザウイルスの第１株における外骨格であってもよい。第１株の早期発生標本またはウイルスの別株は、約２９のアミノ酸を含む。
【０１０６】
表１において、ガチョウレプリキンおよびその相同体の経歴は、１９１７年から現在の鳥類Ｈ５Ｎ１ウイルスの流行まで追跡される。表１は、インフルエンザのウイルス株におけるガチョウレプリキンの「骨格」相同性の保存を示す。
【０１０７】
表１は、その他のインフルエンザレプリキンにおけるガチョウレプリキンおよびその相同体のタンパク質構造の存在の経歴を、１年毎またはそれより短期間毎に示す。表１は、それら相同体におけるアミノ酸置換の経歴およびレプリキンの定義およびレプリキンにより供給される急速な複製機能に不可欠なレプリキン構造の特定アミノ酸の保存をさらに示す。
【表１】
【０１０８】
表１の検討は、アミノ酸のランダム置換が１９１７年から現在までのインフルエンザ悪性株において発生した場合、ガチョウレプリキンの特定フレームワークアミノ酸は、エピデミックが発生した株において毎年保存されないことを示す。しかし、ランダム置換の結果とは反対に、インフルエンザの毒性株は、毎年一貫して、レプリキンを定義する位置に保存アミノ酸を含む。つまり、レプリキンを定義するアミノ酸の１つ、例えばリジンまたはヒスチジンにおいて置換が発生する場合、レプリキンの定義は喪失する。それにもかかわらず、レプリキン配列は８５年間以上にわたって保存される。したがって、特定アミノ酸が長年にわたって保存されることから、置換は完全にランダムであるとは言えない。レプリキンの定義に重要でないアミノ酸（例えばリジンまたはヒスチジン以外のアミノ酸）において置換が発生するという事実は、株の病原性におけるレプリキンの重要性を示す。
【０１０９】
さらに表１から、置換が発生する場合、レプリキン骨格の特定の明らかに好適な位置において発生することが分かることに注目する。表１は、１位、３〜２４位および２６〜２７位における置換の再発を示す。さらに、置換はこれらの位置全体で発生するが、リジンは第２リジン（これらの毒性株で置換されていない）から６〜１０アミノ酸の位置に存在し続ける。
【０１１０】
２９のアミノ酸ストレッチ内のリジン位置に置換がある場合であっても、１９５７年に見られるように、１１位のＫが１０位に移動すると、その新規位置は２００５年まで維持された。ＹＰ，ＡＹ、Ｎ（１５位）およびＬＶＬＷＧを有し、ほぼ例外なくレプリキン骨格の相同構造を保存する。
【０１１１】
中国（安徽省）におけるＨ５Ｎ１の２００６年株のレプリキン骨格において追加のＫが出現したことに注目することが重要である。この追加のＫの存在は、レプリキン骨格におけるレプリキン数の増加を知らせる。２００６年中国（安徽省）株は、（以下で説明されるように）６．６のレプリキン数を有する。レプリキン数６．６は、Ｈ５Ｎ１株に関してこれまで認められた中で最高値であり、インフルエンザの全体Ａ株において、１９１８年のパンデミックをもたらしたインフルエンザ株のレプリキン数にのみ匹敵する。この最初の２００６年報告が反復および維持される場合、２００４年および２００５年のカウント４．５および４．０がそれぞれ実質的に増加することを示し、Ｈ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」のエピデミックの継続または増加を予測する。
【０１１２】
レプリキン骨格配列を含むインフルエンザウイルスの初期毒性株を再検討し、レプリキン骨格が非レプリキン配列に分解されたが、レプリキン骨格の骨格構造に対する識別可能な相同性を維持する場合の複製速度および毒性に対する影響を判断した。レプリキン骨格における内部ＫおよびＨが欠失することにより（末端におけるそれらとは異なり）、例えば、２９のアミノ酸における２または３未満の含有レプリキンを表さないか、またはもはや完全にレプリキンでないが、例えば、非限定的に骨格の２９アミノ酸ＫＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＨ等の外部「シェル」を保存することは、分離株のウイルス配列に見られることが多く、高いレプリキン数および毒性は、典型的にエピデミックまたは流行の終端時に失われる。このレプリキン骨格の「破壊」（または不完全な合成）は、レプリキン数における減少に関する場合と同様に、流行またはエピデミックの衰弱を示す別の指標として有用であり、内部ＫおよびＨを伴う完全に代表的な骨格の出現のように、より多くのレプリキン、すなわち高いレプリキン数を産生し、その出現は通常レプリキン数が３を越える場合、またそれに近づく場合に発生する。これは、流行またはエピデミックの来たる出現の指標として有用である。この実際の使用に加えて、このシェル現象は、以前に認識されなかったレプリキン骨格は、ウイルスの重要な構造的要素であり、流行およびエピデミックにおけるウイルスの「成功」と密接に関連する機能を有することを証明する別の「原理の証拠」である。
【０１１３】
例えば、レプリキン骨格を有する特定インフルエンザ種の早期発生標本は、後に以下のように変化する。
１）２９アミノ酸長が保存される。
２）最初２つのアミノ酸位置（１および２）が保存される。例えば、ＫＫ。
３）最後２つのアミノ酸位置（２８および２９）が保存される。例えば、ＨＨ。
４）しかし、ＫＫから６〜１０アミノ酸にＫはもはや存在しない（レプリキンの定義を必要とする）。
そのようにして、骨格はもはやレプリキン骨格ではなく、骨格エクソスケルトンとなる。レプリキン骨格は、高いレプリキン数およびエピデミックの発生に関連するが、骨格エクソスケルトンはウイルスの休眠およびエピデミックの減少または終了に関連する。したがって、骨格エクソスケルトンは、レプリキン骨格および特定のウイルス流行が減少している場合に残基として残る変性構造であるため、この目的において有用な診断構造であると思われる。これは、１）抗体または小さい阻害性ＲＮＡ等の抗急速複製の標的、および２）抗ウイルスワクチンのベースとしてのレプリキン骨格の実態および使用を確認する。
【０１１４】
レプリキン骨格の完全性および保存は、好ましくは２つのリジンで開始し、２つのヒスチジンで終端する固定２９アミノ酸配列が存在するという事実により理解されてもよい。次に好ましくは、骨格は１６〜約３０アミノ酸長である。
【０１１５】
アミノ酸置換
骨格構造を破壊しないレプリキン骨格における置換は、特定のアミノ酸に限定されないようである。しかし、特定のアミノ酸はペプチドの構造および機能に対して類似の影響を及ぼす共通の化学特性を共有するため、同様のアミノ酸を持つレプリキン配列に対して同様の構造的影響を共有する１つのアミノ酸の置換は、異なる基からの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換より可能性が高いと想定される。
【０１１６】
アミノ酸は、酸性、塩基性、親水性、および疎水性４つのカテゴリに分類されてもよい。特定の基におけるアミノ酸は、異なる基のアミノ酸と比較して、その基内のアミノ酸と置換される可能性が高いと想定される。酸性側鎖を有する酸基は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。塩基性側鎖を有する塩基は、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンを含む。極性中立側鎖を有する中性の親水性基は、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トレオニン、セリンおよびシステインを含む。非極性中立側鎖を有する疎水性基は、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、プロリン、バリンおよびロイシンを含む。そのようにして、レプリキン骨格配列における特定アミノ酸の好適な置換は、本発明において想定されるように、同一のアミノ酸基内の置換、つまり置換アミノ酸である。例えば、ロイシンは、グルタミン酸よりもメチオニンにより置換される可能性が高く、メチオニンの置換は、ペプチドの特定部分の一部機能を破壊する可能性が低いと想定される。
【０１１７】
レプリキン骨格のＨ５Ｎ１インフルエンザ保存
幾つかの国における現行の高死亡率Ｈ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」の流行は、延滞インフルエンザパンデミックの第１段階を表すかもしれないというという懸念がある。１つの報告（Ｕｎｇｃｈｕｓａｋ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ２００５ Ｊａｎ ２７；３５２（４）：３２３‐５）は、推定されるＨ５Ｎ１の最初のヒトからヒトへの転移において、「ウイルス遺伝子のシーケンシングは、血球凝集素のレセプタ結合部位における変化またはウイルスのその他のキー特性を識別しなかった。８つのウイルス遺伝子セグメントの配列は、すべてタイにおける最近の鳥類分離株から得られたその他のＨ５Ｎ１配列と密接にクラスタ化したことを示唆する」。系統発生解析は、「ヒトインフルエンザウイルスとの再集合」の証拠がないため、Ｈ５Ｎ１は新規の変型ではないことを示唆した。しかし、われわれはここで、過去２度のＨ５Ｎ１エピデミックにおいて変化せず、実際に１９５９年以降保存されていた特定のＨ５Ｎ１タンパク質配列の部位における最近の３つの変化を報告する。これまで、ウイルスエピデミックおよび休眠に関連するタンパク質化学は存在しなかった。われわれは、過去１００年の３度のインフルエンザパンデミック、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２のそれぞれが、リジンおよびヒスチジンを豊富に含み、急速複製に関連するウイルスにおける特定ペプチド類、つまりレプリキンの濃度の増加により、およびそれに関連してレトロスペクティブ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）に予測されたことを発見した。１９９７年、２００１年、および２００３年〜２００４年の３度のＨ５Ｎ１エピデミックそれぞれにおいて、レプリキンが予測的であることを発見した（図１１）。それらが分離株に出現する各年において、図１１に示されるように１００アミノ酸あたりのレプリキンを数えることができ、また表１に示されるようにそれらの配列を分析および比較することができる。レプリキンの分析は、入手可能な配列情報におけるレプリキン濃度を測定する目的で、手動または本発明の好適な側面においてソフトウエアを使用して自動に行われてもよい。
【０１１８】
図１１は、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックの流行に先立つインフルエンザのＨ５Ｎ１株の血球凝集素タンパク質におけるレプリキンパターンの濃度の急速増加を示すグラフである。図１１を検討すると、Ｈ５Ｎ１の血球凝集素タンパク質において増加するレプリキン濃度（「レプリキン数」）が、３度の「鳥インフルエンザ」エピデミックに先行したことが分かる。例えば、１９９５年〜１９９７年のレプリキン数（標準＋／−ＳＤ）における増加は、１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１エピデミックに先行した（Ｅ１）。１９９９年〜２００１年のレプリキン数の増加は、２００１年のエピデミックに先行した（Ｅ２）。および２００２年〜２００４年のレプリキン数の増加は、２００４年のエピデミックに先行した（Ｅ３）。１９９９年の減少は、香港におけるＥ１エピデミックを受けて鶏を大量に処理したことで発生した。
【０１１９】
ウイルスタンパク質におけるレプリキンの総数に加えて、長年にわたる各レプリキンの構造は有益な情報であり、抗体および小ＲＮＡ等のワクチンおよびその他治療に対する標的を提供する。上述のように、表１は、１９１７年にインフルエンザに感染したガチョウにおいて最初に認められたレプリキン（ガチョウレプリキン）を示す。アミノ末端における一定長の不変リジン、およびカルボキシ末端におけるヒスチジン残基は、数十年にわたって固定骨格の異なる株に保存された。ガチョウレプリキンの相同体は、１９１７年〜２００６年の株（１９１８年、１９５７年、１９６８年の３度のパンデミックに関与した株であるＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２を含む）において出現し、Ｈ１Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ１間のさらなる置換を伴う。ガチョウレプリキンにおいて発生した特定の置換でさえも、ランダムではなく選択的であり、長年にわたり保持される傾向がある。そのため、一般にアミノ酸置換はランダムに発生すると仮定されるが、インフルエンザでは、すべての置換が実際にランダムであるとは限らないと思われる。数十年にわたるこのレプリキン保存により、合成インフルエンザワクチンを急速かつ安価に事前調整でき、それらは１年以上有効である。
【０１２０】
１９９７年のＨ５Ｎ１香港エピデミックにおいて、ヒト死亡率は約２７％であった。２００４において、アジアでＨ５Ｎ１に感染したことが報告された５２人のうち、約７０％が死亡した。最近では、ベトナムにおける１１症例のうち９例が、２００４年１２月２８日〜２００５年１月２７日までに死亡した。ウイルスの毒性は増加したと考えられるが、ヒトからヒトへのさらなる感染の拡大に必要であると考えられる任意の変化は、まだ発生していないと考えられている。しかし、われわれは、２００４年ベトナム、タイおよび中国で分離株から得られたガチョウレプリキン骨格の３つのＨ５Ｎ１レプリキンアミノ酸残基の１８位、２４位、および２８位において最近の置換を認めた（表１を参照）。２４位における置換は、１９５９年Ｈ５Ｎ１の出現以降発生していないが、その他の株、１９５７年のＨ２Ｎ２および１９６８年のＨ３Ｎ２により発生し、合わせて２００万人を越える死者をもたらした過去２度のインフルエンザパンデミック、およびＨ７Ｎ７により生じた最近の毒性エピデミックに存在した（表１を参照）。これらは考えられる危険の兆候にすぎないが、図１１に示される上昇レプリキン数と併せて、置換に関するこれらのデータおよびそのようなレプリキンデータとパンデミックとの過去の関連は、ウイルスがヒトからヒトに広まる可能性は低いという系統発生解析から得られるような安心感を与えない。
【０１２１】
表１は、インフルエンザのウイルス株におけるレプリキン骨格の完全性を示す。上述のように、レプリキン骨格がエクソスケルトン骨格に分解されると、病原性が減少すると考えられる。したがって、一般的に２つのリジンで開始し、２つのヒスチジンで終端する固定２９アミノ酸配列が存在するという事実から、レプリキン骨格の完全性および保存が見られる。
【０１２２】
本発明の側面は、ウイルスの病原性または複製速度、エピデミックまたはパンデミックを追跡するか、またはエピデミックあるいはパンデミックの発生を予測するレプリキン構造および機能の組み合わせである。この組み合わせの例は、１９１８年の株およびＨ５Ｎ１の現行Ｈ５Ｎ１株等のインフルエンザ株におけるレプリキン数の増加をカウントに使用される本発明のレプリキンアルゴリズムの能力である。１９１８年インフルエンザパンデミックおよび「鳥インフルエンザ」の現行の流行におけるレプリキン数は、本発明に従う、および本発明により可能となる典型的側面の予測能力を示す。
【０１２３】
