レーザ顕微鏡装置
【課題】誘導ラマン散乱イメージングおよび多光子励起の蛍光のイメージングを同一の装置において両立することを可能とし、種々のイメージング方法により標本のイメージングを行う。
【解決手段】標本中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに略等しい周波数差Ω′を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を２つの光路Ｌ１，Ｌ２に導光し、導光されてきたパルスレーザ光１０６、１０７を合波する合波手段１０８と、一方に周波数分散調節手段１０９と、他方にパルスレーザ光変調手段１１０と、前記合波手段１０８により合波された前記２つのパルスレーザ光を標本中に集光し、標本中の分子の特定の分子振動から発生した誘導ラマン散乱を前記パルスレーザ変調部の変調に同期して検出する変調信号検出手段１１７と、を有することを特徴とするレーザ顕微鏡装置１０１を提供する。
【解決手段】標本中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに略等しい周波数差Ω′を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を２つの光路Ｌ１，Ｌ２に導光し、導光されてきたパルスレーザ光１０６、１０７を合波する合波手段１０８と、一方に周波数分散調節手段１０９と、他方にパルスレーザ光変調手段１１０と、前記合波手段１０８により合波された前記２つのパルスレーザ光を標本中に集光し、標本中の分子の特定の分子振動から発生した誘導ラマン散乱を前記パルスレーザ変調部の変調に同期して検出する変調信号検出手段１１７と、を有することを特徴とするレーザ顕微鏡装置１０１を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導ラマン散乱過程を利用して特定の分子をイメージングするレーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光と分子との相互作用の１つに誘導ラマン散乱がある。誘導ラマン散乱は３次の非線形光学効果の１つであり、光と分子の分子振動とが相互作用することにより、該分子振動の振動エネルギーだけずれた光が散乱されること（ラマン散乱）を基にする過程である。この誘導ラマン散乱過程を利用することで、蛍光色素や蛍光タンパクといったプローブを用いることなく標本中の分子を無染色にイメージングできる顕微鏡の１つに、誘導ラマン散乱顕微鏡というものがある（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
誘導ラマン散乱顕微鏡では、標本中の分子の特定の分子振動からの誘導ラマン散乱に起因する信号を検出し、描画コントラストとして用いることで標本中の分子を無染色にイメージングすることが可能となる。さらには、誘導ラマン散乱に利用する分子の特定の分子振動を選択することで、標本中の種々の分子を無染色にイメージングすることも原理上可能となる。
【０００４】
この誘導ラマン散乱顕微鏡の原理を詳細に述べる。通常、誘導ラマン散乱を発生させるための励起光として、周波数（波長と同義）の異なる２つのパルスレーザ光を用いる。２つのパルスレーザ光の周波数差を標本中の分子の特定の分子振動の周波数に一致するように調節する。こうした状態で、２つのパルスレーザ光を標本中に集光することで、標本中の分子の特定の分子振動に起因した誘導ラマン散乱が発生する。
【０００５】
誘導ラマン散乱は、励起光として用いた２つのパルスレーザ光のうち、周波数の高い（波長の短い）パルスレーザ光（ポンプ光）のエネルギーの一部が、周波数の低い（波長の長い）パルスレーザ光（ストークス光）に移動したと考えることができる。このエネルギーの移動の際に、標本中の特定の分子振動が介在していると見なすことができる。このエネルギーの移動は、ポンプ光の強度減少（誘導ラマンロス：ΔIraman_loss）およびストークス光強度増加（誘導ラマンゲイン：Δiraman_gain）として下記の式１のように定式化されている。ここでNは誘導ラマンに寄与する分子数、σは分子のラマン散乱断面積、Ipump, Istokesはそれぞれポンプ光とストークス光の強度である。
【０００６】
〔数１〕
誘導ラマンゲイン ΔIraman_gain = NxσxIpump x Istokes
誘導ラマンロス ΔIraman_loss = - NxσxIpump x Istokes
【０００７】
上記説明のとおり、誘導ラマン散乱顕微鏡では、ポンプ光またはストークス光の強度変化（誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロス）を検出し、描画コントラストとして用いることで標本中の分子を無染色にイメージングすることが可能となる。このことは、誘導ラマン散乱顕微鏡が、蛍光顕微鏡において励起光と異なる周波数を持つ蛍光を検出するように分光選択的に検出することができないことを意味する。
【０００８】
ここで、非特許文献１にも示されているように、従来、誘導ラマン散乱イメージングを行うためのパルスレーザ光としては、比較的狭い周波数帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の分子振動の周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、強い誘導ラマン散乱が発生し、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出することで標本の分子のイメージングを行うことができる。
【０００９】
一方で、標本の特定分子にあらかじめ所定の蛍光物質をラベリングしておき、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１８５７（２００８）
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
誘導ラマン散乱顕微鏡において、比較的周波数帯域が狭い（または、パルス幅が広い）ピコ秒パルスレーザ光が用いられている（例えば、非特許文献１）。これは、標本中の分子の特定の分子振動からの誘導ラマンを効率的に発生させるためである。というのも、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いた場合、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の分子振動からの誘導ラマン散乱の発生に効率的に利用できないためである。周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いた場合、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の分子振動の周波数に一致しない成分も含まれる。これら分子の特定の分子振動の周波数に一致しない成分は、該分子振動からの誘導ラマン散乱の発生に寄与しない。
【００１３】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減してイメージングを行うことを目的として、周波数スペクトル帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用される。さらには、標本中においてフーリエ限界パルスに近い状態となるように集光することで、蛍光の励起効率をより高めることが可能となる。
【００１４】
上記理由から、誘導ラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違しており、同一のレーザ顕微鏡装置によって達成することが困難である。ところが、種々の分子は異なる分子情報を総合的に評価しなければ正確な分類等の評価ができない場合があり、同一の装置内で同じ標本から多様な分子情報を得ることが望ましい。
【００１５】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、誘導ラマン散乱イメージングおよび多光子型（多光子過程を有する）の観察（例えば蛍光イメージング）を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、標本中の分子が低濃度であっても高感度に分子振動をイメージングでき、これにより蛍光等の他のイメージングと併用して多様で且つ高感度な検出情報を提供できるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述した課題を解決するために、本発明者らは、誘導ラマン散乱を用いたイメージングのための光学系と、他の組合せが有望なイメージング用の光学系とを共通の構成で実施できるだけではなく使用するレーザ光の仕様を共通化することもできる構成を鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち、周波数分散量調節手段により、導光される２つの各パルスレーザ光に、周波数分散を与えることができる。周波数分散を与えることで、各パルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、フェムト秒パルスレーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、与える周波数分散量を適切に調節することで、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数帯域を有している状態を作ることができる。さらには、導光される２つのパルスレーザ光の周波数分散量を調節することで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を任意に調節することが可能となる。また、適切に与える周波数分散量を調節することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つことも可能となる。ここで、「周波数分散量」のことを「チャープ」と一般的に呼ばれることもある。
【００１７】
このように２つのパルスレーザ光の周波数差を調節した状態で、標本面上に集光することにより、標本中に含まれる分子のうち２つのパルスレーザ光の周波数差と等しい周波数を持つ分子振動において誘導ラマン散乱が発生する。このとき、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することで２つのパルスレーザ光のエネルギーを誘導ラマン散乱に効率的に利用することができる。もちろん、適切に与える周波数分散量を調節し、２つのパルスレーザ光の周波数差が一定となる場合、最も効率よく２つのパルスエネルギーを誘導ラマン散乱用いることができる。
【００１８】
先述のとおり、誘導ラマン散乱顕微鏡では、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出することでイメージングを行う。２つのパルスレーザ光うち周波数が高いパルスレーザ光の強度の減分（ポンプ光）、または、他方のパルスレーザ光の強度の増分（ストークス光）を検出する（式１参照）。通常、誘導ラマン散乱によるポンプ光またはストークス光の強度の増減は微小であるため、該強度の増減がポンプ光やストークス光のレーザノイズなどに埋もれる恐れがある。そこで、該増減を高感度に検出するために、パルスレーザ光変調手段により、パルスレーザ光に一定の周波数で変調を加える。該変調を加えることで、標本中の特定の分子において発生する誘導ラマン散乱も同様に変調される。結果として、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスによるポンプ光またはストークス光の強度の増減も同様に変調される。この変調されたポンプ光またはストークス光の強度の増減を、変調信号検出手段において、パルスレーザ光変調手段の変調周波数に同期した形で検出する。
【００１９】
以上の説明のように、フェムト秒パルスレーザ光のような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を用いた場合においても、効率的に誘導ラマン散乱光を発生させることが可能となる。
【００２０】
一方、フェムト秒レーザのような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を利用した場合、２つのパルスレーザ光のうちいずれか一方を標本中に集光することにより、多光子蛍光観察や第２光調波観察を行うことが可能となる。つまり、１台のレーザ顕微鏡装置により、誘導ラマン散乱観察、多光子観察、第二高調波観察を行うことが可能となる。
【００２１】
上記発明においては、パルスレーザ光変調手段がパルスレーザ光の位相を変調することであっても良い（ここで言う「位相」とは、パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するような位相量も含む）。一方のパルスレーザ光の位相を適切に調節することで、２つのパルスレーザ光が「時間的に重なった状態」と「重ならない状態」との間で変調（位相変調）することが可能となる。これにより、誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスの強度も同様に変調(強度変調)される。この強度変調された誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスを捉えることで誘導ラマン散乱イメージングを行う。こうすることで、パルスレーザ光に対しては位相変調を与えるため、パルスレーザ光の強度は変化しない。このため、誘導ラマン散乱イメージングに加えて、多光子蛍光イメージングや第二高調波イメージングを行う場合、それぞれのイメージングに影響を与えることなく同時観察することが可能となる。
【００２２】
上記発明においては、パルスレーザ光変調手段がパルスレーザ光の強度を変調することであっても良い。一方のパルスレーザ光の強度を適切に変調することで、標本中の分子の特定の分子振動から発生する誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスの強度も同様に変調される。この強度変調された誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスを捉えることで誘導ラマン散乱イメージングを行う。こうすることで、パルスレーザ光の強度変調量を制御することにより、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの変調量も自由に調節することが可能となる。このため、誘導ラマン散乱イメージングを行う標本中の分子振動の種類や標本の環境に応じて、変調量を自由に調節することが可能となる。
【００２３】
さらに、上記発明においては、１ピコ秒以下のパルス幅を有するフェムト秒パルスレーザ光を発生するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、前記分岐手段により分岐された２つの光路のいずれか一方の光路に設けられ、該２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、を備えていても良い。
【００２４】
このようにすることで、単一のレーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光を分岐し、一方の光路において、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるように、フェムト秒パルスレーザ光の周波数を周波数変換手段によって変換し、２つの異なる周波数をもつパルスレーザ光を得ることができる。これにより、２つの周波数の異なるパルスレーザ光のレーザ光源を共通化して装置構成を簡略化しまたシステムの構成コストを下げることができる。
【００２５】
さらに、上記発明においては、前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面 上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備えていても良い。
【００２６】
こうすることで一方のパルスレーザ光に対して、他方のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を２つのパルスレーザ光の周波数帯域内において任意に調整することが可能となる。これにより、標本面上において２つのパルスレーザ光のタイミングを調整し、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つのパルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、効率的に誘導ラマン散乱を発生させることが可能となる。また、周波数差を任意に調整することができるため、標本中の分子の別の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００２７】
また、上記発明においては、前記周波数変換手段が光学非線形ファイバであってもよい。周波数変換手段として光学非線形ファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いる光学非線形ファイバの種類を選定することにより、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することが可能となる。
【００２８】
また、上記発明においては、前記パルスレーザ光変調手段が、電気光学効果を有する電気光学変調素子から構成されていてもよい。このようにすることで、電気光学変調素子の駆動を制御することにより、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の位相（偏光）を制御、変調することができる。さらには、該電気光学変調素子を通過した位相（偏光）が制御されたパルスレーザ光を偏光子に通過させてもよい。こうすることで、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。
【００２９】
また、上記発明においては、前記パルスレーザ光変調手段が、音響光学効果を有する音響光学変調素子から構成されていてもよい。このようにすることで、音響光学素子の駆動を制御することにより、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。こうすることで、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。
