ワクチン接種および遺伝子治療のためのマイクロカプセル化ＤＮＡ
【課題】現存のワクチン接種および遺伝子治療技術を改善し、かつインビボにおいて効果的であるか、または公知の組成物および方法において同定されたいくつかの問題または不利益を少なくとも克服する、新規の組成物およびそれらの投与方法を提供すること。
【解決手段】微粒子およびＤＮＡを含む組成物であって、ここで、該ＤＮＡは、該微粒子内にあり、かつポリペプチドをコードする配列を含み、ここで、該微粒子は、レシピエントへの投与後にそのコード配列の発現を誘導するように適合されている、組成物。
【解決手段】微粒子およびＤＮＡを含む組成物であって、ここで、該ＤＮＡは、該微粒子内にあり、かつポリペプチドをコードする配列を含み、ここで、該微粒子は、レシピエントへの投与後にそのコード配列の発現を誘導するように適合されている、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロカプセル化ＤＮＡ、マイクロカプセル化ＤＮＡを含むワクチン、微粒子中のＤＮＡの投与を含むワクチン接種方法および遺伝子治療方法、ＤＮＡを含む微粒子を調製する方法、およびＤＮＡ含有粒子を含む乾燥化組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーであるポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）は、インビボにおいて微粒状の形態で薬物および生物学的製剤を送達するために製薬産業によって長年使用されてきた。米国ＦＤＡは、前立腺ガンの処置において使用される酢酸ロイプロリド（Ｌｕｐｒａｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標））に対するＰＬＧマイクロスフェア３０日送達系を承認した。ワクチン用途についてのポリマーマイクロカプセル化技術の可能性の有用な総説は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｍｏｒｒｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ， １９９４， １２巻、１号、５〜１１頁において見出される。
【０００３】
カプセル化に対する代替として、例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ．Ａ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １９８８， ５（２）， ９９−１３９頁に記載されたように、リポソームと呼ばれるリン脂質ベシクルにおいて抗原を送達することもまた知られている。コレラ毒素、マラリアスポロゾイトタンパク質、および破傷風トキソイドを含む多くの抗原が、リポソームを使用して腹腔内に送達されてきたこと、ならびにインフルエンザ抗原が鼻内から送達されることが報告されている。
【０００４】
特定の状況下において、組織への裸のＤＮＡの注入が、そのＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の発現を導き得ることもまた知られている。例えば、１９８４年に、米国ＮＩＨでの研究は、リス肝炎に対する裸のクローン化プラスミドＤＮＡの肝臓内注入が、リスにおいてウイルス感染および抗ウイルス抗体の形成の両方を生じたことを報告した。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−９５／０５８５３は、生物学的に活性なペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドの投与のための方法、組成物、およびデバイスを記載する。この公開された適用は、とりわけ、裸のＤＮＡのレシピエントにおいて抗体を惹起することを目的とした免疫原性抗原をコードする裸のＤＮＡの注入を記載する。
【０００６】
ＤＮＡのリポソームの送達も公知であり、そして、例えば、ＥＰ−Ａ−０４７５１７８において記載されている。
【０００７】
所望の遺伝子産物の発現を得るための代替の方法は、ＥＰ−Ａ−０１６１６４０において記載されており、ここでは、ウシ成長ホルモンを発現するマウス細胞がカプセル化され、そして乳産生を増加するために雌牛に移植される。
【０００８】
ＥＰ−Ａ−０２４８５３１は、マイクロカプセル中に直鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）をカプセル化すること、そしてこれらをインターフェロン産生の誘導のために使用することを記載する。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−９４／２３７３８は、ＤＮＡの細胞取り込みを促進し、そして標的化する結合体と組合わせたＤＮＡを含む微粒子を記載することを意図する。実施例において、タングステンを含む微粒子による細胞のボンバードメントが記載されている。これらの実施例は、ＤＮＡコート金属粒子を用いる従来のボンバードメントとほとんど違わないように思える。さらに、超音波処理が、微粒子製造において提唱されている（これは、ＤＮＡ損傷の危険を冒すことが知られる工程である）が、示されたデータは、カプセル化ＤＮＡの完全性を決定するには不十分であり、かつ不適切である。
【００１０】
本発明では、通常、活性な真核生物のプロモーターの制御下に置かれる、免疫原性、酵素的、または他の有用な生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、インビボにおいて送達することが望まれる。本発明の目的は、当該分野で公知のワクチン接種治療に対する改善および先行技術の遺伝子治療方法に対する改善を含む。
【００１１】
現存の組成物および方法の改善またはそれに対する代替が望ましい。なぜなら、これらの現存の方法は多くの欠点を含むことが知られているからである。
【００１２】
ＷＯ−Ａ−９５／０５８５３は所望の遺伝子産物をコードする裸のポリヌクレオチドの投与を記載する。しかし、この刊行物における組成物および方法は、無菌的手順を必要とする、それ自身不快であり不便な投与経路である注射に対してのみ適切である。
【００１３】
ＷＯ−Ａ−９４／２３７３８は、インビボにおける達成された実施例は提示されていないが、カプセル化ＤＮＡがレシピエントの体内において粒子から放出され、そして次に細胞によって取り込まれるプロセスを提供することを意図する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、現存のワクチン接種および遺伝子治療技術を改善し、かつインビボにおいて効果的であるか、または公知の組成物および方法において同定されたいくつかの問題または不利益を少なくとも克服する、新規の組成物およびそれらの投与方法を提供することを求める。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）微粒子およびＤＮＡを含む組成物であって、ここで、該ＤＮＡは、該微粒子内にあり、かつポリペプチドをコードする配列を含み、ここで、該微粒子は、レシピエントへの投与後にそのコード配列の発現を誘導するように適合されている、組成物。
（項目２）経口投与後に前記コード配列の発現を誘導するように適合されている、項目１に記載の組成物。
（項目３）環状ＤＮＡを含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）（ｉ）プラスミドＤＮＡ、および（ｉｉ）１以上の挿入、欠失、および置換によってプラスミドＤＮＡから誘導されたＤＮＡから選択される二本鎖ＤＮＡを含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）上記ＤＮＡが、上記コード配列の転写を促進する配列を含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目６）上記微粒子が、非毒性で、かつ薬学的に受容可能であり、かつ生分解性ポリマーからなるかまたはこれを含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目７）上記ポリマーが、ラクチド含有ポリマーである、項目６に記載の組成物。
（項目８）上記ポリマーが、グリコリド含有ポリマーである、項目６または７に記載の組成物。
（項目９）上記ポリマーが、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、項目７または８に記載の組成物。
（項目１０）上記微粒子の少なくとも５０％が、０．０１μｍ〜３０μｍの大きさ範囲にある、項目１から９のいずれかに記載の微粒子を含む組成物。
（項目１１）上記微粒子の少なくとも５０％が、１μｍ〜１０μｍの大きさ範囲にある、項目１０に記載の微粒子を含む組成物。
（項目１２）実質的に全ての微粒子が、３０μｍ未満の大きさ範囲にある、項目１０または１１に記載の微粒子を含む組成物。
（項目１３）免疫原をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ経口投与または非経口投与後にレシピエントにおいて該免疫原の発現を誘導するように適合されている、項目１から１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）上記レシピエントにおいて、上記免疫原に特異的な抗体の産生を誘導するように適合されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）ＩｇＡ抗体の産生を誘導するように適合されている、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）哺乳動物のワクチン接種のために適合された、項目１３から１５のいずれかに記載の組成物であって、ここで、該ワクチン接種が、上記免疫原に応答した哺乳動物による抗体の産生によって得られ、該免疫原自身は、上記ＤＮＡコード配列の発現によって産生される、組成物。
（項目１７）項目１から１６のいずれかに記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、免疫原に対する抗体を誘起するためのワクチンであって、ここで上記ＤＮＡ配列が該免疫原をコードする、ワクチン。
（項目１８）上記免疫原が、ウイルスまたは細菌または他の病原性微生物の免疫原性成分であるか、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体である、項目１７に記載のワクチン。
（項目１９）上記ＤＮＡ配列が、ウイルスタンパク質をコードする、項目１８に記載のワクチン。
（項目２０）味覚増強剤をさらに含む、項目１７から１９のいずれかに記載のワクチン。
（項目２１）第１および第２のワクチン成分を含む、項目１７から２０のいずれかに記載のワクチンであって、該第１のワクチン成分が微粒子内にあるＤＮＡを含み、ここで、該ＤＮＡが免疫原をコードする配列を含み、かつ該微粒子がインビボでの第１の半減期を有し、そして第２のワクチン成分が微粒子中にあるＤＮＡを含み、ここで、該ＤＮＡが免疫原をコードする配列を含み、かつ該微粒子がインビボでの第２の半減期を有する、ワクチン。
（項目２２）上記第１のワクチン成分の上記免疫原および上記第２のワクチン成分の上記免疫原が、同一である、項目２１に記載のワクチン。
（項目２３）上記第１および第２の半減期がそれぞれ、２週間まで、そして２週間を超える、項目２１または２２に記載のワクチン。
（項目２４）上記第１および第２の半減期の比が、少なくとも２：１である、項目２１または２２に記載のワクチン。
（項目２５）レシピエントにおいて、所望の非免疫原性遺伝子産物の発現を誘導するように適合されている、項目１から１２のいずれかに記載の組成物。
（項目２６）所望の非免疫原性産物の発現を誘導するための、項目２５に記載の組成物であって、この産物は、（ｉ）以前に実質的に発現されていないか、または（ｉｉ）増加することが所望されるレベルで以前に発現されている、組成物。
（項目２７）遺伝子産物が発現しないこと、発現の減少、または遺伝子産物の不在によって生じる疾患の処置または予防のための、項目２５または２６に記載の組成物であって、ここで、該組成物の該ＤＮＡコード配列は、該遺伝子産物をコードする、組成物。
（項目２８）遺伝子治療のための、項目２５から２７のいずれかに記載の組成物。
（項目２９）ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、かつ水分含有量が５％未満である、組成物。
（項目３０）ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、かつ水分含有量が５％未満であり、項目１から２８のいずれかに記載の組成物を凍結乾燥することによって得られる、組成物。
（項目３１）貯蔵用の組成物を調製する方法であって、ＤＮＡを含むポリマー粒子の水溶液を調製する工程、および該溶液を５％未満の水分含有量まで乾燥させる工程を包含する、方法。
（項目３２）以下の工程を包含する、微粒子を作製する方法：
ｉ．ＤＮＡと微粒子前駆体との混合物を調製する工程；
ｉｉ．ＤＮＡを含有する微粒子を形成する工程；および
ｉｉｉ．該混合物からＤＮＡ含有微粒子を分離する工程、ここで、該ＤＮＡ含有微粒子中のＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、かつ該微粒子が、レシピエントにおける該コード配列の発現を誘導するように適合されている、方法。
（項目３３）ａ．前記ＤＮＡがそのコード配列の発現を誘導する能力が、微粒子形成前にそのコード配列の発現を誘導する能力の少なくとも２５％であるような条件下で、複数の微粒子を形成する工程、を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）項目３３に記載の方法であって、カプセル化されたＤＮＡのうちの少なくとも１０％が、そのコード配列の発現を誘導する能力を保持しているような、剪断応力が減少した条件下で、エマルジョンを形成する工程を包含する、方法。
（項目３５）カプセル化されたＤＮＡの少なくとも２５％が、そのコード配列の発現を誘導する能力を保持している、項目３４に記載の方法。
（項目３６）ＤＮＡとアルコールとの混合物を調製する工程、および微粒子前駆体を該混合物に添加する工程を包含する、項目３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）アルコール含有量が１０〜４０％で、ＤＮＡおよびアルコールの溶液を調製する工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）上記大きさ範囲が０．０１μｍ〜３０μｍである微粒子を形成する工程を包含する、項目３２から３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）上記ＤＮＡが、環状のプラスミドＤＮＡである、項目３２から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）上記微粒子を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３２から３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）微粒子中にＤＮＡをカプセル化するための方法であって、ここで、該ＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、かつコード配列の発現を誘導するように適合されており、該ＤＮＡと微粒子の形成に適切な水中油中水エマルジョンとの混合物を調製する工程、ＤＮＡを含む微粒子を形成する工程、および遠心分離によって該混合物からＤＮＡ含有微粒子を分離する工程を包含し、該ＤＮＡがそのコード配列の発現を誘導するその能力を保持していることで特徴付けられる、方法。
（項目４２）項目１７から２４のいずれかに記載のワクチンを投与する工程を包含する、ワクチン接種方法。
（項目４３）ワクチン接種が、上記コード配列から発現された上記免疫原に対する抗体を誘起することによって得られる、項目４２に記載のワクチン接種方法。
（項目４４）発現されるべき遺伝子産物を同定する工程、項目２６から２８のいずれかに記載の組成物を調製する工程、ここで、上記コード配列が該遺伝子産物をコードし、および該組成物を投与する工程を包含する、遺伝子治療方法。
