レポータージーンアッセイ、該アッセイ用キット、及び培養培地
【課題】 レポータージーンアッセイにおいて、その検出感度の優れた新規なレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、および該レポータージーンアッセイに好適に用い得る培地を提供する。
【解決手段】 本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１と、かかる細胞を培養するための９６穴プレートと、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（体積比１：１）と糖質コルチコイドとからなる培地セットと、を備えて構成される。
【解決手段】 本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１と、かかる細胞を培養するための９６穴プレートと、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（体積比１：１）と糖質コルチコイドとからなる培地セットと、を備えて構成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）が生物体内で引き起こす遺伝子発現のメカニズムを利用した、試料中の内分泌撹乱物質の含有量を簡易に測定するレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイ用のキット、及び該レポータージーンアッセイに適した培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中のダイオキシン類（ポリクロロジベンゾパラジオキシン、及びポリクロロジベンゾフラン）や、ダイオキシン関連物質であるコプラナーポリ塩化ビフェニル（以下、コプラナーＰＣＢという。）は、生体内において、図１に示すように作用すると考えられている。
【０００３】
詳細には、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢは、生体内で細胞内に取り込まれた後は、先ず芳香族炭化水素レセプター（以下、ＡｈＲという。）と結合してＡｈＲ複合体を形成する。次いで、このＡｈＲ複合体にＡｈＲ核運搬プロテイン（以下、Ａｒｎｔという。）が結合してＡｈＲ複合体−Ａｒｎｔを形成し、ＡｈＲ複合体の核内への移動を促す。そして、核内に移動したＡｈＲ複合体−Ａｒｎｔは、核内のＤＮＡにおいてＸｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（以下、ＸＲＥという。）と呼ばれる特定配列に結合し、ＸＲＥの下流に存在するＣＹＰ１Ａ１遺伝子を含む幾つかの遺伝子の発現を促進、若しくは抑制する。
【０００４】
すなわち、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢは、ＣＹＰ１Ａ１タンパク質を含む幾つかのタンパク質を、本来ホルモンで制御される量より多く合成し、また、それ以外の幾つかのタンパク質の合成を阻害するのである。
【０００５】
近年、かかるダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの遺伝子発現メカニズムを利用した、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量の測定方法が種々開発されている。その一つに、ホタルや発光細菌等における生物発光に関与する酵素（ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列をコードするルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いた、レポータージーンアッセイがある。
【０００６】
かかるレポータージーンアッセイは、図２に従って説明すれば、ＸＲＥの下流にあって、ＡｈＲを介して活性が制御される遺伝子の一部を、ルシフェラーゼ遺伝子で組み換えた組み換え細胞を用いて行うものであり、かかる組み換え細胞をダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを含む培地で培養することにより、上記と同様のメカニズムでＣＹＰ１Ａ１遺伝子やその他の遺伝子と伴に、ルシフェラーゼ遺伝子をも活性化しようとするものである。そして、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって産生されたルシフェラーゼの発光量を測定して、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を定量するのである。
【０００７】
かかる測定方法は、測定可能な濃度範囲が高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計（ＨＲＧＣＭＳ）に比べて遜色なく、分析に要する時間も短くて済む等、多くの利点を有するものであった。
【０００８】
しかしながら、かかる方法で試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を求めるには、ルシフェラーゼの発光量、すなわち検出感度が低いと測定値に大きく誤差が生じるおそれがあった。したがって、精度の高い測定を期すためには、検出感度をさらに上げることが求められていた。
【０００９】
ここで、ＤＩＯＸＩＮ２００２において、上記測定方法の一態様であるＣＡＬＵＸ（ＣＡＬＵＸは、ゼノバイオテック デテクション システムズ インターナショナル インコーポレーテッドの商標である。）Ａｓｓａｙを用いて血中のダイオキシン類の含有量を測定した場合には、血中に存在する、副腎皮質ホルモンの一つであるコルチコイドが測定結果に悪影響を及ぼすこと、及び、かかる要因のため、測定精度を上げるには、血中からコルチコイドを厳格に取り除く必要があることが発表されている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】アイ．ウィンダル（Ｉ．Ｗｉｎｄａｌ）、外７名、「オルガノハロゲン コンパウンド（ＯＲＧＡＮＯＨＡＬＯＧＥＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ）」、５８巻（２００２）、ｐ．３８９−３９２
【００１０】
これに対して、本発明者らは、このコルチコイドを取り除くのではなく、逆に積極的に用いることによって、レポータージーンアッセイにおける検出感度を上げ得るのではないかと考えた。そして、鋭意研究を重ねた結果、コルチゾール及びその類縁体の使用が、レポータージーンアッセイの高感度化に有用であることを見出し、本発明に至ったのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、レポータージーンアッセイにおいて、その検出感度の優れた新規なレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、及び該レポータージーンアッセイに好適に用い得る培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、基礎培地と、糖質コルチコイドと、被測定試料から抽出される芳香族炭化水素レセプター結合物質とを混合して、細胞培養培地とする工程と、芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部又は一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞を、前記細胞培養培地で培養する工程と、を含んで構成され、前記組み換え細胞から産生されるレポータータンパクの活性から、前記被測定試料中の芳香族炭化水素レセプター結合物質の含有量を測定することにある。
【００１３】
かかる構成により、組み換え細胞中のレポーター遺伝子の発現が活性化されることとなる。ここで、かかる作用は、糖質コルチコイドが芳香族炭化水素レセプター結合物質と共存することによりＡｈＲやＡｒｎｔの量を増加させることによると考えられる。
【００１４】
また、本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、前記細胞培養培地とする工程が、さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなされることにある。
【００１５】
かかる構成により、ＡｈＲを分解する酵素であるプロテアソームの働きが抑制されるため、ＡｈＲ量が減少することが防がれて、レポーター遺伝子の発現がさらに活性化されることとなる。
【００１６】
また、本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、前記細胞培養培地とする工程が、さらにコレステロール酸化生成物を混合してなされることにある。
【００１７】
かかる構成により、レポーター遺伝子の発現がさらに活性化されることとなる。
【００１８】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００１９】
また、前記基礎培地を、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して調製し、前記組み換え細胞をＨｅｐａ１ｃｌｃ７から作製しうる。
【００２０】
また、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子でありうる。
【００２１】
かかる構成により、組み換え細胞中のレポーター遺伝子の発現がより効果的に活性化されることとなる。
【００２２】
また、本発明のレポータージーンアッセイ用キットの要旨とするところは、芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部又は一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞と、前記組み換え細胞の培養に用いられる培地を調製するための培地セットとを備えるレポータージーンアッセイ用キットであって、前記培地セットが糖質コルチコイドを備えることにある。
【００２３】
ここで、前記培地セットがプロテアソーム抑制物質を備えうる。
【００２４】
また、前記培地セットがコレステロール酸化生成物を備えうる。
【００２５】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００２６】
また、前記培地セットが、ＲＰＭＩ１６４０培地と、ウシ胎児血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンとを備えうる。
【００２７】
また、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子でありうる。
【００２８】
また、前記組み換え細胞が、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１でありうる。
【００２９】
なお、かかるレポータージーンアッセイ用キットから生じる作用は、前記レポータージーンアッセイについての記載と同様であり、その詳しい説明は省略する。
【００３０】
また、本発明の培養培地の要旨とするところは、基礎培地と糖質コルチコイドとを混合してなることにある。
【００３１】
さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなる。
【００３２】
さらにコレステロール酸化生成物を混合してなる。
【００３３】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００３４】
また、前記基礎培地が、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して構成されうる。
【００３５】
かかる構成により、本発明の培養培地は、レポータージーンアッセイにおける組み換え細胞の培養に好適に用い得ることとなる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明において、レポーター遺伝子を有してなる組み換え細胞を、糖質コルチコイド（及び、プロテアソーム抑制物質及び／又はコレステロール酸化生成物）を含む細胞培養培地で培養することにより、レポータータンパクの産生能、すなわち検出感度を上げることが可能となったため、試料中に含まれる内分泌撹乱物質の定量限界を下げることができる。また、複数の試料間における内分泌撹乱物質含有量の僅かな差をも検出することができる。
