レーザ顕微鏡装置
【課題】コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子励起の蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とする。
【解決手段】極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源４と、極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐するビームスプリッタ５と、２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波するレーザコンバイナ８と、合波された極短パルスレーザ光を標本Ａに照射する顕微鏡本体３と、レーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置９と、２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるフォトニッククリスタルファイバ１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置１０とを備えるレーザ顕微鏡装置１を採用する。
【解決手段】極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源４と、極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐するビームスプリッタ５と、２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波するレーザコンバイナ８と、合波された極短パルスレーザ光を標本Ａに照射する顕微鏡本体３と、レーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置９と、２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるフォトニッククリスタルファイバ１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置１０とを備えるレーザ顕微鏡装置１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いるのが良い。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうと、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。
【０００７】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、前記２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波された極短パルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、前記レーザ光源と前記分岐手段との間に設けられ、前記レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、前記分岐手段によって分岐された２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、前記分岐手段と前記周波数変換手段との間に設けられ、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００１０】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、レーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光のような極短パルスレーザ光が、第１の周波数分散調節手段を通過した後、分岐手段により２つの光路に分岐される。そして、２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光が合波手段により合波され、合波された極短パルスレーザ光が、照射手段により標本に照射される。
【００１１】
この際、多光子蛍光観察時には、第１の周波数分散調節手段により、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することで、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。また、レーザ光源と分岐手段との間に第１の周波数分散調節手段を配置することで、極短パルスレーザ光源の波長変更時や環境要因に伴う光軸変動の影響による第１の周波数分散調整手段内のアライメントずれを抑える事ができ、結果的に安定的な分散補償が可能となる。
【００１２】
また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時には、周波数変換手段により、２つの光路を導光される各極短パルスレーザ光に、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、第１の周波数分散調節手段および第２の周波数分散調節手段により、２つの光路を導光される各極短パルスレーザ光に等しい周波数分散量を与えることで、時間軸上の各時刻において、２つの極短パルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つの極短パルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。
【００１３】
以上のように、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、１台のレーザ顕微鏡装置により、一方の光路を導光される極短パルスレーザ光を用いて多光子蛍光観察を行うとともに、２つの光路を導光される極短パルスレーザ光を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができ、マルチモーダルな観察が可能となる。
【００１４】
上記発明において、前記第２の周波数分散調節手段が、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、第２の周波数分散調節手段によって、極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節し、周波数変換手段に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、周波数変換手段における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００１５】
上記発明において、前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上における極短パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
これにより、標本面上において２つの極短パルスレーザ光のタイミングを調整し、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つの極短パルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差を任意に調整することで、標本中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００１６】
上記発明において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。
【００１７】
上記発明において、前記第２の周波数分散調節手段が、線形分散ガラス媒質であることとしてもよい。
第２の周波数分散調節手段として線形分散ガラス媒質を用いることにより、簡易かつ安価に、周波数変換手段に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、周波数変換手段における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００１８】
上記発明において、前記２つの光路に、極短パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、光量調節手段を作動させて、各光路の極短パルスレーザ光の光量を調節し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および／または多光子蛍光の発生強度を調整することで、最適な画像で観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体（照射・観察手段）３とを備えている。
【００２１】
レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、該２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’を合波するレーザコンバイナ（合波手段）８とを備えている。
【００２２】
レーザ光源４とビームスプリッタ５との間には、レーザ光源４から出射されたフェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）９が設けられている。
第１の周波数分散装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、第１の周波数分散装置９を通過するパルスレーザ光に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。
【００２３】
また、第１の周波数分散装置９は、多光子蛍光観察時には、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。具体的には、第１の周波数分散装置９は、パルスレーザ光Ｌ１が第１の周波数分散装置９から標本Ａまでに経験する周波数分散量を減じるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってパルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光Ｌ１が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができる。
【００２４】
第２の光路７には、パルスレーザ光Ｌ２に与える周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）１０と、第２の周波数分散装置１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の周波数帯域を変更するフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１通過後のパルスレーザ光Ｌ２’’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）２１とが設けられている。
【００２５】