インドネシアおよびベトナムにおいてヒトＨ５Ｎ１株から発見された単一置換は、以前のＨ５Ｎ１株には存在しないが、最近の１９５７年（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年（Ｈ３Ｎ２）における２度の致死的ヒトパンデミックに歴史的に存在する
上記表１を再検討したところ、１９５７年の高死亡率インフルエンザパンデミックに関与するインフルエンザウイルスのＨ２Ｎ２株、および１９６８年の高死亡率インフルエンザパンデミックに関与するインフルエンザのＨ３Ｎ２株は、ガチョウレプリキン骨格におけるアミノ酸番号２４に単一のアミノ酸置換を含むことが明らかになった。表１を参照のこと。本出願人は、インドネシアおよびベトナムでヒトにおいて発見されたＨ５Ｎ１ウイルスタンパク質における最近の単一アミノ酸置換もガチョウレプリキン骨格におけるアミノ酸番号２４に置換を有することを発見した。インドネシアおよびベトナムで最近ヒトにおいて単離されたＨ５Ｎ１ガチョウレプリキンペプチドは、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ（Ｍ／Ｉ）ＷＧＩＨＨであり、Ｈ５Ｎ１のインドネシア株は２４位にイソロイシンを含み、Ｈ５Ｎ１のベトナム株は２４位にメチオニンを含む。上述のように、本出願人は、アミノ酸２４における置換が高い毒性およびヒトパンデミックを予測することを教授する。
【０１２４】
ヒトにおいて最近単離されたＨ５Ｎ１のインドネシア株は、Ｈ５Ｎ１のガチョウレプリキンにおけるアミノ酸番号２４での置換（本明細書では「Ｓ」置換と指定する）が以前のどのＨ５Ｎ１株にも存在しないが、１９５７年（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年（Ｈ３Ｎ２）の過去２度の高死亡率インフルエンザパンデミックには存在したため重要である。１９５７年および１９６８年のパンデミックは、数百万人の死をもたらした。２４位におけるアミノ酸置換は、１人が死亡した最近のＨ７Ｎ７の流行（幸いなことに短期間）においても同様に存在した。表１を参照のこと。それにもかかわらず、Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおける２４位のアミノ酸置換は、１９５９年から現在（２００６年）までに分析および記録されたすべてのＨ５Ｎ１から欠失している。
【０１２５】
国立医学図書館（Ｐｕｂｍｅｄ）の１２００万を越えるエントリを見直した結果、アミノ酸配列におけるＳ置換を検出し、ＦｌｕＦｏｒｅｃａｓｔ（登録商標）ソフトウエアを使用して、Ｓが長年にわたって発生したことを追跡した（ｗｗｗ．Ｒｅｐｌｉｋｉｎｓ．ｃｏｍを参照）。
【０１２６】
Ｓ置換は、鶏からの最近のＨ５Ｎ１分離株では認められなかった。代わりに、高い死亡率を伴うヒト症例から得られたＨ５Ｎ１分離株において最近認められたにすぎない。Ｓ置換は、２００４年ベトナムおよび２００６年インドネシアにおいてヒトから得た分離株で観察された。表１を参照のこと。ベトナムおよびインドネシアのヒトにおける疫学的証拠は、Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおけるＳ置換が、対ヒト「クラスタ」と関連することを示唆する。ここで、鳥からヒトへの転移は確立されておらず、またヒト同士の転移は除外されている。Ｓ置換は、Ｈ５Ｎ１のヒト同士の転移が、これまでのところまれではあるが、既に発生している可能性があることを示唆する。
【０１２７】
世界保健機構（ＷＨＯ）および米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ）のスポークスパーソンは、最近、高い死亡率を持つＨ５Ｎ１のインドネシア人症例から得たＨ５Ｎ１分離株において「著しく」心配な配列変化は見られていないと発表した。著しい配列変化は、ヒトからヒトへの転移が生じる前に必要であると当業者は考える。そのため、「著しい」配列変化はヒトパンデミックの必要条件であると考えられる。Ｓ置換と対ヒト「クラスタ」との関連は、ＷＨＯおよびＣＤＣにより予測された「著しい」配列が、上述のようなガチョウレプリキン骨格内の単一アミノ酸変化において予期せず検出されうることを示唆する。
【０１２８】
ガチョウレプリキンウイルスペプチドは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、およびＨ５Ｎ１において、８８年間（１９１７年から現在まで）高度に保存されることが発見されたという事実にもかかわらず、驚くべき変異、つまりＳ変異がガチョウレプリキンにおいて特定の保存位置、２４位において識別された。上記で確立されたように、タンパク質におけるレプリキン濃度の増加は、急速複製およびエピデミックと関連している。例えば、図６、７、８、１０および１１を参照のこと。上昇する「レプリキン数」（１００アミノ酸あたりのレプリキン数）は、各主要なインフルエンザエピデミック、過去１００年における最近の３度のインフルエンザパンデミック、および１９９７年〜現在までの過去３度のＨ５Ｎ１エピデミックと量的に関連し、予測的であることが多いことが分かった。図６、７、８、１０および１１を参照のこと。
【０１２９】
Ｓ置換等の単一置換は、単独でパンデミックの唯一の原因とはならない。それにもかかわらず、Ｓ置換の発生は、１９５７年および１９６８年における過去２度の高死亡率パンデミックにおけるマーカである。さらに、鶏においては（現在まで）発生していないが、ヒトのみにおけるＨ５Ｎ１でのＳ置換の発生は、高い総レプリキン数および死亡率を伴い、Ｈ５Ｎ１が実際にヒトパンデミックに至る経路となりうることを示唆する。
【０１３０】
ヒトパンデミックが到来する可能性が高いことを示唆する証拠は、レプリキン数および高い死亡率と併せて、Ｓ置換を識別する前に行われた安心な評価とは顕著に異なる。そのため、Ｓ置換の詳細な機能は完全に知られてはいないが、この証拠は、Ｓ置換の疫学的機能が高いレプリキン数と併せて明らかであることを示唆する。
【０１３１】
Ｈ５Ｎ１から完全なパンデミックが実体化するかどうか、またそれがいつであるかを最終的に決定する要因は依然として不明である。次のパンデミックの因子となりうるＨ５Ｎ１の最終置換構造に関する情報がこれまで欠如していたため、適切なワクチンを産生する試みが遅れている。本明細書に開示されるレプリキンペプチド構造およびガチョウレプリキン骨格は、到来の可能性があるパンデミックに対するワクチンの産生について必要な指示を提供する。
【０１３２】
標的としてのＳ置換レプリキン骨格
インフルエンザウイルスの新生株におけるレプリキン骨格での予測的置換により提供される合成ワクチンのターゲットに関する非限定例は、表１の配列標示「１９５７ Ｈ２Ｎ２ヒトインフルエンザパンデミック」、「１９６８ Ｈ３Ｎ２ヒトインフルエンザパンデミック」、「１９７９〜２００３ Ｈ７Ｎ７インフルエンザ」、「２００４ Ｈ５Ｎ１（ベトナム、高い病原性）」および「２００６ Ｈ５Ｎ１インドネシア（高い病原性）」で提供される。上述のように、ガチョウレプリキンおよび表１に開示されるその他すべての配列と比較して、ロイシンを１９５７年および１９６８年パンデミック株におけるイソロイシンで置換すること、およびロイシンをＨ７Ｎ７の１９７９年〜２００３年株におけるイソロイシンで置換することは、ロイシンが２００４年ベトナムのＨ５Ｎ１新生株におけるメチオニン、および２００６年インドネシアのＨ５Ｎ１新生株におけるイソロイシンで最近置換されたことにより連続的な毒性の増加がもたらされるという予測的重要性を提供する。ベトナムおよびインドネシアにおける高い死亡率は、ヒトからヒトに転移した幾つかの証拠とともに、これらの置換株において毒性が実際に増加したことを示唆する。したがって、これらの株の置換レプリキン骨格ペプチドは、合成ワクチンの開発に役立つレプリキン骨格ペプチドの非限定的な好適実施形態である。本発明の別の非限定実施形態は、２００４年ベトナムから単離された置換Ｈ５Ｎ１および２００６年インドネシアから単離された置換Ｈ５Ｎ１のレプリキン骨格ペプチドであり、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基で置換された末端ヒスチジンから５番目の位置にある。より好適な実施形態において、レプリキン骨格ペプチドは、末端ヒスチジンから５番目の位置で、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸と置換される。
【０１３３】
本発明の別の実施形態において、１９５７年Ｈ２Ｎ２パンデミック株の骨格ペプチド、１９６８年Ｈ３Ｎ２パンデミック株、および１９７９年〜２００３年Ｈ７Ｎ７株は、これらの新生株に対する合成ワクチンの相同性標的も提供する。
【０１３４】
したがって、本発明は、本発明の単離したレプリキンペプチドも提供する。本レプリキンペプチドは、約２９のアミノ酸を含む。単離したレプリキンペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含んでもよく、［Ｓ］はインフルエンザウイルスの第２株と比較して、置換される任意のアミノ酸であるか、その他はほぼ同一のレプリキンペプチド配列を含んでもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は任意の疎水性アミノ酸であってもよい。さらに好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。さらに好適な実施形態において、上記で具体化された配列は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離される。
【０１３５】
ＶＩ．レプリキン骨格を使用したインフルエンザ毒性の増加を予測する方法
長期にわたるレプリキン骨格の歴史的データは、インフルエンザウイルスの新生株の毒性を予測するツールを提供する。インフルエンザウイルスの株において、レプリキン数が長期にわたって増加している場合、それはインフルエンザウイルスの新生株であり、毒性の増加を予想できる。インフルエンザウイルスの新生株が、歴史的に毒性が高いインフルエンザウイルスの株における毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連するレプリキン骨格ペプチドにアミノ酸置換を含む場合、新生株は毒性の増加を有すると予測してもよい。
【０１３６】
したがって本発明は、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法を提供する。本方法は、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチドと、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチドと、インフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドと、を含むステップと、
（２）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換された第３レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸を識別するステップと、
（３）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第３株が、高い複製、毒性、または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（４）第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基は、第２レプリキン骨格と比較して、第１レプリキン骨格ペプチドにおけるアミノ酸残基と同一の残基位置にあることを判断するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数と、インフルエンザウイルスの第１株の初期分離株のレプリキン数とを比較するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いことを判断するステップと、
（７）インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップと、を含む。
【０１３７】
例えば、上述および表１に開示されるように、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２の１９５７年および１９６８年パンデミック株においてイソロイシンを持つ、ならびにＨ７Ｎ７の１９７９年〜２００３年株においてイソロイシンを持つ開示レプリキン骨格におけるガチョウレプリキンおよびその相同体におけるロイシンの置換は、２００４年ベトナムでのＨ５Ｎ１の新生株におけるメチオニンとのロイシンの最近の置換、および２００６年インドネシアでのＨ５Ｎ１の新生株におけるイソロイシンとの置換が継続的な毒性の増加をもたらすという予測重要性を提供する。高い死亡率およびヒト同士の感染が結合して起こることが証明されたことからも分かるように、ベトナムおよびインドネシア株において毒性は明らかに増加した。
【０１３８】
したがって、本発明の方法の非限定的な好適実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン骨格ペプチドは、任意のその他のアミノ酸の場合、ロイシンの置換を受けた。より好適な実施形態において、置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸で行われた。さらに好適な実施形態において、置換はメチオニンまたはイソロイシンで行われた。一層好適な実施形態において、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン骨格ペプチドにおける置換は、レプリキン骨格ペプチドの２４位、または代替として末端ヒスチジンから５番目の残基において行われた。
【０１３９】
本発明は、パンデミックを予測する方法も提供する。本方法は、ウイルスＤＮＡを単離およびシーケンシングするステップと、コード化されたアミノ酸配列に関して、結果として生じる配列を走査するステップと、アミノ酸配列に関して本明細書に記載される予測方法を行うステップと、を含む。核酸配列は、アミノ酸の配列をコード化する場合、アミノ酸配列と相同である。本発明の方法の好適な実施形態において、パンデミックを予測する方法は、結果として生じる核酸配列を走査するステップと、ガチョウレプリキンの２４位における変化を特定するステップと、Ｈ５Ｎ１のガチョウレプリキンにおけるＳ置換の存在に基づいて、将来のパンデミックを予測するステップとを含む。
【０１４０】
上述の非限定的方法は、発見された任意のレプリキン骨格または以下に開示される任意のレプリキン骨格を採用してもよい。
【０１４１】
ＶＩＩ．レプリキンを使用してインフルエンザ毒性の増加を予測する方法
本発明は、長期にわたるレプリキン配列の変化、地理、または疫学的事象を監視することにより、インフルエンザウイルスの株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する非限定的な方法も提供する。インフルエンザウイルスの株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法は、
（１）インフルエンザウイルスの第１株を識別するステップであって、インフルエンザウイルスの株のレプリキン数は、インフルエンザウイルスの第１株の早期発生分離株のレプリキン数より大きいステップと、