【００３７】
本願発明は、ＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙにおいて特に好ましく用いることができ、その結果、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢ含有量の簡易測定におけるＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙの信頼性をより高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、該レポータージーンアッセイに好ましく用い得る培地の態様を、以下に詳しく説明する。
【００３９】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１と、かかる細胞を培養するための９６穴プレートと、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（体積比１：１）と糖質コルチコイドとからなる培地セットと、を備えて構成される。
【００４０】
かかる測定キットを用いたレポータージーンアッセイは、予め被測定試料中からダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを単離して、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという。）中に溶解（濃縮）しておく以外に、例えば、以下の工程を経て行う。
【００４１】
すなわち、先ず、培地セットのＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液とから、ＲＰＭＩ１６４０培地を８９容量部、ウシ胎児血清を９容量部、ペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液を２容量部混合して基礎培地を調製し、かかる基礎培地を用いて、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を９６穴プレート上で１４〜２４時間培養する。培養後、プレートから基礎培地を取り除く。
【００４２】
次に、培地除去後のプレート上のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に、上記と同様の態様で調製した基礎培地と、所定量の糖質コルチコイドと、前述のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢのＤＭＳＯ溶液と、を混合して調製される細胞培養培地を添加する。
【００４３】
そして、このプレートを３７℃、ＣＯ２５％の環境下で２０〜２４時間培養する。培養後、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１から細胞培養培地を取り除き、これを溶解し、産生されたルシフェラーゼの活性をルミノメーターで測定する。最後に、予め作成した検量線に基づいて、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を算出する。
【００４４】
ここで、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１は、従来のレポータージーンアッセイ（すなわち、基礎培地に糖質コルチコイドを人為的に添加しない態様）において、ルシフェラーゼ産生能が高いことで知られ、特にＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙにおいて好ましく用いられてきた。このため、本発明においてレポーター遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子とする場合には、本発明にかかる組み換え細胞はマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１であることが好ましい。かかる態様により、レポーター遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子とする場合における、本発明のレポータージーンアッセイの検出感度を最も効果的に上げることができる。なお、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１は、米国特許第５８５４０１０号明細書に基づいて、Ｈｅｐａ１ｃｌｃ７においてＡｈＲを介して活性が制御される遺伝子の一部を、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子で組み換えることによって調製され得る。
【００４５】
培地セットから調製される基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地を８５〜９５容量部、ウシ胎児血清を７〜９容量部、ペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液を１〜３容量部含有して構成されることが好ましい。かかる態様により、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の培養を効率よく行うことが可能となる。
【００４６】
本発明の重要な点は、従来レポータージーンアッセイにおいて、その測定精度を上げるためには、被測定試料中に含まれると好ましくないと考えられ、そのため被測定試料中からは取り除く必要があるとされてきた物質を、逆に積極的に利用することにより、その検出感度を上げようとすることにある。
【００４７】
詳細には、従来被測定試料中の含有量が不明であったために、レポータージーンアッセイの精度にどの程度の影響を及ぼしたのか分からなかった物質について、その量を人為的に定めて使用することにより、レポータージーンアッセイの検出感度を上げるとともに、これらの物質とルシフェラーゼの産生量（発光量）との関係を表す検量線を別途作成することにより実測値を補正し、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を高精度に測定しようとするものである。
【００４８】
このため、本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える糖質コルチコイドの基礎培地への添加量は、人為的に定められたものであれば、特定の値に限定されるものではない。
【００４９】
すなわち、本発明にかかる糖質コルチコイドの基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度を上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたり糖質コルチコイドが０．３μｇ以上、さらには０．５μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が０．３μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度を十分に上げることができない一方、０．５μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを優れた精度で検出することが可能になる。
【００５０】
また、基礎培地への糖質コルチコイドの混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上に糖質コルチコイドを添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、糖質コルチコイドは、基礎培地１ｍｌあたり２０μｇ以下、さらには１０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５１】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える糖質コルチコイドは、本発明のレポータージーンアッセイの検出感度を上げ得るものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、コルチゾールやコルチコステロンやコルチゾン、あるいはデキサメタゾンやプレドニソロン等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られず、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００５２】
以上、本発明のレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、及び該レポータージーンアッセイに好適に用いる培地についての実施態様を詳述したが、本発明は上述の実施態様に限られるものではなく、その他の態様でも実施し得るものである。
【００５３】
本発明にかかる細胞培養培地は、基礎培地に糖質コルチコイドのみを添加して構成することによっても、レポータージーンアッセイの検出感度を上げ得るため、検出感度を上げるためにさらに他の化合物を添加することは必須の要件ではないが、かかる細胞培養培地は、基礎培地と糖質コルチコイドとの混合培地に、さらにプロテアソーム抑制物質を添加して構成されてもよい。かかる態様により、ＡｈＲを分解してＸＲＥより下流の遺伝子発現を阻害するプロテアソームの働きが抑制されることとなるため、結果としてレポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる。
【００５４】
また、本発明にかかる細胞培養培地は、かかるプロテアソーム抑制物質に代えて、あるいはプロテアソーム抑制物質と伴に、コレステロール酸化生成物を添加して構成されてもよい。かかる構成によっても、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる。
【００５５】
ここで、本発明にかかるプロテアソーム抑制物質の基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたりプロテアソーム抑制物質が５μｇ以上、さらには１０μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が５μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに十分に上げることができない一方、プロテアソーム抑制物質の含有量が１０μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢをさらに優れた精度で検出することが可能になる。
【００５６】
また、基礎培地へのプロテアソーム抑制物質の混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上にプロテアソーム抑制物質を添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、プロテアソーム抑制物質は、基礎培地１ｍｌあたり７０μｇ以下、さらには５０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５７】
本発明にかかるコレステロール酸化生成物の基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたりコレステロール酸化生成物が０．３μｇ以上、さらには０．５μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が０．３μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに十分に上げることができない一方、コレステロール酸化生成物の含有量が０．５μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢをさらに優れた精度で検出することが可能になる。
【００５８】
