乳酸の製造方法
【課題】 乳酸の製造方法の提供。
【解決手段】 糖化原料を、耐酸性微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法。
【解決手段】 糖化原料を、耐酸性微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸は、醸造、漬物などの食品用途、医薬、農薬、化粧品などの化学原料用途、さらに繊維仕上げ、塗料、溶剤、生分解性プラスチックなどの工業用途等に使用されており、需要増加が期待されている。
【０００３】従来より、乳酸発酵には乳酸菌が使用されているが、乳酸菌が乳酸発酵することのできるpH範囲は6〜7であるため、乳酸が生成されてpHが6以下になると、それ以上乳酸を生成することができなくなる。従って、高濃度の乳酸を得るためには、発酵中に生成する乳酸をアルカリ（例えば炭酸カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム等）で中和する必要がある。
【０００４】しかし、アルカリで中和すると、乳酸塩を乳酸に戻す工程が必要であり副産物を生じること等により、その処理にコストがかかる。また、バイポーラ膜と呼ばれる特殊なイオン交換膜を用いると、副産物を生じることなく乳酸塩を乳酸とアルカリに戻すことができるが、バイポーラ膜は高価なうえ効率が悪いという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、低コストで生産性の高い乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、酸性条件下でも乳酸を生成することができる微生物を用いて乳酸発酵を行うことにより、簡易かつ高収率で乳酸を製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、糖化原料を、耐酸性乳酸生成微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法である。上記発酵は、中和剤で処理することなく行うことができるものである。
【０００８】微生物としては、pH6以下の条件でも乳酸発酵することができるもの、例えば酵母菌又はカビが挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、乳酸発酵により乳酸を製造する際に、乳酸生成微生物として耐酸性微生物を使用することを特徴とする。該微生物を用いると、中和剤を使用せずに乳酸発酵することができる。「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好ましくはpHが6以下、さらに好ましくはpH２〜５で乳酸発酵を行うことができる微生物を意味する。本発明の方法に使用する微生物は、耐酸性を有し、かつ乳酸生成を行うことができる限り、特に限定されるものではなく、天然から採取されたものも含まれる。本発明では、乳酸生成遺伝子を組み込んだ組換えベクターを上記耐酸性微生物に導入して形質転換体を得、乳酸生成遺伝子が機能するように操作することもできる。「乳酸生成遺伝子が機能する」とは、該遺伝子が組み込まれたベクターを導入した宿主（微生物）を培養して乳酸を生成させたときに、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がっても）当該発現が維持されて乳酸を生成し得るように発現することを意味する。
【００１０】１．耐酸性乳酸生成微生物の調製本発明において使用する乳酸生成遺伝子は特に限定されるものではなく、例えばビヒドバクテリウム属に属する微生物（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)）、ラクトバシルス属に属する微生物（例えばラクトバシルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)）などを採取源とする。
【００１１】乳酸生成遺伝子としては、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）遺伝子が挙げられる。乳酸生成遺伝子の採取源である上記微生物からのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
【００１２】本発明の組換えベクターは、適当なベクターに乳酸生成遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。乳酸生成遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００１３】プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5,等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１４】ベクターに乳酸生成遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００１５】本発明において使用する乳酸生成遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、乳酸生成遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００１６】例えば、本発明において使用する組換えベクターは、乳酸生成遺伝子の上流にGAP（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター（GAP-P）を、下流にGAP遺伝子のターミネーター（GAP-T）及びアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を連結して遺伝子発現カセットを作製し、このカセットを、予めURA3遺伝子及び2μm oriを連結しておいたプラスミドに連結することにより構築することができる（図１；pYLD1）。