（２）インフルエンザウイルスの第１株の第１レプリキンペプチドを識別するステップと、
（３）第１レプリキンペプチドと相同であるが、アミノ酸の場合、アミノ酸置換はヒスチジン残基において行われない、インフルエンザウイルスの第２株における第２レプリキンペプチドを識別するステップと、
（４）第２レプリキンペプチドと相同であるが、アミノ酸置換は第１レプリキンペプチドにおけるアミノ酸置換と同位置で行われる、インフルエンザウイルスの第３株における第３レプリキンペプチドを識別するステップと、
（５）インフルエンザウイルスの第３株が、インフルエンザウイルスの第２株において高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すことを判断するステップと、
（６）インフルエンザウイルスの第１株が、インフルエンザウイルスの第２株において高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すことを予測するステップと、を含む。
【０１４２】
本方法の好適な実施形態において、アミノ酸置換はリジン残基またはヒスチジン残基において行われない。レプリキンアルゴリズムは、第１、第２および第３レプリキンペプチドのそれぞれにおいて満たされる必要がある。
【０１４３】
本発明は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離したインフルエンザレプリキンペプチドをさらに提供する。
【０１４４】
ＶＩＩＩ．エビ白点ウイルスにおける相同性骨格配列
本発明者は、レプリキンについて現在までに調査されたすべてのその他ウイルスおよび有機体と比較して（マラリアを除く）、白点エビウイルスが異常に高いレプリキン数を有することをさらに発見した。レプリキンは、真菌、イースト、ウイルス、細菌、藻類において急速な複製を基本的に伴うことが示されているが、本発明者は、藻類以外の海洋有機体におけるレプリキンの存在を始めて示した。また藻類についても、レプリキンの存在が急速な蔓延に関連する。エビにおいて、最初は東洋諸国で、また現在では西半球の国々でも白点ウイルスがエビの捕獲量に何百万ドルもの損害を与えている。現時点で有効な予防または治療はない。レプリキン高死亡率海洋ウイルス性疾患のその他の例は、コイ等の魚、サケの出血性疾患において見られ、海洋生態系および疾患に広まる可能性がある。
【０１４５】
エビ白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）のヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキンの反復配列の存在は、異常に高いレプリキン数１０３．８の要因である。このウイルスレプリキン数は、例えば、通常１未満〜最大５または７の範囲であるインフルエンザウイルスのレプリキン数よりはるかに高く、熱帯熱マラリア原虫（マラリア）に見られる（今までのところ）記録的なレプリキン数１１１のみに匹敵する。興味深いことに、エビ白点症候群の有機体はウイルスであり、熱帯熱マラリア原虫の場合はトリパノソームであるが、エビ（白点ウイルス）またはヒト（マラリア）にかかわらず、どちらも赤血球、異常な宿主細胞におけるそれらの繁殖サイクルの重要部分を費やし、電撃性の急速に複製する疾患であって宿主細胞の高い死亡率を伴い、またどちらも高いレプリキン数をそのような記録的に高い値まで増加する同一の方法、つまりレプリキン反復およびレプリキン重複を使用すると考えられる。
【０１４６】
本発明者は、ウイルスのレプリキン骨格部分における毒性インフルエンザウイルスと白点ウイルスとの関係も確立した。これら２つのウイルスの関係はこれまで示唆されていない。広範な置換が存在するが、エビ白点症候群ウイルスの幾つかの短鎖レプリキンに関する本出願人の発見は、特に長さおよびキーリジン（ｋ）ならびにヒスチジン（ｈ）残基（固定骨格またはレプリキン骨格）に関して、インフルエンザウイルスレプリキン配列に対する著しい相同性を示し、両ウイルス群において、同様のレプリキン産生機序が使用されることを示唆する。
【表２】
【０１４７】
さらに、ブタおよび鳥類を含むがそれらに限定されない多くの種は、ヒトインフルエンザ感染の動物「保有宿主」を提供することが知られているため、現在、エビウイルス等の海洋形態を検査することができ、ブタインフルエンザおよび鳥インフルエンザ等の流行に対する初期警告診断的利点を有する。一部インフルエンザウイルスの類似性が種の間で認められており、これらウイルスの種間転移が知られているが、ウイルスの活性を図る定量方法はこれまでにない。これまで、異なる種に移動する可能性のある保有宿主の活性の増加を評価すること、よって事前の警告を出すことは不可能であった。現在、各種におけるレプリキンの活性について、ウイルス複製速度の増加およびその他の種に転移する可能性のある種におけるエピデミックの出現の証拠を常に監視することができる。
【０１４８】
このデータは、独自の歴史およびその宿主細胞の急速複製および疾患の共有機能を有する新種のペプチドとしてレプリキンをさらに指示する。そのエビ宿主細胞に対する高い死亡率を伴う白点症候群ウイルスは、現在そのレプリキンをウイルスレプリキンの初期形態、または類似形態学的分岐として評価した。いずれかの場合において、インフルエンザウイルスの場合のように、鳥および動物レプリキンの保有宿主として良好に作用する。エビにおけるこれらレプリキン発見を診断および予防に使用することは、インフルエンザおよびレプリキンを含むその他の有機体に対する診断および予防に使用する場合と同様に行う。
【０１４９】
ＩＸ．１９１８年パンデミックに遡るＳＡＲＳウイルスおよびＨ３Ｎ２‐ＦＵＪＩＡＮインフルエンザウイルスレプリキンにおける相同配列
特定のＳＡＲＳウイルスレプリキンペプチドは、ガチョウレプリキンと相同であるレプリキン骨格配列との相同体を含むインフルエンザウイルス分離株の幾つかの株におけるペプチドと相同体を共有する。相同体は、２，０００万人もの死をもたらした１９１８年インフルエンザパンデミックの株における配列に遡る２００６年毒性インフルエンザ株から拡大する。
【０１５０】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、２００２年〜２００３年インフルエンザシーズンにおいて最初に出現した。インフルエンザＧＲおよびコロナウイルスレプリキン（または一部の不明な共有前駆体）から得たＳＡＲＳレプリキンの２００２年における二重複製期限は、すべて２００２年に発生した以下の事象により示唆される。１）８５年間で初めての縮合は、ＧＲ‐Ｈ１Ｎ２レプリキン配列が２９から２８アミノ酸になったことに見られる（表３）（現行エピデミックにおける２９〜２７アミノ酸から得たＨ３Ｎ２Ｆｕｊｉａｎにおいて同様の縮合が見られた（表３））。２）ＧＲ‐Ｈ１Ｎ２のレプリキン数は、Ｈ１Ｎ２から移動するＧＲに一致して顕著な減少を示した。３）コロナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質のレプリキン数は、顕著な増加を示した。４）以下のモチーフを含むレプリキンを持つＳＡＲＳコロナウイルスが２００２年〜２００３年に出現した。ＧＲ １９１８およびＧＲ‐Ｈ１Ｎ２ ２００１に既に見られる「ｋｋｇ」および「ｋ‐ｋ」；インフルエンザＧＲ‐Ｈ１Ｎ２ ２００１に見られる「ｋ‐ｋｋ、「ｋｋ」および「ｋｌ」；鳥類気管支炎コロナウイルスレプリキンに見られる「ｋｋ」；およびブタエピデミック下痢コロナウイルスのレプリキンに見られる「ｋｋ‐ｋｋ‐ｋ」、「ｋ‐ｋ」、「ｋｋ」、「ｋｌ」および「ｋｔ」（表３）。
【表３】
【０１５１】
１９１７年ガチョウレプリキンの存在を含む、近年の増加的に高いレプリキン数のピークは、現在Ｈ１Ｎ２（表３）において、１９１７年のレプリキン数に近づいており、来るべきパンデミックの警告となりうる。ＳＡＲＳウイルスおよびＨ３Ｎ２‐Ｆｕｊｉａｎウイルスは、高い死亡率に関連すると思われるガチョウレプリキン（図１７）の短いレプリキン派生物の現行キャリアであるため、既に始まっている可能性がある。
【０１５２】
ガチョウレプリキンは少なくとも８５年の歴史を持ち、インフルエンザおよびＳＡＲＳのＡ株の大部分またはすべてに関与するため、レプリキン自体およびその構成要素は、パナマ型保護に対する保存されたワクチン候補である。７〜２１アミノ酸長、ガチョウと比較してリジンおよびヒスチジン％の豊富な縮合型短鎖ＳＡＲＳレプリキンは、２９アミノ酸長のガチョウレプリキンの死亡率（２．５％）と比較して、ＳＡＲＳの高い死亡率（１０〜５５％）と関連して発生した。ＳＡＲＳにおける長鎖レプリキンとここで混合された短鎖レプリキンは、高い死亡率に関与する可能性がある。これは、エボラおよび天然痘ウイルスならびに炭疽菌等のその他の有機体のレプリキンの場合も同様である（表３）。これらの短鎖ＳＡＲＳレプリキンは、一層高い未治療死亡率に関連する天然痘、炭疽菌、およびエボラ等のその他有機体の短鎖レプリキンと驚くべき相同性を示した（表３）。インフルエンザレプリキンを用いたＳＡＲＳコロナウイルス相同体におけるレプリキンの検出により、ワクチンの小型ＳＡＲＳ抗原の合成を可能にした。
【０１５３】
短鎖合成ワクチンは、はるかに短期間で安価に産生することができ、一般に現行の全体ウイルスワクチンにおける数千の望ましくないタンパク質の複数のエピトープにより引き起こされる感染および免疫干渉に付随する副作用を回避するはずである。短鎖グリオーマレプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」は、合成物質のための良好なベースとなることが立証された。米国特許番号６，２４２，５７８を参照のこと。これは、癌細胞に対する細胞毒性を有する抗マリグニン抗体をピコグラム／細胞で産生し、癌患者の生存と量的に関連する。われわれは、ヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質において認められる５つのＳＡＲＳ短鎖レプリキンを合成した。例６を参照のこと。これらの合成短鎖ＳＡＲＳレプリキンをウサギに注射した場合、大量の特定抗体を産生した。例えば、２１アミノ酸ＳＡＲＳヌクレオキャプシドレプリキン抗体は、１：２０４，８００を越える希釈で結合する。様々な小ペプチドを用いて、天然痘ワクチンにおいて見られるように、総タンパク質または数千のタンパク質、あるいは核酸の使用により生じる望ましくない副作用のない強い免疫反応を得るための試みが以前に他者により行われたが、失敗に終わっているため、小型合成レプリキン抗原が強い免疫反応を実現する能力は、これらのＳＡＲＳワクチンの有効性にとって重要である。
【０１５４】
図１７に示されるような結果を用いて、インフルエンザおよびＳＡＲＳウイルスにおけるレプリキン構造と高い死亡率との関連を評価した。高い死亡率と短鎖または縮合レプリキン配列との関連は、図１７のセクションＢに示される高死亡率の有機体、インフルエンザおよびＳＡＲＳ以外のウイルス、および細菌、マラリアおよび癌において見られる。レプリキン構造の統一概念、および任意の細胞型または感染性有機体ではなく、レプリキンと急速複製との関連に関する統一概念の裏付けとして、流布および毒性に複製が重要となる広範囲のウイルス、細菌、マラリアおよび癌有機体における基本的レプリキン構造の普及に加えて、以下の相同配列が認められている。１位および２位における「ｋ」に注目する。取り込みまたは急速複製を刺激するためＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他のレセプタあるいはリガンドに提示する「ｋ」の配列に注目する。「二重ｋ」および「複数ｋ」の頻度に注目する。最も縮合短縮されたレプリキンの３位における「ｇ」の頻度および三重項「ｋｋｇ」、「ｈｅｋ」、「ｈｄｋ」、および「ｈｋｋ」の発生に注目する。このレプリキンは、天然痘ウイルス、炭疽菌ウイルス、ラウス肉腫、および多形性グリア芽腫（グリオーマ）、大腸癌および乳癌におけるｃ‐ｓｒｃ、メラノーマおよび大腸癌におけるｃ‐ｙｅｓを含む最高の死亡率を持つ有機体、癌細胞、および遺伝子に関連する。オーストラリアおよび東南アジアにおいて２つの近年出現した高死亡率ウイルスであるニパウイルスおよびヘンドラウイルスのほぼ同一レプリキン構造にも注目する。これら２つのウイルスは、それらに対して形成された類似または同一の抗体を有することが報告されているが、その構造的ベースについてはこれまで知られておらず、われわれがこの類似抗体に対する２つのほぼ同一レプリキンを発見した。
【０１５５】
また表３は、われわれが発見した２００３年の５つのＳＡＲＳレプリキンと、１９１７年インフルエンザガチョウレプリキンおよび２つのコロナウイルス（鳥類気管支炎コロナウイルスおよびブタエピデミック下痢ウイルス）との関連を示す。表３および図１７における最初の２００３年ヒトＳＡＲＳレプリキンは、２００２年におけるインフルエンザＨ１Ｎ２の中間構造による、１９１７年インフルエンザガチョウレプリキンおよびヒト１９１８年レプリキンに対する特定の配列相同性を示す（例えば、１位、１８位および１９位におけるレプリキン「ｋ」を参照）。１９１７年ガチョウレプリキン配列は、表３および図１７において、１９９９年におけるレプリキンの定義に重要ではないアミノ酸に多くの置換があるにもかかわらず、大部分が保存されていることを示す（置換はイタリック体で示される）。次に、元の２９アミノ酸１９１７年レプリキン配列は、２００１年Ｈ１Ｎ２レプリキンにおける１９１７年〜１９１８年のその構造にほぼ正確に回復されたことが分かった。しかし、２００２年Ｈ１Ｎ２インフルエンザレプリキンは、２９から２８アミノ酸に短縮され、アミノ酸ｋｅｖｌ（ｉ／ｖ）ｗｇ（ｖ／ｉ）ｈｈが「左にシフト」したことがはっきりと証明される。
【０１５６】
２００３年に１つのレプリキンが、最初にリストされる２００３年ヒトＳＡＲＳウイルスの２１アミノ酸レプリキンにさらに短縮（または小型化）された。２００３年ＳＡＲＳレプリキンにおけるｋの割合（％）は、ガチョウレプリキンおよび１９１８年ヒトパンデミックレプリキンの２０．７％と比較して、現在３８．１％（８／２１）である。インフルエンザ２９アミノ酸レプリキンと比較して、３つのＳＡＲＳレプリキンが、さらに１９、１１および９アミノ酸長配列にそれぞれ短縮（または小型化）されたことが認められた。図に示されるＳＡＲＳ９アミノ酸配列におけるｋの割合（％）は４４．４％（４／９）である。ＳＡＲＳレプリキンの短縮に関して、ヒトにおけるＳＡＲＳ死亡率は、１９１８年インフルエンザパンデミックにおける２．５％と比較して、若年層において１０％、老年層において５５．５％まで上昇した。
【０１５７】
アミノ酸配列を表３に示し、相同の程度およびインフルエンザレプリキンの８５年間（１９１７年〜２００２年）にわたる保存を強調表示する。１９１７年ガチョウレプリキンにおいてその証拠が最初に認められた。そのような保存は、これまで認められていない。また表３は、２００３年ヒトＳＡＲＳウイルスにおけるレプリキンが、最初に１９１７年ガチョウレプリキンとして、また１９１８年ヒトパンデミックインフルエンザレプリキンとして出現したインフルエンザレプリキンに対する相同性を有することに加え、コロナウイルス鳥類気管支炎ウイルスレプリキン（例えば、１位および２位が「ｋ」であり、「ｈ」で終端する）およびコロナウイルス急性下痢ウイルスレプリキン（例えば、レプリキンの１位および１１位が「ｋ」であり、末端が「ｈ」である）の両方に対して特定の配列相同性があることを示す。インフルエンザおよびコロナウイルスレプリキンの両方に関連するというこの証拠は、幾つかの最近のインフルエンザエピデミックおよび以前のパンデミックと同様に、ＳＡＲＳが香港で発生し、ＳＡＲＳウイルスが、ヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質を含むその構造に一部起因して新規コロナウイルスとして分類されていることからも興味深い。ＳＡＲＳがヒトにおいてエピデミック肺炎として最初に出現したことについては、特定の疫学的証拠も関連している。このエピデミック肺炎は、込み合った香港のアパートで勃発した。そこでは糞便汚水の激しい逆流があり、それが換気扇により空中に浮遊した。