（項目４５）投与が、経口または鼻内である、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４６）投与が、注射による、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４７）粘膜免疫を誘導するための医薬の製造における、項目１から１６のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目４８）ＩｇＡ抗体の産生を誘導するための医薬の製造における、項目１から１６のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目４９）予防的または治療的免疫応答を誘導するための医薬の製造における、項目１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
【００１６】
ＤＮＡは、もはや遺伝子産物の発現を誘導できなくなるように、容易に損傷を受けることが知られている。驚くべきことに、本発明者らは、ポリマー粒子中にＤＮＡをカプセル化するための技術を発明することに成功し、その結果、ＤＮＡは、それによってコードされた遺伝子産物の発現を誘導するのに十分な完全性を保持する。本発明者らは、哺乳動物のワクチン接種または遺伝子治療に適切なＤＮＡ含有微粒子を発明することにも成功した。
【００１７】
従って、本発明の第１の局面は、ポリマー中にカプセル化されたＤＮＡを含む薬学的組成物を提供し、このＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、ここでこの組成物は、レシピエントにおいてコード配列の発現を誘導するように適合されている。好ましくは、コード配列は、その配列の発現を促進するプロモーターを付随する。薬学的組成物が哺乳動物で使用される場合、真核生物のプロモーター、および特に広範な種々の組織タイプで作動するプロモーターを使用することが都合が良い。本発明の特定の実施態様では、組織または細胞のタイプに特異的なプロモーターが使用される。
【００１８】
使用において、薬学的組成物は経口投与され、そしてコード配列が発現されて、所望の治療効果を導く。
【００１９】
ワクチン接種に適切な本発明の組成物は、免疫原をコードする配列を含む。その組成物の投与後、発現された免疫原は、レシピエント内で抗体の産生を誘起し、それによってレシピエントのワクチン接種に貢献する。
【００２０】
以下の実施例において記載される本発明の特定の実施態様は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。それは、インビボにおいて投与されており、そしてそのタンパク質の哺乳動物における発現を誘導することが分かっている。その発現は、そのタンパク質に対して特異的な抗体の産生の測定によって検出された。本発明の特定の実施態様の組成物は、約１０μｍまでの大きさである微粒子を含む。
【００２１】
一般に、本発明の微粒子は、ファゴサイトーシス（例えば、マクロファージまたは他の抗原提示細胞によるファゴサイトーシス）によってレシピエントの細胞に入ることが意図される。続いて、微粒子本体は細胞内隙で分解し、そしてＤＮＡが放出される。本発明の微粒子は０．０１μｍ〜３０μｍの大きさであることが好ましい。１μｍ〜１０μｍがより好ましい範囲である。これらの大きさが、ＤＮＡのインビボにおける発現を確実に達成することに対して適切であることが見出された。微粒子の大きさが取り込みを決定するので、ＤＮＡの取り込みを促進する薬剤が、本発明の微粒子において必要とされないこともまた注目されるべきである。
【００２２】
本発明による別の組成物は、非免疫原性の産物をコードする配列を含む。そのような組成物は特に遺伝子治療において有用であり、ここでは、レシピエントにおいて、発現されていないか、または増加することが望ましいレベルで発現されている遺伝子産物を発現することが望ましい。この場合、本発明の組成物は、所望の産物をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてここでは組成物の投与後、コード配列の発現により、所望の産物のレベルが増大し、遺伝子治療の効果を与える、
また、遺伝子治療適用のための微粒子は、ファゴサイトーシスによるそれらの取り込みを標的化するために、０．０１μｍ〜３０μｍ、より好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲の大きさを有することが本発明の特徴である。
【００２３】
ワクチン接種における使用のための本発明の特定の実施態様は、ウイルス、細菌、または他の病原性微生物のタンパク質もしくはその免疫原性組成物、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ配列を含む。タンパク質は、例えば、ＨＩＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、麻疹ウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質（例えば、肝炎表面抗原）、または百日咳菌タンパク質である。さらに、組成物が経口的に使用される場合、それは、好都合には、味覚増強剤もまた含み得る。用語「味覚増強剤」は、甘味料、香味料、および組成物の他の成分由来のいかなる不快な味覚をも隠蔽する薬剤を包含することが意図される。それは、好都合には、腸溶性にコートされ得るか、または適切な制酸剤処方物と同時投与され得る。
【００２４】
以下に記載された特定の実施態様において、微粒子の調製物は、麻疹ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。微粒子の経口投与は、そのタンパク質に対して特異的な抗体における増加を誘起した。同様に、別の微粒子調製物は、ロタウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。これらの微粒子調製物の経口投与は、抗ロタウイルスタンパク質抗体、およびウイルスによるチャレンジに対する防御効果を誘起した。
【００２５】
遺伝子治療に適切な本発明の特定の実施態様は、遺伝性疾患の処置のために必要とされる酵素または別のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。例えば、グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡ配列は、ゴーシェ病の処置のために適切である。
【００２６】
従って、本発明者らは、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡの能力がカプセル化プロセスによって実質的に影響を受けないようにポリマー内にカプセル化されたＤＮＡを提供した。ＤＮＡが、乳化およびポリマー粒子の産生のために必要な他の工程によって、容易に損傷され得ることが知られている。本発明者らは、カプセル化ＤＮＡの投与に際して得られるべき生物学的効果のために、十分に効力のあるＤＮＡがカプセル化されるような、ＤＮＡのカプセル化を提供した。
【００２７】
本発明は、カプセル化ＤＮＡが経口投与に適切であり、先行技術に記載の注射用ＤＮＡ調製物に関連した不快であり不便な局面が避けられるという点で、利点を提供する。以下に記載の実施例に記載の特定の実施態様は、本発明の組成物の経口投与に応じて免疫原特異的抗体を誘導することにおいて成功している。さらに、カプセル化ＤＮＡ処方物は乾燥（例えば、凍結乾燥）に適切であり、長期間にわたって安定であり、かつ保存に適切な形態になる。さらに、多くのワクチン適用について、全身体液媒介性および細胞媒介性免疫応答と同様に、粘膜表面での免疫もまた惹起され得れば有益である。以下に記載の本発明の特定の実施態様は、経口投与後に特定のＩｇＡ抗体の有意な増大を誘起することが示された。従って、本発明は、ＤＮＡをポリマー粒子と共に含む薬学的組成物を提供し、このＤＮＡは、ポリペプチドをコードし、そしてこの組成物は、レシピエントにおいて粘膜ポリペプチド特異的ＩｇＡ抗体を誘導するように適合されている。
【００２８】
本発明の微粒子のポリマーは、好ましくは、生分解性および非毒性の両方である。適切なポリマーは、ラクチド含有ポリマーおよびグリコリド含有ポリマー、および０−１００：１００−０ラクチド：グリコリドのコポリマーを包含する。本発明の特定の実施態様では、ポリマーは、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（他に記されていなければ、ＰＬＧという）を含む。これは、ヒトおよび獣医学的用途について認可されているので選択した。
【００２９】
本発明の産物は、代表的には、動物（特に、動物）におけるインビボ用途のためである。従って、微粒子のポリマーは、インビボで非毒性であり、かつ薬学的用途に適切であるべきである。ポリマーはさらに、レシピエントにおいてそのＤＮＡを放出するので、生分解性（生分解性ポリマーからなるか、または生分解性ポリマーを含むのいずれかにより）であるべきである。当該分野には、ヒトおよび動物の経口用途に適切なポリマーに関する広範な文献が存在し、そして当業者は、困難なく当該分野のポリマーを本発明の微粒子に適合させ得る。これに関連して、ＥＰ−Ａ−０４５１３９０、ＷＯ−Ａ−９５／３１１８４およびＷＯ−Ａ−９５／３１１８７の開示内容を参考のために本明細書において援用する。
【００３０】
粒子内に含有されるＤＮＡは、代表的には、二本鎖ＤＮＡを含む。本発明における使用に適切なＤＮＡ配列の構築は、当業者により理解される。配列が転写プロモーターおよび遺伝子コード配列の両方を含むことが好ましい。ＤＮＡ配列が転写終結およびポリアデニル化をコード配列の下流に提供することが、さらに好ましい。
【００３１】
ＤＮＡは、二本鎖で環状スーパーコイル化されていることが特に好ましい。粒子の製造の間、ＤＮＡは強い剪断力を受けることが観察されている。特定の穏やかな粒子製造条件を用いて、（一部、予めスーパーコイル化したＤＮＡが、進行中に開環形態に変換され得ることが観察されたが）、本発明者らは、機能的ＤＮＡを保持するよう首尾よく成し遂げた。
【００３２】
プラスミドＤＮＡは特に適切であり、そして以下に記載の本発明の特定の実施態様において用いられる。プラスミド製造に関しては広範な文献があるので、当業者は、本発明の微粒子に適切なプラスミドを容易に調製できる。一般に、任意の真核生物プロモーター配列を取り込むプラスミドが適切である。
【００３３】
本発明のさらなる随意の特性は、ＤＮＡ含有ポリマー粒子が、インビボにおいて異なる半減期を有するように製造され得ることである。ワクチン接種の間に抗原を投与するとき、抗原ができるだけ長い時間枠にわたって送達されることが有益であり得る。本発明の特定の実施態様は、第１および第２のワクチン成分を含むワクチンを提供し、第１のワクチン成分は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、ここでＤＮＡは、免疫原をコードする配列を含み、そしてここでポリマーは、インビボにおける第１の半減期を有し、そして第２のワクチン成分は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、ここでＤＮＡは、免疫原をコードする配列を含み、そしてここでポリマーは、インビボにおける第２の半減期を有する。それぞれの半減期は、５日まで、および５日より多い半減期であり得る。一例では、第１および第２のワクチン成分の免疫原は同一である。あるいは、それぞれのワクチン成分は、異なる免疫原をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
【００３４】
本発明の一実施態様では、第１および第２のそれぞれのワクチン成分の半減期は、２日まで、そして２週間より多い半減期である。さらなる実施態様では、第１および第２の半減期は、少なくとも一桁異なる。
【００３５】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様の使用では、ルシフェラーゼをコードするプラスミドが、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして約２μｍの大きさの粒子中のＰＬＧ内にカプセル化される。このカプセル化ＤＮＡは、マウスに投与され、そして抗ルシフェラーゼ抗体を誘起した。この抗体は、数週間にわたって検出された。本発明のカプセル化ＤＮＡに応じた抗体の産生を、裸のＤＮＡの腹腔内投与および経口投与に応じた抗体産生と比較した。両方の場合において、カプセル化ＤＮＡは、同等または有意に高い量のＩｇＧおよびＩｇＭを誘起し、そしてまた有意なＩｇＡ応答を惹起した。
【００３６】
本発明の第２の局面は、ＤＮＡの生物学的活性が有意な程度保持されるように、ポリマー中にＤＮＡをカプセル化する方法を提供する。第２の局面の一実施態様では、ポリマー粒子内にＤＮＡをカプセル化する方法（このＤＮＡは、ＤＮＡ内でコード配列の発現を誘導し得る）は、水中（油中水）エマルジョンを調製して微粒子を形成させる工程、および続いて生成されたＤＮＡ含有微粒子を遠心分離により分離する工程を包含する。得られた微粒子は、好ましくは、０．０１μｍから３０μｍ、より好ましくは、１μｍから１０μｍの範囲の大きさを有する。
【００３７】
本発明の方法は、ＤＮＡの少なくとも一部が、粒子製造の間に損傷されず、そしてそれによりその遺伝子コード配列の発現を誘導する能力を保持することを確実にする条件下で実施される。
【００３８】
ＤＮＡが微粒子中に取り込まれ、そしてＤＮＡ取り込みが、ＤＮＡ＋アルコールの溶液を調製し、微粒子ポリマーを添加し、そしてそれから微粒子を形成することにより増大されることが必須である。溶液のアルコール含有量は、適切には、１％と６０％との間、そして好ましくは、５％と４０％との間で変動する。本発明の特定の実施態様では、アルコール含有量は、ＰＬＧから作製された微粒子について約１５〜３５％であり、より特定すると２０〜３０％であり、２５％およびそれより多く、５０〜６０％までのＤＮＡ取り込みを生じる。エタノールが特に適切である；メタノールおよびプロパノールならびにＤＮＡを変性しない他のアルコール類もまた適切であり、そしてアルコールは、好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ１０アルコールである。
【００３９】
本方法の乳化工程（単数または複数）は、剪断応力を減少した条件下で実施されることがまた好ましく、そしてこれは、エマルジョンを得、そして所望の大きさ範囲の微粒子を形成するのに十分であるが、過剰な剪断によって全てのＤＮＡが損傷されるほどには高くない乳化速度の使用により、必要に応じて達成される。以下に記載の本発明の一実施態様では、乳化ミキサー速度は、少なくとも２５％のＤＮＡ活性（コンピテント細菌の形質転換または培養細胞のトランスフェクションによりアッセイされる）が、ＤＮＡを含有する得られた微粒子中で保持されるように調整される。適切な速度は、８０００ｒｐｍ以下であり、好ましくは６０００ｒｐｍ以下であり、そして以下に記載の特定の実施態様では、速度は約３０００ｒｐｍである。
【００４０】
本方法は、室温で実施され得（これは実験室および工業目的のために便利である）、そしてカプセル化手順の間のプラスミドＤＮＡの安定性を改善する室温以下でも実施され得る。本方法の温度は、２０℃以下、１０℃以下、または５℃以下にさえ下げられ得る。本発明の一実施態様では、本方法は、室温で用いられる量に比較して減少された量の微粒子前駆体を用いて、室温以下で実施される。
【００４１】
従って、本方法のパラメーターは、１０μｍ以下の直径の微粒子の形成を促進し、そして微粒子中へのＤＮＡの取り込みを促進し、そしてそのＤＮＡがレシピエントで発現され得ないようなＤＮＡに対する損傷を避けるように選択される。
【００４２】