【００１７】図1において、各制限酵素名の次に記載されている数字は、アンピシリン抵抗性マーカー遺伝子のHindIII切断位置を０としたときの切断位置を示す。なお、上記組換えベクターpYLD1は大腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、FERM P-17621として寄託されている（寄託日：平成11年10月26日）。
【００１８】本発明において使用される耐酸性乳酸生成微生物（耐酸性乳酸発酵微生物ともいう）は、上記組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主として使用される乳酸発酵微生物は、耐酸性を有する限り特に限定されるものではない。例えば、サッカロミセス属等の酵母、あるいはリゾプス属に属するカビなどの微生物が挙げられる（下記参照）。
【００１９】■ 酵母菌サッカロミセス属：サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルーベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・パラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)クルーベルマイセス属：クルーベルマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルーベルマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、ピキア属：ピキア・パストリス(Pichia pastoris）
【００２０】■ カビリゾプス属：リゾプス・デレマー(Rhyzopus delemer)アスペルギルス属：アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)
【００２１】本発明の耐酸性乳酸生成微生物を得るための形質転換は、上記手法により得られた耐酸性微生物に、乳酸生成遺伝子を含む本発明の組換えベクターを導入し得る方法であれば特に限定されるものではない。例えば、酢酸リチウム法、カルシウムイオンを用いる方法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972)、エレクトロポレーション法等の通常行われる遺伝子工学的手法により形質転換を行う。
【００２２】２．乳酸発酵本発明の耐酸性乳酸生成微生物は、培養して乳酸を生成させると、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がっても）乳酸生成遺伝子の発現が維持されて乳酸を生成し得るように機能する。従って、耐酸性乳酸生成微生物を用いると、中和剤を使用せずに乳酸発酵することができる。
【００２３】本発明において乳酸発酵に使用される糖化原料としては、さつまいも、ジャガイモ、トウモロコシ等が挙げられる。これらの原料を洗浄及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好ましくは120℃の蒸気で5〜30分、好ましくは15分処理する。
【００２４】原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、市販の酵素（例えばターマミル（ノバ社）及びスミチーム（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％添加する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間保持すれば原料の液化、糖化が完了する。
【００２５】上記のようにして得られた液を遠心分離にかけ、固形分（リグニン等）を分離し、原液とする。なお、デンプン原料としてブドウ糖を用いる場合はこれまでの工程を省略し、原液として直接使用することができる。
【００２６】培養のための培地は、通常は糖類、ペプトン、酵母エキスを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコース、0.1〜10％ペプトン、0.1〜10％酵母エキスを含み、さらに好ましくは約2％のグルコース、約2％のペプトン、約1％の酵母エキスが使用される。
【００２７】また、培地として予め濾過除菌したものを用いることができ、特に乳酸菌用培地としてMRS培地又はGYP培地等を用いることができる。更に、コーンスターチ製造の副産物であるコーンスティープリカーを使用することも可能である。発酵条件は以下の通りである。
【００２８】温度：25〜33℃、好ましくは30℃菌体密度：10〜30％、好ましくは25％（湿重量ベース）
基質濃度：5〜20％、好ましくは10％（バッチ発酵の初期濃度）
発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間
【００２９】本発明においては、耐酸性乳酸生成微生物は、1種類単独でもよく、複数種を混合して用いることもできる。複数種を混合する場合は、互いに同一の属に属する微生物であっても異なる属に属する微生物であってもよい。また、混合比率は任意に設定することができ、特に限定されるものではないが、それぞれ均等（例えば3種類の微生物を用いるときは1:1:1）となるようにすることが好ましい。
【００３０】上記条件で発酵させることにより、１〜10％の乳酸が得られる。乳酸の収率は、例えば、Fキット（ベーリンガー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。本発明においては、上記発酵の際に炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアなどの中和剤を添加する必要はない。
【００３１】この発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行う。液分の精製・濃縮は、一般に海水や食品の脱塩に広く採用されているイオン交換膜を利用した電気透析装置（例えばアシライザー（旭化成社））により行うことができる。