第２の周波数分散装置１０は、例えば線形分散ガラス媒質を備えており、第２の周波数分散装置１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’が、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される直前で略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。具体的には、第２の周波数分散装置１０は、パルスレーザ光Ｌ２’が第２の周波数分散装置１０から標本Ａまでに経験する周波数分散量を加えるようになっている。
【００２６】
フォトニッククリスタルファイバ１１は、導光されるパルスレーザ光Ｌ２’の周波数帯域を変更、および／または、拡大したパルスレーザ光Ｌ２’’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００２７】
光路調節装置２１は、例えば、少なくとも２組以上のミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。これらリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’’の光路を折り返し、これらリフレクタの間隔を調節することで、パルスレーザ光Ｌ２’’の光路長を変化させるようになっている。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
【００２８】
レーザコンバイナ８は、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’を合波する合波部（図示略）と、パルスレーザ光Ｌ２’’から所望の周波数帯域の成分を切り出すフィルタ（図示略）とを備えている。このフィルタにパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるに際し不要な周波数成分を除去することができる。
【００２９】
顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。
【００３０】
図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５により集光され第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ１３により集光され第１の検出器１４で検出されてもよい。
【００３１】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、第１の周波数分散装置９を通過されることにより、初期の周波数分散量が与えられる。
【００３２】
初期の周波数分散量を与えられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
第１の光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６に導光されてレーザコンバイナ８に入射する。
【００３３】
一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、第２の周波数分散装置１０を通過させられることにより、第２の周波数分散装置１０から標本Ａ面上までに経験する周波数分散量を加えられ、略フーリエ限界パルス光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。
【００３４】
パルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバ１１を通過させられることにより、第１の光路６のパルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更、および／または、拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’’）となってレーザコンバイナ８に入射する。また、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１１を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。
【００３５】
ここで、パルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量と、パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻において異なる状態となる。この状態においては、パルスレーザ光L１，Ｌ２’’のエネルギーを、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために、効率よく利用することができない。
【００３６】
そこで、第１の周波数分散装置９、および／または、第２の周波数分散装置１０を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００３７】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、光路調節装置２１を作動させて、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図２（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’’の時間的なパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
【００３８】
以上のように第１の周波数分散装置９、第２の周波数分散装置１０、および光路調節装置２１を作動させることで、図３に示されるように、レーザコンバイナ８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。
【００３９】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００４０】
標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４１】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。
また、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることで、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４２】
また、光路調節装置２１により、２つの光路６，７を通過してレーザコンバイナ８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の時間的なタイミングを調節することで、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、標本Ａの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００４３】
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１１を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、パルスタイミング調節手段として、ミラー（リフレクタ）を有する光路調節装置２１を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
【００４４】
また、第２の周波数分散調節装置１０として、線形分散ガラス媒質を採用することで、簡易かつ安価に、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、フォトニッククリスタルファイバ１１における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００４５】
また、レーザ光源装置２と第１の周波数分散装置９とが、一体型となっている場合にも、上述のように第１の周波数分散装置９、第２の周波数分散装置１０、および光路調節装置２１を作動させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００４６】
なお、レーザコンバイナ８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
【００４７】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。
【００４８】
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、第１の周波数分散装置９を作動させることにより、図４（ａ）の矢印Ｐ３に示すように、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図４（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００４９】
標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００５０】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、レーザ光源４を用いて多光子蛍光観察を行うことができる。また、レーザ光源４とビームスプリッタ５との間に第１の周波数分散装置９を配置することで、レーザ光源４の波長変更時や環境要因に伴う光軸変動の影響による第１の周波数分散装置９内のアライメントずれを抑える事ができ、結果的に安定的な分散補償が可能となる。
【００５１】
なお、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。
また、多光子励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二高調波光）観察も行うことができる。
【００５２】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００５３】
また、多光子励起の蛍光またはＳＨＧ光の励起効率が多少悪くなっても良い場合は、上記の３種類の観察を切り替えることなく同時に観察することも可能である。また、第１，２の光検出器１４，１６をコヒーレントアンチストークスラマン散乱光、多光子励起の蛍光、ＳＨＧ光のいずれかの光を検出する検出器として割り当ててもよい。また、光検出器が不足する場合は、第１，２の光検出器１４，１６のいずれかと同等の位置に光検出器を新たに追加してもよい。
【００５４】
なお、光路調節装置２１により、２つの光路６，７を通過するパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の時間的なパルスタイミングを調節し、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’それぞれの周波数帯域内で周波数差Ω’を自由に調節することが可能である。このため、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’は、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに略一致する程度でよく、正確な周波数差である必要はない。
【００５５】