【００３０】
また、上記発明においては、前記周波数分散調節手段を、前記レーザ光源と前記分岐手段の間に配置してもよい。このようにすることで、周波数変換手段に入射するパルスレーザ光の周波数分散量を、周波数変換手段における周波数変換効率が最も高くなるように調節できるようになる。
【００３１】
また、上記発明においては、前記周波数分散調節手段が、標本において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定する構成であるのが好ましい。このようにすることで、誘導ラマン散乱イメージングの実行と同時機または順次（または交互）に、多光子励起型の蛍光イメージングおよび／または第二高調波イメージングのような、異なる分子情報が得られる異種のイメージングを一緒に且つ効果的に行うことができるようになる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、誘導ラマン散乱観察および多光子蛍光の観察を同一の装置において、両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１について、図１〜図６を参照して以下に説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１は、図１に示されるように、レーザ光源装置１０２と、該レーザ光源装置１０２からレーザ光を標本Ａに照射し、標本Ａを観察するための顕微鏡本体１０３とから構成されている。レーザ光源装置１０２と顕微鏡本体１０３とは、コンピュータ１３１と互いに接続しており、顕微鏡本体に内蔵された光検出装置１１９が取得したイメージング用データを演算したり画像処理することで、顕微鏡イメージを形成したり、顕微鏡装置に関するあらゆる制御を行なうものである。コンピュータ１３１は、レーザ光源装置１０２および／または顕微鏡本体１０３の動作を制御する制御手段としても機能する。ここで、レーザ顕微鏡装置１０１は、レーザ光源装置１０２と顕微鏡本体１０３とが一体化した構成であってもよく、或いは顕微鏡本体１０３に対しシステムの一部としてユニット化されて接続するような構成であってもよい。同様に、コンピュータ１３１および／または表示手段であるディスプレイ１３２は、顕微鏡本体１０３に内臓された構成であったり、或いは顕微鏡本体１０３に対しシステムの一部としてユニットされ、接続することで顕微鏡本体１０３および／またはレーザ光源装置１０２と相互に連携するような構成であってもよい。
【００３４】
レーザ光源装置１０２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源１０４と、該レーザ光源１０４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ１０５と、該ビームスプリッタ１０５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２をそれぞれ導光する２つの光路１０６と光路１０７と、該２つの光路１０６と光路１０７を導光する２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を合波する合波装置１０８とを備えている。
【００３５】
第１の光路１０６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）１０９およびパルスレーザ光変調装置（パルスレーザ光変調手段）１１０設けられている。第２の光路１０７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数を変換するフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過後に、パルスレーザ光のＬ２′の光路長を調節する光路長調節装置（パルスタイミング調整手段）１１２とが設けられている。
【００３６】
周波数分散調節装置１０９は、例えば、固定長のガラス等の分散媒質（図示略）を備えている。分散媒質の長さを適切に選択することで、周波数分散調節装置１０９を通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ1'に与える周波数分散量を選択することができる。
【００３７】
パルスレーザ光変調装置１１０については、図２を用いて詳細に説明する。図２に示されているように、パルスレーザ光変調装置は、電気光学効果を有する電気光学変調素子２０１と、該電気光学変調素子２０１を通過したパルスレーザ光Ｌ１０を分岐する偏光ビームスプリッタ２０２と、該偏光ビームスプリッタ２０２により分岐されたパルスレーザ光Ｌ１１、Ｌ１２をそれぞれ導光する光路２０３、２０４と、該２つの光路を導光する２つのパルスレーザ光Ｌ１１′、Ｌ１２′の該偏光ビームスプリッタ２０２通過後の光路を共通にするための、ミラーで構成されるリフレクタ２０５、２０６と、該２つの光路２０３, ２０４の光路中に設けられている１／２波長板２０７、２０８と、リフレクタ２０５、２０６の位置が光軸に沿って調整可能な光路長変更用ステージ２０９, ２１０を備えている。
【００３８】
このような構成において、電気光学変調素子２０１に印加する電圧値を適切に選択し、かつ、印加する電圧値を一定の変調周波数Ｆｍｏｄで変調することで、電気光学変調素子２０１を通過するパルスレーザ光Ｌ１０の偏光方向が９０度回転するようにパルスレーザ光Ｌ１０の位相を変調する。また、パルスレーザ光Ｌ１０の偏光方向と偏光ビームスプリッタ２０２の偏光特性を考慮し、適切に偏光ビームスプリッタ２０２を配置することで、パルスレーザ光Ｌ１０の偏光状態に応じて偏光ビームスプリッタ２０２により、パルスレーザ光Ｌ１０が通過する光路が光路２０３、２０４に偏光状態に応じて切替わる。光路２０３、２０４のそれぞれの光路中のパルスレーザ光Ｌ１１、Ｌ１２は、半波長板２０７または２０８により、偏光方向が９０度回転された後、リフレクタ２０５または２０６により光路が偏向され、再びビームスプリッタを通過した後、共通の光路２１１に導光される。
【００３９】
光路２１１のパルスレーザ光Ｌ１′には、２つの光路２０３と２０４の光路長差に相当する位相シフトを与えることができる。図３に示されているように、パルスレーザ光の様子を時間波形と光の周波数を用いて表示するスペクトルグラムで説明すると、パルスレーザ光Ｌ１′には該位相シフト量に相当する光学時間遅延Δtが与えられ、かつ、該光学時間遅延は変調周波数Ｆｍｏｄで変調された状態となっている。
【００４０】
さらには、光路長変更用ステージ２０９、２１０を光軸に沿って双方向に移動させて光路２０３、２０４の光路長を変更することで、パルスレーザ光Ｌ１′に与える光学時間遅延Δtの量を調節することが可能となっている。
【００４１】
フォトニッククリスタルファイバ１１１は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大させるためのものである。また、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバ１１１の種類および通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の条件に応じた周波数分散をもった状態となっている。
【００４２】
パルスタイミング調節手段１１２は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２′の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２′の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２′のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することができる。
【００４３】
本発明の第１の実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１２により、２つの光路１０６，１０７を通過して合波装置１０８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の時間的なタイミングを調節し、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′を、標本Ａの分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的に誘導ラマン散乱を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の分子の他の分子振動の周波数に一致させることも可能となる。標本Ａは、顕微鏡本体１０３に標本保持手段として設けられた標本ステージ１２０上に、図示しない適宜の収容部材（例えば、スライドガラス、マイクロプレートのウェル、培養用シャーレ）を交換可能にマウントすることで、観察用光路による光走査範囲内に保持される。収容部材を用いる代わりに、標本ステージ１２０上に標本としての生物個体を観察視野中に動かないように固定器具により固定してイメージングすることでもよい。かかる標本ステージ１２０は、通常の顕微鏡と同様にＸＹＺ方向に標本Ａを位置決めすることで観察視野を変更したり適切な基準位置に位置合わせするために駆動（手動または自動）される。
【００４４】
顕微鏡本体１０３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置１０２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１１３およびレンズ群１１４と、前記スキャナ１１３により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１１５と、標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを、集光レンズ１１５とは異なる方向で検出するための集光レンズ１１６と変調信号検出装置（変調信号検出手段）１１７と、標本Ａから発生したパルスレーザ光Ｌ３とは異なる周波数（波長）を有する光を集光レンズ１１５で集光し検出するための、ダイクロイックミラー１１８と光検出装置１１９とを備えている。
【００４５】
変調信号検出装置(変調信号検出手段)１１７は、変調周波数Ｆｍｏｄで変調された光信号を検出することが可能なフォトディテクタと、変調信号Ｆｍｏｄに同期して変調された光信号のみを検出するロックインアンプとを備えている（図示略）。ここで、ロックインアンプは変調信号の周波数に応じた検出を行なうような調整が可能であり、分子の種類ごとに検出感度が高まるような、誘導ラマン散乱の検出感度調節手段として機能している。
【００４６】
ここで、一般的に分子のラマン散乱断面積σは小さいため、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスによるポンプ光またはストークス光の強度変化も微弱になる。このため、ポンプ光、ストークス光の強度変化から誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出する際、励起光のレーザノイズなどに信号が埋もれる場合がある。そこで、本発明では、ポンプ光またはストークス光のいずれか一方の強度を一定の周波数で変調し、該周波数に同期して変化する誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスをロックインアンプで同期検出している。また、同期検出した信号を増幅することで、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを高感度に検出することが可能となる。
【００４７】
ロックインアンプ以外の感度調節手段としては、いわゆるスペクトルアナライザが挙げられる。このように、本発明ではロックアンプやスペクトルアナライザのようなラマン散乱光感度調節手段を具備することで、目的の分子が標本中に低濃度で存在している場合や、生体組織のように目的の分子が生体の深部に有る場合や、生体中の他の光散乱性物質（例えば脂質）により目的の分子からの信号が低下し易い場合や、励起光等の他の光信号が検出ノイズとなり得るような場合等においても、ラマン散乱に特有の検出信号を高Ｓ／Ｎまたは高感度で検出することができるので、同一の標本に対して他の光学的観察手段（例えば、蛍光観察用顕微鏡や高調波観察用顕微鏡）を同時または併用して検出するのに非常に都合がよい。
【００４８】
図１において、符号１２０は標本ステージ、符号１２１はミラーである。また、例えば、標本Ａにおいて発生した蛍光は、前記集光レンズ１１５により集光され光検出器１１９で検出されてもよい。
【００４９】
また、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９は、該周波数分散調節装置１０９を通過したパルスレーザ光Ｌ１′が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定できるようになっている。これにより、レーザ光源１０４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によりフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
【００５０】
このように構成された本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１の作用について以下に説明する。
【００５１】
本第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１を使用して、誘導ラマン散乱による標本Ａの観察を行うには、レーザ光源１０４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させる。レーザ光源１０４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ１０５により２つの光路１０６，１０７に分岐される。
【００５２】
第１の光路１０６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路１０６上に配置されている周波数分散調節装置１０９を通過することにより、周波数分散量が与えられる。一方、第２の光路１０７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１２１によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過することにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２′）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２′にはフォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したことによる所定の周波数分散が与えられる。
【００５３】
周波数分散調節装置１０９によりパルスレーザ光Ｌ１′に与えられる初期の周波数分散量とフォトニッククリスタルファイバ１１０を通過することによりパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる周波数分散量とが相違する場合、図４（ａ）のスペクログラムに図示されているように、時間軸上におけるパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数の傾き（チャープレート）が相違する。この場合、２つの光路１０６，１０７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′は、時間軸上の各時刻において異なっており一定に保たれていない。この状態においては、パルスレーザ光L１′、Ｌ２′のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の分子振動Ωの誘導ラマン散乱の発生に効率的に利用できない。
【００５４】
そこで、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９を作動させて、第１の光路１０６を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２′に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図４（ａ）のパルスレーザ光Ｌ１′のチャープレートＣＲの矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００５５】
２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のパルスの時間的タイミングによっては、図４（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、本発明の第１の実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１２を作動させて、第２の光路１０７を通過するパルスレーザ光Ｌ２′の光学遅延を調節する。すなわち、図４（ｂ）の矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２′の時間的なパルスタイミングを調節する。
【００５６】
これにより、図４(ｃ)に示されるように、合波装置１０８に到達する２つの光路１０６および光路１０７のパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数分散量と周波数差Ω′が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′は、合波装置１０８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。またパルスタイミング調節手段１１２により、パルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数差Ω′を任意に調整することが可能となる。したがって、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の時間的なパルスタイミングを調整し、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致させるよう２つのパルスレーザ光のパルスタイミングを調節することができる。