【００３２】本発明に使用されるイオン交換膜は特に限定されず、従来より公知のイオン交換膜が使用できる。例えば、陽イオン交換膜としてはスルホン酸基、カルボン酸基、さらにこれらのイオン交換基が複数混在した陽イオン交換膜が挙げられる。また、陰イオン交換膜としては４級アンモニウム基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、さらにこれらのイオン交換基が複数混在した陰イオン交換膜が挙げられる。これらの陽イオン及び陰イオン交換膜は、重合型、縮合型、均一型及び不均一型のいずれでもよく、さらに、補強心材の有無や、炭化水素系のものであるか否か、フッ素系のものであるか否かを問わず、材料・製造方法に由来するイオン交換膜の種類、形式などに関係なく任意に選択することができる。本発明において、電気透析装置は電極間に陰イオン交換膜と陽イオン交換膜とを交互に配列して濃縮室と脱塩室とを形成することによって構成されるものが好ましい。
【００３３】なお、電気透析時の各種液の温度は、通常、20〜45℃、好ましくは35〜40℃の範囲である。電気透析を行うと、イオン性物質と非イオン性物質を分離すると同時に乳酸を濃縮することが可能である。この工程により、発酵液中のアルコール、残糖、タンパク質等を分離し、乳酸濃度を濃縮することができる。例えば、電気透析処理により５〜10％の乳酸を25〜30％に濃縮できる。
【００３４】電気透析で除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸等）は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除去することができる。クロマト分離装置としては、例えば固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられる。
【００３５】最後に、溶液中の水分を蒸発装置で蒸発させ、50〜90％濃度の乳酸製品を製造することができる。なお、発酵液の精製・濃縮は、上記の方法に限定されるものではなく、蒸留法によっても行うことができる。
【００３６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３７】〔実施例1〕組換えベクターの構築及び形質転換１． 組換えベクターの構築(1) 乳酸生成遺伝子のクローニングB. longum 由来LDHのN末端アミノ酸配列から32mer(5'-ACIGCICCIG CICCIATIACIGCIAGTTTI GT-3'(配列番号1))のオリゴヌクレオチドを作製した。B. longum aM101-2株の染色体DNAの4.2kb HindIII断片から上記オリゴヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行いLDH遺伝子の部分断片を得、pUC19にクローン化した。全長断片を取得するため、pUBL1の0.3kbのHindIII-SacI断片にハイブリダイズする0.9kbのSalI-SacI断片をpUC118にクローン化した。これらクローンをHindIIIで処理した後連結を行い、Gene Cleanキット（Bio 101）により全長LDH遺伝子（Gene, 85(1989) 161-168）を取得した。
【００３８】(2) 各遺伝子のプラスミドへの連結得られたLDH遺伝子とpKK223-3由来のtacプロモーターをpUC118に連結した。このプラスミドからEcoRI、XhoIサイトでLDH遺伝子を切り出した後、GAPプロモーター、GAPターミネーターを含んでいる酵母発現用ベクターpCHIのEcoRI、SalIサイトに連結した。連結にはTakaraの「ligation kit ver. 2」を用い16℃で16時間反応させた。反応後コンピーテントセルである大腸菌DH5αに形質転換を行い、LB/アンピシリンプレートに撒き、37℃で一晩培養を行い、形質転換株を得た。得られたクローンからアルカリSDS法によりプラスミドの精製、抽出を行い、酵母発現用LDHベクターであるpYLD1を取得した（図１）。
【００３９】なお、本発明の組換えベクターpYLD1は大腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、FERM P-17621として寄託されている（寄託日：平成11年10月26日）。
【００４０】２．組換えベクターの宿主への導入宿主である酵母Saccharomyces cerevisiae YPH500株をYPD培地にて30℃で対数増殖期（O.D. 1.0以下）まで培養を行い、集菌（3000rpm, 2分）及びTEバッファー(10mM Tris, 1mM EDTA, pH7.5)による洗浄を行った後、0.5Mの酢酸リチウム液に懸濁した。上記菌体100μlに1μg のpYDL1と1μgのキャリアーDNA（サケ精子DNA）を添加した。これに800μlのTLP(40% PEG、0.1M酢酸リチウム、10mM Tris、1mM EDTA)を加え、室温に40分静置した後、42℃で10分間熱ショックを与えた。その後菌体を遠心分離し（1200rpm, 10秒）、TEバッファーで洗浄を行い、200μlのTEに懸濁した後選択培地で30℃で2日間培養を行い、形質転換株（YPLD１）を取得した。
【００４１】〔実施例2〕 乳酸発酵乳酸発酵の原料であるさつまいも（100ｇ）を洗浄及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、120℃の蒸気で15分処理した。原料100ｇに対し0.2Lの水を加えた後、市販の酵素（ターマミル（ノバ社）及びスミチーム（新日本化学社））を1.0ｇ（原料と水の総重量に対して１％）添加した。温度60℃で15〜20時間保持し、原料の液化及び糖化を行った。
【００４２】上記のようにして得られた原液を遠心分離（10,000rpm）にかけ、固形分（リグニン等）を分離した。続いて原液に尿素及び硫安を原液重量比で各0.5％添加して発酵原液とし、実施例1で得られた乳酸生成菌YPLD1を用いて以下の発酵に使用した。
【００４３】培地は、上記さつまいも糖化液を用いた。発酵は、温度30℃、菌体密度25％（湿重量ベース）、基質濃度10％（バッチ発酵の初期濃度）、発酵時間20〜24時間で行った。その結果、２〜５％の乳酸が得られた。