また、基礎培地へのコレステロール酸化生成物の混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上にコレステロール酸化生成物を添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、コレステロール酸化生成物は、基礎培地１ｍｌあたり５０μｇ以下、さらには１０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５９】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備えるプロテアソーム抑制物質としては、具体的に、Ｅ−４０３１、Ａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ、Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ、Ｔｅｒｆｅｎａｄｉｎｅ、Ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４ＰＢＡ、ＭＧ１３２、Ｌｉｄｏｃａｉｎ、Ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ、Ｐｉｓｉｃａｉｎｉｄｅ、Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ、Ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られるものではなく、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００６０】
また、本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備えるコレステロール酸化生成物としては、具体的に、７−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、２０−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、２５−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ−３α，５α，６β−ｔｒｉｏｌ、７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、７β−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、７−Ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、５，６−Ｅｐｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られるものではなく、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００６１】
本発明は、糖質コルチコイドに代えてプロテアソーム抑制物質を基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養する態様や、糖質コルチコイドに代えてコレステロール酸化生成物を基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養する態様、あるいは、糖質コルチコイドに代えてプロテアソーム抑制物質とコレステロール酸化生成物とを基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養するであっても構わない。かかる態様によっても、従来のレポータージーンアッセイに比して、プロテアソーム抑制物質の働きによってＡｈＲの分解によるＡｈＲ量の減少が低く抑えられ、また、コレステロール酸化生成物の働きによって、結果としてレポータージーンアッセイの検出感度を上げることができる。
【００６２】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用のキットが備える組み換え細胞は、かかる組み換え細胞が、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢ等のＡｈＲ結合物質を含む培地で培養された際に、レポータータンパクを産生し得る態様であればよい。したがって、本発明にかかる組み換え細胞は、ＡｈＲを介して活性が制御される、ＸＲＥよりも下流の遺伝子の全部又は一部が、ルシフェラーゼ遺伝子以外のレポーター遺伝子で構成されてもよく、かかるレポーター遺伝子として、具体的には、ＧＦＰ遺伝子やＡＰ遺伝子等を挙げることができる。
【００６３】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用のキットが備える組み換え細胞が、ＡｈＲを介して活性が制御されるＸＲＥよりも下流の遺伝子の全部又は一部に、ルシフェラーゼ遺伝子を有してなる態様である場合、かかる組み換え細胞はマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に限定されるものではなく、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ１．１やラット肝ガン細胞Ｈ４ｌｌＥＧｕｄＬｕｃ１．１、あるいはヒト肝ガン細胞１０１Ｌ等であってもよい。
【００６４】
また、ここで用いられるルシフェラーゼ遺伝子は、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の作製に用いられるホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子に限られるものではなく、いずれの生物由来であってもよい。具体的には、かかる生物として、ホタル以外にウミホタルやウミシイタケを挙げることができる。
【００６５】
本発明で用いられる組み換え細胞は、マウスやヒト由来のものに限定されるものではないが、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの細胞内における遺伝子発現メカニズムがヒトと類似するように、哺乳類由来のものであることが好ましい。
【００６６】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える、組み換え細胞を培養するためのプレートは、９６穴プレートに限られるものではなく、プレートが１又は複数の窪みを有するものであればいずれの態様であってもよいことは当然である。
【００６７】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える培地セットは、組み換え細胞を培養するための好適な細胞培養培地を構成し得るものであれば、いずれの態様から構成されてもよい。したがって、かかる培地セットは、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液とから構成されるものに限定されるものではなく、ＤＭＥＭ培地と仔ウシ血清とを含んで構成されてもよい。また、これらの培地セットが、ネオマイシン等の他の抗生物質を含んで構成されてもよい。さらに、かかる培地セットの混合比も、組み換え細胞を好適に培養することができる態様であれば、いずれの混合比から構成されてもよい。
【００６８】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ、該アッセイ用キット、及び培養培地は、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を測定する用途に限定されるものではない。すなわち、本発明は、被測定試料中の一般的にＡｈＲに結合し得る物質（ＡｈＲ結合物質）の含有量を測定する用途に用いることができる。かかるＡｈＲ結合物質としては、具体的には、ポリ塩化ナフタレン類やベンゾａピレン等のＰＡＨｓ等を挙げることができる。
【００６９】
その他、本発明はその趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者の知識に基づき種々なる改良、修正、変形を加えた態様で実施しうるものである。
【００７０】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００７１】
（基礎培地の調製）
ＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社製）培地５００ｍｌに、ウシ胎児血清（インビトロジェン社製）５０ｍｌとペニシリン／ストレプトマイシン混合（体積比１：１）溶液（ナカライテスク社製）１１ｍｌとを混合し、基礎培地を調製した。
【００７２】
（組み換え細胞の培養）
上記基礎培地を用いて、９６穴プレート上でマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１（ゼノバイオティックディテクションシステム（ＸＤＳ）社製）を１４〜２４時間培養して、約７．５×１０５個／ウェルとした後、プレートを逆さにして、培養後の細胞から基礎培地を取り除いた。
【実施例１】
【００７３】
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾパラジオキシン（以下、ＴＣＤＤという。）（ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ（ＣＩＬ）社製）と、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという。）（生化学用、和光純薬工業（株）製）とから、先ず２５０ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液８μｌを調製し、その後、２倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１２５〜０．１ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００７４】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール（和光純薬工業（株）製）のエタノール（和光純薬工業（株）製）溶液１０μｌを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサン（和光純薬工業（株）製）を加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００７５】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００７６】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とルミノメーター（Ａｎｔｈｏｓ社製）とを用いてルシフェラーゼ活性（相対発光強度；ＲＬＵ）を測定した。その結果を表１に示す。また、かかる表１について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図３に示す。
【００７７】
【表１】
（比較例１）
【００７８】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌを加える代わりに、エタノール１０μｌを加えた他は実施例１と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表１に示す。また、かかる表１について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図３に示す。
【実施例２】
【００７９】