【００５７】
合波装置１０８は、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を合波し、パルスレーザ光Ｌ３′を生成する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のそれぞれの光軸を一致させ、集光レンズ１１５により標本Ａに集光されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の焦点が、空間的に重なるように調節することができる。これにより、顕微鏡本体１０３内において、スキャナ１１３およびレンズ群１１４により、標本Ａ面上に集光されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の焦点を、空間的に重なった状態で２次元的に走査する系を容易に構成することができ、イメージングの際に画像取得を容易に行うことができる。
【００５８】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体１０３に入射され、スキャナ１１３によって２次元的に走査された後、レンズ群１１４と集光レンズ１１５を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱を発生させることができる。
【００５９】
また、パルスレーザ光変調装置１１０を通過したパルスレーザ光Ｌ１′に、一定の周波数Ｆｍｏｄで位相変調を与える。パルスレーザ光変調装置１１０において与える位相シフト量を適切に調整することで、図５に示されるように、２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致している共鳴状態と、一致していない非共鳴状態との間での変調が可能となる。共鳴状態では、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおける誘導ラマンが励起され、誘導ラマンゲインまたはロスが発生する。一方、非共鳴状態では誘導ラマンが励起されず、誘導ラマンゲインまたはロスも発生しない。結果として、誘導ラマンゲインまたはロスが変調周波数Ｆｍｏｄで変調されることになる。
【００６０】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、標本Ａを挟んで集光レンズ１１５とは反対側に配置された集光レンズ１１６によって集光され、変調信号検出装置１１７で検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１１６により検出された誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度とを対応づけて記憶し、誘導ラマン散乱の２次元的なイメージングが行える。
【００６１】
また、合波装置１０８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
この場合において、本実施形態によれば、２つの光路１０６，１０７のパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻においても、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致しているため、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωの誘導ラマン散乱の発生に利用することができる。このように誘導ラマン散乱を発生させ、誘導ラマンゲインまたはロスにパルスレーザ光Ｌ３の強度変化を検出し、時間的に積算することにより、明るい誘導ラマン散乱光イメージを得ることができる。
【００６２】
また、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９を作動させることにより、図６（ａ）に矢印Ｐ３に示すように、第１の光路１０６を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量を調節し、図６（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１′が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１′の周波数分散量を設定することができる。その結果、このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１′を集光レンズ１１５により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起による蛍光を効率よく発生させることができる。このとき、パルスレーザ光変調装置１１０の動作を停止させてもよい。
【００６３】
この場合において、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１１５によって集光された後、ダイクロイックミラー１１８によって分岐されて光検出器装置１１９により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１′の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１１９により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００６４】
また、多光子励起型の蛍光イメージングと同様の条件で、第二高調波イメージングも行うことができる。このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１００によれば、誘導ラマン散乱イメージング、多光子励起型の蛍光イメージングおよび第二高調波イメージングを切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１０１により、誘導ラマン散乱イメージングの実行と同時機または順次（または交互）に、多光子励起型の蛍光イメージングおよび／または第二高調波イメージングのような、異なる分子情報が得られる異種のイメージングを一緒に且つ効果的に行うことができ、マルチモーダルイメージングを達成することができる。
【００６５】
また、多光子励起型の蛍光または第二高調波の励起効率が多少低くなってもよい場合は、上記のイメージングを切替えることなく同時にイメージングすることも可能である。また、光検出装置１１９を多光子励起型の蛍光、第二高調波のいずれかの光を検出する検出装置として割り当ててもよい。また、光検出装置が不足する場合は新たに追加してもよい。
【００６６】
この場合において、レーザ光源１０４としてフェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源を用意すれば足り、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために新たにピコ秒パルスレーザ光を発生させるレーザ光源が不要なため、装置を簡易かつ安価に構成することができる。また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１１１を使用するので、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。また、パルスタイミング調節手段１１２も、ミラー（リフレクタ）により構成されるため、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。
【００６７】
また、本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１によれば、パルスタイミング調節手段１１２によって、２つの光路１０６と光路１０７を通過するパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のパルスタイミングを調節し、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′それぞれの周波数スペクトル帯域内で周波数差Ω’を自由に調節することが可能である。このため、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω’は、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに略一致する程度でよく正確な周波数差である必要はない。
【００６８】
つまり、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過することによるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数スペクトル帯域の変更または拡大も正確である必要はない。パルスタイミング調節手段１１２により、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに精度よく一致させることができ、最も効率よく標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからの誘導ラマン散乱を発生させ、効率よく誘導ラマン散乱イメージングを行うことができる。
【００６９】
また、本発明の第１の実施形態においては、パルスレーザ光変調装置１１０は、パルスタイミング調節装置１１２を兼ねてもよい。つまり、パルスレーザ光Ｌ２′の時間的タイミングを調節するかわりに、図２に示されているステージ２０９かつ/または２１０の位置を調節し、パルスレーザ光Ｌ１′の時間的タイミングを調節することによりすることにより行ってもよい。こうする事で、パルスタイミング調整装置１１２を取除くことができ、構成を簡潔にし、操作を簡便にすることが可能となる。
【００７０】
パルスタイミング調節手段１１２は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２′の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２′の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２′のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することができる。
【００７１】
このようにして得られた誘導ラマン散乱イメージと、他の顕微観察装置で得られた異種の分子イメージとを共通のコンピュータ１３１を経て共通のディスプレイ１３２に表示される。ここで、コンピュータは、光検出装置１１９から送出される各種イメージング情報に基づいて異なる分子情報を組み合せた総合評価を実行してその評価結果をディスプレイ１３２に表示することもできる。また、これら複数の異なる種類のイメージを、コンピュータ１３１による画像処理を通じてオーバーレイ（または重畳、合成、並列）してディスプレイ１３２に表示することも可能である。ここでさらに、誘導ラマン散乱イメージは分子振動を検出する他の検出手法に比べて有意に高感度ないし高Ｓ／Ｎ比の分子情報を提供するので、本発明のレーザ顕微鏡装置１０１によって初めて兼用され得るようになった他の光学的観察手段（例えば、蛍光観察用顕微鏡や高調波観察用顕微鏡）による異種のイメージと共に、ディスプレイ１３２上でオーバーレイ表示することで異種情報を複合した複合画像を形成したり或いはコンピュータ１３１内で一緒に画像処理して合成画像を形成するのが容易である。複合画像や合成画像は、誘導ラマン散乱による分子振動に関する情報と上記の他の光学的観察手段による異種の分子情報との組合せで決まる表現形式（例えば色調、濃淡、明度、輝度、分類名称など）をコンピュータ１３１により決定して、決定された表現形式により擬似的に表現した擬似画像であってもよい。こうすることで、多様な分子情報を一度に確認および／または評価する方法を提供したことに等しい態様となる。
【００７２】
さらに、生体のように時系列でイメージデータが変化し得る標本に関しては、コンピュータ１３１が時系列で複数枚のイメージデータ（画像情報）を取得するように顕微鏡装置１０１を制御すると共に、時系列のイメージデータをディスプレイ１３２に表示させるようにする。従って、誘導ラマン散乱による分子振動の情報だけでなく、分子振動以外の異種の分子情報を反映するイメージングデータについても時系列で複数枚の画像を取得するようにして同様にディスプレイ１３２に表示させるようにすることで、生体分子等の動きが有る分子変化の違いをディスプレイ１３２を通じてモニタリングすることとなり、２次元（ＸＹ領域）または３次元（ＸＹＺ領域）の情報に限らず、異種の分子情報の時間的変化から種々の有用な評価結果を得ることが可能となる。
【００７３】
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図７〜８を参照して説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１が第１の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光変調装置７１０の構成、それに伴う作用・効果である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置７０１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
【００７４】
本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１は、図７に示されるように、レーザ光源装置７０２と、レーザ光源装置７０２からのパルスレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体７０３とを備えている。
【００７５】
パルスレーザ光変調装置７１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子で構成される（図示略）。電気光学変調素子に印加する電圧を一定の周波数Ｆｍｏｄで変調し、該電気光学変調素子を通過するレーザ光Ｌ１′の偏光状態を該変調周波数Ｆｍｏｄで変調する。さらに、印加する電圧値を適切に調整することでパルスレーザ光Ｌ１′に与える位相量を調整し、パルスレーザ光Ｌ１′の偏光とパルスレーザ光Ｌ２′の偏光とが、互いに「平行な状態（Ｌ１′／／Ｌ２′）」と「垂直な状態（Ｌ１′⊥Ｌ２′）」との間で変調できる。その他の構成は第１の実施形態と同様である
【００７６】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１の作用について以下に説明する。第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる部分について主に説明する。
【００７７】
本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１では、合波装置１０８以降のパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａに照射することにより、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱が発生する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′の偏光がパルスレーザ光Ｌ２′の偏光と「平行な状態（Ｌ１′／／Ｌ２′）」と「垂直な状態（Ｌ１′⊥Ｌ２′）」となるように、パルスレーザ光変調装置７１０によりパルスレーザ光Ｌ１′の位相を変調する。このとき、図８に示すとおり、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′が標本Ａ中に照射されることで、標本Ａ中の分子の特定の分子振動における誘導ラマン散乱の励起も変調され、結果的に誘導ラマンロスおよび誘導ラマンゲインも変調される。
【００７８】
該パルスレーザ光Ｌ１′の位相変調による、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度の変調量は、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の偏光解消度ρ(０≦ρ≦0.75)に依存している。偏光解消度がより小さい場合（ρ→０）、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの変調量がより大きくなる傾向にある。
【００７９】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、第１の実施形態の場合と同様に、変調信号検出装置１１７において誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度を検出し、標本の二次元的な誘導ラマン散乱のイメージングが行える。
【００８０】
この場合において、パルスレーザ光変調装置７１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子を用意すれば足り、パルスレーザ光の位相変調のために複雑な光学系が不要なため、装置を安価かつ簡易に構成することができる。
【００８１】
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図９〜１０を参照して説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１が第１および第２の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光変調装置９１０の構成と、それに伴う作用・効果が異なる点である。なお、本実施形態においては、コンピュータ１３１およびディスプレイ１３２の説明は上述した他の実施形態と同じ構成とし、図示を省略する。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置９０１について、第１および第２の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
【００８２】