【００４４】この発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行った。液分の精製・濃縮は、マイクロアシライザー（旭化成社）を用いた。電気透析の処理条件は、印加電圧15V（セルあたり1.5V×10セル）、液温40℃である。電気透析後、除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸等）を、クロマト分離装置（擬似移動層クロマト装置トレソーネ（オルガノ社））にかけて除去した。蒸発缶により水分を蒸発させ、90％の乳酸水溶液を得た。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、乳酸の製造方法が提供される。本発明では、アンモニア等のアルカリ（中和剤）を添加・回収する工程がないため操作が簡便であり、生産性が上昇し、さらに、高価なバイポーラ膜を使用する必要がないためコスト低減を図ることができる。
【００４６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Toyota Motor Corporation<120> Method of producing lactic acid<130> P99-0464<140><141><160> 1<170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 32<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Synthetic DNA<220><221> modified base<222> 3<223> i<220><221> modified base<222> 6<223> i<220><221> modified base<222> 9<223> i<220><221> modified base<222> 12<223> i<220><221> modified base<222> 15<223> i<220><221> modified base<222> 18<223> i<220><221> modified base<222> 21<223> i<220><221> modified base<222> 24<223> i<220><221> modified base<222> 30<223> i<400> acngcnccng cnccnatnac ngcnagtttn gt 32
【００４７】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpYLD1の構築図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸は、醸造、漬物などの食品用途、医薬、農薬、化粧品などの化学原料用途、さらに繊維仕上げ、塗料、溶剤、生分解性プラスチックなどの工業用途等に使用されており、需要増加が期待されている。
【０００３】従来より、乳酸発酵には乳酸菌が使用されているが、乳酸菌が乳酸発酵することのできるpH範囲は6〜7であるため、乳酸が生成されてpHが6以下になると、それ以上乳酸を生成することができなくなる。従って、高濃度の乳酸を得るためには、発酵中に生成する乳酸をアルカリ（例えば炭酸カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム等）で中和する必要がある。
【０００４】しかし、アルカリで中和すると、乳酸塩を乳酸に戻す工程が必要であり副産物を生じること等により、その処理にコストがかかる。また、バイポーラ膜と呼ばれる特殊なイオン交換膜を用いると、副産物を生じることなく乳酸塩を乳酸とアルカリに戻すことができるが、バイポーラ膜は高価なうえ効率が悪いという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、低コストで生産性の高い乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、酸性条件下でも乳酸を生成することができる微生物を用いて乳酸発酵を行うことにより、簡易かつ高収率で乳酸を製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、糖化原料を、耐酸性乳酸生成微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法である。上記発酵は、中和剤で処理することなく行うことができるものである。
【０００８】微生物としては、pH6以下の条件でも乳酸発酵することができるもの、例えば酵母菌又はカビが挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、乳酸発酵により乳酸を製造する際に、乳酸生成微生物として耐酸性微生物を使用することを特徴とする。該微生物を用いると、中和剤を使用せずに乳酸発酵することができる。「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好ましくはpHが6以下、さらに好ましくはpH２〜５で乳酸発酵を行うことができる微生物を意味する。本発明の方法に使用する微生物は、耐酸性を有し、かつ乳酸生成を行うことができる限り、特に限定されるものではなく、天然から採取されたものも含まれる。本発明では、乳酸生成遺伝子を組み込んだ組換えベクターを上記耐酸性微生物に導入して形質転換体を得、乳酸生成遺伝子が機能するように操作することもできる。「乳酸生成遺伝子が機能する」とは、該遺伝子が組み込まれたベクターを導入した宿主（微生物）を培養して乳酸を生成させたときに、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がっても）当該発現が維持されて乳酸を生成し得るように発現することを意味する。
【００１０】１．耐酸性乳酸生成微生物の調製本発明において使用する乳酸生成遺伝子は特に限定されるものではなく、例えばビヒドバクテリウム属に属する微生物（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)）、ラクトバシルス属に属する微生物（例えばラクトバシルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)）などを採取源とする。