つまり、フォトニッククリスタルファイバ１１によるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数帯域の変更、および／または、拡大も正確である必要はない。光路調節装置２１により、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに精度よく一致させることができ、最も効率よく標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００５６】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の変形例として、図５に示すように、第１の光路６にパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する周波数分散装置２３を設けることとしてもよい。このようにすることで、第１の周波数分散装置９および第２の周波数分散装置１０を調節することなく、周波数分散装置２３通過後のパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を、パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節することができる。これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために各パルスレーザ光に与える周波数分散量の調整を容易なものとすることができる。
【００５７】
また、周波数分散装置９、１０、２３として、周波数分散量が固定のものを複数用意し、段階的に切り替える方式や、挿脱可能方式により、フェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を切り替える構成を採用してもよい。
【００５８】
また、周波数分散装置９、１０、２３は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置９、１０、２３は、所望の周波数分散量を得るように調整された光ファイバであってもよい。
【００５９】
また、少なくとも一方の光路６，７に、例えば減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’ ’の光量調整ができ、結果的に最適な画像観察を行う事が出来る。
【００６０】
また、多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路７をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路７への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。
【００６１】
また、レーザ光源４は、フェムト秒パルスレーザ光を出射することとして説明したが、これよりもパルス幅の短いアト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光を出射することとしてもよい。
また、周波数変換手段はフォトニッククリスタルファイバ１１であるとして説明したが、これに代えて、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）調整後をそれぞれ示している。
【図３】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図５】図１の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００６３】
Ａ 標本
Ｌ１，Ｌ２ フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ２’’ パルスレーザ光
Ω，Ω’ 周波数（差）
１ レーザ顕微鏡装置
２ レーザ光源装置
３ 顕微鏡本体（照射・観察手段）
４ レーザ光源
５ ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７ 光路
８ レーザコンバイナ（合波手段）
９ 第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）
１０ 第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）
１１ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
２１ 光路調節装置（パルスタイミング調節手段）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いるのが良い。なぜならば、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうと、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率的に利用できなくなってしまう。
【０００７】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、前記２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波された極短パルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、前記レーザ光源と前記分岐手段との間に設けられ、前記レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、前記分岐手段によって分岐された２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、前記分岐手段と前記周波数変換手段との間に設けられ、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００１０】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、レーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光のような極短パルスレーザ光が、第１の周波数分散調節手段を通過した後、分岐手段により２つの光路に分岐される。そして、２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光が合波手段により合波され、合波された極短パルスレーザ光が、照射手段により標本に照射される。
【００１１】
この際、多光子蛍光観察時には、第１の周波数分散調節手段により、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することで、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。また、レーザ光源と分岐手段との間に第１の周波数分散調節手段を配置することで、極短パルスレーザ光源の波長変更時や環境要因に伴う光軸変動の影響による第１の周波数分散調整手段内のアライメントずれを抑える事ができ、結果的に安定的な分散補償が可能となる。
【００１２】
また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時には、周波数変換手段により、２つの光路を導光される各極短パルスレーザ光に、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、第１の周波数分散調節手段および第２の周波数分散調節手段により、２つの光路を導光される各極短パルスレーザ光に等しい周波数分散量を与えることで、時間軸上の各時刻において、２つの極短パルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つの極短パルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。
【００１３】
以上のように、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、１台のレーザ顕微鏡装置により、一方の光路を導光される極短パルスレーザ光を用いて多光子蛍光観察を行うとともに、２つの光路を導光される極短パルスレーザ光を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができ、マルチモーダルな観察が可能となる。
【００１４】
上記発明において、前記第２の周波数分散調節手段が、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、第２の周波数分散調節手段によって、極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節し、周波数変換手段に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、周波数変換手段における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００１５】
上記発明において、前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上における極短パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段を備えることとしてもよい。
これにより、標本面上において２つの極短パルスレーザ光のタイミングを調整し、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つの極短パルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差を任意に調整することで、標本中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００１６】
上記発明において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。
【００１７】
上記発明において、前記第２の周波数分散調節手段が、線形分散ガラス媒質であることとしてもよい。
第２の周波数分散調節手段として線形分散ガラス媒質を用いることにより、簡易かつ安価に、周波数変換手段に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、周波数変換手段における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００１８】
上記発明において、前記２つの光路に、極短パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、光量調節手段を作動させて、各光路の極短パルスレーザ光の光量を調節し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および／または多光子蛍光の発生強度を調整することで、最適な画像で観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体（照射・観察手段）３とを備えている。
【００２１】
レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、該２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’を合波するレーザコンバイナ（合波手段）８とを備えている。
【００２２】