本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１は、図９に示されるように、レーザ光源装置９０２と、レーザ光源装置からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体９０３とを備えている。
【００８３】
本発明の第３の実施形態において、パルスレーザ光変調装置９１０は、音響光学効果を有する音響光学変調素子で構成される（図示略）。この音響光学変調素子に一定の変調周波数Ｆｍｏｄで電圧を印加することで、音響光学変調素子を通過するパルスレーザ光Ｌ１′の強度が該変調周波数Ｆｍｏｄで変調される。その他の構成は第１の実施形態と同様である。
【００８４】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１の作用について以下に説明する。第１および２の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる部分について主に説明する。
【００８５】
本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１では、合波装置１０８以降のパルスレーザ光を標本Ａに照射することにより、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱が発生する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′の強度をある一定値と略０との間で強度変調する。このとき、図１０に示すとおり、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′が標本Ａ中に照射されることで、標本Ａ中の分子の特定の分子振動における誘導ラマン散乱の励起も変調され、結果的に誘導ラマンロスおよび誘導ラマンゲインも変調される。
【００８６】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、第１の実施形態の場合と同様に、変調信号検出装置１１７において誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度を検出し、標本の二次元的な誘導ラマン散乱のイメージングが行える。
【００８７】
この場合において、パルスレーザ光変調装置９１０は、音響光学効果を有する音響光学変調素子を用意すれば足り、パルスレーザ光の強度変調するために複雑な光学系が不要なため、装置を安価かつ簡易に構成することができる。
【００８８】
また、本発明の第３の実施形態に係るパルスレーザ光変調装置９１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子および偏光素子により構成されていてもよい（図示略）。この場合、電気光学変調素子に印加する電圧値と周波数を適切に制御することにより、該電気光学変調素子を通過するパルスレーザ光Ｌ１の偏光状態を変調することが可能となる。このとき、該電気光学返答素子の後段に偏光子を設けることで、偏光子を通過できるパルスレーザ光Ｌ１の成分が、パルスレーザ光Ｌ１の偏光状態に応じて変化する。つまり、電気光学変調素子および偏光子を適切に配置することで、パルスレーザ光Ｌ１′の強度を変調することが可能となる。
【００８９】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【００９０】
周波数分散調節装置１０９は、例えば、固定長の分散媒質を複数用意し、それらを適宜切り替えて、パルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量が変更できるような構成でもよい。
【００９１】
また、周波数分散調節装置１０９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えていてもよい。１対のプリズムを通過したパルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路１０６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散調節装置１０９を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズムの代わりに回折格子を用いてもよい。
【００９２】
また、周波数分散調節装置１０９は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するパルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調節できる。
【００９３】
また、周波数分散調節装置１０９は、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するパルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、光ファイバの長さを変えることで、パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調節できる。
【００９４】
また、周波数変換装置１１１としてフォトニッククリスタルファイバの代わりに、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。
【００９５】
また、パルスレーザ光を発生する単一のレーザ光源１０４と、光路１０６と光路１０７に分岐するビームスプリッタ１０５を用いたが、これに代えて、各光路１０６と光路１０７にそれぞれ１台ずつレーザ光源１０４を取り付けることにしてもよい。この場合、各レーザ光源１０４は互いにパルスタイミングの同期がとれている必要がある。
【００９６】
また、周波数分散量調節装置１０９は、第２の光路１０７に設けられていてもよいし、両光路１０６、１０７のそれぞれ設けられていてもよい。特に、周波数分散調節装置を両光路１０６、１０７に設けることで、両光路１０６、１０７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数分散量を調節し所望の周波数分解能に調節することが可能となる。
【００９７】
また、周波数量分散調節装置１０９がレーザ光源１０４とビームスプリッタ１０５との間に追加で設けられていてもよい。こうすることで、分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１とＬ２に対して等しく周波数分散を与えることが可能となる。これにより、周波数変換装置１１１に入射するパルスレーザ光Ｌ２の周波数分散量を、周波数変換装置１１１における周波数変換効率が最も高くなるように調節することが可能となる。ここで、光学的な分岐手段（例えばビームスプリッタ）により形成する分岐光路の本数は２つに限らず、マルチビーム化した場合、4以上の偶数本であってもよい。ここで、分岐光路が奇数本であっても、一部の光路を共用するようにしたり、標本に対して必要な照射を奇数本で可能にするならば、本発明で分岐が必要な場合の光路は、２以上の任意の本数であってよい。
【００９８】
また、周波数分散量調節装置１０９において、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′のチャープレートを略一致させず、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′に一定量の幅を与えてもよい。その場合、誘導ラマン散乱の発生効率は低下するが、標本Ａ周囲の環境変化の影響により、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωが変化した場合においても、誘導ラマン散乱イメージングを行うことが可能である。更には、標本Ａの分子の異なる分子振動を同時にイメージングすることも可能となる。
【００９９】
また、周波数分散量調節装置１０９において、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′のチャープレートを略一致させず、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′に一定量の幅を与えてもよい場合、周波数分散調節装置１０９は、パルスレーザ光Ｌ１の周波数帯域の所望の周波数帯域のみを透過させる分光フィルタ（バンドパスフィルタ）であってもよい（図示略）。こうすることで、分光フィルタの透過特性を適切に選択することにより、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′幅を、簡便かつ容易に切替えることができる。また、複数の分光フィルタを容易し、それらを切替えるようにしておくことで、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′幅も切替えることが可能となる（図示略）。
【０１００】
また、変調信号検出装置１１７は、集光レンズ１１５に対して標本Ａを挟んで反対側に設置されているが、集光レンズ１１５と同じ側に設置されていてもよい。こうするこことで、生体組織切片などの分厚い標本の誘導ラマン散乱イメージングを行うことが可能となる。
【０１０１】
また本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものであるが、その応用分野は、細胞や組織
等の生体試料あるいは生体以外の有機・無機等の試料を標本ステージ上で顕微観察する通常の顕微鏡装置に限定されず、人体や動物等生体をｉｎ−ｖｉｖｏ観察する、あるいは構造物を非破壊で観察するための内視鏡的顕微観察装置にも適用されるものである。従って、本発明におけるレーザ顕微装置とは、レーザ光を照明光とする任意の顕微観察（顕微鏡と共通する拡大光学系を用いて所望の拡大画像を提供する観察）を含むものであり、本発明はレーザ光を用いる顕微観察により多様な情報を得る技術として大いなる貢献を果たすものである。
【０１０２】
とくに本発明によれば、上述した構成を有することにより、同じ標本上ないし標本中の特定の分子について、誘導ラマン散乱により標本を走査した走査イメージと、多光子励起蛍光および／または第二次高調波による標本を走査した走査イメージとを画像処理したり位置合わせする際に互いのイメージデータの対応付けが容易に行なえるので、走査範囲内の各種分子に関する異種の分子情報に基づく合成画像を用いた観察や総合評価を正確に行なうことができる。
【０１０３】
ここにおいて、本発明は、上述したレーザ顕微鏡装置を用いた分子情報の評価方法または該評価結果の表示方法という他の観点による発明も包含している。かかる評価方法には、上述した実施形態の装置を使用して実行した光信号の光学的処理の工程に加えて、例えば、標本を照射して得られる誘導ラマン散乱による画像データと、同時または連続して同じ標本から得た多光子励起蛍光および／または第二次高調波による画像データとを各種分子の分布位置ごとに画像処理し、画像処理した情報を標本の観察画像として並列ないし合成して表示したり、分子情報の組合せとして標本を分類する工程が含まれる。
【０１０４】
また、本発明は、誘導ラマン散乱を発生させるための光源または照射光として、周波数スペクトル帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）成分からなる光を使用することができる。従って、本発明は、広帯域の光源または照射光を用いることが望ましいあらゆる用途の光学的装置（光ピックアップ、光加工、光治療等を含む）にとって、光源および／または照射光学系を共用できる安価な光学装置ないし光学システムも提供する。さらに、本発明によれば、広帯域の光源または照射光を使用しているにも拘わらず、誘導ラマン散乱による検出すべき光信号を最も高感度で検出されるように周波数分散量を調節したり、所望の分子の振動周波数に応じて最も高感度で検出されるように感度調整したりする構成を有しているので、検出すべき分子が標本等の対象に低濃度（または極微量）しか分布していない場合にも比較的高速にイメージデータを得ることができる。このことから、広帯域の光源または照射光を使用するような他の高感度なイメージングにおいて時系列な画像を得る動作速度をなるべく低下させることなく、本発明による誘導ラマン散乱イメージングを同時機または交互に行なうことが可能である。
【０１０５】
さらに、本発明は、これら表示または分類に含まれる各工程を上述したレーザ顕微鏡装置１０１、７０１、９０１において実行させるためのソフトウェアまたは制御用の電気的プログラムも提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のパルスレーザ光変調装置の構成を示している。
【図３】図２のパルスレーザ光変調装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の状態をスペクトログラム（時間―周波数）で示した図である。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の状態をスペクトログラムで示すグラフであり、周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）周波数分散量調節前、（ｂ）周波数分散量調節後、（ｃ）時間的なパルスタイミング量調整後、をそれぞれ示している。
【図５】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光のスペクトログラムを示す図であり、パルスレーザ光変調装置により位相変調されたパルスレーザ光により誘導ラマン散乱の発生が変調を受ける状態を示している。
【図６】図１のレーザ顕微鏡装置の導光されるパルスレーザ光のスペクトログラムを示す図であり、多光子励起蛍光イメージングにおけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図７】本発明の２実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図８】図７のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光と、標本Ａに照射した後の２つのパルスレーザ光の状態を示した図であり、パルスレーザ光の位相変調により、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスが変調周期に応じて変調されていることを示している。
【図９】本発明の３実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１０】図８のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光と、標本Ａに照射した後の２つのパルスレーザ光の状態を示した図であり、パルスレーザ光の強度変調により、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスが変調周期に応じて変調されていることを示している。
【符号の説明】
【０１０７】
１０１、７０１、９０１・・・レーザ顕微鏡装置
１０２、７０２、９０２・・・レーザ光源装置
１０３、７０３、９０３・・・顕微鏡本体
１０４ ・・・レーザ光源
１０５ ・・・ビームスプリッタ（分岐手段）
１０６、１０７、２０３、２０４、２１１ ・・・光路
１０８・・・ 合波装置（合波手段）
１０９ ・・・周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）
１１０、７１０、９１０・・・パルスレーザ光変調装置（パルスレーザ光変調手段）
１１１・・・ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１２・・・パルスタイミング調節手段
１１３・・・スキャナ
１１４・・・レンズ群
１１５、１１６・・・集光レンズ
１１７・・・変調信号検出装置（変調信号検出手段）
１１８・・・ダイクロイックミラー
１１９・・・光検出装置
１２０・・・標本ステージ
１２１・・・ミラー
１３１・・・コンピュータ
１３２・・・ディスプレイ
２０１・・・電気光学変調素子
２０２ ・・・偏光ビームスプリッタ
２０５、２０６・・・リフレクタ
２０７、２０８・・・１／２波長板
２０９、２１０・・・光路長変更用ステージ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導ラマン散乱過程を利用して特定の分子をイメージングするレーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光と分子との相互作用の１つに誘導ラマン散乱がある。誘導ラマン散乱は３次の非線形光学効果の１つであり、光と分子の分子振動とが相互作用することにより、該分子振動の振動エネルギーだけずれた光が散乱されること（ラマン散乱）を基にする過程である。この誘導ラマン散乱過程を利用することで、蛍光色素や蛍光タンパクといったプローブを用いることなく標本中の分子を無染色にイメージングできる顕微鏡の１つに、誘導ラマン散乱顕微鏡というものがある（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
誘導ラマン散乱顕微鏡では、標本中の分子の特定の分子振動からの誘導ラマン散乱に起因する信号を検出し、描画コントラストとして用いることで標本中の分子を無染色にイメージングすることが可能となる。さらには、誘導ラマン散乱に利用する分子の特定の分子振動を選択することで、標本中の種々の分子を無染色にイメージングすることも原理上可能となる。
【０００４】
この誘導ラマン散乱顕微鏡の原理を詳細に述べる。通常、誘導ラマン散乱を発生させるための励起光として、周波数（波長と同義）の異なる２つのパルスレーザ光を用いる。２つのパルスレーザ光の周波数差を標本中の分子の特定の分子振動の周波数に一致するように調節する。こうした状態で、２つのパルスレーザ光を標本中に集光することで、標本中の分子の特定の分子振動に起因した誘導ラマン散乱が発生する。
【０００５】
誘導ラマン散乱は、励起光として用いた２つのパルスレーザ光のうち、周波数の高い（波長の短い）パルスレーザ光（ポンプ光）のエネルギーの一部が、周波数の低い（波長の長い）パルスレーザ光（ストークス光）に移動したと考えることができる。このエネルギーの移動の際に、標本中の特定の分子振動が介在していると見なすことができる。このエネルギーの移動は、ポンプ光の強度減少（誘導ラマンロス：ΔIraman_loss）およびストークス光強度増加（誘導ラマンゲイン：Δiraman_gain）として下記の式１のように定式化されている。ここでNは誘導ラマンに寄与する分子数、σは分子のラマン散乱断面積、Ipump, Istokesはそれぞれポンプ光とストークス光の強度である。