【００１１】乳酸生成遺伝子としては、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）遺伝子が挙げられる。乳酸生成遺伝子の採取源である上記微生物からのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
【００１２】本発明の組換えベクターは、適当なベクターに乳酸生成遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。乳酸生成遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００１３】プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5,等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１４】ベクターに乳酸生成遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００１５】本発明において使用する乳酸生成遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、乳酸生成遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００１６】例えば、本発明において使用する組換えベクターは、乳酸生成遺伝子の上流にGAP（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター（GAP-P）を、下流にGAP遺伝子のターミネーター（GAP-T）及びアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を連結して遺伝子発現カセットを作製し、このカセットを、予めURA3遺伝子及び2μm oriを連結しておいたプラスミドに連結することにより構築することができる（図１；pYLD1）。
【００１７】図1において、各制限酵素名の次に記載されている数字は、アンピシリン抵抗性マーカー遺伝子のHindIII切断位置を０としたときの切断位置を示す。なお、上記組換えベクターpYLD1は大腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、FERM P-17621として寄託されている（寄託日：平成11年10月26日）。
【００１８】本発明において使用される耐酸性乳酸生成微生物（耐酸性乳酸発酵微生物ともいう）は、上記組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主として使用される乳酸発酵微生物は、耐酸性を有する限り特に限定されるものではない。例えば、サッカロミセス属等の酵母、あるいはリゾプス属に属するカビなどの微生物が挙げられる（下記参照）。
【００１９】
【００２０】
【００２１】本発明の耐酸性乳酸生成微生物を得るための形質転換は、上記手法により得られた耐酸性微生物に、乳酸生成遺伝子を含む本発明の組換えベクターを導入し得る方法であれば特に限定されるものではない。例えば、酢酸リチウム法、カルシウムイオンを用いる方法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972)、エレクトロポレーション法等の通常行われる遺伝子工学的手法により形質転換を行う。
【００２２】２．乳酸発酵本発明の耐酸性乳酸生成微生物は、培養して乳酸を生成させると、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がっても）乳酸生成遺伝子の発現が維持されて乳酸を生成し得るように機能する。従って、耐酸性乳酸生成微生物を用いると、中和剤を使用せずに乳酸発酵することができる。
【００２３】本発明において乳酸発酵に使用される糖化原料としては、さつまいも、ジャガイモ、トウモロコシ等が挙げられる。これらの原料を洗浄及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好ましくは120℃の蒸気で5〜30分、好ましくは15分処理する。
【００２４】原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、市販の酵素（例えばターマミル（ノバ社）及びスミチーム（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％添加する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間保持すれば原料の液化、糖化が完了する。
【００２５】上記のようにして得られた液を遠心分離にかけ、固形分（リグニン等）を分離し、原液とする。なお、デンプン原料としてブドウ糖を用いる場合はこれまでの工程を省略し、原液として直接使用することができる。
【００２６】培養のための培地は、通常は糖類、ペプトン、酵母エキスを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコース、0.1〜10％ペプトン、0.1〜10％酵母エキスを含み、さらに好ましくは約2％のグルコース、約2％のペプトン、約1％の酵母エキスが使用される。
【００２７】また、培地として予め濾過除菌したものを用いることができ、特に乳酸菌用培地としてMRS培地又はGYP培地等を用いることができる。更に、コーンスターチ製造の副産物であるコーンスティープリカーを使用することも可能である。発酵条件は以下の通りである。
【００２８】温度：25〜33℃、好ましくは30℃菌体密度：10〜30％、好ましくは25％（湿重量ベース）
基質濃度：5〜20％、好ましくは10％（バッチ発酵の初期濃度）
発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間
【００２９】本発明においては、耐酸性乳酸生成微生物は、1種類単独でもよく、複数種を混合して用いることもできる。複数種を混合する場合は、互いに同一の属に属する微生物であっても異なる属に属する微生物であってもよい。また、混合比率は任意に設定することができ、特に限定されるものではないが、それぞれ均等（例えば3種類の微生物を用いるときは1:1:1）となるようにすることが好ましい。