ＴＣＤＤとＤＭＳＯとから、先ず１５．６ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液１２μｌを調製し、その後、２／３倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１５．６〜０．４ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００８０】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール−エタノール溶液１０μｌと、濃度５００μｇ／ｍｌのプロテアソーム抑制物質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）のエタノール溶液（和光純薬（株）製）１０μｌとを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサンを加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール及びプロテアソーム抑制物質添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００８１】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００８２】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキットとルミノメーターとを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。また、かかる表２について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図４に示す。
【００８３】
【表２】
（比較例２）
【００８４】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌ、及びプロテアソーム抑制物質−エタノール溶液１０μｌを加える代わりに、エタノール２０μｌを加えた他は実施例２と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。また、かかる表２について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図４に示す。
【実施例３】
【００８５】
ＴＣＤＤとＤＭＳＯとから、先ず１５．６ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液１２μｌを調製し、その後、２／３倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１５．６〜０．４ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００８６】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール−エタノール溶液１０μｌと、コレステロール酸化生成物（ＳＩＧＭＡ製）０．５μｇとを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサンを加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール及びコレステロール酸化生成物添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００８７】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００８８】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキットとルミノメーターとを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。また、かかる表３について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図５に示す。
【００８９】
【表３】
（比較例３）
【００９０】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌ、及びコレステロール酸化生成物０．５μｇを加える代わりに、エタノール１０μｌを加えた他は実施例３と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。また、かかる表３について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図５に示す。
【００９１】
表１及び図３より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイドを添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度が上がる程顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに０．５ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９２】
また、表２及び図４より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイド及びプロテアソーム抑制物質を添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度１．５〜１０ｐｇ／ｍｌ付近で顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに１．９ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９３】
また、表３及び図５より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイド及びコレステロール酸化生成物を添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度１．５〜１０ｐｇ／ｍｌ付近で顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに１．５９ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９４】
なお、表１乃至３に記載する、実施例１乃至３及び比較例１乃至３にかかるＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液の定量下限値は、実施例１乃至３及び比較例１乃至３の操作に先駆けて以下の操作を行うことにより算出した。すなわち、先ず、表１乃至３に記載するＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液を用いる代わりに、ＤＭＳＯ４μｌを用いた（ＴＣＤＤ濃度を０ｐｇ／ｍｌとした）以外は実施例１乃至３及び比較例１乃至３と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、培養後のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を求めた。かかる操作を、実施例１及び比較例１については６回、実施例２及び比較例２については４回、実施例３及び比較例３については３回行った後、得られるＲＬＵの数値から図３乃至５に基づいてそれぞれＴＣＤＤ濃度を計算し、その標準偏差（ＳＤ）を算出した。最後に、かかる値を１０倍した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの生物への作用メカニズムを示す。
【図２】レポータージーンアッセイにおける、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢのルシフェラーゼ遺伝子発現メカニズムを示す。
【図３】基礎培地に糖質コルチコイドが添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】基礎培地に糖質コルチコイドとプロテアソーム抑制物質が添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】基礎培地に糖質コルチコイドとコレステロール酸化生成物が添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）が生物体内で引き起こす遺伝子発現のメカニズムを利用した、試料中の内分泌撹乱物質の含有量を簡易に測定するレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイ用のキット、及び該レポータージーンアッセイに適した培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中のダイオキシン類（ポリクロロジベンゾパラジオキシン、及びポリクロロジベンゾフラン）や、ダイオキシン関連物質であるコプラナーポリ塩化ビフェニル（以下、コプラナーＰＣＢという。）は、生体内において、図１に示すように作用すると考えられている。
【０００３】
詳細には、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢは、生体内で細胞内に取り込まれた後は、先ず芳香族炭化水素レセプター（以下、ＡｈＲという。）と結合してＡｈＲ複合体を形成する。次いで、このＡｈＲ複合体にＡｈＲ核運搬プロテイン（以下、Ａｒｎｔという。）が結合してＡｈＲ複合体−Ａｒｎｔを形成し、ＡｈＲ複合体の核内への移動を促す。そして、核内に移動したＡｈＲ複合体−Ａｒｎｔは、核内のＤＮＡにおいてＸｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（以下、ＸＲＥという。）と呼ばれる特定配列に結合し、ＸＲＥの下流に存在するＣＹＰ１Ａ１遺伝子を含む幾つかの遺伝子の発現を促進、若しくは抑制する。
【０００４】
すなわち、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢは、ＣＹＰ１Ａ１タンパク質を含む幾つかのタンパク質を、本来ホルモンで制御される量より多く合成し、また、それ以外の幾つかのタンパク質の合成を阻害するのである。
【０００５】
近年、かかるダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの遺伝子発現メカニズムを利用した、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量の測定方法が種々開発されている。その一つに、ホタルや発光細菌等における生物発光に関与する酵素（ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列をコードするルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いた、レポータージーンアッセイがある。
【０００６】
かかるレポータージーンアッセイは、図２に従って説明すれば、ＸＲＥの下流にあって、ＡｈＲを介して活性が制御される遺伝子の一部を、ルシフェラーゼ遺伝子で組み換えた組み換え細胞を用いて行うものであり、かかる組み換え細胞をダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを含む培地で培養することにより、上記と同様のメカニズムでＣＹＰ１Ａ１遺伝子やその他の遺伝子と伴に、ルシフェラーゼ遺伝子をも活性化しようとするものである。そして、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって産生されたルシフェラーゼの発光量を測定して、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を定量するのである。
【０００７】
かかる測定方法は、測定可能な濃度範囲が高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計（ＨＲＧＣＭＳ）に比べて遜色なく、分析に要する時間も短くて済む等、多くの利点を有するものであった。
【０００８】
しかしながら、かかる方法で試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を求めるには、ルシフェラーゼの発光量、すなわち検出感度が低いと測定値に大きく誤差が生じるおそれがあった。したがって、精度の高い測定を期すためには、検出感度をさらに上げることが求められていた。
【０００９】