ポリマーおよびＤＮＡの任意の特定の選択に応じて、本方法の変更が、最良の結果を得るために必要であり得る。方法の効率は、形質転換またはトランスフェクションアッセイにより評価され得る。本発明者らにより用いられる形質転換アッセイにおいて、ＤＮＡは、有機溶媒での溶解により微粒子から回収され、定量され、そして細菌の形質転換に用いられる。アンピシリン選択は、形質転換体の成功を決定する。トランスフェクションアッセイにおいて、回収されたＤＮＡは、培養物中で真核生物細胞をトランスフェクトするために用いられ、次いでこの培養物が抗原または遺伝子治療産物の存在についてアッセイされる。これらのアッセイは、本発明の方法により生成された微粒子から回収されたＤＮＡが、元のＤＮＡの活性の５０〜６０％および８０％までを保持し得ることを実証した。このことは、微粒子中への機能的ＤＮＡの高い取り込み効率を示す。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様では、薬学的組成物を作製する方法が提供され、この方法は、構築物内にコード配列の発現のためにＤＮＡ構築物を調製する工程、および構築物の周囲に０．０１μｍと３０μｍとの間の大きさのポリマー粒子を形成する工程を包含し、ここでこの構築物は、コード配列の発現を誘導させ得る状態にある。使用において、構築物が粒子から分離されるとき、これは、コード配列の発現を誘導する。粒子は、好ましくは、ポリマー＋ＤＮＡ＋アルコールの溶液を乳化することにより形成される。
【００４４】
本発明の方法は、本発明の第１の局面の薬学的組成物を生成するように適合される。本方法の工程は、多くのＤＮＡ含有ポリマー粒子を含有する得られた組成物において、有用な割合の粒子が、活性なＤＮＡ（すなわち、本方法によりそのコード配列の発現を誘導する能力が失われるような損傷をうけなかったＤＮＡ）を含有するように適合される。ＤＮＡ活性は、粒子形成工程の前に、活性％として測定される。
【００４５】
ＤＮＡ生物学的活性の受容可能なレベルは、少なくとも１０％であり、好ましくは、少なくとも２５％である。一方、特に脆弱なＤＮＡについては、使用において、治療効果が組成物により示される限り、より低い％が受容可能であり得る。
【００４６】
本発明の特定の実施態様では、組成物は、コード配列および真核生物プロモーターを含む二本鎖のスーパーコイル化ＤＮＡのプラスミド溶液を調製することにより作製される。別個に、ポリマー溶液が調製される。２溶液が一緒に混合され、１０００ｒｐｍと４０００ｒｐｍとの間の速度で乳化される。次いで、安定剤の溶液が添加され、そして新たな混合物が１０００ｒｐｍと４０００ｒｐｍとの間の速度で乳化される。粒子の遠心分離および再懸濁後、その中のＤＮＡは、その活性の２５％を保持する。
【００４７】
本発明の第３の局面は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、そして減少した水分含有量（例えば、５重量％未満）を有する薬学的組成物を提供する。この組成物は、長期貯蔵するのに適切であり、一方、レシピエントへの投与の際に、このＤＮＡ内のコード配列の発現を誘導するＤＮＡの能力を保持している。
【００４８】
貯蔵用の薬学的組成物を調製する方法は、本発明の第１の局面の薬学的組成物を乾燥（例えば、凍結乾燥により）することである。（正確な水含有量は、用いられる乾燥の期間により決定されるが）乾燥した組成物は、５％未満の水含有量を有することが好ましい。
【００４９】
本発明の第４の局面は、ワクチン接種方法を提供し、この方法は、本発明の第１の局面のワクチンを投与する工程を包含する。従って、ワクチン接種は、遺伝子コード配列から発現された免疫原に対する抗体を誘起することにより得られ得る。理解されるように、免疫原は、ウイルスまたは細菌、あるいは他の病原性微生物の成分であり得るか、あるいはこの免疫原のアナログであり得る。このアナログに対する抗体は、病原体自身に対して有効である。
【００５０】
本発明の第５の局面では、遺伝子治療方法が提供され、この方法は、個体において発現されるべき遺伝子産物を同定する工程、所望の遺伝子産物の発現のために本発明の第１の局面の組成物を調製する工程、およびこの組成物を投与する工程を包含する。発現されることが所望される遺伝子産物は、代表的には、遺伝子治療を受けている患者において、以前には完全または適切に発現されていないか、あるいは全く発現されていない遺伝子産物である。
【００５１】
遺伝子治療は、経口または鼻内投与、あるいは注射により都合よく達成され得る。
【００５２】
本発明の第６の局面によると、ＩｇＡ抗体の産生を誘導するための医薬の製造における、本発明の第１の局面の微粒子の使用が提供される。
【００５３】
本発明の第７の局面によると、遺伝子治療のための医薬の製造における、本発明の第１の局面の微粒子の使用が提供される。
【００５４】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様では、粒子材料はＰＬＧである。本発明の方法により生成される粒子の大きさは、一般に、０．０１〜３０μｍ、好ましくは、１〜１０μｍの範囲である。本発明のＤＮＡ含有粒子のための他の適切なポリマー処方物は、ポリ乳酸、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシヴァレレート、ポリ（ヒドロキシブチレート／ヴァレレート）、エチルセルロース、デキストラン、ポリサッカライド、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ−メチル−メタクリレート、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、およびこれら全ての成分の混合物を包含する。
【００５５】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様の使用において、本発明の微粒子の調製物は、タンパク質ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含む。当業者により理解されるように、広範なＤＮＡ配列および構築物が本発明における使用に適切である。特に、本発明は、当該分野において既によく知られ、そして特徴づけられている広範なプラスミドベクターを取り込んで実施され得る。代表的には、本発明で用いられるプラスミドベクターは、所望の遺伝子産物をコードするｃＤＮＡを含む。ＤＮＡ配列のさらなる成分（例えば、プロモーター、レポーター遺伝子、および転写終結配列）の選択は、公知のプラスミドベクターの構築に関する通常の常識に従って当業者により行われ得る。
【００５６】
本発明の組成物のための好ましい投与経路は、経口経路である。本発明の組成物は、好ましくは、高い酸レベルを有する胃を通過する際に顕著な分解を避けるように設計されるべきであることが意図される。
【００５７】
１０μｍ未満の大きさの微粒子の取り込みがとりわけ腸のＭ細胞内で生じ、従ってこの大きさ範囲のＤＮＡ含有粒子の封入が、この腸位置での取り込みを促進するのに有利であり得ることが知られている。ポリマーの性質および特性および成分に対する他の変更は、本発明の概念内で行われ得る。
【００５８】
以下の図面を伴って、本発明の特定の実施態様の説明を続ける。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡ含有粒子への取り込みに適切なタンパク質発現プラスミドの成分の模式図である；
【図２】図２は、実施例３の結果、すなわち、ＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡによるルシフェラーゼ特異的血清抗体の誘導を示す。ここでは、左欄は、３週間後の抗体価を示し、そして右欄は６週間後の抗体価を示す（ｉ．ｍ．は、筋肉内を示し、ｉ．ｐ．は腹腔内を示し、各欄の底部はＩｇＧレベルを示し、最上部はＩｇＭレベルを示す）；
【図３】図３は、各場合においてＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの力価を用いた、カプセル化ＤＮＡの注射投薬および経口投薬についての用量応答データを示す；
【図４】図４は以下を示す：Ａ−２０００ｒｐｍおよび８０００ｒｐｍでの０〜３００秒のＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーでのホモジナイズ後のプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動；およびＢ−カプセル化の前および後のＤＮＡのアガロースゲル電気泳動；
【図５】図５は、ＰＬＧ微粒子内のＤＮＡに対する便抗ルシフェラーゼＩｇＡ応答を示す；
【図６】図６は、麻疹ウイルスＮタンパク質を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口投与の結果を示す；そして
【図７】図７は、ロタウイルスＶＰ６遺伝子を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口投与の結果を示す：Ａ−糞便ロタウイルス特異的ＩｇＡ応答、Ｂ−経口免疫マウスのチャレンジ後に排泄したロタウイルス。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
（ＰＬＧ微粒子におけるプラスミドＤＮＡのカプセル化方法）
装置：
１）エマルザースクリーン（ｅｍｕｌｓｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）に備え付けられた３／４”プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙミキサー。
２）高速遠心分離機。
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−５００ｍｇ（３ｍｌジクロロメタン中）。
２）プラスミドＤＮＡ（水中１２ｍｇ／ｍｌ）。
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）。
４）無水エタノール。
５）ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）。
方法：
１）２００μｌプラスミドＤＮＡ溶液を２５０μｌ ＴＥＮと混合し、そして１５０μｌエタノールを撹拌しながら添加する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌ ＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で３０００ｒｐｍで２分間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌ ＰＶＡに添加し、そして３０００ｒｐｍで２分間乳化する。
４）２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に撹拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器中に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズし、均質な懸濁液にする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上述のように再度遠心分離する。
７）工程６を３回繰り返す。
８）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に上述のように再懸濁し、凍結乾燥に適した容器に移し、イソプロパノール／ドライアイス混合物中で表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００６１】
この方法では、工程１〜３を室温で行う。ＤＮＡは、微粒子中に約２５％の効率で取り込まれた。
【００６２】
（実施例２）
（インビボ送達後のタンパク質の発現用のプラスミド）
本発明の微粒子での使用に適切なプラスミドは、以下の成分からなる（図１を参照のこと）：
１．プラスミド骨格 プラスミド骨格は、複製起点、およびその細菌宿主におけるプラスミドの維持を可能にする抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーを有する。高いコピー数を提供する骨格は、プラスミドＤＮＡの産生を容易にする。一例は、ｐＵＣプラスミドベクターに由来する。
【００６３】
２．転写プロモーター配列 所望のタンパク質の発現は、ｍＲＮＡの合成を開始する（代表的には真核生物の）転写プロモーターにより駆動される。一般には、広範な種々の組織タイプおよび動物種において機能する強力なプロモーターが用いられるべきである（例えば、ヒトサイトメガロウイルス即時型（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター）。しかし、特に遺伝子治療適用については、組織または細胞のタイプに特異的なプロモーターがより適切であり得る。
【００６４】
３．コード配列 コード配列は、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する。それは、タンパク質合成の開始に好ましい配列情況で、転写開始コドンＡＴＧを含有する。コード配列は、転写終結コドンで終わる。発現されるべきタンパク質は、以下を包含する：ａ）レポーター酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）；ｂ）防御免疫応答を誘導し得る病原性微生物成分（例えば、ダニ媒介脳炎ウイルスのＮＳ１タンパク質、麻疹ウイルスのＮ、ＨまたはＦタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１のｇｐ１２０タンパク質）；ｃ）遺伝性疾患の処置について意図される酵素または他のタンパク質（例えば、ゴーシェ病の処置のためのグルコセレブロシダーゼ）。
【００６５】
４．転写終結配列 発現レベルの改善は、ｍＲＮＡ転写の終結を引き起こす配列がコード配列の下流に取り込まれるいくつかの状況下で得られる。これらの配列はまた、しばしば、ポリＡテイルのｍＲＮＡ転写物への付加を引き起こすシグナルを含有する。この役割において用いられ得る配列は、ｈＣＭＶ主要即時型タンパク質遺伝子またはＳＶ４０ウイルスＤＮＡまたは他のいずれかに由来し得る。
【００６６】
（実施例３）
本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルス即時型（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーターの転写制御下で、昆虫タンパク質ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを構築し、そしてインビトロでトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性を実証した。
【００６７】
本発明者らは、実施例１のプロトコルを用いて、中程度（約２５％）の効率を有する、大きさが約２μｍのＰＬＧ微粒子中に精製プラスミドＤＮＡをカプセル化した。アガロースゲル電気泳動では、初めの閉環状スーパーコイル化ＤＮＡのある割合が、カプセル化プロセスにおける剪断応力の結果として、よりゆっくりと移動する形態（おそらくは弛緩された環）への変換を受けることが示される。カプセル化ＤＮＡは、粒子から放出され、そしてエレクトロポレーションによる細菌形質転換および培養細胞へのトランスフェクション後のルシフェラーゼ発現のアッセイにおいて、そのインビボでの生物学的活性の有意な割合を保持することが示された。
【００６８】
マイクロカプセル化ＤＮＡ（５０μｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射および経口によりマウスに投与した。コントロール動物は、非カプセル化ＤＮＡを同じ経路により受け、そしてポジティブコントロールとして標準的な筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により受けた。ルシフェラーゼ特異的血清抗体を、ＤＮＡ投与の３および６週間後にＥＬＩＳＡにより分析した。結果を図２に示す。
【００６９】
図２に示すように、中程度の特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ応答が、ｉ．ｍ．注射後に、予測したように見られた。カプセル化ＤＮＡは、ｉ．ｐ．注射後に強いＩｇＧおよびＩｇＭ応答を惹起した。一方、非カプセル化ＤＮＡは、ずっと弱い応答を与えた。同様に、経口投与したカプセル化ＤＮＡは、良好なＩｇＧ応答を惹起した。これには、非カプセル化ＤＮＡは匹敵しなかった。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答から、ルシフェラーゼ発現および免疫系への提示が、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化されたプラスミドＤＮＡの投与後に、標準的なｉ．ｍ．経路で見られたより高く、かつ非カプセル化ＤＮＡの比較投与において見られたより高い効率で生じたことが示される。