【０１５８】
Ｘ．インフルエンザワクチン、治療および治療薬
本発明は、任意の１つ以上の上述の単離した配列、または任意の１つ以上の上述の単離した配列の任意の抗原部分列、あるいは上述の単離した配列またはそれらの部分列のいずれかに結合する抗体を含むワクチンも提供する。
【０１５９】
現在、インフルエンザ用ワクチン製剤は、ＷＨＯおよびＣＤＣの国際会議において毎年２回変更されている。ワクチン製剤は、世界の所定地域におけるインフルエンザウイルス株の最近の優勢に関する血清学的証拠に基づく。しかし、本発明に先立って、インフルエンザウイルス株に特異的なアミノ酸配列の変化と、インフルエンザエピデミックまたはパンデミックの発生との関連付けはなかった。
【０１６０】
インフルエンザウイルスタンパク質における特定レプリキンおよびその濃度を観察することにより、インフルエンザパンデミックおよびエピデミックに関する第１の特異的な量的初期化学的関連が提供され、特異的に調整されたインフルエンザワクチンを産生して適時投与することにより、世界の特定地域において流行しているインフルエンザウイルスの出現株または再出現株を治療することができる。インフルエンザウイルス株の分離株のタンパク質配列、例えば血球凝集素タンパク質配列について、レプリキンの存在、濃度および／または保存を分析することにより、インフルエンザウイルスパンデミックおよびエピデミックを予測できる。さらに、そのようなインフルエンザ流行の重大性は、最も豊富にあることが認められたレプリキン配列または所定の期間、例えば約１〜約３年にわたってウイルス分離株中で上昇傾向にあるレプリキン配列に基づいたインフルエンザペプチドワクチンを投与することにより、著しく低減できる。
【０１６１】
本発明のインフルエンザペプチドワクチンは、単一のレプリキンペプチド配列を含んでもよく、またはインフルエンザウイルス株において見られる複数のレプリキン配列を含んでもよい。好ましくは、ペプチドワクチンは、所定の期間にわたって濃度の増加が見られ、少なくともその期間は保存されるレプリキン配列に基づく。
【０１６２】
例えば、好適なワクチンは、レプリキン骨格の一部材であるレプリキン配列を含んでもよい。レプリキン骨格配列とインフルエンザウイルスの高い毒性株との関連性と併せて、レプリキン骨格の高い保存性により、レプリキン骨格配列は合成ワクチンに好適な配列となる。ガチョウレプリキン骨格の一部材は、ウサギおよび鶏に皮下投与された場合に強い免疫反応を提供するために有効であることが証明された。例７を参照のこと。
【０１６３】
本発明のワクチンは、新規のレプリキンペプチドと併せて保存レプリキンペプチドを含んでもよく、または新規のレプリキンペプチド配列に基づいてもよい。レプリキンペプチドは、化学合成または組み換え遺伝子技術を含む任意の方法で合成することができ、レプリキン配列のみを含むペプチドに基づくワクチンが好ましいが、非レプリキン配列を含んでもよい。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容しうるキャリアおよび／またはアジュバントを含んでもよい。
【０１６４】
本発明のインフルエンザワクチンは、単独で、またはガンシクロビル；インターフェロン；インターロイキン；アマンタジン、リマンタジン等のＭ２阻害剤；ザナミビルおよびオセルタミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤等の抗ウイルス薬と併用して、および抗ウイルス薬の組み合わせとともに投与することができる。
【０１６５】
本発明のインフルエンザワクチンは、免疫反応において抗体を産生できる任意の動物に投与してもよい。例えば、本発明のインフルエンザワクチンは、ウサギ、鶏、ブタ、またはヒトに投与されてもよい。本発明のインフルエンザワクチンは、一連のインフルエンザ株または特定のインフルエンザ株に配向されてもよい。
【０１６６】
本発明に従う非限定的側面において、インフルエンザワクチンは、インフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２、（Ａ）Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１を含むインフルエンザの動物またはヒト株、またはその後に生じる可能性のあるウイルスの任意のヒト変型、および現行の鳥類Ｈ５Ｎ１等の主に動物に見られるインフルエンザ株に対する免疫反応を対象としてもよい。インフルエンザワクチンは、インフルエンザタンパク質の任意の一部における特定のレプリキンアミノ酸配列をさらに対象としてもよい。ＵＴＯＰＥ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＨに共有結合したＨ５Ｎ１ウイルスのレプリキン骨格ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含むインフルエンザワクチンおよびよく知られたキーホールリンペットシアニンンアジュバントは、鶏およびウサギにおいて強い免疫反応を提供した。例７を参照のこと。
【０１６７】
本発明の非限定的実施形態は、レプリキン骨格配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨを含むインフルエンザワクチンを提供する。［Ｓ］は、インフルエンザウイルスの第２株と比較して置換される以外はほぼ同一のレプリキンペプチド配列を含む任意のアミノ酸であってもよい。好適な実施形態において、［Ｓ］は疎水性アミノ酸であってもよい。さらに好適な実施形態において、［Ｓ］はメチオニンまたはイソロイシンであってもよい。一層好適な実施形態において、上記で具体化された配列は、インフルエンザのＨ５Ｎ１株から単離された配列である。
【０１６８】
さらに非限定的な側面において、インフルエンザワクチンは、ＫＫＫＫＨまたはＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨ等のＵＴＯＰＥを含んでもよい。さらなる代替例において、ワクチンは、本明細書で‐ＫＬＨと表示される、よく知られたキーホールリンペットヘモシアニン等のアジュバントの追加を含んでもよい。さらに好適な非限定的側面において、インフルエンザワクチンは、２つのＵＴＯＰＥ、およびＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＭＷＧＩＨＨ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨまたはＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＩＷＧＩＨＨ ＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ等のアジュバント配列をさらに含むインフルエンザＨ５Ｎ１のレプリキン骨格を含んでもよい。本発明の側面は、以前に単離され、表１において「２００４年 Ｈ５Ｎ１ベトナム、高い病原性」または「２００６年 インドネシア、高い病原性」と標識される鳥インフルエンザレプリキンの１つとして示されるレプリキン骨格配列を含んでもよい。
【０１６９】
１００μｇのペプチドから成るワクチンをウサギおよび鶏に皮下注射により投与することにより、１：５０未満のワクチン接種を受けていない希釈物からの抗体反応は、ワクチン接種後３〜４週間で、１：１２０，０００の希釈から１：２４０，０００を越えるピークに達することが予測される。
【０１７０】
グリオーマレプリキン（配列番号：＿）「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」またはＣ型肝炎レプリキン（配列番号：＿）「ｈｙｐｐｋｐｇｃｉｖｐａｋ」等のレプリキン、あるいは（配列番号：＿）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」または（配列番号：＿）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」等のＨＩＶレプリキンに基づく合成レプリキンワクチン、または好ましくは所定の期間にわたって保存される、および／または出現または再出現するレプリキンに基づくインフルエンザワクチンを使用し、抗体濃度を増加させて、ウイルス感染した細胞をそれぞれ溶解し、ウイルスを細胞外に放出して化学療法が有効になるようにしてもよい。
【０１７１】
レプリキンフラグメントを認識および結合することにより、細胞の破壊をもたらす抗体の誘導を目的とする場合は、特定のレプリキン構造のみを利用することが好ましい。大型タンパク質配列は、「複製関連機能」を有することが当業者に知られているが、大型タンパク質を使用するワクチンは失敗するか、または有効でないことが分かる場合が多い。
【０１７２】
本発明者は単一の理論に固執することを望まないが、本明細書における研究は、先行技術のワクチンが、大型タンパク質配列の使用に基づくため効果がないこと、つまり抗体の形態で適切な免疫反応および／または細胞性免疫を産生できず、保護能がないことを示唆する。大型タンパク質配列は、常に１つ以上のエピトープ（特定の抗体形成を誘導できる独立した抗原配列）を有し、レプリキン構造は、通常これらの可能なエピトープのうちの１つを含む。その他のエピトープが大型タンパク質に存在することは、免疫系に無関係の抗原刺激を「大量に送り込む」ことによって、レプリキン抗原を阻止する可能性があり、レプリキンに対する抗体の適切な形成が妨害される場合がある。このよく知られた抗原優位現象に関する議論については、例えば、Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９７（２）：１７７‐１８３（１９６６）、およびＷｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３４：４８‐５８，１９７６、Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４２１‐４２２（１９９８）を参照のこと。この抗原優位現象によって、免疫系により提示および認識される第１ペプチドエピトープがその後広まり、その他のペプチドエピトープが同時に提示されるが、それに対する抗体が形成される。これは、ワクチン形成において、有機体からのその他のエピトープを提示する前に、定常レプリキンペプチドを最初に免疫系に提示することによって、レプリキンが先取されず免疫記憶に残るようにすることが重要である別の理由である。
【０１７３】
レプリキンワクチンに対する初期反応の量的測定
数日または数週間におけるレプリキンワクチンに対する初期特定抗体反応を量的に測定する能力は、臨床反応が数ヶ月または数年後にしか測定できないその他のワクチンに優る主要な実践的利点である。
【０１７４】
アジュバント
様々なアジュバントを使用し、宿主細胞種に応じて、免疫学的反応を強化してもよい。例えば、フロインド（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーリンペットヘモシアニン、ジントロフェノール、およびＢＣＧ、ホルマリン死菌体（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。それらにおける合成ＵＴＯＰＥのワクチン使用に加えて、ＵＴＯＰＥをその他レプリキンワクチンおよび非レプリキンワクチンに対するアジュバントとして使用できる。
【０１７５】
ＵＴＯＰＥＳ
ｋの割合（％）が高いレプリキンは、ウサギに投与された場合に最も高い抗体反応を生成することが示された。本発明者が設計したこれらの合成ペプチドは、万能合成エピトープ、または「ＵＴＯＰＥ」と指定し、これらのＵＴＯＰＥに基づくワクチンは「ＵＶＡＸ」と称される。推定合成ワクチンであるＵＶＡＸは、単一ワクチン、またはより特異的なレプリキンワクチンまたはその他ワクチンと併用投与されるアジュバントとして使用してもよい。以下は、推定ＵＴＯＰＥおよびＵＶＡＸの例である。
考案した合成レプリキン 配列番号：
（ＵＴＯＰＥまたはＵＶＡＸ）
ＫＫＫＫＨＫ ＿＿＿
ＫＫＫＨＫＫ ＿＿＿
ＫＫＨＫＫＫ ＿＿＿
ＫＨＫＫＫＫ ＿＿＿
ＫＫＫＫＫＫＨ ＿＿＿
ＫＫＫＫＫＨＫ ＿＿＿
ＫＫＫＫＨＫＫ ＿＿＿
ＫＫＫＨＫＫＫ ＿＿＿
ＫＫＨＫＫＫＫ ＿＿＿
ＫＨＫＫＫＫＫ ＿＿＿
ＨＫＫＫＫＫＫ ＿＿＿
【０１７６】
レコグニンおよび／またはレプリキンペプチドを対象に投与し、対象の免疫系を誘導して抗レプリキン抗体を産生してもよい。一般的に０．５〜約２ｍｇ用量、好ましくは各ペプチドの１ｍｇ用量を対象に投与し、免疫反応を誘導する。必要に応じて、後次の用量を投与してもよい。
【０１７７】
置換の識別はワクチンの初期開発を提供する
以前の卵および細胞に基づくインフルエンザワクチンの生成方法は、望ましくない副作用を生じる可能性のある数千もの不要なタンパク質を含み、生成に６〜９ヶ月以上かかり、試験にさらなる時間を要した。ＦｌｕＦｏｒｅｃａｓｔ（登録商標）は、現在、エピデミックまたはパンデミックが到来しつつあるという株特異性警告を１〜３年先行して行うことが可能である。またキーレプリキンおよび置換アミノ酸「Ｓ」の発見により、より正確で潜在的に安全な合成ワクチンを短期間、つまり数日以内に調整して試験することができる。
【０１７８】
Ｈ５Ｎ１ガチョウレプリキンにおけるＳ置換の識別は、Ｈ５Ｎ１におけるＳ置換から生じる将来のヒトパンデミックに対するワクチンの開発用の標的を熟練者に提供する。ワクチンは、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨの任意の一部を含んでもよく、２４位におけるＳ置換（末端ヒスチジンから５残基目）は、任意のアミノ酸置換を表す場合がある。好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外のアミノ酸を表す。より好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸を表す。さらに好適な実施形態において、置換はメチオニンまたはイソロイシンを表す。１つの非限定的ワクチン実施形態は、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸を含む。別の非限定的実施形態において、ワクチンは配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸を含む。代替として、本ワクチンはキーリンペットヘモシアニン等のアジュバントまたはその他のアジュバント、および／またはＫＫＫＫＨＫ等のＵＴＯＰＥあるいは任意のその他のＵＴＯＰＥを含んでもよい。別の非限定実施形態において、配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨの７〜２９アミノ酸抗原部分列に対する抗体も考慮される。本発明のレプリキン骨格またはレプリキン配列の約７〜約２９アミノ酸を有する任意の抗原部分列は、ワクチンおよび抗体を産生するための免疫系の刺激を考慮する。