ここで、ＤＩＯＸＩＮ２００２において、上記測定方法の一態様であるＣＡＬＵＸ（ＣＡＬＵＸは、ゼノバイオテック デテクション システムズ インターナショナル インコーポレーテッドの商標である。）Ａｓｓａｙを用いて血中のダイオキシン類の含有量を測定した場合には、血中に存在する、副腎皮質ホルモンの一つであるコルチコイドが測定結果に悪影響を及ぼすこと、及び、かかる要因のため、測定精度を上げるには、血中からコルチコイドを厳格に取り除く必要があることが発表されている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】アイ．ウィンダル（Ｉ．Ｗｉｎｄａｌ）、外７名、「オルガノハロゲン コンパウンド（ＯＲＧＡＮＯＨＡＬＯＧＥＮ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ）」、５８巻（２００２）、ｐ．３８９−３９２
【００１０】
これに対して、本発明者らは、このコルチコイドを取り除くのではなく、逆に積極的に用いることによって、レポータージーンアッセイにおける検出感度を上げ得るのではないかと考えた。そして、鋭意研究を重ねた結果、コルチゾール及びその類縁体の使用が、レポータージーンアッセイの高感度化に有用であることを見出し、本発明に至ったのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、レポータージーンアッセイにおいて、その検出感度の優れた新規なレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、及び該レポータージーンアッセイに好適に用い得る培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、基礎培地と、糖質コルチコイドと、被測定試料から抽出される芳香族炭化水素レセプター結合物質とを混合して、細胞培養培地とする工程と、芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部又は一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞を、前記細胞培養培地で培養する工程と、を含んで構成され、前記組み換え細胞から産生されるレポータータンパクの活性から、前記被測定試料中の芳香族炭化水素レセプター結合物質の含有量を測定することにある。
【００１３】
かかる構成により、組み換え細胞中のレポーター遺伝子の発現が活性化されることとなる。ここで、かかる作用は、糖質コルチコイドが芳香族炭化水素レセプター結合物質と共存することによりＡｈＲやＡｒｎｔの量を増加させることによると考えられる。
【００１４】
また、本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、前記細胞培養培地とする工程が、さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなされることにある。
【００１５】
かかる構成により、ＡｈＲを分解する酵素であるプロテアソームの働きが抑制されるため、ＡｈＲ量が減少することが防がれて、レポーター遺伝子の発現がさらに活性化されることとなる。
【００１６】
また、本発明のレポータージーンアッセイの要旨とするところは、前記細胞培養培地とする工程が、さらにコレステロール酸化生成物を混合してなされることにある。
【００１７】
かかる構成により、レポーター遺伝子の発現がさらに活性化されることとなる。
【００１８】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００１９】
また、前記基礎培地を、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して調製し、前記組み換え細胞をＨｅｐａ１ｃｌｃ７から作製しうる。
【００２０】
また、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子でありうる。
【００２１】
かかる構成により、組み換え細胞中のレポーター遺伝子の発現がより効果的に活性化されることとなる。
【００２２】
また、本発明のレポータージーンアッセイ用キットの要旨とするところは、芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部又は一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞と、前記組み換え細胞の培養に用いられる培地を調製するための培地セットとを備えるレポータージーンアッセイ用キットであって、前記培地セットが糖質コルチコイドを備えることにある。
【００２３】
ここで、前記培地セットがプロテアソーム抑制物質を備えうる。
【００２４】
また、前記培地セットがコレステロール酸化生成物を備えうる。
【００２５】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００２６】
また、前記培地セットが、ＲＰＭＩ１６４０培地と、ウシ胎児血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンとを備えうる。
【００２７】
また、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子でありうる。
【００２８】
また、前記組み換え細胞が、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１でありうる。
【００２９】
なお、かかるレポータージーンアッセイ用キットから生じる作用は、前記レポータージーンアッセイについての記載と同様であり、その詳しい説明は省略する。
【００３０】
また、本発明の培養培地の要旨とするところは、基礎培地と糖質コルチコイドとを混合してなることにある。
【００３１】
さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなる。
【００３２】
さらにコレステロール酸化生成物を混合してなる。
【００３３】
また、前記糖質コルチコイドがコルチゾールでありうる。
【００３４】
また、前記基礎培地が、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して構成されうる。
【００３５】
かかる構成により、本発明の培養培地は、レポータージーンアッセイにおける組み換え細胞の培養に好適に用い得ることとなる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明において、レポーター遺伝子を有してなる組み換え細胞を、糖質コルチコイド（及び、プロテアソーム抑制物質及び／又はコレステロール酸化生成物）を含む細胞培養培地で培養することにより、レポータータンパクの産生能、すなわち検出感度を上げることが可能となったため、試料中に含まれる内分泌撹乱物質の定量限界を下げることができる。また、複数の試料間における内分泌撹乱物質含有量の僅かな差をも検出することができる。
【００３７】
本願発明は、ＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙにおいて特に好ましく用いることができ、その結果、試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢ含有量の簡易測定におけるＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙの信頼性をより高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、該レポータージーンアッセイに好ましく用い得る培地の態様を、以下に詳しく説明する。
【００３９】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を有するマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１と、かかる細胞を培養するための９６穴プレートと、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液（体積比１：１）と糖質コルチコイドとからなる培地セットと、を備えて構成される。
【００４０】
かかる測定キットを用いたレポータージーンアッセイは、予め被測定試料中からダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを単離して、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという。）中に溶解（濃縮）しておく以外に、例えば、以下の工程を経て行う。
【００４１】
すなわち、先ず、培地セットのＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液とから、ＲＰＭＩ１６４０培地を８９容量部、ウシ胎児血清を９容量部、ペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液を２容量部混合して基礎培地を調製し、かかる基礎培地を用いて、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を９６穴プレート上で１４〜２４時間培養する。培養後、プレートから基礎培地を取り除く。
【００４２】
次に、培地除去後のプレート上のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に、上記と同様の態様で調製した基礎培地と、所定量の糖質コルチコイドと、前述のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢのＤＭＳＯ溶液と、を混合して調製される細胞培養培地を添加する。
【００４３】
そして、このプレートを３７℃、ＣＯ２５％の環境下で２０〜２４時間培養する。培養後、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１から細胞培養培地を取り除き、これを溶解し、産生されたルシフェラーゼの活性をルミノメーターで測定する。最後に、予め作成した検量線に基づいて、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を算出する。
【００４４】
ここで、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１は、従来のレポータージーンアッセイ（すなわち、基礎培地に糖質コルチコイドを人為的に添加しない態様）において、ルシフェラーゼ産生能が高いことで知られ、特にＣＡＬＵＸ Ａｓｓａｙにおいて好ましく用いられてきた。このため、本発明においてレポーター遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子とする場合には、本発明にかかる組み換え細胞はマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１であることが好ましい。かかる態様により、レポーター遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子とする場合における、本発明のレポータージーンアッセイの検出感度を最も効果的に上げることができる。なお、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１は、米国特許第５８５４０１０号明細書に基づいて、Ｈｅｐａ１ｃｌｃ７においてＡｈＲを介して活性が制御される遺伝子の一部を、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子で組み換えることによって調製され得る。
【００４５】
培地セットから調製される基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地を８５〜９５容量部、ウシ胎児血清を７〜９容量部、ペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液を１〜３容量部含有して構成されることが好ましい。かかる態様により、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の培養を効率よく行うことが可能となる。
【００４６】