【０００６】
〔数１〕
誘導ラマンゲイン ΔIraman_gain = NxσxIpump x Istokes
誘導ラマンロス ΔIraman_loss = - NxσxIpump x Istokes
【０００７】
上記説明のとおり、誘導ラマン散乱顕微鏡では、ポンプ光またはストークス光の強度変化（誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロス）を検出し、描画コントラストとして用いることで標本中の分子を無染色にイメージングすることが可能となる。このことは、誘導ラマン散乱顕微鏡が、蛍光顕微鏡において励起光と異なる周波数を持つ蛍光を検出するように分光選択的に検出することができないことを意味する。
【０００８】
ここで、非特許文献１にも示されているように、従来、誘導ラマン散乱イメージングを行うためのパルスレーザ光としては、比較的狭い周波数帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の分子振動の周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、強い誘導ラマン散乱が発生し、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出することで標本の分子のイメージングを行うことができる。
【０００９】
一方で、標本の特定分子にあらかじめ所定の蛍光物質をラベリングしておき、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１８５７（２００８）
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−２４３６４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
誘導ラマン散乱顕微鏡において、比較的周波数帯域が狭い（または、パルス幅が広い）ピコ秒パルスレーザ光が用いられている（例えば、非特許文献１）。これは、標本中の分子の特定の分子振動からの誘導ラマンを効率的に発生させるためである。というのも、周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いた場合、２つのパルスレーザ光のエネルギーを、分子の特定の分子振動からの誘導ラマン散乱の発生に効率的に利用できないためである。周波数帯域が広いパルスレーザ光を用いた場合、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の分子振動の周波数に一致しない成分も含まれる。これら分子の特定の分子振動の周波数に一致しない成分は、該分子振動からの誘導ラマン散乱の発生に寄与しない。
【００１３】
一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減してイメージングを行うことを目的として、周波数スペクトル帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用される。さらには、標本中においてフーリエ限界パルスに近い状態となるように集光することで、蛍光の励起効率をより高めることが可能となる。
【００１４】
上記理由から、誘導ラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違しており、同一のレーザ顕微鏡装置によって達成することが困難である。ところが、種々の分子は異なる分子情報を総合的に評価しなければ正確な分類等の評価ができない場合があり、同一の装置内で同じ標本から多様な分子情報を得ることが望ましい。
【００１５】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、誘導ラマン散乱イメージングおよび多光子型（多光子過程を有する）の観察（例えば蛍光イメージング）を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、標本中の分子が低濃度であっても高感度に分子振動をイメージングでき、これにより蛍光等の他のイメージングと併用して多様で且つ高感度な検出情報を提供できるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述した課題を解決するために、本発明者らは、誘導ラマン散乱を用いたイメージングのための光学系と、他の組合せが有望なイメージング用の光学系とを共通の構成で実施できるだけではなく使用するレーザ光の仕様を共通化することもできる構成を鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち、周波数分散量調節手段により、導光される２つの各パルスレーザ光に、周波数分散を与えることができる。周波数分散を与えることで、各パルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、フェムト秒パルスレーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、与える周波数分散量を適切に調節することで、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数帯域を有している状態を作ることができる。さらには、導光される２つのパルスレーザ光の周波数分散量を調節することで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を任意に調節することが可能となる。また、適切に与える周波数分散量を調節することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つことも可能となる。ここで、「周波数分散量」のことを「チャープ」と一般的に呼ばれることもある。
【００１７】
このように２つのパルスレーザ光の周波数差を調節した状態で、標本面上に集光することにより、標本中に含まれる分子のうち２つのパルスレーザ光の周波数差と等しい周波数を持つ分子振動において誘導ラマン散乱が発生する。このとき、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することで２つのパルスレーザ光のエネルギーを誘導ラマン散乱に効率的に利用することができる。もちろん、適切に与える周波数分散量を調節し、２つのパルスレーザ光の周波数差が一定となる場合、最も効率よく２つのパルスエネルギーを誘導ラマン散乱用いることができる。
【００１８】
先述のとおり、誘導ラマン散乱顕微鏡では、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出することでイメージングを行う。２つのパルスレーザ光うち周波数が高いパルスレーザ光の強度の減分（ポンプ光）、または、他方のパルスレーザ光の強度の増分（ストークス光）を検出する（式１参照）。通常、誘導ラマン散乱によるポンプ光またはストークス光の強度の増減は微小であるため、該強度の増減がポンプ光やストークス光のレーザノイズなどに埋もれる恐れがある。そこで、該増減を高感度に検出するために、パルスレーザ光変調手段により、パルスレーザ光に一定の周波数で変調を加える。該変調を加えることで、標本中の特定の分子において発生する誘導ラマン散乱も同様に変調される。結果として、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスによるポンプ光またはストークス光の強度の増減も同様に変調される。この変調されたポンプ光またはストークス光の強度の増減を、変調信号検出手段において、パルスレーザ光変調手段の変調周波数に同期した形で検出する。
【００１９】
以上の説明のように、フェムト秒パルスレーザ光のような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を用いた場合においても、効率的に誘導ラマン散乱光を発生させることが可能となる。
【００２０】
一方、フェムト秒レーザのような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を利用した場合、２つのパルスレーザ光のうちいずれか一方を標本中に集光することにより、多光子蛍光観察や第２光調波観察を行うことが可能となる。つまり、１台のレーザ顕微鏡装置により、誘導ラマン散乱観察、多光子観察、第二高調波観察を行うことが可能となる。
【００２１】
上記発明においては、パルスレーザ光変調手段がパルスレーザ光の位相を変調することであっても良い（ここで言う「位相」とは、パルスレーザ光の時間的タイミングを調節するような位相量も含む）。一方のパルスレーザ光の位相を適切に調節することで、２つのパルスレーザ光が「時間的に重なった状態」と「重ならない状態」との間で変調（位相変調）することが可能となる。これにより、誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスの強度も同様に変調(強度変調)される。この強度変調された誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスを捉えることで誘導ラマン散乱イメージングを行う。こうすることで、パルスレーザ光に対しては位相変調を与えるため、パルスレーザ光の強度は変化しない。このため、誘導ラマン散乱イメージングに加えて、多光子蛍光イメージングや第二高調波イメージングを行う場合、それぞれのイメージングに影響を与えることなく同時観察することが可能となる。
【００２２】
上記発明においては、パルスレーザ光変調手段がパルスレーザ光の強度を変調することであっても良い。一方のパルスレーザ光の強度を適切に変調することで、標本中の分子の特定の分子振動から発生する誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスの強度も同様に変調される。この強度変調された誘導ラマンゲイン、誘導ラマンロスを捉えることで誘導ラマン散乱イメージングを行う。こうすることで、パルスレーザ光の強度変調量を制御することにより、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの変調量も自由に調節することが可能となる。このため、誘導ラマン散乱イメージングを行う標本中の分子振動の種類や標本の環境に応じて、変調量を自由に調節することが可能となる。
【００２３】
さらに、上記発明においては、１ピコ秒以下のパルス幅を有するフェムト秒パルスレーザ光を発生するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、前記分岐手段により分岐された２つの光路のいずれか一方の光路に設けられ、該２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、を備えていても良い。
【００２４】
このようにすることで、単一のレーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光を分岐し、一方の光路において、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるように、フェムト秒パルスレーザ光の周波数を周波数変換手段によって変換し、２つの異なる周波数をもつパルスレーザ光を得ることができる。これにより、２つの周波数の異なるパルスレーザ光のレーザ光源を共通化して装置構成を簡略化しまたシステムの構成コストを下げることができる。
【００２５】
さらに、上記発明においては、前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面 上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備えていても良い。
【００２６】
こうすることで一方のパルスレーザ光に対して、他方のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を２つのパルスレーザ光の周波数帯域内において任意に調整することが可能となる。これにより、標本面上において２つのパルスレーザ光のタイミングを調整し、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つのパルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、効率的に誘導ラマン散乱を発生させることが可能となる。また、周波数差を任意に調整することができるため、標本中の分子の別の振動周波数に一致させることも可能となる。
【００２７】
また、上記発明においては、前記周波数変換手段が光学非線形ファイバであってもよい。周波数変換手段として光学非線形ファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いる光学非線形ファイバの種類を選定することにより、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することが可能となる。
【００２８】
また、上記発明においては、前記パルスレーザ光変調手段が、電気光学効果を有する電気光学変調素子から構成されていてもよい。このようにすることで、電気光学変調素子の駆動を制御することにより、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の位相（偏光）を制御、変調することができる。さらには、該電気光学変調素子を通過した位相（偏光）が制御されたパルスレーザ光を偏光子に通過させてもよい。こうすることで、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。
【００２９】
また、上記発明においては、前記パルスレーザ光変調手段が、音響光学効果を有する音響光学変調素子から構成されていてもよい。このようにすることで、音響光学素子の駆動を制御することにより、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。こうすることで、簡便かつ容易に、パルスレーザ光の強度を制御、変調することが可能となる。
【００３０】
また、上記発明においては、前記周波数分散調節手段を、前記レーザ光源と前記分岐手段の間に配置してもよい。このようにすることで、周波数変換手段に入射するパルスレーザ光の周波数分散量を、周波数変換手段における周波数変換効率が最も高くなるように調節できるようになる。
【００３１】
また、上記発明においては、前記周波数分散調節手段が、標本において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定する構成であるのが好ましい。このようにすることで、誘導ラマン散乱イメージングの実行と同時機または順次（または交互）に、多光子励起型の蛍光イメージングおよび／または第二高調波イメージングのような、異なる分子情報が得られる異種のイメージングを一緒に且つ効果的に行うことができるようになる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、誘導ラマン散乱観察および多光子蛍光の観察を同一の装置において、両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１について、図１〜図６を参照して以下に説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１は、図１に示されるように、レーザ光源装置１０２と、該レーザ光源装置１０２からレーザ光を標本Ａに照射し、標本Ａを観察するための顕微鏡本体１０３とから構成されている。レーザ光源装置１０２と顕微鏡本体１０３とは、コンピュータ１３１と互いに接続しており、顕微鏡本体に内蔵された光検出装置１１９が取得したイメージング用データを演算したり画像処理することで、顕微鏡イメージを形成したり、顕微鏡装置に関するあらゆる制御を行なうものである。コンピュータ１３１は、レーザ光源装置１０２および／または顕微鏡本体１０３の動作を制御する制御手段としても機能する。ここで、レーザ顕微鏡装置１０１は、レーザ光源装置１０２と顕微鏡本体１０３とが一体化した構成であってもよく、或いは顕微鏡本体１０３に対しシステムの一部としてユニット化されて接続するような構成であってもよい。同様に、コンピュータ１３１および／または表示手段であるディスプレイ１３２は、顕微鏡本体１０３に内臓された構成であったり、或いは顕微鏡本体１０３に対しシステムの一部としてユニットされ、接続することで顕微鏡本体１０３および／またはレーザ光源装置１０２と相互に連携するような構成であってもよい。
【００３４】
レーザ光源装置１０２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源１０４と、該レーザ光源１０４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ１０５と、該ビームスプリッタ１０５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２をそれぞれ導光する２つの光路１０６と光路１０７と、該２つの光路１０６と光路１０７を導光する２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を合波する合波装置１０８とを備えている。
【００３５】
第１の光路１０６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）１０９およびパルスレーザ光変調装置（パルスレーザ光変調手段）１１０設けられている。第２の光路１０７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数を変換するフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１１１と、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過後に、パルスレーザ光のＬ２′の光路長を調節する光路長調節装置（パルスタイミング調整手段）１１２とが設けられている。