レーザ光源４とビームスプリッタ５との間には、レーザ光源４から出射されたフェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）９が設けられている。
第１の周波数分散装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、第１の周波数分散装置９を通過するパルスレーザ光に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。
【００２３】
また、第１の周波数分散装置９は、多光子蛍光観察時には、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。具体的には、第１の周波数分散装置９は、パルスレーザ光Ｌ１が第１の周波数分散装置９から標本Ａまでに経験する周波数分散量を減じるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってパルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光Ｌ１が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができる。
【００２４】
第２の光路７には、パルスレーザ光Ｌ２に与える周波数分散量を調節する第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）１０と、第２の周波数分散装置１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の周波数帯域を変更するフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１通過後のパルスレーザ光Ｌ２’’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）２１とが設けられている。
【００２５】
第２の周波数分散装置１０は、例えば線形分散ガラス媒質を備えており、第２の周波数分散装置１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’が、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される直前で略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。具体的には、第２の周波数分散装置１０は、パルスレーザ光Ｌ２’が第２の周波数分散装置１０から標本Ａまでに経験する周波数分散量を加えるようになっている。
【００２６】
フォトニッククリスタルファイバ１１は、導光されるパルスレーザ光Ｌ２’の周波数帯域を変更、および／または、拡大したパルスレーザ光Ｌ２’’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。
【００２７】
光路調節装置２１は、例えば、少なくとも２組以上のミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。これらリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’’の光路を折り返し、これらリフレクタの間隔を調節することで、パルスレーザ光Ｌ２’’の光路長を変化させるようになっている。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
【００２８】
レーザコンバイナ８は、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’を合波する合波部（図示略）と、パルスレーザ光Ｌ２’’から所望の周波数帯域の成分を切り出すフィルタ（図示略）とを備えている。このフィルタにパルスレーザ光Ｌ２’’を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるに際し不要な周波数成分を除去することができる。
【００２９】
顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。
【００３０】
図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５により集光され第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は集光レンズ１３により集光され第１の検出器１４で検出されてもよい。
【００３１】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、第１の周波数分散装置９を通過されることにより、初期の周波数分散量が与えられる。
【００３２】
初期の周波数分散量を与えられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。
第１の光路６に分岐されたパルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６に導光されてレーザコンバイナ８に入射する。
【００３３】
一方、第２の光路７に分岐されたパルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、第２の周波数分散装置１０を通過させられることにより、第２の周波数分散装置１０から標本Ａ面上までに経験する周波数分散量を加えられ、略フーリエ限界パルス光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。
【００３４】
パルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバ１１を通過させられることにより、第１の光路６のパルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更、および／または、拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’’）となってレーザコンバイナ８に入射する。また、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１１を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。
【００３５】
ここで、パルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量と、パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻において異なる状態となる。この状態においては、パルスレーザ光L１，Ｌ２’’のエネルギーを、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために、効率よく利用することができない。
【００３６】
そこで、第１の周波数分散装置９、および／または、第２の周波数分散装置１０を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００３７】
また、２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、光路調節装置２１を作動させて、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図２（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’’の時間的なパルスタイミングを調節する。これにより、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
【００３８】
以上のように第１の周波数分散装置９、第２の周波数分散装置１０、および光路調節装置２１を作動させることで、図３に示されるように、レーザコンバイナ８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。
【００３９】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００４０】
標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４１】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。
また、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることで、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００４２】
また、光路調節装置２１により、２つの光路６，７を通過してレーザコンバイナ８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の時間的なタイミングを調節することで、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’を、標本Ａの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の別の分子の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００４３】
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１１を使用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、パルスタイミング調節手段として、ミラー（リフレクタ）を有する光路調節装置２１を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
【００４４】
また、第２の周波数分散調節装置１０として、線形分散ガラス媒質を採用することで、簡易かつ安価に、フォトニッククリスタルファイバ１１に導光される直前において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、フォトニッククリスタルファイバ１１における周波数変換を効率良く行うことができ、結果的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率良く発生させることが可能となる。
【００４５】
また、レーザ光源装置２と第１の周波数分散装置９とが、一体型となっている場合にも、上述のように第１の周波数分散装置９、第２の周波数分散装置１０、および光路調節装置２１を作動させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。
【００４６】
なお、レーザコンバイナ８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
【００４７】
また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。
【００４８】
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、第１の周波数分散装置９を作動させることにより、図４（ａ）の矢印Ｐ３に示すように、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図４（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