本発明の重要な点は、従来レポータージーンアッセイにおいて、その測定精度を上げるためには、被測定試料中に含まれると好ましくないと考えられ、そのため被測定試料中からは取り除く必要があるとされてきた物質を、逆に積極的に利用することにより、その検出感度を上げようとすることにある。
【００４７】
詳細には、従来被測定試料中の含有量が不明であったために、レポータージーンアッセイの精度にどの程度の影響を及ぼしたのか分からなかった物質について、その量を人為的に定めて使用することにより、レポータージーンアッセイの検出感度を上げるとともに、これらの物質とルシフェラーゼの産生量（発光量）との関係を表す検量線を別途作成することにより実測値を補正し、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を高精度に測定しようとするものである。
【００４８】
このため、本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える糖質コルチコイドの基礎培地への添加量は、人為的に定められたものであれば、特定の値に限定されるものではない。
【００４９】
すなわち、本発明にかかる糖質コルチコイドの基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度を上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたり糖質コルチコイドが０．３μｇ以上、さらには０．５μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が０．３μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度を十分に上げることができない一方、０．５μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢを優れた精度で検出することが可能になる。
【００５０】
また、基礎培地への糖質コルチコイドの混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上に糖質コルチコイドを添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、糖質コルチコイドは、基礎培地１ｍｌあたり２０μｇ以下、さらには１０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５１】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える糖質コルチコイドは、本発明のレポータージーンアッセイの検出感度を上げ得るものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、コルチゾールやコルチコステロンやコルチゾン、あるいはデキサメタゾンやプレドニソロン等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られず、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００５２】
以上、本発明のレポータージーンアッセイ、該レポータージーンアッセイのための測定キット、及び該レポータージーンアッセイに好適に用いる培地についての実施態様を詳述したが、本発明は上述の実施態様に限られるものではなく、その他の態様でも実施し得るものである。
【００５３】
本発明にかかる細胞培養培地は、基礎培地に糖質コルチコイドのみを添加して構成することによっても、レポータージーンアッセイの検出感度を上げ得るため、検出感度を上げるためにさらに他の化合物を添加することは必須の要件ではないが、かかる細胞培養培地は、基礎培地と糖質コルチコイドとの混合培地に、さらにプロテアソーム抑制物質を添加して構成されてもよい。かかる態様により、ＡｈＲを分解してＸＲＥより下流の遺伝子発現を阻害するプロテアソームの働きが抑制されることとなるため、結果としてレポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる。
【００５４】
また、本発明にかかる細胞培養培地は、かかるプロテアソーム抑制物質に代えて、あるいはプロテアソーム抑制物質と伴に、コレステロール酸化生成物を添加して構成されてもよい。かかる構成によっても、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる。
【００５５】
ここで、本発明にかかるプロテアソーム抑制物質の基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたりプロテアソーム抑制物質が５μｇ以上、さらには１０μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が５μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに十分に上げることができない一方、プロテアソーム抑制物質の含有量が１０μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢをさらに優れた精度で検出することが可能になる。
【００５６】
また、基礎培地へのプロテアソーム抑制物質の混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上にプロテアソーム抑制物質を添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、プロテアソーム抑制物質は、基礎培地１ｍｌあたり７０μｇ以下、さらには５０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５７】
本発明にかかるコレステロール酸化生成物の基礎培地への混合量の下限は、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに上げることができる範囲であればいずれでもよく、具体的には、基礎培地１ｍｌあたりコレステロール酸化生成物が０．３μｇ以上、さらには０．５μｇ以上含有されていることが好ましい。かかる含有量が０．３μｇ未満では、レポータージーンアッセイの検出感度をさらに十分に上げることができない一方、コレステロール酸化生成物の含有量が０．５μｇ以上であれば、微量のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢをさらに優れた精度で検出することが可能になる。
【００５８】
また、基礎培地へのコレステロール酸化生成物の混合量の上限についても、特に制限されるものではないが、検出感度を十分に上げ得る量以上にコレステロール酸化生成物を添加しても本発明の測定コストが高くなる。このため、コレステロール酸化生成物は、基礎培地１ｍｌあたり５０μｇ以下、さらには１０μｇ以下混合すれば十分である。
【００５９】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備えるプロテアソーム抑制物質としては、具体的に、Ｅ−４０３１、Ａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ、Ｃｉｓａｐｒｉｄｅ、Ｔｅｒｆｅｎａｄｉｎｅ、Ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４ＰＢＡ、ＭＧ１３２、Ｌｉｄｏｃａｉｎ、Ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ、Ｐｉｓｉｃａｉｎｉｄｅ、Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ、Ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られるものではなく、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００６０】
また、本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備えるコレステロール酸化生成物としては、具体的に、７−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、２０−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、２５−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ−３α，５α，６β−ｔｒｉｏｌ、７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、７β−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、７−Ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、５，６−Ｅｐｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ等を挙げることができる。なお、これらの物質は、基礎培地にその一種類のみを添加して用いられる態様に限られるものではなく、かかる化合物群から選択される２以上の物質を選択して基礎培地に添加して用いられてもよい。
【００６１】
本発明は、糖質コルチコイドに代えてプロテアソーム抑制物質を基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養する態様や、糖質コルチコイドに代えてコレステロール酸化生成物を基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養する態様、あるいは、糖質コルチコイドに代えてプロテアソーム抑制物質とコレステロール酸化生成物とを基礎培地に添加して調製した細胞培養培地を用いて組み換え細胞を培養するであっても構わない。かかる態様によっても、従来のレポータージーンアッセイに比して、プロテアソーム抑制物質の働きによってＡｈＲの分解によるＡｈＲ量の減少が低く抑えられ、また、コレステロール酸化生成物の働きによって、結果としてレポータージーンアッセイの検出感度を上げることができる。
【００６２】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用のキットが備える組み換え細胞は、かかる組み換え細胞が、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢ等のＡｈＲ結合物質を含む培地で培養された際に、レポータータンパクを産生し得る態様であればよい。したがって、本発明にかかる組み換え細胞は、ＡｈＲを介して活性が制御される、ＸＲＥよりも下流の遺伝子の全部又は一部が、ルシフェラーゼ遺伝子以外のレポーター遺伝子で構成されてもよく、かかるレポーター遺伝子として、具体的には、ＧＦＰ遺伝子やＡＰ遺伝子等を挙げることができる。
【００６３】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用のキットが備える組み換え細胞が、ＡｈＲを介して活性が制御されるＸＲＥよりも下流の遺伝子の全部又は一部に、ルシフェラーゼ遺伝子を有してなる態様である場合、かかる組み換え細胞はマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に限定されるものではなく、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ１．１やラット肝ガン細胞Ｈ４ｌｌＥＧｕｄＬｕｃ１．１、あるいはヒト肝ガン細胞１０１Ｌ等であってもよい。
【００６４】
また、ここで用いられるルシフェラーゼ遺伝子は、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の作製に用いられるホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子に限られるものではなく、いずれの生物由来であってもよい。具体的には、かかる生物として、ホタル以外にウミホタルやウミシイタケを挙げることができる。
【００６５】