【０１７９】
配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｓ］ＷＧＩＨＨのすべてまたは任意の一部に対する抗体は、当業者により開発されてもよい。特に２４位を含むエピトープに配向された抗体も同様に、当業者により開発されてもよい。好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外のアミノ酸を表す。より好適な実施形態において、Ｓ置換はロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸を表す。さらに好適な実施形態において、Ｓ置換はメチオニンまたはイソロイシンを表す。例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ（Ｍ／Ｉ）を含む配列のすべてまたは任意の一部に対する抗体は、当業者により開発されてもよい。
【０１８０】
Ｓ置換を有するガチョウレプリキンに対する抗体を使用し、配列に対する抗体を持つＨ５Ｎ１感染を治療するか、または鳥、動物、またはヒトにおけるＨ５Ｎ１の毒性感染を診断してもよい。
【０１８１】
現在までに試験されたすべてのレプリキン配列は、免疫原生特性を示している。マリグニンから得た１６‐ｍｅｒレプリキンをウサギに注射したところ、１６‐ｍｅｒレプリキンに特異的な抗体が産生された。米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例６および図９Ａおよび９Ｂ、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオキャプシド、スパイクおよびエンベロープタンパク質において認められたＳＡＲＳレプリキンを合成し、ウサギで試験した。免疫反応を定量した。例６を参照のこと。本発明者は、表１において「２００４ Ｈ５Ｎ１ ベトナム、高い病原性」と標示されるＨ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」レプリキンの２９アミノ酸レプリキン骨格から４１アミノ酸レプリキン配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ指定のワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を、２つのＵＴＯＰＥ単位（ＫＫＫＫＨＫ）をＨ５Ｎ１骨格のＣ末端に追加し、２つのＵＴＯＰＥ単位のＣ末端上で共役結合した追加のアジュバント（キーホールリンペットヘモシアニン（‐ＫＬＨと記す）を追加して設計した。１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギおよび鶏に皮下注射した。抗体反応をワクチン接種前および注射から１週間〜８週間後に測定した。抗体反応は１週間で認められ、ワクチン接種から３〜４週間後にピークに達した。ピーク抗体反応は、１：１２０，０００の希釈〜１：２４０，０００を越える希釈の範囲であった。当業者は、本明細書に記載のレプリキン配列およびレプリキン骨格配列それぞれに対する抗体を開発してもよい。
【０１８２】
レプリキンヌクレオチド配列
レプリキンＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス、細菌またはその他のレプリキンコード化物質の感染に起因する疾患を診断するための使用法を多数有する可能性がある。例えば、レプリキンヌクレオチド配列は、原位置で加水分解アッセイを含む、生検組織または血液の加水分解アッセイ、例えばサザンまたはノーザン分析において使用し、例えば、組織標本または環境標本における特定有機体の存在を診断してもよい。また本発明は、関心の特定病原体に存在する特定レプリキンに特異的な抗体を含む、または特定のレプリキン、および任意に診断に必要な様々なバッファおよび／または試薬に対して特異的に加水分解する核酸分子（センスまたはアンチセンス）を含むキットについて考慮する。
【０１８３】
また、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびレプリキン‐またはレコグニン含有ｍＲＮＡの翻訳を抑制するよう機能するリボザイムを含むオリゴリボヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子およびリボザイムはどちらも、当該技術分野において知られる任意の方法で調整されてもよい。アンチセンス分子は、多様なベクターに組み込んで対象に送達することができる。熟練した医師であれば、最適な送達経路を決定できるが、一般にｉ．ｖ．（静脈内）またはｉ．ｍ．（筋肉内）送達が通常である。用量も容易に解明できる。
【０１８４】
特に、好適なアンチセンス核酸分子は、例えば、インフルエンザウイルスポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに含まれるレプリキン配列に相補的である。本レプリキン配列は、７〜約５０のアミノ酸から成り、（１）第２リジン残基から６〜１０残基にある少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％のリジン残基と、を含む。より好ましくは、遺伝子のコード鎖に存在するレプリキン、またはインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質をコード化するｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子である。本アンチセンス核酸分子は、６ヶ月から１年以上の期間保存されることが示された、および／またはその他のインフルエンザウイルス株のレプリキン濃度と比較して、高いレプリキン濃度を有することが示されたインフルエンザウイルスの株に存在するレプリキンをコード化するヌクレオチド配列に相補的である。レプリキン濃度の増加は、好ましくは少なくとも６ヶ月、より好ましくは約１年、最も好ましくは約２〜３年以上かけて発生する。
【０１８５】
同様に、ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンス核酸分子は、（１）第２リジン残基から６〜１９残基にある少なくとも１つのリジン残基と、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基と、（３）少なくとも６％リジン残基と、を含む７〜約５０アミノ酸のレプリキン配列を含むレプリキンをコード化するｍＲＮＡに相補的である。より好ましくは、遺伝子のコード鎖、またはウイルスのタンパク質をコード化するｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンス核酸分子である。
【０１８６】
ＸＩ．コンピュータ
本発明は、コンピュータを使用してインフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法も提供する。レプリキンを含むインフルエンザ株の存在について、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むデータバンクをコンピュータにより走査することもできる。またインフルエンザウイルスの新生株を予測するための要件を満たすレプリキン骨格ペプチドは高い毒性を持つ。
【０１８７】
図２は、本発明の前述の実施形態と併用するために入手可能なコンピュータのブロック図である。コンピュータは、プロセッサ、入出力装置、および前述の実施形態の毒性予測方法を表す実装可能なプログラム指示を格納するメモリを含んでもよい。メモリはスタティックメモリ、揮発性メモリ、および／または非揮発性メモリを含んでもよい。スタティックメモリは、磁気的、または電気的あるいは光学的保存媒体で提供される従来の読み取り専用メモリ（「ＲＯＭ」）であってもよい。揮発性メモリは、従来のランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）であってもよく、またプロセッサ内にキャッシュとして集積されるか、または個別の集積回路としてプロセッサ外で提供されてもよい。非揮発性メモリは、電気的、磁気的または光学的保存媒体であってもよい。
【０１８８】
以下の例は本発明のみを説明することを意図し、本明細書で提供される本発明の全範囲を限定しない。当然のことながら、本発明の修正および変型は上述の教示により包含され、本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく添付の請求項の範囲に含まれる。
【０１８９】
実施例１
レプリキンの抽出、単離、および識別の過程、およびレプリキン含有有機体を標的、標識または破壊するためのレプリキンの使用
ａ）藻類
バミューダ水地から以下の藻類を収集し、同日に抽出するか、または−２０℃で凍結し、次の日に抽出した。中性バッファにおける１ｇアリコート、例えば１００ｃｃの０．００５Ｍリン酸バッファ溶液ｐＨ７（「リン酸バッファ」）中の藻類を冷室（０〜５℃）において１５分間、ワーリングブレンダで均質化し、３０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄みを蒸発により濃縮し、冷たいリン酸バッファに対して透析することにより約１５ｍｌ量を産生した。この抽出液の量を記録し、タンパク質分析用に得られたアリコートおよび残渣を分別して、１〜４のｐＫ範囲を有するタンパク質留分を得た。
【０１９０】
分別の好適な方法は、以下のクロマトグラフィである。抽出溶液を冷室（４℃）において、０．００５Ｍリン酸バッファで平衡されたＤＥＡＥセルロース（Ｃｅｌｌｅｘ‐Ｄ）カラム２．５ｘ１１．０ｃｍ上で分別する。溶離溶媒の段階的な変化は、以下の溶液を用いて行った。
溶液１‐４．０４ｇのＮａＨ２Ｐ０４および０．５ｇのＮａＨ２Ｐ０４を１５リットルの蒸留水（０．００５モル、ｐＨ７）に溶解する。
溶液２‐８．５７ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４８０ｍｌの蒸留水に溶解する。
溶液３‐１７．１ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４８０ｍｌの蒸留水に溶解する（０．０５モル、ｐＨ４．７）。
溶液４‐５９．６５ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４７０ｍｌの蒸留水に溶解する（０．１７５モル）。
溶液５‐１０１．６ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４５５ｍｌの蒸留水に溶解する（ｐＨ４．３）。
溶液６‐３４０．２ｇのＮａＨ２Ｐ０４を２，４６５ｍｌの蒸留水に溶解する（１．０モル、ｐＸ‐ｉ４．１）。
溶液７‐２８３．６３ｇの８０％リン酸（Ｈ３Ｐ０４）を２，４６０ｍｌの蒸留水中で形成する（１．０モル、ｐＨ１．０）。
【０１９１】
６〜１０ｍｌ量の抽出液をカラムに移し、溶液１と重ねた。また３００ｍｌの溶液１の容器を取り付け、重力によりカラム上に滴下させた。３ｍｌアリコートの溶離剤を収集し、溶液１で除去されるすべてのタンパク質がカラムから除去されるまで、ＯＤ２８０におけるタンパク質含有量について分析した。次に溶液２をカラムに適用し、各溶液で除去可能なタンパク質がすべてカラムから除去されるまで、溶液３、４、５、６および７を連続して適用する。溶液７からの溶離剤を複合し、リン酸バッファに対して透析し、透析液および透析物に関するタンパク質含有量を特定し、両者をゲル電気永動により分析した。３，０００〜２５，０００ダルトン分子量のペプチドまたはタンパク質の１つまたは２つのバンドを溶液７において取得する。例えば、溶液７においてにおいて示された藻類のＣａｕｌｅｒｐａ ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌａｕｒｅｎｃｉａ ｏｂｔｕｒａ、Ｃｌａｄｏｐｈｅｘａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｎａｔａｎｓ、Ｃａｕｌｅｒｐａ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ、Ｈａｌｉｍｅｄａ ｔｕｎａ、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｏｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓはすべて、上述のような抽出および治療後に、感染のないこのモル重量領域において明らかなペプチドバンドを溶離する。これらの溶液７タンパク質またはそれらの溶離されたバンドを加水分解し、アミノ酸組成物を特定する。そのようにして得られたペプチドは、６％以上のリジン組成物を含むレプリキン前駆体である。次に、アミノ酸配列に対するこれらのレプリキンペプチド前駆体を特定し、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１において詳述される加水分解および質量分析によりレプリキンを特定する。「３点認識」法により定義される基準を満たすものをレプリキンとして識別する。この手順は、イースト、細菌および任意の植物レプリキンにも適用できる。
【０１９２】
ｂ）ウイルス
ａ）藻類の場合において上述のように、同一の抽出物およびカラムクロマトグラフィ分離法を使用し、ウイルス感染細胞におけるレプリキンを単離および識別した。
【０１９３】
ｃ）腫瘍細胞の生体内および生体外組織培養
ａ）藻類の場合において上述されるような同一の抽出物およびカラムクロマトグラフィ分離法を使用し、腫瘍細胞におけるレプリキンを単離および識別する。例えば、悪性脳腫瘍から単離されたアストロシチン、組織培養中のグリオブラストーマ腫瘍細胞から単離されたマリグニン（Ａｇｌｙｃｏ ｌＯＢ）、組織培養中のＭＣＦ７哺乳類癌細胞、および組織培養中のＰ３Ｊリンフォーマ細胞のレプリキン前駆体であり、それぞれａ）リジン含有率９．１％、６．７％、６．７％および６．５％で産生されたレプリキン前駆体において上述のように治療される。米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例１０に記載のＡｇｌｙｃｏ ｌＯＢの加水分解および質量分解により、アミノ酸配列ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｉｄｅ、１６‐ｍｅｒレプリキンが産生された。
【０１９４】
実施例２
レプリキンの診断的使用の例として、Ａｇｌｙｃｏ ｌＯＢまたは１６‐ｍｅｒレプリキンを抗原として使用し、診断的目的で血清中に存在するその対応する抗体の量を獲得および定量してもよいことは、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図２、３、４および７に示される。
【０１９５】
標識、栄養または破壊の目的でレプリキンに結合する物質の産生に関する例として、ウサギに１６‐ｍｅｒレプリキンを注射し、１６‐ｍｅｒレプリキンに特異的な抗体を産生することは、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の例６および図９Ａおよび９Ｂに示される。