【００７０】
（実施例４）
さらなる実験において、実施例１の方法により作製したマイクロカプセル化ＤＮＡを、用量（１〜５０μｇ ＤＮＡ）の範囲で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射または経口により異系交配マウスの群に投与した。ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡクラスのルシフェラーゼ特異的血清抗体を、ＤＮＡ投与の３、６、および９週間後にＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７１】
図３において、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡのｉ．ｐ．注射が良好なＩｇＧおよびＩｇＭ応答、ならびにおよび中程度のＩｇＡ応答を惹起したことが見られ得る。経口投与したカプセル化ＤＮＡは、３つの全ての抗体クラスにおいて良好な応答を惹起した。ＤＮＡ投与後の時間に伴って抗体価が増大するという傾向があり、そして応答は、多かれ少なかれ用量関連的でもある。たった１μｇの量のＤＮＡが有意な応答を、特に投与後のより長い時間で惹起し得ることが明らかである。これらの抗体応答により、ルシフェラーゼ発現は、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化されたプラスミドＤＮＡのｉ．ｐ．注射または経口のいずれかによる投与後に生じることが、再度確認される。それらはまた、抗原が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの抗体クラスを惹起するような様式で、これらの手段により免疫系に提示されることを実証する。
【００７２】
（実施例５）
本発明者らは、プラスミドＤＮＡの物理的完全性および生物学的機能に対する高速ホモジナイズ工程（カプセル化プロセスにおける中間体である必要な水−油−水エマルジョンを生成するために用いた）の効果を試験した。
【００７３】
最初の実験では、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを、マイクロカプセル化実験において用いられるべき濃度および容積に類似した濃度および容積に調整し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙホモジナイザーでホモジナイズした。試料を、アガロースゲル電気泳動による分析（図４Ａ）のために、０〜３００秒の間隔で取り出した。このような分析手順は、スーパーコイル化（ｓｃ）ＤＮＡ、開環（ｏｃ）ＤＮＡ（一本鎖に切り目が入っている）、および線状（ｌ）ＤＮＡ（両鎖が近接点で切断されている）の間を識別し得る（例えば、ＧａｒｎｅｒおよびＣｈｒａｍｂａｃｈ １９９２． Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ， ｎｉｃｋｅｄ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡ， ４．４ ｋｂ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ， ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３， １７６−１７８の図２Ｃを参照のこと）。このような条件にわずか１０秒の時間曝すことにより、ｓｃ形態からｏｃ形態に変換されることが明らかである。８０００ｒｐｍでは、線状形態へのさらなる変換、および最終的にはより広範囲にわたる分解が生じる。しかし、２０００ｒｐｍの減少速度では、ＤＮＡのｏｃ形態は、ＰＬＧカプセル化に関与するエマルジョン中間体の形成に典型的に必要とされる時間にわたって、比較的安定である。従って、これらの研究は、プラスミドＤＮＡが剪断誘導損傷に無防備であり、そして変化が最小であるＤＮＡのカプセル化を得るためには、正確な条件に対して、慎重な注意が必要であることを示す。
【００７４】
この原理から、本発明者らは、大きさが約２μｍのＰＬＧ微粒子中に精製プラスミドＤＮＡを中程度（約２５％）の効率でカプセル化するための条件を開発した。アガロースゲル電気泳動（図４Ｂ）は、初めの閉環状スーパーコイル化ＤＮＡが、カプセル化プロセスにおける剪断応力の結果として、ｏｃ形態への変換を受けることを示す。微粒子から放出されたＤＮＡの生物学的活性を、エレクトロポレーションによる細菌形質転換および培養細胞へのトランスフェクション後のルシフェラーゼ発現のアッセイにおいて評価した。粒子から放出されたＤＮＡは、これらの両アッセイにおいて、そのインビトロ活性の有意な割合（約２５％）を保持している。
【００７５】
（実施例６）
実施例３の方法により作製されたルシフェラーゼをコードするＰＬＧカプセル化ＤＮＡはまた、発現タンパク質に対して粘膜免疫応答を惹起し得る。ルシフェラーゼに特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体のレベルを、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡの１、５、２０、または５０μｇのｉ．ｐ．または経口投薬を受けたマウスの便試料において、ＥＬＩＳＡにより評価した。有意なレベルのＩｇＧまたはＩｇＭ抗体は、どの群のマウスの便試料においても見出されなかった。幾分限定されたＩｇＡ応答が、ｉ．ｐ．注射マウスにおいて見られた；しかし、経口投与によって、便試料中に有意なレベルのルシフェラーゼＩｇＡ抗体が生じた（図５）。これらは、５０μｇのＰＬＧカプセル化ＤＮＡを受けたそれらのマウスにおいて異常に高いレベルに達した。これらの結果は、単回用量のＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡの経口投与が、全身抗体応答と同様に粘膜応答を惹起し得ることを示す。これは、粘膜表面での感染に対する防御が望ましい適用（例えば麻疹またはＡＩＤＳ）において、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡワクチンの有用な特質であり得る。
【００７６】
（実施例７）
本発明者らは、ルシフェラーゼを発現するカプセル化プラスミドＤＮＡの経口投与が全身抗体応答を誘起し得るという本発明者らの観察を拡張するために、麻疹ウイルス（ＭＶ）ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を発現するプラスミドを開発した。Ｎ−発現構築物は、ルシフェラーゼを発現する構築物（実施例３に記載）と、コード配列をＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株ＭＶＮコード配列で置換したことを除いて、同一である。精製プラスミドＤＮＡを、ＰＬＧカプセル化した（実施例１に記載の方法を用いる）。
【００７７】
同系交配Ｃ３Ｈマウスを、経口栄養補給により投与した、０．１Ｍ 重炭酸ナトリウムに懸濁した２回の投薬（１３日間隔）で免疫した；各用量には、５０μｇ ＤＮＡが含まれていた。マウスのコントロール群は、ＰＢＳ単独、またはコード配列を含まないプラスミドベクターＤＮＡ含有ＰＬＧ粒子を受けた。マウスを時々採血し、そしてＭＶ Ｎに特異的なＩｇＧの血清レベルを、昆虫細胞において発現された組換えＭＶ Ｎを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより測定した。図６Ａに示されるように、ＭＶ Ｎを発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡでの免疫により、有意なレベルのＮ特異的抗体が生じた：示した結果は、２回目のＤＮＡ投与５３日後に採取した１／１００希釈血清における平均吸光度である。これらの実験におけるＤＮＡ免疫に対する個々のマウスの応答には、かなりの程度の変動があるようであった（図６Ｂ）が、非常に高いレベルの抗体（１０４を超える代償的な（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）力価、追跡実験で測定）が存在する動物もいる。これらの結果から、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口送達は、重要な病原体に対する免疫応答を誘起する有効な方法であることが実証された。
【００７８】
（実施例８）
（ＰＬＧ微粒子中のプラスミドＤＮＡのカプセル化のさらなる方法）
装置：
１）エマルザースクリーンに備え付けられた３／４’’プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ミキサー
２）高速遠心分離機
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−３ｍｌのジクロロメタン中５００ｍｇ
２）プラスミドＤＮＡ（＞ＴＥ緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）
４）無水エタノール
５）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）。
方法：
１）４５０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、１５０μｌのエタノールと攪拌しながら混合する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌのＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で、２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌのＰＶＡに添加し、そして２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
４）この２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に攪拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズして、均質な懸濁液にする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上記のように再度遠心分離する。
７）工程５および６を４回繰り返す。
８）微粒子ペレットを上記のように２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして凍結乾燥に適した容器に移し、イソプロパノール／ドライアイス混合物中で表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００７９】
この方法では、工程１〜３を室温で行う。効率は、実施例１に比較して、３０〜４０％効率まで改善された。
【００８０】
（実施例９）
（ＰＬＧ微粒子中のプラスミドＤＮＡのカプセル化のさらなる方法）
装置：
１）エマルザースクリーンに備え付けられた３／４’’プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ミキサー
２）高速遠心分離機
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−３ｍｌのジクロロメタン中４００ｍｇ
２）プラスミドＤＮＡ（＞ＴＥ緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）
４）無水エタノール
５）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ。
方法：
１）４５０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、１５０μｌのエタノールと攪拌しながら混合する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌのＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で、２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌのＰＶＡに添加し、そして２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
４）この２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に攪拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズして、均質な懸濁液とする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上記のように再度遠心分離する。
７）工程５および６を４回繰り返す。
８）微粒子ペレットを上記のように２５ｍｌの水に再懸濁し、そして凍結乾燥に適した容器に移し、表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００８１】
この方法では、工程１〜３を４℃で行う。微粒子中へのＤＮＡの取り込みの効率は、５０〜６０％であった。
【００８２】
（実施例１０）
マウスロタウイルス（幼若マウス流行性下痢（ＥＤＩＭ）ウイルス）のＶＰ６遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＩＡ／ＶＰ６）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで構築した。ＶＰ６をコードする遺伝子を、ベクター（ｐＪＷ４３０３）中に、即時型転写プロモーターの配列およびヒトサイトメガロウイルスのイントロンＡおよびｔＰＡ由来分泌シグナル配列の下流に挿入した。この遺伝子には、ウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結配列およびポリアデニル化配列が続く。精製プラスミドＤＮＡを、実施例１に記載の方法を用いてＰＬＧカプセル化した。
【００８３】
同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化された５０マイクログラムのＶＰ６発現ＤＮＡを含む用量を経口投与することによって免疫した。マウスのコントロール群は、カプセル化ベクターＤＮＡの同様の用量を受けた。マウスを、隔週間隔で、腸ロタウイルス特異的ＩｇＡについて、ＥＤＩＭウイルスを抗原として用いて、ＥＬＩＳＡによって試験した。免疫の９週間後、動物をＥＤＩＭウイルスでチャレンジし、そしてモノクローナル抗体に基づくＥＬＩＳＡを用いて、便中のウイルスの排出をモニターした。
【００８４】
図７Ａに示すように、ＶＰ６を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡでの免疫によって、コントロール動物と比較して、有意なレベルのロタウイルス特異的腸ＩｇＡ抗体が生じた。これは特筆すべきである。なぜなら、ＶＰ６発現プラスミドＤＮＡの他の投与経路によっては、ウイルスチャレンジの前に検出可能なレベルの腸ウイルス特異的ＩｇＡは誘起されなかったからである。ＥＤＩＭウイルスでのチャレンジ後、コントロール群と比較して、ＰＬＧカプセル化ＶＰ６発現プラスミドＤＮＡを受けたマウスにおけるロタウイルス流出は減少した（図７Ｂ）。
【００８５】
これらの結果は、ウイルス流出の減少に現れるように、経口投与されたＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡが、ａ）特異的腸ＩｇＡ応答、およびｂ）ウイルスチャレンジに対する防御を誘導し得ることを示す。
【００８６】