本発明で用いられる組み換え細胞は、マウスやヒト由来のものに限定されるものではないが、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの細胞内における遺伝子発現メカニズムがヒトと類似するように、哺乳類由来のものであることが好ましい。
【００６６】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える、組み換え細胞を培養するためのプレートは、９６穴プレートに限られるものではなく、プレートが１又は複数の窪みを有するものであればいずれの態様であってもよいことは当然である。
【００６７】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ用の測定キットが備える培地セットは、組み換え細胞を培養するための好適な細胞培養培地を構成し得るものであれば、いずれの態様から構成されてもよい。したがって、かかる培地セットは、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合溶液とから構成されるものに限定されるものではなく、ＤＭＥＭ培地と仔ウシ血清とを含んで構成されてもよい。また、これらの培地セットが、ネオマイシン等の他の抗生物質を含んで構成されてもよい。さらに、かかる培地セットの混合比も、組み換え細胞を好適に培養することができる態様であれば、いずれの混合比から構成されてもよい。
【００６８】
本発明にかかるレポータージーンアッセイ、該アッセイ用キット、及び培養培地は、被測定試料中のダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの含有量を測定する用途に限定されるものではない。すなわち、本発明は、被測定試料中の一般的にＡｈＲに結合し得る物質（ＡｈＲ結合物質）の含有量を測定する用途に用いることができる。かかるＡｈＲ結合物質としては、具体的には、ポリ塩化ナフタレン類やベンゾａピレン等のＰＡＨｓ等を挙げることができる。
【００６９】
その他、本発明はその趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者の知識に基づき種々なる改良、修正、変形を加えた態様で実施しうるものである。
【００７０】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００７１】
（基礎培地の調製）
ＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社製）培地５００ｍｌに、ウシ胎児血清（インビトロジェン社製）５０ｍｌとペニシリン／ストレプトマイシン混合（体積比１：１）溶液（ナカライテスク社製）１１ｍｌとを混合し、基礎培地を調製した。
【００７２】
（組み換え細胞の培養）
上記基礎培地を用いて、９６穴プレート上でマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１（ゼノバイオティックディテクションシステム（ＸＤＳ）社製）を１４〜２４時間培養して、約７．５×１０５個／ウェルとした後、プレートを逆さにして、培養後の細胞から基礎培地を取り除いた。
【実施例１】
【００７３】
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾパラジオキシン（以下、ＴＣＤＤという。）（ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ（ＣＩＬ）社製）と、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという。）（生化学用、和光純薬工業（株）製）とから、先ず２５０ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液８μｌを調製し、その後、２倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１２５〜０．１ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００７４】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール（和光純薬工業（株）製）のエタノール（和光純薬工業（株）製）溶液１０μｌを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサン（和光純薬工業（株）製）を加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００７５】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００７６】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とルミノメーター（Ａｎｔｈｏｓ社製）とを用いてルシフェラーゼ活性（相対発光強度；ＲＬＵ）を測定した。その結果を表１に示す。また、かかる表１について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図３に示す。
【００７７】
【表１】
（比較例１）
【００７８】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌを加える代わりに、エタノール１０μｌを加えた他は実施例１と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表１に示す。また、かかる表１について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図３に示す。
【実施例２】
【００７９】
ＴＣＤＤとＤＭＳＯとから、先ず１５．６ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液１２μｌを調製し、その後、２／３倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１５．６〜０．４ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００８０】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール−エタノール溶液１０μｌと、濃度５００μｇ／ｍｌのプロテアソーム抑制物質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）のエタノール溶液（和光純薬（株）製）１０μｌとを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサンを加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール及びプロテアソーム抑制物質添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００８１】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００８２】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキットとルミノメーターとを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。また、かかる表２について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図４に示す。
【００８３】
【表２】
（比較例２）
【００８４】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌ、及びプロテアソーム抑制物質−エタノール溶液１０μｌを加える代わりに、エタノール２０μｌを加えた他は実施例２と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。また、かかる表２について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図４に示す。
【実施例３】
【００８５】
ＴＣＤＤとＤＭＳＯとから、先ず１５．６ｐｇ／ｍｌのＴＣＤＤのＤＭＳＯ溶液１２μｌを調製し、その後、２／３倍希釈によって、ＴＣＤＤ濃度１５．６〜０．４ｐｇ／ｍｌまでのＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌを調製した。
【００８６】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、濃度１００μｇ／ｍｌのコルチゾール−エタノール溶液１０μｌと、コレステロール酸化生成物（ＳＩＧＭＡ製）０．５μｇとを加え、さらに、各溶液の総量が１ｍｌとなるようにヘキサンを加え撹拌した。その後、遠心式エバポレーターを用いてコルチゾール及びコレステロール酸化生成物添加後の各溶液からエタノール及びヘキサンを留去した。
【００８７】
濃縮後の各溶液に、予め調製した基礎培地４００μｌをそれぞれ加えて撹拌し、ＴＣＤＤ濃度の異なる細胞培養培地を調製した。そして、かかる細胞培養培地を、上記培養後のマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１に１９０μｌ／ウェル加え、３７℃、ＣＯ２５％環境下で、２０〜２４時間培養した。
【００８８】
培養後、培地を取り除き、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１の細胞膜を溶解し、ルシフェラーゼアッセイキットとルミノメーターとを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。また、かかる表３について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図５に示す。
【００８９】
【表３】
（比較例３）
【００９０】
各濃度のＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液４μｌに、上記のコルチゾール−エタノール溶液１０μｌ、及びコレステロール酸化生成物０．５μｇを加える代わりに、エタノール１０μｌを加えた他は実施例３と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。また、かかる表３について、ＴＣＤＤ濃度に対してＲＬＵをプロットしたものを図５に示す。
【００９１】
表１及び図３より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイドを添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度が上がる程顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに０．５ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９２】
また、表２及び図４より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイド及びプロテアソーム抑制物質を添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度１．５〜１０ｐｇ／ｍｌ付近で顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに１．９ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９３】
また、表３及び図５より、レポータージーンアッセイにおいて、基礎培地に糖質コルチコイド及びコレステロール酸化生成物を添加して構成される細胞培養培地で組み換え細胞を培養することにより、従来の培養培地で組み換え細胞を培養したときよりもＲＬＵが大きくなったことから、その検出感度が上がることが分かった。特に、その効果は、ＴＣＤＤ濃度１．５〜１０ｐｇ／ｍｌ付近で顕著であった。また、その定量限界（定量下限値）も、従来の方法に比べてさらに１．５９ｐｇ／ｍｌ下げ得ることがわかった。
【００９４】