【０１９６】
１６‐ｍｅｒレプリキンに対する抗体を使用し、このレプリキンを含む特定細胞を標識するというレプリキンを標識する物質の使用例は、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図８および例６に示される。
【０１９７】
１６‐ｍｅｒレプリキンに対する抗体を使用し、このレプリキンを含む特定細胞を抑制または破壊するというレプリキンを破壊する物質の使用例は、米国特許６，２４２，５７８Ｂ１の図９に示される。
【０１９８】
実施例３
インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質の分離株またはノイラミニダーゼタンパク質の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。インフルエンザウイルスの分離株を取得し、インフルエンザ血球凝集素および／またはノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列を任意の当該技術分野で知られる方法、例えば血球凝集素またはノイラミニダーゼ遺伝子のシーケンシングおよびそこからタンパク質配列を派生させることにより取得する。新規レプリキンの存在、長期にわたるレプリキンの保存、および各分離株中のレプリキン濃度について、配列を走査する。レプリキン配列および濃度と、以前（約６ヶ月〜約３年前）に分離株から得られたアミノ酸配列との比較により、到来するインフルエンザシーズンにおいてインフルエンザの原因として最も可能性の高い株、および季節性インフルエンザペプチドワクチンまたは核酸ベースワクチンに対するベースを形成する株の出現の予測に使用するデータを提供する。濃度の増加の観察、特に約６ヶ月〜約３年以上にわたるインフルエンザウイルスの所定株におけるレプリキン濃度の段階的な増加は、将来のインフルエンザエピデミックまたはパンデミックの考えられる原因として、株の出現を予測する。
【０１９９】
新生株において認められたレプリキンに基づくペプチドワクチンまたは核酸ベースワクチンを生成する。長期にわたって血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ配列内のレプリキン配列の濃度が最も高く増加したインフルエンザウイルスの株として新生株を識別する。好ましくは、ペプチドまたは核酸ワクチンは、新生株に保存されることが観察された任意のレプリキン配列に基づくか、またはそれらを含む。保存レプリキンは、好ましくは血球凝集素またはノイラミニダーゼに約２年間および好ましくはそれ以上存在するレプリキン配列である。ワクチンは、新生株において識別されたレプリキン配列の任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２００】
ワクチン産生の場合、効果的なワクチンに有用であると識別されたレプリキンペプチドまたはペプチドは、任意の方法で合成される。化学合成および分子生物学技術、クローンニング、宿主細胞における発現、およびその後の精製を含む。ペプチドは、好ましくは、それに対する治療的抗体反応を誘導するために決定された量で薬学的に許容しうるキャリアと混合されてもよい。一般に、用量は約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【０２０１】
インフルエンザワクチンは、好ましくは「インフルエンザシーズン」の開始に先立って、それを必要とする患者に投与される。インフルエンザのシーズンは、一般に１０月後半に始まり、４月後半まで続く。しかし、ワクチンは、１年の任意の時期に投与してもよい。インフルエンザワクチンは毎年１回投与されることが好ましく、現在までに観察されたレプリキン配列に基づき、および好ましくはインフルエンザウイルスの新生株において保存される。インフルエンザワクチンに含めるべき別の好適なレプリキンは、１年以上欠失した後、インフルエンザの株において再出現したことが示されたレプリキンである。
【０２０２】
実施例４
コロナウイルスヌクレオキャプシドの分離株、またはスパイク、あるいはエンベロープ、乃至はその他のタンパク質の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。
【０２０３】
実施例５
熱帯熱マラリア原虫抗原の分離株の配列データをレプリキンの存在および濃度について分析することは、配列の視覚走査または本明細書に記載の３点認識法に基づくコンピュータプログラムを使用して行う。
【０２０４】
実施例６
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオキャプシド、スパイク、およびエンベロープタンパク質において認められた５つの短いＳＡＲＳレプリキンのアミノ酸配列を合成し、ウサギで試験してＳＡＲＳコロナウイルスにおけるレプリキン配列に対する免疫反応を試験した。以下のレプリキン配列を試験した：（１）２００３年ヒトＳＡＲＳヌクレオキャプシド（配列番号：＿）；（２）２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）；（３）２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）、２００３年ヒトＳＡＲＳスパイクタンパク質（配列番号：＿）；（４）２００３年ＳＡＲＳエンベロープタンパク質（配列番号：＿）；および（５）２００３年ヒトＳＡＲＳヌクレオキャプシドタンパク質（配列番号：＿）。各合成ペプチドをウサギに皮下注射した。試験したウサギは、１：１００，０００を越える希釈で結合された５つの配列それぞれに対して測定可能な特異的抗体を産生した。２１アミノ酸ＳＡＲＳヌクレオキャプシドレプリキン抗体（配列番号：＿）は、１：２０４，８００を越える希釈で結合することが示された。様々な小型ペプチドを用いて、総タンパク質または天然痘ワクチンに見られるような数千のタンパク質または核酸により生じる望ましくない副作用を伴うことなく、強い免疫反応を得るという試みが他者により行われたが、失敗に終わったため、小型の合成レプリキン抗原が強い免疫反応を獲得する能力は、ＳＡＲＳワクチンの有効性にとって重要であることが示された。
【０２０５】
実施例７
４１アミノ酸レプリキン配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ‐ＫＬＨ指定ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２は、本発明者により、表１において「２００４年Ｈ５Ｎ１ベトナム、高い病原性」と標示されるＨ５Ｎ１「鳥インフルエンザ」レプリキンの２９アミノ酸レプリキン骨格から、Ｈ５Ｎ１骨格のＣ末端上の２つのＵＴＯＰＥ単位（ＫＫＫＫＨＫ）および２つのＵＴＯＰＥ単位のＣ末端上で共有結合される追加のアジュバント（キーホールリンペットヘモシアニン（‐ＫＬＨと標示）を追加して設計された。１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギおよび鶏に皮下注射した。ワクチン接種前および注射後１週間から８週間の抗体反応を測定した。抗体反応は１週間目に認められ、ワクチン接種から３〜４週間後にピークに達した。ピーク抗体反応は、１：１２０，０００の希釈から１：２４０，０００を越える希釈の範囲であった。高結合９６ウェルプレート上で固体相（０．１μｇ／１００μｌ／ウェル）に結合されたペプチド‐ＧＧＧ（ヤギγグロブリン）を用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体タイターを特定した。まず血清を５０倍に希釈した後、さらに２倍連続希釈法で希釈した。ＥＬＩＳＡタイターの結果は、４０５ｎｍの０．２において光学密度から得られる、および連続希釈曲線の非線形回帰分析から生じた推定希釈要素から判断した。西洋ワサビペルオキシダーゼ複合２次抗体およびＡＢＴＳ置換基を使用して検出を行った（ＡＢＴＳは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ．ＧｍｂＨの登録商標である）。表４は、２羽の鶏および２匹のウサギから得られた結果を示す。ウサギＤ４５００に関する試験から得られた個別のウェル結果を表５に示す。例６に報告された結果と併せて、合計６回のウサギまたは鶏における抗体反応に関するレプリキン配列の試験において、６つの配列すべてが測定可能な抗体反応を生じ、抗原を証明した。
【０２０６】
【表４】
【０２０７】
【表５】
【０２０８】
実施例８
インフルエンザの新生毒性株は、以下の方法を使用して予測してもよい。インフルエンザウイルスの毒性株におけるレプリキン骨格の存在について、インフルエンザウイルスの分離株の配列および疫学的データを、疫学的データと合わせて、または本明細書に記載のレプリキン骨格アルゴリズムに基づくコンピュータプログラムを使用して、視覚的走査シーケンスにより分析する。
【０２０９】
単離したインフルエンザウイルスペプチドは、単離したペプチドが１６〜約３０のアミノ酸を含み、さらに、
（１）末端リジン、および任意に末端リジンに直接隣接するリジンと、
（２）末端ヒスチジン、および末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンと、
（３）別のリジンから約６〜約１０アミノ酸内にあるリジンと、
（４）少なくとも６％のリジンと、を含む場合、レプリキン骨格ペプチドであると見なされてもよい。
【０２１０】
レプリキン骨格配列を含む単離した配列を、レプリキン骨格系のその他の部材と共有および置換された配列について調べ、疫学的毒性のレベルにより比較する。疫学的毒性は、発生の程度および／または宿主死亡率％、または当業者に知られる任意の方法で決定されてもよい。
【０２１１】
次に、個別のレプリキン骨格ペプチド内の個別の置換を、個別のレプリキン骨格ペプチドが単離した特定の分離株に関連する高い毒性の発生との関連について調べる。６ヶ月〜３年をかけて増加するレプリキン数に基づいて新生株であること、および代表的なレプリキン骨格ペプチドを含むことが示されたインフルエンザウイルスの現行株を調べ、初期新生株における高い毒性に関連する置換が、インフルエンザの新生株に存在するかどうかを判断する。高い毒性に関連する個別の置換が存在する場合、インフルエンザウイルスの新生株も高い毒性を有すると予測してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６〜３０アミノ酸を含むインフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離したレプリキンペプチドであって、さらに、
（１）末端リジン、および任意に当該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン、および当該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（３）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン
を含み、ここで、当該インフルエンザウイルスの第１株の実質的に単離したレプリキンペプチドは、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列と比較して、アミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、ヒスチジンの置換ではなく、また上記インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列は、
（１）１６〜３０アミノ酸；
（２）末端リジン、および任意に当該末端リジンに直接隣接するリジン；
（３）末端ヒスチジン、および当該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（４）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（５）少なくとも６％のリジン
を含み、インフルエンザウイルスの第３株はレプリキン配列を含み、当該レプリキン配列は、
（１）１６〜３０アミノ酸；
（２）末端リジン、および任意に前記末端リジンに直接隣接するリジン；
（３）末端ヒスチジン、および前記末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（４）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（５）少なくとも６％のリジン
を含み、インフルエンザウイルスの上記第１株のレプリキン配列に存在する置換は、インフルエンザウイルスの上記第３株のレプリキン配列に追加で存在し、およびインフルエンザウイルスの上記第３株における置換の存在は、インフルエンザウイルスの上記第２株と比較して、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連することを特徴とする、前記レプリキンペプチド。
【請求項２】
前記置換アミノ酸残基が、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキンペプチドの末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する、請求項１に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基である、請求項２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４】
前記置換アミノ酸残基が、任意の疎水性アミノ酸である、請求項３に記載のレプリキンペプチド。
【請求項５】
前記置換アミノ酸残基が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項４に記載のレプリキンペプチド。
【請求項６】
配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｘ］ＷＧＩＨＨを含み、ここで残基［Ｘ］は、ロイシン以外の任意のアミノ酸である、請求項５に記載のレプリキンペプチド。
【請求項７】
前記残基［Ｘ］が、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンおよびバリンからなる群から選択される、請求項６に記載のレプリキンペプチド。
【請求項８】
前記残基［Ｘ］は、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項７に記載のレプリキンペプチド。
【請求項９】
前記単離レプリキンが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスペプチドである、請求項１に記載のレプリキンペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のレプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載のレプリキンペプチドの抗原部分配列を含むワクチンであって、当該抗原部分配列が、請求項１に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基である、前記ワクチン。