本発明の組成物および方法は、ＤＮＡワクチンの送達のための遅発放出系において適用を有する；免疫原の発現が延長されることによって、有効な単回用量の初回投与および追加投与が可能になり、結果として長期の記憶応答が有効に誘導される。別の適用は、ワクチンの経口送達のためのビヒクルにある；ワクチン投与のための簡単かつ受容可能な手段は、ワクチン取り込み率を改善するようである；さらに、凍結乾燥したカプセル化プラスミドＤＮＡは、非常に安定で、かつ環境条件に非感受性であるようである。さらなる適用は、遺伝子治療のための遅発放出系にある；ＤＮＡの長期放出および続く発現は、反復処置の必要性をおそらく低減させる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロカプセル化ＤＮＡ、マイクロカプセル化ＤＮＡを含むワクチン、微粒子中のＤＮＡの投与を含むワクチン接種方法および遺伝子治療方法、ＤＮＡを含む微粒子を調製する方法、およびＤＮＡ含有粒子を含む乾燥化組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーであるポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）は、インビボにおいて微粒状の形態で薬物および生物学的製剤を送達するために製薬産業によって長年使用されてきた。米国ＦＤＡは、前立腺ガンの処置において使用される酢酸ロイプロリド（Ｌｕｐｒａｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標））に対するＰＬＧマイクロスフェア３０日送達系を承認した。ワクチン用途についてのポリマーマイクロカプセル化技術の可能性の有用な総説は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｍｏｒｒｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ， １９９４， １２巻、１号、５〜１１頁において見出される。
【０００３】
カプセル化に対する代替として、例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ．Ａ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １９８８， ５（２）， ９９−１３９頁に記載されたように、リポソームと呼ばれるリン脂質ベシクルにおいて抗原を送達することもまた知られている。コレラ毒素、マラリアスポロゾイトタンパク質、および破傷風トキソイドを含む多くの抗原が、リポソームを使用して腹腔内に送達されてきたこと、ならびにインフルエンザ抗原が鼻内から送達されることが報告されている。
【０００４】
特定の状況下において、組織への裸のＤＮＡの注入が、そのＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の発現を導き得ることもまた知られている。例えば、１９８４年に、米国ＮＩＨでの研究は、リス肝炎に対する裸のクローン化プラスミドＤＮＡの肝臓内注入が、リスにおいてウイルス感染および抗ウイルス抗体の形成の両方を生じたことを報告した。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−９５／０５８５３は、生物学的に活性なペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドの投与のための方法、組成物、およびデバイスを記載する。この公開された適用は、とりわけ、裸のＤＮＡのレシピエントにおいて抗体を惹起することを目的とした免疫原性抗原をコードする裸のＤＮＡの注入を記載する。
【０００６】
ＤＮＡのリポソームの送達も公知であり、そして、例えば、ＥＰ−Ａ−０４７５１７８において記載されている。
【０００７】
所望の遺伝子産物の発現を得るための代替の方法は、ＥＰ−Ａ−０１６１６４０において記載されており、ここでは、ウシ成長ホルモンを発現するマウス細胞がカプセル化され、そして乳産生を増加するために雌牛に移植される。
【０００８】
ＥＰ−Ａ−０２４８５３１は、マイクロカプセル中に直鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）をカプセル化すること、そしてこれらをインターフェロン産生の誘導のために使用することを記載する。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−９４／２３７３８は、ＤＮＡの細胞取り込みを促進し、そして標的化する結合体と組合わせたＤＮＡを含む微粒子を記載することを意図する。実施例において、タングステンを含む微粒子による細胞のボンバードメントが記載されている。これらの実施例は、ＤＮＡコート金属粒子を用いる従来のボンバードメントとほとんど違わないように思える。さらに、超音波処理が、微粒子製造において提唱されている（これは、ＤＮＡ損傷の危険を冒すことが知られる工程である）が、示されたデータは、カプセル化ＤＮＡの完全性を決定するには不十分であり、かつ不適切である。
【００１０】
本発明では、通常、活性な真核生物のプロモーターの制御下に置かれる、免疫原性、酵素的、または他の有用な生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、インビボにおいて送達することが望まれる。本発明の目的は、当該分野で公知のワクチン接種治療に対する改善および先行技術の遺伝子治療方法に対する改善を含む。
【００１１】
現存の組成物および方法の改善またはそれに対する代替が望ましい。なぜなら、これらの現存の方法は多くの欠点を含むことが知られているからである。
【００１２】
ＷＯ−Ａ−９５／０５８５３は所望の遺伝子産物をコードする裸のポリヌクレオチドの投与を記載する。しかし、この刊行物における組成物および方法は、無菌的手順を必要とする、それ自身不快であり不便な投与経路である注射に対してのみ適切である。
【００１３】
ＷＯ−Ａ−９４／２３７３８は、インビボにおける達成された実施例は提示されていないが、カプセル化ＤＮＡがレシピエントの体内において粒子から放出され、そして次に細胞によって取り込まれるプロセスを提供することを意図する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、現存のワクチン接種および遺伝子治療技術を改善し、かつインビボにおいて効果的であるか、または公知の組成物および方法において同定されたいくつかの問題または不利益を少なくとも克服する、新規の組成物およびそれらの投与方法を提供することを求める。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）微粒子およびＤＮＡを含む組成物であって、ここで、該ＤＮＡは、該微粒子内にあり、かつポリペプチドをコードする配列を含み、ここで、該微粒子は、レシピエントへの投与後にそのコード配列の発現を誘導するように適合されている、組成物。
（項目２）経口投与後に前記コード配列の発現を誘導するように適合されている、項目１に記載の組成物。
（項目３）環状ＤＮＡを含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）（ｉ）プラスミドＤＮＡ、および（ｉｉ）１以上の挿入、欠失、および置換によってプラスミドＤＮＡから誘導されたＤＮＡから選択される二本鎖ＤＮＡを含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）上記ＤＮＡが、上記コード配列の転写を促進する配列を含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目６）上記微粒子が、非毒性で、かつ薬学的に受容可能であり、かつ生分解性ポリマーからなるかまたはこれを含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目７）上記ポリマーが、ラクチド含有ポリマーである、項目６に記載の組成物。
（項目８）上記ポリマーが、グリコリド含有ポリマーである、項目６または７に記載の組成物。
（項目９）上記ポリマーが、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、項目７または８に記載の組成物。
（項目１０）上記微粒子の少なくとも５０％が、０．０１μｍ〜３０μｍの大きさ範囲にある、項目１から９のいずれかに記載の微粒子を含む組成物。
（項目１１）上記微粒子の少なくとも５０％が、１μｍ〜１０μｍの大きさ範囲にある、項目１０に記載の微粒子を含む組成物。
（項目１２）実質的に全ての微粒子が、３０μｍ未満の大きさ範囲にある、項目１０または１１に記載の微粒子を含む組成物。
（項目１３）免疫原をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ経口投与または非経口投与後にレシピエントにおいて該免疫原の発現を誘導するように適合されている、項目１から１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）上記レシピエントにおいて、上記免疫原に特異的な抗体の産生を誘導するように適合されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）ＩｇＡ抗体の産生を誘導するように適合されている、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）哺乳動物のワクチン接種のために適合された、項目１３から１５のいずれかに記載の組成物であって、ここで、該ワクチン接種が、上記免疫原に応答した哺乳動物による抗体の産生によって得られ、該免疫原自身は、上記ＤＮＡコード配列の発現によって産生される、組成物。
（項目１７）項目１から１６のいずれかに記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、免疫原に対する抗体を誘起するためのワクチンであって、ここで上記ＤＮＡ配列が該免疫原をコードする、ワクチン。
（項目１８）上記免疫原が、ウイルスまたは細菌または他の病原性微生物の免疫原性成分であるか、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体である、項目１７に記載のワクチン。
（項目１９）上記ＤＮＡ配列が、ウイルスタンパク質をコードする、項目１８に記載のワクチン。
（項目２０）味覚増強剤をさらに含む、項目１７から１９のいずれかに記載のワクチン。
（項目２１）第１および第２のワクチン成分を含む、項目１７から２０のいずれかに記載のワクチンであって、該第１のワクチン成分が微粒子内にあるＤＮＡを含み、ここで、該ＤＮＡが免疫原をコードする配列を含み、かつ該微粒子がインビボでの第１の半減期を有し、そして第２のワクチン成分が微粒子中にあるＤＮＡを含み、ここで、該ＤＮＡが免疫原をコードする配列を含み、かつ該微粒子がインビボでの第２の半減期を有する、ワクチン。
（項目２２）上記第１のワクチン成分の上記免疫原および上記第２のワクチン成分の上記免疫原が、同一である、項目２１に記載のワクチン。
（項目２３）上記第１および第２の半減期がそれぞれ、２週間まで、そして２週間を超える、項目２１または２２に記載のワクチン。
（項目２４）上記第１および第２の半減期の比が、少なくとも２：１である、項目２１または２２に記載のワクチン。
（項目２５）レシピエントにおいて、所望の非免疫原性遺伝子産物の発現を誘導するように適合されている、項目１から１２のいずれかに記載の組成物。
（項目２６）所望の非免疫原性産物の発現を誘導するための、項目２５に記載の組成物であって、この産物は、（ｉ）以前に実質的に発現されていないか、または（ｉｉ）増加することが所望されるレベルで以前に発現されている、組成物。
（項目２７）遺伝子産物が発現しないこと、発現の減少、または遺伝子産物の不在によって生じる疾患の処置または予防のための、項目２５または２６に記載の組成物であって、ここで、該組成物の該ＤＮＡコード配列は、該遺伝子産物をコードする、組成物。
（項目２８）遺伝子治療のための、項目２５から２７のいずれかに記載の組成物。
（項目２９）ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、かつ水分含有量が５％未満である、組成物。
（項目３０）ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、かつ水分含有量が５％未満であり、項目１から２８のいずれかに記載の組成物を凍結乾燥することによって得られる、組成物。
（項目３１）貯蔵用の組成物を調製する方法であって、ＤＮＡを含むポリマー粒子の水溶液を調製する工程、および該溶液を５％未満の水分含有量まで乾燥させる工程を包含する、方法。
（項目３２）以下の工程を包含する、微粒子を作製する方法：
ｉ．ＤＮＡと微粒子前駆体との混合物を調製する工程；
ｉｉ．ＤＮＡを含有する微粒子を形成する工程；および
ｉｉｉ．該混合物からＤＮＡ含有微粒子を分離する工程、ここで、該ＤＮＡ含有微粒子中のＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、かつ該微粒子が、レシピエントにおける該コード配列の発現を誘導するように適合されている、方法。
（項目３３）ａ．前記ＤＮＡがそのコード配列の発現を誘導する能力が、微粒子形成前にそのコード配列の発現を誘導する能力の少なくとも２５％であるような条件下で、複数の微粒子を形成する工程、を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）項目３３に記載の方法であって、カプセル化されたＤＮＡのうちの少なくとも１０％が、そのコード配列の発現を誘導する能力を保持しているような、剪断応力が減少した条件下で、エマルジョンを形成する工程を包含する、方法。
（項目３５）カプセル化されたＤＮＡの少なくとも２５％が、そのコード配列の発現を誘導する能力を保持している、項目３４に記載の方法。
（項目３６）ＤＮＡとアルコールとの混合物を調製する工程、および微粒子前駆体を該混合物に添加する工程を包含する、項目３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）アルコール含有量が１０〜４０％で、ＤＮＡおよびアルコールの溶液を調製する工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）上記大きさ範囲が０．０１μｍ〜３０μｍである微粒子を形成する工程を包含する、項目３２から３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）上記ＤＮＡが、環状のプラスミドＤＮＡである、項目３２から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）上記微粒子を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３２から３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）微粒子中にＤＮＡをカプセル化するための方法であって、ここで、該ＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、かつコード配列の発現を誘導するように適合されており、該ＤＮＡと微粒子の形成に適切な水中油中水エマルジョンとの混合物を調製する工程、ＤＮＡを含む微粒子を形成する工程、および遠心分離によって該混合物からＤＮＡ含有微粒子を分離する工程を包含し、該ＤＮＡがそのコード配列の発現を誘導するその能力を保持していることで特徴付けられる、方法。
（項目４２）項目１７から２４のいずれかに記載のワクチンを投与する工程を包含する、ワクチン接種方法。
（項目４３）ワクチン接種が、上記コード配列から発現された上記免疫原に対する抗体を誘起することによって得られる、項目４２に記載のワクチン接種方法。
（項目４４）発現されるべき遺伝子産物を同定する工程、項目２６から２８のいずれかに記載の組成物を調製する工程、ここで、上記コード配列が該遺伝子産物をコードし、および該組成物を投与する工程を包含する、遺伝子治療方法。
（項目４５）投与が、経口または鼻内である、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４６）投与が、注射による、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４７）粘膜免疫を誘導するための医薬の製造における、項目１から１６のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目４８）ＩｇＡ抗体の産生を誘導するための医薬の製造における、項目１から１６のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目４９）予防的または治療的免疫応答を誘導するための医薬の製造における、項目１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