なお、表１乃至３に記載する、実施例１乃至３及び比較例１乃至３にかかるＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液の定量下限値は、実施例１乃至３及び比較例１乃至３の操作に先駆けて以下の操作を行うことにより算出した。すなわち、先ず、表１乃至３に記載するＴＣＤＤ−ＤＭＳＯ溶液を用いる代わりに、ＤＭＳＯ４μｌを用いた（ＴＣＤＤ濃度を０ｐｇ／ｍｌとした）以外は実施例１乃至３及び比較例１乃至３と同様にしてマウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１を培養し、培養後のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を求めた。かかる操作を、実施例１及び比較例１については６回、実施例２及び比較例２については４回、実施例３及び比較例３については３回行った後、得られるＲＬＵの数値から図３乃至５に基づいてそれぞれＴＣＤＤ濃度を計算し、その標準偏差（ＳＤ）を算出した。最後に、かかる値を１０倍した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢの生物への作用メカニズムを示す。
【図２】レポータージーンアッセイにおける、ダイオキシン類やコプラナーＰＣＢのルシフェラーゼ遺伝子発現メカニズムを示す。
【図３】基礎培地に糖質コルチコイドが添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】基礎培地に糖質コルチコイドとプロテアソーム抑制物質が添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】基礎培地に糖質コルチコイドとコレステロール酸化生成物が添加された時の、レポータージーンアッセイのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培地と、糖質コルチコイドと、被測定試料から抽出される芳香族炭化水素レセプター結合物質とを混合して、細胞培養培地とする工程と、
芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部または一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞を、前記細胞培養培地で培養する工程と、
を含んで構成され、前記組み換え細胞から産生されるレポータータンパクの活性から、前記被測定試料中の芳香族炭化水素レセプター結合物質の含有量を測定するレポータージーンアッセイ。
【請求項２】
前記細胞培養培地とする工程が、さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなされる請求項１に記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項３】
前記細胞培養培地とする工程が、さらにコレステロール酸化生成物を混合してなされる請求項１または２に記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項４】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項１から３のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項５】
前記基礎培地を、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して調製し、
前記組み換え細胞をＨｅｐａ１ｃｌｃ７から作製する請求項１から４のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１から５のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項７】
芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部または一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞と、前記組み換え細胞の培養に用いられる培地を調製するための培地セットとを備えるレポータージーンアッセイ用キットであって、
前記培地セットが糖質コルチコイドを備えるレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項８】
前記培地セットがプロテアソーム抑制物質を備える請求項７に記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項９】
前記培地セットがコレステロール酸化生成物を備える請求項７または８に記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１０】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項７から９のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１１】
前記培地セットが、ＲＰＭＩ１６４０培地と、ウシ胎児血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンとを備える請求項７から１０のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項７から１１のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１３】
前記組み換え細胞が、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１である請求項７から１２のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１４】
基礎培地と糖質コルチコイドとを混合してなる培養培地。
【請求項１５】
さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなる請求項１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
さらにコレステロール酸化生成物を混合してなる請求項１４または１５に記載の培養培地。
【請求項１７】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項１４から１６のいずれかに記載の培養培地。
【請求項１８】
前記基礎培地が、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して構成される請求項１４から１７のいずれかに記載の培養培地。
【請求項１】
基礎培地と、糖質コルチコイドと、被測定試料から抽出される芳香族炭化水素レセプター結合物質とを混合して、細胞培養培地とする工程と、
芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部または一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞を、前記細胞培養培地で培養する工程と、
を含んで構成され、前記組み換え細胞から産生されるレポータータンパクの活性から、前記被測定試料中の芳香族炭化水素レセプター結合物質の含有量を測定するレポータージーンアッセイ。
【請求項２】
前記細胞培養培地とする工程が、さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなされる請求項１に記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項３】
前記細胞培養培地とする工程が、さらにコレステロール酸化生成物を混合してなされる請求項１または２に記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項４】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項１から３のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項５】
前記基礎培地を、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して調製し、
前記組み換え細胞をＨｅｐａ１ｃｌｃ７から作製する請求項１から４のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１から５のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ。
【請求項７】
芳香族炭化水素レセプターを介して活性が制御される遺伝子の全部または一部をレポーター遺伝子に組み換えた組み換え細胞と、前記組み換え細胞の培養に用いられる培地を調製するための培地セットとを備えるレポータージーンアッセイ用キットであって、
前記培地セットが糖質コルチコイドを備えるレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項８】
前記培地セットがプロテアソーム抑制物質を備える請求項７に記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項９】
前記培地セットがコレステロール酸化生成物を備える請求項７または８に記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１０】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項７から９のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１１】
前記培地セットが、ＲＰＭＩ１６４０培地と、ウシ胎児血清と、ペニシリンと、ストレプトマイシンとを備える請求項７から１０のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項７から１１のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１３】
前記組み換え細胞が、マウス肝がん細胞Ｈ１Ｌ６．１である請求項７から１２のいずれかに記載のレポータージーンアッセイ用キット。
【請求項１４】
基礎培地と糖質コルチコイドとを混合してなる培養培地。
【請求項１５】
さらにプロテアソーム抑制物質を混合してなる請求項１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
さらにコレステロール酸化生成物を混合してなる請求項１４または１５に記載の培養培地。
【請求項１７】
前記糖質コルチコイドがコルチゾールである請求項１４から１６のいずれかに記載の培養培地。
【請求項１８】
前記基礎培地が、ＲＰＭＩ１６４０培地とウシ胎児血清とペニシリンとストレプトマイシンとを混合して構成される請求項１４から１７のいずれかに記載の培養培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７８８８
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【発行日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１８６２（Ｐ２００５−５１１８６２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０２１２
【国際出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【出願人】（５９１２３７３３１）株式会社日吉 (6)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【発行日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０２１２
【国際出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【出願人】（５９１２３７３３１）株式会社日吉 (6)
【Ｆターム（参考）】
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