【００３６】
周波数分散調節装置１０９は、例えば、固定長のガラス等の分散媒質（図示略）を備えている。分散媒質の長さを適切に選択することで、周波数分散調節装置１０９を通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ1'に与える周波数分散量を選択することができる。
【００３７】
パルスレーザ光変調装置１１０については、図２を用いて詳細に説明する。図２に示されているように、パルスレーザ光変調装置は、電気光学効果を有する電気光学変調素子２０１と、該電気光学変調素子２０１を通過したパルスレーザ光Ｌ１０を分岐する偏光ビームスプリッタ２０２と、該偏光ビームスプリッタ２０２により分岐されたパルスレーザ光Ｌ１１、Ｌ１２をそれぞれ導光する光路２０３、２０４と、該２つの光路を導光する２つのパルスレーザ光Ｌ１１′、Ｌ１２′の該偏光ビームスプリッタ２０２通過後の光路を共通にするための、ミラーで構成されるリフレクタ２０５、２０６と、該２つの光路２０３, ２０４の光路中に設けられている１／２波長板２０７、２０８と、リフレクタ２０５、２０６の位置が光軸に沿って調整可能な光路長変更用ステージ２０９, ２１０を備えている。
【００３８】
このような構成において、電気光学変調素子２０１に印加する電圧値を適切に選択し、かつ、印加する電圧値を一定の変調周波数Ｆｍｏｄで変調することで、電気光学変調素子２０１を通過するパルスレーザ光Ｌ１０の偏光方向が９０度回転するようにパルスレーザ光Ｌ１０の位相を変調する。また、パルスレーザ光Ｌ１０の偏光方向と偏光ビームスプリッタ２０２の偏光特性を考慮し、適切に偏光ビームスプリッタ２０２を配置することで、パルスレーザ光Ｌ１０の偏光状態に応じて偏光ビームスプリッタ２０２により、パルスレーザ光Ｌ１０が通過する光路が光路２０３、２０４に偏光状態に応じて切替わる。光路２０３、２０４のそれぞれの光路中のパルスレーザ光Ｌ１１、Ｌ１２は、半波長板２０７または２０８により、偏光方向が９０度回転された後、リフレクタ２０５または２０６により光路が偏向され、再びビームスプリッタを通過した後、共通の光路２１１に導光される。
【００３９】
光路２１１のパルスレーザ光Ｌ１′には、２つの光路２０３と２０４の光路長差に相当する位相シフトを与えることができる。図３に示されているように、パルスレーザ光の様子を時間波形と光の周波数を用いて表示するスペクトルグラムで説明すると、パルスレーザ光Ｌ１′には該位相シフト量に相当する光学時間遅延Δtが与えられ、かつ、該光学時間遅延は変調周波数Ｆｍｏｄで変調された状態となっている。
【００４０】
さらには、光路長変更用ステージ２０９、２１０を光軸に沿って双方向に移動させて光路２０３、２０４の光路長を変更することで、パルスレーザ光Ｌ１′に与える光学時間遅延Δtの量を調節することが可能となっている。
【００４１】
フォトニッククリスタルファイバ１１１は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大させるためのものである。また、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバ１１１の種類および通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の条件に応じた周波数分散をもった状態となっている。
【００４２】
パルスタイミング調節手段１１２は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２′の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２′の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２′のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することができる。
【００４３】
本発明の第１の実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１２により、２つの光路１０６，１０７を通過して合波装置１０８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の時間的なタイミングを調節し、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′を、標本Ａの分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的に誘導ラマン散乱を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の分子の他の分子振動の周波数に一致させることも可能となる。標本Ａは、顕微鏡本体１０３に標本保持手段として設けられた標本ステージ１２０上に、図示しない適宜の収容部材（例えば、スライドガラス、マイクロプレートのウェル、培養用シャーレ）を交換可能にマウントすることで、観察用光路による光走査範囲内に保持される。収容部材を用いる代わりに、標本ステージ１２０上に標本としての生物個体を観察視野中に動かないように固定器具により固定してイメージングすることでもよい。かかる標本ステージ１２０は、通常の顕微鏡と同様にＸＹＺ方向に標本Ａを位置決めすることで観察視野を変更したり適切な基準位置に位置合わせするために駆動（手動または自動）される。
【００４４】
顕微鏡本体１０３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置１０２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１１３およびレンズ群１１４と、前記スキャナ１１３により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１１５と、標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを、集光レンズ１１５とは異なる方向で検出するための集光レンズ１１６と変調信号検出装置（変調信号検出手段）１１７と、標本Ａから発生したパルスレーザ光Ｌ３とは異なる周波数（波長）を有する光を集光レンズ１１５で集光し検出するための、ダイクロイックミラー１１８と光検出装置１１９とを備えている。
【００４５】
変調信号検出装置(変調信号検出手段)１１７は、変調周波数Ｆｍｏｄで変調された光信号を検出することが可能なフォトディテクタと、変調信号Ｆｍｏｄに同期して変調された光信号のみを検出するロックインアンプとを備えている（図示略）。ここで、ロックインアンプは変調信号の周波数に応じた検出を行なうような調整が可能であり、分子の種類ごとに検出感度が高まるような、誘導ラマン散乱の検出感度調節手段として機能している。
【００４６】
ここで、一般的に分子のラマン散乱断面積σは小さいため、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスによるポンプ光またはストークス光の強度変化も微弱になる。このため、ポンプ光、ストークス光の強度変化から誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを検出する際、励起光のレーザノイズなどに信号が埋もれる場合がある。そこで、本発明では、ポンプ光またはストークス光のいずれか一方の強度を一定の周波数で変調し、該周波数に同期して変化する誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスをロックインアンプで同期検出している。また、同期検出した信号を増幅することで、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスを高感度に検出することが可能となる。
【００４７】
ロックインアンプ以外の感度調節手段としては、いわゆるスペクトルアナライザが挙げられる。このように、本発明ではロックアンプやスペクトルアナライザのようなラマン散乱光感度調節手段を具備することで、目的の分子が標本中に低濃度で存在している場合や、生体組織のように目的の分子が生体の深部に有る場合や、生体中の他の光散乱性物質（例えば脂質）により目的の分子からの信号が低下し易い場合や、励起光等の他の光信号が検出ノイズとなり得るような場合等においても、ラマン散乱に特有の検出信号を高Ｓ／Ｎまたは高感度で検出することができるので、同一の標本に対して他の光学的観察手段（例えば、蛍光観察用顕微鏡や高調波観察用顕微鏡）を同時または併用して検出するのに非常に都合がよい。
【００４８】
図１において、符号１２０は標本ステージ、符号１２１はミラーである。また、例えば、標本Ａにおいて発生した蛍光は、前記集光レンズ１１５により集光され光検出器１１９で検出されてもよい。
【００４９】
また、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９は、該周波数分散調節装置１０９を通過したパルスレーザ光Ｌ１′が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定できるようになっている。これにより、レーザ光源１０４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によりフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。
【００５０】
このように構成された本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１の作用について以下に説明する。
【００５１】
本第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１を使用して、誘導ラマン散乱による標本Ａの観察を行うには、レーザ光源１０４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させる。レーザ光源１０４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ１０５により２つの光路１０６，１０７に分岐される。
【００５２】
第１の光路１０６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路１０６上に配置されている周波数分散調節装置１０９を通過することにより、周波数分散量が与えられる。一方、第２の光路１０７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１２１によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過することにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２′）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２′にはフォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したことによる所定の周波数分散が与えられる。
【００５３】
周波数分散調節装置１０９によりパルスレーザ光Ｌ１′に与えられる初期の周波数分散量とフォトニッククリスタルファイバ１１０を通過することによりパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる周波数分散量とが相違する場合、図４（ａ）のスペクログラムに図示されているように、時間軸上におけるパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数の傾き（チャープレート）が相違する。この場合、２つの光路１０６，１０７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′は、時間軸上の各時刻において異なっており一定に保たれていない。この状態においては、パルスレーザ光L１′、Ｌ２′のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の分子振動Ωの誘導ラマン散乱の発生に効率的に利用できない。
【００５４】
そこで、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９を作動させて、第１の光路１０６を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１１１を通過したパルスレーザ光Ｌ２′に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図４（ａ）のパルスレーザ光Ｌ１′のチャープレートＣＲの矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。
【００５５】
２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のパルスの時間的タイミングによっては、図４（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、本発明の第１の実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１２を作動させて、第２の光路１０７を通過するパルスレーザ光Ｌ２′の光学遅延を調節する。すなわち、図４（ｂ）の矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２′の時間的なパルスタイミングを調節する。
【００５６】
これにより、図４(ｃ)に示されるように、合波装置１０８に到達する２つの光路１０６および光路１０７のパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数分散量と周波数差Ω′が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′は、合波装置１０８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。またパルスタイミング調節手段１１２により、パルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の周波数差Ω′を任意に調整することが可能となる。したがって、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１′、Ｌ２′の時間的なパルスタイミングを調整し、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致させるよう２つのパルスレーザ光のパルスタイミングを調節することができる。
【００５７】
合波装置１０８は、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を合波し、パルスレーザ光Ｌ３′を生成する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のそれぞれの光軸を一致させ、集光レンズ１１５により標本Ａに集光されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の焦点が、空間的に重なるように調節することができる。これにより、顕微鏡本体１０３内において、スキャナ１１３およびレンズ群１１４により、標本Ａ面上に集光されるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の焦点を、空間的に重なった状態で２次元的に走査する系を容易に構成することができ、イメージングの際に画像取得を容易に行うことができる。
【００５８】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体１０３に入射され、スキャナ１１３によって２次元的に走査された後、レンズ群１１４と集光レンズ１１５を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱を発生させることができる。
【００５９】
また、パルスレーザ光変調装置１１０を通過したパルスレーザ光Ｌ１′に、一定の周波数Ｆｍｏｄで位相変調を与える。パルスレーザ光変調装置１１０において与える位相シフト量を適切に調整することで、図５に示されるように、２つのパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致している共鳴状態と、一致していない非共鳴状態との間での変調が可能となる。共鳴状態では、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおける誘導ラマンが励起され、誘導ラマンゲインまたはロスが発生する。一方、非共鳴状態では誘導ラマンが励起されず、誘導ラマンゲインまたはロスも発生しない。結果として、誘導ラマンゲインまたはロスが変調周波数Ｆｍｏｄで変調されることになる。
【００６０】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、標本Ａを挟んで集光レンズ１１５とは反対側に配置された集光レンズ１１６によって集光され、変調信号検出装置１１７で検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１１６により検出された誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度とを対応づけて記憶し、誘導ラマン散乱の２次元的なイメージングが行える。
【００６１】
また、合波装置１０８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω′が標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。
この場合において、本実施形態によれば、２つの光路１０６，１０７のパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻においても、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωに一致しているため、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωの誘導ラマン散乱の発生に利用することができる。このように誘導ラマン散乱を発生させ、誘導ラマンゲインまたはロスにパルスレーザ光Ｌ３の強度変化を検出し、時間的に積算することにより、明るい誘導ラマン散乱光イメージを得ることができる。