【００１６】
ＤＮＡは、もはや遺伝子産物の発現を誘導できなくなるように、容易に損傷を受けることが知られている。驚くべきことに、本発明者らは、ポリマー粒子中にＤＮＡをカプセル化するための技術を発明することに成功し、その結果、ＤＮＡは、それによってコードされた遺伝子産物の発現を誘導するのに十分な完全性を保持する。本発明者らは、哺乳動物のワクチン接種または遺伝子治療に適切なＤＮＡ含有微粒子を発明することにも成功した。
【００１７】
従って、本発明の第１の局面は、ポリマー中にカプセル化されたＤＮＡを含む薬学的組成物を提供し、このＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含み、ここでこの組成物は、レシピエントにおいてコード配列の発現を誘導するように適合されている。好ましくは、コード配列は、その配列の発現を促進するプロモーターを付随する。薬学的組成物が哺乳動物で使用される場合、真核生物のプロモーター、および特に広範な種々の組織タイプで作動するプロモーターを使用することが都合が良い。本発明の特定の実施態様では、組織または細胞のタイプに特異的なプロモーターが使用される。
【００１８】
使用において、薬学的組成物は経口投与され、そしてコード配列が発現されて、所望の治療効果を導く。
【００１９】
ワクチン接種に適切な本発明の組成物は、免疫原をコードする配列を含む。その組成物の投与後、発現された免疫原は、レシピエント内で抗体の産生を誘起し、それによってレシピエントのワクチン接種に貢献する。
【００２０】
以下の実施例において記載される本発明の特定の実施態様は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。それは、インビボにおいて投与されており、そしてそのタンパク質の哺乳動物における発現を誘導することが分かっている。その発現は、そのタンパク質に対して特異的な抗体の産生の測定によって検出された。本発明の特定の実施態様の組成物は、約１０μｍまでの大きさである微粒子を含む。
【００２１】
一般に、本発明の微粒子は、ファゴサイトーシス（例えば、マクロファージまたは他の抗原提示細胞によるファゴサイトーシス）によってレシピエントの細胞に入ることが意図される。続いて、微粒子本体は細胞内隙で分解し、そしてＤＮＡが放出される。本発明の微粒子は０．０１μｍ〜３０μｍの大きさであることが好ましい。１μｍ〜１０μｍがより好ましい範囲である。これらの大きさが、ＤＮＡのインビボにおける発現を確実に達成することに対して適切であることが見出された。微粒子の大きさが取り込みを決定するので、ＤＮＡの取り込みを促進する薬剤が、本発明の微粒子において必要とされないこともまた注目されるべきである。
【００２２】
本発明による別の組成物は、非免疫原性の産物をコードする配列を含む。そのような組成物は特に遺伝子治療において有用であり、ここでは、レシピエントにおいて、発現されていないか、または増加することが望ましいレベルで発現されている遺伝子産物を発現することが望ましい。この場合、本発明の組成物は、所望の産物をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてここでは組成物の投与後、コード配列の発現により、所望の産物のレベルが増大し、遺伝子治療の効果を与える、
また、遺伝子治療適用のための微粒子は、ファゴサイトーシスによるそれらの取り込みを標的化するために、０．０１μｍ〜３０μｍ、より好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲の大きさを有することが本発明の特徴である。
【００２３】
ワクチン接種における使用のための本発明の特定の実施態様は、ウイルス、細菌、または他の病原性微生物のタンパク質もしくはその免疫原性組成物、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ配列を含む。タンパク質は、例えば、ＨＩＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、麻疹ウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質（例えば、肝炎表面抗原）、または百日咳菌タンパク質である。さらに、組成物が経口的に使用される場合、それは、好都合には、味覚増強剤もまた含み得る。用語「味覚増強剤」は、甘味料、香味料、および組成物の他の成分由来のいかなる不快な味覚をも隠蔽する薬剤を包含することが意図される。それは、好都合には、腸溶性にコートされ得るか、または適切な制酸剤処方物と同時投与され得る。
【００２４】
以下に記載された特定の実施態様において、微粒子の調製物は、麻疹ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。微粒子の経口投与は、そのタンパク質に対して特異的な抗体における増加を誘起した。同様に、別の微粒子調製物は、ロタウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。これらの微粒子調製物の経口投与は、抗ロタウイルスタンパク質抗体、およびウイルスによるチャレンジに対する防御効果を誘起した。
【００２５】
遺伝子治療に適切な本発明の特定の実施態様は、遺伝性疾患の処置のために必要とされる酵素または別のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。例えば、グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡ配列は、ゴーシェ病の処置のために適切である。
【００２６】
従って、本発明者らは、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡの能力がカプセル化プロセスによって実質的に影響を受けないようにポリマー内にカプセル化されたＤＮＡを提供した。ＤＮＡが、乳化およびポリマー粒子の産生のために必要な他の工程によって、容易に損傷され得ることが知られている。本発明者らは、カプセル化ＤＮＡの投与に際して得られるべき生物学的効果のために、十分に効力のあるＤＮＡがカプセル化されるような、ＤＮＡのカプセル化を提供した。
【００２７】
本発明は、カプセル化ＤＮＡが経口投与に適切であり、先行技術に記載の注射用ＤＮＡ調製物に関連した不快であり不便な局面が避けられるという点で、利点を提供する。以下に記載の実施例に記載の特定の実施態様は、本発明の組成物の経口投与に応じて免疫原特異的抗体を誘導することにおいて成功している。さらに、カプセル化ＤＮＡ処方物は乾燥（例えば、凍結乾燥）に適切であり、長期間にわたって安定であり、かつ保存に適切な形態になる。さらに、多くのワクチン適用について、全身体液媒介性および細胞媒介性免疫応答と同様に、粘膜表面での免疫もまた惹起され得れば有益である。以下に記載の本発明の特定の実施態様は、経口投与後に特定のＩｇＡ抗体の有意な増大を誘起することが示された。従って、本発明は、ＤＮＡをポリマー粒子と共に含む薬学的組成物を提供し、このＤＮＡは、ポリペプチドをコードし、そしてこの組成物は、レシピエントにおいて粘膜ポリペプチド特異的ＩｇＡ抗体を誘導するように適合されている。
【００２８】
本発明の微粒子のポリマーは、好ましくは、生分解性および非毒性の両方である。適切なポリマーは、ラクチド含有ポリマーおよびグリコリド含有ポリマー、および０−１００：１００−０ラクチド：グリコリドのコポリマーを包含する。本発明の特定の実施態様では、ポリマーは、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（他に記されていなければ、ＰＬＧという）を含む。これは、ヒトおよび獣医学的用途について認可されているので選択した。
【００２９】
本発明の産物は、代表的には、動物（特に、動物）におけるインビボ用途のためである。従って、微粒子のポリマーは、インビボで非毒性であり、かつ薬学的用途に適切であるべきである。ポリマーはさらに、レシピエントにおいてそのＤＮＡを放出するので、生分解性（生分解性ポリマーからなるか、または生分解性ポリマーを含むのいずれかにより）であるべきである。当該分野には、ヒトおよび動物の経口用途に適切なポリマーに関する広範な文献が存在し、そして当業者は、困難なく当該分野のポリマーを本発明の微粒子に適合させ得る。これに関連して、ＥＰ−Ａ−０４５１３９０、ＷＯ−Ａ−９５／３１１８４およびＷＯ−Ａ−９５／３１１８７の開示内容を参考のために本明細書において援用する。
【００３０】
粒子内に含有されるＤＮＡは、代表的には、二本鎖ＤＮＡを含む。本発明における使用に適切なＤＮＡ配列の構築は、当業者により理解される。配列が転写プロモーターおよび遺伝子コード配列の両方を含むことが好ましい。ＤＮＡ配列が転写終結およびポリアデニル化をコード配列の下流に提供することが、さらに好ましい。
【００３１】
ＤＮＡは、二本鎖で環状スーパーコイル化されていることが特に好ましい。粒子の製造の間、ＤＮＡは強い剪断力を受けることが観察されている。特定の穏やかな粒子製造条件を用いて、（一部、予めスーパーコイル化したＤＮＡが、進行中に開環形態に変換され得ることが観察されたが）、本発明者らは、機能的ＤＮＡを保持するよう首尾よく成し遂げた。
【００３２】
プラスミドＤＮＡは特に適切であり、そして以下に記載の本発明の特定の実施態様において用いられる。プラスミド製造に関しては広範な文献があるので、当業者は、本発明の微粒子に適切なプラスミドを容易に調製できる。一般に、任意の真核生物プロモーター配列を取り込むプラスミドが適切である。
【００３３】
本発明のさらなる随意の特性は、ＤＮＡ含有ポリマー粒子が、インビボにおいて異なる半減期を有するように製造され得ることである。ワクチン接種の間に抗原を投与するとき、抗原ができるだけ長い時間枠にわたって送達されることが有益であり得る。本発明の特定の実施態様は、第１および第２のワクチン成分を含むワクチンを提供し、第１のワクチン成分は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、ここでＤＮＡは、免疫原をコードする配列を含み、そしてここでポリマーは、インビボにおける第１の半減期を有し、そして第２のワクチン成分は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、ここでＤＮＡは、免疫原をコードする配列を含み、そしてここでポリマーは、インビボにおける第２の半減期を有する。それぞれの半減期は、５日まで、および５日より多い半減期であり得る。一例では、第１および第２のワクチン成分の免疫原は同一である。あるいは、それぞれのワクチン成分は、異なる免疫原をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
【００３４】
本発明の一実施態様では、第１および第２のそれぞれのワクチン成分の半減期は、２日まで、そして２週間より多い半減期である。さらなる実施態様では、第１および第２の半減期は、少なくとも一桁異なる。
【００３５】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様の使用では、ルシフェラーゼをコードするプラスミドが、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして約２μｍの大きさの粒子中のＰＬＧ内にカプセル化される。このカプセル化ＤＮＡは、マウスに投与され、そして抗ルシフェラーゼ抗体を誘起した。この抗体は、数週間にわたって検出された。本発明のカプセル化ＤＮＡに応じた抗体の産生を、裸のＤＮＡの腹腔内投与および経口投与に応じた抗体産生と比較した。両方の場合において、カプセル化ＤＮＡは、同等または有意に高い量のＩｇＧおよびＩｇＭを誘起し、そしてまた有意なＩｇＡ応答を惹起した。
【００３６】
本発明の第２の局面は、ＤＮＡの生物学的活性が有意な程度保持されるように、ポリマー中にＤＮＡをカプセル化する方法を提供する。第２の局面の一実施態様では、ポリマー粒子内にＤＮＡをカプセル化する方法（このＤＮＡは、ＤＮＡ内でコード配列の発現を誘導し得る）は、水中（油中水）エマルジョンを調製して微粒子を形成させる工程、および続いて生成されたＤＮＡ含有微粒子を遠心分離により分離する工程を包含する。得られた微粒子は、好ましくは、０．０１μｍから３０μｍ、より好ましくは、１μｍから１０μｍの範囲の大きさを有する。
【００３７】
本発明の方法は、ＤＮＡの少なくとも一部が、粒子製造の間に損傷されず、そしてそれによりその遺伝子コード配列の発現を誘導する能力を保持することを確実にする条件下で実施される。
【００３８】
ＤＮＡが微粒子中に取り込まれ、そしてＤＮＡ取り込みが、ＤＮＡ＋アルコールの溶液を調製し、微粒子ポリマーを添加し、そしてそれから微粒子を形成することにより増大されることが必須である。溶液のアルコール含有量は、適切には、１％と６０％との間、そして好ましくは、５％と４０％との間で変動する。本発明の特定の実施態様では、アルコール含有量は、ＰＬＧから作製された微粒子について約１５〜３５％であり、より特定すると２０〜３０％であり、２５％およびそれより多く、５０〜６０％までのＤＮＡ取り込みを生じる。エタノールが特に適切である；メタノールおよびプロパノールならびにＤＮＡを変性しない他のアルコール類もまた適切であり、そしてアルコールは、好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ１０アルコールである。
【００３９】
本方法の乳化工程（単数または複数）は、剪断応力を減少した条件下で実施されることがまた好ましく、そしてこれは、エマルジョンを得、そして所望の大きさ範囲の微粒子を形成するのに十分であるが、過剰な剪断によって全てのＤＮＡが損傷されるほどには高くない乳化速度の使用により、必要に応じて達成される。以下に記載の本発明の一実施態様では、乳化ミキサー速度は、少なくとも２５％のＤＮＡ活性（コンピテント細菌の形質転換または培養細胞のトランスフェクションによりアッセイされる）が、ＤＮＡを含有する得られた微粒子中で保持されるように調整される。適切な速度は、８０００ｒｐｍ以下であり、好ましくは６０００ｒｐｍ以下であり、そして以下に記載の特定の実施態様では、速度は約３０００ｒｐｍである。
【００４０】
本方法は、室温で実施され得（これは実験室および工業目的のために便利である）、そしてカプセル化手順の間のプラスミドＤＮＡの安定性を改善する室温以下でも実施され得る。本方法の温度は、２０℃以下、１０℃以下、または５℃以下にさえ下げられ得る。本発明の一実施態様では、本方法は、室温で用いられる量に比較して減少された量の微粒子前駆体を用いて、室温以下で実施される。
【００４１】
従って、本方法のパラメーターは、１０μｍ以下の直径の微粒子の形成を促進し、そして微粒子中へのＤＮＡの取り込みを促進し、そしてそのＤＮＡがレシピエントで発現され得ないようなＤＮＡに対する損傷を避けるように選択される。
【００４２】
ポリマーおよびＤＮＡの任意の特定の選択に応じて、本方法の変更が、最良の結果を得るために必要であり得る。方法の効率は、形質転換またはトランスフェクションアッセイにより評価され得る。本発明者らにより用いられる形質転換アッセイにおいて、ＤＮＡは、有機溶媒での溶解により微粒子から回収され、定量され、そして細菌の形質転換に用いられる。アンピシリン選択は、形質転換体の成功を決定する。トランスフェクションアッセイにおいて、回収されたＤＮＡは、培養物中で真核生物細胞をトランスフェクトするために用いられ、次いでこの培養物が抗原または遺伝子治療産物の存在についてアッセイされる。これらのアッセイは、本発明の方法により生成された微粒子から回収されたＤＮＡが、元のＤＮＡの活性の５０〜６０％および８０％までを保持し得ることを実証した。このことは、微粒子中への機能的ＤＮＡの高い取り込み効率を示す。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様では、薬学的組成物を作製する方法が提供され、この方法は、構築物内にコード配列の発現のためにＤＮＡ構築物を調製する工程、および構築物の周囲に０．０１μｍと３０μｍとの間の大きさのポリマー粒子を形成する工程を包含し、ここでこの構築物は、コード配列の発現を誘導させ得る状態にある。使用において、構築物が粒子から分離されるとき、これは、コード配列の発現を誘導する。粒子は、好ましくは、ポリマー＋ＤＮＡ＋アルコールの溶液を乳化することにより形成される。