【００３０】上記条件で発酵させることにより、１〜10％の乳酸が得られる。乳酸の収率は、例えば、Fキット（ベーリンガー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。本発明においては、上記発酵の際に炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアなどの中和剤を添加する必要はない。
【００３１】この発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行う。液分の精製・濃縮は、一般に海水や食品の脱塩に広く採用されているイオン交換膜を利用した電気透析装置（例えばアシライザー（旭化成社））により行うことができる。
【００３２】本発明に使用されるイオン交換膜は特に限定されず、従来より公知のイオン交換膜が使用できる。例えば、陽イオン交換膜としてはスルホン酸基、カルボン酸基、さらにこれらのイオン交換基が複数混在した陽イオン交換膜が挙げられる。また、陰イオン交換膜としては４級アンモニウム基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、さらにこれらのイオン交換基が複数混在した陰イオン交換膜が挙げられる。これらの陽イオン及び陰イオン交換膜は、重合型、縮合型、均一型及び不均一型のいずれでもよく、さらに、補強心材の有無や、炭化水素系のものであるか否か、フッ素系のものであるか否かを問わず、材料・製造方法に由来するイオン交換膜の種類、形式などに関係なく任意に選択することができる。本発明において、電気透析装置は電極間に陰イオン交換膜と陽イオン交換膜とを交互に配列して濃縮室と脱塩室とを形成することによって構成されるものが好ましい。
【００３３】なお、電気透析時の各種液の温度は、通常、20〜45℃、好ましくは35〜40℃の範囲である。電気透析を行うと、イオン性物質と非イオン性物質を分離すると同時に乳酸を濃縮することが可能である。この工程により、発酵液中のアルコール、残糖、タンパク質等を分離し、乳酸濃度を濃縮することができる。例えば、電気透析処理により５〜10％の乳酸を25〜30％に濃縮できる。
【００３４】電気透析で除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸等）は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除去することができる。クロマト分離装置としては、例えば固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられる。
【００３５】最後に、溶液中の水分を蒸発装置で蒸発させ、50〜90％濃度の乳酸製品を製造することができる。なお、発酵液の精製・濃縮は、上記の方法に限定されるものではなく、蒸留法によっても行うことができる。
【００３６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３７】〔実施例1〕組換えベクターの構築及び形質転換１． 組換えベクターの構築(1) 乳酸生成遺伝子のクローニングB. longum 由来LDHのN末端アミノ酸配列から32mer(5'-ACIGCICCIG CICCIATIACIGCIAGTTTI GT-3'(配列番号1))のオリゴヌクレオチドを作製した。B. longum aM101-2株の染色体DNAの4.2kb HindIII断片から上記オリゴヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行いLDH遺伝子の部分断片を得、pUC19にクローン化した。全長断片を取得するため、pUBL1の0.3kbのHindIII-SacI断片にハイブリダイズする0.9kbのSalI-SacI断片をpUC118にクローン化した。これらクローンをHindIIIで処理した後連結を行い、Gene Cleanキット（Bio 101）により全長LDH遺伝子（Gene, 85(1989) 161-168）を取得した。
【００３８】(2) 各遺伝子のプラスミドへの連結得られたLDH遺伝子とpKK223-3由来のtacプロモーターをpUC118に連結した。このプラスミドからEcoRI、XhoIサイトでLDH遺伝子を切り出した後、GAPプロモーター、GAPターミネーターを含んでいる酵母発現用ベクターpCHIのEcoRI、SalIサイトに連結した。連結にはTakaraの「ligation kit ver. 2」を用い16℃で16時間反応させた。反応後コンピーテントセルである大腸菌DH5αに形質転換を行い、LB/アンピシリンプレートに撒き、37℃で一晩培養を行い、形質転換株を得た。得られたクローンからアルカリSDS法によりプラスミドの精製、抽出を行い、酵母発現用LDHベクターであるpYLD1を取得した（図１）。
【００３９】なお、本発明の組換えベクターpYLD1は大腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、FERM P-17621として寄託されている（寄託日：平成11年10月26日）。
【００４０】２．組換えベクターの宿主への導入宿主である酵母Saccharomyces cerevisiae YPH500株をYPD培地にて30℃で対数増殖期（O.D. 1.0以下）まで培養を行い、集菌（3000rpm, 2分）及びTEバッファー(10mM Tris, 1mM EDTA, pH7.5)による洗浄を行った後、0.5Mの酢酸リチウム液に懸濁した。上記菌体100μlに1μg のpYDL1と1μgのキャリアーDNA（サケ精子DNA）を添加した。これに800μlのTLP(40% PEG、0.1M酢酸リチウム、10mM Tris、1mM EDTA)を加え、室温に40分静置した後、42℃で10分間熱ショックを与えた。その後菌体を遠心分離し（1200rpm, 10秒）、TEバッファーで洗浄を行い、200μlのTEに懸濁した後選択培地で30℃で2日間培養を行い、形質転換株（YPLD１）を取得した。