【請求項１２】
ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｘ］ＷＧＩＨＨの実質的に単離されたアミノ酸配列を含むワクチンであって、当該残基［Ｘ］が、ロイシン以外の任意のアミノ酸である、前記ワクチン。
【請求項１３】
前記残基［Ｘ］が、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸である、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記残基［Ｘ］が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１６】
ＵＴＯＰＥをさらに含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１７】
請求項１に記載のレプリキンペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項１８】
請求項１に記載のレプリキンペプチドの抗原部分列に対する実質的に単離した抗体であって、当該抗原部分配列が、請求項１に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基を含む、前記抗体。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離されたレプリキンペプチドであって、当該インフルエンザウイルスの第１株が、インフルエンザウイルスの新生株であり、また上記実質的に単離されたレプリキンペプチドが、７〜約５０アミノ酸を含み、そして以下の：
（１）上記レプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、及び当該レプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基若しくは少なくとも１つのリジン残基；
（２）第２リジン残基から６〜１０残基に位置する第１リジン残基；
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（４）少なくとも６％のリジン残基
から成るモチーフを識別し、ここで上記インフルエンザウイルスの第２株における他の点では同一の配列と比較して、識別されたモチーフの末端残基の間のレプリキンペプチド配列に位置する１つのアミノ酸における置換が生じ、リジンまたはヒスチジンが置換されず、インフルエンザウイルスの前記第１株の前記識別されたモチーフの前記末端残基間の前記置換が、第２株と比較して、急速複製および毒性の増加に関連する；
前記識別されたモチーフを選択し、前記識別されたモチーフを含む前記レプリキンペプチドを単離するステップによって単離される、前記レプリキンペプチド。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株から単離される、請求項１９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項２２】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの前記アミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基を含む抗原部分配列を含むワクチン。
【請求項２３】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドに対して実質的に単離される抗体。
【請求項２４】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの抗原部分配列に対して実質的に単離される抗体であって、当該抗原部分配列が、請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの７〜２９アミノ酸残基を含む、前記抗体。
【請求項２５】
インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法であって、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、当該レプリキン骨格は、上記インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチド、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチド、およびインフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドを含むステップ、
（２）上記第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換された上記第３レプリキン骨格ペプチドにおける１つのアミノ酸を識別するステップであって、当該置換アミノ酸がヒスチジンではないステップ、
（３）インフルエンザウイルスの前記第２株と比較して、インフルエンザウイルスの前記第３株が、高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すかどうかを判断するステップ、
（４）上記第２レプリキン骨格と比較して、上記第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基が、上記第１レプリキン骨格ペプチドにおいても置換されるかどうかを判断するステップ、
（５）上記インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数を、上記インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数と比較するステップ、
（６）上記インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数が、上記インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いかどうかを判断するステップ、
（７）上記インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記第２レプリキン骨格と比較して、前記第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基が、第２レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に配置される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外のアミノ酸残基である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外の疎水性アミノ酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記置換アミノ酸残基が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１、第２および第３レプリキン骨格が、２９のアミノ酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスの第１新生株からレプリキンペプチドを識別するステップであって、前記インフルエンザウイルスレプリキンペプチドは７〜約５０アミノ酸で構成され、また前記インフルエンザウイルスレプリキンペプチドは、
（１）前記単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および少なくとも１つのリジン残基または前記単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基にある第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、から成るモチーフを含み、
前記インフルエンザウイルスの第２株における同一配列と比較して、前記モチーフの前記末端残基間でアミノ酸の置換が発生し、リジンまたはヒスチジンは置換されていないステップと、インフルエンザウイルスの第３株における同一配列における前記置換をインフルエンザウイルスの前記第２株と比較して、インフルエンザウイルスの前記第３株における急速複製および毒性の増加とを関連付けるステップと、およびインフルエンザウイルスの前記第１株の前記毒性の増加を予測するステップと、を含むことを特徴とするインフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法。
【請求項３２】
アミノ酸配列ＫＫＸ1Ｘ2Ｘ3ＹＰＴＩＫＸ4Ｘ5Ｘ6ＮＮＴＮＸ7ＥＤＬＬＶＸ8ＷＧＩＸ9Ｈを含む実質的に単離されたレプリキンペプチドであって、式中、
Ｘ1はＮまたはＧであり、
Ｘ2はＮまたはＳであり、
Ｘ3はＡまたはＴであり、
Ｘ4はＲまたはＫであり、
Ｘ5はＳまたはＴであり、
Ｘ6は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ7は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ8はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、そして
Ｘ9はＨまたはＱである、前記レプリキンペプチド。
【請求項３３】
Ｘ6がＹである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３４】
Ｘ7がＱ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３５】
Ｘ7がＱまたはＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３６】
Ｘ7がＱである、請求項３５に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３７】
Ｘ8がメチオニン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンまたはグルタミンであることを、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３８】
Ｘ8がメチオニン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニンまたはトリプトファンである、請求項３７に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３９】
Ｘ8がメチオニンまたはイソロイシンである、請求項３８に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４０】
Ｘ8がメチオニンである、請求項３９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４１】
Ｘ8がイソロイシンである、請求項３９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４２】
Ｘ9がＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４３】
Ｘ1がＮであり、
Ｘ2がＳであり、
Ｘ3がＴであり、
Ｘ4がＲであり、そして
Ｘ5がＳである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４４】
請求項３２に記載のレプリキンペプチドの抗原部分配列を含む実質的に単離されたペプチドであって、当該抗原部分配列が、請求項３２に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ残基である、前記ペプチド。
【請求項４５】
請求項３２に記載の実質的に単離されたレプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項４６】
請求項４４に記載の実質的に単離されたペプチドを含むワクチン。
【請求項４７】
請求項３２に記載の実質的に単離されたレプリキンペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項４８】
請求項４４に記載の実質的に単離されたペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項４９】
請求項１に記載のレプリキンペプチドをコードする、実質的に単離された核酸。
【請求項５０】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドをコードする、実質的に単離された核酸。
【請求項１】
１６〜３０アミノ酸を含むインフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離したレプリキンペプチドであって、さらに、
（１）末端リジン、および任意に当該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン、および当該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（３）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン
を含み、ここで、当該インフルエンザウイルスの第１株の実質的に単離したレプリキンペプチドは、インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列と比較して、アミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、ヒスチジンの置換ではなく、また上記インフルエンザウイルスの第２株のレプリキン配列は、
（１）１６〜３０アミノ酸；
（２）末端リジン、および任意に当該末端リジンに直接隣接するリジン；
（３）末端ヒスチジン、および当該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（４）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（５）少なくとも６％のリジン
を含み、インフルエンザウイルスの第３株はレプリキン配列を含み、当該レプリキン配列は、
（１）１６〜３０アミノ酸；
（２）末端リジン、および任意に前記末端リジンに直接隣接するリジン；
（３）末端ヒスチジン、および前記末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；
（４）別のリジンから６〜１０アミノ酸にあるリジン；及び
（５）少なくとも６％のリジン
を含み、インフルエンザウイルスの上記第１株のレプリキン配列に存在する置換は、インフルエンザウイルスの上記第３株のレプリキン配列に追加で存在し、およびインフルエンザウイルスの上記第３株における置換の存在は、インフルエンザウイルスの上記第２株と比較して、複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加に関連することを特徴とする、前記レプリキンペプチド。
【請求項２】