【００４４】
本発明の方法は、本発明の第１の局面の薬学的組成物を生成するように適合される。本方法の工程は、多くのＤＮＡ含有ポリマー粒子を含有する得られた組成物において、有用な割合の粒子が、活性なＤＮＡ（すなわち、本方法によりそのコード配列の発現を誘導する能力が失われるような損傷をうけなかったＤＮＡ）を含有するように適合される。ＤＮＡ活性は、粒子形成工程の前に、活性％として測定される。
【００４５】
ＤＮＡ生物学的活性の受容可能なレベルは、少なくとも１０％であり、好ましくは、少なくとも２５％である。一方、特に脆弱なＤＮＡについては、使用において、治療効果が組成物により示される限り、より低い％が受容可能であり得る。
【００４６】
本発明の特定の実施態様では、組成物は、コード配列および真核生物プロモーターを含む二本鎖のスーパーコイル化ＤＮＡのプラスミド溶液を調製することにより作製される。別個に、ポリマー溶液が調製される。２溶液が一緒に混合され、１０００ｒｐｍと４０００ｒｐｍとの間の速度で乳化される。次いで、安定剤の溶液が添加され、そして新たな混合物が１０００ｒｐｍと４０００ｒｐｍとの間の速度で乳化される。粒子の遠心分離および再懸濁後、その中のＤＮＡは、その活性の２５％を保持する。
【００４７】
本発明の第３の局面は、ポリマーカプセル化ＤＮＡを含み、そして減少した水分含有量（例えば、５重量％未満）を有する薬学的組成物を提供する。この組成物は、長期貯蔵するのに適切であり、一方、レシピエントへの投与の際に、このＤＮＡ内のコード配列の発現を誘導するＤＮＡの能力を保持している。
【００４８】
貯蔵用の薬学的組成物を調製する方法は、本発明の第１の局面の薬学的組成物を乾燥（例えば、凍結乾燥により）することである。（正確な水含有量は、用いられる乾燥の期間により決定されるが）乾燥した組成物は、５％未満の水含有量を有することが好ましい。
【００４９】
本発明の第４の局面は、ワクチン接種方法を提供し、この方法は、本発明の第１の局面のワクチンを投与する工程を包含する。従って、ワクチン接種は、遺伝子コード配列から発現された免疫原に対する抗体を誘起することにより得られ得る。理解されるように、免疫原は、ウイルスまたは細菌、あるいは他の病原性微生物の成分であり得るか、あるいはこの免疫原のアナログであり得る。このアナログに対する抗体は、病原体自身に対して有効である。
【００５０】
本発明の第５の局面では、遺伝子治療方法が提供され、この方法は、個体において発現されるべき遺伝子産物を同定する工程、所望の遺伝子産物の発現のために本発明の第１の局面の組成物を調製する工程、およびこの組成物を投与する工程を包含する。発現されることが所望される遺伝子産物は、代表的には、遺伝子治療を受けている患者において、以前には完全または適切に発現されていないか、あるいは全く発現されていない遺伝子産物である。
【００５１】
遺伝子治療は、経口または鼻内投与、あるいは注射により都合よく達成され得る。
【００５２】
本発明の第６の局面によると、ＩｇＡ抗体の産生を誘導するための医薬の製造における、本発明の第１の局面の微粒子の使用が提供される。
【００５３】
本発明の第７の局面によると、遺伝子治療のための医薬の製造における、本発明の第１の局面の微粒子の使用が提供される。
【００５４】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様では、粒子材料はＰＬＧである。本発明の方法により生成される粒子の大きさは、一般に、０．０１〜３０μｍ、好ましくは、１〜１０μｍの範囲である。本発明のＤＮＡ含有粒子のための他の適切なポリマー処方物は、ポリ乳酸、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシヴァレレート、ポリ（ヒドロキシブチレート／ヴァレレート）、エチルセルロース、デキストラン、ポリサッカライド、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ−メチル−メタクリレート、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、およびこれら全ての成分の混合物を包含する。
【００５５】
以下の実施例に記載の本発明の特定の実施態様の使用において、本発明の微粒子の調製物は、タンパク質ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含む。当業者により理解されるように、広範なＤＮＡ配列および構築物が本発明における使用に適切である。特に、本発明は、当該分野において既によく知られ、そして特徴づけられている広範なプラスミドベクターを取り込んで実施され得る。代表的には、本発明で用いられるプラスミドベクターは、所望の遺伝子産物をコードするｃＤＮＡを含む。ＤＮＡ配列のさらなる成分（例えば、プロモーター、レポーター遺伝子、および転写終結配列）の選択は、公知のプラスミドベクターの構築に関する通常の常識に従って当業者により行われ得る。
【００５６】
本発明の組成物のための好ましい投与経路は、経口経路である。本発明の組成物は、好ましくは、高い酸レベルを有する胃を通過する際に顕著な分解を避けるように設計されるべきであることが意図される。
【００５７】
１０μｍ未満の大きさの微粒子の取り込みがとりわけ腸のＭ細胞内で生じ、従ってこの大きさ範囲のＤＮＡ含有粒子の封入が、この腸位置での取り込みを促進するのに有利であり得ることが知られている。ポリマーの性質および特性および成分に対する他の変更は、本発明の概念内で行われ得る。
【００５８】
以下の図面を伴って、本発明の特定の実施態様の説明を続ける。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡ含有粒子への取り込みに適切なタンパク質発現プラスミドの成分の模式図である；
【図２】図２は、実施例３の結果、すなわち、ＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡによるルシフェラーゼ特異的血清抗体の誘導を示す。ここでは、左欄は、３週間後の抗体価を示し、そして右欄は６週間後の抗体価を示す（ｉ．ｍ．は、筋肉内を示し、ｉ．ｐ．は腹腔内を示し、各欄の底部はＩｇＧレベルを示し、最上部はＩｇＭレベルを示す）；
【図３】図３は、各場合においてＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの力価を用いた、カプセル化ＤＮＡの注射投薬および経口投薬についての用量応答データを示す；
【図４】図４は以下を示す：Ａ−２０００ｒｐｍおよび８０００ｒｐｍでの０〜３００秒のＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーでのホモジナイズ後のプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動；およびＢ−カプセル化の前および後のＤＮＡのアガロースゲル電気泳動；
【図５】図５は、ＰＬＧ微粒子内のＤＮＡに対する便抗ルシフェラーゼＩｇＡ応答を示す；
【図６】図６は、麻疹ウイルスＮタンパク質を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口投与の結果を示す；そして
【図７】図７は、ロタウイルスＶＰ６遺伝子を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口投与の結果を示す：Ａ−糞便ロタウイルス特異的ＩｇＡ応答、Ｂ−経口免疫マウスのチャレンジ後に排泄したロタウイルス。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
（ＰＬＧ微粒子におけるプラスミドＤＮＡのカプセル化方法）
装置：
１）エマルザースクリーン（ｅｍｕｌｓｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）に備え付けられた３／４”プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙミキサー。
２）高速遠心分離機。
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−５００ｍｇ（３ｍｌジクロロメタン中）。
２）プラスミドＤＮＡ（水中１２ｍｇ／ｍｌ）。
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）。
４）無水エタノール。
５）ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）。
方法：
１）２００μｌプラスミドＤＮＡ溶液を２５０μｌ ＴＥＮと混合し、そして１５０μｌエタノールを撹拌しながら添加する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌ ＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で３０００ｒｐｍで２分間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌ ＰＶＡに添加し、そして３０００ｒｐｍで２分間乳化する。
４）２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に撹拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器中に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズし、均質な懸濁液にする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上述のように再度遠心分離する。
７）工程６を３回繰り返す。
８）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に上述のように再懸濁し、凍結乾燥に適した容器に移し、イソプロパノール／ドライアイス混合物中で表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００６１】
この方法では、工程１〜３を室温で行う。ＤＮＡは、微粒子中に約２５％の効率で取り込まれた。
【００６２】
（実施例２）
（インビボ送達後のタンパク質の発現用のプラスミド）
本発明の微粒子での使用に適切なプラスミドは、以下の成分からなる（図１を参照のこと）：
１．プラスミド骨格 プラスミド骨格は、複製起点、およびその細菌宿主におけるプラスミドの維持を可能にする抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーを有する。高いコピー数を提供する骨格は、プラスミドＤＮＡの産生を容易にする。一例は、ｐＵＣプラスミドベクターに由来する。
【００６３】
２．転写プロモーター配列 所望のタンパク質の発現は、ｍＲＮＡの合成を開始する（代表的には真核生物の）転写プロモーターにより駆動される。一般には、広範な種々の組織タイプおよび動物種において機能する強力なプロモーターが用いられるべきである（例えば、ヒトサイトメガロウイルス即時型（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター）。しかし、特に遺伝子治療適用については、組織または細胞のタイプに特異的なプロモーターがより適切であり得る。
【００６４】
３．コード配列 コード配列は、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する。それは、タンパク質合成の開始に好ましい配列情況で、転写開始コドンＡＴＧを含有する。コード配列は、転写終結コドンで終わる。発現されるべきタンパク質は、以下を包含する：ａ）レポーター酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）；ｂ）防御免疫応答を誘導し得る病原性微生物成分（例えば、ダニ媒介脳炎ウイルスのＮＳ１タンパク質、麻疹ウイルスのＮ、ＨまたはＦタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１のｇｐ１２０タンパク質）；ｃ）遺伝性疾患の処置について意図される酵素または他のタンパク質（例えば、ゴーシェ病の処置のためのグルコセレブロシダーゼ）。
【００６５】
４．転写終結配列 発現レベルの改善は、ｍＲＮＡ転写の終結を引き起こす配列がコード配列の下流に取り込まれるいくつかの状況下で得られる。これらの配列はまた、しばしば、ポリＡテイルのｍＲＮＡ転写物への付加を引き起こすシグナルを含有する。この役割において用いられ得る配列は、ｈＣＭＶ主要即時型タンパク質遺伝子またはＳＶ４０ウイルスＤＮＡまたは他のいずれかに由来し得る。
【００６６】
（実施例３）
本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルス即時型（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーターの転写制御下で、昆虫タンパク質ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを構築し、そしてインビトロでトランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性を実証した。
【００６７】
本発明者らは、実施例１のプロトコルを用いて、中程度（約２５％）の効率を有する、大きさが約２μｍのＰＬＧ微粒子中に精製プラスミドＤＮＡをカプセル化した。アガロースゲル電気泳動では、初めの閉環状スーパーコイル化ＤＮＡのある割合が、カプセル化プロセスにおける剪断応力の結果として、よりゆっくりと移動する形態（おそらくは弛緩された環）への変換を受けることが示される。カプセル化ＤＮＡは、粒子から放出され、そしてエレクトロポレーションによる細菌形質転換および培養細胞へのトランスフェクション後のルシフェラーゼ発現のアッセイにおいて、そのインビボでの生物学的活性の有意な割合を保持することが示された。
【００６８】
マイクロカプセル化ＤＮＡ（５０μｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射および経口によりマウスに投与した。コントロール動物は、非カプセル化ＤＮＡを同じ経路により受け、そしてポジティブコントロールとして標準的な筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により受けた。ルシフェラーゼ特異的血清抗体を、ＤＮＡ投与の３および６週間後にＥＬＩＳＡにより分析した。結果を図２に示す。
【００６９】
図２に示すように、中程度の特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ応答が、ｉ．ｍ．注射後に、予測したように見られた。カプセル化ＤＮＡは、ｉ．ｐ．注射後に強いＩｇＧおよびＩｇＭ応答を惹起した。一方、非カプセル化ＤＮＡは、ずっと弱い応答を与えた。同様に、経口投与したカプセル化ＤＮＡは、良好なＩｇＧ応答を惹起した。これには、非カプセル化ＤＮＡは匹敵しなかった。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答から、ルシフェラーゼ発現および免疫系への提示が、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化されたプラスミドＤＮＡの投与後に、標準的なｉ．ｍ．経路で見られたより高く、かつ非カプセル化ＤＮＡの比較投与において見られたより高い効率で生じたことが示される。
【００７０】
（実施例４）
さらなる実験において、実施例１の方法により作製したマイクロカプセル化ＤＮＡを、用量（１〜５０μｇ ＤＮＡ）の範囲で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射または経口により異系交配マウスの群に投与した。ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡクラスのルシフェラーゼ特異的血清抗体を、ＤＮＡ投与の３、６、および９週間後にＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７１】