【００６２】
また、本発明の第１の実施形態においては、周波数分散調節装置１０９を作動させることにより、図６（ａ）に矢印Ｐ３に示すように、第１の光路１０６を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量を調節し、図６（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１′が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１′の周波数分散量を設定することができる。その結果、このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１′を集光レンズ１１５により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起による蛍光を効率よく発生させることができる。このとき、パルスレーザ光変調装置１１０の動作を停止させてもよい。
【００６３】
この場合において、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１１５によって集光された後、ダイクロイックミラー１１８によって分岐されて光検出器装置１１９により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１′の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１１９により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００６４】
また、多光子励起型の蛍光イメージングと同様の条件で、第二高調波イメージングも行うことができる。このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１００によれば、誘導ラマン散乱イメージング、多光子励起型の蛍光イメージングおよび第二高調波イメージングを切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１０１により、誘導ラマン散乱イメージングの実行と同時機または順次（または交互）に、多光子励起型の蛍光イメージングおよび／または第二高調波イメージングのような、異なる分子情報が得られる異種のイメージングを一緒に且つ効果的に行うことができ、マルチモーダルイメージングを達成することができる。
【００６５】
また、多光子励起型の蛍光または第二高調波の励起効率が多少低くなってもよい場合は、上記のイメージングを切替えることなく同時にイメージングすることも可能である。また、光検出装置１１９を多光子励起型の蛍光、第二高調波のいずれかの光を検出する検出装置として割り当ててもよい。また、光検出装置が不足する場合は新たに追加してもよい。
【００６６】
この場合において、レーザ光源１０４としてフェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源を用意すれば足り、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために新たにピコ秒パルスレーザ光を発生させるレーザ光源が不要なため、装置を簡易かつ安価に構成することができる。また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１１１を使用するので、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。また、パルスタイミング調節手段１１２も、ミラー（リフレクタ）により構成されるため、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。
【００６７】
また、本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０１によれば、パルスタイミング調節手段１１２によって、２つの光路１０６と光路１０７を通過するパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′のパルスタイミングを調節し、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′それぞれの周波数スペクトル帯域内で周波数差Ω’を自由に調節することが可能である。このため、パルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数差Ω’は、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに略一致する程度でよく正確な周波数差である必要はない。
【００６８】
つまり、フォトニッククリスタルファイバ１１１を通過することによるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数スペクトル帯域の変更または拡大も正確である必要はない。パルスタイミング調節手段１１２により、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに精度よく一致させることができ、最も効率よく標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからの誘導ラマン散乱を発生させ、効率よく誘導ラマン散乱イメージングを行うことができる。
【００６９】
また、本発明の第１の実施形態においては、パルスレーザ光変調装置１１０は、パルスタイミング調節装置１１２を兼ねてもよい。つまり、パルスレーザ光Ｌ２′の時間的タイミングを調節するかわりに、図２に示されているステージ２０９かつ/または２１０の位置を調節し、パルスレーザ光Ｌ１′の時間的タイミングを調節することによりすることにより行ってもよい。こうする事で、パルスタイミング調整装置１１２を取除くことができ、構成を簡潔にし、操作を簡便にすることが可能となる。
【００７０】
パルスタイミング調節手段１１２は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２′の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２′の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２′のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することができる。
【００７１】
このようにして得られた誘導ラマン散乱イメージと、他の顕微観察装置で得られた異種の分子イメージとを共通のコンピュータ１３１を経て共通のディスプレイ１３２に表示される。ここで、コンピュータは、光検出装置１１９から送出される各種イメージング情報に基づいて異なる分子情報を組み合せた総合評価を実行してその評価結果をディスプレイ１３２に表示することもできる。また、これら複数の異なる種類のイメージを、コンピュータ１３１による画像処理を通じてオーバーレイ（または重畳、合成、並列）してディスプレイ１３２に表示することも可能である。ここでさらに、誘導ラマン散乱イメージは分子振動を検出する他の検出手法に比べて有意に高感度ないし高Ｓ／Ｎ比の分子情報を提供するので、本発明のレーザ顕微鏡装置１０１によって初めて兼用され得るようになった他の光学的観察手段（例えば、蛍光観察用顕微鏡や高調波観察用顕微鏡）による異種のイメージと共に、ディスプレイ１３２上でオーバーレイ表示することで異種情報を複合した複合画像を形成したり或いはコンピュータ１３１内で一緒に画像処理して合成画像を形成するのが容易である。複合画像や合成画像は、誘導ラマン散乱による分子振動に関する情報と上記の他の光学的観察手段による異種の分子情報との組合せで決まる表現形式（例えば色調、濃淡、明度、輝度、分類名称など）をコンピュータ１３１により決定して、決定された表現形式により擬似的に表現した擬似画像であってもよい。こうすることで、多様な分子情報を一度に確認および／または評価する方法を提供したことに等しい態様となる。
【００７２】
さらに、生体のように時系列でイメージデータが変化し得る標本に関しては、コンピュータ１３１が時系列で複数枚のイメージデータ（画像情報）を取得するように顕微鏡装置１０１を制御すると共に、時系列のイメージデータをディスプレイ１３２に表示させるようにする。従って、誘導ラマン散乱による分子振動の情報だけでなく、分子振動以外の異種の分子情報を反映するイメージングデータについても時系列で複数枚の画像を取得するようにして同様にディスプレイ１３２に表示させるようにすることで、生体分子等の動きが有る分子変化の違いをディスプレイ１３２を通じてモニタリングすることとなり、２次元（ＸＹ領域）または３次元（ＸＹＺ領域）の情報に限らず、異種の分子情報の時間的変化から種々の有用な評価結果を得ることが可能となる。
【００７３】
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図７〜８を参照して説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１が第１の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光変調装置７１０の構成、それに伴う作用・効果である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置７０１について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
【００７４】
本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１は、図７に示されるように、レーザ光源装置７０２と、レーザ光源装置７０２からのパルスレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体７０３とを備えている。
【００７５】
パルスレーザ光変調装置７１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子で構成される（図示略）。電気光学変調素子に印加する電圧を一定の周波数Ｆｍｏｄで変調し、該電気光学変調素子を通過するレーザ光Ｌ１′の偏光状態を該変調周波数Ｆｍｏｄで変調する。さらに、印加する電圧値を適切に調整することでパルスレーザ光Ｌ１′に与える位相量を調整し、パルスレーザ光Ｌ１′の偏光とパルスレーザ光Ｌ２′の偏光とが、互いに「平行な状態（Ｌ１′／／Ｌ２′）」と「垂直な状態（Ｌ１′⊥Ｌ２′）」との間で変調できる。その他の構成は第１の実施形態と同様である
【００７６】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１の作用について以下に説明する。第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる部分について主に説明する。
【００７７】
本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置７０１では、合波装置１０８以降のパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａに照射することにより、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱が発生する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′の偏光がパルスレーザ光Ｌ２′の偏光と「平行な状態（Ｌ１′／／Ｌ２′）」と「垂直な状態（Ｌ１′⊥Ｌ２′）」となるように、パルスレーザ光変調装置７１０によりパルスレーザ光Ｌ１′の位相を変調する。このとき、図８に示すとおり、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′が標本Ａ中に照射されることで、標本Ａ中の分子の特定の分子振動における誘導ラマン散乱の励起も変調され、結果的に誘導ラマンロスおよび誘導ラマンゲインも変調される。
【００７８】
該パルスレーザ光Ｌ１′の位相変調による、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度の変調量は、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の偏光解消度ρ(０≦ρ≦0.75)に依存している。偏光解消度がより小さい場合（ρ→０）、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの変調量がより大きくなる傾向にある。
【００７９】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、第１の実施形態の場合と同様に、変調信号検出装置１１７において誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度を検出し、標本の二次元的な誘導ラマン散乱のイメージングが行える。
【００８０】
この場合において、パルスレーザ光変調装置７１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子を用意すれば足り、パルスレーザ光の位相変調のために複雑な光学系が不要なため、装置を安価かつ簡易に構成することができる。
【００８１】
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図９〜１０を参照して説明する。本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１が第１および第２の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光変調装置９１０の構成と、それに伴う作用・効果が異なる点である。なお、本実施形態においては、コンピュータ１３１およびディスプレイ１３２の説明は上述した他の実施形態と同じ構成とし、図示を省略する。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置９０１について、第１および第２の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
【００８２】
本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１は、図９に示されるように、レーザ光源装置９０２と、レーザ光源装置からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体９０３とを備えている。
【００８３】
本発明の第３の実施形態において、パルスレーザ光変調装置９１０は、音響光学効果を有する音響光学変調素子で構成される（図示略）。この音響光学変調素子に一定の変調周波数Ｆｍｏｄで電圧を印加することで、音響光学変調素子を通過するパルスレーザ光Ｌ１′の強度が該変調周波数Ｆｍｏｄで変調される。その他の構成は第１の実施形態と同様である。
【００８４】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１の作用について以下に説明する。第１および２の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる部分について主に説明する。
【００８５】
本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置９０１では、合波装置１０８以降のパルスレーザ光を標本Ａに照射することにより、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωにおいて誘導ラマン散乱が発生する。このとき、パルスレーザ光Ｌ１′の強度をある一定値と略０との間で強度変調する。このとき、図１０に示すとおり、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′が標本Ａ中に照射されることで、標本Ａ中の分子の特定の分子振動における誘導ラマン散乱の励起も変調され、結果的に誘導ラマンロスおよび誘導ラマンゲインも変調される。
【００８６】
標本Ａにおいて発生した誘導ラマン散乱による誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの検出は、第１の実施形態の場合と同様に、変調信号検出装置１１７において誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスの強度を検出し、標本の二次元的な誘導ラマン散乱のイメージングが行える。
【００８７】
この場合において、パルスレーザ光変調装置９１０は、音響光学効果を有する音響光学変調素子を用意すれば足り、パルスレーザ光の強度変調するために複雑な光学系が不要なため、装置を安価かつ簡易に構成することができる。
【００８８】
また、本発明の第３の実施形態に係るパルスレーザ光変調装置９１０は、電気光学効果を有する電気光学変調素子および偏光素子により構成されていてもよい（図示略）。この場合、電気光学変調素子に印加する電圧値と周波数を適切に制御することにより、該電気光学変調素子を通過するパルスレーザ光Ｌ１の偏光状態を変調することが可能となる。このとき、該電気光学返答素子の後段に偏光子を設けることで、偏光子を通過できるパルスレーザ光Ｌ１の成分が、パルスレーザ光Ｌ１の偏光状態に応じて変化する。つまり、電気光学変調素子および偏光子を適切に配置することで、パルスレーザ光Ｌ１′の強度を変調することが可能となる。
【００８９】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【００９０】
周波数分散調節装置１０９は、例えば、固定長の分散媒質を複数用意し、それらを適宜切り替えて、パルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量が変更できるような構成でもよい。
【００９１】