前記置換アミノ酸残基が、インフルエンザウイルスの第１株のレプリキンペプチドの末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に位置する、請求項１に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基である、請求項２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４】
前記置換アミノ酸残基が、任意の疎水性アミノ酸である、請求項３に記載のレプリキンペプチド。
【請求項５】
前記置換アミノ酸残基が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項４に記載のレプリキンペプチド。
【請求項６】
配列ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｘ］ＷＧＩＨＨを含み、ここで残基［Ｘ］は、ロイシン以外の任意のアミノ酸である、請求項５に記載のレプリキンペプチド。
【請求項７】
前記残基［Ｘ］が、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、プロリンおよびバリンからなる群から選択される、請求項６に記載のレプリキンペプチド。
【請求項８】
前記残基［Ｘ］は、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項７に記載のレプリキンペプチド。
【請求項９】
前記単離レプリキンが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスペプチドである、請求項１に記載のレプリキンペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のレプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載のレプリキンペプチドの抗原部分配列を含むワクチンであって、当該抗原部分配列が、請求項１に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基である、前記ワクチン。
【請求項１２】
ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶ［Ｘ］ＷＧＩＨＨの実質的に単離されたアミノ酸配列を含むワクチンであって、当該残基［Ｘ］が、ロイシン以外の任意のアミノ酸である、前記ワクチン。
【請求項１３】
前記残基［Ｘ］が、ロイシン以外の任意の疎水性アミノ酸である、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記残基［Ｘ］が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１６】
ＵＴＯＰＥをさらに含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１７】
請求項１に記載のレプリキンペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項１８】
請求項１に記載のレプリキンペプチドの抗原部分列に対する実質的に単離した抗体であって、当該抗原部分配列が、請求項１に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基を含む、前記抗体。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスの第１株から実質的に単離されたレプリキンペプチドであって、当該インフルエンザウイルスの第１株が、インフルエンザウイルスの新生株であり、また上記実質的に単離されたレプリキンペプチドが、７〜約５０アミノ酸を含み、そして以下の：
（１）上記レプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、及び当該レプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基若しくは少なくとも１つのリジン残基；
（２）第２リジン残基から６〜１０残基に位置する第１リジン残基；
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（４）少なくとも６％のリジン残基
から成るモチーフを識別し、ここで上記インフルエンザウイルスの第２株における他の点では同一の配列と比較して、識別されたモチーフの末端残基の間のレプリキンペプチド配列に位置する１つのアミノ酸における置換が生じ、リジンまたはヒスチジンが置換されず、インフルエンザウイルスの前記第１株の前記識別されたモチーフの前記末端残基間の前記置換が、第２株と比較して、急速複製および毒性の増加に関連する；
前記識別されたモチーフを選択し、前記識別されたモチーフを含む前記レプリキンペプチドを単離するステップによって単離される、前記レプリキンペプチド。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株から単離される、請求項１９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項２２】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの前記アミノ酸配列の７〜２９アミノ酸残基を含む抗原部分配列を含むワクチン。
【請求項２３】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドに対して実質的に単離される抗体。
【請求項２４】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの抗原部分配列に対して実質的に単離される抗体であって、当該抗原部分配列が、請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドの７〜２９アミノ酸残基を含む、前記抗体。
【請求項２５】
インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性、または宿主細胞の死亡率の増加を予測する方法であって、
（１）複数のレプリキン骨格ペプチドを含むインフルエンザウイルスレプリキン骨格を識別するステップであって、当該レプリキン骨格は、上記インフルエンザウイルスの第１株から単離した第１レプリキン骨格ペプチド、インフルエンザウイルスの第２株から単離した第２レプリキン骨格ペプチド、およびインフルエンザウイルスの第３株から単離した第３レプリキン骨格ペプチドを含むステップ、
（２）上記第２レプリキン骨格ペプチドと比較して、置換された上記第３レプリキン骨格ペプチドにおける１つのアミノ酸を識別するステップであって、当該置換アミノ酸がヒスチジンではないステップ、
（３）インフルエンザウイルスの前記第２株と比較して、インフルエンザウイルスの前記第３株が、高い複製、毒性または宿主細胞の死亡率を示すかどうかを判断するステップ、
（４）上記第２レプリキン骨格と比較して、上記第３レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基が、上記第１レプリキン骨格ペプチドにおいても置換されるかどうかを判断するステップ、
（５）上記インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数を、上記インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数と比較するステップ、
（６）上記インフルエンザウイルスの第１株のレプリキン数が、上記インフルエンザウイルスの第１株の初期発生分離株のレプリキン数より多いかどうかを判断するステップ、
（７）上記インフルエンザウイルスの第２株と比較して、インフルエンザウイルスの第１株における複製、毒性または宿主細胞の死亡率の増加を予測するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記第２レプリキン骨格と比較して、前記第１レプリキン骨格において置換されたアミノ酸残基が、第２レプリキン骨格の末端ヒスチジンから５アミノ酸残基に配置される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外のアミノ酸残基である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記置換アミノ酸残基が、ロイシン以外の疎水性アミノ酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記置換アミノ酸残基が、メチオニンまたはイソロイシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１、第２および第３レプリキン骨格が、２９のアミノ酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスの第１新生株からレプリキンペプチドを識別するステップであって、前記インフルエンザウイルスレプリキンペプチドは７〜約５０アミノ酸で構成され、また前記インフルエンザウイルスレプリキンペプチドは、
（１）前記単離したレプリキンペプチドの第１末端に位置する少なくとも１つのリジン残基、および少なくとも１つのリジン残基または前記単離したレプリキンペプチドの第２末端に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（２）第２リジン残基から６〜１０残基にある第１リジン残基と、
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基と、
（４）少なくとも６％のリジン残基と、から成るモチーフを含み、
前記インフルエンザウイルスの第２株における同一配列と比較して、前記モチーフの前記末端残基間でアミノ酸の置換が発生し、リジンまたはヒスチジンは置換されていないステップと、インフルエンザウイルスの第３株における同一配列における前記置換をインフルエンザウイルスの前記第２株と比較して、インフルエンザウイルスの前記第３株における急速複製および毒性の増加とを関連付けるステップと、およびインフルエンザウイルスの前記第１株の前記毒性の増加を予測するステップと、を含むことを特徴とするインフルエンザウイルスの新生株における毒性の増加を予測する方法。
【請求項３２】
アミノ酸配列ＫＫＸ1Ｘ2Ｘ3ＹＰＴＩＫＸ4Ｘ5Ｘ6ＮＮＴＮＸ7ＥＤＬＬＶＸ8ＷＧＩＸ9Ｈを含む実質的に単離されたレプリキンペプチドであって、式中、
Ｘ1はＮまたはＧであり、
Ｘ2はＮまたはＳであり、
Ｘ3はＡまたはＴであり、
Ｘ4はＲまたはＫであり、
Ｘ5はＳまたはＴであり、
Ｘ6は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ7は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ8はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、そして
Ｘ9はＨまたはＱである、前記レプリキンペプチド。
【請求項３３】
Ｘ6がＹである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３４】
Ｘ7がＱ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３５】
Ｘ7がＱまたはＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３６】
Ｘ7がＱである、請求項３５に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３７】
Ｘ8がメチオニン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンまたはグルタミンであることを、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３８】
Ｘ8がメチオニン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニンまたはトリプトファンである、請求項３７に記載のレプリキンペプチド。
【請求項３９】
Ｘ8がメチオニンまたはイソロイシンである、請求項３８に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４０】
Ｘ8がメチオニンである、請求項３９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４１】
Ｘ8がイソロイシンである、請求項３９に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４２】
Ｘ9がＨである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４３】
Ｘ1がＮであり、
Ｘ2がＳであり、
Ｘ3がＴであり、
Ｘ4がＲであり、そして
Ｘ5がＳである、請求項３２に記載のレプリキンペプチド。
【請求項４４】
請求項３２に記載のレプリキンペプチドの抗原部分配列を含む実質的に単離されたペプチドであって、当該抗原部分配列が、請求項３２に記載のレプリキンペプチドのアミノ酸配列の７〜２９アミノ残基である、前記ペプチド。
【請求項４５】
請求項３２に記載の実質的に単離されたレプリキンペプチドを含むワクチン。
【請求項４６】
請求項４４に記載の実質的に単離されたペプチドを含むワクチン。
【請求項４７】
請求項３２に記載の実質的に単離されたレプリキンペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項４８】
請求項４４に記載の実質的に単離されたペプチドに対する実質的に単離された抗体。
【請求項４９】
請求項１に記載のレプリキンペプチドをコードする、実質的に単離された核酸。
【請求項５０】
請求項１９に記載の前記レプリキンペプチドをコードする、実質的に単離された核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【公表番号】特表２００９−５３８６３０（Ｐ２００９−５３８６３０Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３４３３（Ｐ２００９−５１３４３３）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９９７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０７０２
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０１１４１７８１）
【出願人】（５０１１４１７９２）
【出願人】（５０７２７３７９２）
【出願人】（５０７２７３８０６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９９７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０７０２
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０１１４１７８１）
【出願人】（５０１１４１７９２）
【出願人】（５０７２７３７９２）
【出願人】（５０７２７３８０６）
【Ｆターム（参考）】
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