図３において、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡのｉ．ｐ．注射が良好なＩｇＧおよびＩｇＭ応答、ならびにおよび中程度のＩｇＡ応答を惹起したことが見られ得る。経口投与したカプセル化ＤＮＡは、３つの全ての抗体クラスにおいて良好な応答を惹起した。ＤＮＡ投与後の時間に伴って抗体価が増大するという傾向があり、そして応答は、多かれ少なかれ用量関連的でもある。たった１μｇの量のＤＮＡが有意な応答を、特に投与後のより長い時間で惹起し得ることが明らかである。これらの抗体応答により、ルシフェラーゼ発現は、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化されたプラスミドＤＮＡのｉ．ｐ．注射または経口のいずれかによる投与後に生じることが、再度確認される。それらはまた、抗原が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの抗体クラスを惹起するような様式で、これらの手段により免疫系に提示されることを実証する。
【００７２】
（実施例５）
本発明者らは、プラスミドＤＮＡの物理的完全性および生物学的機能に対する高速ホモジナイズ工程（カプセル化プロセスにおける中間体である必要な水−油−水エマルジョンを生成するために用いた）の効果を試験した。
【００７３】
最初の実験では、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを、マイクロカプセル化実験において用いられるべき濃度および容積に類似した濃度および容積に調整し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙホモジナイザーでホモジナイズした。試料を、アガロースゲル電気泳動による分析（図４Ａ）のために、０〜３００秒の間隔で取り出した。このような分析手順は、スーパーコイル化（ｓｃ）ＤＮＡ、開環（ｏｃ）ＤＮＡ（一本鎖に切り目が入っている）、および線状（ｌ）ＤＮＡ（両鎖が近接点で切断されている）の間を識別し得る（例えば、ＧａｒｎｅｒおよびＣｈｒａｍｂａｃｈ １９９２． Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ， ｎｉｃｋｅｄ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡ， ４．４ ｋｂ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ， ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３， １７６−１７８の図２Ｃを参照のこと）。このような条件にわずか１０秒の時間曝すことにより、ｓｃ形態からｏｃ形態に変換されることが明らかである。８０００ｒｐｍでは、線状形態へのさらなる変換、および最終的にはより広範囲にわたる分解が生じる。しかし、２０００ｒｐｍの減少速度では、ＤＮＡのｏｃ形態は、ＰＬＧカプセル化に関与するエマルジョン中間体の形成に典型的に必要とされる時間にわたって、比較的安定である。従って、これらの研究は、プラスミドＤＮＡが剪断誘導損傷に無防備であり、そして変化が最小であるＤＮＡのカプセル化を得るためには、正確な条件に対して、慎重な注意が必要であることを示す。
【００７４】
この原理から、本発明者らは、大きさが約２μｍのＰＬＧ微粒子中に精製プラスミドＤＮＡを中程度（約２５％）の効率でカプセル化するための条件を開発した。アガロースゲル電気泳動（図４Ｂ）は、初めの閉環状スーパーコイル化ＤＮＡが、カプセル化プロセスにおける剪断応力の結果として、ｏｃ形態への変換を受けることを示す。微粒子から放出されたＤＮＡの生物学的活性を、エレクトロポレーションによる細菌形質転換および培養細胞へのトランスフェクション後のルシフェラーゼ発現のアッセイにおいて評価した。粒子から放出されたＤＮＡは、これらの両アッセイにおいて、そのインビトロ活性の有意な割合（約２５％）を保持している。
【００７５】
（実施例６）
実施例３の方法により作製されたルシフェラーゼをコードするＰＬＧカプセル化ＤＮＡはまた、発現タンパク質に対して粘膜免疫応答を惹起し得る。ルシフェラーゼに特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体のレベルを、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡの１、５、２０、または５０μｇのｉ．ｐ．または経口投薬を受けたマウスの便試料において、ＥＬＩＳＡにより評価した。有意なレベルのＩｇＧまたはＩｇＭ抗体は、どの群のマウスの便試料においても見出されなかった。幾分限定されたＩｇＡ応答が、ｉ．ｐ．注射マウスにおいて見られた；しかし、経口投与によって、便試料中に有意なレベルのルシフェラーゼＩｇＡ抗体が生じた（図５）。これらは、５０μｇのＰＬＧカプセル化ＤＮＡを受けたそれらのマウスにおいて異常に高いレベルに達した。これらの結果は、単回用量のＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡの経口投与が、全身抗体応答と同様に粘膜応答を惹起し得ることを示す。これは、粘膜表面での感染に対する防御が望ましい適用（例えば麻疹またはＡＩＤＳ）において、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡワクチンの有用な特質であり得る。
【００７６】
（実施例７）
本発明者らは、ルシフェラーゼを発現するカプセル化プラスミドＤＮＡの経口投与が全身抗体応答を誘起し得るという本発明者らの観察を拡張するために、麻疹ウイルス（ＭＶ）ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を発現するプラスミドを開発した。Ｎ−発現構築物は、ルシフェラーゼを発現する構築物（実施例３に記載）と、コード配列をＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株ＭＶＮコード配列で置換したことを除いて、同一である。精製プラスミドＤＮＡを、ＰＬＧカプセル化した（実施例１に記載の方法を用いる）。
【００７７】
同系交配Ｃ３Ｈマウスを、経口栄養補給により投与した、０．１Ｍ 重炭酸ナトリウムに懸濁した２回の投薬（１３日間隔）で免疫した；各用量には、５０μｇ ＤＮＡが含まれていた。マウスのコントロール群は、ＰＢＳ単独、またはコード配列を含まないプラスミドベクターＤＮＡ含有ＰＬＧ粒子を受けた。マウスを時々採血し、そしてＭＶ Ｎに特異的なＩｇＧの血清レベルを、昆虫細胞において発現された組換えＭＶ Ｎを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより測定した。図６Ａに示されるように、ＭＶ Ｎを発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡでの免疫により、有意なレベルのＮ特異的抗体が生じた：示した結果は、２回目のＤＮＡ投与５３日後に採取した１／１００希釈血清における平均吸光度である。これらの実験におけるＤＮＡ免疫に対する個々のマウスの応答には、かなりの程度の変動があるようであった（図６Ｂ）が、非常に高いレベルの抗体（１０４を超える代償的な（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）力価、追跡実験で測定）が存在する動物もいる。これらの結果から、ＰＬＧカプセル化ＤＮＡの経口送達は、重要な病原体に対する免疫応答を誘起する有効な方法であることが実証された。
【００７８】
（実施例８）
（ＰＬＧ微粒子中のプラスミドＤＮＡのカプセル化のさらなる方法）
装置：
１）エマルザースクリーンに備え付けられた３／４’’プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ミキサー
２）高速遠心分離機
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−３ｍｌのジクロロメタン中５００ｍｇ
２）プラスミドＤＮＡ（＞ＴＥ緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）
４）無水エタノール
５）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）。
方法：
１）４５０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、１５０μｌのエタノールと攪拌しながら混合する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌのＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で、２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌのＰＶＡに添加し、そして２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
４）この２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に攪拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズして、均質な懸濁液にする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上記のように再度遠心分離する。
７）工程５および６を４回繰り返す。
８）微粒子ペレットを上記のように２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして凍結乾燥に適した容器に移し、イソプロパノール／ドライアイス混合物中で表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００７９】
この方法では、工程１〜３を室温で行う。効率は、実施例１に比較して、３０〜４０％効率まで改善された。
【００８０】
（実施例９）
（ＰＬＧ微粒子中のプラスミドＤＮＡのカプセル化のさらなる方法）
装置：
１）エマルザースクリーンに備え付けられた３／４’’プローブを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ミキサー
２）高速遠心分離機
３）通常の実験用ガラス器具、ビーカー、測定シリンダー、スターラーなど。
試薬：
１）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）溶液−３ｍｌのジクロロメタン中４００ｍｇ
２）プラスミドＤＮＡ（＞ＴＥ緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）
３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液（水中８％ ｗ／ｖ）
４）無水エタノール
５）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ。
方法：
１）４５０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を、１５０μｌのエタノールと攪拌しながら混合する。よく混合する。
２）この混合物を３ｍｌのＰＬＧ溶液に添加し、そしてＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー中で、２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
３）このエマルジョンを１００ｍｌのＰＶＡに添加し、そして２０００ｒｐｍで２分半の間乳化する。
４）この２重エマルジョンを１リットルの水に添加し、そして１分間活発に攪拌する。
５）微粒子の懸濁液を遠心分離容器に分配し、そして１０，０００×ｇａｖで３０分間遠心分離する。
６）微粒子ペレットを２５ｍｌの水中に再懸濁し、そして大きなクリアランス（０．５ｍｍ）を有する手動ホモジナイザーでホモジナイズして、均質な懸濁液とする。２００ｍｌの水で希釈し、そして上記のように再度遠心分離する。
７）工程５および６を４回繰り返す。
８）微粒子ペレットを上記のように２５ｍｌの水に再懸濁し、そして凍結乾燥に適した容器に移し、表面を凍結し、そして４８時間凍結乾燥する。
【００８１】
この方法では、工程１〜３を４℃で行う。微粒子中へのＤＮＡの取り込みの効率は、５０〜６０％であった。
【００８２】
（実施例１０）
マウスロタウイルス（幼若マウス流行性下痢（ＥＤＩＭ）ウイルス）のＶＰ６遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＩＡ／ＶＰ６）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで構築した。ＶＰ６をコードする遺伝子を、ベクター（ｐＪＷ４３０３）中に、即時型転写プロモーターの配列およびヒトサイトメガロウイルスのイントロンＡおよびｔＰＡ由来分泌シグナル配列の下流に挿入した。この遺伝子には、ウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結配列およびポリアデニル化配列が続く。精製プラスミドＤＮＡを、実施例１に記載の方法を用いてＰＬＧカプセル化した。
【００８３】
同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＰＬＧ微粒子中にカプセル化された５０マイクログラムのＶＰ６発現ＤＮＡを含む用量を経口投与することによって免疫した。マウスのコントロール群は、カプセル化ベクターＤＮＡの同様の用量を受けた。マウスを、隔週間隔で、腸ロタウイルス特異的ＩｇＡについて、ＥＤＩＭウイルスを抗原として用いて、ＥＬＩＳＡによって試験した。免疫の９週間後、動物をＥＤＩＭウイルスでチャレンジし、そしてモノクローナル抗体に基づくＥＬＩＳＡを用いて、便中のウイルスの排出をモニターした。
【００８４】
図７Ａに示すように、ＶＰ６を発現するＰＬＧカプセル化ＤＮＡでの免疫によって、コントロール動物と比較して、有意なレベルのロタウイルス特異的腸ＩｇＡ抗体が生じた。これは特筆すべきである。なぜなら、ＶＰ６発現プラスミドＤＮＡの他の投与経路によっては、ウイルスチャレンジの前に検出可能なレベルの腸ウイルス特異的ＩｇＡは誘起されなかったからである。ＥＤＩＭウイルスでのチャレンジ後、コントロール群と比較して、ＰＬＧカプセル化ＶＰ６発現プラスミドＤＮＡを受けたマウスにおけるロタウイルス流出は減少した（図７Ｂ）。
【００８５】
これらの結果は、ウイルス流出の減少に現れるように、経口投与されたＰＬＧカプセル化プラスミドＤＮＡが、ａ）特異的腸ＩｇＡ応答、およびｂ）ウイルスチャレンジに対する防御を誘導し得ることを示す。
【００８６】
本発明の組成物および方法は、ＤＮＡワクチンの送達のための遅発放出系において適用を有する；免疫原の発現が延長されることによって、有効な単回用量の初回投与および追加投与が可能になり、結果として長期の記憶応答が有効に誘導される。別の適用は、ワクチンの経口送達のためのビヒクルにある；ワクチン投与のための簡単かつ受容可能な手段は、ワクチン取り込み率を改善するようである；さらに、凍結乾燥したカプセル化プラスミドＤＮＡは、非常に安定で、かつ環境条件に非感受性であるようである。さらなる適用は、遺伝子治療のための遅発放出系にある；ＤＮＡの長期放出および続く発現は、反復処置の必要性をおそらく低減させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−４７６２０（Ｐ２０１０−４７６２０Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７５９６０（Ｐ２００９−２７５９６０）
【出願日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【分割の表示】特願平９−５１８０００の分割
【原出願日】平成８年１１月１１日（１９９６．１１．１１）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【分割の表示】特願平９−５１８０００の分割
【原出願日】平成８年１１月１１日（１９９６．１１．１１）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]