【００４１】〔実施例2〕 乳酸発酵乳酸発酵の原料であるさつまいも（100ｇ）を洗浄及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、120℃の蒸気で15分処理した。原料100ｇに対し0.2Lの水を加えた後、市販の酵素（ターマミル（ノバ社）及びスミチーム（新日本化学社））を1.0ｇ（原料と水の総重量に対して１％）添加した。温度60℃で15〜20時間保持し、原料の液化及び糖化を行った。
【００４２】上記のようにして得られた原液を遠心分離（10,000rpm）にかけ、固形分（リグニン等）を分離した。続いて原液に尿素及び硫安を原液重量比で各0.5％添加して発酵原液とし、実施例1で得られた乳酸生成菌YPLD1を用いて以下の発酵に使用した。
【００４３】培地は、上記さつまいも糖化液を用いた。発酵は、温度30℃、菌体密度25％（湿重量ベース）、基質濃度10％（バッチ発酵の初期濃度）、発酵時間20〜24時間で行った。その結果、２〜５％の乳酸が得られた。
【００４４】この発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行った。液分の精製・濃縮は、マイクロアシライザー（旭化成社）を用いた。電気透析の処理条件は、印加電圧15V（セルあたり1.5V×10セル）、液温40℃である。電気透析後、除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸等）を、クロマト分離装置（擬似移動層クロマト装置トレソーネ（オルガノ社））にかけて除去した。蒸発缶により水分を蒸発させ、90％の乳酸水溶液を得た。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、乳酸の製造方法が提供される。本発明では、アンモニア等のアルカリ（中和剤）を添加・回収する工程がないため操作が簡便であり、生産性が上昇し、さらに、高価なバイポーラ膜を使用する必要がないためコスト低減を図ることができる。
【００４６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Toyota Motor Corporation<120> Method of producing lactic acid<130> P99-0464<140><141><160> 1<170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 32<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Synthetic DNA<220><221> modified base<222> 3<223> i<220><221> modified base<222> 6<223> i<220><221> modified base<222> 9<223> i<220><221> modified base<222> 12<223> i<220><221> modified base<222> 15<223> i<220><221> modified base<222> 18<223> i<220><221> modified base<222> 21<223> i<220><221> modified base<222> 24<223> i<220><221> modified base<222> 30<223> i<400> acngcnccng cnccnatnac ngcnagtttn gt 32
【００４７】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpYLD1の構築図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 糖化原料を、耐酸性乳酸生成微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項２】 発酵が、中和剤で処理することなく行われるものである請求項1記載の製造方法。
【請求項３】 耐酸性乳酸生成微生物が、pH6以下の条件でも乳酸発酵することができるものである請求項1又は２記載の製造方法。
【請求項４】 耐酸性乳酸生成微生物が、乳酸生成遺伝子を組み込んだ組換えベクターにより形質転換されたものである請求項1〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】 微生物が酵母菌又はカビである請求項1〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１】 糖化原料を、耐酸性乳酸生成微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液から乳酸を採取することを特徴とする乳酸の製造方法。
【請求項２】 発酵が、中和剤で処理することなく行われるものである請求項1記載の製造方法。
【請求項３】 耐酸性乳酸生成微生物が、pH6以下の条件でも乳酸発酵することができるものである請求項1又は２記載の製造方法。
【請求項４】 耐酸性乳酸生成微生物が、乳酸生成遺伝子を組み込んだ組換えベクターにより形質転換されたものである請求項1〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】 微生物が酵母菌又はカビである請求項1〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００１−２０４４６４（Ｐ２００１−２０４４６４Ａ）
【公開日】平成１３年７月３１日（２００１．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０００−１８８２６（Ｐ２０００−１８８２６）
【出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１３年７月３１日（２００１．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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