また、周波数分散調節装置１０９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えていてもよい。１対のプリズムを通過したパルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路１０６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散調節装置１０９を通過するパルスレーザ光Ｌ１′に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズムの代わりに回折格子を用いてもよい。
【００９２】
また、周波数分散調節装置１０９は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するパルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調節できる。
【００９３】
また、周波数分散調節装置１０９は、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するパルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、光ファイバの長さを変えることで、パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調節できる。
【００９４】
また、周波数変換装置１１１としてフォトニッククリスタルファイバの代わりに、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。
【００９５】
また、パルスレーザ光を発生する単一のレーザ光源１０４と、光路１０６と光路１０７に分岐するビームスプリッタ１０５を用いたが、これに代えて、各光路１０６と光路１０７にそれぞれ１台ずつレーザ光源１０４を取り付けることにしてもよい。この場合、各レーザ光源１０４は互いにパルスタイミングの同期がとれている必要がある。
【００９６】
また、周波数分散量調節装置１０９は、第２の光路１０７に設けられていてもよいし、両光路１０６、１０７のそれぞれ設けられていてもよい。特に、周波数分散調節装置を両光路１０６、１０７に設けることで、両光路１０６、１０７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′の周波数分散量を調節し所望の周波数分解能に調節することが可能となる。
【００９７】
また、周波数量分散調節装置１０９がレーザ光源１０４とビームスプリッタ１０５との間に追加で設けられていてもよい。こうすることで、分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１とＬ２に対して等しく周波数分散を与えることが可能となる。これにより、周波数変換装置１１１に入射するパルスレーザ光Ｌ２の周波数分散量を、周波数変換装置１１１における周波数変換効率が最も高くなるように調節することが可能となる。ここで、光学的な分岐手段（例えばビームスプリッタ）により形成する分岐光路の本数は２つに限らず、マルチビーム化した場合、4以上の偶数本であってもよい。ここで、分岐光路が奇数本であっても、一部の光路を共用するようにしたり、標本に対して必要な照射を奇数本で可能にするならば、本発明で分岐が必要な場合の光路は、２以上の任意の本数であってよい。
【００９８】
また、周波数分散量調節装置１０９において、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′のチャープレートを略一致させず、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′に一定量の幅を与えてもよい。その場合、誘導ラマン散乱の発生効率は低下するが、標本Ａ周囲の環境変化の影響により、標本Ａ中の分子の特定の分子振動の周波数Ωが変化した場合においても、誘導ラマン散乱イメージングを行うことが可能である。更には、標本Ａの分子の異なる分子振動を同時にイメージングすることも可能となる。
【００９９】
また、周波数分散量調節装置１０９において、パルスレーザ光Ｌ１′およびＬ２′のチャープレートを略一致させず、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′に一定量の幅を与えてもよい場合、周波数分散調節装置１０９は、パルスレーザ光Ｌ１の周波数帯域の所望の周波数帯域のみを透過させる分光フィルタ（バンドパスフィルタ）であってもよい（図示略）。こうすることで、分光フィルタの透過特性を適切に選択することにより、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′幅を、簡便かつ容易に切替えることができる。また、複数の分光フィルタを容易し、それらを切替えるようにしておくことで、パルスレーザ光Ｌ１′とＬ２′の周波数差Ω′幅も切替えることが可能となる（図示略）。
【０１００】
また、変調信号検出装置１１７は、集光レンズ１１５に対して標本Ａを挟んで反対側に設置されているが、集光レンズ１１５と同じ側に設置されていてもよい。こうするこことで、生体組織切片などの分厚い標本の誘導ラマン散乱イメージングを行うことが可能となる。
【０１０１】
また本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものであるが、その応用分野は、細胞や組織
等の生体試料あるいは生体以外の有機・無機等の試料を標本ステージ上で顕微観察する通常の顕微鏡装置に限定されず、人体や動物等生体をｉｎ−ｖｉｖｏ観察する、あるいは構造物を非破壊で観察するための内視鏡的顕微観察装置にも適用されるものである。従って、本発明におけるレーザ顕微装置とは、レーザ光を照明光とする任意の顕微観察（顕微鏡と共通する拡大光学系を用いて所望の拡大画像を提供する観察）を含むものであり、本発明はレーザ光を用いる顕微観察により多様な情報を得る技術として大いなる貢献を果たすものである。
【０１０２】
とくに本発明によれば、上述した構成を有することにより、同じ標本上ないし標本中の特定の分子について、誘導ラマン散乱により標本を走査した走査イメージと、多光子励起蛍光および／または第二次高調波による標本を走査した走査イメージとを画像処理したり位置合わせする際に互いのイメージデータの対応付けが容易に行なえるので、走査範囲内の各種分子に関する異種の分子情報に基づく合成画像を用いた観察や総合評価を正確に行なうことができる。
【０１０３】
ここにおいて、本発明は、上述したレーザ顕微鏡装置を用いた分子情報の評価方法または該評価結果の表示方法という他の観点による発明も包含している。かかる評価方法には、上述した実施形態の装置を使用して実行した光信号の光学的処理の工程に加えて、例えば、標本を照射して得られる誘導ラマン散乱による画像データと、同時または連続して同じ標本から得た多光子励起蛍光および／または第二次高調波による画像データとを各種分子の分布位置ごとに画像処理し、画像処理した情報を標本の観察画像として並列ないし合成して表示したり、分子情報の組合せとして標本を分類する工程が含まれる。
【０１０４】
また、本発明は、誘導ラマン散乱を発生させるための光源または照射光として、周波数スペクトル帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）成分からなる光を使用することができる。従って、本発明は、広帯域の光源または照射光を用いることが望ましいあらゆる用途の光学的装置（光ピックアップ、光加工、光治療等を含む）にとって、光源および／または照射光学系を共用できる安価な光学装置ないし光学システムも提供する。さらに、本発明によれば、広帯域の光源または照射光を使用しているにも拘わらず、誘導ラマン散乱による検出すべき光信号を最も高感度で検出されるように周波数分散量を調節したり、所望の分子の振動周波数に応じて最も高感度で検出されるように感度調整したりする構成を有しているので、検出すべき分子が標本等の対象に低濃度（または極微量）しか分布していない場合にも比較的高速にイメージデータを得ることができる。このことから、広帯域の光源または照射光を使用するような他の高感度なイメージングにおいて時系列な画像を得る動作速度をなるべく低下させることなく、本発明による誘導ラマン散乱イメージングを同時機または交互に行なうことが可能である。
【０１０５】
さらに、本発明は、これら表示または分類に含まれる各工程を上述したレーザ顕微鏡装置１０１、７０１、９０１において実行させるためのソフトウェアまたは制御用の電気的プログラムも提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】図１のパルスレーザ光変調装置の構成を示している。
【図３】図２のパルスレーザ光変調装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の状態をスペクトログラム（時間―周波数）で示した図である。
【図４】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光の状態をスペクトログラムで示すグラフであり、周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）周波数分散量調節前、（ｂ）周波数分散量調節後、（ｃ）時間的なパルスタイミング量調整後、をそれぞれ示している。
【図５】図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光のスペクトログラムを示す図であり、パルスレーザ光変調装置により位相変調されたパルスレーザ光により誘導ラマン散乱の発生が変調を受ける状態を示している。
【図６】図１のレーザ顕微鏡装置の導光されるパルスレーザ光のスペクトログラムを示す図であり、多光子励起蛍光イメージングにおけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。
【図７】本発明の２実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図８】図７のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光と、標本Ａに照射した後の２つのパルスレーザ光の状態を示した図であり、パルスレーザ光の位相変調により、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスが変調周期に応じて変調されていることを示している。
【図９】本発明の３実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図１０】図８のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を導光されるパルスレーザ光と、標本Ａに照射した後の２つのパルスレーザ光の状態を示した図であり、パルスレーザ光の強度変調により、誘導ラマンゲインまたは誘導ラマンロスが変調周期に応じて変調されていることを示している。
【符号の説明】
【０１０７】
１０１、７０１、９０１・・・レーザ顕微鏡装置
１０２、７０２、９０２・・・レーザ光源装置
１０３、７０３、９０３・・・顕微鏡本体
１０４ ・・・レーザ光源
１０５ ・・・ビームスプリッタ（分岐手段）
１０６、１０７、２０３、２０４、２１１ ・・・光路
１０８・・・ 合波装置（合波手段）
１０９ ・・・周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）
１１０、７１０、９１０・・・パルスレーザ光変調装置（パルスレーザ光変調手段）
１１１・・・ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１２・・・パルスタイミング調節手段
１１３・・・スキャナ
１１４・・・レンズ群
１１５、１１６・・・集光レンズ
１１７・・・変調信号検出装置（変調信号検出手段）
１１８・・・ダイクロイックミラー
１１９・・・光検出装置
１２０・・・標本ステージ
１２１・・・ミラー
１３１・・・コンピュータ
１３２・・・ディスプレイ
２０１・・・電気光学変調素子
２０２ ・・・偏光ビームスプリッタ
２０５、２０６・・・リフレクタ
２０７、２０８・・・１／２波長板
２０９、２１０・・・光路長変更用ステージ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光を変調するパルスレーザ光変調手段と、
前記合波手段により合波された前記２つのパルスレーザ光を標本中に集光し、標本中の分子の特定の分子振動から発生した誘導ラマン散乱を前記パルスレーザ変調部の変調に同期して検出する変調信号検出手段と、
を有することを特徴とするレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記パルスレーザ光変調手段が、前記パルスレーザ光の位相を変化させることで変調することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記パルスレーザ光変調手段が、前記パルスレーザ光の強度を変化させることで変調することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
１ピコ秒以下のパルス幅を有するフェムト秒パルスレーザ光を発生するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記分岐手段により分岐された２つの光路のいずれか一方の光路に設けられ、該２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、
を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング 調節手段を備える請求項１から請求項4いずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記周波数変換手段が非線形ファイバである請求項４に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項７】
前記パルスレーザ光変調手段が、電気光学効果を有する電気光学変調素子からなることを特徴とする請求項２または請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項８】
前記パルスレーザ光変調手段が、音響光学効果を有する音響光学変調素子からなることを特徴とする請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項９】
前記周波数分散調節手段を、前記レーザ光源と前記分岐手段の間に配置したことを特徴とする請求項４または５に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記周波数分散調節手段が、標本において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定する請求項１から請求項８いずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項１】
標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段と、
前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光を変調するパルスレーザ光変調手段と、
前記合波手段により合波された前記２つのパルスレーザ光を標本中に集光し、標本中の分子の特定の分子振動から発生した誘導ラマン散乱を前記パルスレーザ変調部の変調に同期して検出する変調信号検出手段と、
を有することを特徴とするレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記パルスレーザ光変調手段が、前記パルスレーザ光の位相を変化させることで変調することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記パルスレーザ光変調手段が、前記パルスレーザ光の強度を変化させることで変調することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
１ピコ秒以下のパルス幅を有するフェムト秒パルスレーザ光を発生するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、
前記分岐手段により分岐された２つの光路のいずれか一方の光路に設けられ、該２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の分子振動の周波数に略等しい周波数差を与える周波数変換手段と、
を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング 調節手段を備える請求項１から請求項4いずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項６】
前記周波数変換手段が非線形ファイバである請求項４に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項７】
前記パルスレーザ光変調手段が、電気光学効果を有する電気光学変調素子からなることを特徴とする請求項２または請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項８】
前記パルスレーザ光変調手段が、音響光学効果を有する音響光学変調素子からなることを特徴とする請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項９】
前記周波数分散調節手段を、前記レーザ光源と前記分岐手段の間に配置したことを特徴とする請求項４または５に記載のレーザ顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記周波数分散調節手段が、標本において略フーリエ限界パルスとなるように分散量を設定する請求項１から請求項８いずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１５８４１３（Ｐ２０１１−１５８４１３Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１８３８（Ｐ２０１０−２１８３８）
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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