【００４９】
標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００５０】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、レーザ光源４を用いて多光子蛍光観察を行うことができる。また、レーザ光源４とビームスプリッタ５との間に第１の周波数分散装置９を配置することで、レーザ光源４の波長変更時や環境要因に伴う光軸変動の影響による第１の周波数分散装置９内のアライメントずれを抑える事ができ、結果的に安定的な分散補償が可能となる。
【００５１】
なお、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。
また、多光子励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二高調波光）観察も行うことができる。
【００５２】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射するレーザ光源４を用いて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。
【００５３】
また、多光子励起の蛍光またはＳＨＧ光の励起効率が多少悪くなっても良い場合は、上記の３種類の観察を切り替えることなく同時に観察することも可能である。また、第１，２の光検出器１４，１６をコヒーレントアンチストークスラマン散乱光、多光子励起の蛍光、ＳＨＧ光のいずれかの光を検出する検出器として割り当ててもよい。また、光検出器が不足する場合は、第１，２の光検出器１４，１６のいずれかと同等の位置に光検出器を新たに追加してもよい。
【００５４】
なお、光路調節装置２１により、２つの光路６，７を通過するパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の時間的なパルスタイミングを調節し、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’それぞれの周波数帯域内で周波数差Ω’を自由に調節することが可能である。このため、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’’の周波数差Ω’は、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに略一致する程度でよく、正確な周波数差である必要はない。
【００５５】
つまり、フォトニッククリスタルファイバ１１によるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数帯域の変更、および／または、拡大も正確である必要はない。光路調節装置２１により、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに精度よく一致させることができ、最も効率よく標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。
【００５６】
また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の変形例として、図５に示すように、第１の光路６にパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する周波数分散装置２３を設けることとしてもよい。このようにすることで、第１の周波数分散装置９および第２の周波数分散装置１０を調節することなく、周波数分散装置２３通過後のパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を、パルスレーザ光Ｌ２’’の周波数分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節することができる。これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために各パルスレーザ光に与える周波数分散量の調整を容易なものとすることができる。
【００５７】
また、周波数分散装置９、１０、２３として、周波数分散量が固定のものを複数用意し、段階的に切り替える方式や、挿脱可能方式により、フェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を切り替える構成を採用してもよい。
【００５８】
また、周波数分散装置９、１０、２３は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置９、１０、２３は、所望の周波数分散量を得るように調整された光ファイバであってもよい。
【００５９】
また、少なくとも一方の光路６，７に、例えば減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’ ’の光量調整ができ、結果的に最適な画像観察を行う事が出来る。
【００６０】
また、多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路７をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路７への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。
【００６１】
また、レーザ光源４は、フェムト秒パルスレーザ光を出射することとして説明したが、これよりもパルス幅の短いアト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光を出射することとしてもよい。
また、周波数変換手段はフォトニッククリスタルファイバ１１であるとして説明したが、これに代えて、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）調整後をそれぞれ示している。
【図３】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図５】図１の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００６３】
Ａ 標本
Ｌ１，Ｌ２ フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’，Ｌ２’’ パルスレーザ光
Ω，Ω’ 周波数（差）
１ レーザ顕微鏡装置
２ レーザ光源装置
３ 顕微鏡本体（照射・観察手段）
４ レーザ光源
５ ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７ 光路
８ レーザコンバイナ（合波手段）
９ 第１の周波数分散装置（第１の周波数分散調節手段）
１０ 第２の周波数分散装置（第２の周波数分散調節手段）
１１ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
２１ 光路調節装置（パルスタイミング調節手段）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、
該レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波された極短パルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、
前記レーザ光源と前記分岐手段との間に設けられ、前記レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、
前記分岐手段によって分岐された２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、
前記分岐手段と前記周波数変換手段との間に設けられ、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第２の周波数分散調節手段が、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上における極短パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第２の周波数分散調節手段が、線形分散ガラス媒質である請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記２つの光路に、極短パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられている請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項１】
極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、
該レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記２つの光路を導光されてきた極短パルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波された極短パルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、
前記レーザ光源と前記分岐手段との間に設けられ、前記レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第１の周波数分散調節手段と、
前記分岐手段によって分岐された２つの光路のいずれか一方に設けられ、前記２つの光路を導光される極短パルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、
前記分岐手段と前記周波数変換手段との間に設けられ、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光の周波数分散量を調節する第２の周波数分散調節手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第２の周波数分散調節手段が、前記周波数変換手段に導光される極短パルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記２つの光路の少なくとも一方に、前記標本面上における極短パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第２の周波数分散調節手段が、線形分散ガラス媒質である請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記２つの光路に、極短パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられている請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−９６６６６（Ｐ２０１０−９６６６６Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６８７３２（Ｐ２００８−２６８７３２）
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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